HUT62606A - Process for producing cyclic vasoactive peptides - Google Patents

Description

Ez a találmány vazoaktív peptid (VIP) analóg ciklikus peptidekre vonatkozik, valamint ezen ciklikus peptideket tartalmazó gyógyszerkompozíciókra. Ezeket a gyógyszerkompozíciókat légúti összehúzódási rendellenességek kezelésére használják.

A vazoaktfv intesztinális pepiidet (VIP) először a disznóbélben fedezték fel, abból izolálták és tisztították. [3,879,371 számú Egyesült Államok-beli szabadalom]. A peptid huszonnyolc (28) aminosavból áll, és erősen emlékeztet a szekretinre és a glukagonra. [Carlquist et al, Horm. Metab. Rés., 14, 28-29 (1982)].A VIP aminosav szekvenciájának, jele 1(SEQIDNO:1)-NH2J.

Ismeretes, hogy a VIP sokféle, biológiai hatást gyakorol az emésztőszervekre és a keringési rendszerre. Kimutatták, hogy mivel a VIP hasonlít a gasztrointesztinális hormonokhoz, serkenti a pankreatin és az epe kiválasztást,a glukagon és inzulin kiválasztást valamint aktiválja a hasnyálmirigy bikarbónát kiválasztását. [Kerrins, C. és Said, S. I., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 142, 1014-1017 (1972); Domschke, S., et al., Gastroenterology, 73„ 478-480 (1977)].

VÍP-et tartalmazó neuronokat mutattak ki a belső és külső elválasztású rendszerek, a bél és a sima izomzat sejtjeinek immunológiai vizsgálatával.[Polák, J. M. et al., Gut, 15, 720-724 (1974)]. Azt is kimutatták, hogy a VIP az idegrendszerre hat azzal, hogy különböző hormonok elválasztását idézi elő, például a prolaktinét [Frawley, L. S., et al., Neuroe-ndocrinoiogy, 33, 79=83 (1981)], a tíroxinét [Ahrr-n, B. et al,

- 3 Natúré, 287, 343-345 (1980)], továbbá az inzulinét és a glukagonét [Schebalin, M. et al., Am. J. Physiology E., 232, 197-200 (1977)]. A VIP ezen kívül a vese renin kiválasztását is stimulálja in vivő és in vitro. [Porter, J. P. ei al., Neuroendocrinology, 36, 404-408 (1983)]. A VIP jelenlétét kimutatták többféle állatfaj és az ember légútjainak idegeiben és idegvégződéseiben. [Dey, R. D. és Said, S. I., Fed. Proc., 39, 1062 (1980); Said, S. I. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)]. A VIP kardiovaszkuláris és bronchopulmonáris hatása is jelentős, mert a VIP hatásos értágítónak és simaizom relaxánsnak bizonyult. Hatását a perifériás, pulmonáris és koronária érrendszerre fejti ki. [ Said, S. I. ,et al., Clin. Rés., 20, 29 (1972)]. A VIP értágító hatást gyakorol az agyi erekre is. [Lee, T. J. és Berszin, I., Science, 224, 898-900 (1984)]. ín vitro kísérletekkel kimutatták, hogy a vazoaktív intesztinális peptid az agyi artériákba kívülről bejuttatva értágító hatású volt. A VIP ezért a cerebrális vazodilatáció egyik lehetséges transzmittere. [Lee, T. és Saito, A., Science, 224, 898-901 (1984)]. A VIP a szem ereire is erőteljes értágító hatást gyakorol. [Nilsson, S. F. E. és Bili, A. Acta Physiol. Scand., 121, 385-392(1984)].

Lehetséges, hogy a VIP-nek szabályozó hatása van az immun rendszerre. O Dorisio és mások kimutatták, hogy a VIP befolyásolhatja a limfociták szaporodását és migrációját. [J. Immunoi., 135, 792s-796s (1985)].

Mivel a VIP simaizom relaxánsnak bizonyult, és mint említettük, rendszerint jelen van a légúti szövetekben, feltételezték, hogy a VIP a hörgők simaizom relaxációjának endogén mediátora lehet. [Dey, R. D., és Said, S. I. Fed. Proc., 39, 1962 (1980)]. Kimutatták, hogy asztmás betegektől nyert szövetek nem tartalmaznak immunaktív VlP-et, ellentétben a más betegektől nyert szövetekkel. Ez talán a VIP vagy a VlP-érzékeny idegvégződések hiányára utal az asztma betegséggel összefüggésben. [Ollerenshaw, S. etal, New England J. Med., 320, 12441248 (1989)]. VIP-pel végzett in vivő és in vitro igazolták, hogy a VIP elernyeszti a légcső sima izmait, és védelmet nyújt olyan hörgőösszehúzó anyagokkal szemben mint a hisztamin vagy a proszataglandin P2a· [Wassermann et al, Vasoactive Intestinal Peptid, S.I. Said, kiadó, Raven Press, N. Y. 1982, 177-184; Said, S. I. etal. Ann. N. Y. Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)]. Intravénásán adva a VIP védelmet nyújt a hörgőösszehúzó anyagokkal szemben, mint a hisztamin, proszataglandin E'2a, leukotriének, valamint a hörgők antigénekkel kiváltott összehúzódása. [Said, S. I. et al, supra, (1982)]. A VIP in vitro gátolta az emberi légutak sejtjeinek nyálka elválasztását is. [Coles, S. J. et al_f Am. Rév. Respir. Dis., 124, 531-536 (1981)].

Intravénás infúzió formájában adva asztmás betegeknek a VIP megnövelte íi kilégzés csúcssebességét és megvédett a hisztamin okozta hörgőtágulás ellen. [Móricé, A. H. és Sever, P. S., Peptides, 7, 279-280 (1986); Móricé, A. etal, The Láncét, H 1225-1227 (1983)]. Viszont ez az intravénás infúzió közben megfigyelt, légzőszervekre gyakorolt hatást kardiovaszkuláris mellékhatások kísérték, leginkább hipotenzió, tachikardia, továbbá az arc kipirulása, ha olyan intravénás adagokban alkalmazták, amelyeknek nem volt kardiovaszkuláris hatása, akkor a VIP a légutak áteresztőképességét sem befolyásolta. [Palmer, J. B. D., et al,

Thorax, 41, 663-666 (1986)]. Az aktivitás hiányát az adagok kis méretének tulajdonították, és valószínűleg a vegyület gyors lebontásának a következménye.

Aeroszol formában alkalmazva embernél, a természetes VEP csak elhanyagolható védőhatást mutatott a hisztamin okozta hörgő összehúzódással szemben. [Altién et al., Pharmacologist, 25, 123 (1983)]. Inhalációval alkalmazva embereknél, a VIP nem befolyásolta a légzés alapparamétereit, de volt v védőhatása a hisztamin okozta hörgő összehúzódással szemben. [Barnes, P. J. és Dixon, C. M. S., Am. Rév. Respir. Dis., 130, 162-166 (1984). Aeroszolként a VIP nem okozott sem vémyomáscsökkenést sem tachikardiát a hörgőtágulással kapcsolatban. [Said, S. I. et al., Vasoactive Intestinal Peptide, S. I. Said kiadó, Raven Press, N. Y., 1982, 185-191).

Mivel a VIP érdekes és klinikailag potenciálisan hasznos hatásokat mutatott, több szintetikus kutatási programm tárgya lett, amely programmok célja a molekula egy vagy több tulajdonságának a javítása. Takayema et al. olyan VIP analógokat írtak le, ahol a 8. helyzetben glutaminsav helyettesíti az aszparaginsavat. Ez a vegyület kevésbé volt hatásos, mint a természetes VIP. [Chem. Phann. Bull., 28, 2265-2269 (1980)]. Wendlberger et al. egy olyan VIP analóg készítését írta le, amely a 17. helyzetben norleucint tartalmaz metionin helyett. [Peptide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290-295 (1980)]- ez a peptid a természetes VTP-pel azonos hatást mutatott abban, hogyhogy a radioaktív jóddal jelzett VIP-et máj membrán készítményekből kiszorítsa. Watts és Wooton egy sor lineáris és gyűrűs VEP töredéket írt le, amelyek az eredeti szekvencia 6- G -

12.tagjait tartalmazták. [Eur. Pat. 184309 és 325044; US. Pat. 4,737,487 és 4,866,039]. Turner et al. azt találták, hogy a VIP 10-28 tagú töredékei a VIP antagonistái. [Peptides, 7, 849-854 (1986)]. A [4-Cl-D-Pheö Leu¹⁷]VIP szubsztituált származékról szintén azt találták, hogy kötődik a VIP receptorhoz,és a VIP antagonistája. Pandol, S. et al, Gastrintest. Liver Physiol., 13, G553-G557 (1986)]. Gozes et al. szerint a [LysU^o^Arg^Arg^Pro^Tyröj-VIP analóg kompetitív módon gátolja a VIP kötődését a receptorokhoz a gliasejtekben. [Endocrinology, 125, 2945-2949 (1989)]. Robberecht etal, leírtak néhány VIP analógot, ahol a természetes VIP N terminusa D tartalmú csoportokkal volt szubsztiuálva. [Peptides, 9, 339-345], Ezek az analógok kevésbé erősen kötődnek a VIP receptorhoz, és a c-AMP aktiválásban is kevésbé aktívak, mint a természetes VIP. Tachibana és Ito a prekurzor molekula néhány VIP analógját írta le. [Peptide Chem.., T. Shiba és S. Shakibara kiadók, Prot. Rés. Foundation, 1988, 481-486; Jap. Pat 1083012; U. S. Pat. 4,822,774]. Ezek a vegyületek a VIP-nél 1-3-szor erősebb hatású bronchodilátorok és

1-2-szer erősebb a vérnyomáscsökkentő hatásuk. Musso et al. is leírtak néhány VIP analógot, amelyek 6-7, 9-13, 15-17 és 19-28 helyzetekben szubsztituálva voltak. [Biochemistry, 27, 8174-8181 (1988); Eur. Pat. 8271141; U. S. Pat 4,835,252]. Ezek a vegyületek ugyanolyan vagy kisebb aktivitásúak voltak, mint a természetes VIP a receptorhoz való kötődésben és a biológiai hatásukban. Bártfai et al, egy sor szubsztituált [Leu^⁷]VEP analógot írtak le. [International Patent Application WO 89/05857].

Ez a találmány gyűrűs vazoaktív peptidekkel foglalkozik. A gyűrűs peptid olyan peptid, ahol a peptid lánc egyik aminosavjának oldalláncban

lévő karboxil terminusa kovalensen kötődik a prptídlánc másik aminosavjának oldalláncban lévő amino csoportjával, amid csoportot képezve. A peptidláncban lévő két aminosav csoport közötti kovalens kötés hozza létre a gyűrűs szerkezetet.

A gyűrűs peptidek biológiai hatása lényegesen eltérhet lineáris analógjaikétól. A gyűrűs peptidek szerkezete merevebb, és több jól meghatározott szerkezeti elemet tartalmaznak. Ezek a változások a gyűrűs peptidek bilógiai profiljában jelentkeznek. Egy peptid analóg ciklizálása a pepiid hatását meghosszabbíthatja,mivel a peptid megnövekedett merevsége miatt kevésbé lesz érzékeny a kémiai és enzimatikus lebontásra. A gyűrűs peptidek a biológiai rendszerek számára jobban hozzáférhetőek, mert a szerkezet merevebbé válása folytán a fizikai tulajdonságai megváltoznak. Ezenkívül a gyűrűs peptidek jól definiált alakja a lineáris peptidekénél nagyobb spéci fi tást tesz lehetővé a receptoron, így csökken a kívánt biológiai aktivitással együtt jelentkező nemkívánatos aktivitásra való képessége.

Jelen találmány vonatkozik az I képletű, [X-(SEQ ID NO:2)-Y] jelű ciklikus peptidekre, ahol Rg Asp, vagy Asn; R] 7 Met vágj' Nle; R26 Ue vagy Val; Rgg A.sn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:3)-Y] jelű peptidek, ahol X, Y, Rg és R12 jelentése az I képletben megadott.

I

A találmány vonatkozik továbbá Π képletű, [X-(SEQ ID NO:4)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol Rg Asp, vagy Asn; R17 Met vagy Nle;

R26 Ue vagy Val; R28 Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport;

vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ DD NO:5)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése az Π képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá Hl képletű, [X-lSEQ DD NO:6)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol R17 Met vagy Nle; R26 He vagy Val; R₂8 Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y lüdroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ DD NO:7)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése, az ΙΠ képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá IV képletű, [X-(SEQ ED NO:8)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol R{2 Arg vagy Lys; R17 Met vagy Nle; Rőő He vág)' Val; R28 Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X=(SBQ ID NO:9)=Y] jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése az IV képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá V képletű, [X-(SEQ ID NO:10)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol Rj jelentése His, N-CH3-Ala; R2 Ser vagy Alá; R^ jelentése (1) általános képletű csoport, amelyben Q ciklohexil-alacsony alkil vagy aril-alacsony alkil; Rg jelentése Asp, Glu vagy Alá; Rjq jelentése Tyr vagy Rg; R42 jelentése Arg vagy Lys; Rjg jelentése Gin vagy Alá; R47 jelentése Met, Nle vagy Alá; R19 jelentése Val vagy Alá; R22 jelentése Tyr vagy Rg; R24 jelentése Asn vagy Alá; R26 jelentése De, Val vagy Leu; R27 jelentése Leu vagy Lys; R28 jelentése Asn, Thr vagy Lys; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil, hidrolizálható karboxil védőcsoport vagy R29R3Q-R3I-Z; R29 jelentése Gly vagy Alá; R30 jelentése Gly vagy Alá; R31 jelentése Alá, Met, Cys(Acm), vagy Thr; Z hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Q jelentése előnyösen (2), (3), vagy (4) általános képletű csoport, ahol n=l,2; X] és X2 jelentése egymástól függetlenül hidrogén, OH, (O3. F, Cl, I, CH3, CP3, NO, Ν(ΟΗ₃)₂, NHCOCH3, NHCOC₆H5, vagy C(CH3>3.

Még előnyösebben Q jelentése benzil, p-fluoro-benzil, p-aminobenzil, p=hidroxi=benzil, o»metil, LmetiLnaftil, vagy 2-metil-naftil. legelőnyösebben Q jelentése benzil

Előnyösek az alábbi jelű peptidek: [X-(SEQ ED NO: 11)-Y], [X=(SEQ ID NO: 12)-Y], [X-(SEQ ID NO:13)-Y], [XVSEQ ID NO:14)-Y], [X10 (SEQ ID NO:15)-Y], [X-(SEQ ID NO:16)-Y], [X-(SEQ ID NO:17)-Y], [X-(SEQ ID NO:18)-Y], [X-(SEQ ID NO:19)-Y], [X-(SEQ ID NO:70)Y], [X-(SEQ ID NO:71)-Y], [X-(SEQ ID NO:72)-Y], [X-(SEQ ID

NO.*73)-Y], ahol X, Y, Rj, R2, Ró, Rg, R10’ ^R12, ^R16, ^R17, ^R1Q, ^R22>

R24 és R27 jelentése az V képletben megadott.

A legelőnyösebb gyűrűs peptid a [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2] jelű

A találmány szerinti peptidek a tracheobronchiális sima izomzat tartós relaxációját idézik elő kardiovaszkuláris mellékhatások nélkül, és ezért használhatók a hörgők összehúzódási rendellenességeinek, például asztmának a kezelésére.

A találmány a vazoaktív intesztinális peptid (VIP) olyan új analógjaira vonatkozik, amelyeknek megnövelt tartós bronchodilatációs hatása van, megfigyelhető mellékhatások nélkül.

A leírásban az alacsony alkil kifejezés 1-6 szénatomszámú, egyenes láncú vagy elágazó telített alifás szénhidrogén csoportot jelent, az alacsony alkil csoport előnyösen metil.

A leírásban az aril kifejezés mononukleáris aromás szénhidrogén csoportot jelent, például fenilt, amely lehet szubsztituálatlan vagy egy vagy több helyen szubsztituált alacsony alkil, alacsony alkoxi, amino, nitro, mono- és di alacsony alkilamino, alacsony alkil amido vagy fenilamido csoportokkal. Az aril kifejezés jelenthet továbbá polinukleáris aril csoportot is, például naftilt, amely szubsztituálva lehet egy vagy több, fent felsorolt csoporttal. Az előnyös aril csoportok a szubsztituálatlan vagy egy fluor szubsztituenst tartalmazó fenil vagy a szubsztituálatlan naftil.

A leírásban X egy szubsztituenst jelent az amino-terminális aminosav amino csoportjának nitrogénjén és Y egy szubsztituenst jelent a karboxil-terminális aminosav karbonil csoportján. X lehet hidrogén vagy egy hidrolizálható amino védőcsoport. Y lehet hidroxil vagy egy hidrolizálható karboxil védőcsoport.

Ami a hidrolizálható amino védőcsoport és a hidrolizálható karboxil védőcsoport kifejezéseket illeti, a találmány szerint bármilyen hagyományos, hidrolízissel eltávolítható védőcsoport használható. Alább bemutatunk néhány példát. Előnyös amino védőcsoportok lehetnek az (5) és (6) általános képlet szerintiek, ahol X3 alacsony alkil vagy halogénnel szubsztituált alacsony alkil. Ezen védőcsoportok közül különösen előnyösek azok, amelyekben X3 jelentése C4.3 alkil vagy haló C4.3 alkil

Előnyös karboxil védőcsoportok az alacsony alkil észterek, NH2 és alacsony alkil amidok; különösen előnyösek a Cj_3 alkil észterek, NH/ és a C[„3 alkil amidok.

Jelen találmány vonatkozik az I képletű, [X-(SEQ ID NO:2)”Y] jelű ciklikus peptidekre, ahol Rg Asp, Glu vagy Asn; R]2 Arg, Lys, Om, vagy Asp; R17 Met vagy Nle; R26 he vagy Val; ^R28 Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:3)-Y] jelű peptidek, ahol X, Y, Rg és R12 jelentése az I képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá Π képletű, [X-(SEQ ID NO:4)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol Rg Asp, vagy Asn; Rp Met vagy Nle; &26 Ile vagy Val; R2g Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:5)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése az Π képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá ΠΙ képletű, [X-(SEQ ID NO:6)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol Rp Met vagy Nle; R26 He vagy Val; R28 Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidrolizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidrolizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:7)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése az Hl képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá IV képletű, [X=(SEQ ID NO:8)=Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol Rp Arg vagy Lys; Rp Met vagy Nle;

- 13 R₂6 H^c vagy Val; R28 Asn vagy Thr; X hidrogén vagy hidroiizálható amino védőcsoport; Y hidroxil vagy hidroiizálható karboxil védőcsoport;

vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Előnyösek az [X-(SEQ ID NO:9)-Y] jelű peptidek, ahol X, és Y, jelentése az IV képletben megadott.

A találmány vonatkozik továbbá V képletű, [X-(SEQ ID NO:10)-Y] jelű új ciklikus peptidekre is, ahol Rj jelentése His, N-CH3-Ala; R2 Ser vagy Alá; jelentése (1) általános képletű csoport, amelyben Q ciklohexil-alacsony alkil vagy aril-alacsony alkil; Rg jelentése Asp, Glu vagy Alá; Riq jelentése Tyr vagy R5; Rj₂ jelentése Arg vagy Lys; R^g jelentése Gin vagy Alá; R17 jelentése Met, Nle vagy Alá; R19 jelentése Val vagy Alá; R₂₂ jelentése Tyr vagy Rg; R24 jelentése Asn vagy Alá; R₂6 jelentése De, Val vagy Leu; R₂7 jelentése Leu vagy Lys; R₂g jelentése Asn, Thr vagy Lys; X hidrogén vagy hidroiizálható amino védőcsoport; Y hidroxil, hidroiizálható karboxil védőcsoport vagy R₂gR3O-R3I-Z; R₂9 jelentése Gly vagy Alá; R3Q jelentése Gly vagy Alá; R31 jelentése Alá, Met, Cys(Acm), vagy Thr; Z hidroxil vagy hidroiizálható karboxil védőcsoport; vagy ezek gyógyászatilag alkalmazható sói.

Q jelentése előnyösen (2), (3), vagy (4) általános képletű csoport, ahol n=l,2; Xj és X₂ jelentése egymástól függetlenül hidrogén, OH, OCH3, F, Cl, I, CH3, CF3, NO, N(CH₃)₂, NHCOCH3, NHCOC₆H₅, vagy C(CH₃)₃.

Még előnyösebben Q jelentése benzil, p-fluoro-benzil, p-aminobenzil, p-hidroxi-benzil, o-metil, 1-metil-naftil, vagy 2-metil-naftil. Legelőnyösebben Q jelentése benzil

Előnyösek az alábbi jelű peptidek: [X-(SEQ ID NO:11)-Y], [X-(SEQ JD NO:12)-Y], [X-(SEQ ÍD NO:13)-Y], [X-(SEQ ID NO:14)-Y], [X(SEQ ID NO:15)-Y], [X-(SEQ ID NO:16)-Y], [X-(SEQ ID NO:17)-Y], [X-(SEQ ID NO:18)-Y], [X-(SEQ ID NO:19)-Y], [X-(SEQ ID NO:70)Y], [X-(SEQ ID NO:71)-Y], [X-(SEQ ID NO:72)-Y], [X-(SEQ ID NO:73)-Y], ahol X, Y, Rj, R2, Rg, Rg, R1(), R12, ^Rló> ^R17> ^R19> ^R22R24 és R27 jelentése az V képletben megadott.

A találmány tárgya továbbá eljárás az említett peptidek készítésére, az említett peptideket tartalmazó gyógyászati készítmények készítésére, valamint ezen peptidek és nem toxikus, inért hordozóanyagok használatát bronchotracheális összehúzódást rendellenességek kezelésére. A gyűrűs polipeptidek említett készítési eljárását az jellemzi, hogy (a) egy védett és gyantához kötött megfelelő aminosav szekvenciájú peptid védőcsoportjait szelektíven eltávolítjuk, hogy oldaliáncbeli szabad amino csoportot és oldalláncbeli szabad karboxil csoportot kapjunk.

(b) az oldalláncbeli szabad amino csoportot és az oldalláncbeli szabad karboxil csoportot kovalensen összekötjük egy megfelelő amidképző reagenssel.

(c) eltávolítjuk a védőcsoportot és a gyűrűs peptideket lehasítjuk a gyantáról megfelelő védőcsoport eltávolító és hasító reagenssel, szükség esetén további adalékok, például kation eltávolítók jelenlétében, és szükség esetén a gyűrűs peptideket gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.

Ennek a találmánynak a tárgya továbbá az említett gyűrűs peptidek használata olyan gyógyszerkompozíciók előállítására amelyeket bronchotracheális összehúz ódási rendellenességek kezelésére használnak.

A peptidek elnevezésének nomenklatúrája megfelel a szokásosan használtnak, amikor is az N-terminális amino csoport van a baloldalon és a C terminális karboxil csoport a jobboldalon. A természetes aminosav kifejezés a fehérjékben természetben előfordulóaminosavak egyikét jelenti, vagyis lehet Gly, Alá, Val, Leu, He, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp, és His. Ahol az aminosavnak izomer formái léteznek, az aminosavak L izomerjeiről beszélünk, hacsak kifejezetten meg nem nevezzük a másikat.

Az alábbiakban felsoroljuk azokat a rövidítéseket és jeleket, amelyek a fentieken kívül további aminosavakat, védőcsoportokat, oldószereket és más hasonlókat jelentenek.

Jel Jelentés

Ac. Acetil

Orn

Ornitin — 16

Nle	Norleucin
Pmoc	9-Fluorenilmetiloxikarbonil
Pm	9-Fluorenilmetil
Boc	t-Butiloxikarbonil
Bőm	Benziloximetil
CH2C12	Diklórmetán
CH3CN	Acetonitril
DMF	Dimetilformamid
DIPEA	N,N-diizopropiletilamin
TPA	Trifhiorecetsav
HOBT	N - Hidroxibenzotriazol
DCC	N,N diciklohexilkarbodiimid
DIC	N,N Diizopropilkarbodiimid
BOP	Benzotriazol-1 -iloxi-tri- (dimetilamino)foszfónium hexafluorofoszfát
N-Me-Ala	ld. a (7) számú képletet
2-Nal	Id. a (8) számú képletet
P-Phe	ld. a (9) számú képletet
PAB-MS	Gyors atom bombázásos tömegspektrometria

A természetes VIP peptidszekvenciájának analógjait úgy jelöljük, hogy a helyettesítő aminosavat szögletes zárójelbe, tesszük a VIP előtt. Az N-terminális amino csoport szubsztituenseit, vagyis X-et a fenti példákban a zárójelben lévő szubsztituenstől halra írjuk. A zárójelbe, tett szekrvenci ászárnak a Vlfjobboldalán ami nn savak eltávolítását vagy hozzáadását jelentik a természetes szekvenciához képest. Például, Ac[T,ys^,Nleh^G1y^]-VIP(l-29)-NH2 egy olyan polipeptidet jelent, amelyben az aminosav szekvencia megfelel a természetes emberi VIP-nek azzal a különbséggel, hogy az N terminuson hidrogén helyett acetil csoport van, az. arginin helyett egy lizint tartalmaz 12-es helyzetben, egy norleucint a metionin helyett 17-es helyzetben. Ezenkívül egy glicin van kapcsolva a 28-as aszparagin karboxil csoportjához, és ez a 29-es helyzet. Az OH és az NH2 jelek a VIP után vagy zárójelben a polipeptid szabad sav illetve amid formáját jelzik. Tulajdonképpen egyiket sem használtuk, a kifejezés mindkét formát jelentheti.

Mint már említettük, a gyűrűs peptid kifejezés a leírásban azt jelenti, hogy a peptid egyik aminosavjának oldalláncbeli karboxil csoportját kovalensen kötjük a peptidlánc egy másik aminosavjának oldalláncbeli amino csoportjához amid kötés képzésével. A gyűrűs peptídekre többféle elnevezést használhatunk. Alább felsorolunk néhány példát.

[Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2] jelű, (a) képletű [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂] jelű, (b) képletű [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2] jelű, (c) képletű

A bemutatott háromféle (a-c) képletű szerkezet, a velük együtt alkalmazott SEQ ID NO: és a szekvencia lista ugyanazt a polipeptidet jelenti és határozza meg, amelynek az aminosav szekvenciája megfelel a természetes emberi VIP-nek, amelyben az N terminuson egy hidrogént acetil csoport helyettesít, a 12-es helyzetben egy arginint lizin helyettesít, a 17--es helyzetben egy metionint norleucin helyettesít, a 26=os helyzetben egy izoleucint valin helyettesít és a 28-as helyzetben egy aszparagint treonin helyettesít. Ezenkívül amidkötés jött létre a 8-as helyzetű aszparaginsav oldalláncbeli karboxilja és a 12-es helyzetű lizin oldalláncbeli amino csoportja között, és így gyűrűs peptid analóg keletkezett.. A peptidszerkezet fenti jelölései egyenértékűek és felcserélhetők.

A leírásban R_n n helyzetű aminosavat jelent valamelyik bemutatott szerkezetben és X_íia n helyzetű aminosavat jelent a megfelelő szekvenciában az alábbi szekvencia lista szerint; ezek egyenértékűek és felcserélhetők azokban az esetekben, ahol Xaa két vagy több aminosav közötti választást jelent.

A találmány szerinti ciklikus peptidekben a következő konfigurációkat használjuk, hacsak másképp nem említjük.

Aminosav a	Aminosav terminus, amely
láncban	gyűrűs peptidet képez
Lys	ε amino (e=epszilon)
Orn	δ amino (ö=delta)
Asp	β karboxil (p=béta)
Glu	γ karboxil (y=gamma)

Az ezen találmány szerinti vegyületek közé tartoznak az alább felsorolt aminosav szekvenciákat tartalmazó peptidek:

Ac- [Lys¹², Nle¹⁷ _f Val²⁸, Thr²⁸ ] -VIP cyclo (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Glu⁸->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH21

Ac- [Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Asp⁹—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH21

Ac-[Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Asp⁸—»Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH2)

Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys⁸—>Asp¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH2)

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Glu⁸->Orn¹²) [Ac-(SEQ ID N0:25)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys¹²->Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID N0:26)-NH2]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²^,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²^—»Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH21

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH21

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂] '· *·*Λ • · * » · ♦ ·* · » · »«· • · Λ « » — ······«·

- 20 Ac- [p-F-Phe⁶, 2-Nal¹^,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸,Gly2⁹<30,Met31]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH21

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH2]

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,

Gly²9,30,Qy_S(Acm)²¹]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH21

Ac-[Alá²,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁸,Asp²⁸,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH2)

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo(Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH2]

Ac-[2-Nal¹⁸,Leu¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val^{2 6},Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH2]

Ac-[O-CH3~Tyr¹3,Leu¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH2]

Ac-[p-F-Phe⁶,p-NH₂-Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH2Í < ·· ♦· ♦·* • · · ··< * · #

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂1

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²5) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH₂]

Ac-[O-Me-Tyr¹Q,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Alá^{2 9-21}]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²5,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Alá²⁹”²¹]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]

Ac-[N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:46)-NH₂]

Ac- [Glu⁸,p-NH₂-Phe¹Q, Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²8 j _ VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]

Ac- [Glu⁸,0-CH^-Tyr¹^ Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH₂]

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂J

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂]

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷' ²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,m-OCH3-Tyr²²,Asp²⁵,Val^{2 6},Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Val²®, Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂)

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,m-OCHg-Tyr²²,Asp²5, Leu^{2 6},

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂]

Ac-[Alá⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Alá²⁴, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Alá¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu^{2 6},Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂]

Ac-[Alá⁸,Lys¹²,Alá¹⁶,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂]

Ac-[Alá⁸,Lys¹²,Alá¹⁶'¹⁷'¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'^{2 8}]-VIP cyclo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂] !*« ·«··4* • ·· Λ ··· · · · • · · · » ··· 99 r,99

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Alá¹⁶,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Alá¹⁶'¹⁷'¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸' Gly²⁹' ³⁰,Thr³¹]VIP cyclo (Lys²¹-4Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,

Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys^¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂]

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹-4Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH₂] *

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Alá^29-31]-VIP cyclo (Lys^¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂] • ·< *· ···· 4· · · · * ··· · · · «·« • * · · · ··· ·« * ··

A találmány szerinti vegyületek nehézség nélkül előállíthatók bármilyen hagyományos módszerrel, amellyel peptidkötés alakítható ki aminosavak között, Ilyen hagyományos módszer például bármilyen folyadékfázisú eljárás, amely szerint egy aminosavnak, amelynek karboxil csoportja vagy más reaktív csoportja védve van, a szabad amino csoportja kondenzálhat egy másik aminosavnak, amelynek az amino csoportja vagy más reaktív csoportja védve van, a primer karboxil csoportjával.

A találmány szerinti vegyületek szintézisére szolgáló eljárást meg lehet valósítani úgy, hogy az aminosavakat a kívánt szekvenciának megfelelően egyenként adjuk egy másik aminosavhoz vagy származékához, vagy úgy is, hogy hagyományos módon peptid részleteket állítunk elő a kívánt szekvenciával, majd összekapcsoljuk, hogy a kívánt peptidet eredményezze.

A találmány szerinti új vegyületek előállítására szolgáló egyik ilyen hagyományos módszer például magában foglalhat bármilyen szilárd fázisú peptidszintézist. Eszerint a módszer szerint az új vegyületek szintézise, úgy megy végbe, hogy a kívánt aminosav csoportokat a szekvenciának megfelelő sorrendben egyenként kapcsoljuk a növekvő peptidlánchoz, a szilárd fázisú módszerek általános alapelveinek megfelelően. [Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149'2154 (1963); Bárány The

Pe-ptides, Analysis, Synthesis, and Biology, Vol. 2, Gross, e. és Meienhofer, J. kiadók, Academic Press, 1-284 (1980)].

A peptidszintézis általános módszere szerint az aminosav magok oldalláncában lévő reaktív csoportokat védik olyan megfelelő védőcsoportokkal, amelyek neggátolják a reaktív csoportok kémiai reakcióit, amíg a védőcsoportot végül eltávolítják. Általános módszer, hogy egy szabad aminosavon vagy egy oligopeptiden a szabad amino csoportot védik, míg a molekulája a karboxil csoportjánál fogva reagál,és ezután szelektíven eltávolítják a védőcsoportot az alfa amino csoportról, s a következő reakció ezen a ponton történhet. Bár a szilárd fázisú peptidszintézis számára kifejlesztettek néhány speciális védőcsoportot, megjegyezzük, hogy minden aminosavat meg lehet védeni a folyadékfázisú szintézisekben hagyományosan használt védőcsoportokkal.

Az alfa aminosavak megvédhetők egy megfelelő védőcsoporttal, amely lehet aromás uretán típusú, például benziloxikarbonil (Z) és szubsztituált benziloxikarbonil, például p-klórbenziloxikarbonil, p* nitrobenzi Ioxikarbonil, p-brómbenziloxikarbonil, p-bifenil-izopropiloxikarbonil, 9-fluorenilmetil-oxikarbonil (Fmoc) és p-metoxibenziloxikarbonil·, alifás uretán típusú, például t-butiloxikarbonil (Boc),diizopropilmetiloxi-karbonil, izopropiloxikarbonil és alliloxikarbonil. Az alfa amino csoport legelőnyösebb védőcsoportja a Boc.

A karboxil csoportok megvédhetők egy megfelelő védőcsoporttal, amely lehet aromás észter ,például benzil (OBzl) vagy szubsztituált benzil, amelynek szubsztituensei lehetnek alacsony alkil, halogén, nitro, tio vagy szubsztituált tio, például alacsony alkil (1*7 szénatomszámú) tio; alifás észter, például alacsony alkil, t*butil (Ot-Bu), ciklopentil, ciklohexil (OcHx), ciktoheptil és 9 fluorenilmetil (OFm). A glutaminsav (Glu) legelőnyösebb védőcsoportjai OBzl és OFm. Az aszparaginsav (Asp) legelőnyösebb védőcsoportjai OcHx, OBzl és OFm.

A hidroxil csoportok megvédhetŐk egy megfelelő védőcsoporttal, amely éter lehet, például benzil (Bzl) vagy szubsztituált benzil, amelynek szubsztituensei lehetnek alacsony alkil, halogén, például 2,6-diklórbenzil (DCB), nitro vagy metoxi; t-butil (t-Bu), tetrahidropiranil és trifenilmetil (tritil). A szerin (Ser) és a treonin (Thr) legelőnyösebb védőcsoportja a Bzl., a tiroziné (Tyr) a Bzl és a DCB.

Az oldal láncbeli aminosavak megvédhetŐk egy megfelelő védőcsoporttal, amely lehet aromás uretán típusú, például benziloxikarbonil (Z) és szubsztituált benziloxikarbonil, például pklórbenziloxikarbonil, 2-klórbenziloxikarbonil (2-C1-Z), p-nitrobenziloxikarbonil, p-brómbenziloxikarbonil, p-bifenil-izopropiloxikarbonil, 9fluorenilmetil-oxikarbonil (Fmoc) és p-metoxibenziloxikarbonil (Moz); alifás uretán típusú, például t-butiloxikarbonil (Boc), diizopropil-metíloxikarbonil, izopropiloxikarbonil és alliloxikarbonil. Az ornitin (Orn) legelőnyösebb védőcsoportja Z, a liziné (Lys) 2-C1-Z és Fmoc.

A guanidino csoportok megvédhetŐk egy megfelelő védőcsoporttal, amely lehet nitro, p-toluolszulfonil(Tos), Z, adamantiloxikarbonil és Boc. Az arginin (Arg) legelőnyösebb védőcsoportja Tos.

ί

Az oldalláncbeli amid csoportokat xantillal (Xan) védhetjük. Az aszparaginnak (Asn) és a glutaminnak (Gin) nincs előnyös védése.

Az imidazol csoportok megvédhetők megfelelő védőcsoportokkal, amely lehet p-toluolszulfonil (Tos), 9-fhiorenilmetiloxikarbonil (Frnoc), trifenilmetil (tritil), 2,4-dinitrofenil (Dnp), Boc és benziloximetil (Bőm). A hisztidin (His) legelőnyösebb védőcsoportjai Tos és Bőm.

Hacsak másképp meg nem adjuk, az. alább megadott százalékok szilárd anyagokra szilárd keverékben tömegszázalékot jelentenek, folyadékokra folyadékban térfogatszázalékot, és szilárd anyagokra folyadékban vegyes százalékot. Továbbá, hacsak másképp nem említjük, a reagensek és eszközök alább felsorolt szállítóit nem tekintjük kizárólagosnak. A szakember nehézség nélkül választhat hasonló reagenseket és eszközöket más szállítóktól.

Minden oldószert, az izopropanolt (iPrOH), a diklórmetánt (CH2CI2) és a dimetilfonnamidot (DMF) a Fischertől vagy a Burdick & Jacksontól vettük és további desztilláció nélkül használtuk. A trifluorecetsavat a Halocarbontól vettük és további tisztítás nélkül használtuk.A diizopropiletilamint (DIPEA) a Pfaltz and Bauertől vásároltuk, és használat előtt CaO-ról és ninhidrinről desztilláltuk le. A diciklohexilkarbodiimidet (DCC) és a diizopropilkarbodiimidet (DIC) a Fiukétól vásároltuk és további tisztítás nélkül használtuk. A hidroxibenzotriazol (HOBT) és azl,2-etánditiol (EDT) a Sigma Chemical Co. terméke volt és további tisztítás nélkül használtuk. A védett aminosavak általában L konfígurációjúak voltak, és vagy a Chemical Dinamics Corp. vagy a Bachem szállította őket. Ezen reagensek tisztaságát használat előtt vékonyréteg kromatográfíával, NMR-rel és olvadáspont méréssel ellenőriztük. A Boc-O-Me-Tyr-t, Boc-2-Nal-t és a Boc-p-P-Phe-t az irodalomban leírt módon állítottuk elő. [Bolin, D. R. US. Pat. Appl. 374,503]. A Boc-Asp(OFm)-et és a Boc-Glu(OPm)-et az irodalomban leírt módon állítottuk elő. [Bolin, D. R. et aL, Org. Prep. Proc. Int., 21, 67-74 (1989)]. A benzhidrilamin gyanta sztirol-1% divinilbenzol kopolimer volt (100-200 vagy 200-400 mesh), és a Biomega, a Bachem az Omni vagy az Advanced Chemtech szállította. Ezen gyanták teljes nitrogéntartalma általában 0.3-1.2 meq/g között volt.

A vékonyréteg kromatográfiát (TLC) üveg alapú, Merek gyártmányú 60 P254 szilikagél lapokon végeztük megfelelő oldószer rendszerekkel. A kimutatást UV fluoreszcenciával, jódgőzökkel vagy ninhidrines lefújással végeztük (primer és szekunder aminok esetén).

Az aminosav összetétel meghatározására a peptideket zárt, evakuált hidrolízis csőben 1-4 mg fenolt tartalmazó 6N HCl-val 115 °C-on 22-24 órán át hidrolizáltuk. Az analízist vagy egy Beckman 121M aminosav analizátoron végeztük, vagy egy Waters féle HPLC-n alapuló aminosav analizáló rendszert használtunk vagy Waters Cat Ex gyantával vagy Pierce A A511 oszloppal és ninhidrines detektálással.

A nagynyomású folyadék kromatográfiát (HPLC) egy LDC készüléken végeztük, amelynek részei voltak: Constametric I és Hl szivattyúk, egy Gradient Master nevű oldószeradagoló és keverő programm, és egy Spectromonitor ül változtatható hullámhosszú UV detektor. Az analitikai HPLC-t fordított fázisú üzemmódban végeztük, Waters pBondapak Cjg oszlopot használva (0.4x30 cm). A preparatív HPLC elválasztásokat Whatman Magnum 20 partisii 10 ODS-3 oszlopon végeztük (2x25 cm vagy 2x50 cm), amelyet Waters GuardPak Cjg előtét oszloppal szereltünk fel. A gélkromatográfiát 2x85 cm-es oszlopon végeztük LKB varioperpex perisztaltikus pumpával és IBM változtatható hullámhosszú UV detektorral.

A peptideket előnyösen a Merrifíeld által általánosan leírt [J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)] szilárd fázisú szintézissel állítottuk elő, bár ezzel egyenértékű kémiai szintézisek is alkalmazhatók, mint azt már említettük. A szilárd fázisú szintézis a peptid C terminusa felől indul el úgy , hogy egy védett alfa aminosavat egy megfelelő gyantához kapcsolunk. Ilyen kiindulási anyagot úgy kapunk, hogy egy' alfa amino csoportján védett aminosavat észter kötéssel klórmetilezett vagy hidroximetilezett gyantához kapcsolunk, vagy amid kötéssel egy benzhidrilamin (BHA) vagy para-metilbenzhidrilamin (MBHA) gyantához. A hidroximetil gyanta készítése jól ismert. A klórmetilezett gyanták a kereskedelemből beszerezhetők, és készítésük szintén jól ismert. A BHA és MBHA gyanták a kereskedelemből beszerezhetők, és általában akkor használják őket, amikor a szintetizálandó peptid szubsztituálatlan amid csoportot tartalmaz a C terminuson.

Az első aminosavat általában öoc=aminosav formában, szimmetrikus arihidrídjeként kötik a gyantához, és 2-10 ekvivalens

aktíváit aminosavat használnak a gyanta egy nitrogén ekvivalensére, a reakció után a gyantát kimossák és vákuumban szárítják. A gyanta aminosav megkötő kapacitását úgy határozzák meg, hogy a Bocaminosavas gyantából egy aliquot részt aminosavra analizálnak. Ez az érték általában 0.2-0,4 mmol/g gyanta közé esik. Ha a gyantán reagálatlan amino csoport marad, azt elreagáltatják ecetsavanhidriddel diizopropiletilamin jelenlétében diklórmetános közegben.

A Boc -aminosav hozzáadása után a gyantát ismétlődő ciklusoknak vetik alá, az aminosavakat a szekvencia sorrendjében adva hozzá. Eltávolítják az alfa amino csoportot védő Boc-ot savas körülmények között. Erre a célra használható trifluorecetsav diklórmetánban, sósav dioxánban vagy hangyasav és ecetsav elegyei. Előnyösen alkalmazható 50 térfogat% TEA diklórmetánban. Ez tartalmazhat még 1-5% EDT-t vagy dimetilszulfidot a t-butil karbónium ionok el távolítására. Ismeretesek más standard hasítási módszerek is, amelyek szintén alkalmazhatók.

Az alfa amino védőcsoport eltávolítása után a többi védett aminosavat egyenként hozzákapcsolják a kívánt sorrendben, és végül egy' védett peptid-gyanta intermediert kapnak. Az aminosavak kapcsolásához a szilárd fázisú peptidszintézisben használt aktiváló reagensek ismertek. Például ilyen szintézisekhez megfelelően használható reagensek a benztriazol-1.-iloxi-tri-(dimetilamino)foszfóniumhexafluorofoszfát (BOP), a diciklohexilkarbodiimid (DCC) és a diizopropilkarbodiimid (DIC). Előnyösek a DCC és a DIC. Más aktiváló reagensek is használhatók, amelyeket Bárány és Merrifield írtak le. [The Peptides, Vol 2, J.

Meienhofer kiadó, Academic Press, 1979, 1-284], A szintézisciklusok optimalizálására sokféle reagenst lehet adni a reakcióelegyhez, például 1 lúdroxibenzotriazolt (HOBT), N-hidroxiszukcinimidet (HOSu), és 3,4dihidro-3-liidroxi-4-oxo-l ,2,3-benztriazmt (HOOxBT). Előnyös a HOBT.

Egy tipikus szintetikus ciklus időrendje az alábbi

1. Időrend /Protokol/

Lépés	Reagens	Idő
1	CH2C12	2x30 mp
2	50% TPA/CH2C12	1 perc
3	50% TFA/CH2C12	15 perc
4	CH2C12	2x30 mp
5	iPrOH	2x30 mp
6	CH2C12	4x30 mp
7	6% DDPEA/CH2C12	3x2 perc
8	CH2C12	3x30 mp
9	kapcsolás	10 perc - 18 óra
10	CH2C12	2x30 mp
11	iPrOH	1x30 mp
12	CH2C12	1x30 mp
13	DMF	2x30 mp
14	ch2ci2	3x30 mp

A kapcsolások és a mosások során használt oldószerek mennyisége 10-40 ml/g gyanta volt. A kapcsolásokat vagy a Boc-aminosavak előre elkészített szimmetrikus anhidridjeível végeztük, vagy Chacií izukarbamid származékokkal. Általában 2-10 ekvivalens aktivált Boc-aminosavat adtunk egy ekvivalens amin gyantához diklórmetános oldatban. A BocArg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) és Boc-His(Bom) esetében 20-25%-os DMP/CH2CI2 oldószert használtunk. A Boc-Asn-t, Boc-Gln-t és Boc-His(Bom)-ot HOBT aktív észter formájukban kapcsoltuk, hogy minimalizáljuk az ismert mellékreakciókat.

A peptidek ciklizálását általában jól ismert módszerekkel végeztük a következőképpen. A pepiiden belül azoknál az aminosavaknál , amelyeknek az oldalláncát kapcsolni akartuk, különböző védőcsoportokat használtunk. Az amino csoportokat tartalmazó aminosavaknál (Lys és Om) az N^e- és NÖ- Fmoc származékokat építettük a peptidláncba, a karboxil csoportokat tartalmazó aminosavaknál (Asp és Glu) pedig az OP és az Ογ-Pm származékokat. A pepiidet, még a gyantához kötve, 20-40% piperidint tartalmazó DMF-es oldattal kezeltük, hogy' szelektíven eltávolítsuk a Fmoc és a Fm védőcsoportokat.Az oldalláncban lévő szabad amino és karboxil csoportokat ezután kovalensen összekapcsoltuk a molekulán belül egy megfelelő amidképző reagenssel, mint például difenilfoszforilazid (DPPA), DCC, DIC vagy BOP. Előnyös a DCC és a BOP.

Egy tipikus ciklizálási reakció időrendje az. alábbi

2. Időrend /Protokol/

Lépés.

Reagens

DMF

20=40% piperídin/DMF

Idő

1x30 mp perc

3	DMF	lx30mp
4	20-40% piperidin/DMF	20 perc
5	iPrOH	1x30 mp
6	DMF	1x30 mp
7	iPrOH	2x30 mp
8	DMF	2x30 mp
9	6% DIPEA/CH2CI2	2x2 perc
10	CH2C12	1x30 mp
11	DMF	1 x30 mp
12	kapcsolás	1-24 óra
13	iPrOH	1x30 mp
14	ch2ci2	1x30 mp
15	DMF	2x30 mp
16	CH2C12	3x30 mp

A kapcsolási reakciókat a szintézis során végig követtük, és a Kaiser féle Dinhidrin teszttel határoztuk meg, hogy mennyire mentek végbe.. Kaiser et aZ, Anal. Biochem., 34, 595-598 (1970)]. A Boc-Arg(Tos), BocAsn és a Boc-GIn lassan reagáltak.A nem teljes kapcsolási reakciókat vagy újra elvégeztük frissen aktivált aminosavval, vagy blokkoltuk úgy, hogy a peptid gyantát ecetsav anhidriddel kezeltük, ahogy fent leírtuk. A teljesen elkészült peptid gyantát vákuumban néhány órán át szárítottuk.

A blokkoló csoportok eltávolítását és a peptid lehasítását a gyantáról minden vegyület esetében a következőképpen végeztük. Általában, a peptidgyantát lg gyantára számítva 25-100 pl etánditíollal, 1 ml anizollal és 9 ml folyékony hidrogénfluoriddal kezeltük 0 °C-on 45-60 percig, Teflon HF készülékben (Peninsula). Egy másik, kétlépéses hasítási eljárás is alkalmazható [Tam et al., Tetrahedron Letters, 23, 2939-2940 (1982)], amely szerint 3 ml dimetil szulfiddal és 1 ml hidrogénfluoriddal kezelik 2 órán át 0 °C-on és a 90%-os HF-dal való kezelés előtt bepárolták. Az illékony reagenseket ezután vákuumban távolítottak el jégfürdő hőmérsékletén. A maradékot kétszer- háromszor 20 ml dietiléterrel és etilacetáttal mostuk és szűrtük. A peptideket a gyantáról háromszornégyszer 20 ml 10%-os ecetsavval való mosással extraháltak és szűrtűk. Az egyesített vizes szűrleteket liofilizálva kaptuk a nyers terméket.

A nyers pepiidet először finomszemcsés Sephadex G-25 oszlopon gélkromatográfiával tisztítottak, hogy elválasszuk a monomer és oligomer anyagokat. A peptideket minimális térfogatú 10%-os ecetsavas oldatban vittük fel a gél oszlopra. Az oszlopot 10%-os ecetsawal eluáltak 0.5-1.5 ml/perc áramlási sebességgel. A távozó oldatot 254 nm-en vizsgáltuk, a kívánt sávban elnyelő frakciókat összegyűjtöttük, és liofilizálva kaptak a félig tiszta terméket.

A félig tiszta peptid tisztítása általában preparatív HPLC-vel történt. A peptideket minimális térfogatú 1%-os ecetsavas vagy 0.1%=os TEA oldatban vittük az oszlopra. A gradiens elúció általában 10%-os B pufferrel indult, majd 10-25% B 10 perc alatt, és 25-25% B 3 óra alatt (A puffer: 0.1% TFA/H₂O, B puffer: 0-1% TFA/CH3CN), 8 ml/perc áramlási sebességnél. Az UV detektálás 220 nm-en történt. 1.5-2.5

- 36 percenként vettük á frakciókat, és analitikái HPLC-vel analizáltuk őkét. A nagy tisztaságúnak ítélt frakciókat összegyűjtöttük és liofilizáltuk.

A végtermék tisztaságát fordított fázisú analitikai HPLC-vel ellenőriztük, mint már említettük.Ennek általános körülményei: gradiens elúció, 20-40% b 15 perc alatt, 2.0 ml/perc áramlási sebességgel.(A puffer: 0.022% TPA/H₂O, B puffer: 0.022% TPA/CH3CN). Az UV detektálás 210 nm-en történt. Az összes termék tisztaságát 97-99%-ra becsültük. Az egyes peptidek aminosav analízisét elvégeztük, és az elfogadható határok között volt, általában minden végterméket megvizsgáltunk gyors atom bombázásos tömegspektrometriával (PABMS) is. Minden termék az elfogadható határok között adta a várt M+H ionokat.

A találmány szerinti új vegyületeknek értékes gyógyászati tulajdonságaik vannak. Relaxálják a légcsövet, és erőteljes hörgőtágító hatásuk van. Ezenkívül a vegyületeknek nincs kardiovaszkuláris hatásuk. Az új peptidek által elért hörgőtágulás több mint két órán át fenntartható.Ezért, mivel aktív bronchodilatánsok , a vegyületek értékes gyógyászati anyagok bronchokonstriktív rendellenességek, például asztma kezelésében.

Az I-V képletű új vegyületeket kombinálhatjuk tipikus gyógyászati hordozókkal, előnyösen nem-toxikus, inért gyógyászatilag elfogadható hordozó anyagokkal, hogy olyan kompozíciókat alkossanak, amelyek megfelelnek bronchokonstriktív rendellenességek, mint az asztma, kezelésében való használatnak. Belsőleg alkalmazva az adagok nagysága több tényezőtől függ, például magától a vegyülettől és a formulázástól. A hatékony adagolás mértékét a szokásos módszerekkel lehet megállapítani az effektív koncentráció (EC50) megadott értékeiből. Embernél a tipikus adagolás 0.01-100 pg/kg lehet. A kis, pl. 0.1 pg ED5Q értékű vegyületek jellemző adagjai embernél 0.2.-20 pg/kg-osak lehetnek.

Az T-V képlet szerinti új vegyületek gyógyászatilag alkalmazható sókat képeznek számos szerves és szervetlen savval, például kénsavval, foszforsawal, sósavval, hidrogénbromiddal, hidrogénjodiddal, salétromsavval, szulfaminsawal, citromsawal, tejsavval, piroszőlősawal, oxálsavval, maleinsavval, borostyánkősavval, borkősavval, fahéjsavval, ecetsavval, triflourecetsawal, benzoésawal, szalicilsavval, glukonsavval, aszkorbinsavval, és más savakkal.

A hatásos vegyületeket parenterálisan lehet adagolni, intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, orálisan vagy intranazálisan. A parenterális adagolás előnyös módja orális vagy intranazális alkalmazás aeroszol útján.

Találmányunkat továbbá az alábbi példákon mutatjuk be.

1. Példa

Boc-Thr(Bzl)-BHA gyen t a előállítása

Benzhidrilamin kopolis±irol-l% divinilbenzol térhálósított gyantát (9,5 g, 3,6 mekv. 200-400 ASTM mesh, Vega Biochem) 100 ml metilénkloridban duzzasztottak, szűrtük és mostuk a l.Protokol 7-8 lépése alapján. Boc-Thr(Bzl) (3,35 g,

10,8 mmol) és diciklohexilkarbodiimid (1,12 g, 5,42 mmol) 50 ml CH^C^ -ben egy órán át végzett reagáltatást követőenszürtük és 50 ml diklormetánban a duzzasztott gyantához adtuk. Ezt az elegyet 18 órán át szobahőfokon rázattuk. DIPEA -t (63θ ml, 3,6 mmol) adtunk hozzá és további egy órán át rázattuk és ezt követően az 1. Protokol 10-14 lépését alkalmaztuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. Az elreagálatlan amin csoportokéit a gyantát 30 percig 1 ml ecetsavanhidridet és 1 ml DIPEA-t tartalmazó 50 ml metilénkloriddal kezelve elreagáltattuk, szűrtük és mostuk az 1. Protokol 13-14 lépésének megfelelően. A gyantát egy éjszakán át vákuumban szárítva 9,8 g Boc-Thr(Bzl)-BÉLA, gyantát nyertünk. A gyanta egy részletét aminosav analízisnek alávetve 0,17 mmol Thr/g eredményt kaptunk.

2. Példa

Ac-/Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Asp⁸ - Lys¹²) /Ac-(SEQ ID No:20)-NH₂/ előállítása

A Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát (9,8 g, 1,7 ml), melyet az 1. példa alapján állítottunk elő az l.Protokol alkalmazásával •szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. A kapcsolások mindegyikét Boc-aminosavból és diciklohexilkarbodiimidből előre elkészített szimetrikus anhidridet alkalmaztunk. Boc-asparagint és Boc-histidin(benziloximetil)--t kapcsoltunk, mint viszonylag HOBT aktiv észtereket. A kapcsolási lépés teljessé tételéhez általában 1-18 óra volt a reakció idő. Öt kapcsolási ciklust hajtottunk végre Boc-Leu-val (1,5 g, 6,0 mmol), Boc-Valnal (1,3 g, 6,0 mmol), Boc-Ser(Bzl)-nel (l,8,g, 6,0 mmol), Boc-Asn-nal (773 mg, 3,3 mmol) és Boc-Leu-nal (1,5 g, 6,0 mmol).

A gyantát vákuum alatt szárítva 12,2 g Boc-hexapeptid gyantát nyertünk.

Az igy kapott gyanta 8,2 g-os részletét hat ciklusban kapcsoltuk az alábbiakkal: Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,77 g, 4,0 mmol), BocLys(2-Cl-Z) (l,67.g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2“Cl-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Val (876 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (762 mg, 4,0 mmol), valamint Boc-Nle (932 mg, 4,0 mmol). így 10,2 g Boc-dodekapeptid gyantát nyertünk.

Az igy kapott gyanta 1,26 g-ját (0,139 mmol) a következő két kapcsolási ciklusnak vetettük alá: Boc-Gln (205 mg, 0,93 mmol) és Boc-Lys(2-Cl-Z) (627 mg, 1,5 mmol). Az igy kapott gyahta fedélét (0,069 mmol) az alábbi 14 kapcsolási ciklusnak vetettük alá: Boc-Arg(Tos) (324 mg, 0,76 mmol), Boc-Leu (188 mg, 0,76 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (354 mg 0,76 mmol), Boc-Thr(bzl) (234 mg, 0,76

- 40 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (333 mg, 0,76 mmol), Boc-Asn (97 mg

0,76 mmol), Boc-Asp(Ofm) (311 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Phe (201 mg, 0,76 mmol), Boc-Val (164 mg, 0,76 mmol), Boc-Ala (143 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp(OcHx) (238 mg, 0,76 mmol), Boc-Ser(Bzl) (223 mg, 0,76 mmol) és Boc-His(Bom) (156 mg, 0,41 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén végigvive, majd 1,0 ml ecetsavanhidridet és 66 ml DIPEA-t (0,38 mmol) tartalmazó 20 ml metilénkloriddal 30 percig kezeltük. A gyantát a 10-14 lépéseket alkalmazva mostuk.

A gyantát a 2. Protokol 1-11 lépését alkalmazva szelektíven leblokkoltuk és hétszer reagáltattuk DCC-t (49 mg, 0,24 mmol) és HOBT-t (32 mg, 0,24 mmol) tartalmazó 20 ml desztillált DMPel 24 órán keresztül. Ezt követően a Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk, vákuumban szárítottuk. így 0,72 g terméket nyertünk.

A gyantát 0°C-on két órán keresztül 6 ml dimetilszulfiddal és 2 ml folyékony HF-el kezeltük. A reakcióelegyet bepároltuk és a keletkezett gyantát 0,7 ml anizollal és 6 ml folyékony HP-el kezeltük 45 percen át 0°0-on. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml ecetsavetilészterrel mostuk. Ezt követően 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesitett vizes szürletet liofilizálva 227 mg szilár fehér anyagot nyertünk.

- 41 A .nyers terméket preparativ HPLC-vel tisztítottuk, Whatman . Magnum-20 ODS-3 oszlopon (2x25 cm) és lineáris gradiens eluciót alkalmazva / 10-40% B, 4 óra, (A puffer: 0,1% TFA/HgO, B puffer: 0,1% TFA/CH^CN)/. A fő csúcsot analitikai HPLC-vel meghatározva és vágva gyűjtöttük a frakciót és liofilifáltuk, mely eredményeként 26,7 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot Magnum-20 ODS-3 oszlopon (2x50 cm) icmételten kromatográfáltuk, az előzőekben alkalmazott gradiens eluciót alkalmazva. A fő csúcsot vágva és liofilizálva 9,5 mg fehér, amorf port nyertünk. Ez az anyag HPLC-vel vizsgálva egységes és amminosav analízise a vártnak megfelelő. FAB-MS; MH 3277,8 (számított) és 3276,1 (mért).

3. Példa

Ac-yGlu⁸,Lys¹² ,Mle¹⁷ ,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Glu⁸ - Lys¹²) /Ac-(SEQ ID No:21)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin kopolistirol-1% divinilbenzol térhálósított gyantát (17,7 g, 2,6 mekv., 200-400 ASTM mesh, Vega Biochem) 160 ml metilénkloridban duzzasztottul^, szűrtük és az 1. Protokol 7-8 lépése szerint mostuk. A gyantát ismét szuszpendáltuk 160 ml metilénkloridban és ehhez adtunk Boc-Thr(Bzl)-t (6,25 g, 20,2 mmol) és diciklohexilkarbodiimidet (2,10 g, 10,1 mmol). Ezt az elegyet 8 órán keresztül rázattuk szobahőfokon, szűrtük és azután az 1. Protokol 10-14 lépését alkalmaztuk. A Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt. Az elreagálatlan amin

- 42 csoportokat elreagáltattuk a gyantát 5 ml DIPEA-t és 5 ml ecetsav anhidridet tartalmazó 150 ml metilénkloriddal kezelve 60 percig, majd szűrtük és a 13-14 lépésnek megfelelően mostuk. A gyantát egy éjszakán át vákuumben szárítottuk és igy 18,0 g Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát nyertünk. A gyanta egy részletét aminosav analízisnek alávetve 0,17 mmol. Thr/g értéket kaptunk.

A Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát (18,0 g, 3,06 mmol) az l.Protokol alkalmazásával szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Az összes kapcsolás során előre elkészített Boc-aminosavból és diöiklohexilkarbodiimidből nyert szimetrikus anhidridet alkalmaztunk. A Boc-asparagint, Boc-glutamint és Boc-histidint mint viszonylag HOBT aktív észtert kapcsoltuk. Öt kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol), Boc-Val (5,32 g, 24,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (7,23 g, 24,5 mmol), Boc-Asn (3,13 g, 13,5 mmol) és Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol). A gyantát vákuum alatt megszáritva 22,9 g Boc-hexapeptid gyantát nyertünk.

A gyanta 7,48 g-ját (1,0 mmol) tiz kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbiakkal: Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66, 4,0 mmol), Boc-Val (869 g, 4,0 mmol), Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmol), Boc-Nle (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Gln (1,08 g, 4,4 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmol) és Boc-Leu (998 mg, 4,0 mmol). így 9,6 g Boc-hexadekapeptidet nyertünk.

- 43 A kapott gyantából 7,68 g-ot (0,8 mmol) Boc-Lys(Pmoc)-al (1,5 g,

3,2 mmol) egy ciklusban kapcsolva 8,32 g Boc-heptadekapeptid gyantát nyertünk.

A gyanta 6,24 g-ját (0,6 mmol) két kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmol) és Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,06 g, 2,4 mmol) és igy 6,28 g Boc-nonadekapeptid gyantát ny,értünk.

Ebből a gyanátból 2,09 g (0,2 mmol) mennyiséget kilenc kapcsolási ciklusnak vetettünk alá az alábbiakkal: Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Asp(Ofm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) és Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). A gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén végigvittük és 0,25 ml acetanhidridet valamint 70 ml DIPEA-t tartalmazó 20 ml metilénkloriddal kezeltük 20 percen keresztül. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk.

A gyantát ezután szelektíven leblokkoltuk a 2. Protokol 1-11 lépéseinek megfelelő kezeléssel. A gyanta háromnegyed részét (0,15 mmol) reagáltattuk DCC-vel (77 mg, 0,37 mmol) és HOBT-vel (51 mg, 0,37 mmol) 72 órán át 20 ml desztillált DIvIE-ben majd 24 órán át 20 ml toluolban, A Kaiser analízis eredménye ezt követően negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépése szerint mostuk, vákuum alatt szárítottuk és igy 1,72 g terméket kaptunk.

• · · • · ··· «

Ennek a gyantának 1,14 g-ját (0,099 mmol) leblokkoltuk a 2. Példában leirt kezeléssel azzal az eltéréssel, hogy a második (1 ml anizol és 9 ml HP ) kezelést elhagytuk. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. A vizes szürletet egyesítettük , liofilizáltuk és igy 535 mg fehér szilárd terméket nyertünk.

A nyers terméket gélszüréssel Sephadex G-25-ön (2x100 cm-es oszlop) és 10%-os ecetsavval eluálva tisztítottuk. A monomer csúcsot az összegyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel végzett analíziseknek megfelelően vágtuk, összegyűjtöttük és liofilizálva 83,5 g közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 2. Példában leírtak szerint tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy a 20-40% lineáris gradiens szerinti eluciót 3 órá. alatt hajtottuk végre. A gyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel végzett analízise alapján vágtuk a fő csúcsot, liofilizáltuk és igy 18,9 mg fehér amorf port kaptunk. Az anyag HPLC-vel vizsgálva homogén volt, az aminosav analízis eredménye megfelelő. FAB-MS: MH 3292,0 (számított) és 3291,8 (mért).

4. Példa

Ac-/Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²Nle¹⁷,Val²⁶Thr²⁸/-VIP ciklo(Asp⁹ - Lys¹²) /Ac-(SEQ ID No:22)-NH₂/ előállítása

1,55 g (0,15 mmol) részletét a 3. Példa szerinti Boc-nonadekapep- 45 tid’ gyantának 9 . kapcsolási ciklusnak vetettük alá az következőkkel: Boc-Asp(Ofm) (247 mg, 0,6 mmol), Boc-Asn (153 mg, 0, 66 mmol), Boc Thr(bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (159 mg, 0,6 mmol), Boc-Val (130 mg, 0,6 mmol), Boc-Ala (113, mg, 0,6 mmol), Boc-Asp(OvHx) (189 mg, 0,6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (177 mg, 0,6 mmol) és Boc-His(Bom) (248 mg, 0,66 mmol). A peptid gyantára alkalmaztuk az 1. Protokol 1-8 lépését és 30 percig 0,25 ml ecetsavanhidridet és 70 ml DlPEA-t tartalmazó 20 ml metilénkloriddal kezeltük. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk.

A gyantát szelektíven (leblokkoltuk fa 2₀ Protokol 1-11 lépésének megfelelő kezelés alkalmazásával majd kétszer reagáltattuk.DOO-t (77 mg , 0,37 mmol) és HOBT-t (51 mg, 0,37 mmol) tartalmazó 20 ml desztillált DMP-el 24 és 72 órán keresztül és kétszer 2o ml toluollal 24 és 48 órán keresztül. A Kaiser ninhidrin analizis negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-15 lépése szerint mostuk és vákuum alatt szárítva 1,54 g terméket nyertünk.

A gyanta 1,26 g-ját (0,122 mmol) a 3. Példa szerint HP-el kezelve deblo'kkoltuk. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes fázisokat liofilizáltuk (szűrés után) és igy 485 mg fehér szilárd anyagot kaptunk.

A nyers terméket gél szűréssel Sephadex G-25-ön a 3. Példában leírtak szerint tisztitottzk és igy 83,5 mg közepesen tiszta tér·«* méket kaptunk. Ezt a terméket preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk’ :a 3. Példában leírtakkal analóg módon azzal az eltéréssel, hogy a 20-45% lineáris gradiens 3 órán keresztül fut. A fő csúcsot a gyüjtött’frakciók analitikai HPLC-vel végzett analízise alapján vágtuk, gyűjtöttük és liofilizáltuk. így 11,5 mg fehér amorf port nyertünk. A termék HPLC-vel analizálva egységes, az aminosav analízis eredménye a várt. FAB-MS: MH 3277,6 (számított)

3277.6 (mért).

5. Példa

Ac-(0m¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Asp⁸ - Orn¹²) /Ac-(SEQ ID No:23)-NH₂/ előállítása

A 3. Példa szerint előállított Boc-hexádekapeptid 1,92 g-nyi (0,2 mmol) részletét tizenkét kapcsolási ciklusnak vetettük elá az alábbiakkal: Boc-Om(Fmoc) (364 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg,

1.6 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg,

1,6 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). A pepiid gyantát azl.Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük, majd 30 percig 20 ml metilénkloridban 0,25 ml ecetsavanhidriddel és 70 ml DIPEA-val kezeltük. A gyantát a 10-14 lépés alkalmazásával mostuk és egy éjszakán át szárítva 2,38 g terméket nyertünk.

Ezen gyanta 1,38 g-ját (0,11 mmol) szelektive (leblokkoltuk a

2. Protokol 1-11 lépésének megfelelően kezelve és reagáltatva DCC-vel (55 mg, 0,27 mmol) és HOBT-vel (37 mg, 0,27 mmol) desztillált 20 ml DMF-ben 24 órán át és 20 ml toluolban 24 órán át és ötször 20 ml desztillált Df.íF-ben 24 órán keresztül. A Kaiser ninhidrin analízis némileg pozitív. A gyantát a 13-16 lépésnek megfelelően (2.Protokol) mostuk és vákuumban szárítottuk.

A gyanta 0,8 g-nyi (0,05 mmol) mennyiségét a 3. Példának megfelelően HP-el kezelve deblokkoltuk. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes szürletet liofilizálva 429 mg szilárd mézgát kaptunk.

A nyers terméket gélsztiréssel Sephadex G-25-ön a 3. Példa szerint tisztítva 107 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot preparativ HPLC-vel a 3. Példában leírtak szerint tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy a 10-40% lineáris gradiens futásideje 3 óra volt. A fő csúcsot a gyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel végzett analízise alapján vágtuk, gyűjtöttük és liofilizáltuk. így 17,5 mg fehér amorf por formájú terméket nyertünk. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis a várt. FAB-MS: MH 3263,7 (számított), 3264,1 (mért).

6. Példa

Ac-/Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸ /-VIP ciklo (Lys⁸ - Asp¹²) /Ac-(SEQ ID No:24)-NH₂/ előállítása • <· «te ······ • ·« φ · ··· · · · ··« • · 9··· ·· 9·» •

A 3· Példa szerint előállított Boc-hexadekapeptid gyanta 1,0 gnyi (0,1 mmol) részletét tizenkét kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Asp(OFm) (165 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (176 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (187 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) és Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol). A peptid gyantát a Protokol 18 lépésének megfelelően kezeltük és 30 percig 20 ml metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel és 35 ml DIPEA-val kezeltük.

A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és igy - egy éjszakán át történő szárítás után - 1,2 g terméket kaptunk.

Ezen gyanta 0,8 g-ját (0,066 mmol) szelektív deblokkolásnak vetettük alá a 2. Protokol 1-11 lépése alapján végzett kezeléssel és 20 ml desztillált DMF-ben 24 órán át reagáltatva BOP-vel (58 mg, 0,13 mmol). A Kaiser ninhidrid analízis negatív volt.

A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépése szerint mostuk és vákuumban szárítottuk.

Ezt a gyantát HF-dal kezelve a 3. Példában leírtak szerint deblokkoltuk. A reakcióelegyet bepároltuk és a maradékot 1x15 ml dietiléterrel és 3x15 ml etilacetáttal mostuk. A gyantát 3x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes szürletet liofilizálva szilárd mézgát nyertünk.

- 49 ···* *··* ί ·»·

A nyers terméket gél szűréssel Sephadex G-25-ön a 3. Példa szerint tisztítva 43,8 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezen enyagot a 3. Példához hasonlóan preparativ HPLC-vel tisztítottuk azzal a különbséggel, hogy a 10-40%-os lineáris gradienst 3 óra alatt futattuk le. A fő csúcsot a gyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel analizálva vágtuk, gyűjtöttük és liofilizálva

7,5 mg fehér amorf port kaptunk. Ez a termék HPLC-vel vizsgálva homogén, az aminosav analízis a várt és FAB-MS: MH 3277,8 (számított) és 3276,4 (mért).

7. Példa

Ac-/Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Glu⁸ - Om¹²) /Ac-(SEQ ID No:25)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin kopolistirol-1% divinilbenzol térhálósított gyantát (25,0 g, 17,5 mekv, 200-400 ASTM mesh, Bachem) 160 ml metilénkloridban dizzasztottuk, szűrtük és az 1. Protokol 7-8 lépése szerint mostuk. A gyantát újból szuszpendáltuk 160 ml metilénkloridban és Boc-Thr(Bzl)-t (16,2 g, 52,5 mmol) és diciklohexilkarbodiimidet ( 5,4 g, 26,2 mmol) adtunk hozzá. Az elegyet 6 órán át szobahőfokon rázattuk, szűrtük és az 1. Protokol 10-14 lépésének vetettük alá. A Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt. Az elreagálatlan amin csoportokat elreagáltattűk a gyanta 150 ml metilénkloridban 5 ml ecetsavanhidriddel és 5 ml DIPEAval 60 percig végzett kezelésével. A gyantát egy éjszakán át vákuumban szárítottuk és igy 29,6 g Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát kaptunk. A gyanta egy részletét aminosav analizátorral vizsgálva 0,21 mmol Thr/g adódott.

Ezen gyanta. 14.0 g-ját (2,94 mmol) a 2. Példában leirt Protokol szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenegy kapcsolási ciklust alkalmaztunk az alábbiakkal: Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (6,9 g, 23,5 mmol), Boc-Asn (3,0 g, 13,0 mmol), Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (10,3 g, 23,5 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ala (4,4 g, 23,5 mmol) és Boc-Nle (5,4 g, 23,5 mmol). így 26 g Boc-dekapeptidet nyertünk.

Ezen gyanta 5,5 g-ját (0,61 mmol) további négy kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbiakkal: Boc—Gin (655 mg, 2,7 mmol), BocLys(2-Cl-Z) (2,0 g, 4,8 mmol), Boc-Arg(Tos) (2,1 g, 4,8 mmol) és Boc-Leu (1,2 g, 4,8 mmol). A gyantát vákuumban szárítva 6,12 g Boc-hexadekapeptidet kaptunk.

Ezen gyanta 2,0 g-nyi (0,2 mmol) részletét tizenkét kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Om(Emoc) (91 mg, 0,2 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Glu(OPm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol) Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol). A második ciklus Boc-Thr(Bzl) (250 mg, 0,8 mmol).

A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén keresztülvive 180 percig 30 ml metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel és 38 ml DIPEA-val kezeltüko A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk, vákuum alatt szárítót tűk.így 2,4 g terméket kaptunk.

Ezen gyanta 1,15 g-nyi (0,1 mmol) részletét a 2. Protokol 1-11 pontjának megfelelően kezelve szelektive (leblokkoltuk majd 20 ml desztillált DRIF-ben 24 órán át majd 6 órán át BOP-val (58 mg, o,13 mmol) és 400 ml DIPEA-val reagálhattuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk, vákuum alatt szárítottuk és igy 1,05 g terméket nyertünk.

A gyantát 0°0-on egy órán át 9 ml HP-al, 1 ml anizollal és 100 ml etánditiollal kezelve (leblokkoltuk. A reakcióelegyet bepároltuk, a maradékot 2x15 ml dietiléterrel és 2x15 ml etilacetáttál mostuk. A gyantát 4x20 ml 10%-os ecetsavval extraháltuk. Az egyesített vizes fázisokat szűrtük, liofilizáltuk és igy 385 mg világos sárga szilárd terméket nyertünk.

A nyers terméket a 3. Példában leírtak szerint gélszütéssel Sephadex-25-ön tisztítva 134 mg félig tiszta terméket kaptunk. Ezt a 3. Példával analóg módon preparativ HPLC-vel tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy a 26-36% lineáris gradiens futtatási ideje 3 óra volt. A fö csúcsot a gyűjtött frakciók analitikai HPLC-vel végzett analízise alapján vágtuk, összegyűjtöttük és liofilizálva 23,2 mg fehér amorf port kaptunk. Ez HPLC-vel vizsgálva egy- 52 séges, az aminosav analízis eredménye a várt. FAB-MS‘:_; MH 3277,8 (számított), 3276,3 (mért).

8. Példa

Ac-/Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo /Lys¹²-Glu¹⁶/ /Ac-(SEQ ID No: 26)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin kopolistirol-1% divinilbenzol térhálósított gyantát (3θ g, 21,4 mekv. 200.400 ASTM mesh, Bahhem) a 22. Példával analóg módon kezeltünk azzal a különbséggel, hogy 19,9 g Boc-Thr(Bzl)-t (64,3 mmol) és 6,6 g diciklohexilkarbodiimidet (32,1 mmol) használtunk. Az elegyet 18 órán keresztül szobahőfokon ráztuk, szűrtük és az l.Protokol 10-14 lépésének megfelelően tovább kezeltük. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. Az elreagálatlan .amino csoportot 200 ml metilénkloridban. 8 ml acetsavanhidriddel és 8 ml DIPEA-val kezeltük 60 percig, majd szűrtük és a Protokol 13-14 lépése szerint mostuk. A gyantát egy éjszakán át vákuumben szárítottuk és igy 34,2 g Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantát kaptunk. A gyanta egy részletét aminosav analízissel vizsgálva 0,47 mmol Thr/g értéket kaptunk.

Ezen Boc-Thr(Bzl)_BHA gyanta 0m85 g (0,45 mmol) részletét szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá egy Applied Biosystem 430A model peptid sintetizátorban. Az összes kapcsoláshoz egy Boc-aminosavból és diciklokarbodiimidből előre elkészített szi- 53 metrikus anhidridet használtunk,, Boc-aszparagin, Boc-glutamin és Boc-arginin(tozil) mint megfelelő HOBT aktív észtereket kapcsoltuk. Tizenegy kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol) Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) és Boc-Ule (462 mg, 2,o mmol) és igy Boc-dodekapeptid keletkezett.

A gyantát ezt követően öt kapcsolási cikluson vittük keresztül a következőkkel (a 2. Példa szerint): Boc-Glu(OPm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(2-G1-Z) (664 mg, 1,6 mmol), Boc-Arg(Tos) (685 mg,

1,6 mmol), Boc-Leu (398 mg, 1,6 mmol), Boc-Lys(Bmoc) (375 mg, 0,8 mmol), A gyantát vákuum alatt szárítottuk és igy 2,12 g Bocheptadekapeptidet nyertünk.

Ezen peptid gyanta 1,06 g-ját (0,2 mmol) ezután szelektive deblokkoltuk a 2. Protokol 1-11 lépésének megfelelően és kétszer 20 ml desztillált DMP-ben BOP-val (177 'mg, 0,4 mmol) és 200 ml DIPEAval reagáltattuk 2 órán illetve 8 órán keresztül, A Kaiser ninhidrin analízis eredménye enyhén pozitív volt. Az elreagálatlan amin csoportokat elreagáltattuk 20 ml 6%-os DIPEA/metilénklorid-ban 0,5 ml ecetsavanhidriddel 10 perc alatt, szűrtük és a 2. Protokol

13-16 lépésének megfelelően mostuk. Ezt a gyantát egy kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következővel. :Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6

- 54 mmol) és ezután visszahelyeztük a fentebb említett Applied.

Biosystems 43OA peptid szintetizátorba. Az alábbi sorrendben tiz kapcsolási ciklusnak vetetük alá: Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). A peptid gyantát végigvittük az 1. Protokol 1-8 lépésein és 20 ml metilénkloridban 30 percen keresztül 0,5 ml ecetsavanhidriddel és 100 ml DIPEA-val reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépést alkalmazva mostuk és vákuumban szárítottuk.

A peptid gyanát a 7. Példa szerint deblokkolva 340 mg nyers pepiidet nyertünk. A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 35 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot ugyancsak a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk, azzal az eltéréssel,hogy a 25-35% lineáris gradienst futtattu le és igy 15,6 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyület HPLCvel vizsgálva homogén volt, az aminosav analízis eredménye-a várt volt. FAB-MS: MH 3276,6 (számított) és 3278,0 (mért).

9. Példa

Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo /Lys²⁰ - Asp²⁴/ /Ac-(SEQ ID No: 27)-NHg/ előállítása

A 8. Példa szerint előállított Boc-Thr(Bzl) gyanta 0,42 g-nyi (ο,2 mmol) részletét kilenc kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következő sorrendben: Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (322 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol) és Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol). A harmadik illetve a negyedik ciklus Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) illetve Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol).

A gyantát ezután szelektiv deblokkolásnak vetettük alá a 2. Protokol 1-11 lépése szerint és 20 ml desztillált DMF-ben 6 órán át reagáltattűk D'OP-val .(177 mg, 0,4 mmol) és 200 ml DIPEA-val.

A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt.

Ezen gyantát ezután a 8. Példa szerint egy Applied Biosystems Módéi 430A -ba helyeztük és 17 kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbi sorrendben: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn(464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol),Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Ezt a gyantát további egy kapcsolási cikluson vittük keresztül Boc-His(Tos)-al (164 mg, 0,4 mmol).Ezután az l.Protokol 1-8 lépésén vittük keresztül majd 30

- 56 percen keresztül 20 ml 6%-os DIPEA/metilénklorid-ban 1 ml ecetsavanhidriddel reagáltattűk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lé_{r f} „ , x pesenek megfelelően mostuk és vákuum alatt szárítottuk, gy 1,94 g terméket nyertünk.

Ezen peptid gyanta 0,97 g-nyi (0,1 mmol) részletét a 7. Példa szerint deblokkoltuk és igy 265 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. Példában leírtakhoz hasonlóan gél szűréssel tisztítva 149 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezen terméket tovább tisztítottuk a 3· Példában is alkalmazott preparativ HPLCveí azzal az eltéréssel, hogy 25-35% lineáris gradiens lefuttatására került sor és igy 28,1 g fehér amorf port kaptunk termékként. Ezt HPLC-vel vizsgálva homogénnek bizonyult és az aminosav erdménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3278,6 (számított) és 3278,8 (mért).

10. Példa

Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID Ho:28)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin kopolistirol-1% divinilbenzol térhálósított gyanta (5,0 g, 2,6 mekv. 200-400 ASTM mesh, Vega Biochem) 50 ml metilénkloridban duzzasztottunk, szűrtük és az 1. Protokol 7-8 pontja szerint mostuk. A gyantát 60 ml metilénkloridban ulra? szuszpendáltuk és hozzáadtunk Boc-Thr(Bzl) (2,32 g, 7,5 mmol)-t és diciklohexilkarbodiimidet (774 mg, 3,75 mmol). Ezt az elegyet 4 órán át szobahőfokon rázattuk, szűrtük és azután az 1. Protokol

10-14 pontját alkalmazva kezeltük. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. Az elreagálatlan amin csoportokat 60 percig 5° ml metilénkloridban 5 ml ecetsavanhidriddel és 5 ml DIPEA-val reagáltattuk, szűrtük és a Protokol 13-14 lépését alkalmazva mostuk. A gyantát vákuumban szárítottuk egy éjszakán át és igy 5,8 g Boc-ThrfBzl)-BHA gyantát nyertünk. Ezen gyanta egy részletét aminosav analizátorral vizsgálva 0,26 mmol Thr/g eredményt kaptunk. Ezen gyanta 1,44 g-nyi részletét szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá a 2. Példához hasonlóan at 1. Protokol alkalmazásával. Három kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel:Boc-Leu (399 mg, 1,6 mmol), Boc-Val (348 mg, 1,6 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol). Ezen gyanta felét (p,2 mmol) négy kapcsolási ciklusnak betettünk alá a következő sorrendben: Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Leu (199 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol) és Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol).

Ezen gyantát szelektíven deblokkoltuk a 2. Protokol 1-11 lépését alkalmazva és 2 órán keresztül 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben reagáltattuk BOP-vel (177 mg, 0,4 mmol). A Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt.

Ezt a gyantát egy kapcsolási cikluson vittük át Boc-Lys(2-C1-Z)vel (332 mg, 0,8 mmol) ésszilárd fázisú szintézisnek vetettük alá a 6. Példához hasonlóan egy Applied Biosystems model 43OA-n. Tizenkilenc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel:

Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmól), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (63θ mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn(OcIIx) (63θ mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) és ezután az 1. Pro tokái’1-8 lépését alkalmaztuk és 30 percen át 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban llml ecetsavanhidriddel kezeltük. Az 1. Protokol 10-14 lépésének megfelelően mostuk és vákuum alatt szárítottuk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példában leírtakhoz hasonlóan (leblokkoltuk és igy 210 mg nyers terméket kaptunk. A peptidet a 3. Példával azonos módon gél szűréssel tisztítottuk és igy 93 mg félig tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. Példához hasonló módon preparativ HPLO-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy 27-37%-os gradienst alkalmaztunk és igy 26,2 mg fehér amorf port nyertünk. A terméket HPLO-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt, FAB-MS: MH 3305,8 (számított) ÉS 3305,8 (mért).

11. Példa

Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:29)-HN₂/ előállítása

0,4 g (0,1 mmol) benzhidrilamin gyantát (100-200 ASTM mesh, Bachem) a fetiekben ismertetett Protokol alkalmazásával szilár fázisú szintézisnek vetettük alá. Minden kapcsolást úgy végeztünk, hogy molárisán ekvivalens Boc-amonosavat és diizopropilkarbodiimidet használtunk. A Boc-aszparagint és a Boc-glutamint mint viszonylag aktív észtert úgy alkalmaztuk, hogy a kapcsolásnál : szereplő elegy-» hez 1,5 mo. feleslegbe adtunk HOBT-t. A kapcsolási lépés általában 2-18 óra alatt vált teljessé. Az alábbi kapcsolási ciklusokat alkalmaztuk a következőkkel: Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (206 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0_}5 mmol) és Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol).

Ezen gyantát a 2. Protokol 1-11 lépései alapján szelektive deblokkoltuk és 2 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-vel (88mg, 0,2 mmol) reagáltattuk, A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt.

Tizenkilenc kapcsolási ciklusnak vetettük alá a kővetkezőkkel: Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol), ' Boc-Gln (246 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu

- 60 (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol), Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén keresztülvittük és 30 percig 10 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a 10-14 lépést alkalmazva mostuk és vákuum alatt szárítottuk.

A peptid gyantát a - 7. Példa szerint deblokkoltuk és igy 304’mg nyers terméket kaptunk. A peptidet a 3. Példában leírtakkal azonos módon gél szűréssel tisztítottuk és igy 215 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Az anyagot a 3· Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy 26-36% lineáris gradienst futattunk. így 20,1 mg fehér amorf port kaptunk. A termék HPLC-vel vizsgálva homogén volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő volt. PAB-MS: MH 3277,6 (számított) , 3277,7 (mért),

12. Példa

Ac-/p-B-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Oly²⁹’³⁰, Met³¹/-VIP (1-31)-NH2 ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /A.c-(SEQ ID No:30)-NH2/ előállítása θ,4 g (0,1 mmol) benzhidrilamin gyantát (100-200 ASTM mesh, Bachem) a 11. Példában leírtak szerint szilárd fázisú szintézis- . nek vetettük alá. Három kapcsolási ciklust a következőkkel végeztük: Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). További kilenc kapcsolási ciklust és ciklizációt a 11. Példával azonos módon végeztük. Ezt követő tizenkilenc kapcsolási ciklust a 11. Pédának megfelelően végeztük azzal az eltéréssel, hogy a tizedik ,lépésben Boc-Ala helyett Boc-Val-t (217 mg, 1,0 mmol) és a tizenkilencedik ciklusban BocTyr(2,6-DGB) helyett Boc-2-Nal (158 mg, 0,5 mmol) -t alkalmaztunk, valamint a huszonharmadi'k lépésben Boc-Phe helyett Boc-p-P-Phe-t (142 mg, 0,5 mmol) alkalmaztunk,

A peptid gyantát a 7. Példa szerint (leblokkolva 345 mg nyers peptidet kaptunk. A 3. Példának megfelelően gél szűréssel tisztítva 215 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot ugyancsak a 3. ^édában leírtak szerint preparativ HPLC-vel tisztítva,azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 30-40$, 16,4 mg fehér amorf port kaptunk termékként, amit HPLO-vel vizsgálva homogén volt és aminosav analízis eredménye >a .várt volt, PAB-MS: Γ,ίΗ

3574,7 (számított) és 3575,1 (mért).

13. Péda

Ac-/Glu⁸,Om¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo /Lys²¹ - Asp²⁵/ /Ac-(SEQ ID No:31)-NH₂/ előállítása

- 62 θ,4 g (0,1 mmol) benzhidrilamin gyantát (100-200 ASTM mesh, Bachem) a 11. Példához hasonlóan szilárd fázisú, szintézisnek vetettük alá. Ugyancsak a 11. Példában leírtak szerint tizenkilenc kapcsolási ciklusnak vetettük alá. azzal az eltéréssel, hogy a tizedik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Val-t (217mg, 1,0 mmol), a tizenhetedik lépésben ^oc-Lys(2-Cl-Z) helyett Boc-0rn(Z)-t (366 mg,

1,0 mmol) és a huszonegyedik ciklusban Boc-Asp(OcHx) helyett Boc-Glu(Bzl)-t (337 mg, l,Ommol) alkalmaztunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. Példában leírtak szerint (leblokkoltuk és igy 255 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tovább tisztítva 200 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tisztítottuk tovább azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 28-30% volt. Az igy kapott 30,7 mg termék amorf por. A termék HPLC-vel vizsgálva egységes volt és aminosav analízise a várt eredményt adta. FAB-MS: MH 3305,8 (számított), 3305,5 (mért)·

14. Példa

Ac-/p-P-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹»³⁰, Cys(Acm)³¹/-VIP (1-31)-NH2 ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:32)-NH2/ előállítása.

Benzhidrilamin gyantát (0,4 mg, 0,1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) a 11. Példa szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Három kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). A következő kilenc kapcsolási ciklust és a ciklizációt a 11. Példa alapján történt. Tizenkilenc kapcsolási ciklust ugyancsak a 11. Példában leírtak szerint végeztünk azza az eltéréssel, hogy a huszonharmadik ciklusban Boc-Phe helyett Boc-p-F-Phe-t (142 mg, 0,5 mmol) alkalmaztunk.

Ezen peptid gyantát a 7· Példa szerint leblokkolva 268 mg nyers pepiidet kaptunk. A pepiidet a 3. Példa alapján gél szűréssel tisztítottuk és igy 165 mg közepesen tiszta terméket kaptunk.

Ezt az anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt és igy 28,1 mg tiszta fehér amorf port nyertünk. A vegyületet HPLC-vel vizsgálva az egységes volt és az aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-IvIS: MH 3584,1 (számított), 3584,0 (mért)

15. Példa

Ac-/Al^²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:33)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (1,5 g, 0,4 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) a 11. Példához hasonlóan Applied Biosystems model 43OA peptid szintetizáló berendezésben szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Nyolc kapcsolási ciklusnak vetettük alá az alábbi• · · · · ··· · · · ··· akkal: Boc-Thr(Bzl) ('619 mg, 2,0mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OEm) (822 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DOB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(Pmoc) (938 mg, 2,0 mmol).

Ezenngyántát a 2. Protokil 1-11 lépése szerint kezelve (leblokkoltuk és 2 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-val (356 mg, 0,8 mmol) reagáltattuk. A gyantát a 2, Protokol 13-16 lépései szerint mostuk és vákuum alatt szárítva 1,9 g Boc-oktapeptidet kaptunk.

Ezen gyanta 0,95 g-nyi részletét (0,2 mmol) a 11. Példához hasonlóan egy Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátorban szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizennyolc kapcsolási r

ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-01-Z) (830 mg, 2',0 mmol) ,Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), BocLeu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), BocThr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol),Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol),Boc-Asp(0cHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol),Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) és BocAsp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). így 1,54 g Boc-hexakozapeptid gyantát nyertünk.

- 65 Ezen gyanta 0,77 g-nyi (0,1 mmol) részletét a 2. Példa szerinti Protokolt alkalmazva szilárd fázisú, szintézisnek vetettük alá.

Két kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol) és Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol). A peptid gyantát végigvittük az 1. Protokol 1-8 lépésén és 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénklorid-ban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk és igy 0,74 g terméket kaptunk vákuumban történő szárítás után.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkoltuk és igy 172 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 110 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezen anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tisztítottuk tovább azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 22-37% volt és igy 40,0 mg fehér amorf port nyertünk. A termék HPLCvel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt az elvártnak. FAB-MS: ΙΛΗ 3261,7 (számított), 3261,8 (mért).

16. Példa

Ac-A-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ IL No: 34)-NH₂

A 15. Példa szerinti Boc-hexaokozapeptid 0,77 g-nyi(0,l mmol) részletét 2. Példa szerinti protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá.Két kapcsolási ciklust végeztünk a 'következőkkel: Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) és Boc-N-Me-Ala (81 mg,

0,4 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépése szerint órán keresztül 20 ml DMF-ben BOP-vel (442 mg, 1,0 mmol), ecetsavval (57 ml, 1,0 mmol) és DIPEA-val (523 ml, 3,0 mmol) reagáltattuk majd 60 percen keresztül 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük, A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,73 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 191 mg nyers pepiidet nyertünk. A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 138 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3· Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 22-37%. így 28,0 mg fehér amorf port kaptunk, amelyet HPLC-vel vizsgálva egységesnek adódott és aminosav analizátorral vizsgálva a várt eredményt adta. FAB-MS: MH 3225,4 (számított), 3225,4 (mért),

17. Példa

Ac-/2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:35)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (4,0 g, l,08mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) a 2, Példához hasonlóan az l_o Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Nyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel:Boc-Thr(Bzl) (1,34 mg, 4,3 mmol),Boc-Leu (925 mg,

4,3 mmol), Boc-Val (938 mg, 4,3 mmol),Boc-Asp(0Fm) (889 mg, 2,1 mmol),Boc-Asn (557 mg, 2,4 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,3 mmol),

- 67 ¢-+

Boc-Tyr(2,6-DGB) (1,9 g, 4,3 mmol) és Boc-Lys(Fmoc) (l,lg, 4,3 mmol).

Ezen, gyantát ezután a 2,Protokol 1-11 lépésének megfelelően kezelve (leblokkoltuk (szelektíven) és 2 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/ DMF-ben DOP-vel (885 mg, 2,0 mmol) reagáltattuk. A gyantát a 2.

Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk₀

A gyantát további kapcsolási cikluson vittük keresztül a következővel:. Boc-Lys(2-Cl-Z) (179 g, 4,3 mmol) és vákuum alatt szárítva 6,3 g Boc-nőnapeptid gyantát kaptunk.

A gyanta 1,89 g-nyi részletét kilenc kapcsolási ciklusnak tettük ki a következőkkel: Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-Ala (227 mg,

1,2 mmol), Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmol),Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmol), Boc-Gln (325 mg, 1,32 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (498 mg, 1,2 mmol), B_Oc-Arg(Tos) (514 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (498 mg, 2,0 mmol) és BocThr(Bzl) (371 mg, 1,2 mmol). így 2,06 g Boc-oktadekapeptid'gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0,68 g-nyi mennyiségét (0,1 mmol) tiz kapcsolási cikluson vittük ,keresztül a következőkkel: Boc-2-Nal (126 mg, o,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, o,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol), Boc-His(Tos)

- 68 (164 mg, 0,4 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük és 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a 10-14 lépésnek megfelelően mostuk és vákuumban szárítva 0,82 g terméket kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. Példa szerint leblokkolva 261 mg nyers peptidet kaptunk. A pepiidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 186 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tisztítottuk tovább azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 30-40%, így 60,1 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyületet HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3296,3 (számított), 3295,6 (mért).

18. Példa

Ac-/O-Me-Tyr^1O,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (lys²l - Asp²^) /Ac~(SEQ ID No:36)-NH₂/ előállítása

0,6o g (0,1 mmol) 17. Példa szerinti Boc-aktadekapeptidet tiz kapcsolási ciklusnak vehettük? alá a 17. Példa szerint azzal az eltéréssel, hogy a tizenkilencedik ciklusban Boc-2-Nal helyett Boc-Tyr(Ö-Me)-t (59 mg, 0,2 mmol) alkalmazva 0,61 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkoltuk és igy 175 mg • >« *·>* • · · í

nyers gyantát kaptunk. Ezen peptidet a 3. Példa szerint gélszüréssel tisztítva 136 mg közepesen tiszta terméket kapunk. Ezt az anyagot ugyancsak a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 28-38%,

42,4 mg fehér amorf port nyertünk. Ezt HPLC-vel elemezve egységesnek adódott és az aminosav analízis eredménye a várt.

FAB-MS: MH 3276,7 (számított) és 3276,0 (mért).

19. Példa

Ac-/p-F-Phe⁶,p-NH2-Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:37)-NH2/ előállítása

0,625 g (0,09 mmol) Boc-oktadekapeptid gyantát a 17. Példa szerint tiz kapcsolási ciklusnak vetettük alá azzal a különbséggel, hogy a tizenkilencedik ciklusban Boc-2-Nal helyett Boc-p-HH(Z)Phe-t (166 mg, 0,4 mmol) és a huszonharmadik kapcsolási ciklusban Boc-Phe helyett Boc-p-F-Phe-t (113 mg, 0,4 mmol) alkalmaztunk és így 0,84 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkoltuk minek erdményeként 182 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3· Példa szerint gél szűréssel tisztítva 160 mg félig tiszta terméket kaptunk.

Ezt az anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt, így 47,2 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyületet HPLC-vel elemezve homogén és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt.

• ·

FAB-MS: ΜΗ 3279,7 (számított) és 3279,8 (mért).

• »·

20.Példa

Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:38)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (1,25 g, 1,0 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) az 1. Protokol alapján a 2. Példa szerint szilárd fázisú, szintézisnek vetettük alá. Nyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol) és Boc-Lys(Fmoc) (937 mg, 2,0 mmol).

Ezen gyantát a 2. Protokol 1-11 pontja szerint kezelve szelektive deblokkoltuk és 2 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-vel (885 mg, 2,0 mmol) reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis nega tiv volt. A gyantát a 2. Protokol 13-16 lépése szerint mostuk.

Ezen gyantát egy kapcsolási cikluson vittük keresztül Boc-Lys(2Cl-Z)-vel (1,66 g, 4,0 mmol) és vákuumban szárítva 2,7 g Bocnonapeptid gyantát kaptunk.

Ezen peptid 0,54 g-nyi részletét (0,2 mmol) az Applid Biosystems model 430A peptid analizátorral a 8. Példa szerint szilárd fázisú ·♦· · 4 ♦ ·«· • · · * * ··· «· · ♦ ♦

-71-.

szintézisnek vetettük alá. Tizennyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2:,.0mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). így 1,16 g Boc-heptakosapeptidet nyertünk.

Ezen gyanta 0,54 g-nyi részletét (0,1 mmol) egy kapcsolási ciklusnak vetettük alá Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) -val és azután az 1. Protokol 1-8 lépésén végigvittük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát a.10-14 lépésnek megfelelően (1,Protokol) mostuk és vákuumban megszáritva 0,5 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7· Példához hasonlóan leblokkoltuk azzal az eltéréssel, hogy 5 ml HF-et és 0,5 ml anizolt alkalmaztunk.

A peptidet a 3. Példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 74,6 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt a 3. .Példával analóg módon preparativ.HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 24-34% volt,17,1 mg fehér amorf port kaptunk,mely HPLC-vel vizsgálva egységes és az aminosav analízis eredménye a várt íróit. FAB-MS: MH 3333,8 (számított) és 3333,4 (mért), • ·* «« ··«· ·· • · · · · ··· · · · ··· • * · · * ··· ♦· « ··

21. Példa

Ac-/N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:39)-NH₂/ előállítása

0,58 g (0,1 mmol) Boc-heptakozapeptid gyantát a 20. példa szerint kacsolási ciklusnak vetettük alá Boc-N-Me-Ala-val (81 mg, 0,4 mmol) és azután az 1. Protokol 1-8 lépésén keresztülvive majd 6 órán át 20 ml DMF-ben BOP-vel (523 mg, 1,0 mmol), ecetsavval (57 ml, 1,0 mmol) és DIPEA-val (523 ml, 3,0 mmol) majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel kezeltük. A gyantát az 1. Protokol 10-14 pontjának megfelelően mostuk és vákuumban szárítva 0,4 g terméket kaptunk.

μ

A peptid gyantát a 20. élda szerint deblokkoltuk és igy 165 mg nyers peptidet kaptunk, A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítottuk amikor 101 mg közepesen tiszta termék keletkezett,, Ezt a 3. ^élda szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 24-34% volt, 19,8 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyület HPLC-vel vizsgálva homogén és az aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-MS: MH 3281,8 (számított) és 3281,9 (mért).

22, Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵»Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac(SEQ ID No:40)-HH₂/ előállítása • V ··· • · · ··· • * · « · ·· · ··

0,54 g (0,2 mmol) részletét a Boc-nonapeptid gyantának (a 20.

Példában előállított) Applied Biosystems model 43OA peptid szintetizátorral hasonlóan a 8, Példához szilárd fázisú, szintézisnek vetettük alá. Tizennyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőekkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol) Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(OBzl) (675 mg, 2,0 mmol), BocThr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). így 0,58 g Bocheptakozapeptid gyantát nyertünk.

A gyantát egy kapcsolási cikluson vezettük át Boc-^is(Tos)-val (164 mg, 0,4 mmol) és ezután az 1. Protokol 1-8 lépését alkalmaztuk majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel ..kezeltük. A gyantát az 1. Protokol 1-8 lépései szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,53 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkoltuk azzal az eltéréssel, hogy 5 ml HF~et és 0,5 ml anizolt alkalmaztunk. 151 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 110 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal a különbséggel, hogy a lineáris gradiens 23,5 - 33,5% volt. A termék 22,8 mg fehér amorf por. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt, FAB-MS: MH 3347,9 (számított) és 3347,0 (mért),

23. Példa

Ac-/O-Me-Tyr^1O,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁵,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:41)-NH₂/ előállítása

1,84 g-nyi részt ' (0,3 mmol) a 17. Példa szerint előállított Bocnonapeptid gyantából a 8, Példához hasonlóan Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátoron szilárd fázisa reakciónak vetettünk alá. Kilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). így 2,2 g· Boc-aktadekapeptidgyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0,73 g-nyi (0,1 mmol) részletét tiz kapcsolási cikluson vittük keresztül a következőkkel: Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol) Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) és Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol). A pepiidet az 1.Protokol 1-8 lépéseinek meg felelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépés nek megfelelően mostuk. 0,77 g terméket kaptunk a vákuumbantörténő szárítás után.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva. 187 mg nyers peptidet kaptunk. Apeptidet a 3. Példának megfelelően gél szűréssel tisz titva 131 mg közepesen tiszta termékhez jutottunk. Ezt a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel továbbtisztitva, azzal az eltéréssel hogy a lineáris gradiens 26-36% volt, 5,3 mg fehér amorf port kaptunk, ami HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3291,8 (számított)

3291,7 (mért).

24. Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁵,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸,Ála²⁹~³¹/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:42)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (1,1 g, 0,5 mmol, 200-400 ASTM mesh, Biomega) a 2. Példa szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhárom kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 .mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol),

- 76 Boc-Tyr(2,6-DCB) (881 mg, 2qp.O mmol), Boc-Lys(Fmoc) (936 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol)·

Ezen gyantát ezután a 2. Protokol 1-11 lépésének megfeleljen leblokkoltuk és 1 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-vel (443 mg, 0,1 ipmol) reagáltattűk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. A gyantát a 2, Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk és vákuumban végzett szárítás után 2,02 g Boc- tride^r . kapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0,8 g-nyi (0,2 mmol) részletét a (. Példához hasonlóan Applied Biosystems peptid szintetizátoron szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhat kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol),

Boc-Nle (462 mg, 2:,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol) Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (63o mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). így 1,2 g Boc-nonakozapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0,6 g-jái (0,1 mmol) két kapcsolási cikluson vittük végig a következőkkel: Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) 0,72 g terméket nyerve. Ezt az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percen keresztül 20 ml 6%-os DIPEA/metilén'klorid-ban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1, Protokol 10-14 lépése szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,645 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 280 mg nyers peptidet kaptunk. A 3. Példának megfelelően gél szűréssel tisztítva 160 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3· példa szerint praparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 22-32% volt, 23,1 mg fehér amorf port kaptunk. Azt HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analizátorral kapott eredmény a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3561,1 (számított) 3560,8 (mért).

25.. Példa

Ac-/Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷ *²⁸,Ala^{29 31}/VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:43)-NH₂/ előállítása

0,6 g-nyi 24. Példa szerint előállított Boc-nonakozapeptid gyantát (0,1 mmol) két kapcsolási cikluson vittünk keresztül a következőkkel: Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) amikor is 0,68 g terméket kaptunk. Ezen gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük és 60 percig

ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagálhattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mosva és vákuumban szárítva 0,56 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 160 mg nyers pepiidet nyertünk. A peptidet a 3. Példának megfelelően gél szűréssel tisztítva 70 mg félig tiszta termékhez jutottunk. Ezt az anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLO-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt, 21,8 g fehér amorf port kaptunk. A vegyület HPLC-vel egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3545,1 (számított) 3545,3 (mért).

26. Példa

Ac-ZN-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:44)-NH₂/ előállítása

1,1 g 20. Példa szerint előállított Példa szerint egy Applied Biosystems zátoron szilárd fázisú szintézisnek csolási ciklust hajtottunk végre az Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln Boc-Lys(2-G1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol),

Boc-Lys(2-C1-Z)

Boc-nonapeptid gyantát a 8, model 43OA peptid szintetivetettünk alá. Tizenhét kapalábbiakkal;

(378 mg, 2,0 mmol), (493 mg, 2,0 mmol),

Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), (830 mg, 2,0 mmol), • ·

- 79 Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-'Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és igy 2,22 g Boc-hexakozapeptid . λ. gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 1,1 g-ját további két kapcsolási ciklusban Boc-Ser(Bzl)-el (238 mg, 0,8 mmol) és Boc-N-Me-Ala-val (163 mg, 0,8 mmol) kapcsoltunk majd, az 1. Protokol 1-8 lépése szerint kezeltül és 1 órán át 20 ml DMF-ben BOP-Cl-el (100 mg, 0,2 mmol), ecetsavval (23 ml, 0,2 mmol) és DIPEA-val (140 mg, 0,4 mmol) reagáltattuk.

A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,95 g terméket nyertünk.

Ezen peptid gyantát a 7-Példa szerint deblokkolva 245 mg nyers peptidet kaptunk. Ezen peptidet a 3· Példa szerint gél szűréssel tisztítva 165 mg félig tiszta terméket nyertünk. Ezen anyagot a

3. Példa szerint preparativ HPDC-vel tovább’.tiszitva, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 25-35% volt,

33,7 mg fehér amorf port kaptunk, ami HPLC-'vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. PABMS: MH 3295,8 (számított) 3294,5 (mért).

27. Példa

Ac-/p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷ »²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:45)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (2,49 g, 2,0 mmol, 100-200 ASTIá mesh, Bachem) a 2. Példa szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettünk alá. Hat kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Lys (2-G1-Z) (3*32 :g, 8,0 mmol),

Boc-Lys(2-C1-Z) (3,32 g, 0,8 mmol), Boc-Leu (1,85 ^Lg, 8,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (1,02 g, 4,4 mmol), Boc-Leu (1,05 g, 8,0 mmöl). A gyantát szárítottuk és a felét eltávolitottuk. További három kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Tyr(2₉6-DCB) (2,52 g, 6,4 mmol) és Boc-Lys(2-C1-Z) (2,65 g, 6,4 mmol).

Ezt a gyantát a 2.Protokol 1-11 lépése szerint szelektíven leblokkoltuk majd 4,5 órán át 20 ml 1%-os DIPEA/DiVíF-ben BOP-vel (L,42 g,

3,2 mmol) reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis negatív volt. A 2.Protokol 13-16 lépésének megfelelően mostuk és szárítva 6,56 g Boc-nonapeptidet nyertünk.

Ezen peptid gyanta 1,64 g-ját (0,4 mmol) a 8. Példa szerint egy Applies OBiosystems model430A peptid szintetizátorral szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhárom kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), • ·

- 81 Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol),

Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-01-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). így 2,56 g Boc-dokosapeptidet nyertünk.

Ezen gyanta 0,64 g-ját (0,1 mmol) hat kapcsolási ciklusnak vetettük alá a következőkkel: Boc-p-F-Phe (283 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (218 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol)

Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol), Boc-His(Tos) (818 mg, 2φ0 mmol). A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésén végigvittük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattűk. A gyantát a 1014 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 0,69 g terméket nyertünk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva. 224 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 213 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal a különbséggel, hogy az alkalmazott gradiens 27-37% volt, 70,5 mg fehér amorf port kaptunk, A vegyületet HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosavanalizis eredménye a vártnak megfelelt, FAB-MS: MH 3365,9 számított) 33,65,6 (mért).

28. Példa

Ac-/1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-Vip ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No: 46)-NH₂/ előállítása

1,28 g 27. Példa szerinti Boc-dokosapeptid gyantát (0,2 mmol) a 27. Példa szerint hat kapcsolási cikluson vittünk keresztül a következő' eltéréssel·:/ első ciklusban Boc-p-F-Phe helyett Boc-l-Nal-t (315 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk.

A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépései szerint kezeltük és 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhirdiddel reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 1,41 g terméket kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 420 mg nyers peptidet kaptunk. Ezt a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 305 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Az anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott gradiens 25-35% volt és igy

66,9 mg fehér amorf port nyertünk. A vegyületet HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosavanalizis eredmény e megfelelt a vártnak, FAB-MS: MH 3398,0 (számított) 3398,8 (mért).

29. Példa

Ac-/Glu⁸,p-NH2-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:47)-NH2/ előállítása « · ·

- 83 1,64 g (0,4 mmol) részletét a 27. Példa szerinti Boc-nonapeptid '.gyantának a 8. Példa szerint egy Applied Biosystems model 43OA peptid szintetizátorral szilárd fázisú, reakciónak vetettük alá. Kilenc kapcsolási ciklust végeztünk el a következőkkel: Boc-Ala (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) ( 830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). így 2,2 g Boc-oktadekapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 1,1 g-ját 0,2 mmol) tiz kapcsolási ciklusnak vetettük alá: Boc-p-NH(CBZ)-Phe (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (512 mg, 2,2 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (620 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (532 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (436 mg, 2,0 mmol) Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-His(Tos) (1,64 g, 4,0 mmol). A peptid gyantát az 1.Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilónkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 1,45 g terméket nyertünk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkoltuk 'és igy 580 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tiszitva 400 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gra- 84 ·<·* diens 22-32% volt, és igy fehér amorf port kaptunk (60,6 mg).

Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és aminosav anaizis eredménye a vártnak megfelelt, PAB-MS: MH 3346,9 (számított) 3346,8 (mért).

30. Példa

Ac-/Glu⁸,0-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵ _}L_eu ²⁶,Lys²⁷ »²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No: 48)-NH / előállítása

1,1 g (0,2 mmol) 29. Példa szerinti Boc-oktadekapeptid gyantát a 29. Példa szerint tiz kapcsolási cikluson vittük keresztül azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-O-Me-Tyr (148 mg, 0.,5-mmol) szerepelt a Boc-p-NH(CBZ)-Phe helyett. A peptid gyantát az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a 10-14 lépés szerint mostuk és vákuumban szárítva 1, 45 g terméket kaptunk, ,

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 555 mg nyers pepiidet kaptunk, amit a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 460 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt az anyagot a .<

3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 25-35% volt 152, 9 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyületet HPLC-vel elemezve egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt a vártnak. EAB-MS MH 3361,9 (számított) 3361,7 (mért) • · ·

31. Példa

Ac-/p-F-Phe⁶,Lys¹² ,Nle¹⁷ ,Ala¹⁹ ,Asp²⁵ ,Val²⁶ ,Thr²⁸/-VIP ci'klo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:49)-NH₂/ előállítása

1,2 g (0,2 mmol) 17. Példa szerinti Boc-nőnapeptid gyantát a 8.

Példa szerint Applied Biosystems model 430A peptid szintetizátorral szilár fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhárom kapcsolási ciklust alkalmaztunk a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) Boc-Ala (378 mr, 2^r,0 mmol) ,Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol),

Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol),

Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol),

Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) és Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). így 1,3 g Boc-dokosapeptid gyantát nyertünk.

Ezen gyanta 0,65 g-ját (0,1 ,mmol)a 27. Példa szerint hat kacsolási ciluson vittük keresztül. A peptidet az 1. Protokol 1-8 lépése szerint kezeltük és 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk.A gyantát a lo-14 lépés szerint mostuk és vákuumban megszáritva 0,856 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 550 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 33θ mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt a 3. Bélcla szerint preparativ HPLC-vel tisztítva tovább, azzal az eltéréssel, ··· • · · · · ««·· ·· · ··

- 86 — hogy a lineáris gradiens 27-37% volt, 80,9 mg fehér amorf port nyertünk. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosavanalizis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3295,7 (számított) 3296,2 (mért).

32. Példa

Ac-/1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:50)-NH / előállítása

0,65 g (0,1 mmol) 31. Példa szerinti Boc-dokozapeptid gyantát a 27. ^példa szerint hat kapcsolási cikluson vittük keresztül azzal a különbséggel,hogy az első ciklusban Boc-p-F-Phe helyett Boc-1-Nal-t (315 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk. Ezen peptidet az 1. Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát a 10_T14 lépés alkalmazásával mostuk és vákuum alatt szárítva 0,801 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint leblokkolva 250 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 188 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot a 3. ^példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott gradiens 27-37% volt, 28,0 mg fehér amorf port nyertünk. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis eredménye megfelelt a vártnak. FAB-MS MH; 3327,8 (számított) 3328,5 (mért).

- 87 - ···' ··* ^; ··*

33. Példa

Ac-/Ala²,Glu⁸Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸,Gly²⁹’³⁰, Thr³¹/_vii> ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:51)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (1,1 g, 0,5 mmol.200-400 ASTM mesh, Biomega) a 2. Példa szerint az 1. Protokol alkalmazásává,1 szilárd fázisú : -szintézisnek vetettük alá. Tizenhárom kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 24. példához hasonló módon, azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Thr(Bzl)-t (619 mg, 2,0 mmol) alkalmaztunk valamint a második ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Gly-t (350 mg, 2,0 mmol) és a harmadik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Gly-t (350 mg, 2,0 mmol) használtunk, így 2,03 g Boc-tridekapeptid gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 1,22 g-ját (0,3 mmol) a 8. Példa szerint Applied Biosystems model·' 430A peptid szintetizátor alkalmazásával szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenhat kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 24. Példához hasonló módon, azzal az eltéréssel, hogy a tizenegyedik ciklusban Boc-Asp(OcHx) helyett Boc-Gly(Bzl)-t (675 mg, 2,0mmol) használtunk. 1,95 g Boc-nonakozapeptid., gyantát kaptunk.

Ezen gyanta 0,975 g-ját (0,15 mmol) két kapcsolási cikluson vittük keresztül a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). így 1,05 g terméket kaptunk.

Ezt a gyantát az 1.Protokol 1-8 lépése szerint kezeltük majd percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mostuk és vákuumban történő szárítás után 0, 897 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 270 mg nyers pepiidet nyertünk, amelyet a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott lineáris gradiens 24-34% volt, 28,7 mg fehér amorf port kaptunk. Az anyagot HPLC-vel vizsgálva egységes volt és az aminosav analízis a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3547,1 (számított) és 3546,9 (mért).

34. ^Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸,Gly²⁹’³⁰, Thr^31/“ VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:52)-NH₂/ előállítása

A 33. Példa szerinti Boc-nonakozapeptid gyanta 0,975 g-ját

0,15 mmol) a 33. Példához hasonló módon két kapcsolási cikluson vittük keresztül azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Ser(Bzl)-t (590 mg, 2,0 mmol) használtunk. 0,915 g terméket kaptunk.

A 7. Példa szerint ezen peptid gyantát deblokkoltuk és igy 303

- 89 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. Példához hasonló módon gél szűréssel tisztítva közepesen tiszta terméket nyertünk (180 mg). Ezt az anyagot a 3. Példaszerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt, 42,8 mg fehér amorf port kaptunk.

Az anyagot HPLC-vel vizsgálva homogén volt és az aminosav analízis eredménye is megfelelt a vártnak. FAB-MS; MH 3563,1 (számított) 3562,6 (mért).

35. ^példa

Ac-/Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:53)-NH₂/ előállítása

0,27 g (0,1 mmol) 2o.Példa szerinti Boc-nonapeptid gyantát a 8. Példa szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Tizenkilenc kapcsolási ciklusz hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg 2,0 mmol), Boc-l'yr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu (Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc.-Phe (531 mg, 2,0 mmol) Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol)

Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) és Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol). A termék 0,57 g Boc-oktakozapeptid gyanta.

Ezen gyantát az 1.Protokol 1-8 lépésének megfelelően kezeltük majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépései szerint mostuk majd vákuumban száritva 0,506 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkoltuk és igy 160 mg nyers peptidet kaptunk. A peptidet a 3, példa szerint gél szűréssel tisztítva közepesen tiszta 100 mg terméket kaptunk,amit a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel továbbtisztitva, azzal, az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt, 17,1 mg fehér amorf port kaptunk. A vegyület HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis .-eredménye a vártnak megfelelt, PAB-IIS MH:

3331,9 (számított) 3332,0 (mért).

36. Példa

Ao-/p-l>H₂-Phe¹⁰,lyE¹²,Hle¹LAla¹⁹>Asp25_jVal26_iThl.26_/__VIp οι 25 ciklo (Lys ^χ - Asp ) /Ac-(SEQ ID Ho:54)-NH₂/ előállítása

0,6 g (0,1 mmol) 17. Példa szerinti Boc-nonapeptid gyantát a 8. Példa szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettünk alá. Kilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 23. Példához hasonló módon és igy 0,72 g Boc-oktadekapeptid gyantát kaptunk. Ezen gyantát egy kapcsolási cikluson vittünk keresztül Boc-p-NH(CBZ)-Phe (166 mg, 0,4 mmol) felhasználásával és igy 0,79 g Boc-nonadekapeptidet kaptunk. Ezen gyantát a 8. Példában leírtak szerint szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Kilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a . ' következőkkel;· ·. .. '

Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol),Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol),Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol),Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) és igy 0,91 g terméket kaptunk. Ezt a gyantát az 1,Protokol 1-8 pontja szerint kezeltünk majd 60 percig 20 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagáltattuk. A gyantát az 1. Protokol 10-14 lépése szerint mostuk, vákuumban szárítottuk és igy 0,85 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Példa szerint leblokkoltuk 350 mg nyers peptidet kapva , amit a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 138 mg közepesen tiszta terméket nyertünk, amit a 3. ^példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva, azzal az eltéréssel, hogy a lineáris gradiens 25-35% volt, 25,2 mg fehér amorf port kaptunk. Ez HPLC-vel vizsgálva egységes vált és az aminosav analízis is megfelelt a vártnak. FAB-MS: MH 3276,8 (számított) 3276,2 (mért).

37. ^rélda

Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:55)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol) a 2, Példa szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú reakciónak vetettük alá.

Kilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre az alábbiakkal: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0,mmol), Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OPm) (213mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (255 mg, 1,1 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-m-OGH^—Tyr(Bzl) (80 mg, 0,2 mmol), Boc-LysíEmoc) (234 mg, 0,5 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol),

Ezen gyantát a 2. Protokol 1-11 lépései szerint szelektive deblokkoltuk majd 3,5 órán át 10 ml 1%-os DIPEA/DMF-ben BOP-vel (132 mg, 0,3 mmol) reagáltattuk. A Kaiser ninhidrin analízis eredménye negatív volt.

Ezt követően tizenkilenc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a következőkkel: Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg,

1,0 mmol), Boc-Nle (331 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln (270 mg, 1,1 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, l,o mmol),Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol),Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg,

0,5 mmol), Boc-Asn (256 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0

- 93 mmol), Boc-Thr(Bzl) (31o mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol) Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol), Boc-His(Tos) (408 mg, 1,0 mmol).

Ezen gyantát az 1.Protokol 1-8 pontja szerint kezeltük majd.

percig 10 ml 6%-os DIPEA/metilénkloridban 0,5 ml ecetsavanhidriddel reagátattuk és a gyantát az 1. Protokol 10-14 pontja szerint mostuk, vákuumban szárítottuk. így 0,814 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint leblokkoltuk és igy 265 mg nyers peptidet kaptunk. Ezt a 3. Példa szerinti gél szűréssel tisztítva közepesen tiszta termékhez (150 mg) jutottunk amit ugyancsak a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tisztítva 23-33%-os gradiens alkalmazása mellett - 8,1 mg fehér amorf port kaptunk ami HPLC-vel egységes és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő. FAB-MS: MH 3307,8 (számított), 3306,8 (mért).

38.Példa

Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:56)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol) a 2. Példa szerint, az 1, Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 37. Példa szerint

- 94 azzal az eltéréssel, hogy a hetedik ciklusban Boc-m-OCH^-Tyr(Bzl) helyett Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl)-t (78 mg, 0,2 mmol) alkalmaz tűni·: és igy 0,754 g terméket nyertünk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint leblokkoltuk és az igy kapott 254 mg nyers peptidet a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 114 mg közepesen tiszta terméket kaptunk, amit a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva - 27-37% -os gradiens alkalmazásával - 15,1 mg fehér amorf port kaptunk.

A termék HPLC-vel egységes, az aminosav analízis a várt eredményt adta. FAB-MS: MH 32<95,7 (számított) 3295,5 (mért).

39. Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-0CH3-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:57)-NH2/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 mg, 0,1 mmol) a 2. Példa szerint az 1. Proto'kolnak megfelelően szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust végeztünk a 37. Példa szerint azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-Thr(Bzl) helyett Boc-Lys(2-Cl-Z)-t (415 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk, a második ciklusbanBoc-Leu helyett Boc-Lys(2-Cl-Z)-t (415 mg, 1,0 mmol), a harmadik ciklusban Boc-Val helyett Boc-Leu-t (268 mg, 1,0 mmol) és a huszonegyedik ciklusban Boc-Asp(OcHx) helyett Boc-Glu(0-Bzl)-t (337 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk. így 0,90 g terméket nyertünk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 270 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 155 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt ugyancsak a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel - 25-35% gradiens mellett - tovább tisztítva 29,6 mg fehér amorf port kaptunko Az anyag HPLC-vel egységes, az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt.

FAB-MS: MH 3377,9 (számított) 3377,9 (mért)

40. Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:58)-NII₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 mg, 0,1 mmol) a 2, Példa szerint az

1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a 39.Példa szerint, azzal az eltéréssel, hogy a hetedik ciklusban Boc-m-OCH^-Tyr(Bzl) helyett Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl)-t (78 mg, 0,2 mmol) használtunk 4s igy 0,83 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 24θ mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. Példa szerint gél szűréssel tisztítva 100 mg közepes tisztaságú terméket kaptunk. Ezt az anyagot a 3. Példa szerint tovább tisztítottuk preparativ HPLC-vel - 25-35% gradienst alkalmazva - és igy 37,2 mg fehér amorf port nyertünk. A termék HPLC-vel egységes, az aminosav analízis eredménye a várt volt . FAB-MS: MH 3365,9 (számított) 3365,8 (mért).

41. Példa

Ac-/Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No: 59)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát a 2. Példa szerint az 1.Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 39-Példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy az ötödik ciklusban Boc-Asn helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol), a hetedik ciklusban Boc-m-OCH^-Tyr(Bzl) helyett Boc-Tyr(2,6-DCB)-t (440 mg, 1,0 mmol) és a huszonegyedik ciklusban Boc-Glu(OBzl) helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és igy 0,85 g terméket kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 255 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. Példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 112 mg közepes tisztaságú terméket katunk. Ezt ugyancsak a 3. Példához hasonlóan preparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk -25-35% lineáris gradienssel - és 12, 0 mg fehér amorf port nyertünk. A termék HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3246,8 (számított)

3246,7 (mért).

42. Példa

Ac—/Glu⁸,Lys¹²,Alá¹⁶’¹⁷’¹⁹»Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No: 6O)-NH₂/ előállítása • · · « · ··· · · * ··

- 97 Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol) a 2. Példához hasonlóan az 1.Protokol alapján szilárd fázisú, szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a 41. Példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy az ötödik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Asn-t (256 mg, 1,1 mmol), a tizenkettedik ciklusban Boc-Nle helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol), a tizenharmadik ciklusban Boc-Gln helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) és a huszonegyedik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Glu(OBzl)-t (337 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk. így 0,80 mg terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példához hasonlóan deblokkoltuk és igy 254 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. Példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 115, mg közepes tisztaságú terméket nyertünk. Ezt ugyan csak a 3. Példához hasonlóan preparativ HPLC-vel tovább tisztítva - 20-30%-os gradienst alkalmazva - 32,1 mg fehér amorf port nyertünk. A termék HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye megfelel a vártnak. FAB-MS: MH 3248,7 (számított) 3248,3 (mért).

43. Példa

Ac-/Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:61)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol) a 2. Pédához hasonlóan az 1.Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá.

• ·

- 98 Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 41. Példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy a tizenharmadik ciklusban

Boc-Gln helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és 0,93 g terméket kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. példához hasonlóan deblokkolva 250 mg nyers peptidet kaptunk, amit a 3. Példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 100 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt az anyagot ugyancsak a 3. Példa szerint preparativ HPLC-vel tovább tisztítva - 27-37% gradienst alkalmazva - 23,6 mg fehér amorf port kaptunk. A termék HPLO-vel elemezve homogén, az aminosav analízis a várt eredményt mutatta. FAB-MS: MH 3189,8 (számított)

3189,9 (mért),

44. Példa

Ac-/Ala⁸,Lys¹²,Ala^16,17,18,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:62)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 mg, 0,1 mmol) a 2. Példához hasonlóan az.' 1.Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 43. Példához hasonlóan azzal az eltéréssel, hogy a tizenkettedik ciklusban Boc-Nle helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) használtunk és 0,762 g terméket kaptunk.

Ezt a peptid gyantát a 7. ¹³élda szerint deblokkolva 240 mg nyers • ·

- 99 pepiidet kaptunk, melyet a 3. ^éldához hasonlóan gél szűréssel tisztítottuk és igy közepesen tiszta 150 mg terméket kaptunk.

Ezt a 3· Példához hasonlóan preparativ HPLC-vel tovább tisztítva

- 22-33% gradiens alkalmazásával - 55,3 mg fehér amorf por képződik. A terméket HPLC-vel vizsgálva egységes, az amonósav analízis eredménye a vártnak megfelelő.

FAB-MS: MH 3147,7 (Számított) 3148,0 (mért).

45. Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:63)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát a 2. Példához hasonlóan az 1.Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 42. Példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy a tizenkettedik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Nle-t (231 mg, 1,0 mmol) használtunk és igy 0,775 mg terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példához hasonló módon deblokkolva 203 rag nyers peptidet kaptunk, amit a 3. Példához hasonló módon gél szűréssel tisztítva 100 mg közepesen tiszta terméket nyertünk. Ezt ugyancsak a 3. Példához hasonlóan preparativ HPLC-vel tovább tisztítva - 27-37% lineáris gradiens alkalmazásával - 40,0 mg fehér amorf port kaptunk. A termék HPLC-vel vizsgálva egységes, az

100 • *· ·4 ·»«ι ·« • · « 1 « • · · · · · · · · ♦ · · · · aminosav analízis a várt eredményt mutatta.

FAB-MS: MH 3290,( (számított) 3290,5 (mért).

46. Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Ala^16,17,19,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ci'klo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:64)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát a 2, Példához hasonlóan az l.Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Huszonnyolc kapcsolási ciklust alkalmaztunk a 43.Példához hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy a huszonegyedik ciklusban Boc-Ala helyett BocGlu(0Bzl)-t (337 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és igy 0,837 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 178 mg nyers peptidet nyertünk, melyet a 3. Példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 126 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt preparativ HPLC-vel tisztítottuk tovább - 20-30% lineáris gradiens mely eredményeként 24,9 mg fehér amorf port kaptunk.

A termék HPLC-vel mérve egységes, az aminosav elemzés a várt eredményt mutatta. FAB-MS: MH 3205,7 (számított) 3205,2 (mért).

• · — 101 — ·« ·« • · · * · · · · • · · • ·« ♦· « ·«

47. Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹’³⁰,Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:65)-NH / előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 mg, 0,1 mmol) az 1.Protokol alapján három kapcsolási ciklusnak vetetük alá a következőkkel: Boc-Thr(Bzl) (310 mfe., 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmól) és Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Ezt követően huszonnyolc kapcsolási ciklust hajtottunk végre a 37. Példához hasonlóan azzal az eltéréssel, hogy a hetedik ciklusban Boc-m-OCH^-TyríBzl) helyett Boc-Tyr(2,6-DCB)-t (440 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és a huszonegyedik ciklusban Boc-Asp(OcHx) helyett Boc-Glu(0-Bzl)-t (337 mg, 1,0 mmol) használtunk és 0,895 g terméket nyertünk.

Ezt a peptid gyantát a 7. Példa szerint leblokkolva 440 mg nyers peptid keletkezett, melyet a 3. Példához hasonlóan gél szűréssel tisztítva 120 mg közepes tisztaságú termék keletkezett. Ezt praparativ HPLC-vel tovább tisztítottuk - 25-35% gradiens és 27,7 mg fehér amorf port kaptunk, mely HPLC-vel egységes, aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő. FAB-MS: MH 3506,9 (számított) 3205,8 (mért).

48. Példa

Ac-/p-F-Phe⁶, Glu⁸,Ly's¹² ,Nle¹⁷, Asp²⁵ ,Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹ »³⁰, Thr³¹/VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:66)-NH₂/ előállítása • 4* *

- 102 Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol) harmincegy kapcsolási cikluson vezettük keresztül a 47. Példához hasonló módon, azzal az eltéréssel, hogy a tizenharmadik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Val-t (217 mg, 1,0 mmol) és a huszonhatodik ciklusban Boc-Phe helyett Boc-p-F-Phe-t (142 mg, 0,5 mmol) alkalmaztunk és igy 0,754 g terméket nyertünk.

Ezt a peptid gyantát a 7. Példa szerint deblokkolva 280 mg nyers peptidet kaptunk, melyet gél szűréssel tisztítva közepes tisztaságú 152 mg terméket kaptunk Ezt preparativ HPLC-vel tovább tisztítva - 27-38% lineáris gradiens - 53,4 mg fehér amorf port kaptunk, ami HPLC-vel egységes és az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelő. PAB-MS: MH 3553,0 (számított) 3552,2 (mért).

49. Példa

Ac-/Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸,Gly²⁹’³⁰,Thr³¹/VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No: 67 )-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, - 0,1 mmol) a.. 47.· - példához hasonlóan harmincegy kapcsolási ciklusnak vetettünk alá azzal az eltéréssel, hogy a negyedik ciklusban Noc-Thr(Bzl) helyett BocLys (2-Cl-Z)-t (414 mg, 1,0 mmol), az ötödik ciklusban Boc-Leu helyett Boc-Lys(2-Cl-Z)-t (414 mg, 1,0.mmol), a hatodik ciklusban Boc-Val helyett Boc-Leu-t (249 mg, 1,0 mmol), a tizenharmadik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Val-t (217 mg, 1,0 mmol) és a harmincadik cik+ lusban Boc-Ser(Bzl) helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) alkalmaz- 103 tünk és 0,838 mg terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példa szerinti deblokkolás után kapott

370 mg nyers peptidet gél szűréssel tisztítva 196 mg közepesen tiszta terméket kaptunk. Ezt preparativ HPLC-vel tovább tisztítva - 23 - 33% lineáris gradiens - 48,4 mg fehér amorf port kaptunk. Ezt HPLC-vel vizsgálva egységes, az aminosav analízis eredménye a vártnak megfelelt. FAB-MS: MH 3575,1 (számított) 3574,0 (mért)

-104 -

50. Példa

Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28,Gly²⁹»³°,Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹ - Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID Ho:68)-NH₂/ előállítása

Benzhidrilamin gyantát (0,125 g, 0,1 mmol), 100-200 ASTM mesh, Bachem) a 2. Példában leírtak szerint az 1. Protokol alapján szilárd fázisú szintézisnek vetettük alá. Harmincegy kapcsolási ciklusnak vatattük alá a 49. példához hasonlóan azzal az eltérései, hogy a harmincadik ciklusban Boc-Ala helyett Boc-Ser(Bzl)-t (295 mg, 1,0 mmol) alkalmaztunk és igy 0,913 g terméket kaptunk.

A peptid gyantát a 7. Példában leirtakszerint deblokkoltuk és igy 378 mg nyers peptidet nyertünk. A peptidet a 3. példában leírtak szerint gél szűréssel tisztítottuk és igy 24° mg félig tiszta terméket kaptunk. A terméket a 3. Példa alapján preparativ HPLCvel tovább tisztítottuk azzal az eltéréssel, hogy 25-35% lineáris gradienst alkalmaztunk. így 28,8 mg fehér amorf port kaptunk. Az anyagot HPLC-vel elemezve homogén volt és az aminosav analízis eredménye a várt volt. FAB-MS: MH 3591,1 (számított) és 3590,3 (mért).

51. Példa

Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Ala²⁵,Leu²⁶,Dys²⁷»²⁸,Ala^{29 31}/-VIP ciklo (Lys²¹ Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID No:69)NH₂/ előállítása

- 105 Penzhidrilamin gyantát (o,125 g, 0,1 mmol), 100-200 ASTM mesh, Bachem) a 2. Példában '.írtak szerint az 1; Protokol alapján szilárd fázisú, szintézisnek vetettünk alá. A 47. Példához hasonló módon harmincegy kapcsolási ciklusnak vetettük alá azzal az eltéréssel, hogy az első ciklusban Boc-Thr(Bzl) helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) illetve a második ciklusban Boc-Gly helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol) , a harmadik ciklusban Boc-Gly helyett Boc-Ala-t (189 mg, 1,0 mmol), a negyedik ciklusban a BicThr(Bzl) helyett Poc-Lys(2-Cl-Z)-t (414 mg, 1,0 mmol), at ötödik kilusban Boc-Leu helyett Boc-Lys(2-Cl-Z)-t (414 mg, 1,0 mmol), a hatodik ciklusában Boc-Val helyett Boc-Leu-t (249 mg, 1,0 mmol), a tizennegyedik ciklusban Boc-Glu(OBzl) helyett Boc-Asp(OcHx)-t / (315 mg, 1,0 mmol) használtunk és igy 0,844 g terméket kaptunk.

Ezen peptid gyantát a 7. Péda alapján deblokkolva 360 mg nyers peptidet kaptunk, A peptidet a 3. Példában leírtaknak megfelelően gél szűréssel tisztítva 115 mg közepesen tiszta termeket kaptunk. Ezen anyagot a 3. Példában leírtak szerint preparativ HPLCvel továbbtisztitva, azzal az eltéréssel,hogy 24-34% lineáris gradienst alkalmaztunk, 34,7 mg fehér amorf port kaptunk. Ezen vegyületet HPLC-vel analizálva egységesnek találtuk és az aminosav analizátor vizsgálat a várt eredményt mutatta. FAB-MS: MH 3547,1 (számított) és 3546,0 (mért).

- 106 -

52. Példa

A VIP analógok 3-ég-cső relaxáló aktivitása Λ - ^p

A VIP analógok relaxáló aktivitását módéiként tengeri malac légcsövét alkalmazva tanulmányoztuk. (Wásserman,M.A. et al., in Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, ed., Raven Press, N.Y. 1982, pp 177-184) A szöveteket hironemü albínó tengerimalacból (400600 g tömegüek) vettük.Az altatást uretánnal (2 g/kg, i.p.) végeztük. Érzéstelenítés utána.' légcsövet eltávolítót tűk és négy gyűrű alakú szegmensre osztottuk (3 mm hosszú). Ezen gyűrűket 30 mm-es saválló dróton felfüggesztettük egy textillel bevont füdőben és összekötöttük egy selyem fonalon keresztül egy Grass erő átalakítóval (model FT03C, Grass Instruments Co. , Quincy,' MA) a feszültség izometrikus regisztrálására. A sima izomszövetek az alábbi összetételű fürdőben voltak: 120 mM NaCl, 4,7 mM KC1,

2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM MgS0₄.7H₂0, 25mM NaHCO^, 1,2 mM KgHPO^ monobázis és lOmM dextroz, A fürdőt 37°C-on tartottuk és folyamatosan áramoltattunk keresztül 95% Og és 5% COg tartalmú gázbuborékokat.

A jeleket egy 8 csatornás és egy négy csatornás Hawlett-Packard rekorderrel ( Hawlett-Packard, Paramus, N.J. 7702B és 7754A model) regisztráltuk.A légcső gyűrűket 1,5 g nyugalmi feszültség alá helyeztük melyet korábbi kísérletek alapján optimálisnak találtunk. Az egyes feszültségmérések között 60 perces stabilizálási perioódus telt el, a szöveteket 15 percig mostuk.

A kumulatív koncentráció függvényében a jel görbét ugyanazon sző- 107 -

vetminta alkalmazásával vettük fel, fokozatosan növelve a VIP illetye a VIP analógok koncentrációját a fürdőben VanRossum módszerének megfelelően /Arch. Int. Pharmacodyn., 299-330 (1963)/. Egy szövetmintával csak egy kumulatív jelgörbét vettünk fel. Az egyes minták közötti eltérés kiküszöbölésére a relaxációs jelet százalékosan adtuk meg, amikor a VIP hatására bekövetkező maxi-6 mális jelre vonatkoztatva adtuk meg (10 M = 100%). Ugyanazon mérést három mintán is mértük és az ΕΟ^θ értékeket lineáris regresszió alkalmazásával számítottuk.

Az eredményeket az I. Táblázatban foglaltuk össze úgy a természetes VIP mint a VIP analógok relaxációs aktivitását tengéri malac légcsövére₀

- 108

I. Táblázat

A VIP analógok görcsoldó aktivitása a tengeri malac .légcsövének sima izmán mérve

Vegyületec

- — -íaMi

VIP[(Seq ID NO:1)-NH2]10

Ac- [Lys¹², Nle¹⁷, Val²6, Thr²⁸] -VIP cyclo (Asp⁸-4Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂]14

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Val^{2 6},Thr^{2 8}]-VIP cyclo (Glu⁸-»Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂]34

Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyclo (Asp⁹->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH₂]17

Ac-[Orn¹², Nle¹⁷,Val^{2 8},Thr²⁸]-VIP cyclo (Asp⁸-K)rn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂]40

Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys⁸->Asp¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂]38

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyclo (Glu⁸-40rn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂]16

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁸,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys¹²—»Glu¹⁸) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂]37

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²4,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²⁰->Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]5.3

109Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵, val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH₂]3.1

Ac-[Lysl²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵, Val²6,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—^Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]0.70

Ac-[p-F-Phe⁶,2-NallO,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹]-VIP cyclo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂]1.3

Ac-[Glu®,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂]2.2

Ac-[p-F-Phe ⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp ^{2 5},Va1^{2 6},Thr ^{2 8},

Gly2 9, 30,cys (Acm) ³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH₂]0.44 r,

Ac-[Alá²,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val^{2 6}, Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂]1.2

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val^{2 6},

Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:34)-NH₂]0.71

Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp^{2 5},Val^{2 6},Thr^{2 8}]VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂]4.2

Ac-[O-CH3~Tyr¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp^{2 5},Val^{2 6},

Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂]0.84

- 110

Ac-[p-F-Phe ⁶,p-NH2~Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp^{2 5}, Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH2J4.4

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷,Alá¹®,Asp²5,Leu^{2 8},Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂]0.13

Ac-[N-Me-Alal,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp² 5,Leu^{2 6},

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH2J0.95

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁸,Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸]VIP cyclo (Lys²¹-4Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH210.45

Ac-[O-Me-Tyr¹0,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁸,Val²⁸,

Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂]2.6

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁸,Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸,

Alá^{2 9-31} ]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]0.61

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp^{2 8},Leu^{2 8},

Lys²⁷'²⁸,Alá²⁹”³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]0.55

Ac-[N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁸,Leu²⁸,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]0.36

Ac-[p-F-Phe⁸,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁸,Leu^{2 8},

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹->Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH210.47

111

Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu^{2 6},

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂]0.26

Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹, Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]0.32

Ac-[Glu⁸,O-CH₃-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]0.41

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:4 9)-NH₂]0.39

Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyclo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH₂]2.9’

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂]0.92

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH210.35

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸1 -VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]0.78

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:54)-NH₂]0.96

- 112 .Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,m-OCH3-Tyr²²,Asp^{2 5},Val^{2 6},

Thr²®]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2]0.31

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²², Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²®]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:56)-NH210.52

Ac-[Glu®,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH3-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁶, Lys²⁷'²®]-VIP cyclo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH2]0.29

Ac-[Glu®,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²®]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂]0.31

Ac-[Alá®,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,Leu^{2 6},

Lys²⁷'²®J-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]1.1

Ac-[Glu®,Lys¹²,Alá¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'28 j _

VIP cyclo (Lys²¹—*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂]0.2 6

Ac-[Alá®, Lys¹²,Alá¹⁶,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²®]-VIP cyclo (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2]2.4

Ac-Ala®,Lys¹²,Alá¹⁶'¹⁷ >¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²®]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH2]0.1

- 113 Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Alá¹⁶,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸J-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp25) [AC-SEQ ID NO:63)-NH2]0.9

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Alá¹⁶'¹⁷'¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'2θ]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2]0.22

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,

Gly²⁹' ³θ,ΤΙΐΓ³¹]-νΐΡ cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH210.88

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp^{2 5},Val^{2 6},Thr^{2 8},

Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2]0.57

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'30,Thr³¹]-VIP cyclo Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH210.19

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo Lys²¹—>Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH210·

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸'Alá^{29- 31}1 VIP cyclo (Lys—»Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:69)-NH2]0.42

- 114 -

53. Példa

A VIP analógok hörgőtágitó hatása

A VIP és VIP analógok bronchodilatációs hatását, aktivitását in vivő tengeri malacokon mértük a légcsőbe csepegtetéssel történő beadással. Ez a technika hím tengeri malacot alkalmaz (Hartley strain, Charles River) 400-600 g testtömeggel. Az állatokat 2g/kg hasfalon keresztül beadott uretánnal altattunk és polietilén kanült vezettünk a véna jugularisba a hatóanyag beadására.

Az állatokon légcsőmetszést alkalmaztunk és desztillált vizes oldatot vagy a teszt komponens desztillált vizes oldatát adagoltuk a légcsőbe. Az oldat koncentrációját úgy állítottuk be, hogy a beadott térfogat állandó, 100 ml legyen. Az állatokat egy percre a hátukra fektettük, hogy a hatóanyag a tüdőbe jusson. Egy percei késöbba spontán légzés megakadályozására szuccinilkölin’.kloridotadtunk intravénásán (1,2 mg/kg) és az állatot Harvard Ivlodel 600 animal respirátorral lélegeztettük 40 légvétel/perc és 4,0 cnr/löket térfogattal. Az állatokat maximális összehúzódást eredményező hisztamin dózissal ingereltük (5θ mg/kg, i.v.) és mértük a légcső nyomását (vizoszlop cm) , melyet egy Statham nyomás átalakítóval regisztráltunk.

A tracheális nyomás változását legalább három kontroll és három

- 115 hatóanyaggal történő kezeléskor kapott eredmény átlagolásával kaptuk és a százalékos inhibiciót számítottuk. A tesztanyagot változó koncentrációban adagolva meghatároztuk a közepes hatású dózist térfoga). Az értékét lóg dózis - jel görbéből határoztuk meg úgy, hogy 10% és 90% inhidiciós efektus között legalább három dózisértéknél mértünk. A regressziós koeficiens a korrelációszámításnál minden esetben legalább 0,95 volt.

A kapott eredményeket a II. Táblázatban foglaltuk össze, amely szemlélteti a bronchodilatációs hatását (aktivitását) a VIP analó gok esetében összehasonlítva a természetes VIP-vel, ♦ *

- 116 II. Táblázat

Bronchodilatációs aktivitása a VIP analógoknak tengeri malacón

Vegyületed

-(μ?)

VIP[(Seq ID NO:1)-NH2]7.3

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂]39

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²⁰—> Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]2.3

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac^-(SEQ ID NO:28)-NH₂]1.2

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]0.34

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹]-VIP cyclo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH2]0.90

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH2]0.19

Ac-[p-F-Phe ⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp^{2 5},Val^{2 6},Thr^{2 8},

Gly²⁹'³⁰,Cys(Acm)³¹]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2]

0.19

- 117

Ac-[Alá²,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val^{2 6}, Thr^{2 8}]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂]0.6

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂]1.0 'Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷/²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH2]0.09

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp^{2 5},Leu^{2 6},

Lys²⁷/²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂]0.06

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷/²⁸]VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:40)-NH₂]0.022

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷/²⁸,

Alá^29-51]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]0.072

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷/²⁸,Alá^29-51]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]0.14

Ac-[N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷/²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]0.097

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu^{2 6},

Lys²⁷/²⁸J-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂]0.026

- 118 Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸, Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu^{2 6},

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,O-CH3-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:4 9)-NH₂]

Ac-[Alá²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁸,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyclo Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂]

Ac-[Alá², Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]

0.036

0.075

0.094

0.26

0.1

0.14

0.35

- 119 ac- [Lys¹²,Nla¹⁷, Ala¹⁹,m-OCH3-Tyr²2,asp²5,v_al²®,

Thr²®J-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²®) [Ac-(SEQ ID NOí55)-NH2)

0.14

Ac-[Lys¹², Niel?,Alá¹⁹,m-F-L-Tyr²² ,Asp²⁵,val²®,

Thr²®]-VIP cyclo (Lys²¹-4Asp²⁵) tAc-(SEQ ID NO:56)-NH2)7.2

Ac-[Glu®,Lys¹²,NI·¹⁷,Alá¹⁹,m-OCH3“Tyr²²,Asp² 5,

Leu²®,Lys²⁷/²®J-VIP cyclo (Lys²¹-»Asp²5) [Ac-(SEQ ID NOí57)-NH210.019

Ac- [ Glu®, Lys¹², NI·¹⁷, Alá¹⁹, m-F-L~Tyr²², Asp²⁵,

Leu²®,Lys²⁷/28]-VIP cyclo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NOiSSJ-NHj]0.03 ac-[Alá®,Lys¹²,NI·¹⁷,Alá¹⁹,Alá²⁴,Asp^{2 5},Leu^{2 6},

Lys²⁷/²®]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NOí59)-NH2J 0.17Ac-[Glu®,Lys¹²,Alá¹®*¹⁷ *¹⁹,Asp²⁵,Leu²®,LyS²⁷/²®)VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²®) [AO-(SEQ ID NO:ÍO)-NH210.17

Ac-[Alá®,Lys¹²,Alá¹®,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,

Leu²®,Lys²⁷/²®]-VIP cyclö (Lys²¹-4A8p²5) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2]0.045

Ac-Ala8,Lys¹²,Alá¹®/¹⁷»¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²®,

Lys²⁷/²®]-VIP cyclo (Lys²¹-4Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH2]0.24 * · ·

- 12° Ac- [Glu⁸, Lys¹²,Alá¹⁶' ¹⁷· ¹⁹,Alá²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²®]-VIP cyclo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2]

Ac-[Glu⁸, Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹^Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,

Gly²⁹'®0,Thr®¹]-VIP cyclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu®,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²®, Gly²⁹'2θ,Thr®¹]-VIP cyclo Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2]

Ac-[Alá²,Glu®,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'®°,Thr®¹]-VIP cyclo Lys²¹-+Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2]

Ac-[Glu®,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²®,

Gly²⁹'3θ,Thr®¹]-VIP cyclo Lys²¹—>Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸'Alá²9“ ®¹1'VIP cyclo (Lys—>Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂]

0.13

0.84

0.12

0.077

0.04

0.04

Claims (3)

- 121 1./ Eljárás I általános képletű /X-ÍSEQ ID N:2)-Y/ jelű ciklikus peptid - ahol Rg jelentése Asp, Glu vagy Lys, Jelentése Arg, Lys, Orn vagy Asp, R17 Jelentése Met vagy Nle, ^26 Jelentése Ile vagy Val, Rgg Jelentése Asn vagy Thr, X Jelentése hidrogénatom vagy hídrólizálhatő amino védőcsoport, Y Jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálhatő karboxi védőcsoport vagy ezek gyógyszerészet Heg megfelelő sóinak előállítására azzal Jellemezve, hogy (a) egy védett és gyantához kötött megfelelő aminosav szekvenciájú peptid védőcsoportjait szelektíven eltávolítjuk, hogy oldalláncbeli szabad aminocsoportot és oldalláncbeli szabad karboxi1csoportot kapjunk, (b) az oldalláncbeli szabad aminocsoportot oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kovalensen és az összekötjük egy megfelelő amidképző reagenssel, (c) eltávolítjuk a védőcsoportot és a gyűrűs peptideket lehasítjuk a gyantáról megfelelő védőcsoport eltávolító és hasító reagenssel, szükség esetén további adalékok, például kation eltávolítók Jelenlétében, és szükség esetén a gyűrűs peptideket gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk. 122

1· 11/a zámlasfám: 218-98055

14541-5

1093 Budape

7/2

III.

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Glu-RírAla-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID N0:6)-Y)

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R28-Y

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Glu-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X- (SEQ ID NO.: 7) -Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y

IV.

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Ri2Leu-Arg-Lys-Gln-Ri7-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:8)-Y]

Leu-Asp-Ser-R2e-Leu-R28-Y

X-HIs-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:9)-Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y

V.

X-R1-R2-Asp-Alá-V al- Rg-Thr- Rg-Asn- R 1 g-Th r-R 2Leu-Arg-Lys-R 1 g-R-i 7-Ala-R! ₉-Lys-Lys-R₂2[X-(SEQ ID NO:10)-Y]

Dr. Tóth-Urbán László

1093 BudaJbst.<4iuzra.d,y u. 24. I.

14541-a

11/'·

Lsu-R24-Asp-R26-R27R28‘Y

7/3

X-Ri -Rg-Asp-Ala-VakRe-Thr-Ra-Asn-Rio-Thr-Ri 2Leu-Arg-Lys-R 1 θ-R 17-Ala-R 1 g-Lys-Lys-R₂₂[X-(SEQ ID NO:11)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R27-Thr-Y

X-RvR^Asp-Ala-Val-Rs-Thr-Rg-Asn-Rio-Ttir-R^

Leu-Arg-Lys-Ri6-Nla-Ala-Ris-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:12)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R2r^Th|’-Y

X-R1 -R2-Asp-Ala-Val-Re-Thr- R₈-Asn-R 1 o-Thr-LeuLeu-Arg-Lys-Rie-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22* [X-(SEQ ID NO:13)-Y]

Leu-R24‘Asp-Val-R27Thr-Y

X-RrRrAsp-Ala-Val-Re-Thr-Re-Asn-Rio-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ri9-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:14)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R27-Thr-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R₈-Asn-R₁o-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:15)-Y]

Dr. Tóth-Urbán László

1093 BudapeVLvÁöí.íi?11/a

OTEVzámlaszáin: 218-98055 14541-5

Leu-R₂4-Asp-Val-R₂rThr-Y

7/4

X-Ri -RyAsp-Ala-Val-Re-Thr-Rg-Asn-Rio-Thr-Ri 2Leu-Arg-Lys-R 1 g'R 1 τ Ala-R 1 g-Lys-Lys-R₂₂[X-(SEQ ID NO:16)-Y]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R₈-Asn-R₁o-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:17)-Y]

Leu-R₂₄-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-RvRa-Asp-Ala-VahRe-Thr-Ra-Asn-Rio-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ri_e-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:18)-Y]

Leu-R₂4-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-Ri-R2-Asp-Ala-Val-Re-Thr-R8-Asn-Rio-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂2[X-(SEQ ID NO:19)-Y]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-Ri-R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Rs-Asn-Rio-Thr-LysLeu-Aig-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂2[X-SEQ ID NO:70-Y]

Dr. Tóth-Urbán László ιιϊί t

1093 Budámét, KörraXWr u. 24. 1. 11/a

14541-5

Leu-R₂4-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

7/5

X-Ri-Ser-Asp-Ala-Val-Re-Thr-Re-Asn-Rio-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID No:71-Y]

X-RrAla-Asp-Ala-Val-Re-Thr-Ra-Asn-Río-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID NO:72-Y]

X-Ri-Rz-Asp-Ala-Vai-Re-Thr-Re-Asn-RiQ-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ala-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID NO:73-Y]

11/5

Ί/6

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY ··*'·*’·’T

3194'92

Ac-HIs-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-TyrLeu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-NH₂ lAc-(SEQ ID NO:2Q)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo(8-»12) b. [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyclo (Asp⁸-»Lys¹²) c.

[Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂]

11/s

DrS&íth Urbán Lászlg

Őre számlaszám: 218- 98055

14541-5

7/7

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

1*12 0

94. A 89. igénypont szerinti olyan ciklikus peptidek, ahol R₂g J^el^entése Val és R₂g jelentése Thr /X-(SEQ ID NOsll)-Y/.

95. A 89. igénypont szerinti olyan ciklikus peptidek, ahol Ryy jelentése Nle; R₂₆ jelentése Val és R₂g jelentése

Thr /X-(SEQ ID NOsl2)-Y/.

96. A 89. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:31)-NH/ ciklikus peptid.

97. A 95. igénypont szerinti olyan ciklikus peptidek, ahol jelentése Alá; R₂g je- lentése Val és R₂g jelentése Thr /X-(SEQ ID N0;13)-Y/.

98. A 97. igénypont szerinti Ac-/2-Nal¹⁹,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0i35)-NH₂/ ciklikus peptid.

99. A 97. igénypont szerinti Ac-/O-?Me-Tyr¹⁹,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo /Ac-(SEQ ID N0í36)-NH₂/ ciklikus peptid.

100. A 97. igénypont szerinti Ac-/p-P-Phe⁶,p-NH2-Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:37)-NH2/ ciklikus peptid.

101. A 95. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol jelentése Lys; R^y jelentése Nle; R₂6 jelentése Val és

R₂₈ jelentése Thr /X-(SEQ ID N0:14)-Y/.

- 143 -

102. A 101. igénypont szerinti Ac-/Lys¹⁷,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁸, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0s28)-NH₂/ ciklikus peptid.

103. A 101. igénypont szerinti Ac-/p-F-Fhe^,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly^29,3O,Met³¹/ VIP (1-31)-¾ ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:30)-NHy ciklikus peptid.

r Q η p

104. A 101. igénypont szerinti Ac-/p-F-Phe°,G-lu ,Lys^x Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly^29,30,Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:66)-NH₂/ ciklikus peptid.

105. A 95. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₁₂ jelentés

R₂g jelentése Val és R₂g .jelentése Thr /X-(SEQ ID N0sl5)-Y/.

106. A 105. igénypont szerinti Ac-/lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:29)-NHg/ ciklikus peptid.

107. A 105. igénypont szerinti Ac-/p-F-Phe⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Oly²⁹’^3Ö^s(Acm)³¹/-VIP (1-31)-¾ ciklo (Iys^2:L-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:32)-8^/ ciklikus peptid.

108. A 105. igénypont szerinti Ac-/Alá²,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂/' ciklikus peptid.

109. A 105. igénypont szerinti Ac-/N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,V91²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO;34; -NH^ ciklikus peptid.

1Ω Ί 2 17

110. A 105. igénypont szerinti Ac-/0-Me-Tyr ,Lys ,Nle ,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:41) ciklikus peptid.

- 144 -

111. A 105. igénypont szerinti Ac-/p-F-Phe⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹, Asp²⁵,Val²⁶ ₁Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:49)-NH/ ciklikus peptid.

112. A 105. igénypont szerinti Ac-/l-Nal⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:50)-NHy ciklikus peptid.

113. A 105. igénypont szerinti Ac-/p-NH₂-Phe¹®,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NOí54V -NHg/ ciklikus peptid.

114. A 105. igénypont szerinti Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-0CHg,~ Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:55 -NHg/ ciklikus peptid.

115. A 105. igénypont szerinti Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Aső²⁵,Val²⁶,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:^! -NH₂/ ciklikus peptid.

116. A 105. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly^29,3°,Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0í65)-NH₂/ ciklikus peptid.

117. A 89. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₂g jelentése Leu és R₂y és R₂q mindegyike Lys /X-(SEQ ID NOfu.

Y/

118. A 117. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R^₂ jelentése Lys; jelentése Alá; R^g jelentése Alá;

R₂g jelentése Leu és R₂y és R₂g mindegyike Lys /X-(SEQ ID NO:17)-//%

119. A 118. igénypont szerinti Ac-/Glu,Lys¹²,Ala^18,17,19,Asp²⁵,Leu²⁸,Lys^27,28/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:60)-NH₂/ ciklikus peptid.

• · • «

- 145 -

120. A 118. igénypont szerinti AcVAla\Lys¹²,Ala^16,17,19,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:62)-NH₂/ ciklikus peptid.

121. A 118. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Ala¹^^,17,19,“ Ala²\Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:64)-NH₂/ ciklikus peptid.

122. A 117. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₁₂ jelentése Lys; R₁y jelentése Nle; R₂g jelentése Leu és R₂y és R₂g mindegyike Lys /X-(SEQ ID N0:18)-Y/.

123. A 122. igénypont szerinti Ac-/Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28,Gly^29,30,Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac—(SEQ ID NO:67)-1^3/ ciklikus peptid.

124. A 122. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Lys^²,Nle^⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸,Gly^29,30,Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:68)-NH₂/ ciklikus peptid.

125. A 122, igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R^₂ jelentése Lys; R^y jelentése Nle; R-^g jelentése Alá;

R₂g jelentése Leu és R₂y -Y/.

és R₂q mindegyike Lys /X-(SEQ ID NO:19)-

126. A 125. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₁₂ jelentése Lys; R^ jelentése Gin; R-j_y jelentése Nle; Rj.g jelentése Alá; R₂g jelentése Leu és R₂y és R₂q mindegyike Lys /X-(SEQ ID N0:70)-Y/.

127. A 126. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₂ jelentése Ser; ^R12 jelentése Lys; ^R16 jelentése Gin;

R^y jelentése Nle; R-^g jelentése Alá; R₂g jelentése Leu és R₂y és R_2Q mindegyike Lys /X-(SEQ ID N0:71)-Y/.

• ♦·· · · · · • * · » ·

- 146 -

128. A 127. igénypont szerinti Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NOsSÖ)-!®^ ciklikus peptid/

129. A 127. igénypont szerint Ac-/N-Me-Ala ,Lys ,Nle ,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID ΝΟ:39)-ΝΗ₂/ ciklikus peptid.

130. A 127. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Iys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:40)-NEL·/ ciklikus peptid,

131. A 127. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸, Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸,Ala²⁹“³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID Ν0:42·)-ΝΗ^/ ciklikus peptid.

Ί Q Ί Ο

132. A 127. igénypont szerinti Ac-/N-Me-Ala^x,Glu°,Lys^x ,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:44)-NH/ ciklikus peptid.

133. A 127. igénypont szerinti Ac-/p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,· Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID ΝΟ:45)-ΝΗ^/ ciklikus peptid.

134. A 127. igénypont szerinti Ac-/l-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:46)-NH₂/ ciklikus peptid.

135· A 127. igénypont szerinti Ac-/ⁱGlu⁸,p-NH₂-Phe¹^,Lys¹²,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:47)-NHV ciklikus peptid.

8 TO 12

136. A 127. igénypont szerinti Ac-/Glu ,0-Me-Tyr ,Lys,Nle¹⁷,Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0s48)-NH₂/ ciklikus peptid.

• ·

- 147 -.

137. A 127. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸,Gly²⁹»^3O,Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NOí52^-NH^/ ciklikus peptid.

138. A 127. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH3-Tyr²²fAsp²⁵,Leu²⁶,Iys^27,28/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:57)-NH2/ ciklikus peptid.

139. A 127. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁸,Lys^27,28/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac~(SEQ ID NO :58 )-^2/ ciklikus peptid.

140. A 127. igénypont szerinti Ac-/Ala^,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴‘,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:59)-NH2^ ciklikus peptid.

141. A 127. igénypont szerinti Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28,Ala²⁹~³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:69) -NHg/ ciklikus peptid.

142. A 128. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek, ahol R₂ jelentése Alá? R^₂ jelentése Lys? R^g jelentése Gin? jelentése Alá? R₂g jelentése Leu és R₂y és R₂₈ mindegyike Lys /X-SEQ ID N0:72)-Y/.

143. A 142. igénypont szerinti Ac-/Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28,Ala^{29 31}/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac~(SEQ ID NO:43)-NH2/ ciklikus peptid.

144. A 142. igénypont szerinti Ac-/Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,As p^{2 5},Leu²⁶,Lys ²⁷’²⁸,Gly²⁹’³⁰,Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:51)-NH^/ ciklikus peptid,

145Í A 142. igénypont szerinti Ac-/Ala²,Glu⁸,Lys¹²,NLe¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:53)-NH2/ ciklikus peptid.

* ί*. · • · · · · ·

146· A 125. igénypont szerinti olyan ciklikus polipeptidek,

- 148 ahol a₁₂ jelentése Lys; Rjelentése Alá; R^y jelentése Nle;

R-^ jelentése Alá; R₂6 jelentése Leu és R₂y és R₂q mindegyike Lys /X-(SEQ ID N0:19)-Y/.

147. A 146. igénypont szerinti Ac-/Ala²,Lys¹²,Ala¹⁸,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²5,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:61)-NH₂/ ciklikus peptid.

8 12 16 17

148. A 146. igénypont szerinti Ac-/Glu ,Lys ,Ala ,Nle

Alá¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷»²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID

N0:63)~NH2/ ciklikus peptid.

149. Gyógyászati készítmény, azzal jelleme zve , hogy valamely, a 76-148. igénypontok 'bármelyike szerinti ciklikus pepiidet és kívánt esetben egy vagy több más gyógyászatilag hatá sos anyagot és inért gyógyászatilag alkalmas vivőanyagot tartal maz.

A bejelentő helyett a meghatalmazott;

Dr. Tóth-Urbán László

1093 Budapest?

Adószál

OTP

056-,

14541-5

7/1 _{3 1} g ₄ / 9 2 KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

626 06

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-LeuArg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-IleLeu-Asn-NH2 [(SEQ ID NO:1)-NH₂]

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Re-Asn-Tyr-Thr-Ri2Leu-Arg-Lys-GIn-R 17- Ala-Val-Lys-Lys-TyrLeu-Asp-Ser-R2e-Leu-R28-Y [X-(SEQ ID NO:2)-Y]

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asn-Tyr-Thr-R₁₂Leu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:3)-Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y

X-Hls-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asp-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-GIn-RirAla-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:4)-Y]

Leu-Asp-Ser-R₂6-Leu-R₂8-Y

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asn-Asp-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-TyrLeu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y [X-(SEQ ID NO:5)-Y]

Dr. Tóth-Urbán László »'

1 12

34. / A 30. igénypont szerinti eljárás Ac-/N-Me-Ala , Lys ,

... 17 .. 19 . 25 .26 28 , ,,_τη ,, , 21 . 25.

Nle , Alá , Asp , Val , Thr /-VIP ciklo (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

- 131

10 12

35. / A 30. igénypont szerinti eljárás Ac-/0-Me-Tyr , Lys , Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO^D-NHg/ ciklikus peptid előállítására.

6 12

36. / A 30. igénypont szerinti eljárás Ac-/p-F-Phe , Lys , Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:49)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

R 1 ?

37./ A 30. igénypont szerinti eljárás Ac-/1-Nal , Lys , .... 17 .,19 .25 ,, .26 28 . ,,_T_ ... ,_T 21 . 25·,

Nle , Alá , Asp , Val , Thr /-VIP ciklo (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID NO:50)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

38./ A

30.

τ 12 17

Lys Nle ,

21 . 25.

(Lys -Asp ) igénypont szerinti eljárás .,19 .25 ,, ,26

Alá , Asp , Val , /Ac-(SEQ

ID N0:54)-NH₂/

Ac-Zp-NHg-Phe¹⁰,

Thr²⁸/-VIP ciklikus ciklo peptid előállítására.

39./ A 30.

igénypont , , 19 „„„ m 22

Alá , m-OCHg, Tyr , szerinti eljárás .25 ,, , 26

Asp , Val , a /T 12 Ac-/Lys

OQ

Thr /-VIP

17 Nle , ciklo _fI 21 . 25.

(Lys -Asp ) /Ac-(SEQ

ID N0:55)-NH₂/ cikiikus peptid előál1ítására.

40./ A 30.

igénypont

Alá¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, szerinti eljárás .26 28, ,,_T_. Val , Thr /-VIP * ζτ 12 Ac-/Lys , ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) in 17 Nle , /Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

- 132 τ 12

Lys ,

Ac-/Glu⁸,

41./ A 30. igénypont szerinti eljárás

... 17 .. 19 . 25 ,, .26 28 29,30

Nle , Alá , Asp , Val , Thr , Gly

Thr³¹/-VIP ciklo

21 25 (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:65)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

42./ A 14. igénypont szerinti e1járás olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol R„„ go mindegyike Lys /X-(SEQ ID NO:16)-Y/.

Jelentése

Leu és ^R27 ^{éa R}2S

43./ A 42. igénypont szerinti e1Járás olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol R₁₂

Jelentése

Lys, R_1?

Jelentése Alá, R^_g Jelentése Alá, R₂g Jelentése Leu és és

R₂₈ mindegyike Lys /X-(SEQ

ID NO:17J-Y/.

44./ A 43. igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu, Lys , .. 16,17,19 . 25 . 26 , 27,28. „_TD ... 21 . 25.

Alá , Asp , Leu , Lys /-VIP ciklo (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:60)-NH_/ ciklikus peptid előállítására.

45./ A 43.

Alá¹⁶’¹⁷·¹⁹ (Lys²¹-Asp²⁵) igénypont szerinti eljárás Ac-/Ala⁸, Lys¹²,

.. 24 * 25 . 26 . 27,28. ,._TD ...

Alá , Asp , Leu , Lys /-VIP ciklo /Ac-(SEQ ID N0:62)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

- 133 τ -¹²

Lys ,

46./ A 43.

Alá¹⁶’¹⁷’¹⁹ , igénypont

.. 24 Alá , g szerinti eljárás Ac-/Glu , a 25 .26 , 27,28 . _WTO Asp , Leu , Lys /-VIP ciklo

z. 21 . 25 x (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ

ID N0:64)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

47./ A 42. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol R₁₂ jelentése Lys, R₁₇ jelentése Nle, R„„ Jelentése Leu és R„„ és R__o mindegyike Lys c. í Zo /X-(SEQ ID NO:18)-Y/.

1? 17 24

13. / A 12. igénypont szerinti eljárás Ac-/Lys , Nle , Asp

Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²⁰-Asp²⁴) /Ac-(SEQ ID N0:27)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

14. / Eljárás V általános képletű /X-(SEQ ID NO: 1OJ-Y/ Jelű ciklikus peptidek

- ahol Rj jelentése His, N-CH^-Ala; Rg Jelentése Ser vagy Alá; Rg Jelentése egy (I) általános képletű csoport, melyben Q Jelentése kis szénatomszámú alkil-ciklohexil vagy kis szénatomszámú alkil-aril csoport; R_o Jelentése Asp, Glu vagy o

Alá; Jelentése Tyr vagy FU-tal azonos;R._ Jelentése Arg vagy 1U b Id

Lys; Rjg Jelentése Gin vagy Alá; Jelentése Met, Nle vagy

Alá; R_ig Jelentése Val vagy Alá; R₂₂ Jelentése Tyr vagy Rg-tal azonos; R„. Jelentése Asn vagy Alá; R„„ Jelentése Ile, Val, vagy ^4 db

Rgg Jelentése Asn, Thr vagy

Lys, X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino védőcsoport, Y Jelentése hldroxicsoport vagy hidrolizálható karboxi védőcsoport vagy ^R2g^-R3o^-R3i^-Z> ahol R_2g Jelentése Gly vagy Alá; R_gg Jelentése Gly vagy Alá; R_g^ Jelentése Alá, Met, Cys (Acm), vagy Thr; Z Jelentése hidroxilcsoport vagy egy hidrolizálható karboxi védőcsoport - vagy ezek gyógyszerészeti lég megfelelő sóinak előállítására azzal Jellemezve, hogy (a) egy védett és gyantához kötött megfelelő aminosav szekvenciájú peptid védőcsoportjait szelektíven eltávolítjuk, hogy oldalláncbeli szabad aminocsoportot és oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kapjunk, •·· 9 · · ·« • · · · · «·· ·· ··

- 127 - (b) az oldalláncbeli szabad aminocsoportot és az oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kovalensen összekötjük egy megfelelő amidképző reagenssel, (c) eltávolítjuk a védőcsoportot és a gyűrűs peptideket lehasítjuk a gyantáról megfelelő védőcsoport eltávolító és hasító reagenssel, szükség esetén további adalékok, például kation eltávolítók Jelenlétében, és szükség esetén a gyűrűs peptideket gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.

15. / A 14. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus peptid előállítására, melyben Q Jelentése metil-ciklohexil-csoport.

16. / A 14. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus peptid előállítására, melyben Q Jelentése C₁_₂-alkil-aril-csoport.

17. / A 16. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus peptid előállítására, melyben Q Jelentése C^-alkil-fenil-csoport, melyben a fenilgyűrű szubsztituálatlan vagy egyszer vagy többször OH, OCH_g F, Cl, I, CH_3> CFg, NOg, NH₂, N(CH₃)_2> NHCOCH„, NHCOC„H„ vagy C(CH„)„ csoporttal van szubsztituálva.

J O O J J

- 128

18./ A 16. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus peptid előállítására, melyben Q Jelentése ^c^_2 alkil-naft11-csoport, melyben a naftilgyűrű szubsztituálatlan vagy egyszer vagy többször

OH, OCILj F,

Cl, i, ch₃, cf₃, no₂, nh₂, n(ch₃)₂,

NHCOCHg, NHCOCgHg vagy CÍCHg)^ csoporttal van szubsztituálva.

19./ A 14. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus peptidek előállítására, ahol R„_o

2b /X-(SEQ ID NO:11)-Y/.

Jelentése Val és R__o Jelentése Thr

20./ A 14. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus peptidek

Jelentése Nle, R₂₆ Jelentése Val és R₂₈ előállítására, ahol R₁₇ /X-(SEQ ID NO:12)-Y/.

Jelentése Thr

21./ A 14.

λ 25 .26

Asp , Val ,

8 12 17 igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu , Orn , Nle ,

OQ 04 OR

Thr /-VIP ciklo (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID NO: 31)

-NH,,/ ciklikus peptid előállítására.

22. / A 20. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus peptidek előállítására, ahol R₁₂ Jelentése Leu, R^ jelentése Nle, Jelentése Alá, R__ Jelentése Val és R„_o Jelentése Thr /X-(SEQ ID

ZÓ

NO:13)-Y/.

10 12 17

23. / A 22. igénypont szerinti eljárás Ac-ZZ-Nal¹ ,Leu¹ , Nle Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:35)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

-129 -

10 12

24. / A 22« igénypont szerinti eljárás Ac-/0-Me-Tyr , Leu _t Nle¹⁷, Alá¹⁹, Asp²⁵ , Val²⁶ , Thr²⁸ /-VIP ciklo /Ac-(SEQ ID N0:36)-NHg/ ciklikus peptid előállítására.

θ

25. / A 22. igénypont szerinti eljárás Ac-/p-F-Phe , p-NH„-Phe ,Leu , Nle , Alá , Asp , Val , Thr /-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:37)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

26. / A 20. igénypont szerinti eljárás, olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol R₁₂ Jelentése Lys, R_1? Jelentése Nle, Rgg Jelentése Val és Rgg Jelentése Thr /X-(SEQ ID NO: 14)-Y/.

1717

27. / A 26. igénypont szerinti eljárás Ac-/Lys , Nle , Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:28)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

R1Π

28. / A 26. igénypont szerinti eljárás Ac-/p-F-Phe , 2-Nal , . 12 ... 17 . 25 ,, .26 28 29,30 „ .31 ._VTn

Lys , Nle , Asp , Val , Thr , Gly , Met /VIP ?125 (1-31)-NH₂ cikloíLys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:30)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

29./ A 26. igénypont szerinti eljárás Ac-/p-F-Phe⁶, Glu⁸, . 12 _M1 17 . 25 .26 28 29,30 _T. 31, _UTD ...

Lys , Nle , Asp , Val , Thr , Gly , Thr /-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:66)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

- 13^υ -

30. / A 20. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol Jelentése Lys, R_1? jelentése Nle, R_ig jelentése Alá, R^g jelentése Val és R_2g Jelentése Thr /X-(SEQ ID NO:15)-Y/.

12 17

31. / A 30. igénypont szerinti eljárás Ac-/Lys , Nle , Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:29)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

A 12

32./ A 30. igénypont szerinti eljárás Ac-/p-F-Phe , Lys , ... 17 _A1 19 . 25 ,, .26 _. 28 29,30 „ , . .31 , _VTD

Nle , Alá , Asp , Val , Thr , Gly , Cys(Acm) /-VIP

21 28 (1-31)-NH₂ ciklo (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:32)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

2 12

72. / A 71. igénypont szerinti eljárás Ac-/Ala , Lys ,

.. 16 ... 17 .. 19 .. 24 . 25 . 26 . 27,28 , _VTP

Alá , Nle , Alá , Alá , Asp , Leu , Lys ,/-VIP ciklo (Lys-Asp) /Ac-(SEQ ID N0:61)-NH₂/ ciklikus előál1ítására.

Q

73. / A 71. igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu ,

.. 16 17 .. 19 . 25 . 26 . 27,28 . ,._TD

Alá , Nle , Alá , Asp , Leu , Lys ,/-VIP (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:63)-NH₂/ ciklikus előállítására.

74. / Eljárás győgyszerkompozíciő előállítására,

Jellemezve, hogy az 1-73. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított ciklikus peptidet és kívánt esetben egy vagy több más terápikusan aktív anyagot terápikusan inért vivőanyaggal összekeverjük és galenikus formára hozzuk.

75. / Az 1-73. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított ciklikus peptid alkalmazása a 74. igénypont szerinti győgyszerkompozíciő előállítására.

peptid

T ¹² Lys , ciklo peptid azzal

A meghatalmazott a/

1093 Buda;

Dr. Tóth-Urbán Lászlp «Γ......9 ^t,1. 11/a

Ofcí szánü^zám: 218-98055

14541-5 • · * ·

Képviselő: Dr.TÓTH-URBÁN László ügyvéd

Társképviselő: Dr.JALSOVSZKY Györgyné ügyvéd

165/1051

CIKLIKUS VAZOAKTIV PEPTIDEK ÉS ELJÁRÁS EZEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA

F.HOFFMANN-LA ROCHE AG, Bázel, Svájc

Feltalálók:

BOLIN Dávid Róbert Montclair, N.J.

O’DONNELL Margaret Clifton, N.J.

Amerikai Egyesült Államok

1992. 10. 09.

A bejelentés napjai

Elsőbbsége:

1991. 10. 11. (773.747)

Amerikai Egyesült Államok

- 139 -

76. /1/ általános képletű /X-(SEQ ID Ní2)-Y/ jelű ciklikus peptidek - ahol

Rg jelentése Asp, Glu vagy Lys; R^₂ jelentése Arg, Lys, Orn vagy Asp; R^y jelentése Met vagy Nle; R₂g jelentése Ile vagy Val;

Rgg jelentése Asn vagy Thr; X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino-védőcsoport; Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálható karboxi-védőcsoport vagy ezek gyógyszerészetileg megfelelő sói.

77. A 76. igénypont szerinti ciklikus peptidek, azzal jellemezve , hogy R-^y jelentése Nle; R₂g jelentése Val és R₂g jelentése Thr.

78. A 77. igénypont szerinti Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸/-

-VIP ciklo (Asp⁸-Lys¹²) /Ac-(SEQ ID N0í20)-NH₂/ ciklikus peptidek.

79. A 77. igénypont szerinti Ac/411u⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²/4. -VIP ciklo (Glu⁸-Lys¹²) / Ac-(SEQ ID NO:21)^^ ciklikus peptidek.

80. A 77· igénypont szerinti Ac-/Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸/-

-VIP ciklo (Asp⁸-Orn¹²) /Ac-(SEQ ID NOs23)-NH₂/ ciklikus peptidek.

81. A 77. igénypont szerinti Ac-/Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸/-VlP ciklo (Lys⁸-Asp¹²) /Ao-(SEQ ID N0;24)-NH₂/ ciklikus peptidek.

82. A 77. igénypont szerinti Ac-/Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸/-VlP ciklo (Glu⁸-Orn¹²) /Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂/ ciklikus peptidek.

83. /11/ általános képlett! /X-(SEQ ID N0í4)-Y/ jeli! ciklikus peptidek - ahol

Rg jelentése Asp vagy Asn; R-jj jelentése Met vagy Nle; R₂g jelen·»«·« · · · ··♦· « · « · V · « ······ ··*··· · ·« · ··» · ··

- 140 tése Ile vagy Val; R₂g jelentése Asn vagy Thr; X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino-védőcsoport; Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálhatő karboxi-védőcsoport vagy ezek gyógyszerészetileg megfelelő sói.

84. A 83. igénypont szerinti Ac-/Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁸(Thr²⁸/-VIP ciklo (Asp⁹-Lys¹²) /Ac-(SEQ ID N0:22)-NH2/ ciklikus peptidek.

85. /111/ általános képletű /X-(SEQ ID N0:6)-Y/ jelű ciklikus peptidek - ahol

Hyj jelentése Met vagy Nle; R₂g jelentése Ile vagy Val; R₂g .jelentése Asn vagy Thr; X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálhatő amino-védőcsoport; Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálható karboxi-védőcsoport vagy ezek gyógyszerészétileg megfelelő sói.

86. A 85. igénypont szerinti Ac-/Lys¹²,Glu¹⁵,Nle¹⁷,Val²⁵,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys¹²-Glu¹⁶) /Ac-(SEQ ID NÖ:26)-NH₂/ ciklikus peptidek.

87. /IV/ általános képletű /X-(SEQ ID N0:8)-Y/ jelű ciklikus peptidek - ahol

R₁₂ jelentése Arg vagy Lys; R-^ jelentése Met vagy Nle; R₂g jelentése Ile vagy Val; R₂g jelentése Asn vagy Thr; X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálhatő amino-védőcsoport; Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrolizálhatő karboxi-védőcsoport vagy ezek gyógyszerészetileg megfelelő sói.

88. A 87. igénypont szerinti Ac-/Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²^,Val^ ,Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²⁰-Asp²⁴) /Ac-(SEQ ID N0:27)-NH₂/ ciklikus peptidek.

*·«·

44«

-141-.

89. /V/ általános képletű /X-(SEQ ID N0;10)-Y/ jelű ciklikus peptidek

- ahol Jelentése His, N-CH^-Ala; Rg jelentése Ser vagy Alá;

R„ jelentése egy (I) általános képletű csoport, melyben Q Jelentése kis szénatomszámú alkil-ciklohexil vagy kis szénatomszámú alkll-arll csoport; Rg jelentése Asp, Glu vagy Alá; R_1Q Jelentése Tyr vagy Rg-tal azonos;R₁₂ Jelentése Arg vagy Lys; R._n Jelentése Gin vagy Alá; R₁₇ Jelentése Met, Nle vagy Alá; R_ig Jelentése Val vagy Alá; Rg₂ Jelentése Tyr vagy R^-tal azonos; R^ jelentése Asn vagy Alá; R_2g Jelentése Ile, Val, vagy Leu; Rg? Jelentése Leu vagy Lys, Rgg jelentése Asn, Thr vagy Lys, X jelentése hidrogénatom vagy hidrollzálhatő amino védőcsoport, Y jelentése hidroxicsoport vagy hidrollzálhatő karboxi védőcsoport vagy ⁸29^-Κ30^-^31^{_2, 81101 8}29 J^el^entése Oly vagy Alá; R_3Q Jelentése Gly vagy Alá; R₃₁ Jelentése Alá, Met, Cys (Acm), vagy Thr; Z jelentése hidroxilesöpört vagy egy hidrollzálhatő karboxi védőcsoport - vagy ezek gyógyszerészetileg megfelelő sói.

90. A 89. igénypont szerinti ciklikus peptid, amelyben

Q jelentése metil-ciklohexil-csoport.

91. A 89. igénypont szerinti ciklikus peptid, amelyben Q jelentés e C-^g-alkil-ar il-csoport.

92. A 91. igénypont szerinti ciklikub peptid, amelyben Q jelentése C₁_₂“^alkl-¹“^:E,en:i-l”^csoP^or^> amelyben a fenilgyürü helyettesitetlen vagy egyszer vagy többször OH, OCH^, F, Cl, I, CH^, OF3, N0₂, NH₂, N(CH^)₂> NHCOCHp NHCOCgH^ vagy CfCH^)^ csoporttal helyettesített.

- 142 -

93. A 91. igénypont szerinti olyan ciklikus peptid, amely- ben Q jelentése -naftil-csőport, amelyben a naftilgyűrű helyettesitetlen vagy OH, OCH^, F, Cl, I, OH^, CF^, N0₂, ^2’ NÍCH^g» NHCOCHp NHCOCgH₅ vagy C(CH^)^ csoporttal egyszeresen vagy többszörösen helyettesített.

Leu; Rj_y jelentése Nle; Rqq

2 8

70./ Az 67. igénypont szerinti eljárás Ac-/Ala , Glu , , 12 ... 17 19 _A 25 , 26 , 27,28 _z ,._TD

Lys , Nle , Alá , Asp , Leu , Lys , /-VIP ciklo

91 9R (Lys -Asp*°) /Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

• ·« ··*

- 138 -

71. / Az 50. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol Jelentése Lys, R^g

Jelentése Alá, Jelentése Nle, R^g Jelentése Alá, R₂₆ és Rgg mindegyike Lys /X-(SEQ ID

NO:19)-Y/.

2 8

48./ A 47. igénypont szerinti eljárás Ac-/Ala ,Glu ,

T 12 Lys , ui 17 Nle , * 25 .26 Asp , Leu , . 27,28 Lys Gly²⁹'³⁰, Thr³¹/-VIP ciklo ,. 21 . 25 x (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:67)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására. 49./ A 47. igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu⁸, T ¹² Lys , Ml ¹⁷ Nle , * 25 _r 26 Asp , Leu , . 27,28 Lys Gly²⁹’³⁰, Thr³¹/-VIP ciklo z. 21 . 25s (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:68)-NH₂/

ciklikus peptid előállítására.

50./ A 47. Igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol R₁₂ Jelentése Lys, R₁₇ Jelentése Nle, R_ig Jelentése Alá, R₂₆ Jelentése Leu és R₂₇ és Rgg mindegyike Lys /X-(SEQ ID NO:19)-Y/.

- 134

51./ Az 50. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol Jelentése Lys, ^R16 jelentése Gin, R₁₇ Jelentése Nle, Rj_g Jelentése Alá, R_2g Jelentése Leu és Rgy és R_2g mindegyike Lys /X-(SEQ ID N0:70)-Y/.

Jelentése mi

52. / Az 51. igénypont szerinti eljárás olyan ciklikus polipeptidek előállítására, ahol Jelentése Ser,

Jelentése Lys, R_lg Jelentése Gin, R₁₇ Jelentése Nle, R_ig Jelentése Alá,

Lys /X-(SEQ ID NO:71)-Y/.

12 17

53. / Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/Lys , Nle , _A1 19 . 25 . 26 , 27,28 . .,_TD 21 . 25. .. í_Crn

Alá , Asp , Leu , Lys /-VIP ciklo (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:38)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

54./ Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/N-Me-Ala ,

. 12 ... 17 _A1 19 * 25 .26 . 27,28 . _UTD Lys , Nle , Alá , Asp , Leu , Lys /-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására. 55./ Az 52. igénypont g szerinti eljárás Ac-/Glu , T ¹² Lys , ... 17 _A1 19 _A 25 , 26 Nle , Alá , Asp , Leu , Lys^27,28/-VIP ciklo (Lys²¹· * 25. -Asp )

/Ac-(SEQ ID N0:40)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

• · *

- 135 -

8 12

56./ Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu , Lys ,

17 ._Ί 19 . 25 . 26 . 27,28 .. 29-31. _UTD .. .

Nle , Alá , Asp , Leu , Lys Alá /-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:42)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

57./ Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/N-Me-Ala\ -.8 _T 12 17 19 . 25 ,26 , 27,28. _VTD

Glu , Lys , Nle , Alá , Asp , Leu , Lys /-VIP (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:44)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

ciklo

58./ Az 52. igénypont szerinti „.8 ,12 17 19 * 25

Glu , Lys , Nle , Alá , Asp , ciklo (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID o

eljárás Ac-/p-F-Phe , , 26 , 27,28, ,,_TD

Leu , Lys /-VIP

N0:45)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

g

59./ Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/1-Nal ,

Glu⁸, ciklo peptid Lys¹², Nle¹⁷, (Lys²¹-Asp²⁵) előállítására. Alá¹⁹, /Ac-(SEQ a 25 Asp , ID , 26 , 27,28 . ,,_TD Leu , Lys /-VIP N0:46)-NH₂/ ciklikus 60./ Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu⁸,

mu nu 10 t 12 17 .. 19 .25 , 26 p-NHg-Phe , Lys , Nle , Alá , Asp , Leu , Lys^27,28/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:47)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

• ♦ · • « 4· • 4 «· 4 · •· · • 4 ···

136

61./ Az 52. igénypont szerinti eljárás AC-/G1U⁸, „ „ _. 10 , 12 ... 17 ..19 O-Me-Tyr , Lys , Nle , Alá , * 25 Asp , , 26 , Leu , Lys 27, 28/_yip ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:48)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

62./ Az 52. igénypont Lys¹², Nle¹⁷, Alá¹⁹, Gly^29,30, Thr³¹/-VIP ciklo szerinti eljárás *25 , 26

Asp , Leu ,

Ac-/Glu⁸, (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID

N0:52)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

8 12

63. / Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu , Lys , Nle¹⁷, Alá¹⁹, m-0CH₃-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’²⁸/-VIP ciklo ?1 25 (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:57)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

8 12

64. / Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu , Lys ,

... 17 ... 19 _ , _ 22 .25 . 26 , 27,28. _VTD ,

Nle , Alá , m-F-L-Tyr , Asp , Leu , Lys /-VIP ciklo 21 25 (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

8 12

65. / Az 52. igénypont szerinti eljárás Ac-/Ala , Lys ,

... 17 *i 19 ..24 .25 , 26 , 27,28 . ,._TD ...

Nle , Alá , Alá , Asp , Leu , Lys /-VIP ciklo

21 25 (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID N0:59)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

66./ Az 52.

19 . 25

Alá , Asp , ₍. 21 . 25, (Lys -Asp ) igénypont τ 26 Leu , /Ac-(SEQ előállítására.

67./ az 51.

- 137 * «♦ «4 ·*«· ·«

3 · «· «

4 »· · · ···«

V · « ·4 * · A » ·«*

12 szerinti eljárás Ac-/Lys ,

Lys²⁷·²⁸, Ala^28-31/~VIP

ID N0:69)-NH₂/ ciklikus igénypont szerinti eljárás olyan polipeptidek előállítására, ahol R₂ Jelentése Alá,

Lys, R.„ jelentése Gin, lb 1 ( jelentése Nle, R^g ⁸26 J^elentése Leu, és ^R27 és R₂g mindegyike

N0:72)-Y/.

68./ τ 12 Lys , ciklo

Az 67. Igénypont

... 17 19 .25 ,26

Nle , Alá , Asp , Leu ,

91 9R (Lys -Asp ) /Ac-(SEQ ID szerinti eljárás . 27,28

Lys peptid előállítására.

Ml 17 Nle , ciklo pept i d ciklikus

Jelentése

Jelentése Alá,

Lys /X-SEQ ID

Ac-/Ala², Glu⁸,

Ala^29_31/-VIP

N0:43)-NH₂/ ciklikus

69./ Az 67. igénypont szerinti ,,„12 _M1 17 19 .25

Lys , Nle , Alá , Asp ,

Thr³¹/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ

Glu⁸,

27,28 29,30 ; > Gly eljárás Ac-/Ala², τ 26 , :

Leu , Lys

ID NO:51)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

2 12 17

33. / A 30. igénypont szerinti eljárás Ac-/Ala , Lys , Nle , Alá¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys²¹-Asp²⁵) /Ac-(SEQ ID N0:33)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

2. / Az 1. igénpont szerinti eljárás olyan ciklikus peptid előállítására, ahol R.„ Jelentése Nle, R„„ Jelnetése Val és R_OC(

11 cto 2ö

Jelentése Thr.

3. / A 2. igénypont szerinti eljárás Ac-/Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, 28 8 12

Thr /-VIP ciklo (Asp -Lys ) /Ac-(SEQ ID N0:20)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

4. / A 2. igénypont szerinti eljárás Ac-Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Glu⁸-Lys¹²) /Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

5. / A 2. igénypont szerinti eljárás Ac-(0rn¹², Nle¹⁷, Val²⁶, 28 8 12

Thr /-VIP ciklo (Asp -Oni ) /Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

6. / A 2. igénypont szerinti eljárás Ac-/Lys⁸, Asp¹², Nle¹⁷ , Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys⁸- Asp¹²) /Ac-(SEQ ID N0:24)-NH₂/ ciklikus peptid előállítására.

7. / A 2. igénypont szerinti eljárás Ac-/Glu⁸, Orn¹², Nle¹⁷ , Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Glu⁸-0rn¹²) /Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂ ciklikus peptid előállítására.

8./ Eljárás II általános képletű /X-(SEQ ID NO:4)-Y/ Jelű ciklikus peptid

- ahol R_q Jelentése Asp vagy Asn, R₁₇ Jelentése Met vagy Nle,

Jelentése Ile vagy Val, Jelentése Asn vagy Thr, X jelentése hidrogénatom vagy hidrolizálható amino védőcsoport, Y Jelentése hldroxicsoport vagy hidrolizálható karboxi védőcsoport

- vagy ezek győgszerészetileg megfelelő sóinak előállítására, azzal Jellemezve, hogy (a) egy védett és gyantához kötött megfelelő aminosav szekvenciájú peptid védőcsoportjait szelektíven eltávolítjuk, hogy oldalláncbeii szabad aminocsoportot és oldal láncbeii szabad karboxilcsoportot kapjunk, (b) az oldalláncbeli szabad aminocsoportot és az oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kovalensen összekötjük egy megfelelő amidképző reagenssel, (c) eltávolítjuk a védőcsoportot és a gyűrűs peptideket lehasítjuk a gyantáról megfelelő védőcsoport eltávolító és hasító reagenssel, szükség esetén további adalékok, például peptideket gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.

kation eltávolítók Jelenlétében, és szükség esetén a gyűrűs

- 124

8 9 12

9./ A 8. igénypont szerinti eljárás Ac-/Asn , Asp , Lys

Nle¹⁷, Val²⁶ , Thr²⁸ /-VIP clklo (Asp⁹ -Lys¹² ) /Ac-(SEQ ID

ΝΟ:22)-ΝΗ£/ ciklikus peptid előállítására.

10./ Eljárás a III általános képletű, /X-(SEQ ID N0:6)-Y/ Jelű ciklikus peptidek

- ahol jelentése Met vagy Nle, ίί,θ Jelentése Ile vagy Val, R„_o Jelentése Asn vagy Thr, X jelentése hidrogénatom vagy hídrólizálhatő amino védőcsoport, Y Jelentése hidroxicsoport vagy hídrólizálhatő karboxi védőcsoport - vagy ezek gyógszerészetileg megfelelő sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy védett és gyantához kötött megfelelő aminosav szekvenciájú peptid védőcsoportjait szelektíven eltávolítjuk, hogy oldalláncbeli szabad aminocsoportot és oldal láncbeli szabad karboxilcsoportot kapjunk, (b) az oldalláncbell szabad aminocsoportot és az oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kovalensen összekötjük egy megfelelő amidképző reagenssel, (c) eltávolítjuk a védőcsoportot és a gyűrűs peptideket lehasítjuk a gyantáról megfelelő védőcsoport eltávolító és kation eltávolítók jelenlétében, és szükség esetén a gyűrűs hasító reagenssel, szükség esetén további adalékok, például peptideket gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.

- 125 . ..., .· ··· « · · <·· ♦ · ♦ · * «·· »» « ·4

12 16

11. / A 10. igénypont szerinti eljárás Ac-/Lys , Glu , Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸/-VIP ciklo (Lys¹²-Glu¹⁶) /Ac-(SEQ ID N0:26)-NHg/ ciklikus peptid előállítására.

12. / Eljárás a IV általános képletú /X-(SEQ ID N0:8)-Y) Jelű ciklikus peptidek előállítására

- ahol Jelentése Arg vagy Lys, R₁₇ jelentése Met vagy Nle, Rgg Jelentése Ile vagy Val, R_2g Jelentése Asn vagy Thr, X Jelentése hidrogénatom vagy hídrólizálható amino védőcsoport, Y Jelentése hidroxicsoport vagy hídrólizálhatő karboxl védőcsoport

- vagy ezek győgszerészetileg megfelelő sóinak előállítására, azzal Jellemezve, hogy (a) egy védett és gyantához kötött megfelelő aminosav szekvenciájú peptid védőcsoportjait szelektíven eltávolítjuk, hogy oldal láncbeii szabad aminocsoportot és oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kapjunk, (b) az oldalláncbeli szabad aminocsoportot és az oldalláncbeli szabad karboxilcsoportot kovalensen összekötjük egy megfelelő amidképző reagenssel, (c) eltávolítjuk a védőcsoportot és a gyűrűs peptideket lehasítjuk a gyantáról megfelelő védőcsoport eltávolító és hasító reagenssel, szükség esetén további adalékok, például kation eltávolítók Jelenlétében, és szükség esetén a gyűrűs peptideket gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.

• · « · · «·« · · 9 ··· • · * · * • «9 *· · *9

- 126 -

3 1 9 4 ' 9 l /7/ /8/ /9/

Dr. Tcth-Urhán László ii íjmád /

1093 Budapgf. &t>7raxiSr u. 24. I. 11/a Adójúm

PTfJszarfflEsZ