CZ295838B6 - Způsob výroby peptidů - Google Patents
Způsob výroby peptidů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ295838B6 CZ295838B6 CZ1999803A CZ80399A CZ295838B6 CZ 295838 B6 CZ295838 B6 CZ 295838B6 CZ 1999803 A CZ1999803 A CZ 1999803A CZ 80399 A CZ80399 A CZ 80399A CZ 295838 B6 CZ295838 B6 CZ 295838B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- peptide
- sequence
- acid
- protected
- fmoc
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 169
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 150000008574 D-amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 108
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 108
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 88
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 86
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 72
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 69
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 69
- -1 Boc group Chemical group 0.000 claims description 68
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 60
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 32
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 22
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 18
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 16
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- VUCNQOPCYRJCGQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(hydroxymethyl)phenoxy]acetic acid Chemical compound OCC1=CC=C(OCC(O)=O)C=C1 VUCNQOPCYRJCGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 8
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 8
- HXOYWJCDYVODON-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(hydroxymethyl)-3-methoxyphenoxy]butanoic acid Chemical compound COC1=CC(OCCCC(O)=O)=CC=C1CO HXOYWJCDYVODON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- SCZNXLWKYFICFV-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4,5,7,8,9-octahydropyrido[1,2-b]diazepine Chemical compound C1CCCNN2CCCC=C21 SCZNXLWKYFICFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920000361 Poly(styrene)-block-poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 claims description 6
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 claims description 6
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 5
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 claims description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- IMMCAKJISYGPDQ-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-9,10-bis(phenylethynyl)anthracene Chemical compound C12=CC=CC=C2C(C#CC=2C=CC=CC=2)=C2C(Cl)=CC=CC2=C1C#CC1=CC=CC=C1 IMMCAKJISYGPDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RWQUWTMOHXGTNN-UHFFFAOYSA-N 9-n,10-n-bis(4-butylphenyl)-9-n,10-n-bis(4-methylphenyl)phenanthrene-9,10-diamine Chemical compound C1=CC(CCCC)=CC=C1N(C=1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C=1N(C=1C=CC(C)=CC=1)C=1C=CC(CCCC)=CC=1)C1=CC=C(C)C=C1 RWQUWTMOHXGTNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007821 HATU Substances 0.000 claims description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000005518 carboxamido group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- QEHRETCJMLQPCR-UHFFFAOYSA-N (2,4-dimethoxyphenyl)-(4-hydroxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QEHRETCJMLQPCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KODNUMJIUACFIE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-1-[carbamohydrazonoyl(hydroxy)amino]sulfanyl-1-hydroxyguanidine Chemical compound NN=C(N)N(O)SN(O)C(N)=NN KODNUMJIUACFIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N Ethylene carbonate Chemical compound O=C1OCCO1 KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002222 fluorine compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 2
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 claims description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 claims 1
- ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine Chemical group C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 abstract description 17
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 64
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 38
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 36
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 36
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 36
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 25
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 23
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 23
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- ITECRQOOEQWFPE-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)acetic acid Chemical compound COC1=CC=C(C(O)C(O)=O)C=C1 ITECRQOOEQWFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 15
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 14
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 10
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 8
- VXGABWCSZZWXPC-UHFFFAOYSA-N methyl 2-(methylamino)acetate Chemical compound CNCC(=O)OC VXGABWCSZZWXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 8
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 7
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 108700041474 des(formylvalyl)gramicidin Proteins 0.000 description 6
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- KMPWYEUPVWOPIM-QAMTZSDWSA-N cinchonine Chemical compound C1=CC=C2C([C@@H]([C@@H]3[N@]4CC[C@H]([C@H](C4)C=C)C3)O)=CC=NC2=C1 KMPWYEUPVWOPIM-QAMTZSDWSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 4
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 4
- 108700027361 sarcosine methyl ester Proteins 0.000 description 4
- OBUGXZVDQXDGTF-VEJNRXSDSA-N (3s)-3-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-[[(2s)-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-4-amino-1-(carboxymethylamino)-1,4-dioxobutan-2-yl]am Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OBUGXZVDQXDGTF-VEJNRXSDSA-N 0.000 description 3
- HJBLUNHMOKFZQX-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-1,2,3-benzotriazin-4-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(O)N=NC2=C1 HJBLUNHMOKFZQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 3
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 3
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical group C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700037654 Acyl carrier protein (ACP) Proteins 0.000 description 2
- 102000048456 Acyl carrier protein (ACP) Human genes 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001280 alpha hydroxy acids Chemical group 0.000 description 2
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- KMPWYEUPVWOPIM-UHFFFAOYSA-N cinchonidine Natural products C1=CC=C2C(C(C3N4CCC(C(C4)C=C)C3)O)=CC=NC2=C1 KMPWYEUPVWOPIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000005112 continuous flow technique Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012434 nucleophilic reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- ITECRQOOEQWFPE-MRVPVSSYSA-N (2r)-2-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)acetic acid Chemical compound COC1=CC=C([C@@H](O)C(O)=O)C=C1 ITECRQOOEQWFPE-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPYXQYWILNVAU-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 DFPYXQYWILNVAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFLKTDAONDZLAN-UHFFFAOYSA-N 2-(n-phenylanilino)acetic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1N(CC(=O)O)C1=CC=CC=C1 KFLKTDAONDZLAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAHZZVIEFRTEY-UHFFFAOYSA-N 2-heptylcyclohex-2-en-1-one Chemical compound CCCCCCCC1=CCCCC1=O HBAHZZVIEFRTEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 229920001367 Merrifield resin Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYSYLSDKVZDWJU-UHFFFAOYSA-N [O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 Chemical compound [O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.[O-]B([O-])F.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 PYSYLSDKVZDWJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001295 alanines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004391 aryl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000000119 electrospray ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N leu-enkephalin Chemical group C=1C=C(O)C=CC=1CC(N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- JPDSHWJXMMBSTD-UHFFFAOYSA-N methyl 3-nitro-4-sulfanylbenzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(S)C([N+]([O-])=O)=C1 JPDSHWJXMMBSTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C.CCN(C(C)C)C(C)C WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002095 near-infrared Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N nmp n-methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O.CN1CCCC1=O VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000012607 strong cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000006918 subunit interaction Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001196 time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
- C07K1/042—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers characterised by the nature of the carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Prostheses (AREA)
Abstract
Popisuje se způsob výroby peptidů X-AA.sub.1.n.-AA.sub.2.n....AA.sub.n.n.-Y, kde AA je zbytek L- nebo D-aminokyseliny, X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny, Y je NH.sub.2.n. a n je celé číslo větší než 2, syntézou na pevné fázi, s výhodou s použitím metody Fmoc, přičemž mezi C-koncovou část připojenou na pevnou fázi se vkládá pre-sekvence obsahující 3 až 9, s výhodou 5 až 7 zbytků aminokyselin nezávisle zvolených z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranního řetězce chráněnými v průběhu reakčních kroků a s faktorem náklonnosti P.alfa. > 0,57 a faktorem náklonnosti P.beta. .<=. 1,10 nebo odpovídajících D-aminokyselin a uvedená pre-sekvence je z vytvořeného peptidu odštěpena.
Description
Způsob výroby peptidů
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká zlepšeného způsobu výroby peptidů syntézou na pevné fázi.
Dosavadní stav techniky
Syntéza peptidů na pevné fázi (solid-phase peptide synthesis, SPPS) je vysoce úspěšná metoda zavedená Merrifieldem v roce 1963 (Merrifield, R. B. (1963), J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 2154). Touto metodou bylo dosud syntetizováno velké množství peptidů. Vynikající přehled v současnosti používaných chemických syntéz peptidů a proteinů je uveden v Kent, S. B. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989, který je zařazen odkazem.
V praxi se používají dvě strategie pro výstavbu peptidových řetězců syntézou na pevné fázi, a to postupné syntézy na pevné fázi a kondenzace fragmentů na pevné fázi.
Při postupné SPPS se váže C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného, v případě nutnosti na postranním řetězci chráněného reaktivního derivátu kovalentní vazbou buď přímo, nebo prostřednictvím vhodné propojovací skupiny (linker) na „pevný“ nosič, například polymerní pryskyřici, která je v nabobtnalém stavu v organickém rozpouštědle. Ν-α-ochranná skupina se odstraní a postupně se přidávají následující chráněné aminokyseliny.
Když bylo dosaženo požadované délky peptidového řetězce, ochranné skupiny postranních řetězců se odstraní a peptid se odštěpí z pryskyřice, což může být provedeno v oddělených krocích nebo současně.
Při kondenzaci fragmentů na pevné fázi se cílová sekvence sestaví postupnou kondenzací fragmentů na pevném nosiči s použitím chráněných fragmentů vyrobených metodou postupné SPPS.
V průběhu let byly vyvinuty dvě strategie pro vytvoření vazby založené na použití různých Ν-α-ochranných skupin a přizpůsobení ochranných skupin postranního řetězce.
Merrifield používal jako Ν-α-ochrannou skupinu tórc-butyloxykarbonyl (Boc), zatímco Carpino a Han zavedli 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) (Carpino, L. A. a Han, G. Y. (1972), J. Org. Chem. 37, 3404 - 3409).
Operace používané při jednom cyklu prodloužení řetězce při postupné SPPC s použitím reakcí Boc a Fmoc jsou ilustrovány v následujících reakčních schématech (převzaté z Kent, S. B. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989).
φ o
>» Jí <n
CL t CM
Boc-AAn-OBzlCH2CONH-CH2-pryskyrice i—*· Fmoc-AAn-O-Bzl-O-CH c >Φ
C ro ω X3
O >> c
CL
Jí tf>
'Φ c g Λ i—
J= O o φ
Q >. Jí tn 2?
CL t CM
X o ó o
I c < <
CM X z «5 J3
N CtJ >
CO O x 'c >a> c ra
O
C ‘o.
Jí « Φ c c ra l—
JC
O o
Φ Q >» Jí w £ CL
CM
X o
I X z o o
CM X g
N CO O
I c < <
I co
X z
F ó
I s H
Φ o
| Φ | Cfí | |
| o | >v | |
| ra | loM | |
| N | CL | |
| ra u. | CM X | ra |
| Ή | o 1 | X) N |
| φ c | X | ra > |
o o
CM - x θ
N CQ
Boc-AAn-i-AAn-OBzlCH2CONH-CH2-pryskyrice Fmoc-AAn-i-AAn-0-Bzl-0-CH2-pryskyřice
-2CZ 295838 B6
Peptid chráněný Ν-α-Boc navázaný na pryskyřici PAM se zbaví Ν-α-ochranné skupiny kyselinou trifluoroctovou (TFA). Získaná aminová sůl se promyje a neutralizuje terciárním aminem. Následující peptidová vazba se vytvoří reakcí s aktivovanou Boc-aminokyselinou, například symetrickým anhydridem. Obecně je ochrana postranního řetězce založená na benzylu a odstranění ochranné skupiny se provede HF nebo kyselinou sulfonovou.
Peptid chráněný Ν-α-Fmoc navázaný na pryskyřici se zbaví Ν-α-ochranné skupiny působením sekundárního aminu, normálně piperidinu, v organickém rozpouštědle, například N,N-dimethylformamidu (DMF) nebo dichlormethanu (DCM). Po promytí se neutrální peptidová pryskyřice ponechá reagovat s aktivovanou Fmoc-aminokyselinou, například hydroxybenztriazolovým aktivním esterem.
Ochrana postranního řetězce je založena na skupinách terc-butyl, trityl a arylsulfonyl a pro odstranění ochranné skupiny z postranních řetězců se s výhodou používá TFA.
I když se v podstatě pro všechny běžně používané syntézy peptidů používají strategie s Boc a Fmoc, někteří autoři navrhovali jiné Ν-α-ochranné skupiny (Stewart, J. M. a Young, J. D., Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Company (1984)).
Boc vytváří v kyselém prostředí labilní urethanovou skupinu a další návrhy z této kategorie jsou bifenylizopropyloxykarbonyl (Bpoc), 3,5-dimethoxyfenylizopropyloxykarbonyl (Ddz), fenylizopropyloxykarbonyl (Poc) a 2,3,5-tetramethylbenzyloxykarbonyl (Tmz).
Mezi další typy dostupných Ν-α-ochranných skupin patří nitrofenylsulfenyl (Nps), který je možno odstranit buď velmi zředěnou bezvodou kyselinou, například HC1, nebo napadením nukleofilním činidlem, například methyl-3-nitro-4-merkaptobenzoátem. Je možno také použít dithiasukcinylu (Dts), který je odstranitelný působením nukleofílního činidla.
SPPS má obecnou výhodu, že je využitelná při plně automatizované nebo poloautomatizované chemii vytváření řetězců. Systém pro SPPS za podmínek nízkotlakého kontinuálního průtoku byl vyvinut Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137 a dále vylepšován, viz Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270 - 272 a WO 90/02605.
I když SPPS dnes představuje základní kámen při syntéze proteinů a peptidů, stále ještě zbývá vyřešit některé problémy. Protože některé z těchto problémů mohou mít vztah ke struktuře peptidů, bude vhodná následující krátká diskuse.
Empirické předpovědi konformací proteinů byly prováděny autory Chou, P. Y. a Fasman, G. D. (1978), Annu Rev. Biochem. 47, 254 - 276. Je dobře známo, že architektura proteinů může být popsána primární, sekundární, terciární a kvartemí strukturou. Primární struktura se týká sekvence aminokyselin proteinu. Sekundární struktura je místní prostorová organizace polymerní kostry, přičemž se nebere v úvahu konformace postranních řetězců. Jako příklady sekundárních struktur je možno uvést α-šroubovice, β—listy a β-otáčky, což jsou reverzní úseky řetězců skládající se z tetrapeptidů. Terciární struktura je uspořádání všech atomů v prostoru včetně disulfídických můstků a poloh postranních řetězců, takže se berou v úvahu všechny interakce na krátké i dlouhé vzdálenosti.
Termín kvarterní struktura může být použit pro označení interakce mezi podjednotkami proteinu, například a- a β-řetězců hemoglobinů.
Po diskusi dřívějších pokusů spojovat sekundární strukturu proteinů s aminokyselinovým složením, kde například Ser, Thr, Val, Ile a Cys byly klasifikovány jako „rozbíjející šroubovice“ (helix breakers) a Ala, Leu a Glu jako „tvořící šroubovice“ (helix formers), přičemž hydrofobní zbytky
-3 CZ 295838 B6 byly zařazovány jako silně „struktury β tvořící“ a prolin spolu se zbytky nabitých aminokyselin jako „struktury β rozbíjející“ připravili Chou a Fasman statistickou analýzu 29 proteinů se známou rentgenovou strukturou pro vytvoření pravidel pro předpovídání a- a β-oblastí.
Na základě těchto studií vytvořili tzv. faktory náklonnosti (prospensity factors) Ρα, Ρβ a Pt, které jsou konformační parametry vyjadřující polohové preference vystupovat jako α-šroubovice, βlist a popřípadě β-otáčka pro přirozené L-aminokyseliny tvořící část proteinů.
Pro ilustraci jsou Pa a Ρβ uvedeny níže. Jednopísmenkové zkratky pro jednotlivé aminokyseliny i o j sou uvedeny v závorkách.
| Pa | Ρβ | |||
| Glu | (E) | 1,51 | Val | 1,70 |
| Met | (M) | 1,45 | lle | 1,60 |
| Ala | (A) | 1,42 | Tyr | 1,47 |
| Leu | (L) | 1,21 | Phe | 1,38 |
| Lys | (K) | 1,16 | Trp | 1,37 |
| Phe | (F) | 1,13 | Leu | 1,30 |
| Gin | (Q) | 1,11 | Cyr | 1,19 |
| Trp | (W) | 1,08 | Thr | 1,19 |
| lle | (i) | 1,08 | Gin | 1,10 |
| Val | (V) | 1,06 | Met | 1,05 |
| Asp | (D) | 1,01 | Arg | 0,93 |
| His | (H) | 1,00 | Asn | 0,89 |
| Arg | (R) | 0,98 | His | 0,87 |
| Thr | (T) | 0,83 | Ala | 0,83 |
| Ser | (S) | 0,77 | Ser | 0,75 |
| Cys | (C) | 0,70 | Gly | 0,75 |
| Tyr | (Y) | 0,69 | Lys | 0,74 |
| Asn | (N) | 0,67 | Pro | 0,55 |
| Pro | (P) | 0,57 | Asp | 0,54 |
| Gly | (G) | 0,57 | Glu | 0,37 |
-4CZ 295838 B6
Hodnoty pod 1,00 obvykle ukazují, že dotyčná aminokyselina musí být považována pro konkrétní sekundární strukturu za nevýhodnou.
Jako příklad je možno uvést hydrofobní kyseliny (například Val, Ile, Leu), které silně podporují tvorbu β-listu, zatímco nabité aminokyseliny (například Glu, Asp a His) tvorbu β-listu narušují.
Ve struktuře α-šroubovice je udržována spirální konfigurace peptidu rigidně v místě vodíkových můstků mezi atomem vodíku připojeným katomu dusíku v jedné opakující se jednotce
O H
II I (C - C - N -) a atom kyslíku připojený na atom uhlíku tři jednotky podél řetězce.
Jestliže se polypeptid přivede do roztoku, může se přivést α-šroubovice k rozvinutí za vytvoření náhodného svinutí nastavením pH. Přechod od α-šroubovice k náhodnému svinutí probíhá v úzkém rozmezí pH. Protože vodíkové vazby jsou z hlediska pevnosti vazby v a-šroubovici všechny ekvivalentní, mají sklon přecházet do jiného uspořádání všechny najednou. Změna může být také indukována teplem.
Struktura β-listu se skládá z úplně natažených peptidových řetězců, u kterých vodíkové vazby spojují atomy vodíku na jednom řetězci s atomy kyslíku v sousedním řetězci. Vodíkové vazby tedy nepřispívají k vnitřní organizaci řetězce jak je tomu u α-šroubovice, ale pouze vážou řetězec s řetězcem. Sousední řetězce mohou být paralelní nebo antiparalelní.
β-otáčky se často pozorují v těch částech peptidového řetězce, které spojují antiparalelní řetězce ve struktuře β-listu.
U β-otáčky tvoří skupina CO- a NH- aminokyseliny číslo n v peptidovém řetězci vodíkovou vazbu s odpovídajícími skupinami v aminokyselině číslo n + 4.
α-šroubovice a β—list tvoří silně proměnlivé části peptidové konformace proteinů (od 0 do 80 %) a zbývající části proteinů jsou naskládány v jiných strukturách. U většiny proteinů se jeví části peptidových řetězců jako nepravidelně složené „náhodné smyčky“.
Pokud se nyní obrátíme k obecným problémům týkajícím se SPPS, v referenci Kent, S. Β. H. (1988), Annu Rev. Biochem. 57, 957 - 989 se osvětluje syntéza „obtížně syntetizovaných sekvencí“ (difficult sequences).
Jak je zřejmé, celá podstata SPPS je založena na úplném odstranění Ν-α-ochranných skupin před každým z následujících kroků vazby.
To znamená, že v ideálním případě by se měly všechny aminokyseliny s odstraněnou N-aochrannou skupinou vázat na reaktivní derivát aminokyseliny podle požadované sekvence, tj. měla by probíhat úplná aminoacylace.
Kent uvádí, že nejvážnější potenciální problém v postupné SPPS je neúplná tvorba peptidové vazby, kterou vznikají peptidy s jednou nebo více chybějícími aminokyselinami (delecemi), ale s podobnými vlastnostmi jako má cílová sekvence.
Takové neúplné vazby převažují více u některých sekvencí než u jiných, a proto tedy termín „obtížně syntetizovatelná sekvence“ a zjevně převažují více u způsobu Fmoc než u způsobu Boc.
-5 CZ 295838 B6
Vědci včetně autorů předkládaného vynálezu studovali velký počet zjištěných „obtížně syntetizovatelných sekvencí“.
Při syntéze SPPS homo-oligopeptidů obsahujících leucin nebo alanin s použitím strategie Fmoc bylo pozorováno neúčinné odstraňování Ν-α-ochranných skupin piperidinem v závislosti na sekvenci (B. D. Larsen, C. Larsen a A. Holm, Peptides 1990; E. Giralt a D. Andreu, (eds.) 1991 ESCOM Science Publishers B. V., str. 193 - 185 a Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9). Výzkumy ukázaly, že tento jev byl spojen s následnou pomalou a neúplnou vazbou aminokyseliny a jako příčina obtížné vazby a neúplného odstranění Fmoc byl ukázán důkaz agregace rostoucího peptidového řetězce od β—listu. Tento důkaz byl založen na obecných fyzikálně-chemických pozorováních (Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9) a na podrobném studiu Ramanova spektra v blízké infračervené oblasti (Due Larsen, B., Christensens, D. H., Holm, A., Zillmer, R., a Faurskov, O. (1993), J. Amer. Chem. Soc. 115, 6247 - 6253). Uvedená fyzikálně-chemická pozorování mohou být shrnuta následujícím způsobem: v případě syntézy H-(Ala)n-Lys-OH na polyamidem polymerizované křemelinové matrix (PepSynK) nebyly pozorovány žádné problémy až do n = 5, ale pro n = 6 bylo po provedení standardního odstranění ochranných skupin piperidinem (20 % piperidin v DMF) stále ještě přítomno přibližně 20 až 25 % peptidu chráněného Fmoc. Při pokračování syntézy na n = 10 byla získána relativně komplikovaná směs obsahující cílový peptid (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 6, 7, 8, a 9 a deleční peptidy se skupinou Fmoc stále ještě připojenou na N-konec, kde n = 6, 7, 8 a 9 (obr. 1). Tato směs byla po separaci HPLC na jednotlivé složky identifikována FAB MS. Chybné sekvence nebo částečné odstranění ochranné skupiny pro n = 2 až 5 nebo neúplné odstranění ochranných skupin z cílového peptidu (n = 10) nebylo pozorováno, takže problém bylo možno přiřadit dané oblasti homo-oligopeptidového řetězce. Tento typ obtížných aminoacylací a neúplného odstraňování ochranných skupin je proto možno označit jako nenáhodný na rozdíl od náhodných obtíží, které jsou způsobeny pouze běžnými sférickými problémy (Kent, S. B. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989). Ačkoliv byly měněny experimentální podmínky, například typ pryskyřice, doba kroku odstraňování ochranných skupin, rozpouštědla, přidávání chaotropních látek, problémy stále přetrvávaly, i když optimální vliv na nekompletní odstraňování skupiny Fmocmělo zahřívání na 50 °C (Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9).
Nejcharakterističtějším rysem homo-oligoanalinového řetězce je to, že kroky neúplného odstranění Fmoc jsou následovány výrazně pomalými acylacemi další aminokyselinou v sekvenci. Efektivní doby acylace pro každý z prvních šesti alaninů jsou menší než 60 minut, zatímco úplná acylace u Ala7, Ala8, Ala9 a Alaio je 26,28, 30 popřípadě 7 hodin (obr. 2).
Kent, S. B. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989 navrhuje řadu řešení problému týkajícího se nesnází spojených s vazbou závislou na sekvenci, například použití tepla při kroku vazby a kvantitativní přeměnu zbytkových nezreagovaných peptidových řetězců navázaných na pryskyřici na ukončené peptidy v kroku navázání „čepičky“.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí zlepšené metody SPPS, kterou je možno syntetizovat s vysokým výtěžkem a čistotou peptidy, které jsou známy nebo se ukážou jako „nesnadno syntetizovatelné sekvence“.
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout zlepšený způsob SPPS, kterým se dosáhne snížení doby reakce nejen pro nesnadno syntetizovatelné sekvence, ale i pro jinak nekomplikované sekvence, kde je žádoucí snížit za normálních okolností dlouhé doby reakcí.
-6CZ 295838 B6
Způsob, kterým se dosahuje tohoto a dalších předmětů a výhod vynálezu, bude zřejmý z následujícího podrobnějšího popisu a obrázků, které ukazují záznamy HPLC pro různé peptidy získané syntézou na pevné fázi.
Pro objasnění problémů popsaných výše s ohledem na prameny B. D. Larsen, C. Larsen a A. Holm, Peptides 1990; E. Giralt a D. Andreu, (eds.) 1991 ESCOM Science Publishers B. V., str. 193 - 185 a Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9 se autoři předkládaného vynálezu zaměřili za otázku, do jaké míry může být stupeň tvorby struktury typu β-listu homo-oligoalaninového řetězce ovlivněn zavedením kratší peptidové sekvence, presekvence, do řetězce na C-konci. Tato otázka je spojena se skutečností, že proteinové struktury a polypeptidové sekvence mohou mít oblasti s dobře definovanými strukturami závislými na aminokyselinách v sekvenci a na předcházejících aminokyselinách. Jak bylo uvedeno dříve, výzkumy podle Chou, P. Y. a Fasman, G. D. (1978), Annu Rev. Biochem. 47, 251 - 276, týkající se proteinových struktur vedly k poznání tříd aminokyselin definovaných jako indukující převážně α-šroubovici, β—list nebo indukující náhodné svinutí. Ačkoliv je možno předpokládat, že podobné předpovědi mohou platit pro homo-oligoalaniny nebo leuciny, bylo ukázáno, že pravidla Choua a Fasmana nepředpovídají vytváření struktur typu β-listu homo-oligoalaninovými nebo leucinovými peptidy. Navíc nelze očekávat, že by pravidla, která odvodili Chou a Fasman, mohla být použita při syntéze peptidů na pryskyřici a jasně nemohou platit, jestliže se účastní syntézy aminokyseliny s chráněným postranním řetězcem.
V základních studiích byla zkoumána syntéza molekuly H-(Ala)n-(Lys)m-OH, kde (Lys)m znamená pre-sekvenci s m rovným 1, 3 a 6. Byla použita verze syntézy na pevné fázi polyamidu s kontinuálním průtokem (Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137) na plně automatizovaném syntezátoru peptidů jak bylo popsáno dříve (Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270- 272) s použitím DMF jako rozpouštědla, trojnásobného přebytku Fmoc-alaninu a esterů Fmoc-lysin(tBoc)-pfp, a standardního odstranění ochranných skupin Fmoc 20 % piperidinem v DMF po dobu 10 minut. Doby reakce byly monitorovány pomocí Dhbt-OH, který se deprotonuje na žlutý aniont Dbht-O“, pokud jsou ještě přítomny neacylované aminoskupiny, a zmizení žluté barvy označuje konec syntézy. Po odštěpení peptidů z pryskyřice 95 % vodnou TFA byl produkt promyt etherem a analyzován HPLC. Výsledky pro m = 1 jsou popsány výše (obr. 1). V případě m = 3 je ze záznamu HPLC na obr. 3 vidět, že syntéza může pokračovat až kAlaio bez detekovatelných množství delečních peptidů nebo neúplného odstranění Fmoc. Když se však pokračuje v syntéze až k Ala20, chromatogram (obr. 4) ukazuje přítomnost delečních peptidů. Výsledky jsou ještě výraznější pro H-(Ala)n-(Lys)6-OH, kde se produkty bez detekovatelných delečních peptidů získají jak pro Alaio (obr. 5), tak i pro Ala2o (obr. 6). Navíc se doby reakcí drasticky sníží z až 30 hodin pro standardní reakce na < 2 hodiny pro jeden krok. Sekvence H-Ala20-OH byla dosud syntetizována metodologií Boc, ale byly získány vysoké hladiny delečních a inzerčních peptidů (Merrifield, R. B., Singer, J. a Chait, B. T. (1988), Anal. Biochem. 174, 399- 414). Presekvence Lys6, která je za převažujících podmínek syntézy zcela chráněna skupinou tBoc, má nejsilnější a nejpříznivější vliv na strukturu rostoucího peptidového řetězce, protože odstraňuje jinak velmi vážné potíže při syntéze způsobené nekompletním odstraňováním ochranných skupin a extrémně pomalou reakcí.
V souladu s těmito třemi překvapujícími objevy je předkládaný vynález založen na zavedení zvláštní pre-sekvence do C-koncové části připojené na pevný nosič.
To je zcela základní průlom proti pokusům podle dosavadního stavu techniky, kde byl kladen v případě nesnadno syntetizovatelných sekvencí důraz na podmínky reakce a povahu pevného nosiče.
Jak bude dále diskutováno níže, C-koncová sekvence, kterou je požadovaný peptid připojen na pevný nosič, by mohla také zahrnovat vhodné linkery (mezičlánky) pro dosažení například lepšího připojení nebo lepších podmínek pro odštěpení.
-7CZ 295838 B6
Předmětem vynálezu je způsob výroby peptidů
X-AAi-AA2.....AAn-Y, kde AA je zbytek L- nebo D-aminokyseliny, X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny, Y je OH, NH2 a n je celé číslo větší než 2, syntézou na pevné fázi, kde C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného reaktivního derivátu, v případě nutnosti s chráněným postranním řetězcem, je navázána na pevný nosič nebo polymer, případně prostřednictvím linkeru, potom zbavena Ν-α-ochranné skupiny, a následující aminokyseliny vytvářející sekvenci peptidu jsou postupně navazovány nebo navazovány jako peptidové fragmenty ve formě vhodně chráněných reaktivních derivátů nebo fragmentů, kde po vytvoření požadovaného peptidu je Ν-α-ochranná skupina z požadovaného peptidu odstraněna a peptid je odštěpen z pevného nosiče, který je charakterizován dále uvedenými kroky: zvolí se pre-sekvence tvořená 3 až 9 zbytky zvolenými nezávisle z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranního řetězce chráněnými v průběhu reakčních kroků a s faktorem náklonnosti Pa >0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ < 1,10, kde pre-sekvenci obsahuje C-koncová část uvedeného peptidu; a uvedená presekvence se z vytvořeného peptidu odštěpí.
L-aminokyseliny splňující výše uvedené limity pro faktory náklonnosti Pa a Ρβ jsou Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met a Gin.
Tyto aminokyseliny mají všechny funkční skupiny postranních řetězců ze skupiny karboxy, karboxamido, amino, hydroxy, guanidino, sulfid nebo imidazol.
Výhodné aminokyseliny v pre-sekvenci jsou Lys a Glu a jejich kombinace, například (Glu)q(Lys)p, kde p + q je 3 až 9, s výhodou 6 až 9, a pořadí Lys a Glu je zvoleno libovolně.
Ν-α-aminoskupina aminokyselin při každém vazebném kroku použitých peptidových fragmentů by měla být vhodně při reakci chráněna. Ochranná skupina může být Fmoc nebo Boc nebo jakákoliv jiná vhodná ochranná skupina, jako jsou například výše popsané skupiny podle odkazů Stewart, J. M. a Young, J. D., Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Company (1984), Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270- 272, Meldal, M., Bisgaard Holm, C., Boejesen, G., Havsteen Jakobsen, M. a Holm, A. (1993), Int. J. Peptide and Protein Res. 41, 250 - 260, McKenzie, A., Pirie, D. J. C. (1936), Berichte 69, 868, Knorr, E. (1904), Berichte 37, 3172, Peptides: Synthesis, structures and applications, Gutte, B., ed. Academie Press lne. 1995. Výhodnou ochrannou skupinou Ν-α-aminokyseliny je Fmoc.
Důležité je, aby byly funkční skupiny postranního řetězce v pre-sekvenci v průběhu reakčních kroků vhodně chráněny. Ochranné skupiny použitelné k tomuto účelu jsou odborníkovi v oboru dobře známy a výhodné skupiny se uvádějí v nárocích 7-12.
Aniž by si autoři přáli být vázáni náklonnou teorií, předpokládá se, že fyzikálně-chemické vlastnosti chráněného postranního řetězce pre-sekvence, jako například lysinu, jsou odpovědné za pozorovanou „peptidovou syntézu, při které napomáhá struktura“ („structural assisted peptide synthesis, SAPS“) snížením nebo odstraněním tvorby β-listu v polyalaninové sekvenci.
V případě jiných homo-oligo pre-sekvencí bylo pozorováno, že (Glu(tBu))6 stejně jako smíšená sekvence (Glu(tBu)Lys(tBoc))3 indukuje u polyalaninového řetězce výhodnou strukturu, což umožňuje vytvoření produktů bez delečních peptidů.
Pro zjištění, zdaje SAPS obecnější jev, nebo zdaje vlastní pouze homo-oligopeptidům jako je sekvence polyalanin, byly zkoumány směsné sekvence známéjako nesnadno syntetizovatelné.
Syntéza H-VQAAIDYING-OH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74 je dobře známá obtížná syntéza, která byla použita jako modelová reakce v řadě případů (Cameron, L. R., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun., 270 - 272). Při standardní syntéze byly pozorovány deleční peptidy speptidem des-Val (vrchol 2) jako převažujícím vedlejším produktem (viz příklad 7 a obr. 7).
Podle vynálezu byla syntetizována sekvence H-VQAAIDYING-K6-OH s použitím presekvence (Lys(tBoc))Ď připojené na C-konec materiálu pepsyn K. Syntéza probíhala za poskytnutí produktu se správnou molekulovou hmotností s vysokou čistotou a významně sníženým množstvím peptidu des-Val (viz příklad 8 a obr. 8).
Udává se, že další nesnadno syntetizovatelnou sekvencí je H-VNVNVQVQVD-OH, která byla syntetizována na řadě pryskyřic (polymer Rapp, PEG-PS, Pepsyn K, PEGA 199/300, PEGA 800/130 a PEGA 300/130), ve všech případech se značnou převahou glutaminu z Val1 kromě použití pryskyřice PEGA 1900/300 (Meldal, M. (1993), Peptides 1993; Schneider, C. H. a Eberle, A. N. (eds) 1993 ESCOM Science Publishers B. V., str. 61 - 62). Podle vynálezu probíhala syntéza H-VNVNVQVQVDK6-OH za získání produktů se správnou molekulovou hmotností. Ve spektru nebyly detekovány deleční peptidy (viz příklad 9).
Pro ověření dalšího důležitého hlediska předkládaného vynálezu, tj. snížených dob reakcí získaných zavedením pre-sekvence na C-koncové části požadovaného peptidu byly monitorovány reakční doby u jednotlivých aminokyselin při syntéze enkefalinu, H-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOH, s a bez pre-sekvence (Lys(tBoc))6 podle popisu v příkladu 15.
Výsledky měření ukazují, že reakční doby u této jinak nekomplikované syntézy efektivně probíhají v kombinaci se zvolenou pre-sekvencí.
Ve výše uvedených případech byly peptidové sekvence získány s hexalysinovou pre-sekvencí, která může být pro některé účely přijatelná nebo dokonce výhodná. Tak například β—list vytvářející sekvence mohou způsobovat vážné potíže s rozpustností, ale v případě H-Ala2o(Lys)6-OH se peptid změnil na rozpustný ve vodném roztoku, zatímco H-Alai0-Lys-OH se velmi rychle srážel z roztoků TFA při zředění vodou. V případě (Glu)6 může být využita rozpustnost poskytnutá presekvencí a větším množstvím karboxylových skupin. Například pro metodu ELISA, kde je možné místní připojení na povrch aktivovaný vhodnými aminoskupinami, protože je možná snadná aktivace ve vodném roztoku například karbodiimidem. Bylo také zvažováno, jakým způsobem mohou být tato pozorování využita pro praktickou syntézu peptidů bez přítomnosti pre-sekvence ve finálním produktu. Proto byly prováděny pokusy zavést mezi pre-sekvenci a cílový peptid, například pryskyřice-(Lys(tBoc)6-linker-peptid, linker umožňující odštěpení peptidu z linkeru standardními činidly jako je roztok TFA. Zavedení běžně používaného linkeru HMPA jak se popisuje níže v příkladu 10, pryskyřice-(Lys(tBoc))6-HMPA-Lys(tBoc)Alai0, však mělo jasně negativní vliv na syntézu H-Alai0-Lys-OH, protože vznikaly deleční peptidy (obr. 9). Vliv pre-sekvence na polyalaninovou strukturu je zřejmě ztracen v důsledku toho, že aromatická skupina v linkeru rozbijí strukturní efekt v peptidové kostře (Ala)n-(Lysm). Pro zachování strukturního efektu bylo zkoumáno zavedení opticky aktivního linkeru mezi (Ala)n a (Lys)m s použitím kyseliny 4-methoxymandlové (MMa) jako možného kandidáta. Tento typ linkeru pravděpodobně nebyl dosud použit. Předpokládá se, že přítomnost methoxylové skupiny umožní odštěpení cílového peptidu z linkeru pomocí standardních štěpících roztoků s obsahem TFA. Kyselina 4—methoxymandlová může být rozlišena na své opticky aktivní formy, z nichž konfigurace R ((+)-konfigurace) je identická s L-proteinovými aminokyselinami. Byly provedeny dva typy experimentů: (a) syntéza s použitím racemické kyseliny 4-methoxymandlové; (b) syntéza s použitím kyseliny R-4-methoxymandlové (R-MMa). Schéma syntézy je ukázáno níže (schéma 1) a dále ilustrováno v příkladech 11, 12, 13 a 14.
-9CZ 295838 B6
Schéma 1
OMe
(r¥- CONHCHzCH2NH-(A A)m-NHCO-CHOH
Fmoc-AAi-OH aktivace
OMe
1. Odstranění Fmoc (r)—CONHCH2CH7NH-(AA)ftl-NHCO-CH-OCO-CnR-NllFmoc
2. Vazba s 1. Fmoc-AA atd.
V prvním případě byla syntetizována sekvence pryskyřice-(Lys(tBoc))6-MMa-Lys-Alai0 pro získám H-Lys-Alaio-OH, kde lysinová skupina je zavedena pro zvýšení rozpustnosti ve vodném roztoku pro analýzu HPLC. Výsledky analýzy HPLC jsou uvedeny v obr. 10. Bylo dosaženo mnohem lepšího produktu než v případě linkeru HMPA (obr. 9 a příklad 10), ačkoliv jsou přítomny deleční peptidy. V případě (b) byl syntetizován stejný peptid za stejných podmínek a došlo k vytvoření peptidu bez detekovatelných delečních peptidů nebo neúplného odstranění skupiny Fmoc. Tyto výsledky mohou být porovnány se syntézou H-Lys-Alaio-OH s použitím konstruktu pryskyřice-MMa-Lys-Alaio, kde je vynechána pre-sekvence (Lys)tBoc))6. Jsou vidět významná množství delečních peptidů.
Podle uvedených pozorování se další hledisko předkládaného vynálezu týká způsobu syntézy peptidů na pevné fázi popsaného výše vyznačujícího se dalším lysém, tj. že mezi pre-sekvenci připojenou k nosiči a požadovanou peptidovou sekvenci AAi-AAn je vložen linker, který umožňuje selektivní odštěpení uvedené sekvence. S výhodou je linker opticky aktivní. Použitelná skupina linkerů jsou α-hydroxy a α-aminokyseliny obecného vzorce
X —C —COOHZ
R2 kde X je OH nebo NH2 a R1 a R2 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, Ci_3alkyl, fenyl a substituovaný fenyl, kde substituenty jsou jeden nebo více substituentů schopných darovat elektron, například zvolené ze skupiny Ci_3alkoxy, Ci_3alkyl nebo jsou spojeny dvě vicinální skupiny substituentů za vytvoření 5- nebo 6-členného kruhu spolu s atomy uhlíku, ke kterému jsou připojeny.
Nejvýhodnějšími linkery jsou racemická kyselina 4-methoxymandlová, kyselina (+)^4-methoxymandlová, difenylglycin a kyselina glykolová.
Je třeba rozumět, že jestliže X je OH, produktem vytvořeným po štěpení bude peptid AAi-AAn-OH, tj. Y = OH, zatímco v případě kde X je NH2 bude vytvořen amid peptidu AAi-AAn-NH2, tj.
Y = NH2.
-10CZ 295838 B6
V ještě dalším provedení vynálezu se vloží mezi pre-sekvenci navázanou na nosič a sekvenci AAj-AAn první linker, a mezi pre-sekvenci a pevný nosič se vloží druhý linker, s ortogonálními podmínkami štěpení vzhledem k prvnímu linkeru, umožňujícími selektivní odštěpení druhého linkeru, např. působením kyseliny trifluoroctové (TFA), kyseliny trifluormethansulfonové (TFMSA), HBr, HC1, HF, nebo báze jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid, za poskytnutí požadovaného peptidu AA]-AAn navázaného na pre-sekvenci prostřednictvím uvedeného prvního linkeru, který se potom od pre-sekvence popřípadě odštěpí.
Při syntéze na pevné fázi způsobem podle vynálezu se mohou používat činidla využívající jeden nebo více z výše popsaných znaků týkajících se pre-sekvencí a linkerů.
První takové činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi může mít obecný vzorec
X-AA' J-... .-AA'm-Y!-R, kde R je pevný nosič použitelný při syntéze peptidů na pevné fázi, Yi je aminokyselinová sekvence obsahující od 3 do 9, s výhodou od 5 do 7 zbytků aminokyselin nezávisle zvolených z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranních řetězců chráněnými při krocích reakce a s faktory náklonnosti Pa > 0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ < 1,10, například Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met nebo Gin, nebo odpovídajících D-aminokyselin, AA' je zbytek Lnebo D-aminokyseliny, m je 0 nebo celé číslo od 1 do 40 a X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny.
Druhé takové činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi může mít obecný vzorec
X-AA'1-....-AA'ra-Li-Yi-R, kde X, AA', m, Yi a R jsou jak definováno výše a Li je s výhodou opticky aktivní linker, který umožňuje selektivní odštěpení vazby na AA'm.
Výhodné linkery jsou α-hydroxy nebo a-aminokyseliny jak je popsáno výše.
Třetí takové činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi může mít obecný vzorec
X-AA' i- -AA^-Lj-Yj-Lr-R, kde X, AA', m, Yb R a Li jsou jak definováno výše a L2 je linker, umožňující selektivní odštěpení z pevného nosiče.
Čtvrté takové činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi může mít obecný vzorec
X-AA'!-....-AA'm-Yi-L2-R, kde X, AA', m, Yb R a L2 je jak definováno výše.
Je zřejmé, že výše uvedená činidla mohou být ve formě polymerů, gelů nebo jiných pevných fází připravených pro syntézu peptidů na pevné fázi podle vynálezu tím, že
a) obsahují pre-sekvenci a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (první hledisko) nebo
b) obsahují pre-sekvenci, s výhodou opticky aktivní Štěpící linker a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (druhé hledisko) nebo
c) obsahují druhý linker umožňující odštěpení z nosiče, pre-sekvenci, první s výhodou opticky aktivní linker umožňující odštěpení a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (třetí hledisko) a
d) obsahují linker umožňující odštěpení z nosiče, pre-sekvenci a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (čtvrté hledisko).
-11 CZ 295838 B6
Konkrétní podmínky použité při experimentech, na kterých je vynález založen, jsou uvedeny níže mezi obecnými postupy.
Obecně řečeno, bez ohledu na nové a charakteristické rysy týkající se pre-sekvence a nových linkerů pro štěpení může být způsob podle vynálezu prováděn za tradičních podmínek syntézy peptidů na pevné fázi popsaných v literatuře uváděné v části Dosavadní stav techniky.
Může však být vhodný následující krátký souhrn.
Skupiny Fmoc mohou být odstraněny působením aminu jako je piperidin nebo diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU).
Ochranné skupiny postranního řetězce mohou být odstraněny kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), HBr, HC1 nebo HF.
Pevný nosič se s výhodou volí z funkcionalizovaných pryskyřic jako je polystyren, polyakrylamid, polyethylenglykol, celulóza, polyethylen, latex nebo dynabeads.
V případě potřeby mohou být navázány C-koncové aminokyseliny na pevný nosič běžným linkerem jako je 2,4~dimethoxy-4'-hydroxybenzofenon, kyselina 4-(4~hydroxy-methyl-3-methoxyfenoxyj-máselná (HMPB), kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, kyselina 4-hydroxymethylfenoxyoctová (HMPA), kyselina 3-(4-hydroxymethylfenoxy)propionová nebo kyselina p[(R,Sý-a[l-(9H-fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-fenoxyoctová(AM).
Syntéza může být prováděna vsádkovým způsobem nebo kontinuálně na automatickém nebo poloautomatickém syntezátoru peptidů.
Jednotlivé reakční kroky mohou být prováděny v přítomnosti rozpouštědla, například zvoleného ze skupiny acetonitril, Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), N-methylpyrrolidon (NMP), dichlormethan (DCM), trifluorethanol (TFE), ethanol, methanol, voda, směsi uvedených rozpouštědel s nebo bez dalších látek jako jsou chloristany nebo ethylenkarbonáty.
Jednotlivé vazby mezi aminokyselinami, aminokyselinou a dříve vytvořenou peptidovou sekvencí nebo peptidovým fragmentem a dříve vytvořenou peptidovou sekvencí mohou být prováděny běžnými kondenzačními způsoby jako je azidová metoda, metoda směsného anhydridu kyseliny, metoda symetrického anhydridu, karbodiimidová metoda, metoda aktivního esteru jako je pentafluorfenyl (Pfp), 3,4—dihydro-4—oxobenzotriazm-3-yl (Dhbt), benzotriazol-l-yl (Bt), 7-azabenzotriazol-l-yl (At), 4-nitrofenyl, imidoestery kyseliny N-hydroxyjantarové (NHS), chloridy kyselin, fluoridy kyselin, aktivace in šitu činidly jako O-(7-azábenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HATU), O-(benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HBTU), O-(benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorborát (TBTU) nebo benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexafluorfosfát (BOP).
Vytvořený peptid může být odštěpen od nosiče kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBR), chlorovodík (HC1), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid.
Alternativně se peptid odštěpuje od nosiče fotolýzou.
Při provedení, kdy je linker, vložen mezi pre-sekvenci připojenou na nosič a sekvenci AA]-AAn umožňující selektivní odštěpení uvedené sekvence, může být uvedené štěpení prováděno kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBR), chlorovodík (HC1), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid.
-12CZ 295838 B6
Syntéza peptidu uskutečňovaná s pomocí sekvence (SAPS)
Postupy experimentů:
Syntéza peptidů
Obecné postupy
Přístroje a strategie syntézy
Peptidy byly syntetizovány buď vsádkovým způsobem v polyethylenové nádobě opatřené polypropylenovým filtrem pro filtraci, nebo kontinuální průtokovou verzí metody na pevné fázi polyamidu (Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137) na plně automatickém syntezátoru peptidů (Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270 - 272) s použitím 9-fluorenylmethyloxykarbonylu (Fmoc) nebo tercbutyloxykarbonylu (Boc) jako Ν-α-aminových ochranných skupin a vhodných společných ochranných skupin pro funkční skupiny postranních řetězců.
Rozpouštědla
Rozpouštědlo DMF (Ν,Ν-dimethylformamid, Riedel de-Haen, Německo) bylo čištěno průchodem přes kolonu naplněnou silnou kationtovou iontoměničovou pryskyřicí (Lewatit S 100 MB/H silně kyselá, Bayer AG Leverkusen, Německo) a analyzováno na přítomnost volných aminů před použitím přídavkem 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazinu (Dhbt-OH), který poskytuje žluté zbarvení (aniont Dbht-O”) v přítomnosti volných aminů. Rozpouštědlo DCM (dichlormethan pro analýzu, Riedel de-Háen, Německo) byl přímo použit bez čištění.
Aminokyseliny
Aminokyseliny chráněné Fmoc a odpovídající pentafluorfenyl (Pfp) estery byly získány od firmy MilliGen, UK, NovaBiochem, Švýcarsko a Bachem, Švýcarsko a Dhbt-estery od firmy NovaBiochem, Švýcarsko s vhodně chráněnými postranními řetězci. Aminokyseliny chráněno Boc byly zakoupeny u firmy Bachem, Švýcarsko.
Vazebná činidla
Vazebné činidlo diizopropylkarbodiimid (DIC) bylo zakoupeno u firmy Riedel de-Haen, Německo a před použitím destilováno; dicyklohexylkarbodiimid (DCC) byl pořízen u firmy Merck-Schuchardt, Mnichov, Německo a čištěn destilací, O-benzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborát (TBTU) byl získán od firmy PerSeptive Biosystems GmbH Hamburk, Německo.
Linkery
Linkery HMPA, Novabiochem, Švýcarsko; kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, NovaBiochem; kyselina 4-methoxymandlová, Aldrich, Německo; HMPB, NovaBiochem; AM, NovaBiochem; kyselina 3-(4-hydroxymethylfenoxy)propionová, NovaBiochem, byly navázány na pryskyřici ve formě předem vytvořeného 1-hydroxybenzotriazolového (HObt) esteru vytvořeného pomocí DIC. Racemická kyselina 4-methoxymandlová (98 % čistoty, Aldrich, Německo) byla použita přímo jako linker nebo rozdělena působením (+)-cinchoninu (čistota 85 %, Aldrich, Německo) za poskytnutí opticky aktivního linkeru kyseliny (+)—4-methoxymandlové, [a]20 = + 146 (voda) s95,8% opticky čistotou a kyselina (-)-4-methoxymandlová, [a]20 = -128,6 (voda) s 88,1% optickou čistotou.
Rozdělení kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové (A. McKenzie, D. J. C. Pirie, McKenzie, A., Pirie, D. J. C. (1936), Berichte 69, 868; Knorr, E. (1904), Berichte 37, 3172)
-13 CZ 295838 B6
Kyselina (+/-)-4-methoxymandlová (10 g, 54,89 mmol; Aldrich 98 %) byla rozpuštěna v 500 ml horké vody (60 až 80 °C) a roztok byl dekantován za stálého zahřívání pro odstranění nerozpustných nečistot. Do horkého roztoku byl po malých částech přidán (+)-cinchonin (16,16 g, 54,89 mmol, Aldrich, 85 %, [a]D 20 = + 211° (podle literatuiy + 228°). Roztok se vyčeřil po 15 minutách míchání při 60 až 80 °C a byl ochlazen v ledu. Po 1 h byla sraženina shromážděna filtrací a sušena v exikátoru přes noc za získání 9,9 g cinchoninové soli. Sůl byla rekrystalizována z vařiči vody (80 ml), roztok byl za zahřívání dekantován a potom ochlazen v ledu. Sraženina byla oddělena filtrací po 1 hodině, třikrát promyta studenou vodou a sušena přes noc v exikátoru za získání 7,84 g (16,45 mmol). Cinchoninová sůl (2 g, 4,2 mmol) byla rozpuštěna ve 40 ml 2N HC1 a ihned extrahována 3 x 30 ml diethyletheru. Etherová fáze byla sušena nad Na2SO4 a odpařena dosucha za získání 0,55 g kyseliny 4-methoxymandlové. Optická čistota uvolněné kyseliny 4-methoxymandlová byla odhadnuta na 18,5 % ([a]D20 = + 100,8°). Třetí rekrystalizací byla získána optická čistota 95,8 % ([a]D20 = + 140,0°).
Pevné nosiče
Peptidy syntetizované strategií Fmoc byly syntetizovány na třech různých typech pevných nosičů s použitím koncentrací Fmoc-chráněné aktivované aminokyseliny v DMF 0,05M nebo vyšší. 1) PEG-PS (polyethylenglykol naroubovaný na polystyren; pryskyřice TentaGel S NH2, 0,27 mmol/g, Rapp Polymere, Německo nebo pryskyřice NovaSyn TG, 0,29 mmol/g, Novabiochem, Švýcarsko); 2) PepSyn Gel (polydimethylakrylamidová pryskyřice funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu, 1,0 mmol/g; MilliGen, UK); 3) PepSyn K (polydimethylakrylamidová pryskyřice na křemelinovém nosiči funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu, 0,11 mmol/g; MilliGen, UK).
Peptidy syntetizované strategií Boc byly syntetizovány na Merrifieldově pryskyřici (polystyrendivinylbenzen) s připojenou první aminokyselinou (Novabiochem, Švýcarsko).
Katalyzátory a jiné reagencie
Diizopropylethylamin (DIEA) byl získán od firmy Aldrich, Německo a ethylendiamin od firmy Fluka, Švýcarsko, piperidin od firmy Riedel de-Haen, Frankfurt, Německo. 4-(N,N-dimethylamino)pyridin (DMAP) byl získán od firmy Fluka, Švýcarsko a použit jako katalyzátor při vazebných reakcích s účastí symetrických anhydridů. 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3benzotriazin (Dhbt-OH) byl získán od firmy Fluka, Švýcarsko a 1-hydroxybenzotriazol (HObt) od firmy NovaBiochem, Švýcarsko.
Postupy provádění vazby
První aminokyselina byla navázána jako symetrický anhydrid v DMF vytvořený znáklonné N-a-chráněné aminokyseliny a DIC. Následující aminokyseliny byly navázány jako Pfp- nebo Dhbt-estery nebo jako předem vytvořené HObt estery vyrobené z vhodných N-a-chráněných aminokyselin a HObt pomocí DIC nebo TBTU v DMF. V případě Fmoc byly všechny acylace kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C pro zabránění odštěpení ochranné skupiny Fmoc při testu (Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1-9).
Odstranění Ν-α-aminové ochranné skupiny
Odstranění ochranné skupiny Fmoc bylo provedeno působením 20 % piperidinu v DMF (1 x 3 a 1 x 7 min při syntéze vsádkovým způsobem) nebo průtokem rozpouštědla odstraňujícího ochranné skupiny přes pryskyřici (10 min, průtok 1 ml/min při kontinuální syntéze) s následným promýváním DMF, dokud již nebylo možno detekovat žlutou barvu (Dhbt-O_) po přídavku Dhbt-OH od odtékajícího DMF.
-14CZ 295838 B6
Odstranění skupiny Boc bylo prováděno působením 50 % TFA vDCM (obj.) 1 x 1,5 min a 1 x 20 min s následným promytím 6 x 9 min vždy DCM, neutralizací 10 % triethylaminem v DCM (obj.) vždy 2 x 1,5 min a s následným promytím 6x9 min DCM.
Odštěpení peptidu z pryskyřice kyselinou
Peptidy byly oddělovány z pryskyřic působením 95 % kyseliny trifluoroctové (TEA, Halocarbon Products Corporation, USA; Biesterfeld & Co. Hamburk, Německo) ve vodě (obj.) při pokojové teplotě 2 hodiny. Odfiltrované pryskyřice byly promyty 95 % směsí TFA-voda a filtráty a promývací roztoky odpařeny za sníženého tlaku. Zbytek byl promyt etherem a lyofílizován ze směsi kyselina octová - voda. Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a identifikován metodou matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOF MS) nebo hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrorozprašováním (ESMS).
Štěpení peptidu z pryskyřice pomocí báze
Sušená pryskyřice (1 g) byla smísena s 1M hydroxidem sodným (10 ml) při 4 °C a ponechána 15 min při teplotě místnosti. Pryskyřice byla zfíltrována do láhve s obsahem 10% vodné kyseliny octové. Peptid byl izolován lyofílizací a gelovou filtrací.
Odštěpení peptidu z pryskyřice TFMSA
Sušená pryskyřice (250 mg) byla vložena do kulové baňky s míchací tyčinkou. Byla přidána směs thioanisol/ethandithiol (2:1, 750 μΐ), směs byla ochlazena v ledu, bylo přidáno 5 ml TFA a směs byla míchána 5 až 10 minut. Po kapkách byla přidána TFMSA (500 μΐ) a reakce pokračovala při teplotě místnosti 30 až 60 minut. Peptid se vysrážel přidáním etheru.
Odstranění ochranných skupin z postranních řetězců
Ochranné skupiny se odstraňují z postranních řetězců s výhodou při odštěpování peptidu z pryskyřice.
Předem vytvořený HObt-ester
Metoda a. 3 ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny byly rozpuštěny v DMF spolu s 3 ekv. HObt a 3 ekv. DIC. Roztok byl ponechán při pokojové teplotě 10 min a potom přidán k pryskyřici, která byla promyta roztokem 0,2 % Dhbt-OH v DMF před přídavkem předem aktivované aminokyseliny.
Metoda b. 3 ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny byly rozpuštěny v DMF spolu s 3 ekv. HObt, 3 ekv. TBTU a 4,5 ekv. DIEA. Roztok byl ponechán při teplotě místnosti 5 min a potom přidán k pryskyřici.
Předem vytvořený symetrický anhydrid ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny bylo rozpuštěno v DCM a ochlazeno na 0 °C. Byl přidán DCC (3 ekv.) a reakce pokračovala 10 minut. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a zbytky rozpuštěny v DMF. Roztok byl zfiltrován a ihned přidán k pryskyřici s následným přidáním 0,1 ekv. DMAP.
Odhad výtěžku vazby první Ν-α-amino chráněné aminokyseliny
K 3 až 5 mg suché Fmoc-chráněné sloučeniny peptid - pryskyřice bylo přidáno 5 ml 20% piperidinu v DMF v průběhu 10 min při teplotě místnosti a při 301 nm byla odhadována UV absorpce aduktu dibenzofulven-piperidin. Výtěžek byl stanoven s použitím vypočteného koeficientu e30i vztaženého ke standardu Fmoc-Ala-OH.
- 15CZ 295838 B6
V případě ochrany Boc byl výtěžek vazby určován ninhydrinovou metodou po odstranění skupiny Boc (Sarin, V. K., Kent, S. B. H., Tam, J. P. a Merrifield, R. B. (1981), Anal. Biochem., 117, 147- 157).
Syntéza peptidů na pryskyřici PepSyn K
Suchá pryskyřice PepSyn K (přibližně 500 mg) byla přelita ethylendiaminem a ponechána při teplotě místnosti přes noc. Pryskyřice byla odsáta a promyta 10 x 15 ml DMF, vždy 5 minut. Po odtažení byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF (obj.) (2x15 ml, vždy 5 min) a nakonec promývána DMF, dokud již nemohlo být detekováno přídavkem Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. 3 ekv. HMPA, 3 ekv. HObt a 3 ekv. DIC byly rozpuštěny v 10 ml DMF a ponechány 10 min aktivovat; potom byla směs přidána k pryskyřici a vazba probíhala 24 hodin. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 minut) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Byla navázána první aminokyselina a ochrana postranního řetězce byla provedena symetrickým anhydrinem (viz výše); výtěžky reakce byly testovány jak bylo popsáno výše. Ve všech případech byly vyšší než 70 %. Syntéza potom pokračovala buď kontinuálně, nebo vsádkově, jak bude popsáno dále.
Kontinuální syntéza na pryskyřici PepSyn K použitím techniky kontinuálního průtoku
Pryskyřice (přibližně 500 mg) s připojenou první aminokyselinou byla vložena do kolony připojené na plně automatický syntezátor peptidů. Skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány ve formě chráněné Fmoc, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, estery Pfp (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Ukončení každé reakce bylo automaticky určováno monitorováním zmizení žlutého zbarvení aniontu Dhbt-OH spektrofotometricky. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s navázaným peptidem promyta DMF (průtok 1 ml/min, 10 min), DCM (vždy 3 min, 3 x 5 ml) a nakonec diethyletherem (3x5 ml), vyjmuta z kolony a sušena ve vakuu.
Pokračování vsádkové syntézy peptidů na pryskyřici PepSyn K
Pryskyřice (přibližně 500 mg) s navázanou první aminokyselinou byla vložena do polyethylenové nádoby opatřené polypropylenovým filtrem a byla odstraněna skupina Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako předem vytvořené, Fmocchráněné, v případě potřeby s chráněnými postranními řetězci, HObt estery (3 ekv.) v DMF (5 ml) vyrobené jak bylo popsáno výše. Vazebné reakce pokračovaly 2 h, pokud není uvedeno jinak. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Všechny acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (5x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem (5x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.
Vsádková syntéza peptidů na PEG-PS
Pryskyřice TentaGel S NH2 nebo NovaSyn TG (250 mg, 0,27 - 0,29 mmol/g) byla vložena do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem. Pryskyřice byla ponechána bobtnat v DMF (5 ml) a byla smísena s 20% piperidinem v DMF pro zajištění přítomnosti neprotonovaných aminoskupin na pryskyřici. Pryskyřice byla odsáta a promývána DMF, dokud nemohlo být detekováno po přídavku Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. Byla provedena reakce HMPA (3 ekv.) jako předem vytvořeného esteru HObt jak bylo popsáno výše a reakce byla ponechána probíhat 24 h. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x5 ml, vždy 5 min) a acylace byla zkontrolována ninhydrinovým testem. První aminokyselina byla navázána ve formě předem vytvořeného symetrického anhydridu jak bylo popsáno výše. Vazebné výtěžky prvních aminokyselin chráněných Fmoc byly určovány výše popsaným způsobem. Ve všech případech byly lepší než 60 %. Následující aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako předem vytvořené, Fmocchráněné, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, estery HObt (3 ekv.) jak bylo popsáno výše. Vazebné reakce pokračovaly 2 hodiny, pokud není uvedeno jinak. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x5 ml, vždy 5 min) pro odstranění nadbytku činidla. Všechny acylace
-16CZ 295838 B6 byly kontrolovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C. Po ukončené syntéze byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (3x5 ml, vždy 5 min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.
Vsádková syntéza peptidů na gelu PepSyn
Sušená pryskyřice PepSyn Gel (500 mg, 1 mmol/g) byla vložena do polyethylenové nádoby opatřené polypropylenovým fdtrem. Pryskyřice byla ponechána bobtnat v ethylendiaminu (15 ml) a byla mírně míchána třepáním 20 hodin. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 min). Po odsátí byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF (obj.) (2x15 ml, vždy 5 min) a nakonec promyta DMF (5 x 15 ml, vždy 5 min), až již nebylo detekováno po přidání Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. HMPA (3 ekv.) byla navázána jako předem aktivovaný ester HObt jak bylo popsáno výše (metoda a) a vazba pokračovala 24 h. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x15 ml, vždy 5 min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. První aminokyselina byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše. Vazebné výtěžky pro první aminokyseliny chráněné Fmoc byly odhadnuty jak bylo popsáno výše. Ve všech případech byly lepší než 70 %. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako předem vytvořené estery HObt (3 ekv.) chráněné Fmoc, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, jak bylo popsáno výše (metoda a). Vazby pokračovaly 2 hodiny a v případě potřeby ještě přes noc. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x5 ml, vždy 5 min) pro odstranění nadbytku činidla. Všechny acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (3x15 ml, vždy 5 min), DCM (3x15 min, vždy 2 min) a nakonec diethyletherem (3x15 ml, vždy 2 min) a sušena ve vakuu.
Podmínky HPLC
HPLC byla prováděna na přístroji Waters 600 E opatřeném detektorem Waters 996 Photodiode array detector s kolonou Waters Radial Pak 8 x 100 mm Ci8 s reverzní fází. Pufr A byl 0,1 objemových procent TFA ve vodě a pufr B 90 obj. procent acetonitrilu, 9,9 obj. % vody a 0,1 obj. % TFA. Pufry byly čerpány přes kolonu s průtokem l,5ml/min s použitím gradientu: 1. Lineární gradient od 0 do 70 % B (20 min), lineární gradient od 70 do 100 % B (1 min), izokraticky 100 % B (5 min). 2. Izokraticky 0 % B (2 min), lineární gradient od 0 do 50 % B (23 min), lineární gradient od 50 do 100 % B (5 min), izokraticky 100 % B (5 min).
Hmotnostní spektroskopie
Hmotnostní spektra typu matrix assisted laser desorbtion ionization time-of-flight (MALDI TOF) byla získávána na přístroji Fisons TofSpec E. Hmotnostní spektra s elektrorozprašovací ionizací byla získávána na přístroji Finnigan Mat LCQ opatřeném elektrorozprašovací (ESI) sondou (ES-MS).
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 je záznam HPLC surového H-Ala10-Lys-OH ukazující podstatná množství delečních peptidů (vrcholy 1, 2, 3 a 4) a peptidů s neúplně odstraněným Fmoc (vrcholy 6, 7, 8 a 9) v přítomnosti cílového peptidu (vrchol 5).
Obr. 2 je diagram znázorňující postupné doby reakce pro každý zalaninů při syntéze H-AlaioLys-OH.
Obr. 3 je záznam HPLC H~Alaio-Lys3-OH ukazující cílový peptid. Nebyly pozorovány deleční peptidy.
-17CZ 295838 B6
Obr. 4 je záznam HPLC H-Ala20-Lys3-OH ukazující deleční peptidy (vrcholy 1, 2, 3, 4 a 5) mimo cílového peptidů (vrchol 6).
Obr. 5 je záznam HPLC H-Alai0-Lys6-OH. Nejsou vidět žádné deleční peptidy.
Obr. 6 je záznam HPLC H-Ala2o-Lys6-OH. Nejsou vidět žádné deleční peptidy.
Obr. 7 je záznam HPLC H-VQAAIDYING-OH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74. Cílový peptid (vrchol 3) je doprovázen delečními peptidy (vrchol 2 patří peptidů des-Val).
Obr. 8 je záznam HPLC H-VQAAIDYING-K6-OH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74 navázaný na pre-sekvenci Lys(Boc)6 s přítomností pouze malého množství peptidů des-Val (vrchol 1).
Obr. 9 je záznam HPLC H-Alai0-Lys-OH vyrobeného přidáním linkeru HMPA. Je vidět několik delečních peptidů (z Alai0-Lys(tBoc)-HMPA-(Lys(tBoc))6-pryskyřice).
Obr. 10 je podobný záznam HPLC H-Alai0-Lys-OH vyrobeného použitím linkeru MMa. Je vidět podstatné snížení množství delečních peptidů ve srovnání s obr. 9 (z Ala]0-LysMMa-(Lys(tBoc))6-pryskyřice).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza H-Ala10-Lys-OH (srovnání)
Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že jde o komplikovanou směs obsahující cílový peptid (n = 10) i deleční peptidy odpovídající n = 6, 7, 8 a 9 a deleční peptidy, u kteiých byla skupina Fmoc stále připojena na N-konec s n = 6, 7, 8, popřípadě 9. Identita jednotlivých peptidů byla potvrzena metodou MALDI TOF MS.
Příklad 2
Syntéza H-Alai0-Lys3-OH
Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenníbez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 91,0 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 3). Identita peptidů byla potvrzena použitím metody MALDI TOF MS.
Příklad 3
Syntéza H-Ala]0-Lys6-OH
500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.
Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenníbez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 90,9 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 5). Identita peptidů byla potvrzena ES MS.
Příklad 4
Syntéza H-Ala2o-Lys3-OH
- 18CZ 295838 B6
500 mg Fmoc-Ala10-(Lys(Boc))3 pryskyřice PepSyn KA (ze syntézy H-Alai0-Lys3-OH) bylo použito pro syntézu metodou kontinuálního průtoku.
Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Alan-Lys3-OH (n = 20) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 19, 18, 17 a 16 (viz obr. 4). Sekvence chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena ESMS.
Příklad 5
Syntéza H-Ala20-Lyse-OH
500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.
Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, zeje homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 91,4 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 6). Identita peptidu byla potvrzena ES MS.
Příklad 6
Syntéza H-Ala20-Lys-(Glu-Lys)3-OH
500 mg pryskyřice Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu metodou kontinuálního průtoku.
Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC. Bylo zjištěno, že čistota je lepší než 98 % bez přítomnosti delečních a Fmoc-chráněných sekvencí. Výtěžek 97 %. Identita peptidu byla potvrzena ES MS.
Příklad 7
Syntéza úseku 65 - 74 Acyl Carrier Protein (ACP), H-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-AsnGly-OH (srovnání)
500 mg Fmoc-Gly pryskyřice PepSyn KA (0,074 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.
Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílovou molekulu doprovázenou přibližně 16 % peptidu des-Val. Identita peptidů byla potvrzena technikou MALDITOF MS.
Příklad 8
Syntéza úseku 65 - 74 Acyl Carrier Protein (ACP), H-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-AsnGly-Lys6-OH s použitím pre-sekvence (Lys(Boc))6
500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.
Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid s vysokou čistotou (~ 95 %) s podstatně sníženým množstvím peptidu des-Val. Identita peptidů byla potvrzena technikou MALDI TOF MS.
Příklad 9
Syntéza H-Val-Asn-Val-Asn-Val-Gln-Val-Gln-Val-Asp-Lyse-ΟΗ s použitím pre-sekvence (Lys(Boc))6
-19CZ 295838 B6
500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.
Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že má čistotu lepší než 90 %) bez delečních peptidů a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 100 %. Identita peptidů byla potvrzena technikou MALDITOF MS.
Příklad 10
Syntéza H-Alai0-Lys-OH s použitím (Lys(Boc))6 jako pre-sekvence a HMPA jako linkeru (H-Ala]0-Lys(Boc)-OCH2-PhOCH2CO-(Lys(Boc))6-NHCH2CH2NH PepSyn K)
500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo překryto ethylendiaminem (5 ml) a ponecháno při teplotě místnosti přes noc. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 min). Po odsátí byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF obj. (2x15 ml, vždy 5 min) a nakonec DMF, až již nebylo detekováno po přídavku Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. Derivatizovaná pryskyřice byla použita pro syntézu technikou kontinuálního průtoku.
Prvních 6 lyzinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno ve formě esterů Fmoc-Lys(Boc)-Pfp (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl určován automaticky jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odštěpena jak bylo popsáno výše. Po ukončení byla na vrchol kolony nanesena pre-sekvence 3 ekv. navázaná na HMPA ve formě předaktivovaného esteru HObt jak bylo popsáno výše. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odstraněn pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. Příští aminokyselina podle sekvence byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše nanesený na vrchol kolony spolu s 0,1 ekv. DMAP a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min. Nadbytek reagencie byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku vazby, který byl odhadnut jak bylo popsáno dříve; byla zjištěna hodnota 84 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako estery Pfp (3 ekv.) chráněné Fmoc, popřípadě s chráněným postranním řetězcem, za přidávání Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl automaticky určen jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice speptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min), odstraněna z kolony a sušena ve vakuu. Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše.
Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Alan-Lys-OH (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 9, 8, 7 a 6 (viz obr. 9). Sekvence chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena metodou MALDI TOF MS.
Příklad 11
Syntéza H-Alai0-Lys-OH s použitím kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Ala10-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CONHCH2CH2NH PepSyn K)
500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo smíseno s ethylendiaminem jak bylo popsáno výše. Derivatizovaná pryskyřice byla použita pro syntézu metodou kontinuálního průtoku. Na vrchol kolony bylo naneseno 10 ekv. kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové, 10 ekv. HObt a 10 ekv. DIC rozpuštěné v 5 ml DMF, předaktivované 10 min a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. První aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a nanesena na vrchol kolony spolu s 0,1 ekv. DMAP a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min. Potom byl nadbytek
-20CZ 295838 B6 reagencie odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Byl odebrán malý vzorek pryskyřice pro kontrolu výtěžku reakce, který byl testován podle výše uvedeného popisu; byl zjištěn výtěžek 75 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako estery Pfp chráněné Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl určován automaticky jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem, odstraněna z kolony a sušena ve vakuu.
Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno dříve a lyofilizován z roztoku kyselina octová - voda.
Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Alan-Lys-OH (n = 10) spolu s delečními peptidy odpovídajícími n = 9, 8, 7 a 6. Identita peptidů byla potvrzena MALDI TOS MS.
Příklad 12
Syntéza H-Alai0-Lys-OH s použitím (Lys(Boc))6 jako pre-sekvence a kyseliny (+/-)-4methoxymandlové jako linkeru (H-Alai0-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Lys(Boc))6NHCH2CH2NH PepSyn K)
500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo smí seno s ethylendiaminem jak bylo popsáno výše. Derivatizovaná pryskyřice byla použita pro syntézu způsobem kontinuálního průtoku. Prvních šest lysinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako estery Pfp (3 ekv.) chráněné Fmoc a s chráněnými postranními řetězci za přídavku Dhbt-IH (1 ekv.). Konec každé reakce byl automaticky stanoven jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odštěpená jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy pre-sekvence bylo navázáno 10 ekv. kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové ve formě předaktivovaného esteru HObt jak bylo popsáno výše a naneseno na vrchol kolony. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a nanesena na vrchol kolony Spolu s (0,1 ekv.) DMAP. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Byl odebrán malý vzorek pryskyřice pro kontrolu výtěžku reakce, který byl zjištěn výše popsaným způsobem jako 68 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako estery Píp chráněné Fmoc (3 ekv.) za přídavku Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl automaticky určován jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, průtok 1 ml/min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, průtok 1 ml/min), vyjmuta z kolony a sušena ve vakuu. Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše a lyofilizován ze směsi kyselina octová - voda. Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Alan-Lys-OH (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 9, 8, 7 a 6. Bylo zjištěno, že množství delečních peptidů je výrazně sníženo ve srovnání s příklady 10 a 11 (viz obr. 10). Sekvence chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena metodou MALDI TOF MS.
Příklad 13
Syntéza H-Alai0-Lys-OH s použitím (Lys(Boc))6 jako pre-sekvence a kyseliny (+)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Alai0-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Lys(Boc))6-NHCH2CH2NH PepSyn K)
500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo vloženo do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým a byl přidán ethylendiamin jak bylo popsáno výše. Prvních šest lysinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako Pfp estery chráněné Fmoc a s chráněnými postranními
-21 CZ 295838 B6 řetězci (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Po ukončení pre-sekvence reagovala pryskyřice s navázaným peptidem s odstraněnými ochrannými skupinami s 10 ekv. kyseliny (+)-4—methoxymandlové ve formě předaktivovaného HObt-esteru jak bylo popsáno výše (dělení výše popsaným způsobem, 95,8 % optické čistoty) a vazebná reakce pokračovala 24 hodin. Nadbytek činidla byl odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a reakce pokračovala 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku reakce, kteiý byl určen výše popsaným způsobem jako 66 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc výše popsaným způsobem.
První alanin byl navázán jako ester Pfp chráněný Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (průtok 1 ml/min 12 min) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem při 80 °C. Skupina Fmoc byla potom odstraněna působením 2 % piperidinu v DMF (obj.) (1 min, průtok 1 ml/min) s následným promytím DMF (10 s, průtok 10 ml/min), 0,2 % Dhbt-OH v DMF (20 min, průtok 1 ml/min) a nakonec DMF (2x5 ml, vždy 1 min). Následující alanin chráněný Fmoc byl ihned navázán jako ester Pfp (3 ekv.) s přidáním 1 ekv. Dhbt-OH v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako Pfp estery chráněné Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml). Nadbytek činidla byl odstraněn praním DMF (12 min, průtok 1 ml/min) a acylace byly testovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odstraněna výše popsaným způsobem. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.
Peptid byl odštěpen z pryskyřice výše popsaným způsobem a lyofilizován z ledové kyseliny octové. Surový lyofílizát byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc.
Příklad 14
Syntéza H-Alaio-Lys-OH s použitím (Glu(OtBu))6 jako pre-sekvence a kyseliny (+)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Alai0-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Glu(OtBu))6NHCH2CH2NH PepSyn K)
500 mg suché pryskyřice PepSyn K bylo vloženo do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem a byl přidán ethylendiamin jak bylo popsáno výše. Prvních šest kyselin glutamových tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako Fmoc-Glu(OtBu)-Pfp estery (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Po ukončení pre-sekvence bylo přidáno 10 ekv. kyseliny (+)-4-methoxymandlové ve formě předaktivovaného HObt-esteru jak bylo popsáno výše (dělení výše popsaným způsobem, 95,8 % optické čistoty) a vazebná reakce pokračovala 24 hodin. Nadbytek činidla byl odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše za katalázy DMAP (0,1 ekv.) a reakce pokračovala 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku reakce, který byl určenvýše popsaným způsobem jako 75 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc výše popsaným způsobem.
-22CZ 295838 B6
První alanin byl navázán jako ester Pfp chráněný Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (průtok 1 ml/min 12 min) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem při 80 °C. Skupina Fmoc byla potom odstraněna působením 2 % piperidinu v DMF (obj.) (1 min, průtok 1 ml/min) s následným promytím DMF (10 s, průtok 10 ml/min), 0,2 % Dhbt-OH v DMF (20 min, průtok 1 ml/min) a nakonec DMF (2x5 ml, vždy 1 min). Následující alanin chráněný Fmoc byl ihned navázán jako ester Pfp (3 ekv.) s přidáním 1 ekv. Dhbt-OH v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako Pfp estery chráněné Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml). Nadbytek činidla byl odstraněn praním DMF (12 min, průtok 1 ml/min) a acylace byly testovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odstraněna výše popsaným způsobem. Po ukončení syntézy byla pryskyřice speptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.
Peptid byl odštěpen z pryskyřice výše popsaným způsobem a lyofdizován z ledové kyseliny octové. Surový lyofilizát byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc.
Příklad 15
Syntéza peptidu Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Lyse-OH na materiálu NovSyn TentGel
Suchá pryskyřice NovaSyn TG (0,29 mmol/g, 250 mg) byla vložena do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem a dále zpracovávána způsobem vsádkové syntézy peptidů na PEG-PS až do dokončení pre-sekvence Lys6. Následující aminokyseliny tvořící sekvenci Leuenkefalinu byly navázány jako předem vytvořené HObt estery chráněné Fmoc (3 ekv.) v DMF (5 ml) vytvořené pomocí DIC. Před každou z posledních 5 vazebných reakcí byla pryskyřice promyta roztokem Dhbt-OH (80 mg v 25 ml) pro sledování zmizení žlutého zbarvení při postupující vazebné reakci. Když již nebyla žlutá barva viditelná, reakce byly přerušeny promytím pryskyřice DMF (5x5 ml, vždy 5 min). Acylace potom byly kontrolovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C výše uvedeným způsobem. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s navázaným peptidem promyta DMF (3x5 ml, vždy 1 min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3 x 5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.
Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše a lyofílizován z kyseliny octové. Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Bylo zjištěno, že čistota je lepší než 98 % a identita peptidu byla potvrzena ES-MS. Bylo dosaženo výtěžku 84 %.
-23CZ 295838 B6
Tabulka 1
Φ o cn
Φ L_
CO XI o Q
c c.
Ě Ě
O O
CD Tt
V V
Q C Φ > Sť! CD
OT i
CD
ΙΟ.
cn
| c | c | Q | c | c |
| e | E | E | E | E |
| CN | CN | CN | t— | |
| V | v | v | v | v |
| CC | Dí | £T | Ct | Ct | ct | ||
| 1 < | 1 < | < | < | < | < | ||
| CL | CL | CL | D_ | CL | CL | ||
| s | 5 | S | S | s | s | ||
| I <o | X | X | X | X | X | ||
| <0 | jo | co | CO | co | |||
| 'o | c? | 'o' | 'o' | 'o | θ' | ||
| o | o | o | O | O | O | ||
| CD | CD | CD | m | CD | cd | ||
| to | tň | 'ví | Ίη | cn | cn | cn | |
| >> | >> | >> | >. | >> | |||
| c? | —1 | —1 | —1 | —I | |||
| Φ | O | χ | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| o | CD | CD | CD | CD | CD | CD | |
| >u. | ·♦—' | —I | _J | —J | _J | —1 | |
| co | X | Φ | Φ | Φ | <D | ||
| x: | -C | x: | x: | ||||
| D_ 1 | CL | CL 1 | CL | | ||||
| Q. | Φ | X | >> | >. | >s | ||
| 1 | o r- | CD X | 0 | 0 1 > | |||
| -3 | Φ > | » >» | |||||
| CL | 0 1 | 0 1 | |||||
| CD | Φ | ||||||
| CL | (0 t | X | >> | ||||
| £ | H | ||||||
| 0. | X |
co c
| X | X | X | X | X |
| o | o 1 | O | O | o |
| 3 | Φ | >, | 1 u. | |
| CD | x: | >. | ||
| —1 | CL | CD | 0 | H |
| ó | ύ | ΰ | ύ | ύ |
| o | o | o | o | o |
| E | E | E | E | E |
| u_ | LL | LL | LL | LL |
R = NovaSyn TG derivatizovaný kyselinou 4-hydroxymethylfenoxyoctovou (HMPA) jako linkerem (subst.:
0,29 mmol/g). Doby reakce jsou založeny na testu Dhbt-OH a ninhydrinem.
-24CZ 295838 B6
Materiály a metody
Zkratky
AM kyselina p-[(R,S)-a[l-(9H-fluoren9-yl)-methoxyformamido]-2,4— dimethoxybenzyl)-fenoxyoctová
At 7-azabenzotriazol-l-yl
Boc terc-butyloxykarbonyl
BOP benzotriazolyl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexafluorfosfát
Bpoc bifenylpropyloxykarbonyl
Bt benzotriazol-l-yl tBu terč, butyl
DBU diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en
Ddz 3,5-dimethoxyfenylizopropyloxykarbonyl
DCC dicyklohexylkarbodiimid
DCM dichloromethan
DIC diizopropylkarbodiimid
DIEA N,N-diizopropylethylamin
DMAP 4-(N,N-dimethylamino)pyridin
Dhbt-OH 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazin
DMF N,N-dimethylformamid
Dts dithiasukcinyl
EDT ethandithiol
FAB bombardování rychlými atomy
Fmoc 9-íluorenylmethyloxykarbonyl
HATU 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát
HBTU O-(benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát
HMPA kyselina 4-hydroxymethylfenoxyoctová
HMPB kyselina 4- (4-hydroxymethyl-3-methoxyfenoxy)-máselná
HObt 1-hydroxybenzotriazol
HOAt l-hydroxy-7-azobenzotriazol
HPLC vysokotlaká kapalinová chromatografie
MCPS syntéza peptidů na více kolonách
MHC hlavní histokompatibilitní komplex
MMa kyselina 4-methoxymandlová
NMR nukleární magnetická rezonance
NHS imidoester kyseliny N-hydroxyjantarové
NMP N-methylpyrrolidon
NPS nitrofenylsulfonyl
Mtr 4-methoxy-2,3,6-trimethylfenylsulfonyl
PAM fenylacetamidomethyl
Pbf 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
PEG-PS polyethyleneglykol naroubovaný na polystyren
PepSyn Gel polydimethylakrylamidová pryskyřice funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu
PepSyn K křemelina nesoucí polydimethylakrylamidovou pryskyřici funkcionalizovanou methylesterem sarkosinu
Pfp pentafluorfenyl
Pmc 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl
Poc fenylizopropyloxykarbonyl
TBTU O-(benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborát
TFA kyselina trifluoroctová
TFE trifluorethanol
TFMSA kyselina trifluoromethansulfonová
Tmz 2,4,5-tetramethylbenzyloxykarboxyl
Claims (26)
1. Způsob výroby peptidů
X-AA,-AA2.....AAn-Y, kde AA je zbytek L- nebo D-aminokyseliny,
X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny,
Y je OH, NH2 a n je celé číslo větší než 2, syntézou na pevné fázi, kde C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného reaktivního derivátu, v případě nutnosti s chráněným postranním řetězcem, je navázána na pevný nosič nebo polymer, případně prostřednictvím linkeru, potom zbavena Ν-α-ochranné skupiny, a následující aminokyseliny vytvářející sekvenci peptidu jsou postupně navazovány nebo navazovány jako peptidové fragmenty ve formě vhodně chráněných reaktivních derivátů nebo fragmentů, kde po vytvoření požadovaného peptidu je Ν-α-ochranná skupina z požadovaného peptidu odstraněna a peptid je odštěpen z pevného nosiče, vyznačující se tím, že způsob dále zahrnuje následující kroky:
zvolí se pre-sekvence tvořená 3 až 9 zbytky zvolenými nezávisle z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranního řetězce chráněnými v průběhu reakčních kroků a s faktorem náklonnosti Pa > 0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ < 1,10, kde pre-sekvenci obsahuje C-koncová část uvedeného peptidu; a uvedená pre-sekvence se z vytvořeného peptidu odštěpí.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aminokyseliny v pre-sekvenci jsou zvoleny z aminokyselin, které mají v postranním řetězci funkční skupinu karboxy, karboxamido, amino, hydroxy, guanidino, sulfid nebo imidazol.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že aminokyseliny tvořící část pre-sekvence jsou nezávisle zvoleny ze skupiny Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met a Gin.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že aminokyselinami jsou buď výlučně Lys, nebo Glu nebo sekvence (Glu)q(Lys)p, kde p + qje3až9, s výhodou 6 až 9, a pořadí Lys a Glu je zvoleno libovolně.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Ν-α-amino ochrannou skupinou je Fmoc, Boc nebo jakákoliv jiná vhodná ochranná skupina.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že Ν-α-amino ochrannou skupinou je skupina Fmoc nebo Boc.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje karboxylovou skupinu, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou tBu.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje aminoskupinu, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou Boc.
-26CZ 295838 B6
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje hydroxylovou skupinu, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou tBu.
10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje skupinu karboxamido, která je chráněná skupinou a) benzhydryl, b) trityl, c) tBu.
11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje guanidinovou skupinu chráněnou skupinou 4-methoxy-2,3,6trimethylfenylsulfonyl (Mtr), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) nebo 2,2,4,6,7pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf).
12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje imidazolovou skupinu chráněnou Boc.
13. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že skupiny Fmoc se odstraňují pomocí aminu jako je piperidin nebo diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU).
14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že ochranné skupiny postranního řetězce se odstraňují kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), kyselina trifluormethansulfonová (TFMSA), HBr, HC1 nebo HF.
15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pevný nosič je zvolen z funkcionalizovaných pryskyřic jako polystyren, polyakrylamid, polyethylenglykol, celulóza, polyethylen, latex nebo materiál dynabeads.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že funkcionalizované pryskyřice jsou zvoleny z pryskyřic PEG-PS, tedy polyethylenglykol roubovaný na polystyrenu, nebo pryskyřic polydimethylakrylamidových.
17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pre-sekvence obsahuje od 5 do 7 aminokyselinových zbytků.
18. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že C-koncová aminokyselina je navázána na pevný nosič běžným linkerem jako je 2,4-dimethoxy-4'-hydroxybenzofenon, kyselina 4-(4-hydroxymethyl-3-methoxyfenoxy)máselná (HMPB), kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, kyselina 4—hydroxymethylfenoxyoctová (HMPA), kyselina 3-(4-hydroxymethylfenoxy)propionová nebo kyselina p-[(R,S)-a[l-(9H-fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyljfenoxyoctová (AM).
19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že syntéza se provádí vsádkovým způsobem.
20. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že způsob se provádí kontinuálně na automatickém nebo poloautomatickém syntezátoru peptidů.
21. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kroky reakce se provádějí v přítomnosti rozpouštědla zvoleného ze skupiny acetonitril, Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), N-methylpyrrolidon (NMP), dichlormethan (DCM), trifluorethanol (TFE), ethanol, methanol, voda, směsi uvedených rozpouštědel s nebo bez dalších látek jako jsou chloristan nebo ethylenkarbonát.
22. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vazebné reakce mezi dvěma aminokyselinami, aminokyselinou a dříve vytvořenou sekvencí peptidu nebo fragmentem peptidu
-27CZ 295838 B6 a dříve vytvořenou sekvencí peptidů se provádí běžnými kondenzačními způsoby jako je azidová metoda, metoda směsného anhydridu kyseliny, metoda symetrického anhydridu, karbodiimidová metoda, metoda aktivního esteru jako je pentafluorfenyl (Pfp), 3,4-dihydro-4-oxobenzotriazin3—yl (Dhbt), benzotriazol-l-yl (Bt), 7-azabenzotriazol-l-yl (At), 4-nitrofenyl, imidoestery kyseliny N-hydroxyjantarové (NHS), chloridy kyselin, fluoridy kyselin, aktivita in šitu činidly jako 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HATU), O-(benzotriazol-l-ylý-l, 1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HBTU), O-(benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3— tetramethyluroniumtetrafluorborát (TBTU) nebo benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)fosfonium-hexafluorfosfát (BOP).
23. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid se z nosiče odštěpuje kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBr), chlorovodík (HC1), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid.
24. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid se z nosiče odštěpuje fotolýzou.
25. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pre-sekvence se z vytvořeného peptidů odštěpí enzymaticky.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že enzym se volí z vhodných karboxy- a endopeptidáz.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK97196 | 1996-09-09 | ||
| PCT/DK1997/000375 WO1998011125A1 (en) | 1996-09-09 | 1997-09-09 | Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ80399A3 CZ80399A3 (cs) | 1999-08-11 |
| CZ295838B6 true CZ295838B6 (cs) | 2005-11-16 |
Family
ID=8099561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1999803A CZ295838B6 (cs) | 1996-09-09 | 1997-09-09 | Způsob výroby peptidů |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7348404B2 (cs) |
| EP (1) | EP0929567B1 (cs) |
| JP (1) | JP4405594B2 (cs) |
| AT (1) | ATE290014T1 (cs) |
| AU (1) | AU723268B2 (cs) |
| CA (1) | CA2265900C (cs) |
| CZ (1) | CZ295838B6 (cs) |
| DE (1) | DE69732640T2 (cs) |
| DK (1) | DK0929567T3 (cs) |
| ES (1) | ES2239364T3 (cs) |
| HU (1) | HU230354B1 (cs) |
| IL (1) | IL128829A (cs) |
| PT (1) | PT929567E (cs) |
| WO (1) | WO1998011125A1 (cs) |
Families Citing this family (99)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1950223A3 (en) * | 1998-03-09 | 2009-05-13 | Zealand Pharma A/S | Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis |
| US6528486B1 (en) | 1999-07-12 | 2003-03-04 | Zealand Pharma A/S | Peptide agonists of GLP-1 activity |
| US7550425B2 (en) | 2000-06-16 | 2009-06-23 | Zealand Pharma A/S | Diuretic peptide conjugates |
| JP4903709B2 (ja) | 2004-10-19 | 2012-03-28 | ロンザ アーゲー | 固相ペプチド合成のための方法 |
| ES2361095T5 (es) | 2005-05-04 | 2021-11-23 | Zealand Pharma As | Análogos del péptido 2 tipo glucagón (GLP-2) |
| GB0514071D0 (en) | 2005-07-07 | 2005-08-17 | Zealand Pharma As | N- or C- terminally modified small peptides |
| US20090171097A1 (en) * | 2005-11-22 | 2009-07-02 | Hiroshi Sugiyama | Automated solid phase synthesis of pyrrole-imidazole polyamide |
| JP5473334B2 (ja) | 2005-12-23 | 2014-04-16 | ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ | 修飾リジン模倣化合物 |
| JP5295785B2 (ja) * | 2006-02-20 | 2013-09-18 | エファ・ユニバーシティ・インダストリー・コラボレイション・ファウンデイション | 細胞膜透過性ペプチド |
| CA2647867C (en) * | 2006-03-29 | 2015-11-03 | Otsuka Chemical Co., Ltd. | Method for production of peptide thioester compound |
| WO2008056155A1 (en) | 2006-11-08 | 2008-05-15 | Zealand Pharma A/S | Selective glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues |
| DK2158214T3 (da) | 2007-06-15 | 2011-12-05 | Zealand Pharma As | Glukagonanaloger |
| EA020537B1 (ru) | 2008-12-15 | 2014-11-28 | Зилэнд Фарма А/С | Аналоги глюкагона |
| US8642540B2 (en) | 2008-12-15 | 2014-02-04 | Zealand Pharma A/S | Glucagon analogues |
| CN102282166B (zh) | 2008-12-15 | 2015-04-01 | 西兰制药公司 | 胰高血糖素类似物 |
| ES2502218T3 (es) | 2008-12-15 | 2014-10-03 | Zealand Pharma A/S | Análogos de glucagón |
| EA022816B1 (ru) | 2009-07-13 | 2016-03-31 | Зилэнд Фарма А/С | Ацилированные аналоги глюкагона |
| EA023925B1 (ru) | 2010-04-27 | 2016-07-29 | Зилэнд Фарма А/С | Пептидные конъюгаты агонистов рецептора glp-1 и их применение |
| AR081975A1 (es) | 2010-06-23 | 2012-10-31 | Zealand Pharma As | Analogos de glucagon |
| WO2011160633A1 (en) | 2010-06-24 | 2011-12-29 | Zealand Pharma A/S | Glucagon analogues |
| PH12013501495A1 (en) | 2011-01-20 | 2013-09-16 | Zealand Pharma As | Combination of acylated glucagon analogues with insulin analogues |
| WO2013064669A1 (en) | 2011-11-03 | 2013-05-10 | Zealand Pharma A/S | Glp-1 receptor agonist peptide gastrin conjugates |
| AP2014007797A0 (en) | 2011-12-23 | 2014-07-31 | Boehringer Ingelheim Int | Glucagon analogues |
| WO2013098408A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Zealand Pharma A/S | Glucagon and cck receptor agonist peptide conjugates |
| US9657062B2 (en) | 2012-02-03 | 2017-05-23 | Zealand Pharma A/S | Ghrelin analogues |
| CA2872315A1 (en) | 2012-05-03 | 2013-11-07 | Zealand Pharma A/S | Glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues |
| EA028665B1 (ru) | 2012-05-03 | 2017-12-29 | Зилэнд Фарма А/С | Соединения - двойные агонисты gip-glp-1 и способы |
| EP2875043B1 (en) | 2012-07-23 | 2016-12-21 | Zealand Pharma A/S | Glucagon analogues |
| TWI608013B (zh) | 2012-09-17 | 2017-12-11 | 西蘭製藥公司 | 升糖素類似物 |
| WO2014164680A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Molecular Templates, Inc. | Cd20-binding immunotoxins for inducing cellular internalization and methods using same |
| US9695214B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-07-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Solid phase peptide synthesis processes and associated systems |
| US9169287B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-10-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Solid phase peptide synthesis processes and associated systems |
| HK1219477A1 (zh) | 2013-03-21 | 2017-04-07 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | 合成含有乙内酰脲的肽产物 |
| EP2976325B1 (en) | 2013-03-21 | 2017-03-01 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Synthesis of cyclic imide containing peptide products |
| AU2014336098B2 (en) | 2013-10-17 | 2018-05-10 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Acylated glucagon analogues |
| US9988429B2 (en) | 2013-10-17 | 2018-06-05 | Zealand Pharma A/S | Glucagon analogues |
| WO2015067715A2 (en) | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Zealand Pharma A/S | Gip-glp-1 dual agonist compounds and methods |
| WO2015067716A1 (en) | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Zealand Pharma A/S | Glucagon-glp-1-gip triple agonist compounds |
| US10435474B2 (en) | 2013-12-24 | 2019-10-08 | Ossianix, Inc. | Baff selective binding compounds and related methods |
| WO2015138452A1 (en) | 2014-03-11 | 2015-09-17 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions |
| CA2937407A1 (en) | 2014-01-27 | 2015-07-30 | Molecular Templates, Inc. | De-immunized shiga toxin a subunit effector polypeptides for applications in mammals |
| CA2940252C (en) | 2014-03-11 | 2022-10-18 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising binding regions, shiga toxin a subunit effector regions, and carboxy-terminal, endoplasmic reticulum localization signal motifs |
| EP3514168B1 (en) | 2014-06-11 | 2021-09-01 | Molecular Templates, Inc. | Protease-cleavage resistant cytotoxic cell-targeting molecules |
| CA2953569A1 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Ossianix, Inc. | Semi-synthetic nurse shark vnar libraries for making and using selective binding compounds |
| EP3212218B1 (en) | 2014-10-29 | 2021-06-30 | Zealand Pharma A/S | Gip agonist compounds and methods |
| WO2016077840A2 (en) | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Ossianix, Inc. | TfR SELECTIVE BINDING COMPOUNDS AND RELATED METHODS |
| ES2856457T3 (es) | 2015-02-05 | 2021-09-27 | Molecular Templates Inc | Moléculas de unión a CD20 multivalentes que comprenden regiones efectoras de una subunidad de toxina shiga y composiciones enriquecidas de estas |
| EA035791B1 (ru) | 2015-03-18 | 2020-08-11 | Зилэнд Фарма А/С | Аналоги амилина |
| GB201506380D0 (en) | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Serodus Asa | Materials and methods for treatment of pulmonary hypertension |
| US10336802B2 (en) | 2015-04-16 | 2019-07-02 | Zealand Pharma A/S | Acylated glucagon analogue |
| DK3303373T3 (da) | 2015-05-30 | 2020-06-02 | Molecular Templates Inc | Deimmuniserede Shiga toksin A-underenhedsstilladser og cellemålrettede molekyler omfattende samme |
| JP6884133B2 (ja) | 2015-07-26 | 2021-06-09 | モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. | 志賀毒素ａサブユニットエフェクター及びｃｄ８＋ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子 |
| CA2999031A1 (en) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and systems for solid phase peptide synthesis |
| US11097010B2 (en) | 2016-08-06 | 2021-08-24 | Ossianix, Inc. | In vivo methods for selecting peptides that cross the blood brain barrier, related compositions and methods of use |
| US10071140B2 (en) | 2016-09-09 | 2018-09-11 | Zealand Pharma A/S | Amylin analogues |
| CN110099922A (zh) | 2016-12-09 | 2019-08-06 | 西兰制药公司 | Glp-1/glp-2双重激动剂 |
| WO2018104558A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Zealand Pharma A/S | Acylated glp-1/glp-2 dual agonists |
| WO2018104561A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Zealand Pharma A/S | Acylated glp-1/glp-2 dual agonists |
| WO2018104559A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Zealand Pharma A/S | Glp-1/glp-2 dual agonists |
| WO2018103868A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Zealand Pharma A/S | Acylated glp-1/glp-2 dual agonists |
| CA3049456A1 (en) | 2017-01-25 | 2018-08-02 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes |
| PE20200678A1 (es) | 2017-06-16 | 2020-06-11 | Zealand Pharma As | Posologias para la administracion de analogos de peptido de tipo glucagon-2 (glp-2) |
| US11512136B2 (en) | 2017-11-02 | 2022-11-29 | Ossianix, Inc. | Transferrin receptor (TfR)-selective binding peptides capable of crossing the blood brain barrier and methods of use thereof |
| PE20201254A1 (es) | 2018-02-27 | 2020-11-16 | Zp Spv 3 K/S | Analogos de compstatina y sus usos medicos |
| WO2019204272A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Molecular Templates, Inc. | Her2-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds |
| WO2019246288A1 (en) | 2018-06-22 | 2019-12-26 | Ossianix, Inc. | Anti-cd98hc vnars for crossing the blood brain barrier and type iv vnar libraries |
| KR20210052389A (ko) | 2018-08-27 | 2021-05-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 다운스트림 정제에서의 라만 분광법의 사용 |
| WO2020056327A1 (en) | 2018-09-14 | 2020-03-19 | Ossianix, Inc. | Tfr-specific binding moieties and transcytosis method to select vnars that cross cellular barriers |
| WO2020081493A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins |
| WO2020154531A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors |
| US11414496B2 (en) | 2019-01-23 | 2022-08-16 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Anti-CD38 binding domains |
| EP3982919A1 (en) | 2019-06-14 | 2022-04-20 | Zealand Pharma A/S | Pharmaceutical parenteral composition of dual glp1/2 agonist |
| CA3148536A1 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Anne Pernille Tofteng SHELTON | Compstatin analogues and their medical uses |
| WO2021055816A1 (en) | 2019-09-18 | 2021-03-25 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds |
| KR20220066095A (ko) | 2019-09-20 | 2022-05-23 | 질랜드 파마 에이/에스 | Kv1.3 차단제 |
| WO2021102445A1 (en) | 2019-11-24 | 2021-05-27 | Molecular Templates, Inc. | Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents |
| EP4126003A1 (en) | 2020-03-30 | 2023-02-08 | Zealand Pharma A/S | Glp-1/glp-2 dual agonists |
| WO2021198195A1 (en) | 2020-03-30 | 2021-10-07 | Zealand Pharma A/S | Agonist combination |
| CN116209671A (zh) | 2020-07-16 | 2023-06-02 | 西兰制药第三特殊目的公司 | 补体因子c3的抑制剂及其医学用途 |
| WO2022103769A1 (en) | 2020-11-11 | 2022-05-19 | Ossianix, Inc. | High affinity human and monkey specific tfr-1 vnars |
| TW202241491A (zh) | 2020-12-16 | 2022-11-01 | 丹麥商西蘭製藥公司 | Ｇｌｐ－１／ｇｌｐ－２雙重促效劑之醫藥組合物 |
| US20240299552A1 (en) | 2020-12-16 | 2024-09-12 | Zealand Pharma A/S | Pharmaceutical Composition of GLP-1/GLP-2 Dual Agonists |
| JP2023553561A (ja) | 2020-12-16 | 2023-12-22 | ジーランド ファーマ エー／エス | Ｇｌｐ－１／ｇｌｐ－２デュアルアゴニストの医薬組成物 |
| WO2022175410A1 (en) | 2021-02-18 | 2022-08-25 | Zealand Pharma A/S | Composition for treating short bowel syndrome |
| US20220306700A1 (en) | 2021-03-17 | 2022-09-29 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens |
| BR112023019022A2 (pt) | 2021-03-23 | 2023-10-17 | Zealand Pharma As | Bloqueadores de kv1.3 |
| WO2022260877A1 (en) | 2021-06-07 | 2022-12-15 | Ossianix, Inc. | Shark vnars for treating covid-19 |
| KR20240022551A (ko) | 2021-06-18 | 2024-02-20 | 베이징 투오 지에 바이오파마수티컬 컴퍼니 리미티드 | 글루카곤 유사체 및 이의 의학적 용도 |
| WO2023023166A1 (en) | 2021-08-17 | 2023-02-23 | Ossianix, Inc. | Deimmunized vnar domains and scaffolds |
| US20250073311A1 (en) | 2021-09-03 | 2025-03-06 | Zealand Pharma A/S | Dosage regime |
| IL313185A (en) | 2021-12-01 | 2024-07-01 | Zealand Pharma As | Peptide inhibitors of the interleukin-23 receptor |
| EP4593864A1 (en) | 2022-09-28 | 2025-08-06 | Zealand Pharma A/S | Methods for treating obesity |
| KR20250089536A (ko) | 2022-10-18 | 2025-06-18 | 질랜드 파마 에이/에스 | 억제제 |
| WO2024168411A1 (pt) * | 2023-02-15 | 2024-08-22 | Proteimax Bio Technology Israel Ltd | Aditivo de alimento e/ou suplemento alimentar, processo de obtenção, formulação de alimento funcional e/ou suplemento alimentar, uso |
| EP4471048A1 (en) | 2023-06-01 | 2024-12-04 | Zealand Pharma A/S | Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor |
| EP4471049A1 (en) | 2023-06-01 | 2024-12-04 | Zealand Pharma A/S | Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor |
| WO2025056677A1 (en) | 2023-09-15 | 2025-03-20 | Zealand Pharma A/S | Dasiglucagon for use in the treatment of congenital hyperinsulinism |
| WO2025120002A1 (en) | 2023-12-04 | 2025-06-12 | Zealand Pharma A/S | Petrelintide for reducing weight whilst preserving lean mass |
| WO2025120001A1 (en) | 2023-12-04 | 2025-06-12 | Zealand Pharma A/S | Amylin analogues for reducing consumption of high-fat food |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5116666A (cs) * | 1974-07-30 | 1976-02-10 | Shionogi Seiyaku Kk | |
| US5021550A (en) * | 1986-10-07 | 1991-06-04 | Thomas Jefferson University | Method for preventing deletion sequences in solid phase synthesis |
| JP2807287B2 (ja) * | 1989-10-13 | 1998-10-08 | 株式会社医学生物学研究所 | ペプチドおよびその用途 |
| JP3929484B2 (ja) * | 1993-09-14 | 2007-06-13 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | エコチンおよびその同族体を含む医薬的組成物 |
| US7176282B1 (en) * | 1996-09-09 | 2007-02-13 | Zealand Pharma A/S | Solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis |
| EP1950223A3 (en) * | 1998-03-09 | 2009-05-13 | Zealand Pharma A/S | Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis |
-
1997
- 1997-09-09 DK DK97939974T patent/DK0929567T3/da active
- 1997-09-09 CA CA002265900A patent/CA2265900C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 AU AU41993/97A patent/AU723268B2/en not_active Ceased
- 1997-09-09 PT PT97939974T patent/PT929567E/pt unknown
- 1997-09-09 HU HU0102900A patent/HU230354B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 DE DE69732640T patent/DE69732640T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 ES ES97939974T patent/ES2239364T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 AT AT97939974T patent/ATE290014T1/de active
- 1997-09-09 CZ CZ1999803A patent/CZ295838B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 EP EP97939974A patent/EP0929567B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 IL IL12882997A patent/IL128829A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 WO PCT/DK1997/000375 patent/WO1998011125A1/en active IP Right Grant
- 1997-09-09 JP JP51316698A patent/JP4405594B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-06-19 US US11/455,388 patent/US7348404B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2265900C (en) | 2007-07-31 |
| DE69732640D1 (de) | 2005-04-07 |
| DK0929567T3 (da) | 2005-06-27 |
| ATE290014T1 (de) | 2005-03-15 |
| HU230354B1 (hu) | 2016-02-29 |
| DE69732640T2 (de) | 2006-01-12 |
| AU4199397A (en) | 1998-04-02 |
| US20070004905A1 (en) | 2007-01-04 |
| AU723268B2 (en) | 2000-08-24 |
| JP2001500134A (ja) | 2001-01-09 |
| HUP0102900A2 (hu) | 2002-01-28 |
| CZ80399A3 (cs) | 1999-08-11 |
| WO1998011125A1 (en) | 1998-03-19 |
| IL128829A0 (en) | 2000-01-31 |
| PT929567E (pt) | 2005-07-29 |
| IL128829A (en) | 2005-08-31 |
| CA2265900A1 (en) | 1998-03-19 |
| EP0929567B1 (en) | 2005-03-02 |
| US7348404B2 (en) | 2008-03-25 |
| HUP0102900A3 (en) | 2002-02-28 |
| EP0929567A1 (en) | 1999-07-21 |
| JP4405594B2 (ja) | 2010-01-27 |
| ES2239364T3 (es) | 2005-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ295838B6 (cs) | Způsob výroby peptidů | |
| KR101087859B1 (ko) | 인슐린친화성 펩타이드 합성법 | |
| Mahto et al. | A reversible protection strategy to improve Fmoc‐SPPS of peptide thioesters by the N‐acylurea approach | |
| EP2448956B1 (en) | Solid phase peptide synthesis of peptide alcohols | |
| KR20170026326A (ko) | Amg 416의 제조 방법 | |
| EP1891104B1 (en) | Solid phase bound thymosin alpha1 and its synthesis | |
| MX2013004350A (es) | Analogos de peptido insulinotropico dependientes de glucosa. | |
| ES2352204T3 (es) | Método de síntesis peptídica en fase sólida. | |
| US7176282B1 (en) | Solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis | |
| US11419919B1 (en) | High-purity adrenocorticotropic hormone, analogue and a large-scale preparation method thereof | |
| MX2007012505A (es) | Sintesis peptidica de helices alfa sobre una resina peg. | |
| Mathieu et al. | Novel strategy for the synthesis of template‐assembled analogues of rat relaxin1 1 | |
| Cavallaro et al. | Solid‐phase synthesis of a dendritic peptide related to a retinoblastoma protein fragment utilizing a combined boc‐and fmoc‐chemistry approach | |
| CN114805480A (zh) | 一种奥曲肽的制备方法 | |
| EP1008656A1 (en) | Process for producing lh-rh derivatives | |
| Harris et al. | An investigation of the role of the adiponectin variable domain on the stability of the collagen‐like domain | |
| CN120173087A (zh) | 一种司美格鲁肽的固相合成方法 | |
| WO1996040213A1 (en) | Manufacture and purification of peptides | |
| WO2004031205A2 (en) | Use of trichloroacetimidate linker for peptide synthesis | |
| JPH0678356B2 (ja) | カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体 | |
| Cavallaro et al. | Solid‐phase synthesis of cyclic analogues related to the hypoglycaemic peptide hGH [6–13]: Comparison of two i→ i+ 4 lactam cyclization procedures | |
| HK1118295A (en) | Method of peptide synthesis | |
| Gross | Synthetic studies on bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI). I. Optimized stepwise protocols. II. Segment condensation strategies | |
| WO2008098693A2 (en) | Convergent synthesis of glp-1 | |
| HK1116805A (en) | Peptide synthesis of alpha-helixes on peg resin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110909 |