CZ295838B6 - Způsob výroby peptidů - Google Patents

Abstract

Popisuje se způsob výroby peptidů X-AA.sub.1.n.-AA.sub.2.n....AA.sub.n.n.-Y, kde AA je zbytek L- nebo D-aminokyseliny, X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny, Y je NH.sub.2.n. a n je celé číslo větší než 2, syntézou na pevné fázi, s výhodou s použitím metody Fmoc, přičemž mezi C-koncovou část připojenou na pevnou fázi se vkládá pre-sekvence obsahující 3 až 9, s výhodou 5 až 7 zbytků aminokyselin nezávisle zvolených z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranního řetězce chráněnými v průběhu reakčních kroků a s faktorem náklonnosti P.alfa. > 0,57 a faktorem náklonnosti P.beta. .<=. 1,10 nebo odpovídajících D-aminokyselin a uvedená pre-sekvence je z vytvořeného peptidu odštěpena.

Description

Způsob výroby peptidů

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká zlepšeného způsobu výroby peptidů syntézou na pevné fázi.

Dosavadní stav techniky

Syntéza peptidů na pevné fázi (solid-phase peptide synthesis, SPPS) je vysoce úspěšná metoda zavedená Merrifieldem v roce 1963 (Merrifield, R. B. (1963), J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 2154). Touto metodou bylo dosud syntetizováno velké množství peptidů. Vynikající přehled v současnosti používaných chemických syntéz peptidů a proteinů je uveden v Kent, S. B. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989, který je zařazen odkazem.

V praxi se používají dvě strategie pro výstavbu peptidových řetězců syntézou na pevné fázi, a to postupné syntézy na pevné fázi a kondenzace fragmentů na pevné fázi.

Při postupné SPPS se váže C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného, v případě nutnosti na postranním řetězci chráněného reaktivního derivátu kovalentní vazbou buď přímo, nebo prostřednictvím vhodné propojovací skupiny (linker) na „pevný“ nosič, například polymerní pryskyřici, která je v nabobtnalém stavu v organickém rozpouštědle. Ν-α-ochranná skupina se odstraní a postupně se přidávají následující chráněné aminokyseliny.

Když bylo dosaženo požadované délky peptidového řetězce, ochranné skupiny postranních řetězců se odstraní a peptid se odštěpí z pryskyřice, což může být provedeno v oddělených krocích nebo současně.

Při kondenzaci fragmentů na pevné fázi se cílová sekvence sestaví postupnou kondenzací fragmentů na pevném nosiči s použitím chráněných fragmentů vyrobených metodou postupné SPPS.

V průběhu let byly vyvinuty dvě strategie pro vytvoření vazby založené na použití různých Ν-α-ochranných skupin a přizpůsobení ochranných skupin postranního řetězce.

Merrifield používal jako Ν-α-ochrannou skupinu tórc-butyloxykarbonyl (Boc), zatímco Carpino a Han zavedli 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) (Carpino, L. A. a Han, G. Y. (1972), J. Org. Chem. 37, 3404 - 3409).

Operace používané při jednom cyklu prodloužení řetězce při postupné SPPC s použitím reakcí Boc a Fmoc jsou ilustrovány v následujících reakčních schématech (převzaté z Kent, S. B. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989).

φ o

>» Jí <n

CL t CM

Boc-AA_n-OBzlCH2CONH-CH2-pryskyrice i—*· Fmoc-AA_n-O-Bzl-O-CH c >Φ

C ro ω X3

O >> c

CL

Jí tf>

'Φ c g Λ i—

J= O o φ

Q >. Jí tn 2?

CL t CM

X o ó o

I c < <

CM X z «5 J3

N CtJ >

CO O x 'c >a> c ra

O

C ‘o.

Jí « Φ c c ra l—

JC

O o

Φ Q >» Jí w £ CL

CM

X o

I X z o o

CM X g

N CO O

I c < <

I co

X z

F ó

I s H

Φ o

Φ	Cfí
o	>v
ra	loM
N	CL
ra u.	CM X	ra
Ή	o 1	X) N
φ c	X	ra >

o o

CM - ^x θ

N CQ

Boc-AA_n-i-AAn-OBzlCH₂CONH-CH2-pryskyrice Fmoc-AA_n-i-AAn-0-Bzl-0-CH2-pryskyřice

-2CZ 295838 B6

Peptid chráněný Ν-α-Boc navázaný na pryskyřici PAM se zbaví Ν-α-ochranné skupiny kyselinou trifluoroctovou (TFA). Získaná aminová sůl se promyje a neutralizuje terciárním aminem. Následující peptidová vazba se vytvoří reakcí s aktivovanou Boc-aminokyselinou, například symetrickým anhydridem. Obecně je ochrana postranního řetězce založená na benzylu a odstranění ochranné skupiny se provede HF nebo kyselinou sulfonovou.

Peptid chráněný Ν-α-Fmoc navázaný na pryskyřici se zbaví Ν-α-ochranné skupiny působením sekundárního aminu, normálně piperidinu, v organickém rozpouštědle, například N,N-dimethylformamidu (DMF) nebo dichlormethanu (DCM). Po promytí se neutrální peptidová pryskyřice ponechá reagovat s aktivovanou Fmoc-aminokyselinou, například hydroxybenztriazolovým aktivním esterem.

Ochrana postranního řetězce je založena na skupinách terc-butyl, trityl a arylsulfonyl a pro odstranění ochranné skupiny z postranních řetězců se s výhodou používá TFA.

I když se v podstatě pro všechny běžně používané syntézy peptidů používají strategie s Boc a Fmoc, někteří autoři navrhovali jiné Ν-α-ochranné skupiny (Stewart, J. M. a Young, J. D., Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Company (1984)).

Boc vytváří v kyselém prostředí labilní urethanovou skupinu a další návrhy z této kategorie jsou bifenylizopropyloxykarbonyl (Bpoc), 3,5-dimethoxyfenylizopropyloxykarbonyl (Ddz), fenylizopropyloxykarbonyl (Poc) a 2,3,5-tetramethylbenzyloxykarbonyl (Tmz).

Mezi další typy dostupných Ν-α-ochranných skupin patří nitrofenylsulfenyl (Nps), který je možno odstranit buď velmi zředěnou bezvodou kyselinou, například HC1, nebo napadením nukleofilním činidlem, například methyl-3-nitro-4-merkaptobenzoátem. Je možno také použít dithiasukcinylu (Dts), který je odstranitelný působením nukleofílního činidla.

SPPS má obecnou výhodu, že je využitelná při plně automatizované nebo poloautomatizované chemii vytváření řetězců. Systém pro SPPS za podmínek nízkotlakého kontinuálního průtoku byl vyvinut Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137 a dále vylepšován, viz Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270 - 272 a WO 90/02605.

I když SPPS dnes představuje základní kámen při syntéze proteinů a peptidů, stále ještě zbývá vyřešit některé problémy. Protože některé z těchto problémů mohou mít vztah ke struktuře peptidů, bude vhodná následující krátká diskuse.

Empirické předpovědi konformací proteinů byly prováděny autory Chou, P. Y. a Fasman, G. D. (1978), Annu Rev. Biochem. 47, 254 - 276. Je dobře známo, že architektura proteinů může být popsána primární, sekundární, terciární a kvartemí strukturou. Primární struktura se týká sekvence aminokyselin proteinu. Sekundární struktura je místní prostorová organizace polymerní kostry, přičemž se nebere v úvahu konformace postranních řetězců. Jako příklady sekundárních struktur je možno uvést α-šroubovice, β—listy a β-otáčky, což jsou reverzní úseky řetězců skládající se z tetrapeptidů. Terciární struktura je uspořádání všech atomů v prostoru včetně disulfídických můstků a poloh postranních řetězců, takže se berou v úvahu všechny interakce na krátké i dlouhé vzdálenosti.

Termín kvarterní struktura může být použit pro označení interakce mezi podjednotkami proteinu, například a- a β-řetězců hemoglobinů.

Po diskusi dřívějších pokusů spojovat sekundární strukturu proteinů s aminokyselinovým složením, kde například Ser, Thr, Val, Ile a Cys byly klasifikovány jako „rozbíjející šroubovice“ (helix breakers) a Ala, Leu a Glu jako „tvořící šroubovice“ (helix formers), přičemž hydrofobní zbytky

-3 CZ 295838 B6 byly zařazovány jako silně „struktury β tvořící“ a prolin spolu se zbytky nabitých aminokyselin jako „struktury β rozbíjející“ připravili Chou a Fasman statistickou analýzu 29 proteinů se známou rentgenovou strukturou pro vytvoření pravidel pro předpovídání a- a β-oblastí.

Na základě těchto studií vytvořili tzv. faktory náklonnosti (prospensity factors) Ρα, Ρβ a Pt, které jsou konformační parametry vyjadřující polohové preference vystupovat jako α-šroubovice, βlist a popřípadě β-otáčka pro přirozené L-aminokyseliny tvořící část proteinů.

Pro ilustraci jsou Pa a Ρβ uvedeny níže. Jednopísmenkové zkratky pro jednotlivé aminokyseliny i o j sou uvedeny v závorkách.

	Pa	Ρβ
Glu	(E)	1,51	Val	1,70
Met	(M)	1,45	lle	1,60
Ala	(A)	1,42	Tyr	1,47
Leu	(L)	1,21	Phe	1,38
Lys	(K)	1,16	Trp	1,37
Phe	(F)	1,13	Leu	1,30
Gin	(Q)	1,11	Cyr	1,19
Trp	(W)	1,08	Thr	1,19
lle	(i)	1,08	Gin	1,10
Val	(V)	1,06	Met	1,05
Asp	(D)	1,01	Arg	0,93
His	(H)	1,00	Asn	0,89
Arg	(R)	0,98	His	0,87
Thr	(T)	0,83	Ala	0,83
Ser	(S)	0,77	Ser	0,75
Cys	(C)	0,70	Gly	0,75
Tyr	(Y)	0,69	Lys	0,74
Asn	(N)	0,67	Pro	0,55
Pro	(P)	0,57	Asp	0,54
Gly	(G)	0,57	Glu	0,37

-4CZ 295838 B6

Hodnoty pod 1,00 obvykle ukazují, že dotyčná aminokyselina musí být považována pro konkrétní sekundární strukturu za nevýhodnou.

Jako příklad je možno uvést hydrofobní kyseliny (například Val, Ile, Leu), které silně podporují tvorbu β-listu, zatímco nabité aminokyseliny (například Glu, Asp a His) tvorbu β-listu narušují.

Ve struktuře α-šroubovice je udržována spirální konfigurace peptidu rigidně v místě vodíkových můstků mezi atomem vodíku připojeným katomu dusíku v jedné opakující se jednotce

O H

II I (C - C - N -) a atom kyslíku připojený na atom uhlíku tři jednotky podél řetězce.

Jestliže se polypeptid přivede do roztoku, může se přivést α-šroubovice k rozvinutí za vytvoření náhodného svinutí nastavením pH. Přechod od α-šroubovice k náhodnému svinutí probíhá v úzkém rozmezí pH. Protože vodíkové vazby jsou z hlediska pevnosti vazby v a-šroubovici všechny ekvivalentní, mají sklon přecházet do jiného uspořádání všechny najednou. Změna může být také indukována teplem.

Struktura β-listu se skládá z úplně natažených peptidových řetězců, u kterých vodíkové vazby spojují atomy vodíku na jednom řetězci s atomy kyslíku v sousedním řetězci. Vodíkové vazby tedy nepřispívají k vnitřní organizaci řetězce jak je tomu u α-šroubovice, ale pouze vážou řetězec s řetězcem. Sousední řetězce mohou být paralelní nebo antiparalelní.

β-otáčky se často pozorují v těch částech peptidového řetězce, které spojují antiparalelní řetězce ve struktuře β-listu.

U β-otáčky tvoří skupina CO- a NH- aminokyseliny číslo n v peptidovém řetězci vodíkovou vazbu s odpovídajícími skupinami v aminokyselině číslo n + 4.

α-šroubovice a β—list tvoří silně proměnlivé části peptidové konformace proteinů (od 0 do 80 %) a zbývající části proteinů jsou naskládány v jiných strukturách. U většiny proteinů se jeví části peptidových řetězců jako nepravidelně složené „náhodné smyčky“.

Pokud se nyní obrátíme k obecným problémům týkajícím se SPPS, v referenci Kent, S. Β. H. (1988), Annu Rev. Biochem. 57, 957 - 989 se osvětluje syntéza „obtížně syntetizovaných sekvencí“ (difficult sequences).

Jak je zřejmé, celá podstata SPPS je založena na úplném odstranění Ν-α-ochranných skupin před každým z následujících kroků vazby.

To znamená, že v ideálním případě by se měly všechny aminokyseliny s odstraněnou N-aochrannou skupinou vázat na reaktivní derivát aminokyseliny podle požadované sekvence, tj. měla by probíhat úplná aminoacylace.

Kent uvádí, že nejvážnější potenciální problém v postupné SPPS je neúplná tvorba peptidové vazby, kterou vznikají peptidy s jednou nebo více chybějícími aminokyselinami (delecemi), ale s podobnými vlastnostmi jako má cílová sekvence.

Takové neúplné vazby převažují více u některých sekvencí než u jiných, a proto tedy termín „obtížně syntetizovatelná sekvence“ a zjevně převažují více u způsobu Fmoc než u způsobu Boc.

-5 CZ 295838 B6

Vědci včetně autorů předkládaného vynálezu studovali velký počet zjištěných „obtížně syntetizovatelných sekvencí“.

Při syntéze SPPS homo-oligopeptidů obsahujících leucin nebo alanin s použitím strategie Fmoc bylo pozorováno neúčinné odstraňování Ν-α-ochranných skupin piperidinem v závislosti na sekvenci (B. D. Larsen, C. Larsen a A. Holm, Peptides 1990; E. Giralt a D. Andreu, (eds.) 1991 ESCOM Science Publishers B. V., str. 193 - 185 a Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9). Výzkumy ukázaly, že tento jev byl spojen s následnou pomalou a neúplnou vazbou aminokyseliny a jako příčina obtížné vazby a neúplného odstranění Fmoc byl ukázán důkaz agregace rostoucího peptidového řetězce od β—listu. Tento důkaz byl založen na obecných fyzikálně-chemických pozorováních (Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9) a na podrobném studiu Ramanova spektra v blízké infračervené oblasti (Due Larsen, B., Christensens, D. H., Holm, A., Zillmer, R., a Faurskov, O. (1993), J. Amer. Chem. Soc. 115, 6247 - 6253). Uvedená fyzikálně-chemická pozorování mohou být shrnuta následujícím způsobem: v případě syntézy H-(Ala)_n-Lys-OH na polyamidem polymerizované křemelinové matrix (PepSynK) nebyly pozorovány žádné problémy až do n = 5, ale pro n = 6 bylo po provedení standardního odstranění ochranných skupin piperidinem (20 % piperidin v DMF) stále ještě přítomno přibližně 20 až 25 % peptidu chráněného Fmoc. Při pokračování syntézy na n = 10 byla získána relativně komplikovaná směs obsahující cílový peptid (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 6, 7, 8, a 9 a deleční peptidy se skupinou Fmoc stále ještě připojenou na N-konec, kde n = 6, 7, 8 a 9 (obr. 1). Tato směs byla po separaci HPLC na jednotlivé složky identifikována FAB MS. Chybné sekvence nebo částečné odstranění ochranné skupiny pro n = 2 až 5 nebo neúplné odstranění ochranných skupin z cílového peptidu (n = 10) nebylo pozorováno, takže problém bylo možno přiřadit dané oblasti homo-oligopeptidového řetězce. Tento typ obtížných aminoacylací a neúplného odstraňování ochranných skupin je proto možno označit jako nenáhodný na rozdíl od náhodných obtíží, které jsou způsobeny pouze běžnými sférickými problémy (Kent, S. B. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989). Ačkoliv byly měněny experimentální podmínky, například typ pryskyřice, doba kroku odstraňování ochranných skupin, rozpouštědla, přidávání chaotropních látek, problémy stále přetrvávaly, i když optimální vliv na nekompletní odstraňování skupiny Fmocmělo zahřívání na 50 °C (Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9).

Nejcharakterističtějším rysem homo-oligoanalinového řetězce je to, že kroky neúplného odstranění Fmoc jsou následovány výrazně pomalými acylacemi další aminokyselinou v sekvenci. Efektivní doby acylace pro každý z prvních šesti alaninů jsou menší než 60 minut, zatímco úplná acylace u Ala₇, Ala₈, Ala₉ a Alaio je 26,28, 30 popřípadě 7 hodin (obr. 2).

Kent, S. B. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989 navrhuje řadu řešení problému týkajícího se nesnází spojených s vazbou závislou na sekvenci, například použití tepla při kroku vazby a kvantitativní přeměnu zbytkových nezreagovaných peptidových řetězců navázaných na pryskyřici na ukončené peptidy v kroku navázání „čepičky“.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí zlepšené metody SPPS, kterou je možno syntetizovat s vysokým výtěžkem a čistotou peptidy, které jsou známy nebo se ukážou jako „nesnadno syntetizovatelné sekvence“.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout zlepšený způsob SPPS, kterým se dosáhne snížení doby reakce nejen pro nesnadno syntetizovatelné sekvence, ale i pro jinak nekomplikované sekvence, kde je žádoucí snížit za normálních okolností dlouhé doby reakcí.

-6CZ 295838 B6

Způsob, kterým se dosahuje tohoto a dalších předmětů a výhod vynálezu, bude zřejmý z následujícího podrobnějšího popisu a obrázků, které ukazují záznamy HPLC pro různé peptidy získané syntézou na pevné fázi.

Pro objasnění problémů popsaných výše s ohledem na prameny B. D. Larsen, C. Larsen a A. Holm, Peptides 1990; E. Giralt a D. Andreu, (eds.) 1991 ESCOM Science Publishers B. V., str. 193 - 185 a Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9 se autoři předkládaného vynálezu zaměřili za otázku, do jaké míry může být stupeň tvorby struktury typu β-listu homo-oligoalaninového řetězce ovlivněn zavedením kratší peptidové sekvence, presekvence, do řetězce na C-konci. Tato otázka je spojena se skutečností, že proteinové struktury a polypeptidové sekvence mohou mít oblasti s dobře definovanými strukturami závislými na aminokyselinách v sekvenci a na předcházejících aminokyselinách. Jak bylo uvedeno dříve, výzkumy podle Chou, P. Y. a Fasman, G. D. (1978), Annu Rev. Biochem. 47, 251 - 276, týkající se proteinových struktur vedly k poznání tříd aminokyselin definovaných jako indukující převážně α-šroubovici, β—list nebo indukující náhodné svinutí. Ačkoliv je možno předpokládat, že podobné předpovědi mohou platit pro homo-oligoalaniny nebo leuciny, bylo ukázáno, že pravidla Choua a Fasmana nepředpovídají vytváření struktur typu β-listu homo-oligoalaninovými nebo leucinovými peptidy. Navíc nelze očekávat, že by pravidla, která odvodili Chou a Fasman, mohla být použita při syntéze peptidů na pryskyřici a jasně nemohou platit, jestliže se účastní syntézy aminokyseliny s chráněným postranním řetězcem.

V základních studiích byla zkoumána syntéza molekuly H-(Ala)_n-(Lys)_m-OH, kde (Lys)_m znamená pre-sekvenci s m rovným 1, 3 a 6. Byla použita verze syntézy na pevné fázi polyamidu s kontinuálním průtokem (Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137) na plně automatizovaném syntezátoru peptidů jak bylo popsáno dříve (Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270- 272) s použitím DMF jako rozpouštědla, trojnásobného přebytku Fmoc-alaninu a esterů Fmoc-lysin(tBoc)-pfp, a standardního odstranění ochranných skupin Fmoc 20 % piperidinem v DMF po dobu 10 minut. Doby reakce byly monitorovány pomocí Dhbt-OH, který se deprotonuje na žlutý aniont Dbht-O“, pokud jsou ještě přítomny neacylované aminoskupiny, a zmizení žluté barvy označuje konec syntézy. Po odštěpení peptidů z pryskyřice 95 % vodnou TFA byl produkt promyt etherem a analyzován HPLC. Výsledky pro m = 1 jsou popsány výše (obr. 1). V případě m = 3 je ze záznamu HPLC na obr. 3 vidět, že syntéza může pokračovat až kAlaio bez detekovatelných množství delečních peptidů nebo neúplného odstranění Fmoc. Když se však pokračuje v syntéze až k Ala₂₀, chromatogram (obr. 4) ukazuje přítomnost delečních peptidů. Výsledky jsou ještě výraznější pro H-(Ala)_n-(Lys)₆-OH, kde se produkty bez detekovatelných delečních peptidů získají jak pro Alaio (obr. 5), tak i pro Ala₂o (obr. 6). Navíc se doby reakcí drasticky sníží z až 30 hodin pro standardní reakce na < 2 hodiny pro jeden krok. Sekvence H-Ala₂₀-OH byla dosud syntetizována metodologií Boc, ale byly získány vysoké hladiny delečních a inzerčních peptidů (Merrifield, R. B., Singer, J. a Chait, B. T. (1988), Anal. Biochem. 174, 399- 414). Presekvence Lys6, která je za převažujících podmínek syntézy zcela chráněna skupinou tBoc, má nejsilnější a nejpříznivější vliv na strukturu rostoucího peptidového řetězce, protože odstraňuje jinak velmi vážné potíže při syntéze způsobené nekompletním odstraňováním ochranných skupin a extrémně pomalou reakcí.

V souladu s těmito třemi překvapujícími objevy je předkládaný vynález založen na zavedení zvláštní pre-sekvence do C-koncové části připojené na pevný nosič.

To je zcela základní průlom proti pokusům podle dosavadního stavu techniky, kde byl kladen v případě nesnadno syntetizovatelných sekvencí důraz na podmínky reakce a povahu pevného nosiče.

Jak bude dále diskutováno níže, C-koncová sekvence, kterou je požadovaný peptid připojen na pevný nosič, by mohla také zahrnovat vhodné linkery (mezičlánky) pro dosažení například lepšího připojení nebo lepších podmínek pro odštěpení.

-7CZ 295838 B6

Předmětem vynálezu je způsob výroby peptidů

X-AAi-AA₂.....AA_n-Y, kde AA je zbytek L- nebo D-aminokyseliny, X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny, Y je OH, NH₂ a n je celé číslo větší než 2, syntézou na pevné fázi, kde C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného reaktivního derivátu, v případě nutnosti s chráněným postranním řetězcem, je navázána na pevný nosič nebo polymer, případně prostřednictvím linkeru, potom zbavena Ν-α-ochranné skupiny, a následující aminokyseliny vytvářející sekvenci peptidu jsou postupně navazovány nebo navazovány jako peptidové fragmenty ve formě vhodně chráněných reaktivních derivátů nebo fragmentů, kde po vytvoření požadovaného peptidu je Ν-α-ochranná skupina z požadovaného peptidu odstraněna a peptid je odštěpen z pevného nosiče, který je charakterizován dále uvedenými kroky: zvolí se pre-sekvence tvořená 3 až 9 zbytky zvolenými nezávisle z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranního řetězce chráněnými v průběhu reakčních kroků a s faktorem náklonnosti Pa >0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ < 1,10, kde pre-sekvenci obsahuje C-koncová část uvedeného peptidu; a uvedená presekvence se z vytvořeného peptidu odštěpí.

L-aminokyseliny splňující výše uvedené limity pro faktory náklonnosti Pa a Ρβ jsou Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met a Gin.

Tyto aminokyseliny mají všechny funkční skupiny postranních řetězců ze skupiny karboxy, karboxamido, amino, hydroxy, guanidino, sulfid nebo imidazol.

Výhodné aminokyseliny v pre-sekvenci jsou Lys a Glu a jejich kombinace, například (Glu)_q(Lys)_p, kde p + q je 3 až 9, s výhodou 6 až 9, a pořadí Lys a Glu je zvoleno libovolně.

Ν-α-aminoskupina aminokyselin při každém vazebném kroku použitých peptidových fragmentů by měla být vhodně při reakci chráněna. Ochranná skupina může být Fmoc nebo Boc nebo jakákoliv jiná vhodná ochranná skupina, jako jsou například výše popsané skupiny podle odkazů Stewart, J. M. a Young, J. D., Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Company (1984), Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270- 272, Meldal, M., Bisgaard Holm, C., Boejesen, G., Havsteen Jakobsen, M. a Holm, A. (1993), Int. J. Peptide and Protein Res. 41, 250 - 260, McKenzie, A., Pirie, D. J. C. (1936), Berichte 69, 868, Knorr, E. (1904), Berichte 37, 3172, Peptides: Synthesis, structures and applications, Gutte, B., ed. Academie Press lne. 1995. Výhodnou ochrannou skupinou Ν-α-aminokyseliny je Fmoc.

Důležité je, aby byly funkční skupiny postranního řetězce v pre-sekvenci v průběhu reakčních kroků vhodně chráněny. Ochranné skupiny použitelné k tomuto účelu jsou odborníkovi v oboru dobře známy a výhodné skupiny se uvádějí v nárocích 7-12.

Aniž by si autoři přáli být vázáni náklonnou teorií, předpokládá se, že fyzikálně-chemické vlastnosti chráněného postranního řetězce pre-sekvence, jako například lysinu, jsou odpovědné za pozorovanou „peptidovou syntézu, při které napomáhá struktura“ („structural assisted peptide synthesis, SAPS“) snížením nebo odstraněním tvorby β-listu v polyalaninové sekvenci.

V případě jiných homo-oligo pre-sekvencí bylo pozorováno, že (Glu(tBu))₆ stejně jako smíšená sekvence (Glu(tBu)Lys(tBoc))₃ indukuje u polyalaninového řetězce výhodnou strukturu, což umožňuje vytvoření produktů bez delečních peptidů.

Pro zjištění, zdaje SAPS obecnější jev, nebo zdaje vlastní pouze homo-oligopeptidům jako je sekvence polyalanin, byly zkoumány směsné sekvence známéjako nesnadno syntetizovatelné.

Syntéza H-VQAAIDYING-OH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74 je dobře známá obtížná syntéza, která byla použita jako modelová reakce v řadě případů (Cameron, L. R., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun., 270 - 272). Při standardní syntéze byly pozorovány deleční peptidy speptidem des-Val (vrchol 2) jako převažujícím vedlejším produktem (viz příklad 7 a obr. 7).

Podle vynálezu byla syntetizována sekvence H-VQAAIDYING-K₆-OH s použitím presekvence (Lys(tBoc))_Ď připojené na C-konec materiálu pepsyn K. Syntéza probíhala za poskytnutí produktu se správnou molekulovou hmotností s vysokou čistotou a významně sníženým množstvím peptidu des-Val (viz příklad 8 a obr. 8).

Udává se, že další nesnadno syntetizovatelnou sekvencí je H-VNVNVQVQVD-OH, která byla syntetizována na řadě pryskyřic (polymer Rapp, PEG-PS, Pepsyn K, PEGA 199/300, PEGA 800/130 a PEGA 300/130), ve všech případech se značnou převahou glutaminu z Val¹ kromě použití pryskyřice PEGA 1900/300 (Meldal, M. (1993), Peptides 1993; Schneider, C. H. a Eberle, A. N. (eds) 1993 ESCOM Science Publishers B. V., str. 61 - 62). Podle vynálezu probíhala syntéza H-VNVNVQVQVDK₆-OH za získání produktů se správnou molekulovou hmotností. Ve spektru nebyly detekovány deleční peptidy (viz příklad 9).

Pro ověření dalšího důležitého hlediska předkládaného vynálezu, tj. snížených dob reakcí získaných zavedením pre-sekvence na C-koncové části požadovaného peptidu byly monitorovány reakční doby u jednotlivých aminokyselin při syntéze enkefalinu, H-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOH, s a bez pre-sekvence (Lys(tBoc))₆ podle popisu v příkladu 15.

Výsledky měření ukazují, že reakční doby u této jinak nekomplikované syntézy efektivně probíhají v kombinaci se zvolenou pre-sekvencí.

Ve výše uvedených případech byly peptidové sekvence získány s hexalysinovou pre-sekvencí, která může být pro některé účely přijatelná nebo dokonce výhodná. Tak například β—list vytvářející sekvence mohou způsobovat vážné potíže s rozpustností, ale v případě H-Ala₂o(Lys)6-OH se peptid změnil na rozpustný ve vodném roztoku, zatímco H-Alai₀-Lys-OH se velmi rychle srážel z roztoků TFA při zředění vodou. V případě (Glu)₆ může být využita rozpustnost poskytnutá presekvencí a větším množstvím karboxylových skupin. Například pro metodu ELISA, kde je možné místní připojení na povrch aktivovaný vhodnými aminoskupinami, protože je možná snadná aktivace ve vodném roztoku například karbodiimidem. Bylo také zvažováno, jakým způsobem mohou být tato pozorování využita pro praktickou syntézu peptidů bez přítomnosti pre-sekvence ve finálním produktu. Proto byly prováděny pokusy zavést mezi pre-sekvenci a cílový peptid, například pryskyřice-(Lys(tBoc)₆-linker-peptid, linker umožňující odštěpení peptidu z linkeru standardními činidly jako je roztok TFA. Zavedení běžně používaného linkeru HMPA jak se popisuje níže v příkladu 10, pryskyřice-(Lys(tBoc))6-HMPA-Lys(tBoc)Alai₀, však mělo jasně negativní vliv na syntézu H-Alai₀-Lys-OH, protože vznikaly deleční peptidy (obr. 9). Vliv pre-sekvence na polyalaninovou strukturu je zřejmě ztracen v důsledku toho, že aromatická skupina v linkeru rozbijí strukturní efekt v peptidové kostře (Ala)_n-(Lys_m). Pro zachování strukturního efektu bylo zkoumáno zavedení opticky aktivního linkeru mezi (Ala)_n a (Lys)_m s použitím kyseliny 4-methoxymandlové (MMa) jako možného kandidáta. Tento typ linkeru pravděpodobně nebyl dosud použit. Předpokládá se, že přítomnost methoxylové skupiny umožní odštěpení cílového peptidu z linkeru pomocí standardních štěpících roztoků s obsahem TFA. Kyselina 4—methoxymandlová může být rozlišena na své opticky aktivní formy, z nichž konfigurace R ((+)-konfigurace) je identická s L-proteinovými aminokyselinami. Byly provedeny dva typy experimentů: (a) syntéza s použitím racemické kyseliny 4-methoxymandlové; (b) syntéza s použitím kyseliny R-4-methoxymandlové (R-MMa). Schéma syntézy je ukázáno níže (schéma 1) a dále ilustrováno v příkladech 11, 12, 13 a 14.

-9CZ 295838 B6

Schéma 1

OMe

(r¥- CONHCH_zCH₂NH-(A A)_m-NHCO-CHOH

Fmoc-AAi-OH aktivace

OMe

1. Odstranění Fmoc (r)—CONHCH₂CH₇NH-(AA)_ftl-NHCO-CH-OCO-CnR-NllFmoc

2. Vazba s 1. Fmoc-AA atd.

V prvním případě byla syntetizována sekvence pryskyřice-(Lys(tBoc))6-MMa-Lys-Alai₀ pro získám H-Lys-Alaio-OH, kde lysinová skupina je zavedena pro zvýšení rozpustnosti ve vodném roztoku pro analýzu HPLC. Výsledky analýzy HPLC jsou uvedeny v obr. 10. Bylo dosaženo mnohem lepšího produktu než v případě linkeru HMPA (obr. 9 a příklad 10), ačkoliv jsou přítomny deleční peptidy. V případě (b) byl syntetizován stejný peptid za stejných podmínek a došlo k vytvoření peptidu bez detekovatelných delečních peptidů nebo neúplného odstranění skupiny Fmoc. Tyto výsledky mohou být porovnány se syntézou H-Lys-Alaio-OH s použitím konstruktu pryskyřice-MMa-Lys-Alaio, kde je vynechána pre-sekvence (Lys)tBoc))₆. Jsou vidět významná množství delečních peptidů.

Podle uvedených pozorování se další hledisko předkládaného vynálezu týká způsobu syntézy peptidů na pevné fázi popsaného výše vyznačujícího se dalším lysém, tj. že mezi pre-sekvenci připojenou k nosiči a požadovanou peptidovou sekvenci AAi-AA_n je vložen linker, který umožňuje selektivní odštěpení uvedené sekvence. S výhodou je linker opticky aktivní. Použitelná skupina linkerů jsou α-hydroxy a α-aminokyseliny obecného vzorce

X —C —COOH_Z

R₂ kde X je OH nebo NH₂ a R¹ a R² jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, Ci_₃alkyl, fenyl a substituovaný fenyl, kde substituenty jsou jeden nebo více substituentů schopných darovat elektron, například zvolené ze skupiny Ci_₃alkoxy, Ci_₃alkyl nebo jsou spojeny dvě vicinální skupiny substituentů za vytvoření 5- nebo 6-členného kruhu spolu s atomy uhlíku, ke kterému jsou připojeny.

Nejvýhodnějšími linkery jsou racemická kyselina 4-methoxymandlová, kyselina (+)^4-methoxymandlová, difenylglycin a kyselina glykolová.

Je třeba rozumět, že jestliže X je OH, produktem vytvořeným po štěpení bude peptid AAi-AA_n-OH, tj. Y = OH, zatímco v případě kde X je NH₂ bude vytvořen amid peptidu AAi-AA_n-NH₂, tj.

Y = NH₂.

-10CZ 295838 B6

V ještě dalším provedení vynálezu se vloží mezi pre-sekvenci navázanou na nosič a sekvenci AAj-AA_n první linker, a mezi pre-sekvenci a pevný nosič se vloží druhý linker, s ortogonálními podmínkami štěpení vzhledem k prvnímu linkeru, umožňujícími selektivní odštěpení druhého linkeru, např. působením kyseliny trifluoroctové (TFA), kyseliny trifluormethansulfonové (TFMSA), HBr, HC1, HF, nebo báze jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid, za poskytnutí požadovaného peptidu AA]-AA_n navázaného na pre-sekvenci prostřednictvím uvedeného prvního linkeru, který se potom od pre-sekvence popřípadě odštěpí.

Při syntéze na pevné fázi způsobem podle vynálezu se mohou používat činidla využívající jeden nebo více z výše popsaných znaků týkajících se pre-sekvencí a linkerů.

První takové činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi může mít obecný vzorec

X-AA' J-... .-AA'_m-Y!-R, kde R je pevný nosič použitelný při syntéze peptidů na pevné fázi, Yi je aminokyselinová sekvence obsahující od 3 do 9, s výhodou od 5 do 7 zbytků aminokyselin nezávisle zvolených z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranních řetězců chráněnými při krocích reakce a s faktory náklonnosti Pa > 0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ < 1,10, například Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met nebo Gin, nebo odpovídajících D-aminokyselin, AA' je zbytek Lnebo D-aminokyseliny, m je 0 nebo celé číslo od 1 do 40 a X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny.

Druhé takové činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi může mít obecný vzorec

X-AA'₁-....-AA'_ra-Li-Yi-R, kde X, AA', m, Yi a R jsou jak definováno výše a Li je s výhodou opticky aktivní linker, který umožňuje selektivní odštěpení vazby na AA'_m.

Výhodné linkery jsou α-hydroxy nebo a-aminokyseliny jak je popsáno výše.

Třetí takové činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi může mít obecný vzorec

X-AA' i- -AA^-Lj-Yj-Lr-R, kde X, AA', m, Y_b R a Li jsou jak definováno výše a L₂ je linker, umožňující selektivní odštěpení z pevného nosiče.

Čtvrté takové činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi může mít obecný vzorec

X-AA'!-....-AA'_m-Yi-L₂-R, kde X, AA', m, Y_b R a L₂ je jak definováno výše.

Je zřejmé, že výše uvedená činidla mohou být ve formě polymerů, gelů nebo jiných pevných fází připravených pro syntézu peptidů na pevné fázi podle vynálezu tím, že

a) obsahují pre-sekvenci a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (první hledisko) nebo

b) obsahují pre-sekvenci, s výhodou opticky aktivní Štěpící linker a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (druhé hledisko) nebo

c) obsahují druhý linker umožňující odštěpení z nosiče, pre-sekvenci, první s výhodou opticky aktivní linker umožňující odštěpení a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (třetí hledisko) a

d) obsahují linker umožňující odštěpení z nosiče, pre-sekvenci a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (čtvrté hledisko).

-11 CZ 295838 B6

Konkrétní podmínky použité při experimentech, na kterých je vynález založen, jsou uvedeny níže mezi obecnými postupy.

Obecně řečeno, bez ohledu na nové a charakteristické rysy týkající se pre-sekvence a nových linkerů pro štěpení může být způsob podle vynálezu prováděn za tradičních podmínek syntézy peptidů na pevné fázi popsaných v literatuře uváděné v části Dosavadní stav techniky.

Může však být vhodný následující krátký souhrn.

Skupiny Fmoc mohou být odstraněny působením aminu jako je piperidin nebo diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU).

Ochranné skupiny postranního řetězce mohou být odstraněny kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), HBr, HC1 nebo HF.

Pevný nosič se s výhodou volí z funkcionalizovaných pryskyřic jako je polystyren, polyakrylamid, polyethylenglykol, celulóza, polyethylen, latex nebo dynabeads.

V případě potřeby mohou být navázány C-koncové aminokyseliny na pevný nosič běžným linkerem jako je 2,4~dimethoxy-4'-hydroxybenzofenon, kyselina 4-(4~hydroxy-methyl-3-methoxyfenoxyj-máselná (HMPB), kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, kyselina 4-hydroxymethylfenoxyoctová (HMPA), kyselina 3-(4-hydroxymethylfenoxy)propionová nebo kyselina p[(R,Sý-a[l-(9H-fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-fenoxyoctová(AM).

Syntéza může být prováděna vsádkovým způsobem nebo kontinuálně na automatickém nebo poloautomatickém syntezátoru peptidů.

Jednotlivé reakční kroky mohou být prováděny v přítomnosti rozpouštědla, například zvoleného ze skupiny acetonitril, Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), N-methylpyrrolidon (NMP), dichlormethan (DCM), trifluorethanol (TFE), ethanol, methanol, voda, směsi uvedených rozpouštědel s nebo bez dalších látek jako jsou chloristany nebo ethylenkarbonáty.

Jednotlivé vazby mezi aminokyselinami, aminokyselinou a dříve vytvořenou peptidovou sekvencí nebo peptidovým fragmentem a dříve vytvořenou peptidovou sekvencí mohou být prováděny běžnými kondenzačními způsoby jako je azidová metoda, metoda směsného anhydridu kyseliny, metoda symetrického anhydridu, karbodiimidová metoda, metoda aktivního esteru jako je pentafluorfenyl (Pfp), 3,4—dihydro-4—oxobenzotriazm-3-yl (Dhbt), benzotriazol-l-yl (Bt), 7-azabenzotriazol-l-yl (At), 4-nitrofenyl, imidoestery kyseliny N-hydroxyjantarové (NHS), chloridy kyselin, fluoridy kyselin, aktivace in šitu činidly jako O-(7-azábenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HATU), O-(benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HBTU), O-(benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorborát (TBTU) nebo benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexafluorfosfát (BOP).

Vytvořený peptid může být odštěpen od nosiče kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBR), chlorovodík (HC1), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid.

Alternativně se peptid odštěpuje od nosiče fotolýzou.

Při provedení, kdy je linker, vložen mezi pre-sekvenci připojenou na nosič a sekvenci AA]-AA_n umožňující selektivní odštěpení uvedené sekvence, může být uvedené štěpení prováděno kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBR), chlorovodík (HC1), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid.

-12CZ 295838 B6

Syntéza peptidu uskutečňovaná s pomocí sekvence (SAPS)

Postupy experimentů:

Syntéza peptidů

Obecné postupy

Přístroje a strategie syntézy

Peptidy byly syntetizovány buď vsádkovým způsobem v polyethylenové nádobě opatřené polypropylenovým filtrem pro filtraci, nebo kontinuální průtokovou verzí metody na pevné fázi polyamidu (Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137) na plně automatickém syntezátoru peptidů (Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270 - 272) s použitím 9-fluorenylmethyloxykarbonylu (Fmoc) nebo tercbutyloxykarbonylu (Boc) jako Ν-α-aminových ochranných skupin a vhodných společných ochranných skupin pro funkční skupiny postranních řetězců.

Rozpouštědla

Rozpouštědlo DMF (Ν,Ν-dimethylformamid, Riedel de-Haen, Německo) bylo čištěno průchodem přes kolonu naplněnou silnou kationtovou iontoměničovou pryskyřicí (Lewatit S 100 MB/H silně kyselá, Bayer AG Leverkusen, Německo) a analyzováno na přítomnost volných aminů před použitím přídavkem 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazinu (Dhbt-OH), který poskytuje žluté zbarvení (aniont Dbht-O”) v přítomnosti volných aminů. Rozpouštědlo DCM (dichlormethan pro analýzu, Riedel de-Háen, Německo) byl přímo použit bez čištění.

Aminokyseliny

Aminokyseliny chráněné Fmoc a odpovídající pentafluorfenyl (Pfp) estery byly získány od firmy MilliGen, UK, NovaBiochem, Švýcarsko a Bachem, Švýcarsko a Dhbt-estery od firmy NovaBiochem, Švýcarsko s vhodně chráněnými postranními řetězci. Aminokyseliny chráněno Boc byly zakoupeny u firmy Bachem, Švýcarsko.

Vazebná činidla

Vazebné činidlo diizopropylkarbodiimid (DIC) bylo zakoupeno u firmy Riedel de-Haen, Německo a před použitím destilováno; dicyklohexylkarbodiimid (DCC) byl pořízen u firmy Merck-Schuchardt, Mnichov, Německo a čištěn destilací, O-benzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborát (TBTU) byl získán od firmy PerSeptive Biosystems GmbH Hamburk, Německo.

Linkery

Linkery HMPA, Novabiochem, Švýcarsko; kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, NovaBiochem; kyselina 4-methoxymandlová, Aldrich, Německo; HMPB, NovaBiochem; AM, NovaBiochem; kyselina 3-(4-hydroxymethylfenoxy)propionová, NovaBiochem, byly navázány na pryskyřici ve formě předem vytvořeného 1-hydroxybenzotriazolového (HObt) esteru vytvořeného pomocí DIC. Racemická kyselina 4-methoxymandlová (98 % čistoty, Aldrich, Německo) byla použita přímo jako linker nebo rozdělena působením (+)-cinchoninu (čistota 85 %, Aldrich, Německo) za poskytnutí opticky aktivního linkeru kyseliny (+)—4-methoxymandlové, [a]²⁰ = + 146 (voda) s95,8% opticky čistotou a kyselina (-)-4-methoxymandlová, [a]²⁰ = -128,6 (voda) s 88,1% optickou čistotou.

Rozdělení kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové (A. McKenzie, D. J. C. Pirie, McKenzie, A., Pirie, D. J. C. (1936), Berichte 69, 868; Knorr, E. (1904), Berichte 37, 3172)

-13 CZ 295838 B6

Kyselina (+/-)-4-methoxymandlová (10 g, 54,89 mmol; Aldrich 98 %) byla rozpuštěna v 500 ml horké vody (60 až 80 °C) a roztok byl dekantován za stálého zahřívání pro odstranění nerozpustných nečistot. Do horkého roztoku byl po malých částech přidán (+)-cinchonin (16,16 g, 54,89 mmol, Aldrich, 85 %, [a]_D ²⁰ = + 211° (podle literatuiy + 228°). Roztok se vyčeřil po 15 minutách míchání při 60 až 80 °C a byl ochlazen v ledu. Po 1 h byla sraženina shromážděna filtrací a sušena v exikátoru přes noc za získání 9,9 g cinchoninové soli. Sůl byla rekrystalizována z vařiči vody (80 ml), roztok byl za zahřívání dekantován a potom ochlazen v ledu. Sraženina byla oddělena filtrací po 1 hodině, třikrát promyta studenou vodou a sušena přes noc v exikátoru za získání 7,84 g (16,45 mmol). Cinchoninová sůl (2 g, 4,2 mmol) byla rozpuštěna ve 40 ml 2N HC1 a ihned extrahována 3 x 30 ml diethyletheru. Etherová fáze byla sušena nad Na2SO4 a odpařena dosucha za získání 0,55 g kyseliny 4-methoxymandlové. Optická čistota uvolněné kyseliny 4-methoxymandlová byla odhadnuta na 18,5 % ([a]D²⁰ = + 100,8°). Třetí rekrystalizací byla získána optická čistota 95,8 % ([a]D²⁰ = + 140,0°).

Pevné nosiče

Peptidy syntetizované strategií Fmoc byly syntetizovány na třech různých typech pevných nosičů s použitím koncentrací Fmoc-chráněné aktivované aminokyseliny v DMF 0,05M nebo vyšší. 1) PEG-PS (polyethylenglykol naroubovaný na polystyren; pryskyřice TentaGel S NH₂, 0,27 mmol/g, Rapp Polymere, Německo nebo pryskyřice NovaSyn TG, 0,29 mmol/g, Novabiochem, Švýcarsko); 2) PepSyn Gel (polydimethylakrylamidová pryskyřice funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu, 1,0 mmol/g; MilliGen, UK); 3) PepSyn K (polydimethylakrylamidová pryskyřice na křemelinovém nosiči funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu, 0,11 mmol/g; MilliGen, UK).

Peptidy syntetizované strategií Boc byly syntetizovány na Merrifieldově pryskyřici (polystyrendivinylbenzen) s připojenou první aminokyselinou (Novabiochem, Švýcarsko).

Katalyzátory a jiné reagencie

Diizopropylethylamin (DIEA) byl získán od firmy Aldrich, Německo a ethylendiamin od firmy Fluka, Švýcarsko, piperidin od firmy Riedel de-Haen, Frankfurt, Německo. 4-(N,N-dimethylamino)pyridin (DMAP) byl získán od firmy Fluka, Švýcarsko a použit jako katalyzátor při vazebných reakcích s účastí symetrických anhydridů. 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3benzotriazin (Dhbt-OH) byl získán od firmy Fluka, Švýcarsko a 1-hydroxybenzotriazol (HObt) od firmy NovaBiochem, Švýcarsko.

Postupy provádění vazby

První aminokyselina byla navázána jako symetrický anhydrid v DMF vytvořený znáklonné N-a-chráněné aminokyseliny a DIC. Následující aminokyseliny byly navázány jako Pfp- nebo Dhbt-estery nebo jako předem vytvořené HObt estery vyrobené z vhodných N-a-chráněných aminokyselin a HObt pomocí DIC nebo TBTU v DMF. V případě Fmoc byly všechny acylace kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C pro zabránění odštěpení ochranné skupiny Fmoc při testu (Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1-9).

Odstranění Ν-α-aminové ochranné skupiny

Odstranění ochranné skupiny Fmoc bylo provedeno působením 20 % piperidinu v DMF (1 x 3 a 1 x 7 min při syntéze vsádkovým způsobem) nebo průtokem rozpouštědla odstraňujícího ochranné skupiny přes pryskyřici (10 min, průtok 1 ml/min při kontinuální syntéze) s následným promýváním DMF, dokud již nebylo možno detekovat žlutou barvu (Dhbt-O^_) po přídavku Dhbt-OH od odtékajícího DMF.

-14CZ 295838 B6

Odstranění skupiny Boc bylo prováděno působením 50 % TFA vDCM (obj.) 1 x 1,5 min a 1 x 20 min s následným promytím 6 x 9 min vždy DCM, neutralizací 10 % triethylaminem v DCM (obj.) vždy 2 x 1,5 min a s následným promytím 6x9 min DCM.

Odštěpení peptidu z pryskyřice kyselinou

Peptidy byly oddělovány z pryskyřic působením 95 % kyseliny trifluoroctové (TEA, Halocarbon Products Corporation, USA; Biesterfeld & Co. Hamburk, Německo) ve vodě (obj.) při pokojové teplotě 2 hodiny. Odfiltrované pryskyřice byly promyty 95 % směsí TFA-voda a filtráty a promývací roztoky odpařeny za sníženého tlaku. Zbytek byl promyt etherem a lyofílizován ze směsi kyselina octová - voda. Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a identifikován metodou matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOF MS) nebo hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrorozprašováním (ESMS).

Štěpení peptidu z pryskyřice pomocí báze

Sušená pryskyřice (1 g) byla smísena s 1M hydroxidem sodným (10 ml) při 4 °C a ponechána 15 min při teplotě místnosti. Pryskyřice byla zfíltrována do láhve s obsahem 10% vodné kyseliny octové. Peptid byl izolován lyofílizací a gelovou filtrací.

Odštěpení peptidu z pryskyřice TFMSA

Sušená pryskyřice (250 mg) byla vložena do kulové baňky s míchací tyčinkou. Byla přidána směs thioanisol/ethandithiol (2:1, 750 μΐ), směs byla ochlazena v ledu, bylo přidáno 5 ml TFA a směs byla míchána 5 až 10 minut. Po kapkách byla přidána TFMSA (500 μΐ) a reakce pokračovala při teplotě místnosti 30 až 60 minut. Peptid se vysrážel přidáním etheru.

Odstranění ochranných skupin z postranních řetězců

Ochranné skupiny se odstraňují z postranních řetězců s výhodou při odštěpování peptidu z pryskyřice.

Předem vytvořený HObt-ester

Metoda a. 3 ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny byly rozpuštěny v DMF spolu s 3 ekv. HObt a 3 ekv. DIC. Roztok byl ponechán při pokojové teplotě 10 min a potom přidán k pryskyřici, která byla promyta roztokem 0,2 % Dhbt-OH v DMF před přídavkem předem aktivované aminokyseliny.

Metoda b. 3 ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny byly rozpuštěny v DMF spolu s 3 ekv. HObt, 3 ekv. TBTU a 4,5 ekv. DIEA. Roztok byl ponechán při teplotě místnosti 5 min a potom přidán k pryskyřici.

Předem vytvořený symetrický anhydrid ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny bylo rozpuštěno v DCM a ochlazeno na 0 °C. Byl přidán DCC (3 ekv.) a reakce pokračovala 10 minut. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a zbytky rozpuštěny v DMF. Roztok byl zfiltrován a ihned přidán k pryskyřici s následným přidáním 0,1 ekv. DMAP.

Odhad výtěžku vazby první Ν-α-amino chráněné aminokyseliny

K 3 až 5 mg suché Fmoc-chráněné sloučeniny peptid - pryskyřice bylo přidáno 5 ml 20% piperidinu v DMF v průběhu 10 min při teplotě místnosti a při 301 nm byla odhadována UV absorpce aduktu dibenzofulven-piperidin. Výtěžek byl stanoven s použitím vypočteného koeficientu e₃₀i vztaženého ke standardu Fmoc-Ala-OH.

- 15CZ 295838 B6

V případě ochrany Boc byl výtěžek vazby určován ninhydrinovou metodou po odstranění skupiny Boc (Sarin, V. K., Kent, S. B. H., Tam, J. P. a Merrifield, R. B. (1981), Anal. Biochem., 117, 147- 157).

Syntéza peptidů na pryskyřici PepSyn K

Suchá pryskyřice PepSyn K (přibližně 500 mg) byla přelita ethylendiaminem a ponechána při teplotě místnosti přes noc. Pryskyřice byla odsáta a promyta 10 x 15 ml DMF, vždy 5 minut. Po odtažení byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF (obj.) (2x15 ml, vždy 5 min) a nakonec promývána DMF, dokud již nemohlo být detekováno přídavkem Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. 3 ekv. HMPA, 3 ekv. HObt a 3 ekv. DIC byly rozpuštěny v 10 ml DMF a ponechány 10 min aktivovat; potom byla směs přidána k pryskyřici a vazba probíhala 24 hodin. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 minut) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Byla navázána první aminokyselina a ochrana postranního řetězce byla provedena symetrickým anhydrinem (viz výše); výtěžky reakce byly testovány jak bylo popsáno výše. Ve všech případech byly vyšší než 70 %. Syntéza potom pokračovala buď kontinuálně, nebo vsádkově, jak bude popsáno dále.

Kontinuální syntéza na pryskyřici PepSyn K použitím techniky kontinuálního průtoku

Pryskyřice (přibližně 500 mg) s připojenou první aminokyselinou byla vložena do kolony připojené na plně automatický syntezátor peptidů. Skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány ve formě chráněné Fmoc, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, estery Pfp (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Ukončení každé reakce bylo automaticky určováno monitorováním zmizení žlutého zbarvení aniontu Dhbt-OH spektrofotometricky. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s navázaným peptidem promyta DMF (průtok 1 ml/min, 10 min), DCM (vždy 3 min, 3 x 5 ml) a nakonec diethyletherem (3x5 ml), vyjmuta z kolony a sušena ve vakuu.

Pokračování vsádkové syntézy peptidů na pryskyřici PepSyn K

Pryskyřice (přibližně 500 mg) s navázanou první aminokyselinou byla vložena do polyethylenové nádoby opatřené polypropylenovým filtrem a byla odstraněna skupina Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako předem vytvořené, Fmocchráněné, v případě potřeby s chráněnými postranními řetězci, HObt estery (3 ekv.) v DMF (5 ml) vyrobené jak bylo popsáno výše. Vazebné reakce pokračovaly 2 h, pokud není uvedeno jinak. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Všechny acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (5x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem (5x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

Vsádková syntéza peptidů na PEG-PS

Pryskyřice TentaGel S NH₂ nebo NovaSyn TG (250 mg, 0,27 - 0,29 mmol/g) byla vložena do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem. Pryskyřice byla ponechána bobtnat v DMF (5 ml) a byla smísena s 20% piperidinem v DMF pro zajištění přítomnosti neprotonovaných aminoskupin na pryskyřici. Pryskyřice byla odsáta a promývána DMF, dokud nemohlo být detekováno po přídavku Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. Byla provedena reakce HMPA (3 ekv.) jako předem vytvořeného esteru HObt jak bylo popsáno výše a reakce byla ponechána probíhat 24 h. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x5 ml, vždy 5 min) a acylace byla zkontrolována ninhydrinovým testem. První aminokyselina byla navázána ve formě předem vytvořeného symetrického anhydridu jak bylo popsáno výše. Vazebné výtěžky prvních aminokyselin chráněných Fmoc byly určovány výše popsaným způsobem. Ve všech případech byly lepší než 60 %. Následující aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako předem vytvořené, Fmocchráněné, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, estery HObt (3 ekv.) jak bylo popsáno výše. Vazebné reakce pokračovaly 2 hodiny, pokud není uvedeno jinak. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x5 ml, vždy 5 min) pro odstranění nadbytku činidla. Všechny acylace

-16CZ 295838 B6 byly kontrolovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C. Po ukončené syntéze byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (3x5 ml, vždy 5 min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

Vsádková syntéza peptidů na gelu PepSyn

Sušená pryskyřice PepSyn Gel (500 mg, 1 mmol/g) byla vložena do polyethylenové nádoby opatřené polypropylenovým fdtrem. Pryskyřice byla ponechána bobtnat v ethylendiaminu (15 ml) a byla mírně míchána třepáním 20 hodin. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 min). Po odsátí byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF (obj.) (2x15 ml, vždy 5 min) a nakonec promyta DMF (5 x 15 ml, vždy 5 min), až již nebylo detekováno po přidání Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. HMPA (3 ekv.) byla navázána jako předem aktivovaný ester HObt jak bylo popsáno výše (metoda a) a vazba pokračovala 24 h. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x15 ml, vždy 5 min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. První aminokyselina byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše. Vazebné výtěžky pro první aminokyseliny chráněné Fmoc byly odhadnuty jak bylo popsáno výše. Ve všech případech byly lepší než 70 %. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako předem vytvořené estery HObt (3 ekv.) chráněné Fmoc, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, jak bylo popsáno výše (metoda a). Vazby pokračovaly 2 hodiny a v případě potřeby ještě přes noc. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x5 ml, vždy 5 min) pro odstranění nadbytku činidla. Všechny acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (3x15 ml, vždy 5 min), DCM (3x15 min, vždy 2 min) a nakonec diethyletherem (3x15 ml, vždy 2 min) a sušena ve vakuu.

Podmínky HPLC

HPLC byla prováděna na přístroji Waters 600 E opatřeném detektorem Waters 996 Photodiode array detector s kolonou Waters Radial Pak 8 x 100 mm Ci₈ s reverzní fází. Pufr A byl 0,1 objemových procent TFA ve vodě a pufr B 90 obj. procent acetonitrilu, 9,9 obj. % vody a 0,1 obj. % TFA. Pufry byly čerpány přes kolonu s průtokem l,5ml/min s použitím gradientu: 1. Lineární gradient od 0 do 70 % B (20 min), lineární gradient od 70 do 100 % B (1 min), izokraticky 100 % B (5 min). 2. Izokraticky 0 % B (2 min), lineární gradient od 0 do 50 % B (23 min), lineární gradient od 50 do 100 % B (5 min), izokraticky 100 % B (5 min).

Hmotnostní spektroskopie

Hmotnostní spektra typu matrix assisted laser desorbtion ionization time-of-flight (MALDI TOF) byla získávána na přístroji Fisons TofSpec E. Hmotnostní spektra s elektrorozprašovací ionizací byla získávána na přístroji Finnigan Mat LCQ opatřeném elektrorozprašovací (ESI) sondou (ES-MS).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je záznam HPLC surového H-Ala₁₀-Lys-OH ukazující podstatná množství delečních peptidů (vrcholy 1, 2, 3 a 4) a peptidů s neúplně odstraněným Fmoc (vrcholy 6, 7, 8 a 9) v přítomnosti cílového peptidu (vrchol 5).

Obr. 2 je diagram znázorňující postupné doby reakce pro každý zalaninů při syntéze H-AlaioLys-OH.

Obr. 3 je záznam HPLC H~Alaio-Lys₃-OH ukazující cílový peptid. Nebyly pozorovány deleční peptidy.

-17CZ 295838 B6

Obr. 4 je záznam HPLC H-Ala₂₀-Lys₃-OH ukazující deleční peptidy (vrcholy 1, 2, 3, 4 a 5) mimo cílového peptidů (vrchol 6).

Obr. 5 je záznam HPLC H-Alai₀-Lys₆-OH. Nejsou vidět žádné deleční peptidy.

Obr. 6 je záznam HPLC H-Ala₂o-Lys₆-OH. Nejsou vidět žádné deleční peptidy.

Obr. 7 je záznam HPLC H-VQAAIDYING-OH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74. Cílový peptid (vrchol 3) je doprovázen delečními peptidy (vrchol 2 patří peptidů des-Val).

Obr. 8 je záznam HPLC H-VQAAIDYING-K6-OH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74 navázaný na pre-sekvenci Lys(Boc)₆ s přítomností pouze malého množství peptidů des-Val (vrchol 1).

Obr. 9 je záznam HPLC H-Alai₀-Lys-OH vyrobeného přidáním linkeru HMPA. Je vidět několik delečních peptidů (z Ala_i0-Lys(tBoc)-HMPA-(Lys(tBoc))6-pryskyřice).

Obr. 10 je podobný záznam HPLC H-Alai₀-Lys-OH vyrobeného použitím linkeru MMa. Je vidět podstatné snížení množství delečních peptidů ve srovnání s obr. 9 (z Ala_]0-LysMMa-(Lys(tBoc))₆-pryskyřice).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza H-Ala₁₀-Lys-OH (srovnání)

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že jde o komplikovanou směs obsahující cílový peptid (n = 10) i deleční peptidy odpovídající n = 6, 7, 8 a 9 a deleční peptidy, u kteiých byla skupina Fmoc stále připojena na N-konec s n = 6, 7, 8, popřípadě 9. Identita jednotlivých peptidů byla potvrzena metodou MALDI TOF MS.

Příklad 2

Syntéza H-Alai₀-Lys₃-OH

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenníbez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 91,0 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 3). Identita peptidů byla potvrzena použitím metody MALDI TOF MS.

Příklad 3

Syntéza H-Ala]₀-Lys6-OH

500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenníbez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 90,9 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 5). Identita peptidů byla potvrzena ES MS.

Příklad 4

Syntéza H-Ala₂o-Lys₃-OH

- 18CZ 295838 B6

500 mg Fmoc-Ala₁₀-(Lys(Boc))3 pryskyřice PepSyn KA (ze syntézy H-Alai₀-Lys₃-OH) bylo použito pro syntézu metodou kontinuálního průtoku.

Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Ala_n-Lys₃-OH (n = 20) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 19, 18, 17 a 16 (viz obr. 4). Sekvence chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena ESMS.

Příklad 5

Syntéza H-Ala₂₀-Lyse-OH

500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.

Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, zeje homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 91,4 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 6). Identita peptidu byla potvrzena ES MS.

Příklad 6

Syntéza H-Ala₂₀-Lys-(Glu-Lys)₃-OH

500 mg pryskyřice Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu metodou kontinuálního průtoku.

Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC. Bylo zjištěno, že čistota je lepší než 98 % bez přítomnosti delečních a Fmoc-chráněných sekvencí. Výtěžek 97 %. Identita peptidu byla potvrzena ES MS.

Příklad 7

Syntéza úseku 65 - 74 Acyl Carrier Protein (ACP), H-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-AsnGly-OH (srovnání)

500 mg Fmoc-Gly pryskyřice PepSyn KA (0,074 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.

Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílovou molekulu doprovázenou přibližně 16 % peptidu des-Val. Identita peptidů byla potvrzena technikou MALDITOF MS.

Příklad 8

Syntéza úseku 65 - 74 Acyl Carrier Protein (ACP), H-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-AsnGly-Lys₆-OH s použitím pre-sekvence (Lys(Boc))₆

500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.

Surový lyofílizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid s vysokou čistotou (~ 95 %) s podstatně sníženým množstvím peptidu des-Val. Identita peptidů byla potvrzena technikou MALDI TOF MS.

Příklad 9

Syntéza H-Val-Asn-Val-Asn-Val-Gln-Val-Gln-Val-Asp-Lyse-ΟΗ s použitím pre-sekvence (Lys(Boc))₆

-19CZ 295838 B6

500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že má čistotu lepší než 90 %) bez delečních peptidů a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 100 %. Identita peptidů byla potvrzena technikou MALDITOF MS.

Příklad 10

Syntéza H-Alai₀-Lys-OH s použitím (Lys(Boc))₆ jako pre-sekvence a HMPA jako linkeru (H-Ala_]0-Lys(Boc)-OCH₂-PhOCH₂CO-(Lys(Boc))₆-NHCH₂CH₂NH PepSyn K)

500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo překryto ethylendiaminem (5 ml) a ponecháno při teplotě místnosti přes noc. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 min). Po odsátí byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF obj. (2x15 ml, vždy 5 min) a nakonec DMF, až již nebylo detekováno po přídavku Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. Derivatizovaná pryskyřice byla použita pro syntézu technikou kontinuálního průtoku.

Prvních 6 lyzinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno ve formě esterů Fmoc-Lys(Boc)-Pfp (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl určován automaticky jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odštěpena jak bylo popsáno výše. Po ukončení byla na vrchol kolony nanesena pre-sekvence 3 ekv. navázaná na HMPA ve formě předaktivovaného esteru HObt jak bylo popsáno výše. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odstraněn pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. Příští aminokyselina podle sekvence byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše nanesený na vrchol kolony spolu s 0,1 ekv. DMAP a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min. Nadbytek reagencie byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku vazby, který byl odhadnut jak bylo popsáno dříve; byla zjištěna hodnota 84 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako estery Pfp (3 ekv.) chráněné Fmoc, popřípadě s chráněným postranním řetězcem, za přidávání Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl automaticky určen jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice speptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min), odstraněna z kolony a sušena ve vakuu. Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Ala_n-Lys-OH (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 9, 8, 7 a 6 (viz obr. 9). Sekvence chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena metodou MALDI TOF MS.

Příklad 11

Syntéza H-Alai₀-Lys-OH s použitím kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Ala₁₀-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CONHCH₂CH₂NH PepSyn K)

500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo smíseno s ethylendiaminem jak bylo popsáno výše. Derivatizovaná pryskyřice byla použita pro syntézu metodou kontinuálního průtoku. Na vrchol kolony bylo naneseno 10 ekv. kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové, 10 ekv. HObt a 10 ekv. DIC rozpuštěné v 5 ml DMF, předaktivované 10 min a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. První aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a nanesena na vrchol kolony spolu s 0,1 ekv. DMAP a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min. Potom byl nadbytek

-20CZ 295838 B6 reagencie odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Byl odebrán malý vzorek pryskyřice pro kontrolu výtěžku reakce, který byl testován podle výše uvedeného popisu; byl zjištěn výtěžek 75 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako estery Pfp chráněné Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl určován automaticky jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem, odstraněna z kolony a sušena ve vakuu.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno dříve a lyofilizován z roztoku kyselina octová - voda.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Ala_n-Lys-OH (n = 10) spolu s delečními peptidy odpovídajícími n = 9, 8, 7 a 6. Identita peptidů byla potvrzena MALDI TOS MS.

Příklad 12

Syntéza H-Alai₀-Lys-OH s použitím (Lys(Boc))₆ jako pre-sekvence a kyseliny (+/-)-4methoxymandlové jako linkeru (H-Alai₀-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Lys(Boc))6NHCH₂CH₂NH PepSyn K)

500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo smí seno s ethylendiaminem jak bylo popsáno výše. Derivatizovaná pryskyřice byla použita pro syntézu způsobem kontinuálního průtoku. Prvních šest lysinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako estery Pfp (3 ekv.) chráněné Fmoc a s chráněnými postranními řetězci za přídavku Dhbt-IH (1 ekv.). Konec každé reakce byl automaticky stanoven jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odštěpená jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy pre-sekvence bylo navázáno 10 ekv. kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové ve formě předaktivovaného esteru HObt jak bylo popsáno výše a naneseno na vrchol kolony. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a nanesena na vrchol kolony Spolu s (0,1 ekv.) DMAP. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Byl odebrán malý vzorek pryskyřice pro kontrolu výtěžku reakce, který byl zjištěn výše popsaným způsobem jako 68 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako estery Píp chráněné Fmoc (3 ekv.) za přídavku Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl automaticky určován jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, průtok 1 ml/min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, průtok 1 ml/min), vyjmuta z kolony a sušena ve vakuu. Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše a lyofilizován ze směsi kyselina octová - voda. Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Alan-Lys-OH (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 9, 8, 7 a 6. Bylo zjištěno, že množství delečních peptidů je výrazně sníženo ve srovnání s příklady 10 a 11 (viz obr. 10). Sekvence chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena metodou MALDI TOF MS.

Příklad 13

Syntéza H-Alai₀-Lys-OH s použitím (Lys(Boc))₆ jako pre-sekvence a kyseliny (+)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Alai₀-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Lys(Boc))₆-NHCH₂CH₂NH PepSyn K)

500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo vloženo do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým a byl přidán ethylendiamin jak bylo popsáno výše. Prvních šest lysinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako Pfp estery chráněné Fmoc a s chráněnými postranními

-21 CZ 295838 B6 řetězci (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Po ukončení pre-sekvence reagovala pryskyřice s navázaným peptidem s odstraněnými ochrannými skupinami s 10 ekv. kyseliny (+)-4—methoxymandlové ve formě předaktivovaného HObt-esteru jak bylo popsáno výše (dělení výše popsaným způsobem, 95,8 % optické čistoty) a vazebná reakce pokračovala 24 hodin. Nadbytek činidla byl odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a reakce pokračovala 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku reakce, kteiý byl určen výše popsaným způsobem jako 66 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc výše popsaným způsobem.

První alanin byl navázán jako ester Pfp chráněný Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (průtok 1 ml/min 12 min) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem při 80 °C. Skupina Fmoc byla potom odstraněna působením 2 % piperidinu v DMF (obj.) (1 min, průtok 1 ml/min) s následným promytím DMF (10 s, průtok 10 ml/min), 0,2 % Dhbt-OH v DMF (20 min, průtok 1 ml/min) a nakonec DMF (2x5 ml, vždy 1 min). Následující alanin chráněný Fmoc byl ihned navázán jako ester Pfp (3 ekv.) s přidáním 1 ekv. Dhbt-OH v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako Pfp estery chráněné Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml). Nadbytek činidla byl odstraněn praním DMF (12 min, průtok 1 ml/min) a acylace byly testovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odstraněna výše popsaným způsobem. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice výše popsaným způsobem a lyofilizován z ledové kyseliny octové. Surový lyofílizát byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc.

Příklad 14

Syntéza H-Alaio-Lys-OH s použitím (Glu(OtBu))₆ jako pre-sekvence a kyseliny (+)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Alai₀-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Glu(OtBu))6NHCH₂CH₂NH PepSyn K)

500 mg suché pryskyřice PepSyn K bylo vloženo do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem a byl přidán ethylendiamin jak bylo popsáno výše. Prvních šest kyselin glutamových tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako Fmoc-Glu(OtBu)-Pfp estery (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Po ukončení pre-sekvence bylo přidáno 10 ekv. kyseliny (+)-4-methoxymandlové ve formě předaktivovaného HObt-esteru jak bylo popsáno výše (dělení výše popsaným způsobem, 95,8 % optické čistoty) a vazebná reakce pokračovala 24 hodin. Nadbytek činidla byl odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše za katalázy DMAP (0,1 ekv.) a reakce pokračovala 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku reakce, který byl určenvýše popsaným způsobem jako 75 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc výše popsaným způsobem.

-22CZ 295838 B6

První alanin byl navázán jako ester Pfp chráněný Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (průtok 1 ml/min 12 min) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem při 80 °C. Skupina Fmoc byla potom odstraněna působením 2 % piperidinu v DMF (obj.) (1 min, průtok 1 ml/min) s následným promytím DMF (10 s, průtok 10 ml/min), 0,2 % Dhbt-OH v DMF (20 min, průtok 1 ml/min) a nakonec DMF (2x5 ml, vždy 1 min). Následující alanin chráněný Fmoc byl ihned navázán jako ester Pfp (3 ekv.) s přidáním 1 ekv. Dhbt-OH v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako Pfp estery chráněné Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml). Nadbytek činidla byl odstraněn praním DMF (12 min, průtok 1 ml/min) a acylace byly testovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odstraněna výše popsaným způsobem. Po ukončení syntézy byla pryskyřice speptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice výše popsaným způsobem a lyofdizován z ledové kyseliny octové. Surový lyofilizát byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc.

Příklad 15

Syntéza peptidu Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Lyse-OH na materiálu NovSyn TentGel

Suchá pryskyřice NovaSyn TG (0,29 mmol/g, 250 mg) byla vložena do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem a dále zpracovávána způsobem vsádkové syntézy peptidů na PEG-PS až do dokončení pre-sekvence Lys₆. Následující aminokyseliny tvořící sekvenci Leuenkefalinu byly navázány jako předem vytvořené HObt estery chráněné Fmoc (3 ekv.) v DMF (5 ml) vytvořené pomocí DIC. Před každou z posledních 5 vazebných reakcí byla pryskyřice promyta roztokem Dhbt-OH (80 mg v 25 ml) pro sledování zmizení žlutého zbarvení při postupující vazebné reakci. Když již nebyla žlutá barva viditelná, reakce byly přerušeny promytím pryskyřice DMF (5x5 ml, vždy 5 min). Acylace potom byly kontrolovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C výše uvedeným způsobem. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s navázaným peptidem promyta DMF (3x5 ml, vždy 1 min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3 x 5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše a lyofílizován z kyseliny octové. Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Bylo zjištěno, že čistota je lepší než 98 % a identita peptidu byla potvrzena ES-MS. Bylo dosaženo výtěžku 84 %.

-23CZ 295838 B6

Tabulka 1

Φ o cn

Φ L_

CO XI o Q

c c.

Ě Ě

O O

CD Tt

V V

Q C Φ > Sť! CD

OT i

CD

ΙΟ.

cn

c	c	Q	c	c
e	E	E	E	E
CN		CN	CN	t—
V	v	v	v	v

CC	Dí	£T	Ct	Ct	ct
		1 <	1 <	<	<	<	<
		CL	CL	CL	D_	CL	CL
		s	5	S	S	s	s
		I <o	X	X	X	X	X
		<0	jo	co	CO	co
		'o	c?	'o'	'o'	'o	θ'
		o	o	o	O	O	O
		CD	CD	CD	m	CD	cd
	to	tň	'ví	Ίη	cn	cn	cn
		>>	>>	>>		>.	>>
	c?		—1	—1	—1		—I
Φ	O	χ	3	3	3	3	3
o	CD		CD	CD	CD	CD	CD
>u.	·♦—'		—I	_J	—J	_J	—1
	co		X	Φ	Φ	Φ	<D
				x:	-C	x:	x:
				D_ 1	CL	CL 1	CL |
Q.	Φ			X	>>	>.	>s
1	o r-				CD X	0	0 1 >
-3	Φ >				» >»
CL						0 1	0 1
CD	Φ
CL	(0 t					X	>>
	£						H
	0.						X

co c

X	X	X	X	X
o	o 1	O	O	o
3	Φ		>,	1 u.
CD	x:		>.
—1	CL	CD	0	H
ó	ύ	ΰ	ύ	ύ
o	o	o	o	o
E	E	E	E	E
u_	LL	LL	LL	LL

R = NovaSyn TG derivatizovaný kyselinou 4-hydroxymethylfenoxyoctovou (HMPA) jako linkerem (subst.:

0,29 mmol/g). Doby reakce jsou založeny na testu Dhbt-OH a ninhydrinem.

-24CZ 295838 B6

Materiály a metody

Zkratky

AM kyselina p-[(R,S)-a[l-(9H-fluoren9-yl)-methoxyformamido]-2,4— dimethoxybenzyl)-fenoxyoctová

At 7-azabenzotriazol-l-yl

Boc terc-butyloxykarbonyl

BOP benzotriazolyl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexafluorfosfát

Bpoc bifenylpropyloxykarbonyl

Bt benzotriazol-l-yl tBu terč, butyl

DBU diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en

Ddz 3,5-dimethoxyfenylizopropyloxykarbonyl

DCC dicyklohexylkarbodiimid

DCM dichloromethan

DIC diizopropylkarbodiimid

DIEA N,N-diizopropylethylamin

DMAP 4-(N,N-dimethylamino)pyridin

Dhbt-OH 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazin

DMF N,N-dimethylformamid

Dts dithiasukcinyl

EDT ethandithiol

FAB bombardování rychlými atomy

Fmoc 9-íluorenylmethyloxykarbonyl

HATU 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát

HBTU O-(benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát

HMPA kyselina 4-hydroxymethylfenoxyoctová

HMPB kyselina 4- (4-hydroxymethyl-3-methoxyfenoxy)-máselná

HObt 1-hydroxybenzotriazol

HOAt l-hydroxy-7-azobenzotriazol

HPLC vysokotlaká kapalinová chromatografie

MCPS syntéza peptidů na více kolonách

MHC hlavní histokompatibilitní komplex

MMa kyselina 4-methoxymandlová

NMR nukleární magnetická rezonance

NHS imidoester kyseliny N-hydroxyjantarové

NMP N-methylpyrrolidon

NPS nitrofenylsulfonyl

Mtr 4-methoxy-2,3,6-trimethylfenylsulfonyl

PAM fenylacetamidomethyl

Pbf 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl

PEG-PS polyethyleneglykol naroubovaný na polystyren

PepSyn Gel polydimethylakrylamidová pryskyřice funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu

PepSyn K křemelina nesoucí polydimethylakrylamidovou pryskyřici funkcionalizovanou methylesterem sarkosinu

Pfp pentafluorfenyl

Pmc 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl

Poc fenylizopropyloxykarbonyl

TBTU O-(benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborát

TFA kyselina trifluoroctová

TFE trifluorethanol

TFMSA kyselina trifluoromethansulfonová

Tmz 2,4,5-tetramethylbenzyloxykarboxyl

Claims (26)

1. Způsob výroby peptidů

X-AA,-AA₂.....AA_n-Y, kde AA je zbytek L- nebo D-aminokyseliny,

X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny,

Y je OH, NH₂ a n je celé číslo větší než 2, syntézou na pevné fázi, kde C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného reaktivního derivátu, v případě nutnosti s chráněným postranním řetězcem, je navázána na pevný nosič nebo polymer, případně prostřednictvím linkeru, potom zbavena Ν-α-ochranné skupiny, a následující aminokyseliny vytvářející sekvenci peptidu jsou postupně navazovány nebo navazovány jako peptidové fragmenty ve formě vhodně chráněných reaktivních derivátů nebo fragmentů, kde po vytvoření požadovaného peptidu je Ν-α-ochranná skupina z požadovaného peptidu odstraněna a peptid je odštěpen z pevného nosiče, vyznačující se tím, že způsob dále zahrnuje následující kroky:

zvolí se pre-sekvence tvořená 3 až 9 zbytky zvolenými nezávisle z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranního řetězce chráněnými v průběhu reakčních kroků a s faktorem náklonnosti Pa > 0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ < 1,10, kde pre-sekvenci obsahuje C-koncová část uvedeného peptidu; a uvedená pre-sekvence se z vytvořeného peptidu odštěpí.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aminokyseliny v pre-sekvenci jsou zvoleny z aminokyselin, které mají v postranním řetězci funkční skupinu karboxy, karboxamido, amino, hydroxy, guanidino, sulfid nebo imidazol.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že aminokyseliny tvořící část pre-sekvence jsou nezávisle zvoleny ze skupiny Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met a Gin.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že aminokyselinami jsou buď výlučně Lys, nebo Glu nebo sekvence (Glu)_q(Lys)_p, kde p + qje3až9, s výhodou 6 až 9, a pořadí Lys a Glu je zvoleno libovolně.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Ν-α-amino ochrannou skupinou je Fmoc, Boc nebo jakákoliv jiná vhodná ochranná skupina.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že Ν-α-amino ochrannou skupinou je skupina Fmoc nebo Boc.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje karboxylovou skupinu, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou tBu.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje aminoskupinu, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou Boc.

-26CZ 295838 B6

9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje hydroxylovou skupinu, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou tBu.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje skupinu karboxamido, která je chráněná skupinou a) benzhydryl, b) trityl, c) tBu.

11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje guanidinovou skupinu chráněnou skupinou 4-methoxy-2,3,6trimethylfenylsulfonyl (Mtr), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) nebo 2,2,4,6,7pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf).

12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená funkční skupina postranního řetězce v pre-sekvenci obsahuje imidazolovou skupinu chráněnou Boc.

13. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že skupiny Fmoc se odstraňují pomocí aminu jako je piperidin nebo diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU).

14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že ochranné skupiny postranního řetězce se odstraňují kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), kyselina trifluormethansulfonová (TFMSA), HBr, HC1 nebo HF.

15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pevný nosič je zvolen z funkcionalizovaných pryskyřic jako polystyren, polyakrylamid, polyethylenglykol, celulóza, polyethylen, latex nebo materiál dynabeads.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že funkcionalizované pryskyřice jsou zvoleny z pryskyřic PEG-PS, tedy polyethylenglykol roubovaný na polystyrenu, nebo pryskyřic polydimethylakrylamidových.

17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pre-sekvence obsahuje od 5 do 7 aminokyselinových zbytků.

18. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že C-koncová aminokyselina je navázána na pevný nosič běžným linkerem jako je 2,4-dimethoxy-4'-hydroxybenzofenon, kyselina 4-(4-hydroxymethyl-3-methoxyfenoxy)máselná (HMPB), kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, kyselina 4—hydroxymethylfenoxyoctová (HMPA), kyselina 3-(4-hydroxymethylfenoxy)propionová nebo kyselina p-[(R,S)-a[l-(9H-fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyljfenoxyoctová (AM).

19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že syntéza se provádí vsádkovým způsobem.

20. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že způsob se provádí kontinuálně na automatickém nebo poloautomatickém syntezátoru peptidů.

21. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kroky reakce se provádějí v přítomnosti rozpouštědla zvoleného ze skupiny acetonitril, Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), N-methylpyrrolidon (NMP), dichlormethan (DCM), trifluorethanol (TFE), ethanol, methanol, voda, směsi uvedených rozpouštědel s nebo bez dalších látek jako jsou chloristan nebo ethylenkarbonát.

22. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vazebné reakce mezi dvěma aminokyselinami, aminokyselinou a dříve vytvořenou sekvencí peptidu nebo fragmentem peptidu

-27CZ 295838 B6 a dříve vytvořenou sekvencí peptidů se provádí běžnými kondenzačními způsoby jako je azidová metoda, metoda směsného anhydridu kyseliny, metoda symetrického anhydridu, karbodiimidová metoda, metoda aktivního esteru jako je pentafluorfenyl (Pfp), 3,4-dihydro-4-oxobenzotriazin3—yl (Dhbt), benzotriazol-l-yl (Bt), 7-azabenzotriazol-l-yl (At), 4-nitrofenyl, imidoestery kyseliny N-hydroxyjantarové (NHS), chloridy kyselin, fluoridy kyselin, aktivita in šitu činidly jako 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HATU), O-(benzotriazol-l-ylý-l, 1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HBTU), O-(benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3— tetramethyluroniumtetrafluorborát (TBTU) nebo benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)fosfonium-hexafluorfosfát (BOP).

23. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid se z nosiče odštěpuje kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBr), chlorovodík (HC1), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid.

24. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid se z nosiče odštěpuje fotolýzou.

25. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pre-sekvence se z vytvořeného peptidů odštěpí enzymaticky.

26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že enzym se volí z vhodných karboxy- a endopeptidáz.