HU211534A9 - Cyclic vasoactive peptides - Google Patents

Description

Ez a találmány vazoaktív peptid (VIP) analóg ciklikus peptidekre vonatkozik, valamint ezen ciklikus peptideket tartalmazó gyógyszerkompozíciókra. Ezeket a gyógyszerkompozíciókat légúti összehúzódást rendellenességek kezelésére használják.

A vazoaktív intesztinális peptidet (VIP) először a disznóbélben fedezték fel, abból izolálták és tisztították. [3, 879, 371 számú egyesült államokbeli szabadalom], A peptid huszonnyolc (28) aminosavból áll, és erősen emlékeztet a szekretinre és a glukagonra. [Carlquist et al., Horm. Metab. Rés., 14, 28-29 (1982)]. A VIP aminosav szekvenciájának jele [(SEQ ID NO:1)NH₂] - lásd. VI. képlet.

Ismeretes, hogy a VIP sokféle biológiai hatást gyakorol az emésztőszervekre és a keringési rendszerre. Kimutatták, hogy mivel a VIP hasonlít a gasztrointesztinális hormonokhoz, ezért serkenti a pankreatin és az epe kiválasztást, a glukagon és inzulin kiválasztást, valamint aktiválja a hasnyálmirigy bikarbónát kiválasztását. [Kenins, C. és Said, S. L, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med.. 142. 1014—1017 (1972): Domschke, S.. et al.. Gastroenterology, 73., 478-480 (1977)].

VIP-et tartalmazó neuronokat mutattak ki a belső és külső elválasztási! rendszerek, a bél és a sima izomzat sejtjeinek immunológiai vizsgálatával. [Polák, J. M. et a!.. Gut. 15. 720-724 (1974)]. Azt is kimutatták, hogy a VIP az idegrendszerre hat azzal, hogy különböző hormonok felszabadítását idézi elő, például a prolaktinét [Frawley, L. S.. et al., Neuroendocrinology, 33, 79-83 (1981)], a tiroxinét [Ahren, B. et al.. Natúré, 287, 343-345. (1980)], továbbá az inzulinét és a glukagonél [Schebalin, M. et al., J. Physiology E., 232, 197-200 (1977)]. A VIP ezen kívül a vese renin kiválasztását is stimulálja in vivő és in vitro. [Porter, J. P. et al., Neuroendocrinology, 36, 404-408 (1983)]. A VIP jelenlétét kimutatták többféle állatfaj és az ember légútjainak idegeiben és idegvégződéseiben. [Dey, R. D. és Said,

S. I.. Fed. Prod., 39. 1062 (1980); Said, S. I. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci.. 221, 103-114 (1974)]. A VIP kardiovaszkuláris és bronchopulmonáris hatása is jelentős, mert a VIP hatásos értágítónak és simaizom relaxánsnak bizonyult. Hatását a perifériás, pulmonáris és koronária érrendszerre fejti ki. [Said, S. 1., et al., Clin. Rés., 20, 29 (1972)]. A VIP értágító hatást gyakorol az agyi erekre is. [Lee, T. J. és Berszin, I., Science, 224, 898900 (1984)]. In vitro kísérletekkel kimutatták, hogy a vazoaktív intesztinális peptid az agyi artériákba kívülről bejuttatva értágító hatású volt. A VIP ezért a cerebrális vazodilatáció egyik lehetséges transzmittere. [Lee,

T. és Saito, A., Science, 224. 898-901 (1984)]. A VIP a szem ereire is erőteljes értágító hatást gyakorol. [Nilsson, S. F. E. és Bili. A. Acta Physiol. Scand., 121, 385-392 (1984)].

Lehetséges, hogy a VIP-nek szabályozó hatása van az immun rendszerre. O Dorisio és mások kimutatták, hogy a VIP befolyásolhatja a limfociták szaporodását és migrációját. [J. Immunoi., 135, 792s-796s (1985)]

Mivel a VIP simaizom relaxánsnak bizonyult, és mint említettük, rendszerint jelen van a légúti szövetekben. feltételezték, hogy a VIP a hörgők simaizom relaxációjának endogén mediátora lehet. [Dey, R. D., és Said, S. I. Fed. Proc., 39. 1962 (1980)]. Kimutatták, hogy asztmás betegektől nyert szövetek nem tartalmaznak immunaktív VIP-et, ellentétben a más betegektől nyert szövetekkel. Ez talán a VIP vagy a VIP-érzékeny idegvégződések hiányára utal az asztma betegséggel összefüggésben. [Ollerenshaw, S. et al., New England J. Med., 320, 1244-1248 (1989)]. VIP-pel végzett in vivő és in vitro igazolták, hogy a VIP elernyeszti a légcső sima izmait, és védelmet nyújt olyan hörgőöszszehúzó anyagokkal szemben mint a hisztamin vagy a proszataglandin Fj,. [Wassermann et al., Vasoactive Intestinal Peptid, S. I. Said, kiadó Raven Press, N. Y. 1982, 177-184; Said, S. I. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)]. Intravénásán adva a VEP védelmet nyújt a hörgőösszehúzó anyagokkal szemben, mint a hisztamin, proszataglandin F^, leukotriének, valamint a horgok antigénekkel kiváltott összehúzódása. [Said, S. I. et al., supra, (1982)]. A VIP in vitro gátolta az emberi légutak sejtjeinek nyálka elválasztását is. [Coles, S. }.et al.. Am. Rév. Respir. Dis., 124. 531-536 (1981)].

Intravénás infúzió formájában adva asztmás betegeknek a VIP megnövelte a kilégzés csúcssebességét és megvédett a hisztamin okozta hörgőtágulás ellen. [Móricé, A. H. és Sever, P. S., Peptides, 7, 279-280 (1986); Móricé, A. et al., The Láncét, II 1225-1227 (1983)]. Viszont ezt az intravénás infúzió közben megfigyelt. légzőszervekre gyakorolt hatást kardiovaszkuláris mellékhatások kísérték, leginkább hipotenzió tachikardia. továbbá az arc kipirulása, ha olyan intravénás adagokban alkalmazták, amelyeknek nem volt kardiovaszkuláris hatása, akkor a VIP a légutak áteresztőképességét sem befolyásolta. [Palmer, J, B. D., et al., Thorax. 41. 663-666 (1986)]. Az aktivitás hiányát az adagok kis méretének tulajdonították, és valószínűleg a vegyület gyors lebontásának a következménye.

Aeroszol formában alkalmazva embernél, a természetes VIP csak elhanyagolható védőhatást mutatott a hisztamin okozta hörgő összehúzódással szemben. [Altieri etaí. Pharmacologisl, 25. 123 (1983)]. Inhalációval alkalmazva embereknél, a VIP nem befolyásolta a légzés alapparamétereit, de volt védőhatása a hisztamin okozta hörgő összehúzódással szemben. [Bames. P. és Dixon, C M. S., Am. Rév. Respir. Dis., 130, 162-166 (1984)]. Aeroszolként a VIP nem okozott sem vérnyomáscsökkenést sem tachikardiát a hörgőtágulással kapcsolatban. [Said, S. 1. et al., Vasoactive Intestinal Peptidc, S. 1. Said kiadó, Raven Press, N. Y, 1982, 185-1911.

Mivel a VIP érdekes és klinikailag potenciálisan hasznos hatásokat mutatott, több szintetikus kutatási program tárgya lett. amely programok célja a molekula egy vagy több tulajdonságának a javítása.Takayema et al., olyan VIP analógokat írtak le, ahol a 8. helyzetben glutaminsav helyettesíti az aszparaginsavat. Ez a vegyület kevésbé volt hatásos, mint a természetes VIP. [Chem. Pharm. Bull, 28, 2265-2269 (1980)].

Wendlbcrger etal., egy olyan VIP analóg készítését írta le, amely a 17. helyzetben norleucint tartalmaz metio2

HU 211 534 A9 nin helyett. [Peptide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290295 (1980)]. Ez a peptid a természetes VIP-pel azonos hatást mutatott abban, hogy a radioaktív jóddal jelzett VIP-et máj membrán készítményekből kiszorítsa. Watts és Wooton egy sor lineáris és gyűrűs VIP töredéket írt le, amelyek az eredeti szekvencia 61² tagjait tartalmazták. [Eur. Pat. 184 309 és 325 044; Us. Pat. 4 737 487 és 4 866 039]. Tumer et al., azt találták, hogy a VIP 10-28 tagú töredékei a VIP antagonistái. [Peptides, 7, 849-854 (1986)]. A [4-Cl-D-Phe⁶, Leu^l7]-VIP szubsztituált származékról szintén azt találták, hogy kötődik a VIP receptorhoz, és a VIP antagonistája. Pandol, S. etal., Gastrintest. Liver Physiol., 13, G553G557 (1986)]. Gozes el al., szerint a [Lys’Pro²Arg³Arg⁴Pro⁵Tyr⁶]-VIP analóg kompetitív módon gátolja a VIP kötődését a receptorokhoz a gliasejtekben. [Endocrinology, 125, 2945-2949 (1989)]. Robberecht et al.. leírtak néhány VIP analógot, ahol a természetes VIP N terminusa D tartalmú csoportokkal volt szubsztituálva; [Peptides, 9, 339-345]. Ezek az analógok kevésbé erősen kötődnek a VIP receptorhoz, és a c-AMP aktiválásban is kevésbé aktívak, mint a természetes VIP. Tachibana és Ito a prekurzor molekula néhány VIP analógját írta le. [Peptide Chem., T. Shiba és S. Shakibara kiadók. Prot. Rés. Foundation, 1988, 481486; Jap. Pat 1083012; U. S. Pat. 4 822 774], Ezek a vegyületek a VIP-nél 1-3-szor erősebb hatású bronchodilátorok és 1-2-szer erősebb a vérnyomáscsökkentő hatásuk. Musso et al., is leírtak néhány VIP analógot, amelyek a 6-7, 9-13, 15-17 és 19-28 helyzetekben szubsztituálva voltak. [Biochemistry. 27, 8174— 8181 (1988); Eur. Pat. 8271 151; U. S. Pat 4 835 252]. Ezek a vegyületek ugyanolyan vagy kisebb aktivitásúak voltak, mint a természetes VIP, a receptorhoz való kötődésben és a biológiai hatásukban. Bártfai et al., egy sor szubsztituált [Leu¹⁷]. VIP analógot írtak le. [International Patent Application WO 89/05 857].

Ez a találmány gyűrűs vazoaktív peptidekkel foglalkozik. A gyűrűs peptid olyan peptid, ahol a peptid lánc egyik aminosavjának oldalláncban lévő karboxil terminusa kovalensen kötődik a peptidlánc másik aminosavjának oldalláncban lévő amino terminusával amid kötést képezve. A peptidláncban lévő két aminosav csoport közötti kovalens kötés hozza létre a gyűrűs szerkezetet.

A gyűrűs peptidek biológiai hatása lényegesen eltérhet lineáris analógjaikétól. A gyűrűs peptidek szerkezete merevebb, és több jól meghatározott szerkezeti elemet tartalmaznak. Ezek a változások a gyűrűs peptidek biológiai profiljában jelentkeznek. Egy peptid analóg ciklizálása a peptid hatását meghosszabbíthatja, mivel a peptid megnövekedett merevsége miatt kevésbé lesz érzékeny a kémiai és enzimatikus lebontásra. A gyűrűs peptidek a biológiai rendzserek számára jobban hozzáférhetőek, mert a szerkezet merevebbé válása folytán a fizikai tulajdonságai megváltoznak. Ezenkívül a gyűrűs peptidek jól definiált alakja a lineáris peptidekénél nagyobb specifitást tesz lehetővé a receptoron, így csökken a kívánt biológiai aktvitással együtt jelentkező nemkívánatos aktivitásra való képessége.

Jelen találmány vonatkozik az I képletű, [X-(SEQ ID N0;2)-Y] jelű új ciklikus peptidekre, ahol Rg Asp, Glu vagy Lys; R₁₂ Arg, Lys, Orn vagy Asp; R₎₇ Met vagy Nle; R₂₆ He vagy Val; R₂₈ Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID N0:3)-Y] jelű peptidek, ahol X, Y, R₈ és R₁₂ jelentése az I képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá II képletű, [X(SEQ ID NO:4)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol R_g Asp, vagy Asn; R,₇ Met vagy Nle; R₂₆ He vagy Val; R₂₈ Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO;5)-Y jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése az II képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá III képletű, [X(SEQ ID NO:6)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol R|₇ Met vagy Nle; R₂₆ He vagy Val; R₂₈ Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-ÍSEQ ID NO:7)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Yjelentése az III képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá IV képletű, [X(SEQ ID NO:8)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol R₁₂ Arg vagy Lys; R₁₇ Met vagy Nle; R₂₆ Ile vagy Val; R_2g Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:9)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Yjelentése az IV képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá V képletű, [X(SEQ ID NO: 10)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol Rj jelentése His, N-CH₃-Ala; R₂ Ser vagy Alá; R^ jelentése (1) általános képletű csoport, amelyben Q ciklohexil-alacsony alkil vagy aril-alacsony alkil; Rg jelentése Asp, Glu vagy Alá; R_)o jelentése Tyr vagy R_fi; R]₂ jelentése Arg vagy Lys; R_]6 jelentése Val vagy Alá; R₂₂ jelentése Tyr vagy R^,; R₂₄ jelentése Asn vagy Alá; R₂₆ jelentése Ile, Val vagy Leu; R₂₇ jelentése Leu vagy Lys; R₂g jelentése Asn, Thr vagy Lys; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil, hidrolizálható karboxil védőcsoport vagy R29-R30-R31-Z; R₂₉ jelentése Gly vagy Alá; R₃₀ jelentése Gly vagy Alá; R₃₁ jelentése Alá, Met, Cys(Acm), vagy Thr; Z hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Q jelentése előnyösen (2), (3), vagy (4) általános képletű csoport, ahol n=l .2; X| és X₂ jelentése egymástól függetlenül hidrogén, OH, OCH3, F, Cl, I, CH3, CF3, NO₂, N(CH,)₂, NHCOCH,, NHCÓCgHj, vagy C(CH₃)₃.

Még előnyösebben Q jelentése benzil, p-fluorobenzil, p-amino-benzil, p-hidroxi-benzil, o-metil, 1metil-naftil, vagy 2-metil-naftil. Legelőnyösebben Q jelentése benzil.

Előnyösek az alábbi jelű peptidek: [X-(SEQ ID

HU 211 534 A9

NO:11)-Y],

NO:13)-Y], N0:15)-Y], NO:17)-Y],

N0:19)-Y],

N0:71)-Y],

NO:73)-Y], ahol X, Y,

[X-(SEQ	ID	NO:12)-Y],	[X-CSEQ	ID
[X-(SEQ	ID	N0:14)-Y],	[X-ÍSEQ	ID
[X-(SEQ	ID	N0:16)-Y],	[X-(SEQ	ID
fX-(SEQ	ID	NO:18)-Y],	[X-(SEQ	ID
[X-(SEQ	ID	NO:70)-Y],	[X-ÍSEQ	ID
[X-(SEQ	ID	NO:72)-Y],	[X-(SEQ	ID

Rí, R₂, R«, Re· Rio, R[6, R|

Rjg, R₂₂, R₂₄, és R₂₇ jelentése az V képletben megadott.

A legelőnyösebb gyűrűs peptid a [Ac-(SEQ 1D NO:52)-NHj] jelű.

A találmány szerinti peptidek a tracheobronchiális sima izomzat tartós relaxációját idézik elő kardiovaszkuláris mellékhatások nélkül, és ezért használhatók a hörgők összehúzódási rendellenességeinek, például asztmának a kezelésére.

A találmány a vazoaktív intesztinális pepiid (VIP) olyan új analógjaira vonatkozik, amelynek megnövelt tartós bronchodílatációs hatása van, megfigyelhető mellékhatások nélkül.

A leírásban az „alacsony alkil” kifejezés 1-6 szénatomszámú, egyenes láncú vagy elágazó telített alifás szénhidrogén csoportot jelent, az alacsony alkil csoport előnyösen metil.

A leírásban az „aril” kifejezés mononukleáris aromás szénhidrogén csoportot jelent, például fenilt, amely lehet szubsztituálatlan vagy egy vagy több helyen szubsztituált alacsony alkil, alacsony alkoxi, amino, nitro. mono- és di alacsony alkilamino, alacsony alkil amido vagy fenilamido csoportokkal. Az „aril” kifejezés jelenthet továbbá polinukleáris aril csoportot is. például naftilt, amely szobsztituálva lehet egy vagy több. fent felsorolt csoporttal. Az előnyös aril csoportok a szubsztituálatlan vagy egy fluor szubsztituenst tartalmazó fenil vagy a szubsztituálatlan naftil.

A leírásban X egy szubsztituenst jelent az aminoterminális aminosav amino csoportjának nitrogénjén és Y egy szubsztituenst jelent a karboxi-terminális aminosav karbonil csoportján. X lehet hidrogén vagy egy hidrolizálható amino védőcsoport. Y lehet hidroxil vagy egy hidrolizálható karboxi védőcsoport.

Ami a ..hidrolizálható amino védőcsoport” és a „hidrolizálható karboxil védőcsoport” kifejezéseket illeti, a találmány szerint bármilyen hagyományos, hidrolízissel eltávolítható védőcsoport használható. Alább bemutatunk néhány példát. Előnyös amino védőcsoportok lehetnek az (5) és (6) általános képlet szerintiek, ahol X? alacsony alkil vagy halogénnel szubsztituált alacsony alkil. Ezen védőcsoportok közül különösen előnyösek azok, amelyekben X₃ jelentése C|_₃ alkil észterek, NH₂ és a C|_₃ alkil amidok.

Jelen találmány vonatkozik az I képletű, [X-(SEQ ID N0:2)-Y] jelű ciklikus petidekre, ahol Rg Asp, Glu vagy Lys; R₎₂ Arg, Lys, Orn, vagy Asp, R_J7 Met vagy Nle; R₂6 Ile vagy Val; R₂₈ Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:3)-Y] jelű peptidek, ahol X, Y, R₈ és R,₂ jelentése az 1 képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá II képletű, [X-(SEQ ID N0:4)-Y] jelű dj ciklikus peptidekre is, ahol R_g Asp, vagy Asn; R,₇ Met vagy Nle; R_M Ile vagy Val; R₂₈ Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható kar5 boxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:5)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése az II képletben megadott.

A találmány vonatkozik további ΠΙ képletű, [X10 (SEQ ID N0:6)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol R₁₇ Met vagy Nle; R₂₆ Ile vagy Val; R₂₈ Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:7)-Y] jelű peptidek. ahol X, és Y, jelentése az III képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá IV képletű, [X(SEQ ID N0:8)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol Ri₂ Arg vagy Lys; R₎₇ Met vagy Nle; R₂₆ He vagy Val;

R₂₈ Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport: Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:9)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése az IV képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá V képletű, [X(SEQ ID NO: 10)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol R, jelentése His, N-CH₃-Ala; R₂ Ser vagy Alá; Rg jelentése (I) általános képletű csoport, amelyben Q ciklohexil-alacsony alkil vagy aril-alacsony alkil; R_g jelentése Asp. Glu vagy Alá; R_]0 jelentése Tyr vagy R₆; R₁₂ jelentése Arg vagy Lys; R,_é jelentése Gin vagy Alá; R]₇ jelentése Met. Nle vagy Alá; R₁₉ jelentése Val vagy Alá: R₂₂ jelentése Tyr vagy R₆; R₂₄ jelentése Asn vagy

Alá; R₂₆ jelentése Ile, Val vagy Leu; R₂₇ jelentése Leu vagy Lys; R₂₈ jelentése Asn, Thr vagy Lys; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil, hidrolizálható karboxil védőcsoport vagy R₂9-R₃₀-R₃₁-Z; R₂9 jelentése Gly vagy Alá: R₃₀ jelentése Gly vagy

Alá; R_3l jelentése Alá, Met. Cys(Acm). vagy Thr; Z hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Q jelentése előnyösen (2), (3), vagy (4) általános képletű csoport, ahol n=l,2; Xj és X₂ jelentése egymástól függetlenül hidrogén, OH, OCH₃, F, Cl, 1, CH₃, CF₃, NOj, N(CH₃)₂, NHCOCHj, NHCOC₆H₅, vagy CíCH,)).

Még előnyösebben Q jelentése benzil, p-fluorobenzil, p-amino-benzil, p-hidroxi-benzil, o-metil, 1medlil-naftil. vagy 2-metil-naftil. Legelőnyösebben Q jelentése benzil.

Előnyösek az alábbi jelű peptidek: [X-(SEQ ID NO:11)-Y], [X-(SEQ ID NO:12)-Y], [X-(SEQ ID

NO:13)-Y], [X-(SEQ ID NO:14)-Y], [X-(SEQ ID

NO:15)-Y], [X-(SEQ ID NO:16)-Y], [X-(SEQ ID

NO:J7)-YJ. [X-(SEQ ID N0:18)-Y], (-(SEQ ID NO:19)-Y(. [X-(SEQ ID NO:70)-Y], [X-(SEQ ID

NO:71)-Y], (X-(SEQ ID NO:72)-Y], [X-(SEQ ID

NO:73)-YJ, ahol X, Y, R, R₂ R_e. R₈. R_l0, R,₂. R_l6, Rp, R_i9, R₂₂. R₂₄ és R₂₇ jelentése az V képletben megadott.

A találmány tárgya továbbá eljárás az említett pep4

HU 211 534 A9 tidek készítésére, az említett peptideket tartalmazó gyógyászati készítmények készítésére, valamint ezen peptidek és nem toxikus, inért hordozóanyagok használatára bronchotracheális összehúzódást rendellenességek kezelésére. A gyűrűs polipeptidek említett készítési eljárását az jellemzi, hogy (a) egy védett és gyantához kötött megfelelő aminosav szekvenciájú peptid védőcsoportjait szelektíven eltávolítjuk, hogy odalláncbeli szabad amino csoportot és oldalláncbeli szabad karboxi) csoportot kapjunk.

(b) az oldalláncbeli szabad amino csoportot és az oldalláncbeli szabad karboxi! csoportot kovalensen összekötjük egy megfelelő amidképző reagenssel.

(c) eltávolítjuk a védőcsoportot és a gyűrűs peptideket lehasítjuk a gyantáról megfelelő védőcsoport eltávolító és hasító reagenssel, kívánt esetben további adalékok, például kation eltávolítók jelenlétében, és kívánt esetben a gyűrűs peptideket gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.

Ennek a találmánynak a tárgya továbbá az említett gyűrűs peptidek használata olyan gyógyszerkompozíciók előállítására amelyeket bronchotracheális összehúzódást rendellenességek kezelésére használnak.

A peptidek elnevezésének nomenklatúrája megfelel a szokásosan használtnak, amikor is az N-terminális amino csoport van a baloldalon és a C terminális karboxil csoport a jobboldalon. A természetes aminosav kifejezés a fehérjékben természetben előforduló aminosavak egyikét jelenti, vagyis lehet Gly, Alá, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn. Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp, és His. Ahol az aminosavnak izomer formái léteznek, az aminosavak L izomereiről beszélünk, hacsak kifejezetten meg nem nevezzük a másikat.

Az alábbiakban felsoroljuk azokat a rövidítéseket és jeleket, amelyek a fentieken kívül további aminosavakat, védőcsoportokat, oldószereket és más hasonlókat jelentenek.

JelJelentés

AcAcetil

OrnOrnitin

NleNorleucin

Fmoc9-Fluorenilmetiloxikarbonil

Fm9-Fluorenilmetil

Boct-Butiloxikarbonil

BomBenziloximetil

CH2C12Diklórmetán

CH3CNAcetonitril

DMFDimetilformamid

DIPEAN.N-diizopropiletilamin

TFATrifl uorecetsav

HOBTN-Hidroxibenzotriazol

DCCN.N diciklohexilkarbodiimid

DICN.N Díizoprpilkarbodiimid

BOPBenzotriazol-l-iloxi-tri-(dimetilamino)foszfó nium hexafluorofoszfát

N-Me-Alald. a (7) számú képletet

2-Nalld. a (8) számú képletet

F-Pheld. (9) számú képletet

FAB-MSGyors atom bombázásos tömegspektrometria

A természetes VIP peptidszekvenciájának analógjait úgy jelöljük, hogy a helyettesítő aminosavat szögletes zárójelbe tesszük a „VIP” előtt. Az N-terminális amino csoport szubsztituensek, vagy X-et a fenti példákban a zárójelekben lévő szubsztiuenstől balra írjuk. A zárójelbe tett szekvenciaszámok a „VIP” jobboldalán aminosavak eltávolítását vagy hozzáadását jelentik a természetres szekvenciához képest. Például, Ac[Lys^l2,Nle^l7Gly^{29) VIP(,}‘^29)NH2 egy olyan polipeptidet jelent, amelyben az aminosav szekvencia megfelel a természetes emberi VIP-nek azzal a különbséggel, hogy az N terminuson hidrogén helyett acetil csoport van, az arginin helyett egy lizint tartalmaz 12-es helyzetben, egy norleucint a metionin helyett 17-es helyzetben. Ezenkívül egy glicin van kapcsolva a 28-as aszparagin karboxil csoportjához, és ez a 29-es helyzet. Az „OH” és az „NHj” jelek a „VIP” után vagy zárójelben a polipeptid szabad sav illetve amid formáját jelzik. Ha egyiket sem használtuk, a kifejezés mindkét formát jelentheti.

Mint már említettük, a gyűrűs peptid kifejezés a leírásban azt jelenti, hogy a peptid egyik aminosajának oldalláncbeli karboxil csoportját kovalensen kötjük a peptidlánc egy másik aminosavjának oldalláncbeli amono csoportjához amid kötés képzésével. A gyűrűs peptidekre többféle elnevezést használhatunk. Alább felsorolunk néhány példát.

[Ac-(SEQ ID NO:20)-NH²] jelű, (a) képletű [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH²] jelű. (b) képletű [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH²] jelű, (c) képletű

A bemutatott háromféle (a-c) képletű szerkezet, a velük együtt alkalmazott SEQ ID NO: és a szekvencia lista ugyanazt a polipeptidet jelenti és határozza meg, amelynek az aminosav szekvenciája megfelel a természetes emberi VIP-nek, amelyben az N terminuson egy hidrogént acetil csoport helyettesít, a 12-es helyzeben egy arginint lizin helyettesít, a 17-es helyzetben egy metionint norleucin helyettesít, a 26-os helyzetben egy izoleucint valin helyettesít és a 28-as helyzetben egy aszparagint treonin helyettesít. Ezenkívül amidkötés jött létre a 8-as helyzetű aszparaginsav oldalláncbeli karboxilja és a 12-es helyzetű lizin oldalláncbeli amino csoportja között, és így gyűrűs peptid analóg keletkezett. A peptidszerkezet fenti jelölései egyenértékűek és felcserélhetők.

A leírásban „R_nl n helyzetű aminosavat jelent valamelyik bemutatott szerkezetben és X_B n helyzetű aminosavat jelent a megfelelő szekvenciában az alábbi szekvencia lista szerint; ezek egyenértékűek és felcserélhetők azokban az esetekben, ahol X_aa két vagy több aminosav közötti választást jelent.

A találmány szerinti ciklikus peptidekben a következő konfigurációkat használjuk, hacsak másképp nem említjük.

Aminosav a Aminosav terminus, amely láncban gyűrűs peptidet képez

Lys ε amino (e=epszilon)

Orn δ amino (ö=delta)

Asp β karboxil ^=béta

Glu γ karboxil (ytgamma)

HU 211 534 A9

Az ezen találmány szerinti vegyületek közé tartoznak az alább felsorolt aminosav szekvenciákat tartalmazó peptidek:

Ac-[Lys^l2,Nle'⁷.Val²⁶,Thr^2B]-VIP cyclo (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶ ,Thr²⁸]-VIP cyclo (Glu⁸—»Lys¹²¹ [Ac-(SEQID NO:21)-NH_2]

Ac-[ Asn⁸, Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Asp⁹—»Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NHJ

Ac-[Orn’ ²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr⁷⁸]-VIP cyclo (Asp⁸—>Om¹²) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂]

Ac-[Lys⁸, Asp¹²,Nle¹⁷, Val²⁶, Thr^2S]-VIP cyclo (Lys⁸—>Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂] Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIPcyclo (Glu⁸—»Orn¹²) [Ac-(SEQID NO:25)-NH,] Ac-[Lys¹²,Glu^l6,Nle^l7,Val²⁶,Thr²⁸]-VIPcyclo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂]

Ac- [ Ly s¹² .Nle¹⁷, Asp²⁴. Val ²⁶,Thr²⁸] - VIP cy clo (Lys²⁰—»Asp²⁴' [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶.Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle^l7,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—» Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]

Ac-lp-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸.Gly^^Met³¹ ]-VIP cyclo (Lys²¹ —»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂]

Ac-tGlu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵ ,Val²⁶.Thr^3s]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:31 )-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶.Lys¹².Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶.Thr²⁸,Gly²⁹³⁰,

Cys(Acm)³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [ Ac-( SEQ ID NO.32 )-NH·,]

Ac-[Ala².Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵.Val²⁶.Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂]

Ae-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,VaI²⁶,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH,]

Ac-[2-Nal¹⁰, Leu^l2.Nle¹⁷,Ála¹⁹.Asp²⁵,Val²⁶.Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH,] Ac-[O-CH_rTyr¹⁰.Leu^l2.NÍe^l7,Ala¹⁹.Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NHi] Ac-fp-F-Phe⁶.p-NH_rPhe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹.Asp²⁵.Val²⁶.Thr²⁸]-VIPcyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷.Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^{27 28}]-VIP cyclo (Lys^2,-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂] Ac-[N-Me-Ala^l.Lys^l2,Nle^l7,Ala¹⁹.Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle^l7,Ala^l9,Asp²ⁱ.Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH₂]

Ac-[O-Me-Tyr^l0,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28, Alá^{29 31}]-VIP cyclo (Lys²¹—» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NHJ

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28,· Alá²⁹'³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]

Ac-[N-Me-Ala^l,Glu⁸,Lys¹²,Nle^l7,Ala^l9,Asp²⁵.Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹ —>Asp²⁵] [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶.GIu⁸,Lys¹²,Nle^l7,AIa¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷-²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQID NO:45)-NH₂] Ac-[l-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶.Ly_S27.28^_viP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,p-NH₂Phe¹⁰Lys^l2,Nle^⁷,Ala^l9,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-Vip cyclo (Lys²¹-+Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,O-CH₁-Tyr^lü,Lys^l2,Nle^l7,Ala^l9.Asp²⁵.Leu²⁶,Lys²⁷-²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ác-(SEQID NO:48)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷.Ala¹⁹.Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyclo (Lys²¹ —»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH,]

Ac-[l-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵.Val²⁶,Thr^2B]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH₂]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’^2B,Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys^2l->Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂] Ac-[Glu⁸,Lys¹².Nlc^l7,Ala^l9,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²'²⁸,Gly^{29 3(,}.Thr³¹ J-VIP cyclo (Lys^2l->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂]

Ac-[Ala².Glu⁸,Lys^l2,Nle¹⁷.Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸] VIP cyclo (Lys²¹ —»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH,]

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰.Lys¹²,Nle¹⁷.Asp²⁵,Val²⁶.Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ác-(SEQ ID NO:54)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷.Ala¹⁹, m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH,]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys^2l-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH,] Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, m-OCH,-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷-²⁸]-VlP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂J

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys^{27 2B}]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) |Ad-(SEQ ID NO:58)-NH₂]

HU 211 534 A9

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Alá¹⁹,Alá²⁴, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂] Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶¹⁷¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂]

Ac-[ Alá⁸,Lys¹², Alá ^l6,Nle¹⁷, Alá²⁴, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28]-VIP cyclo (Lys²¹—» Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂] Ac-[Ala⁸.Lys¹²,Ala¹⁶’¹⁷-¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸]VIP cyclo (Lys^2,-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂] Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH₂] Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala^l6l7l9,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]VIP cyclo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂] Ac-[Glu⁸,Lys¹².Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹·³⁰,Thr^3,]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂] Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Yal²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹³⁰,Thr^3|]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂] Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28,Gly²⁹-³°,Thr^3l]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH₂] Ac-[GIu⁸,Lys^l2,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷-²⁸,Gly^{29 30},Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—» Asp²⁵) [Ac-íSEQ ID NO:68)-NH₂] Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala^l9,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷-²⁸,Ala²⁹'³¹]VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂]

A találmány szerinti vegyületek nehézség nélkül előállíthatók bármilyen hagyományos módszenei, amellyel peptidkötés alakítható ki aminosavak között. Ilyen hagyományos módszer például bármilyen folyadékfázisú eljárás, amely szerint egy aminosavnak, amelynek karboxil csoportja vagy más reaktív csoportja védve van, a szabad amino csoportja kondenzálhat egy másik aminosavnak, amelynek az amino csoportja vagy más reaktív csoportja védve van, a primer karboxil csoportjával.

A találmány szerinti vegyületek szintézisére szolgáló eljárást meg lehet valósítani úgy, hogy az aminosavakat a kívánt szekvenciának megfelelően egyenként adjuk egy másik aminosavhoz vagy származékához, vagy úgy is, hogy hagyományos módon peptid részleteket állítunk elő a kívánt szekvenciával, majd összekapcsoljuk, hogy a kívánt pepiidet eredményezze.

A találmány szerinti új vegyületek előállítására szolgáló egyik ilyen hagyományos módszer például magában foglalhat bármilyen szilárd fázisú peptidszintézist. Eszerint a módszer szerint az új vegyületek szintézise úgy megy végbe, hogy a kívánt aminosav csoportokat a szekvenciának megfeleld sorrendben egyenként kapcsoljuk a növekvő peptidlánchoz, a szilárd fázisú módszerek általános alapelveinek megfelelően. [Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 21492154 (1963); Bárány et al., The Peptides, Analysis,

Synthesis, and Biology, Vol. 2, Gross, e. és Meienhofer,

I. kiadók Academic Press, 1-284(1980)].

A peptidszintézis általános módszere szerint az aminosavak oldalláncában lévő reaktív csoportokat védik olyan megfelelő védőcsoportokkal, amelyek meggátolják a reaktív csoportok kémiai reakcióit, amíg a védőcsoportot végül eltávolítják. Általános módszer, hogy egy szabad aminosavon vagy egy oligopeptiden a szabad amino csoportot védik, míg a molekulája a karboxil csoportjánál fogva reagál, és ezután szelektíven eltávolítják a védőcsoportot az alfa amino csoportról, s a következő reakció ezen a ponton történhet. Bár a szilárd fázisú peptidszintézis számára kifejlesztettek néhány speciális védőcsoportot, megjegyezzük, hogy minden aminosavat meg lehet védeni a folyadékfázisú szintézisekben hagyományosan használt védőcsoportokkal.

Az alfa aminosavak megvédhetők egy megfelelő védőcsoporttal, amely lehet aromás uretán típusú, például benziloxikarbonil (Z) és szubsztituált benziloxikarbonil, például p-klórbenziloxikarbonil, p-nitrobenziloxikarbonil, p-brómbenziloxikarbonil, p-bifenil-izopropiloxikarbonil, 9-fluorenilmetil-oxikarbonil (Fmoc) és p-metoxíbenziloxikarbonil; alifás uretán típusú, például t-butiloxikarbonil (Boc), diizopropilmetiloxi-karbonil, izopropiloxikarbonil és alliloxikarbonil. Az alfa amino csoport legelőnyösebb védőcsoportja a Boc.

A karboxil csoportok megvédhetők egy megfelelő védőcsoporttal, amely lehet aromás észter, például benzil (OBzl) vagy szubsztituált benzil, amelynek szubsztituensei lehetnek alacsony alkil, halogén, nitro, tio vagy szubsztituált tio, például alacsony alkil (1-7 szénatomszámú) tio; alifás észter, például alacsony alkil, ι-butil (Ot-Bu), ciklopentil, ciklohexil (OcHx), cikloheptil és 9 fluorenilmentil (OFm). Aglutaminsav (Glu) legelőnyösebb védőcsoportjai OBzl és OFm. Az aszparaginsav (Asp) legelőnyösebb védőcsoportjai OcHx, OBzl és OFm.

A hidroxil csoportok megvédhetők egy megfelelő védőcsoporttal, amely éter lehet, például benzil (Bzl) vagy szubsztituált benzil, amelynek szubsztituensei lehetnek alacsony alkil, halogén, például 2,6-diklórbenzil (DCB), nitro vagy metoxi; t-butil (t-Bu), tetrahidropiranil és trifenilmetil (tritil). A szerin (Ser) és a treonin (Thr) legelőnyösebb védőcsoportja a Bzl, a tiroziné (Tyr) a Bzl és a DCB.

Az oldalláncbeli aminosavak megvédhetők egy megfelelő védőcsoporttal, amely lehet aromás uretán típusú, például benziloxikarbonil (Z) és szubsztituált benziloxikarbonil, például p-klórbenziloxikarbonil, 2-klórbenziIoxikarbonil (2-C1-Z), p-nitrobenziloxi-karbonil, p-brőmbenziloxikarbonil, p-bifenil-izopropiloxikarbonil, 9-fluorenilmetil-oxikarbonil (Fmoc) és p-metoxibenziloxikarbonil (Moz); alifás uretán típusú, például t-butiloxikarbonil (Boc), diizopropil-metiloxikarbonil, izopropiloxikarbonil és alli.oxikarbonil. Az ornitin (Orn) legelőnyösebb védőcsoportja Z, a liziné (Lys) 2-C1-Z és Fmoc.

A guanidino csoportok megvédhetők egy megfelelő védőcsoporttal, amely lehet nitro, p-toluolszulfonil(Tos), Z, adamantiloxikarbonil és Boc. Az arginin (Arg) legelőnyösebb védőcsoportja Tos.

HU 211 534 A9

Az oldalláncbeli amid csoportokat xantillal (Xan) védhetjük. Az aszparaginnak (Asn) és a glutaminnak (Gin) nincs előnyös védése.

Az amidazol csoportok megvédhetők megfelelő védőcsoportokkal, amely lehet p-toluolszulfonil (Tos), 9-fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc), trifenilmetil (Tritil), 2,4-dinitrofenil (Dnp), Boc és benzil oximetil (Bőm). A hisztidin (His) legelőnyösebb védőcsoportjai Tos és Bőm.

Hacsak másképp meg nem adjuk, az alább megadott százalékok szilárd anyagokra szilárd keverékben tömegszázalékot jelentenek, folyadékokra folyadékban térfogatszázalékot, és szilárd anyagokra folyadékban vegyes százalékot. Továbbá, hacsak másképp nem említjük, a reagensek és eszközök alább felsorolt szállítóit nem tekintjük kizárólagosnak. A szakember nehézség nélkül választhat hasonló reagenseket és eszközöket más szállítóktól.

Minden oldószert, az izopropanolt (iPrOH), a diklórmetánt (CH₂C1₂) és a dimetilformamidot (DMF) a Fischertől vagy a Burdick & Jacksontól vettük és további desztilláció nélkül használtuk. Atrifluorecetsavat a Halocarbontól vettük és további tisztítás nélkül használtuk. A diizopropiletilamint (DIPEA) a Pfaltz and Bauertől vásároltuk, és használat előtt CaO-ról és ninhidrinről desztilláltuk le. A diciklohexilkarbodiimidet (DCC) és a diizopropilkarbodiimidet (D1C) a Fiukétól vásároltuk és további tisztítás nélkül használtuk. A hidroxibenzotriazol (HOBT) és az 1.2-etánditiol (EDT) a Sigma Chemical Co. terméke volt és további tisztítás nélkül használtuk. A védett aminosavak általában L konfigurációjúak voltak, és vagy a Chemical Dinamics Corp. vagy a Bachem szállította őket. Ezen reagensek tisztaságát használat előtt vékonyréteg kromatográfiával. NMR-rel és olvadáspont méréssel ellenőriztük. A Boc-O-Me-Tyr-t, Boc-2-Nal-t és a Boc-p-F-Phe-l az irodalomban leírt módon állítottuk elő. [Bolin, D.R.US. Pat. Appl. 734, 503], A Boc-Asp(OF,)-et és a Boc-Glu(OFml-et az irodalomban leírt módon állítottuk elő. [Bolin. D.R. et al.. Org. Prep. Proc. Int.. 21, 67-74 (1989)]. A benzhidrilamin gyanta sztirol-19) divinilbenzol kopolimer volt (100-200 vagy 200-400 mesh). és a Biomega, a Bachem az Omni vagy az Advanced Chemtech szállította. Ezen gyanták teljes nitrogéniartalma általában 0,3-1,2 meq/g között volt.

A vékonyréteg kromatográfiát (TLC) üveg alapú, Merck gyártmányú 6 F254 szilikagél lapokon végeztük megfelelő oldószer rendszerekkel. A kimutatást UV fluoreszenciával, jódgőzökkel vagy ninhidrines lefújással végeztük (primer és szekunder aminok esetén).

Az aminosav összetétel meghatározására a peptideket zárt, evakuált hidrolízis csőben 1-4 mg fenolt tartalmazó 6N HCI-val 115 ’C-on 22-24 órán át hidrolizáltuk. Az analízist vagy egy Beckman 121M aminosav analizátoron végeztük, vagy egy Waters féle HPLC-n alapuló aminosav analizáló rendszert használtunk vagy Waters Cat Ex gyantával vagy Pierce AA511 oszloppal és ninhidrines detektálással.

A nagynyomású folyadék kromatográfiát (HPLC) vagy LDC készüléken végeztük, amelynek részei voltak. Constametric I és III szivattyúk, egy Gradient

Master nevű oldószeradagoló és keverőprogrammal, és egy Spectromonitor III változtatható hullámhosszú UV detektor. Az analitikai HPLC-t fordított fázisú üzemmódban végeztük. Waters pBondapak C₎₈ oszlopot használva (0,4x 30 cm). Apreparatív HPLC elválasztásokat Whatman Magnum 20 partisii 10 ODS-3 oszlopon végeztük (2x25 cm vagy 2x50 cm), amelyet Waters GuardPak C₁₈ előtét oszloppal szereltünk fel. A gélkromatográfiát 2x85 cm-es oszlopon végeztük LKB varioperpex perisztaltikus pumpával és IBM változtatható hullámhosszú UV detektorral.

A peptideket előnyösen a Merrifield által általánosan leírt [J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)] szilárd fázisú szintézissel állítottuk elő, bár ezzel egyenértékű kémiai szintézisek is alkalmazhatók, mint azt már említettük. A szilárd fázisú szintézis a peptid C terminusa felől indul el úgy. hogy egy védett alfa aminosavat egy megfelelő gyantához kapcsolunk. Ilyen kiindulási anyagot úgy kapunk, hogy egy alfa amino csoportján védett aminosavat észter kötéssel klórmetilezett vagy hidroximetilezett gyantához kapcsolunk, vagy amid kötéssel egy benzhidrilamin (BHA) vagy para-metilbenzhidrilamin (MBHA) gyantához. A hidroximetil gyanta készítése jól ismert. A klórmetilezett gyanták a kereskedelemből beszerezhetők, és készítésük szintén jól ismert. A BHA és MBHA gyanták a kereskedelemből beszerezhetők, és általában akkor használják őket, amikor a szintetizálandó peptid szubsztituálatlan amid csoportot tartalmaz a C terminuson.

Az első aminosavat általában Boc-aminosav formában, szimmetrikus anhidridjeként kötjük a gyantához, és 2-10 ekvivalens aktivált aminosavat használunk a gyanta egy nitrogén ekvivalensére, a reakció után a gyantát kimossák és vákuumban szárítjuk. A gyanta aminosav lekötő kapacitását úgy határozzuk meg. hogy a Boc-aminosavas gyantából egy aliquot részt aminosavra analizálunk. Ez az érték általában 0,20,4 mmol g gyanta közé esik. Ha a gyantán reagálatlan amino csoport marad, azt elreagáltatjuk ecetsavanhidriddel diizopropiletilamin jelenlétében diklórmetános közegben.

A Boc-aminosav hozzáadása után a gyantát ismétlődő ciklusoknak vetjük alá, az aminosavakat a szekvencia sorrendjében adva hozzá. Eltávolítjuk az alfa amino csoportot védő Boc-ot savas körülmények között. Erre a célra használható trifluorecetsav diklórmetánban, sósav dioxánban vagy hangyasav és ecetsav elegyei. Előnyösen alkalmazható 50 térfogat% TFA diklórmetánban. Ez tartalmazhat még 1-5% EDT-t vagy dimetilszulfidot a t-butil karbónium ionok eltávolítására. Ismeretesek más standard hasítási módszerek is, amelyek szintén alkalmazhatók.

Az alfa amino védőcsoport eltávolítása után a többi védett aminosavat egyenként hozzákapcsoljuk a kívánt sorrendben, és végül egy védett peptid-gyanta intermediert kapunk. Az aminosavak kapcsolásához a szilárd fázisú peptidszintézisben használt aktiváló reagensek ismertek. Például ilyen szintézisekhez megfelelően használható reagensek a benztriazol-l-iloxi-tri-(dimetilamino)foszfóniumhexafluorofoszfát (BOP), a dicik8

HU 211 534 A9 lohexilkarbodiimid (DCC) és a diizopropilkarbodiimid (DIC). Előnyösek a DCC és a DIC. Más aktiváló reagensek is használhatók, amelyeket Bárány és Merrifield írtak le. [The Peptides, Vol 2, J. Meienhofer kiadó, Academic Press, 1979, 1-284]. A szintézisciklusok optimalizálására sokféle reagenst lehet adni a reakcióelegyhez, például 1-hidroxibenzotriazolt (HOBT), Nhidroxiszukcinimidet (HOSu), és 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l,2,3-benztriazint (HOOxBT). Előnyös a HOBT.

Egy tipikus szintetikus ciklus időrendje az alábbi:

Lépés	1. Időrend (Protokol)
Reagens	Idő
1	CH2C12	2x30 mp
2	50% TFA-CH2CI2	1 perc
3	50% TFA-CH2C12	15 perc
4	ch2ci2	2x30 mp
5	iPrOH	2x30 mp
6	CH2C12	4x30 mp
7	6% DIPEA-CH2C12	3x2 perc
8	ch2ci2	3x30 mp
9	kapcsolás	10 perc-18 óra
10	CHjCI,	2x30 mp
11	iPrOH	1x30 mp
12	CH2C12	1x30 mp
13	DMF	2x30 mp
14	CH2C12	3x30 mp

A kapcsolások és a mosások során használt oldószerek mennyisége 10-40 ml-g gyanta volt. A kapcsolásokat vagy a Boc-aminosavak előre elkészített szimmetrikus anhidridjeivel végeztük, vagy O-acil izokarbamid származékokkal. Általában 2-10 ekvivalens aktivált Boc-aminosavat adtunk egy ekvivalens amin gyantához diklórmetános oldatban. A Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Bom) esetében 20-25%os DMF-CHjCE oldószert használtunk. A Boc-Asn-t, Boc-Gln-t és Boc-his(Bom)-ot HOBT aktív észter formájukban kapcsoltuk, hogy minimalizáljuk az ismert mellékreakciókat.

A peptidek ciklizálást általában jól ismert módszerekkel végeztük a következőképpen. A peptiden belül azoknál az aminosavaknál, amelyeknek az oldalláncát kapcsolni akartuk, különböző védőcsoportokat használtunk. Az amino csoportokat tartalmazó aminosavaknál (Lys és Orn) az Ne- és Νδ- Fmoc származékokat építettük a peptidláncba, a karboxil csoportokat tartalmazó aminosavaknél (Asp és Glu) pedig az Οβ és az Ογ-Fm származékokat. A peptidet, még a gyantához kötve, 20-40% piperidint tartalmazó DMF-es oldattal kezeltük, hogy szelektíven eltávolítsuk a Fmoc és Fm védőcsoportokat. Az oldalláncban lévő szabad amino és karboxil csoportokat ezután kovalensen összekapcsoltuk a molekulán belül egy megfelelő amidképző reagenssel, mint például difenilfoszforilazid (DPPA), DCC, DIC vagy BOP. Előnyös a DCC és a BOP.

Egy tipikus ciklizálási reakció időrendje az alábbi:

Lépés	2. Időrend (Protokol)
Reagens	Idő
1	DMF	1x30 mp
2	2040% piperidin/DMF	1 perc
3	DN1F	1x30 mp
4	2040% piperidin/DMF	20 perc
5	iPrOH	1x30 mp
6	DMF	1 x30 mp
7	iPrOH	2x30 mp
8	DMF	2x30 mp
9	6% DIPEA/CH2C12	2x2 perc
10	ch2ci2	1x30 mp
11	DMF	1x30 mp
12	kapcsolás	1-24 óra
13	iPrOH	1 x30 mp
14	CH2C12	1 x30 mp
15	DMF	2x30 mp
16	CH2C12	3x30 mp

A kapcsolási reakciókat a szintézis során végig követtük, és a Kai ser féle ninhidrin teszttel határoztuk meg, hogy mennyire mentek végbe. [Kaiser et al.. Anal. Biochem., 34, 595-598 (1970)]. A BocArg(Tos), Boc-Asn és a Boc-Gln lassan reagáltak. A nem teljes kapcsolási reakciókat vagy újra elvégeztük frissen aktivált aminosavval, vagy blokkoltuk úgy, hogy a peptid gyantát ecetsav anhidriddel kezeltük, ahogy fent leírtuk. A teljesen elkészült peptid gyantát vákuumban néhány órán át szárítottuk.

A blokkoló csoportok eltávolítását és a peptid lehasítását a gyantáról minden vegyület esetében a következőképpen végeztük. Általában, a peptidgyantát 1 g gyantára számítva 25-100 μΐ etánditiollal, 1 ml anizollal és 9 ml folyékony hidrogénfluoriddal kezeltük 0 °C-on 45-60 percig. Teflon HF készülékben (Peninsula). Egy másik,

HU 211 534 A9 kétlépéses hasítási eljárás is alkalmazható [Tam et al., Tetrahedron Letters, 23, 2939-2940 (1982)], amely szerint 3 ml dimetil szulfiddal és 1 ml hidrogénfluoriddal kezelik 2 órám át 0 C-on és a 90%-os HF-dal való kezelés előtt bepárolták. Az illékony reagenseket ezután vákumban távolítottuk el jégfürdő hőmérsékletén. A maradékot kétszer-háromszor 20 ml dietiléterrel és etilacetátlal mostuk és szűrtük. A peptideket a gyantáról háromszor-négyszer 20 ml 10%-os ecetsavval való mosással extraháltuk és szűrtűk. Az egyesített vizes szűrleteket liofilizálva kaptuk a nyers terméket.

A nyers pepiidet először finomszemcsés Sephadex G-25 oszlopon gél kromatográfiával tisztítottuk, hogy elválasszuk a monomer és oligomer anyagokat. A peptideket minimális térfogatú 10%-os ecetsavas oldatban vittük fel a gél oszlopra. Az oszlopot 10%-os ecetsavval eluáltuk 0,5-1,5 ml/perc áramlási sebességgel. A távozó oldatot 254 nm-en vizsgáltuk, a kívánt sávban elnyerlő frakciókat összegyűjtöttük, és liofílizálva kaptuk a félig tiszta terméket.

A félig tiszta peptid tisztítása általában preparatív HPLC-vel történt. A peptideket minimális térfogatú 1 %-os ecetsavas vagy 0,1 %-os TFA oldatban vittük az oszlopra. A gradiens elúció általában 10%-os B pufferrel indult, majd 10-25%-os B 10 perc alatt, és 25-25% B 3 óra alatt (Apuffer: 0,1% TFA/H₂O. B puffer: 0,1% TFA/CH₃CN). 8 ml/perc áramlási sebességnél. Az UV detektálás 220 nm-en történt. 1,5-2,5 percenként vettük a frakciókat, és analitikai HPLC-vel analizáltuk őket. A nagy tisztaságúnak ítélt frakciókat összegyűjtöttük és liofilizáltuk.

A végtermék tisztaságát fordított fázisú analitikai HPLC-vel ellenőriztük, mini már említettük. Ennek általános körülményei: gradiens elúció, 20-40% b 15 perc alatt, 2,0 ml/perc áramlási sebességgel. (A puffer: 0,022% TFA/H₂O, B puffer: 0,022% TFA/CHjCN). Az UV detektálás 210 nm-en történt. Az összes lennék tisztaságát 97-99%-ra becsültük. Az egyes peptidek aminosav analízisét elvégeztük, és az elfogadható határok között volt. Általában minden végterméket megvizsgáltunk gyors atom bombázásos tömegspeklrometriával (FAB-MS) is. Minden tennék az elfogadható határok között adta a várt M+H ionokat.

A találmány szerinti új vegyületeknek értékes gyógyászati tulajdonságaik vannak. Relaxálják a légcsövet, és erőteljes hörgőtágító hatásuk van. Ezenkívül a vegyületeknek nincs kardiovaszkuláris mellékhatásuk. Az új peptidek által elért hörgőtágulás több mint két órán át fenntartható Ezért, mivel aktív bronchodilatánsok, a vegyületek értékes gyógyászati anyagok bronchokonstriktív rendellenességek, például asztma kezelésében.

Az 1-V képletű új vegyületeket kombinálhatjuk tipikus gyógyászati hordozókkal, előnyösen nem-toxikus, inért gyógyászatilag elfogadható hordozó anyagokkal, hogy olyan kompozíciókat alkossanak, amelyek megfelelnek bronchokonstriktív rendellenességek, mint az asztma kezelésében való használatnak. Belsőleg alkalmazva az adagok nagysága több tényezőtől függ, például magától a vegyülettől és a formulázástól. A hatékony adagolás mértékét a szokásos módszerekkel lehet megállítani az effektív koncentráció (EC₅₀) megadott értékeiből. Embernél a tipikus adagolás 0,01-100 pg/kg lehet. A kis, pl. 01 pg EDjq értékű vegyületek jellemző adagjai embernél 0,2-20 pg/kgosak lehetnek.

Az I-V képlet szerinti új vegyületek gyógyászatilag alkalmazható sókat képeznek számos szerves és szervetlen savval, például kénsavval, foszforsavval, sósavval, hidrogénbromiddal, hidrogénjodiddal, salétromsavval, szulfaminsavval, citromsavval, tejsavval, pirosszőlősavval, oxálsavval, maleinsavval, borostyánkősavval, borkősavval, fahéjsavval, ecetsavval, triflourecetsavval, benzoésavval, szalicilsavval, glukonsavval, aszkorbinsavval, és más savakkal.

A hatásos vegyületeket parenterálisan lehet adagolni, intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, orálisan vagy intranazálisan. A parenterális adagolás előnyös módja orális vagy intranazális alkalmazás aeroszol útján.

Találmányunkat továbbá az alábbi példákon mutatjuk be.

/. példa

Boc-ThriBzli-SHA gyanta előállítása

Benzhidrilamin kopolislirol-1 % divinilbenzol térhálósított gyantát (9,5 g, 3,6 mekv. 200—400 ASTM mesh, Vega Biochem) 100 ml metilénkloridban duzzasztottuk, szűrtük és mostuk a 1. Protokol 7-8 lépése alapján. Boc-Thr(Bzl) (3,35 g, 10,8 mmol) és diciklohexilkarbodiimid (1,12 g, 5,42 mmol) 50 ml CH₂C1₂ben egy órán át végzett reagáltatást követően szűrtük és 50 ml diklormetánban a duzzasztott gyantához adtuk. Ezt az elegyet 18 órán át szobahőfokon rázattuk. DIPEA-t (630 ml, 3,6 mmol) adtunk hozzá és további egy órán át rázattuk és ezt követően az 1. Protokol 10-14 lépését alkalmaztuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt, Az elreagálatban amin csoportokat a gyantát 30 percig lNml ecetsavanhidridet és 1 ml DIPEA-t tartalmazó 50 ml metilénkloriddal kezelve elreagáltattuk, szűrtük és mostuk az 1. Protokol 13-14 lépésének megfelelően. A gyantát egy éjszakán át vákuumban szárítva 9,8 g Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát nyertünk. A gyanta egy részletét aminosav analízisnek alávetve 0,17 mmol Thr/g eredményt kaptunk.

2. példa

Ac-ILys'². Nle'f Val^2b. Thr^J-VIP ciklo (Asp^—tLys¹¹)

IAc-(SEQ ID ΝΟ:20)-ΝΗι] előállítása

A Boc-Thr(Bzll-BHA gyantát (9,8 g, 1,7 ml), melyet az 1. példa alapján állítottunk elő az 1. Protokol alkalmazásával szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. A kapcsolások mindegyiként Boc-aminosavból és diciklohexilkarbodiimidből előre elkészített szimmetrikus anhidridet alkalmaztunk. Boc-asparagint és Bochistidin(benziloximetíl)-t kapcsoltunk, mint viszonylag HOBT aktív észtereket. A kapcsolási lépés teljessé tételéhez általában 1-18 óra volt a reakció idő. Öt kapcsolási ciklust hajtottunk végre Boc-Leu-val (1,5 g, 6,0 mmol), Boc-Val-nal (1,3 g, 6,0 mmól), Boc10

HU 211 534 A9

Ser(Bzl)-nel (1,8 g, 6,0 mmol), Boc-Asn-nal (773 mg,

3,3 mmol) és Boc-Leu-nal (1,5 g, 6,0 mmol). A gyantát vákuum alatt szárítva 12,2 g Boc-hexapeptid gyantát nyertünk.

Az így kapott gyanta 8,2 g-os részletét hat ciklusban kapcsoltuk az alábbiakban : Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,77 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), BocVal (876 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (762 mg, 4,0 mmol), valamint Boc-Nle (932 mg, 4,0 mmol). így 10,2 g Bocdodekapeptid gyantát nyertünk.

Az így kapott gyanta 1,26 g-ját (0,139 mmol) a következő két kapcsolási ciklusnak vetettük alá: BocGln (205 mg, 0,93 mmol) és Boc-Lys (2-CI-Z) (627 mg, 1,5 mmol). Az így kapott gyanta felét (0,069 mmol) az alábbi 14 kapcsolási ciklusnak vetettük alá: Boc-Arg(Tos) (634 mg, 0,76 mmol), BocLeu (188 mg, 0,76 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (534 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (333 mg, 0,76 mmol), Boc-Asn (97 mg 0,76 mmol), Boc-Asp(Ofm) (311 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Phe (201 mg, 0,76 mmol). Boc-Val (164 mg. 0,76 mmol). Boc-Ala (143 mg, 0.76 mmol), BocAsp-(OcHx) (238 mg. 0,76 mmol), Boc-Ser(Bzl) (223 mg, 0,76 mmol) és Boc-His(Bom) (156 mg. 0,41 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén végigvíve, majd 1,0 ml ecetsavanhidridet és 66 ml DIPEA-t (0,38 mmol) tartalmazó 20 ml metilénkloriddal 30 percig kezeltük. A gyantái a 10-16 lépéseket alkalmazva mostuk.

A gyantát a 2. Protokol 1-11 lépését alkalmazva szelektíven deblokkoltuk és hétszer reagáltattuk DCC-t (49 mg, 0,24 mmol) és HOBT-t (32 mg, 0,24 mmol) tartalmazó 20 ml desztillált DMF-el 24 órán keresztül. Ezt követően a Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13—16 lépésének megfelelően mostuk, vákuumban szárítottuk. így 0,72 g terméket nyertünk.

A gyantát 0 ’C-on két órán keresztül 6 ml dimetilszulfiddal és 2 ml folyékony HF-el kezeltük. A reakcióelegyet bepároltuk és a keletkezett gyantát 0,7 ml anizollal és 6 ml folyékony HF-el kezeltük 45 percen át 0 ’C-on. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot Ix ml dieüléterrel és 3x ml ecetsavetilészterrel mostuk. Ezt követően 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes szűrletet liofilizálva 227 mg szilárd fehér anyagot nyertünk.

A nyers terméket preparatív HPLC-vel tisztítottuk, Whatman Magnum-20 ODS-3 oszlopon (2x25 cm) és lineáris gradiens eluciót alkalmazva [10-40% B, 4 óra, (A puffer: 0,1% TFA7H₂O, B puffer: 0,1% TFA/CH₃CN)J. A fő csúcsot analitikai HPLC-vel meghatározva és vágva gyűjtöttük a frakciót és liofilizáltuk. mely eredményeként 26,7 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot Magnum-20 ODS-3 oszlopon (2x50 cm) ismételten kromatografáltuk, az előzőekben alkalmazott gradiens eluciót alkalmazva. A fő csúcsot vágva és liofilizálva 9,5 mg fehér, amorf port nyertünk. Ez az anyag HPLC-vel vizsgálva egységes és amminosav analízise a vártnak megfelelő. FABMS: MH 3277,8 (számított) és 3276,1 (mért).

3. példa

Ac-[Glu^s, Lys¹², Nle'⁷, Val²⁶, Thr*]-VIPciklo (Glu^—tLys'²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NHiJ előállítása

Benzhidrilamin kopolistriol-1% divinilbenzol térhálósított gyantát (17,7 g, 2,6 mekv,, 200-400 ASTM mesh, Vega Biochem) 160 ml metilénkloridban duzzasztottul szűrtük és az 1. Protokol 7-8 lépése szerint mostuk. A gyantát ismét szuszpendáltuk 160 ml metilénktoridban és ehhez adtunk Boc-Thr(Bzl)-t (6,25 g,

20,2 mmol) és diciklohexilkarbodiimidet (2,10 g, 10,1 mmol). Ezt az elegyet 8 órán keresztül rázattuk szobahőfokon, szűrtük és azután az 1. Protokol 10-14 lépését alkalmaztuk. A Kaiser ninhidrin analízis ereménye negatív volt. Az elreagálatlan amin csoportokat elreagáltattuk a gyantát 5 ml DIPEA-t és 5 ml ecetsavanhidridet tartalmazó 150 ml metilénkloriddal kezelve 60 percig, majd szűrtük és a 13-14 lépésnek megfelelően mostuk. A gyantát egy éjszakán át vákuumban szárítottuk és így 18,0 g Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát nyertünk. A gyanta egy részletét aminosav analízisnek alávetve 0,17 mmol Thr/g értékel kaptunk.

A Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát (18,0 g, 3,06 mmol) az 1. Protokol alkalmazásával szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Az összes kapcsolás során előre elkészített Boc-aminosavból és diciklohexilkarbodiimidből nyert szimetrikus anhidridet alkalmaztuk. A Boc-asparagint, Boc-Glutamint és Boc-histidint mint viszonylag HOBT aktív észtert kapcsoltuk. Öt kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Leu (6,1 g,

24.5 mmol), Boc-Val (5,322 g, 24,5 mmol), BocSEr(Bzl) (7,23 g, 24,5 mmol), Boc-Asn (3,13 g,

13.5 mmol) és Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol). A gyantát vákuum alatt megszárítva 22,9 g Boc-hexapeptid gyantát nyertünk.

A gyanta 7,48 g-ját (1,0 mmol) tíz kapcsolás ciklusnak vetettük alá az alábbiakkal: Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1.66 g, 4.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), BocVal (869 g, 4,0 mmol), Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmol). Boc-Nle (925 mg. 4,0 mmol), Boc-Gln (1,08 g,

4.4 mmol), Boc-Lys(2-CI-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), BocArg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmol) és Boc-Leu (998 mg, 4,0 mmol). így 9,6 g Boc-hexadekapeptidet nyertünk.

A kapott gyantából 7,68 g-ot (0,8 mmol) BocLys(Fmoc)-al (1,5 g, 3,2 mmol) egy ciklusban kapcsolva 8,32 g Boc-heptadekapeptid gyantát nyertünk.

A gyanta 6,24 g-ját (0,6 mmol) két kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Thr(Bzl) (472 mg, 2,4 mmol) és Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,06 g,

2.4 mmol) és így 6,28 g Boc-nonadekapeplid gyantát nyertünk.

Ebből a gyantából 2,09 g (0,2 mmol) mennyiséget kilenc kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbiakkal: Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Asp(Ofm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg. 0,8 mmol). Boc-Val

HU 211 534 A9 (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) és Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). A gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén végigvittük és 0,25 ml acetanhidridet valamimnt 70 ml DIPEA-t tartalmazó 20 ml metilénkloriddal kezeltük 20 percen keresztül. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk.

A gyantát ezután szelektíven deblokkoltuk a 2. Protokol 1-11 lépéseinek megfelelő kezeléssel. A gyanta háromnegyed részét (0,15 mmol) reagáltattuk DCC-vel (77 mg, 0,37 mmol) és HOBT-vel (51 mg, 0,37 mmol) 72 órán át 20 ml desztillált DMF-ben majd 24 órán át 20 ml toluolban. A Kaiser analízis eredménye ezt követően negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépése szerint mostuk, vákuum alatt szárítottuk és így 1,72 g terméket kaptunk.

Ennek a gyantának 1,14 g-ját (0,099 mir.J) deblokkoltuk a 2. példában leírt kezeléssel azzal az eltéréssel, hogy a második (1 ml anizol és 9 ml HF) kezelést elhagytuk A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. A vizes szűrletet egyesítettük, li ofilizáltuk és így 535 mg fehér szilárd terméket nyertünk.

A nyers terméket gélszűréssel Sephadex G-25-ön (2x100 cm-es oszlop) és 10%-os ecetsavval eluálva tisztítottuk. A monomer csúcsot az összegyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel végzett analíziseknek megfelelően vágtuk, összegyűjtöttük és liofilizálva 83,5 g közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 2. példában leírtak szerint tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy a 20-40% lineáris gradiens szerint eluciót 3 óra alatt hajtottuk végre. A gyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel végzett analízise alapján vágtuk a fő csúcsot, liofilizáltuk és így 18,9 mg fehér amorf port kaptunk. Az anyag HPLC-vel vizsgálva homogén volt, az aminosav analízis eredménye megfelelő. FAB-MS: MH 3292.0 (számított) és 3291.8 (mért).

példa

Ac-[AsrP. Asp⁹, Lys'², Nle'¹, Val^{4 26}, Thr&J-VIPciklo (Asp⁹^Lys'²) [Ac-fSEQ ÍD NO:22)-NH₁1 előállítása

1,55 g (0,15 mmol) részletét a 3. példa szerinti Bocnonadekapeptid gyantának 9 kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Asp(Ofm) (247 mg, 0,6 mmol), Boc-Asn (153 mg. 0,66 mmol), BocThr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (159 mg. 0,6 mmol), Boc-Val (130 mg, 0,6 mmol), Boc-Ala )113 mg. 0.6 mmol), Boc-Asp(OvHx) (189 mg, 0,6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (177 mg, 0,6 mmol) és BocHis(Bom) (248 mg, 0.66 mmol). A peptid gyantára alkalmaztuk az I. Protokol 1-8 lépését és 30 percig 0.25 ml ecetsavanhidridet és 70 ml DIPEA-t tartalmazó 20 ml metilénkloriddal kezeltük. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk.

A gyantát szelektíven deblokkoltuk a 2. Protokol 1-11 lépésének megfelelő kezelés alkalmazásával majd kétszer reagáltattuk DCC-t (77 mg, 0,37 mmol) és HOBT-t (51 mg, 0,37 mmol) tartalmazó 20 ml desztillált DMF-el 24 és 72 órán keresztül és kétszer 20 ml toluollal 24 és 48 órán keresztül. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-15 lépése szerint mostuk és vákuum alatt szárítva 1,54 g terméket nyertünk.

A gyanta 1,26 g-ját (0,122 mmol) a 3. példa szerint HF-el kezelve deblokkoltuk. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes fázisokat liofilizáltuk (szűrés után) és így 485 mg fehér szilárd anyagot kaptunk.

A nyers terméket gél szűréssel Sephadex G-25-ön a 3. példában leírtak szerint tisztítottuk és így 83,5 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt a terméket preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk a 3. példában leírtakkal analóg módon azzal az eltéréssel, hogy a 2045% lineáris gradiens 3 órán keresztül fut. A fő csúcsot a gyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel végzett analízise alapján vágtuk, gyűjtöttük és liofilizáltuk. így

11.5 mg fehér amorf port nyertünk. A termék HPLCvel analizálva egységes, az aminosav analízis eredménye a várt. FAB-MS: MH 3277.8 (számított) 3277,6 (mért).

5. példa

Ac-lOrn'², Nle'¹, Val²⁶, ThAj-VtP viklo

IAsp^s—vOrn'²)

ÍAc-íSEQ ID NO:23)-NHtJ előállítása

A 3. példa szerint előállított Boc-hexadekapeptid 1,92 g-nyi (0,2 mmol) részletét tizenkét kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbiakkal: Boc-Orn(Fmoc) (364 mg, 0.8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg,

1,6 mmol) Boc-Tyr(2,6-DVB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(Ofm) (329 mg, 0,8 mmol) Boc-Thr(Bzl) (495 mg.

1,6 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük, majd 30 percig 20 ml metilénkloridban 0,25 ml ecetsavanhidriddel és 70 ml DIPEA-val kezeltük. A gyantát a 10-,,4 lépés alkalmazásával mostuk és egy éjszakán át szárítva 2,38 g terméket nyertünk.

Ezen gyanta 1,38 g-ját (0,11 mmol) szelektíve deblokklotuk a 2. Protokol 1-11 lépésének megfelelően kezelve és reagáltatva DCC-vel (55 mg, 0,27 mmol) és HOBT-vel (37 mg. 0,27 mmol) desztillált 20 ml DMFben 24 órán át és 20 ml toluolban 24 órán át és ötször 20 ml desztillált DMF-ben 24 órán keresztül. A Kaiser ninhidrin analízis némileg pozitív. A gyantát a 13-16 lépésnek megfelelően (2. Protokol) mostuk és vákuumban szárítottuk.

A gyanta 0.8 g-nyi (0,05 mmol) mennyiségét a 3. példának megfelelően HFel kezelve deblokkoltuk. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 3x20 ml

HU 211 534 A9

10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes szűrletet lioftlizálva 429 mg szilárd mézgát kaptunk.

A nyers terméket gélszűréssel Sephadex G-25-ön a 3. példa szerint tisztítva 107 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot preparatív HPLC-vel a 3. példában leírtak szerint tisztítottuk azzal az eltéréssel. hogy a 10-40% lineáris gradiens futásideje 3 óra volt. A fő csúcsot a gyűjtött frakciók analitikai HPLCvel végzett analízise alapján vágtuk, gyűjtöttük és liofilizáltuk. így 17,5 mg fehér amorf por formájú terméket nyertünk. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis a várt. FAB-MS: MH 3263,7 (számított), 3264,1 (mért).

6. példa

Ac-i'Lvs’jAsp'/Nle'¹, Val²⁶, Thr^j-VlPciklo (Lvr⁸—>Arp¹²)

IAc-íSEQ ID NO:24j-NH2] előállítása

A 3. példa szerint előállított Boc-hexadekapeptid gyanta 1,0 g-nyi (0,1 mmol) részletét tizenkét kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: BocAsp(Ofm) (165 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0.4 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (176 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (187 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0.4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol) BocAsp(OcHx) (126 mg. 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg. 0.4 mmol) és Boc-His(Bom) (150 mg, 0.4 mmol), A peptid gyantát a Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük és 30 percig 20 ml metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel és 35 ml DIPEA-val kezeltük. A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és így - egy éjszakán át történő szárítás után - 1,2 g terméket kaptunk.

Ezen gyanta 0,8 g-ját (0,066 mmol) szelektív deblokkolásnak vetettük alá a 2. Protokol 1-11 lépése alapján végzett kezeléssel és 20 ml desztillált DMFben 24 órán át reagáltatva BOP-vel (58 mg, 0,13 mmol). A Kai ser ninhidrid analízis negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépése szerint mostuk és vákuumban szárítottuk.

Ezt a gyantát HF-dal kezelve a 3. példában leírtak szerint deblokkoltuk. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes szűrletet lioftlizálva szilárd mézgát nyertünk.

A nyers terméket gél szűréssel Sephadex G-25-ön a 3. példa szerint tisztítva 43,8 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezen anyagot a 3. példához hasonlóan preparatív HPLC-vel tisztítottuk azzal a különbséggel. hogy a 10—40%-os lineáris gradienst 3 óra alatt futtattuk le. A fő csúcsot a gyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel analizálva vágtuk, gyűjtöttük és liofilizálva 7.5 mg fehér amorf port kaptunk. Ez a tennék HPLC-vel vizsgálva homogén, az aminosav analízis a várt és FAB-MS: MH 3277,8 (számított) és

3276.4 (mért).

7. példa

Ac-lGlu/ Orré²,Nle'\ VaP⁶, Thri^-VlPciklo (Glu^s-*0mⁱ²) (Ac-(SEQ ID NO:25)-NHiI előállítása

Benzhidrilamin kopol istiről-1% divinilbenzol térhálósított gyantát (25,0 g, 17,5 mekv, 200400 ASTM mesh, Bachem) 160 ml metilénkloridban duzzasztottul szűrtük és az 1. Protokol 7-8 lépése szerint mostuk. A gyantát újból szuszpendáltuk 160 ml metilénkloridban és Boc-Thr(Bzl)-t (16,2 g,

52.5 mmol) és diciklohexilkarbodiimidet (5,4 g,

26,2 mmol) adtunk hozzá. Az elegyet 6 órán át szobahőfokon rázattuk, szűrtük és az 1. Protokol 10-14 lépésének vetettük alá. A Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt. Az elreagálatlan amin csoportokat elreagáltattuk a gyanta 150 ml metilénkloridban 5 ml ecetsavanhidriddel és 5 ml DIPEA-val 60 percig végzett kezelésével. A gyantát egy éjszakán át vákuumban szántottuk és így 29,6 g BocThr(Bzl)-BHA gyantát kaptunk. A gyanta egy részletét aminosav analizátorral vizsgálva 0,21 mmol Thr/g adódott.

Ezen gyanta 14,0 g-ját (2,94 mmol) a 2. példában leírt Protokol szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenegy kapcsolási ciklust alkalmaztunk az alábbiakkal: Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), BocVal (5.1 g, 23,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (6,9 g,

23.5 mmol), Boc-Asn (3,0 g, 13,0 mmol) Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (10,3 g,

23,5 mmol) Boc-Lys(2-Cl-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g,

23,5 mmol), Boc-Ala (4,4 g, 23,5 mmol) és Boc-Nle (5,4 g, 23,5 mmol). így 26 g Boc-dekapeptidet nyertünk.

Ezen gyanta 5,5 g-ját (0,61 mmol) további négy kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbiakkal: BocGln (655 mg, 2,7 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (2,0 g, 4,8 mmol), Boc-Arg(Tos) (2,1 g, 4,8 mmol) és BocLeu (1,2 g, 4,8 mmol) A gyantát vákuumban szárítva 6,12 g Boc-hexadekapeptidet kaptunk.

Ezen gyanta 2,0 g-nyi (0,2 mmol) részletét tizenkét kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Orn(Fmoc) (91 mg, 0,2 mmol) BocThr(Bzl) (250 mg, 0,8 mmol) Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol) Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Glu(Ofm) (340 mg, 0,8 mmol) Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol) Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol, Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol) Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol) Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén keresztülvive 180 percig 30 ml metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel és 38 ml DIPEA-val kezeltük. A gyantát a 10 14 lépésnek megfelelően mostuk, vákuum alatt szárítottuk. így 2,4 g terméket kaptunk.

Ezen gyanta 1,15 g-nyi (0,1 mmol) részletét a 2. Protokol 1-11 pontjának megfelelően kezelve szelektíve deblokkoltuk majd 20 ml desztillált DMF-ben 24 órán át majd 6 órán át BOP-val (58 mg, 0,13 mmol) és

HU 211 534 A9

400 ml DIPEA-val reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk, vákuum alatt szárítottuk és így 1,05 g terméket nyertünk.

A gyantát 0 C-on egy órán át 9 ml HF-al, 1 ml anizollal és 100 ml etánditiollal kezelve deblokkoltuk. A reakcióelegyet bepároltuk, a maradékot 2x14 ml dietiléterrel és 2x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 4x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes fázisokat szűrtük, liofilizáltuk és így 385 mg világos sárga szilárd terméket nyertünk.

A nyers terméket a 3. példában leírtak szerint gélszűréssel Sephadex-25-ön tisztítva 134 mg félig tiszta terméket kaptunk. Ezt a 3. példával analóg módon preparatív HPLC-vel tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy a 26-36% lineáris gradiens futtatási ideje 3 óra volt. A fő csúcsot a gyűjtött frakciók analitikai HPLCvel végzett analízise alapján vágtuk, összegyűjtöttük és liofilizálva 23,2 mg fehér amorf port kaptunk. Ez HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye a várt. FAB-MS: MH 3277,8 (számított). 3276.3 (mért).

8. példa

Ac-ILys'². Glu'⁶. Nle'⁷. Val²⁶. Thr^l-VIP ciklo (Lys'^Glu'⁶)

ÍAc-íSEQ ID NO:26]-NHfl előállítása

Benzhidrilamin kopolistirol-1% divinilbenzol térhálósított gyantát (30 g, 21,4 mekv. 200-400 ASTM mesh, Bachem) a 22. példával analóg módon kezeltünk azzal a különbséggel, hogy 19,9 g Boc-Thr(Bzl)-t (64,3 mmol) és 6,6 g diciklohexilkarbodiimidet (32.1 mmol) használtunk. Az elegyet 18 órán keresztül szobahőfokon ráztunk, szűrtük és az 1. Protokol 10-14 lépésének megfelelően tovább kezeltük. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. Az elreagálatlan amino csoportot 200 ml metilénkloridban 8 ml acetsavanhidnddel és 8 ml DIPEA-val kezeltük 60 percig, majd szűrtük és a Protokol 13-14 lépése szerint mostuk. A gyantát egy éjszakán át vákuumban szárítottuk és így

34,2 g Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát kaptunk. A gyanta egy részletét aminosav analízissel vizsgálva 0,47 mmol Thr/g értéket kaptunk.

Ezen Boc-Thr(Bzl)-BHA gyanta 0,85 g (0,45 mmol) részletét szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá egy Applied Biosystem 430A model peptid szintetizátorban. Az összes kapcsoláshoz egy BocAminosavból és diciklokarbodiimidből előre elkészített szimetrikus anhidridet használtunk. Boc-aszparagin, Boc-glutamin és Boc-arginin(tizol) mint megfelelő HOBT aktív észtereket kapcsoltuk. Tizenegy kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Leu (499 mg. 2.0 mmol). Boc-Val (435 mg. 2.0 mmol). Boc-Scr(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol). Boc-Asn (464 mg. 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2.6DCB) (880 mg 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), BocVal (435 mg. 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) és Boc-Nle (462 mg. 2,0 mmol) és így Boc-dodekapeptid keletkezett.

A gyantát ezt követően öt kapcsolási cikluson vittük keresztül a következőkkel (a 2. példa szerint): BocGlu(Ofm) (340 mg, 0,8 mmol) Boc-Lys(-Cl-Z) (664 mg, 1,6 mmol), Boc-Arg(Tos) (685 mg,

1.6 mmol) Boc-Leu (398 mg, 1,6 mmol), BocLys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol). A gyantát vákuum alatt szárítottuk és így 2,12 g Boc-heptadekapeptidet nyertünk.

Ezen peptid gyanta 1,06 g-ját (0,2 mmol) ezután szelektfve deblokkoltuk a 2. Protokol 1-11 lépésének megfelelően és kétszer 20 ml desztillált DMF-ben BOP-val (177 mg, 0,4 mmol) és 200 ml DIPEA-val reagáltattuk 2 órán illetve 8 órán keresztül. A Kaiser ninhidrin analízis eredménye enyhén pozitív volt. Az elreagálatlan amin csoportokat el reagáltattuk 20 ml 6%-os DIPEA/metilénklorid-ban 0,5 ml ecetsavanhidriddel 10 perc alatt, szűrtük és a 2. Protokol 13-16 lépésének megiclelően mostuk. Ezt a gyantát egy kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: BocThr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol) és ezután visszahelyeztük a fentebb említett Applied Biosystems 430A peptid szintetizátorba. Az alábbi sorrendben tíz kapcsolási ciklusnak vetettük alá: Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), BocAsp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol) Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), BocSer(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (819 mg. 2,0 mmol). A peptid gyantát végigvittük az 1. Protokol 1-8 lépésein és 20 ml metilénkloridban 30 percen keresztül 0,5 ml ecetsavanhidriddel és 100 ml DIPEA-val reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépést alkalmazva mostuk és vákuumban szárítottuk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 340 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 35 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot ugyancsak a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk, azzal az eltéréssel, hogy a 25-35% lineáris gradienst futtattuk le és így 15,6 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyület HPLC-vel vizsgálva homogén volt, az aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-MS: MH

3276.6 (számított) és 3278,0 (mért).

9. példa

Ac-ILys'². Nle'⁷. Asp²ⁱ. Val²⁶. Th^j-VlP ciklo (Lví²®-»Ajp^:4) [Ác-(SEQ ID NO:27)-NH₂j előállítása

A 8. példa szerint előállított Boc-Thr(Bzl) gyanta 0,42 g-nyi (0,2 mmol) részletét kilenc kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következő sorrendben: Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol). Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol), Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (322 mg, 0.8 mmol). Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol) és Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol).

A gyantát ezután szelektív deblokkolásnak vetettük alá a 2. Protokol 1-11 lépése szerintés 20 ml desztillált

HU 211 534 A9

DMF-ben 6 órán át reagáltattuk DOB-val (177 mg, 0,4 mmol) és 200 ml DIPEA-val. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt.

Ezen gyantát ezután a 8. példa szerint egy Applied Biosystems Model 430A-ba helyeztünk és 17 kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbi sorrendben: BocAla (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (492 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Ezt a gyantát további egy kapcsolási cikluson vittük keresztül Boc-His(Tos)-al (164 mg, 0,4 mmol). Ezután az 1. Protokol 1-8 lépésén vittük keresztül majd 30 percen keresztül 20 ml 6%-os DIPEA/metilénklorid-ban I ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépésének megfelelően mostuk és vákuum alatt szárítottuk. így 1,94 g terméket nyertünk.

Ezen peptid gyanta 0,97 g-nyi (0,1 mmol) részletét a 7. példa szerint deblokkoltuk és így 265 mg nyers pepiidet nyertünk. A pepiidet a 3. példában leírtakhoz hasonlóan gél szűréssel tisztítva 149 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezen terméket tovább tisztítottuk a 3. példában is alkalmazott preparatív HPLCvel azzal az eltéréssel, hogy 25-35% lineáris gradiens lefuttatására került sor és így 28,1 g fehér amorf port kaptunk termékként. Ezt HPLC-vel vizsgálva homogénnek bizonyult és az aminosav eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3278,6 (számított) és 3278,8 (mért).

10. példa

Ac-lLys'². NleKAsp²⁵, Val²⁶. Th^j-VlPciklo t Lys²'-*Asp²⁵)

IAc-(SEQ ID NO:28)-NHt] előállítása

Benzhidrilamin kopolistirol-1% divinilbenzol térhálósított gyanta (5,0 g, 2,6 mekv. 200-400 ASTM mesh, Vega Biochem) 50 ml metilénkloridban duzzasztottunk, szűrtük és az 1. Protokol 7-8 pontja szerint mostuk. A gyantát 60 ml metilénkloridban újra szuszpendáltuk és hozzáadtunk Boc-Thr(Bzl) (2,32 g,

7,5 mmol)-t és diciklohexilkarbodiimidet (774 mg, 3,75 mmol). Ezt az elegyet 4 órán át szobahőfokon rázattuk, szűrtük és azután az 1. Protokol 10-14 pontját alkalmazva kezeltük. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. Az elreagálatlan amin csoportokat 60 percig 50 ml metilénkloridban 5 ml ecetsavanhidriddel és 5 ml DIPEA-val reagáltattuk, szűrtük és a Protokol 13-14 lépését alkalmazva mostuk. A gyantát vákuumban szárítottuk egy éjszakán ét és így 5,8 g BocThr(Bzl)-BHA gyantát nyertünk. Ezen gyanta egy részletét aminosav analizátorral vizsgálva 0,276 mmol Thr/g eredményt kaptunk. Ezen gyanta 1.44 g-nyi részletét szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá a 2. példához hasonlóan az 1. Protokol alkalmazásával. Három kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Leu (349 mg, 1,6 mmol), Boc-Val (348 mg,

1,6 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol). Ezen gyanta felét (0,2 mmol) négy kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következő sorrendben: Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Leu (199 mg, 0,88 mmol), BocTyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,88 mmol) és Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,88 mmol).

Ezen gyantát szelektíven deblokkoltuk a 2. Protokol 1-11 lépését alkalmazva és 2 órán keresztül 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben reagáltattuk BOP-vel (177 mg, 0,4 mmol). A Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt.

Ezt a gyantát egy kapcsolási cikluson vittük át Boc-Lys(2-Cl-Z)-vel (332 mg, 0,8 mmol) ésszilárd fázisú szintézisnek vetettük alá a 6. példához hasonlóan egy Applied Biosystems model 430A-n. Tizenkilenc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: BocVal (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-CI-Z) (830 mg, 2.0 mmol), BocArg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol),Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), BocThr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol) Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx), (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala )378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), BocSer(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) és ezután az 1. Protokol 1-8 lépését alkalmaztuk és 30 percen át 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 1 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. Az 1. Protokol 10-14 lépésének megfelelően mostuk és vákuum alatt szárítottuk.

Ezen peptid gyantát a 7. példában leírtakhoz hasonlóan deblokkoltuk és így 210 mg nyers terméket kaptunk. A pepiidet a 3. példával azonos módon gél szűréssel tiszítottuk és így 93 mg félig tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. példához hasonló módon preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy 27-37%-os gradienst alkalmaztunk és így

26,2 mg fehér amorf port nyertünk. A terméket HPLCvel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3305,8 (számított) és 3305,8 (mért).

II. példa

Ac-[Lys^]2, Nle'¹, Ala¹⁹, Asp²⁵, VaP⁶, Thr²*}-VIP ciklo (Lys²¹—»Ajp²⁵)

IAc-(SÉQ ID NO:29)-NH₂] előállítása

0,4 g (0,1 mmol) benzhidrilamin gyantát (100—

200 ASTM mesh, Bachem) a fentiekben ismertetett Protokol alkalmazásával szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Minden kapcsolást úgy végeztünk, hogy molárisán ekvivalens Boc-Aminosavat és diizopropilkarbodiimidet használtunk. A Boc-aszparagint és a Boc-glutamint mint viszonylag aktív észtert úgy alkal15

HU 211 534 A9 máztuk, hogy a kapcsolásnál szereplő elegyhez 1,5 mól feleslegbe adtunk HOBT-t. A kapcsolási lépés általában 2-18 óra alatt vált teljessé. Az alábbi 9 kapcsolási ciklusokat alkalmaztuk a következőkkel: Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (206 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg. 1,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0,5 mmol) és Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol).

Ezen gyantát a 2. Protokol 1-11 lépései alapján szelektíve deblokkoltuk és 2 órán át 20 ml 1 %-os DIPEA/DMF-ben BOP-vel (88 mg, 0,2 mmol) reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt.

Tizenkilenc kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-AIa (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln (246 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1.0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (232 mg. 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol). Boc-Phe (265 mg. 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg. 1.0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol). Boc-Asp(OcHx) (315 mg. 1,0 mmol). Boc-Ser(Bzl) (289 mg, 1,0 mmol), Boc-His(Tos) (409 mg.

I, 0 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén keresztül vittük és 30 percig 10 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a 10-14 lépést alkalmazva mostuk és vákuum alatt szárítottuk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk és így 304 mg nyers terméket kaptunk. A peptidet a 3. példában leírtakkal azonos módon gél szűréssel tisztítottuk és így 215 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy 26-36% lineáris gradienst futtattunk. így 20,1 mg fehér amorf port kaptunk. A termék HPLC-vel vizsgálva homogén volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő volt. FABMS: MH 3277,6 (számított) 3277,7 (mért).

12. példa

Ac-lp-F-Pke⁶, 2-Nal^w. Lvs¹², Nle¹'¹. Asp²⁵. Val²⁶,

Thff. Gly²⁹·™ .Mef'l-VIPd-Jh-NH, ciklo (Lys²¹^>Asp²⁵) /Ac-íSEQ 1D NOTOl-Nk] előállítása

0,4 g (0,1 mmol) benzhidrilamin gyantát (100 ASTM mesh, Bachem) all. példában leírtak szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Három kapcsolási ciklust a következőkkel végeztük: Boc-Met (249 mg, 1.0 mmol), Boc-Gly (175 mg. 1,0 mmol).

Boc-Gly (175 mg. 1,0 mmol). További kilenc kapcsolási ciklust és ciklizációt all. példával azonos módon végeztük. Ezt követő tizenkilenc kapcsolási ciklust a

II. példának megfelelően végeztük azzal az eltéréssel, hogy a tizedik lépésben Boc-Ala helyett Boc-Val-t >2.17 mg, 1,0 mmol) és a tizenkielncedik ciklusban

Boc-Tyr(2,6-DCB) helyett Boc-2-Nal (158 mg, 0,5 mmol)-t alkalmaztunk, valamint a huszonharmadik lépésben Boc-Phe helyett Boc-p-F-Phe-t (142 mg, 0,5 mmol) alkalmaztunk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 345 mg nyers peptidet kaptunk. A 3. példának megfelelően gél szűréssel tisztítva 215 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot ugyancsak a 3. példában leírtak szerint preparatív HPLC-vel tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 30-40%,

16,4 mg fehér amorf port kaptunk termékként, amit HPLC-vel vizsgálva homogén volt és aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-MS: MH 3574,7 (számított) és 3575,1 (mért).

13. példa

Ac-ÍGlu*. Orn'², Nle^{12 * * * * * *}, Asp²⁵. Val²⁶, Thr^J-VlP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) fAc-íSÉQ 1D NOtőll-NHrf előállítása

0,4 g (0,1 mmol) benzhidrilamin gyantát (100200 ASTM mesh, Bachem) all. példához hasonlóan szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Ugyancsak a 11. példában leírtak szerint tizenkilenc kapcsolási ciklusnak vetettük alá. azzal az eltéréssel, hogy a tizedik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Val-t (217 mg, 1,0 mmol), a tizenhetedik lépésben Boc-Lys(2-Cl-Z) helyett Bor-Orn(Z)-t (366 mg, 1,0 mmol) és a huszonegyedik ciklusban Boc-Asp(OcHx) helyett BocGlu(Bzl)-t )337 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. példában leírtak szerint deblokkoltuk és így 255 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tovább tisztítva 200 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tisztítottuk tovább azzal az eltéréssel, hogy a lienáris gradiens 28-38% volt. Az így kapott 30,7 mg termék amorf por. A tennék HPLC-vel vizsgálva egységes volt és aminosav analízise a várt eredményt adta. FAB-MS: MH 3305,8 (számított). 3305.5 (mért).

14. példa

Ac-[p-F-Phe⁶. Lvs¹², Nle'¹. Ala^{19 * * * * *}, Asp²⁵, Val^{26 *},

Thtff Gly²⁹·™, Cys(Acm)³¹ j-VlP (1-31 )-NH₂ ciklo (Lys²'—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ 1ϋ NO:32)-NH₂l előállítása.

Benzhidrilamin gyantát (0,4 mg, 0,1 mmol, 100200 ASTM mesh, Bachem) all. példa szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Három kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Cys(Acm) (292 mg. 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1.0 mmol). A következő kilenc kapcsolási ciklus és a ciklizáció all. példa alapján történt. Tizenkilenc kapcsolási ciklust ugyancsak all. példában leírtak szerint végeztünk azzal az eltéréssel, hogy a huszonharmadik ciklusban BocPhe helyett Boc-p-FPhe-t (142 mg. 0,5 mmol) alkalmaztunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 268 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. példa alapján gél szűréssel tisztítottuk és így 165 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot a 3. példa

HU 211 534 A9 szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt és így 28,1 mg tiszta fehér amorf port nyertünk. A vegyületet HPLC-vel vizsgálva az egységes volt és az aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-MS: MH

3584.1 (számított), 3584,0 (mért).

15. példa

Ac-lAla², Lys'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Val²⁶. Thr²*]VIP ciklo (lyj²¹ -^tAsp²⁵)

ÍAc-lSEQ ID NO:33)-NHi] előállítása

Benzhidrilamin gyantát (1,5 g, 0,4 mmol, 100200 ASTM mesh, Bachem) all. példához hasonlóan Applied Biosystems model 430A peptid szintetizáló berendezésben szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Nyolc kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbiakkal: Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), BocAsp(OFm) (822 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tfyr(2,6DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (938 mg, 2,0 mmol).

Ezen gyantát a 2. Protokol 1-11 lépése szerint kezelve deblokkoltuk és 2 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-val (356 mg, 0,8 mmol) reagáltattuk. A gyantát a 2. Protokol. 13-16 lépései szerint mostuk és vákuum alatt szántva 1,9 g Boc-oktapeptidet kaptunk.

Ezen gyanta 0,95 g-nyi részletét (0,2 mmol) all. példához hasonlóan egy Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátorban szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizennyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Lys(2-CI-Z) (830 mg. 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg. 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg. 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol). Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn Í464 mg. 2,0 mmol). Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol). Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). így 1,54 g Bochexakozapeptid gyantát nyertünk.

Ezen gyanta 0,77 g-nyi (0,1 mmol) részletét a 2. példa szerinti Protokolt alkalmazva szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Két kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol) és Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol). A peptid gyantát vcgigvittük az 1. Protokol 1-8 lépésén és 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénklorid-ban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk és így 0,74 g terméket kaptunk vákuumban történő szárítás után.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk és így 172 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 110 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezen anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tisztítottuk tovább azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 22-37% volt és így 40,0 mg fehér amorf port nyertünk. A tennék HPLCvel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt az elvártnak, FAB-MS: MH

3261,7 (számított, 3261,8 (mért).

16. példa

Ac-[N-Me-Ala', Lys'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Val²⁶,

Thr^J-VlP ciklo (Lys²'—vAsp²⁵) [Ac-(SEQ 1D NO:34)-NH₁

A 15. példa szerinti Boc-hexaokozapeptid 0,77 g-nyi (0,1 mmol) részletét 2. példa szerinti protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Két kapcsolási ciklust végeztünk a következőkkel: Boc-Ser(Bzl) (118 mg. 0,4 mmol) és Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0,4 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépése szerint 6 órán keresztül 20 ml DMF-ben BOP-vel (442 mg, 1.0 mmol), ecetsavval (57 ml 1,0 mmol) és DIPEA-val (523 ml, 3,0 mmol) reagáltattuk majd 60 percen keresztül 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,73 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 191 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 138 mg köezepsen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 22-37%. így 28,0 mg fehér amorf port kaptunk, amelyet HPLCvel vizsgálva egységesnek adódott és aminosav analizátorral vizsgálva a várt eredményt adta. FAB-MS: MH 3225,4 (számított). 3225,8 (mért).

17. példa

Ac-[2-Nal'°, Leu'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Val²⁶,

Thr*]- VIP ciklo (Lys²¹ ->Asp²⁵)

ÍAc-(SEQ 1D NO:35)NHf előállítása

Benzhidrilamin gyantát (4,0 g, 1,08 mmol, 100200 ASTM mesh, Bachem a 2. példához hasonlóan az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Boc-Thr(Bzl) (1,34 mg, 4,3 mmol), Boc-Leu (495 mg, 4,3 mmol), Boc-Val (938 mg 4,3 mmol), Boc-Asp(OFm) (889 mg, 2.1 mmol), Boc-Asn (557 mg, 2,4 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,3 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,9 g, 4,3 mmol) és BocLys(Fmoc) (1,1 g, 4,3 mmol).

Ezen gyantát ezután a 2. Protokol 1-11 lépésének megfelelően kezelve deblokkoltuk (szelektíven) és 2 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben DOB-vei (885 mg. 2.0 mmol) reagáltattuk. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk.

A gyantát további kapcsolási cikluson vittük keresztül a következővel: Boc-Lys(2-Cl-Z) (179 mg, 4,3 mmol) és vákuum alatt szárítva 6,3 g Boc-nonapeptid gyantát kaptunk.

A gyanta 1,89 g-nyi részletét kilenc kapcsolási ciklusnak tettük ki a következőkkel: Boc-Ala (227 mg,

1,2 mmol), Boc-Ala (227 mg, 1.2 mmol). Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmol), Boc-Gln (325 mg, 1.32 mmol).

HU 211 534 A9

Boc-Lys(2-Cl-Z) (498 mg, 1,2 mmol), Boc-Arg(Tos) (514 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (498 mg, 2,0 mmol) és Boc-Thr(Bzl) (371 mg, 1,2 mmol). így 2,06 g Boc-oktadekapeptid gyantái kaptunk.

Ezen gyanta 0,68 g-nyi mennyiségét (0,1 mmol) tíz kapcsolási cikluson vittük keresztül a következőkkel: Boc-2-Nla (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), BocThr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol) Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val )87 mg, 0,4 mmol), Boc-Alá (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), BocSer(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük és 50 percig 20 ml /-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk és vákuumban szárítva 0,82 g termékei kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 261 mg nyers pepiidet kaptunk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 186 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tisztítottuk tovább azzal az eltéréssel. hogy az alkalmazott lineáris gradiens 30—40%. így 60,1 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyületet HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH

3296,8 (számított), 3295,6 (mért).

18. példa

Ac-jO-Me-Tyr'⁰. Leu'². Nle'¹, Alá'⁹. Asp²⁵. Val²⁶.

Thr*. 1- VIP ciklo (L\s²¹ ^Asp²⁵) lAc-tSEQ ID NO:36)-NH₂] előállítása

0,60 g (0,1 mmol) 17. példa szerint Boc-aktadekapeptidet tíz kapcsolási ciklusnak vetettük alá a 17. példa szerint azzal az eltéréssel, hogy a tizenkilencedik ciklusban Boc-2-Nal helyett Boc-Tyr(0-ME)-t (59 mg. 0.2 mmol) alkalmazva 0.61 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk és így 175 mg nyers gyantát kaptunk. Ezen peptidet a 3. példa szerint gélszűréssel tisztítva 136 mg közepesen tiszta termékei kapunk. Ezt az anyagot ugyancsak a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 28-38%, 42.4 mg fehér amorf port nyertünk. Ezt HPLC-vel elemezve egységesnek adódott és az aminosav analízis eredménye a várt. FAB-MS: MH 3276,7 (számított) 3276.0 (mért).

19. példa

Ac-[p-F-Phe⁶, p-NH₂-Phe'°, Leu'², Me¹⁷, Alá'⁹.

ASp²⁵. Val²⁶. Th&J-VIP ciklo (W->Asp²') !Ac-(SEQ ID NO:37)-NH₂] előállítása

0,625 g (0,9 mmol) Boc-oktadekapeptid gyantát a

17. példa szerint tíz kapcsolási ciklusnak vetettük alá azzal a különbséggel, hogy a tizenkilencedik ciklusban Boc-2-Nal helyeit Boc-p-NH(Z)-Phe-t (166 mg. 0,4 mmol) cs a huszonharmadik kapcsolási ciklusban Boc-Phe helyett Boc-p-F-Phe-t (113 mg, 0,4 mmol) alkalmaztunk és így 0,84 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk minek eredményeként 182 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 160 mg félig tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt. így 47,2 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyületet HPLC-vel elemezve homogén és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS:MH 3279,7 (számított) és 3279,8 (mért).

20. példa

Ac-[Lys'². Nle¹⁷, Alá^{19 *}, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²¹²*]-VIP ciklo (Lys^{21 * * *}—rAsp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂I előállítása Benzhidrilamin gyantát (1,25 g, 1,0 mmol), 100200 ASTM mesh, Bachem) az 1. Protokol alapján a 2. példa szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Nyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (1,66 g. 4,0 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4.0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), BocAsn (511 mg. 2,2 mmol). Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol) és Boc-Lys(Fmoc) Í937 mg, 2,01 mmol).

Ezen gyantát a 2. Protokol 1-11 pontja szerint kezelve szeleklíve deblokkoltuk és 2 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-vel (885 mg 2,0 mmol) reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépése szerint mostuk.

Ezen gyantát egy kapcsolási cikluson vittük keresztül Boc-Lys(2-CI-Z)-vel (1,66 g, 4,0 mmol) és vákuumban szárítva 2.7 g Boc-nonapeptid gyantát kaptunk.

Ezen peptid 0,54 g-nyi részletét (0,2 mmol) az Applied Btosystems model 430A peptid analizátorral a 8. példa szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizennyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg. 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Boc-Pbe (531 mg, 2,01 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Ser(Bzl) (590 mg. 2.0 mmol). így 1,16 g Boc-heptakosapeptidet nyertünk.

Ezen gyanta 0,54 g-nyi részletét (0,1 mmol) egy kapcsolási ciklusnak vetettük alá Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol)-va1 és azután az 1. Protokol 1-8 lépésén végigviitük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően (1. Protokol) mostuk és vákuumban megszárítva 0,5 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példához hasonlóan deblokkoltuk azzal az eltéréssel, hogy 5 ml HF-et és

HU 211 534 A9

0,5 ml anizolt alkalmaztunk.A peptidet a 3. példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 74,6 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt a 3. példával analóg módon preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 24-34% volt,

17,1 mg fehér amorf port kaptunk, amely HPLC-vel vizsgálva egységes és az aminosav analízis eredmémnye a várt volt. FAB-MS: MH 3333,8 (számított) és

3333,4 (mért).

21. példa

Ac-jN-Me-Ala', Lys¹², Nle'⁷, Alá¹⁹, Asp^{22 * * 25}, Leu²⁶,

Lys²¹· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²'—*Asp²⁵)

ÍAc-(SEQ ID NO:39j-NH₂] előállítása

0,58 g (0,1 mmol) Boc-heptakozapeptid gyantát a 20. példa szerint kapcsolási ciklusnak vetettük alá Boc-N-Me-Ala-val (81 mg, 0,4 mmol) és azután az 1. Protokol 1-8 lépésén keresztülvíve majd 6 órán at 20 ml DMF-ben BOP-vel (523 mg, 1,0 mmol), ecetsavval (57 ml 1,0 mmol) és DIPEA-val (523 ml, 3,0 mmol) majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0.5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát az 1. Protokol 10-14 pontjának megfelelően mostuk és vákuumban szárítva 0,4 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 20. példa szerint deblokkoltuk és így 165 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítottuk amikor 101 mg közepesen tiszta termék keletkezett. Ezt a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 24-34% volt,

19,8 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyület HPLCvel vizsgálva homogén és az aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-MS: MH 3281,8 (számított) és 3281.9 (mért),

22. példa

Ac-[Glu$, Lys¹², Nle'⁷, Alá'⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷· ^X)-VIP ciklo (Lys²'—*Asp²⁵)

ÍAc-iSEQ ID NO:40)-NH2l előállítása

0,54 g (0,2 mmol) részletét a Boc-nonapeptid gyantának (a 20. példában előállított) Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátorral hasonlóan a 8. példához szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizennyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Alá (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), BocLeu (499 mg, 2,0 mmol) Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), BocTyr(2.6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(OBzl) (675 mg, 2,0 mmol) BocThr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol). Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Ser(Bzl) (59 mg, 2,0 mmol). így 0.58 g Boc-heptakozapeptid gyantát nyertünk.

A gyantái egy kapcsolási cikluson vezettük át BocHis(Tos)-val (164 mg, 0,4 mmol) és ezután az 1. Protokol 1-8 lépéséi alkalmaztuk majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát az 1. Protokol 1-8 lépései szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,53 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk azzal az eltéréssel, hogy 5 ml HF-el és 0,5 ml anizolt alkalmaztunk. 151 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 110 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal a különbséggel, hogy a lineáris gradiens 23,5-33,5% volt. A termék 22,8 mg fehér amorf por. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3347,9 (számított) és 3347,0 (mért).

23. példa

Ac-[O-Me-Tyr'°. Lys'², Nle'⁷, Alá'⁹, Asp²⁵. Val²⁶,

Thr^l-VlP ciklo (Ly.V'-tAsp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NHt) előállítása

1,84 g-nyi részt (0,3 mmol) a 17. példa szerint előállított Boc-nonapeptid gyantából a 8. példához hasonlóan Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátoron szilárd fázisú reakciónak vetettünk alá. Kilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). így 2.2 g Boc-oktadekapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0.73 g-nyi (0.1 mmol) részletét tíz kapcsolási cikluson vittük keresztül a következőkkel: Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol). Boc-Asp(OcHx) (126 mg. 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg. 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol). Boc-Ala (76 mg 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) és BocHis(Tos) (164 mg, 0.4 mmol). A peptidet az 1. Protokol 1-8 lépéseinek megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk. 0,77 g terméket kaptunk a vákuumban történő szárítás után.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 187 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. példának megfelelően gél szűréssel tisztítva 131 mg közepesen tiszta termékhez jutottunk. Ezt a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel hogy a lineáris gradiens 26-36% volt, 5,3 mg fehér amorf port kaptunk, ami HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt.FAB-MS: MH 3291,8 (számított) és 3291.7 (mért).

HU 211 534 A9

24. példa

Ac-lGlu%, Lys'². Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²¹· ²⁸, Alá²¹'²'1-VIP ciklo (Lys²'—iAsp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH-J előállítása

Benzhidrilamin gyantát (1,1 g, 0,5 mmol, 200-400 ASTM mesh, Biomega) a 2. példa szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhárom kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-ClZ) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol) BocAsn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (881 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (936 mg, 2,0 mmol). Boc-Lys(2-ClZ) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol).

Ezen gyantát ezután a 2. Protokol 1-11 lépésének megfelelően deblokkoltuk és 1 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-vel (443 mg, 0,1 mmol) reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk és vákuumban végzett szárítás után 2,02 g Boc-tndekapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0.8 g-nyi (0,2 mmol) részletét a 8. példához hasonlóan Applied Biosystems peptid szintetizátoron szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhat kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) Boc-Gln (493 mg. 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Zt (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg. 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg. 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). így 1,2 g Bocnonakozapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0,6 g-ját (0,1 mmol) két kapcsolási cikluson vittük végig a következőkkel: Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-His(Tos) (819 mg. 2,0 mmol), 0,72 g terméket nyerve. Ezt az 1, Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percen keresztül 20 ml 6%-os DIPEA/metilénklorid-ban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mostuk és vákuumban szárítva 0.645 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 280 mg nyers pepiidet kaptunk. A 3. példának megfelelően gél szűréssel tisztítva 160 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel. hogy az alkalmazott lineáris gradiens 22-32% volt,

23,1 mg fehér amorf port kaptunk. Azt HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analizátorral kapott eredmény a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3561,1 (számított) 3560,8 (mért).

25. példa

Ac-[Ala², Cilid, Lys'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²¹·²⁸, Alá²⁹²'J-VIP ciklo (Lys²'—tAsp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:43)-NHil előállítása

0,6 g-nyi 24. példa szerint előállított Boc-nonakozapeptid gyantát (0,1 mmol) két kapcsolási cikluson vittünk keresztül a következőkkel: Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) amikor is 0,68 g terméket kaptunk. Ezen gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük és 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mosva és vákuumban szárítva 0,56 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 160 mg nyers pepiidet nyertünk. A pepiidet a 3. példának megfelelően gél szűréssel tisztítva 70 mg félig tiszta termékhez jutottunk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt, 21,8 g fehér amorf port kaptunk. A vegyület HPLC-vel egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3545,1 (számított) 3545,3 (mért).

26. példa

Ac-IN-Me-Ala', G/td. Lys'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵,

Leu²⁶, Lys^{21 28}j-VIP ciklo (Lys²'—tAsp¹⁵) [Ac-ISEQ ID NO:44)-NH-J előállítása

1,1 g (0,4 mmol) 20. példa szerint előállított Bocnonapeptid gyantát a 8. példa szerint egy Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátoron szilárd fázisú szintézisnek vetettünk alá. Tizenhét kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), BocArg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), BocThr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg. 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx| (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol). Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és így 2,22 g Boc-hexakozapeptid gyantát kapunk.

Ezen gyanta 1,1 g-ját további két kapcsolási ciklusban Boc-Ser(Bzl)-el (238 mg, 0,8 mmol), és Boc-NMe-Ala-val (163 mg. 0,8 mmol) kapcsoltunk majd az 1. Protokol 1-8 lépése szerint kezeltük és 1 órán át 20 ml DMF-ben BOP-Cl-el (100 mg, 0,2 mmol), ecetsavval (23 ml, 0,2 mmol) és DIPEA-val (140 mg, 0,4 mmol) reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,95 g terméket nyertünk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 245 mg nyers pepiidet kaptunk. Ezen peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 165 mg félig tiszta terméket nyertünk. Ezen anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltérés20

HU 211 534 A9 sel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 25-35% volt, 33,7 mg fehér amorf port kaptunk, ami HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3295,8 (számított)

3294,5 (mért).

27. példa

Ac-lp-F-Phe⁶, Glu⁶, Lys'², Nle'⁷, Alá'⁷, Asp¹⁶,

Leu¹⁶, Lys²⁷·¹⁶1-VIP ciklo (Lys¹' —»Asp¹⁶) [Ac-iSEQ ID NO:45)-NHf előállítása

Benzhidrilamin gyantát (2,49 g, 2,0 mmol, 100200 ASTM mesh, Bachem) a 2. példa szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Hat kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Lys(2-Cl-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), BocLys(2-Cl-Z) (3,32 g, 0,8 mmol), Boc-Leu (1,85 g, 8,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), BocAsn (1,02 g,4,4 mmol), Boc-Leu (1,05 g, 8,0 mmol). A gyantát szárítottuk és a felét eltávolítottuk. További három kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Tyr(2,6-DCB) (2,52 g, 6,4 mmol) és BocLys(Fmoc) (1,87 g, 6,4 mmol) és Boc-Lys(2-Cl-Z) (2,65 g. 6,4 mmol).

Ezt a gyantát a 2. Protokol 1-11 lépése szerint szelektíven deblokkoltuk majd 4,5 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-vei, (1,42 g, 3,2 mmol) reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. A 2. Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk és szárítva 6.56 g Boc-nonapeptidet nyertünk.

Ezen peptid gyanta 1,64 g-ját (0,4 mmol) a 8. példa szerint egy Applies Biosystems model 430A peptid szintetizátorral szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhárom kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Ala (378 mg. 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg. 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-CI-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg. 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg. 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). így 2,56 g Boc-dokosapeptidet nyertünk.

Ezen gyanta 0,64 g-ját (0,1 mmol) hat kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-p-F-Phe (283 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (218 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol), Boc-His(Tos) (818 mg, 1,0 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén végigvittük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a ΙΟΙ 4 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,69 g terméket nyertünk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 224 mg nyers pepiidet kaptunk, amit a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 213 mg közepesen tiszta termékei nyertünk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal a különbséggel, hogy az alkalmazott gradiens 27-37% volt, 70,5 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyületet HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosavanalízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS:MH 3365,9 (számított)

3365,6 (mért).

28. példa

Ac-[1-Nal⁶, Glu⁶, Lys'¹, Nle'⁷, Alá'⁷, Asp¹⁵, Leu¹⁶,

Lys¹⁷· ™]-VlP ciklo (Lys¹'-rAsp¹⁶) [AcfSEQ ID NO:46)-NHJ előállítása

1,28 g 27. példa szerinti Boc-dokasapeptid gyantát (0,2 mmol) a 27. példa szerint hat kapcsolási cikluson vittünk keresztül a következő eltéréssel: első ciklusban Boc-p-F-Phe helyett Boc-l-Nal-t (315 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk.

A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépései szerint kezeltük és 60 percig 20 ml 6%-os DlPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 1,41 g terméket kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 420 mg nyers peptidet kaptunk. Ezt a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 305 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott gradiens 25-35% volt és így 66,9 mg fehér amorf port nyertünk. A vegyületet HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosavanalízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3398,0 (számított) 3398,8 (mért).

29. példa

Ac-[Glu⁸, p-NH₂-Phe'°,Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷-²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»ASp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂] előállítása

1,64 g (0,4 mmol) részletét a 27. példa szerinti Boc-nonapeptid gyantának a 8. példa szerint egy Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátorral szilárd fázisú reakciónak vetettük alá. Kilenc kapcsolási ciklust végeztünk el a következőkkel: Boc-Ala (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), BocArg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-CI-Z) (830 mg, 2,0 mmol), BocThr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). így 2,2 g Boc-oktadekapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 1,1 g-ját 0,2 mmol) tíz kapcsolási ciklusnak vetettük alá: Boc-p-NH(CBZ)-Phe (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (512 mg, 2,2 mmol), BocGlu(Bzl), (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (620 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (532 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (436 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-His(Tos) (1,64 g, 4,0 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 1,45 g terméket nyertünk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk és

HU 211 534 A9 így 580 mg nyers pepiidet kaptunk. A pepiidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 400 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 22-32% volt, és így fehér amorf port kaptunk (60,6 mg). Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3346,9 (számított) 3346,8 (mért).

30. példa

Ac-[Glu^g, O-Me-Tyr^w, Lys'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵,

Leu²⁶, Lys²⁷· ^2gj-VIP cikío (Lys¹'->Asp²⁵)

ÍAc-(SEQ ID NO:48)-NH2] előállítása

1.1 g (0,2 mmol) 29. példa szerint Boc-oktadekapeptid gyantát a 29. példa szerint tíz kapcsolási cikluson vittük keresztül azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-O-Me-Tyr (148 mg, 0,5 mmol), szerepelt a Boc-p-NH(DBZ)-Phe helyett. A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a ΙΟΙ 4 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 1.45 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 555 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 460 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. példa szeirnt preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 25-35% volt 152,9 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyületet HPLC-vel elemezve egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3361,9 (számított) 3361,7 (mért).

31. példa

Ac-lp-F-Phe⁶. Lys'², Nle'², Alá'⁹, Asp²⁵. Val²⁶,

Thr-f-VIP ciklo (Lys²'—>Asp²⁵) (Ac-)SEQ ID NO:49)-NH₂] előállítása

1.2 g (0,2 mmol) 17. példa szerinti Boc-nonapeptid gyantát a 8. példa szerint Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátorral szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhárom kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg. 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (394 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol). Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg. 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). így 1,3 g Boc-dokosapeptid gyantát nyertünk.

Ezen gyanta 0,65 g-ját (0,1 mmol) a 27. példa szerint hat kapcsolási cikluson vittük keresztül. A peptidet az 1. Protokol 1-8 lépése szerint kezeltük és 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantái a 10-14 lépés szerint mostuk és vákuumban megszárílva 0,856 g terméket kaptunk. Ezen pepiid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 550 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 330 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tisztítva tovább, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 27-37% volt, 80,9 mg fehér amorf port nyertünk. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosavanalízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3295,7 (számított)

3296,2 (mért).

32. példa

Acjl-NaP, Lys'², Nle'⁷, Alá'⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²*]VIP ciklo (Lys²‘—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH₂J előállítása

0,65 g (0,1 mmol) 31. példa szerinti Boc-dokozapeptid gyantát a 27. példa szerint hat kapcsolási cikluson vittük keresztül azzal a különbséggel, hogy az első ciklusban Boc-p-F-Phe helyett Boc-l-Nal-t (315 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk. Ezen peptidet az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépés alkalmazásával mostuk és vákuum alatt szárítva 0,801 g terméket kaptunk

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 250 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 188 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott gradiens 27-37% volt, 28,0 mg fehér amorf port nyertünk. Az anyagot HPLCvel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3327,8 (számított) 3328.5 (mért).

33. példa

Ac-lAla², Lys'², Nle'⁷, Alá'⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷·²⁸, Gly²⁹·⁵⁰, Thr⁵'/-VIP ciklo (Lys²'—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO.5J )-NH₂] előállítása

Benzhidrílamin gyantát (1,1 g, 0,5 mmol 200-400 ASTM mesh. biomega) a 2. példa szerint az 1. Protokol alkalmazásával szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhárom kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 24. példához hasonló módon, azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Thr(Bzl)-t (619 mg, 2,0 mmol) alkalmaztunk, valamint a második ciklusban Boc-Ala helyett Boc-GIn-t (350 mg, 2,0 mmol) és a harmadik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Gln-t (350 mg, 2,0 mmol) használtunk. így 2,03 g Boc-tridekapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 1,22 g-ját (0,3 mmol) a 8. példa szerint Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátor alkalmazásával szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhat kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 24. példához hasonló módon, azzal az eltéréssel, hogy a tizenegyedik ciklusban Boc-Asp(OcHx) helyett BocGly(Bzl)-t (675 mg, 2,0 mmol) használtunk. 1,95 g Boc-nonakozapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0.975 g-ját (0,15 mmol) két kapcsolási

HU 211 534 A9 cikluson vittük keresztül a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). így 1,05 g terméket kaptunk.

Ezt a gyantát az 1. Protokol 1-8 lépése szerint kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mostuk és vákuumban történő szárítás után 0,897 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint gél szűréssel tisztítva 270 mg nyers pepiidet nyertünk, amelyet a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 24-34% volt, 28,7 mg fehér amorf port kaptunk. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3547.1 (számított) és 3546,9 (mért).

34. példa

Ac-IGlu⁶, Lys'², Nle'¹. Alá'⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lvs²¹·²⁸. G/y²⁹·³⁰, Thr²' J-VIPciklo (Lys²'^>Asp²⁵

IAc-íSEQ ID NO:52)-NH₂] előállítása

A 33. példa szerinti Boc-nonakozapeptid gyanta 0,975 g-ját (0,15 mmol) a 33. példához hasonló módon két kapcsolási cikluson vittük keresztül azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-Ala helyett BocSer(Bzl)-t (590 mg, 2,0 mmol) használtunk. 0.915 g terméket kaptunk.

A 7. példa szerint ezen peptid gyantát deblokkoltuk és így 303 mg nyers pepiidet kaptunk, amit a 3. példához hasonló módon gél szűréssel tisztítva közepesen tiszta terméket nyertünk (180 mg). Ezt az anyagot a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt,

42.8 mg fehér amorf port kaptunk.

Az anyagot HPLC-vel vizsgálva homogén volt és az aminosav analízis eredménye is megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3563,1 (számított) (3562,6 (mért).

35. példa

Ac-[Ala², Glu^g, Lys'², Nle'¹. Alá'⁹. Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys^{21 28}J-VIP ciklo (Lys²'—*Asp²⁵)

ÍAcfSEQ ID NO:53)-NH2] előállítása

0,27 g (0,1 mmol) 20. példa szerinti Boc-nonapeptid gyantát a 8. példa szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenkilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-iyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), BocPhe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol). A termék 0,57 g Boc-oktakozapeptid gyanta.

Ezen gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépései szerint mostuk majd vákuumban szárítva 0,506 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk és így 160 mg nyers peptidet kaptunk. A pepiidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva közepesen tiszta 100 mg terméket kaptunk, amit a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel, továbbtisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt, 17,1 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyület HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3331,9 (számított) 3332.0 (mért).

36. példa

Ac-[p-NH₂-Phe'°, Lys'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Val¹⁶,

Thr*]-VIP ciklo <Lys²'->Asp²⁵) [Ac-ISEQ ID NO:54)-NH₂] előállítása

0,6 g (0,1 mmol) 17. példa szerinti Boc-nonapeptid gyantát a 8. példa szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettünk alá. Kilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 23. példához hasonló módon és így 0,72 g Boc-oktadekapeptid gyantát kaptunk. Ezen gyantát egy kapcsolási cikluson vittünk keresztül Boc-p-NH(DBZ)Phe (166 mg, 0,4 mmol), felhasználásával és így 0,79 g Boc-nonadekapeptidet kaptunk. Ezen gyantát a 8. példában leírtak szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Kilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), BocAsp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), BocSer(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol), és így 0,91 g terméket kaptunk. Ezt a gyantát az 1. Protokol 1-8 pontja szerint kezeltünk majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEAVmetilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mostuk, vákuumban szárítottuk és így 0,85 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk 350 mg nyeres peptidet kapva, amit a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 138 mg közepesen tiszta terméket nyertünk, amit a 3. példa szerint preparatív HPLCvel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt, 25,2 mg fehér amorf port kaptunk. Ez HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis is megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH

3276,8 (számított) 3276,2 (mért).

37. példa

Ac-[Lys'², Nle'¹, Alá¹⁹, m-OCHyTyr²², Asp²⁵,

Val²⁶, Thr²*]- VIP ciklo (Lys²¹ ->ASp²⁵)

IAc-íSEQ ID NO:55)-NH-J előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol) a 2. példa szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú reakciónak vetettük alá. Kilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol). Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Val

HU 211 534 A9 (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (213 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (255 mg, 1,1 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) (80 mg, 0,2 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0,5 mmol), BocLys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol).

Ezen gyantát a 2. Protokol 1-11 lépései szerint szelektíve (leblokkoltuk majd 3,5 órán át 10 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-vel (132 mg, 0,3 mmol) reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt.

Ezt kővetően tizenkilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (331 mg, 1,0 mmol), Boc-GIn (270 mg, 1,1 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol) Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol). Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg, 0.5 mmol), Boc-Asn (256 mg, 1,0 mmol), BocAsp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), BocSer(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol), Boc-His(Tos)(408 mg, 1,0 mmol).

Ezen gyantát az 1. Protokol 1-8 pontja szerint kezeltük majd 60 percig 10 percig 10 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk és a gyantát az 1. Protokol 10-14 pontja szerint mostuk, vákuumban szárítottuk. így 0,814 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk és így 265 mg nyers peptidet kaptunk. Ezt a 3. példa szerinti gél szűréssel tisztítva közepesen tiszta termékhez (150 mg) jutottunk, amit ugyancsak a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tisztítva - 23-33%-os gradiens alkalmazása mellett - 8,1 mg fehér amorf port kaptunk ami HPLC-vel egységes és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő. FAB-MS: MH

3307,8 (számított). 3306,8 (mért).

38. példa

Ac-jLys'², Nle'¹, Alá¹⁹, m-F-L-Tyr², Asp²⁵. Val²⁶.

Thr^j-VIP ciklo (Lys^2,—tASp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g 0.1 mmol) a 2. példa szerint, az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 37. példa szerint azzal az eltéréssel, hogy a hetedik ciklusban Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) helyett Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl)-t (78 mg, 0,2 mmol) alkalmaztunk és így 0,754 g terméket nyertünk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkoltuk és az így kapott 254 mg nyers peptidet a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 114 mg közepesen tiszta terméket kaptunk, amit a 3. példa szerint preparatív HPLCvel tovább tisztítva - 27-37%-os gradiens alkalmazásával - 15,1 mg fehér amorf port kaptunk. A termék HPLC-vel egységes, az aminosav analízis a várt eredményt adta. FAB-MS: 3295,7 (számított) 3295,5 (mért).

39. példa

Ac-lGlu⁶, Lys'². Nle'¹, Alá'⁹, m-OCHy-Tyr²²,

Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²¹· ²⁶]-VIPciklo (Lys²'-»Asp²⁵)

IAc-(SEQ ID NO:57)-NH₂] előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 mg, 0,1 mmol) a 2 példa szerint az 1. Protokolnak megfelelően szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust végeztünk a 37. példa szerint azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-Thr(Bzl)-t (415 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk, a második ciklusban Boc-Leu helyett Boc-Lys(2-Cl-Z)-t (415 mg, 1,0 mmol), a harmadik ciklusban Boc-Val helyett BocLeu-t (268 mg, 1,0 mmol), és huszonegyedik ciklusban Boc-Asp(OcHx) helyett Boc-Glu(0-Bzl)-t (337 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk. így 0,90 g terméket nyertünk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 270 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 155 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt ugyancsak a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel - 25-35% gradiens mellett - tovább tisztítva 29,6 mg fehér amorf port kaptunk. Az anyag HPLC-vel egységes, az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt.

40. példa

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·^2e]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂] előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 mg, 0,1 mmol) a 2. példa szerint az I. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a 39. példa szerint, azzal az eltéréssel, hogy a hetedik ciklusban Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) helyett Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl)-t (78 mg, 0,2 mmol) használtunk és így 0,83 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 240 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. példa szerint gél szűréssel tisztítva 100 mg közepes tisztaságú terméket kaptunk. Ezt az anyagot a 3. példa szerint tovább tisztítottuk preparatív HPLC-vel - 25-35% gradienst alkalmazva - és így 37,2 mg fehér amorf port nyertünk, A termék HPLC-vel egységes, az aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-MS: MH 3365,9 (számított) 3365,8 (mért).

41. példa

AcjAla⁸, L\s'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys^{21 28}1-VIP ciklo (Lys²'—tAsp²⁵) lAc-lSEQ ID NO:59)-NH-,] előállítása Benzhidrilamin gyantát a 2. példa szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 39. példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy az ötödik ciklusban Boc-Asn helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol), a hetedik ciklusban Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) helyett BocTyr(2,6-DCB)-t (440 mg, 1,0 mmol) és a huszonegyedik ciklusban Boc-Glu(OBzl) helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és így 0,85 g terméket kaptunk.

Ezt a pepiid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 255 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. példához

HU 211 534 A9 hasonlóan gél szűréssel tisztítva 112 mg közepes tisztaságú terméket kaptunk. Ezt ugyancsak a 3. példához hasonlóan preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk 2535% lineáris gradienssel - és 12,0 mg fehér amorf port nyertünk. A termék HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MD: MH 3246,8 (számított) 3246,7 (mért).

42. példa

Ac-(Glu⁶, Lys'², Alá'⁶· ^l7·”, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²¹- ^2S]-VIP ciklo (Lys²'Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO-.óOPNHJ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol) a 2. példához hasonlóan az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolás ciklust alkalmaztunk a 41. példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy az ötödik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Asn-t (256 mg, 1,1 mmol), a tizenkettedik ciklusban Boc-Nle helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol), a tizenharmadik ciklusban Boc-GIn helyett Boc-Ala-t (189 mg. 1,0 mmol) és a huszonegyedik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Glu(OBzl)-t (337 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk. így 0,80 mg terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példához hasonlóan deblokkoltuk és így 254 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 115 mg közepesen tisztaságú terméket nyertünk. Ezt ugyancsak a 3. példához hasonlóan preparatív HPLC-vel tovább tisztítva 20-30%-os gradienst alkalmazva - 32,1 mg fehér amorf port nyertünk. A termék HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye megfelel a vártnak. FAB-MS: MH 3248,7 (számított) 3248,3 (mért).

43. példa

Ac-lAla⁶, Lys'², Alá'⁶, Nle'¹, Alá'¹, Alá²⁴. Asp²⁵,

Leu²⁶. Lys²¹· ²⁶J-V1P ciklo (Lys²' —>Asp²⁵)

ÍAc-(SEQ ID NO:6i)-NH₂) előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol) a 2. példához hasonlóan az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 41. példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy a tizenharmadik ciklusban BocGln helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és 0,93 g terméket kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. példához hasonlóan deblokkolva 250 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 100 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot ugyancsak a 3. példa szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva - 27-37% gradienst alkalmazva - 23,6 mg fehér amorf port kaptunk. A termék HPLC-vel elemezve homogén, az aminosav analízis a várt eredményt mutatta. FAB-MS: MH

3189,8 (számított) 3189,9 (mért).

44. példa

Ac-[Ala^g, Lys'², Alá'⁶· ^l7·¹⁹ Alá²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys¹⁷· ^Ά)-\ίΙΡ ciklo (Lys²'—>Asp²⁵) lAc-(SEQ ÍD NO:62j-NH₂] előállítása Benzhidrilamin gyantát (0,125 mg, 0,1 mmol) a 2.

példához hasonlóan az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 43. példához hasonlóan azzal az eltéréssel, hogy a tizenkettedik ciklusban Boc-Nle helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) használtunk és 0,762 g terméket kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 240 mg nyers peptidet kaptunk, melyet a 3. példához hasonlóan gél szűréssel tisztítottuk és így közepesen tiszta 150 mg terméket kaptunk. Ezt a 4. példához hasonlóan preparatív HPLC-vel tovább tisztítva - 2233% gradiens alkalmazásával - 55,3 mg fehér amorf por képződik. A terméket HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő. FAB-MS: MH 3147,7 (számított) 3148,0 (mért).

45. példa

Ac-[Glu^s, Lys'², Alá'⁶, Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Leu²⁶.

Lys²¹· ^j-VIP ciklo (Lys²'—rAsp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH2] előállítása

Benzhidrilamin gyantát a 2. példához hasonlóan az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 42. példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy a tizenkettedik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Nle-t (231 mg, 1,0 mmol) használtunk és így 0,775 mg terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példához hasonló módon deblokkolva 203 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. példához hasonló módon gél szűréssel tisztítva 100 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt ugyancsak a 3. példához hasonlóan preparatív HPLC-vel tovább tisztítva 27-37% lineáris gradiens alkalmazásával - 40,0 mg fehér amorf port kaptunk. A tennék HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis a várt eredményt mutatta. FAB-MS: MH 3290,8 (számított( 3290,5 (mért).

46. példa

Ac-[Glu⁶, Lys'², Alá'⁶· ¹⁷ ”, Alá²⁴ Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²¹·²⁸]-VIP ciklo (Lys²'—*Asp²⁵)

IAc-(SEQ ID NO:64)-NH₂] előállítása

Benzhidrilamin gyantát a 2. példához hasonlóan az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a 43. példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy a huszonegyedik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Glu(OBzl)-t (337 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és így 0,837 g teiméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 178 mg nyers peptidet nyertünk, melyet a 3. példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 126 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt preparatív HPLC-vel tisztítottuk tovább - 20-30% lineáris gradiens - mely eredményeként 24,9 mg fehér amorf port kaptunk. A termék HPLC-vel mérve egységes, az aminosav elemzés a várt eredményt mutatta. FAB-MS: MH 3205,7 (számított) 3205,2 (mért).

47. példa

Ac-ÍGlu⁶, Lys'², Nle'¹, Alá'⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²*

Gly²⁹·³⁰ Thr]-VIP ciklo (Lys²'->Asp²⁵) [Ác-(SEQ ID NO:65)-NH₂] 'előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 mg, 0.1 mmol) az 1.

HU 211 534 A9

Protokol alapján három kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) és Boc-Gly (175 mg, 1,0 mól). Ezt követően huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 37. példához hasonlóan azzal az eltéréssel, hogy a hetedik ciklusban Boc-mOCHj-Tyr(Bzl) helyett Boc-Tyr(2,6-DCB)-t (440 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és a huszonegyedik ciklusban Boc-Asp(OcHx) helyett Boc-Glu(O-Bzl)-t (337 mg, 1,0 mmol) használtunk és 0,895 g terméket nyertünk.

Ezt a peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 440 mg nyers peptid keletkezett, melyet a 3. példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 120 mg közepes tisztaságú termék keletkezett. Ezt preparatív HPLC-vel tovább tisztítottuk - 25-35% gradiens - és 27,7 mg fehér amorf port kaptunk, mely HPLC-vel egységes, aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő. FAB-MS: MH 3506,9 (számított) 3205,8 (mért).

48. példa

Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁶ Lys¹². Nle'¹, Asp²⁵. Val²⁶,

Thr²⁸. G/v²⁹· ^1fl, ThFj-VlP ciklo (Lys²'sAsp²⁵) jAc-(SEQ ID NO:66)-K'H-J előállítása Benzhidrilamin gyantát (0,125 g. 0,1 mmol) harmincegy kapcsolási cikluson vezettük keresztül a 47. példához hasonló módon, azzal az eltéréssel, hogy a tizenharmadik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Val-t (217 mg. 1.0 mmol) és a huszonhatodik ciklusban BocPhe helyett Boc-p-F-Phe-t (142 mg, 0.5 mmol) alkalmaztunk és így 0,754 g terméket nyertünk.

Ezt a peptid gyantát a 7. példa szerint deblokkolva 280 mg nyers peptidet kaptunk, melyet gél szűréssel tisztítva közepes tisztaságú 152 mg terméket kaptunk. Ezt preparatív HPLC-vel tovább tisztítva - 27-38% lineáris gradiens - 53,4 mg fehér amorf port kaptunk, ami HPLC-vel egységes és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő FAB-MS. MH 3553,0 (számított) 3552.2 (mért).

49. példa

Ac-(Ala². Glu⁶. Lxs^>2. Nle'¹. Asp²⁵, Leu²⁶. Lys²¹·²⁸,

Gly²⁹·^3Ü. Thrj-VIP ciklo (Lys²'->Asp²⁵) lAc-tSEQ ID NO:67)-NH₂] előállítása Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0.1 mmol. 100200 ASTM mesh. Bachem.) a 47. példához hasonlóan harmincegy kapcsolási ciklusnak vetettük alá azzal az eltéréssel, hogy a negyedik ciklusban Boc-Thr(Bzl) helyett Boc-Lys(2-CI-Z) (414 mg, 1,0 mmol). az ötödik ciklusban Boc-Leu helyett Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg. 1.0 mmol). a hatodik ciklusban Boc-Val helyett Boc-Leu-t (249 mg. 1,0 mmol), a tizenharmadik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Val-t (217 mg, 1.0 mmol) és a harmincadik ciklusban Boc-Ser(Bzl) helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és 0,838 mg terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példa szerinti deblokkolás után kapott 370 mg nyers peptidet gél szűréssel tisztítva 196 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt preparatív HPLC-vel tovább tisztítva - 23-33% lineáris gradiens - 48,4 mg fehér amorf port kaptunk. Ezt

HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3575,1 (számított) 3574,0 (mért).

50. példa @PÉLDA = Ac-[Glu⁶, Lys¹², Nle'¹,

Asp²⁵, Leu¹⁶, Lys²¹· ²⁸. Gly²⁹· ^M, ThP'j-VIP ciklo (Lys^2,—*Asp²⁵) lac-(SEQ ID NO:68)-NH₂] előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol), 100200 ASTM mesh, Bachem) a 2. példában leírtak szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Harmincegy kapcsolási ciklusnak vetettük alá a 49. példához hasonlóan azzal az eltéréssel, hogy a harmincadik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Ser(Bzl)-t (295 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és így 0,913 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. példában leírtak szerint deblokkoltuk és ígj 378 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. példában leírtak szerint gél szűréssel tisztítottuk és így 240 mg félig tiszta terméket kaptunk. A terméket a 3. példa alapján preparatív HPLCvel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy 2535% lineáris gradienst alkalmaztunk. így 28,8 mg fehér amorf port kaptunk. Az anyagot HPLC-vel elemezve homogén volt és az aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-MS: MH 3591,1 (számított) és 3590,3 (mért)

51. példa

Ac-[Lys‘², Nle'¹. Alá²⁵, Leu²⁶, Lys²¹·²⁸, A/o^{29 31}/VIP ciklo (Lys^-tAsp²⁵) /Ac-íSEQ ID NO:69)-NH₂] előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g. 0,1 mmol), 100200 ASTM mesh. Bachem) a 2. példában leírtak szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. A 47. példához hasonló módon harmincegy kapcsolás ciklusnak vetettük alá azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-Thr(Bzl) helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1.0 mmol), illetve a második ciklusban BocGly helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1.0 mmol), a harmadik ciklusban Boc-Gly helyett Boc-Ala-t (’89 mg, 1.0 mmol), a negyedik ciklusban Boc-Thr(Bzl) helyett Boc-Lys(2-CI-Z)-t (414 mg, 1.0 mmol), az ötödik ciklusban Boc-Leu helyett Boc-Lys(2-Cl-Z)-t (414 mg. 1,0 mmol), a hatodik ciklusban Boc-Val helyett BocLeu-t (249 mg, 1.0 mmol). a huszonnegyedik ciklusban Boc-Glu(OBzl) helyett Boc-Asp(OcHx)-t (315 mg. 1,0 mmol) használtunk és így 0,844 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. példa alapján deblokkolva 360 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. példában leírtaknak megfelelően gél szűréssel tisztítva 115 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezen anyagot a 3. példában leírtak szerint preparatív HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy 24-34% lineáris gradienst alkalmaztunk, 34,7 mg fehér amorf port kaptunk. Ezen vegyületet HPLC-vel analizálva egységesnek találtuk és az aminosav analizátor vizsgálat a várt eredményt mutatta. FAB-MS. MH 3547,1 (számított) és 3546.0 (mért).

HU 211 534 A9

52. példa

A VIP analóg légcső relaxáló aktivitása A VIP analógok relaxáló aktivitását módéiként tengeri malac légcsövét alkalmazva tanulmányoztuk. (Wasserman, M.A. etal., in Vasoactive Intestinal Pepti- 5 de. S.I. Said, ed., Raven Press, N.Y. 1982, pp 177— 184). A szöveteket hímnemű albínó tengerimalacból (400-600 g tömegűek) vettük. Az altatást uretánnal (2 g/kg, i.p.) végeztük. Érzéstelenítés után a légcsövet eltávolitottuk és négy gyűrű alakú szegmensre osztottuk (3 mm hosszú). Ezen gyűrűket 30 mm-es saválló dróton felfüggesztettük egy textillel bevont fürdőben és összekötöttük egy selyem fonalon keresztül egy Grass erő átalakítóval (model FTO3C, Grass Instruments Co., Quincy, MA) a feszültség izometrikus regisztrálására. A sima izomszövetek az alábbi összetételű fürdőben voltak: 120 mM NaCl, 4,7 mM KC1,

2,5 mM CaCI₂, 1,2 mM MgSO₄.7H₂O, 25 mM NaHCOj, 1,2 mM K₂HPO₄ monobázis és 10 mM dextroz.

A fürdőt 37 'C-on tartottuk és folyamatosan áramoltattunk keresztül 95% O₂ és 5% CO₂ tartalmú gázbuborékokat. A jeleket egy 8 csatornás és egy négy csatornás

Hawlett-Packard rekorderrel (Hawlett-Packard, Paramus, N.J, 77O2B és 7754A model) regisztráltuk. A légcső gyűrűket 1,5 g nyugalmi feszültség alá helyeztük melyet korábbi kísérletek alapján optimálisnak találtunk. Az egyes feszültségmérések között 60 perces stabilizálási periódus telt el, a szöveteket 15 percig mostuk.

A kumulatív koncentráció függvényében a jel görbét ugyanazon szövetminta alkalmazásával vettük fel, fokozatosan növelve a VIP illetve a VIP analógok koncentrációját a fürdőben VanRossum módszerének megfelelően [Arch. Int. Pharmacodyn., 299-330 (1963)]. Egy szövetmintával csak egy kumulatív jelgörbét vettünk fel. Az egyes minták közötti eltérés kiküszöbölésére a relaxációs jelet százalékosan adtuk meg, amikor a VIP hatására bekövetkező maximális jelre vonatkoztatva adtuk meg (10^_6M= 100%). Ugyanazon mérést három mintán is mértük és az EC₅₀ értékeket lineáris regresszió alkalmazásával számítottuk.

Az eredményeket az I. Táblázatban foglaltuk össze úgy a természetes VIP analóg relaxációs aktivitását tengeri malac légcsövére.

I. Táblázat

A VIP analógok görcsoldó aktivitása a tengeri malac légcsövének sima izmán mérve

Vegyület	EC5o (nM)
VIP[(Seq ID NO:1)-NH2]	10
Ac-[Lys12. Nle17, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Asp8-»Lys12) ’ [Ac-tSEQ ID NO:20)-NH2]	14
Ac-[Glu8, Lys12, Nle11, Val26, Thr28]-VIPcyclo (Glu8-»Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH2]	34
Ac-tAsn8, Asp9, Lys12, Nle17, Val26. Thr28]-VIP cyclo (Asp9-»Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH2]	17
Ac-JOm12, Nle17, Val26. Thr28]-VIP cyclo (Lys8-»Om12) [Ac-tSEQ ID NO:23)-NH2]	40
Ac-[Lys8. Asp12. Nle17, Val26. Thr28]-VIP cyclo (Lys8-»Asp12) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH2]	38
Ac-(Glu8, Om12, Nle17, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Glu8-»0m'2) [ac-íSEQ ID NO:25)-NH2]	16
Ac-[Lys12, Glu16, Nle17, Val26. Thr28]-VIP cyclo (Lys12-»Glu16) |Ac-(SEQ ID NO:26)-NH21	37
Ac-[Lys12, Nle17, Asp24, Val26, Thr28]-VlP cyclo (Lys20-»Asp24) [Ac-tSEQ 1DNO:27)-NH2)	5.3
Ac-[Lys12. Nle17, Asp25, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Lys2l-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH2]	3.1
Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Val26, Thr28]-VlP cyclo (Lys2l-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:29)NH2]	0.70
Ac-[p-F-Phe6, 2-Nal10, Lys12, Nle17, Asp25, Val26, Thr28, Gly29 30. Met3l]-VlP cyclo (Lys2l-»Asp25j [Ac-(SEQ ID NO:30)NH2]	1.3
Ac-[Glu8, Om12, Nle17, Asp25, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Lys2l-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:31)NH2]	2.2
Ac-[p-F-Phe6. Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Val26, Thr28, Gly29 3U, Cys(Acm)31]-VlP cyclo iLys1—>Asp25) ]Ac-(SEQ ID NO:32)NH2]	0.44
Ac-[Ala2, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Val26, Thr2ll]-VIPcyclo (Lys21-»Asp25) (Ac-(SEQ ID NO:33)NH2]	1.2
Ac-IN-Me-Ala1, Lys12, Nle11, Ala19, Asp25, Val26. Thr28]-V[Pcyclo (Lys^-íAsp25) |Ac-(SEQlD NO:34)NH2]	0.71

HU 211 534 A9

Vegyület	ECjo (nM)
Ac-[2-Nallü,Leu12, Nle17, Alá1’, Asp25, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Lys21->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:35)NH2]	4,2
Ac-lO-CHj-iyr10, Leu12, Nle17, Alá19, Asp25, Val26,Thr28]-VIPcyclo (Lys2'-aAsp25) [Ac-(SEQ ID NO:36)NH2]	0.84
Ac-[p-F-Phe6, p-NH2-Phe10, Leu12, Nle17. Alá19, Asp25, Val26 Thr28]-VIP cyclo (Lys2l->Asp25) |Ac-(SEQID NO:37)NH2]	4.4
Ac-fLys'2 Nle17, Alá19, Asp25, Leu26. Lys27' 2SJ-VIP cyclo (Lys2l-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:38)NH2]	0.13
Ac-JN-Me-Ala1, Lys12, Nle17, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27' “j-VIP cyclo (Lys21-»Asp25) (Ac-(SEQ ÍD NO:39)NH2J	0.95
Ac[Glu8, Lys12, Nle17, Alá19. Asp25, Leu26, Lys27' 28]-VIP cyclo (Lys2l->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:40)NH2]	0.45
Ac-[O-Me-Tyr'°, Lys12, Nle17, Alá19, Asp25. Val26, Thr28J-VIPcyclo (Lys2l-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:41)NH2]	2.6
Ac-[Glu8, Lys12. Nle17, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27' 28, AlaW ,i |-VIP cyclo (Lys21->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:42)NH2]	0.61
Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17. Alá19, Asp25, Leu26. Lys27' 2B, Alá29-31 ]-VIP cyclo (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:43)NH2]	0.55
Ac-IN-Me-Ala1. Glu8, Lys12, Nle”. Alá19, Asp25, Leu26. Lys27' 28]-VIP cyclo (Lys2l->Asp25) |Ac-(SEQ ID NO:44)NH2]	0.36
Ac-[p-F-Phe6, Glu8, Lys12. Nle”. Alá19, Asp25, Leu26, Lys*7 28]-VIPcyclo (Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:45)NH2]	0.47
Ac-ll-Nal6. Glu8. Lys”. Nel”, Alá19. Asp25. Leu26. Lys27' 28]-VlP cyclo (Lys21 ->Asp25) [Ac-lSEQID NO:46)NH2]	0.26
Ac-[G1uX, p-NH^-Phe10. Lys1-, Nle17. Alá19. Asp25, Leu26. Lys27, ~8]-VIP cyclo {Lys-1 —»Asp25) |Ac-(SEQlD NO:47)NH2]	0.32
Ac-[Glu8. O-CIL-Tyr10 Lys12. Nle”, Alá19. Asp25, Leu26. Lys27' 28]-VIP cyclo (Lys31-♦Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:48)NH2]	0.41
Ac-[p-F-Phe6. Lys”, Nle17. Alá19. Asp5, Val36, Thr28]-VIP cyclo (Lys21—>Asp25) | Ac-(SEQ ID NO:49)NH2]	0.39
Ac-ll-Nal6 Lys”, Nle”. Alá19 Asp25. Val26. Thr38]-VIP cyclo (Lys21->Asp25) |Ac-(SEQ ID NO:50)NH2]	2.9
Ac-[Ala:, Glu8. Lys13, Nle17, Alá19, Asp25, Leu26. Lys27'28. Gly29' 30. Thr31 ]-VIP cyclo (Lys21 -+Asp35) [Ac-iSEQ ID NO:5I)NH2J	0.92
Ac-[G1ub. Lys”. Nle”, Alá19. Asp25. Leu26. Lys27' 28, Gly29, 30, Thr31]-VIP cyclo (Lys*1—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:52)NH2]	0.35
Ac-lAla*. Glu8. Lys”. Nle”. Alá19. Asp5. Leu26. Lys27 ’l-VIP cyclo (Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:53)NH2]	0.78
Ac-lp-NH2-Phe'°, Lys12. Nle17, Alá19, Asp25, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Lys21 -+ Asp35) [Ac-(SEQ ID NO:54)NH2]	0.96
Ac-|Lys”, Nle11. Alá19. m-OCH?-Tyr23. Asp25, Val36, Thr38]-VIPcyclo (Lys2l->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:55)NH2]	0.31
Ac-ILys1*, Nle17. Alá19. m-F-L-Tyr“\ Asp-5. Va!26. Thr“8]-V IP cyclo (Lys21—> Asp25) [Ac-(SEQIDNO;56)NH2]	0.52
Ac-[Glu8, Lysl2. Nle”. Alá19 m-OCHi-Tyr22. Asp25, Leu26. Lys27 28]-VIP cyclo íLyV'-oAsp25) [Ac-(SEQ ID NO:57)NH2]	0.29
Ac-|Glu8, Lys”, Nle”, Alá19, m-F-L-Tyr33, Asp35, Leu26, Lys27' 28]-VlPcyclo (Lys*1-♦Asp25) (Ac-íSEQlD NO:58)NH2]	0.31
Ac-[Ala8. Lys12. Nle”. Alá19, Alá24, Asp25. Leu26, Lys27' 28)-VIP cyclo (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:59)NH2]	1.1
Ac-[G1ub, Lys”. Alá16' 19, Asp25, Leu26. Lys27' 28]-VlP cyclo (Lys2'-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:60)NH2]	0.26
Ac-|AlaS. Lys”, Alá16. Nle”. Alá19 Alá24. Asp25, Leu26. Lys27' 28]-VIP cyclo (Lys2l-»Asp25) (Ac-(SEQ ID N0:6] )NH2]	2.4
Ac-[Ala8, Lys”, Alá16' ” 19. Alá*4. Asp25. Leu26, Lys27, *8)-VIP cyclo (Lys l->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:62)NH2]	0.1

HU 211 534 A9

Vegyület	ECío (nM)
Ac-[Glu8, Lys12, Ala16, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27' 28]-VIP cyclo (Lys21-»Aspl5) [Ac-(SEQ ID NO:63)NH2]	0.9
Ac-[GluS, Lys12. Ala16' l7' ”, Ala24, Asp25, Lei?6, Lys27’ 28]-VlPcyclo (Lys21 ->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:64)NH2]	0.22
Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala”, Asp25, Val26, Thr28, Gly29' M, Thr31]-VIP cyclo (Lys2l-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:65)NH2]	0.88
Ac-[p-F-Phe6, Glu8, Lys15, Nle17, Asp25, Val26, Thr28, Gly29' 30, Thr31)-VIP cyclo (Lys5l->Asp5fl) [Ac-(SEQ ID NO:66)NH2]	0.57
Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Asp25, Leu56, Lys57'28, Gly29'30, Thr3l]-VlP cyclo (Lys2l->Aspl5) [Ac-(SEQ ID NO:67)NH2]	0.19
Ac-[Glus, Lys12, Nle17, Asp25, Leu26, Lys27· 28, Gly29· 30 Thr31]-VIP cyclo (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:68)NH2]	0.43
Ac-[Lys12, Nle'5, Ala”, Asp25, Leu26, Lys27' 28, Ala^’l-VIP cyclo (Lys2l->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:69)NH2]	0.42

53. példa

A VIP analógok hörgőtágító hatása

A VIP és VIP analógok bronchodilatációs hatását, aktivitását in vivő tengeri malacokon mértük a légcsőbe csepegtetéssel történő beadással. Ez a technika hím tengeri malacot alkalmaz (Hartley Strain, Charles River) 400-600 g testtömeggel. Az állatokat 2 g/kg hasfalon keresztül beadott uretánnal altattuk és polietilén kanült vezettünk a véna jugularisba a hatóanyag beadására.

Az állatokon légcsőmetszést alkalmaztunk és desztillált vizes oldatot vagy a teszt komponens desztillált vizes oldatát adagoltuk a légcsőbe. Az oldat koncentrációját úgy állítottuk be, hogy a beadott térfogat állandó, 100 ml legyen. Az állatokat egy percre a hátukra fektettük. hogy a hatóanyag a tüdőbe jusson. Egy perccel később a spontán légzés megakadályozására szuccinilkolin kloridot adtunk intravénásán (1,2 mg/kg) és az állatot Harvard Model 600 animal respirálorral lélegez20 tettük 40 légvétel/perc és 4,0 cm³/löket térfogattal. Az állatokat maximális összehúzódást eredményező hisztamin dózissal ingereltük (50 mg/kg, i.v.) és mértük a légcső nyomásást (vízoszlop cm), melyet egy Statham nyomás átalakítóval regisztráltunk.

A tracheális nyomás változását legalább három kontroll és három hatóanyaggal történő kezeléskor kapott ereedmény átlagolásával kaptuk és a százalékos inhibiciót számítottuk. A tesztanyagot változó koncentrációban adagolva meghatároztuk a közepes hatású dózist (ED^ térfogat). Az ED₅₀ értékét lóg dózis - jel görbéből határoztuk meg úgy, hogy 10% és 90% inhidiciós efektus között legalább három dőzisértéknél mértünk. A regressziós koeficiens a korrelációszámításnál minden esetben legalább 0,95 volt.

A kapott eredményeket a II. Táblázatban foglaltuk össze, amely szemlélteti a bronchodilatációs hatását (aktivitását) a VIP analógok esetében összehasonlítva a természetes VIP-vel.

II. Táblázat

Bronchodilatációs aktivitása a VIP analógoknak tengeri malacon

Vegyület	ED5 (pg)
VIP[(Seq ID NO:1)-NH2]	7.3
Ac-[Lys12, Glu16, Nle17, Val26, Thr28)-VlP cyclo (Lys21 ->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH2]	39
Ac-[Lys12, Nle17, Asp24, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Lys20-»Asp24) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH2]	2.3
Ac-[Lys12, Nle17, Asp25, Val26, Thr28)-VIP cyclo (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQID NO:28)-NH2]	1.2
Ac-[Lysl5, Nle17, Ala”, Asp25, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Lys2'-»Asp25) [Ac-(SEQ1D NO:29)-NH2]	0.34
Ac-[p-F-Phe6, 2-Nal10, Lys12, Nle17, Asp25. Val26, Thr28, Gly29, 30 Mel3l)-VIPcyclo (Lys2l-»Asp25) lAc-(SEQ ID NO.30)-NH2]	0.90
Ac-[Glu8, Om12, Nle17, Asp25, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Lys2i-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH2]	0.19
Ac-[p-F-Phe6. Lys12, Nle17. Ala”, Asp25, Val26, Thr28, Gly29·30, Cys(Acm)3l]-VIPcyclo (Lys2l-»Asp25) |Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2]	0.19

HU 211 534 A9

Vegyület	ED5 (pg)
Ae-[Ala2, Lys12, Nle17, Alá19, Asp25, Val26, Thr28]-VIP cyclo (Lys21->Asp25) [Ac-(SEQID NO:33)-NH2]	0.6
Ac-tN-Me-Ala1. Lys12, Nle17, Alá19, Asp25, Val26,Thr28]-VIPcyclo (Lys2l-)Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH2]	1.0
Ac-[Lys12, Nle17, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27 28]-VIP cyclo (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH2]	0.09
Ac-fN-Me-Ala1, Lys12, Nle’7, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27· MJ-VIP cyclo (Lys21>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH2]	0.06
Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Alá19 Asp25, Leu26, Lys27 28]-VIP cyclo (Lys2,->Asp2i) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH2]	0.022
Ac-IGlu8, Lys12, Nle17, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27' 28,Ala29_31]-VIP cyclo (Lys21->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH2]	0.072
Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27'28, Alá29'31 ]-VlP cyclo (Lys2'-)Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH2]	0.14
Ac-tN-Me-Ala1, Glu8, Lys12, Nle17, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27, 28]-V IP cyclo (Lys21-)Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH2]	0.097
Ac-[p-F-Phe6. Glu8, Lys12. Nle17, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27 28]-VIP cyclo CLvs21-)Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH2]	0.026
Ac-[I-Nal6. Glu8, Lys12. Nle17, Alá19. Asp25, Leu26. Lys27· 28]-VIP cyclo (Lys2,^>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH2]	0.036
Ac-IGlu8, p-NH2-Phe10. Lys12. Nle17. Alá19. Asp25. Leu26, Lys2728]-VlP cyclo (Lys21-)Asp25) [Ac-(SEQ ID NO.47)-NH2]	0.075
Ac-IGlu8, O-CFb-Tyr10, Lys1', Nle17. Alá19, Asp25, Leu26. Lys27 281-VIP cvclo (Lys-1—)Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH2]	0.094
Ac-[p-F-Phe6. Lys12, Nle17. Alá19. Asp25. Val26. Thr28]-VIP cyclo (Lys21->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH2]	0.26
Ac-[Ala2. Glu8, Lys12, Nle17 Alá19, Asp25. Leu26, Lys27 28. Gly29’ 50 Thr”j-VIPcyclo (Lys'1 —>Asp25) |Ac-(SEQ ID NO:51)-NH2]	0.1
Ac-[G!u8, Lys12. Nle17, Alá19, Asp25, Leu26. Lys27'28]-VIP cyclo (Lys21—) Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2]	0.1
Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle1'. Alá19, Asp25. Leu26. Lys'7 28-VIP cyclo (Lys21—)Asp5) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH2]	0.14
Ac-(p-NH2-Phe10. Lys12. Nle17, Alá19. Asp25. Val26, Thr28]-VlP cyclo (Lys2l->Asp25) (Ac-(SEQ ID NO:54)-NH2]	0.35

Ac-tLys¹². Nle¹⁷, Alá¹⁹. m-OCHvTyr²², Asp²⁵. Val¹⁶. Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys^2l-)Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:5S)-NH₂]

Ac-tLys1 . Nle17. Alá19, m-F-L-Tyr2'. Asp'5, Val'6 Thr28J-VIPcyclo (Lys21-)Asp251 |Ac-(SEQID NO:56)-NH2]	7,2
Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Alá19. m-OCHi-Tvr'2, Asp25. Leu26. Lys27' 2S]-V1P cyclo (Lys21->Asp25) [Ac-fSEQ ID NO:57)-NH2]	0.019
Ac-|Glu8, Lys12. Nle17, Alá19, m-F-L-Tyr22, Asp2’5. Leu26. Lys2728]-VlP cyclo (Lys2’-)Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH2]	0.03
Ac-|Ala8, Lys12, Nle17, Alá19. Alá24. Asp25. Leu26, Lys27' 28]-VlPcyclo (Lys2l->Asp25) (Ac-(SEQ ID NO:59)-NH2]	0.17
Ac-[Glu\ Lys12, Alá16' 17' 19 Asp25, Leu26, Lys27' 28|- VIP cyclo (Lys2l-)Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH2]	0.17
Ac-[Ala8. Lys12. Alá16, Nle17. Alá19. Alá24, Asp25, Leu26. Lys27' 2S]-V1P cyclo (Lys21 —> Asp25) (Ac-(SEQ ID NO.6I)-NH2]	0.045
Ac-lAla8. Lys12, Alá16' 17 ly, Alá24. Asp5. Leu26, Lys27· 8)-VIP cyclo (Lys'1—>Asp25) [Ac-(SEQID NO:62)-NHi]	0.24
Ac-jGlu8. Lys12. Alá16' 17' 19 Alá24. Asp25, Leu26. Lys27' '8]-VIP cyclo (Lys2,->Asp'5) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2]	0.13

HU 211 534 A9

Vegyület	ED5 (pg)
Ac-[Glu“. Lys12, Nle'7, Alá19, Asp25, Val26, Thr28, Gly29'30, Thr31]-VIP cyclo (Lys21->Asp25) lAc-(SEQ ID NO:65)-NHj]	0.84
Ac-[p-F-Phe6, Glu8, Lys12, Nle17, Asp25. Val26, Thr28, Gly29· 3Ö, Thr31 ]-VIP cyclo (Lys21->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2]	0.12
Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Asp25, Leu26, Lys27' 28, Gly29, 30 Thr31]-VIP cyclo (Lys^-rAsp25) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2]	0.077
Ac-[G1u8, Lys12, Nle17, Asp25. Leu26, Lys27'28, Gly29' “, Thr3,]-VIP cyclo (Lys21-»Asp25) [Ac-ÍSEQ ID NO:68)-NH2]	0.04
Ac-[Lys'\ Nle17, Alá19, Asp25, Leu26, Lys27·28, Ala29 31]-VIP cyclo (Lys21-> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH2]	0.04

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (85)

1. (I) általános képletű [X-(SEQ ID N02)-Y] jelű ciklikus peptidek - ahol

R₈ jelentése Asp, Glu vagy Lys; R₁₂ jelentése Arg, Lys, Orn vagy Asp; R_l7 jelentése Met vagy Nle; R₂₆ jelentése Ile vagy Val; R₂₈. jelentése Asn vagy Thr; X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino-védőcsoport; Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálható karboxi-védőcsoport vagy ezek gyógyászatilag alkalmas sói.

2. Az 1. igénypont szerinti ciklikus peptidek, azzal jellemezve, hogy R_]7 jelentése Nle; R₂₆ jelentése Val és R₂₈ jelentése Thr.

3. A 2. igénypont szerinti Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Asp⁸—»Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂] ciklikus peptidek.

4. A 2. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸. Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Glu⁸->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21 )-NH₂] ciklikus peptidek.

5. A 2. igénypont szerinti Ac-lOrn¹², Nle¹⁷, Val²⁶. Thr²⁸]-VIP ciklo (Asp^s->Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂] ciklikus peptidek.

7. A 2. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Orn¹². Nle¹⁷, Val²⁶. Thr²⁸]-VIP ciklo (Glu⁸->Om¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂] ciklikus peptidek.

8. (II) általános képletű [X-(SEQ ID N0:4)-Y] jelű ciklikus peptidek - ahol

R_g jelentése Asp vagy Asn; R₁₇ jelentése Met vagy Nle; R₂₆ jelentése Ile vagy Val; R₂₈ jelentése Asn vagy Thr; X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino-védőcsoport; Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálható karboxi-védőcsoport vagy ezek gyógyászatilag alkalmas sói.

9. A 8. igénypont szerinti Ac-[Asn⁸, Asp⁹, Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶. Thr²⁸]-VIP ciklo (Asp⁹->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH₂] ciklikus peptidek.

10. (Ili) általános képletű [X-(SEQ ID N0;6)-Y] jelű ciklikus peptidek - ahol

R₁₇ jelentése Met vagy Nle; R₂₆ jelentése Ile vagy Val; R₂₈ jelentése Asn vagy Thr; X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino-védőcsoport; Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálható karboxi-védőcsoport vagy ezek gyógyászatilag alkalmas sói.

11. A 10. igénypont szerinti Ac-[Lysⁱ², Glu¹⁶, Nle¹⁷, Val²⁶. Thr^lNH2]8]-VIP ciklo (Lys¹²->Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂] ciklikus peptidek.

12. (IV) általános képletű [X-(SEQ ID NO;8)-Y

15 jelű ciklikus peptidek - ahol

R₁₂ jelentése Arg vagy Lys; R_]7 jelentése Met vagy Nle; R_M jelentése Ile vagy Val; jelentése Asn vagy Thr; X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino-védőcsoport; Y jelentése hidroxicsoport vagy

20 hidrolizálható karboxi-védőcsoport vagy ezek gyógyászatilag alkalmas sói.

13. A 12. igénypont szerinti Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁴. Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²⁰—> Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂] ciklikus peptidek.

25

14. (V) általános képletű [X-(SEQ ID NO10)-Y] jelű ciklikus peptidek ahol R| jelentése His, N-CH₃-Ala; R₂ jelentése Ser vagy Alá; R₆ jelentése egy (I) általános képletű csoport, melyben Q jelentése kis szénatomszámú alkil-ciklohe30 xil vagy kis szénatomszámú alkil-aril csoport R₈ jelentése Asp, Glu vagy Alá; R_]() jelentése Tyr vagy R^-tal azonos; R,₂ jelentése Arg vagy Lys; R]₆ jelentése Gin vagy Alá; R₁₇ jelentése Met,. Nle vagy Alá; R_l9 jelentése Val vagy Alá; R₂₂ jelentése Tyr vagy R^-tal azo35 nos; R₂₄ jelentése Asn vagy Alá: R₂₆ jelentése Ile, Val, vagy Leu; R₂₇ jelentése Leu vagy Lys, R_2g jelentése Asn, Thr vagy Lys, X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino védőcsoport, Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálható karboxi védőcsoport, vagy

40 R₂₉-R_3O-R₃₁-Z, ahol R₂₉ jelentése Gly vagy Alá; R₃₀ jelentése Gly vagy Alá; R₃| jelentése Alá, Met, Cys(Acm), vagy Thr; Z jelentése hidroxilcsoport vagy egy hidrolizálható karboxi-védőcsoport - vagy ezek gyógyászatilag alkalmas sói.

45

15. A 14. igénypont szerinti ciklikus peptid, amelyben Q jelentése metil-ciklohexil-csoport.

16. A 14. igénypont szerinti ciklikus peptid, amelyben Q jelentése C|„₂-alkil-aril-csoport.

17. A 16. igénypont szerinti ciklikus peptid, amely50 ben Q jelentése Ci_₂-alkil-fenil-csoport, amelyben a fenilgyűrű helyettesítetlen vagy egyszer vagy többször OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, NO₂, NH₂, N(CH₃)₂, NHCOCH₃, NHCOC₆H₅ vagy C(CH₃)₃ csoporttal helyettesített.

55

18. A 16. igénypont szerinti olyan ciklikus peptid, amelyben Q jelentése C|_₂-alkil-naftil-csoport, amelyben a naftilgyűrű helyettesítetlen vagy OH, OCH₃, F, Cl, I. CH,, CF₃, NO₂, NH₂. N(CHj₂, NHCOCHj, NHCOC₆H₅ vagy C(CH₃)₃ csoporttal egyszeresen

60 vagy többszörösen helyettesített.

HU 211 534 A9

19. A 14. igénypont szerinti olyan ciklikus peptidek, ahol R₂₆ jelentése Val és Ris jelentése Thr [X(SEQ IDNO:11)-Y].

20. A 14. igénypont szerinti olyan ciklikus peptidek, ahol R₁₇ jelentése Nle; R₂₆ jelentése Val és R₂₈ jelentése Thr [X-(SEQ ID NO: 12)-Y],

21. A 14. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Orn¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—^Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂] ciklikus peptid.

22. A 20. igénypont szerinti olyan ciklikus peptidek, ahol R,₂ jelentése Leu; R₎₇ jelentése Nle; R₎₉ jelentése Alá; R_2fi jelentése Val és R₂₁< jelentése Thr [X-)SEQ ID NO;13)-Y],

23. A 22. igénypont szerinti Ac-[2-Nal¹⁰, Leu¹², Nle'⁷ Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹ —» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO;35)-NH₂] ciklikus peptid.

24. A 22. igénypont szerinti Ac-fO-Me-Tyr¹⁰, Leu¹², Nle¹⁷. Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²'->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂] ciklikus peptid.

25. A 22. igénypont szerinti Ac-[p-F-Phe⁶, p-NH₂Phe¹⁰, Leu¹². Nle¹⁷. Alá'⁹. Asp²⁵. Val²⁶. Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH₂] ciklikus peptid

26. A 20. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R|2 jelentése Lys; R₎₇ jelentése Nle; R₂₍, jelentése Val R₂₈ jelentése Thr [X-(SEQ ID NÖ:14)-Y].

27. A 26. igénypont szerinti Ac-[Lys¹². Nle¹⁷, Asp²⁵. Va)²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹-. Asp²⁵) [Ae-(SEQ ID NO:28)-NH₂] ciklikus peptid.

28. A 26. igénypont szerinti Ac-(p-F-Phe⁶, 2-Nal¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷. Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹' -’°, Met”]-VIP ciklo (Lys^2l-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂] ciklikus peptid.

29. A 26 igénypont szerinti Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸. Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹ Thr-’¹]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂] ciklikus peptid.

30. A 20. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R,₂ jelentése Lys; R_[7 jelentése Nle; R₁₉ jelentése Alá; R_?h jelentése Val és R_2ít jelentése Thr [X-(SEQ ID N0;15)-Y],

31. A30. igénypont szerinti Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²'-+Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂] ciklikus peptid.

32. A 30. igénypont szerinti Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹². Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹· Cys(Acm)^5l]-VIP (1 —31 )-NH2 ciklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2] ciklikus peptid.

33. A 30. igénypont szerinti Ac-[Ala², Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵. Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO.33)-NH₂] ciklikus peptid.

34. A 30. igénypont szerinti Ac-JN-Me-Ala¹, Lys¹², Nle¹⁷. Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr^2S]-VIP ciklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO;34)-NH₂] ciklikus peptid.

35. A 30. igénypont szerinti Ac-JO-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸,l-VIP ciklo (Lys²'—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO;41)-NH₂] ciklikus peptid.

36. A 30. igénypont szerinti Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹. Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VlP ciklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂] ciklikus peptid.

37. A 30. igénypont szerinti Ac-[1-Nal⁶, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO;50)-NH₂] ciklikus peptid.

38. A 30. igénypont szerinti Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂] ciklikus peptid.

39. A 30. igénypont szerinti Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, m-OCHj, Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸,]-VIP ciklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH₂] ciklikus peptid.

40. A 30. igénypont szerinti Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr^J-VIP ciklo (Lys²'—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂] ciklikus peptid.

41. A 30. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸. Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵. Val²⁶. Thr²⁸. Gly²⁹· Thr]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂] ciklikus peptid.

42. A 14. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₂₆ jelentése Leu és R₂₇ és R_2g mindegyike Lys [X-(SEQIDNO:16)-YJ.

43. A 42. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R|₂ jelentése Lys; R₎₇ jelentése Alá; R_]9 jelentése Alá; R₂₆ jelentése Leu és R₂₇ és R_2e mindegyike Lys [X-[SEQ ID NO:17)-Y],

44. A 43. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Lys¹², Alá¹⁶· ¹⁷· '⁹, Asp²⁵, Leu²⁶. Lys²⁷- ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂] ciklikus peptid.

45. A 43. igénypont szerinti Ac-[Ala⁸, Lys¹²,

Alá¹⁶· *⁷· ’⁹, Alá²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂] ciklikus peptid.

46. A 43. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Lys¹²,

Alá^{16 17} '⁹, Alá²⁴, Asp²⁵. Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH₂] ciklikus peptid.

47. A 42. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol Rí? jelentése Lys; R|₇ jelentése Nle; R₂₆ jelentése Leu és R₂₇ és R²⁸ mindegyik Lys [X-(SEQ ID NO:I8)-Y],

48. A 47. igénypont szerinti Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵. Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸, Gly²⁹· ’°, Thr”]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH₂] ciklikus peptid.

49. A 47. igénypont szerinti Ac-[Giu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶. Lys²⁷· ²⁸, Gly²⁹· ³⁰. Thr³¹]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH₂] ciklikus peptid.

50. A 47. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R,₂ jelentése Lys; R]₇ jelentése Nle; R,₉ jelentése Alá; R₂₆ jelentése Leu és R₂₇ és R_2g mindegyike Lys (X-(SEQ ID NO:19)-Y],

HU 211 534 A9

51. Az 50. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R,₂ jelentése Lys; R_lé jelentése Gin; R₁₇ jelentése Nle; R₁₉ jelentése Alá; R₂₆ jelentése Leu és R₂₇ és R₂₈ mindegyike Lys [X-(SEQ ID NO:70)-Y],

52. A 51. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₂ jelentése Ser; R₎₂ jelentése Lys; R_l6 jelentése Gin; Rn jelentése Nle; R₁₉ jelentése Alá; R_2Í jelentése Leu és R₂₇ és R^ mindegyike Lys [x-(SEQ ID NO:71)-Yj.

53. A 52. igénypont szerinti Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27, 28}]-VIP ciklo (Lys²¹—» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂] ciklikus peptid.

54. Az 52. igénypont szerint Ac-[N-Me-Ala', Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂] ciklikus peptid.

55. Az 52. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH₂] ciklikus peptid.

56. A 52. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27 2S}, Ala²⁹'^3l]-VIP ciklo (Lys^2l->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂] ciklikus peptid.

57. A 52. igénypont szerinti Ac-fN-Me-Ala¹, Glu⁸. Lys¹². Nle¹⁷. Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂] ciklikus peptid.

58. Az 52. igénypont szerinti Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸. Lys¹². Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶. Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂] ciklikus peptid.

59. Az 52. igénypont szerinti Ac-[1-Nal⁶. Glu⁸, Lys¹². Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶. Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂] ciklikus peptid.

60. Az 52. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, p-NH₂Phe¹⁰. Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂] ciklikus pepiid.

61. Az 52. igénypont szerinti Ac-[Glu^s, O-MeTyr¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹-+Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂] ciklikus peptid.

62. Az 52. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸„ Gly^{29, 30}, Thr⁵¹]VlPciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NHJ ciklikus peptid.

63. Az 52. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸. Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, m-OCH₃-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27 28}]VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NHJ ciklikus peptid.

64. Az 52. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, m-F-L-Tyr²²,, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂] ciklikus peptid.

65. Az 52. igénypont szerinti Ac-[Ala⁸ Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹. Alá²⁴. Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NHJ ciklikus peptid.

66. Az 52. igénypont szerinti Ac-fLys¹², Nle¹⁷,

Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27, 28}, Ala^29_31]-VIP ciklo (Lys^2l-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂] ciklikus peptid.

67. Az 52. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₂, jelentése Alá; R₁₂ jelentése lys; R_]6 jelentése Gin; R,₇ jelentése Nle; R_]9 jelentése Alá; R²⁶ jelentése Leu és R₂₇ és R_2g mindegyike Lys [X-(SEQ ID NO:72)-Y],

68. A 67. igénypont szerinti Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸, Ala²⁹“³¹]-VIPciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NHj] ciklikus peptid.

69. A 67. igénypont szerinti Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27 28}, Gly²⁹· ^M, Thr³¹]VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂] ciklikus peptid.

7CUA67. igénypont szerinti Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹-» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂] ciklikus peptid.

71. Az 50. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R,₂ jelentése Lys; R,₆ jelentése Alá; R|₇ jelentése Nle; R_]9 jelentése Alá; R₂₆ jelentése Leu és R₂₇ és R₂₆ mindegyike Lys [X-)SEQ ID NO:73)-Y],

72. A 71. igénypont szerinti Ac-[Ala⁸, Lys¹², Alá¹⁶, Nle¹⁷, Alá¹⁹, Alá²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂] ciklikus peptid.

73. A 71. igénypont szerinti Ac-[Glu⁸, Lys¹², Alá¹⁶, Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶. Lys²⁷· ²⁸]-VIP ciklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH₂] ciklikus peptid.

74. Az 1., 8., 10., 12. vagy 14. igénypontok bármelyike szerinti ciklikus peptid, mint gyógyászati hatóanyag.

75. Az 1., 8., 10., 12. vagy 14. igénypontok bármelyike szerinti ciklikus peptid. mint hörgtágító.

76. Az Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸, Gly²⁹·³⁰, Thr^3l]-VIP ciklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂] ciklikus peptid, mint gyógyászati hatóanyag.

77. Az Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27 28}. Gly^{29 30}, Thr^3l]-VIP ciklo (Lys²¹-*Asp²⁵) fAc-(SEQ ID NO:52)-NH₂] ciklikus peptid, mint hörgtágító.

78. Eljárás az 1., 8., 10., 12. vagy 14. igénypontok bármelyikében igényelt ciklikus peptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy védett és gyantához kötött megfelelő aminosav szekvenciájú peptid védőcsoportjait szelektíven eltávolítjuk, hogy oldalláncbeli szabad aminocsoportot és oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kapjunk;

(b) az oldalláncbeli szabad aminocsoportot és az oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kovalensen összekötjük egy megfelelő amidképző reagenssel; és (c) eltávolítjuk a védőcsoportot és a gyűrűs peptideket lehasítjuk a gyantáról megfelelő védőcsoport eltávolító és hasító reagenssel, kívánt esetben további adalékanyagok, például kation eltávolítók jelenlétében, és

HU 211 534 A9 kívánt esetben a gyűrűs peptidekel gyógyászatilag alkalmas sóvá alakítjuk.

79. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-73. igénypontok bármelyikében igényelt ciklikus peptidet és nem-toxikus, inért, gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.

80. Gyógyászati készítmény, bronchotracheális összehúzódással kapcsolatos rendellenességek kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 1-73. igénypontok bármelyikében igényelt ciklikus peptidet és nem-toxikus, inért, gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.

81. Az 1-73. igénypontok bármelyike szerinti ciklikus peptidek felhasználása különböző rendellenességek kezelésére.

82. Az 1-73. igénypontok bármelyike szerinti ciklikus peptidek felhasználása bronchotracheális összehúzódással kapcsolatos rendellenességek kezelésére.

83. Az 1-73. igénypontok bármelyike szerinti cikli5 kus peptidek, azzal jellemezve, hogy azokat a 78.

igénypont szerinti eljárással állítottuk elő.

84. Új peptidek, ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetésre kerültek.

85. Új eljárás ciklikus peptidek előállítására, aho10 gyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetésre került.

86. Új gyógyászati készítmények, ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetésre kerültek.

87. Az 1-73. igénypontok bármelyike szerinti ciklikus peptidek új felhasználása, ahogyan a jelen szaba15 dalmi leírásban ismertetésre került.