KR100493795B1 - 혈관활성장펩타이드유사체의합성방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 4개의 보호화 펩타이드 분절로부터의 혈관활성 장 펩타이드(VIP) 유사체 Ac-(1-31)-NH2의 신규한 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 4종의 보호화 펩타이드 분절로부터 혈관활성 장 펩타이드 유사체 Ac-(1-31)-NH2를 합성하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.
혈관활성 장 펩타이드(Vasoactive Intestinal Peptide; VIP)는 기도 점액 분비를 조절하여 항알러지 및 항염증 특성을 갖는 평활근 이완제/기관지 확장제이다. 최근 연구로 개선된 대사 안정성을 가지고 수용체-결합성을 증가시키는 VIP의 유사체가 발견되었다. 이러한 VIP 유사체는 유럽 특허출원 제 92/117,185 호의 청구물질이다.
지금까지, 이러한 VIP 유사체는 고상 합성법을 사용하여 제조되었다. 고상 합성법은 클로로메틸화 수지 또는 하이드록시메틸 수지에, 예를 들어 3급 부틸옥시카보닐(Boc)로 에스테르 결합에 의해 보호한 알파 아미노산을 부착시키는 단계를 포함한다. 후속적으로 보다 많은 아미노산이 수지에 첨가된다. 알파 아미노 Boc 보호기는 산성 조건하에서 제거되고 후속적으로 보호화 아미노산은 단계적으로 커플링(coupling)되어 중간체인 보호화 펩타이드 수지가 수득된다. 블로킹기는 제거되고 펩타이드는 다수의 플루오르화 수소의 절단 반응에 의해 수지로부터 절단된다. 펩타이드의 정제는 두 단계, 즉 (A) 크기별 배제 겔 크로마토그래피 및 (B) 제조용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 수행된다. 이러한 다단계 방법은 시간 소모적이고 표적 펩타이드의 회수가 효율적이지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 VIP 유사체를 합성하기 위한 비교적 간단하고 보다 효율적이고 경제적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 보호화 펩타이드 분절로부터 서열구조식
갖는 VIP 유사체, 즉 Ac-(1-31)-NH2(서열번호 1)의 신규한 합성 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 반응은 보호화 분절의 커플링으로, 보다 바람직하게는 4종의 분절, 즉 펩타이드 분절 I(서열번호 2), 펩타이드 분절 II(서열번호 3), 펩타이드 분절 III(서열번호 4) 및 펩타이드 분절 IV(서열번호 5)의 커플링으로 특징지워진다. 이러한 신규한 방법에 따르면, 기존에 유사체를 고상 합성법으로 제조하는 경우 요구되었던 펩타이드 분절의 제조용 HPLC 정제공정이 필요하지 않으며, 표적 환형 VIP 유사체의 합성 과정 동안 형성된 중간체를 정제할 필요도 없다. 생성된 생성물은 제조용 HPLC을 한번 통과시킴으로써 수집된 후에 최종 단계에서 정제된다.
환형 VIP 유사체 Ac-(1-31)-NH2의 합성을 위한 본 발명의 방법은 두개 이상의 보호화 펩타이드 분절의 커플링을 포함한다. 바람직한 보호화 분절은 4종의 보호화 분절, 즉 하기 서열구조식(I)의 분절 I인 Fmoc-(26-31)-NH2(서열번호 2); 하기 서열구조식(II)의 분절 II인 Fmoc-(19-25)-OH(서열번호 3); 하기 서열구조식(III)의 분절 III인 Fmoc-(9-18)-OH(서열번호 4); 및 하기 서열구조식(IV)의 분절 IV인 Ac-(1-8)-OH(서열번호 5)이다:
4종의 보호화 펩타이드 분절, 즉 펩타이드 분절 I(서열번호 2), 펩타이드 분절 II(서열번호 3), 펩타이드 분절 III(서열번호 IV) 및 펩타이드 분절 IV(서열번호 5)를 커플링시킴으로써 화합물 Ac-(1-31)-NH2를 합성하기 위한 본 발명의 방법은, (a) 펩타이드 분절 I의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고, 탈보호화 펩타이드 분절 I을 보호화 펩타이드 분절 II와 커플링시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계로 생성된 펩타이드의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고, 이것을 보호화 분절 III과 커플링시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계로 생성된 펩타이드의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고, 이것을 보호화 분절 IV와 커플링시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계로 생성된 보호화 펩타이드를 탈보호화하여, 탈보호화 Ac-(1-31)-NH2를 생성하는 단계를 포함한다.
보호화 펩타이드 분절 I 내지 IV는 각각의 커플링 반응의 커플링 효율을 최대화하고 생성물의 라세미화 반응을 최소화시키는 것을 기준으로 선택하였다. 동일한 양의 각각의 분절을 각각의 커플링 반응을 위해 사용하여, 표적 펩타이드로의 경제적인 반응경로를 제공하였다. 각각 커플링 단계 후에 형성된 중간체를, 추가로 정제하지 않고 후속적인 커플링 반응에 바로 사용하였다.
전술한 바와 같이, 고상 합성 후에 생성된 각각의 분절의 순도는 단일 정제 단계 후에 분석용 HPLC로 결정된 바와 같이 약 82% 내지 약 97%였고, 각각의 분절은 추가로 정제하지 않고 환형 VIP 유사체의 합성을 위해 사용하였다.
보다 구체적으로, Ac-(1-31)-NH2(서열번호 1)의 정제된 화합물의 합성 방법은 (a) 펩타이드 분절 I(서열번호 2)의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고 탈보호화 펩타이드 분절 I을 보호화 펩타이드 분절 II(서열번호 3)와 커플링시켜 보호화 중간체 펩타이드 Fmoc-(19-31)-NH2(서열번호 6)를 수득하는 단계; (b) 중간체 Fmoc-(19-31)-NH2의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고, 탈보호화 중간체 Fmoc-(19-31)-NH2를 보호화 분절 III(서열번호 4)과 커플링시켜 보호화 중간체 펩타이드 Fmoc-(9-31)-NH2(서열번호 7)를 수득하는 단계; (c) 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고, 탈보호화 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2를 보호화 분절 IV(서열번호 5)와 커플링시켜 보호화 중간체 펩타이드 Ac-(1-31)-NH2를 수득하는 단계; (d) 보호화 펩타이드 Ac-(1-31)-NH2를 탈보호화하는 단계; 및 (e) 예를 들면 제조용 HPLC로 탈보호화 펩타이드 Ac-(1-31)-NH2를 정제하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 펩타이드를 정의하기 위해 사용된 명명법은 N-말단의 아미노기를 왼쪽에 나타내고 C-말단의 카복실기를 오른쪽에 나타내는, 당 분야에서 전형적으로 사용되는 명명법이다. 천연 아미노산이란, 단백질에서 발견되는 천연적으로 발생한 아미노산, 즉 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His를 의미한다. 아미노산은 이성질체 형태를 가지지만, 다른 언급이 없으면 아미노산의 L 형태를 나타낸다.
하기의 약어 또는 기호는 본원 이외에서 기술하는 것과 더불어 아미노산, 보호기, 용매, 시약 등을 나타내기 위해 사용된다.
VIP 다음의 "-OH" 및 "-NH2"의 접미사는 각각 폴리펩타이드의 유리산 및 폴리펩타이드의 아미드 형태를 나타낸다. 접미사가 사용되지 않은 경우에, 표현법은 양쪽 형태를 나타내고자 하는 것이다.
본원에서 정의하는 바와 같이, 환형 펩타이드는 펩타이드내 하나의 아미노산의 측쇄 카복시 말단이 아미드 결합을 형성함에 의해 팹타이드쇄내 다른 아미노산의 측쇄 아미노 말단에 공유결합되어 있는 펩타이드이다. 환형 펩타이드를 나타내기 위해서 다수의 명명법 및 기호가 사용된다. 예를 들면, 다음과 같다:
a. 사이클로(Lys21-Asp25)-Fmoc-Ala19-Lys(Boc)20-Lys21-Tyr(t-Bu)22-Leu23-Asn24-Asp25
-OH;
b. Fmoc-(19-25)-OH;
c. Fmoc-[Ala19-Asp25]-VIP 사이클로(21→25);
d. [Fmoc-(서열번호 3)-OH];
e. Fmoc-[Ala19-Asp25]-VIP 사이클로 (Lys21→Asp25);
f. [Fmoc-(서열번호 3)-OH];
g.
상기 구조 a 내지 g 및 "서열번호"를 사용하는 표현법은 각각 N-말단에서 수소가 Fmoc기로 치환된 VIP 펩타이드 분절에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 동일한 펩타이드를 나타내며 정의한다. 추가적으로, 21 위치의 리신의 측쇄 카복실과 25 위치의 아스파르트산의 측쇄 아민 사이에서 아미드 결합이 형성되어 환형 펩타이드 분절을 형성한다. 펩타이드 구조에 대한 상기 표현은 동등한 것으로 상호교환할 수 있다.
본 발명의 환형 펩타이드에서, 다른 언급이 없으면 하기 원자 배열이 적용된다.
본 발명의 VIP 유사체를 포함하는 펩타이드 분절은 아미노산 사이의 펩타이드 결합을 형성하기 위한 임의의 공지된 종래 방법으로 쉽게 합성될 수도 있다. 이러한 종래의 방법으로는, 예를 들어 아미노산의 유리 알파 아미노기 또는 보호화 카복실기 또는 다른 반응성 기를 갖는 이들의 잔기와, 다른 아미노산의 일차 유리 카복실기 또는 보호화 아미노기 또는 다른 반응성 기를 갖는 이들의 잔기 사이를 축합 반응시키는 용액상 방법을 들 수 있다.
펩타이드 분절을 포함하는 VIP 유사체를 합성하는 방법은, 목적하는 서열내 각각의 아미노산을 다른 아미노산 또는 그의 잔기에 한번에 하나씩 연속해서 첨가하는 방법 또는 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 분절을 우선 종래의 방법으로 합성하고 그 다음 축합하여 목적하는 펩타이드를 제공하는 방법으로 수행될 수도 있다.
펩타이드 분절을 합성하기 위한 이러한 종래의 방법으로는, 예를 들면 고상 펩타이드 합성 방법을 들 수 있다. 이러한 방법에서, 펩타이드 분절의 합성은 목적하는 아미노산 잔기를 고상 방법의 일반론에 따라 성장하는 펩타이드 쇄에 한번에 하나씩 순차적으로 도입시킴으로써 수행될 수 있다(메리필드(Merrifield, R.B.)의 문헌[J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)], 바라니(Barany) 등의 문헌[The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol.2] 및 그로스(Gross, E.) 및 메인호페르(Meienhofer, J.)의 문헌[Eds. Academic Press 1-284 (1980)] 참고).
보호기가 궁극적으로 제거되기 전에 그 부위에서 화학적인 반응이 발생하는 것을 억제하는 적당한 보호기로 다수의 아미노산 잔기의 반응성 측쇄 기를 보호하는 것은 펩타이드의 화학적인 합성에서 일반적인 것이다. 또한, 카복실기에서는 반응시키고 아미노산 또는 분절의 알파 아미노기는 보호화시켜 이 부위에서 후속적인 반응이 일어나게 하기 위해서 알파 아미노 보호기를 선택적으로 제거하는 것이 공지되어 있다. 고상 합성 방법에 대한 특별한 보호기가 개시되어 있지만, 각각의 아미노산은 용액상 합성에서 각각의 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 보호기에 의해 보호될 수도 있다.
알파 아미노기는 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 벤질옥시카보닐(예: p-클로로벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-비페닐-이소프로필옥시카보닐, 9-플루오레닐-메틸-옥시카보닐(Fmoc) 및 p-메톡시벤질옥시카보닐(Moz))과 같은 방향족 우레탄-형태의 보호기; 및 3급-부톡시옥시카보닐(Boc), 디이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐 및 알릴옥시카보닐과 같은 지방족 우레탄-형태의 보호기로부터 선택된 적당한 보호기로 보호될 수도 있다. Boc는 알파 아미노 보호를 위해 가장 바람직하다.
카복실기는 벤질(OBzl) 또는 저급 알킬, 할로, 니트로, 티오 또는 치환된 티오(예: 저급 알킬(탄소수 1 내지 7) 티오)로 치환된 벤질과 같은 방향족 에스테르, 및 저급 알킬, 3급 부틸(OtBu), 사이클로펜틸, 사이클로헥실(OcHx), 사이클로헵틸 및 9-플루오레닐메틸(OFm)과 같은 지방족 에스테르에서 선택된 적당한 보호기에 의해 보호될 수도 있다. 글루타민산(Glu)에 대해서는 OBzl 및 OFm이 가장 바람직하다. 아스파르트산(Asp)에 대해서는 OChx, OBzl 및 OFm이 가장 바람직하다.
하이드록시기는 벤질(Bzl) 또는 저급 알킬, 할로, 니트로 또는 메톡시로 치환된 벤질(예: 2,6-디클로로벤질(DCB)); 3급-부틸(tBu), 테트라하이드로피라닐 및 트리페닐메틸(트리틸)과 같은 에테르중에서 선택된 적당한 보호기로 보호될 수도 있다. 세린(Ser) 및 트레오닌(Thr)에 대해서는 Bzl이 가장 바람직하다. 티로신(Tyr)에 대해서는 Bzl 및 DCB가 가장 바람직하다.
측쇄 아미노 기는 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 벤질옥시카보닐(예: p-클로로벤질옥시카보닐, 2-클로로벤질옥시카보닐, (2-C1-Z), p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-비페닐-이소프로필-옥시카보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 및 p-메톡시-벤질옥시-카보닐(Moz))과 같은 방향족 우레탄-형태의 보호기; 및 3급-부틸옥시카보닐(Boc), 디이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐 및 알릴옥시카보닐과 같은 지방족 우레탄-형태의 보호기중에서 선택된 적당한 보호기로 보호될 수도 있다. Z가 오르니틴(Orn)을 위해 가장 바람직하다. 2-C1-Z 및 Fmoc가 리신(Lys)을 위해 가장 바람직하다.
니트로, p-톨루엔설포닐(Tos), Z, 아다만틸옥시카보닐 및 Boc 중에서 선택된 적당한 보호기로 구아니디노기를 보호할 수도 있다. Tos가 아르기닌(Arg)을 위해 가장 바람직하다.
측쇄 아미드기는 크산틸(Xan)로 보호될 수도 있다. 아스파라긴(Asn) 및 글루타민(Gln)을 위해서는 보호기가 필요치 않다.
p-톨루엔설포닐(Tos), 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), 트리페닐메틸(트리틸), 2,4-디니트로페닐(Dnp), Boc 및 벤질옥시메틸(Bom)중에서 선택된 적당한 보호기로 이미다졸기를 보호할 수도 있다. Tos 및 Bom이 히스티딘(His)을 위해 가장 바람직하다.
본 발명의 목적을 위해 보호화 아미노산은 예를 들어 Lys(Boc), Glu(OtBu) 및 Tyr(tBu)로 표현될 수도 있다.
메탄올(MeOH), 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2), 아세토니트릴(CH3CN), 에테르, 헥산 및 디메틸 포름아미드(DMF)를 포함하는 모든 용매는 피셔(Fisher) 또는 버딕 및 잭슨(Burdick and Jackson)에서 구입하였다. 트리플루오로아세트산(TFA)은 할로카본(Halocarbon)에서 구입하여 추가적인 정제없이 사용하였다. 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 1,2-에탄디티올(EDT), 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N-하이드록시-숙신이미드(HOSu) 및 티오아니졸은 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리흐 케미칼 캄파니 인코포레이티드(Aldrich Chemical Co., Inc.)에서 구입하였다. 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)은 미국 미시간주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)에서 구입하였고, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 벤조트리아졸-1-일옥시-트리-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)는 리셀류 바이오테크놀로지스(Richelieu Biotechnologies)(캐나다 퀘벡 세인트 히아신트 소재)에서 구입하였다. 2-메톡시-4-알콕시벤질 알콜 코폴리스티렌 1% 디비닐벤젠(사스린 수지)은 바켐 바이오사이언스(Bachem Bioscience)에서 구하였다. Fmoc/tBu-보호화 아미노산은 모든 L-배위이고 미국 캘리포니아주 토란스 소재의 바켐 인코포레이티드(Bachem, Inc.)에서 구입하였다.
분석용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 구배 매스터(Gradient Master) 및 분광광도계 III 자외선-가변파장 검출기가 장착되어 있는 LDC 콘스트라메트릭(Constrametric) IIG상에서 수행하였고, 리크로소브(Lichrosorb) RP-8(5μ) 칼럼(4.6㎜×25㎝)(용리액: 20분 동안 (A) 0.1M NaClO4(pH 2.5)에서 (B) CH3CN으로의 선형 구배를 가짐; 유속: 1㎖/분; 검출: 214㎚)에서 수행하였다. 보호화 중간체, Fmoc-(19-31)-NH2 및 Fmoc-(9-31)-NH2의 HPLC는 리크로소브 RP-8(5μ) 칼럼(4.6㎜×25㎝)(용리액: 20분동안 (A) NaClO4(pH 2.5)에서 40 내지 90%의 (B) CH3CN으로의 선형 구배; 유속 1㎖/분; 검출: 214㎚)에서 수행하였다. 보호화 Ac-(1-31)-NH2의 HPLC는 (B) CH3CN: IPrOH(1:1)(20분 동안 60 내지 95%의 (B)의 선형 구배)를 사용하여 동일한 칼럼에서 수행하였다. 환형 VIP 유사체의 HPLC는 (i) 바이닥(Vydac) C-18칼럼(용리액: 20분동안 (A) H2O(0.1% TFA)에서 15 내지 30%의 (B) CH3CN(0.1% TFA)으로의 선형 구배; 유속: 1㎖/분; 검출: 214㎚), (ii) 조르박 프로틴 플러스(Zorbax Protein Plus) 칼럼(용리액: 20분 동안 (A) H2O (0.1% TFA)에서 20 내지 35%의 (B) CH3CN(0.1% TFA)의 선형 구배; 유속: 2㎖/분; 검출: 210㎚), (iii) 리크로소브 RP-8(5μ) 칼럼(용리액: 20분 동안 (A) NaClO4(pH 2.5)에서 30% 내지 50%의 (B) CH3CN으로 선형 구배; 유속: 1㎖/분; 검출: 206㎚)에서 수행하였다. 제조용 HPLC는 델타 프레프(Delta Prep) 3000 시스템 YMC ODS-A(120Å, 15μ) 칼럼(4.7×50㎝)(용리액: 3시간 동안 (A) H2O(0.1% TFA에서 20 내지 50%의 (B)CH3CN:MeOH(1:1) (0.1%의 TFA)의 선형 구배; 유속: 80㎖/분; 검출: 215 ㎚)상에서 수행하였다.
고속 원자 충격 질량 스펙트럼(FAB-MS)을 베크만(Beckman) VG2AB-1F 또는 VG7OE-HF 질량 분석기로 측정하였다. 아미노산의 분석은 베크만 모델 121M 아미노산 분석기로 수행하였다. 보호화 펩타이드 분절 및 유리 펩타이드는 24시간 동안 110℃에서 봉합되고 내용물을 제거한 튜브에서 6N의 HCl(피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.))로 가수분해하였다.
본 발명에서, 4종의 펩타이드 분절 I 내지 IV는 반복성 고상 합성으로 제조하였다. 합성을 통한 커플링 반응은 카이저(Kaiser) 닌하이드린 시험법으로 관찰하여 반응의 진행 및 완료를 결정하였다(카이저(Kaiser) 등의 문헌[Anal. Biochem., 34, 595-598 (1970)] 참고). 수지의 제조는 UV 분석법으로 하기와 같이 관측하였다:
합성 공정의 임의의 시점에서 보호화 아미노산(AA) 수지(Fmoc-AA-수지)의 치환은 301㎚에서의 N-(9-플루오레닐메틸) 피페리딘의 흡광도(ε=7800)를 사용한다. 수지 4 내지 8㎎을 시험관에 정확하게 칭량한 후, DMF내 20%의 피페리딘 0.5㎖로 처리하였다. 예를 들면, Fmoc-Gly-수지 5.05㎎을 함유한 시험관에 DMF내 20%의 피페리딘 0.5㎖를 첨가한다. Fmoc-Gly-수지를 함유하지 않은 빈 시험관에 DMF내 20%의 피페리딘 0.5㎖를 바탕용액으로 사용한다. 15분이 경과한 후, Fmoc-Gly-수지가 있는 시험관을 2 또는 3회 흔들어서 모든 수지가 피페리딘 용액과 접촉하게 한다. DMF를 양쪽 시험관에 체적이 50㎖가 될 때까지 첨가한다. 바탕용액으로 301㎚에서 분광 광도계를 영점화한다. Fmoc-치환의 흡광도를 하기 수학식 1과 같이 계산하였다:
일반적으로, 펩타이드 수지 분절로부터 Fmoc 보호기를 탈보호화하는 것은 하기와 같은 방법으로 수행되었다:
프로토콜 1: Fmoc-탈보호화
실시예 1 내지 8에서 기술하고 있는 분절 I, Fmoc-(26-31)-NH2의 합성은 XAL-연결 수지를 사용하고 커플링 시약으로 벤조트리아졸-1-일옥시트리스-(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)를 사용하여 C-말단 아미드 분절을 제조함을 포함한다. 일반적으로, 최종 순도를 보장하기 위해서 각 아미노산에 대해 이중 커플링이 수행되었다. 전형적으로, 4 당량의 시약이 1차 커플링을 위해 사용되었고, 2 당량의 시약이 2차 커플링을 위해 사용되었다.
실시예 9 내지 15에서 기술하고 있는 분절 II, Fmoc-(19-25)-OH의 합성은 Fmoc-Asp(O-사스린(Sasrin))-OBzl로 COOH-말단 잔기인 Asp가 β-COOH에서 사스린 수지에 연결되는 보호화 헵타펩타이드의 단계별 고상 회합으로 구성된다. 출발 수지는 71.3%의 수율(분석용 HPLC에 의해 순도가 95% 보다 높은 것을 계산함)로 Fmoc-Leu-OH 및 H-Asn-OH로부터 Fmoc-Leu-OH를 Fmoc-Leu-OSu로 예비활성화시킴으로써 제조된 디펩타이드인 Fmoc-Leu-Asp-OH와 커플링된다. 트리펩타이드 수지는 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 및 Fmoc-Lys(Alloc)-OH로 2회 순환 과정의 고상 합성에 각각 적용된다. 생성된 펜타펩타이드 수지의 분획은 Fmoc-Lys(Boc)-OH 및 Fmoc-Ala-OH로 반복하여 2회 이상의 순환 과정의 고형 합성에 적용된다. 완전히 보호화된 헵타펩타이드 수지의 한 등분을 0.5% TFA-CH2Cl2로 절단하여 HPLC로 한개의 주요한 피크(82% 보다 높은 순도의 것만 계산함)를 수득하였다. Pd[(C6H5)3P]2 및 Bu3SnH로 Lys(Alloc)21-보호기를 선택적으로 제거하고 생성된 부분적으로 보호화된 헵타펩타이드 수지를 0.5% TFA-CH2Cl2로 절단하였다. 수지를 완전히 절단하기 위해서, 10분씩의 절단 과정이 총 5회 필요하였다. 분석용 HPLC를 통해 생성물, 즉 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Try(tBu)-Leu-Asn-Asp(OBzl)의 순도가 80%보다 큰 것으로 측정되었고, 총 수율이 75.7%(출발 수지, 즉 Fmoc-Asp(O-사스린)-OBzl의 적재량과 비교시)로 얻어졌다.
선형 헵타펩타이드의 측쇄에서 측쇄로의 고리화(Lys21에서 Asp25로)는 BOP 및 DIPEA를 사용하여 DMF를 함유하는 용액에서 수행되었고, 1.25시간내에 완료되었다. 이러한 조질의 생성물은 분석용 HPLC를 통해 거의 완전히 선형 헵타펩타이드가 전환됨을 알 수 있었다. 생성된 환형 헵타펩타이드의 단일 정제 단계는 실리카 겔에서 수행되었다. 이러한 정제 단계는 락탐화 동안에 형성된 임의의 올리고머를 제거하였다. 정제된 생성물의 분석용 HPLC를 통해 환형 헵타펩타이드의 순도가 98% 보다 큼이 밝혀졌다. 출발 수지와 비교시 정제한 환형 헵타펩타이드의 총 수율은 37%였다.
C-말단 벤질 에스테르의 최종 탈보호화는 약 6시간 동안에 걸쳐 탄소상 10%의 Pd를 사용한 진동 혼합기(vibromixer)에서의 가수소분해로 이루어졌다. 반응은 분석용 HPLC로 관찰되었고, 최종 생성물, 즉 사이클로(Lys21-Asp25)-Fmoc -Ala19-Lys(Boc)20-Lys21-Tyr(tBu)22-Leu23-Asn24-Asp25-OH를 97% 보다 큰 순도로 33.7%의 총 수율(출발 수지와 비교)로 수득하였다. 최종 생성물의 구조 및 식별은 1H-NMR 분광법으로 확인하였고 아미노산 분석 및 질량 분광법으로 완전히 규명하였다.
실시예 16 내지 26에서 기술하고 있는 분절 III, Fmoc-(9-18)-OH의 반복성 고상 합성 및 실시예 27 내지 36에서 기술하고 있는 분절 IV, Ac-(1-8)-OH는 커플링 시약으로는 BOP를 사용하고, Fmoc 보호기의 탈보호를 위해서는 피페리딘을 사용하여 수행하였다. 측쇄 보호기를 분절에 유지시키기 위해서 매우 산 불안정한 사스린 연결기를 사용하였다. 최종 순도를 보장하기 위해서 각각의 아미노산에 대해 일반적으로 2회의 커플링 반응을 수행하였다. 1차 커플링 반응을 위해서는 2당량의 시약을 사용하였고, 2차 또는 3차 커플링을 위해서는 1 당량의 시약을 사용하였다.
절단 후에 수득된 평균 순도는 펩타이드 분절 III은 91%였고, 펩타이드 분절 IV는 95%였다. 절단 후에 수득된 이러한 펩타이드의 순도는 추가의 정제 과정없이 VIP 유사체의 펩타이드 분절 수렴화 합성에서 직접 사용하기에 만족스럽다.
본 발명의 신규한 환형 VIP 유사체의 합성은 4종의 분절, 즉 분절 I 내지 분절 IV를 커플링시킴으로써 이루어졌고, 하기 반응식 1과 같이 설명된다.
분절 커플링의 각각의 순환과정은 하기 (i) 내지 (iv)와 같은 공정으로 수행되었다:
(i) 하나의 펩타이드 분절의 Fmoc-보호기를 DMF내 10%의 Et2NH로 탈보호화(2시간)하는 단계;
(ii) 헥산-에테르로 세척함으로써 플루오렌을 제거하는 단계;
(iii) 0℃에서 30분 내지 1시간동안 DMF-CH2Cl2내 HBTU(1.2 당량), HOBt(3.6 당량)를 사용하고 25℃에서 3시간동안 DIPEA(4.8 당량)를 사용하여, 탈보호화 펩타이드 분절을 1.0 당량의 또다른 보호화 분절과 커플링시키는 단계; 및
(iv) 증발시키고, CH2Cl2에 용해시키고, 포화 NaHCO3 및 10%의 시트르산으로 추출하는 단계.
바람직한 양태에서, 분절 커플링의 각각의 순환과정은 하기 단계 (i) 내지 (xii)와 같이 수행되었다:
(i) DMF내 10%의 Et2NH로 펩타이드 분절 I의 Fmoc-보호기를 탈보호화(2시간)하는 단계;
(ii) 헥산-에테르로 세척하여 플루오렌을 제거하는 단계;
(iii) 0℃에서 30분 내지 1시간동안 DMF-CH2Cl2내 HBTU(1.2 당량), HOBt(3.6 당량)를 사용하고 25℃에서 3시간동안 DIPEA(4.8 당량)를 사용하여, 탈보호화 펩타이드 분절 I을 1.0 당량의 보호화 펩타이드 분절 II와 커플링시키는 단계;
(iv) 증발시키고, CH2Cl2에 용해시키고, 포화 NaHCO3 및 10%의 시트르산으로 추출하여 보호화 중간체 Fmoc-(19-31)-NH2를 수득하는 단계;
(v) 중간체 Fmoc-(19-31)-NH2의 Fmoc-보호기를 DMF내 10%의 Et2NH로 탈보호화(2시간)하는 단계;
(vi) 헥산-에테르로 세척하여 플루오렌을 제거하는 단계;
(vii) 0℃에서 30분 내지 1시간동안 DMF-CH2Cl2에서 HBTU(1.2 당량), HOBt(3.6 당량)를 사용하고 25℃에서 3시간동안 DIPEA(4.8 당량)를 사용하여, 탈보호화 중간체 Fmoc-(19-31)-NH2를 1.0 당량의 보호화 분절 III과 커플링시키는 단계;
(viii) 증발시키고, CH2Cl2에 용해시키고, 포화 NaHCO3 및 10%의 시트르산으로 추출하여 보호화 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2를 수득하는 단계;
(ix) DMF내 10%의 Et2NH로 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2의 Fmoc-보호기를 탈보호화(2시간)하는 단계;
(x) 헥산-에테르로 세척하여 플루오렌을 제거하는 단계;
(xi) 0℃에서 30분 내지 1시간동안 DMF-CH2Cl2내 HBTU(1.2 당량), HOBt(3.6 당량)를 사용하고 25℃에서 3시간동안 DIPEA(4.8 당량)를 사용하여, 탈보호화 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2를 1.0 당량의 보호화 분절 IV와 커플링시키는 단계; 및
(xii) 증발시키고, CH2Cl2에 용해시키고, 포화 NaHCO3 및 10%의 시트르산으로 추출하여 보호화 중간체 Ac-(1-31)-NH2를 수득하는 단계.
환형 VIP 유사체의 분절 수렴화 합성을 실시예 37 내지 실시예 41을 통해 자세하게 기술한다. 보호화 중간체, Fmoc-(19-31)-NH2, Fmoc-(9-31)-NH2 및 Ac-(1-31)-NH2가 각 반응 혼합물의 순환과정의 주요한 생성물로 수득되었다. 이러한 조질의 보호화 중간체는 추가로 정제되지 않고, 각각의 후속적인 커플링 순환과정에서 이들의 조질한 형태로 사용되었다. 분석용 HPLC를 통해 사용된 조건하에서 출발 물질이 완전히 소모되었음을 확인하였다.
완전히 보호화된 펩타이드 Ac-(1-31)-NH2의 최종 탈보호화는 2시간 동안 25℃에서 TFA(90%), EDT(3%), 티오아니졸(5%) 및 아니졸(2%)과의 반응으로 수행되었다. 분석용 HPLC로 환형 VIP 유사체가 합성의 주요한 생성물(72 내지 75%)임을 확인하였다.
조질의 생성물의 정제는 YMC ODS-A 역상 칼럼(4.7×50㎝)을 사용하여 제조용 HPLC를 한번 통과시킴으로써 수행되었다. 추가로 4.0g이하의 양의 조질의 생성물은 이러한 칼럼을 사용하여 쉽게 수득되었고, 정제화된 환형 VIP 유사체가 8.48g, 즉, 조질의 생성물내 존재하는 환형 VIP 유사체의 총 산정량 9.95g(HPLC분석으로부터)의 85.2%로 단리되었다. 이것은 커플링 반응, 탈보호화 및 정제 단계를 포함하는 합성의 총 수율 23.9%에 상응한다. 이러한 방법으로 제조된 환형 VIP 유사체는 분석용 HPLC 및 모세관 대역 전기영동에 의해 균일한 것(>99%)으로 밝혀졌다. 환형 VIP 유사체의 확인은 FAB 질량 분석기 및 아미노산 분석으로 수행되었다.
실시예 1 내지 8은 보호화 분절 I인 Fmoc-(26-31-NH2), Fmoc-Leu-Lys(Boc)- Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-NH2의 고상 합성을 기술한다. 실시예 9 내지 15는 분절 II인 사이클로(Lys21-Asp25)-Fmoc-Ala19-Lys(Boc)20-Lys21-Tyr(tBu)22-Leu23-Asn24- Asp25-OH의 합성을 기술한다. 실시예 16 내지 26은 보호화 분절 III인 Fmoc-(9-18)-OH, Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc) -Gln-Nle-Ala-OH의 고상 합성을 기술한다. 실시예 27 내지 36은 보호화 분절 IV인 Ac-(1-8)-OH, Ac-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-OH의 고상 합성을 기술한다. 환형 VIP 유사체인 Ac-(1-31)-NH2의 합성은 실시예 37 내지 41에 기술되어 있다.
실시예 1
(3)-XAL-수지의 제조
벤즈하이드릴아민(BHA) 수지 150g(적재량: 0.54 밀리당량/g, 로트 번호 13933)을, 10% 트리에틸아민을 함유하는 NMP 용액 2×1500㎖로 중화시킨 후, DMF 1000㎖, MeOH 1000㎖, CH2Cl2 1000㎖, MeOH 1000㎖ 및 CH2Cl2 3×1000㎖로 세척하였다. (3)-XAL-연결기 96.3g(0.18mol, 2.2 당량), BOP 79.6g(0.18mol) 및 HOBt 24.3g(0.18 mmol)을 NMP 200㎖에 용해시켰다. DIPEA 47.03㎖를 첨가하고 중화된 수지를 함유하는 반응기에 상기 용액을 한번에 첨가하였다. 이 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
일정부분을 취하여 이를 DMF와 MeOH로 세척하였다. XAL-연결기의 적재량을 UV 분석법에 의해 분석하여 0.365mmol/g임을 확인하였다. XAL-수지를 DMF 1000㎖, MeOH 1000㎖, CH2Cl2 1000㎖ 및 MeOH 2×1000㎖로 세척하였다. 커플링되지 않은 BHA 수지를 CH2Cl2내 10% 아세트산 무수물 및 10% DIPEA의 용액 1000㎖로 30분동안 블로킹시켰다. 이어서 수지를 여과시키고 CH2Cl2 1000㎖, MeOH 1000㎖, CH2Cl2 2×1000㎖ 및 MeOH 2×1000㎖로 세척하였다.
실시예 2
Fmoc-Thr(tBu)-XAL-BHA의 제조
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Thr(tBu)-OH 119.2g(300mmol), BOP 132g(300mmol) 및 HOBt 40.5g(300mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 78.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 실시예 1에서 제조된 XAL-수지에 한번에 첨가하였다. 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Thr(tBu)-OH 59.6g(150mmol), BOP 66.3g(150mmol) 및 HOBt 20.2g(150mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 39.2㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하였다. 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Thr(tBu)-XAL-BHA 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 3
Fmoc-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Thr(tBu)-XAL-BHA의 Fmoc 보호기를 탈보호시켰다. Fmoc-Gly-OH를 Thr(tBu)-XAL-BHA에 커플링시키는 방법은 다음과 같았다:
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Gly-OH 89.2g(300mmol), BOP 132g(300mmol) 및 HOBt 40.5g(300mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 78.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Thr(tBu)-XAL-BHA에 한번에 첨가하였다. 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Gly-OH 44.6g(150mmol), BOP 66.3g(150mmol) 및 HOBt 20.2g(150mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 39.2㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 4
Fmoc-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA의 Fmoc 보호기를 탈보호시켰다. Fmoc-Gly-OH를 Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA에 커플링시키는 방법은 다음과 같았다:
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Gly-OH 89.2g(300mmol), BOP 132g(300mmol) 및 HOBt 40.5g(300mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 78.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA수지에 한번에 첨가하였다. 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Gly-OH 44.6g(150mmol), BOP 66.3g(150mmol) 및 HOBt 20.2g(150mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 39.2㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 5
Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA의 Fmoc 보호기를 탈보호시켰다. Fmoc-Lys-(Boc)-OH를 Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA에 커플링시키는 방법은 다음과 같았다:
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Lys(Boc)-OH 140.5g(300mmol), BOP 132g(300mmol) 및 HOBt 40.5g(300mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 78.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA수지에 한번에 첨가하였다. 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Lys(Boc)-OH 70.3g(150mmol), BOP 66.3g(150mmol) 및 HOBt 20.2g(150mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 39.2㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 6
Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Gly- Thr(tBu)-XAL-BHA의 Fmoc 보호기를 탈보호시켰다. Fmoc-Lys(Boc)-OH를 Lys(Boc) -Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA에 커플링시키는 방법은 다음과 같았다:
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Lys(Boc)-OH 140.5g(300mmol), BOP 132g(300mmol) 및 HOBt 40.5g(300mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 78.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA수지에 한번에 첨가하였다. 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Lys(Boc)-OH 70.3g(150mmol), BOP 66.3g(150mmol) 및 HOBt 20.2g(150mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 39.2㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 7
Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly- Thr(tBu)-XAL-BHA의 Fmoc 보호기를 탈보호시켰다. Fmoc-Leu-OH를 Lys(Boc)- Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA에 커플링시키는 방법은 다음과 같았다:
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Leu-OH 106g(300mmol), BOP 132g(300mmol) 및 HOBt 40.5g(300mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 78.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA수지에 한번에 첨가하였다. 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Leu-OH 53g(150mmol), BOP 66.3g(150mmol) 및 HOBt 20.2g(150mmol)의 혼합물을 NMP 1000㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 39.2㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA 수지를 DMF 1000㎖(3분), MeOH 1000㎖(3분), CH2Cl2 1000㎖(3분) 및 MeOH 2×1000㎖(3분)로 세척하였다.
Fmoc-(26-31)-XAL-BHA로도 표현되는 펩타이드 수지 분절, 즉 Fmoc-Leu-Lys (Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-XAL-BHA의 최종 중량은 267g이었다.
실시예 8
Fmoc-(26-31)-XAL-BHA의 절단
500㎖ 들이 둥근바닥 플라스크에, 보호화 Fmoc-(26-31)-XAL-BHA 10g을 CH2Cl2내 0.5% TFA 200㎖와 함께 채웠다. 슬러리를 실온에서 30초동안 교반한 후 여과하였다. 그 즉시, 여액에 피리딘을 첨가하여 pH를 7로 조정하였다. 여액을 실온에서 로토백(rotovac)으로 증발시켰다. 잔류물을 증류수 200㎖과 함께 연마시킨후 에테르 2×200㎖로 세척하였다. 그 결과 수득된 고체 물질을 진공중에서 건조시켜 보호화 Fmoc-(26-31)-NH2를 수득하였다.
그 다음, 여과된 펩타이드 수지를 0.5% TFA 용액 200㎖로 15분동안 5회 이상 처리하고, 이어서 피리딘을 사용하여 pH를 7로 조정하였다. 증발, 연마 및 건조후, 각각의 절단물로부터 취한 샘플을 HPLC로 분석하였다. HPLC 조건은 다음과 같았다: 칼럼: 리크로소브 RP-18, 5m, 25㎝; 용리액: (A) 0.1M HClO4/H2O(pH 2.5), (B)MeCN; 구배: 34% 내지 39% MeCN/20분; 유속: 1㎖/분; 및 검출기: 210㎚ Knau.
순도가 90%를 넘는 모든 펩타이드 분절들을 합하였더니 총 수득량이 3.01g이었다. 합해진 물질의 순도는 94.5%였다.
실시예 9
Fmoc-Asp(O-사스린)-OBzl의 제조
2-메톡시-4-알콕시벤질 알콜 코폴리스티렌 1% 디비닐벤젠 가교결합된 수지(사스린-수지, 25g, 0.96 밀리당량/g, 24 밀리당량)를 DMF(2×500㎖) 및 CH2Cl2(3×500㎖)로 세척하였다. CH2Cl2(400㎖)내 Fmoc-Asp-α-O-벤질 에스테르(35g, 78.56mmole, 3.27 당량)를 첨가하고 기계식 진탕기를 사용하여 진탕하였다. CH2Cl2(100㎖)내 DCC(16.2g, 78.5mmol, 3.27 당량) 용액을 첨가한 후, N-메틸모폴린(3.36㎖, 30mmol, 3.27 당량) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.293g, 2.4mmole, 0.1 당량)를 첨가하고 5시간동안 진탕하였다. 일정부분을 취하여 메탄올로 세척하고 건조시켰다. UV 분석법에 의해 적재량을 측정하였더니 0.60mmol/수지의 g이었다. 이 수지를 DMF(2×500㎖) 및 메탄올(5×500㎖)로 세척하고 진공중에서 건조시켜 Fmoc-Asp(O-사스린-수지)-OBzl 32.8g을 수득하였다. 이 수지 10g 상당량을 DMF(180㎖)에 현탁시키고 DMF(40㎖)중 벤조산 무수물(6.78g, 30mmol, 5 당량) 용액을 첨가한 후 DIPEA(5.22㎖, 30mmol, 5 당량)를 첨가하고 현탁액을 30분동안 진탕하였다. 수지를 DMF(5×200㎖)로 세척하고 치환도를 측정하였더니 0.60mmol/g이었다.
실시예 10
N
α
-Fmoc-L-루실-L-아스파라긴(Fmoc-Leu-Asn-OH)의 합성
Fmoc-L-Leu-OH(10g, 28.32mmol)를 DMF(10㎖)-CH2Cl2(70㎖) 혼합물에 용해시키고 빙욕에서 냉각시켰다. N-하이드록시숙신이미드(3.58g, 31.14mmol, 1.1 당량) 및 디사이클로헥실카보디이미드(6.06g, 31.14mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 1시간동안 및 25℃에서 14시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙욕중에서 냉각시키고 여과시키고 침전을 CH2Cl2(40㎖)로 세척하였다. 여액을 증발 건조시키고 잔류물을 디옥산(80㎖)-H2O(10㎖) 혼합물에 용해시켜 Fmoc-Leu-OSu의 용액을 생성시켰다. Na2CO3(2.50g, 42.28mmol, 1.5 당량)중 무수 L-아스파라긴(5.606g, 42.48mmol, 1.5 당량) 용액을 상기 Fmoc-Leu-OSu 용액에 첨가하였다. 디옥산 10㎖를 추가로 첨가하고 반응 혼합물을 25℃에서 2시간동안 교반하였다. 에틸 아세테이트(200㎖)를 반응 혼합물에 첨가하고, 교반하면서 5% 수성 HCl을 첨가함으로써 pH를 약 2로 조정하였다. EtOAc 층을 분리하고 수성층을 각각 100㎖로 4회 이상 추출하였다. EtOAc 추출물을 합하고 포화 NaCl(100㎖) 및 H2O(3×100㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 가온시키면서(40 내지 45℃) DMF(60㎖)중에 용해시키고 흐림점이 될 때까지 H2O를 첨가하였다. 생성물을 하룻밤 정치시켜 결정화시켰다. 이를 여과시키고, 에테르로 세척하고 DMF-H2O로부터 재결정화시켰다. 디옥산으로부터 동결건조시켜 생성물 9.45g(71.3%)을 수득하였다. NMR 및 FAB 질량 분광분석법을 사용하여 C25H29N3O6의 분자구조식을 확인하였으며 (M+H)+에 대해 측정된 질량은 468.3이었다. 생성물 Fmoc-Leu-Asn-OH의 순도를 분석용 HPLC로 측정한 결과 95%보다 높은 것으로 관찰되었다(도 4). HPLC 조건은 다음과 같았다: 칼럼: 리크로소브 RP-8(5μ); 용리액: (a) 0.1M NaClO4(pH 2.5) - (b) CH3CN; 구배: 40% 내지 80% (B) 20분; 유속: 1㎖/분; 및 검출: 210㎚.
실시예 11
Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys(Alloc)-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-사스린)-OBzl의 제조
다음과 같은 방법에 따라 고상 펩타이드 합성을 수행하였다(수지 1g당 용매 20㎖가 사용되었다): (1) 20% 피페리딘/DMF, 1분; (2) 20% 피페리딘/DMF, 10분; (3) DMF, 4×2분; (4) NMP, 1×2분; (5) 보호화 아미노산을 전술된 바와 같이 커플링시킴; 및 (6) DMF, 3×2분.
출발물질로서 Fmoc-Asp(O-사스린)-OBzl 10g(6.0mmol, 0.60mmol/g)을 사용하여 고상 펩타이드 합성을 전술된 바와 같이 수행하였다. 디펩타이드, Fmoc-Leu-Asn-OH를 H-Asp(O-사스린-수지)-OBzl에 커플링시킴으로써 Fmoc-Leu-Asn -Asp(O-사스린-수지)-OBzl을 하기와 같이 제조하였다:
Fmoc-Asn-Leu-OH(4.2g, 9mmol, 1.5 당량)에, HBTU(3.41g, 9mmol, 1.5 당량), HOBt(4.13g, 27mmol, 4.5 당량), DIPEA(3.135㎖, 18mmol, 3 당량) 및 NMP/CH2Cl2(1:1) 220㎖를 첨가하였다. 혼합물을 1.25시간동안 커플링시켰다. 이 특정 커플링에 있어서, Fmoc-Leu-Asn-OH를 NMP/CH2Cl2(1:1) 160㎖에 용해시켰다. NMP와 CH2Cl2의 혼합 반응이 발열반응이므로, 펩타이드에 첨가하기 전에 용매를 냉각시키고 H-Asp(O-사스린-수지)-OBzl에 첨가한 후, DIPEA 및 HOBt를 첨가하고, 반응 용기를 2분동안 진탕시켰다. 그 다음, 차가운 CH2Cl2 30㎖를 첨가하고 마지막으로 NMP/CH2Cl2(1:1) 20㎖ 및 NMP 10㎖에 용해된 HBTU의 용액을 첨가하였다. NMP:CH2Cl2의 비를 1:1로 유지하였다. 커플링 반응의 pH를 5 내지 6으로 유지하였다.
Fmoc-Tyr(tBu)-OH를 다음과 같이 수지에 커플링시킴으로써 Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-사스린-수지)-OBzl을 제조하였다: Fmoc-Tyr(tBu) -OH(5.4g, 12mmol, 2 당량)에, HBTU(3.4g, 12mmol, 2 당량), HOBt(1.8g, 12mmol, 2 당량), DIPEA(5.75㎖, 33mmol, 5.5 당량) 및 NMP 220㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 수지에 첨가하고 1시간 동안 커플링시켰다.
Fmoc-Lys(Alloc)-OH를 다음과 같이 수지에 커플링시킴으로써 Fmoc-Lys (Alloc)-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-사스린-수지)-OBzl을 제조하였다: Fmoc-Lys (Alloc)-OH(5.4g, 12mmol, 2 당량)에, HBTU(3.4g, 12mmol, 2 당량), HOBt(1.8g, 12mmol, 2 당량), DIPEA(5.75㎖, 33mmol, 5.5 당량) 및 NMP 220㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 수지에 첨가하고 1시간동안 커플링시켰다.
Fmoc-Lys(Alloc)21-OH를 첨가한 후, 수지를 메탄올로 세척하고 건조시켜 보호화 Fmoc-(21-25)-(O-사스린-수지)-OBzl 13.3g(0.45mmol/g, 5.98mmol)을 수득하였다. 이 펩타이드 수지 절반(6.65g, 2.99mmol)을 전술된 바와 같은 고상 합성 순환 과정에 2번 더 적용시키고 다음과 같이 Fmoc-Lys(Boc)-OH와 커플링시켰다: Fmoc-Lys(Boc)-OH(2.8g, 6mmol, 2 당량)에, BOP(2.65g, 6mmol, 2 당량), HOBt(0.918g, 6mmol, 2 당량), DIPEA(3.25㎖, 18.65mmol, 6.2 당량) 및 NMP 120㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 수지에 첨가하여 1시간동안 커플링시킨 후, 다음과 같이 Fmoc-Ala-OH와 커플링시켰다: Fmoc-Ala-OH(1.86g, 6mmol, 2 당량)에, HBTU(2.27g, 6mmol, 2 당량), HOBt(0.90g, 6mmol, 2 당량) 및 NMP 120㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 수지에 첨가하고 1시간 동안 커플링시켰다.
수지를 DMF(3×120㎖) 및 메탄올(4×120㎖)로 세척하고 진공중에서 건조시켜 보호화 Fmoc-(19-25)-(O-사스린-수지)-OBzl 7.3g(0.39mmol/g, 2.84mmol)을 수득하였다. Fmoc-(19-25)-(O-사스린-수지)-OBzl 일부를 0.5% TFA-CH2Cl2로 절단하고 분석용 HPLC로 분석하였더니 순도가 82%보다 높았다.
실시예 12
Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys(Alloc)-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-사스린)-OBzl의 탈보호를 통한 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-사스린)-OBzl의 제조
보호화 헥사펩타이드-수지인 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys(Alloc) -Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-사스린)-OBzl(7.2g, 0.39mmol/g, 2.8mmol)을 CH2Cl2 130㎖에 현탁시키고 헬륨으로 발포시켰다. 아세트산(0.330㎖, 5.75mmol), 비스(트리페닐 포스핀) 팔라듐 디클로라이드(0.138g, 0.196mmol) 및 트리부틸틴 하이드라이드(3.165㎖, 11.9mmol)를 첨가하고, 펩타이드-수지를 헬륨으로 1.5시간동안 발포시키고, 반응 용기를 배수시켰다. 상기 반응을 총 5회 반복하여 Alloc기를 완전히 탈보호시켰다. 펩타이드-수지 일정부분을 0.5% TFA-CH2Cl2로 절단하고 분석용 HPLC로 Alloc기가 완전히 탈보호되었음을 확인하였다. 수지를 CH2Cl2(2×120㎖) 및 메탄올(4×120㎖)로 세척하고, 진공중에서 건조시켜 부분적으로 보호화 펩타이드 수지인 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-사스린)-OBzl 7.1g(0.40 mmol/g, 2.84mmol)을 얻었다.
실시예 13
Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp(O-사스린)-OBzl의 절단을 통한 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl의 제조
실온에서 부분적으로 보호화 Fmoc-(19-25)-사스린-수지-OBzl 7.1g(2.84mmol)을 CH2Cl2(140㎖)내 0.5% TFA로 10분동안 처리하고, 여과하고, 그 즉시 여액에 피리딘을 첨가함으로써 pH를 6 내지 7로 조정하였다. 펩타이드-수지를 전술된 바와 같이 CH2Cl2내 0.5% TFA로 4회 처리하고 여액을 합하고 증발시켰다. 펩타이드를 물과 함께 연마시키고, 여과하고, 물로 충분히 세척하고, 진공중에서 건조시켰다. 조질 펩타이드를 무수 에테르로 세척하고 진공중에서 건조시켜 부분적으로 보호화 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl 3.26g(총수율, 75.7%)을 수득하였고, 이를 분석용 HPLC로 측정하여 순도가 80%보다 높음을 확인하였다.
실시예 14
선형 헵타펩타이드의 고리화를 통한 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn -Asp-OBzl사이클로(Lys21→Lys25)의 제조
DMF 100㎖내 부분적으로 보호화된 선형 헵타펩타이드 Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys -Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OBzl 3.26g(2.271mmol)의 용액을, DMF 500㎖내 BOP 시약 2.0g(4.53mmol, 2 당량) 및 DIPEA 3.16㎖(18.14mmol, 8 당량)의 용액에 자기적으로 교반시키면서 20분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 실온에서 1.25시간 동안 교반시킨 후, 일정부분을 취하고 분석용 HPLC로 선형 펩타이드가 완전히 고리화되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 추가로 1시간동안 교반하고, 아세트산으로 산성화시키고, 증발시켜 부피가 약 20㎖가 되게 하고, 증류수(200㎖)를 첨가하였다. 침전물을 여과에 의해 회수하고, 증류수로 잘 세척하고, 진공중에서 건조시켰다. 생성물을 무수 에테르로 세척하고 건조시켜 보호화 환형 헵타펩타이드 3.0g을 수득하였다. 분석용 HPLC로 선형 펩타이드가 환형 헵타펩타이드로 거의 완전히 전환되었음을 확인하였다. 이 물질을 CH2Cl2내 10%의 메탄올 100㎖에 용해시켰다. 불용성 물질(올리고머)을 셀라이트를 통해 용액을 여과시킴으로써 제거하고, 여액을 증발시켜 조질 보호화 환형 펩타이드 2.85g을 수득하였다. 이 물질을 CH2Cl2 100㎖에 용해시키고, 워터스 프렙 팩 실리카겔 칼럼(Waters Prep Pack Silica Gel Column)(4.7×30㎝, 15 내지 20μ)(유속: 50㎖/분; 검출: 280㎚)에 적재시켰다. 칼럼을 CH2Cl2 500㎖ 및 CH2Cl2(2000㎖)내 5% MeOH로 용리시키고 마지막으로 CH2Cl2내 8% MeOH로 용리시켰다. 순수한 펩타이드(분석용 HPLC에 의해 분석시)를 함유하는 분획을 합하고, 증발 건조시키고, 디옥산으로부터 동결건조시켜 정제된 환형 헵타펩타이드(총수율 37%) 1.445g을 수득하였고, 이를 분석용 HPLC로 분석하였더니 순도가 98%보다 높았다.
실시예 15
Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-OH 사이클로(Lys21→Asp25)의 제조
실시예 14의 완전히 보호화된 환형 헵타펩타이드(1.445g, 1.111mmol)를 헬륨 기류하에서 진동혼합기 플라스크에서 MeOH 60㎖에 용해시켰다. 여기에 탄소상 10% 팔라듐 0.314g을 첨가하고, 반응 혼합물을 진동혼합 장치에서 3.5시간동안 수소화시켰다. 분석용 HPLC로 벤질 에스테르로 완전히 보호화된 헵타펩타이드중 약 30%가 남아있음을 확인하였다. 탄소상 10% 팔라듐 0.2g을 더 첨가하고 수소화를 2.75시간동안 수행하였다. 분석용 HPLC로 벤질기의 탈보호가 완전히 이루어졌음을 확인하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 MeOH로 세척하였다. 여액 및 세척액을 증발시키고 디옥산으로부터 동결건조시켜 환형 헵타펩타이드산 1.225g(91.1%, 총수율: 33.7%)을 수득하였다. 분석용 HPLC로 분석하여 생성물의 순도가 97%보다 높음을 확인하였다. 아미노산 분석법, FAB-MS, 광학 회전 및 1H-NMR 분광분석법을 사용하여 생성물의 특성을 특징화하고 확인하였다.
실시예 16
Fmoc-Ala-사스린 수지의 제조
2-메톡시-4-알콕시벤질 알콜 코폴리스티렌 1% 디비닐벤젠 가교결합된 수지(사스린 수지) 50g을 메틸렌 클로라이드 500㎖ 및 DMF 2×500㎖으로 세척하였다.
Fmoc-Ala-OH 74.6g(240mmol)을 CH2Cl2/DMF(부피비 2:1) 650㎖에 용해시켰다. 용액을 빙욕에서 냉각시키고 DCC 49.5g(240mmol)을 첨가하고, 이어서 4-디메틸아미노 피리딘 1.46g(12mmol) 및 N-메틸모폴린 6.27㎖(60mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 궤도 회전 진탕기(orbital rotary shaker)에서 9시간동안 교반시켰다.
수지를 여과시키고, DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 500㎖(3분)로 세척하였다.
일정부분을 취하고, 건조시켜, UV 분석법에 의해 측정한 결과 적재량이 0.54mmol/g이었다.
이어서 수지를 CH2Cl2 2×500㎖(3분) 및 DMF 500㎖(3분)로 세척하였다. 이어서 수지를 DMF 400㎖에 현탁시키고, 벤조산 무수물 54.3g(240mmol)을 첨가한 후 DMF 100㎖ 및 디이소프로필에틸아민 41.7㎖(240mmol)를 첨가하였다. 현탁액을 30분동안 진탕하였다. 수지를 여과하고, CH2Cl2 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 2×500㎖(3분), DMF 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 17
Fmoc-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Ala-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다. Fmoc-Nle-OH를 Ala-사스린에 커플링시키는 방법은 다음과 같았다:
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Nle-OH 19.08g(54mmol), BOP 23.9g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 14.1㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Ala-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Nle-OH 9.54g(27mmol), BOP 11.9g(27mmol) 및 HOBt 3.65g(27mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖에 용해시키고 실온에서 교반시켰다. DIPEA 7.05㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Nle-Ala-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 18
Fmoc-Gln-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Nle-Ala-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Gln-OH 19.9g(54mmol), BOP 23.9g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 14.1㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Nle-Ala-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Gln-OH 9.9g(27mmol), BOP 11.9g(27mmol) 및 HOBt 3.65g(27mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.05㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Gln-Nle-Ala-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 19
Fmoc-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Gln-Nle-Ala-사스린의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Lys(Boc)-Gln-OH 25.3g(54mmol), BOP 23.9g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 14.1㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Gln-Nle-Ala-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Lys(Boc)-OH 12.7g(27mmol), BOP 11.9g(27mmol) 및 HOBt 3.65g(27mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.05㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 20
Fmoc-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Arg(Pmc)-OH 40.1g(54mmol), BOP 23.9g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 14.1㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Arg(Pmc)-OH 20.1g(27mmol), BOP 11.9g(27mmol) 및 HOBt 3.65g(27mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.05㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 21
Fmoc-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Leu-OH 19.1g(54mmol), BOP 23.9g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 14.1㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Leu-OH 9.6g(27mmol), BOP 11.9g(27mmol) 및 HOBt 3.65g(27mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.05㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 22
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Lys(Boc)-OH 25.4g(54mmol), BOP 23.9g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 14.1㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Lys(Boc)-OH 12.7g(27mmol), BOP 11.9g(27mmol) 및 HOBt 3.65g(27mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.05㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 23
Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc) -Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Thr(tBu)-OH 28.7g(54 mmol), BOP 23.9g(54 mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 14.1㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Thr(tBu)-OH 14.4g(27mmol), BOP 11.9g(27mmol) 및 HOBt 3.65g(27mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.05㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 24
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc) -Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 24.8g(54mmol), BOP 23.9g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 14.1㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 12.4g(27mmol), BOP 11.9g(27mmol) 및 HOBt 3.65g(27mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.05㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle- Ala-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 25
Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc) -Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린의 Fmoc기를 탈보호시키고, 대칭적인 무수물 방법을 통해 Fmoc-Asn-OH를 커플링시켰다.
Fmoc-Asn-OH 19.4g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)를 CH2Cl2 135㎖ 및 DMF 270㎖의 혼합물에 용해시켰다. DCC 11.2g(54 mmol)을 첨가하기 전에 혼합물을 빙욕내에서 교반하였다. 혼합물을 30분동안 교반하고, 여과하고, 여액을 Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-사스린 수지((10-18) 사스린 수지)에 한번에 첨가하였다. 90분후에 커플링을 완결하였다.
생성된 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Asn-OH 19.4g(54mmol) 및 HOBt 7.3g(54mmol)을 CH2Cl2 135㎖ 및 DMF 270㎖의 혼합물에 용해시켰다. 혼합물을 빙욕에서 교반한 후 DCC 11.2g(54mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 여과하고, 여액을 (10-18)-사스린 수지에 한번에 첨가하였다. 90분후에 커플링을 완결하였다.
이어서 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다. 커플링이 완결된 후에는 탈보호를 수행하지 않았다. 생성물인 Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc) -Gln-Nle- Ala-사스린 수지(Fmoc-(9-18)-사스린 수지)의 최종 중량은 112g이었다.
실시예 26
Fmoc-(9-18)-사스린 수지로부터 Fmoc-(9-18)의 절단
Fmoc-(9-18)-사스린 수지 20g을 실온에서 CH2Cl2내 0.2% TFA 400㎖로 1분동안 처리한 후에 여과하였다. 피리딘을 첨가하여 여액의 pH를 7로 조정하였다. 여액을 증발시킨 후, 잔류물을 증류수 50㎖와 함께 연마시킨 후, 에테르 50㎖로 세척하였다. 그 결과 수득된 고체 물질을 진공중에서 건조시켰다.
이어서 여과된 펩타이드 수지를 0.2% TFA 용액 400㎖로 10분동안 6회 이상 처리하고, 이어서 피리딘을 사용하여 pH를 7로 조정하였다. 증발, 연마 및 건조후, HPLC 분석을 수행하였다. 분석용 HPLC 조건은 다음과 같았다: 칼럼: 리크로소브 RP-18, 5m, 25㎝; 용리액: (A) 0.1M HClO4/H2O(pH 2.5), (B) MeCN; 구배: 34% 내지 39% MeCN/20분; 유속: 1㎖/분; 및 검출기: 210㎚ Knau.
순도가 90%를 넘는 모든 펩타이드 분절들을 합하여 총 9.9g을 수득하였다. 펩타이드 수지 112g으로부터 얻은 절단물로부터 수득된 생성물 52g은 91%의 평균 순도를 갖는다.
실시예 27
Fmoc-Glu(OtBu)-사스린 수지의 제조
2-메톡시-4-알콕시벤질 알콜 코폴리스티렌 1% 디비닐벤젠 가교결합된 수지(사스린-수지) 50g을 메틸렌 클로라이드 500㎖ 및 DMF 2×500㎖로 세척하였다.
Fmoc-Glu(OtBu)-OH 102g(240mmol)을 CH2Cl2/DMF(부피비 9:1) 500㎖에 용해시켰다. 용액을 빙욕에서 냉각시키고, 이어서 DCC 49.5g(240mmol)을 CH2Cl2/DMF(9:1) 100㎖에 용해시켜 제조한 DCC 용액을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 여과하여 DCU를 제거하였다. 여액을 상기 세척된 사스린 수지를 첨가한 후에 4-디메틸아미노피리딘 1.46g(12mmol) 및 N-메틸모폴린 6.27㎖(60mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 궤도 회전기에서 9시간동안 교반시켰다.
수지를 여과하고 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 500㎖(3분)로 세척하였다. 일정부분을 취하고, 건조하고, UV 분석법에 의해 적재량을 측정하였더니 0.59mmol/g이었다.
수지를 CH2Cl2 2×500㎖(3분) 및 DMF 500㎖(3분)로 세척하였다. 이어서 수지를 DMF 400㎖에 현탁시키고, 벤조산 무수물 54.3g(240mmol)을 첨가한 후 DMF 100㎖ 및 디이소프로필에틸아민 41.7㎖(240mmol)를 첨가하였다. 현탁액을 30분동안 진탕시켰다. Fmoc-Glu(OtBu)-사스린 수지를 여과하고, CH2Cl2 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 2×500㎖(3분), DMF 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 28
Fmoc-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Glu-(OtBu)-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Thr(tBu)-OH 23.4g(59mmol), BOP 26.1g(59mmol) 및 HOBt 8.0g(59mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 15.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Glu(OtBu)-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.7g(29.5mmol), BOP 13.1g(29.5mmol) 및 HOBt 4.0g(29.5mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.7㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 29
Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Phe-OH 22.8g(59mmol), BOP 26.1g(59mmol) 및 HOBt 8.0g(59mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 15.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
닌하이드린 시험결과 커플링 반응이 완결되어 2차 커플링이 필요하지 않았다.
실시예 30
Fmoc-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Val-OH 20g(59mmol), BOP 26.1g(59mmol) 및 HOBt 8.0g(59mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 15.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Val-OH 10g(29.5mmol), BOP 13.1g(29.5mmol) 및 HOBt 4.0g(29.5mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.7㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 31
Fmoc-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Ala-OH 18.4g(59mmol), BOP 26.1g(59mmol) 및 HOBt 8.0g(59mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 15.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Ala-OH 9.2g(29.5mmol), BOP 13.1g(29.5mmol) 및 HOBt 4.0g(29.5mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.7㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 32
Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Asp(tBu)-OH 24.3g(59mmol), BOP 26.1g(59mmol) 및 HOBt 8.0g(59mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 15.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Asp(OtBu)-OH 12.1g(29.5mmol), BOP 13.1g(29.5mmol) 및 HOBt 4.0g(29.5mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.7㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 33
Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe -Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-Ser(tBu)-OH 22.6g(59mmol), BOP 26.1g(59mmol) 및 HOBt 8.0g(59mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 15.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-Ser(tBu)-OH 11.3g(29.5mmol), BOP 13.1g(29.5mmol) 및 HOBt 4.0g(29.5mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.7㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 34
Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 제조
프로토콜 1에 기술된 방법에 따라 Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala -Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 Fmoc기를 탈보호시켰다.
1차 커플링을 위해서, Fmoc-His(Trt)-OH 36.6g(59mmol), BOP 26.1g(59mmol) 및 HOBt 8.0g(59mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 15.4㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
2차 커플링을 위해서, Fmoc-His(Trt)-OH 18.3g(29.5mmol), BOP 13.1g(29.5mmol) 및 HOBt 4.0g(29.5mmol)의 혼합물을 NMP 400㎖중에 실온에서 교반시키면서 용해시켰다. DIPEA 7.7㎖를 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반시켰다. 그 결과 수득한 시약을 수지에 한번에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반시켰다.
여과 후, Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)- Glu(OtBu)-사스린 수지를 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하였다.
실시예 35
His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 아세틸화
프로토콜 1에 기술된 탈보호 방법에 따라 보호화 펩타이드 수지인 Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린을 피페리딘 2×25%로 처리하고 세척하였다. Fmoc기를 탈보호한 후에, N-말단 아민을 다음과 같이 아세틸화하였다:
CH2Cl2 800㎖내 Ac2O 100㎖와 DIPEA 100㎖의 용액을 펩타이드 수지에 첨가하고 반응을 90분동안 진행시켰다.
수지를 여과하고, 이어서 DMF 500㎖(3분), MeOH 500㎖(3분), CH2Cl2 500㎖(3분) 및 MeOH 2×500㎖(3분)로 세척하고, 진공중에서 건조시켜, 보호화 Ac-(1-8)-사스린 수지인 Ac-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 110g을 수득하였다.
실시예 36
Ac-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-사스린 수지의 절단
실온에서 보호화 Ac-(1-8)-사스린 수지 20g을 CH2Cl2내 0.5% TEA 400㎖으로 1분동안 처리한 후 여과하였다. 여액에 피리딘을 첨가하여 pH를 7로 조정하였다. 여액을 증발시키고 잔류물을 증류수 50㎖과 함께 연마시킨 후 에테르 50㎖로 세척하였다. 그 결과 수득된 고체 물질을 진공중에서 건조시켰다. 이어서 여과된 펩타이드 수지를 0.5% TFA 용액 400㎖로 10분동안 3회 이상 처리하고, 피리딘을 사용하여 pH를 7로 조정하였다. 증발, 연마 및 건조후, HPLC로 분석하였다.
여과된 펩타이드 수지를 0.3% TFA 용액 400㎖로 10분동안 3회 이상 처리하고, 피리딘을 사용하여 pH를 7로 조정하였다. 증발, 연마 및 건조후, 펩타이드 분절을 HPLC로 분석하였다. 분석용 HPLC 조건은 다음과 같았다: 칼럼: 리크로소브 RP-18, 5m, 25㎝; 용리액: (a) 0.1M HClO4/H2O(pH 2.5), (b) MeCN; 구배: 34% 내지 39% MeCN/20분; 유속: 1㎖/분; 및 검출기: 210㎚ Knau.
순도가 90%를 넘는 모든 펩타이드 분절들을 합하여 총 10.8g을 수득하였다. 펩타이드 수지 110g의 절단으로 수득된 생성물은 총 46g이고, 95%의 평균 순도를 갖는다.
실시예 37
Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-NH
2
(보호화 Fmoc-(19-31)-NH
2
)의 합성
분절 I인 Fmoc-(26-31)-NH2(서열번호 2)(8.91g, 8.24mmol)를 DMF중 10% 디에틸아민 90㎖에 용해시키고, 실온에서 2시간동안 교반하였다. 아민 및 용매를 진공중에서 건조시키고 잔류물을 헥산과 에테르의 4:1 혼합물과 함께 연마시키고, 여과기상의 고체 생성물을 수거하고 헥산과 에테르의 4:1 혼합물로 세척하여 H-(26-31)-NH2 7.0g을 무색 분말로서 수득하였다(수율 98.9%).
분절 II인 Fmoc-(19-25)-OH(서열번호 3)(9.89g, 8.15mmol), H-(26-31)-NH (7.0g, 8.15mmol), HOBt(4.49g, 29.3mmol) 및 DIPEA(6.81㎖, 39.1mmol)을 DMF/CH2Cl2(1:1) 120㎖에 용해시키고, 빙수욕에서 교반하였다. 고체 HBTU(3.71g, 9.78mmol)를 10분에 걸쳐 상기 용액에 적가하였다. 0℃에서 30분동안 계속 교반시키고 이어서 실온에서 3시간동안 계속 교반시켰다. 용액을 진공중에서 증발시켜 용매를 제거하고 잔류물을 CH2Cl2에 용해시켰다. 이 용액을 포화 NaHCO3(3회), 10% 수성 시트르산(2회), 물 및 염수로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 여액을 증발시켜 조질 보호화 중간체인 Fmoc-(19-31)-NH2 17.4g(수율 100%)을 무색 고체로서 수득하였다. 분석용 HPLC로 측정된 순도는 약 70%이었다.
실시예 38
Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-NH
2
(보호화 Fmoc -(9-31)-NH
2
)의 합성
Fmoc-(19-31)-NH2(17.4g)를 DMF내 10% 디에틸아민 90㎖에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 아민 및 용매를 진공중에서 제거하고 잔류물을 헥산과 에테르의 3:1 혼합물과 함께 연마시키고, 여과기상의 고체 생성물을 수거하여 헥산과 에테르의 3:1 혼합물로 세척하여 H-(19-31)-NH2 16.67g을 무색 고체로서 수득하였다(수율 100%).
Fmoc-(9-18)-OH(서열번호 4)(16.59g, 8.15mmol), H-(19-31) -NH2(16.67g), HOBt(4.49g, 29.3mmol) 및 DIPEA(6.81㎖, 39.1mmol)을 DMF/CH2Cl2(2:1) 150㎖에 용해시키고(용액은 약간 혼탁하였다), 빙수욕에서 교반하였다. HBTU(3.70g, 9.78mmol)를 10분에 걸쳐 상기 용액에 적가하였다. 용액은 투명해졌으며, 0℃에서 30분동안 계속 교반시키고 이어서 실온에서 3시간동안 계속 교반시켰다. 용액을 진공중에서 증발시켜 용매를 제거하고 잔류물을 CH2Cl2에 용해시켰다. 이 용액을 포화 NaHCO3(3회), 10% 수성 시트르산(2회), 물 및 염수로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 여액을 진공중에서 증발시켜 조질의 보호화 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2 24.77g(수율 약 79%)을 무색 고체로서 수득하였다. 분석용 HPLC로 측정된 순도는 약 60%이었다.
실시예 39
Ac-His(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Val-Phe-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys(Boc)-Lys-Tyr(tBu)-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Gly-Thr(tBu)-NH
2
(보호화 Fmoc-(1-31)-NH
2
)의 합성
Fmoc-(9-31)-NH2(24.77g)를 DMF중 10% 디에틸아민 100㎖에 용해시키고, 실온에서 2시간동안 교반하였다. 아민 및 용매를 진공중에서 제거하고 잔류물을 헥산과 에테르의 3:1 혼합물과 함께 연마시키고, 여과기에서 고체 생성물을 수거하고 헥산과 에테르의 3:1 혼합물로 세척하여 H-(9-31)-NH2 22.56g을 무색 고체로서 수득하였다(수율 96.7%).
DMF/CH2Cl2(1:1) 200㎖내 H-(9-31)-NH2(22.56g, 6.22mmol), Ac-(1-8) OH(서열번호 5)(8.79g, 6.22mmol), HOBt(3.43g, 22.38mmol) 및 DIPEA(5.19㎖, 29.84mmol)의 용액을 빙수욕중에서 교반하면서 상기 용액에 HBTU(2.83g, 7.46mmol)를 10분에 걸쳐 적가하였다. 용액을 0℃에서 30분동안 계속 교반시키고 이어서 실온에서 3시간동안 계속 교반시켰다. 용액을 증발시키고 잔류물을 CH2Cl2에 용해시켰다. 이 용액을 포화 NaHCO3(3회), 10% 수성 시트르산(2회), 물 및 염수로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 여액을 증발시켜 조질의 보호화 Ac-(1-31)-NH2 29.54g(수율 약 72.2%)을 무색 고체로서 수득하였다. 분석용 HPLC로 측정된 순도는 78%이었다.
실시예 40
보호화 Ac-(1-31)-NH
2
의 탈보호를 통한 환형 VIP 유사체의 합성
보호화 Ac-(1-31)-NH2(29.54g)를 TFA(135㎖), EDT(4.5㎖), 티오아니졸(7.5㎖) 및 아니졸(3㎖)의 혼합물 150㎖에 용해시키고, 실온에서 2시간동안 교반하였다 이 용액을 증발시켜 TFA를 제거하고 미리 냉각된 에테르 500㎖에 부어 침전을 형성시키고 이를 수거하고 에테르로 잘 세척하였다. 생성물을 진공중에서 건조시켜 Ac-(1-31)-NH2 25.5g을 무색 분말로서 얻었고, HPLC로 측정된 이 물질의 순도는 약 72 내지 75%이었다.
실시예 41
환형 VIP 유사체의 정제
조질 펩타이드 Ac-(1-31)-NH2의 정제를 델타 프렙 3000 시스템(Delta Prep 3000 System)에서 제조용 HPLC로 수회 수행하였다. 환형 VIP 유사체의 표준물에 대해 조박스 프로텍션 플러스(Zorbax Protection Plus) 칼럼의 조질 생성물의 일정부분을 정량적 HPLC 분석하여, 조질 생성물 25.5g중에 유사체 9.95g이 존재함을 확인하였다. 전형적인 수행에서는 펩타이드(4g)를 0.1% TFA/H2O 200㎖에 용해시키고 YMC ODS-A(120Å, 15μ) 칼럼(4.7×50㎝)에 적용하였다. 이동상은 (A) 0.1% TFA/H2O-(B) 0.1% TFA(50% MeOH-CH3CN)이었다. 구배 용리를 80㎖/분의 유속으로 20%(B)(10분)에서 출발하여 20% 내지 50%(B)(180분)으로 수행하였다. UV 검출을 215㎚에서 수행하였다. 주요 피이크를 함유하는 분획을 수거하고 분석용 HPLC로 평가하였다. 고순도로 판단된 분획을 합하고, 차가운 핑거(finger) 회전 증발기상에서 농축시키고, 동결건조시켜 환형 VIP 유사체 Ac-(1-31)-NH2 1.2g을 수득하였다. 조질의 생성물을 동일한 방법에 의해 처리하여 정제된 환형 VIP 유사체 총 8.48g(회수율 85.2%)을 수득하였다(총수율 23.9%). 분석용 HPLC 분석법 및 모세관 전기영동법에 의해 생성물의 순도가 99%보다 높음을 확인하였다. 생성물을, 아미노산 분석, FAB-MS, 광학적 회전, 자외선 흡광도 및 원편광 이색성에 의해 확인하고 특징지었다.
서열 목록
(1) 서열들에 관한 일반 정보
(i) 출원인:
(A) 명칭: 에프 호프만-라 롯슈 아크티엔게젤샤프트
(B) 가: 그렌짜헤르스트라세 124
(C) 시: 바즐
(D) 주: BS
(E) 국가: 스위스
(F) 우편 번호(ZIP): 체하-4010
(G) 전화: 061-6885108
(H) 팩스: 061- 6881395
(I) 텔렉스: 962292/965542 hlr ch
(ii) 발명의 명칭: VIP 유사체의 합성 방법
(iii) 서열의 갯수: 7
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: 애플 매킨토시
(C) 운용 시스템: 애플 매킨토시
(D) 소프트 웨어: 워드 5.1
(v) 현출원 정보:
출원 번호: EP
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 추정서열: NO
(ix) 특징적 부분
(A) 특징을 나타내는 기호: 변형된 부위
(B) 존재위치: 21..25
(D) 기타 정보: "LYS21에서 ASP25로의 측쇄 고리화"
(xi) 서열 표시: 서열번호 1:
[서열 1]
(2) 서열번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 6 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 추정서열: NO
(xi) 서열 표시: 서열번호 2:
[서열 2]
(2) 서열번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 7 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 추정서열: NO
(ix) 특징적 부분
(A) 특징을 나타내는 기호: 변형된 부위
(B) 존재위치: 3..7
(D) 기타 정보: "LYS3 및 ASP7의 측쇄가 고리화됨"
(xi) 서열 표시: 서열번호 3:
[서열 3]
(2) 서열번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 10 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 추정서열: NO
(xi) 서열 표시: 서열번호 4:
[서열 4]
(2) 서열번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 8 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 추정서열: NO
(xi) 서열 표시: 서열번호 5:
[서열 5]
(2) 서열번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 13 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 추정서열: NO
(ix) 특징적 부분
(A) 특징을 나타내는 기호: 변형된 부위
(B) 존재위치: 3..7
(D) 기타 정보: "LYS3 및 ASP7의 측쇄가 고리화됨"
(xi) 서열 표시: 서열번호 6:
[서열 6]
(2) 서열번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 추정서열: NO
(xi) 서열 표시: 서열번호 7:
[서열 7]
Claims (13)
- 펩타이드 분절 I(서열번호 2), 펩타이드 분절 II(서열번호 3), 펩타이드 분절 III(서열번호 4) 및 펩타이드 분절 IV(서열번호 5)로 구성된 보호화 펩타이드 분절을 커플링(coupling)시킴을 포함하는, Ac-(1-31)-NH2(서열번호 1)의 합성 방법.
- 제 1 항에 있어서,(a) 펩타이드 분절 I의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고, 탈보호화 펩타이드 분절 I을 보호화 펩타이드 분절 II와 커플링시키는 단계;(b) (a) 단계에서 생성된 펩타이드의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고, 이것을 보호화 분절 III과 커플링시키는 단계;(c) (b) 단계에서 생성된 펩타이드의 Fmoc-보호기를 탈보호화하고, 이것을 보호화 분절 IV와 커플링시키는 단계; 및(d) (c) 단계에서 생성된 보호화 펩타이드를 탈보호화하여 탈보호화 Ac-(1-31)-NH2를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,탈보호화 펩타이드 Ac-(1-31)-NH2를 정제함을 추가로 포함하는 방법.
- 제 3 항에 있어서,정제를 제조용 HPLC에 의해 수행하는 방법.
- 하기 단계 (a) 내지 (h)를 포함하는, 펩타이드 분절 I(서열번호 2), 펩타이드 분절 II(서열번호 3), 펩타이드 분절 III(서열번호 4) 및 펩타이드 분절 IV(서열번호 5)의 4종의 Fmoc 보호화 펩타이드 분절을 커플링시킴으로써 정제된 화합물 Ac-(1-31)-NH2(서열번호 1)를 합성하는 방법:(a) 펩타이드 분절 I의 Fmoc-보호기를 탈보호화하는 단계;(b) 탈보호화 펩타이드 분절 I을 보호화 펩타이드 분절 II와 커플링시켜 보호화 중간체 Fmoc-(19-31)-NH2를 수득하는 단계;(c) 중간체 Fmoc-(19-31)-NH2의 Fmoc-보호기를 탈보호화하는 단계;(d) 탈보호화 중간체 Fmoc-(19-31)-NH2를 보호화 분절 III과 커플링시켜 보호화 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2를 수득하는 단계;(e) 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2의 Fmoc-보호기를 탈보호화하는 단계;(f) 탈보호화 중간체 Fmoc-(9-31)-NH2를 보호화 분절 IV와 커플링시켜 보호화 중간체 Ac-(1-31)-NH2를 수득하는 단계;(g) 보호화 펩타이드 Ac-(1-31)-NH2를 탈보호화하는 단계; 및(h) 탈보호화 펩타이드 Ac-(1-31)-NH2를 정제하는 단계.
- 제 5 항에 있어서,(h) 단계중의 정제를 제조용 HPLC로 수행하는 방법.
- 제 5 항에 있어서,펩타이드 분절 및 중간체의 Fmoc-보호기를 DMF내 10%의 Et2NH로 탈보호화하는 방법.
- 제 5 항에 있어서,탈보호화한 후, 펩타이드 분절 및 중간체를 헥산-에테르로 세척함으로써 플루오렌을 제거하는 방법.
- 제 5 항에 있어서,탈보호화 펩타이드 분절 및 중간체를,(a) DMF-CH2Cl2내 HBTU 및 HOBt, 및 DIPEA를 사용하여 1.0 당량의 보호화 펩타이드 분절과 커플링시키고;(b) 증발시키고, CH2Cl2에 용해시키고;(c) 포화 NaHCO3 및 10%의 시트르산으로 추출하는 방법.
- 제 9 항에 있어서,1.2 당량의 HBTU, 3.6 당량의 HOBt 및 4.8 당량의 DIPEA를 사용하여 0℃에서 30분 내지 1시간 및 25℃에서 3시간동안 커플링을 수행하는 방법.
- Fmoc-(19-31)-NH2(서열번호 6) 및 Fmoc-(9-31)-NH2(서열번호 7)로 구성된 그룹에서 선택된 펩타이드.
- Fmoc-(26-31)-NH2(서열번호 2), Fmoc-(19-25)-OH(서열번호 3), Fmoc-(9-18)-OH(서열번호 4) 및 Ac-(1-8)-OH(서열번호 5)로 구성된 그룹에서 선택된 보호화 펩타이드.
- 제 12 항에 있어서,서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4가 탈보호화된 펩타이드.
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