BG61125B2

BG61125B2 - Циклични вазоактивни пептидни аналози

Info

Publication number: BG61125B2
Application number: BG098608A
Authority: BG
Inventors: David Bolin; Margaret O'donnell
Original assignee: F. Hoffmann - La Roche Ag
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 1996-11-29
Also published as: IL103396A0; MX9205822A; FI924580A; US5677419A; FI20002041A; FI111646B; HU9203194D0; FI924580A0; ZA927724B; SK308692A3; IL103396A; JPH05213996A; NO923929L; CN1198841C; SK279399B6; JP2515473B2; EP0536741A2; DK0536741T3; CZ281818B6; NO980377L

Abstract

Изобретението се отнася до вазоактивни пептидни (viр) аналози, в които крайната странична карбоксилна верига на една аминокиселина в пептидната верига е прикачена ковалентно към крайната странична аминоверига на друга аминокиселина в пептидната верига чрез образуването на амидна връзка. Ковалентното свързване между двата аминокиселинни остатъка в пептидната верига води до образуването на пръстенна структура. Изобретението се отнася и до получаването на циклични вазоактивни пептиди и фармацевтични състави, които ги съдържат, приложими при лечението на бронхотрахеални констриктивни заболявания. 82 претенции

Description

Област на техниката t

Изобретението се отнася до циклични пептиди, които са вазоактивни пептидни аналози (VIP), и до фармацевтични препарати, съдържащи тези циклични пептиди. Фармацевтичните препарати могат да се използват за лечение на заболявания, причинени от бронхотрахеално свиване.

Вазоактивни интестинални пептиди (VIP) за първи път са открити, изолирани и пречистени от свински черва.(патент us 3 879 371). Пептидът има двадесет и осем (28) аминокиселини и показва широка хомология със секретин и глюкагон.(Carlquist et al, Horm. Metab. Res., 14, 28-29 (1982). Аминокиселинната последователност на VIP е следната:

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Arg-LeuArg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-beu-Asn-Ser-IleLeu-Asn-NH₂ |SEQ ID NO:1)-NH₂|

Вазоактивният интестинален пептид (VIP) е известен, че проявява широк спектър от биологична активност по отношение на гастроинтестиналния тракт и циркулаторната система. По отношение на неговата подобност с гастроинтестиналните хормони, установено е, че VIP стимулира панкреатичната и жлъчната секреция, хепатитната гликогенолиза, секрецията на глюкагон и инсулин и активира освобождаването на бикарбонат от панкреаса.(Kerrins С. and Said, S.I., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 142, 1014-1017 (1972); Domschke, S. et al., Gastroenterology, 73, 487-480 (1977).

Неврони, съдържащи VIP, са били локализирани чрез имуноопити в клетки на ендокринната и екзокринната системи, червата и гладките мускули. (Polak, J.M. et al., Gut, 15, 720-724 (1974). Намерено е, че VIP е невроефектор, причиняващ освобождаването на

X някои хормони, включително пролактин.(Frawley, L.S. et al.,

Neuroendocrinology, 33, 79-83 (1981), ТИРОКСИН (Ahren, В.

(1980) et al.,Nature, 287, 343-345 И инсулин И глюкагон (Schebalin,

М. et al, Am.J. Physiology Ε.,232,197-200, (1977). СЪЩО e yctfaновено, че VIP стимулира освобождаването на ренин от бъбреците in vivo и. * in vitro . (Porter, J.P. et al., Neuroendocrinology, 36, 404-408 (1983). Намерено е, че VIP присъства в нервите и нервните окончания на дихателните пътища на много животински видове и човека.(Dey,R.D. and Said S.I., Fed.Proc., 39,1062 (1980);Said, S.I., et al, Ann.N.Y.Acad.Sci.,221, 103-114 (1974).

Кардиоваскуларният и бронхопулмонарният ефект на VIP представлява интересуващото той е силен вазодилататор и релаксант на гладките мускули, действащ върху периферните, пулмонарните и коронароваскуларните (Said S.I.,et al.,Clin.Res.,20,29,(1972

VIP има също вазодилататорен ефект върху церебралните кръвоносни СЪДОВе.(Lee T.J. and Berszin, I., Science, 224, 898-900 (1984).

In vitro изследвания са показали, че вазоактивният интестинален пептид (VIP), приложен повърхностно върху церебралните артерии, индуцирайки вазодилатация, което води до заключение, че VIP е възможен преносител за церебрална вазодилатация.(Lee т. and Saito

A., Science, 224, 898-901 (1984).

VIP може да има регулиращи ефекти върху имунната система. o'Dorisio et al са показали, че VIP може да модулира пролиферацията И миграцията на лимфоцити.(J. Immunol.,135, 792s-796s (1985).

След като е установено, че VIP успокоява гладката мускулатура и обикновено присъства в дихателните тъкани, както беше посочено, предполага се, че VIP може да бъде ендогенен медиатор на релаксацията на бронхиалната гладка мускулатура.(Dey,R.D. and Said S.I., Fed. Proc., 39, 1962, (1980).Показа’” е, че тъкани от астматични

Λ пациенти не съдържат имунореактивен VIP в сравнение с тъкан от нормални пациенти. Това може да бъде индикация за загуба на VIP или вазоактивни интестинални пептидни нервни влакна, които имат

I връзка СЪС заболяването ОТ астма.(Ollerrnshaw S. et al, New England J. Med., 320, 1244-1248 (1989). Изпитването in vitro и in vivo показва, че VIP успокоява трахеалната гладка мускулатура и предпазва срещу бронхоконстрикторни агенти като хистамин и простагландин F_2a. (Wasserman,М.A. et al, Vasoactive Intestinal Peptide S.I.Said, ed. Raven Press, N.Y., 1982, 177-184; Said, S.I. et al, Ann. N.Y.Acad.Sci., 221, 103-114 (1974). Когато се прилага венозно, VIP има предпазващо действие срещу бронхоконстрикторни агенти като хистамин, простагландин F_2a, левкотриени, тромбоцитен активиращ фактор,както и антиген-индуцирани бронхоконстриктори.(Said S.I. et al., supra, (1982). Също така VIP инхибира мукозната секреция в дихателните тъкани у човека in vitro .(Coles, S.J. et al, Am. Rev. Respir. Dis., 124, 531-536 (1981).

Когато се прилага при хора чрез интравенозна инфузия на астматични пациенти, VIP показва предизвикване на повишаване в пика на скоростта на експираторния поток и той проявява защитно действие срещу бронходилатация, предизвикана от хистамин.(Morice, А.н. and Sever, P.S., Peptides, 7, 279-280 (1986); Morice, A. et al, The Lancet, 11,1225-1227 (1983). Пулмонарните ефекти на VIP, които се наблюдават при тази интравенозна инфузия, обаче са придружени от кардиоваскуларни странични ефекти, най-често хипотензия и тахикардия и също лицева червенина /енхимоза/. Когато се прилага в интравенозни дози, които не предизвикват кардиоваскуларни ефекти, VIP не променя специфичната проводимост на дихателните пътища. (Palmer, J.B.D., et al., Thorax, 41, 663-666 (1986).Отсъствието на активност се обяснява като дължащо се на прилаганата ниска доза и вероятно на бързото разпадане на съединението.

н

Когато се прилага при хора под форма на аерозол, чистият VIP има само маргинална ефективност при защита срещу бронхоконстрикция, индуцирана от хистамин.(Altieri et al., Pharmacologist, 25,123, k

(1983). Намерено е, че VIP няма значителен ефект върху основните параметри на дихателните пътища, но има защитно действие срещу >> бронхоконстрикция, индуцирана от хистамин, когато се прилага при хора чрез инхалиране.(Barnes, P.J. and Dixon, C.M.S., Am.Rev. Respir.Dis., 130, 162-166 (1984). Когато се прилага аерозолно, съобщава се, че VIP не показва тахикардийни или хипотензивни ефекти, заедно С бронходилатацията.(Said, S.I. et al, Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, ed. Raven Press, N.Y., 1928, 185-191).

Поради интересната и добра клинично приложима биологична активност на VIP, субстанцията е била обект на различни описани програми за синтезиране с цел за подобряване на едни или други свойства на тази молекула. Takeyama et al. описват аналози на VIP със заместител от глутаминова киселина за аспартамовата киселина в позиция 8. Това съединение е установено, че е по-слабо активно ОТ ЧИСТИЯ YIP.(Chem. Pharm. Bull., 28, 2265-2269 (1980) Wendlberger et al. са описали получаването на аналог на У1Р_?имащ норлевцинов заместител на метионин в позиция 17.(Peptide, Proc., 16th Eur.Pept. Symp., 290-295 (1980). Установено е, че пептидът е еднакво активен с естествения VIP по отношение на неговата способност да измества радиойодиран VIP от препарати на чернодробна мебрана. watts и Wooton са съобщили серия от линейни и циклични фрагменти на VIP, съдържащи между 6 и 12 остатъка от естествената последователност.( ЕР 184309, ЕР 325044; US 4 737 487 US 4 866 039). Turner et al. съобщават, че фрагментът VIP(10-28) е¹ антагонист на VIP. ( Peptides, 7, 849-854 (1986).Съобщава се също за ^г”’бституирани аналози {4-CI-D-Phe 6, Leu¹⁷]_-VIP ,които образуУ ват връзка с рецептора на VIP и антагонизират активността на VIP. (Pandol, S. et al., Gastrointest.Liver Physiol., 13, G553-G557(1986).

Gozes et al.съобщават, че аналогът |LySp Pro2»Argj, Argp Pro₅, Tyr_&I-VIP е конкурентен инхибитор на VIP, свързвайки се с неговия рецептор при глиалните клетки. (Endocrinology, 125,29452949 (1989). Robberecht et al. описват някои аналози на VIP с D-остатъци, субституирани при N-остатъците на естествения VIP (Peptides, 9, 339-345 (1988). Всички тези аналози се свързват по-слабо с рецептора на VIP и показват по-ниска активност от естествения VIP при с-АМР активирането. Tachibana и Ito са описали някои VIP-аналози на прекурсорната молекула.(Peptide Chem. Т. Shiba и S.Sakakibara ИЗД. Prot. Res. Foundation,

1988,481-486, Патент JP 1083012, патент US 4 822 774). Тези съединения са показали, че са 1-3 пъти по-активни бронходилататори от VIP и имат 1-2 пъти по-висока степен на хипотензивна активност. Musso et al. също са описали някои VIP-аналози, имащи заместители в позиции 6-7, 9-13, 15-17, и 19-28.(Biochemistry, 27, 8174-8181 (1988). , US 4 835 252). Тези съединения са показали еднаква или по-ниска активност от естествения VIP при свързването с рецептора на VIP и при биологичния отговор. Bartfai et al. са съобщили серия от множествено субституирани |Leu¹⁷ | -VIP аналози.( РСТ заявка 89/05857).

Освец това синтетични вазоактивни интестинални пептидни аналози са описани и в патент ЕР 405 242. Тук линейните деривати съдържат заместители на избрани амино киселини в специфични позиции на VIP молекулата.

Настоящото изобретение се отнася до циклични вазоактивни пептидни аналози. Цикличен пептид е този, в който крайната странична карбокси верига при една амино киселина в пептидната верига е свързана ковалентно към страничната крайна амино верига на амидна61125 та връзка. Ковалентното свързване между два аминокиселинни остатъка в пептидната верига води до получаването на пръстенна структура.

Биологичната активност на цикличните пептиди може да бъде

I съществено различна в сравнение с тази на сродните линейни аналози. Цикличните пептиди по строеж са по-устойчиви,като притежават по-добре дефинирани структури.Тези изменения се отразяват в биологичните профили на цикличните пептиди. Циклизирането на пептидния аналог може да разшири трайността на действието на пептида в следствие на повишаването на устойчивостта, което го прави по-малко чувствителен на химическо и ензимно разпадане. Бионаличността на цикличните пептиди може да се повиши чрез изменения във физическите свойства на пептида в резултат на придаване устойчивост на структурата. Освен това, добре дефинираният строеж на цикличния пептид може да позволи по-голяма специфичност по отношение на предвиждания рецептор, отколкото тази на линейните пептиди, като по тоди начин се редуцира тенденцията за нежелани биологични активности, съпровождащи желаната такава.

Изобретението се отнася до нови циклични пептиди с формула (

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asn-Tyr-Thr-R^j“ I

Leu-Arg-Lys-Gin-R^-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- |X-(SEQ ID ΝΟί2)-Υ|

В КОЯТО Rg е Asp, Glu ИЛИ Lys; ^e Arg, Lys, Orn или Asp;

e Met ИЛИ Nle; R2& e lie ИЛИ Vai; R2g e Asn ИЛИ Thr; X e водородо или хидролизируема защитна амино група; У е хидрокси или хидролизируема защитна карбокси група; или техни фармацевтично приемливи соли.

Предпочитани са пептиди с формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Kg-Asn-Tyr-Thr-R₁₂“

Leu-Ajrg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- |X-(SEQ ID N0:3)-Y|

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y

В която X, Y, Rg u R₁₂ имат горните значения от формула I. Изобретението също се отнася до нови циклични пептиди с формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asp-Tyr-Thr-Lys- ¹¹

Leu-Arg-Lys-Gln-R^-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- |X-(SEQ ID NO:4)-Y|

Leu-Asp-Ser-R₂g-Leu-R2g-Y

В КОЯТО Rg е Asp ИЛИ Asn; R^? e Met ИЛИ Nle; R₂g e lie ИЛИ Vai; R_2ge Asn или Thr; x е водород или хидролизируема защитна амино група; У е хидрокси или хидролизируема защитна карбокси група, или техни фармацевтично приемливи соли.

Предпочитан е пептид с формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asn-Asp-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- |X-(SEQ ID NO:5)-Y|

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y в която X и У имат значенията, дадени във формула II.

Изобретението също се отнася до нови циклични пептиди с формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys I-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Leu-Arg-Lys-Glu-R^y-Ala-Val-Lys-Lys-TyrLeu-Asp-Ser-R₂₆ -Leu-R _2g-Y $

|X-(SEQ ID NO:6)-Y|

В КОЯТО R₁₇ е Met ИЛИ Nle; R_2& е Не ИЛИ Vai; R_2g e Asn ИЛИ

Thr; x е водород или хидролизируема защитна амино група; У е хидрокси или хидролизируемазащитна карбокси група, или техни фармацевтично приемливи соли.

Предпочитани са пептиди с формула

I—I

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Glu-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- |X-(SEQ ID NO:7)-Y|

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y в която X и У имат значенията, посочени във формула III.

Изобретението се отнася също до нови циклични пептиди с формула

в която R₁₂ е Arg или Lys; R_1? е Met или Nle; R₂₆ е Не или Vai; R_2g e Asn или Thr; X е водород или хидролизируема защитна амино група; У е хидроксил или хидролизируема защитна карбокси група, или техни фармацевтично приемливи соли.

Предпочитани са пептиди с формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysI-----------------------------------Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- |X-(SEQ ID NO:9)-Y| ί--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Leu-Asp-Ser-val-Leu-Thr-Y ft която X и У имат значенията_?както във формула IV.

X-Rj-R2“Asp-Ala-Val-R^-Asn-RjQ-Thr-Rj2“

Leu-Arg-Lys-R^g-R^y-Ala-R|g-Lys-Lys-R22”

Leu-R2£”Asp-R2£-R27^Κ28^

В КОЯТО R₁ e His, N-CH^-Ala; R₂ e Ser ИЛИ Ala |X-(SEQ ID N0:10)-Y| ^R6 θ

където q е циклохексил нисш алкил или арил нисш алкил^₈ е Asp,Glu ИЛИ AIa;R₁₀ е Туг ИЛИ R_& ;R₁₂ θ Arg ИЛИ Lys ; R₁₆ e Gin ИЛИ Ala;

r₁₇ e Met, Nle или AIa;R₁₉ e Vai или Ala; r₂₂е Туг или R₆ ; R₂₄ e Asn или Ala; R₂₆ e He, Vai ИЛИ Leu; R₂₇ e Leu или Lys;R₂₈ e Asn,Thr или Lys; X е водород или хидролизируема защитна амино група; У е хидроксил, хидролизируема защитна карбок си група ИЛИ R₂₉-R₃q-R₃₁-Z; R₂₉ е Gly ИЛИ Ala; R^q е Gly или Ala; R₃₁ e Ala, Met, Cys (Acm) или Thr; Z е хидроксил или хидролизируема защитна карбокси група, или техни фармацевтично приемливи соли.

За предпочитане q е

където η = 1,2; и Xg независимо са водород, СН₃, CF₃, NO₂, NH₂, N(CH₃)₂, NHCOCH₃, nhcoc_&h₅

Предпочитани о са бензил, р-флуоробензил,

OH, OCH₃,F, С1,1, ИЛИ С(СН₃)₃. ι-аминобензил, рхидроксибензил, о-метил, 1-метилнафтил или 2-метилнафтил. Найпредпочитано Q е бензил.

Предпочитани са пептиди със следващите формули

V

X-RrRz-Asp-AJa-VakRs-Thr-Re-Asn-RwThr-RizI-------------Leu-Arg-Lys-R ίβ-R 17-Ala-R ig-Lys-Lys-R^ [X-(SEQ

ID N0:11)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R27-'^nir-^Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R₆-17ir-R₈-Asn-R₁o-Thr-R₁₂Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-A!a-R₁₉-Lys-Lys-R22[X-(SEQ

ID N0:12)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R2rT+^rY

X-R ]-R₂-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-LeuLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ

ID N0:13)-YJ

Leu-R24-Asp-Val-R27-T+^r‘Y

X-R₁-R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R₈-Asn-R₁o-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ri9-Lys-Lys-R22[X-(SEQ

ID N0:14)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R27-T^hr-Y

X-R_rR2-Asp-Ala-Val-R₈-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-A!a-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ

ID N0:15)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R₂7-Thr-Y

X-RfR^Asp-Ala-Val-Re-Thr-Ra-Asn-Rio-Thr-R^ ι I

Leu-Arg-Lys-Ri6-Ri7-Ala-Rig-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:16)-Y]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R i -R₂-Asp-Ala-VakR₆-Thr-R₈-Asn-R, _O-Thr-LysLeu-Arg-Lys-R_ie-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys-R22Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R₁-R2-Asp-Ala-VaLR_fi-Thr-R₈-Asr>-R₁o-Thr-LysLeu-Arg-Lys-R-ie-Nle-Ala-Rig-Lys-Lys-R^I

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R^Rz-Asp-Ala-VakRe-Thr-Rg-Asn-R^-Thr-LysLeu-Arg-Lys-R i₆-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R^Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R₁-R2’Asp-Ala-Val-R6-Thr-R8-Asn-R₁o-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:17)-Y] [X-(SEQ ID N0:18)-Y] [X-(SEQ ID N0:19)-Y]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID N0:70-Y]

ID NO;71-Y|

ID NO:72-Y|

ID NO:73-Y| ^19» ^22’ ^24’

X-R₁-Ser-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-R_g-Asn-R₁₀-Thr-LysI---------------------ί

Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22~ Leu-R2^-Asp-Leu-Lys-Lys-Y (X-SEQ

X-R^-Ala-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Rg-Asn-R^Q-Thr-LysI---------------------------1

Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22 Leu-R2^-Asp-Leu-Lys-Lys-Y |X-SEQ

X-R^-R2-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Rg-Asn-R₁Q-Thr-LysI I

Leu-Arg-Lys-Ala-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22“ Leu-R24“Asp-Leu-Lys-Lys-Y |X-SEQ където X, Y, R^, R2, Κθ, Rg, ^R12’ ^16* ^17’ u r₂₇ имат значенията,както във формула V.

12 17

Най-предпочитаният цикличен пептид е Ac-|Glu ,Lys ,Nle , *ι 19 a 25 , 26 _т 27,28 29,30 311 _{ντυ ΤΙΜνπΛ}

Ala , Asp , Leu , Lys ’ , Gly ’ , Thr |-VIP ЦИКЛО

I (Lys²¹—**Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂|.

Пептидите, описани в изобретението, ’ продуцират забавено релаксиране на трахеобронхиалната гладка мускулатура без странични кардиоваскуларни ефекти и така могат да се използват за лечение на бронхоконстриктивни заболявания като астма.

Изобретението се отнася до нови аналози на вазоактивния интестинален пептид (VIP), които имат повишена продължителна бронходилатираща активност без забележими странични ефекти.

Използваният тук термин ’’нисш алкил” включва наситени алифатни въглеводородни групи с права или разклонена верига с 1-6 въглеродни атома. Предпочитана нисша алкилна група е метил.

Използваният термин арил” означава мононуклеарни ароматни въглеводородни групи като фенил, който може да е незаместен или заместен в една или повече позиции с нисш алкил, нисш алкокси, амино, нитро, моно- или ди-нисш алкиламино, нисш алкиламидо или фениламидо. Арил също означава полинуклеарни арилни групи като нафтил, който може да бъде заместен с един или повече от гореспоменатите радикали. Предпочитани арилни групи са фенил, незаместен или моносубституиран с флуор, или незаместен нафтил.

Използваният тук X е субституент на азота от амино групата на амино-терминална аминокиселина, и У е заместител в карбонилната група на карбокси-терминалната амино киселина. X може да бъде водород или хидролизируема амино защитна група. У може да бъде хидроксил или хидролизируема карбокси защитна група.

По отношение на термините хидролизируема амино защитна група и хидролизируема карбокси защитна група всяка подходяща защитна група, която може да бъде отделена чрез хидролиза, може да бъде използвана в съответствие с това изобретение. Примери за такива групи са изброени по-нататък. Предпочитани амино защитни групи са където Хд е нисш алкил или хало нисш алкил. Най-предпочитани от тях са тези, в които Хд е С^^алкил или халоС-^алкил.

Предпочитани карбокси защитни групи са нисши алкилни естери, ПН₂ и нисши алкилни амиди като особено предпочитани са С^^алкилни естери, ПН₂ и С^алкилни амиди.

Изобретението се отнася до нови циклични пептиди с формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asn-Tyr-Thr-R^2^_ I

Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇-_Ai_a_va-Lys-Lys-Tyr-

|X-(SEQ ID ⁷:2)-Y| където Rg е Asp, Glu ИЛИ Lys; ^e Arg, Lys, Orn ИЛИ Asp; ’17 e Met ИЛИ Nle; R₂₆ e He ИЛИ Vai; R₂g e Asn ИЛИ Thr; X е ВОДОРОД или хидролизируема амино защитна група, У е хидроксил или хидролиI зируема карбокси защитна група, или техни фармацевтично приемливи соли.

Предпочитани са пептиди с формула I

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asn-Tyr-Thr-R^₂Leu-Arg-lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr|X-(SEQ ID NO:3)-Y|

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y където χ, Y, R_o „ _D имат значенията както във формула I. о и *

Настоящото изобретение се отнася също до нови циклични пептиди с формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asp-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-R^-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-

|X-(SEQ ID NO:4)-Y| където Rg e Asp ИЛИ Asn; R^? e Met ИЛИ Nle; R₂g е Не ИЛИ Vai; R_2g e Asn или Thr; X е водород или хидролизируема амино защитна група; У е хидроксил или хидролизируема карбокси защитна група, или техни фармацевтично приемливи соли.

Предпочитани са пептиди с формулата i I

X-His^Ser~Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asn-Asp-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gin-Nle-Ala-Vai-Lys-Lys-Tyr|X-(SEQ ID NO:5)-Y|

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y където X и У са,както във формула II.

Изобретението се отнася също до нови циклични пептиди с фор мула

Leu-Asp-Ser-R2g-Leu-R₂g-Y където R₁₇ е Met или Nle; R_2& е Не ИЛИ Vai;

х е водород или хидролизируема амино защитна

R₂g е Asn ИЛИ Thr; група; У е хидроксил или хидролизируема карбокси защитна група, или техни фармацевтич но приемливи соли.

Предпочитани пептиди са с формула _____

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysI

Leu-Arg-Lys-Glu-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr|X-(SEQ ID NO:7)-Y| Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y където X и У имат значения както във формула III.

Изобретението се отнася също до нови циклични пептиди със следващата формула IV

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-R.^^- ('

Leu-Arg-Lys-Gln-R^y

I----------------------------------Ala-Val-Lys-Lys-Tyr|X-(SEQ ID NO:8)-Y|

Leu-Asp-Ser-R

Leu-R₂g“Y където R₁₂ e Arg или Lys; R^₇ e Met или Nle; R₂g е Не ИЛИ Vai; R₂g e Asn или Thr; X е водород или хидролизируема амино защитна група; У е хидроксил или хидролизируема карбокси защитна групаг или техни фармацевтично приемливи соли.

Предпочитани са пептиди с формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysI--------------------------------1

Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-TyrLeu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y |X-(SEQ ID NO:9)-Y|

където X и У имат значенията_?както във формула IV.

Изобретението също се отнася до циклични пептиди с формула

X-R* -R^-Asp-Ala-Val-R^-Thr-Rfl-Asn-R.j θ-Thr-R

Leu-Arg-Lys-R^^-R^₂-Ala-R^g-Lys-Lys-R₂₂Г '

Leu-R₂₄~Asp-R₂^“R₂y-R₂g“Y където R₁ е His, N-CH^-Ala; R₉ e Ser ИЛИ Ala;R< e N j ζ ° H

12“ ί >

йъдето Q е циклохексил нисш алкил или арил нисш алкил,*R_Re Asp,Glu или ^R17 ^е е Asn

R₂₈ е щитна

Ala; R_1q

Met, Nle или Ala;

Asn, Thr e Tyr ИЛИ R^; Arg ИЛИ Lys; R^^e Gin ИЛИ Ala;

ИЛИ Ala; R-₁₉ e Vai ИЛИ Ala; R₂₂ e Tyr ИЛИ R_&; R₂₄R₂£ e He, Vai или. Leu R₂₂ e Leu ИЛИ Lys; -* или Lys; X е водород или хидролизируема амино загрупа, У е хидроксил, хидролизируема карбокси защитна група или R_2g-R₃₀-R₃₁-Z; R₂₉ e Gly ИЛИ Ala; R^_o e Gly ИЛИ Ala; R₃₁ e Ala, Met, Cys (Acm) или Thr: z е хидрокси или хидролизируема карбокси защитна група, или техни фармацевтично приемливи соли.

СН₃, CF₃, NO₂, NH₂, N(CH₃)₂, NHCOCH₃, NHCOC₆H₅ ИЛИ c(ch₃)₃

Предпочитани значения на Q са бензил, р-флуоробензил, р-амино бензил, р-хидроксибензил, о-метил, 1-метил нафтил или 2-метилнафтил. Най-предпочитано q е бензил.

Предпочитани са пептиди с формула

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val

Leu-Arg-Lys-R^g-R^y

Leu-R₂₄-Asp-Val-R₂₂

-Rg-Thr-Rg-Asn-R^Q

-Ala-R^g-Lys-Lys-R

|X-(SEQ ID NO:11)-Y|

-Thr-¥

X-Ri-R^Asp-Ala-Val-Re-Thr-RB-Asn-Rio'Ibr-RigLeu-Arg-Lys- R i β-N le-Ala-R 19-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:12)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R2rThr-Y

X-R, -R₂-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-R_e-Asn-R! _O-Thr-LeuLeu-Arg-Lys-R₁6*Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:13)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R2rTb^r-^Y

X-Ri^-Asp-Ala-VaPRs-Thr-Re-Asn-RKrThr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Rig-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:14)-Y]

Ееи-Р24-Азр-\/а1-Р2гТЬ^г-^у

X-R₁-R2-Asp-Ala-VakR6-Thr-R_e-Asn-Rio-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Rie-Nle-Ala-AIa-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:15)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R27-Thr-Y

X-R₁-R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R₈-Asn-R₁o-Ihr-R₁₂Leu-Arg-Lys-R 16-R i r Ala-R 19-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:16)-Y]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-Ri-R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R8-Asn-Rio-'nir-LysLew-Arg-Lys-R₁₅-Ala-AJa-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:17)-Y)

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-R₈-Asn-R₁o-Thr-LysLeti-Arg-Lys-R_l6-Nte-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:18)-Y]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R-i^-Asp-Ala-Val-Re-Thr-Rg-Asn-Rio-Thr-LysLeu-Arg-Lys-R 16-^NI®-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID N0:19)-Ϊ]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-Ri-R₂-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R₀-Asr>-Rio-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R2210 Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID NO:70-Y]

X-R i-Ser-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-R ю-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID N0:71-Y]

X-R^-Ala-Asp-Ala-Val-R_g-Thr-Rg-Asn-R^Q-Thr-LysI--------------------------Leu-Arg-Lys-Gln~Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22

Leu-R*₂₄-Asp-Leu-Lys-Lys-Y |X-(SEQ ID NO:72-Y|

X-R^-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Rg-Asn-R^Q-Thr-Lysi-------------------------1

Leu-Arg-Lys-Ala-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22^_

I--------------------------------------------------ί-----------------------------Leu-R₂₄-Asp-Leu-Lys-Lys-Y |X-SEQ ID NO:73-Y| където x,

Y, R.p R₂, Rg, Rg, ^12’ ^16’ ^17’ ^19’ ^22* ^24 u R₂₇ имат посочените значения за формула V.

Освен това изобретението се отнася и до метод за получаване на споменатите пептиди, до фармацевтични препарати, съдържащи такива пептиди, както и до методи за използването им заедно с не токсични инертни терапевтично приемливи носители за лечение на бронхотрахеални констриктивни заболявания. Методът за получаване на цикличните полипептиди се характеризира с това, че а )защитен и свързан със смола пептид със съответната аминокиселинна последователност се депротектира селективно до образуването на верига със свободна странична амино група и свободна странична верига на карбоксилна група;

б) свободната странична верижна амино група и свободната странична верижна карбоксилна група се свързват ковалентно с подходящ реагент, образуващ амид, и

в) циклизираният пептид се депротектира и отцепва от смолата чрез с подходящ обработване депротекцианен и отцепващ реагент, по желание в присъствие на други подходящи добавки като катионен очистител и след това цикличният пептид може да се превърне във фармацевтично приемлива сол.

Изобретението се отнася също и до употребата на цикличните пептиди за получаването на фармацевтични препарати за лечение на

бронхотрахеални констриктивни заболявания.

Използваната номенклатура за дефиниране на пептидите е типичната, известна в тази област и използвана,когато амино групата при t крайния азот е в левия край, а карбоксилната група при крайния Сатом е в десния край.Под естествени аминокиселини се има пред вид някоя природна аминокиселина, намерена в протеините като Gly, Ala, Vai, Leu, lie, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp u His. Когато аминокиселините имат изомерни форми,обикновено се има пред вид L-формата на аминокиселината, която е представена, освен ако друго не· е специално указано.

За описване на аминокиселините, използвани в изобретението, както и защитните групи, разтворителите и реагентите, са използва ни следните съкращения или означения:

Съкращение

Ас

Огп

Nle

Fmoc

Fm

Вос

Bom

СН₂С1₂

CH₃CN

DMF

DIPEA

TFA

HOBT

DCC

DIC

BOP

Значение ацетил орнитин норлевцин 9-флуоренилметилоксикарбонил 9-флуоренилметил t-бутилоксикарбонил бензилоксиметил метилен хлорид ацетонитрил диметилформамид

Ν,Ν’ -диизопропилетиламин трифлуорооцетна киселина к_хидроксибензотриазол

Ν,Ν’ -дициклохексилкарбодиимид

Ν,Ν’ -диизопропилкарбодиимид бензотриазол-1-илокси-три-(диметиламино)фосфониев хексафлуорофосфат

N-Me-Ala

2-Nal t

p-F-Phe

FAB-MS

Аналози на природната VIP пептидна последователност са посочени чрез обозначаване на заместената аминокиселина в скоби преди VIP. Представянето на заместители на N-терминалната амино група например чрез X, както по-горе се означава отляво на заместителя в скоби. Номерата на последователност, които са дадени в скоби ( отдясно на VIP’\ означават задраскването на аминокиселината и ' 7 прибавяния към изброяването на естествената последователност. Например Ac-|Lys¹²,Nle¹⁷,Gly²⁹|-viP(l-29)-NH₂ означава полипептид.

имащ аминокиселинна последователност, съответстваща на природния човешки VIP, в който една ацетилна група е субституирана с водород при крайния азот, лизин е заместен с аргинин в позиция 12, и норлевцин е заместен с метионин в позиция 17. Допълнително глицин е свързан към карбоксилната част на аспарагин 28, граничещ с позиция 29. Заместителите -ОН и -NHc>, следващи У1Р”,или скобите се отнасят до свободната киселина и амидните форми на полипептида, респективно. Когато не е използван никакъв заместител_fизразеното показва, че обхваща и двете форми.

Както е посочено по-горе и както е дефиниран тук,цикличен пептид е пептид, в който страничната верига на карбоксилния край на една аминокиселина в пептида е прикачена ковалентно към страничнаI та верига на амино-терминала на друга аминокиселина в пептидната верига чрез образуването на амидна връзка.За представянето на цикличния пептид са използваните номенклатури и символи, някои от които са следните:

Ac-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- a.

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-NH₂ |Ac-(SEQ ID NO:2O)-NH₂*1 Ac-jLys₁₂,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²^)-VIP ЦИКЛО (8 - 12) b.

jAc-(SEQ ID NO:2O)-NH₂~}

Ac-(Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸|-VIP ЦИКЛО (Asp⁸-^ LysJ²) B. |Ac-(SEQ ID N0:20)-NH₂7

Горните три структури ( а -в) и придружаващото представяне, което използва Seq id NO: _?и по-нататък представения листинг за последователностите, всеки представлява и дифинира същия полипептид, имащ аминокиселинна последователност, съответстваща на природния човешки VIP, в който една ацетилна група е субституирана с водород при крайния азот, лизин е субституиран с аргинин в позиция 12, норлевцин е субституиран с метионин в позиция 17, валин е заместен с изолевцин в позиция 26 и треонин е заместен с аспарагин в позиция 28. Допълнително е образувана амидна връзка между страничната карбоксилна верига на аспарагиновата киселина в позиция 8 с аминната странична верига на лизин в позиция 12 и по този начин се получава цикличниятпептиден аналог.Горепосоченото представяне на пептидната структура се счита, че е еквивалентно и вътрешнопроме нимо.

Използваните термини r за аминокиселина в позиция η в п една от показаните тук структури и Хаа за аминокиселина в позиция η в съответната последователност в приложение листинг за последователностите са еквивалентни и равнозначни в тези случаи,

когато Хаа” представлява

селекция измежду една или повече амино

киселини.

В цикличните пептиди

от изобретението са използвани следва-

щите конфигурации, освен ако не е посочено друго.

Амино киселина	Терминал на аминокиселинната
във верига	връзка за образуване на цик- личен пептид
Lys	ε амино
Orn	<5 амино
Asp	β карбоксил
Glu	у карбоксил

Избрани съединения от изобретението включват пептиди, имащи следните аминокиселинни последователности:

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP Цикло (Asp⁸-*Lys¹²) [Ac-(SEQ ID N0:20)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Glu⁸-»Lys¹²) [Ac-(SEQ ID N0:21)-NH₂]

Ac-[Asn⁸, Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷, Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Asp⁹-»Lys¹²) [Ac-(SEQ ID N0:22)-NH₂]

Ac-[Orn¹²,Nle¹⁷,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Asp⁸->Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂]

Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys⁸-*Asp¹²) [Ac-(SEQ ID N0:24)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷, Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Glu⁸->Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂] ( Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys¹²->Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID N0:26)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Asp²⁴,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²⁰-»Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID N0:27)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:28)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val2 6,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵)

[Ac-(SEQ ID N0:29)-NH₂] i

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹]-VIP -ЦИИЛ0 (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:30)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶, Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:31)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰,Cys(Acm)³¹]-VIP ЦИКЛр (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH₂]

Ac-[Ala²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP

ЦИКЛ 0( Ly s ²¹ —»Asp^{2 5}) [Ac-(SEQ ID N0:33)-NH₂]

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО 20 (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:34)-NH₂]

Ac-[2-Nal¹⁰, Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО i (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:35)-NH₂]

Ac-[О-СНз-Туг¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—XAsp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:36)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,p-NH₂-Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶, Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:37)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:38)-NH2]

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys ² Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:39)-NH2]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH2]

Ac-[O-Me-TyriO,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:41)-NH2]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Ala^{2 9-51}]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:42)-NH2]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Ala²⁹“³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂] (

Ac-[N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:44)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu^{2 6},Lys²⁷'²⁸]-VIP 30 ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:45)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵)

[Ac-(SEQ ID NO:46)-NH21 k

Ac- [Glu⁸, p-NH2-Phe¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu2 θ, Lys²⁷ > 28 j _

VIP ЦИКЛО. (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,O-CH3-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH21

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [AC-(SEQ ID N0:50)-NH2]

Ac- [Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷ · ²⁸,

Gly²⁹,30,Thr²¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:51)-NH2)

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷< ²⁸,

Gly²⁹, 30,_Thr31j__VIP цикла (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:52)-NH₂]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:53)-NH2)

Ac-[p-NH2-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:54)-NH2]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,А1а¹⁹,т-ОСНз-Туг²²,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²², Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIPЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH2]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,А1а¹⁹,т-ОСНз-Туг²², Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷r ²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]VIP ЦИКЛО (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:58)-NH₂]

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH21

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH2]

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]VIP 'ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂]

Ac-[Ala⁸,Lys¹², Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷ > ²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH2] t

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹θ’¹⁷ ’¹⁸,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’ ²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH21

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸’ Gly²⁸’³θ,Thr³¹]VIP ЦИКЛО (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2)

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸,

Gly²⁸, 30,Thr³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys² ^Asp^{2 5}) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁸, 30_zThr³¹)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Asp²⁵, Leu^{2 6},Lys²⁷'²⁸, Gly²⁸'30,Thr³1]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2)

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸,Ala^28-31]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵)

/. [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂]

Съединенията от настоящото изобретение могат лесно да се синтезират чрез всеки известен подходящ метод за образуването на пептидна връзка между аминокиселини. Такива обичайни методи включват например всяка процедура в течна фаза, позволяваща кондензацията между свободната алфа амино група на амино киселина или наин остатък, чиято карбоксилна група или други реактивоспособни групи са защитени, и свободната първична карбоксилна група на друга амино киселина или неин остатък, чиито 30 амино група или други реактивоспособни групи са защитени.

Методът за синтезиране на съединенията от настоящото изобретение може да се осъществи чрез процедура, при която всяка амино — киселина с желаната последователност се прибавя едновременно в последствие към друга амино киселина или неин остатък, или чрез процедура, при която пептидните фрагменти с желаната аминокиселинна последователност първоначално се синтезират конвенционално и после се кондензират, за да дадат желания пептид.

Такива конвенционални методи за синтезиране на новите съединения от изобретението включват например всеки метод на пептиден синтез в твърда фаза. При такъв метод синтезът на новите съедине-t ния може да се проведе чрез последователно инкорпориране на желаните аминокиселинни остатъци по едно време в растящата пептидна верига съгласно основните принципи на методите в твърда фаза.|Merrifield, R.B.,J.Am.Chem.Soc., 85,2149-2154 (1963);Barany wt al., The Peptides,Analysis,Synthesis and Biology,Vol.2, Gross,E.and Meienhofer, J., Eds. Academic Press, 1-284 (1980)|.

Обща c химическия синтез на пептиди е защитата на реактивните странични групи от веригата на много аминокиселинни остатъци с подходящи защитни групи, които ще предпазят протичането на химическа реакция в тази част, докато защитната група не ;е отделена. Обикновено също така подобна е защитата на алфа амино групата в аминокиселина или фрагмент, когато тази част реагира при карбоксилната група, последвано от селективно отделяне на алфа амино защитната група, което да позволи протичането на последваща реакция на това място. Специфичните защитни групи имат отношение към метода на синтез в твърда фаза. Трябва да се отбележи, че всяка аминокиселина може да бъде защитена чрез подходяща защитна група, която обикновено се използва за съответната амино киселина при синтеза в течна фаза.

Алфа амино групи могат да бъдат защитени чрез подходяща защитна група, избрана измежду защитните групи от ароматно-уретанов тип, като бензилоксикарбонил (ζ) и заместен бензилоксикарбонил каI то р-хлоробензилоксикарбонил, р-нитробензилоксикарбонил, р-бромобензилоксикарбонил, р-бифенил-изопропилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) и р-метоксибензилоксикарбонил (Moz); защитни групи от алифатно-уретанов тип като t -бутилоксикарбонил (Вос), диизопропилметилоксикарбонил, изопропилоксикарбонил и алилоксикарбонил. Вос е най-предпочияан за алфа амино защита.

Карбоксилни групи могат да бъдат защитени чрез подходяща защитна група, избрана от ароматните естери като бензил (OBzl) или бензил, субституиран с нисш алкил, хало, нитро, тио или заместен тио, например нисш алкил (1-7 С атоми)тио; алифатни естери като нисш алкил, t-бутил (Ot-Bu) , циклопентил, циклохексил (ОсНх), циклохептил и 9-флуоренилметил (OFm). OBzl и OFm са найпредпочитани за глутаминова киселина (Glu).OChx,OBzl u OFm са предпочитани за аспарагинова киселина (Asp).

Хидроксилни групи могат да бъдат защитени чрез подходящи защитни групи, избрани измежду етери като бензил ( Bzl) или бензил, субституиран с нисш алкил, хало, като 2,6-дихлоробензил ( DCB) , нитро или метокси, t-бутил (t-Bu), тетрахидроксипиранил и трифенилметил (тритил). Bzl е най-предпочитан за серин (Ser) и треонин (Thr). Bzl и DCB са най-предпочитани за тирозин (Туг).

Аминогрупи от страничната верига могат да бъдат защитени с подходяща защитна група, избрана от групите от ароматно-уретанов тип като бензилоксикарбонил (ζ) и субституиран бензилоксикарбонил като р-хлоробензилоксикарбонил, 2-хлоробензилоксикарбонил (2-CIр-нитробензилоксикарбонил, р-бромобензилоксикарбонил, р-бифенилизопропилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) и р-метокси-бензилоксикарбонил (Moz) ;защитни групи от алифатно-уретанов тип като t-бутилоксикарбонил (Вос), диизопропи^пметилоксикар61125 нил, изопропилоксикарбонил и алилоксикарбонил. ζ е най-предпочитан за орнитин (огп) . За лизин (Lys) най-предпочитани са 2-CI-Z И Fmoc.

Гванидино-групи могат да бъдат да бъдат защитени чрез подходяща защитна група като нитро, р-толуенсулфонил (Tos) , Z , адамантилоксикарбонил и Вос. Най-предпочитан за аргинин ( Arg) е Tos.

Амидни групи в страничната верига могат да бъдат защитени с ксантил (хап) . Не е известна предпочитана защита за аспарагин (Asn) и глутамин (Gin).

Имидазолови групи могат да бъдат защитени чрез подходящи група като р-толуенсулфонил (Tos), 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трифенилметил (тритил), 2,4-динитрофенил (Впр), вос и бензилоксиметил (Вот) . Най-предпочитани за хистидин (His) са Tos и Вот .

Освен ако друго не е посочено, по-наяат$к дадените проценти за твърди вещества в течни смеси, течност в течност и твърдо вещество в течности са на базата на тегло/тегло, обем/обем и тегло/обем, съответно. Използваните реактиви и апаратура са споменати или лесно биха могли да бъдат заменени от познати на специа. листа в областта.

Използваните разтворители изопропанол ( i-PrOH) , метиленхлорид (CHgCIg) и диметилформамид (ДМФА) са от Фишер или Бурдик^и Джексън и са използвани без допълнително дестилиране . Трифлуорооцетната киселина е набавена от халокарбон и използвана без пречистване. Диизопропилетиламин ( dipea) е взет от Pfaltz _и Bauer дестилиран през СаО и нинхидрин преди използване. Дициклохексилкарбодиимид ( dcc) и диизопропилкарбодиимид ( DIC) са взети от' Флука и използвани без пречистване. Хидроксибензотриазол (НОВТ) и 1,2-етандитиол ( EDT) са набавени от Sigma Chemical Co. и използвани без пречистване. Защитените аминокиселини са обикновено

c L конфигурация и са комерсиализирани от Chemical Dynamics Corp, или Bachem. . Чистотата на тези реагенти е потвърдена чрез тънкослойна хроматография, nmr и точка на топене. Boc-0-Me-Tyr, Вос-2-Nal и Boc-p-F-Phe се получават,както е описано в патентна заявка САЩ 374 503. Boc-Asp(OFm) и Boc-Glu(OFm) се получават, както е описано В Bolin D.R. et al, Org.Prep.Proc.Int., 21, 67-74 (1989). Бензхидриламинова смола (BHA) е кополимер на стирол1% дивинилбензен (100-200 или 200-400 mesh ), получена от Biomega Bachem, Omni ИЛИ Advanced Chemtech. Тоталното съдържание на азот на тези смоли е обикновено между 0.3-1.2 meg/g.

Тънкослойната хроматография (TLC) се осъществява на стъклени плаки от Мерк, предварително грундирани със силикагел 60 F254, като се използва подходяща система от разтворители. Определянето на съединенията се осъществява чрез uv охлащцаща флуоресценция (254 нм абсорбция), йодно оцветяване или нинхидринов спрей ( за първични и вторични амини).

За анализа на състава на аминокиселините пептидите се хидролизират в 611 HCI, съдържащ 1 - 4 mg фенол,при 115°С за 22-24 часа в затворени вакумирани хидролизни тръбички. Анализът се провежда или на аминокиселинен анализатор Beckman 121М, или на Waters HPLC- базираща се система за анализ на аминокиселини, като се използва или Waters Cat Ех смола ИЛИ Pierce АА511 колона И НИНхидриново определяне.

Високоефективна течна хроматография ( HPLC) се провежда на апарат LDC ,състоящ се от Констаметрик I и III помпи, градиентен програмен разтворител и миксер, и спектромонитор III uv- детектор с променлива дължина на вълната. Аналитична HPLC се провежда в обратимофазов метод^като се използва Waters Bondapak c^g колони (0.4 χ 30 см). Препаративна hplc за разделяне се осъществява Whatman Magnum 20 partisil 10 ODS -3 КОЛОНИ (2 X 25 err или 2 х 50cm), екипирана с Waters Guard- Рак предколона. Гел-хроматографията се осъществява чрез колона 2 х 85 cm, вариоперпексна перисталтична помпа и УВ детектор IBM с променяща t

дължина на вълната.

Най-често пептидите се получават чрез синтез в твърда фаза по методика, описана OT Merrifield, J.Amer. Chem.Soc., 85, 2149 (1963) ,макар че и други подобни химически синтези, известни от нивото на техниката, могат да бъдат използвани, както беше вече споменато. Синтезът в твърда фаза започва от края с терминален въглерод в пептида чрез свързване на защитена алфа-амино киселина към подходяща змола. Такъв изходен материал може да бъде приготвен чрез закачване на алфа-амино защитена аминокиселина посредством естерна връзка към хлорометилирана смола или хидроксиметилна смола, или чрез амидна връзка към бензхидриламинова (ВНА) или пара-метилбензхидриламинова (МВНА) смола. Получаването на хидроксиметилова смола е добре известно от нивото на техниката. Хлорометилираните смоли са търговски достъпни и получаването им също е добре известно. ВНА и МВНА смоли като супорти са търговски достъпни и обикновено се употребяват,когато желаният пептид^след като е синтезиран,притежава несубституиран амид при терминалния С.

/

Обикновено първата амино киселина, която се свързва с ВНА смола_?се прибавя под формата на Вос-аминокисеяинен симетричен анхидрид, като се използват 2-10 еквивалента от активираната аминокиселина за един азотен еквивалент смола. - След свързване смолата се промива и суши под вакуум. Дозирането на аминокиселината по отношение на смолата може да бъде определяно чрез аминокиселинен анализ на аликвот от Вос-аминокиселина смола. Дозировките обикновено са 0.2 до 0.4 _mmi/g ‘' смола. Всяка нереагирала аминокиселина може да бъде неутрализирана чрез реакция на смолата с оцетен анхидрид и диизопропилетиламин в метилен хлорид.

След прибавянето на Вос-амино киселина смолите се прекарват през няколко повтарящи се цикъла за допълнително прибавяне на амино киселини. Алфа-амино Вос защитата се отделя в кисели условия. За тази цел могат да се използват смеси от трифлуорооцетна киселина (ТФА ) в метилен хлорид, HCI в диоксан или мравчена киселина/оцетна киселина. За предпочитане се използва 50% ТФА в метилен хлорид (обем/обем). Те могат също да съдържат 1-5% от обема на EDT или диметилсулфид като акцептор за t-бутилкарбониевите йони. Други стандартни отцепващи реагенти, известни от нивото на техниката, могат да бъдат използвани.

След отделянето на алфа-амино защитната група, следващите защитени аминокиселини се свързват степенно в желания ред до получаване на междинен защитен пептид-смола. Активиращите реагенти, използвани за свързване на аминокиселините в твърдо-фазовия синтез на пептидите^са добре известни. Подходящи реагенти за такъв синтез са бензотриазол-1-илокси-три-(диметиламино)фосфониев хексафлуороDCC и DIC. Други активиращи реафосфат (БОР), ^ициклохексилкарбодиимид ( DCC ) и диизопропилкарбог диимид ( Die ). Предпочитани са генти са описани ОТ Вагапу И Merrifield, The Peptides, Vol.2, J. Meienhofer, ИЗД. Academic Press, 1979,11-284 И могат да бъдат използвани. Различни реагенти като 1-хидроксибензотриазол (НОВТ) П-хидроксисукцинимид (HOSu ) и 3,4-дихидро-3-хидрокси-4-оксо1,2,3-бензотриазин (НООВТ) могат да се прибавят към свързващата смес, за да се оптимизират синтетичните цикли. Предпочитан е НОВТ.

Следващият протокол показва типичните синтетични цикли:

ПРОТОКОЛ 1

Стадий

Реагент

Време

1	СН₂С1₂	2 х 30 сек
2	50% Т$А/СН₂С1₂	1 мин
3	50% ТМ/СН₂С1₂	15 мин

4	^СН2^С12	2 X	30	сек
5	i-PrOH	2 х	30	сек
6	^СН2^С12	4 х	30	сек
7 .	6% dipea/ch₂ci₂	3 х	2 мин
8	^СН2^С12	3 х	30	сек
9	купелуване	10 мин	-18 часа
10	^СН2^С12	2 х	30	сек
11	i-PrOH	1 х	30	сек
12	^СН2^С12	1 х	30	сек
13	ДМФА	2 х	30	сек
14	CHoCIo	3 х	30	сек

Разтворителите за всички промивания и купелуване се измерват до обеми от 10-40 mg/g смола. Купелуването се осъществява или чрез преформирани симетрични анхидриди на Вос-аминокиселините или при използване на 0-ацил изокарбамидни деривати. Обикновено 2-10 еквивалента активирана Вос-аминокиселина се прибавя на еквивалент амино-смола, като се използва метилен хлорид за разтворител. Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) u Boc-His(Bom) са купелувани Β 20-25% DMF/CH₂C1₂. Boc-Asn, Boc-Gln u Boc-His(Bom) са купелувани като техните HOBT активни естери,за да се намалят известните странични реакции.

Пептидите се циклизират обикновено чрез известни методи по следния начин. Използват се различни защитни групи в страничните аминокиселини на пептида, където страничните вериги трябва да се свържат. За аминокиселините от амино-страната Lys и Огп N - и N -Fmoc дериватите са инкорпорирани в пептидната верига. За аминокиселините от карбоксилната страна Asp и Glu 0 - и 0 Fm- дериватите са инкорпорирани. Докато пептидът е все още свързан за смолата,се обработва с 20-40% пиперидин в ДМФА^за да се отделят селективно Fmoc и Fm защитните групи. Свободните крайни амино- и карбоксилни групи от веригата тогава се свързват ковалентно с молекулата чрез обработване с подходящ амид образувайки реагент като дифенилфосфорилазид (DPPA), DCC, Die или ВОРлПредпочитани са dcc и ВОР.

Протоколът за типичния циклизационен процес показва следните данни:

ПРОТОКОЛ 2

Стадий

Реагент

Време

1	ДМФА	1 х 30 сек',
2	20-40%пиперидин/ДМФА	1 мин
3	ДМФА	1 х 30 сек
4	20-40% пиперидин/ДМФА	20 мин
5	i-PrOH	1 х 30 сек
6	ДМФА	1 х 30 сек
7	i-PrOH	2 х 30 сек
8	ДМФА	2 х 30 сек
9	6% DIPEA/CH₂C1₂	2 х 30 сек
10	^СН2^С12	1 х 30 сек
11	ДМФА	1 х 30 сек
12	купелуване	1 -24 часа
13	i-PrOH	1 х 30 сек
14	СН₂С1₂	1 х 30 сек
15	ДМФА	2 х 30 сек
16	СН₂С1₂	3 х 30 сек

Реакциите на купелуване в процеса на синтеза се контролират чрез Кайзеров нинхидринов тест за определяне степента на цялостност. Kaiser et al., Anal. Biochem.,34φ 595-598 (1970).Бавни реакционни кинетики са наблюдавани за Boc-Arg(Tos), Boc-Asn и Вос- Gin. Реакциите на непълно купелуване или се провеждат отново с прясно приготвена активирана аминокиселина или се допълват чрез обработване на пептидната смола с оцетен анхидрид както е описано по-горе. Събраните пептидни смоли се сушат под вакуум няколко часа.

За всяко съединение блокиращите групи се премахват и пептидът се отделя от смолата чрез следващата процедура. Обикновено пептидните смоли се обработват с 25 -100β етандитиол, 1 ml < анизол и 9 мл течен флуороводород на грам смола при 0°С за 45-60 минути в апаратура Teflon HF (Peninsula) . Алтернативно може да бъде използвана модифицирана двустепенна процедура на разцепване, описана В Tam et al., Tetrahedron Letters, 23, 293982940 (1982), където пептидната смола се третира с 3 мл диметил сулфид и 1 мл флуороводород за 2 часа рри 0°С _f като преди третирането се изпарява до 90% HF . След това летливите реагенти се отделят под вакуум при температура на ледена баня. Остатъкът се промива два или три пъти с по 20 мл Et₂O и EtOAc и се филтрува. Пептидите се екстрахират от смолата чрез промиване с три или четири обема по 20 мл 10% АсОН и се филтрува. Събраните водни филтрати се лиофилизират до получаването на суров продукт.

Получените сурови пептиди първоначално се пречистват чрез гел хроматография върху Сефадекс G-25 фина среда, за да се отделят мономерите от олигомерните продукти. Пептидите се разтварят в минимален обем от 10% АсОН и се поставят в гелната колона. Колоната се елуира с 10% АсОН при скорост на потока 0.5-1.5 мл/мин. Ефлуентът се контролира при 254 нм и фракциите, съдържащи желаната ивица се утаяват и се лиофилизират до получаване на полу-чисти продукти.

Пречистването на тези продукти- полу-пречистени пептиди обикновено се осъществява чрез препаративна hplc . Пептидите се зареждат в колоните в минимум обем или от 1% АсОН или 0.1% ТФА. Градиентното елуиране обикновено започва в 10% В буфер, 10-25% ВФА/Н^О, за 10 минути, и 25-35% В за 3 часа ( буфер А:0.1% ТФА/HgO, буфер В 0.1%ТФА/ CH^CN ) при скорост на потока 8.0 мл/мин. Провежда се УВдетекция при 220 нм. Събират се фракции на 1.5-2.5 минути интервали и се проверяват чрез аналитична hplc . Отчетените фракции с висока чистота се утаяват и лиофилизират.

Чистотата на крайните про' '^гти се проверява чрез аналитична Й

HPLC на обратно-фазова колона, както беше споменато. Обикновено градиентното елуиране в 20-40% В (буфер А : 0.022% ТФА/Н^О, буфер В : 0.022%T$A/CH₃CN ) за 15 минути при 2.0 мл/мин УВ-детекция е при 210 нм. Пречистването на всички продукти се изчислява приблизително на 97-99%. Провежда се аминокиселинен анализ на отделните пептиди и получените стойности са в приемливи граници. По принцип всички крайни продукти също се подлагат на бързо атомно бомбордиране мас спектрометрия ( fab-ms ). Всички продукти дават очакваните двойки от М+Н йони в приемливи граници.

Съединенията от настоящото изобретение имат значителни фармакологични свойства. Те имат трахеалнв релаксантна активност и са силни бронходилататори. Съединенията също така нямат странични кардиоваскуларни ефекти. Получената с тези нови пептиди бронходилатация може да се поддържа повече от два часа. Така като високоактивни бронходилататори съединенията са и добри фармацевтични агенти за лечение на бронхоконстриктивни заболявания като астма.

Съединенията с формули от I до V могат да бъдат комбинирани с различни типични фармацевтични носители, за предпочитане нетоксични, инертни терапевтично приемливи носители, за приготвяне на състави, подходящи за лечение на бронхоконстриктивни заболявания като астма. Дозировката на тези съединения в галенично приложимите форми е в зависимост от различни фактори като особеностите на използваното съединение и особеностите на формата. Ефективна дозировка може да бъде определени от специалиста в областта според представената тук ефективна концентрация (EC^q). Типични дозировки при хора са 0.01 -100 г/кг. За съединения с ниска ЕС₅₀ като 0.1 г характерни дозировки при хора може да бъде 0.02-20 г/кг.

Новите съединения с формули I -V образуват фармацевтиично приемливи присъединителни с киселина соли с различни неорганични и органични киселини като сярна, фосфорна, хлороводородна, бромоводочо родна, йодоводородна, азотна, сулфаминова, лимонена, млечна, пирогроздова, оксалова, малеинова, янтарна, винена, канелена, оцетна, трифлуорооцетна, бензоена, салицилова, глюконова, аскорбинова и други' подобни киселини.

Съединенията могат да се прилагат парентерално, интравенозно, подкожно, интрамускуларно, перорално или интраназално. Предпочитан начин на парентерално приложение е аерозолният чрез перорално или интраназално администриране.

Изобретението се илюстрира от следващите примери.

ПРИМЕР 1 . Получаване на Boc-Thr(Bzl)-BHA - смола

9.5 г бензхидриламин кополистирен-1% дивинилбензен омрежена смола ( 3.6 mequiv. 200-400 ASTM mesh, Vega Biochem. ) се накисва в 100 мл метилен хлорид, филтрува се и се промива,като се използват стадии 7-8 от протокол 1. 3.35 г, 10.8 ммол Boc-Thr(Bzl) и 1.12 г, 5.42 ммола дициклохексилкарбодиимид реагират в 50 мл CHgCIg за 1 час, филтрува се и се прибавя в 50 мл CHgCIg към накисната смола. Тази смес се разбърква 18 часа при стайна температура. Прибавя се 630 мл, 3.6 ммола dipea и се разбърква още 1 час, филтрува се и после се осъществяват стадии 10-14 от протокол 1. Получава се негативен резултат при Кайзеров нинхидринов анализ. Нереагиралите амино групи се хващат чрез обработване на смолата с 1 мл оцетен анхидрид и 1 мл DIPEA в 50 мл метилен хлорид за 30 минути, филтрува се и се промива по стадии 13-14 от протокол 1. Смолата се суши под вакуум цяла нощ до получаване 9.8 г от Вос-Thr(Bzl)-BHA- смола. Част от тази смола се подлага на анализ за амино киселини, който показва дозировка от 0.17 ммола Thr /г. ПРИМЕР 2 . Получаване на Ac-|Lys¹², Nle¹⁷, Vai²⁶, Thr²^-VIP

ЦИКЛО (Asp⁸^ Lys¹²) [Ac-(SEQ ID No;20)-NH₂}

9.8 r, 1.7 ммола Boc-Thr(Bzl)-BHA - смола от пример 1 се подлага на твърдо-фазов синтез,като се използват условията на протокол 1. Всички купелувания се осъществяват при използване на преформирани симетрични анхидриди, получени он Вос-амино киселина и дициклохексилкарбодиимид. Вос-аспарагин, Вос-глутамин и Вос-хистидин(бензилоксиметил) се купелуват както съответните НОВТ активни естери. Реакционното време за пълно провеждане на стадия на купелуване е обикновено 1 -18 часа. Пет цикъла на купелуване са осъществени всеки в един цикъл с Boc-Leu (1.5 г, 6.0 ммола),

1.3 г, 6.0 ммола Boc-Val , (1.8 г, 6.0 ммола) Boc-Ser(Bzl) 773 мг, 3.3 ммола Boc-Asn и 1.5 г, 6.0 ммола Boc-Leu . Смолата се суши под вакуум и се получава 12.2 г Вос-хексапептидна смола.

Порция от 8.2 г, 1.13 ммола от тази смола се купелува с шест цикъла, в един цикъл с 1.77 г, 4.0 ммола Вос- Tyr(2,6-DCB) 1.67 г, 4.0 ммола Вос- Lys(2-CI-Z), 1.67 г, 4.0 ммола Boc-Lys(2CI-Z), 876 мг, 4.0 ммола Boc-Val , 762 мг, 4.0 ммола Вос-AIa и 932 мг, 4.0 ммола Вос- Я1еи се получава 10.2 г Вос-додекапептидна смола.

Порция от 1.26-г, 0.139 ммола от тази смола се прекарва през два цикъла на купелуване всеки един с 205 мг, 0.93 ммола Boc-Gln и 627 мг, 1.5 ммола Вос- Lys(2-ci-z) . Половината от тази смола, или 0.069 ммола се прекарва през 14 цикъла на купелуване, всеки един с 324 мг, 0.76 ммола Boc-Arg(Tos) , 188 мг, 0.76 ммола Boc-Leu, 354 ΜΓφ 0176 ммола Boc-Lys(Fmoc), 234 МГ , 0176 ммола Boc-Thr(Bzl), 333 МГ, 0.76 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 97 МГ , 0.76 ммола Boc-Asn, 311 мг, 0.76 ммола Boc-Asp(OFm) , 234 мг, 0.76 ммола Boc-Thr(Bzl) , 201 мг, 0.76 ммола Boc-Phe , 164 мг, 0.76 ммола Boc-Val , 143 мг, 0.76 ммола Вос-AIa, 238 мг, 0.76 ммола Boc-Asp (ОсНх), 223 мг, 0.76 ммола Boc-Ser(Bzl) и 156 мг, 0.41 ммола Вос-His (Вот) . Пептидната смола се прекарва през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 1.0 мл оцетен анхидрид и 66 '”1,0.38 ммола dipea в 20 мл метилен хлорид за 30 минути. Смолата се промива при условия на стадии 10-14.

След това смолата селективно се деблокира чрез третиране по стадий 1-11 от протокол 2 и реагира седем пъти с 49 мг, 0.24 ммола DCC и 80 ‘мг, 0.24 ммола НОВТ в 20 мл дестилиран ДМФА за 24 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Смолата се промива според стадии £3-16 от протокол 2 и се суши под вакуум до добив от 0.72 г.

Тази смола се третира с 6 мл диметилсулфоксид и 2 мл течен флуороводород за 2 часа и 0°С. Реакционната смес се изпарява и остатъкът се третира с 0.7 мл анизол и 6 мл течен флуороводород за 45 минути при 0°С. Реакционната смес се изпарява и остатъкът се промива 1 х 15 мл Et₂O и 3 х 15 мл EtOAc . Смолата се екстахира с 3 х 20 мл 10% АсОН. Събраните водни филтрати се лиофилизират до получаване на 227 мг бяло вещество.

Полученият суров материал се пречиства чрез препаративна HPLC на колона Whatman Magnum-20 ODS-3 (2 χ 25 см) И се елуира C линеен градиент от 10-40% В (буфер А: 0.1% ТФА/HgO, буфер В: 0.1% ТФА/ CH_₃CN ) за 4 часа. Главният пик се отрязва чрез анализ на събраните фракции с аналитична Hplc , утаява се и се лиофилизира до добив 26.7 мг получист продукт. Този материал отново се поставя в колона Magnum -20 ODS-3 (2 х 50 см) и се елуира със същия градиент. Главният пик се отрязва и лиофилизира до 9.5 мг добив от бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира с EPLC и дава точен анализ на аминокиселина. fab*ms : ΜΗ изчислено

3277.8, намерено 3276.1 .

ПРИМЕР 3 .Получаване на £ac-G1u⁸, Lys¹² ,Nle¹⁷ ,Val²⁶ ,Thr^j-viP g

(Glu L_ys12) |ac-(BEQ ID NO:21)-NH₂·^

17.7 г бензхидриламин кополистирен-1%дивинилбензен омрежена смола (2.6 mequiv, 200-400 ASTM mesh, Vega Biochera се накис4) ва в 160 мл метилен хлорид, филтрува и промива, като се използват стадии 7-8 от протокол 1. Смолата се суспендира отново в 160 мл метилен хлорид и се прибавят 6.25 г, 20.2 ммола Boc-Thr(Bzl) и t

2.10 г, 10.1 ммола дициклохексилкарбодиимид. Тази смес се разбърква 8 часа при стайна температура, филтрува се и после се осъществяват стадии 10-14 от протокол 1. Кайзеровият нинхидринов анализ е отрицателен.Нереагиралите аминогрупи се улавят чрез обработване на смолата с 5 мл оцетен анхидрид и 5 мл DIPEA в 150 мл метилен хлорид за 60 минути, филтрува се и се промива по стадии 13-14. Смолата се суши под вакуум цяла нощ и се получават 18.0 г.смола на Boc-Thr(Bzl)-BHA . Част от тази смола ;ве подлага на аминокиселинен анализ, който показва дозиране от 0.17 ммола Thr/r.

18.0 г, 3.06 ммола Смола Boc-Thr(Bzl) -ВНА се подлага на твърдофазов синтез, като се използва горният протокол 1.Всички купелувания се осъществяват като се използва преформиранисиметрични анхидриди, получени от Вос-аминокиселина и дициклохексилкарбодиимид. Вос-аспарагин, Вос-глутамин и Вос-хистидин(бензилоксиметил) се купелуват^както съответните НОВТ активни естери. Пет цикъла на купелуване са осъществени, всеки от тях с 6.1 г,24.5 ммола Boc-Leu , 5.32 г, 24.5 ммола Boc-Val, 7.23 г, 24.5 ммола Boc-Ser(Bzl) , 3.13 г, 13.5 ммола Boc-Asn и 6.1 г,24.5 ммола Boc-Leu . Смолата се суши под вакуум и се получава 22.9 г Восхексапептидна смола.

Порция от 7.48 г, 1.0 ммола от тази смола се обработва в десет цикъла на купелуване, всеки от тях с 1.76 г, 4.0 ммола Boc-Tyr(276-DCB) , 1.66 Г, 4.0 ммола Boc-Lys(2-Cl-Z),1.66 Г, 4.0 ммола. Boc-Lys(2-Cl-Z), 869 МГ, 4.0 ммола Boc-Val, 1.5 Г, 8.0 ммола Вос-А1а, 925 МГ, 4.0 ммола Boc-Nle, 1.08 Г, 4.4 ммола Boc-Gln , 1.66 г, 4.0 ммола Boc-Lys(2-Cl-Z) , 1.71 г, 4.0 ммола Boc-Arg(Tos), и 998 МГ, 4.0 ммола Boc-Leu пават 9.6 Г ВОС- хексадекацептидна .^смола.

Порция от 7.68 г, 0.8 ммола от тази смола се прекарва през един цикъл на купелуванес 1.5 г, 3.2 ммола Boc-Lys(Fmoc) и се получава 8.32 г Вос-хептадекапептидна смола.

Порция от 6.24 г, 0.6 ммола от тази смола се прекарва през два цикъла на купелуване, всеки от тях с 742 мг, 2.4 ммола Boc-Thr(Bzl) , и 1.06 г, 2.4 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB ) до получаване на 6.28 г Вос-нонадекапептидна смола.

Порция от 2.09 г, 0.2 ммола от тази смоласе прекарва през девет цикъла на купелуване всеки от тях с 204 мг, 0.88 ммола ВосAsn , 340 мг, 0.8 ммола Вос-Asp(OFm) , 248 мг, 0.8 ммола Вос-Thr (Bzl), 212 мг, 0.8 ммола Вос-Phe, 174 мг, 0.8 ммола Вос-Vai , 151 мг, 0.8 ммола Вос-А1а, 258 мг, 0.8 ммола Вос-Asp(0cHx), 236 мг 0.8 ммола Boc-Ser(Bzl) ,и 330 мг, 0.88 ммола Boc-His(Bom) ,Пептидната смола се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се обработва с 0.25 мл оцетен анхидрид и 70 мл DIPEA в 20 мл метилен хлорид за 20 минути. Смолата се промива^като се използват стадии 10-14.

След това смолата селективно се деблокира чрез обработване по стадии 1-11 от протокол 2. Три четвърти от тази смола, 0.15 ммола реагират с ъс 77 мг, 0.37 ммола ДСС и 51 мг, 0.37 ммола НОВТ в 20 мл дестилиран ДМФА за 72 часа и в 20 мл толуен за 24 часа,. Кайзеровият нинхидринов анализ е негативен. Смолата се промива като се използват стадии 13-16 от протокол 2 и се суши под вакуум до получаване на 1.72 г.

Порция от 1.14 г, 0.099 ммола от тази смола се деблокира чрез обработване^както в пример 2, с изключение, че във втората фааа се използват 1 мл анизол и 9 мл HF . Реакционната смес се изпарява и остатъкът се промива 1 х 15 мл Et₂O и 3 х 15 мл EtOAc. Смолата се екстрахира с 3 х 20 мл 10% АсОН. Събраните водни филтрати се лиофилизират и се получава 535 мг бяло твърдо вещество.

Този суров продукт се пречиства чрез гел филтрация върху Сефадекс Г-25 фин ( 2 х 100 см колона) чрез елуиране с 10% АсОН.

I

Мономерният пик се определя чрез анализ с аналитична hplc на събраните фракции, утаява се и се лиофилизира до получаване на 83л5 мг получист продукт. Този материал по-нататък се пречиства чрез препаративна hplc _? както в пример 2, с изключение на това, че линейният градиент от 20-40% се пропуска за 3 часа. Главният пик се определя чрез анализ с аналитична hplc на събраните фракции, утаяване и лиофилизиране дава 18.9 мг бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира чрез hplc и дава верен аминокиселинен анализ. FAB-MS : ΜΗ изчислено 3292.0, намерено 3291.8 ПРИМЕР 4. Получаване на Ac-lAsn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸JVIP- ЦИКЛО (Asp⁹ -> Lys¹²) |ac-(SEQ ID No:22)-NH₂)

Порция от 1.55 г, 0.15 ммола Вос-нонадекапептидна смола от пример 3 се подлага на девет цикъла купелуване, всеки от тях с

247 мг, 0.6 ммола Boc-Asp(OFm) , 153 мг, 0.66 ммола Boc-Asn ,

248 мг, 0.8 ммола Boc-Thr (ζζΐ)· ,159 мг, 0.6 ммола Boc-Phe ,

130 мг, 0.6 ммола Boc-Val, 113 мг:,¹ 0.6 ммола Вос-А1а, 189 мг,

0.6 ммола Boc-Asp(ОсНх), 177 мг, 0.6 ммола Boc-Ser(Bzl) и 248 мг 0.66 ммола Boc-His(Bom) . Пептидната смола се обработва чрез стадии 1-8 от протокол 1 и после се третира с 0.25 мл оцетен анхидрид и 70 мл DIPEA в 20 мл метилен хлорид за 30 минути. Смолата се промива_?като се използват стадии 10-14.

После смолата селективно се деблокира чрез обработване чрез стадии 1-11 от протокол 2 , реагира двукратно с 77 мг ,0.37 ммола ДСС и 51 мг, 0.37 ммола НОВТ в 20 мл дестилиран ДМФА за 24 и за 72 часа, и после двукратно в 20 мл толуен за 24 и за 48 часа.Кайзеровият нинхидринов анализ е негативен. Смолата се промива чрез стадии 10-14.

След това смолата селективно се деблокира чрез третиране по стадии 1-11 от протокол 2 и реагира двукратно със <77 мг, 0.37 ί

ммола ДСС и 51 мг, 0.37 ммола НОВТ в 20 мл дестилиран ДМФА за 24 и 72 часа, и двукратно в 20 мл толуен за 24 и 48 часа. Кайзернинхидриновият анализ е негативен. След това смолата се промива, като се използват стадии 13-15 от протокол 2, и се суши под вакуум до добив 1.54 г.

Порция от 1.26 г, 0.122 ммола от тази смола се деблокира чрез обработване с hf . както в пример 3. Реакционната смес се изпарява и остатъкът се промива с 1 х 15 мл Et₂o и 3 х 15 мл EtOAc . Смолата се екстрахира с 3 х 20 мл 10% АсОН. Събраните водни екстракти се лиофилизират до получаване на 485 мг бяло твърдо вещество.

Този суров продукт се пречиства чрез гел филтрация върху Сефадекс Г-25 фин^както в пример 3, и се получават 83.5 мг получист продукт. След това той се пречиства чрез препаративна hplc, както в пример 3, с изключение на това, че 20-45% линеен градиент се пропуска за 3 часа. Главният пик се отделя чрез анализиране с аналитична HPLC на събраните фракции, утаяване и лиофилизиране до получаване на добив от 11.5 мг бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира чрез HPLC и дава коректен аминокиселинен анализ. FAB-MS ; МН изчислено 3277.8, намерено 3277.6.

ПРИМЕР 5.

Получаване на Ac-(orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸}.-VlP цикло (Asp⁸ -^-Orn¹²) (Ac-(SEQ ID Νο:23)-ΝΗ₂]

Порция от 1.92 г, 0.2 ммола Вос-хексадекапептидна смола от пример 3 се пропуска през дванадесет купелувания, като всеки цикъл се провежда с 364 мг, 0.8 ммола Boc-Orn(Fmoc) , 495 мг, 1.6 ммола ВОС- Thr(Bzl), 352 МГ, 0', 8 ММОЛа Boc-Tyr^/0 6-DCB), 102 МГ, 0.44 ммола Boc-Asn , 329 мг, 0.8 ммола Boc-Asp(OFm) , 495 мг, 1.6 ммола Boc-TRr(Bzl), 212 мг, 0.8 ммола Boc-Phe , 174 мг, 0.8 ммола Boc-Val, 151 мг,0.8 ммола Вос-А1а, 252 мг, 0.8 ммола Boc-Asp(OcHx),

I

236 мг, 0.8 ммола Boc-Ser(Bzl) и 330 мг, 0.88 ммола Boc-His(Bom) Пептидната смола се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.25 мл оцетен анхидрид и 70 мл dipea в 20 мл метилен хлорид за 30 минути. Смолата се промива_fкато се използват стадии 10-14 и се суши цяла нощ до получаване на 2.38 г.

Порция от 1.38 г, 0.11 ммола от тази смола след това селективно се деблокира чрез обработване със стадии 1-11 от протокол 2 и реагира с 55 мг, 0.27 ммола ДСС и 37 мг, 0.27 ммола НОВТ в 20 мл дестилиран ДМФА за 24 часа, в 20 мл толуен за 24 часа и още пет пъти в 20 мл дестилиран ДМФА за 24 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е слабо позитивен. Смолата се промива_;като се използват стадии 13-16 от протокол 2,и се суши под вакуум.

Порция от 0.8 г, 0.05 ммола от тази смола се деблокира чрез обработване₅както в пример 3,с HF . Получената реакционна смес се изпарява и остатъкът се промива с 1 х 15 мл Et₂cr и 3 х 15 мл EtOAc. Смолата се екстрахира с 3 х 20 мл 10% АсОН. Събраните водни филтрати се лиофилизират до получаването на 429 мг смолисто твърдо вещество.

Този суров продукт се пречиства чрез гел филтрация върху Сефадекс Г -25 фин_?както в пример З^до получаване на 107 мг получист продукт. Този материал се подлага отново на пречистване чрез препаративна HPLC , както в пример 3, с изключение на това, че 10-40% линеен градиент се пропуска за 3 часа. Главният пик се . отделя чрез анализ с аналитична HPLC и събраните фракции, утаени и лиофилизирани дават добив 17.5 мг бял аморфен прах. Това съединие се хомогенизира чрез HPLC и дава верен аминокиселинен анализ.

fab-ms : мн изчислено 3263.7^ намерено 3264.1

ПРИМЕР 6.

Получаване на Ac-(Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸)-VIP цикло (Lys⁸-> Asp¹²) (ac-(SEQ ID No^MhJ

Порция от 1.0 г, 0.1 ммола Вос-хексадекапептидна смола от пример 3 се прекарва през дванадесет цикъла на купелуване, като с 165 мг, 0.4 ммола Boc-Asp(OFm), 124 всеки от тях се осъществява

МГ,	0.4	ммола Boc-Thr(Bzl),	176	мг,	0.4	ммола
102	мг,	0.44 ммола Boc-Asn,	187	мг,	0.4	ммола
мг,	0.4	ммола Boc-Thr(Bzl),	106	мг,	0.4	ммола
0.4	ммола Boc-Val, 76 мг, 0	.4 ммола	Вос-	-Ala,

Boc-Tyr(2,6-DCB),

Boc-Lys(Fmoc), 124

Boc-Phe, 87 мг,

126 мг, 0.4 ммола

Boc-Asp(OcHx), 118 мг, 0.4 ммола Boc-Ser(Bzl) и 150 мг, 0.4 ммола

Boc-His(Bom). Пептидната смола се прекарва през стадии 1-8 от протокола и се обработва с 0.5 мл оцетен анхидрид и 35 мл dipea в мл метилен хлорид за 30 минути. Смолата се промива според стадии 10-14 и се суие цяла нощ до получаване на 1.2 г.

Порция от 0.8 г, 0.066 ммола от тази смола след това селективно се деблокира чрез обработване според стадии 1-11 от протокол 2 и после реагира с 58 мг, 0.13 ммола ВОР в 20 мл дестилиран ДМФА за 24 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Смолата се промива,като се използват стадии 13-16 от протокол 2_?и се суши под вакуум.

Смолата се деблокира чрез обработване с HF , както в пример 3. Реакционната смес се изпарява и остатъкът се промива с 1 х 15 мл EtjO и 3 х 15 мл EtOAc. Смолата се екстрахира с 3 х 20 мл 10% АсОН. Събраните водни филтрати се лиофилизират до получаване на смолеобразно вещество.

Суровият продукт се пречиства чрез гел филтрация върху

Сефадекс Г-25 фин_;както в пример З.и се получават 43.8 г получист продукт.Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc с, както в пример 3, с изключение, че 10-40% линеен градиент про4¾ пуска за 3 часа. Главният пик се отделя чрез анализиране с аналитична HPLC на събраните фракции, утаяване и лиофилизиране до получаване на 7.5 мг бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира

I чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ. FABtMS:MH изчислено 3277.8, намерено 3276.4.

ПРИМЕР 7.

Получаване на Ac-{Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸)-VIP

ЦИКЛО (G1u⁸4s>Orn¹²) {Ac-(SEQ ID No:25)-NH₂]

25.0 г Бензхидриламин кополистирен-1% дивинилбензен омрежена смола ( 17.5 mequiv 200-400 ASTM mesh,Bachem ) се накисва В 160 мл метилен хлорид, филтрува се и се промива, като се използват стадии 7-8 от протокола в таблица 1. Смолата отново се суспендира в 160 мл метилен хлорид и към полученото се прибавя 16.2 г,

52.5 ммола Boc-Thr(Bzl) и 5.4 г, 26.2 ммола дициклохексилкарбодиимид. Тази смес се разбърква 6 часа при стайна температура, филтрува се и после се осъществяват стадии 10-14 от протокол 1. Кайзернинхидриновият анализ е негативен. Нереагирелите аминогрупи се хващат чрез обработване на смолата с 5 мл оцетен анхидрид и 5 мл dipea в 150 мл метилен хлорид за 60 минути, филтрува се и се промива по стадии 13-14 от протокола. Смолата се суши под вакуум цяла иощ и се получава 29.6 г Boc-Thr(Bzl) -ВНА смола. Част от тази смола се подлага на аминокиселинен анализ, който показва доза от 0.21 ммола Thr/r.

Порция от 14.0 г, 2.94 ммола от тази смола се подлага на твърдофазов синтез, като се използва гореспоменатиятпротокол_?както в пример 2. Осъществяват се единадесет цикъла на купелуване всеки с

5.9 г, 23.5 ммола Boc-Leu, 5.1 г, 23.5 ммола Boc-Val, 6.9 г, 23.5 ммола Boc-Ser(Bzl), 3.0 г, 13.0 ммола Boc-Asn, 5.9 г, 23.5 ммола Boc-Leu, 10.3 г, 23.5 Boc-Tyr(2,6-DCB), 9.8 г, 23.5 ммола ВосLys(S-CI-z), 9.8 г, 23.5 ммола Boc-Lys(2-CI-Z), 5.1 г, 23.5 мола yQ

Boc-Val, 4.4 г, 23.5 ммола Вос-А1а.и 5.4 г, 23.5 ммола Boc-Nle и се получава 26 г Вос-декапептидна смола.

Порция от ι5.5 г, 0.61 ммола от тази смола се купелува в четири цикъла, всеки цикъл с по 655 мг, 2.7 ммола Boc-Gln, 2.0 г, 4.8 ммола Boc-Lys(2-CI-Z), 2.1 г, 4.8 ммола Boc-Arg(Tos) и 1.2 г, 4.8 ммола Boc-Leu. Смолата се суши под вакуум и се получава 6.2 г Вос-хексадекапептидна смола.

Порция от 2.0 г, 0.2 ммола от тази смола се прекарва през дванадесет цикъла на купелуване и всеки един с 91 мг, 0.2 ммола Boc-Orn(Fmoc), 250 мг, 0.8 ммола Boc-Thr(Bzl), 352 мг, 0.8 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 102 мг, 0.44 ммола Boc-Asn, 340 мг, 0.8 ммола Boc-Glu(OFm), 248 мг, 0.8 ммола Boc-Thr(Bzl), 212 мг, 0.8 ммола Boc-Phe, 174 мг, 0.Θ ммола Boc-Val, 152 мг, 0.8 ммола Вос-А1а, 252 мг, 0.8 ммола Boc-Asp(OcHx), 236 мг, 0.8 ммола Boc-Ser(Bzl) и 150 мг, 0.4 ммола Boc-His(Bom). Пептидната смола се пропуска в стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид и 38 мл DIPEA в 30 мл метилен хлорид за 180 минути. Смолата се промива,като ее използват стадии 10-14_уи се суши под вакуум до получаване на 2.4 г.

Порция от 1.15 г, 0.1 ммола от тази смола после селективно се деблокира чрез обработване според стадии 1-11 от протокол 2 и реагира двукратно с 58 г, 0.13 ммола ВОР и 400 мл dipea в 20 мл дестилиран ДМфА за 24 часа и за 6 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Смолата се промива_?като се използват стадии 13-16 от протокол 2,и се суши под вакуум до получаване 1.05 г.

Тази смола се деблокира чрез обработване с 9 мл HF , 1 мл анизол и 100 мл етандитиол за 1 час при 0°С. Реакционната смес се изпарява и остатъкът се промива с 2 х 15 мл Et₂O и 2 х 15 мл EtOAc. Смолата се екстрахира с 4 х 20 мл 10% АсОН. Събраните водни филтрати се лиофилизират и се получава добив от 385 мг бледо

5k жълто вещество.

Този суров продукт се пречиства чрез гел филтрация върху Сефадекс Г-25 фин,както в пример 3,до получаване 134 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC, както в пример 3, с разлика, че 26-36% линеен градиент се пропуска за 3 часа. Главният пик се отделя чрез анализ с аналитична HPLC на събраните фракции, утаява се и се лиофилизира до получаване на 23.2 мг бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира чрез hplc и показва точен аминокиселинен анализ.Fab-MS : 'ΜΗ изчислено 3277.8, намерено 3276.3.

ПРИМЕР 8.

Получаване на Ac-|Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VlP

ЦИКЛО (Lys¹² -> Glu¹⁶) ]Ac-(SEQ ID Νο:26'>-ΝΗ^| г Бензхидриламин кополистирен -1% дивинилбензен омрежена смола ( 21.4 mequiv , 200-4Q0 ASTM mesh,Bachem ) се третира,, както в пример 2 _?с изключение, че се използват 19.9 г Вос-

64.3 ммола и 6.6 г, 32.1 ммола дициклохексилкарбодиимид. Тази смес се разбърква 18 часа при стайна температура, филтрува се и после се осъществяват стадии 10-14 от протокол 1. Кайзер-нинхидt риновият анализ е негативен. Нереагиралите аминогрупи се улавят чрез обработване на смолата с 8 мл оцетен .анхидрид и 8 мл dipea в 200 мл метилен хлорид за 60 минути, филтрува се и се промива според стадии 13-14 от протокола. Смолата се суши под вакуум цяла нощ и се получава 34.2 г Boc-Thr(BzL) -ВНА смола. Част от тази смола се подлага на аминокиселинен анализ, който показва доза от 0.47 ммола Thr/r.

Порция от 0.85 г, 0.4 ммола от тази Вос-Thr(Bzl)-BHA смола се подлага на твърдофазов синтез върху Applied Biosystems модел 430А пептиден синтезатор. Всички купелувания се осъществяват чрез преформиряни симетрични анхидриди, получени от Вос-аминокиселина и дициклохексилкарбодиимид. Вос-аспарагин, Вос-глутамин и Вос-аргинин(тозил) се купелуват по обичаен начин^както съответните НОВТ активирани естери. Единадесет цикъла на купелуване са осъществени и всеки от тях с 499 мг, 2.0 ммала Boc-Leu, 435 мг, 2.0 ммола ВосVal, 590 мг, 2.0 ммола Boc-Ser(Bzl),464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn , 499 мг, 2.0 ммола Boc-Leu, 880 мг, 2.0 ммола Вос-Tyr (2,6-DCB),

830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-CI-Z), 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-CI-Z)

435 мг, 2.0 ммола Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1аи 462 мг, L.

2.0 ммола Boc-Nle до получаване на Вос-додекапептидна смола.

Тази смола се прекарва през пет цикъла на купелуване, както в пример 2, всеки един от тях с 340 мг, 0.8 ммола Boc-Glu(OFm), 664 мг, 1.6 ммола Boc-Lys(2-CI-Z), 685 мг, 1.6 ммола Boc-Arg(Tos), 398 мг, 1.6 ммола Boc-Leu.и 375 мг, 0.8 ммола Boc-Lys(Fmoc). Смолата се суши под вакуум и се получава 2.12 г Вос-хептадекапептидна смола.

Порция от 1.06 г, 0.2 ммола от тази смола после се деблокира селективно чрез обработване по стадии 1-11 от протокол 2 и реагира двукратно със' 177 мг, 0.4 ммола ВОР и 200 мл dipea в 20 мл дестилиран ДМФА за 2 часа и за 8 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е съвсем леко позитивен. Нереагиралите амино групи се улавят чрез третиране на смолата с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DiPEA/метилен хлорид за 10 минути, филтрува се и се промива по стадии 1316 от протокол 2. Тази смола после се пропуска през един цикъл на купелуване с 495 мг, 1.6 ммола Boc-Thr(Bzl) и след това обратно се поставя на Applied Biosystems 430 А пептиден синтезатор,както по-горе. Осъществяват се десет цикъла на купелуване всеки^както следва: 880 мг, 2.0 ммола Boc-Tyr(2₇6*DCB), 464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 618 мг, 2.0 ммола ВосThr(Bzl), 531 мг, 2.0 ммола Boc-Phe, 435 МГ, 2.0 ммола Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 590 мг,

I

2.0 ммола Boc-Ser(Bzl) и 819 мг, 2.0 ммола Boc-His(Tos). После пептидната смола се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и реагира с 0.5 мл оцетен анхидрид и 100 мл dipea в 20 мл метилен хлорид за 30 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 и се суши под вакуум.

Пептидната смола се деблокира,както в пример 7,до получаване на 340 мг суров пептид. Пептидът се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получава 35 мг получист продукт. Този материал по-нататък се пречиства чрез препаративна HPLC , както в пример 3, с изключение на това, че 25-35% линеен градиент се пропуска до получаване на 15.6 г бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms:МН изчислено 3276.6, намерено 3278.0.

ПРИМЕР 9.

Получаване на Ac-|Lys¹²,Nle^,Asp²⁴, Val²⁶,Thr²⁸J-VIP ЦИКЛО (Lys²0 Asp²⁴) {Ac-(SEQ ID No:27)-NH2J

Порция от 0.42 г, 0.2 ммола от Boc-Thr(Bzl) смолата от пример 8 се пропуска през девет цикъла на купелуване,всеки един с 200 мг, 0.8 ммола Boc-Leu, 174 мг, 0.8 ммола Boc-Val, 236 мг, 0.8 ммола Boc-Ser(Bzl), 329 мг, 0.8 ммола Boc-Asp(OFm), 200 мг, 0.8 ммола Boc-Leu, 352 мг, 0.8 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 332 мг, 0.8 ммола Boc-Lys(2-CI-Z), 375 мг, 0.8 ммола Boc-Lys(Fmoc) и 174 мг, 0.8 ммола Boc-Val.

Тази смола после се деблокира селективно чрез третиране със стадии 1-11 от протокол 2 и реагира със 177 мг, 0.4 ммола ВОР и 200 мл DIPEA в 20 мл дестилиран ДМФА за 6 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен.

Тази смола после се подлага на твърдофазов синтез върху Applied Biosystems модел 430А пептиден синтезатор,както в пример 8. Осъществяват се седемнадесет цикъла на купелуване всеки един с

378 мг, 2.0 ммола Boc-AIa, 462 мг, 2.0 ммола Boc-Nle,493 мг, 2.0 ммола Boc-Gln, 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-CI-Z),856 мг, 2.0 ммола Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммола Boc-Leu, 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys (2-CI-Z), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 880 мг, 2.0 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl),531 мг, 2.0 ммола Boc-Phe, 435 мг, 2.0 ммола Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммола Boc-AIa,630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx).и 590 мг, 2.0 ммола Boc-Ser(Bzl). Тази смола се прекарва през един цикъл на купелуване с 164 мг, 0.4 ммола Boc-His(Tos) и после преминава през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 1 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 30 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 от протокол 1,и се суши под вакуум до получаване на 1.94 г.

Порция от 0.97 г, 0.1 ммола от тази пептидна смола се деблокира, както в пример 7,до добив 265 мг суров пептид. Пептидът се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,до получаване на 149 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, за разлика с това, че се пропуска 2535 % линеен градиент и се получава 28.1 г бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ. FAB-MS :МН изчислено 3278.6, намерено 3278.8.

ПРИМЕР 10.

Получаване на Ac-jTys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr² ]-VIP ЦИКЛО (Lys²l -5*Asp²^) [Ac-(SEQ ID No:28)-NH2J

5.0 г Бензхидриламин кополистирен -1% дивинилбензен омрежена смола ( 2.6 mequiv, 200-400 ASTM mesh,Vega Biochem ) _ce накисва в 50 мл метилен хлорид, филтрува се и се промива_;като се използват стадии 7-8 от протокол 1. Смолата се ресуспендира в 60 мл метилен хлорид и се прибавя 2.32 г, 7.5 ммола Boc-Thr(Bzl) и 774 мг, 3.75 ммола дициклохексилкарбодиимид. Тази смес се разбърква 4 часа при стайна температура, филтрува се и после се осъществяват ста55 дии 10-14 от протокол 1. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Нереагиралите аминогрупи се улавят чрез обработване на смолата с 5 мл оцетен анхидрид и 5 мл dipea в 50 мл метилен хлорид за 60

I минути, филтрува се и се промива по стадии 13-14 от протокола. Смолата се суши под вакуум цяла нощ до получаване на 5.8 г от Boc-Thr(Bzl) -ВНА смола. Част от тази смола се подлага на аминокиселинен анализ, който показва доза от 0.276 ммола Thr/r.

Порция от 1.44 г, 0.4 ммола от тази смола се подлага на твърдофазов синтез,като се използват условията на протокол 1 и както е в пример 2. Осъществяват се три цикъла на купелуване всеки с 399 мг, 1.6 ммола Boc-Leu, 348 мг, 1.6 ммола Вос-Уа1.и 329 мг,

0.8 ммола Boc-Asp(OFm). Половината от тази смола, или 0.2 ммола се прекарва през четири цикъла на купелуване всеки с 204 мг, 0.88 ммола Boc-Asn, 199 мг, 0.8 ммола Boc-Leu, 352 мг, 0.8 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB) и 375 мг, 0.8 ммола Boc-Lys(Fmoc).

Тази смола после селективно се деблокира чрез обработване със стадии 1-11 от протокол 2 и реагира със 177 мг, 0.4 ммола ВОР в 20 мл И DIPEA/ДМФА за 2 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен.

Тази смола се прекарва през един цикъл на купелуване с 332 мг, 0.8 ммола Boc-Lys(2-CI- ) и после се подлага на твърдофазов синтез в Applied Biosystems модел 430А пептиден синтезатор както в пример 8. Осъществяват се деветнадесет цикъла на купелуване с 435 мг, 2.0 ммола Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 462 мг, 2.0 ммола Boc-Nle, 493 мг, 2.0 ммола Boa-Gin, 830 мг, 2.0 ммола ВосLys-(2-Cl-Z), 856 мг_ч 2.0 ММОЛа Boc-Arg(Tos), 499 МГ, 2.0 ммола Boc-Leu, 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-Cl-Z), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 880 мг, 2.0 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn,630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 531МГ , 2.0 ммола Boc-Phe,· 435 МГ, 2.0 ММОЛа Вос-А1а

378 мг, 2.0 ммол Boc-AIa, 630 мг, 2.0 ммол Boc-Asp(ОсНх),

590 мг, 2.0 ммол Boc-Ser(Bzl), и 819 мг, 2.0 ммол Boc-His(Tos) и после се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 1 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 30 минути. Смолата се промива^като се използват стадии 10-14 от протокол 1, и се суши под вакуум.

Тази пептидна смола се деблокира_fкакто в пример 7, до получаване на 210 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация както в пример 3,до получаване на 93 мг получист продукт. Този материал след това се пречиства чрез препаративна нрьс^както в пример 3, с изключение на това, че се пропуска 27-37% линеен градиент до получаване на 26.2 мг бял аморфен прах.Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ. fab-ms :МН изчислено 3305.8, намерено 3305.8

ПРИМЕР 11,

Получаване на Ac-(Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸} -VIP ЦИКЛО (Lys²¹ -5»-Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:29)-NH^

Порция от 0.4 г, 0.1 ммола бензхидриламинова смола (100200 astm mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез, като се използват условията на гореспоменатия протокол. Всички купелувания се осъществяват,като се използват еднакви моларни еквиваленти от Вос-аминокиселина и диизопропилкарбодиимид. Вос-аспарагин и Вос-глутамин са вкарани,както съответните активни естери_лчрез прибавянето на 1.5 моларен излишек НОВТ към купелуващата смес. Реакционното време обикновено е 2-18 часа за пълното провеждане на стадия на купелуване.Осъществени са девет цикъла на купелуване всеки с 309 мг, 1.0 ммол· Boc-Thr(Bzl), 249 мг, 1.0 Boc-Leu, 217 мг, 1.0 ммол Boc-Val, 206 мг, 0.5 ммол. Boc-Asp(OFm) 232 мг, 1.0 ммол Boc-Asn, 249 мг, 1.0 ммол Boc-Leu_f440 мг, 1.0 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 234 мг, 0.5 ммол Boc-Lys(Fmoc) и 415 мг, 1.0 ммол ВосТази смола после се деблокира селективно чрез обработване с етапи 1-11 от протокол 2 и реагира с 88 мг, 0.2 ммола ВОР в 20 мл 1% DIPEA/ДМФА за 2 часа. Кайзер-нинхидриновият янялиз е отрицателен.

Провеждат се деветнадесет цикъла на купелуване всеки с по

189 мг, 1.0 ммола Вос-А1а, 189 мг, 1.0 ммола Вос-А1а, 231 мг, 4.0 ммол Boc-Nle, 246 мг, 1.0 ммол Boc-Gln, 415 мг, 1.0 ммол Boc-Lys (2-Cl-Z),428 мг, 1.0 ммол Boc-Arg(Tos), 249 мг, 1.0 ммол Boc-Leu 415 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z), 309 мг, 1.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 440 мг, 1.0 ммол Boc-Tyr(2,6-DCB), 232 мг, 1.0 ммол Boc-Asn, 315 мг, 1.0 ммол Boc-Asp(OcHx), 309 мг, 1.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 265 мг 1.0 ммол Boc-Phe, 217 мг, 1.0 ммол Boc-Val, 189 мг, 1.0 ммол Вос-А1а<, 315 мг, 1.0 ммол Boc-Asp(OcHx), 295 мг, 1.0 ммол Boc-Ser (Bzl) и 409 мг, 1.0 ммол Boc-His(Tos). Пептидната смола после се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 10 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 30 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14,и се суши под вакуум.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,до получаване на суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3_?до получаване на 215 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, с изключение на това , че се пропуска 26-36% линеен градиент и се получава добив 20.1 мг бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира чрез HPLQi показва точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: мн изчислено 3277.6, намерено 3277.7 ПРИМЕР 12.

Получаване на Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵

Vai²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹’^3O,Met³¹)-VIP (1B-31)-NH2 ЦИКЛО (Lys²¹ _>.Asp²⁵) [Ac -(SEQ ID No:30)-NH₂^

Порция от 0.4 г, 0.1 ммол бензхидриламинова смола (100-200

5«

ASTM, mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,както в пример 11. Провеждат се три цикъла на купелуване всеки с 249 мг, 1.0 ммол Boc-Met, 175 мг, 1.0 ммол Boc-Gly, и 175 мг, 1.0 ммол Boc-Gly*

I

Девет цикъла на купелуване и циклизирането се осъществяват,както в пример 11. Деветнадесет цикъла на купелуване се осъществяват,както в пример 11, с разликата, че Вос-Ala в десетия цикъл е заместен от 217 мг, 1.0 ммол Boc-Val, Boc-Tyr(2,6-DCB) в деветнадесетия цикъл е заменен от 158 мг, 0.5 ммола Вос-2-Nal и Boc-Phe в двадесет и третия цикъл е заменен с 142 мг, 0.5 ммол Boc-p-F-Phe.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, и се получава 345 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3, и се получава 215 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разликата, че се пропуска 30-40% линеен градиент, и се получава 16.4 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ.fab-ms :МН изчислено 3574.7, намерено 3575.1

ПРИМЕР 13.

Получаване на Ac-^Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸)-VIP цикло (Lys²¹ Asp²⁵) [ac-(SEQ ID No:31)-NH₂]

Порция от 0.4 г, 0.1 ммол бензхидриламин смола (100-200 ASTM mesh, Bachem ) се подлага на твърдофазов синтез^както в пример 11. Девет цикъла на купелуване и циклизирането се осъществяват,както в пример 11. Деветнадесет цикъла на купелуване се провеждат,както в пример 11,с разликата, че Вос-AIa в десетия цикъл е заместен от 217 мг, 1.0 ммол Boc-Val, Boc-Lys(2-Cl-z ) в седемнадесетия цикъл е заместен с 366 мг, 1.0 ммол Boc-Orn(Z) и Boc-Asp(OcHx) в двадесет и първия цикъл е заменен от 337 мг, 1.0 ммол Boc-Glu(Bzl).

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, и се получава 255 мг суров пептид. Той пречиства чрез гел филтрация,както t с в пример 3_;до получаване на 200 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, с разликата, че се пропуска 28-38% линеен градиент и се получава добив

I

30.7 мг бял аморфен прах.Съединението се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms:МН изчислено 3305.8 намерено 3305.5

ПРИМЕР 14.

Получаване на Ac-£p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁸,Thr²⁸Gly²⁹’³⁰,Cys(Acm)³¹^-VIP (1-31)-NH₂ ЦИКЛО (Lys²¹ -^>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:32)-Nh£|

0.4 r, 0.1 ммол Бензхидриламин смола ,100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез_?както в пример 11. Провеждат се три цикъла на купелуване всеки един с 292 мг, 1.0 ммол Boc-Cys(Acm), 175 мг, 1.0 ммол Boc-Gly,H 175 мг, 1.0 ммол Boc-Gly. Девет цикъла на купелуване се осъществяват и циклизиране,както в пример 11. Деветнадесет цикъла на купелуване се провеждат^както в пример 11, с изключение на това, че Boc-Phe в двадесет и трети цикъл е заместен с 142 мг, 0.5 ммола Boc-p-F-Phe.

Тази пептидна смола се дееблокира,както в пример 7^и се получават 268 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получават 165 мг получист продукт. Материалът после се пречиства чрез препаративна НРЦС^както в пример 3, с разликата, че се пропуска 25-35% линеен градиент и се получават

28.1 мг бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ.fab-ms :МН изчислено

3584.1, намерено 3584.0

ПРИМЕР 15.

Получаване на Ac-fAla²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸^VIP цикло (Lys²¹ --3- Asp²⁵) £ac-(SEQ ID No:33|-NH₂·]

1.5 r, 0.4 ммола Бензхидриламин смола (100-200 Astm mesh,Bachem) Q се подлага на твърдофазов синтез в Applied Biosystems модел 430А пептиден синтезатор,както в пример 11. Провеждат се единадесет цикъла на купелуване всеки с 619 мг, 2.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 499 мг, ‘2.0 ммол Boc-Leu, 435 мг, 2.0 ммола Boc-Val, 822 мг, 2.0 ммол Boc-Asp(OFm) 464 мг, 2.0 ммол Boc-Asn, 499 мг, 2.0 ммол Boc-Leu 880 мг, 2.0 ммол Boc-Tyr(2,6-DCB) и 938 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(Fmoc)

Тази смола после селективно се деблокира чрез обработване според стадии 1-11 от протокол 2 и реагира с 356 мг, 0.8 ммола ВОР в 20 мл 1% dipea/ДМФА за 2 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Смолата се промива.като се използват стадии 1316,от протокол 2 и се суши под вакуум до получаване на 1.9 г Вос-октапептидна смола.

Порция от 0.95 г, 0.2 ммола от тази смола отново се подлага на твърдофазов синтез в Applied Biosystems пептиден синтезатор модел 430А,както в пример 11. Провеждат се единадесет цикъла на купелуване всеки един с 830 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z), 378 мг 2.0 ммол Вос-А1а, 378 мг, 2.0 ммол . Вос-А1а, 462 мг, 2.0 ммол Boc-Nle, 493 мг, 2.0 ммол Boc-Gln, 830 мг, 2.0 ммол'. Boc-Lys (2-C1-Z), 856 мг, 2.0 ммол Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммол·' BocLeu, 830 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(2-DCB ), 618 мг, 2.0 ммол' Boc-Thr (Bzl), 880 мг, 2.0 ммол Boc-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммол* BocAsn, 630 мг, 2.0 ммол Boc-Asp(OcHx), 618 мг, 2.0 ммол' Boc-Thr (Bzl), 531 мг, 2.0 ммол Boc-Phe, 435 мг, 2.0 ммол Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммол .. Вос-AIa, и 630 мг, 2.0 ммол/ Boc-Asp(OcHx) до получаването на 1.54 г Вос-хексакозапептидна смола.

Порция от 0.77 г, 0.1 ммол от тази смола се подлага на твърдофазов синтез, като се използва гореспоменатият протокол, при условията на пример 2. Провеждат се два цикъла на купелуване с 76 мг, 0.4 ммол Вос-AIa и 328 мг, 0.8 Ммол. Boc-His(Tos). Получената пептидна смола се прекарва през стадии 1-8 от протокол 1 и реаги6А pa c 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% dipea /метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14,и се суши под вакуум до получаване на 0.74 г.

t

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,до получаване 172 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,до получаване на 110 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разликата, че се пропуска 22-37% линеен градиент, и се получават 40.0 мг бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms :МН изчислено 3261.7, намерено 3261.8

ПРИМЕР 16.

Получаване на Ac-(N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵Val²⁶, Thr²⁸}-VIP ЦИКЛО (Lys²¹ Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID Νο:34)-ΝΗ₂“]

Порция от 0.77 г, 0.1 ммол Вос-хексаокозапептидна смола от пример 15 се подлага на твърдофазов синтез^като се използва горния протокол,както в пример 2. Провеждат се два цикъла на купелуване с 118 мг, 0.4 ммол. Boc-Ser(Bzl) и 81 мг, 0.4 ммола Boc-N-Me-Ala. Пептидната смола се прекарва през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 442 мг, 1.0 ммол ВОР, 57 мл, 1.0 ммол оцетна киселина и 523 мл, 3.0 ммол DIPEA в 20 мл ДМФА за 6 часа и после с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DIPEA/метилен хлорид за 60 минути.Смолата се промива,като се използват стадии 10-14,и се суши под вакуум до получаване на 0.73 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,до получаване на 191 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,до получаване на 138 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc , както в пример 3, с разликата, че се пропуска 22-37% линеен градиент и се получава 28.0 мг аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC (ύΐ и показва точен аминокиселинен анализ. FAB-MS :МН изчислено

3225.4, намерено 3225.8

ПРИМЕР 17.

Получаване на Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸JVIP Цикло (Lys²¹ Asp²⁵) £ac-(SEQ ID No:35)-NH₂]

4.0 r, 1.08 ммола Бензхидриламин смола, 100-200 ASTM mesh, Bachem ) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 2 „както в пример 2. Провеждат се единадесет цикъла на купелуване всеки с 1.34 г, 4.3 ммол. Boc-Thr(Bzl), 925 мг, 4.3 ммолBoc-Leu, 938 мг, 4.3 ммол : Boc-Val, 889 мг, 2.1 ммол Boc-Asp(OFm) 557 мг, 2.4 ммол Boc-Asn , 925 мг, 4.3 ммол Boc-Leu, 1.9 г, 4.3 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB) и 1.1 Г, 4.3 ммол Boc-Lys(Fmoc).

След това смолата селективно се деблокира чрез третиране по стадии 1-11 от протокол 2 и реагира с 885 мг, 2.0 ммола ВОР в 20 мл 1% DIPEA/ДМФА за 2 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Смолата се промива,като се използват стадии 13-16_?от протокол 2. Тази смола се прекарва през един цикъл на купелуване с 1.79 г, 4.3 ммола Boc-Lys (2-C1-Z) и се суши под вакуум до получаване на 6.3 г Вос-нонапептидна смола.

Порция от 1.89 г, 0.3 ммола от тази смола се провежда през девет цикъла на купелуване всеки с 227 мг, 1.2 ммол Вос-А1а, 227 мг, 1.2 ммол Вос-А1а, 278 мг, 1.2 ммол Boc-Nle, 325 мг, 1.32 ммол Boc-Gln, 498 мг, 1.2 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z), 514 мг,

1.2 ммол Boc-Arg(Tos), 299 мг, 1.2 ммол Boc-Leu,498 мг, 2.0 ммол Boc-Leu, и 371 мг, 1.2 ммол Boc-Thr(Bzl) и се получават 2.06 г Вос-октадекапептидна смола.

Порция от 0.68 г, 0.1 ммол от тази смола преминава през десет цикъла на купелуване всеки с 126 мг, 0.4 ммол Вос-2-Nal, 102 мг, < J

0.44 ммол Boc-Asn, 126 мг, 0.4 Boc-Asp (OcHx)jl24 мг, 0.4 ммол Boc-Thr(Bzl), 106 мг, 0.4 ммол Boc-Phe, 87 мг,0.4 ммол Boc-Val, ¢2) мг, 0.4 ммол Boc-AIa, 126 мг, 0.4 ммол Boc-Asp(OcHx), 118 мг, 0.4 ммол Boc-Ser(Bzl), и 164 мг, 0.4 ммол Boc-His(Tos) . Пептидната смола се прекарва през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% dipea /метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14_?и се суши под вакуум до получаване на 0.82 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, до получаване на 261 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример З.и се получава 186 мг получист продукт. Той после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разликата,че се пропуска 30-40% линеен градиент до получаване на 60.1 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ.fab-ms :МН изчислено 3296.8, намерено 3295.6

ПРИМЕР 18,

Получаване на Ac-[o-Me-Tyr^1O,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸J-VIP цикло (Lys²¹ Asp²⁵) fAc-(SEQ ID No:36)-NH₂”)

Порция от 0.68 r, 0.1 ммол Вос-октадекапептидна смола от пример 17 се пропуска през десет цикъла на купелуване,както в пример 17, с разликата, че Вос-2-Nal в деветнадесетия цикъл е заменен с 59 мг, 0.2 ммол Вос-Туг(О-Ме) до получаване на 0.61 г.

Тази пептидна смола се деблокира_Ткакто в пример 7,до получаване на 175 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,до получаване добив 136 мг получист продукт.Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разликата, че се пропуска 28-38% линеен градиент и се получава

42.4 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-ms:MH изчислено 3276.7, намерено 3276.0

ПРИМЕР 19.

Получаване на Ac-(p-F-Phe⁶,p-NH₂-Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸J-VIP цикло (Lys²¹ -^>Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID

No:37)-NH₂·)

Порция от 0.625 г, 0.09 ммола Вос-октадекапептидна смола се прекарва през десет цикъла на купелуване_;както в пример 17, с разликата, че Вос-2-Nal в деветнадесети цикъл е заместен със 166 мг, 0.4 ммол . Boc-p-NH(z)-Phe и Boc-Phe в двадесет и трети цикъл е заместен със 113 мг, 0,4 ммола Boc-p-F-Phe до получаване на 0.84 г.

Тази пептидна смола се деблокира.както в пример 7,и се получават 182 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3 и се получава 160 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc , както в пример 3, с разликата, че се пропуска 25-35% линеен градиент и се получава 47.2 мг бял аморфен прах. Това съединение се хомогенизира чрез hplc и показва точен аминокиселинен анализ.fab-ms :МН изчислено 3279.7, намерено 3279.8

ПРИМЕР 20. Получаване на Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶Lys²⁷’²⁸)-VIP цикло (Lys²¹ -^Asp²⁵) {Ac-(SEQ ID Νο:38)-ΝΗ₂“]

1.25 г, 1.0 ммол Бензхидриламин смола, 100-200 ASTM mesh, Bachem ) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се единадесет цикъла на купелуване всеки с 1.66 г, 4.0 ммол. Boc-Lys(2-Cl-z ), 1.66 г, 4.0 ммол Boc-Lys(2-C1-Z), 925 мг, 4.0 ммол Boc-Leu, 823 мг, 2.0 ммол Boc-Asp(OFm), 511 мг, 2.2 ммол Boc-Asn, 925 мг,4.0 ммол Boc-Leu, 1.76 г, 4.0 ммол Boc-Tyr(2,6-DCB) и 937 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(Fmoc).

След това тази смола селективно се деблокира чрез третиране по стадии 1-11 от протокол 2 и реагира с 885 мг, 2.0 ммол ВОР в (q5 мл 1% dipea /ДМФА за 2 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Смолата се промива,като се използват стадии 13-16 от протокол 2.

I

Тази смола се прекарва през един цикъл на купелуване с

1.66 г, 4.0 ммол. Boc-Lys(2-C1-Z) и се суши под вакуум до получаване на Вос-нонапептидна смола.

Порция от 0.54 г, 0.2 ммола от тази смола се подлага на твърдофазов синтез в Applied Biosystems модел 430А пептиден синтезатор^ както в пример 8. Провеждат се единадесет цикъла на купелуване всеки с 378 мг, 2.0 ммол Вос-А1а, 378 мг, 2.0 ммол Вос-А1а, 462 мг, 2.0 ммол Boc-Nle, 493 мг, 2.0 ммол Boc-Gln, 830 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(2-C1-Z), 856 мг, 2.0 ммол Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммол Boc-Leu, 830 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(2-C1-Z), 618 мг, 2.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 880 мг, 2.0 ммол Boc-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммол/ Boc-Asn, 630 мг, 2.0 ммол Boc-Asp(OcHx), 618 мг, 2.0 ммол. Boc-Thr((Bzl) 531 мг, 2.0 ммол/. Boc-Phe, 435 мг, 2.0 ммол Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммол Вос-А1а, 630 мг, 2.0 ммол Boc-Asp (ОсНх), и 590 мг, 2.0 ммол. Boc-Ser(Bzl) и се получава 1.16 г Вос-хептакозапептидна смола.

Порция от 0.54 г, 0.1 ммол от тази смола се прекарва през един цикъл на купелуване с 819 мг, 2.0 ммол Boc-His(Tos) и после се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се обработва с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% dipea/метилен хлорид за 60 минути.Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 от протокол 1_?и се суши под вакуум до получаване на 0.5 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, с разликата, че се използват 5 мл HF и 0.5 мл анизол и се получава 127 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация както в пример 3 и се получава 74.6 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC , както в пример 3, с разлика, че се пропуска 24-34% линеен градиент и се получава 17.1 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ. fab-MS :МН изчислено 3333.8, намерено k

3333.4

ПРИМЕР 21,

Получаване на Ac-£N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28'| VIP ЦИКЛО (Lys²¹ Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:39)-Nh£]

Порция от 0.58 г, 0.1 ммол Вос-хептакозапептидна смола от пример 20 се пропуска през един цикъл на купелуване с 81 мг, 0.4 ммола Boc-N-Me-AIa и после преминава през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 443 мг, 1.0 ммол ВОР, 57 мл,1.0 ммол оцетна киселина и 523 мл, 3.0 ммола DIPEA в 20 мл ДМФА за 6 часа и с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 60 минути.Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 от протокол 1,и се суши под вакуум до получаване на 0.4 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 20_?до получаване на 165 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3 и се получават 101 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 24-34% линеен градиент и се получава добив'19.8 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms :МН изчислено

3281.8, намерено 3281.9

ПРИМЕР 22.

Получаване на Ac-£Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶Lys^27,28JVIP ЦИКЛО (Lys²¹ Asp²⁵) fAc-(SEQ ID Νο:40)-ΝΗ₂Ί

Порция от 0.54 г, 0.2 ммол Вос-нонапептиидна смола от пример 20 се подлага на твърдофазов синтез в пептиден синтезатор Applied Biosystems модел 430А,както в пример 8. Провеждат се единадесет цикъла на купелуване всеки с 378 мг, 2.0 ммол Вос-А1а, (¢4

I

378 мг, 2.0 ммол Boc-AIa, 462 мг, 2.0 ммол Вос- Nig 493 мг, 2.0 ммол Boc-Gln, 830 мг, 2.0 ммол Вос-Lys(2-C1-Z), 856 мг, 2.0 ммол Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммол Boc-Leu, 830 мг, 2.0 ммол Вос-Lys(2-C1-Z ), 618 мг, 2.0 ммол Boc-^Thr(Bzl), 880 мг, 2.0 ммол Вос-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммол Boc-Asn, 675 мг,2.0 ммол. Boc-Glu(OBzl),618 мг, 2.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 531 мг, 2.0 ммол Boc-Phe, 435 мг, 2.0 ммол Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммол Boc-AIa,

630 мг, 2.0 ммол Boc-Asp(ОсНх) и 590 мг, 2.0 ммол Boc-Ser(Bzl) и се получават 0.58 г Вос-хептакозапептидна смола.

Тази смола участва в един цикъл на купелуване съв 164 мг,

0.4 ммола Boc-His(Tos) и после се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DIPEA/ метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 от протокол 1,и се суши под вакуум до получаване на 0.53 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, с разлика, че се използват 5 мл HF и 0.5 мл анизол и се получава 151 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3 и се получава 110 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC както в пример 3, като за разлика се пропуска 23.5-33.5% линеен градиент и се получава 22.8 г бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS :МН изчислено 3347.9, намерено 3347.0

ПРИМЕР 23.

Получаване на Ac-(o-Me-Tyr^1O,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹Asp²⁵,Vai²⁶Thr²⁸)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹ -9-Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID No:41)-NH^J

Порция от 1.84 г, 0.3 ммол от Вос-нонапептидна смола от пример 17 се подлага на твърдофазов синтез в пептиден синтезатор Applied Biosystems модел 430А,К7к:то в пример 8. Провеждат се девет цикъла на купелуване всеки с 378 мг, 2.0 ммол Вос-А1а,

378 мг, 2.0 ммол . Вос-А1а, 462 мг, 2.0 ммол·' Boc-Nle, 493 мг, 2.0 ммол. Boc-Gln, 830 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(2-C1-Z), 856 мг, 2.0 ммол

I

Вос-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммол.. Boc-Leu, 830 мг, 2.0 ммол

Вос-Lys(2-Cl-Ζ) и 618 мг, 2.0 ммол Boc-Thr(Bzl) и се получава

2.2 г Вос-октадекапептидна смола.

Порция от 0.73 г, 0.1 ммол от тази смола се пропуска през десет цикъла на купелуване, всеки цикъл съответно с 59 мг, 0.2 ммола Вос-Туг(О-Ме), 102 мг, 0.44 ммол Boc-Asn, 126 мг, 0.4 ммол. Вос-Asp(OcHx), 124 мг, 0.4 ммол . Boc-Thr(Bzl), 106 мг, 0.4 ммола Boc-Phe, 87 мг, 0.4 ммол. Boc-Val, 76 мг, 0.4 ммол. Вос-А1а, 126 мг, 0.4 ммол. Вос-Asp(OcHx), 118 мг, 0.4 ммол. Boc-Ser(Bzl) , и 164 мг, 0.4 ммол Boc-His(Tos) . Пептидната смола се прекарва през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метиЛен хлорид за 60 минути. Смолата се промива, като се използват стадии 10-14,и се суши под вакуум до получаване на 0.77 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7 до получаване на 187 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация_f\ както в пример 3, и се получава 131 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 26-36% линеен градиент и се получава

5.3 г бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms :МН изчислено

3291.8, намерено 3291.7

ПРИМЕР 24.

Получаване на Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵Leu²⁶, Lys^27,28,Ala²⁹⁸³¹^ - VIP ЦИКЛО (Lys²¹ -*>Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID No:42)-Nh£)

1.1 г, 0.5 ммола Бензхидриламинова смола, 200-400 astm mesh, Biomega) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Тринадесет цикъла на купелуване се провеж-

I дат всеки цикъл съответно с 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 378 мг, 2.0 ммол Вос-А1а, 378 мг, 2.0 ммол . Вос-А1а, 830 мг, 2.0 ммол. Boc-Lys(2-C1-Z), 830 мг, 2.0 ммол. Boc-Lys(S-Cl-Z), 499 мг, 2.0 ммол Boc-Leu, 823 мг, 2.0 ммол Boc-Asp(OFm), 5Ц мг, 2.2 ммол Boc-Asn, 499 мг, 2.0 ммол . Boc-Leu, 881 мг, 2.0 ммола Вос-Туг (2,6-DCB), 936 мг, 2.0 ммол . Boc-Lys(Fmoc) , 830 мг, 2.0 ммол. Boc-Lys(2-C1-Z) и 378 мг, 2.0 ммол . Вос-А1а.

Тази смола после се деблокира селективно чрез третиране по стадии 1-11 от протокол 2 и реагира с 443 мг, 1.0 ммол ВОР в 20 мл 1% dipea/ДМФА за 1 час. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Смолата се промива,като се използват стадии 13-16 от протокол 2^и се суши под вакуум до получаване на 2.02 г Вос-тридекапептидна смола.

Порция от 0.8 г, 0.2 ммола от тази смола се подлага на твърдофазов синтез в пептиден синтезатор Applied Biosystems модел 430А,както в пример 8. Провеждат се шестнадесет цикъла на купелуване, всеки цикъл съответно с 378 мг, 2.0 ммол Вос-А1а, 462 мг, 2.0 ммол Boc-Nle, 493 мг, 2.0 ммол. Boc-Gln, 830 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z), 856 мг, 2.0 ммол. Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммол Boc-Leu, 830 мг, 2.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z), 618 мг, 2.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 880 мг, 2.0 ммол Boc-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммол Boc-Asn, 630 мг, 2.0 ммол Boc-Asp(OcHx), 618 мг, 2.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 531 мг, 2.0 ммол Boc-Phe, 435 мг, 2.0 ммол Boc-Val 378 МГ, 2.0 ММОЛ Boc-Ala, и 630МГ , 2.0 ММОЛа Boc-Asp(OcHx) и се получава 1.2 г Вос-нонакозапептидна смола.

Порция от 0.6 г, 0.1 ммол от тази смола участва в два цикъла на купелуване,както по-горе,с 590 мг, 2.0 ммола Boc-ser(Bzl) и ю

Boc-His(Tos) и се получава 0.72 г. После тази смола се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DiPEA/метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 от протокол 1,и се суши под вакуум до получаване на 0.645 г.

Тази пептидна смола се деблокира_?както в пример 7,до получаване на 280 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получават 160 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc , както в пример 3, с разликата, че се пропуска 22-32% линеен градиент, при което се получава 23.1 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и показва точен аминокиселинен анализ. FAB-MS :МН изчислено 3561.1, намерено 3560.8

ПРИМЕР 25.

Получаване на Ac-fAla^Glu^Lys^^Nle'^jAlal’^Asp^jLeu²⁸, Lys ’ ,А1а J-VIP ЦИКЛО (Lys —»-Asp )

Pac-(SEQ ID Νο:43)-ΝΗ£|

Порция от 0.6 г, 0.1 ммол Вос-нонакозапептидна смола от пример 24 се прекарва през два цикъла на купелуване ,както по-горе,с 590 мг, 2.0 ммола Boc-Ser(Bzl) и 819 мг, 2.0 ммола Boc-His(Tos) и се получава 0.68 г. Тази смола после се пропуска през стадии 18 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DiPEA/метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива .като се използват стадии 10-14 от протокол- 1,и се суши под вакуум до получаване на 0.56 г.

Тази пептидна смола се деблокира.както в пример 7,и се получава 160 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3_?и се получава 70 мг получист продукт. Този материал после се причества чрез препаративна HPLC^aKTO в пример 3, с разлиΉ ката, че се пропуска 25-35% линеен градиент и се получава 21.8 г бял аморфен прах.Съединението се хомогенизира чрез hplc и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms ; ΜΗ изчислено 3545.1, намерено 3545.3 ПРИМЕР 26.

Получаване на Ac-jb-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷ ’ ²⁸J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹ —^Asp²^) [Ac-(SEQ ID No:44)NH₂)

Порция от 1.1 г, 0.4 ммол Вос-нонапептидна смола от пример 20 се подлага на твърдофазов синтез в пептиден синтезатор модел 430А Applied Biosystems както в пример 8. Провеждат се седемнадесет цикъла на купелуване, всеки цикъл съответно с 378 мг, 2.0 ммола Boc-AIa, 378 мг, 2.0 ммола Boc-AIa, 462 мг, 2.0 ммола Boc-Nle , 493 мг, 2.0 ммола Boc-Gln , 830 мг, 2.0 ммола Boc-^LY^S(2-C1-Z), 856 мг, 2.0 ммола Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммола ВосLeu, 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-C1-Z), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr (Bzl),880 мг, 2.0 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 531 мг, 2.0 ммола Boc-Phe, 435 мг, 2.0 ммола Boc-Val 378 мг, 2.0 ммола Boc-AIa и 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx) и се получава 2.24 г Вос-хексакозапептидна смола.

Порция от 1.1 г, 0.2 ммола от тази смола се прекарва през два цикъла на купелуване с 238 мг, 0.8 ммол Boc-Ser(Bzl) и 163 мг, 0.8 ммол Boc-N-Me-AIa и после се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира със 100 мг, 0.2 ммола BOP-CI, 23 мл, 0.2 ммол оцетна киселина и 140 мл, 0.4 ммол dipea в 20 мл ДМФА за 1 час. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 от протокол 1_?и се суши под вакуум до получаване на 0.95 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получава 245 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация.

както в пример 3,и се получава 165 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC , както в пример 3, с разликата, че се пропуска 25-35% линеен градиент,и се получават

33.7 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ. FAB-MS : МН изчислено 3295.8 намерено 3294.5

ПРИМЕР 27,

Получаване на Ac-{p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys^27,28J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹ —> Asp²⁵) [ac-(SEQ ID No:45)-NH₂1

2.49 r, 2.0 ммола бензхидриламинова смола, 100-200 astm mesh, Bachem ) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се шест цикъла на купелуване,като всеки цикъл съответно е с 3.32 г, 8.0 ммола Boc-Lys(2-Cl-z), 3.32 г,8.0 ммола Boc-Lys(2-Cl-Z), 1.85 г, 8.0 ммола Boc-Leu, 823 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OFm), 1.02 г, 4.4 ммола Boc-Asn, и 1.05 г, 8.0 ммола Boc-Leu. Смолата се суши и се отделя 0.4 ммол . Провеждат се още три цикъла на купелуване всеки цисъл съответно с 2.52 г,

6.4 ммола Вос-Tyr(2,6-DCB), 1.87 г, 6.4 ммола Boc-Lys(Fmoc) и 2.65 г, 6.4 ммола Boc-Lys(2-C1-Z).

Тази смола после се деблокира селективно чрез третиране по стадии 1-11 от протокол 2 и реагира с 1.42 г, 3.2 ммола ВОР в 20 мл 1% dipea/ДМФА за 4.5 часа. Кайзер-нинхидриновият анализ е негативен. Смолата се промива,като се използват стадии 13-16 от протокол 2,и се суши до получаване на 6.56 г Вос-нонапептидна смола.

Порция от 1.64 г, 0.4 ммол от тази смола се подлага на твърдофазов синтез,както в пример 8,в пептиден синтезатор модел Applied Biosystems модел 430А. Осъществяват се тринадесет цикъла на купелуване всеки съответно с 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 462 мг, 2.0 ммола Boc-Nle, 493 мг, 2.0 ммола Boc-Gln, 13

830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-C1-Z), 856 мг, 2.0 ммола Boc-Arg(Tos) 499 мг, 2.0 ммола Boc-Leu, 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-ci-z),

618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 880 мг, 2.0 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB)

464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx) и 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl) и се получава 2.56 г Вос-докозапептидна смола.

Порция от 0.64 г, 0.1 ммола от тази смола се прекарва през шест цикъла на купелуване всеки цикъл съответно с 283 мг, 1.0 ммола Boc-p-F-Phe, 218 мг, 1.0 ммол Boc-Val, 189 мг, 1.0 ммол. Вос-AIa, 315 мг, 1.0 ммол Boc-Asp(OcHx), 295 мг, 1.0 ммол Boc-Ser (Bzl), и 818 мг, 2.0 ммола Boc-His(Tos). Пептидната смола се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% dipea /метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива_;като се използват стадии 10-14,и се суши под вакуум до получаване на 0.69 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получават 224 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример З.до получаване на 213 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разликата, че се пропуска 27-37% линеен градиент и се получава

70.5 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено 3365.9 намерено 3365.6

ПРИМЕР 28.

Получаване на Ac- [1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷ * ²⁸J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹ ->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:46)-NH₂J

Порция от 1.28 г, 0.2 ммол Вос-докозапептидна смола от пример 27 се прекарва през шест цикъла на купелуване,както в пример-/' 27,с разликата, че Boc-p-F-Phe в първия цикъл е заменен с 315 мг, 1.0 ммол Вос-1- Nal. Пептидната смола се пропуска през стадии

1-8 от протокол 1 и се обработва с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14„и се суши под вакуум до получаване 1.41 г.

ί

Тази пептидна смола се деблокира.както в пример 7,и се получават 420 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация.както в пример 3 и се получават 305 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 25-35% линеен градиент и се получава 66.9 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и показва точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: ΜΗ изчислено 3398.0, намерено 3398.8 ПРИМЕР 29.

Получаване на Ac-[Glu⁸,p-NH2-Phe^1O,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷’²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹ -^в-Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:47)-NH2]

Порция от 1.64 г, 0.4 ммол Вос-нонапептидна смола от пример 27 се подлага на твърдофазов синтез в пептиден синтезатор модел 430А Applied Biosystems , както в пример 8. Провеждат се девет цикъла на купелуване всеки цикъл съответно с 378 мг, 2.0 ммола ВосА1а, 378 мг, 2.0 ммола Вос-AIa, 462 мг, 2.0 ммола Boc-Nle, 493 мг, 2.0 ммола Boc-Gln,830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-Cl-Z), 856 мг, 2.0 ммола Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммола Boc-Leu, 830 мг, 2.0 ммола Вос-Lys(2-C1-Z), и 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl) и се получават

2.2 г Вос-октадекапептидна смола.

Порция от 1.1 г, 0.2 ммол от тази смола се пропуска през десет цикъла на купелуване всеки цикъл съответно с 415 мг, 1.0 ммол Boc-p-NH(CBZ)-Phe , 512 мг, 2.2 ммола Boc-Asn, 675 мг, 2.0 ммола Boc-Glu(Bzl), 620 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl),532 МГ, 2.0 ММОЛа Boc-Phe, 436 мг, 2.0 ммола Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммола Вос-AIa, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 590 мг, 2.0 ммола Boc-Ser(Bzl) и 1.64 г, 4.0 ммола Boc-His(Tos) . Пептид^т=та смола се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 60 минути.Смолата се промива,като се използват стадии 10-14₇и се суши под вакуум до получаване на 1.45 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получават 580 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,и се получава 400 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc.както в пример 3, с раслика, че се пропуска 22-32% линеен градиент и се получава

60.9 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ, fab-ms; ΜΗ изчислено 3346.9, намерено 3346.8

ПРИМЕР 30.

Получаване на Ac-(Glu⁸,O-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, LyS²⁷’²⁸J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^-Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID No:48)-NH23

Порция от 1.1 г, 0.2 ммол Вос-октадекапепти.цна смола от пример 29 се пропуска през десет цикъла на купелуване,както в пример 29 _?с разлика, че Boc-p-NH(CBZ)-Phe в първия цикъл е заместен със 148 мг, 0.5 ммол . Boc-0-Me-Tyr. Пептидната смола се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива, като се използват стадии 10-14,и се суши под вакуум до получаване на 1.45 г

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получава 555 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гелфилтрация,както в пример 3 и се получава 460 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 25-35% линеен градиент,и се получават 152.9 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено 3361.9, намерено 3361.7

ПРИМЕР 31,

Получаване на Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr^2&]VIP ЦИКЛО (Lys²¹-7>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID Νο:49)-ΝΗ2]

Порция от 1.2 г, 0.2 ммол Вос-нонапептидна смола от пример се подлага на твърдофазов синтез в пептиден синтезатор модел 430А Applied Biosystems , както в пример 8. Провеждат се тринадесет цикъла на купелуване всеки цикъл съответно с 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 462 мг, 2.0 ммола ВосNle, 493 мг, 2.0 ммола Boc-Gln, 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-C1-Z) 856 мг, 2.0 ммола Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммола Boc-Leu, 830 мг 2.0 ммола Boc-Lys(2-C1-Z), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 880 мг 2.0 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx) и 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl) и се получават 1.3 г Вос-докозапептидна смола.

Порция от 0.65 г, 0.1 ммол от тази смола се прекарва през шест цикъла на купелуване както в пример 27. Пептидната смола се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% dipea /метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14,и се суши под вакуум до получаване 0.856 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получават 550 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,и се получава 225 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 27-37% линеен градиент и се получава 80.9 г бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: μη изчислено 3295.7, намерено 3296.2

ПРИМЕР 32,

Получаване на Ac-fl-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸)VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:50)-NH₂)

Порция от 0.65 г, 0.1 ммол Вос-докозапептидна смола от пример 31 се пропуска през шест цикъла на купелуване,както в пример 27, с разлика, че Boc-p-F-Phe от първия цикъл е заменен с 315 мг, 1.0 ммол Вос-1-Nal. Пептидната смола се прекарва през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14,и се суши под вакуум до получаване 0.801 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,до получаване 250 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,до получаване на 188 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc ,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 27-37% линеен градиент,и се получават 28.0 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено 3327.8, намерено 3328.5

ПРИМЕР 33,

Получаване на Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷ ’ ²⁸ ,Gly²⁹ ’³⁰,Thr³¹}-VIP 4MK.no(Lys²¹-+-Asp²⁵) [Ac(SEQ ID Νο:51)-ΝΗ₂^

1.1 r, 0.5 ммол Бензхидриламинова смола, 200-400 ASTM mesh, Biomega ) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1, както в пример 2. Провеждат се тринадесет цикъла на купелуване, както в пример 24,с разлика, че Вос-AIa от първия цикъл е заменен с 619 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), Boc-AIa от втория цикъл е заменен с 350 мг, 2.0 ммола Boc-Gly, и Boc-AIa от третия цикъл е заменен с 350 мг, 2.0 ммола Boc-Gly и се получават 2.03 г Востридекапептидна смола.

Порция от 1.22 г, 0.3 ммол от тази смола се подлага на твърдофазов синтез,както в пример 8,в пептиден синтезатор модел 430А Applied Biosystems. Провеждат се шестнадесет цикъла на купелуване, както в пример 24, с разлика, че Boc-Asp(OcHx) в единадесетия цикъл е заменен с 675 мг, 2.0 ммола Boc-Glu(Bzl) и се получават 1.95 г Вос-нонакозапептидна смола.

Порция от 0.975 г, 0.15 ммола от тази смола се прекарва през два цикъла на купелуване?както преди това?с 378 мг, 2.0 ммола Вос-AIa и 819 мг, 2.0 ммола Boc-His(Tos). Тази смола се пропуска след това през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива?като се използват стадии 10-14^от протокол 1 и се суши под вакуум до получаване на 0.897 г.

Тази пептидна смола се деблокира_;както в пример 7,и се получава 270 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3?и се получават 150 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc както в пример 3, с разлика, че се пропуска 24-34% линеен градиент и се получава 28.7 г бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено

3547.1, намерено 3546.9

ПРИМЕР 34.

Получаване на Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸, Gly^29,30,Thr³¹)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹ -ϊ-Asp²⁵) [ac-(SEQ ID No:52)nh₂)

Порция от 0.975 г, 0.15 ммол Вос-нонакозапептидна смола от пример 33 се пропуска през два цикъла на купелуване,както в пример 33,с разлика, че Вос-AIa в първия цикъл се замества с 590 мг, 2.0 ммола Вос- Ser(Bzl) и се получават 0.915 г.

Тази пептидна смола се пеблокира^както в пример 7 до получа61125 ване на 303 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получават 180 мг получист продукт.Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 25-35% линеен градиент,и се получават

42.8 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено

3563.1, намерено 3562.6

ПРИМЕР 35.

Получаване на Ac-fAla²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷’²⁸)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) fAc-(SEQ ID No:53)-NH₂'j

Проция от 0.27 r, 0.1 ммол Вос-нонапептидна смола от пример 20 се подлага на твърдофазов синтез в пептиден синтезатор модел 430А Applied Biosystems както в пример 8. Провеждат се деветнадесет цикъла на купелуване всеки цикъл съответно с 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 462 мг, 2.0 ммола Boc-Nle, 493 мг, 2.0 ммола Boc-Gln, 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2C1-Z), 856 мг, 2.0 ммола Boc-Arg(Tos), 499 мг, 2.0 ммола Boc-Leu 830 мг, 2.0 ммола Boc-Lys(2-ci-z), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 880 мг, 2.0 ммола Boc-Tyr(2,6-DCB), 464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn, 675 мг, 2.0 ммола Boc-Glu(Bzl), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 531 мг, 2.0 ммола Boc-Phe, 435 мг, 2.0 ммола Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 590 мг, 2.0 ммола Boc-Ser(Bzl) и 818 мг, 2.0 ммола Boc-His(Tos) и се получават 0.57 г Вос-октакозапептидна смола.

Тази смола после се* пропуска пре.з р?хсизиИ' 1=-8 от протокол 1 и се’третира,.е 0.5 мл. оцетен анхидрид в 20: мл 6% МРЕА/метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии ΙΟΙ 4 от протокол 1 и се суши под вакуум до получаване на 0.506 г.

Получената пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получава 160 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, £0 както в пример 3 и се получават 100 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, с разлика, че се пропуска линеен градиент 25-35% и после се получава 17.1 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ. fab-MS: МН изчислено 3331.9, намерено 3332.0

ПРИМЕР 36, Получаване на Ac-‘[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁸, Thr²⁸)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹ -=>Asp²⁵) [ac-(SEQ ID No:54)-NH₂J

Порция от 0.6 г, 0.1 ммол Вос-нонапептидна смола от пример 17 се подлага на твърдофазов синтез,както в пример 8,в пептиден синтезатор модел 430А Applied Biosystems. Провеждат се девет цикъла на купелуване,както в пример 23,и се получава 0.72 г Вос-октапептидна смола. Тази смола се пропуска през един цикъл на купелуване със 166 мг, 0.4 ммол Boc-p-NH(CBZ)-Phe и се получава 0.79 г Вос-нонапептидна смола. Тази смола се подлага на твърдофазов синтез, както в пример 8_?в пептиден синтезатор модел 430А Applied Biosystems. Провеждат се девет цикъла на купелуване всеки цикъл съответно с 464 мг, 2.0 ммола Boc-Asn, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 618 мг, 2.0 ммола Boc-Thr(Bzl), 531 мг, 2.0 ммола Boc-Phe, 435 мг 2.0 ммола Boc-Val, 378 мг, 2.0 ммола Вос-А1а, 630 мг, 2.0 ммола Boc-Asp(OcHx), 590 мг, 2.0 ммола Boc-Ser(Bzl), и 819 мг, 2.0 ммола Boc-His(Tos) и се получава 0.91 г. Тази смола после се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 20 мл 6% DIPEA /метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 от протокол 1,и се суши под вакуум и се получава 0.85 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, и се получава 350 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3 и се получава 138 мг получист продукт. Този мате61125 риал после се пречиства чрез препаративна HPLC.както в пример 3, с разлика, че се пропуска 25-35% линеен градиент и се получават

25.2 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc

I и дава точен аминокиселинен анализ, fab-ms : МН изчислено

3276.8, намерено 3276.2

ПРИМЕР 37,

Получаване на Ac-fLys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,m-OCH3-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:55)-NH2]

0.125 r, 0.1 ммол Бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез^като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се девет цикъла на купелуване всеки цикъл съответно с 310 мг, 1.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 267 мг, 1.0 ммол Boc-Leu, 217 мг, 1.0 ммол Boc-Val, 212 мг, 0.5 ммола Boc-Asp (OFm), 255 мг, 1.1 ммол Boc-Asn, 249 мг, 1.0 ммол Boc-Leu, 80 мг, 0.2 ммола Boc-m-OCHg-Tyr(Bzl), 234 мг, 0.5 ммола Boc-Lys(Fmoe) и 415 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-C1-Z).

Тази смола после се деблокира селективно чрез третиране по стадии 1-11 от протокол 2 и реагира със 132 мг, 0.3 ммол ВОР в 10 мл 1% dipea/ДМФА за 3.5 часа. Смолата се промива .като се използват стадии 13-16 от протокол 2.

Провеждат се оше деветнадесет цикъла на купелуване всеки цикъл съответно със 189 мг, 1.0 ммол Вос-А1а, 189 мг, 1.0 ммол ВосА1а, 231 мг, 1.0 ммол Boc-Nle, 270 мг, 1.1 ммол Boc-Gln, 415 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-C1-Z), 428 мг, 1.0 ммол Boc-Arg(Tos), 267 мг, 1.0 ммол Boc-Leu, 415 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z), зю мг, 1.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 220 мг, 0.5 ммол Boc-Tyr(2,6-^DCB), 256 мг, 1.0 ммол Boc-Asn, 315 мг, 1.0 ммол Boc-Asp(OcHx), 310 мг,1.0 ммол Вос-Thr(Bzl), 265 мг, 1.0 ммол Boc-Phe, 217 мг, 1.0 ммол Boc-Val, 189 мг, 1.0 ммол Вос-А1а, 315 мг, 1.0 ммол Вос-Asp(OcHx), 295 мг, 1.0 ммол Вос-Ser(Bzl), и 409 мг, 1.0 ммол Вос-His(Tos).

ίίλ

Тази смола после се пропуска през стадии 1-8 от протокол 1 и се третира с 0.5 мл оцетен анхидрид в 10 мл 6% DlPEA/метилен хлорид за 60 минути. Смолата се промива,като се използват стадии 10-14 от протокол 1 и се суши под вакуум до получаване на 0.814 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,до получаване на 265 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получават 150 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 23-33% линеен градиент и се получават 8.1 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено

3307.8, намерено 3306.8

ПРИМЕР 38.

Получаване на Ac- [Lys¹ ^Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵Val²⁶,Thr²^['VIP ЦИКЛО (Lys²¹—> Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID No:56)-NH₂]

0.125 r, 0.1 ммол Бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем цикъла на купелуване, както в пример 37, с разлика, че Boc-m-OCHg-TyrCBzl) в седмия цикъл е заместен със 78 мг, 0.2 ммола Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) _z и се получава 0.754 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, и се получава 254 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получава 114 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3_?с разлика, че се пропуска 27-37% линеен градиент и се получава 15.1 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено 3295.7, намерено 3295.5

ПРИМЕР 39.

Получаване на Ac-{Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹^, m-OCH^-Tyr^jAsp²^, Leu²⁸,Lys ^27,28^-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»*Asp²^) [ac-(SEQ ID No:57 nh₂}

0.125 r, 0.1 ммол Бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем цикъла на купелуване,както в пример 37, с разлика, че Boc-Thr(Bzl)B първия цикъл се замества с 415 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-C1-Z), Boc-Leu във втория цикъл се замества с 415 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z) Boc-Val в третия цикъл се замества с 268 мг, 1.0 ммол Boc-Leu и Boc-Asp(OcHx) в двадесет и първия цикъл се замества с 337 мг, 1.0 ммол Boc-Glu (Ο-ΒζΙ),η се получава 0.90 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, и се получава 270 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получава 155 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc „както в пример 3, с разлика, че се пропуска 25-35% линеен градиент,и се получава

29.6 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено 3377.3 намерено 3377.9

ПРИМЕР 40.

Получаване на Ac-(Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁸, Lys²⁷’²⁸]-VIP ПИКЛО (Lys²¹^Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No;58)-NH₂]

0.125 γ,Ο.1 ммол Бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез.като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем цикъла на купелуване„както в пример 39, с разлика, че Вос-т-06Нд-Туг(Вг1) в седмия цикъл се замества с 78 мг, 0.2 ммол Boc-nr-F-DL-Tyr(Bzl) и се получа 0.83 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получават 240 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация.както в пример 3,и се получават 100 мг получист продукт. Този материал i

после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 25-35% линеен градиент,и се получава 37.2 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено 3365.9, намерено 3365.8

ПРИМЕР 41, _{п А} г_А, 8 _т 12 17 _Д1 19 _А, 24 . 25 _т 26 _т 27,28

Получаване на Ac-j_Ala ,Lys ,Nle ,А1а ,А1а ,Asp ,Leu ,Lys ’ -VIP UHKJIo(Lys²¹—=>-Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No^)-^]

0.125 r, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 astm mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем пикъла на купелуване,както в пример 39,с разлика, че Boc-Asn в петия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Boc-AIa, Boc-m-OCHg-TyriBzOB седмия цикъл се замества с 440 мг, 1.0 ммол Boc-Tyr(2,6-DCB) и Boc-Glu (OBzl) в двадесет и първия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Boc-AIa,и се получава 0.85 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7. до получаване на 255 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3 и се получава · 112 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC,както в пример 3, с разликата, че се пропуска 25-35% линеен градиент^и се получава 12.0 мг бял аморфен прах. Съединението показва точен аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено 3246.8, намерено 3246.7 ПРИМЕР 42.

Получаване на Ac- (g1u⁸,Lys¹²,Ala¹⁶’¹⁷’¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸) -VIP ЦИКЛО (Lys²¹—ь-Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID No:60)-NH₂]

0.125 r, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh,

8b

Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1 както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем цикъла на купелуване,както в пример 41, с разлика, че Вос-AIa в петия цикъл се замества с 256 мг, 1.1 ммол Вос-Asn, Boc-Nle в дванадесетия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Вос-AIa, Boc-Gln в тринадесетия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Вос-AIa и Вос-AIa в двадесет и първия цикъл се замества с 337 мг, 1.0 ммол Boc-Glu(OBzl),и се получава 0.80 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получават 254 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3_?и се получава 115 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна нрдс,както в пример 3, с разликата, че се пропуска линеен градиент 20-30%,и се получава 32.1 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено 3248.7, намерено 3248.3 ПРИМЕР 43,

Получаване на Ac- [kla⁸,Lys¹²,А1а¹⁸,Nle¹⁷, Ala¹⁹,А1а²^,Asp²⁵,Leu²⁸, Lys²⁷’²⁸)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:61)-NH₂3

0.125 r, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем цикъла на купелуване,както в пример 41, с разликата, че Boc-Gln в тринадесетия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Вос-AIa и се получава 0.93 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получава 250 мг суров ппетид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,и се получава 100 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна НРЦС^както в пример 3, с разлика, че се пропуска 27-37% линеен градиент,и се получава 23.6 мг бял амоофен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен

8<р аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено 3189.8, намерено 3189.9 ПРИМЕР 44,

Получаване на Ас-{А1а⁸,Еуз¹²,А1а^18,17,1^,А1а²^,А8р²⁵,Ееи²⁸, Lys²⁷ ’ ²⁸)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:62)-NH₂'}

0.125 г, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез_}като се използва протокол 1_?както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем цикъла на купелуване, както в пример 43, с разликата, че Boc-Nle в дванадесетия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Вос-AIa и се получава 0.762 г.

Тази пептидна смола се деблокира.както в пример 7,и се получават 240 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получават 150 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3₉с разликата, че се пропуска 22-32% линеен градиент и се получава

55.3 мг, бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: ΜΗ изчислено 3147.7, намерено 3148.0

ПРИМЕР 45.

Получаване на AC-[01u⁸,Lys¹²,Ala¹⁸,Nle¹⁷,Ala¹^,Asp²⁵,Leu²⁸, Lys²⁷’²⁸J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹^rAsp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:63)-NH₂]

0.125 r, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем цикъла на купелуване,както в пример 42, с разликата, че Вос-AIa в дванадесетия цикъл се замества с 231 мг, 1.0 ммол Вос-ΝΙθ и се получава 0.775 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получават 203 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3„и се получава 100 мг получист продукт.Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc^kbkto в пример 3, с разлика, че се пропуска 27-37% пинеен градиент,и се получава 40.0 мг я бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено 3290.8, намерено 3290.5

ПРИМЕР 46.

Получаване на Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶’¹⁷*¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys^27,28)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID No^AJ-NhJ

0.125 r, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 astm mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1_?както в пример 2. Провеждат се двадесет и осем цикъла на купелуване, както в пример 43, с разликата, че Boc-AIa в двадесет и първия цикъл се замества с 337 мг, 1.0 ммол Boc-Glu(OBzl),и се получава 0.837 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получават 178 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация, както в пример 3,и се получава 126 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна HPLC както в пример 3, с разликата, че се пропуска 20-30% линеен градиент и се получава

24.9 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено 3205.7, намерено 3205.2

ПРИМЕР 47.

Получаване на Ac-|jSlu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹’³⁰,Thr³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID Νο:65)-ΝΗ₂*]

0.125 г, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem) се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1, както в пример 2. Провеждат се три цикъла на купелуване всеки цикъл съответно с 310 мг, 1.0 ммол Boc-Thr(Bzl), 175 мг, 1.0 ммол Boc-Gly, и 175 мг, 1.0 ммол Boc-Gly. Осъществяват се още двадесе и осем цикъла на купелуване,както в пример 37, с разлика, че Вос-тOCHg-Tyr(Bzl) в седмия цикъл се замества с 440 мг, 1.0 ммола Вос61125 (2,6-dcb) и Вос-Asp(OcHx) в двадесет и първия цикъл се замества с 337 мг, 1.0 ммол Boc-Glu(O-Bzl) и се получава 0.895 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7, и се получаI ва 440 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3_?и се получава 120 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, с разлика, че се пропуска 25-35% линеен градиент,и се получава 27.7 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ, fab-ms: ΜΗ изчислено 3506.9,намерено

3205.8

ПРИМЕР 48.

Получаване на Ac-fp-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,

Gly²⁹ ’³⁰ ,Thr³¹J-VIP ЦИКЛО (Lys^21jsrAsp²⁵) (Ac-(SEQ ID No : 66)-NH^

0.125 r, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh Bachem, се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се тридесет и един цикъла на купелуване ,както в пример 47, с разликата, че Вос-AIa в тринадесетия цикъл е заместен с 217 мг, 1.0 ммол Boc-Val и Вос-Phe в двадесет и шестия цикъл се замества със 142 мг, 0.5 ммола Boc-p-F-Phe и се получава 0.754 г.

Тази пептидна смола се деблокира както в пример 7,и се получава 280 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3, и се получава 152 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна НРЕС_?както в пример 3, с разликата, че се пропуска 27-38% линеен градиент,и се получава 53.4 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено 3553.0,намерено 3552.2 ПРИМЕР 49.

Получаване на Ac-(Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷ ’²⁸ ,

Gly ⁸⁰,Thr³¹}-VIP ЦИКЛО (Lys2¹^*’Asp²⁵'' (Ac-(SEQ ID No:67)-NH.£J $3

0.125 г, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 astm mesh, Bachem се подлага на твърдофазов синтез.като се използва протокол 1?както в пример 2. Провеждат се тридесет и един цикъла на купелуI ване,както в пример 47,с разликата, чеВос-1Ъг(Вг1)в четвъртия цикъл се замества с 414 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z), Boc-LeuB петия цикъл се замества с 414 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-C1-Z), Boc-Val в шестия цикъл се замества с 249 мг, 1.0 ммол Boc-Leu, Вос-AIa в тринадесетия цикъл се замества с 217 мг, 1.0 ммол Boc-Val и ВосSer(Bzl) в тридесетия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол ВосА1а и се получава 0.838 г.

Тази пептидна смола се деблокира както в пример 7, и се получава 370 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация както в пример 3, и се получава 196 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препартивна hplc . както в пример 3, с разликата, че се пропуска 23-33% линеен градиент, и се получава 48.4 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено 3575.1,намерено 3574.0 ( ΠΡΠί',ΈΡ 50.

Получаване на Ac-(Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸,Gly²⁹’³⁰, Thr³¹^-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-->Asp²⁵) [ac-(SEQ ID No:68)-NH^J

0.125 r, 0.1 ммол бензхидриламинова смола 100-200 ASTM mesh, Bachem,се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се тридесет и един цикъла на купелуване,както в пример 49,с разликата, че Вос-AIa в тридесетия цикъл се замества с 295 мг, 1.0 ммол Boc-Ser(Bzl),и се получава 0.913 г.

Тази пептидна смола се деблокира.,както в пример 7, и се получава 378 мг суров пептид. Той се пречиства чрез гел филтрация.както в пример 3,и се получава 240 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препарятивна hplc, както в пример 3, с раз30 ликата, че се пропуска 25-35% линеен градиент,и се получава 28.8 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез hplc и дава точен аминокиселинен анализ. FAB-MS: МН изчислено 3591.1, намерено 3590.3*

ПРИМЕР 51.

Получаване на Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28,Ala²⁹ ³¹} -VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^Asp²⁵) {Ac-(SEQ ID No;69)-NH^[

Bachem, се подлага на твърдофазов синтез,като се използва протокол 1,както в пример 2. Провеждат се тридесет и един цикъла на купелуване,както в пример 47, с разликата, че Boc-Thr(Bzl)B първия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Boc-AIa, Boc-Gly във втория цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Boc-AIa, Boc-Gly в третия цикъл се замества със 189 мг, 1.0 ммол Boc-AIa, Boc-Thr(Bzl)B четвъртия цикъл се замества с 414 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-z), ВосLeu в петия цикъл се замества с 414 мг, 1.0 ммол Boc-Lys(2-Cl-Z ) Boc-Val в шестия цикъл се замества с 249 мг, 1.0 ммол Boc-Leu, и Boc-Glu(OBzl) в двадесет и четвъртия цикъл се замества с 315 мг, ( 1.0 ммол Boc-Asp(OcHx),и се получава 0.844 г.

Тази пептидна смола се деблокира,както в пример 7,и се получава 360 мг суром ппетид. Той се пречиства чрез гел филтрация,както в пример 3,и се получава 115 мг получист продукт. Този материал после се пречиства чрез препаративна hplc,както в пример 3, с разликата, че се пропуска 24-34% линеен градиент,и се получава 34.7 мг бял аморфен прах. Съединението се хомогенизира чрез HPLC и дава точен аминокиселиненанализ. fab-ms; МН изчислено 3547.1, намерено 3546.0

ПРИМЕР 52,

Трахеално-релаксантна активност на аналози на VIP

Релаксантната активност на аналозите на VIP е изследвана при модел, използващ трахеа от морски свинчета.( Wasserman,М.A. et al, Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, ИЗД. Raven Press,N.Y. 1982, стр.177-184). Всички тъкани се взети от мъжки албиносморски свинчета с тегло 400-600 г, анестезирани с уретан 2г/кг интраперитонеално. След убиване на плъховете трахеата се отделя и се разделя на четири пръстенни сегмента с 3 мм дължина.Всеки пръстен , се окачва чрез 30 градуирани жички от неръждаема стомана в 10 мл облицована тъканна баня и се закрепва чрез 4-0 копринен конец към силов субституционен преобразовател, модел FTO3C, Grass instruments, Quincy,МА, за изометрично отчитане на налягането.Гладкият мускул се намокря в модифициран разтвор на Кребс свс следния състав:120 мМ NaCl 4.7 mM КС1, 2.5 тМ СаС1₂, 1.2 тМ MgSO₄.7H₂O, 25тМ NaHCO,, 1.2 тМ к₂нро₄ едноосновен, и 10 мМ декстроза.Тъканните бани се поддържат при 37°С и непрекъснато се барботират с 95% Og и 5% СО^.Резултатите се записват на 8 и 4 канален апарат Hewlett-Packard, модел 7702В и 7754А, съответно. Трахеалните сегменти се поставят под остатъчно налягане от 1.5 г, което е определено като оптимално в предварителните изпитвания. В следващия 60-минутен стабилизационен период се изискват чести пренагласявания на налягането. Тъканите се измиват на 15-минутни интервали.За всяка тъкан се получават криви на кумулативния концентрационен отговор чрез последователни повишения на концентрацията на банята от VIP или VIP аналози,съгласно метода на VanRossum, Arch. Int.Pharmacodyn.,143,299-330 (1963).За единична тъкан е получена само една крива на кумулативния дозиран отговор.За да се доведе до минимум изменяемостта между тъканите, релаксантните отговори се изразяват като процент на максималния отговор,получен за VIP, (10~θ М = 100%),прибавен на края всеки експеримент на концентрационния отговор.Отговорите, получени от три тъкани,се обединяват и се определят стойностите на EC^q чрез линейна регресия.

Резултатите, резюмирани в таблица I, показват трахеално-релаксантната активност на VIP аналозите в сравнение с природния VIP.

ТАБЛИЦА I

РЕЛАКСАНТНА АКТИВНОСТ НА VIP АНАЛОЗИ ПРИ ТРАХЕАЛНА ГЛАДКА

МУСКУЛАТУРА НА МОРСКИ СВИНЧЕТА

ЕС50

СЪЕДИНЕНИЕ,

-------—----—--------------ί“Ξ2

VIP[(Seq ID NO:1)-NH2)10

AC-[Lys¹²,Nle¹⁷,Vai²⁶, Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2]14

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Glu⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID N0:21)-NH2]34

Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛ0 (Asp⁹—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID N0:22)-NH2]17

Ac-[Orn¹²,Nle¹⁷,Vai²⁶,Thr²⁸)-VIP ЦИКЛО (Asp⁸--Югп¹²) [Ac-(SEQ ID N0:23) -NH2]40

Ac-[Lys⁸, Asp¹²,Nle¹⁷, Vai²⁶, Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys⁸—»Asp¹²) [Ac-(SEQ ID N0:24)-NH2]38

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Vai²⁶, Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Glu⁸—Югп¹²) [Ac-(SEQ ID N0:25) -NH2 ]

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Vai²⁶, Thr²⁸] -VIP ЦИКЛО (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID N0:26)-NH2]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴, Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²⁰->Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:28)-NH₂] 3.1

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁸, Asp²⁵, Vai²⁶, Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]0.70

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹0,Lys¹²,Nle¹⁷, Asp²⁵, Vai²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:30)-NH₂]1.3

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:31)-NH₂]2.2

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai^{2 6},Thr²⁸, _Gly29,30_rCys(Acm)31]_vip ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:32)-NH₂]0.44

Ac-(Ala²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Vai^{2 6},Thr²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂]1.2

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,

Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂]0.71

Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]VIP . ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:35) -NH₂ ]4.2

Ac-[O-CH₃-Tyr¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Vai²⁶,

Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂]0.84

Ac-[p-F-Phe⁶,p-NH₂-Phe¹⁸, Leu¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID N0:37)-NH₂] 4.4

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:38) -NH₂]0.13

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂]0.95

Ac-[Glu⁸,Lys Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu^S,Lys^⁷,2 8j_

VIP ЦИКЛО (Lys²¹—4Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:4 0)-NH₂]0.45

Ac- [O-Me-Tyr¹⁸, LysNle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Vai²⁶,

Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—^Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:41)-NH₂]2.6

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Ala^29-31]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]0.61

Ac-[Ala2,Glu⁸,Lys¹2,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸,Ala^29-31]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]0.55

Ac-[N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷' ²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]0.36

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷,28]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂]0.47

Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,

Ly.s²⁷’²⁸]-VIP ЦИКЛО- (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:46)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵).

[Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,O-CH₃-Tyr¹⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu^ 6, Lys²⁷'²⁸)-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:49)-NH₂)

Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:50)-NH₂]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, _Lys27,28_/Gly29,30_/Thr31]_vip ЦИКЛО (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸, Gly^{2 9}'³θ,Thr³¹]-VIP ЦИКЛО( Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷/28]-viP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:53)-NH₂]

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵, Vai²⁶,

Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]

0.26

0.32

0.41

0.39

2.9

0.92

0.35

0.78

0.96

Ac- [Lys , NleП, Alai9, m-ОСНз-Туг²² _f Asp²⁵, Vai^{2 8},

Tl?r²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH₂] 0.31

Ac-[LysI²,NleAlai⁸,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Vai²⁸,

Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²l-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂]0.52

Ac- [Glu⁸, Lysl²,Nlel7, А1а1⁸,т-ОСНз-Туг²², Asp²⁸,

Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²!—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂]0.29

Ac-[Glu⁸,LysI²,Nlel⁷, Alai⁸,m-F-L-Tyr²², Asp²⁸,

Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:58)-NH₂]0.31

Ac-[Ala⁸,LysI²,Nlel⁷,Alai⁸,Ala²⁴,Asp²⁵, Leu²⁸,

Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²!—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]1.1

Ac-[Glu⁸,LysI², Alai⁸'I⁷'I⁸,Asp²⁵,Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸]VIP ЦИКЛО (Lys²1—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂]0.2 6

Ac-[Ala⁸,Lys12,Alai⁸,Nlel⁷,Alai⁸,Ala²⁴, Asp²⁵,

Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²l-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂]2.4

Ac-Ala⁸,Lys12, Alai⁸'I⁷ > I⁸,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁸,

Lys²⁷/ 28j-viP ЦИКЛО (Lys²l->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH210.1

Ac-[Glu⁸, Lys¹²,Ala¹⁸,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁸,

Lys²⁷' 28]-viP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp25) [Ас-SEQ ID NO:63)-NH2]

Ac- (Glu⁸, Lys¹²,Ala¹⁸'¹⁷' Ala²^, Asp²⁵, Leu^{2 8},

Lys²⁷, 28] _vip ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:64)-NH21

Ac - [Glu⁸, LysI², Nle¹⁷,Ala¹⁹Asp²⁵, Vai²⁸, Thr²⁸, Gly²⁹' 30, Thr³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁸,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹'30,_Thr31j-vip ЦИКЛО(Lys²¹->Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹' 30,_Thr31]-vip ЦИКЛО(Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2]

Ac-(Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵, Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹' ³⁰,Thr³¹]-VIP цикло(Lys²¹-^Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2] (

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁸, Lys²⁷' ²⁸'Ala^{2 9_}31]~vip цикло (Lys—*Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂]

0.9

0.22

0.88

0.57

0.19

0.43

0.42

ПРИМЕР 53.

Бронходилататорна активност на VIP аналози

Бронходилататорната in vivo активност на VIP и VIP аналози

I при морски свинчета се определя чрез трахеален инстилационен начин на прилагане. При този метод се използват морски свинчета порода Hartley strain, Charles River, C тегло 400-600 Г. Животните се анестезират с 2 г/кг уретан интраперитонеално и полиетиленова спринцивка се вкарва във вратната вена за интравенозно приложение на лекарството.

Животните се трахеотомизират и се прилагат дозирани разтвори на дестилирана вода или изпитваното съединение, разтворено в дестилирана вода, в трахеата, приблизително три четвърти разстоянието до карината с пипета. Концентрацията на дозирания разтвор се нагласява да отделя постоянен обем от 100 мл. Животните се поставят на гръб за една минутата да се подпомогне освобождаването на лекарството в белия дроб. Минута по-късно спонтанното дишане се спира с 1.2 мг/кг сукцинилхолин хлорид, приложен интравенозно и животните се пречистват с респиратор Harvard Model 680 за малки животни, нагласен на 40 духания/минута и 4.0 см ударен обем. Животните се изпитват с максимална коистрикторна доза от 50 мг/кг хистамин интравенозно и трахеалното налягане като см вода се отчита чрез преобразувател на налягането Statham Р 32 АА.

Изменението на трахеалното налягане се определя средно поне при 3 контролни и 3 третирани с лекарство животни и се отчита процента на инхибиране. Относителната ефикасност на съединения, приложени чрез инстилационен начин,се определя чрез прилагане на различни дози от изпитваното съединение и пресмятане на средната ефективна доза -стойността на Εϋ^θ . Тази стойност се определя от логаритмичните криви за съотношението доза-отговор при наймалко 3 дози, които причиняват инхибиторни ефекти между 10% и 90%.

Корелационните коефициенти за линията на спадане за всяко съединение са винаги по-високи от 0.95.

За определяне времетраенето на инхибиция за различните съединения времето между прилагането на съединението и вкарването на хистамин е различно. Продължителността на активността се изчислява като времетраене,когато инхибирането се понижи до 40%.

Резултатите, резюмирани в таблица II, показват бронходилататорната in vivo активност на VIP аналози в сравнение с природен VIP.

(00

ТАБЛИЦА II

I

БРОНХОДИЛАТАТОРНА АКТИВНОСТ НА VIP аналози при морски свинчета

ED5 о

СЪЕДИНЕНИЯ__________________________________________ (Ид)

VIP[(Seq ID NO:1)-NH2]7.3

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys¹²->Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID N0:26)-NH₂]39

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Asp^{2 4}, Vai^{2 6},Thr^{2 8}]-VlF ЦИКЛО (Lys²⁰-»Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID N0:27)-NH2]2.3

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH₂]1.2

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai^{2 6},Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH2]0.34

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁹' ³⁰,Met³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) \ [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂]0.90

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷, Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂]0.19

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸, _Gly29,30_fCys(Acm)31]__VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH₂]-0.19

Of

Ac-[Ala², Lys¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:33) -NH2 ]0.6

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:34)-NH₂]1.0

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:38) -NH₂]0.09

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:39)-NH₂]0.06

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸ ]VIP ЦИКЛО (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:40)-NH₂]0.022

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Ala²⁹“³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:42)-NH₂]0.072

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸,Ala^29-31]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]0.14

Ac-[N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu^{2 6},

Lys²⁷'²⁸]-VIP цикло (Lys²¹—>Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]0.097

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:45)-NH₂]0.026 tot

Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸J VIP 4HKJI0(Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂] 0.036

Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:47)-NH₂]0.075

Ac-[Glu⁸,О-СНз-Туг¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]0.094

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸]VIP ЦИКЛО (Lys²¹-* Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂]0.26

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:51)-NH₂]0.1

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹' 30, Thr³¹]-VIP ЦИКЛО Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2)0.1

(. Ac- [Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷,28] _vip ЦИКЛО (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]0.14

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Vai²⁶,

Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]0.35

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²², Asp²⁵, Vai^{2 6}, Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:55)-NH₂]0.14

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²², Asp²⁵,Vai²⁶, Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂]7.2

Ac-[Glu⁸,Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²², Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:57)-NH₂]0.019

Ac- [Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂]0.03

Ac-(Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]0.17

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]VIP ЦИКЛО (Lys²¹—*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂]0.17

Ac-(Ala⁸,Lys¹², Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴, Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2]0.045

Ac-Ala⁸,Lys¹², Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴, Asp²⁵,Leu^{2 6},

Lys²⁷,28]_vip ЦИКЛО (Lys²¹-»Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:62)-NH2]0.24

4C7

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2]

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Asp²⁵,Vai^{2 6},Thr²⁸, Gly²⁹'30_rTh_r31j -viP ЦИКЛ0(®Уз²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2)

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP ЦИКЛО( Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸, _Gl_y29,30_/Thr31j_vip ЦИКЛО( Lys²¹—>Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸'Ala²⁹ ³¹) VIP ЦИКЛО (Lys—>Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:69)-NH2] (

4.

0.13

0.84

0.12

0.077

0.04

I C 5

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

ί. Циклични пептиди с формула

I ¹

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asr>-Tyr~Thr-R^2

Leu-Arg-Lys-Gln-R^-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- |Х—(SEQ ID No:12)-Y| Leu-Asp-Ser-R^-Leu-R^-Y

В КОЯТО Rg Θ Asp, Glu ИЛИ Lys ; R₁₂ e Arg, Lys, Orn или Asp;

R₁₇ e Met или Nle; R₂₆ e He ИЛИ Vai ; R_2g e Asn ИЛИ Thr ;

X е водород или хидролизируема амино защитна група; У е хидроксил или хидролизируема карбокси защитна група, или техни фармацевтично приемливи соли.
2. Цикличен пептид съгласно претенция 1, където R₁₇ е Nle, R₂₆ е Val и R₂g е Thr.
3. Пептид съгласно претенция 2, където посоченият пептид е

Ac-|Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸|-VIP ЦИКЛО (Asp⁸-^Lys¹²) |Ac-(SEQ ID No:20)-NH₂|, to IO

Glu ,Lys , Nle¹⁷,Val²⁶,Tnr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Clu⁸-^.Lys¹²) (Ac-(SEQ ID No:21)NH Д ,

5. Пептид съгласно претенция 2, където посоченият пептид е

19 17 9& ο о Q 19

Ac-|Orn ,Nle ,Val ,Thr |-VIP ЦИКЛО (Asp -^Orn¹ ) |Ac-(SEQ

ID No:23)-NH₂|,

6. Пептид съгласно претенция 2, където посоченият пептид е Ac- [Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys⁸^»Asp¹²) (Ac-(SEQ ID No:24)-NH₂],

7. Пептид съгласно претенция 2, където посоченият пептид е

Ac-[Glu⁸ , Orn¹² , Nle¹⁷ , Val²⁶ ,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Glu%»Orn¹²) [Ac-(SEO ID No:25)-NH₂J, top

8. Циклични пептиди с фирмула

I I

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asp-Tyr-Thr-Lys¹Leu-Arg-Lys-Gln-R^-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr|X-(SEQ ID No:4)-Y|

Leu-Asp-Ser-R₂g-Leu-R₂g“Y

В КОЯТО Rg e Asp или Asn; R₁₇ е Mer ИЛИ Nle; R₂₆ е 11еили Vai;

R_2g e Asn или Thr; X е водород или хидролизируема амино защитна група; У е хидроксил или хидролизируема карбокси защитна група, или техни фармацевтично приемливи соли.

9. Пептид съгласно претенция 8, където посоченият пептид представлява Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Vai²⁸,Thr²⁸]-VIP цикло (Asp⁹—Lys¹²) [Ac-(SEQ ID No:22)-NH₂].

10. Циклични пептиди c формула

I Ι ш

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys1-----------------------------~¹

Leu-Arg-Lys-Glu-R^^-Ala-Val-Lys-Lys-ThrLeu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R_2g-Y |X-(SEQ ID No:6)-Y|

В КОЯТО Rg e Asp или Asn; R_1? e Met или Nle ^{; R}26 β lie или Vai;

X е водород или хидролизируема амино защитна група, У е хидроксил или хидролизируема карбокси защитна група, или техни фармацевтично приемливи соли.

11. Пептид съгласно претенция 10, където този пептид представлява Ac-(Lys¹²,Glu¹⁸,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP ПИКЛО (Lys¹²-^Glu¹⁸) [Ac- (SEQ ID No:26)-NH₂'] ,

12. Циклични пептиди c формула

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-K^

IV

Leu-Arg-Lys-Gln-R^y-Ala-Val-Lys-Lysi-TyrLeu-Asp-Ser-R2g-Leu-R2g”Y в която r₁₂ e Arg или Lys; R₁₇ e Met или Nle; β₂₆ θ ^Ile или Vai;

R_2g e Asn или Thr; X е водород или хидролизируема амино защитна група; У е хидроксил или хидролизируема карбокси защитна група, или техни фармацевтично приемливи соли.

13. Пептид съгласно претенция 12, където този пептид представлява

Ac- [Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴,Val²⁶,Thr²⁸)-VIP цикло (Lys²⁰-»Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID No:27)-NH₂1

14. Циклични пептиди c формула

X-Rj-R2-Asp-Ala-Val-R^-Asn-R^Q-Thr-Rj2^_

I ^v

Leu-Arg-Eys-Rjg“Rj₇“Ala-R^g-Lys-Lys-R22“

I------------------------------Leu-R₂₄-Asp-R₂₆ ^_R27’^R28^Y |X-(SEQ ID No:10)-Y|

В която β^ e His, N-CH^-Ala; R₂ e Ser ИИЛИ Ala; βθ e като Q е нисш алкил циклохексил или нисш алкил apwi;R_g е Asp, Glu или Ala; R₁₀ е Туг или βθ ; β₁₂ θ Arg или Lys; β₁₆ e Gin или Ala; β₁₇ e Met,Nle или Ala; β₁₉ e Vai или AIa;B₂₂ е Туг или κθ; ^R24 е Asn ИЛИ Ala; β₂θ е Ile, Vai или Leu; β_2? e Leu ИЛИ Lys;

B₂g e Asn, Thr или Lys; X е водород или хидролизируема амино защитна група; У е хидроксил, хидролизируема карбокси зашитна група ИЛИ ^R29“^R30^R31^Z’ ^R29 ^{е С1}У ^{или AIa; R}30 ^{е С1}У ^{или AIa}>^R31 ^{е А1а}»

Met, Cys(Acm) или Thr; z е хидроксил или хидролизируема карбокси защитна група, или техни фармацевтично приемливи соли.

15* Цикличен пептид съгласно претенция 14, където Q е метилцик- лохексил. 16. Цикличен пептид съгласно претенция 14, където Q е С^алкил арил. 17. Цикличен пептид съгласно претенция 16 , където Q е С1_г>алкил

фенил, в който фениловият пръстен е незаместен или заместен с един или повече заместители като OH, OCHg, F, Cl, I, сн₃, CF₃, no₂, nh₂, n(ch₃)₂, nhcoch₃, nhcoc₆h₅, или c(ch₃)₃.

18. Цикличен пептид съгласно претенция 16, където Q е С^алкил нафтил, в който нафтиловите пръстени са несубституирани или заместени с един или повече заместители като OH, OCHg, F, Cl, I, сн₃, CF₃, NO₂, NH₂, N(CH₃)₂, NHCOCH₃, NHCOC₆H₅ или C(CH₃)₃.

19. Пептид съгласно претенция 14, където R₂₆ ^{е Val u R}28 ^{e Thr} '[x-(SEQ ID Νο:11)-γφ

20. Пептид съгласно претенция 14, където R₁₇ е Nle, r₂₆ е Val u

R₂₈ e Thr [x-(SEQ ID No:12)-y]·

21. Пептид съгласно претенция 20, където посоченият пептид представлява Ac-(g1u⁸,0rn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸J -VIP цикло (Lys²¹-*Asp²⁵) {Ac-(SEQ ID Νο:31)-Νη£[»

22. Пептид съгласно претенция 20, където r₁₂ е Leu, R₁₇ е Nle, R_ig e Ala, R₀₆ e Val u R_2g e Thr [x-(SEQ ID No:13)-yJ.

23. Пептид съгласно претенция 22, където посоченият пептид представлява Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸!VIP цикло (Lys²¹^> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:35)-NH₂'),

24. Пептид съгласно претенция 22, където посоченият пептид представлява Ac- |_O-Me-Tyr¹⁰,Leu¹² ,Nle¹⁷ , Ala¹⁹ ,Asp²⁵,Val²⁶,ΤΗγ²⁸Ί VIP цикло (Lys²X-Asp²⁵) [Ac-(SE0 ID No;36)-NH₂J,

25. Пептид съгласно поетенция 22, където посоченият пептид е

J

Ac-[p-F-Phe⁶,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸}-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-*,-Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:37)-NH^}.

26. Пептид съгласно претенция 20, където r₁₂ е Lys, r₁₇ e Nle,

R₂₆ e Vai u R_2g e Thr Jx-(SEQ ID No:14)-Y],

27. Пептид съгласно претенция 26, където посоченият пептид представлява Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸}-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:28)-NH₂].

28. Пептид съгласно претенция 26, където посоченият пептид е

Ac-[p-F-Phe ,2-Nal ,Lys ,Nle ,Asp ,Val ,Thr ,Gly ’ ,Met J -VIP (1-31)-NH₂ цикло (Lys²¹—>Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NozSO^NH^,

29. Пептвд съгласно претенция 26, като посоченият пептид е а Г г ви θ ri θ т 12 мт 17 . 25 _v ,26 28 _r, 29,30 31т

Ac-[p-F-Phe ,Glu ,Lys ,Nle ,Asp ,Val ,Thr ,Gly ’ ,Thr J -VIP ЦИКЛО (Lys²¹-»Asp²⁵) ]Ac-(SEQ ID No:66)-NH^ .

,30. Пептид съгласно претенция 20, където r_{12 е} Lys, R_1? e Nle, R_ig e Ala, R_2& e Vai u R_2g e Thr [x-(SEQ ID No:15)-Yj.

31. Пептид съгласно претенция 30, където посоченият пептид е

Ас- (Lys¹² , Nle^?, Ala^, Дзр25, УаЦб -VIP ЦИКЛО (Lys >Asp^^) (AC -(SEQ ID No:29)-NH^}.

32. Пептид съгласно претенция 30, като посоченият пептид е

Λ Г V DI, θ Т 12 Ml 17 Al 19 A 25 _w ,26 28 _r, 29,30

Ac-[p-F-Phe ,Lys ,Nle ,Ala ,Asp ,Val ,Thr ,Gly ’ ,

Cys(Acm)³¹J-VIP (1-31)-NH2 ЦИКЛО (Lys²¹-^Asp²⁵ ) [ac-(SEQ ID No:32)-NH2} ,

33. Пептид съгласно претенция 30, като посоченият пептид е

Ac- (Xia²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸}-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—^Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:33)-NH₂} ,

34. Пептид съгласно претенция 30, като посоченият пептид е

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Vai²⁶,Thr²⁸}-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—Asp²⁵) £ac-(SEQ ID No:34)-NH₂},

35. Пептид съгласно претенция 30, където посоченият пептид представлява но

Ac-fo-Me-Tyr¹⁰,Lys¹² ,Nle¹⁷ ,Ala¹⁹ ,Asp²⁵ ,Val²⁶ ,Thr²⁸“] -VIP ЦИКЛО (Lys²¹~*> Asp²⁵) [ac-(SEQ ID No:41)-NH₂|,

36. Цептид съгласно претенция 30, където посоченият пептид е

Ac-[j)-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸)-VIP ЦИКЛО (Lys²Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID No:49)-ΝΗ₂Ί,

37. Пептид съгласно претенция 30, където посоченият пептид е

Ac-[l-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸'[-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-*- Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID Νο:50)-ΝΗ₂·},

38. Пептид съгласно претенция 30, където посоченият пептид е

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,А1а¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—>“ Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:54)-NH₂7 .

39. Пептид съгласно претенция 30, където посоченият пептид е

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—> Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID No: 55)-14^ .

40. Пептид съгласно претенция 30, където посоченият пептид е

Ac-[Lys¹² ,Nle¹⁷ ,А1а¹⁹ ,m-F-L-Tyr²² ,Asp²⁵ ,Val²⁶ ,Thr²⁸ j-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—*· Asp²⁵) £ac-(SEQ ID No: 56)-NH^J,

41. Пептид съгласно претенция 30, където посоченият пептид е

Ac-[Glu ,Lys ,Nle ,А1а ,Asp ,Val ,Thr ,Gly ’ ,Thr JVIP ЦИКЛО (Lys²¹—*·Asp²⁵) [ac-(SEQ ID No:65)-NlQ_#

42. Пептид съгласно претенция 14, където r₂₆ е Leu и R₂₇ и R_2gса двата Lys |x-(SEQ ID Νο:16)-υ],

43. Пептид съгласно претенция 42, където R₁₂ е Lys, R^₇ е Ala, e Ala, e Leu u R₂₇ u R_2g ca Lys [X-(SEQ ID No:17)-Yj_<

44. Пептид съгласно претенция 43, където посоченият пептид е

VIP цикло (_Lys ²¹_^Asp²⁵) (ac-(SEQ ID Νο:60)-ΝΗ2^

45. Пептид съгласно претенция 43, където посоченият пептид е

VIP ЦИКЛО (Lys²¹—Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID No:62)-NH₂] ,

46. Пептид съгласно претенция 43, където споменатият пептид е

ЦИКЛО (Lys²¹—* Asp²⁵) £ac-(SEQ ID No:64)-NH₂1_>

47. Пептид съгласно претенция 42, където r₁₂ е Lys, r₁₇ е Nle ,

R₂₆e Leu И R₂₇ И R₂₈ ca Lys [x-(SEQ ID No:18)-NH₂),

48. Пептид съгласно претенция 47, където споменатият пептид е . г_А1 2 8 _т 12 _м. 17 _А 25 _т „26 _т 27,28 _г. 29,30 _τμ^31η

Ac-[Ala ,Glu ,Lys ,Nle ,Asp ,Leu ,Lys ’ ,Gly ’ ,Thr |-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—*-Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID No:67)-NH₂1,

49. Пептид съгласно претенция 47, където споменатият пептид е

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸,Gly²⁹’³⁰,Thr³¹)-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:68)-NH₂~] ,

50. Пептид съгласно претенция 47, където r₁₂ е Lys , r₁₇ e Nle, R^g e Ala, R₂₈ e Leu u R₂₇ u R₂g ca Lys [_X-(SEQ ID No;19)-Yj,

51. Пептид съгласно претенция 50, където r_j2 е Lys, R₁₆ e Gin,

R^₇ e Nle, R^g e Ala, e Leu u R₂₇ u R₂g ca Lys fx(SEQ ID No:70)-Yj_#

52. Пептид съгласно претенция 51, където r₁ е Ser, r₁₂ e Lys, R₁₆ e Gin, R₁₇ e Nle, R^g e Ala, R₂g e Leu, u R₂₇ u R_2g ca

Lys [X-(SEQ ID No:71)-Y*}₍

53. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е _А г, 12 _М1 17 _А1 19 _А 25 _т 26 , 27,28-,

Ac-[Lys ,Nle ,А1а ,Asp ,Leu ,Lys J.-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-* Asp²⁵) (\c-(SEQ ID No: 38)-NH₂}

54. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е (_Lys ²¹_^ Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID Νο:39)-ΝΗ₂[_>

55. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е
4 IZj _А г^-ι 8, 12 _М1 17 _Аι 19 _А 25 _т 26 _т 27,28η _ντΈ)

Ac-[Glu Lys ,Nle ,Ala ,Asp ,Leu ,Lys ’ l-VIP ЦИКЛО (Lys²¹->- Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID No : 40)-NH'j, _t

56. Пептид. съгласно претенция 52, където споменатият пептид е _А т_л1 8 _т 12 _М1 17 _А1 19 _А 25 , 26 _т 27,28 _Λ1 29-31η _VTD

Ac-[Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Asp ,Leu ,Lys ’ ,Ala |-VIP

ЦИКЛО (Lys²¹—> Asp²⁵) |ac-(SEQ ID No:42)-NH₂j,

57. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е

Λ Гм Μ Λ1 1 θ Т 12 _кт1 17 _А1 19 _А 25 _т 26 _т 27,28^, _ντηAc-|N-Me-Ala ,Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Asp ,Leu ,Lys ’ |-VIP цикло (Lys²Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID N0:44)-NH₂'}_<

58. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е λ Г г nu θ ги 8 т 12 _м, 17 _А-] 19 . 25 _т 26 _т 27,28S _VTn

Ac-[p-F-Phe ,Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Asp ,Leu ,Lys ’ J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^* Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂],

59. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е

Λ Г-1 м Ί β 8 τ 12 _Μ1 17 _Α1 19 _Α 25 _τ 26 _τ 27,28η _ντηAc-|l-Nal ,Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Asp ,Leu ,Lys ’ I-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-**· Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID NO:46)-NH^

60. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е Ac-{g1u⁸,p-NH2-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸JVIP ЦИКЛО (Lys²¹—Asp²⁵) fAc-(SEQ ID NO:47)-NH2|,

61. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е * 8 _п „ _т 10 _т 12 _м, 17 _А1 19 _А 25 _т 26 , 27,287 .

Ac-|Glu ,O-Me-Tyr ,Lys ,Nle ,А1а ,Asp ,Leu ,Lys jVIP ЦИКЛО (Lys²¹—> д₃р25) £ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂)_>

62. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е

-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂)_<

63. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е

VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^> Asp²⁵) £ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂).

64. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е _А Г_Р1 8 . 1 . 17 _А1 19 „ , „ 22 _А 25 _т 26 _Ί 27,28η

Ac.--|_Glu ,Lys Le ,Ala ,m-F-L-Tyr ,Asp ,Leu ,Lys ’ Д61125

-VIP цикло (Lys²¹-**· Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂^

65. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е

Ac-^Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,А1а¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’^2?|-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^ Asp²⁵) [ac-(SEQ ID NO:59)-NH^

66. Пептид съгласно претенция 52, където споменатият пептид е

Ac-(Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸,Ala²⁹“³¹]-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂]_>

67. Пептид съгласно претенция 51, къдете R₂ ^{е AIa}> ^Ri2 ^{e Lys}’

R₁₆ e Gin , R₁₇ e Nle, R^ e Ala, R_2& e Leu и R₂₇ и R_2g ca двата Lys [x-(SEQ ID NO:72)-y],

68. Пептид съгласно претенция 67, където споменатият пептид е

Ас-[А1а ,Glu ,Lys ,Nle ,А1а ,Asp ,Leu ,Lys ’ ,Ala JVIP цикло (Lys²¹—Asp²⁵) (ac-(SEQ ID NO: 43)-НнД^

69. Пептид съгласно претенция 67, където споменатият пептид е * 2 8 _т 12 17 _А. 19 _А 25 _т 26 _т 27,28 29,30

Ас-[Ala ,Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Asp ,Leu ,Lys ’ ,Gly ,

Thr³¹J-VIP цикло (Lys²¹—Asp²⁵) (ac-(SEQ ID NO: 51)-NH^ .

70. Пептид съгласно претенция 67, където споменатият пептид е

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Νΐβ¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷ ’²⁸J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹—^Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID N0:53)-NfQ,

71. Пептид съгласно претенция 50, където R₁₂ е Lys, R₁₆ e Ala, R_1? e Nle, R₁₉ e Ala, R₂₆ e Leu и R₂₇ и R₂₈ ca Lys Jx-(SEQ ID ΝΟ:73)-Ϋ1.

72. Пептид съгласно претенция 71, където споменатият пептид е Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸JVIP цикло (Lys²¹—Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:61)-NH^j_t

73. Пептид съгласно поетенция 71, където споменатият пептид е пикло (Lys

74. Цикличен пептид съгласно всяка една от претенциите 1, 8, 10,

12 или 14 като терапевтичен агент.

75. Цикличен пептид съгласно коя да е от претенции 1, 8, 10,

I

12 или 14 като бронходилататор.

76. Цикличен пептид Ac-fGlu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷’²⁸,Gly²⁹’³⁰,ΤΗΓ³¹Ί-νΐΡ ЦИКЛО (Lys²¹->Asp²⁵) {ac-(seq ID νό:52)-νη₂Ί като терапевтичен агент.

r— Q j Ο Λ 1 Q ОС Ο £

77. Цикличен пептид Ac-[_Glu ,Lys ,Nle ,А1а ,Asp ,Leu , Lys²⁷’²⁸,Gly^29,30,Thr³¹J-VIP ЦИКЛО (Lys²¹-^ Asp²⁵) [ac-(SEQ ID Ν0:52)-ΝΗ_οΊ като боонходилататор.

Zz

78. Метод, за получаване на цикличен пептид съгласно коя да е от претенции 1, 8, 10, 12 или 14, характеризираш се с това, че

а) защитен и свързан със смола пептид със съответната аминокиселинна последователност се депротектира селективно до създаването на свободни странични амино групи и свободни странични карбоксилни групи;

б) свободната странична амино група и свободната странична карбоксилна група се свързват чрез ковалентна връзка с подходящ реагент, който образува амид, и в) циклизираният пептид са депротектира и освобождава от смолата чрез обработване с подходящ депротекционен и разцепващ реагент, по желание в присъствието на други подходящи добавки като катионни акцептори и евентуално такива, превръщащи цикличния пептид във фармацевтично приемлива сол.

79. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това,' че съдържа цикличен пептид съгласно всяка претенция от 1 до 73 и нетоксичен инертен терапевтически приемлив носител.

80. Фармацевтичен състав за лечение на бронхотоахеални констриктивни заболявания, характеризиращ се с това, че съдържа ефективно количество цикличен пептид, съгласно коя да е прг-^нция от 1 до 73 к / 5

Vi нетоксичен фармацевтично приемлив течен или твър носител.

81. Използване на цикличен пептид съгласно коя да е претенция от 1 до 73 за приготвяне на фармацевтични състави, t

82. Използване на цикличен пептид съгласно коя да е претенция от 1 до 73 за приготвяне на фармацевтични състави за лечение на бронхотрахеални констриктивни заболявания.