DE2534085A1 - Adrenocorticotrope polypeptide, deren salze und komplexe sowie arzneimittel - Google Patents
Adrenocorticotrope polypeptide, deren salze und komplexe sowie arzneimittelInfo
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Description
"Adrenocorticotrope Polypeptide, deren Salze und Komplexe sowie Arzneimittel"
Priorität: 30. Juli 1974, Japan, Nr. 87 758/74
Eine Anzahl adrenocorticotroper Polypeptide mit kürzeren Kettenlängen
als das native Hormon (ACTH) und ACTH-ähnlicher Wirkung
sind bisher bekannt. Derartige Verbindungen sind hauptsächlich
in den Stellungen 1,4, 5, I5, 16, I7, 18 und den Endstellungen
modifiziert. Beispielsweise kann die Aminosäure L-Serin in der 1-Stellung durch ex. -Amino isobutt er säure, ß-Alanin, D-Serin, Glycin,
D-Älanin, γ-Aiainobuttersäure oder Sarcosin ersetzt werden;
die Aminosäure L-Methionin in der 4-Stellung kann durch L-Norleucin,
L-Isoleucin oder L-Norvalin ersetzt werden; die Aminosäure
L-Glutaminsäure in der 5-Stellung kann durch L-Glutamin,
die Aminosäure L-Lysin in der 15- und 16-Stellung jeweils durch
L-Ornithin, die Aminosäure L-Arginin in der 17- und IS-Stellung
jeweils durch L-Lysin oder L-Ornithin und die Carboxylgruppe . der C-endständigen Aminosäure durch eine Säureamidgruppe ersetzt^
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werden. Einer der Nachteile dieser Peptide ist Jedoch, daß sie
eine ziemlich starke melanozytenstimulierende Aktivität, verglichen
mit ihrer die Nebenniere anregenden Aktivität, aufweisen. Da alle corticotrop aktiven Polypeptide im Molekül die für
die melanozytenstimulierende Aktivität verantwortliche Aminosäurensequenz
enthalten, weisen sie diese unerwünschte Aktivität mehr oder weniger stark auf. Deshalb wird die Haut von Patienten,
die ein derartiges Peptid mit einer starken melanozytenanregenden Aktivität einnehmen, dunkel pigmentiert.
Wenn corticotrop aktive Peptide als Arzneimittel für therapeutische
Zwecke benutzt werden, werden sie in Form eines Komplexes mit Zink verabfolgt. Der Grund dafür ist, daß sie eine protahierte
Wirkung verglichen mit dem entsprechenden unkomplexierten
Peptid aufweisen. Jedoch wurde kürzlich mehrfach darauf hingewiesen, daß gefährliche anaphylaktische Reaktionen durch einen
solchen Komplex von ACTH mit Zink häufiger als durch das unkomplexierte
Peptid verursacht werden können.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein nicht-komplexiertes Peptid
mit einer starken nebennierenanregenden Wirkung bei einem hohen Aktivität s spie gel und mit einer schwachen melanozytenstimulierenden
Aktivität zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten
Gegenstand.
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253AOBb
In den Verbindungen der Erfindung wird zusätzlich zu den Modifizierungen
der Aminosäurereste in den Stellungen 1, I7 und 18 des Peptids durch Austausch der Aminosäurereste in den Stellungen
19 "bis 24 durch Lysinreste eine Verstärkung und Verlängerung
der Aktivität mit geringen Nebeneffekten bewirkt. Die Aminosäu-
I5 resequenz 15 bis 24 des natürlichen Corticotropins ist Lys-Lys-
Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro. Eine derartige Substitution
der Stellungen 15 bis 24 in AGTH ist unbekannt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können nach an sich bekannten Methoden durch aufeinanderfolgende Kondensation der
Aminosäuren oder durch Kondensation kleiner Peptidfragmente hergestellt
werden. Insbesondere können die Verbindungen der Erfindung entweder
(a) durch Umsetzung eines Aminosäureesters oder Peptidesters
mit einer freien Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit geschützten Aminogruppen in
Gegenwart eines Kondensationsmittels oder
(b) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit einer freien Aminogruppe und geschützter oder ungeschützter
Carboxylgruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit·einer aktivierten Carboxylgruppe und geschützter
Aminogruppe oder
(c) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier
Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit aktivierter
Aminogruppe und geschützter Carboxylgruppe und anschließende Abspaltung der Schutzgruppen durch Hydrogenolyse, Acidolyse,
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Hydrolyse, Hydrazinolyse, Reduktion mit Natrium in flüssigem
Ammoniak oder andere Weise hergestellt werden.
Peptidbindungen werden nach üblichen Methoden gebildet.. Beispiele
für diese Methoden sind die Azid-, Dicyclohexylcarbodiimid-, Carbonyldiimidazol-, gemischte Anhydrid- oder aktivierte
Estermethode, z.B. die p-Nitrophenylestermethode, die N-Hy dr oxy succinimidester-,
Cyanmethylester-, p-Nitrophenylthiolester-, Pentachlorphenylester-, Isoxazolium-, N-Carboxyanhydrid-, Tetraäthylpyrophosphit
oder Ithylchlorphosphitmethode oder deren Kombinationen.
Die Peptide können auch nach der sogenannten Synthese in fester Phase oder nach der Redoxmethode hergestellt werden.
Die vorgenannten Methoden können zwar zur Bildung Jeder Peptidbindung bei der Herstellung der Verbindungen der Erfindung
angewendet v/erden, die bevorzugte Methode ist jedoch die Dicyclohexylcarbodiimid-,
Azid-, gemischte Anhydrid- und aktivierte Estermethode. Bei den vorstehend genannten Kupplungsmethoden
können N-Hydroxysuecinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid
oder 1-Hydroxybenzotriazol zugesetzt werden.
Bei der Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I werden freie funktionelle Gruppen, die an der Reaktion nicht
teilnehmen, vorzugsweise geschützt, insbesondere durch solche Gruppen, die durch Hydrogenolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse,
Hydrolyse oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak
Die
leicht entfernt werden können ./Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol oder tert.-Butanol, oder einem durch einen aromatischen Rest substituierten alipha-
leicht entfernt werden können ./Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol oder tert.-Butanol, oder einem durch einen aromatischen Rest substituierten alipha-
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tischen Alkohol, wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol oder
p-Methoxybenzy!alkohol, oder durch Amidbildung geschützt. Diese
Carboxylschutzgruppen werden in üblicher Weise eingeführt.
Die Aminogruppe wird vorzugsweise mit einer 1-Methylcyclohexyloxycarbony1-1-methyIcyclopentyloxycarbonylgruppe,
9~Methyl-9-fluorenyloxycarbony!gruppe, tert.-Butyloxycarbonylgruppe, tert.-Amyloxycarbonylgruppe,.
o-Nitrophenylsulfenylgruppe, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylgruppe,
Benzyloxycarbony!gruppe, p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe,
p-Methoxybenzyloxycarbony!gruppe,
Tosylgruppe, Formy!gruppe oder Tritylgruppe in üblicher Weise
geschützt. Zum Schutz der Guanidylgruppe des Arginins wird vorzugsweise
die Nitrogruppe, Tosylgruppe oder Adamantyloxycarbonylgruppe verwendet. Der Schutz der Guanidylgruppe ist jedoch nicht
immer erforderlich. Die <x>-ständige Aminogruppe des Lysins wird
vorzugsweise durch eine der vorgenannten Aminoschutzgruppen geschützt. Jedoch wird vorzugsweise eine co-Aminoschutzgruppe verwendet,
die selektiv von der einer oc-Aminoschutzgruppe zu entfernen
ist. Die co -ständige Carboxylgruppe der Glutaminsäure wird vorzugsweise durch die vorgenannten Carboxylschutzgruppen
geschützt, und die Imidazolgruppe des Histidins kann z.B. durch eine Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Benzylgruppe geschützt
werden. Die Hydroxylgruppe des Serins oder Tyrosins kann z.B. durch eine Acetyl-, Benzyl- oder tert.-Butylgruppe geschützt
werden, doch ist dieser Schutz nicht immer erforderlich.
Die im Verfahren verwendeten Schutzgruppen können durch Hydrogenolyse,
Hydrolyse, Hydrazinolyse, Reduktion mit Natrium in
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flüssigem Ammoniak oder durch Behandlung mit einer Säure, wie Trifluoressigsäure, Ameisensäure, einem Halogenwasserstoff, wie
Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, wie Fluorwasserstoffsäure., Bromwasserstoff
säure oder Chlorxtfasserstoffsäure, oder deren Gemischen
oder mit einem Alkalihydroxid, wie. Natriumhydroxid, in üblicher Weise und Je nach der Art der Gruppe abgespalten werden. Die
letzte Kupplungsreaktion zur Herstellung der Polypeptide der allgemeinen Formel I wird beispielsweise durch Kondensation eines
geschützten Dekapeptids der allgemeinen Formel
R1-X1-Tyr-Ser-X2-X3(R2)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH
1 2
in der R eine Amino schutzgruppe, R eine Schutzgruppe für die
to-ständige Carboxylgruppe der Glutaminsäure, X. eine o^-Aminoisobuttersäure-,
B-Alanin-, L-Serin-, D-Serin-, Glycin-, D-Alanin-, y-Aminobutt er säure- oder Sarcosingruppe, X2 ein L-Methionin-,
L-Forleucin-, L-Isoleucin- oder L-Nbrvalingruppe und X^
ein L-Glutaminsäure- oder L-Glutamingruppe bedeutet, mit einem
geschützten Peptid der allgemeinen Formel
H-Lys(R5)-Pro-Yal-Gly-/Lys(RZ|'}7 ~τ
3 4-in der R und R jeweils eine Schutzgruppe für die co -ständige
angegebene
Aminogruppe bedeutet, und T und η die in Anspruch 2/Bedeutung haben,
nach der aktivierten Ester-, Azid-, Dicyclohexylcarbodiimid-,
Carbonyldiimidazol- oder gemischte Anhydridmethode oder nach einer Kombination dieser Methoden durchgeführt. Sämtliche
Schutzgruppen werden danach von dem entstandenen geschützten
Peptid der allgemeinen Formel
R1-X1-Tyr-Ser-X2-X
Pro-Val-Gly-/Ly s(R
R1-X1-Tyr-Ser-X2-X
Pro-Val-Gly-/Ly s(R
R1-X1-Tyr-Ser-X2-X (R2)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(R5)-
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durch Acidolyse, katalytisch^ Hydrierung, Hydrazinolyse oder
durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten.
Die letzte Kupplungsreaktion wird vorzugsweise nach der aktivierten
Estermethode, insbesondere der N-Hydroxysuccinimidester-Methode, in einem inerten Lösungsmittel, bei Temperaturen von
-20 bis +600C, insbesondere O bis 45°C, etwa 1 bis 72 Stunden,
insbesondere mehrere Stunden bis 4-8 Stunden durchgeführt. Spezielle
Beispiele für verwendbare Lösungsmittel sind Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Hexamethylphosphortriamid, Gemische
dieser Lösungsmittel mit Wasser sowie Gemische der Lösungsmittel untereinander. Die Schutzgruppen werden vorzugsweise durch
Acidolyse mit einer Säure, beispielsweise einer Halogenwasserstoff
säure, wie Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure
oder Salzsäure, oder Trifluoressigsäure, während eines Zeitraums von 30 Minuten bis mehrere Stunden bei Temperaturen von
-20 bis +600C entfernt.
Die auf die vorstehend geschilderte Weise hergestellten Yerbindungen
der Erfindung können nach an sich bekannten Methoden gereinigt werden, z.B. durch Ionenaustauschchromatographie, Verteilungschromatographie
, Gelfiltration, Adsorptionschromatographie oder durch Gegenstromverteilung.
Die Verbindungen der Erfindung fallen je nach den Reaktionsbedingungen
in Form der freien Base oder in Form von Säureadditionssalzen an. Die Salze können auch durch Umsetzung der Peptide
mit anorganischen oder organischen Säuren hergestellt wer-
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-β-
den. Beispiele für diese Säuren sind Halogenwasserstoffsäuren,
z.B. Chlorwasserstoff- und· Bromwasserstoffsäure, oder Phosphorsäure,
Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzolsulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure. Zur
Salzbildung kann die Säure in äquimolarer Menge oder im Überschuß verwendet werden.
Die Verbindungen der Erfindung können in Komplexe mit komplexbildenden Schwermetallverbindungen, wie Zink-, Kupfer-, Eisen-,
Nickel- oder Kobaltverbindungen, komplexbildenden Polyaminosäuren, wie Polyglutaminsäure, PoIyasparaginsäure, Copolyglutamyltyrosin
oder Copoly-asparagyl-glutaminsäure, umgewandelt werden. Die Komplexe zeigen gegenüber dem normalen Peptid eine längere
Wirkung.
Die Verbindungen der Erfindung zeigen eine starke biologische Aktivität und sie sind dem nativen Corticotropin und anderenähnlichen
Peptiden überlegen.
Die biologische Prüfung der Verbindungen der Erfindung im Vergleich
zu nativem Corticotropin (ACTH), ^GIyV-ACTH(1-18)-HH2
(Bull. Chem. Soc.,· Japan, Bd. 4-3 (I97O), S. 196), /Äib.^?-ACTH-(1-18)-M2
(ibid., Bd. 43 (I97O), S. 3873), /lib1, Lys17'1??-
ACTH(1-18)-NH2, CortrosynR und CortrosynR-Z erfolgt durch Bestimmung
der Aktivität der Bildung von Steroiden durch intramuskuläre Verabfolgung an hypophysectomierte Ratten, wobei ein
Peptidpräparat in den Oberschenkelmuskel injiziert und 30 Minuten
nach der Injektion Blut aus der abdominalen Aorta entnom-
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men wurde. Weiter wurde die Aktivität der Steroidbildung durch
intravenöse Verabreichung an hypophysectomierte Ratten derart bestimmt, daß ein Peptidpräparat in die femorale Vene injiziert
und 30 Minuten später Blut aus der abdominalen Aorta entnommen '
wurde. Für alle Versuche wurde der dritte USP Corticotropin-Bezugsstandard verwendet, und die Bildung von 11-Hydroxycorticosteroiden
(11-OHCS) wurde fluorimetrisch nach Peterson (J.Biol. Chem. Bd. 225 (1957), S. 25) durchgeführt. Für Jeden Versuch
wurden mehrere Bestimmungen durchgeführt, und die erhaltenen Werte wurden nach der Methode von Sheps und Moore, J.Pharmacol.
Exptl.Therap. Bd. 128 (1960), S. 99 statistisch behandelt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle I zusammengestellt.
Der Effekt auf das Nebennierenwachstum und die Rückbildung der
Thymusdrüse wurde auf folgende Weise bestimmt: Die Peptide wurden intramuskulär Ratten mit einem Körpergewicht
von 100 bis I50 g mit einer Dosis von 20/Ug und 100 /ug pro Ratte'
pro Tag 2 Tage injiziert. 24- Stunden nach der letzten Injek-
die
tion wurden/Ratten getötet und die Nebenniere und die Thymusdrüse gewogen.
Die in vivo melanozytenstimulierende Aktivität wurde nach der
Methode von Tanaka, Endocrinol., Japonica, Bd. 19 (1972), S.383,
bestimmt. Auch diese Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
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- 10 Tabelle I
| Peptide | 3timul lie Ne L.ν. |
ierende benniere i.m. |
Wirung auf in Wirkung auf das Wachstum der Neben niere und die' Rückbil dung der Thymusdrüse a) |
Malanozy tenstimu lierende Wirkung in vivo |
■ | f | 1.72 | - a/b i |
| LAibVys17'18·19.!- ACTH(1-19)-NH2 |
5.7 | 7.8 ' | 0.41 | 0.11 | 0.11 | . 3.73 | ||
| [AibVys17'18'19'20) ■ACTH( 1-20) -NH2 |
6.3 | 10.7 | 0,18 | 0.15 | 1.00 | 1.20 | ||
| Native,! ACTH | 1.0 | 4.0 | * | 0.82 | ||||
| [GIy1J-ACTH(I-IS)- NH2 |
1.0 | 1.0 | * | |||||
| [AXb1J-ACTH(I-Ie)- NH2 |
4.1 | 9.9 | 0.12 | 0.12 | ||||
| [Aib1,Lys17'18j^ACTH (1-18)-NH2 |
9.3 | 9.4 | 0.40 | 0.49 | ||||
| Cortrosyn | 1.8 | 3.1 | ||||||
| Cortrosyn-Z | 1.00 | 0.58 |
Anmerkung : * Die Effekte auf das Nebennierungswachstum und die
Thymusrückbildung sind sehr schwach. CortrosynE=ACTH (1-24)-0H,
•p
Cortrosyn-Z = Zinkkomplex von Cortrosyn. Die nebennierenstimulierende
Aktivität und die melanozytenstimulierende Aktivität werden als relative Wirksamkeit ausgedrückt.
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Es sind mehrere Methoden zur Bestimmung der nebemiierenstimulierenden
Aktivität bekannt, die die Hauptwirkung von ACTH darstellt. Die zuverlässigste Methode zur Prüfung dieser Aktivität
ist eine Prüfung der Wirkung aif das llebennierenwachstum und
die Thymusrückbildung. Dabei sind Polypeptide mit einem höheren Verhältnis von a/b (vgl. Tabelle I) erwünscht. Zu bemerken ist,
daß die Effekte von nativem ACTH, /Gly_7-ACTH(1-18)-NH2 und Cortrosyn
auf das Nebennierenwachstum und die Thymusrückbildung sehr schwach sind. Diese Peptide sind daher nicht als Arzneistoffe
geeignet. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind dem nativen
ACTH und den bekannten Peptiden hinsichtlich ihres hohen Verhältnisses von a/b überlegen.
Die protahierte Wirkung der erfindungsgemäßen Polypeptide, wie 2Äib1,Lysi7'18'127~ACTH(1-19)-KH2, wurde an Ratten mit einem
Körpergewicht von 100 bis 120 g untersucht. Synthetisches menschliches ATCH, Cortrosyn-Z (eine Zinkkomplexsuspension von ACTH-(1-24)-0H)
und ZGlyl7-ACTH(1-18)-EH2 wurden als Vergleichsverbindungen
verwendet. Die Peptide wurden den Ratten .intramuskulär oder intravenös in einer Dosis von 5/ug pro Ratte injiziert.
Danach wurde die Bildung von H-Hydroxycorticosteroiden (11-OHCS)
bestimmt. Die Zeitabhängigkeit des 11-OHCS-Spiegels im Plasma
nach intramuskulärer bzw. intravenöser Verabfolgung der Peptide ist in den Figuren 1 bzw. 2 gezeigt. Danach weist das erfindungsgemäße
Peptid ZÄib1,Lys17'18i1^7-ACTH(1-19)-NH2 verglichen
mit dem synthetischen menschlichen ACTH und verwandten Peptiden eine stark protahierte Wirkung auf. Cortrosyn-Z ist das einzige
ACTH-Präparat, das zu therapeutischen Zwecken benutzt wird, ob-
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wohl es eine ziemlich starke melanozytenstimulierende Aktivität hat (vgl. Tabelle I). Die nebennierenstxmulierende Wirkung des
/Äib1,Lys17'18>127-ACTH(1-19)-NH2 weist nahezu dieselbe Protraktion
wie Cortrosyn-Z auf. Da freies /Äib ,Lys ^*18» V-ACTH(1-19)-NHp
diese Langzeitwirkung besitzt, sind die erfindungsgemäßen
Peptide für therapeutische Zwecke sehr geeignet. In Figur 2 ist keine Kurve für Cortrosyn-Z gezeigt, da die Suspension
nicht intravenös verabfolgt werden kann.
Die erfindungsgemäßen -'Polypeptide sind für therapeutische Zwecke,
wie zur Behandlung von Entzündungen, Nebenniereninsuffizienz infolge von Hypophysenstörungen, akutem oder chronischem Gelenkrheumatismus,
Allergosen oder Nebennierenerkrankungen von Menschen und Tieren, oder zur Untersuchung der Nebennierenfunktion
von Menschen und Tieren geeignet.
Die Polypeptide, ihre Salze mit Säuren und Komplexe können oral oder parenteral in üblichen Verabreichungsformen, z.B. als Injektionspräparate,
Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen oder Aerosolen, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägerstoffen,
Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungsmitteln, Puffern, isotonisierenden Verbindungen und/oder Netzmitteln, verabfolgt
werden.
Die verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren, Peptide und ihre Derivate folgt den Vorschlägen der IUPAC-IUB Commission der
Biochemischen Nomenklatur; vgl. J. ' Biol. Chem. Bd. 241 (1966),
S. 2491, Bd. 242 (1967), S. 555 und Bd. 247 (1972), S. 977-
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Wenn nicht besonders angegeben, liegen alle Amino säure gruppe η
in der L-Konfiguration vor.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi s-Phe-Ar g-Trp-Gly -Ly s-Pr ο -Val-Gly-Ly s-Ly s-Lys-Lys-Lys-HH2
(/Iib\Lysi7'18»127-ACTH(1-19)-HH2). (Aib = <*-
Aminoisobuttersäure )
a) Z-Lys(Boc)-KHp (Z - Benzyloxycarbonyl, Boc = tert.-Butyloxycarbonyl) (I)
a) Z-Lys(Boc)-KHp (Z - Benzyloxycarbonyl, Boc = tert.-Butyloxycarbonyl) (I)
Eine Lösung von 9?55 g N^-Benzyloxycarbonyl-N -tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-K-hydroxysuccinimidester
(Z-Lys(Boc)-0Su) in 50 ml Dioxan viird mit 10 ml konzentrierter Ammoniaklösung versetzt.
Anschließend wird das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird der
kristalline Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird nacheinander mit kalter 0,5 K Salzsäure, Wasser, 1 m Natriumbicarbonatlösung
und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur trockne eingedampft.
Der Rückstand wird aus Äthylacetat und Petroläther kristallisiert. Ausbeute 7,18 g (94,6% d.Th.) vom F. 145 bis 146°C,
Ä7!5'5 = -2,1 - 0,5° (c = 1,004, Methanol).
Analyse: GHN
C19H29N3O5; ber.: 60,14 7,70 11,0?
gef.: έθ,42 7,61 11,00
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b) H-Lys(BoC)-KH2 (H)
5,69 g der erhaltenen Yerbindung werden 2 1/2 Stunden in 50 ml
Methanol in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert.
Anschließend wird der Katalysator abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt
und unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand erstarrt beim Digerieren mit Petroläther. Der Feststoff wird abfiltriert,
unter vermindertem Druck getrocknet und aus Äthylacetat und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 3,61 g (98,1% d.
Th.) vom F. 104 bis 1O5*5°C, ί°θψ^ = +8,2 ± 0,5° (c = 1,006,
Methanol).
CHN
C11H25U5O3; ber.: 53,86 9,4-5 17,13
gef.: 53,89 9,54 17,02.
c) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-HH2 (III)
20 ml einer Lösung von 4,78 g Z-Lys(Boc)-OSu in Chloroform werden
mit 30 ml einer Lösung von 2,45 g der Verbindung II in Äthylacetat
versetzt. Sodann wird das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach. Zusatz von 20 ml Methanol wird das Rühren
weitere 3 Stunden fortgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand
in Äthylacetat suspendiert. Die Suspension wird nacheinander mit kalter 0,5 S" Salzsäure, Wasser, 1 m Fatriumbicarbonatlösung und
Wasser gewaschen. Das in Äthylacetat unlösliche Produkt wird abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Ausbeute 5,15 g vom F. 168 bis 169°C. Das Filtrat und die Waschwässer
werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft.
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253A085
Der kristalline Rückstand und das in Äthylacetat unlösliche Produkt
werden vereinigt und aus Methanol und Diäthylather umkristallisiert.
Ausbeute 5,25 g (86,2% d.Th.) vom F. 169 bis 17O0G,
/<*7^2'5 = _11,1 ± Oj5o (c = 2,025, Methanol).
| C | 29 | H | 13 | N | 52 |
| 59, | 28 | 8, | 12 | 11, | 52. |
| 59, | 8, | 11, | |||
gef. :
d) H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-FH2 (I?)
4,25 g der Verbindung III werden 2 1/2 Stunden in 50 ml Methanol
in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Sodann wird der Katalysator abfiltriert und das Eiltrat unter vermindertem
Druck eingedampft. Der kristalline Rückstand wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und η-Hexan umkristallisiert. Ausbeute
3,30 g (99,4% d.Th.) vom F. 112 bis 115°C, lh.7^' =
-27,2 + 0,4° (c = 2,023, Chloroform).
CHN
O22H^3IT5O6; ber. : 55,79 9,15 14,79
gef.: 55,75 9,14 14,85.
e) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 (V)
50 ml einer Lösung-von 2,84 g der Verbindung (IV) in Chloroform
werden mit 2,87 S Z-Lys(Boc)-OSu versetzt. Das Gemisch wird 68
Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und die Lösung nacheinander
mit kalter 0,1 N Salzsäure, Wasser, 1 m Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Der nach dem Eindampfen unter vermindertem
Druck erhaltene Rückstand wird in Äthylacetat gelöst. Die Lösung
509887/1096
wird in der Kälte stehengelassen. Der erhaltene -gelatinöse Niederschlag
wird abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck bei 600C getrocknet. Ausbeute 4,85 g (96,6% d.Th.) vom
F. 170 bis 1710C, /q^jp'5 = -16,1 - 0,6° (c = 1,0^4, Methanol).
C HN
C41H69N7O11; ber. : 58,90 8,32 11,73
gef.: 58,78 8,32 11,47.
f) H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 (VI)
3?34 g der Verbindung (V) werden 2 Stunden in 50 ml Methanol in
Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem
Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und durch Zusatz von Petroläther ausgefällt. Der Niederschlag
wird abfiltriert, gexmschen und unter vermindertem Druck bei
600C getrocknet. Ausbeute 2,80 g (99,6% d.Th.) rom F. 114 bis
1170C, Z°i7p3 = -4,2 - 0,5° (c = 1,018, Methanol).
CHN
C33H63N7O9; ber. : 56,47 9,05 13,97
gef.: 56,46 9,08 13,83.
g) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 (VII)
1,43 g Z-Lys(Boc)-0Su werden zu einer Lösung von 2,11 g der Verbindung
(VI) in 30 ml Chloroform und 3 ml Methanol gegeben, und
das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und
sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und nacheinander mit kalter 0,1 N
Salzsäure, Wasser, 1 m Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewa-
_J 50 9 8 87/1096
sehen. Der nach dem Eindampfen unter vermindertem Druck erhaltene
Feststoff \vird aus einem Gemisch von Methanol und Diäthyläther
umgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und bei 600C getrocknet. Ausbeute 3,04 g (95,3% d.Th.) vom F.
194 bis 1950C, ^ct7j5'5 = -18,6 - 0,6° (c = 1,012, Methanol).
C- H N
C52H89N9014' ter· : 58,68 8,43 11,84
gef.: 58,89 8,73 11,84.
h) H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(BoC)-NH2 (VIII)
2,13 g der Verbindung VII werden 4,5Stunden in 30 ml Methanol in
Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem
Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Methanol und Äthylacetat ausgefällt. Der gelatinöse Niderschlag
wird abfiltriert, gewaschen und bei 6O0C getrocknet. Ausbeute
1,64 g (88,1% d.Th.) vom F. 168 bis 17O0C, ß*J^ = -11,9 - 0,6°
(c = 1,006, Methanol).
C H N
^4H85N9O12; ber. : 56,81 8,94 13,55
gef.: 56,94 8,94 13,55-
i) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH (IX)
3 ml einer Lösung von 43Ο mg Z-Lys(Boc)-OSu und 837 ^S der Verbindung
VIII in Dimethylformamid v/erden 15 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Reaktionsgemisch
mit 10 ml eiskalter 0,1 N Salzsäure versetzt. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser und Diäthyläther gewa-
509887/1096
sehen und unter vermindertem Druck getrocknet. Anschließend wird
der Niederschlag aus einem Gemisch von Wasser und Methanol umkristallisiert.
Ausbeute 1,08 g (92,8% d.Th.) vom F. 223 bis 224oC,Z"°i7ß3 = -20,4 i 0,6° (c = 0,957, Methanol).
| C | 54 | H | 50 | N | 92 |
| 58, | 71 | 8, | 55 . | 11, | 78. |
| 58, | 8, | 11, | |||
i ber-:
gef. :
gef. :
j) H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-]m2 (X)
905 mg der Verbindung IX in 20 ml Methanol werden 4 1/2 Stunden
in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem
Druck eingedampft und der Katalysator mit Methanol gewaschen. Die Filtrate und die Waschlösungen werden unter vermindertem
Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Methanol und Diäthyläther umgefällt. Ausbeute 836 mg vom F. 208 bis 2100C,
Π*3ψ = -17,3 - 0,6° (c = 1,029, Methanol).
CH N
C55H103N11O15; ber. : 55,30 9,03 12,90
gef.: 55,37 8,78 12,97-
k) Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(BoO)-NH2
(XI)
Eine Lösung von 209 mg Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-OH (hergestellt
gemäß JA-OS 25^5/73), 38 mg N-Hydroxysuccinimid und 3^-8 mg der
Verbindung X in 6 ml Dimethylformamid werden bei -100C mit 68 mg
NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.'Das Gemisch wird 20 Stunden
bei 50C und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach
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wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Nach dem Einengen des Piltrats wird ein gelatinöser Rückstand erhalten. Der Rückstand
wird in Äthylacetat digeriert, abfiltriert und unter vermindertem
Druck getrocknet. Ausbeute 469 mg (88,2% d.Th.) vom F. 234 bis
235°C, C<*J^^ = -29,5 - 0,7° (c = 1,005, Methanol).
C. H N
C86H148N16O23; ber.: 58,22 8,41 12,63
gef. : 58,46 8,54 12,49.
1) Aib-Tyr-Ser-Met-Glu^His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-
Lys-Lys-Lys-LyS-NH2 (/Äib1 ,Lys17'18i1?7-ACa}H(1-19)-NH2) (XII)
100 mg Boc-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH·
Hydrochlorid (hergestellt gemäß JA-OS 2545/73 oder JA-OS 46 147/
74) und 0,06 mMol H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys
(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-HH2, (durch Hydrierung der Verbindung XI
erhalten) in 4 ml eines Gemisches von Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid
(1 : 1) werden mit 15 mg N-Hydroxysuccinimid, 0,01 ml Triäthylamin und 5^,5 mg N^'-Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 21 Stunden stehengelassen und anschließend mit 15 ml eines Gemisches von Ithylacetat und
Diäthyläther (1 : 1) versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, gev/aschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 153
mg. Das erhaltene Peptid wird mit 0,1 ml Äthandithiol und 0,1 ml Anisol in 2 ml 90prozentiger wäßriger Trichloressigsaure gelöst.
Die Lösung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 10 ml Diäthyläther wird der entstandene Niederschlag
abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Ausbeute 168 mg. Das Nonadekapeptid-trifluoracetat
wird in 0,1 N Essigsäure gelöst und
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die Lösung auf eine mit Amberlite CG-400 (Acetatform) beschickte
Säule der Abmessungen 0,9 x 25 cm gegeben. Das peptidacetathaltige
Eluat wird eingeengt und lyophilisiert. Ausbeute 125 mg.
Das Produkt wird anschließend auf eine mit Carboxymethylcellulose (Serva CM-Cellulose, 0,70 mÄq/g) beschickte Säule der Abmessungen
2,2 χ 25 cm gegeben und gereinigt, wobei als Laufmittel
ein Ammoniumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 und einer Fließgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde verwendet werden. Dieser
Puffer wird in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,03 "bis 0,6 m eingesetzt. Die Fraktionen (Mj101 bis 158) mit
jeweils 10 ml Volumen werden gesammelt, eingeengt und zu 89 mg Pulver lyophilisiert. Das Pulver wird weiter verteilungschromatographisch
(2,0 χ 75 cm) an Sephadex G-25 gereinigt. Als Laufmittel
wird dabei ein Gemisch von n-Butanol/Essigsäure/Pyridin/ Wasser (12 : 3 : 4 : 6 VolumenbeLle) mit einer Fließgeschwindigkeit
von 15 ml/Stunde und als Peptidtest die Folin-Lowry-Methode
verwendet. Die Fraktionen (Nr. 60 bis 100) mit jeweils 5 ml werden
gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Ausbeute 69 mg /aj^^ = 64,4 - 2,1° (c = 0,511, N/10
Essigsäure), χ JVJ N NaOH282 ψ
■χ 0,1 N HCl o f Λ ei „^ . 0,1 N HCl Poo _„ r-^ cm ._ .
Amax 280 1^ (E1% 22'1)' λ Schulter 288 1^ (E1% 16'7)*
Aminosäureanalyse (molares Verhältnis): Lys 5»92 (6), His 1,00
(1), Arg 0,96 (1), Ser 0,89 (1), GIu 1,10 (1), Pro 1,14 (1), GIy 2,00 (2), Aib 0,77 (1), VaI 0,99 (1), Met 1,02 (1), Tyr 1,03
(1), Phe 1,03 (1)» Trp/Tyr 1,13 (1)· Die Werte in Klammern geben
die theoretisch berechneten molaren Verhältnisse an.
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Beispiel 2
Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
(/lib1 ,Lysi7'1S'19'22/-ACTH(1-1O)-M2
a) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
(XIII)
167 ™g Z-Lys(Boc)-OSu und 413 mg der Verbindung X werden in
3 ml Dimethylformamid gelöst und 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird anschließend mit 10 ml
eiskalter 0,1 N Salzsäure versetzt. Der entstandene Niderschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem
Druck getrocknet. Ausbeute' 530 mg (99,6% d.Th) vom F. 231,5 bis
2330C. Das Produkt wird aus einem Gemisch von Wasser und Methanol
umkristallisiert. Ausbeute 514 mg (96,6% d.Th.) vom F. 229
bis 2300C, ί^-_7ψ - -20,8 - 0,6° (c = 1,042, Methanol).
CHN
C74H129N13O20; ber. : 58,53 8,53 11,83
gef.: 58,44 8,55 11,97-
b) Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
(XIV)
Eine Lösung von 0,05 mMol Boc-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu )-His~Phe-Arg-Trp-GIy-OH·HCl-(vgl.
Beispiel 11) und 0,05 mMol H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc
)-Lys(Boc )-Lys(Boc )-Lys(Boc )-Lys(Boc )-Lys(Boc ) NHp(durch Hydrierung der Verbindung XIII erhalten) in 3 nü- eines
Gemischs von Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid (1 : 1) wird
mit 12,7 mg N-Hydroxysuccinimid und 0,01 mg Triäthylamin versetzt.
Nach Zugabe von 45,4 mg Dicyclohexylcarbodiimid wird das Gemisch 21 Stunden weiter gerührt. Das Reaktionsgemisch wird
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tropfenweise mit 15 ml eines Gemischs von Äthylacetat und Diäthyläther
(1:1) versetzt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Ausbeute 150 mg. Das geschützte
Peptid wird mit 0,1 ml Äthandithiol und 0,15 ml Anisol
in 2 ml 90p^ozentiger wäßriger Trichloressigsäure gelöst. Das
Gemisch vrird 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit 10 ml Diäthyläther versetzt. Der entstandene Niederschlag
wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Ausbeute 160 mg. Dieses Produkt wird in 0,1 N Essigsäure gelöst. Die Lösung
wird auf eine mit Amberlite CG-4-00 (Acetatform) beschickte
Säule der Abmessung 0,9 x '25 cm gegeben. Als Laufmittel wird
0,1 N Essigsäure verwendet. Die Eluate werden gesammelt, eingeengt
und zu 132 mg Produkt lyophilisiert. Die das rohe Peptid
enthaltende Lösung wird zuerst zur Reinigung des Peptids auf
eine mit Carboxymethylcellulose (Serva, 0,7mlq/g) beschickte
Säule der Abmessung 2,2 χ 25 cm gegeben. Als Laufmittel wird Ammoniumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 verwendet. Dieser
Puffer wird mit einem salzlinearen Gradienten von 0,03 bis 0,06 m eingesetzt. Die Fraktionen (Nr. 101 bis 166) werden gesammelt,
eingeengt und zu 81 mg Produkt lyophilisiert. Das erhaltene Peptid wird in einem Gemisch von n-Butanol/Essigsäure/
Pyridin/Wasser (1-2:3 : 4- : 6, Volumenteile) gelöst und die
Lösung auf eine mit Sephadex G-25 (Medium) beschickte Säule der Abmessung 2,0 χ 75 cm gegeben. Als Laufmittel dient das vorstehend
genannte Lösungsmittelsystem mit einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/Stunde und einem 2,2 fachen Volumen des gesamten
Säulenvolumens. Die Fraktionen (Nr. 85'bis I30) werden gesammelt
und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in V/asser
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24 gelöst und die Lösung lyophilisiert. Ausbeute 71 mg, /°^7D '
-66,0 ί 2,1° (c = 0,521, Ν/10 Essigsäure), Λ JJ^ "^^ 282
rv1 cm o Q. _ Q ,„1 cm _ . 0,1 N HCl ^n r-1 cm . p.
,0,1 N HCl ODQ m, r-pi cm ^,c- QN
Λ Schulter 288 1^ (E1% 15'9)'
Λ Schulter 288 1^ (E1% 15'9)'
Die Dünnschichtchromatographie ergibt einen einzigen Fleck, die Papierelektrophorese weist auf eine einzige Komponente hin.
Aminosäureanalyse (molares Verhältnis): Lys 6,"72 (7)» His 1,00
(1), Arg 1,00 (1), Ser 0,91 (1), GIu 1,12 (1), Pro 1,15 (1),
GIy 2,00 (2), Aib 1,12. (1), VaI 0,96 (1), Met 1,00 (1), Tyr 0,99
(1), Phe 0,95 (1), Trp/ryr 1,09 (1). Die Zahlen in Klammern bedeuten
das theoretisch berechnete molare Verhältnis.
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Claims (6)
1. Adrenocorticotrope Polypeptide der allgemeinen Formel I X1-Tyr-Ser-X2-X3-His-Phe-Arg-Trp"-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)n-y
(D
in der X^ ein o<- -Aminoisobuttersäure-, B-Alanin-, L-Serin -,
D-Serin-, Glycin-, D-Alanin-, γ-Aminobuttersäure- oder Sarcosinrest,
X2 ein L-Methionin-, L-Norleucin-, L-Isoleucin-oder
L-Norvalinrest und X^ ein L-Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest
bedeutet, η eine ganze Zahl mit einem Wert von 5 bis
ist und Y R. oder eine Gruppe der allgemeinene Formel
-JN^T 2 oder
bedeutet, wobei R. eine Hydroxyl- oder Alkoxygruppe mit 1
bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt, Ro, R^, R1, und Rn- Wasserstoffatome
oder Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeuten, m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 10 ist
und Y eine Gruppe bedeutet, die an die Carbonylgruppe des C-endständigen Lysinrests gebunden ist, sowie ihre Salze mit
Säuren und Komplexe.
2. Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X,
ein oc-Aminoisobuttersäurerest ist.
3. Polypeptidenach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß X2
ein L-Methionin- und X^ ein L-Glutaminsäurerest ist.
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4-. Polypeptidenach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß η
den Wert 5 oder 6 hat und Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe
ist.
5. Polypeptide nach Anspruch. 4, dadurch gekennzeichnet, daß Y
eine Aminogruppe ist.
6. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung nach Anspruch. 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/
oder Hilfsstoffen.
509887/1096
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