CZ80399A3

CZ80399A3 - Způsob výroby peptidů

Info

Publication number: CZ80399A3
Application number: CZ99803A
Authority: CZ
Inventors: Bjarne Due Larsen; Arne Holm
Original assignee: Zealand Pharmaceuticals A/S
Priority date: 1996-09-09
Filing date: 1997-09-09
Publication date: 1999-08-11
Also published as: CA2265900C; DE69732640D1; DK0929567T3; ATE290014T1; HU230354B1; DE69732640T2; AU4199397A; US20070004905A1; AU723268B2; JP2001500134A; HUP0102900A2; WO1998011125A1; IL128829A0; PT929567E; IL128829A; CZ295838B6; CA2265900A1; EP0929567B1; US7348404B2; HUP0102900A3

Description

Způsob výroby peptidů

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká zlepšeného způsobu pro výrobu peptidů syntézou na pevné fázi. Vynález se také týká činidla, které je použitelné při syntéze na pevné fázi.

Dosavadní stav techniky

Syntéza peptidů na pevné fázi (solid-phase peptide synthesis, SPPS) je vysoce úspěšná metoda zavedená Merrifieldem v roce 1963 (Merrifield, R. B. (1963), J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 - 2154). Touto metodou bylo dosud syntetizováno velké množství peptidů. Vynikající přehled v současnosti používaných chemických syntéz peptidů a proteinů je uveden v Kent, S. Β. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989, který je zařazen odkazem.

V praxi se používají dvě strategie pro výstavbu peptidových řetězců syntézou na pevné fázi, a to postupné syntézy na pevné fázi a kondenzace fragmentů na pevné fázi.

Při postupné SPPS se váže C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného, v případě nutnosti na postranním řetězci chráněného

2o reaktivního derivátu kovalentní vazbou buď přímo nebo prostřednictvím vhodné propojovací skupiny (linker) na „pevný“ nosič, například polymerní pryskyřici, která je v nabobtnalém stavu v organickém rozpouštědle. Ν-α-ochranná skupina se odstraní a postupně se přidávají následující chráněné aminokyseliny.

Když bylo dosaženo požadované délky peptidového řetězce, ochranné skupiny postranních řetězců se odstraní a peptid se odštěpí z pryskyřice, což může být provedeno v oddělených krocích nebo současně.

Při kondenzaci fragmentů na pevné fázi se cílová sekvence sestaví postupnou kondenzací fragmentů na pevném nosiči s použitím chráněných fragmentů vyrobených metodou postupné SPPS.

V průběhu let byly vyvinuty dvě strategie pro vytvoření vazby 5 založené na použití různých Ν-α-ochranných skupin a přizpůsobení ochranných skupin postranního řetězce.

Merrifield používal jako Ν-α-ochrannou skupinu terc.butyloxykarbonyl (Boc), zatímco Carpino a Han zavedli 9fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) (Carpino, L. A. a Han, G. Y.

(1972), J. Org. Chem. 37, 3404 - 3409).

Operace používané při jednom cyklu prodloužení řetězce při postupné SPPC s použitím reakcí Boc a Fmoc jsou ilustrovány v následujících reakčních schématech (převzaté z Kent, S. Β. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989).

• · • · • · · ·

CO

φ o

>>

w

L_

CL i

CM

X o

I

X

Φ o

>c_ c

Φ o

>k.

>,

	-id	se (fí	Φ	(fí
X—	ω	o	>.
c >φ	>Φ c	<*> k. Q.	co N	CL 1
c co u. ω	c (0 u. -C	CM X o	ČÓ c_ 4—* □	CM X o 1	co jo N
Ό O	o o	1 X 2”	Φ C	X z	co >

Φ o

šk_ «

>>

o o

CM

X o

N

CQ o

I c

<

I

O

CQ

O o

CM

X o

N

CQ

O

I c

<

I co

X

Ο o

CM

X o

N

CQ

O

I c

<

CM

X o

CM <

<

o o

CQ

X o

<

o o

CQ lf) o

I

CC

M—

ΙCM

X o

I

X z

o o

CM

X o

N

CQ

O

I c

<

I i

c <

<

I o

o

CQ « ·

4

Peptid chráněný Ν-α-Boc navázaný na pryskyřici PAM se zbaví Ν-α-ochranné skupiny kyselinou trifluoroctovou (TFA). Získaná aminová sůl se promyje a neutralizuje terciárním aminem. Následující peptidová vazba se vytvoří reakcí s aktivovanou Boc-aminokyselinou, například symetrickým anhydridem. Obecně je ochrana postranního řetězce založená na benzylu a odstranění ochranné skupiny se provede HF nebo kyselinou sulfonovou.

Peptid chráněný Ν-α-Fmoc navázaný na pryskyřici se zbaví N-aochranné skupiny působením sekundárního aminu, normálně io piperidinu, v organickém rozpouštědle, například N,Ndimethylformamidu (DMF) nebo dichlormethanu (DCM). Po promytí se neutrální peptidová pryskyřice ponechá reagovat s aktivovanou Fmocaminokyselinou, například hydroxybenztriazolovým aktivním esterem.

Ochrana postranního řetězce je založena na skupinách terc.15 butyl, trityl a arylsulfonyl a pro odstranění ochranné skupiny z postranních řetězců se s výhodou používá TFA.

I když se v podstatě pro všechny běžně používané syntézy peptidů používají strategie s Boc a Fmoc, někteří autoři navrhovali jiné Ν-α-ochranné skupiny (Stewart, J. M. a Young, J. D., Solid phase

2o peptide synthesis, Pierce Chemical Company (1984)).

Boc vytváří v kyselém prostředí labilní urethanovou skupinu a další návrhy z toto kategorie jsou bifenylizopropyloxykarbonyl (Bpoc), 3,5-dimethoxyfenylizopropyloxykarbonyl (Ddz), fenylizopropyloxykarbonyl (Poc) a 2,3,5-tetramethylbenzyloxykarbonyl (Tmz).

Mezi další typy dostupných Ν-α-ochranných skupin patří nitrofenylsulfenyl (Nps), který je možno odstranit buď velmi zředěnou bezvodou kyselinou, například HCI, nebo napadením nukleofilním činidlem, například methyl-3-nitro-4-merkaptobenzoátem. Je možno • · • · • · · · • · • · ···· · · · ·♦·· • · · · ···· · ·· · • · ··· · ·· ······ _····· · · · ···· ·· ·· · ·· ·· ·· také použít dithiasukcinylu (Dts), který je odstranitelný působením nukleofilního činidla.

SPPS má obecnou výhodu, že je využitelná při plně automatizované nebo poloautomatizované chemii vytváření řetězců.

Systém pro SPPS za podmínek nízkotlakého kontinuálního průtoku byl vyvinut Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137 a dále vylepšován, viz Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270 - 272 a WO 90/02605.

ίο I když SPPS dnes představuje základní kámen při syntéze proteinů a péptidů, stále ještě zbývá vyřešit některé problémy. Protože některé z těchto problémů mohou mít vztah ke struktuře péptidů, bude vhodná následující krátká diskuse.

Empirické předpovědi konformací proteinů byly prováděny autory Chou, P. Y. a Fasman, G. D. (1978), Annu Rev. Biochem. 47, 251 - 276. Je dobře známo, že architektura proteinů může být popsána primární, sekundární, terciární a kvarterní strukturou. Primární struktura se týká sekvence aminokyselin proteinu. Sekundární struktura je místní prostorová organizace polymerní kostry, přičemž se 20 nebere v úvahu konformace postranních řetězců. Jako příklady sekundárních struktur je možno uvést a-šroubovice, β-listy a β-otáčky, což jsou reverzní úseky řetězců skládající se z tetrapeptidů. Terciární struktura je uspořádání všech atomů v prostoru včetně disulfidických můstků a poloh postranních řetězců, takže se berou v úvahu všechny 25 interakce na krátké i dlouhé vzdálenosti.

Termín kvarterní struktura může být použit pro označení interakce mezi podjednotkami proteinu, například a- a β-řetězců hemoglobinů.

Po diskusi dřívějších pokusů spojovat sekundární strukturu 30 proteinů s aminokyselinovým složením, kde například Ser, Thr, Val, Ile a Cys byly klasifikovány jako „rozbíjející šroubovice“ (helix breakers) a • · • · • · · · • ·

Ala, Leu a Glu jako „tvořící šroubovice“ (helix formers), přičemž hydrofobní zbytky byly zařazovány jako silně „struktury β tvořící“ a prolin spolu se zbytky nabitých aminokyselin jako „struktury β rozbíjející“ připravili Chou a Fasman statistickou analýzu 29 proteinů se známou rentgenovou strukturou pro vytvoření pravidel pro předpovídání a- a β-oblastí.

Na základě těchto studií vytvořili tzv. faktory náklonnosti (propensity factors) Ρα, Ρβ a Pt, které jsou konformační parametry vyjadřující polohové preference vystupovat jako a-šroubovice, β-list a popřípadě β-otáčka pro přirozené L-aminokyseliny tvořící část proteinů.

Pro ilustraci jsou Pa a Ρβ uvedeny níže. Jednopísmenkové zkratky pro jednotlivé aminokyseliny jsou uvedeny v závorkách.

	Pa	Ρβ
Glu	(E)	1,51	Val	1,70
Met	(M)	1,45	lle	1,60
Ala	(A)	1,42	Tyr	1,47
Leu	(L)	1,21	Phe	1,38
Lys	(K)	1,16	Trp	1,37
Phe	(F)	1,13	Leu	1,30
Gin	(Q)	1,11	Cyr	1,19
Trp	(W)	1,08	Thr	1,19
lle	(i)	1,08	Gin	1,10
Val	(V)	1,06	Met	1,05
Asp	(D)	1,01	Arg	0,93
His	(H)	1,00	Asn	0,89
Arg	(R)	0,98	His	0,87
Thr	(T)	0,83	Ala	0,83
Ser	(S)	0,77	Ser	0,75
Cys	(C)	0,70	Gly	0,75
Tyr	(Y)	0,69	Lys	0,74
Asn	(N)	0,67	Pro	0,55
Pro	(P)	0,57	Asp	0,54
Gly	(G)	0,57	Glu	0,37

• · · • · · ·· • · · • · « • · · · ·

Hodnoty pod 1,00 obvykle ukazují, že dotyčná aminokyselina musí být považována pro konkrétní sekundární strukturu za nevýhodnou.

Jako příklad je možno uvést hydrofobní kyseliny (například Val, 5 Ile, Leu), které silně podporují tvorbu β-listu, zatímco nabité aminokyseliny (například Glu, Asp a His) tvorbu β-listu narušují.

Ve struktuře α-šroubovice je udržována spirální konfigurace peptidu rigidně v místě vodíkových můstků mezi atomem vodíku připojeným k atomu dusíku v jedné opakující se jednotce o

O H II I (C - C - N -) a atom kyslíku připojený na atom uhlíku tři jednotky podél řetězce.

Jestliže se polypeptid přivede do roztoku, může se přivést ašroubovice k rozvinutí za vytvoření náhodného svinutí nastavením pH. Přechod od α-šroubovice k náhodnému svinutí probíhá v úzkém zo rozmezí pH. Protože vodíkové vazby jsou z hlediska pevnosti vazby v α-šroubovici všechny ekvivalentní, mají sklon přecházet do jiného uspořádání všechny najednou. Změna může být také indukována teplem.

Struktura β-listu se skládá z úplně natažených peptidových 25 řetězců, u kterých vodíkové vazby spojují atomy vodíku na jednom řetězci s atomy kyslíku v sousedním řetězci. Vodíkové vazby tedy nepřispívají k vnitřní organizaci řetězce jak je tomu u α-šroubovice, ale pouze vážou řetězec s řetězcem. Sousední řetězce mohou být paralelní nebo antiparalelní.

• to ···· β-otáčky se často pozorují v těch částech peptidového řetězce, které spojují antiparalelní řetězce ve struktuře β-listu.

U β-otáčky tvoří skupiny CO- a NH- aminokyseliny číslo n v peptidovém řetězci vodíkovou vazbu s odpovídajícími skupinami v aminokyselině číslo n + 4.

α-šroubovice a β-list tvoří silně proměnlivé části peptidové konformace proteinů (od 0 do 80 %) a zbývající části proteinů jsou naskládány v jiných strukturách. U většiny proteinů se jeví části peptidových řetězců jako nepravidelně složené „náhodné smyčky“.

io Pokud se nyní obrátíme k obecným problémům týkajícím se

SPPS, v referenci Kent, S. Β. H. (1988), Annu Rev. Biochem. 57, 957 989 se osvětluje syntéza „obtížně syntetizovatelných sekvencí“ (difficult sequences).

Jak je zřejmé, celá podstata SPPS je založena na úplném odstranění Ν-α-ochranných skupin před každým z následujících kroků vazby.

To znamená, že v ideálním případě by se měly všechny aminokyseliny s odstraněnou Ν-α-ochrannou skupinou vázat na reaktivní derivát aminokyseliny podle požadované sekvence, tj. měla by probíhat úplná aminoacylace.

Kent uvádí, že nejvážnější potenciální problém v postupné SPPS je neúplná tvorba peptidové vazby, kterou vznikají peptidy s jednou nebo více chybějícími aminokyselinami (delecemi), ale s podobnými vlastnostmi jako má cílová sekvence.

Takové neúplné vazby převažují více u některých sekvencí než u jiných, a proto tedy termín „obtížně syntetizovatelné sekvence“ a zjevně převažují více u způsobu Fmoc než u způsobu Boc.

Vědci včetně autorů předkládaného vynálezu studovali velký počet zjištěných „obtížně syntetizovatelných sekvencí“.

• · • · ···· ··· ···· • · · · · ··· · · · · λO ·· ··· · ·· ··· ···

-10-··· ·· · · · ···· ·· ·· «·· ·· ··

Při syntéze SPPS homo-oligopeptidů obsahujících leucin nebo alanin s použitím strategie Fmoc bylo pozorováno neúčinné odstraňování Ν-α-ochranných skupin piperidinem v závislosti na sekvenci (B. D. Larsen, C. Larsen a A. Holm, Peptides 1990; E. Giralt a D. Andreu, (eds.) 1991 ESCOM Science Publishers Β. V., str. 193 185 a Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9). Výzkumy ukázaly, že tento jev byl spojen s následnou pomalou a neúplnou vazbou aminokyseliny a jako příčina obtížné vazby a neúplného odstranění Fmoc byl ukázán důkaz agregace ío rostoucího peptidového řetězce do β-listu. Tento důkaz byl založen na obecných fyzikálně-chemických pozorováních (Larsen, B. D. a Holm,

A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9) a na podrobném studiu Ramanova spektra v blízké infračervené oblasti (Due Larsen,

B. , Christensen, D. H., Holm, A., Zillmer, R., a Faurskov, O. (1993), J. is Amer. Chem. Soc. 115, 6247 - 6253). Uvedená fyzikálně-chemická pozorování mohou být shrnuta následujícím způsobem: v případě syntézy H-(Ala)_n-Lys-OH na polyamidem polymerizované křemelinové matrix (PepSynK) nebyly pozorovány žádné problémy až do n = 5, ale pro n = 6 bylo po provedení standardního odstranění ochranných skupin piperidinem (20 % piperidin v DMF) stále ještě přítomno přibližně 20 až 25 % peptidů chráněného Fmoc. Při pokračování syntézy na n = 10 byla získána relativně komplikovaná směs obsahující cílový peptid (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 6, 7, 8 a 9 a deleční peptidy se skupinou Fmoc stále ještě připojenou na N-konec, kde n = 6, 7, 8 a 9 (obr. 1). Tato směs byla po separaci HPLC na jednotlivé složky identifikována FAB MS. Chybné sekvence nebo částečné odstranění ochranné skupiny pro n = 2 až 5 nebo neúplné odstranění ochranných skupin z cílového peptidů (n = 10) nebylo pozorováno, takže problém bylo možno přiřadit dané oblasti homo-oligopeptidového řetězce. Tento typ obtížných aminoacylací a neúplného odstraňování ochranných skupin je proto možno označit jako nenáhodný na rozdíl od náhodných obtíží, které • · · · * · · 4 · · 4 ···· ·· · · · · ·· · · · 4 _{A A} ·· 4 4 4 · ·· ······

-11-,,. · · · · · ···· · · * * · * 4 «4 ·* jsou způsobeny pouze běžnými sférickými problémy (Kent, S. Β. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989). Ačkoliv byly měněny experimentální podmínky, například typ pryskyřice, doba kroku odstraňování ochranných skupin, rozpouštědla, přidávání chaotropních látek, problémy stále přetrvávaly, i když optimální vliv na nekompletní odstraňování skupiny Fmoc mělo zahřívání na 50 °C (Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9).

Nejcharakterističtějším rysem homo-oligoalaninového řetězce je to, že kroky neúplného odstranění Fmoc jsou následovány výrazně ío pomalými acylacemi další aminokyselinou v sekvenci. Efektivní doby acylace pro každý z prvních šesti alaninů jsou menší než 60 minut, zatímco úplná acylace u Ala?, Alag, Alag a Ala-ιο je 26, 28, 30 popřípadě 7 hodin (obr. 2).

Kent, S. Β. H. (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 957 - 989 15 navrhuje řadu řešení problému týkajícího se nesnází spojených s vazbou závislou na sekvenci, například použití tepla při kroku vazby a kvantitativní přeměnu zbytkových nezreagovaných peptidových řetězců navázaných na pryskyřici na ukončené peptidy v kroku navázání „čepičky“.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí zlepšené metody SPPS, kterou je možno syntetizovat s vysokým výtěžkem a čistotou peptidy, které jsou známy nebo se ukážou jako „nesnadno syntetizovatelné sekvence“.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout zlepšený způsob SPPS, kterým se dosáhne snížení doby reakce nejen pro nesnadno syntetizovatelné sekvence, ale i pro jinak nekomplikované sekvence, kde je žádoucí snížit za normálních okolností dlouhé doby reakcí.

o ·· ··· · ··

12-· · · · · · «· ···

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí činidla nebo kitu pro použití při SPPS, kterými je možno dosáhnout výše uvedených zlepšení způsobu syntézy.

Způsob, kterým se dosahuje tohoto a dalších předmětů a výhod 5 vynálezu, bude zřejmý z následujícího podrobnějšího popisu a obrázků, které ukazují záznamy HPLC pro různé peptidy získané syntézou na pevné fázi.

Pro objasnění problémů popsaných výše s ohledem na prameny B. D. Larsen, C. Larsen a A. Holm, Peptides 1990; E. Giralt a D. io Andreu, (eds.) 1991 ESCOM Science Publishers Β. V., str. 193 - 185 a Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 9 se autoři předkládaného vynálezu zaměřili za otázku, do jaké míry může být stupeň tvorby struktury typu β-listu homo-oligoalaninového řetězce ovlivněn zavedením kratší peptidové sekvence, pre-sekvence, do řetězce na C-konci. Tato otázka je spojena se skutečností, že proteinové struktury a polypeptidové sekvence mohou mít oblasti s dobře definovanými strukturami závislými na aminokyselinách v sekvenci a na předcházejících aminokyselinách. Jak bylo uvedeno dříve, výzkumy podle Chou, Ρ. Y. a Fasman, G. D. (1978), Annu Rev.

Biochem. 47, 251 - 276, týkající se proteinových struktur vedly k poznání tříd aminokyselin definovaných jako indukující převážně ašroubovici, β-list nebo indukující náhodné svinutí. Ačkoliv je možno předpokládat, že podobné předpovědi mohou platit pro homooligoalaniny nebo leuciny, bylo ukázáno, že pravidla Choua a Fasmana nepředpovídají vytváření struktur typu β-listu homooligoalaninovými nebo leucinovými peptidy. Navíc nelze očekávat, že by pravidla, která odvodili Chou a Fasman, mohla být použita při syntéze peptidů na pryskyřici a jasně nemohou platit, jestliže se účastní syntézy aminokyseliny s chráněným postranním řetězcem.

V základních studiích byla zkoumána syntéza molekuly H-(Ala)_n(Lys)_m-OH, kde (Lys)_m znamená pre-sekvenci s m rovným 1, 3 a 6.

·· ·· ······ ·· ·· • · · · ··· · · · · ·· · · · · · · · ·· · • · ··· · ·· ··· ··· _{Λ η} · · · · · · · ·

- *] j .···· ·· ·· ··· ·· ··

Byla použita verze syntézy na pevné fázi polyamidu s kontinuálním průtokem (Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137) na plně automatizovaném syntezátoru peptidů jak bylo popsáno dříve (Cameron, L., Meldal, M. a Sheppard, R. C.

(1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270 - 272) s použitím DMF jako rozpouštědla, trojnásobného přebytku Fmoc-alaninu a esterů Fmoc-lysin(tBoc)-pfp, a standardního odstranění ochranných skupin Fmoc 20 % piperidinem v DMF po dobu 10 minut. Doby reakce byly monitorovány pomocí Dhbt-OH, který se deprotonuje na žlutý aniont ío Dbht-O', pokud jsou ještě přítomny neacylované amoniskupiny, a zmizení žluté barvy označuje konec syntézy. Po odštěpení peptidu z pryskyřice 95 % vodnou TFA byl produkt promyt etherem a analyzován HPLC. Výsledky pro m = 1 jsou popsány výše (obr. 1). V případě m = 3 je ze záznamu HPLC na obr. 3 vidět, že syntéza může pokračovat až k Alaw bez detekovatelných množství delečních peptidů nebo neúplného odstranění Fmoc. Když se však pokračuje v syntéze až k Ala₂₀, chromatogram (obr. 4) ukazuje přítomnost delečních peptidů. Výsledky jsou ještě výraznější pro H-(Ala)„-(Lys)6-OH, kde se produkty bez detekovatelných delečních peptidů získají jak pro Ala₁₀ (obr. 5), tak i pro Ala₂o (obr. 6). Navíc se doby reakcí drasticky sníží z až 30 hodin pro standardní reakce na < 2 hodiny pro jeden krok. Sekvence H-Ala₂₀-OH byla dosud syntetizována metodologií Boc, ale byly získány vysoké hladiny delečních a inzerčních peptidů (Merrifield, R. B., Singer, J. a Chait, Β. T. (1988), Anal. Biochem. 174, 399 - 414).

Pre-sekvence Lys6, která je za převažujících podmínek syntézy zcela chráněna skupinou tBoc, má nejsilnější a nejpříznivější vliv na strukturu rostoucího peptidového řetězce, protože odstraňuje jinak velmi vážné potíže při syntéze způsobené nekompletním odstraňováním ochranných skupin a extrémně pomalou reakcí.

V souladu s těmito třemi překvapujícími objevy je předkládaný vynález založen na zavedení zvláštní pre-sekvence do C-koncové části připojené na pevný nosič.

·· ···· • · · · · · · · · ·· · • · ··· · ·· ··· ···

X X · · · · · · · ·

- Ί4 -···· ·« ·· ··· ·· · ·

Το je zcela základní průlom proti pokusům podle dosavadního stavu techniky, kde byl kladen v případě nesnadno syntetizovatelných sekvencí důraz na podmínky reakce a povahu pevného nosiče.

Jak bude dále diskutováno níže, C-koncová sekvence, kterou je 5 požadovaný peptid připojen na pevný nosič, by mohla také zahrnovat vhodné linkery (mezičlánky) pro dosažení například lepšího připojení nebo lepších podmínek pro odštěpení.

První hledisko předkládaného vynálezu se tedy týká způsobu výroby peptidů

X-AA1-AA2.....AA_n-Y kde AA je zbytek L- nebo D-aminokyseliny, X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny, Y je OH, NH2 nebo aminokyselinová sekvence obsahující tři až devět zbytků aminokyselin a n je celé číslo větší než 2, syntézou na pevné fázi, kde C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného reaktivního derivátu, v případě nutnosti s chráněným postranním řetězcem, je navázána na pevný nosič nebo polymer případě prostřednictvím linkeru, potom zbavena Ν-α-ochranné skupiny, a následující aminokyseliny vytvářející sekvenci peptidu jsou postupně navazovány nebo navazovány jako peptidové fragmenty ve formě vhodně chráněných reaktivních derivátů nebo fragmentů, kde po vytvoření požadovaného peptidu je N-aochranná skupina z požadovaného peptidu odstraněna a peptid je odštěpen z pevného nosiče, který se vyznačuje tím, že C-koncová část připojená na nosič nebo polymer obsahuje pre-sekvenci tvořenou 3 až

9, s výhodou 5 až 7 aminokyselinovými zbytky zvolenými nezávisle z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranního řetězce chráněnými v průběhu reakčních kroků a s faktorem náklonnosti Pa >0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ > 1,10 nebo odpovídajících Daminokyselin a uvedená pre-sekvence je popřípadě z vytvořeného peptidu odštěpena.

·· ·· »··· ·· ·· • · · · · · · · • · ···· · ·· · • · · · ·· ··· ··· • · · · · · ·· ····· ·· ··

L-aminokyseliny splňující výše uvedené limity pro faktory náklonnosti Pa a Ρβ jsou Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met a Gin.

Tyto aminokyseliny mají všechny funkční skupiny postranních řetězců ze skupiny karboxy, karboxamido, amino, hydroxy, guanidino, sulfid nebo imidazol.

Výhodné aminokyseliny v pre-sekvenci jsou Lys a Glu a jejich kombinace, například (Glu)_q(Lys)_p, kde p + q je 3 až 9, s výhodou 6 až 9, a pořadí Lys a Glu je zvoleno libovolně.

Ν-α-aminoskupina aminokyselin při každém vazebném kroku io použitých peptidových fragmentů by měla být vhodně při reakci chráněna. Ochranná skupina může být Fmoc nebo Boc nebo jakákoliv jiná vhodná ochranná skupina, jako jsou například výše popsané skupiny podle odkazů Stewart, J. M. a Young, J. D., Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Company (1984), Cameron, L.,

Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270 - 272, Meldal, M., Bisgaard Holm, C., Boejesen, G., Havsteen Jakobsen, M. a Holm, A. (1993), Int. J. Peptide and Protein Res. 41, 250 - 260, McKenzie, A., Pirie, D. J. C. (1936), Berichte 69, 868, Knorr, E. (1904), Berichte 37, 3172, Peptides: Synthesis, structures and applications, Gutte, B., ed. Academie Press lne. 1995. Výhodnou ochrannou skupinou Ν-α-aminokyseliny je Fmoc.

Důležité je, aby byly funkční skupiny postranního řetězce v presekvenci v průběhu reakčních kroků vhodně chráněny. Ochranné skupiny použitelné k tomuto účelu jsou odborníkovi v oboru dobře známy a výhodné skupiny se uvádějí v nárocích 7-12.

Aniž by si autoři přáli být vázáni náklonnou teorií, předpokládá se, že fyzikálně-chemické vlastnosti chráněného postranního řetězce pre-sekvence, jako například lysinu, jsou odpovědné za pozorovanou „peptidovou syntézu, při které napomáhá struktura („structural assisted peptide synthesis, SAPS“) snížením nebo odstraněním tvorby β-listu v polyalaninové sekvenci.

V případě jiných homo-oligo pre-sekvencí bylo pozorováno, že (Glu(tBu))₆ stejně jako smíšená sekvence (Glu(tBu)Lys(tBoc))3 indukuje u polyalaninového řetězce výhodnou strukturu, což umožňuje vytvoření produktů bez delečních peptidů.

Pro zjištění, zda je SAPS obecnější jev, nebo zda je vlastní pouze homo-oligopeptidům jako je sekvence polyalanin, byly zkoumány směsné sekvence známé jako nesnadno syntetizovatelné.

Syntéza H-VQAAIDYING-QH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74 je dobře známá obtížná syntéza, která byla použita jako modelová ío reakce v řadě případů (Cameron, L. R., Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun., 270 - 272). Při standardní syntéze byly pozorovány deleční peptidy s peptidem des-Val (vrchol 2) jako převažujícím vedlejším produktem (viz příklad 7 a obr. 7).

Podle vynálezu byla syntetizována sekvence H-VQAAIDYING15 Κβ-ΟΗ s použitím pre-sekvence (Lys(tBoc))6 připojené na C-konec materiálu pepsyn K. Syntéza probíhala za poskytnutí produktu se správnou molekulovou hmotností s vysokou čistotou a významně sníženým množstvím peptidů des-Val (viz příklad 8 a obr. 8).

Udává se, že další nesnadno syntetizovatelnou sekvencí je H20 VNVNVQVQVD-OH, která byla syntetizována na řadě pryskyřic (polymer Rapp, PEG-PS, Pepsyn K, PEGA 199/300, PEGA 800/130 a PEGA 300/130), ve všech případech se značnou převahou glutaminu z Val¹ kromě použití pryskyřice PEGA 1900/300 (Meldal, M. (1993), Peptides 1993; Schneider, C. H. a Eberle, A. N. (eds) 1993 ESCOM

Science Publishers Β. V., str. 61 - 62). Podle vynálezu probíhala syntéza H-VNVNVQVQVDK₆-OH za získání produktů se správnou molekulovou hmotností. Ve spektru nebyly detekovány deleční peptidy (viz příklad 9).

Pro ověření dalšího důležitého hlediska předkládaného vynálezu, tj. snížených dob reakcí získaných zavedením pre-sekvence na C-koncové části požadovaného peptidů byly monitorovány reakční • · ·· ··<· • · ·· · · ···· · · · · • · ··· · ·· ··· ··· *7 · · · · · · · · ” ! / “···· ·· ·· ··· ·· ·· doby u jednotlivých aminokyselin při syntéze enkefalinu, H-Tyr-GlyGly-Phe-Leu-OH, s a bez pre-sekvence (Lys(tBoc))6 podle popisu v příkladu 15.

Výsledky měření ukazují, že reakční doby u této jinak nekomplikované syntézy efektivně probíhají v kombinaci se zvolenou pre-sekvencí.

Ve výše uvedených případech byly peptidové sekvence získány s hexalysinovou pre-sekvencí, která může být pro některé účely přijatelná nebo dokonce výhodná. Tak například β-list vytvářející io sekvence mohou způsobovat vážné potíže s rozpustností, ale v případě H-Ala₂o(Lys)6-OH se peptid změnil na rozpustný ve vodném roztoku, zatímco H-Alaio-Lys-OH se velmi rychle srážel z roztoků TFA při zředění vodou. V případě (Glu)6 může být využita rozpustnost poskytnutá pre-sekvencí a větším množstvím karboxylových skupin.

Například pro metodu ELISA, kde je možné místní připojení na povrch aktivovaný vhodnými aminoskupinami, protože je možná snadná aktivace ve vodném roztoku například karbodiimidem. Bylo tako zvažováno, jakým způsobem mohou být tato pozorování využita pro praktickou syntézu peptidů bez přítomnosti pre-sekvence ve finálním produktu. Proto byly prováděny pokusy zavést mezi pre-sekvenci a cílový peptid, například pryskyřice-(Lys(tBoc))6-linker-peptid, linker umožňující odštěpení peptidů z linkeru standardními činidly jako je roztok TFA. Zavedení běžně používaného linkeru HMPA jak se popisuje níže v příkladu 10, pryskyřice-(Lys(tBoc))6-HMPA25 Lys(tBoc)Alaio, však mělo jasně negativní vliv na syntézu H-AIaw-LysOH, protože vznikaly deleční peptidy (obr. 9). Vliv pre-sekvence na polyalaninovou strukturu je zřejmě ztracen v důsledku toho, že aromatická skupina v linkeru rozbíjí strukturní efekt v peptidové kostře (Ala)_n-(Lys)m· Pro zachování strukturního efektu bylo zkoumáno

3o zavedení opticky aktivního linkeru mezi (Ala)_n a (Lys)_m s použitím kyseliny 4-methoxymandlové (MMa) jako možného kandidáta. Tento typ linkeru pravděpodobně nebyl dosud použit. Předpokládá se, že

1_ · ·

-· · · · · · · · · přítomnost methoxylové skupiny umožní odštěpení cílového peptidů z linkeru pomocí standardních štěpících roztoků s obsahem TFA. Kyselina 4-methoxymandlová může být rozlišena na své opticky aktivní formy, z nichž konfigurace R ((+)-konfigurace) je identická s L5 proteinovými aminokyselinami. Byly provedeny dva typy experimentů: (a) syntéza s použitím racemické kyseliny 4-methoxymandlové; (b) syntéza s použitím kyseliny R-4-methoxymandlové (R-MMa). Schéma syntézy je ukázáno níže (schéma 1) a dále ilustrováno v příkladech 11, 12, 13 a 14.

Schéma 1

(Ty— CONHCH₂CH₂NH-(A A)_m-NHCO-CH-OH

OMe aktivace

Fmoc-AAj-OH aktivace (r)— CONHCHjCHjNH-(A AVNHCO-CH-OCO-CI1R-NI iFmoc

1. Odstranění i _Fmoc

2. Vazba s 1. Fmoc-AA atd

V prvním případě byla syntetizována sekvence pryskyřice25 (Lys(tBoc))6-MMa-Lys-Ala-io pro získání H-Lys-Alai₀-OH, kde lysinová skupina je zavedena pro zvýšení rozpustnosti ve vodném roztoku pro analýzu HPLC. Výsledky analýzy HPLC jsou uvedeny v obr. 10. Bylo dosaženo mnohem lepšího produktu než v případě linkeru HMPA ···· · * · · · · · ·· · · ···· · · · · • · <·« · ·· ······

IQ · · · · · · · · “ Iv···· ·· ·· ♦·· ·· ·· (obr. 9 a příklad 10), ačkoliv jsou přítomny deleční peptidy. V případě (b) byl syntetizován stejný peptid za stejných podmínek a došlo k vytvoření peptidu bez detekovatelných delečních peptidů nebo neúplného odstranění skupiny Fmoc. Tyto výsledky mohou být porovnány se syntézou H-Lys-Alaio-OH s použitím konstruktu pryskyřice-MMa-Lys-Alaw, kde je vynechána pre-sekvence (Lys(tBoc))₆. Jsou vidět významná množství delečních peptidů.

Podle uvedených pozorování se další hledisko předkládaného vynálezu týká způsobu syntézy peptidů na pevné fázi popsaného výše io vyznačujícího se dalším rysem, tj. že mezi pre-sekvenci připojenou k nosiči a požadovanou peptidovou sekvenci AAi-AA_n je vložen linker, který umožňuje selektivní odštěpení uvedené sekvence. S výhodou je linker opticky aktivní. Použitelná skupina linkerů jsou a-hydroxy a aaminokyseliny obecného vzorce

R¹

I

X —C —COOH I

R2 kde X je OH nebo NH₂ a R¹ a R² jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, Ci_3alkyl, fenyl a substituovaný fenyl, kde substituenty jsou jeden nebo více substituentů schopných darovat elektron, například zvolené ze skupiny C-i-3alkoxy, Ci_3alkyl nebo jsou spojeny dvě vicinální skupiny substituentů za vytvoření 5- nebo 6-členného kruhu spolu s atomy uhlíku, ke kterému jsou připojeny.

Nejvýhodnějšími linkery jsou racemická kyselina 4methoxymandlová, kyselina (+)-4-methoxymandlová, difenylglycin a kyselina glykolová.

·· ···· • ·

Je třeba rozumět, že jestliže X je OH, produktem vytvořeným po štěpení bude peptid AAi-AA_n-OH, tj. Y = OH, zatímco v případě kde X je NH₂ bude vytvořen amid peptidu AAi-AA_n-NH₂₎ tj. Y = NH₂.

V ještě dalším provedení vynálezu se vloží

Další důležité provedení vynálezu se týká činidel pro použití při syntéze na pevné fázi s použitím jednoho nebo více z výše popsaných rysů týkajících se pre-sekvencí a linkerů.

První hledisko tohoto provedení se týká činidla pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi obecného vzorce

X-AA’i-.....-AA^-YrR kde R je pevný nosič použitelný při syntéze peptidů na pevné fázi, Yi je aminokyselinová sekvence obsahující od 3 do 9, s výhodou od 5 do 7 zbytků aminokyselin nezávisle zvolených z nativních Laminokyselin s funkčními skupinami postranních řetězců chráněnými is při krocích reakce a s faktory náklonnosti Pa > 0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ < 1,10, například Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met nebo Gin, nebo odpovídajících D-aminokyselin, AA’ je zbytek L- nebo D-aminokyseliny, m je 0 nebo celé číslo od 1 do 40 a X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny.

Druhé hledisko tohoto provedení se týká činidla pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi obecného vzorce

X-AA’i-.....-AA’_m-Li-Yi-R kde X, AA’, m, Yi a R jsou jak definováno výše a Li je s výhodou opticky aktivní linker, který umožňuje selektivní odštěpení vazby na

AA’m·

Výhodné linkery jsou α-hydroxy nebo a-aminokyseliny jak je popsáno výše.

Třetí hledisko tohoto provedení se týká činidla pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi obecného vzorce ·· ···· “b···

Χ-ΑΑ’ι-.....-AA’m-Li-Yi-L₂-R kde X, AA’, m, Yi, R a Li jsou jak definováno výše a L₂ je linker, umožňující selektivní odštěpení z pevného nosiče.

Čtvrté hledisko tohoto provedení se týká činidla pro použití při 5 syntéze peptidů na pevné fázi obecného vzorce

X-AA*!-.....-AAm-YrLz-R kde X, AA’, m, Yi, Ra L₂ je jak definováno výše.

Je zřejmé, že výše uvedená činidla mohou být ve formě polymerů, gelů nebo jiných pevných fází připravených pro syntézu peptidů na pevné fázi podle vynálezu tím, že

a) obsahují pre-sekvenci a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (první hledisko) nebo

b) obsahují pre-sekvenci, s výhodou opticky aktivní štěpící linker a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (druhé hledisko) nebo

c) obsahují druhý linker umožňující odštěpení z nosiče, presekvenci, první s výhodou opticky aktivní linker umožňující odštěpení a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (třetí hledisko) a

d) obsahují linker umožňující odštěpení z nosiče, pre-sekvenci a popřípadě jednu nebo více aminokyselin z požadované sekvence (čtvrté hledisko).

Konkrétní podmínky použité při experimentech, na kterých je vynález založen, jsou uvedeny níže mezi obecnými postupy.

Obecně řečeno, bez ohledu na nové a charakteristické rysy týkající se pre-sekvence a nových linkerů pro štěpení může být způsob podle vynálezu prováděn za tradičních podmínek syntézy peptidů na pevné fázi popsaných v literatuře uváděné v části Dosavadní stav techniky.

··

- 99 „ · · £-£- ···· 4· ···<

• 9 • ··· • · · • * ··· ·· ·· * » • · · ι>1· 9 · · • · ·· *·

Může však být vhodný následující krátký souhrn.

Skupiny Fmoc mohou být odstraněny působením aminu jako je piperidin nebo diazaabicykio[5,4,0]undec-7-en (DBU).

Ochranné skupiny postranního řetězce mohou být odstraněny 5 kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), HBr, HCl nebo HF.

Pevný nosič se s výhodou volí z funkcionalizovaných pryskyřic jako je polystyren, polyakrylamid, polyethylenglykol, celulóza, polyethylen, latex nebi dynabeads.

ίο V případě potřeby mohou být navázány C-koncové aminokyseliny na pevný nosič běžným linkerem jako je 2,4-dimethoxy4’-hydroxybenzofenon, kyselina 4-(4-hydroxy-methyl-3methoxyfenoxy)-máselná (HMPB), kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, kyselina 4-hydroxymethylfenoxyoctová (HMPA), kyselina 3-(415 hydroxymethylfenoxy)propionová nebo kyselina p-[(R,S)-a[1-(9Hfluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-fenoxyoctová (AM).

Syntéza může být prováděna vsádkovým způsobem nebo kontinuálně na automatickém nebo poloautomatickém syntezátoru peptidů.

Jednotlivé reakční kroky mohou být prováděny v přítomnosti rozpouštědla, například zvoleného ze skupiny acetonitril, N,Ndimethylformamid (DMF), N-methylpyrrolidon (NMP), dichlormethan (DCM), trifluorethanol (TFE), ethanol, methanol, voda, směsi uvedených rozpouštědel s nebo bez dalších látek jako jsou chloristany nebo ethylenkarbonáty.

Jednotlivé vazby mezi dvěma aminokyselinami, aminokyselinou a dříve vytvořenou peptidovou sekvencí nebo peptidovým fragmentem a dříve vytvořenou peptidovou sekvencí mohou být prováděny běžnými kondenzačními způsoby jako je azidová metoda, metoda směsného ·· ·· • toto · • · · . 23 - ·* ί ί ···· ·· ·· ···· toto ·· • to to to · · · • to ··· · · · · ··· · · to·· ··· • · · · · ·· ··· ·· toto anhydridů kyseliny, metoda symetrického anhydridů, karbodiimidová metoda, metoda aktivního esteru jako je pentafluorfenyl (Pfp), 3,4dihydro-4-oxobenzotriazin-3-yl (Dhbt), benzotriazol-1-yl (Bt), 7azabenzotriazol-1-yl (At), 4-nitrofenyl, imidoestery kyseliny N5 hydroxyjantarové (NHS), chloridy kyselin, fluoridy kyselin, aktivace in šitu činidly jako O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HATU), O-(benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HBTU), O-(benzotriazol-l-yl)1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorborát (TBTU) nebo io benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexafluorfosfát (BOP).

Vytvořený peptid může být odštěpen od nosiče kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBR), chlorovodík (HCI), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, aikoxid nebo hydroxid.

Alternativně se peptid odštěpuje od nosiče fotolýzou.

Při provedení, kdy je linker vložen mezi pre-sekvenci připojenou na nosič a sekvenci AA-i-AA_n umožňující selektivní odštěpení uvedené sekvence, může být uvedené štěpení prováděno kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBR), chlorovodík (HCI), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, aikoxid nebo hydroxid.

QA · · ··· · ··

- Z*T “ ·♦···· ···· ·· ·· ···

Syntéza peptidů uskutečňovaná s pomocí sekvence (SAPS)

Postupy experimentů:

Syntéza peptidů Obecné postupy

Přístroje a strategie syntézy

Peptidy byly syntetizovány buď vsádkovým způsobem v polyethylenové nádobě opatřené polypropylenovým filtrem pro filtraci nebo kontinuální průtokovou verzí metody na pevné fázi polyamidu (Dryland, A. a Sheppard, R. C. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans. I,

125 - 137) na plně automatickém syntezátoru peptidů (Cameron, L.,

Meldal, M. a Sheppard, R. C. (1987), J. Chem. Soc. Chem. Commun, 270 - 272) s použitím 9-fluorenylmethyloxykarbonylu (Fmoc) nebo terc.-butyloxykarbonylu (Boc) jako Ν-α-aminových ochranných skupin a vhodných společných ochranných skupin pro funkční skupiny postranních řetězců.

Rozpouštědla

Rozpouštědlo DMF (Ν,Ν-dimethylformamid, Riedel de-Háen, Německo) bylo čištěno průchodem přes kolonu naplněnou silnou kationtovou iontoměničovou pryskyřicí (Lewatit S 100 MB/H silně kyselá, Bayer AG Leverkusen, Německo) a analyzováno na přítomnost volných aminů před použitím přídavkem 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo1,2,3-benzotriazinu (Dhbt-OH), který poskytuje žluté zbarvení (aniont Dhbt-O) v přítomnosti volných aminů. Rozpouštědlo DCM (dichlormethan pro analýzu, Riedel de-Háen, Německo) byl přímo použit bez čištění.

• · · ·

- 25 Aminokyseliny

Aminokyseliny chráněné Fmoc a odpovídající pentafluorfenyl (Pfp) estery byly získány od firmy MilliGen, UK, NovaBiochem, Švýcarsko a Bachem, Švýcarsko a Dhbt-estery od firmy NovaBiochem,

Švýcarsko s vhodně chráněnými postranními řetězci. Aminokyseliny chráněno Boc byly zakoupeny u firmy Bachem, Švýcarsko.

Vazebná činidla

Vazebné činidlo diizopropylkarbodiimid (DIC) bylo zakoupeno 10 u firmy Riedel de-Háen, Německo a před použitím destilováno; dicyklohexylkarbodiimid (DCC) byl pořízen u firmy Merck-Schuchardt, Mnichov, Německo a čištěn destilací. O-benzotriazolyl-N,N,N’,N’tetramethyluroniumtetrafluorborát (TBTU) byl získán od firmy

PerSeptive Biosystems GmbH Hamburk, Německo.

Linkery

Linkery HMPA, Novabiochem, Švýcarsko; kyselina 4hydroxymethylbenzoová, NovaBiochem; kyselina 4-methoxymandlová, Aldrich, Německo; HMPB, NovaBiochem; AM, NovaBiochem; kyselina

3-(4-hydroxymethylfenoxy)propionová, NovaBiochem, byly navázány na pryskyřici ve formě předem vytvořeného 1hydroxybenzotriazolového (HObt) esteru vytvořeného pomocí DIC. Racemická kyselina 4-methoxymandlová (98 % čistoty, Aldrich, Německo) byla použita přímo jako linker nebo rozdělena působením (+)-cinchoninu (čistota 85 %, Aldrich, Německo) za poskytnutí opticky aktivního linkeru kyseliny (+)-4-methoxymandlové, [a]²⁰ = + 146 (voda) s 95,8 % optickou čistotou a kyselina (-)-4-methoxymandlová, [a]²⁰ = - 128,6 (voda) s 88,1 % optickou čistotou.

oo ······ · · ·····« ···· ·· ·· · · ·

Rozdělení kyseliny (+/-)-4-methoxvmandlové (A. McKenzie, D. J. C. Pirie, McKenzie, A., Pirie, D. J. C. (1936), Berichte 69, 868; Knorr, E. (1904), Berichte 37, 3172)

Kyselina (+/-)-4-methoxymandlová (10 g, 54,89 mmol; Aldrich, 5 98 %) byla rozpuštěna v 500 ml horké vody (60 - 80 °C) a roztok byl dekantován za stálého zahřívání pro odstranění nerozpustných nečistot. Do horkého roztoku byl po malých částech přidán (+)cinchonin (16,16 g, 54,89 mmol, Aldrich, 85 %, [a]_D ²⁰ = + 211° (podle literatury + 228°). Roztok se vyčeřil po 15 minutách míchání při 60 až io 80 °C a byl ochlazen v ledu. Po 1 hod byla sraženina shromážděna filtrací a sušena v exikátoru přes noc za získání 9,9 g cinchoninové soli. Sůl byla rekrystalizována z vařící vody (80 ml), roztok byl za zahřívání dekantován a potom ochlazen v ledu. Sraženina byla oddělena filtrací po 1 hodině, třikrát promyta studenou vodou a sušena přes noc v exikátoru za získání 7,84 g (16,45 mmol). Cinchoninová sůl (2 g, 4,2 mmol) byla rozpuštěna ve 40 ml 2N HCl a ihned extrahována 3 x 30 ml diethyletheru. Etherová fáze byla sušena nad Na2SO4 a odpařena dosucha za získání 0,55 g kyseliny 4-methoxymandlové. Optická čistota uvolněné kyseliny 4-methoxymandlové byla odhadnuta na 18,5 % ([a]o²° = ⁺ 100,8°). Třetí rekrystalizací byla získána optická čistota 95,8 % ([a]_D ²⁰ = + 140,0°).

Pevné nosiče

Peptidy syntetizované strategií Fmoc byly syntetizovány na třech různých typech pevných nosičů s použitím koncentrací Fmoc-chráněné aktivované aminokyseliny v DMF 0,05M nebo vyšší. 1) PEG-PS (polyethylenglykol naroubovaný na polystyren; pryskyřice TentaGel S NH₂, 0,27 mmol/g, Rapp Polymere, Německo nebo pryskyřice NovaSyn TG, 0,29 mmol/g, Novabiochem, Švýcarsko); 2) PepSyn Gel (polydimethylakrylamidová pryskyřice funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu, 1,0 mmol/g; MilliGen, UK); 3) PepSyn K • · · · • · • · (polydimethylakrylamidová pryskyřice na křemelinovém nosiči funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu, 0,11 mmol/g; MilliGen,

UK).

Peptidy syntetizované strategií Boc byly syntetizovány na

Merrifieldově pryskyřici (polystyren-divinylbenzen) s připojenou první aminokyselinou (Novabiochem, Švýcarsko).

Katalyzátory a jiné reagencie

Diizopropylethylamin (DIEA) byl získán od firmy Aldrich,

Německo a ethylendiamin od firmy Fluka, Švýcarsko, piperidin od firmy Riedel de-Háen, Frankfurt, Německo. 4-(N,N-dimethylamino)pyridin (DMAP) byl získán od firmy Fluka, Švýcarsko a použit jako katalyzátor při vazebných reakcích s účastí symetrických anhydridů. 3,4-dihydro3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (Dhbt-OH) byl získán od firmy

Fluka, Švýcarsko a 1-hydroxybenzotriazoi (HObt) od firmy NovaBiochem, Švýcarsko.

Postupy provádění vazby

První aminokyselina byla navázána jako symetrický anhydrid v

DMF vytvořený z náklonné Ν-α-chráněné aminokyseliny a DIC. Následující aminokyseliny byly navázány jako Pfp- nebo Dhbt-estery nebo jako předem vytvořené HObt estery vyrobené z vhodných N-achráněných aminokyselin a HObt pomocí DIC nebo TBTU v DMF. V případě Fmoc byly všechny acylace kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C pro zabránění odštěpení ochranné skupiny Fmoc při testu (Larsen, B. D. a Holm, A. (1994), Int. J. Peptide & Protein Res. 43, 1 - 9).

• · · ·

- 28 ···· ··· ···· ·· · · ···· · ·· · • · ··· · · · ··· ··· ♦ ···· · · · ···· ·· ·· ··· ·· ··

Odstranění Ν-α-aminové ochranné skupiny

Odstranění ochranné skupiny Fmoc bylo provedeno působením 20 % piperidinu v DMF (1 x 3 a 1 x 7 min při syntéze vsádkovým způsobem) nebo průtokem rozpouštědla odstraňujícího ochranné skupiny přes pryskyřici (10 min, průtok 1 ml/min při kontinuální syntéze) s následným promýváním DMF, dokud již nebylo možno detekovat žlutou barvu (Dhbt-O') po přídavku Dhbt-OH do odtékajícího DMF.

Odstranění skupiny Boc bylo prováděno působením 50 % TFA v io DCM (obj.) 1 x 1,5 min a 1 x 20 min s následným promytím 6x9 min vždy DCM, neutralizací 10 % triethylaminem v DCM (obj.) vždy 2 x

1,5 min a s následným promytím 6x9 min DCM.

Odštěpení peptidu z pryskyřice kyselinou

Peptidy byly oddělovány z pryskyřic působením 95 % kyseliny trifluoroctové (TFA, Halocarbon Products Corporation, USA; Biesterfeld & Co. Hamburk, Německo) ve vodě (obj.) při pokojové teplotě 2 hodiny. Odfiltrované pryskyřice byly promyty 95 % směsí TFA-voda a filtráty a promývací roztoky odpařeny za sníženého tlaku.

Zbytek byl promyt etherem a lyofilizován ze směsi kyselina octová voda. Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a identifikován metodou matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI TOF MS) nebo hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrorozprašováním (ESMS).

Štěpení peptidu z pryskyřice pomocí báze

Sušená pryskyřice (1 g) byla smísena s 1M hydroxidem sodným (10 ml) při 4 °C a ponechána 15 min při pokojové teplotě. Pryskyřice byla zfiltrována do láhve s obsahem 10 % vodné kyseliny octové.

Peptid byl izolován lyofilizací a gelovou filtrací.

- 29 • · · · · · • · · · · ·· · • · · ··· ··· ······ ·· ···· ·· ·· ··· ·· ··

Odštěpení peptidu z pryskyřice TFMSA

Sušená pryskyřice (250 mg) byla vložena do kulové baňky s míchací tyčinkou. Byla přidána směs thioanisol/ethandithiol (2:1,

750 pl), směs byla ochlazena v ledu, bylo přidáno 5 ml TFA a směs byla míchána 5-10 minut. Po kapkách byla přidána TFMSA (500 μΙ) a reakce pokračovala při pokojové teplotě 30 - 60 minut. Peptid se vysrážel přidáním etheru.

io Odstranění ochranných skupin z postranních řetězců

Ochranné skupiny se odstraňují z postranních řetězců s výhodou při odštěpování peptidu z pryskyřice.

Předem vytvořený HObt-ester

Metoda a. 3 ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny byly rozpuštěny v DMF spolu s 3 ekv. HObt a 3 ekv. DIC. Roztok byl ponechán při pokojové teplotě 10 min a potom přidán k pryskyřici, která byla promýta roztokem 0,2 % Dhbt-OH v DMF před přídavkem předem aktivované aminokyseliny.

Metoda b. 3 ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny byly rozpuštěny v DMF spolu s 3 ekv. HObt, 3 ekv. TBTU a 4,5 ekv. DIEA. Roztok byl ponechán při pokojové teplotě 5 min a potom přidán k pryskyřici.

Předem vytvořeny symetricky anhydrid

6 ekv. Ν-α-chráněné aminokyseliny bylo rozpuštěno v DCM a ochlazeno na 0 °C. Byl přidán DCC (3 ekv.) a reakce pokračovala 10 minut. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a zbytky rozpuštěny v DMF. Roztok byl zfiltrován a ihned přidán k pryskyřici s následným přidáním 0,1 ekv. DMAP.

• · • · « · « <

- 30 Odhad výtěžku vazby první Ν-α-amino chráněné aminokyseliny

K 3 - 5 mg suché Fmoc-chráněné sloučeniny peptid - pryskyřice bylo přidáno 5 ml 20 % piperidinu v DMF v průběhu 10 min při pokojové teplotě a při 301 nm byla odhadována UV absorpce adduktu dibenzofulven-piperidin. Výtěžek byl stanoven s použitím vypočteného koeficientu e₃oi vztaženého ke standardu Fmoc-Ala-OH.

V případě ochrany Boc byl výtěžek vazby určován ninhydrinovou metodou po odstranění skupiny Boc (Sarin, V. K., Kent, S. Β. H., Tam, io J. P. a Merrifield, R. B. (1981), Anal. Biochem., 117, 147 - 157).

Syntéza peptidů na pryskyřici PepSyn K

Suchá pryskyřice PepSyn K (přibližně 500 mg) byla přelita ethylendiaminem a ponechána při pokojové teplotě přes noc.

Pryskyřice byla odsáta a promyta 10 x 15 ml DMF, vždy 5 minut. Po odtažení byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF (obj.) (2x15 ml, vždy 5 min) a nakonec promývána DMF, dokud již nemohlo být detekováno přídavkem Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. 3 ekv. HMPA, 3 ekv. HObt a 3 ekv. DIC byly rozpuštěny v 10 ml DMF a ponechány 10 min aktivovat; potom byla směs přidána k pryskyřici a vazba probíhala 24 hodin. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 minut) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Byla navázána první aminokyselina a ochrana postranního řetězce byla provedena symetrickým anhydrinem (viz výše); výtěžky reakce byly testovány jak bylo popsáno výše. Ve všech případech byly vyšší než 70 %. Syntéza potom pokračovala buď kontinuálně nebo vsádkově, jak bude popsáno dále.

00 00 0000 • 000 000 0000

0 0 0000 0 0« ·

0 000 0 00 000 000 0*1 0000·« ·· w I “ 0000 00 ·· ··· ·· ··

Kontinuální syntéza na pryskyřici PepSyn K použitím techniky kontinuálního průtoku

Pryskyřice (přibližně 500 mg) s připojenou první aminokyselinou byla vložena do kolony připojené na plně automatický syntezátor peptidů. Skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány ve formě chráněné Fmoc, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, estery Pfp (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Ukončení každé reakce bylo automaticky určováno monitorováním zmizení žlutého zbarvení ío aniontu Dhbt-OH spektrofotometricky. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s navázaným peptidem promyta DMF (průtok 1 ml/min, 10 min), DCM (vždy 3 min, 3x5 ml) a nakonec diethyletherem (3x5 ml), vyjmuta z kolony a sušena ve vakuu.

Pokračování vsádkové syntézy peptidů na pryskyřici PepSyn K

Pryskyřice (přibližně 500 mg) s navázanou první aminokyselinou byla vložena do polyethylenové nádoby opatřené polypropylenovým filtrem a byla odstraněna skupina Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako předem

2o vytvořené, Fmoc-chráněné, v případě potřeby s chráněnými postranními řetězci, HObt estery (3 ekv.) v DMF (5 ml) vyrobené jak bylo popsáno výše. Vazebné reakce pokračovaly 2 hod, pokud není uvedeno jinak. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Všechny acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min),

DCM (5x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem (5x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

- 32 ·· ♦··· · · ·· • ♦ · · · · · • · · · · · · · · »· ··· · ·· ······ *····· ·· <·· · ·· ·· ··· ·· · ·

Vsádková syntéza peptidů na PEG-PS

Pryskyřice TentaGel S NH₂ nebo NovaSyn TG (250 mg, 0,27 0,29 mmol/g) byla vložena do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem. Pryskyřice byla ponechána bobtnat v DMF (5 ml) a byla smísena s 20 % piperidinem v DMF pro zajištění přítomnosti neprotonovaných aminoskupin na pryskyřici. Pryskyřice byla odsáta a promývána DMF, dokud nemohlo být detekováno po přípdavku Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. Byla provedena reakce HMPA (3 ekv.) jako předem vytvořeného esteru ío HObt jak bylo popsáno výše a reakce byla ponechána probíhat 24 hod. Pryskyřice byla odsáha a promytá DMF (5x5 ml, vždy 5 min) a acylace byla zkontrolována ninhydrinovým testem. První aminokyselina byla navázána ve formě předem vytvořeného symetrického anhydridu jak bylo popsáno výše. vazebné výtěžky prvních aminokyselin chráněných Fmoc byly určovány výše popsaným způsobem. Ve všech případech byly lepší než 60 %. Následující aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako předem vytvořené, Fmoc-chráněné, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, estery HObt (3 ekv.) jak bylo popsáno výše. Vazebné reakce

2o pokračovaly 2 hodiny, pokud není uvedeno jinak. Pryskyřice byla odsáta a promytá DMF (5x5 ml, vždy 5 min) pro odstranění nadbytku činidla. Všechny acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C. Po ukončené syntéze byla pryskyřice s peptidem promytá DMF (3x5 ml, vždy 5 min), DCM (3x5 ml, vždy

1 min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

Vsádková syntéza peptidů na gelu PepSvn

Sušená pryskyřice PepSyn Gel (500 mg, 1 mmol/g) byla vllžena do polyethylenové nádoby opatřené polypropylenovým filtrem. Pryskyřice byla ponechána bobtnat v ethylendiaminu (15 ml) a byla • 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · · 9 99 9 9 9 9 9 mírně míchána třepáním 20 hodin. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 min). Po odsátí byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF (obj.) (2 x 15 ml, vždy 5 min) a nakonec promyta DMF (5x15 ml, vždy 5 min), až již nebylo dotekováno po přidání Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. HMPA (3 ekv.) byla navázána jako předem aktivovaný ester HObt jak bylo popsáno výše (metoda a) a vazba pokračovala 24 hod. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x15 ml, vždy 5 min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. První aminokyselina byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše. Vazebné výtěžky pro první aminokyseliny chráněné Fmoc byly odhadnuty jak bylo popsáno výše. Ve všech případech byly lepší než 70 %. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako předem vytvořené estery HObt (3 ekv.) chráněné Fmoc, v případě potřeby s chráněným postranním řetězcem, jak bylo popsáno výše (metoda a). Vazby pokračovaly 2 hodiny a v případě potřeby ještě přes noc. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (5x5 ml, vždy 5 min) pro odstranění nadbytku činidla. Všechny acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (3x15 ml, vždy 5 min), DCM (3x15 ml, vždy 2 min) a nakonec diethyletherem (3 x 15 ml, vždy 2 min) a sušena ve vakuu.

Podmínky HPLC

HPLC byla prováděna na přístroji Waters 600 E opatřeném detektorem Waters 996 Photodiode array detector s kolonou Waters Radial Pak 8 x 100 mm Cis s reverzní fází. Pufr A byl 0,1 objemových procent TFA ve vodě a pufr B 90 obj. procent acetonitrilu, 9,9 obj. % vody a 0,1 obj. % TFA. Pufry byly čerpány přes kolonu s průtokem

1,5 ml/min s použitím gradientu: 1. lineární gradient od 0 do 70 % B (20 min), lineární gradient od 70 do 100 % B (1 min), izokraticky

- 34 100 % Β (5 min). 2. Izokraticky 0 % Β (2 min), lineární gradient od 0 do % B (23 min), lineární gradient od 50 do 100 % B (5 min), izokraticky 100 % B (5 min).

Hmotnostní spektroskopie

Hmotnostní spektra typu matrix assisted laser desorbtion ionization time-of-flight (MALDI TOF) byla získávána na přístroji Fisons TofSpec E. Hmotnostní spektra s elektrorozprašovací ionizací byla získávána na přístroji Finnigan Mat LCQ opatřeném ío elektrorozprašovací (ESI) sondou (ES-MS).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je záznam HPLC surového H-Alaio-Lys-OH ukazující podstatná 15 množství delečních peptidů (vrcholy 1, 2, 3 a 4) a peptidu s neúplně odstraněným Fmoc (vrcholy 6, 7, 8 a 9) v přítomnosti cílového peptidu (vrchol 5).

Obr. 2 je diagram znázorňující postupné doby reakce pro každý 20 z alaninů při syntéze H-Alaw-Lys-OH.

Obr. 3 je záznam HPLC H-Ala₁₀-Lys₃-OH ukazující cílový peptid. Nebyly pozorovány deleční peptidy.

Obr. 4 je záznam HPLC H-Ala₂o-Lys₃-OH ukazující deleční peptidy (vrcholy 1, 2, 3, 4 a 5) mimo cílového peptidu (vrchol 6).

Obr. 5 je záznam HPLC H-Alai₀-Lys₆-OH. Nejsou vidět žádné deleční peptidy.

··

Obr. 6 je záznam HPLC H-Ala₂₀-Lys₆-OH. Nejsou vidět žádné deleční peptidy.

Obr. 7 je záznam HPLC H-VQAAIDYING-OH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74. Cílový peptid (vrchol 3) je doprovázen delečními peptidy (vrchol 2 patří peptidu des-Val).

Obr. 8 je záznam HPLC H-VQAAIDYING-K₆-OH, Acyl Carrier Protein (ACP) 65 - 74 navázaný na pre-sekvenci Lys(Boc)₆ ío s přítomností pouze malého množství peptidu des-Val (vrchol 1).

Obr. 9 je záznam HPLC H-Alaw-Lys-OH vyrobeného přidáním linkeru HMPA. Je vidět několik delečních peptidů (z Alaw-Lys(tBoc)15 HMPA-(Lys(tBoc))₆-pryskyřice).

Obr. 10 je podobný záznam HPLC H-Alaw-Lys-OH vyrobeného použitím linkeru MMa. Je vidět podstatné snížení množství delečních peptidů ve srovnání s obr. 9 (z Alaw-Lys-MMa20 (Lys(tBoc))₆-pryskyřice).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza H-Alaw-Lys-OH (srovnání) ₂5 Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že jde o komplikovanou směs obsahující cílový peptid (n=10) i deleční peptidy odpovídající n = 6, 7, 8 a 9 a deleční peptidy, u kterých byla skupina Fmoc stále připojena na N-konec s n = 6, 7, 8, popřípadě 9. Identita jednotlivých peptidů byla potvrzena metodou

3o MALDI TOF MS.

·· « ) · · » · · • · · β

- 36 Příklad 2

Syntéza H-Alaw-Lysg-OH

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo 5 zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 91,0 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 3). Identita peptidu byla potvrzena použitím metody MALDI

TOF MS.

io Příklad 3

Syntéza H-Alaw-Lys6-OH

500 mg Fmoc-Lys(Boc) pryskyřice PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo 15 zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 90,9 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 5). Identita peptidu byla potvrzena ES MS.

Příklad 4

2o Syntéza H-Ala?n-Lys₃-OH

500 mg Fmoc-Alai₀-(Lys(Boc))₃ pryskyřice PepSyn KA (ze syntézy H-Alaio-Lys₃-OH) bylo použito pro syntézu metodou kontinuálního průtoku.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo 25 zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Ala_n-Lys₃-OH (n = 20) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 19, 18, 17 a 16 (viz obr. 4). Sekvence chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena ES

MS.

• · · ·

- 37 Příklad 5

Syntéza H-Alago-Lyss-OH

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Výtěžek 91,4 %. Bylo zjištěno, že čistota podle HPLC je lepší než 98 % (viz obr. 6). Identita peptidu byla potvrzena ES MS.

Příklad 6

Syntéza H-Alago-Lys-fGlu-Lysb-OH

500 mg pryskyřice Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmol/g) bylo použito pro syntézu metodou kontinuálního průtoku.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC. Bylo zjištěno, že čistota je lepší než 98 % bez přítomnosti delečních a Fmocchráněných sekvencí. Výtěžek 97 %. Identita peptidu byla potvrzena ES MS.

Příklad 7

Syntéza úseku 65 - 74 Acyl Carrier Protein (ACP), H-Val-GIn-Ala-AlaIle-Asp-Tvr-lle-Asn-Gly-OH (srovnání)

500 mg Fmoc-Gly pryskyřice PepSyn KA (0,074 mmol/g) bylo použito pro syntézu postupem „kontinuální průtok“.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílovou molekulu doprovázenou přibližně 16 % peptidu des-Val. Identita peptidů byla potvrzena technikou MALDI TOF

MS.

·· ····

Příklad 8

Syntéza úseku 65 - 74 Acyl Carrier Protein (ACP), H-Val-GIn-Ala-AlaIle-Asp-Tyr-lle-Asn-Glv-Lyse-OH s použitím pre-sekvence (Lys(Boc)).6

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid s vysokou čistotou (~ 95 %) s podstatně sníženým množstvím peptidu des-Val. Identita peptidů io byla potvrzena technikou MALDI TOF MS.

Příklad 9

Syntéza H-Val-Asn-Val-Asn-Val-GIn-Val-GIn-Val-Asp-Lyse-OH s použitím pre-sekvence (LysfBocHe

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že má čistotu lepší než 90 %) bez delečních peptidů a sekvencí chráněných Fmoc.Výtěžek 100 %. Identita peptidů byla

2o potvrzena technikou MALDI TOF MS.

Příklad 10

Syntéza H-Alaio-Lys-OH s použitím (Lys(Boc))e jako pre-sekvence a HMPA jako linkeru (H-Alaio-Lvs(Boc)-OCH2-PhOCH7CO-(Lys(Boc))625 NHCHzCH^NH PepSyn K).

500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo překryto ethylendiaminem (5 ml) a ponecháno při pokojové teplotě přes noc. Pryskyřice byla odsáta a promyta DMF (10 x 15 ml, vždy 5 min). Po ·· ···· odsátí byla pryskyřice promyta 10 % DIEA v DMF obj. (2x15 ml, vždy 5 min) a nakonec DMF, až již nebylo detekováno po přídavku Dhbt-OH k vytékajícímu DMF žluté zbarvení. Derivatizovaná pryskyřice byla použita pro syntézu technikou kontinuálního průtoku.

Prvních 6 lyzinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno ve formě esterů Fmoc-Lys(Boc)-Pfp (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl určován automaticky jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odštěpena jak bylo popsáno výše. Po ukončení byla na vrchol kolony nanesena pre-sekvence 3 ekv. navázaná na io HMPA ve formě předaktivovaného esteru HObt jak bylo popsáno výše. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odstraněn pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. Příští aminokyselina podle sekvence byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše nanesený na vrchol kolony spolu s 0,1 ekv. DMAP a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min. Nadbytek reagencie byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku vazby, který byl odhadnut jak bylo popsáno dříve; byla zjištěna hodnota 84 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako estery Pfp (3 ekv.) chráněné Fmoc, popřípadě s chráněným postranním řetězcem, za přidávání Dhbt-OH (1 ekv.).

Konec každé reakce byl automaticky určen jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min), odstraněna z kolony a sušena ve vakuu. Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Ala_n-Lys-OH (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 9, 8, 7 a 6 (viz obr. 9). Sekvence • · · · · · 9 9 999999 *····· ·· 9999 99 99 999 99 99

- 40 chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena metodou MALDI TOF MS.

•9 ····

Příklad 11

Syntéza H-Alaio-Lvs-OH s použitím kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Alaw-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CONHCH2CH2NH

PepSyn K).

500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo smíseno s ethylendiaminem jak bylo popsáno výše. Derivatizovaná pryskyřice io byla použita pro syntézu metodou kontinuálního průtoku. Na vrchol kolony bylo naneseno 10 ekv. kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové, 10 ekv. HObt a 10 ekv. DIC rozpuštěné v 5 ml DMF, předaktivované 10 min a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min).

Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. První aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a nanesena na vrchol kolony spolu s 0,1 ekv. DMAP a syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min. Potom byl nadbytek reagencie odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Byl odebrán malý vzorek pryskyřice pro kontrolu výtěžku reakce, který byl testován podle výše uvedeného popisu; byl zjištěn výtěžek 75 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. zbývající aminokyseliny podle sekvence byly vázány jako estery Pfp chráněné Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl určován automaticky jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min) a nakonec diethyletherem, odstraněna z kolony a sušena ve vakuu.

·· ··»«

Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno dříve a lyofilizován z roztoku kyselina octová - voda.

Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Ala_n-Lys-OH (n = 10) spolu s delečními peptidy odpovídajícími n = 9, 8, 7 a 6. Identita peptidu byla potvrzena MALDI TOF MS.

Příklad 12

Syntéza H-Alaio-Lys-QH s použitím (Lys(Boc))fi jako pre-sekvence io a kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Alaw-Lys(Boc)OCH-(4-MeOPh)CO-(Lys(Boc))6-NHCH?CH?NH PepSyn K).

500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo smíseno s ethylendiaminem jak bylo popsáno výše. Derivatizovaná pryskyřice byla použita pro syntézu způsobem kontinuálníhp průtoku. Prvních šest lysinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako estery Pfp (3 ekv.) chráněné Fmoc a s chráněnými postranními řetězci za přídavku Dhbt-OH (1 ekv.). Konec každé reakce byl automaticky stanoven jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odštěpena jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy pre-sekvence bylo navázáno

10 ekv. kyseliny (+/-)-4-methoxymandlové ve formě předaktivovaného esteru HObt jak bylo popsáno výše a naneseno na vrchol kolony. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 2 hodiny a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu acylace ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako předem vytvořený symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a nanesena na vrchol kolony spolu s (0,1 ekv.) DMAP. Syntezátor pracoval v recirkulačním modu 90 min a nadbytek činidla byl potom odstraněn promytím DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Byl odebrán malý vzorek pryskyřice pro kontrolu výtěžku reakce, který byl zjištěn výše popsaným způsobem

- 42 ·« »· » · · • · ·· «· « · · • · · • ♦ · · · · • · ·· ·· jako 68 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc jak bylo popsáno výše. Zbylé aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako estery Pfp chráněné Fmoc (3 ekv.) za přídavku DhbtOH (1 ekv.). Konec každé reakce byl automaticky určován jak bylo popsáno výše. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promýta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, průtok 1 ml/min) a nakonec diethyletherem (3x5 ml, průtok 1 ml/min), vyjmuta z kolony a sušena ve vakuu. Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše a lyofilizován ze směsi kyselina octová - voda. io Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že obsahuje cílový peptid H-Ala_n-Lys-OH (n = 10) stejně jako deleční peptidy odpovídající n = 9, 8, 7 a 6. Bylo zjištěno, že množství delečních peptidů je výrazně sníženo ve srovnání s příklady 10 a 11 (viz obr. 10). Sekvence chráněné Fmoc nebyly detekovány. Identita peptidů byla potvrzena metodou MALDI TOF MS.

Příklad 13

Syntéza H-Alaw-Lys-OH s použitím (Lys(Boc))fi jako pre-sekvence a kyseliny (+)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Alaio-Lys(Boc)20 OCH-(4-MeOPh)CO-(Lys(Boc))B-NHCH2CH7NH PepSyn K).

500 mg suché pryskyřice PepSyn K (0,1 mmol/g) bylo vloženo do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem a byl přidán ethylendiamin jak bylo popsáno výše. Prvních šest lysinů tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako Pfp estery chráněné Fmoc as chráněnými postranními řetězci (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Po ukončení pre-sekvence reagovala pryskyřice s navázaným peptidem s odstraněnými

3o ochrannými skupinami s 10 ekv. kyseliny (+)-4-methoxymandlové ve formě předaktivovaného HObt-esteru jak bylo popsáno výše (dělení

- 43 • A AA

A A A A A A · • A A • A A

AA A A >A ·· AAAA • A A AAA

A

A A

A A • A

A

AAA

A· A A » A A A

A A A A • A A AAA A A

AA AA výše popsaným způsobem, 95,8 % optické čistoty) a vazebná reakce pokračovala 24 hodin. Nadbytek činidla byl odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše a reakce pokračovala 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku reakce, který byl určen výše popsaným způsobem io jako 66 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc výše popsaným způsobem.

První alanin byl navázán jako ester Pfp chráněný Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (průtok

1 ml/min 12 min) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem při 80 °C. Skupina Fmoc byla potom odstraněna působením 2 % piperidinu v DMF (obj.) (1 min, průtok 1 ml/min) s následným promytím DMF (10 s, průtok 10 ml/min), 0,2 % Dhbt-OH v DMF (20 min, průtok 1 ml/min) a nakonec DMF (2x5 ml, vždy 1 min). Následující alanin chráněný Fmoc byl ihned navázán jako ester Pfp (3 ekv.) s přidáním 1 ekv. Dhbt-OH v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako Pfp estery chráněné

Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml). Nadbytek činidla byl odstraněn praním DMF (12 min, průtok 1 ml/min) a acylace byly testovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odstraněna výše popsaným způsobem. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta

DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

·· • · · • · • · • · »··· • · · ··

-44 ·· ···· • · • ··· • · · • · ·· ··· ·· ·· • · · • · · · ··· ··· • · ·· ··

Peptid byl odštěpen z pryskyřice výše popsaným způsobem a lyofilizován z ledové kyseliny octové. Surový lyofilizát byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez deleci a sekvencí chráněných Fmoc.

Příklad 14

Syntéza H-Alaw-Lys-OH s použitím (Glu(OtBu))fi jako pre-sekvence a kyseliny (+)-4-methoxymandlové jako linkeru (H-Alaig-Lys(Boc)OCH-(4-MeOPh)CO-(Glu(OtBu))s-NHCH?CH?NH PepSyn K).

ío 500 mg suché pryskyřice PepSyn K bylo vloženo do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem a byl přidán ethylendiamin jak bylo popsáno výše. Prvních šest kyselin glutamových tvořících pre-sekvenci bylo navázáno jako FmocGlu(OtBu)-Pfp estery (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.). Acylace byly kontrolovány ninhydrinovým testem prováděným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna jak bylo popsáno výše. Po ukončení pre-sekvence bylo přidáno 10 ekv. kyseliny (+)-4-methoxymandlové ve formě predaktivovaného HObtesteru jak bylo popsáno výše (dělení výše popsaným způsobem,

95,8 % optické čistoty) a vazebná reakce pokračovala 24 hodin.

Nadbytek činidla byl odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem. Další aminokyselina podle sekvence byla navázána jako symetrický anhydrid chráněný Fmoc s chráněným postranním řetězcem jak bylo popsáno výše za katalázy DMAP (0,1 ekv.) a reakce pokračovala 2 hodiny. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (12 min, průtok 1 ml/min). Malý vzorek pryskyřice byl odebrán pro kontrolu výtěžku reakce, který byl určen výše popsaným způsobem jako 75 %. Syntéza potom pokračovala odštěpením skupiny Fmoc výše popsaným způsobem.

První alanin byl navázán jako ester Pfp chráněný Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Nadbytek činidla byl potom odstraněn promýváním DMF (průtok 1 ml/min 12 min) a acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem při 80 °C. Skupina Fmoc byla potom odstraněna působením 2 % piperidinu v DMF (obj.) (1 min, průtok 1 ml/min) s následným promytím DMF (10 s, průtok 10 ml/min), 0,2 % Dhbt-OH v DMF (20 min, průtok 1 ml/min) a nakonec DMF (2x5 ml, vždy 1 min). Následující alanin chráněný Fmoc byl ihned navázán jako ester Pfp (3 ekv.) s přidáním 1 ekv. Dhbt-OH v DMF (2 ml) po dobu 2 hodin. Acylace byla kontrolována ninhydrinovým testem provedeným výše popsaným způsobem. Zbývající aminokyseliny podle sekvence byly navázány jako Pfp estery chráněné Fmoc (3 ekv.) s přídavkem Dhbt-OH (1 ekv.) v DMF (2 ml). Nadbytek činidla byl odstraněn praním DMF (12 min, průtok 1 ml/min) a acylace byly testovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C jak bylo popsáno výše. Skupina Fmoc byla odstraněna výše popsaným způsobem. Po ukončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF (10 min, průtok 1 ml/min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3x5 ml, vždy 1 min) a sušena ve vakuu.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice výše popsaným způsobem a lyofilizován z ledové kyseliny octové. Surový lyofilizát byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc.

Příklad 15

Syntéza peptidu Tyr-Glv-Glv-Phe-Leu-Lys6-OH na materiálu NovaSyn

TentaGel

Suchá pryskyřice NovaSyn TG (0,29 mmol/g, 250 mg) byla vložena do polyethylenové nádobky opatřené polypropylenovým filtrem a dále zpracovávána způsobem vsádkové syntézy peptidů na PEG-PS

-46 až do dokončení pre-sekvence Lys6. Následující aminokyseliny tvořící sekvenci Leu-enkefalinu byly navázány jako předem vytvořené HObt estery chráněné Fmoc (3 ekv.) v DMF (5 ml) vytvořené pomocí DIC. Před každou z posledních 5 vazebných reakcí byla pryskyřice promyta roztokem Dhbt-OH (80 mg v 25 ml) pro sledování zmizení žlutého zbarvení při postupující vazebné reakci. Když již nebyla žlutá barva viditelná, reakce byly přerušeny promytím pryskyřice DMF (5x5 ml, vždy 5 min). Acylace potom byly kontrolovány ninhydrinovým testem provedeným při 80 °C výše uvedeným způsobem. Po ukončení syntézy ío byla pryskyřice s navázaným peptidem promyta DMF (3x5 ml, vždy 1 min), DCM (3x5 ml, vždy 1 min), diethyletherem (3x5 ml, vždy min) a sušena ve vakuu.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice jak bylo popsáno výše a lyofilizován z kyseliny octové. Surový lyofilizovaný produkt byl analyzován HPLC a bylo zjištěno, že je homogenní bez delecí a sekvencí chráněných Fmoc. Bylo zjištěno, že čistota je lepší než 98 % a identita peptidu byla potvrzena ES-MS. Bylo dosaženo výtěžku 84 %.

• ·

	Φ o c Φ > JC Φ	CZ E	c 'E	cz E	CZ E
		CA	¹	o	o	o	o
		Φ		CM	co	co	•Ν’
	Φ CT	U- Q.		v	v	v	V
	JC	N
	CO	Φ
	Φ	JO
	u.
	co
	JZ)
	o	CT
	Q	C Φ >	c.	c	c	c	c
		JC Φ	E	E	E	E	E
r		CA	CN	m	CN	CN	T—
		Φ	V	v	V	V	v
		L-

CL ca ca

JO ca

E φ

φ

C

O

JC co <

0.

X

N

I

O >

o

		OC	X	X	X	X I	X \|	CT o
		1 <	1 <	<	<	<	<	>.	É φ c
		CL	X	X	X	X	X	X o
			Σ	z			Zš	c
		X	X	X	X	X	X	Φ M—	*L-
		to z—> CT	1 to 7?	1 to o	1 to 'cj	1 to 7?	1 co	>» JZ	CT >« JZ
		O	o	o	O	O	o	Φ	c
		co	co	co	CO	CO	co	E	'c
	<£>	CA	CA	CA	CA	CA	CA		co
		>,	>,	>»	><			X
	TT		_1			_l \|	I	o L_	X
Φ Q	O	1 X	3	3	3	3	3	TJ	O
co	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ		1
>LZZ			_l	_l	_l	_l	_J	JZ	JO
>> JC CA >>	CA >4 _l		1 X	Φ JZ Ο-	Φ sz X	Φ JZ X	Φ JZ X	4 3 o	JZ Q 3
Q.	Φ			Χ	><	>.	>4	c	ω
1	CT r-				O	O	O	Φ	Φ 1
33 X Q. Φ CL	Φ > JC Φ CA				i X	1 o 1 X	1 >4 o 1 >>	CA >> JC ‘Z* c	co c >. c Φ
	Φ						Η-	co	>N
	CL						Χ	> o N	O CO N

co 3 > o 'ι- V)

Tabulka 1 to c

φ ca

JC o

c

Ě <

X	X	X	X	X
o	o 1	O	O	o
3	Φ	Ζ»	1 >»	1 L_
Φ	JZ	o
_]	X	o	H-
1 u	1 u	CT	ΰ	u
o	o	o	o	o
E	E	E	E	E
Ll_	X	X	X	X

Φ

C

O

H c

ω co >

o z

II

X

Φ o

JC co

Φ >4

JO o

Q

CT) ó

E

CT)

CN

Ó • · • ·

-48 Materiály a metody

Zkratky

AM	kyselina p-[(R,S)-a[1-(9H-fluoren9-yl)-methoxyformamido] 2,4-dimethoxybenzyl)-fenoxyoctová
At	7-azabenzotriazol-1 -yl
Boc	terč. butyloxykarbonyl
BOP	benzotriazolyl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfonium- hexafluorfosfát
Bpoc Bt	bifenylpropyloxykarbonyl benzotriazol-1-yl
tBu	terč. butyl
DBU	diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en
Ddz	3,5-dimethoxyfenylizopropyloxykarbonyl
DCC	dicyklohexylkarbodiimid
DCM	dichloromethan
DIC	diizopropylkarbodiimid
DIEA	Ν,Ν-diizopropylethylamin
DMAP	4-(N,N-dimethylamino)pyridin
Dhbt-OH	3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin
DMF	N,N-dimethylformamid
Dts	dithiasukcinyl
EDT	ethandithiol
FAB	bombardování rychlými atomy
Fmoc	9-fluorenylmethyloxykarbonyl
HATU	O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
HBTU	hexafluorfosfát O-(benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát
HMPA	kyselina 4-hydroxymethylfenoxyoctová
HMPB	kyselina 4-(4-hydroxymethyl-3-methoxyfenoxy)-máselná

• · · · ··· ···· • · · · ···· · ·· · • · ··· · · · · · · ··· • · • · • · · ·

HObt	40 · · · · · · ” *+& “ ···· ·· ·· ··· 1 -hydroxybenzotriazol
HOAt	1 -hydroxy-7-azobenzotriazol
HPLC	vysokotlaká kapalinová chromatografie
MCPS	syntéza peptidů na více kolonách
MHC	hlavní histokompatibilitní komplex
MMa	kyselina 4-methoxymandlová
NMR	nukleární magnetická rezonance
NHS	imidoester kyseliny N-hydroxyjantarové
NMP	N-methylpyrrolidon
NPS	nitrofenylsulfenyl
Mtr	4-methoxy-2,3,6-trimethylfenylsulfonyl
PAM	fenylacetamidomethyl
Pbf	2,2,4,6,7-pentamehtyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
PEG-PS	polyethyleneglykol naroubovaný na polystyren
PepSyn Gel polydimethylakrylamidová pryskyřice
PepSyn K	funkcionalizovaná methylesterem sarkosinu křemelina nesoucí polydimethylakrylamidovou pryskyřici
Pfp	funkcionalizovanou methylesterem sarkosinu pentafluorfenyl
Pmc	2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl
Poc	fenylizopropyloxykarbonyl
TBTU	O-(benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-
TFA	tetrafluorborát kyselina trifluoroctové
TFE	trifluorethanol
TFMSA	kyselina trifluoromethansulfonová
Tmz	2,4,5-tetramethylbenzyloxykarboxyl

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby peptidů

X-AAj-AA₂ .....AAn-Y kde AA je zbytek L- nebo D-aminokyseliny,

X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny,

Y je OH, NH₂ nebo aminokyselinová sekvence obsahující tři až devět zbytků aminokyselin a n je celé číslo větší než 2, syntézou na pevné fázi, kde C-koncová aminokyselina ve formě Ν-α-chráněného reaktivního derivátu, v případě nutnosti s chráněným postranním řetězcem, je navázána na pevný nosič nebo polymer případně prostřednictvím linkeru, potom zbavena Ν-α-ochranné skupiny, a následující aminokyseliny vytvářející sekvenci peptídu jsou postupně navazovány nebo navazovány jako peptidové fragmenty ve formě vhodně chráněných reaktivních derivátů nebo fragmentů, kde po vytvoření požadovaného peptídu je Ν-α-ochranná skupina z požadovaného peptídu odstraněna a peptid je odštěpen z pevného nosiče, vyznačující se tím, ž e C-koncová část připojená na nosič nebo polymer obsahuje pre-sekvenci tvořenou 3 až 9, s výhodou 5 až 7 aminokyselinovými zbytky zvolenými nezávisle z nativních Laminokyselin s funkčními skupinami postranního řetězce chráněnými v průběhu reakčních kroků a s faktorem náklonnosti Pa > 0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ > 1,10 nebo odpovídajících D-aminokyselin a uvedená pre-sekvence je popřípadě z vytvořeného peptídu odštěpena.

·· ·· · · · · · · · ·· · • · ··· · ·· ··· ···

C4 ······ · ·

- Ol - «··· ·· ·· ··· ·· ··
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e aminokyseliny v pre-sekvenci jsou zvoleny z aminokyselin, které mají v postranním řetězci funkční skupinu karboxy, karboxamido, amino, hydroxy, guanidino, sulfid nebo imidazol.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e aminokyseliny tvořící část pre-sekvence jsou nezávisle zvoleny ze skupiny Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met a Gin.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e aminokyselinami jsou buď výlučně Lys nebo Glu nebo sekvence (Glu)_q(Lys)_p, kde p + q je 3 až 9, s výhodou 6 až 9, a pořadí Lys a Glu je zvoleno libovolně.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e Ν-α-amino ochrannou skupinou je Fmoc, Boc nebo jakákoliv jiná vhodná ochranná skupina.

20
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e Ν-α-amino ochrannou skupinou je skupina Fmoc nebo Boc.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím,

25 že funkční skupinou postranního řetězce v pre-sekvenci je karboxylová skupina, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou tBu.

- 52
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e funkční skupinou postranního řetězce v pre-sekvenci je aminoskupina, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou Boc.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e funkční skupinou postranního řetězce v pre-sekvenci je hydroxylová skupina, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou tBu.
10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e funkční skupinou postranního řetězce v pre-sekvenci je skupina karboxamido, která je vhodně chráněná, s výhodou skupinou a) benzhydryl, b) trityl, c) tBu.

z
11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e funkční skupinou postranního řetězce v pre-sekvenci je guanidinová skupina chráněná skupinou 4-methoxy-2,3,6trimethylfenylsulfonyl (Mtr), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-620 sullfonyl (Pmc) nebo 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran5-sulfonyl (Pbf).
12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e uvedená funkční skupina postranního řetězce v pre25 sekvenci obsahuje imidazolovou skupinu chráněnou Boc.
13. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e skupiny Fmoc se odstraňují pomocí aminu jako je piperidin nebo diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU).

- 53 • · · · • · · ·
14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e ochranné skupiny postranního řetězce se odstraňují kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), kyselina

5 trifluormethansulfonová (TFMSA), HBr, HCI nebo HF.
15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e pevný nosič je zvolen z funkcionalizovaných pryskyřic jako polystyren, polyakrylamid, polyethylenglykol, celulóza, io polyethylen, latex nebo materiál dynabeads.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, ž e C-koncová aminokyselina je připojena na pevný nosič běžným linkerem jako je 2,4-dimethoxy-4’-hydroxybenzofenon, is kyselina 4-(4-hydroxymethyl-3-methoxyfenoxy)máselná (HMPB), kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, kyselina 4hydroxymethylfenoxyoctová (HMPA), kyselina 3-(4hydroxymethylfenoxy)propionová nebo kyselina p-[(R,S)-a[1(9H-fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]20 fenoxyoctová (AM).
17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e syntéza se provádí vsádkovým způsobem.

25
18. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provádí kontinuálně na automatickém nebo poloautomatickém syntezátoru peptidů.

- 54 ·· «·
19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e kroky reakce se provádějí v přítomnosti rozpouštědla zvoleného ze skupiny acetonitril, Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), N-methylpyrrolidon (NMP), dichlormethan (DCM),

5 trifluorethanol (TFE), ethanol, methanol, voda, směsi uvedených rozpouštědel s nebo bez dalších látek jako jsou chloristan nebo ethylenkarbonát.
20. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, io že vazebné reakce mezi dvěma aminokyselinami, aminokyselinou a dříve vytvořenou sekvencí peptidů nebo fragmentem peptidů a dříve vytvořenou sekvencí peptidů se provádí běžnými kondenzačními způsoby jako je azidová metoda, metoda směsného anhydridu kyseliny, metoda

15 symetrického anhydridu, karbodiimidová metoda, metoda aktivního esteru jako je pentafluorfenyl (Pfp), 3,4-dihydro-4oxobenzotriazin-3-yl (Dhbt), benzotriazol-1-yl (HOBt), 7azabenzotriazol-1-yl (HOAt), 4-nitrofenyl, imidoestery kyseliny N-hydroxyjantarové (NHS), chloridy kyselin, fluoridy kyselin,

20 aktivace in šitu činidly jako O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HATU), O-(benzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HBTU), 0(benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborát (TBTU) nebo benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)-fosfonium25 hexafluorfosfát (BOP).
21. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e peptid se z nosiče odštěpuje kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA),

3o bromovodík (HBR), chlorovodík (HCl), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid.

4 4 4 4

4 4 4 4

4 · 4 4 · 4

4 ·

4 4 4 4

- 55
22. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e peptid se z nosiče odštěpuje fotolýzou.

5
23. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se mezi pre-sekvenci připojenou na nosič a sekvenci AAiAA_n vkládá linker, který umožňuje selektivní odštěpení uvedené sekvence.

ío
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e linker je opticky aktivní.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, ž e linkerem je α-hydroxy nebo ct-aminokyselina obecného

15 vzorce

R¹

I

X —C —COOH

20 | r₂ kde X je OH nebo NH₂ a R¹ a R² jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, Ci.₃alkyl, fenyl a substituovaný fenyl, kde

25 substituenty jsou jeden nebo více substituentů schopných darovat elektron, zvolené ze skupiny Ci-3alkoxy, O-alkyl nebo jsou spojeny dvě vicinální skupiny substituentů za vytvoření 5nebo 6-členného kruhu spolu s atomy uhlíku, ke kterému jsou připojeny.

- 56 ·· ·· ·· ···· ·· ·· ···· · · · ···· • · · · ···· · ·· · • · · · · · ·· ··· ··· ····· · · · ···· ·· ·· ··· ·· ··
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, ž e linkerem je kyselina (+)-4-methoxymandlová, difenylglycin nebo kyselina glykolová.

5
27. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e sekvence AAi-AA_n se odštěpuje z pre-sekvence kyselinou jako je kyselina trifluoroctová (TFA), trifluormethansulfonová (TFMSA), bromovodík (HBR), chlorovodík (HCI), fluorovodík (HF) nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo io hydroxid.
28. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e pre-sekvence se z vytvořeného peptidu odštěpuje enzymaticky.

Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, ž e enzym je zvolen z vhodných karboxy- a endopeptidáz.
30. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím,

20 ž e se mezi pre-sekvenci připojenou na nosič a sekvenci AA-iAA_n vloží první linker a mezi pre-sekvenci a pevný nosič druhý linker s orthogonálními podmínkami štěpení vzhledem k prvnímu linkeru, čímž je umožněno selektivní odštěpení druhého linkeru, například kyselinou trifluoroctovou (TFA),

25 trifluormethansulfonovou (TFMSA), HBr, HCI, HF nebo bází jako je amoniak, hydrazin, alkoxid nebo hydroxid za získání požadovaného peptidu AA-i-AA_n připojeného na pre-sekvenci uvedeným prvním linkerem.

• · • ·

- 57
31. Činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi obecného vzorce

X-AA’i-.....-AA’_m-Yi-R kde R je pevný nosič použitelný při syntéze peptidů na pevné 5 fázi, Yi je aminokyselinová sekvence obsahující od 3 do 9, s výhodou od 5 do 7 zbytků aminokyselin nezávisle zvolených z nativních L-aminokyselin s funkčními skupinami postranních řetězců chráněnými při krocích reakce a s faktory náklonnosti

Pa > 0,57 a faktorem náklonnosti Ρβ < 1,10, nebo io odpovídajících D-aminokyselin, AA’ je zbytek L- nebo Daminokyseliny, m je 0 nebo celé číslo od 1 do 40 a X je atom vodíku nebo ochranná skupina aminoskupiny.
32. Činidlo podle nároku 31, vyznačující se tím,

15 že aminokyseliny tvořící část sekvence Yi jsou nezávisle zvoleny ze skupiny Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met a Gin.
33. Činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi obecného

20 vzorce

X-AA’i-.....-AAm-LrYi-R kde X, AA’, m, Yi a R jsou jak definováno v nároku 31 a Li je linker, který umožňuje selektivní odštěpení vazby na AA’_m.

25
34. Činidlo podle nároku 33, vyznačující se tím, ž e linker Li je opticky aktivní.

·· ··· ·

9 9·· 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 999 ··· _ sk - ······ · · ** W ······ · · · 9 · 99 9 9
35. Činidlo podle nároku 33, vyznačující se tím, ž e linker Li je α-hydroxy nebo a-aminokyselina obecného vzorce

5 R¹

I

X_C —COOH I

R₂ io kde X je OH nebo NH₂ a R¹ a R² jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, Ci_₃alkyl, fenyl a substituovaný fenyl, kde substituenty jsou jeden nebo více substituentů schopných darovat elektron, zvolené ze skupiny Ci-3alkoxy, Ci^alkyl nebo

15 jsou spojeny dvě vicinální skupiny substituentů za vytvoření 5nebo 6-členného kruhu spolu s atomy uhlíku, ke kterému jsou připojeny.
36. Činidlo podle nároku 35, vyznačující se tím,

20 že linkerem je kyselina 4-methoxymandlová, kyselina (+)-4methoxymandlová, difenylglycin nebo kyselina glykolová.
37. Činidlo pro použití při syntéze na pevné fázi obecného vzorce

X-AA’i-.....-AAVLi-YrLa-R

25 kde X, AA’, m, Yi, RaLi jsou jak definováno v nároku 33 a L₂ je linker s orthogonálními podmínkami štěpení vzhledem k prvnímu linkeru, umožňující selektivní odštěpení z pevného nosiče.

30
38. Činidlo pro použití při syntéze peptidů na pevné fázi obecného vzorce • · ·· ··· · • ··· · · · · • · · · · · · ·· · ··· · ·· · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ··

Χ-ΑΑ’ι-.....-AAm-Yi-l^-R kde X, AA’, m, Yi, RaL₂ je jak definováno v nároku 37.
39. Činidlo podle nároku 38, vyznačující se tím, že L₂ je zvolen ze skupiny 2,4-dimethoxy-4’hydroxybenzofenon, kyselina 4-(4-hydroxy-methyl-3methoxyfenoxy)-máselná (HMPB), kyselina 4-hydroxymethylbenzoová, kyselina 4-hydroxymethylfenoxyoctová (HMPA), kyselina 3-(4-hydroxymethylfenoxy)propionová nebo kyselina p-[(R,S)-a[1-(9H-fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4dimethoxybenzylj-fenoxyoctová (AM).