KR100936536B1

KR100936536B1 - 목표 부위 이외의 아민이 보호된 펩타이드, 그 제조방법및 이를 이용한 ｐｅｇ가 선택적으로 접합된 펩타이드의제조방법

Info

Publication number: KR100936536B1
Application number: KR1020030003518A
Authority: KR
Inventors: 이상득; 이강춘; 나동희; 윤유석
Original assignee: 주식회사 바이오인프라
Priority date: 2003-01-18
Filing date: 2003-01-18
Publication date: 2010-01-13
Also published as: KR20040066454A

Abstract

본 발명은 목표 부위 이외의 아민(들)이 선택적으로 보호된 합성 펩타이드 및 그 제조 방법과 이를 이용하여 합성 펩타이드의 목표 부위에 PEG를 선택적으로 접합하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 목표 부위의 아민에 선택적으로 결합된 PEG 접합 펩타이드를 월등히 고수율로 제조할 수 있다.

PEG 접합 펩타이드, 목표 부위, 탈보호, 칼시토닌, GRF, Fmoc, Nsc, Boc, Mtt

Description

목표 부위 이외의 아민이 보호된 펩타이드, 그 제조방법 및 이를 이용한 ＰＥＧ가 선택적으로 접합된 펩타이드의 제조방법{Peptides having protected amines of untargeted sites, methods for production thereof and of specifically conjugated PEG peptides using the same}

도 1은 실시예 20의 Lys¹⁸-PEG 2K-연어 칼시토닌(B)과 비교예 1의 모노-PEG 2K-연어 칼시토닌(A)의 역상크로마토그람을 나타낸다.

도 2는 실시예 20의 Lys¹⁸-PEG 2K-연어 칼시토닌의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다.

도 3은 연어 칼시토닌(A)과 실시예 20의 Lys¹⁸-PEG 2K-연어 칼시토닌(B)의 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI -TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다.

도 4는 GRF(1-29)(A)와 실시예 23의 Lys²¹-PEG 5K-GRF(1-29)(B)의 역상크로마토그람을 나타낸다.

도 5는 실시예 23의 Lys²¹-PEG 5K-GRF(1-29)의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다.

도 6은 GRF(1-29)(A)와 실시예 23의 Lys²¹-PEG 5K-GRF(1-29)(B)의 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI -TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 두개 이상의 측쇄 아민을 갖는 합성 펩타이드에 한 개 이상의 PEG(폴리에틸렌 글리콜, polyethylene glycol)를 목표 부위의 아민에 선택적으로 접합하는 기술에 관한 것으로, 목표 부위 이외의 아민(들)이 선택적으로 보호된 합성 펩타이드 및 그 제조 방법과 이를 이용하여 합성 펩타이드의 목표 부위에 PEG를 선택적으로 접합하고 이온교환크로마트그라프법으로 정제하는 방법에 관한 것이다.

펩타이드 및 단백질에 PEG를 접합하는 기술은 Davis와 Abuchowski의 연구(Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3571-3581, 1977; Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3582-3586, 1977)에 기초한다. PEG는 친수성이고 생체적합성이며 무독성인 고분자로서 H(OCH₂CH₂)_nOH의 구조를 가지며 펩타이드 및 단백질에 접합될 경우 당단백질의 당쇄처럼 효소대사를 입체적으로 방해하여 억제하고 분자 크기를 증가시켜 신사구체 여과를 감소시킴으로써 생리활성의 지속시간을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 폴리펩타이드와 PEG의 공유결합에 관해서는 미국특허 제 4179337호에 공개되어 있으며, 여기에서는 단백질과 효소를 PEG로 수식할 경우 수식하지 않은 경우에 비해 면역원성과 항원성이 감소하고 혈중 반감기가 연 장된다고 보고하였다.

폴리펩타이드에 PEG를 공유결합시키기 위해서는 먼저 PEG의 말단 수산기를 활성기(reactive functional group)로 변환시키는 "활성화(activation)" 과정을 필요로 한다. "활성화 PEG(activated PEG)"로는 PEG 알데히드, PEG 에폭시드, PEG 트레실레이트(tresylate)와 같은 알킬화 시약(alkylating reagent)과 PEG 에스테르와 같은 아실화 시약(acylating agent) 등이 있으며 그 대표적인 예로는 PEG 숙신이미딜 숙시네이트가 있다. Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7:175-186(1984), 미국특허 제 512614 등에서 폴리(에틸렌 글리콜)-N-숙신이미드 카보네이트 및 그 제조방법을 참조할 수 있다. PEG는 필요에 따라 분자량 2,000~40,000의 PEG가 다양하게 사용될 수 있으며 메톡시화 PEG 및 측쇄화 PEG(branched PEG) 등이 사용될 수 있다. 측쇄화 PEG는 R(-PEG-OH)_m의 구조로 나타낼 수 있으며 여기에서 R은 펜타에리트리톨이나 글리세롤과 같은 중심 부위(central core moiety)를, m은 3~100 의 측쇄(branching arm)의 수를 나타낸다. 하이드록실기는 화학적 수식에 이용될 수 있다. 다른 측쇄화 PEG으로 (CH₃O-PEG-)_pR-X의 구조가 사용되고 있으며(WO96/21469), 여기에서 p는 2~3, R은 라이신, 글리세롤과 같은 중심 부위, X는 카복실과 같이 활성화에 사용되는 관능기를 나타낸다. 또 다른 측쇄화 PEG로 사용되는 펜던트 PEG(pendant PEG)은 PEG 쇄의 말단이 아닌 골격에 카복실과 같은 활성기를 갖는다. 이들 측쇄화 PEG은 모두 전술한 바와 같이 "활성화"시켜 사용될 수 있다.

펩타이드의 아민에 "활성화" PEG를 접합시키는 반응에 있어서, 일반적으로 PEG는 하나 이상의 아민에 비선택적 화학결합을 하게 되므로 이 기술의 핵심은 특정 위치의 아민에 PEG 분자를 선택적으로 결합시키는 방법에 있다. 그러나 아미노산 서열 중에 라이신이 1개 이상 포함된 펩타이드의 경우에는 두개 이상의 아민이 존재하기 때문에 특정 위치의 아민에 선택적으로 PEG를 접합하는 것은 매우 어렵다. 일반적인 방법으로 펩타이드에 PEG를 접합할 경우에는 펩타이드에 PEG가 하나 결합된 접합체부터 PEG가 아민의 수 만큼 결합된 접합체까지 다양한 접합체가 생성될 수 있으며 PEG가 하나 결합된 접합체(모노-PEG conjugate)의 경우에도 PEG의 접합 부위가 서로 다른 위치 이성체들(positional isomers)이 생성된다. 통상 펩타이드의 PEG 접합체는 결합된 PEG의 수와 결합부위에 따라 활성과 효소대사 등이 다르게 나타나기 때문에, 이러한 혼합물이 생성되는 제조방법은 활성 수율이 매우 낮으며 혼합물이라는 단점을 갖는다. 혼합물 중에서 특정 이성체를 분리 정제하는 경우에는 공정이 매우 까다롭고 수율이 낮으며 높은 비용이 수반된다. 이러한 단점을 보완하기 위해 다양한 방법의 부위-선택적 PEG 접합(site-specific PEGylation)이 시도되고 있으나 임의의 특정 위치 아민에 선택적으로 PEG를 접합시킬 수 있는 효율적인 방법은 개발되어 있지 않다.

Chem. Pharm. Bull. 39(12):3373-3375(1991)에는 피브로넥틴-관련 트리펩티드[fibronectin-related tripeptide(Arg-Gly-Asp)]와 아미노-폴리(에틸렌 글리콜) 결합체 및 그 약효에 대해 보고되어 있다. 여기에서는 펩타이드의 아스파트산을 디시클로헥실카보디이미드(DCC)/1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)로 활성화하여 아미 노 PEG와 결합시킴으로써 PEG 접합체를 제조하는 방법을 제시하였다. 그러나 이러한 방법은 C-말단의 수식에만 제한적으로 사용할 수 있으며 펩타이드의 C-말단 활성화 과정에서 인접 아미노산의 라세미화를 일으킬 수 있다는 단점이 있다. 이러한 라세미화는 글라이신을 제외한 다른 모든 아미노산에서 일어날 수 있으며 결과적으로 펩타이드의 활성 저하를 초래할 수 있다.

Journal of Protein Chemistry 10(6):623-627(1991)에는 합성 레진을 이용하여 펩타이드에 모노메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)(mPEG) 또는 폴리비닐알콜(PVA)를 결합시키는 방법이 보고되어 있으나, 이 방법으로는 펩타이드의 N-말단에 하나의 고분자가 결합된 접합체 만을 합성할 수 있기 때문에 PEG 접합 효과를 극대화(펩타이드의 활성을 최대한 유지하고 효소대사를 최소로 억제)할 수 있는 위치에 PEG를 결합시키는 방법을 제공하지 못한다.

PCT 특허출원 제PCT/US94/06953호(1994)에서는 펩타이드 합성과정 중에 PEG를 도입하는 부위-선택적 PEG 접합 펩타이드의 제조방법을 제공한다. 즉, 미리 정한 목표 부위의 라이신까지의 펩타이드를 합성하고 PEG를 결합시킨 후 나머지 부분의 펩타이드를 계속 합성하여 PEG 접합 펩타이드를 완성하는 방법과 펩타이드의 합성 과정에서 미리 정한 목표 부위의 라이신 위치에 N^α-아민이 Fmoc(9-플루오렌일메톡시카보닐)으로 보호되고 측쇄 아민에 PEG가 결합된 라이신을 사용하여 PEG 접합 펩타이드를 제조하는 방법, 그리고 미리 정한 목표 부위의 아민에 PEG가 결합된 펩타이드 분절과 나머지 분절을 합성하여 결합시키는 방법 들을 제공한다. 그러나 이 러한 방법은 미리 결합된 PEG가 다음 단계의 합성반응에 영향을 줌으로써 바람직하지 않은 결과를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 펩타이드의 합성 중간에 PEG를 도입하고 나머지 부분의 합성을 계속할 경우에 아미노산의 서열 중 한 개 이상의 아미노산이 결손된 펩타이드가 생성될 수 있으며, 이러한 불순물은 생체에 대한 영향을 알 수 없을 뿐 아니라 정제가 거의 불가능하다. 그러므로 이러한 방법은 의약품으로 사용 가능한 PEG 접합 펩타이드를 제조하는 방법으로 바람직하지 않다.

PCT 특허출원 제PCT/EP98/07748호는 유기용매 중에서 GRF의 아민에 PEG를 결합시키고 생성된 Lys(PEG)¹²-GRF와 Lys(PEG)²¹-GRF, Lys(PEG)^{12, 21}-GRF 및 [N^α-PEG-Try¹, Lys(PEG)^{12, 21}]-GRF의 혼합물을 겔크로마토그라프법과 역상크로마토그라프법으로 정제하는 방법을 제공하나, 이 방법은 N^α, Lys¹² 및 Lys²¹의 아민기 간의 선택성을 주지 못한다. 이 특허는 또한 [Lys(Alloc)^{12, 21}]-GRF(1-29) 및 [N^α-이소프로필-Try¹, Lys(Alloc)¹²]-GRF(1-29)의 합성 및 이를 이용한 선택적 PEG 접합방법을 제공하고 있으나, [Lys(Alloc)^{12, 21}]-GRF(1-29)은 N^α아민의 PEG 접합 만이 가능하며 같은 특허에서 효력이 가장 좋다고 나타낸 Lys²¹-PEG 접합체의 제조방법을 제공하지 못한다. 또한, [N^α-이소프로필-Try¹, Lys(Alloc)¹²]-GRF(1-29)를 사용하여 PEG 접합체를 제조할 경우에는 GRF(1-29)-NH₂의 PEG 접합체가 아닌 [N^α- 이소프로필-Try¹]-GRF(1-29)-NH₂의 PEG 접합체 즉, [N^α-이소프로필-Try¹, Lys(PEG)²¹]-GRF(1-29)가 생성되게 된다. 그러므로 이 방법은 N-말단에 아민기를 갖는 원래의 펩타이드, GRF(1-29)-NH₂에 대한 완전한 선택적 PEG 접합방법을 제공하지 못한다.

이에 본 발명자들은 목표 부위 이외의 아민에 PEG가 접합된 불순물의 생성을 방지하고 목표 부위의 아민에만 PEG가 접합된 목적물 만을 생성시킴으로써 목적물의 수율을 획기적으로 높이고 목적물의 분리 정제에 드는 노력과 비용을 감소시킬 수 있는 선택적 PEG 접합법을 개발하고자 하였다.

본 발명은 완전한 선택성을 가지고 목표 부위의 아민에만 PEG가 접합됨으로써 PEG 접합효과가 극대화된 선택적 PEG 접합 펩타이드를 제조하는 수단을 제공한다.

본 발명은 목표 부위 이외의 아민(들)이 선택적으로 보호된 합성 펩타이드 및 그 제조 방법과 이를 이용하여 합성 펩타이드의 목표 부위에 PEG를 선택적으로 접합하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 (A) 목표 부위의 아민(들)과 목표 부위 이외의 아민(들)을 서로 다른 조건에서 탈보호되는 보호기{예를 들면, ivDde[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸] 또는 Mtt(4-메틸트리 틸)와 Boc(3급-부톡시카보닐)}로 구분하여 각각 보호하고 N^α-아민을 Fmoc 또는 Nsc로 보호하여 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는, 목표 부위 이외의 아민(들)이 선택적으로 보호된 펩타이드의 제조방법, (B) 상기 방법에 의해 제조된 목표 부위 이외의 아민(들)이 선택적으로 보호된 펩타이드 및 (C) (1) 상기 펩타이드와 활성화 PEG를 반응시키는 단계와 (2) 단계(1)에서 얻어진 화합물의 아민 보호기를 산-염기 탈보호 조건에서 탈보호하는 단계를 포함하는, 목표 부위의 아민(들)에 PEG가 선택적으로 접합된 선택적 PEG 접합 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 합성된 펩타이드의 N^α-아민을 포함하여 목표 부위 이외의 아민(들)의 보호기를 최종 아민 보호기로 치환하는 단계를 추가로 포함하는, 목표 부위 이외의 아민(들)이 선택적으로 보호된 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

상기 최종 아민 보호기로서는 Fmoc, Nsc, Dde, ivDde 및 기타 염기성에서 탈보호되는 보호기로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있으며, 또는 Boc 및 기타 산성에서 탈보호되는 보호기로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수도 있다.

펩타이드를 합성하는 일반적인 방법의 하나는 레진에 N^α-아민이 보호된 C-말단 아미노산의 카복실기를 결합시키고 염기성 조건에서 아민을 탈보호한 후 다음 서열의 N^α-아민이 보호된 아미노산을 결합시키는 반응을 반복하여 N-말단 아미노산 까지 합성하는 것이다. 아미노산 서열 중에 측쇄 아민이 있는 라이신이 포함된 경우, 라이신의 측쇄 아민은 산성 조건에서 탈보호되는 Boc으로, N^α-아민은 염기성 조건에서 탈보호되는 Fmoc 또는 Nsc[4-니트로페닐설포닐에톡시카보닐] 등으로 보호된 라이신을 사용함으로써 다음 순서의 아미노산을 결합시키기 위한 N^α-아민의 탈보호 조건에서 측쇄 아민이 탈보호되지 않도록 하는 방법이 사용된다. 그러나 측쇄 아민이 둘 이상인 펩타이드의 경우에는 측쇄 아민들 사이의 구분이 어렵기 때문에 완전히 선택적으로 보호된 펩타이드를 합성하는 것이 어려웠다. 본 발명자 등은 둘 이상의 측쇄 아민을 갖는 펩타이드의 합성에서 N^α-아민의 보호기로 Fmoc 또는 Nsc를 사용하고 측쇄 아민의 보호기로 서로 구분된 조건에서 탈보호되는 두 종류의 아민 보호기 즉, Boc과 ivDde 또는 Mtt를 사용하여 산-염기 탈보호 조작 만으로 측쇄 아민이 구분되는 선택적으로 보호된 펩타이드를 합성하였으며 이를 이용한 완전한 선택적 PEG 접합 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. 여기에서 목표 부위 이외의 측쇄 아민과 N-말단 아민을 구분하여 서로 다른 보호기를 사용해야 하는 이유는 펩타이드 합성시 N-말단 아민 만을 선택적으로 반응시켜야 하기 때문이다. 목표 부위 이외의 아민(들)은 PEG 접합반응 조건에서의 안정성 등의 필요에 따라 펩타이드 합성의 최종단계에서 다른 보호기로 치환될 수 있다. 이러한 방법은 산-염기 조건을 변화시키는 것 만으로 선택적으로 보호된 펩타이드를 합성하는 것이 가능하기 때문에 환원반응이나 알릴치환반응 등을 사용하는 방법에 비해 반응이 간단하고 경제적이며 고순도의 펩타이드를 얻을 수 있는 장점이 있다.

예를 들어, 본 발명의 구체적인 실시태양으로서는 다음과 같은 방법들이 있을 수 있다.

목표 부위의 측쇄 아민을 Boc으로, 목표 부위 이외의 측쇄 아민(들)을 ivDde로 보호하는 방법에서는, 목표 부위의 라이신을 도입하는 단계에서는 N^α-아민이 Fmoc 또는 Nsc로 보호되고 측쇄 아민이 Boc으로 보호된 라이신을 사용하고, 다른 위치의 라이신을 도입하는 단계에서는 N^α-아민이 Fmoc 또는 Nsc로 보호되고 측쇄 아민이 ivDde로 보호된 라이신을 사용하여 펩타이드를 합성한다. 합성 과정 중 ivDde는 Fmoc 또는 Nsc의 탈보호 조건, 예를 들어 1% DBU(1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데스-7-엔)-20% 피페리딘/DMF(N,N-디메틸포름아미드) 조건에서, 탈보호되지 않는다. 합성된 펩타이드-레진(목표 부위의 측쇄 아민은 Boc으로, 목표 부위 이외의 측쇄 아민은 ivDde로, N-말단 아민은 Fmoc 또는 Nsc로 보호된)의 목표 부위 이외의 측쇄 아민의 ivDde와 N-말단 아민의 Fmoc을 탈보호한 후 탈보호된 아민을 Fmoc 또는 Nsc{예를 들면, Fmoc-OSu(9-플루오렌일메톡시카보닐-숙신아미드) 또는 Nsc-OSu로 반응시킴으로써}로 보호한다. 이때 상기 탈보호반응은 예를 들어 2 % 히드라진 용액으로 처리하여 이루어질 수 있다. 이 펩타이드-레진을 절단(cleavage) 용액(예를 들어, TIS(트리이소프로필실란):물:TFA(트리플루오로아세트산)= 2.5:2.5:95)으로 처리하여 레진과 펩타이드를 분리하고 동시에 목표 부위의 아민의 Boc을 탈보호시킴으로써, 목표 부위 이외의 아민(들)이 Fmoc 또는 Nsc로 보호된 펩타이드를 얻을 수 있다.

목표 부위의 측쇄 아민을 Boc으로, 목표 부위 이외의 측쇄 아민(들)을 Mtt로 보호하는 방법에서는, 목표부위 측쇄 아민의 라이신을 도입하는 단계에서는 N^α-아민이 Fmoc 또는 Nsc로 보호되고 측쇄 아민이 Boc으로 보호된 라이신을 사용하고, 다른 위치의 라이신을 도입하는 단계에서는 N^α-아민이 Fmoc 또는 Nsc로 보호되고 측쇄 아민이 Mtt로 보호된 라이신을 사용하여 펩타이드를 합성한다. 합성 과정 중 Mtt는 Fmoc 또는 Nsc의 탈보호에 사용하는 염기성 조건에서 탈보호되지 않는다. 합성된 펩타이드-레진(목표 부위의 측쇄 아민은 Boc으로, 목표 부위 이외의 측쇄 아민은 Mtt로, N-말단 아민은 Fmoc 또는 Nsc로 보호된)의 목표 부위 이외의 측쇄 아민의 Mtt를 탈보호한다. 상기 탈보호반응은 예를 들어 1% TFA/MC(메틸렌 클로라이드)로 처리하여 이루어질 수 있다. 이때 목표 부위의 아민의 보호기 Boc은 탈보호되지 않는다. 이 펩타이드-레진(목표 부위의 측쇄 아민은 Boc으로, N-말단 아민은 Fmoc 또는 Nsc로 보호되고 목표 부위 이외의 측쇄 아민은 유리된)에 Fmoc-OSu 또는 Nsc-OSu를 반응시켜 목표 부위 이외의 측쇄 아민(들)을 Fmoc 또는 Nsc로 보호한 후, 절단 용액(예를 들어, TIS:물:TFA=2.5:2.5:95)으로 목표 부위의 아민의 보호기 Boc을 탈보호함으로써 선택적으로 보호된(목표 부위의 아민은 유리되고 목표 부위 이외의 아민(들)은 Fmoc 또는 Nsc로 보호된) 펩타이드를 얻을 수 있다.

목표 부위 이외의 아민(들)이 Boc으로 보호된 펩타이드는 목표 부위의 아민을 ivDde로, 목표 부위 이외의 아민(들)을 Boc으로 보호하는 방법으로 제조할 수 있다. 목표 부위의 라이신을 도입하는 단계에서는 N^α-아민이 Fmoc 또는 Nsc로 보호 되고 측쇄 아민이 ivDde로 보호된 라이신을 사용하고, 다른 위치의 라이신을 도입하는 단계에서는 N^α-아민이 Fmoc 또는 Nsc로 보호되고 측쇄 아민이 Boc으로 보호된 라이신을 사용하여 펩타이드를 합성한다. 합성 과정 중 ivDde는 Fmoc 또는 Nsc의 탈보호 조건, 예를 들어 1% DBU-20% 피페리딘/DMF 조건에서, 탈보호되지 않는다. 합성된 펩타이드-레진(목표 부위의 측쇄 아민은 ivDde로, 목표 부위 이외의 측쇄 아민은 Boc으로, N-말단 아민은 Fmoc 또는 Nsc로 보호된)의 N-말단 아민의 보호기 Fmoc을 탈보호하고(예를 들어, DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘으로 처리하여) 다시 절단 용액(예를 들어, TIS:물:TFA=2.5:2.5:95)으로 처리하여 레진과 펩타이드를 분리한다. 이 때 목표부위 이외의 측쇄 아민 보호기 Boc은 탈보호된다. 이 펩타이드(목표 부위의 측쇄 아민은 ivDde로 보호되고 목표 부위 이외의 측쇄 아민과 N-말단 아민은 유리된)의 유리된 아민을 Boc으로 보호하고, 목표 부위의 아민의 ivDde를 탈보호함으로써 목표 부위 이외의 아민(들)이 Boc으로 보호된 펩타이드를 얻을 수 있다. 이때 상기 보호반응은 예를 들어, Boc₂O(디-3급-부틸 디카보네이트)를 반응시켜 이루어질 수 있고, 상기 탈보호반응은 예를 들어, 2 % 히드라진 용액으로 처리하여 이루어질 수 있다.

목표 부위 이외의 아민(들)이 Boc으로 보호된 펩타이드는 목표 부위의 아민을 Mtt로, 목표 부위 이외의 아민(들)을 Boc으로 보호하는 방법으로도 제조할 수 있다. 이 방법에서는 2-CLTR(2-클로로트리틸 레진)과 같이 산에 극도로 민감한 레진을 사용하여야 하며, 수분 등에 의해 합성 수율과 순도가 저하될 수 있으므로 주 의하여야 한다. 이 방법에서는, 목표 부위의 라이신을 도입하는 단계에서는 N^α-아민이 Fmoc 또는 Nsc로 보호되고 측쇄 아민이 Mtt로 보호된 라이신을 사용하고, 다른 위치의 라이신을 도입하는 단계에서는 N^α-아민이 Fmoc 또는 Nsc로 보호되고 측쇄 아민이 Boc으로 보호된 라이신을 사용하여 펩타이드를 합성한다. 합성 과정 중 Mtt는 Fmoc 또는 Nsc의 탈보호에 사용하는 염기성 조건에서 탈보호되지 않는다. 합성된 펩타이드-레진(목표 부위의 측쇄 아민은 Mtt로, 목표 부위 이외의 측쇄 아민은 Boc으로, N-말단 아민은 Fmoc 또는 Nsc로 보호된)을 N-말단 아민의 보호기 Fmoc 또는 Nsc를 탈보호하고 유리된 N-말단의 N^α-아민을 Boc으로 보호한다. 상기 탈보호반응은 예를 들어, DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘으로 처리하여 이루어질 수 있고, 상기 보호반응은 예를 들어, Boc₂O와 반응시켜 이루어질 수 있다. 합성된 펩타이드-레진(목표 부위의 아민이 Mtt로, 목표 부위 이외의 아민(들)이 Boc으로 보호되고 C-말단이 레진에 결합된)을 TFA/MC로 처리하여 레진과 펩타이드를 분리하고 목표 부위의 아민의 보호기 Mtt를 탈보호함으로써 목표 부위 이외의 아민(들)이 Boc으로 보호된 펩타이드를 얻을 수 있다. 여기에서 얻어지는 보호된 펩타이드는 목표 부위 이외의 아민들이 Boc으로 보호되어 있고 아민 이외의 활성기, 즉 하이드록실기나 카복실기의 보호기가 탈보호되지 않은 상태이며 이들 보호기는 PEG 접합 이후에 절단 용액(예를 들면, TIS:물:TFA=2.5:2.5:95)으로 Boc을 탈보호하는 과정에서 동시에 탈보호된다.

상기한 방법 이외에도 다양한 방법이 본 발명으로부터 도출될 수 있으며, 이들 또한 본 발명에 포함된다.

또한 본 발명의 방법에 따라 합성된 펩타이드는 그대로 PEG 접합에 사용할 수도 있으며 필요에 따라 최종 아민 보호기로, N^α-아민을 포함한 목표 부위 이외의 아민을 보호하는 단계를 추가로 거친 후 PEG 접합에 사용할 수도 있다. 이 때 최종 아민 보호기는 Fmoc, Nsc, Dde[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸], ivDde 또는 기타 염기성에서 탈보호되는 보호기 중에서 선택된 1종 이상의 보호기일 수 있고, Boc 또는 기타 산성에서 탈보호되는 보호기 중에서 선택된 1종 이상의 보호기일 수도 있다.

본 발명은 또한 펩타이드 합성의 효율성을 높이기 위해 펩타이드를 두개 이상의 분절로 나누어 합성하고, 이를 축합시켜 목표 부위 이외의 아민(들)이 보호된 펩타이드를 합성하는 방법을 포함한다. 이 경우에도 아민(들)의 보호-탈보호 방법은 동일하며 다만, 분절의 축합반응에서는 라세미화가 일어날 수 있으므로 이 방법은 아미노산 서열 중에 축합반응시 라세미화를 일으키지 않는 Gly이나 Pro을 포함하는 펩타이드에 대해서 효과적으로 사용할 수 있으며, 합성이나 정제가 어려운 펩타이드의 경우에 더욱 유용하게 사용할 수 있다. 이 방법에서는 예를 들어, N-말단부터 Gly 또는 Pro까지의 분절과 다음 순서의 아미노산에서부터 C-말단까지의 분절을 나누어 합성하고 두 분절을 축합하여 펩타이드를 합성한다. N-말단 쪽 분절의 합성에 사용하는 레진은 산에 극도로 민감한 TRT 계열의 레진을 사용하며, 분절의 합성을 완료한 후 산성 조건에서 다른 보호기를 유지한 상태로 레진에서 분리한다. C-말단 쪽 분절은 일반적인 레진을 사용하여 합성한 후 레진에 결합된 상태에서 N-말단 분절과 축합한 후 레진에서 분리할 수 있으며, 산에 민감한 레진을 사용하여 C-말단 쪽 분절을 합성하고 보호기를 유지한 상태로 레진에서 분리한 후 용액 상에서 N-말단 쪽 분절과 축합할 수도 있다. 산에 민감한 레진과 측쇄 아민 보호기로 Mtt를 사용하여 분절을 합성한 후 레진에서 분리할 경우에는 Mtt가 탈보호되지 않도록 AcOH:TFE(2,2,2-트리플루오로에탄올):MC (1:1:8) 또는 TFE:MC (2:8) 조건에서 레진에서 분리시킨다. N-말단 쪽 분절의 목표 부위 이외의 측쇄 아민을 ivDde로 보호한 경우에는 축합반응을 완료한 후 전체서열의 펩타이드를 레진에서 분리하기 전에 보호기를 Fmoc 또는 Nsc로 치환할 수 있다. 또한 N-말단 쪽 분절에 목표 부위 아민이 있는 경우에는 Boc이 탈보호되지 않는 조건으로 레진에서 분리하여야 한다. C-말단 쪽 분절은 연속합성법과 동일한 방법으로 합성한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 펩타이드의 합성방법으로서는 본 발명이 적용가능한 것이라면 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 고체상 펩타이드 합성방법이 사용된다.

본 발명이 적용될 수 있는 펩타이드로서는 둘 이상의 측쇄 아민을 가진 펩타이드라면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명은 특정 부분에 PEG를 결합시킴으로써 생물학적 반감기를 연장시키거나 면역원성이나 항원성을 감소시킬 필요가 있는 펩타이드에 유용할 것이다. 예로서는 칼시토닌 또는 GRF(1-29)를 들 수 있다.

목표 부위 이외의 아민(들)이 보호된 펩타이드는 펩타이드의 완전한 선택적 PEG 접합을 가능하게 한다. 목표 부위 이외의 아민(들)이 Fmoc, Nsc, Boc 또는 PEG 접합반응 조건에서 안정한 다른 아민 보호기로 보호된 펩타이드와 활성화된 PEG를 반응시키면 PEG는 펩타이드의 목표 부위의 아민에만 선택적으로 결합되며 당량비와 반응 조건에 따라 반응은 거의 완전하게 진행된다. 이 보호된 펩타이드-PEG 접합체(목표 부위의 아민에 PEG가 결합되고 목표 부위 이외의 아민이 보호기로 보호된)를 탈보호{예를 들어, 보호기가 Fmoc 또는 Nsc인 경우 5% 피페리딘/DMF 조건에서, 보호기가 Boc인 경우 절단 용액(TIS:물:TFA=2.5:2.5:95) 조건에서}하면 목표 부위의 아민에 선택적으로 PEG가 접합된 펩타이드를 얻을 수 있다.

따라서 본 발명의 또 다른 태양은 (1) 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드와 활성화 PEG를 반응시키는 단계 및 (2) 상기 얻어진 화합물의 아민 보호기를 산-염기 탈보호 조건에서 탈보호하는 단계를 포함하는, 목표 부위의 아민에 PEG가 선택적으로 접합된 선택적 PEG 접합 펩타이드의 제조방법이다.

상기 반응물 중에서 다른 펩타이드 유래물질은 확인되지 않으며 이온교환 크로마토그라프법으로 펩타이드에 결합하지 않은 PEG와 유리된 보호기 등을 제거하고 역상 레진[예를 들면, C-18 Sep-Pak 카트리지(catridge)]를 이용하여 염을 제거한 후, 동결건조함으로써 고순도의 선택적 펩타이드-PEG 접합체를 얻을 수 있다.

본 발명에 따라 제조되는 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드와 접합될 수 있는 활성화 PEG는 특별히 한정되지 않고 앞서 언급된 모든 PEG가 포함되지만, 바람직하게는 1,000 내지 40,000의 직쇄 또는 분지형의 하이드록시 또는 메톡시 형태의 알킬화(alkylating) 또는 아실화(acylating) PEG이고, 특히 바 람직하게는 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 숙신이미딜 숙시네이트, 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 숙신이미딜 프로피오네이트, 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 숙신이미딜 카보네이트, 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 숙신이미딜 카바메이트 및 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 트레실레이트로 이루어진 군 중 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.

본 발명의 선택적 펩타이드-PEG 접합체는 치료학적으로 유용한 양을 함유하는 약제학적 복용형으로 제형화할 수 있다. 우선적으로 고려되는 제형은 주사제, 점적주사제, 주사용 데포제, 흡입제 등이며 완충제, 등장화제, 안정화제, 계면활성제, 점증제, 보존제, 착색제, 방향제 등을 첨가할 수 있다.

이하, 실시예에서 본 발명의 구체적인 방법을 예시한다. 그러나 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에서 사용하는 약어는 다음의 의미를 갖는다.

Ac=아세틸, Ac₂O=아세트산 무수물, AcCN=아세토니트릴, AcOH=아세트산, Bop= 벤조트리아졸-1-일옥시 트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, Clt=2-클로로트리틸, DCM=디클로로메탄, DIC=1,3-디이소프로필카보디이미드, DIPEA=N,N-디이소프로필에틸아민, DMSO=디메틸설폭시드, EDT=1,2-에탄디티올, EtOAc=에틸 아세테이트, HBTU=N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N- 메틸메탄암모늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드, HOBt=1-하이드록시벤조트리아졸, Pbf=2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐, Pmc=2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐, PyBop=벤조트리아졸-1-일옥시트리(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, SPPS=고체상 펩타이드 합성, TBTU=N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸메탄암모늄 테트라플루오로보레이트 N-옥시드, tBu=3급-부틸, TEA=트리에틸아민, Trt=트리틸

실시예 1. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 11-diFmoc-연어 칼시토닌의 연속합성

구조: Fmoc-Cys¹-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln²⁰-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly³⁰-Thr-Pro-NH₂ (1,7 디설피드 결합)

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	-	-	-	-	4.0
DCM^*	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	-	-	-	-	20.0
di-Fmoc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
산화
DMF 중 0.1M 요오드	-	-	-	-	50.0
DMF (산화반응용)	-	-	-	-	50.0
DMF 중 1.0M 아스코르브산	-	-	-	-	250
DMF	-	-	-	-	310
DCM	-	-	-	-	60
MeOH	-	-	-	-	60
헵탄	-	-	-	-	60
절단
TFA	-	-	-	-	86
TIS	-	-	-	-	2.0
물	-	-	-	-	2.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	1100

*커플링 사이클당 사용량을 표시함

하기의 반응 순서로 펩타이드를 합성하였다.

반응 순서: Nsc-Pro, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Ser(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Pro, Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc), Nsc-His(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Glu(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Nsc-Cys(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Nsc-Asn(Trt), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Cys(trt)

2.0 g의 링크 아미드 레진을 50 ml 펩타이드 반응 용기에 넣고, 20 ml DCM을 부어 30 분 정도 유지하여 레진이 충분히 부풀도록 한 다음 용액은 여과하여 제거하였다. 2x20 ml 탈보호용액(DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)으로 각 5 분씩 반응하여 Fmoc을 제거한 다음 20 ml DMF로 5-7회 동안 세척하였다. 남아있는 피페리딘과 디벤조풀벤(dibenzofulvene)의 제거를 확인하기 위하여 클로라닐(chloranil) 시험법[Nsc 또는 Fmoc 관련 부가물 및 잔여 피페리딘이 완전히 제거되었는지를 결정하기 위해 사용한다. 시험용액은 톨루엔 중 클로라닐 포화용액 1방울을 아세톤 약 1ml에 가하여 제조한다. DMF 세척액 1방울을 클로라닐 시험용액에 가하여 DMF 세척액을 시험한다. 2차 아민이 존재하면 청자색을 띤다]으로 확인하였다.

칼시토닌의 C-말단 아미노산인 Pro을 도입하기 위하여 Nsc-Pro-OH(1.5 eq), Bop(1.5 eq), HOBt(1.5 eq)와 DIPEA(1.5eq)를 4 ml DMF와 8 ml DCM에 녹여 위의 레진이 있는 반응기에 넣었다. 반응액을 추가의 8 ml DCM으로 세척하여 반응기에 붓고, DIPEA(1.5 eq)를 더 가한 다음, 35℃-40℃ 온도에서 적당한 혼합기로 1 시간 가량 고루고루 섞어 반응을 진행시켰다. 반응의 종말점은 카이저(Kaiser) 시험법[정성 닌히드린시험을 사용하여 반응의 종결을 확인하기 위해, 레진 샘플 2-10mg을 들어내어 에탄올로 깨끗이 세척한다. 80% 페놀 용액 2방울, 피리딘 중 0.02 mM KCN 2방울 및 에탄올 중 5% 닌히드린 2방울을 샘플에 가한다. 샘플을 약 120℃에서 4-6분 동안 열블록에 둔다. 유리 아민이 존재하면 레진이나 용액이 청자색을 띤다]으로 판단하며, 반응의 진행이 완료되지 않았으면 반응시간을 추가로 30 분 내지 1 시간 가량 늘려 반응을 진행시켰다. 반응이 완료되었으면 반응액을 여과하여 제거하고 3x20 ml DMF로 세척하고, 2x20 ml 탈보호용액으로 각 5 분씩 반응시킨 후 DMF로 충분히 세척하였다.

계속적인 아미노산의 도입은 위에 예시된 방법에 의해서 실시하고 그 반응 순서는 칼시토닌의 C-말단에서부터 Pro³² 이후로 차례로 진행되며 보호기 아미노산 도입 후 탈보호용액을 이용하여 Nsc나 Fmoc의 제거를 반복하였다. Nsc-Cys(Trt)를 도입한 다음 3x20 ml 2 % 히드라진 용액으로 각 10-30 분 가량 반응시켜 ivDde와 Nsc를 제거한 다음 레진을 4x20 ml DMF, 4x20 ml DCM, 4x20 ml DMF로 충분히 여과 세척하였다. 반응기에 Fmoc-OSu (5.0 eq)를 DMF 20 ml 에 녹여 붓고 1-2 시간 가량 잘 혼합 시켜주어 1,11 위치의 아민에 각각 Fmoc을 도입하였다. 반응의 진척은 카이저 시험법으로 확인하고, 반응이 완료된 것으로 판단되면 반응액을 여과하여 제거하고, 4x20 ml DMF와 4x20 ml DCM으로 충분히 세척하고 질소 기류 하에서 건조시켜 8.5 g의 펩타이드 부착 레진을 얻을 수 있었다.

1,7 디설피드 결합은 I₂ 산화법으로 달성할 수 있었으며, 위에서 얻은 펩타이드 레진을 여과가 가능한 150 ml 펩타이드 반응기에 넣은 다음 50 ml DMF를 부어 30 분 정도 평형을 유지하도록 하였다. 반응기에 추가로 50 ml DMF 중 0.1 M I₂ 를 붓고 2 시간 가량 잘 혼합하여 산화반응을 진행시켰다. 반응의 진행은 HPLC로 관측하며, 반응이 완료되었으면 5x50 ml DMF와 5x50ml 아스코르브산으로 각 5분 여과 세척을 진행하여 남아있는 I₂을 충분히 제거하였다. 추가로 3x20 ml DMF, 3x20 ml DCM, 3x20 ml MeOH, 그리고 3x20 ml 헵탄으로 세척하고, 질소로 건조하고, 진공으로 6 시간 가량 건조하여 8.1 g 의 건조된 펩타이드 부착 레진을 얻었다.

위의 건조된 레진을 80 ml의 절단 용액 (2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)과 상온에서 1시간 30 분 가량 반응시킨 다음 레진을 제거하고, 그 레진을 TFA로 10 ml 정도로 세척하였다. 세척액과 여과액을 모두 모아 500 ml 에테르에 부어 생성된 부유물을 원심분리기로 침전시키고, 추가로 3x200 ml 에테르로 원심 분리하여 세척하였다. 침전물을 질소로 건조하여 4.8 g의 건조된 펩타이드 혼합물을 얻었으며, 이 혼합물을 prep-HPLC를 이용하여 정제하고, 동결건조하여 896 mg의 1,11-diFmoc-연어 칼시토닌을 얻을 수 있었다. 본 실시예에서 제조된 펩타이드의 목표 부위는 Lys¹⁸의 아민이다.

[Preparative HPLC 정제조건]

Vydac 프로테인 & 펩타이드-C₁₈, 20x250 mm, 5 u, 300 A

TFA 완충된 AcCN 및 물 구배

[펩타이드 분석 조건 1]

기기 : Waters Alliance

유속 : 1.0 ml/분

구배 : 0-45분, B 0-100%(A : 물 중 0.1% TFA, B : AcCN 중 0.1% TFA)

컬럼 : Nova-Pak-C₁₈, 3.9 mm x 150 mm, 5 u, 100 A

[질량분석 조건]

기기 : Voyager DE-STR Maldi Tof Mass(Perseptive)

운영 모드 : Reflector

추출 모드(Extraction mode): Delayed

극성 : 양성

매트릭스 : α-시아노-4-하이드록시신남산

Maldi Tof; 3877.43, (M+1=3877.44) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 2. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 18-diFmoc-연어 칼시토닌의 연속합성

구조: Fmoc-Cys¹-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu- His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln²⁰-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly³⁰-Thr-Pro-NH₂ (1,7 디설피드 결합)

반응 순서: Nsc-Pro, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Ser(tBu), Nsc-Gly, Nsc- Thr(tBu), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Pro, Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-His(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Glu(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Nsc-Cys(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Nsc-Asn(Trt), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Cys(trt).

반응은 위의 표와 반응 아미노산 순서에 맞춰 실시예 1에서 예시한 바와 같이 진행하였다. IvDde 제거와 diFmoc 도입 그리고 I₂ 산화과정을 거친 후 펩타이드 부착 레진은 8.2 g이었으며, 실시예 1과 같이 TFA-절단 용액(2.5:2.5:95=TIS:물:TFA)을 처리하고 prep-HPLC로 정제하여 892 mg의 1,18-diFmoc-연어 칼시토닌를 얻을 수 있었다.

Maldi Tof; 3877.33, (M+1=3877.44) HPLC; 97 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 3. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 11, 18-diFmoc-연어 칼시토닌의 연속합성

구조: H-Cys¹-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln²⁰-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly³⁰-Thr-Pro-NH₂ (1,7 디설피드 결합)

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH x 2	574.6	1.5	1.5	1.72	-
Boc-Cys(trt)-OH	463.6	1.5	1.5	0.695
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	-	-	-	-	4.0
DCM^*	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	-	-	-	-	20.0
di-Fmoc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
산화
DMF 중 0.1M 요오드	-	-	-	-	50.0
DMF (산화반응용)	-	-	-	-	50.0
DMF 중 1.0M 아스코르브산	-	-	-	-	250
DMF	-	-	-	-	310
DCM	-	-	-	-	60
MeOH	-	-	-	-	60
헵탄	-	-	-	-	60
절단
TFA	-	-	-	-	86
TIS	-	-	-	-	2.0
물	-	-	-	-	2.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	1100

반응 순서: Nsc-Pro, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Ser(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Pro, Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-His(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Glu(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Nsc-Cys(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Nsc-Asn(Trt), Nsc-Ser(tBu), Boc-Cys(trt).

반응은 위의 표와 반응 아미노산 순서에 맞춰 실시예 1에서 예시한 바와 같이 진행하였다. IvDde 제거와 diFmoc 도입 그리고 I₂ 산화과정을 거친 후 펩타이드 부착 레진은 8.2 g 이었으며, 실시예 1과 같이 TFA-절단 용액(2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)을 처리하고 prep-HPLC로 정제하여 890 mg의 11,18-diFmoc-연어 칼시토닌를 얻을 수 있었다.

Maldi Tof; 3877.23, (M+1=3877.44) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 4. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 12-diFmoc-GRF(1-29)의 연속합성

구조: Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	73.10	-	-	-	4.0
DCM^*	84.93	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	73.10	-	-	-	20.0
di-Fmoc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	73.10	-	-	-	240
DCM	84.93	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
절단(레진 1g)
TFA	114.02	-	-	-	11.5
TIS	158.36	-	-	-	0.25
물	18.02	-	-	-	0.25
EDT	94.02				0.157
TMS-Br	153.10				0.130
디에틸 에테르	74.12	-	-	-	250

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc- Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Nsc-Tyr(tBu)

2.0 g의 링크 아미드 레진을 50 ml 펩타이드 반응 용기에 넣고, 20 ml DCM을 부어 30 분 정도 유지하여 레진이 충분히 부풀도록 한 다음, 용액은 여과하여 제거하였다. 2x20 ml 탈보호용액(DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)으로 각 5 분씩 반응하여 Fmoc을 제거한 다음, 20 ml DMF로 5-7회 동안 세척하였다. 남아있는 피페리딘과 디벤조풀벤의 제거를 확인하기 위하여 클로라닐 시험법으로 확인하였다.

GRF(1-29)의 C-말단 아미노산인 Arg을 도입하기 위하여 Nsc-Arg(Pbf)-OH(1.5 eq), Bop(1.5 eq), HOBt(1.5 eq)와 DIPEA(1.5eq)를 2 ml DMF와 8 ml DCM에 녹여 위의 레진이 담겨 있는 반응기에 넣었다. 반응액을 추가의 8 ml DCM으로 세척하여 반응기에 붓고, DIPEA(1.5 eq)를 더 가한 다음, 35℃-40℃ 온도에서 적당한 혼합기로 1 시간 가량 고루고루 섞어 반응을 진행시켰다. 반응의 종말점은 카이저 시험법으로 판단하며, 반응의 진행이 완료되지 않았으면 30 분 내지 1 시간 가량 더 반응을 진행시켰다. 반응이 완료되었으면 반응액을 여과하여 제거하고, 3x20 ml DMF로 세척하고, 2x20 ml 탈보호용액으로 각 5 분씩 반응시킨 후 DMF로 충분히 세척하였다.

계속적인 아미노산의 도입은 위에 예시된 방법에 의해서 실시하고, 그 반응 순서는 GRF(1-29)의 C-말단에서부터 Arg 이후 차례로 진행되며 보호기 아미노산 도입 후 탈보호용액을 이용하여 Nsc 혹은 Fmoc의 제거를 반복하였다. Nsc-Tyr(tBu)를 도입한 다음, 3x20 ml 2 % 히드라진 용액으로 각 10-30 분 가량 반응시켜 ivDde와 Nsc를 제거한 다음, 레진을 4x20 ml DMF, 4x20 ml DCM, 4x20 ml DMF로 충분히 여과 세척하였다. 반응기에 Fmoc-OSu (5.0 eq)를 DMF 20 ml 에 녹여 붓고, 1-2 시간 가 량 잘 혼합 시켜주어 1, 12 위치의 아민에 각각 Fmoc을 도입하였다. 반응의 진척은 카이저 시험법으로 확인하고, 반응이 완료된 것으로 판단되면 반응액을 여과하여 제거하고, 4x20 ml DMF와 4x20 ml DCM으로 충분히 세척하고 질소를 불어 건조시켜 8.5 g의 펩타이드 부착 레진을 얻을 수 있었다.

위의 건조된 레진 중 1 g을 취하여 10 ml의 절단 용액 (2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)과 상온에서 1시간 30 분 가량 반응시키고, 추가로 TMS-Br과 EDT로 15 분간 더 반응시켰다. 여과하여 레진을 제거하고, 그 레진을 TFA 2 ml 정도로 세척하였다. 세척액과 여과액을 모두 모아 100 ml 에테르에 부어 생성된 부유물을 원심분리기로 침전시키고, 추가로 3x50 ml 에테르로 원심 분리하여 세척하였다. 침전물을 질소로 건조하여 690 mg의 건조된 펩타이드 혼합물을 얻었으며, 이 혼합물을 prep-HPLC를 이용하여 정제하고, 동결건조기를 이용하여 농축 건조하여 116 mg의 1,12-diFmoc-GRF(1-29)를 얻을 수 있었다.

Maldi Tof; 3803.39, (M+1=3803.46) HPLC; 96 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 5. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 21-diFmoc-GRF(1-29)의 연속합성

구조: Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	73.10	-	-	-	4.0
DCM^*	84.93	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	73.10	-	-	-	20.0
di-Fmoc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	73.10	-	-	-	240
DCM	84.93	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
절단(레진 1g)
TFA	114.02	-	-	-	11.5
TIS	158.36	-	-	-	0.25
물	18.02	-	-	-	0.25
EDT	94.02				0.157
TMS-Br	153.10				0.130
디에틸 에테르	74.12	-	-	-	400

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Nsc-Lys(Boc), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc- Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Nsc-Tyr(tBu)

위의 표에서 사용된 시약과 용매를 실시예 4에서 예시한 바와 같이 반응 순서에 따라 진행하였다. DiFmoc의 도입은 실시예 4와 같은 방법으로 DMF 중 2% 히드라진으로 ivDde 제거한 다음 Fmoc-OSu(20 ml DMF 중 3.37 g)를 사용하여 성취할 수 있었으며, 반응 후 건조된 레진으로 7.9 g을 얻을 수 있었다. 위에서 얻은 펩타이드 레진 1 g을 취하여 10 ml의 절단 용액 (2.5:2.5:95 =TIS/물/TFA)과 혼합하여 1 시간 30 분간 반응시키고, 반응액에 추가로 EDT(0.130 ml)와 TMS-Br(0.157 ml)을 넣고 15 분간 더 교반하였다. 반응액을 실시예 4에서와 같이 에테르 처리하여 펩타이드 혼합물 710 mg을 얻었으며, prep-HPLC 정제과정을 거쳐 86 mg 1,21-diFmoc-GRF(1-29)을 얻었다.

Maldi Tof; 3803.59, (M+1=3803.46) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 6. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 12, 21-diFmoc-GRF(1-29)의 연속합성

구조: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Nsc-Lys(ivDde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Boc-Tyr(tBu)

위의 표에서 사용된 시약과 용매를 실시예 4에서 예시한 바와 같이 반응 순서에 따라 진행하였다. DiFmoc의 도입은 실시예 4와 같은 방법으로 DMF 중 2% 히드라진으로 ivDde 제거한 다음 Fmoc-OSu(20 ml DMF 중 3.37 g)를 사용하여 성취할 수 있었으며, 반응 후 건조된 레진으로 8.4 g을 얻을 수 있었다. 위에서 얻은 펩타이드 레진 1 g을 취하여 10 ml의 절단 용액 (2.5:2.5:95 =TIS/물/TFA)과 혼합하여 1 시간 30 분간 반응시키고, 반응액에 추가로 EDT(0.130 ml)와 TMS-Br(0.157 ml)을 넣고 15 분간 더 교반하였다. 반응액을 실시예 4에서와 같이 에테르 처리하여 펩타이드 혼합물 710 mg을 얻었으며, prep-HPLC 정제과정을 거쳐 86 mg 12,21-diFmoc-GRF(1-29)을 얻었다.

실시예 7. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 12-diNsc-GRF(1-29)의 연속합성

구조: Nsc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys(Nsc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	73.10	-	-	-	4.0
DCM^*	84.93	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	73.10	-	-	-	20.0
di-Nsc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	73.10	-	-	-	240
DCM	84.93	-	-	-	160
Nsc-OSu	372.3	5.0	10.0	3.72	-
절단(레진 1g)
TFA	114.02	-	-	-	11.5
TIS	158.36	-	-	-	0.25
물	18.02	-	-	-	0.25
EDT	94.02				0.157
TMS-Br	153.10				0.130
디에틸 에테르	74.12	-	-	-	250

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc) Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Nsc-Tyr(tBu)

위의 표에서 사용된 시약과 용매를 실시예 4에서 예시한 바와 같이 반응 순서에 따라 진행하였다. DiNsc의 도입은 실시예 4와 같은 방법으로 DMF 중 2% 히드라진으로 ivDde 제거한 다음 Nsc-OSu(20 ml DMF 중 3.72 g)를 사용하여 성취할 수 있었으며, 반응 후 건조된 레진으로 8.1 g을 얻을 수 있었다. 위에서 얻은 펩타이드 레진 1 g을 취하여 10 ml의 절단 용액(2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)과 혼합하여 1 시간 30 분간 반응시키고, 반응액에 추가로 EDT(0.130 ml)와 TMS-Br(0.157 ml)을 넣고 15 분간 더 교반하였다. 반응액을 실시예 4에서와 같이 에테르 처리하여 펩타이드 혼합물 700 mg을 얻었으며, prep-HPLC 정제과정을 거쳐 136 mg 1,12-diNsc-GRF(1-29)을 얻었다.

Maldi Tof; 3874.46 (M+1=3874.39) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 8. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 12-di(ivDde)-GRF(1-29)의 연속합성

구조: ivDde-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys(ivDde)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	73.10	-	-	-	4.0
DCM^*	84.93	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	73.10	-	-	-	20.0
ivDde의 도입
DMF	73.10	-	-	-	20
ivDde-OH (2-이소발레릴디메돈)	226.3	-	-	1.0	-
절단(레진 1g)
TFA	114.02	-	-	-	11.5
TIS	158.36	-	-	-	0.25
물	18.02	-	-	-	0.25
EDT	94.02				0.157
TMS-Br	153.10				0.130
디에틸 에테르	74.12	-	-	-	400

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Nsc-Tyr(tBu)

위의 표에서 사용된 시약과 용매를 실시예 4에서 예시한 바와 같이 위의 반 응 순서에 따라 진행하였다. N-말단의 ivDde의 도입은 Nsc-Tyr(tBu)를 반응 시킨 후 Nsc를 제거한 다음 2-이소발레릴디메돈(20 ml DMF 중 1.0 g)을 사용하여 12 시간 동안 반응하여 이룰 수 있었다. 반응 후 건조된 레진으로 8.1 g을 얻었으며 그중에 1 g을 취하여 10 ml의 절단 용액(2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)과 혼합하여 1 시간 30 분간 반응시키고, 반응액에 추가로 EDT(0.130 ml)와 TMS-Br(0.157 ml)을 넣고 15 분간 더 교반하였다. 반응액을 실시예 4 에서와 같이 에테르 처리하여 펩타이드 혼합물 680 mg을 얻었으며, prep-HPLC 정제과정을 거쳐 97 mg 1,12-di(ivDde)-GRF(1-29)을 얻었다.

Maldi Tof; 3771.39, (M+1=3771.55) HPLC; 94 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 9. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 12-diBoc-GRF(1-29)의 연속합성

실시예 9-1. 21-Nsc-GRF(1-29)의 합성

구조: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys(Nsc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	73.10	-	-	-	4.0
DCM^*	84.93	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	73.10	-	-	-	20.0
Nsc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	73.10	-	-	-	240
DCM	84.93	-	-	-	160
Nsc-OSu	372.3	5.0	5.0	3.72	-
절단(레진 1g)
TFA	114.02	-	-	-	80
TIS	158.36	-	-	-	2.0
물	18.02	-	-	-	2.0
EDT	94.02				1.26
TMS-Br	153.10				1.04
디에틸 에테르	74.12	-	-	-	2000

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Nsc-Lys(Boc), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Boc-Tyr(tBu)

위의 표에서 사용된 시약과 용매를 실시예 4에서 예시한 바와 같이 반응 순서에 따라 진행하였다. Nsc의 도입은 실시예 4와 같은 방법으로 DMF 중 2% 히드라진으로 ivDde 제거한 다음 Nsc-OSu(20 ml DMF 중 3.72 g)를 사용하여 성취할 수 있었으며, 반응 후 건조된 레진으로 7.5 g을 얻을 수 있었다. 위에서 얻은 펩타이드 레진을 취하여 80 ml의 절단 용액(2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)을 가하여 1 시간 30 분간 반응시키고, 반응액에 추가로 EDT(1.26 ml)와 TMS-Br(1.04 ml)을 넣고 15 분간 더 교반하였다. 반응액을 실시예 4에서와 같이 에테르 처리하여 펩타이드 혼합물 4.1 g을 얻었으며, prep-HPLC 정제과정을 거쳐 520 mg 21-Nsc-GRF(1-29)을 얻었다.

Maldi Tof; 3616.39, (M+1=3616.17) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 9-2. 1, 12-diBoc-GRF(1-29)의 합성

구조: Boc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
21-Fmoc-GRF(1-29)	-	1.0	0.1	0.36	-
Boc₂O	218.3			1.0
DMF	-	-	-	-	10
5% Na₂CO₃	-	-	-	-	10
헥산	-	-	-	-	150
메틸 3급-부틸 에테르(MTBE)	-	-	-	-	60

위에서 합성한 21-Nsc-GRF(1-29) 360 mg과 DMF 5 ml를 25 ml 자기 교반 막대가 장치된 단구 반응기에 넣고 잘 녹였다. 반응물이 질소 가스를 이용하여 공기가 적절히 차단된 환경에 놓이도록 하고, 얼음 수조를 이용하여 온도를 0-5℃ 로 낮추었다. 반응액에 Boc₂O(1 g / 5 ml DMF)을 0-5 ℃ 에서 적가하고, 약 10분간 그 온도를 유지한 다음, 얼음 수조를 제거하여 서서히 상온에 이르도록 하였다. 3-4 시간 동안 계속 교반하면서 반응의 진도는 HPLC(펩타이드 분석 조건 1)로 각 시간 별로 채취하여 관측하였다. 반응이 완료된 것으로 나타나면 반응액에 5 % Na₂CO₃ 10 ml을 침전이 석출되지 않도록 잘 교반하며 적가하였다. 약 30 분간 반응을 진행하며 Nsc 제거 반응의 진도는 HPLC로 관측하였다. 반응액을 1/4 정도로 농축한 다음, 150 ml 의 헥산으로 세척하여 끈적거리는 오일로 얻었다. 이 오일에 20 ml MTBE를 붓고 12 시간 동안 방치하여 얻은 침전을 원심분리기로 분리하여 얻을 수 있었다. 2x20 ml MTBE로 추가로 세척하고 질소 가스로 건조하여 330 mg 1,12-diBoc-GRF(1-29)을 얻을 수 있었다.

Maldi Tof; 3559.21, (M+1=3559.20) HPLC; 92 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 10. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 Dde를 사용하는 1, 12-di(Dde)-GRF(1-29)의 연속합성

구조: Dde-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys(Dde)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(Dde)-OH	532.6	1.5	1.5	0.799	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	73.10	-	-	-	4.0
DCM^*	84.93	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	73.10	-	-	-	20.0
Dde의 도입
DMF	73.10	-	-	-	20
Dde-OH (2-아세틸디메돈)	184.2	-	-	1.0	-
절단(레진 1g)
TFA	114.02	-	-	-	11.5
TIS	158.36	-	-	-	0.25
물	18.02	-	-	-	0.25
EDT	94.02				0.157
TMS-Br	153.10				0.130
디에틸 에테르	74.12	-	-	-	250

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Fmoc-Lys(Dde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Nsc-Tyr(tBu)

위의 표에서 사용된 시약과 용매를 실시예 4에서 예시한 바와 같이 위의 반 응 순서에 따라 진행하였다. N-말단의 Dde의 도입은 Nsc-Tyr(tBu)를 반응 시킨 후 Nsc를 제거한 다음 2-아세틸디메돈(20 ml DMF 중 1.0 g)을 사용하여 6 시간 동안 반응하여 이룰 수 있었다. 반응 후 건조된 레진으로 8.8 g을 얻었으며, 그중에 1 g을 취하여 10 ml의 절단 용액(2.5:2.5:95 =TIS/물/TFA)과 혼합하여 1 시간 30 분간 반응시키고, 반응액에 추가로 EDT(0.130 ml)와 TMS-Br(0.157 ml)을 넣고 15 분간 더 교반하였다. 반응액을 실시예 4에서와 같이 에테르 처리하여 펩타이드 혼합물 590 mg을 얻었으며, prep-HPLC 정제과정을 거쳐 104 mg 1,12-diDde-GRF(1-29)을 얻었다.

Maldi Tof; 3687.69, (M+1=3687.55) HPLC; 95 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 11. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 Mtt를 사용하는 1, 11-diFmoc-연어 칼시토닌의 연속합성

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(Mtt)-OH	624.8	1.5	1.5	0.937	-
Fmoc-Cys(Trt)-OH	585.7	1.5	1.5	0.879
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	-	-	-	-	4.0
DCM^*	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	-	-	-	-	20.0
di-Fmoc의 도입
DCM 중 1% TFA	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	260
DCM	-	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
산화
DMF 중 0.1M 요오드	-	-	-	-	50.0
DMF (산화반응용)	-	-	-	-	50.0
DMF 중 1.0M 아스코르브산	-	-	-	-	250
DMF	-	-	-	-	310
DCM	-	-	-	-	60
MeOH	-	-	-	-	60
헵탄	-	-	-	-	60
절단
TFA	-	-	-	-	86
TIS	-	-	-	-	2.0
물	-	-	-	-	2.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	1100

반응 순서: Nsc-Pro, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Ser(tBu), Nsc-Gly, Nsc- Thr(tBu), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Pro, Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc), Nsc-His(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Glu(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Fmoc-Lys(Mtt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Nsc-Cys(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Nsc-Asn(Trt), Nsc-Ser(tBu), Fmoc-Cys(trt)

2.0 g의 링크 아미드 레진을 50 ml 펩타이드 반응 용기에 넣고, 20 ml DCM을 부어 30 분 정도 유지하여 레진이 충분히 부풀도록 한 다음 용액은 여과하여 제거하였다. 2x20 ml 탈보호용액(DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)으로 각 5 분씩 반응하여 Fmoc을 제거한 다음, 20 ml DMF로 5-7회 동안 세척하였다. 남아있는 피페리딘과 디벤조풀벤의 제거를 확인하기 위하여 클로라닐 시험법으로 확인하였다.

칼시토닌의 C-말단 아미노산인 Pro을 도입하기 위하여 Nsc-Pro-OH(1.5 eq), Bop(1.5 eq), HOBt(1.5 eq)와 DIPEA(1.5eq)를 4 ml DMF와 8 ml DCM에 녹여 위의 레진이 담겨 있는 반응기에 넣었다. 반응액을 추가의 8 ml DCM으로 세척하여 반응기에 붓고, DIPEA(1.5 eq)를 더 가한 다음, 35℃-40℃ 온도에서 적당한 혼합기로 1 시간 가량 고루고루 섞어 반응을 진행시켰다. 반응의 종말점은 카이저 시험법으로 판단하며, 반응의 진행이 완료되지 않았으면 반응시간을 30 분 내지 1 시간 가량 더 반응을 진행시켰다. 반응이 완료되었으면 반응액을 여과하여 제거하고, 3x20 ml DMF로 세척하고 2x20 ml 탈보호용액으로 각 5 분씩 반응시킨 후, DMF로 충분히 세척하였다.

계속적인 아미노산의 도입은 위에 예시된 방법에 의해서 실시하고, 그 반응 순서는 칼시토닌의 C-말단에서부터 Pro³² 이후로 차례로 진행되며 커플링 반응과 탈보호 반응을 순서에 맞추어 반복하여 실시하였다. 위에 예시한 반복 반응인 커플링과 탈보호 반응은 자동화 기기를 이용하여 실시할 수도 있다. 마지막으로 N-말단의 Fmoc-Cys(Trt)를 도입한 다음 레진을 DCM으로 충분히 세척하였다. 레진을 3x20 ml 1 % TFA 용액으로 각 10-30 분 가량 반응시켜 11 위치의 Mtt를 제거하였다. Mtt의 제거의 확인은 반응용액을 TLC 점적(spotting) 하여 UV와 TFA 흄(fume)과의 반응성으로 블랭크와의 비교를 통해서 확인할 수 있었다. 반응이 완료되었으면 레진을 4x20 ml DMF, 4x20 ml DCM, 4x20 ml DMF로 충분히 여과 세척하고, 반응기에 Fmoc-OSu (5.0 eq)를 DMF 20 ml 에 녹여 붓고, 1-2 시간 가량 잘 혼합 시켜주어 11 위치의 Lys에 Fmoc을 도입하였다. 이 반응의 진척은 카이저 시험법으로 확인하였고 반응이 완료된 것으로 판단되면 반응액을 여과하여 제거하고, 4x20 ml DMF와 4x20 ml DCM으로 충분히 세척하고 질소 기류 하에서 건조시켜 8.5 g의 펩타이드 부착 레진을 얻을 수 있었다.

1,7 디설피드 결합은 I₂ 산화법으로 달성할 수 있었으며, 위에서 얻은 펩타이드 레진을 여과가 가능한 150 ml 펩타이드 반응기에 넣은 다음, 50 ml DMF를 부어 30 분 정도 평형을 유지하도록 하였다. 반응기에 추가로 50 ml DMF 중 0.1 M I₂를 붓고 2 시간 가량 잘 혼합하여 산화반응을 진행시켰다. 반응의 진행은 HPLC로 관측하며, 반응이 완료되었으면 5x50 ml DMF와 5x50ml 아스코르브산으로 각 5분 여과 세척을 진행하여 남아있는 I₂을 충분히 제거하였다. 추가로 3x20 ml DMF, 3x20 ml DCM, 3x20 ml MeOH, 그리고 3x20 ml 헵탄으로 세척하고 질소로 건조하고 진공으로 6 시간 가량 건조하여 8.1 g 의 건조된 펩타이드 부착 레진을 얻었다.

위의 건조된 레진을 80 ml의 절단 용액 (2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)과 상온에서 1시간 30 분 가량 반응시킨 다음, 레진을 제거하고 그 레진을 TFA로 10 ml 정도로 세척하였다. 세척액과 여과액을 모두 모아 500 ml 에테르에 부어 생성된 침전을 원심분리기로 침전시키고, 추가로 3x200 ml 에테르로 원심 분리하여 세척하였다. 침전물을 질소로 건조하여 4.8 g의 건조된 펩타이드 혼합물을 얻었으며, 이 혼합물을 prep-HPLC를 이용하여 정제하고, 동결건조기를 이용하여 농축 건조하여 896 mg의 1,11-diFmoc-연어 칼시토닌을 얻을 수 있었다.

실시예 12. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 Mtt를 사용하는 1, 12-diFmoc-GRF(1-29)의 연속합성

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(Mtt)-OH	624.8	1.5	1.5	0.937	-
Fmoc-Tyr(tBu)-OH	459.6	1.5	1.5	0.689	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	73.10	-	-	-	4.0
DCM^*	84.93	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	73.10	-	-	-	20.0
di-Fmoc의 도입
DCN 중 1% TFA	-	-	-	-	60.0
DMF	73.10	-	-	-	260
DCM	84.93	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
절단(레진 1g)
TFA	114.02	-	-	-	11.5
TIS	158.36	-	-	-	0.25
물	18.02	-	-	-	0.25
EDT	94.02				0.157
TMS-Br	153.10				0.130
디에틸 에테르	74.12	-	-	-	250

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt), Nsc-Gly, Nsc-Leu, Nsc-Val, Fmoc-Lys(Mtt), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc- Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Fmoc-Tyr(tBu)

GRF(1-29)의 C-말단 아미노산인 Arg을 도입하기 위하여 Nsc-Arg(Pbf)-OH(1.5 eq), Bop(1.5 eq), HOBt(1.5 eq)와 DIPEA(1.5eq)를 4 ml DMF와 8 ml DCM에 녹여 위의 레진이 담겨 있는 반응기에 넣었다. 반응액을 추가의 8 ml DCM으로 세척하여 반응기에 붓고 DIPEA(1.5 eq)를 더 가한 다음, 35℃-40℃ 온도에서 적당한 혼합기로 1 시간 가량 고루고루 섞어 반응을 진행시켰다. 반응의 종말점은 카이저 시험법으로 판단하며, 반응의 진행이 완료되지 않았으면 반응시간을 30 분 내지 1 시간 가량 더 반응을 진행시켰다. 반응이 완료되었으면 반응액을 여과하여 제거하고, 3x20 ml DMF로 세척하고 2x20 ml 탈보호용액으로 각 5 분씩 반응시킨 후, DMF로 충분히 세척하였다.

계속적인 아미노산의 도입은 위에 예시된 방법에 의해서 실시하고 그 반응 순서는 GRF(1-29)의 C 말단에서부터 Arg 이후 차례로 진행되며 커플링 반응과 탈보호 반응을 순서에 맞추어 반복하여 실시하였다. 위에 예시한 반복 반응인 커플링과 탈보호 반응은 자동화 기기를 이용하여 실시할 수도 있다. N-말단의 Fmoc-Tyr(tBu)를 도입한 다음, 레진을 DCM으로 충분히 세척한 후 20 ml DCM 에 15분 가량 담가 놓는다. DCM을 제거한 다음, 레진에 3x20 ml 1 % TFA 용액으로 각 10-30 분 가량 반응시켜 12 위치의 Mtt를 제거하였다. Mtt의 제거의 확인은 반응용액을 TLC 점적하여 UV와 TFA 흄과의 반응성으로 블랭크와의 비교를 통해서 확인할 수 있었다. 반응이 완료되었으면 레진을 4x20 ml DMF, 4x20 ml DCM, 4x20 ml DMF로 충분히 여과 세척하고, 반응기에 Fmoc-OSu (5.0 eq)를 DMF 20 ml 에 녹여 붓고 1-2 시간 가량 잘 혼합 시켜주어 12 위치의 Lys에 Fmoc을 도입하였다. 이 반응의 진척은 카이저 시험법으로 확인하였고, 반응이 완료된 것으로 판단되면 반응액을 여과하여 제거하고 4x20 ml DMF와 4x20 ml DCM으로 충분히 세척하고 질소 기류 하에서 건조시켜 8.5 g의 펩타이드 부착 레진을 얻을 수 있었다.

위의 건조된 레진 중 1 g을 취하여 10 ml의 절단 용액 (2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)과 상온에서 1시간 30 분 가량 반응시키고, 추가로 TMS-Br과 EDT로 15 분간 더 반응시켰다. 여과하여 레진을 제거하고 그 레진을 TFA로 2 ml 정도로 세척하였다. 세척액과 여과액을 모두 모아 100 ml 에테르에 부어 생성된 부유물을 원심분리기로 침전시키고 추가로 3x50 ml 에테르로 원심 분리하여 세척하였다. 침전물을 질소로 건조하여 690 mg의 건조된 펩타이드 혼합물을 얻었으며, 이 혼합물을 prep-HPLC를 이용하여 정제하고, 동결건조기를 이용하여 농축 건조하여 116 mg의 1,12-diFmoc-GRF(1-29)를 얻을 수 있었다.

실시예 13. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 11-diFmoc-연어 칼시토닌의 분절축합 합성

실시예 13-1. Nsc-Gly-2-ClTrt-레진의 합성

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당) ^*
2-클로로트리틸 레진	-	-	-	10.0	-
Nsc-Gly	332.30	1.0	10.0	3.32
DIPEA	129.30	3.0	30.0	3.88	9.22
DCM					768
MeOH					8

10 g 의 2-CLTR 레진을 250 ml 펩타이드 반응기에 넣고 100 ml의 DCM을 붓고 30 분 가량 레진이 잘 부풀도록 한 다음 용액을 여과하여 제거하였다. Nsc-Gly-OH (3.32 g)과 DIPEA(5.22 ml)를 100 ml DCM에 잘 녹인 다음, 그 용액을 레진이 장착된 반응기에 넣고 상온에서 1 시간 가량 잘 혼합하여 반응을 진행시켰다. 반응액을 여과하여 제거하고 100 ml DCM으로 세척하고 80 ml 17:2:1 DCM:MeOH:DIPEA로 20 분간 반응시켜 레진의 활성기를 모두 MeOH로 치환하여 제거하였다. 4x100 ml DCM으로 세척한 다음 질소 가스로 건조하여 Nsc-Gly-CLTR 13.1 g을 얻었다{UV-스펙트럼 검증(기기 : BioRad Smart Spec 3000, Extinction coefficient of Nsc : 2000 cm^-1M^-1 at 300 nm ; 용량 0.61mmol/g).

실시예 13-2. Nsc-AA^sCt(1-10)-OH의 합성

구조: Nsc-Cys¹-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-OH (1,7-디설피드 결합)

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
Nsc-Gly-2-CLTR	-	1.0	5.0	8.2	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	7.5	-	-
DIPEA^*	129.3	3.0	15.0	1.94	2.61
Bop^*	442.3	1.5	7.5	3.32	-
HOBt^*	135.1	1.5	7.5	1.01	-
DMF^*	-	-	-	-	4.0
DCM^*	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	100
DMF(각 세척에 사용)^*	-	-	-	-	50.0
산화
DCM 중 0.1M 요오드	-	-	-	-	250.0
DCM(산화반응용)	-	-	-	-	250.0
DMF	-	-	-	-	800
MeOH					300
DCM	-	-	-	-	300
헵탄	-	-	-	-	300
절단
TFA	-	-	-	-	2.0
피리딘	-	-	-	-	2.0
DCM	-	-	-	-	250
에탄올	-	-	-	-	50
물	-	-	-	-	200

위에서 합성한 8.2 g Nsc-Gly-2-CLTR (용량 0.61mmol/g)을 200 ml 용량의 펩타이드 반응기에 넣고 평형에 이르도록 DCM 50 ml를 붓고 30 분 가량 기다린다. DCM을 여과하여 제거하고 2x50ml 탈보호용액(DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)으로 각 5 분씩 반응시킨 다음 5x50 ml DMF로 충분히 세척하였다. 펩타이드 순서에 맞춰 C-말단으로부터 축합반응과 탈보호반응을 표에 예시된 시약을 사용하여 실시예 1에서와 같이 반복적으로 실시하였다. 반응 순서는 Leu, Val, Cys(Trt), Thr(tBu), Ser(tBu), Leu, Asn(Trt), Ser(tBu), 그리고 Cys(Trt)로 실시되며 Nsc-Cys(Trt)-OH 축합 반응 후 다음 반응을 위해 Nsc를 제거시키지 않는다.

1,7 디설피드 결합은 I₂ 산화법으로 달성할 수 있었으며, 위에서 얻은 펩타이드 레진을 여과가 가능한 800 ml 펩타이드 반응기에 넣은 다음 250 ml DCM을 부어 30 분 정도 평형을 유지하도록 하였다. 반응기에 추가로 250 ml DCM 중 0.1 M I₂을 붓고 2 시간 가량 잘 혼합하여 산화반응을 진행시켰다. 반응의 진행은 HPLC로 관측하며(펩타이드 분석 조건 2), 반응이 완료되었으면 5x100 ml DMF로 각 10 분씩 여과 세척하고 I₂을 충분히 제거하였다. 추가로 3x100 ml DMF, 3x100 ml DCM, 3x100 ml MeOH, 그리고 3x100 ml 헵탄으로 세척하고 질소 가스로 건조하고 진공으로 6 시간 가량 건조하여 16.9 g 의 건조된 펩타이드 부착 레진을 얻었다

펩타이드는 온화한 산 조건에서 보호기를 보존한 채 탈루시켰으며, 150 ml DCM 중 1% TFA으로 2 분 가량 처리하여 여과한 용액과 100 ml DCM 중 0.5% TFA으로 1 분 가량 처리한 용액을 소요된 TFA와 동량의 피리딘을 사용하여 곧 바로 중화하였다. 이 용액을 약 1/4 가량의 부피로 진공 농축한 다음 50 ml 에탄올을 부어 처리한 후, 재농축하여 남아있는 최종 부피가 약 50 ml 정도가 되도록 하였다. 이 용액에 100 ml 물을 부어 침전시키고, 그 침전물을 원심 분리기를 이용하여 분리하였으며, 2x50 ml의 물을 사용하여 침전을 세척하였다. 침전물을 진공을 통해 잘 건조하여 6.8 g Nsc-AA^sCt(1-10)-OH (93 % HPLC 순도) 을 얻을 수 있었다.

[펩타이드 분석 조건 2]

기기 : Waters Alliance

유속 : 1.0 ml/분

구배 : 0-50분, B 40-100%(A : 물 중 0.1% TFA, B : AcCN 중 0.1% TFA)

컬럼 : Nova-Pak-C₁₈, 3.9 mm x 150 mm, 5 u, 100 A

Maldi Tof; 1663.23, (M+1=1662.09) HPLC; 93 % 이상 (펩타이드 분석 조건 2)

실시예 13-3. 11-N^α-Fmoc-11-ivDde-18-Boc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진의 합성

구조: Fmoc-Lys(ivDde)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-링크 아미드 레진

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	-	-	-	-	4.0
DCM^*	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)^*	-	-	-	-	20.0

2.0 g 링크 아미드 레진을 펩타이드 반응용기에 넣은 후 20 ml DCM을 부어 충분히 반응을 평형에 이르도록 30 분간 방치하였다. 레진에 부착된 Fmoc을 제거하기 위하여 탈보호용액(DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)을 2x20 ml 각 5 분 사용하여 달성하였고, 그 레진을 5x20 ml DMF로 충분히 세척하였다. 펩타이드 순서에 맞춰 C-말단으로부터 축합반응과 탈보호반응을 표에 예시된 시약을 사용하여 실시예 1에서와 같이 반복적으로 실시하였다. 반응 순서는 Pro, Thr(tBu), Gly, Ser(tBu), Gly, Thr(tBu), Asn(Trt), Thr(tBu), Arg(Pbf), Pro, Tyr(tBu), Thr(tBu), Gln(Trt), Leu, Lys(Boc), His(Trt), Leu, Glu(tBu), Gln(Trt), Ser(tBu), Leu, Lys(ivDde)로 실시되었다. 마지막 Fmoc-Lys(ivDde)-OH 축합 반응 후, Fmoc은 제거시키지 않고 레진을 4x20 ml DMF와 4x20 ml DCM으로 세척한 다음, 질소 가스로 건조시켜 6.5 g 펩타이드 부착 레진을 얻을 수 있었다(UV-스펙트럼 검증; 용량 0.14 mmol/g).

실시예 13-4. Nsc-AA^sCt(1-10)-OH와 Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진의 축합에 의한 1, 11-diFmoc-연어 칼시토닌의 합성

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
탈보호반응
Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	3.57	-
DCM					30
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	180
분절 축합
H-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	-	-
Nsc-AA^sCt (1-10)-OH (2.2)	1662	1.5	0.75	1.25	-
DIPEA	129.3	3.0	1.5	0.194	0.26
Bop	442.3	1.5	0.75	0.332	-
HOBt	135.1	1.5	0.80	0.108	-
DMF	-	-	-	-	4.0
DCM	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	20.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	20.0
diFmoc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
절단
TFA	-	-	-	-	38
TIS	-	-	-	-	1.0
물	-	-	-	-	1.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	500

위에서 합성한 Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진 3.85 g을 펩타이드 반응기에 부은 다음, 30 ml DCM으로 충분히 불린다. 반응기의 용액을 제거하고 2x20 ml 탈보호용액 (DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)을 각 5분씩 처리하여 Fmoc을 제거하고 잔유물이 남아있지 않도록 클로라닐 시험법으로 잘 관찰하면서 7-9 회정도 20 ml DMF로 충분히 세척하였다.

위에서 합성한 펩타이드 분절 Nsc-AA^sCt(1-10)-OH 1.25 g을 4 ml DMF에 녹인 다음 HOBt(0.108 g)와 DIPEA(0.160 ml)를 넣고 반응액의 온도를 얼음 수조를 이용하여 0-5 ℃로 낮추었다. 질소 환경에서 반응액에 Bop(0.332 g)을 넣고 0-5 ℃를 유지하면서 10 분 정도 잘 혼합시켰다. 반응액을 위의 레진이 장착된 펩타이드 반응기에 붓고 10 분간 잘 흔들어 혼합시킨 다음, DIPEA(0.100 ml)를 가하였다. 반응은 상온에서 약 12 시간 가량 진행하며 반응의 진도는 카이저 시험과 분석용 HPLC(펩타이드 분석 조건 1)로 판단하였다. 반응이 완료되었으면 레진을 3x20 ml DMF로 충분히 세척하고, 2 % 히드라진 3x20 ml 을 10-30 분간 처리하여 염기에 약한 Nsc와 ivDde를 제거하였다. ivDde의 제거의 확인은 제거용액과 2 % 히드라진용액을 TLC 각각 점적하여 UV-흡광 정도를 비교하여 판단하였다. 제거가 완전히 이루어지면 레진을 4x20 ml DMF, 4x20 ml DCM, 3x20ml DMF로 여과 세척하고, Fmoc-OSu (20 ml DMF 중 3.37 g) 을 부어 2 시간 동안 반응시켜 diFmoc을 도입하였다. Fmoc의 도입은 정성 카이저 시험법으로 확인하고, 레진을 4x20ml DMF와 4x20ml DCM으로 세척한 다음 질소 가스로 건조하여 4.3 g의 펩타이드 부착 레진을 얻을 수 있었다.

위에서 얻은 레진과 40 ml의 TFA-절단 용액(2.5:2.5:95=TIS:물:TFA)으로 상온에서 2 시간 가량 반응하여 얻은 반응액을 여과하고 차가운 300 ml 에테르에 부 어 펩타이드 침전을 유도 시켰다. 침전을 원심분리기로 분리하고 추가로 2x100 ml 에테르로 세척하고 건조하여 펩타이드 혼합물로 2.6 g을 얻었다. 그 펩타이드 혼합물을 prep-HPLC로 정제하고, 동결건조기로 농축 건조하여 1036 mg의 1,11-diFmoc 연어 칼시토닌을 얻었다.

Maldi Tof; 3877.41, (M+1=3877.44) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 14. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 11-diNsc-연어 칼시토닌의 분절축합 합성

구조: Nsc-Cys¹-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-Lys(Nsc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln²⁰-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly³⁰-Thr-Pro-NH₂ (1,7 디설피드 결합)

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
탈보호반응
Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진 (실시예 13)	-	1.0	0.5	3.57	-
DCM					30
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척당)	-	-	-	-	200
분절 축합
H-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	-	-
Nsc-AA^sCt (1-10)-OH (실시예 13)	1662	1.5	0.75	1.25	-
DIPEA	129.3	3.0	1.5	0.194	0.26
Bop	442.3	1.5	0.75	0.332	-
HOBt	135.1	1.5	0.80	0.108	-
DMF	-	-	-	-	4.0
DCM	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	20.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	20.0
diNsc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Nsc-OSu	372.3	5.0	10.0	3.72	-
절단
TFA	-	-	-	-	38
TIS	-	-	-	-	1.0
물	-	-	-	-	1.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	500

실시예 13에서 합성한 Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진 3.57 g과 Nsc-AA^sCt(1-10)-OH 및 위의 표에 나타낸 용매와 시약을 사용하여 실시예 13과 같은 방법 으로 분절 축합시키고, Nsc-OSu(20 ml DMF 중 3.72 g)로 diNsc를 도입하여 펩타이드 부착 레진 4.8 g을 얻었다. 이 펩타이드 부착 레진과 TFA 절단 용액(2.5:2.5:95=TIS:물:TFA)을 사용하여 얻은 펩타이드 혼합물을 분리 정제하여 1228 mg 의 1,11-diNsc 연어 칼시토닌을 얻었다.

Maldi Tof; 3947.40, (M+1=3947.38) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 15. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 18-diFmoc-연어 칼시토닌의 분절축합 합성

실시예 15-1. 11-N^α-Nsc-11-Boc-18-ivDde-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진의 합성

구조: Nsc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(ivDde)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-링크 아미드 레진

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	-	-	-	-	4.0
DCM^*	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	20.0
DMF(각 세척에 사용)^*	-	-	-	-	20.0

반응 순서: Nsc-Pro, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Ser(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Pro, Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-His(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Glu(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc)

실시예 13의 Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진의 합성과 같은 방법으로 합성하여 6.8 g 의 잘 건조된 레진을 얻었으며 UV-스펙트럼으로 정량하여 레진의 펩타이드 용량이 0.13 mmol/g 으로 결정하였다(UV-스펙트럼 검증; 용량 0.13 mmol/g).

실시예 15-2. Nsc-AA^sCt(1-10)-OH와 Nsc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진의 축합에 의한 1, 18-diFmoc-연어 칼시토닌의 합성

구조: Fmoc-Cys¹-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln²⁰-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly³⁰-Thr-Pro-NH₂ (1,7 디설피드 결합)

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
탈보호반응
Nsc-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	3.85	-
DCM					30
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	200
분절 축합
H-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	-	-
Nsc-AA^sCt (1-10)-OH (실시예 13)	1662	1.5	0.75	1.25	-
DIPEA	129.3	3.0	1.5	0.194	0.26
Bop	442.3	1.5	0.75	0.332	-
HOBt	135.1	1.5	0.80	0.108	-
DMF	-	-	-	-	4.0
DCM	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	20.0
DMF( 각 세척에 사용)	-	-	-	-	20.0
diFmoc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
절단
TFA	-	-	-	-	38
TIS	-	-	-	-	1.0
물	-	-	-	-	1.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	500

위에서 합성한 Nsc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진 3.85 g과 실시예 13에서 합성한 Nsc-AA^sCt(1-10)-OH 1.2 g 및 위의 표에 나타낸 용매와 시약을 사용하여 실 시예 13과 같은 방법으로 분절 축합시키고, Fmoc-OSu로 diFmoc을 도입하여 펩타이드 부착 레진 4.2 g을 얻었다. 이 펩타이드 부착 레진을 TFA 절단 용액(2.5:2.5:95=TIS:물:TFA)을 사용하여 얻은 펩타이드 혼합물을 분리 정제하여 949 mg 의 1,18-diFmoc 연어 칼시토닌을 얻었다.

실시예 16. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 18-diNsc-연어 칼시토닌의 분절축합 합성

구조: Nsc-Cys¹-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Nsc)-Leu-Gln²⁰-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly³⁰-Thr-Pro-NH₂ (1,7 디설피드 결합)

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
탈보호반응
Nsc-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진 (실시예 15)	-	1.0	0.5	3.85	-
DCM					30
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	200
분절 축합
H-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	-	-
Nsc-AA^sCt(1-10)-OH (2.2)	1662	1.5	0.75	1.25	-
DIPEA	129.3	3.0	1.5	0.194	0.26
Bop	442.3	1.5	0.75	0.332	-
HOBt	135.1	1.5	0.80	0.108	-
DMF	-	-	-	-	4.0
DCM	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	20.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	20.0
di-Nsc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Nsc-OSu	372.3	5.0	10.0	3.72	-
절단(레진 1g)
TFA	-	-	-	-	38
TIS	-	-	-	-	1.0
물	-	-	-	-	1.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	500

실시예 15에서 합성한 Nsc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진 3.85 g과 실시예 13에서 합성한 Nsc-AA^sCt(1-10)-OH 1.2 g 및 위의 표에 나타낸 용매와 시약을 사용하 여 실시예 13과 같은 방법으로 분절 축합시키고, Nsc-OSu(20 ml DMF 중 3.72 g)로 diNsc를 도입하여 펩타이드 부착 레진 4.2 g을 얻었다. 이 펩타이드 부착 레진을 TFA 절단 용액(2.5:2.5:95=TIS:물:TFA)을 사용하여 얻은 펩타이드 혼합물을 분리 정제하여 941 mg 의 1,18-diNsc 연어 칼시토닌을 얻었다.

Maldi Tof; 3947.41, (M+1=3947.38) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 17. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 11, 18-diFmoc-연어 칼시토닌의 분절축합 합성

실시예 17-1. 11-N^α-Fmoc-11, 18-di(ivDde)-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진의 합성

구조: Fmoc-Lys(ivDde)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(ivDde)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-링크 아미드 레진

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
링크-아미드 레진	-	1.0	1.0	2.0	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	1.5	-	-
Fmoc-Lys(ivDde)-OH x 2	574.6	1.5	1.5	0.861	-
DIPEA^*	129.3	3.0	3.0	0.387	0.52
Bop^*	442.3	1.5	1.5	0.442	-
HOBt^*	135.1	1.5	1.5	0.135	-
DMF^*	-	-	-	-	4.0
DCM^*	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	20.0
DMF(각 세척에 사용)^*	-	-	-	-	20.0

반응 순서: Nsc-Pro, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Ser(tBu), Nsc-Gly, Nsc-Thr(tBu), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Pro, Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-His(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Glu(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Ser(tBu), Nsc-Leu, Fmoc-Lys(ivDde).

실시예 13과 같은 방법으로 합성하여 6.1 g 의 잘 건조된 레진을 얻었으며 UV-스펙트럼으로 정량하여 레진의 펩타이드 용량이 0.15 mmol/g 으로 결정하였다(UV-스펙트럼 검증; 용량 0.15 mmol/g).

실시예 17-2. Nsc-AA^sCt(1-10)-OH와 Nsc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진의 축합에 의한 11, 18-diFmoc-연어 칼시토닌의 합성

구조: H-Cys¹-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu- Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln²⁰-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly³⁰-Thr-Pro-NH₂ (1,7 디설피드 결합)

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
탈보호반응
Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	3.33	-
DCM					30
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	180
분절 축합
H-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	-	-
Nsc-AA^sCt (1-10)-OH (실시예 13)	1662	1.5	0.75	1.25	-
DIPEA	129.3	3.0	1.5	0.194	0.26
Bop	442.3	1.5	0.75	0.332	-
HOBt	135.1	1.5	0.80	0.108	-
DMF	-	-	-	-	4.0
DCM	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40
DMF( 각 세척에 사용)	-	-	-	-	20.0
N-말단 Boc의 도입
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘					40.0
(Boc)₂O	218.3	5.0	2.5	0.55
DMF					200
di-Fmoc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
절단(레진 1g)
TFA	-	-	-	-	38
TIS	-	-	-	-	1.0
물	-	-	-	-	1.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	500

위에서 합성한 Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진 3.33 g과 실시예 13에서 합성한 Nsc-AA^sCt(1-10)-OH 1.2 g 및 위의 표에 나타낸 용매와 시약을 사용하여 실시예 13과 같은 방법으로 분절 축합시켰다. 축합 반응 후 Nsc를 제거하기 위하여 탈보호용액 (DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)을 2x 20 ml 각 5 분씩 사용하여 달성하였고, 4x 20 ml DMF로 세척한 다음 Boc₂O(20 ml DMF 중 0.55 g)를 과량 넣어 반응시켜 N-말단을 Boc으로 보호한 다음 5x 20 ml DMF로 충분히 세척하였다. 2 % 히드라진 3x20 ml 을 10-30 분간 처리하여 염기에 약한 ivDde를 제거하였으며, ivDde 제거 확인은 반응 용액과 2 % 히드라진 용액을 TLC 각각 점적하여 UV-흡수도를 비교하여 판단하였다. IvDde의 제거가 완전히 이루어졌으면 레진을 4x20 ml DMF, 4x20 ml DCM, 4x20ml DMF로 여과 세척하고, Fmoc-OSu (20 ml DMF 중 3.37 g) 을 부어 2 시간 동안 반응시켜 diFmoc을 도입하였다. Fmoc의 도입은 정성 카이저 시험법으로 확인하고, 레진을 4x20ml DMF와 4x20ml DCM으로 세척한 다음 질소 가스로 건조하여 4.5 g의 펩타이드 부착 레진을 얻을 수 있었다.

위에서 얻은 레진과 40 ml의 TFA-절단 용액(2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)으로 상온에서 2 시간 가량 반응하여 얻은 반응액을 여과하여 차가운 300 ml 에테르에 부어 펩타이드 침전을 유도시켰다. 침전을 원심분리기로 분리하고 추가로 2x100 ml 에테르로 세척하고 건조하여 펩타이드 혼합물로 2.6 g을 얻었다. 그 펩타이드 혼합물을 prep-HPLC로 정제하고, 동결건조기로 농축 건조하여 769 mg의 11,18-diFmoc 연어 칼시토닌을 얻었다.

실시예 18. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 11, 18-diNsc-연어 칼시토닌의 분절축합 합성

구조: H-Cys¹-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys⁷-Val-Leu-Gly¹⁰-Lys(Nsc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Nsc)-Leu-Gln²⁰-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly³⁰-Thr-Pro-NH₂ (1,7 디설피드 결합)

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
탈보호반응
Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진 (실시예 17)	-	1.0	0.5	3.33	-
DCM					30
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	200
분절 축합
H-AA^sCt(11-32)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	-	-
Nsc-AA^sCt (1-10)-OH (실시예 13)	1662	1.5	0.75	1.25	-
DIPEA	129.3	3.0	1.5	0.194	0.26
Bop	442.3	1.5	0.75	0.332	-
HOBt	135.1	1.5	0.80	0.108	-
DMF	-	-	-	-	4.0
DCM	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	20.0
N-말단 Boc의 도입
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘					40
(Boc)₂O	218.3	5.0	2.5	0.55
DMF					200
di-Nsc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Nsc-OSu	372.3	5.0	10.0	3.72	-
절단(레진 1g)
TFA	-	-	-	-	38
TIS	-	-	-	-	1.0
물	-	-	-	-	1.0
디에틸 에테르	-	-	-	-	500

실시예 17에서 합성한 Fmoc-AA^sCt(11-32)-링크 아미드 레진 3.33 g과 실시예 13에서 합성한 Nsc-AA^sCt(1-10)-OH 1.2 g 및 위의 표에 나타낸 용매와 시약을 사용하여 실시예 13과 같은 방법으로 분절 축합시켰다. 실시예 17과 같은 방법으로 Boc(20 ml DMF 중 0.55g)을 도입하고 ivDde를 제거한 다음 Nsc-OSu(20 ml DMF 중 3.72 g)로 diNsc를 도입하여 펩타이드 부착 레진 4.3 g을 얻었다. 이 펩타이드 부착 레진을 TFA 탈루용액을 사용하여 얻은 펩타이드 혼합물을 분리 정제하여 942 mg 의 11,18-diNsc 연어 칼시토닌을 얻었다.

Maldi Tof; 3947.39, (M+1=3947.38) HPLC; 98 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 19. 목표 부위 이외의 측쇄 아민 보호기로 ivDde를 사용하는 1, 12-diFmoc-GRF(1-29)의 분절축합 합성

실시예 19-1. Nsc-AA^GRF(1-15)-OH의 합성

구조: Nsc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(Trt)-Tyr¹⁰(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(ivDde)-Val-Leu-Gly-OH

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
체인 어셈블리(커플링 사이클당^*)
Nsc-Gly-2-클로로트리틸 레진	-	1.0	5.0	8.2	-
Nsc -아미노산^*	-	1.5	7.5	-	-
DIPEA^*	129.3	3.0	15.0	1.94	2.61
Bop^*	442.3	1.5	7.5	3.32	-
HOBt^*	135.1	1.5	7.5	1.01	-
DMF^*	-	-	-	-	4.0
DCM^*	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘^*	-	-	-	-	100
DMF(각 세척에 사용)^*	-	-	-	-	50.0
절단
TFE	-	-	-	-	10
AcOH	-	-	-	-	10
DCM	-	-	-	-	280
에탄올	-	-	-	-	100
물	-	-	-	-	100

반응 순서: Nsc-Leu, Nsc-Val, Fmoc-Lys(ivDde), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Tyr(tBu), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Asn(Trt), Nsc-Thr(tBu), Nsc-Phe, Nsc-Ile, Nsc-Ala, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Ala, Nsc-Tyr(tBu)

실시예 13과 같은 방법으로 합성한 Nsc-Gly-2-CLTR을 200 ml 펩타이드 반응기에 넣고 50 ml DCM을 부어 방치하여 레진이 충분히 부풀도록 하였다. DCM은 여과하여 제거하고 2x50 ml 탈보호용액(DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)으로 각 5 분간 처리하여 Nsc를 제거하였다. 다음 반응을 위하여 5-7 회 가량 DMF로 충분히 세척하였다. 축합반응은 위에 명시된 반응 순서에 따라 실시예 1에서 예시된 바와 같이 Nsc 또는 Fmoc 보호 아미노산(1.5 eq), HOBt(1.5 q), Bop(1.5 eq), DIPEA(3.0 eq)를 사용하여 진행하였다. 반응의 확인은 카이저 시험법으로 진행하며 세척액에 아민의 존재는 클로라닐 시험법으로 확인할 수 있었다.

위에서 얻은 펩타이드 부착 레진은, 펩타이드의 다른 보호기를 유지한 상태로 2-CTRL 레진에서 분리할 수 있는 조건 즉, 100 ml의 DCM:TFE:AcOH(8:1:1)에서 3 시간 동안 처리한 다음 반응액을 여과하여 분리하고 레진을 2x100 ml DCM으로 세척하였다. 반응액과 세척액을 모두 모아 1/4 정도로 농축한 다음, 100 ml 에탄올과 100 ml 물로 희석하여 냉장고에 12 시간 동안 방치하였다. 생성된 고체를 여과하고 잘 건조하여 12.6g Nsc-AA^GRF(1-15)-OH을 얻을 수 있었다.

Maldi Tof; 3144.09, (M+1=3143.95) HPLC; 92 % 이상 (펩타이드 분석 조건 2)

실시예 19-2. Nsc-AA^GRF(16-29)-링크 아미드 레진의 합성

구조: Nsc-Gln(Trt)-Leu-Ser(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Ile-Met-Ser(Trt)-Arg(Pbf)-링크 아미드 레진

반응 순서: Nsc-Arg(pbf), Nsc-Ser(Trt), Nsc-Met, Nsc-Ile, Nsc-Asp(tBu), Nsc-Gln(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Leu, Nsc-Lys(Boc), Nsc-Arg(Pbf), Nsc-Ala, Nsc-Ser(Trt), Nsc-Leu, Nsc-Gln(Trt)

링크 아미드 레진 2.0g 및 위의 표에 나타낸 시약과 용매를 사용하여 예시된 반응 순서에 따라 실시예 1과 같은 방법으로 축합반응과 탈보호 반응을 진행하였다. 축합반응은 카이저 시험법으로 관측하였으며, 세척액에 남아있는 부반응물의 제거는 클로라닐 시험법을 통하여 확인할 수 있었다. 최종적으로 얻은 펩타이드 부착 레진은 6.5 g이었으며 UV-정량을 통하여 반응 용량은 0.12 mmol/g 으로 측정되었다.

실시예 19-3. Nsc-AA^GRF(1-15)-OH와 Nsc-AA^GRF(16-29)-링크 아미드 레진의 축합에 의 한 1,12-diFmoc-GRF(1-29)의 합성

재료	MW	eq	mmol	gram	ml
탈보호반응
Nsc-AA^GRF(16-29)-링크 아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	4.17	-
DCM					30
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	40.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	200
분절 축합
H-AA^GRF(16-29)-링크-아미드 레진(위에서 제조된 것)	-	1.0	0.5	-	-
Nsc-AA^GRF(1-15)-OH (위에서 제조된 것)	3143	1.5	0.75	2.36	-
DIPEA	129.3	3.0	1.5	0.194	0.26
Bop	442.3	1.5	0.75	0.332	-
HOBt	135.1	1.5	0.80	0.108	-
DMSO	-	-	-	-	10
DCM	-	-	-	-	16.0
DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘	-	-	-	-	20.0
DMF(각 세척에 사용)	-	-	-	-	20.0
di-Fmoc의 도입
DMF 중 2% 히드라진 하이드레이트	-	-	-	-	60.0
DMF	-	-	-	-	240
DCM	-	-	-	-	160
Fmoc-OSu	337.3	5.0	10.0	3.37	-
절단(레진 1g)
TFA	-	-	-	-	11.5
TIS	-	-	-	-	0.25
물	-	-	-	-	0.25
디에틸 에테르	-	-	-	-	400

위에서 합성한 Nsc-AA^GRF(16-29)-링크 아미드 레진 4.17g을 적당한 펩타이드 반응기에 장착하였다. 반응기에 30 ml DCM을 부어 레진이 잘 부풀도록 한 다음 용 액은 여과하여 제거하고 2x20 ml 탈보호용액 (DMF 중 1% DBU-20% 피페리딘)으로 각 5 분간 처리하여 Nsc를 제거하였다. 레진을 DMF를 사용하여 충분히 세척한 다음 위에서 합성한 2.36 g의 Nsc-AA^GRF(1-15)-OH을 10 ml DMSO에 녹여 반응기에 넣었다. 반응액에 위 표에 나타낸 HOBt, DIPEA, Bop 등을 가하고 12 시간 동안 반응을 진행시켰다. 반응의 진도는 HPLC로 매 2 시간 간격으로 확인하며 반응이 완료된 것으로 확인되면 DMF를 사용하여 충분히 세척하였다.

분절축합이 끝난 다음 레진을 3x20 ml DMF 중 2% 히드라진으로 각 20 분 가량 처리하여 ivDde와 Nsc를 제거하였다. IvDde의 제거 확인은 실시예 4에서와 같이 TLC를 통하여 확인할 수 있었으며 세척 용매로 충분히 세척하였다. Fmoc-OSu(20 ml DMF 중 3.37 g)로 2 시간 처리하여 1, 12 위치에 각각 Fmoc을 도입하였고 레진을 잘 세척하고 진공 건조하여 4.3 g의 펩타이드 부착 레진을 얻을 수 있었다.

위의 건조된 레진 중 1 g을 취하여 10 ml의 절단 용액 (2.5:2.5:95 =TIS:물:TFA)과 상온에서 약 90분간 반응시키고 TMS-Br과 EDT을 가하여 15 분간 더 반응시켰다. 여과하여 레진을 제거하고 그 레진을 TFA로 2 ml 정도로 세척하였다. 세척액과 여과액을 모아 100 ml 에테르에 부어 생성된 침전을 원심분리기로 침전시키고 추가로 3x50 ml 에테르로 원심 분리하여 세척하였다. 침전물을 질소로 건조하여 654 mg의 건조된 펩타이드 혼합물을 얻었으며, 이 혼합물을 prep-HPLC를 이용하여 정제하고, 동결건조기를 이용하여 농축 건조하여 141 mg의 1,12-diFmoc-GRF(1-29)를 얻을 수 있었다.

MALDI-TOF; 3803.49, (M+1=3803.46) HPLC; 97 % 이상 (펩타이드 분석 조건 1)

실시예 20. 1, 11-diFmoc 연어 칼시토닌을 이용한 Lys¹⁸-PEG 2K-연어 칼시토닌의 제조

1, 11-diFmoc 연어 칼시토닌 10 mg eq를 DMF 1 ml에 녹이고 TEA 0.2%를 가한 후 폴리(에틸렌 글리콜) 2,000 숙신이미딜 프로피오네이트 5당량을 가하여 45℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 피페리딘 50 ㎕를 가하고 5분간 반응시켜 Fmoc을 탈보호시킨 후 10% 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 500 ㎕를 가하여 산성화하였다. 이 반응액을 20 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)으로 10배 희석하여 아래 조건의 이온교환 크로마토그라프법으로 정제하였다. 용출액을 C-18 Sep-Pak 카트리지에 가하여 흡착시킨 후 20 ml의 증류수로 세척하고 5 ml의 70% 아세토니트릴로 용출시켰다. 질소 기류 하에서 용출액의 아세토니트릴을 증발시킨 후 동결건조하였다.

이 시료는 실험예 1에 나타낸 바와 같이 시험하였을 때, 역상 크로마토그람에서 단일 피크를 나타내었으며(도 1-B), MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서도 모노-PEG 2K-연어 칼시토닌 이외에 미반응 연어 칼시토닌, 디-PEG 2K-연어 칼시토닌, 트리-PEG 2K 연어 칼시토닌 등은 확인되지 않았다(도 2). 또한 실험예 1에 나타낸 바와 같이 측정한 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서 Lys¹⁸-PEG 2K- GRF(1-29)의 분절에 해당하는 피크 만을 나타내었다(도 3-B). 이 시료를 증류수에 녹여 실험예 1에 나타낸 역상 크로마토그라프법으로 연어 칼시토닌 표준액을 기준으로 정량하였을 때 수율은 87.6%였다.

[이온교환 크로마토그라프 조건]

컬럼 : TSK SP-5PW (55 x 200 mm, 15 um)(강한 양이온-교환 매질, strong cation-exchange media)

용리액

용리액 A : 20 mM 아세트산나트륨(pH 4.5)

용리액 B : 300 mM 염화나트륨/20 mM 아세트산나트륨(pH 4.5)

용리액 C : 1 M 염화나트륨/20 mM 아세트산나트륨(pH 4.5)

00-10분 : 100% A

10-40분 : 0% A →100% B

40-50분 : 100% C

유속 : 3 ml/분

검출 : UV 215 nm

비교예 1. 연어 칼시토닌을 이용한 모노-PEG 2K-연어 칼시토닌의 제조

연어 칼시토닌 10 mg을 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 5 ml에 녹이고 폴리(에틸렌 글리콜) 2,000 숙신이미딜 프로피오네이트 1.5 당량을 가하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 1 M 글라이신 용액 50 ㎕를 가하고 30분간 방치하여 반응을 종결시켰다. 이 반응액을 아래 조건의 크기-배제(size-exclusion) 크로마토그라프법 으로 5회에 나누어 모노-PEG 접합체를 분리하였다. 이 용출액을 모아서 C-18 Sep-Pak 카트리지에 가하여 흡착시킨 후 20 ml의 증류수로 세척하고 5 ml의 70% 아세토니트릴로 용출시켰다. 질소 기류 하에서 용출액의 아세토니트릴을 증발시킨 후 동결건조하였다.

이 시료는 실험예 1에 나타낸 바와 같이 시험하였을 때, 역상 크로마토그람에서 Cys¹-N^α-PEG 2K-연어 칼시토닌, Lys¹¹- PEG 2K-연어 칼시토닌 및 Lys¹⁸- PEG 2K-연어 칼시토닌의 3개의 피크를 나타내었으며(도 1-A) 피크 면적의 비율은 약 1:1:1이었다. 이 시료를 증류수에 녹여 실험예 1의 역상 크로마토그라프법으로 연어 칼시토닌 표준액을 기준으로 정량하였을 때 수율은 28.4%였다.

[크기-배제 크로마토그라프 조건]

컬럼 : Superose 12 HR 10/30(Amershampharmacia)

용리액 : 10 mM PBS (pH 7.4)

유속 : 0.4 ml/분

검출 : UV 215 nm

실험예 1. Lys¹⁸-PEG 2K-연어 칼시토닌의 확인

실험예 1-1. 역상 크로마토그라프법에 의한 이성체의 확인 및 정량

실시예 20과 비교예 1에서 얻은 시료를 각각 Pharm. Res., 16(6), 813-818, 1999의 방법에 따라 아래 조건의 역상크로마토그라프법으로 비교하였다. 실시예 20 의 시료는 Lys¹⁸- PEG 2k-연어 칼시토닌의 단일 피크 만을 나타내었으나(도 1-B), 비교예 1의 시료는 Cys¹-N^α-PEG 2K-연어 칼시토닌, Lys¹¹- PEG 2K-연어 칼시토닌 및 Lys¹⁸- PEG 2K-연어 칼시토닌의 피크가 약 1:1:1의 비율로 나타났다(도 1-A). 실시예 20의 수율은, 연어 칼시토닌 표준액 피크면적에 대한 Lys¹⁸- PEG 2K-연어 칼시토닌의 피크면적의 비율로 계산하였을 때 87.6%였다. 비교예 1에 있어서 모노-PEG 접합체 전체 수율은, 연어 칼시토닌 표준액 피크면적에 대한 3개 위치이성체 피크의 면적 합계의 비율을 기준으로 계산하였을 때 28.4%였으며, Lys¹⁸-PEG 2K-연어 칼시토닌(피크 2)의 수율은 10.2%였다.

[역상 크로마토그라프 조건]

컬럼 : Lichrospher100 RP-8 (4 mm ID x 250 mm L, 5 um, Merck)

이동상

용리액 A : 0.1 % TFA/D.W.

용리액 B : 0.1 % TFA/AcCN

00-30분 : 36% B →44% B

유속 : 1ml/분

검출 : UV 215 nm

실험예 1-2. MALDI-TOF 질량 분석에 의한 부반응물 및 이성체의 확인

실시예 20의 시료는, 아래의 MALDI-TOF 질량분석 조건에서 분석하였을 때 모노-PEG 2K-연어 칼시토닌에 해당하는 피크 만을 나타내었으며 미반응 연어 칼시토닌, 디-PEG 2K-연어 칼시토닌, 트리-PEG 2K 연어 칼시토닌 등은 확인되지 않았다(도 2). 실시예 20의 시료를 Lys-C 효소로 처리한 펩타이드 분절의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 동일하게 처리한 연어 칼시토닌 표준품과 비교하여 도 3에 나타내었다. Lys-C 효소 처리 시료는, 시료액 10 ㎕에 Lys-C 효소 0.1 ㎍/ml를 함유한 50 mM 트리스 완충액(pH 8.5) 5 ㎕를 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 매트릭스 용액과 1:2로 혼합하여 제조하였다. 연어 칼시토닌의 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(도 3-A)에서는 Pro¹~Gly¹⁰ 분절과 Lys¹¹~His¹⁷ 분절, Lys¹⁸~Pro³² 분절의 피크가 확인되었으나, 실시예 20 시료의 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(도 3-B)에서는 Pro¹~Gly¹⁰분절과 Lys¹¹~Pro³²분절에 PEG에 결합된 분절의 피크 만을 나타내었으며 Lys¹¹~His¹⁷ 분절과 Lys¹⁸~Pro³² 분절은 확인되지 않았다. 이 결과로부터 실시예 20의 시료는 Lys¹⁸-위치에만 PEG가 결합된 Lys¹⁸-모노-PEG 2K-연어 칼시토닌임을 확인할 수 있었다.

[MALDI-TOF 질량분석 조건]

이온 선택: 양이온

매트릭스 용액 : α-시아노-4-하이드록시 신남산 포화용액(0.1 % TFA/50 % AcCN/DW)

모드 : 직선형(linear)

샘플 : 매트릭스 = 1:2

가속 전압(Accelerating voltage) : 25 kV

실시예 21. 1, 11-diFmoc-연어 칼시토닌을 이용한 Lys¹⁸-PEG 1K- 연어 칼시토닌, Lys¹⁸-PEG 5K- 연어 칼시토닌, Lys¹⁸-PEG 10K- 연어 칼시토닌의 제조

1, 11-diFmoc-연어 칼시토닌과 폴리(에틸렌 글리콜) 1,000 숙신이미딜 프로피오네이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 5,000 숙신이미딜 프로피오네이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 10,000 숙신이미딜 프로피오네이트를 사용하여 실시예 20과 동일한 방법으로 Lys¹⁸-PEG 1K- 연어 칼시토닌, Lys¹⁸-PEG 5K- 연어 칼시토닌, Lys¹⁸-PEG 10K-연어 칼시토닌를 각각 제조하였다. 각각의 시료를 실험예 1의 방법으로 정량하였을 때 수율은 각각 86.9%, 81.5%, 82.7%였으며 Lys¹⁸-PEG 접합체 이외의 어떠한 펩타이드 유래물질이나 이성체도 확인되지 않았다.

실시예 22. 1, 11-diNsc-연어 칼시토닌을 이용한 Lys¹⁸-PEG 2K-연어 칼시토닌의 제조

1, 11-diNsc 연어 칼시토닌 10 mg eq를 DMF 1 ml에 녹이고 TEA 0.2%를 가한 후 폴리(에틸렌 글리콜) 2,000 숙신이미딜 프로피오네이트 5당량을 가하여 45℃에 서 1시간 동안 반응시켰다. 피페리딘 100 ㎕를 가하고 5분간 반응시켜 Nsc를 탈보호시킨 후 10% 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 500 ㎕를 가하여 산성화하였다. 이 반응액을 실시예 20과 동일한 조건으로 정제한 후 실험예 1의 방법으로 연어 칼시토닌을 기준으로 정량하였을 때 수율은 84.8%였다. 또한 실험예 1의 방법으로 측정한 역상 크로마토그람과 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서 Lys¹⁸-PEG 2K-연어 칼시토닌을 제외한 어떠한 펩타이드 유래물질이나 이성체도 확인되지 않았다.

실시예 23. 1, 12-diFmoc-GRF(1-29)를 이용한 Lys²¹-PEG 5K-GRF(1-29)의 제조

1, 12-diFmoc-GRF(1-29) 10 mg eq를 DMF 1 ml에 녹이고 TEA 0.2%를 가한 후 폴리(에틸렌 글리콜) 5,000 숙신이미딜 프로피오네이트 5당량을 가하여 45℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 피페리딘 50 ㎕를 가하고 5분간 반응시켜 Fmoc을 탈보호시킨 후 10% 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 500 ㎕를 가하여 산성화하였다. 이 반응액을 실시예 20과 동일한 방법으로 정제하여 PEG 접합 펩타이드를 수득하였다. 이 시료는 실험예 2에 나타낸 바와 같이 시험하였을 때, 역상 크로마토그람에서 단일 피크를 나타내었고(도 4-B), MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서도 모노-PEG 5K-GRF(1-29)의 피크 만을 나타내었으며 미반응 GRF(1-29), 디-PEG 5K-GRF(1-29), 트리-PEG 5K-GRF(1-29) 등은 확인되지 않았다(도 5). 또한 실험예 2에 나타낸 바와 같이 측정한 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서도 Lys²¹-PEG 5K- GRF(1-29)의 분절에 해당하는 피크 만을 나타내었다(도 6-B). 이 시료를 증류수에 녹여 실험예 2의 역상 크로마토그라프법으로 GRF(1-29) 표준액을 기준으로 정량하였을 때 수율은 91.2%였다.

실험예 2. Lys²¹-PEG 5K-GRF(1-29)의 확인

실시예 23의 시료는, 아래 조건에서 측정한 역상 크로마토그람에서 모노-PEG 5K-GRF(1-29)의 단일 피크 만을 나타내었으며(도 4-B), 미반응 GRF(1-29)(도 4-A)나 기타 다른 피크를 나타내지 않았다. 또한 실험예 1과 동일한 방법으로 측정한 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서 모노-PEG 5K-GRF(1-29) 이외의 다른 펩타이드 유래 피크를 나타내지 않았다(도 5). 또한 실험예 1과 동일한 방법으로 측정한 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(도 6-B)에서도 Try¹~Arg¹¹분절과 Lys¹²~Arg²⁹분절에 PEG 5K가 결합된 분절의 피크만을 나타내었으며 GRF(1-29)를 동일한 방법으로 처리하여 측정한 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(도 6-A)에서 나타나는 Lys¹²~Arg²⁰분절이나 Lys²¹~Arg²⁹분절의 피크는 확인되지 않았다. 이러한 결과로부터 실시예 23의 시료는 Lys²¹-위치에만 PEG가 결합된 Lys²¹-모노-PEG 5K-GRF(1-29)임을 확인할 수 있었다.

[역상 크로마토그라프 조건]

컬럼 : Lichrospher100 RP-8 (4 mm ID x 250 mm L, 5 um, Merck)

이동상

용리액 A : 0.1 % TFA/D.W.

용리액 B : 0.1 % TFA/AcCN

00-15분 : 34% B → 55% B

유속 : 1ml/분

검출 : UV 215 nm

실시예 24. 1, 12-diNsc-GRF(1-29)를 이용한 Lys²¹-PEG 1K- GRF(1-29)의 제조

1, 12-diNsc-GRF(1-29) 10 mg eq를 DMF 1 ml에 녹이고 TEA 0.2%를 가한 후 폴리(에틸렌 글리콜) 1,000 숙신이미딜 프로피오네이트 5당량을 가하여 45℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 피페리딘 100 ㎕를 가하고 5분간 반응시켜 Nsc를 탈보호시킨 후 10% 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 500 ㎕를 가하여 산성화하였다. 이 반응액을 실시예 20과 동일한 조건으로 정제한 후 실험예 2의 역상크로마토그라프법으로 GRF(1-29)를 기준으로 정량하였을 때 수율은 92.8%였다. 또한 실험예 1의 방법으로 측정한 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서 모노-PEG 1K-GRF(1-29)의 피크만이 확인되었으며 Lys-C 효소처리 분절의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서도 Lys²¹-PEG 1K-GRF(1-29)의 분절에 해당하는 피크만을 나타내었다.

본 발명에 의해 간단히 산-염기의 조건을 변화시킴으로써 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드를 합성하는 것이 가능하기 때문에, 목표 부위의 아민에 선택적으로 결합된 PEG 접합 펩타이드를 제조하기 위한 종래의 방법에 비해 월등한 고수율로 목적 생성물을 수득할 수 있으며, 과도한 분리 및 정제 공정이 요구되지 않아 경제적이고 종래 제조과정 중 필수적으로 수반되던 부산물의 생성이 억제되어 임상적 용도로 보다 적합한 PEG 접합 펩타이드를 제공할 수 있게 되었다. 따라서 본 발명의 PEG 접합 펩타이드가 임상적 용도로 사용될 때, PEG 접합효과를 극대화시킬 수 있다.

<110> PEGSPHERE CO., LTD. <120> Peptides having protected amines of untargeted sites, methods for production thereof and of specifically conjugated PEG peptides using the same <130> 2003DP101 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Oncorhynchus keta <300> <301> O'Dor, RK Parkes, CO Copp, DH <302> Amino acid composition of salmon calcitonin <303> Can. J. Biochem. <305> 47 <306> 823-825 <307> 1969-01-01 <400> 1 Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu 1 5 10 15 His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro 20 25 30 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <301> Rivier, J. et al. <302> Characterization of a growth hormone-releasing factor from a human pancreatic islet tumor <303> Nature <305> 300 <306> 276-278 <307> 1982-01-01 <400> 2 Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg 20 25

Claims

목표 부위의 측쇄 아민과 목표 부위 이외의 측쇄 아민을 각각 ivDde 또는 Mtt 중 하나와 Boc으로 구분하여 보호하고 N^α-아민을 Fmoc 또는 Nsc로 보호하여 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는, 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드의 제조방법.
제1항에 있어서, N^α-아민을 포함하여 목표 부위 이외의 아민의 아민 보호기를 Fmoc, Nsc, Dde 및 ivDde로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 최종 아민 보호기로 치환하는 단계를 추가로 포함하는, 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드의 제조방법.
제1항에 있어서, N^α-아민을 포함하여 목표 부위 이외의 아민의 아민 보호기를 Boc로 치환하는 단계를 추가로 포함하는, 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩타이드의 합성이 고체상 합성에 의해 이루어지는, 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩타이드를 둘 이상의 분절로 나누어 합성한 후, 상기 분절들을 축합함으로써 이루어지는, 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 목표 부위 이외의 아민이 선택적으로 보호된 펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 펩타이드가 칼시토닌 또는 GRF(1-29)인 펩타이드.
(1) 제6항의 펩타이드와 활성화 PEG를 반응시키는 단계 및

(2) 단계(1)에서 얻어진 화합물의 아민 보호기를 산-염기 탈보호 조건에서 탈보호하는 단계

를 포함하는, 목표 부위의 아민에 PEG가 선택적으로 접합된 선택적 PEG 접합 펩타이드의 제조방법.
제8항에 있어서, 단계(2)의 반응물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 선택적 PEG 접합 펩타이드의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 정제 단계가 반응물을 이온교환크로마토그래피법으로 분리하고 염을 제거한 후 건조하는 것을 포함하는, 선택적 PEG 접합 펩타이드의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 활성화 PEG가 분자량 1,000 내지 40,000의 직쇄 또는 분지형의 하이드록시 또는 메톡시 형태의 알킬화 또는 아실화 PEG인, 선택적 PEG 접합 펩타이드의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 활성화 PEG가 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 숙신이미딜 숙시네이트, 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 숙신이미딜 프로피오네이트, 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 숙신이미딜 카보네이트, 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 숙신이미딜 카바메이트 및 모노-메톡시 폴리(에틸렌글리콜) 트레실레이트로 이루어진 군 중 1종 이상의 성분인, 선택적 PEG 접합 펩타이드의 제조방법.