FI111646B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten syklisen peptidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

111646

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen syklisen peptidin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee patenttivaatimuksessa 1 mää-' 5 riteltyä menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen sykli sen peptidin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi. Keksinnön mukaisesti saatavat sykliset peptidit ovat verisuoniin vaikuttavia vasoaktiivisen peptidin (VIP) analogeja ja ne ovat hyödyllisiä keuhkoput-10 kia ja henkitorvea kuristavien sairauksien hoidossa.

Vasoaktiivinen suolistopeptidi (VIP) löydettiin, eristettiin ja puhdistettiin ensimmäiseksi sian suolesta. (US-patentti 3 879 371). Peptidissä on kaksikymmentäkahdeksan (28) aminohappoa ja siinä on laajaa homologiaa sek-15 retiinin ja glukagonin kanssa. [Carlquist et ai., Horm.’ Metab. Res. 14 (1982) 28 - 29]. VIP:n aminohapposekvenssi on seuraavanlainen:

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-20 Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 [(SEQ ID NO:l)-NH2] VIP:llä tiedetään olevan laaja valikoima biologisia aktiivisuuksia koko ruoansulatuskanavassa ja veren-*? 25 kiertojärjestelmässä. Ottaen huomioon VIP:n samankaltai suus ruoansulatuskanavahormonien kanssa sen on todettu stimuloivan haima- ja sapen eritystä, maksan glykogeenin hajoamista glukoosiksi, glukagonin ja insuliinin eritystä ja aktivoivan haiman bikarbonaatin vapautusta. [Kerrins, 30 C. ja Said, S.I., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 142 (1972) :* 1014 - 1017; Domschke, S. et ai., Gastroenterology 73 (1977) 478 - 480].

Hermosoluja, jotka sisältävät VIP:in, on immuno-analyysin avulla paikallistettu olevan umpieritys- ja 35 avoeritysrauhasten, suolen ja sileän lihaksen solujen joukossa. [Polak, J.M. et ai., Gut 15 (1974) 720 - 724].

111640 2 VIP:n on todettu olevan neuroefektori, joka aiheuttaa useiden hormonien vapauttamista, mukaan lukien prolaktiini [Frawley, L.S. et ai., Neuroendocrinology 33 (1981) 79 - 83], tyroksiini [Ahren, B. et ai.. Nature 287 (1980) 343 -5 345] ja insuliini ja glukakoni [Schebalin, M. et ai., Am. J. Physiology E. 232 (1977) 197 - 200] . VIP:n on myös todettu stimuloivan reniinin vapautusta munuaisesta in vivo ja in vitro. [Porter, J.P. et ai., Neuroendocrinology 36 (1983) 404 - 408]. VIP:ä on todettu olevan läsnä erilais-10 ten eläinlajien ja ihmisen ilmateissä olevissa hermoissa ja hermopäätteissä. [Dey, R.D. ja Said, S.I., Fed. Proc. 39 (1980) 1062; Said, S.I. et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei. 221 (1974) 103 - 114]. VIP:n sydämeen ja verisuoniin liittyvät ja keuhkoihin ja keuhkoputkiin liittyvät vaikutukset 15 ovat kiinnostavia, koska VIP:n on todettu olevan tehokas verisuonia laajentava aine ja tehokas sileän lihaksen ren-touttaja, joka vaikuttaa periferisiin, keuhkojen ja sepel-valtimoverisuoniverkostoihin. [Said, S.I. et ai., Clin. Res. 20 (1972) 29]. VIP:llä on todettu olevan verisuonia 20 laajentava vaikutus aivoverisuoniin. [Lee, T.J. ja Ber-szin, I., Science 224 (1984) 898 - 900]. _In vitro -tutkimukset ovat osoittaneet, että vasoaktiivinen suolis-topeptidi, lisättynä ulkoisesti aivovaltimoille, aiheutti verisuonten laajentumista, mikä viittaa siihen, että VIP 25 on mahdollinen välittäjäaine (transmitter) aivojen verisuonten laajentamista varten. [Lee, T. ja Saito, A., Science 224 (1984) 898 - 901]. Silmässä VIP:n on myös osoitettu olevan tehokas verisuonten laajentaja [Nilsson, S.F.E. ja Bill, A., Acta Physiol. Scand. 121 (1984) 385 -30 392] .

• * VIP:llä voi olla säätelyvaikutuksia immuunijärjestelmään. O'Dorisio et ai. ovat osoittaneet, että VIP kykenee moduloimaan imusolujen lisääntymistä ja vaellusta. [J. Immunol. 135 (1985) 792 - 796].

35 Koska VIP:n on todettu rentouttavan sileää lihas ta, ja sitä on normaalisti läsnä ilmatiekudoksissa, kuten 3 111646 yllä on mainittu, on oletettu, että VIP voi olla keuhkoputkien sileän lihaksen rentoutuksen endogeeninen välittä- . ' jäaine. [Dey, R.D. ja Said, S.I., Fed. Proc. 39 (1980) 1962]. On osoitettu, että astmapotilailta peräisin olevat 1 5 kudokset eivät sisällä immunoreaktiivista VIP verrattuna normaaleilta potilailta peräisin olevaan kudokseen. Tämä voi viitata siihen, että VIP:n tai VIP:n vaikutukseen liittyvien hermosäikeiden puute liittyy astmasairauteen. [Ollerenshaw, S. et ai., New England J. Med. 320 (1989) 10 1244 - 1248]. In vitro ja in vivo -testaaminen on osoitta nut VIP:n rentouttavan henkitorven sileää lihasta ja suo-jaavan keuhkoputkea kuristavilta aineilta, kuten histamiinilta ja prostaglandiini F2a:lta. [Wasserman, M.A. et ai. teoksessa Vasoactive Intestinal Peptide, S. I. Said, 15 toim., Raven Press, N.Y., 1982, ss. 177 - 184; Said, S.I. et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei. 221 (1974) 103 - 114]. Laskimoon annettuna VIP:n on todettu suojaavan keuhkoputkea kuristavilta aineilta, kuten histamiinilta, prostaglandiini F2a:lta, leukotrieeneiltä, verihiutaleita aktivoivalta te-20 kijäitä, samoin kuin myös antigeenin aiheuttamilta keuhkoputken kaventumilta [Said, S.I. et ai., yllä, (1982)]. VIP:n on myös todettu estävän liman eritystä ihmisen ilma-tiekudoksessa in vitro. [Coles, S.J. et ai., Am. Rev. Res-pir. Dis. 124 (1981) 531 - 536].

, 25 Ihmisellä VIP:n on todettu, kun se on annettu in- fuusiona laskimoon astmapotilaille, aiheuttavan uloshengi-tyksen huippuvirtausnopeuden suurenemisen ja suojaavan histamiinin aiheuttamalta keuhkoputken laajentumalta. [Morice, A.H. ja Sever, P.S., Peptides 7 (1986) 279 - 280; 30 Morice, A. et ai., The Lancet II (1983) 1225 - 1227].

• I

Keuhkovaikutuksiin, jotka havaittiin tällä VIP:n infuusi-olla laskimoon, liittyi kuitenkin sydämeen ja verisuoniin liittyviä sivuvaikutuksia, huomattavimmin alhaista verenpainetta ja sydämen tiheälyöntisyyttä ja myös kasvojen pu-35 nastumista. Kun VIP annettiin laskimoon annoksina, jotka eivät aiheuttaneet sydän-verisuonivaikutuksia, VIP ei 111646 4 muuttanut ilmateiden ominaisjohtavuutta. [Palmer, J. B. D. et ai., Thorax 41 (1986) 663 - 666]. Aktiivisuuden puut teen selitettiin johtuvan annetusta alhaisesta annoksesta ja mahdollisesti yhdisteen nopeasta hajoamisesta.

5 Kun alkuperäistä VIP:tä on annettu aerosolin avul la ihmisille, se on ollut vain erittäin lievästi vaikuttava histaaminen aiheuttamalta keuhkoputken kaventumalta suojaamisessa. [Altieri et ai., Pharmacologist 25 (1983) 123]. VIP:llä ei todettu olevan merkittävää vaikutusta pe-10 rustason ilmatieparametreihin, mutta sillä oli suojaavaa vaikutus histamiinin aiheuttamaa keuhkoputken kaventumista vastaan, kun se annettiin lääkehöyryn hengittämisen avulla ihmisille. [Barnes, P.J. ja Dixon, C.M.S., Am. Rev. Respir. Dis. 130 (1984) 162 - 166]. On selostettu, että 15 aerosolin avulla annettuna VIP ei tuo esille sydämentykytys- tai verenpainetta alentavia vaikutuksia keuhkoputkien . laajentamisen yhteydessä. [Said, S.I. et ai. teoksessa Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, toim., Raven Press, N.Y., 1928, ss. 185 - 191].

20 VIP:n kiinnostavien ja mahdollisesti kliinisesti hyödyllisten biologisten aktiivisuuksien johdosta aine on ollut useiden sellaisten raportoitujen synteesiohjelmien kohde, joiden päämääränä on ollut parantaa yhtä. tai useampaa tämän molekyylin ominaisuuksista. Takeyama et ai. ovat 25 selostaneet VIP-analogin, jossa on glutamiinihapolla korvattu asparagiinihappo asemassa 8. Tämän yhdisteen todettiin olevan vähemmän tehokas kuin alkuperäinen VIP. [Chem. Pharm. Bull. 28 (1980) 2265 - 2269]. Wendlberger et ai.

ovat esitelleet sellaisen VIP-analogin valmistuksen, jossa 30 on norleusiinilla korvattu metioniini asemassa 17. [Peptide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp. (1980) 290 - 295]. Peptidin todettiin olevan yhtä tehokas kuin alkuperäinen VIP kyvyltään syrjäyttää radiojodattu VIP maksan kalvovalmis-teista. Watts ja Wooton ovat selostaneet sarjan lineaari-35 siä ja syklisiä VIP-fragmentteja, jotka sisältävät kuudesta kahteentoista jäännöstä alkuperäisestä sekvenssistä.

111646 5 [EP-patentit 184 309 ja 325 044; US-patentit 4 737 487 ja 4 866 039]. Turner et ai. ovat selostaneet, että fragment-' ti VIP (10 - 28) on VIP:n antagonisti. [Peptides 7 (1986) 849 - 854]. Substituoidun analogin [4-Cl-D-Phe6,Leu17] -VIP 5 on myös selostettu sitoutuvan VIP;n reseptoriin ja vastustavan VIP: n aktiivisuutta. [Pandol, S. et ai., Gastro-intest. Liver Physiol. 13 (1986) G553 - G557]. Gozes et ai. ovat selostaneet, että analogi [Lys1, Pro2,Arg3,Arg4, -Pro5,Tyr6]-VIP on kilpaileva inhibiittori VIP:n sitoutumi-10 selle sen hermotukisolujen pinnalla olevaan reseptoriin. [Endocrinology 125 (1989) 2945 - 2949] . Robberecht et ai. ovat selostaneet useita VIP-analogeja, joissa on korvauksina D-jäännöksiä alkuperäisen VIP:n N-päätteessä. [Peptides 9 (1988) 339 - 345]. Kaikki nämä analogit sitoutuivat 15 vähemmän tiukasti VIP:n reseptoriin ja osoittivat pienempää aktiivisuutta kuin alkuperäinen VIP c-AMP- . aktivaatiossa. Tachibana ja Ito ovat selostaneet useita edeltäjämolekyylin VIP-analogeja. [Teoksessa Peptide

Chem., T. Shiba ja S. Sakakibara, toimittajat, Prot. Res. 20 Foundation, 1988, ss. 481 - 486, JP-patentti 1 083 012, US-patentti 4 822 774] . Näiden yhdisteiden osoitettiin olevan 1-3 kertaa tehokkaampia keuhkoputken laajentajia kuin VIP, ja niillä oli 1-2 kertaa korkeampi verenpainetta alentavan aktiivisuuden taso. Musso et ai. ovat . 25 myös selostaneet useita VIP-analogeja, joissa on substituutioita asemissa 6-7, 9 - 13, 15 - 17 ja 19 - 28.

[Biochemistry 27 (1988) 8174 - 8181; EP-patentti 8 271 141; US-patentti 4 835 252]. Näiden yhdisteiden todettiin olevan yhtä tai vähemmän tehokkaita kuin alkupe-30 räinen VIP VIP:n reseptoriin sitoutumisessa ja biologisen vasteen suhteen. Bartfai et ai. ovat selostaneet sarjan monisubstituoituja [Leu17]-VIP-analogeja. [Kansainvälinen patenttihakemus W0 89/05857].

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan syklisiä vaso-35 aktiivisen peptidin analogeja. Syklinen peptidi on peptidi, jossa yhden peptidiketjussa olevan aminohapon sivuket- 111646 6 jukarboksipääte on kiinnittynyt kovalenttisesti toisen peptidiketjussa olevan aminohapon sivuketjuaminopäättee-seen amidisidoksen muodostumisen kautta. Tämä kahden peptidiket jussa olevan aminohappojäännöksen välinen kovalent-5 tinen sidos tuottaa rengasrakenteen.

Syklisten peptidien biologinen aktiivisuus voi olla oleellisesti erilainen verrattuna lähtöaineina olleiden lineaaristen analogien aktiivisuuksiin. Sykliset peptidit ovat konformaatioltaan jäykempiä omaten rajoitetumpia ra-10 kenteita. Nämä muutokset heijastuvat syklisten peptidien biologisissa profiileissa. Peptidianalogin saattaminen rengasmuotoon voi pidentää peptidin vaikutuksen kestoa suurentuneen jäykkyyden johdosta, mikä tekee sen vähemmän alttiiksi kemialliselle ja entsymaattiselle hajotukselle. 15 Syklisten peptidien biologinen hyötyosuus voi olla suurentunut rakenteen jäykistymisestä tuloksina olevien peptidin fysikaalisten ominaisuuksien muutosten johdosta. Lisäksi syklisen peptidin rajoitettu muoto voi antaa suuremman spesifisyyden kohdereseptorin suhteen kuin on lineaarisil-20 la peptideillä, vähentäen siten taipumusta toivotun biologisen aktiivisuuden myötä seuraaviin epäsuotaviin biologisiin aktiivisuuksiin.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan uusia syklisiä peptidejä, joilla on kaava IV 25 X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-R12- I (IV) 3 q Leu-Arg-Lys-Gln-R17-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- «·

Leu-Asp-Ser-R2s-Leu-R2s-Y [X-(SEQ ID NO: 8)-Y] 111646 7 jossa R12 on Arg tai Lys;· Rn on Met tai Nle; R26 on Ile tai Vai; R28 on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryhmä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai niiden farmaseut-5 tisesti hyväksyttäviä suoloja.

Edullisia kaavan IV mukaisista peptideistä ovat ne, joilla on kaava: X-His-Ser-Asp-Äla-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys- 10 I- leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ id N0:9)-Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y

15 jossa X ja Y ovat kuten edellä kaavassa IV.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan myös uusia syklisiä peptidejä, joilla on kaava V

2 X-RrR2-Asp-Ala-Val*R6-Thr-R8-Asn-Rio-Thr-Rl2-

Leu-Arg-Lys-Ri6-RirAla-Ri9-Lys-Lys-R22- [X-(SEQ ID N0:10)-Y] (y) I-

LeU"R24"ASp*R2g-R27'R28"Y

25 jossa Ri on His, N-CH3~Ala; R2 on Ser tai Ala; R6 on

30 Q

H 11 Ά O

35 jossa Q on alempialkyylisykloheksyyli tai alempialkyy-liaryyli; Rs on Asp, Glu tai Ala; Rio on Tyr tai R6,' R12 on 111646 8

Arg tai Lys; Ri6 on Gin tai Ala; R17 on Met, Nle tai Ala; R19 on Vai tai Ala; R22 on Tyr tai Rö; R24 on Asn tai Ala; R26 on Ile, Vai tai Leu; R27 on Leu tai Lys; R28 on Asn, Thr tai Lys; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suo-5 jaryhmä; Y on hydroksyyli, hydrolysoitavissa oleva karbok-sin suo jaryhmä tai R29-R30-R31-Z; R29 on Gly tai Ala; R30 on Gly tai Ala; R31 on Ala, Met, Cys (Acm) tai Thr; Z on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

10 Q on edullisesti:

Xl -ch2 „ -"--Ο. öo jolloin n on 1 tai 2; Xi ja X2 ovat itsenäisesti vety, OH, OCH3, F, Cl, I, CH3, CF3, NO2, NH2, N(CH3)2, NHCOCH3, NHCOC6H5 tai C(CH3)3.

20 Edullisemmin Q on bentsyyli, p-fluoribentsyyli, p- aminobentsyyli, p-hydroksibentsyyli, o-metyyli-, 1-metyy-linaftyyli tai 2-metyylinaftyyli. Q on edullisimmin bentsyyli .

Edullisia ovat seuraavien kaavojen mukaiset pepti- * 25 dit: X-Ri*R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-Rio-Thr-Ri2- I-

Leu-Arg-Lys-R 16-R17-AIa-R 19-Lys-Lys-R22- [x—(SEQ ID no-11)— Y] I-

Leu-R24-Asp-Val-R2rlhr‘Y

111646 9 X- R1 · R2-Asp-Ala-V ai- Rg-Th f- Rg-Asn- R ) g-Th r-Ri 2- l-

Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ri9-Lys-Lys-R22- [x-(SEQ ID NO:12)-Y] 5 I-

Leu-R24-Asp-V al-R27-Thr-Y X-Rr^-Asp-Ala-Val-Re-Thr-Rg-Asn-R^-Thr-Leu- 10 I-

Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-A!a-Lys-Lys-R22- [X-(SEQ ID N0:13)-Y] I-

Leu-R24-Asp-Val-R2rThr-Y

15 X-Ri-R2'Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R8-Asn-Rio-Thr-Lys- !

Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ri9-Lys-Lys-R22- [X-(SEQ ID NO:14)-Y] I--

2 0 Leu-R24-Asp-Val-R2?-Thr-Y

X-R1 -R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr*Re-Asn· R^o-Thr-Lys- • 25 Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22- [X- (SEQ ID NO· 15) — γ] I -

Leu-R24-Asp-Val-R27-Thr-Y

3 o X-RrR2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-R1o-Thr-Rl2- :· |

Leu-Arg-Lys-RTg-Ri7-Ala-Rig-Lys-Lys-R22- [X-(SEQ ID NO:16)-Y] I-

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

111646 10 X-Ri-R2'Asp-Ala-VaI-R6-Thr-R8-Asn-Rio"Thr-LyS'

, 1 I

-3 Leu-Arg-Lys-Ri6-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys-R22- [X-(SEQ ID NO: 11) -Y ] I-

leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

10 X-R1-R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-R1o-Thr-Lys- I-

Leu-Arg-Lys-Rie-Nle-Ala-R^-Lys-Lys-Raa- [x-(SEQ ID NO:l8)-Y] I--

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

15 X-RrR2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-R10-Thr-Lys- l

Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22- [X-(SEQ ID NO:19)-Y] 20 |

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R1-R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R8-Asn-Rio-Thr-Lys-

.: 25 I

Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22- I- -

Leu-R24-Asp-L.eu-Lys-L.ys-Y [X-SEQ ID NO : 7 0-Y] 30 "; X-Ri-Ser-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-R1trThr-Lys- I :

Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22- I--

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID No:71-Y] 111646 11 X-RrAla-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R8-Asn-Rio-Thr-Lys- 5 Γ”

Leu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22* I-

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID NO:72-Y] ^ X-RrRrAsp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-Rio-Thr-Lys- I “~

Leu-Arg-Lys-Ala-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22- i-—- leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID NO:73-Y] 15 111646 12 Tässä käytettynä termi "aryyli" tarkoittaa yk-siytimisiä aromaattisia hiilivetyryhmiä, kuten fenyyliä, jotka voivat olla substituoimattomia· tai substituoituja yhdessä tai useammassa asemassa alemmalla-alkyylillä, 5 alemmalla-alkoksilla, aminolla, nitrolla, mono- tai dia-lempialkyyliaminolla, alempialkyyliamidolla tai fenyy-liamidolla. "Aryyli" tarkoittaa myös moniytimisiä aryyli-ryhmiä, kuten naftyyliä, jotka voivat olla substituoituja yhdellä tai useammalla yllä mainitulla ryhmällä. Edullisia 10 aryyliryhmiä ovat fenyyli, joka on substituoimaton tai mo-nosubstituoitu fluorilla, tai substituoimaton naftyyli.

Tässä käytettynä X on aminoterminaalisen aminohapon aminotypessä oleva substituentti ja Y on karboksiter-minaalisen aminohapon karbonyyliryhmässä oleva substi-15 tuentti. X voi olla vety tai hydrolysoitavissa oleva ami-non suojaryhmä. Y voi olla hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä.

Mitä tulee termeihin "hydrolysoitavissa oleva ami-non suojaryhmä" ja "hydrolysoitavissa oleva karboksin suo-20 jaryhmä", mitä tahansa tavanomaisia suojaryhmiä, jotka voidaan poistaa hydrolyysin avulla, voidaan käyttää tämän keksinnön mukaan. Esimerkkejä sellaisista ryhmistä on alla. Edullisia aminon suojaryhmiä ovat Λ· - 30 jolloin X3 on alempialkyyli tai halogeenialempialkyyli.

.. Näistä suojaryhmistä sellaiset, joissa X3 on Ci-3-alkyyli tai halogeeni-Ci-3-alkyyli, ovat erityisen edullisia.

Edullisia karboksin suojaryhmiä ovat alempialkyy- liesterit, NH2 ja alempialkyyliamidit, jolloin Ci-3-alkyy-35 liesterit, NH2 ja Ci-3-alkyyliamidit ovat erityisen edullisia .

111646 13

Keksinnön mukaiselle menetelmälle edellä mainittujen uusien peptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) suojatusta ja hartsiin sidotusta peptidistä, 5 jolla on vastaava aminohapposekvenssi, poistetaan selektiivisesti suojausta vapaan sivuketjuaminoryhmän ja vapaan sivuketjukarboksyyliryhmän aikaansaamiseksi; b) vapaa sivuketjuaminoryhmä ja vapaa sivuketju-karboksyyliryhmä kytketään kovalenttisesti sopivan amidin- 10 muodostusreagenssin avulla ja c) peptidistä, jolle on suoritettu renkaanmuodos-tus, poistetaan suojaus ja se lohkaistaan hartsista käsittelemällä sopivalla suojauksenpoisto- ja lohkaisureagens-silla, haluttaessa muiden sopivien lisäaineiden ollessa 15 läsnä kationinpoistajina, ja haluttaessa muutetaan syklinen peptidi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Peptidien määrittelyyn käytetty nimistö on se, jota alalla tyypillisesti käytetään, jolloin N-päätteessä oleva aminoryhmä esiintyy vasemmalla ja C-päätteessä oleva 20 karboksyyliryhmä esiintyy oikealla. Luonnollisilla aminohapoilla tarkoitetaan jotakin luonnossa esiintyvistä aminohapoista, joita on proteiineissa, so. Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Milloin aminohapolla on ·· 25 isomeerisiä muotoja, edustettuna on aminohapon L-muoto, ellei toisin ole nimenomaan osoitettu.

Seuraavia lyhennyksiä tai symboleja käytetään edustamaan aminohappoja yllä kuvattujen lisäksi, suojaryh-miä, liuottimia, reagensseja ja vastaavia.

30 Symboli Merkitys ·♦· Ac asetyyli

Orn ornitiini

Nle norleusiini

Fmoc 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli 35 Fm 9-fluorenyylimetyyli

Boc t-butyylioksikarbonyyli 111646 14

Bom bentsyylioksimetyyli CH2CI2 metyleenikloridi CH3CN asetonitriili DMF dimetyyliformamidi 5 DIPEA N,N-di-isopropyylietyyliamiini TFA trifluorietikkahappo HOBT N-hydroksibentsotriatsoli DCC N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi DIC N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi 10 BOP bentsotriatsol-1-yylioksitri(dimetyyliamino)- fosfoniumheksafluorifosfaatti CH, Ν·Μ6·Α13 Η ΓθΗ

15 CH3 I

2-Nal f 20 %-A^oh p · 25 p-F-Phe f

H^V

H O 1 2 3 4 5 6 FAB-MS nopea atomi -pommitusmassaspektrometria 2 *·· Alkuperäisen VIP-peptidisekvenssin analogit on il 3 maistu ilmoittamalla korvatut aminohapot hakasuluissa en 4 nen ilmausta "VIP". Johdannaisen tekeminen N- 5 terminaalisesta aminoryhmästä, so. kuten X:n avulla yllä, 6 on osoitettu hakasuluissa olevien korvausten vasemmalla puolella. Sekvenssin numerot, jotka esiintyvät suluissa 15 111646 ilmauksen "VIP" oikealla puolella, osoittavat aminohappojen poistot ja lisäykset alkuperäisen sekvenssin numeroinnissa tehtyinä. Toisin sanoen esimerkiksi Ac-[Lys12,Nle17, Gly29]-VIP (1-29)-NH2 ilmaisee polypeptidin, 5 jonka aminohapposekvenssi vastaa alkuperäistä ihmisen VIP, jossa N-päätteessä on vety korvattu asetyyliryhmällä, ar-giniini on korvattu lysiinillä asemassa 12 ja metioniini on korvattu norleusiinilla asemassa 17. Lisäksi glysiini on kytketty asparagiinin 28 karboksyylikohtaan ja tämä on 10 nimitetty asemaksi 29. Loppuliitteet "-OH" ja "-NH2", jotka seuraavat ilmausta "VIP" tai sulkuja, viittaavat vastaavasti polypeptidin vapaaseen happo- ja amidimuotoon. Siinä tapauksessa että kumpaakaan loppuliitettä ei käytetä, ilmauksen tarkoitetaan käsittävän kummatkin muodot.

15 Kuten yllä on mainittu, tässä määritellyn mukainen syklinen peptidi on peptidi, jossa yhden peptidissä olevan aminohapon sivuketjukarboksipääte on kiinnittynyt kova-lenttisesti toisen peptidiketjussa olevan aminohapon sivuket juaminopäätteeseen amidisidoksen muodostuksen kautta. 20 Syklisen peptidin esittämiseen käytetään useita nimistöjä ja symboleja. Seuraavat ovat esimerkkejä: I 1

Ac-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys- * 25 Leu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- a.

Leu-Asp-Ser-V al-Leu -Thr-N H2 (Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2) •J v 9 • ·

Ac-[Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(8 - 12) b.

[AC-(SEQ ID NO: 20 )-NH2] 35 Ac-[Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Asp8 - Lys12) c.

[AC-(SEQ ID NO:20)-NH2] 16 111646

Yllä olevat kolme rakennetta (a - c) ja oheinen esitysmuoto, jossa käytetään ilmausta SEQ ID NO: ja alla olevaa sekvenssiluettelotietoa, kaikki esittävät ja määrittelevät saman polypeptidin, jonka aminohapposekvenssi 5 vastaa alkuperäistä ihmisen VIP, jossa vety on korvattu asetyyliryhmällä N-päätteessä, arginiini on korvattu ly-siinillä asemassa 12, metioniini on korvattu norleusiinil-la asemassa 17, isoleusiini on korvattu valiinilla asemassa 26 ja asparagiini on korvattu treoniinilla asemassa 28. 10 Lisäksi amidisidos on muodostettu asemassa 8 olevan aspa-ragiinihapon sivuketjukarboksyylin ja asemassa 12 olevan lysiinin sivuketjuamiinin kesken muodostaen siten syklinen peptidianalogi. Yllä olevien peptidirakenteen esittämisten katsotaan olevan samanarvoisia ja vaihdettavia.

15 Tässä käytettynä termit "Rn" aminohaposta, joka on asemassa n yhdessä tässä esitetyistä rakenteista, ja "Xaa" aminohaposta, joka on asemassa n vastaavassa sekvenssissä alla olevassa sekvenssiluettelossa, ovat samanarvoisia ja vaihdettavia niissä tapauksissa, joissa Xaa edustaa valin-20 taa kahden tai useamman aminohapon joukosta.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavissa syklisissä peptideissä pätevät seuraavat konfiguraatiot, ellei toisin ole ilmoitettu.

Ketjussa oleva Aminohapon pääte, joka on sidottu · 25 aminohappo syklisen peptidin aikaansaamiseksi

Lys ε-amino (ε = epsilon)

Orn δ-amino (δ = delta)

Asp β-karboksyyli (β = beeta) 30 Glu γ-karboksyyli (y = gamma) * · «

Edustavia tämän keksinnön mukaisesti saatavia yhdisteitä ovat peptidit, joilla on seuraavat aminohapposekvenssit : 35 111646 n

Ac-[Lys12,Nle17,Asp24,Vai26,Thr28]-VlP-syklo- (Lys20-»Asp24) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH2]

Ac- [Lys12 f Nle17, Asp22, Vai26, Thr28 ] - VIP -syklo-(Lys21-*Asp25) 5 [AC-(SEQ ID NO:28)-NH2]

Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25, Vai26, Thr28)-VIP -syklo-(Lys21—»Asp25) 10 [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH2)

Ac-[p-F-Phe6,2-Nal10,Lys12, Nle17, Asp25, Vai26,

Thr28, Gly2 28, Met81) - VIP -syklo-(Lys21 —»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH2) 15

Ac-[Glu8,Orn12,Nle17,Asp25, Vai28, Thr28)-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH2] 20 Ac-[p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Vai26,Thr28,

Gly29, 20, CyS (Acm) 31 ] - vip -syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2]

Ac-TAla2,Lys12,Nle17, Ala19,Asp25,Vai26,Thr28]-VIP-25 syklo-(Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH2]

Ac-[N-Me-Ala1,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, vai26, Thr28)-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) 30 [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH2] ) ·

Ac-[2-Nal10,Leu12,Nle17,Ala19, Asp25, vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH2]

Ac- [0-CH3~Tyr18, Leu 12 f Nle17, Ala19, Asp25, val2 6, Thr28 ] - VIP -syklo- (Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH2] 18 111646 5 Ac- [p-F-Phe6, p-NH2-Phe18, Leu 12, Nle17,Ala19, Asp25, Val26,

Thr28 ] -VIP-syklo- (Lys2l-»Asp25).

[Ac-(SEQ ID NO :37)-NH2]

Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-10 (Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH2]

Ac-FN-Me-Ala1,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Leu26, Lys27/28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) 15 [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH2]

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Leu26, Lys27·28]-VIP -syklo-(Lys21—»Asp25) [AC-(SEQ ID NO :4 0)-NH2) 20

Ac-[O-Me-Tyr10,Lys12,Nle17, Ala19,Asp25, Val26,Thr28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH2] • 25 Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27'28, Ala29-51]-VIP- syklo- (Lys21-» Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :42)-NH2]

Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17, Ala19,Asp25, Leu2 6,Lys27'28, 30 Ala29-31] -VIP -syklo-(Lys21—»Asp25) * [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH2]

Ac-[N-Me-Ala1,Glu8,Lys12,Nle17, Ala19, Asp25,Leu2 6,Lys27'28]-VIP- syklo- (Lys21—»Asp25) 35 [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH2] 19 111646

Ac- [p-F-Phe8,Glu8, Lys1 ^Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28 ] -VIP-syklo- (Lys21-4Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH2] 5 Acr [ 1-Nal8, Glu8, Lys72, Nle17, Ala19, Asp25, Leu2 8, Lys27'28 ] - VIP - syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:4 6)-NH2]

Ac- [Glu8, p—NH2-Phe18, Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu28, Lys27'28] -10 VIP -syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH2]

Ac- [Glu8,O-CH3-Tyr10,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP -syklo-(Lys21—>Asp25) 15 [Ac-(SEQ ID NO:4 8)-NH2]

Ac-[p-F-Phe8,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25,Val28,Thr28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :4 9)-NH2] 20

Ac-[1-Nal8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25, Val28,Thr28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :50)-NH2] *: 25 Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Leu28,Lys27'28,

Gly29'88,Thr31]-VIP-syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :51)-NH2]

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Leu28,Lys27'28, 30 Gly29'30, Thr31]-VIP-syklo-(Lys2l-^Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :52)-NH2]

Ac-LAla2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Leu2 8,Lys27'28]-VIP- syklo-(Lys21—»Asp25) 35 [Ac-(SEQ ID NO :53)-NH2] 111646 20

Ac-[p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17, Ala19, Asp25, Vai26,Thr28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH2] 5

Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, m-OCH3~Tyr22, Asp25,Val26,Thr28]-VIP-syklo- (Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :55)-NH2] 10 Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, m-F-L-Tyr22, Asp25,Vai26,Thr28]-VIP -syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :5 6)-NH2]

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,m-OCH3-Tyr22,Asp25,Leu26, 15 Lys27'28] - VIP - syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH2]

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17, Ala19,m-F-L-Tyr22, Asp25, Leu2 6, Lys27· 28]-VIP -syklo-(Lys21—»Asp25) 20 [Ac-(SEQ ID NO :58)-NH2]

Ac-[Ala8,Lys12,Nle17,Ala19,Ala24, Asp25,Leu26,Lys27'28]-VIP -syklo-(Lys21—»A.sp25) [Ac-(SEQ ID NO :5 9)-NH2] ·: 25

Ac-[Glu8,Lys12, Ala16'17' 19, Asp25, Leu2 6, Lys27'28]-VIP -syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH2] 30 Ac-[Ala8,Lys12,Ala16,Nle17,Ala19,Ala2^,Asp25, Leu26,Lys27'28]- VIP -syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :61)-NH2]

Ac-[Ala8,Lys12, Ala16'17'19,Ala24, Asp25, Leu26,Lys27'28]-VIP -35 syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :62)-NH2] 111646 21

Ac-[Glu8,Lys12,Ala16,Nle17, Ala19, Asp25,Leu26,Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH2] 5

Ac-.[Glu8,Lys12,Ala16'17'19, Ala24, Asp25, Leu26, Lys27' 28 ] -VIP-syklo- (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :64)-NH2] 10 · Ac-[Glu8,Lysl2,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28' Gly29'30,Thr31]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2]

Ac-[p-F-Phe8,Glu8,Lys12,Nle17, Asp25, Val28,Thr28, 15 Gly29' 30,Thr31]-VIP-syklo-(Lys2l-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2]

Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17, Asp25, Leu2 8,Lys27 > 28,

Gly29'30^ Thr31] -VIP-syklo-(Lys2l-»Asp25) 20 [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2]

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Asp25,Leu2 8, Lys27 >28, Gly29'3^,Thr31]-VIP — syklo- (Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :68)-NH2] •i 25

Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25, Leu2 8, Lys27'28,Ala29-31]-VlP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH2] 111646 22 Tämän keksinnön mukaisesti kaavojen IV ja V mukaiset yhdisteet voidaan helposti syntetisoida käyttäen mitä tahansa tunnettua tavanomaista menetelmää peptidisidoksen muodostamiseksi aminohappojen välille. Tällaisia tavan-5 omaisia menetelmiä ovat esimerkiksi mikä tahansa liuos-faasimenetelmä, joka sallii kondensaation sellaisen aminohapon tai sen jäännöksen vapaan alfa-aminoryhmän, jonka karboksyyliryhmä tai muut reaktiokykyiset ryhmät on suojattu, ja toisen aminohapon tai sen jäännöksen, jonka ami-10 noryhmä tai muut reaktiokykyiset ryhmät on suojattu, vapaan primaarisen karboksyyliryhmän kesken.

Menetelmä kaavojen IV ja V mukaisten yhdisteiden syntetisoimiseksi voidaan suorittaa käyttäen menettelyä, jossa kukin aminohappo halutussa sekvenssissä lisätään yk-15 si kerrallaan peräkkäin toiseen aminohappoon tai sen jäännökseen, tai menettelyä, jossa peptiditragmentteja, joissa on haluttu aminohapposekvenssi, syntetisoidaan ensin tavanomaisesti ja sitten kondensoidaan halutun peptidin aikaansaamiseksi .

20 Tällaisia tavanomaisia menetelmiä kaavojen IV ja V

mukaisten uusien yhdisteiden syntetisoimiseksi on esimerkiksi mikä tahansa kiinteän faasin peptidisynteesimenetel-mä. Sellaisessa menetelmässä uusien yhdisteiden synteesi voidaan suorittaa yhdistämällä peräkkäin halutut aminohap-25 pojäännökset yksi kerrallaan kasvavaan peptidiketjuun kiinteän faasin menetelmien yleisten periaatteiden mukaan [Merrifield, R.B., J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149 - 2154; Barany et ai., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, voi. 2, Gross, E. ja Meienhofer, J., toimittajat, 30 Academic Press (1980) 1 - 284).

Yhteistä peptidien kemiallisille synteeseille on eri aminohapporyhmien reaktiokykyisten sivuketjuryhmien suojaaminen sopivilla suojaryhmillä, jotka estävät kemiallista reaktiota tapahtumasta tuossa kohdassa, kunnes suo-35 jaryhmä lopulta poistetaan. Tavallisesti on yhteistä myös aminohapossa tai fragmentissa olevan alfa-aminoryhmän suo- 111646 23 jääminen siksi ajaksi kun tuo kokonaisuus reagoi karbok-syyliryhmän kohdalla, mitä seuraa alfa-aminon suojaryhmän selektiivinen poistaminen, jotta sallittaisiin seuraavan reaktion tapahtua tuossa kohdassa. Vaikka erityisiä suoja-5 ryhmiä on esitelty kiinteän faasin synteesimenetelmää varten, tulisi huomata, että kukin aminohappo voidaan suojata sellaisen suojaryhmän avulla, jota tavanomaisesti käytetään kyseistä aminohappoa varten liuosfaasisynteesissä.

Alfa-aminoryhmät voidaan suojata sopivalla suoja-10 ryhmällä, joka on valittu aromaattisista uretaanityyppiä olevista suojaryhmistä, kuten bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, kuten p-kloo-ribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli, p-bifenyyli-isopropyyliok-15 sikarbonyyli, 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc) ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyli (Moz); alifaattisista uretaanityyppiä olevista suojaryhmistä, kuten t-butyy-lioksikarbonyyli (Boc), di-isopropyylimetyylioksikarbon-yyli, isopropyylioksikarbonyyli ja allyylioksikarbonyyli.

20 Boc on edullisin alfa-aminon suojausta varten.

Karboksyyliryhmät voidaan suojata sopivalla suoja-ryhmällä, joka on valittu aromaattisista estereistä, kuten bentsyyli (OBzl) tai bentsyyli, joka on substituoitu alemmalla alkyylillä, halogeenilla, nitrolla, tiolla tai sub-25 stituoidulla tiolla, so. alempialkyyli (1-7 hiiliatomia) -tiolla; alifaattisista estereistä, kuten alempialkyyli, t-butyyli (Ot-Bu), syklopentyyli, sykloheksyyli (OcHx), sykloheptyyli ja 9-fluorenyylimetyyli (OFm). OBzl ja OFm ovat edullisimmat glutamiinihappoa (Glu) varten. OcHx, 30 OBzl ja OFm ovat edullisimmat asparagiinihappoa (Asp) var-ten.

Hydroksyyliryhmät voidaan suojata sopivalla suoja-ryhmällä, joka on valittu eettereistä, kuten bentsyyli (Bzl) tai bentsyyli, joka on substituoitu alemmalla alkyy-35 Iillä, halogeenilla, kuten 2,6-diklooribentsyyli (DCB), nitrolla tai nietoksilla; t-butyyli (t-Bu), tetrahydropyra- 111646 24 nyyli ja trifenyylimetyyli (trityyli). Bzl on edullisin seriiniä (Ser) ja treoniinia (Thr) varten. Bzl ja DCB ovat edullisimmat tyrosiinia (Tyr) varten.

Sivuketjuaminoryhmät voidaan suojata sopivalla 5 suojaryhmällä, joka on valittu aromaattisista ure-taanityyppiä olevista suojaryhmistä, kuten bentsyylioksi-karbonyyli (Z) ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli, 2-klooribentsyy-lioksikarbonyyli (2-Cl-Z), p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, 10 p-bromibentsyylioksikarbonyyli, p-difenyyli-isopropyyli-oksikarbonyyli, 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Emoc) ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyli (Moz); alifaattisista uretaanityyppiä olevista suojaryhmistä, kuten t-butyy-lioksikarbonyyli (Boc), di-isopropyylimetyylioksikar-15 bonyyli, isopropyylioksikarbonyyli ja allyylioksikarbonyy- li. Z on edullisin ornitiiniä (Orn) varten. 2-Cl-Z ja Fmoc ovat edullisimmat lysiiniä (Lys) varten.

Guanidinoryhmät voidaan suojata sopivalla suoja-ryhmällä, joka on valittu ryhmistä nitro, p-toluee-20 nisulfonyyli (Tos), Z, adamantyylioksikarbonyyli ja Boc. Tos on edullisin arginiiniä (Arg) varten.

Sivuketjuamidiryhmät voidaan suojata ksantyylin (Xan) avulla. Suojaamattomuus on edullista asparagiinin (Asn) ja glutamiinin (Gin) tapauksessa.

25 Imidatsoliryhmät voidaan suojata sopivalla suoja- ryhmällä, joka on valittu p-tolueenisulfonyylin (Tos), 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyylin (Fmoc), trifenyylimetyy-lin (trityyli), 2,4-dinitrofenyylin (Dnp), ryhmän Boc ja bentsyloksimetyylin (Bom) joukosta. Tos ja Bom ovat edul-30 lisimmat histidiiniä (His) varten.

*; Ellei toisin ole määritelty, prosenttimäärät, jot ka on alla annettu kiinteille aineille kiinteissä seoksissa, nesteille nesteissä ja kiinteille aineille nesteissä, ovat vastaavasti paino/paino-, tilavuus/tilavuus- ja pai-35 no/tilavuusprosentteja. Lisäksi ellei toisin ole määritelty, alla mainittujen reagenssien ja instrumenttien toimit- 111646 25 tajien ei tarkoiteta olevan pakollisia. Ammatti-ihminen kykenee valitsemaan samanlaisia reagensseja tai instrumentteja muilta toimittajilta.

Kaikki liuottimet, isopropanoli (iPrOH), mety-5 leenikloridi (CH2CI2) ja dimetyyliformamidi (DMF) hankittiin toiminimeltä Fisher tai Burdick & Jackson ja käytettiin ilman lisätislausta. Trifluorietikkahappo hankittiin toiminimeltä Halocarbon ja käytettiin ilman lisäpuhdistus-ta. Di-isopropyylietyyliamiini (DIPEA) hankittiin toi-10 minimeltä Pfaltz and Bauer ja tislattiin CaO:n ja ninhyd-riinin seasta ennen käyttöä. Disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC) ja di-isopropyylikarbodi-imidi (DIC) hankittiin toiminimeltä Fluka ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Hyd-roksibentsotriatsoli (HOBT) ja 1,2-etaaniditioli (EDT) 15 hankittiin toiminimeltä Sigma Chemical Co. ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Suojatut aminohapot olivat yleensä L-konfiguraation omaavia ja hankittiin kaupallisesti toiminimeltä Chemical Dynamics Corp. tai Bachemilta. Näiden reagenssien puhtaus varmistettiin ohutkerroskromatografi-20 an, NMR:n ja sulamispisteen avulla ennen käyttöä. Boc-O-Me-Tyr, Boc-2-Nal ja Boc-p-F-Phe valmistettiin kuten on selostettu. (Bolin, D.R., US-patenttihakemus 374 503). Boc-Asp(OFm) ja Boc-Glu(OFm) valmistettiin kuten on selostettu. [Bolin, D.R. et ai., Org. Prep. Proc. Int. 21 25 (1989) 67 - 74]. Bentshydryyliamiinihartsi (BHA) oli kopo- lymeeri, jonka muodostivat styreeni ja 1 % divinyylibent-seeniä (100 - 200 tai 200 - 400 mesh) , ja se hankittiin toiminimeltä Biomega, Bachem, Omni tai Advanced Chemtech. Näiden hartsien kokonaistyppipitoisuus oli yleensä 0,3 -30 1,2 milliekvivalenttia/g.

Ohutkerroskromatografia (TLC) suoritettiin lasi-pohjaisilla esipäällystetyillä silikageeli 60 F254 -le vyillä (Merck) käyttäen sopivia liuotinseoksia. Yhdisteiden osoittaminen suoritettiin UV-fluoresenssin sammuttami-35 sen (absorptio aallonpituudella 254 nm) , jodivärjäyksen 111646 26 tai ninhydriinisuihkeen (primaaristen ja sekundaaristen amiinien tapauksessa) avulla.

Aminohappokoostumuksen analyysejä varten peptidejä hydrolysoitiin 6 N HClrssa, joka sisälsi 1 - 4 mg fenolia, 5 115 °C:ssa 22 - 24 tunnin ajan suljetuissa, tyhjennetyissä hydrolyysiputkissa. Analyysit suoritettiin käyttäen joko Beckman 121M -aminohappoanalysoijaa tai Waters- HPLC:aan perustuvaa aminohappoanalyysijärjestelmää käyttäen joko Waters Cat Ex -hartsia tai Pierce AA511 -pylvästä ja nin-10 hydriinillä osoittamista.

Korkeapainenestekromatografia (HPLC) suoritettiin LDC-laitteella, joka käsitti Constametric I ja III -pumput, Gradient Master -liuotinohjelmoijän ja -sekoit-timen ja Spectromonitor III - säädettävän aallonpituuden 15 UV-detektorin. Analyyttinen HPLC suoritettiin käänteis-faasitavalla käyttäen Waters pBondapak Cis -pylväitä (0,4 x 30 cm). Preparatiiviset HPLC-erottelut suoritettiin Whatman Magnum 20 partisil 10 ODS-3 -pylväissä (2 x 25 cm tai 2 x 50 cm), jotka oli varustettu Waters Guard-Pak Cie 20 -esipylväällä. Geelikromatografia suoritettiin käyttäen kooltaan 2 x 85 cm olevaa pylvästä, LKB varioper-pex -peristalttista pumppua ja IBM-säädettävän alloonpi-tuuden UV-detektoria.

Peptidit valmistettiin edullisesti käyttäen kiin-25 teän faasin synteesiä menetelmällä, jonka on yleisesti kuvannut Merrifield [J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149], vaikka muuta vastaavaa alalla tunnettua kemiallista synteesiä voitaisiin käyttää kuten aikaisemmin on mainittu. Kiinteän faasin synteesi aloitetaan peptidin C-termi-30 naalisesta päästä kytkemällä suojattu alfa-aminohappo so-pivaan hartsiin. Tällainen lähtöaine voidaan valmistaa kiinnittämällä alfa-aminosuojattu aminohappo esterisidok-sella kloorimetyloituun hartsiin tai hydroksimetyylihart-siin tai amidisidoksella bentshydryyliamiini (BHA) tai pa-35 rametyylibentshydryyliamiini (MBHA) -hartsiin. Hydroksime-tyylihartsin valmistus on alalla tunnettua. Kloorimetyloi- 111646 27 tuja hartseja on kaupallisesti saatavana ja valmistus on myös alalla tunnettua. BHA- ja MBHA-hartsikantajia on kaupallisesti saatavana ja niitä käytetään yleensä, kun halutussa syntetisoitavassa peptidissä on substituoimaton ami-5 di C-päätteessä.

Yleensä ensimmäinen BHA-hartsiin kytkettävä aminohappo lisättiin Boc-aminohapon symmetrisenä anhydridinä käyttäen 2-10 ekvivalenttia aktivoitua aminohappoa hartsin typpiekvivalenttia kohti. Kytkemisen jälkeen hartsi 10 pestiin ja kuivattiin tyhjössä. Hartsin kuormitus aminohapolla voidaan määrittää Boc-aminohappohartsin näytteen aminohappoanalyysin avulla. Kuormitukset olivat yleensä 0,2 - 0,4 mmoolia/g hartsia. Kaikki reagoimattomat amino-ryhmät voidaan suojata antamalla hartsin reagoida etikka-15 happoanhydridin ja di-isopropyylietyyliamiinin kanssa me-tyleenikloridissa.

Boc-aminohapon lisäämisen jälkeen hartseille suoritettiin useita toistojaksoja aminohappojen lisäämiseksi peräkkäin. Alfa-aminon Boc-suojaus poistettiin happamissa 20 olosuhteissa. Trifluorietikkahappoa <TFA) metyleeniklori-dissa, HC1 dioksaanissa tai muurahaishappo/etikkahappo-seoksia voidaan käyttää tähän tarkoitukseen. Edullisesti käytetään 50 % TFA metyleenikloridissa (tilavuus/-tilavuus). Tämä voi myös sisältää 1-5 tilavuus-% EDT tai • 25 dimetyylisulfidia t-butyylikarboniumionien poistajana.

Voidaan myös käyttää muita yleisiä alalla tunnettuja loh-kaisureagensseja.

Alfa-aminon suojaryhmän poistamisen jälkeen seu-raavat suojatut aminohapot kytketään asteittain halutussa 30 järjestyksessä välituotteen, suojattu peptidi -hartsin, saamiseksi. Aktivointireagenssit, joita käytetään aminohappojen kytkemiseen peptidien kiinteän faasin synteesissä, ovat alalla tunnettuja. Esimerkiksi ovat sopivia rea-gensseja tällaisia synteesejä varten bentsotriatsol-1-35 yylioksitri(dimetyyliamino)fosfoniumheksafluorifosfaatti (BOP), disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC) ja di-isopro- .111646 28 pyylikarbodi-imidi (DIC). Tässä ovat edullisia DCC ja DIC. Muita aktivointireagensseja, joita ovat kuvanneet Ba-rany ja Merrifield (teoksessa The Peptides, voi. 2, J. Meienhofer, toim., Academic Press, 1979, ss. 1 - 284), 5 voidaan käyttää. Erilaisia reagensseja, kuten 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBT), N-hydroksisukkinimidiä (HOSu) ja 3,4-dihydro-3-hydroksi-4-okso-l,2,3-bentsotriat-siinia (HOOBT), voidaan lisätä kytkentäseoksiin syn-teesijaksojen optimoimiseksi. Tässä on edullinen HOBT.

10 Ohje tyypillistä synteesijaksoa varten oli seuraa vanlainen:

Ohje 1

Vaihe Reagenssi Aika 15 1 CH2C12 2 x 30 s 2 50 % TFA/CH2C12 1 min 3 50 % TFA/CH2C12 15 min 4 CH2C12 2 x 30 s 5 iPrOH 2 x 30 s 20 6 CH2C12 4 x 30 s 7 6 % DIPEA/CH2C12 3x2 min 8 CH2C12 3 x 30 s 9 kytkeminen 10 min - 18 tuntia 10 CH2C12 2 x 30 s 25 11 iPrOH 1 x 30 s 12 CH2C12 1 x 30 s 13 DMF 2 x 30 s 14 CH2C12 3 x 30 s 30 Liuottimia mitattiin kaikkia pesuja ja kytkemisiä varten tilavuuksiksi 10 - 40 ml/g hartsia. Kytkemiset suoritettiin käyttäen joko Boc-aminohappojen ennalta muodostettuja symmetrisiä anhydridejä tai O-asyyli-isourea-johdannaisina. Yleensä 2-10 ekvivalenttia aktivoitua 35 Boc-aminohappoa lisättiin yhtä ekvivalenttia amiinihartsia kohti käyttäen metyleenikloridia liuottimena. Boc- 111646 29

Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) ja Boc-His(Bom) kytkettiin 20 - 25 % DMF/CH2Cl2-seoksessa. Boc-Asn, Boc-

Gln ja Boc-His(Bom) kytkettiin niiden HOBT- aktiivisina estereinä tunnettujen sivureaktioiden minimoimiseksi.

5 Peptidit saatettiin rengasmuotoon yleensä käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä seuraavalla tavalla. Niissä peptidin aminohappokohdissa, joiden sivuketjut oli määrä kytkeä, käytettiin erilaisia suojaryhmiä. Aminokohdan aminohapoiksi Lys ja Orn Νε- ja NB-Fmoc-johdannaiset sisälly-10 tettiin peptidiketjuun. Karboksyylikohdan aminohapoiksi Asp ja Glu liitettiin 0β- ja 0Y-Fm-johdannaiset. Peptidin ollessa vielä kiinnittyneenä hartsiin sitä käsiteltiin 20 - 40 % piperidiinillä DMF:ssa Fmoc- ja Fm-suojaryhmien poistamiseksi selektiivisesti. Vapaat sivuketjuamino- ja 15 -karboksyyliryhmät kytkettiin sitten kovalenttisesti molekyylissä käsittelemällä sopivalla amidinmuodostusreagens-silla, kuten difenyylifosforyyliatsidilla (DPPA), reagens-silla DCC, DIC tai BOP. Edullisia ovat tässä DCC ja BOP.

Tyypillisen renkaanmuodostusmenetelmän ohje oli 20 seuraavanlainen:

Ohje 2

Vaihe Reagenssi Aika 1 DMF 1 x 30 s 25 2 20 - 40 % piperiini/DMF 1 min 3 DMF 1 x 30 s 4 20 - 40 % piperidiini/DMF 20 min 5 iPrOH 1 x 30 s 6 DMF 1 x 30 s 30 7 iPrOH ' 2 x 30 s V 8 DMF 2 x 30 s 9 6 % DIPEA/CH2C12 2x2 min 10 CH2CI2 1 x 30 s 11 DMF 1 x 30 s 35 12 kytkeminen 1 x 24 tuntia 13 iPrOH 1 x 30 s 111646 30 14 CH2C12 1 x 30 s 15 DMF 2 x 30 s 16 CH2C12 3 x 30 s 5 Koko synteesin aikana kytkentäreaktioita tarkkail tiin Kaiser-ninhydriinitestin avulla loppuunsaattamisas-teen määrittämiseksi [Kaiser et ai., Anal. Biochem. 34 (1970) 595 - 598]. Hidas reaktiokinetiikka havaittiin aminohapoilla Boc-Arg(Tos) , Boc-Asn ja Boc-Gln. Kaikkien epä-10 täydellisten kytkemisreaktioiden tapauksessa joko uudel-leenkytkettiin käyttäen juuri valmistettua aktivoitua aminohappoa tai suojattiin käsittelemällä peptidihartsia etikkahappoanhydridillä kuten yllä on kuvattu. Täydellisesti koottuja peptidihartseja kuivattiin tyhjössä useiden 15 tuntien ajan.

Kunkin yhdisteen tapauksessa suojaryhmät poistettiin ja peptidi lohkaistiin hartsista seuraavan menetelmän avulla. Yleensä peptidi-hartseja käsiteltiin 25 -100 piillä etaaniditiolia, 1 mlilla anisolia ja 9 mlilla 20 nestemäistä fluorivetyä grammaa hartsia kohti 0 °C:ssa 45 - 60 minuutin ajan Teflon HF -laitteessa (Peninsula). Vaihtoehtoisesti voitaisiin käyttää modifioitua kahden vaiheen lohkaisumenetelmää [Tam et ai., Tetrahedron Letters 23 (1982) 2939 - 2940], jossa peptidi-hartsia käsi- 25 teltiin 3 mlilla dimetyylisulfidia ja 1 mlilla fluorivetyä 2 tunnin ajan 0 °C:ssa ja haihdutettiin ennen käsittelyä 90 % HFillä. Haihtuvat reagenssit poistettiin sitten tyh- jössä jäähauteen lämpötilassa. Jäännös pestiin kahdella tai kolmella 20 mlin tilavuudella sekä Et20 että EtOAc ja 30 suodatettiin. Peptidit uutettiin hartsista pesemällä koi-mella tai neljällä 20 mlin tilavuudella 10 % AcOH ja suodatettiin. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin raaka tuote.

Raa'at peptidit puhdistettiin aluksi geelikromato-35 grafian avulla käyttäen Sephadex G-25 hieno -täytettä mo-nomeeristen aineiden erottamiseksi oligomeerisistä. Pepti- 111646 31 dit liuotettiin mahdollisimman pieneen tilavuuteen 10 % AcOH ja lisättiin geelipylvääseen. Pylvästä eluoitiin 10 % AcOH:lla käyttäen virtausnopeutta 0,5 - 1,5 ml/min. Ef- fluenttia tarkkailtiin aallonpituudella 254 nm ja halutun 5 vyöhykkeen sisältävät' fraktiot yhdistettiin ja lyofilisoi-tiin, jolloin saatiin puolittain puhdistettuja tuotteita.

Puolittain puhdistettujen peptidien puhdistaminen suoritettiin yleensä preparatiivisen HPLC:n avulla. Peptidit lisättiin pylväisiin mahdollisimman pienessä tilavuu-10 dessa joko 1 % AcOH tai 0,1 % TFA. Gradienttieluutio aloitettiin yleensä pitoisuudesta 10 % B-puskuriliuosta, 10 -25 % B 10 minuutissa ja 25 - 35 % B 3 tunnissa (puskuri-liuos A: 0,1 % TFA/H20, puskuriliuos B: 0,1 % TFA/CH3CN) käyttäen virtausnopeutta 8,0 ml/min. UV:n avulla osoitta-15 minen suoritettiin aallonpituudella 220 nm. Fraktioita koottiin 1,5 - 2,5 minuutin väliajoin ja tutkittiin analyyttisen HPLC:n avulla. Fraktiot, joiden arvioitiin olevan erittäin puhtaita, yhdistettiin ja lyofilisoitiin.

Lopullisten tuotteiden puhtaus tarkistettiin ana-20 lyyttisen HPLC:n avulla käyttäen käänteisfaasipylvästä kuten yllä on mainittu. Yleensä käytettiin gradienttieluu-tiota, joka käsitti 20 - 40 % B (puskuriliuos A: 0,022 % TFA/H2O, puskuriliuos B: 0,022 % TFA/CH3CN) 15 minuutissa virtausnopeuden ollessa 2,0 ml/min. Osoittaminen UV:n 25 avulla tapahtui aallonpituudella 210 nm. Kaikkien tuotteiden puhtauden arvioitiin olevan noin 97 - 99 %. Suoritettiin yksittäisten peptidien aminohappoanalyysejä, ja saadut arvot olivat hyväksyttävissä rajoissa. Yleensä kaikille lopputuotteille suoritettiin myös nopea-atomipommi-30 tusmassaspektrometria (FAB-MS). Kaikki tuotteet tuottivat odotetun hyväksyttävissä rajoissa olevan M + H-emäionin.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavilla uusilla yhdisteillä on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia. Niillä on henkitorvea rentouttava vaikutus, ja ne ovat te-35 hokkaita keuhkoputkea laajentavia aineita. Yhdisteillä on myös sydämeen ja verisuoniin liittyviä sivuvaikutuksia.

111646 32 Näiden uusien peptidien tuottama keuhkoputkien laajentuma voi jatkua yli kahden tunnin ajan. Siten koska yhdisteet ovat erittäin aktiivisia keuhkoputkea laajentavia aineita, ne ovat arvokkaita farmaseuttisia vaikuttaja-aineita keuh-5 koputkia kuristavien sairauksien, esim. astman, hoitoa varten.

Kaavojen IV ja V mukaiset uudet yhdisteet voidaan yhdistää erilaisten tyypillisten farmaseuttisten kantaja-aineiden, edullisesti myrkyttömän, inertin, terapeuttises-10 ti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa sellaisten koostumusten aikaansaamiseksi, jotka sopivat käytettäväksi keuhkoputkia kuristavien sairauksien kuten astman hoidossa. Näiden yhdisteiden annostus galeenisessa antomuodossa riippuu erilaisista tekijöistä, kuten käytettävästä nimen-15 omaisesta yhdisteestä ja nimenomaisesta koostumuksesta. Tehokkaan annostuksen voi alan ammatti-ihminen määrittää tässä esitetyn tehokkaan pitoisuuden (EC50) perusteella. Tyypillisiä annostuksia ihmisillä olisivat 0,01 - 100 pg/kg. Yhdisteillä, joilla on alhainen EC50, kuten 0,1 pg, 20 tyypillisiä annostuksia ihmisillä olisivat noin 0,02 -20 pg/kg.

Kaavojen IV ja V mukaiset uudet yhdisteet muodostavat farmaseuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja monien erilaisten epäorgaanisten ja orgaanisten happojen, 25 kuten rikki-, fosfori-, kloorivety-, bromivety-, jodive-ty-, typpi-, sulfamidi-, sitruuna-, maito-, palorypäle-, oksaali-, maleiini-, meripihka-, viini-, kaneli-, etikka-, trifluorietikka-, bentsoe-, salisyyli-, glukoni-, askor-biini- ja vastaavien happojen, kanssa.

30 Kysymyksessä olevat yhdisteet voidaan antaa poti- laalle ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti joko laskimoon, ihon alle, lihakseen, suun kautta tai nenään. Edullinen antamistie ruoansulatuskanavan ulkopuolista antamista varten on aerosolin avulla suun kautta tai nenään antaminen.

111646 33 Tätä keksintöä valaistaan lisäksi seuraavien esimerkkien avulla, joista esimerkit 2-8 eivät varsinaisesti kuvaa keksintöä.

Esimerkki 1 5 Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsin valmistus

Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli-bentseeniristikytkyhartsia (9,5 g, 3,6 milliekvivalenttia, 200 - 400 ASTM mesh, Vega Biochem) turvotettiin 100 ml:ssa metyleenikloridia, suodatettiin ja pestiin käyttäen ohjeen 10 1 vaiheita 7-8. Boc-Thr (Bzl) :n (3,35 g, 10,8 mmol) ja disykloheksyylikarbodi-imidin (1,12 g, 5,42 mmol) annettiin reagoida 50 ml:ssa CH2CI2 1 tunnin ajan, suodatettiin ja lisättiin 50 mlrssa CH2CI2 turvonneen hartsin joukkoon. Tätä seosta ravistettiin 18 tunnin ajan huoneenlämpötilas-15 sa. DIPEA (630 ml, 3,6 mmol) lisättiin ja sitten ravistettiin vielä 1 tunnin ajan, suodatettiin ja sitten suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 - 14. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Kaikki reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 1 ml:11a etikkahappoanhyd-20 ridiä ja 1 ml:11a DIPEA 50 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin ajan, suodatettiin ja pestiin ohjeen 1 vaiheiden 13 - 14 mukaan. Hartsia kuivattiin tyhjössä yön ajan, jolloin saatiin 9,8 g Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti 25 kuormituksen olevan 0,17 mmoolia Thr/g.

Esimerkki 2

Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Asp8 Lys12) [Ac- (SEQ ID No:20)-NH2] valmistus

Esimerkistä 1 saadulle Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsille 30 (9,8 g, 1,7 mmol) suoritettiin kiinteän faasin synteesi * käytäen yllä olevaa ohjetta 1. Kaikki kytkemiset suoritettiin käyttäen ennalta muodostettuja symmetrisiä anhydride-jä, jotka oli valmistettu Boc-aminohaposta ja disyklohek-syylikarbodi-imidistä. Boc-asparagiini, Boc-glutamiini ja 35 Boc-histidiini(bentsyloksimetyyli) kytkettiin vastaavina HOBT-aktiivisina estereinä. Reaktioajat olivat yleensä 1 - 111646 34 18 tuntia kytkemisvaiheen loppuun suorittamiseksi. Suoritettiin viisi kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kullakin aminohapoista Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol), Boc-Val (1,3 g, 6,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (1,8 g, 6,0 mmol), 5 Boc-Asn (773 mg, 3,3 mmol) ja Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol). Hartsi kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 12,2 g Boc-heksapeptidihartsia.

8,2 g:n (1,13 mmol) osa tästä hartsista kytkettiin kuuden jakson avulla, jotka käsittivät yhden jakson kunkin 10 aminohapoista Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,77 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,67 g, 4.0 mmol), Boc-Val (876 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (762 mg, 4.0 mmol) ja Boc-Nle (932 mg, 4,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 10,2 g Boc-dodekapeptidihartsia.

15 1,26 g:n (0,139 mmol) osalle tästä hartsista suo ritettiin kaksi kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kummankin aminohapoista Boc-Gln (205 mg, 0,93 mmol) ja Boc-Lys(2—Cl—Z) (627 mg, 1,5 mmol) kanssa. Puolelle tästä hartsista (0,069 mmol) suoritettiin neljätoista kyt-20 kentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Arg(Tos) (324 mg, 0,76 mmol), Boc-Leu (188 mg, 0,76 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (354 mg, 0,76 mmol), Boc-

Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (333 mg, 0,76 mmol), Boc-Asn (97 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp(OFm) (311 ' 25 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Phe (201 mg, 0,76 mmol), Boc-Val (164 mg, 0,76 mmol), Boc-Ala (143 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp (OcHx) (238 mg, 0,76 mmol), Boc-Ser(Bzl) (223 mg, 0,76 mmol) ja Boc-His(Bom) (156 mg, 0,41 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 30 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 1,0 ml: 11a etikkahap-’*! poanhydridiä ja 66 ml :11a DIPEA (0,38 mmol) 20 ml:ssa me- tyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin käyttäen vaiheita 10-14.

Hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suo-35 jausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida seitsemän kertaa DCC:n (49 mg, 0,24 111646 35 mmol) ja HOBT:n (32 mg, 0,24 mmol) kanssa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,72 g.

5 Tätä hartsia käsiteltiin 6 ml:11a dimetyylisulfi- dia ja 2 ml:11a nestemäistä HF 2 tunnin ajan 0 °C:ssa. Re-aktioseos haihdutettiin ja jäännöstä käsiteltiin 0,7 ml :11a anisolia ja 6 ml:11a nestemäistä HF 45 minuutin ajan 0 °C:ssa. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännös pes-10 tiin 1 x 15 ml:11a Et20 ja 3 x 15 ml:11a EtOAc. Hartsia uutettiin 3 x 20 ml:11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodok-set lyofilisoitiin, jolloin saatiin 227 mg valkeaa kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin preparatiivisen 15 HPLC:n avulla käyttäen Whatman Magnum-20 ODS-3 -pylvästä (2 x 25 cm) ja eluoiden lineaarisen gradientin avulla, jonka muodosti 10 - 40 % B (puskuriliuos Ä: 0,1 % TFA/H2O, puskuriliuos B: 0,1 % TFA/CH3CN) 4 tunnissa. Päähuippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC 20 -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 26,7 mg puolipuhdasta tuotetta. Tämä aine lisättiin uudelleen Magnum-20 ODS-3 -pylvääseen (2 x 50 cm)' ja eluoitiin käyttäen samaa gradienttia. Päähuippu erotettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 9,5 mg valkeaa, amor-• 25 fista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n pe rusteella ja tuotti oikeanlaisen aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,8, saatu 3276,1.

Esimerkki 3

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-30 syklo- (Glu8 Lys12) [Ac-(SEQ ID No:21)-NH2] vai- t mistus

Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli-bentseeniristikytkyhartsi (17,7 g, 2,6 milliekvivalenttia, 200 - 400 ASTM mesh, Vega Biochem) turvotettiin 160 ml:ssa 35 metyleenikloridia, suodatettiin ja pestiin ohjeen 1 vaiheiden 7-8 mukaan. Hartsi uudelleensuspendoitiin 160 111646 36 ml:aan metyleenikloridia ja tähän lisättiin Boc-Thr(Bzl) (6,25 g, 20,2 mmol) ja disykloheksyylikarbodi-imidiä (2,10 g, 10,1 mmol). Tätä seosta ravistettiin 8 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, suodatettiin ja sitten suoritet-5 tiin ohjeen 1 vaiheet 10 - 14. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 5 ml:11a etikkahappoanhydridiä ja 5 ml :11a DIPEA 150 ml:ssa metyleenikloridia 60 minuutin ajan, suodatettiin ja pestiin vaiheiden 13 - 14 mukaan.

10 Hartsia kuivattiin tyhjössä yön ajan,' jolloin saatiin 18,0 g Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti kuormituksen olevan 0,17 mmoolia Thr/g.

Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsille (18,0 g, 3,06 mmol) 15 suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen yllä olevaa ohjetta 1. Kaikki kytkemiset suoritettiin käyttäen ennalta muodostettuja symmetrisiä anhydridejä, jotka oli valmistettu Boc-aminohaposta ja disykloheksyylikarbodi-imidistä. Boc-asparagiini, Boc-glutamiini ja Boc-histidiini(bent-20 syloksimetyyli) kytkettiin vastaavina HOBT- aktiivisina estereinä. Suoritettiin viisi kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol), Boc-Val (5,32 g, 24,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (7,23 g, 24,5 mmol), Boc-Asn (3,13 g, 13,5 mmol) ja Boc-25 Leu (6,1 g, 24,5 mmol) kanssa. Hartsi kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 22,9 g Boc-heksapeptidihartsia.

7,48 g:n (1,0 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kymmenen kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 30 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Val (869 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmol), Boc-Nle (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Gln (1,08 g, 4,4 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol),

Boc-Arg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmol) ja Boc-Leu (998 mg, 4,0 35 mmol) kanssa, jolloin saatiin 9,6 g Boc-heksadeka-peptidihartsia.

111646 37 7,68 g:n (0,8 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin yksi kytkentäjakso aminohapon Boc-Lys(Fmoc) (1,5 g, 3,2 irtmol) kanssa, jolloin saatiin 8,32 g Boc-heptadekapeptidihartsia.

5 6,24 g:n (0,6 mmol) osalle tästä hartsista suori tettiin kaksi kytkentäjakoa, jotka käsittivät yhden jakson kummankin aminohapoista Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmol) ja Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,06 g, 2,4 mmol) kanssa, jolloin saatiin 6,28 g Boc-nonadekapeptidihartsia.

10 2,09 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suori tettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Asp(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 15 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) ja Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,25 ml:11a etikkahappoanhydridiä ja 70 ml:11a DIPEA 20 ml:ssa mety-20 leenikloridia 20 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan.

Hartsista poistettiin selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan. Kolmen neljäsosan tästä hartsista (0,15 mmol) annettiin reagoida 25 DCC:n (77 mg, 0,37 mmol) ja HOBT:n (51 mg, 0,37 mmol) kanssa 20 ml:ssa tislattua DFM 72 tunnin ajan ja 20 ml:ssa tolueenia 24 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,72 g.

30 1,14 g:n (0,099 mmol) osasta tätä hartsia poistet- tiin suojaus käsittelemällä, kuten esimerkissä 2, paitsi että toisessa vaiheessa käytettiin 1 ml anisolia ja 9 ml HF. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännös pestiin 1' x 15 ml:11a Et20 ja 3 x 15 ml:11a EtOAc. Hartsia uutettiin 3 x 35 20 ml:lla-10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoi- tiin, jolloin saatiin 535 mg valkeaa kiinteää ainetta.

111646 38 Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa (2 x 100 cm:n pylväs) ja eluoiden 10 % AcOH:lla. Monomeerihuippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, 5 yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 83,5 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tämä aine puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 2, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 20 - 40 % 3 tunnissa. Päähuippu erotettiin koottu-10 jen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 18,9 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3292,0, saatu 3291,8.

15 Esimerkki 4

Yhdisteen Ac-[Asn8, Asp9, Lys12, Nle17, Vai26,

Thr28] -VIP-syklo- (Asp9 -> Lys12) [Ac-(SEQ ID No :22)- NH2] valmistus 1,55 g:n (0,15 mmol) osalle esimerkistä 3 saatua 20 Boc-nonadekapeptidihartsia suoritettiin yhdeksän kytkentä-jaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Asp(OFm) (247 mg, 0,6 mmol), Boc-Asn (153 mg, 0,66 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (159 mg, 0,6 mmol), Boc-Val (130 mg, 0,6 mmol), Boc-Ala (113 mg, 25 0,6 mmol), Boc-Asp(OcHx) (189 mg, 0,6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (177 mg, 0,6 mmol) ja Boc-His (Bom) (248 mg, 0,66 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 -8 ja sitä käsiteltiin 0,25 ml :11a etikkahappoanhydridiä ja 70 ml :11a DIPEA 20 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin 30 ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan.

\ Hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suo jausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida kaksi kertaa DCC:n (77 mg, 0,37 mmol) ja HOBT:n (51 mg, 0,37 mmol) kanssa 20 ml:ssa tis-35 lattua DMF 24 ja 72 tunnin ajan ja kaksi kertaa 20 ml:ssa tolueenia 24 ja 48 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi 111646 39 oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 -15 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,54 g.

1,26 g:n (0,122 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin suojaus käsittelemällä HF:llä, kuten esimerkissä 3.

5 Reaktioseos haihdutettiin ja jäännös pestiin 1 x 15 ml:11a Et20 ja 3 x 15 ml:11a EtOAc. Hartsia uutettiin 3 x 20 ml:11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin 485 mg valkeaa kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen 10 avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 83,5 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tämä aine puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 20 - 45 % 3 tunnissa. 15 Päähuippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 11,5 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,8, 20 saatu 3277,6.

Esimerkki 5

Yhdisteen Ac-[Orn12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Asp8 —» Orn12) [Ac- (SEQ ID No :23)-11¾] valmistus 1,92 g:n (0,2 mmol) osalle esimerkistä 3 saatua 25 Boc-heksadekapeptidihartsia suoritettiin kaksitoista kyt-kentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Orn(Fmoc) (364 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 30 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 millimolia), Boc-Phe *_ (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 millimolia) ja Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 35 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,25 ml: 11a etikkahap-poanhydridiä ja 70 ml:11a DIPEA 20 ml:ssa metyleeniklori- 40 111640 dia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja sitä kuivattiin yön ajan, jolloin saatiin 2,38 g.

1,38 g:n (0,11 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä oh-5 jeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja annettiin reagoida DCC:n (55 mg, 0,27 mmol) ja HOBT:n (37 mg, 0,27 mmol) kanssa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 tunnin ajan, 20 ml:ssa toluee-nia 24 tunnin ajan ja viisi kertaa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli heikosti 10 positiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä.

0,8 g:n (0,05 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin suojaus käsittelemäälä HF:llä, kuten esimerkissä 3. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännös pestiin 1 x 15 ml :11a 15 Et20 ja 3 x 15 ml: 11a EtOAc. Hartsia uutettiin 3 x 20 ml:11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin 429 mg kumimaista kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa, kuten esimerkissä 3, 20 jolloin saatiin 107 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 10 - 40 % 3 tunnissa.

Päähuippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen • 25 HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 17,5 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3263,7, saatu 3264,1.

... 30 Esimerkki 6

Yhdisteen Ac-[Lys8, Asp12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Lys8 -> Asp12) [Ac- (SEQ ID No:24)-NH2] valmistus 1,0 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkistä 3 saatua 35 Boc-heksadekapeptidihartsia suoritettiin kaksitoista kyt-kentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminoha- 111646 41 poista Boc-Asp(OFm) (165 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (176 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (187 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 5 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Bo-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) ja Boc-His (Born) (150 mg, 0,4 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen vaiheet 1-8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä ja 35 10 ml:lla DIPEA 20 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsia pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin yön ajan, jolloin saatiin 1,2 g.

0,8 g:n (0,066 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä oh-15 jeen 2 vaiheiden 1 - 11 mukaan ja sen annettiin reagoida BOP:n (58 mg, 0,13 mmol) kanssa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä.

20 Tästä hartsista poistettiin suojaus käsittelemäälä HF:llä, kuten esimerkissä 3. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännöstä pestiin 1 x 15 ml:11a Et20 ja 3 x 15 ml:11a EtO-Ac. Hartsia uutettiin 3 x 20 ml :11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin kumimainen • 25 kiinteä aine.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 43,8 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 30 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-·· aarista gradienttia, joka käsitti 10 - 40 % 3 tunnissa.

Päähuippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 7,5 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä 35 yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oi- 111646 42 kean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,8, saatu 3276,4.

Esimerkki 7

Yhdisteen Ac-[Glu8, Orn12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-5 syklo-(Glu8 -» Orn12) [Ac-(SEQ ID No:25)-NH2] val mistus

Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli-bentseeeniristikytkyhartsia (25,0 g, 17,5 milliekvivalent-tia, 200 - 400 ASTM mesh, Bachem) turvotettiin 160 ml:ssa 10 metyleenikloridia, suodatettiin ja pestiin taulukossa 1 olevan ohjeen vaiheiden 7-8 mukaan. Hartsi uudelleensus-pendoitiin 160 ml:aan metyleenikloridia ja tähän lisättiin Boc-Thr(Bzl) (16,2 g, 52,5 mmol) ja disykloheksyylikarbo-di-imidiä (5,4 g, 26,2 mmol). Tätä seosta ravistettiin 6 15 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, suodatettiin ja sitten suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 - 14. Kaiser- ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Reagoimattomat amii-niryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 5 ml:11a etik-kahappoanhydridiä ja 5 ml:11a DIPEA 150 ml:ssa metyleeni-20 kloridia 60 minuutin ajan, suodatettiin ja pestiin ohjeen vaiheiden 13 - 14 mukaan. Hartsia kuivattiin tyhjössä yön ajan, jolloin saatiin 29,6 g Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti kuormituksen olevan 0,21 mmoolia Thr/g.

• 25 14,0 g:n (2,94 mmol) osalle tästä hartsista suori tettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen yllä olevaa ohjetta kuten esimerkissä 2. Suoritettiin yksitoista kytken-täjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), 30 Boc-Ser(Bzl) (6,9 g, 23,5 mmol), Boc-Asn (3,0 g, 13,0 ·· mmol), Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (10,3 g, 23,5 mmol), Boc-Lys (2—Cl —Z) (9,8 g, 23,5 mmol),

Boc-Lys (2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ala (4,4 g, 23,5 mmol) ja Boc-Nle (5,4 g, 23,5 35 mmol) kanssa, jolloin saatiin 26 g Boc-dekapeptidihartsia.

111646 43 5,5 g:n (0,61 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kytkeminen neljän jakson avulla, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Gln (655 mg, 2,7 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (2,0 g, 4,8 mmol), Boc-Arg(Tos) 5 (2,1 g, 4,8 mmol) ja Boc-Leu (1,2 g, 4,8 mmol) kanssa.

Hartsia kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 6,12 g Boc-heksadekapeptidihartsiä.

2,0 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kaksitoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi 10 jakso kunkin aminohapoista Boc-Orn(Fmoc) (91 mg, 0,2 mmol), Boc-Thr(Bzl) (250 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-

Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 15 mmol), Bo-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) ja Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml :11a etikkahappoanhydridiä ja 38 ml:11a DIPEA 30 ml:ssa mety-20 leenikloridia 180 minuutin ajan. Hartsia pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 2,4 g· 1,15 g:n (0,1 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä oh-25 jeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida kaksi kertaa BOP:n (58 mg, 0,13 mmol) ja 400 ml:n DIPEA kanssa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 ja 6 tunnin ajan. Kai-ser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Tätä hartsia pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin 30 tyhjössä, jolloin saatiin 1,05 g.

*·· Tästä hartsista poistettiin suojaus käsittelemällä 9 ml:11a HF, 1 ml:lla anisolia ja 100 ml:lla etaanidi-tiolia 1 tunnin ajan 0 °C:ssa. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännöstä pestiin 2 x 15 ml :11a Et20 ja 2 x 15 ml:11a 35 EtOAc. Hartsia uutettiin 4 x 20 ml:11a 10 % AcOH. Yhdiste- 111646 44 tyt vesisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin 385 mg vaaleaa, keltaista kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa, kuten esimerkissä 3, 5 jolloin saatiin 134 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 26 - 36 % 3 tunnissa. Päähuippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen 10 HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 23,2 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,8, saatu 3276, 3.

15 Esimerkki 8

Yhdisteen Ac-[Lys12, Glu16, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Lys12 Glu16) [Ac-(SEQ ID No:26)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli-20 bentseeniristikytkyhartsia (30 g, 21,4 milliekvivalenttia, 200 - 400 ASTM nesh, Bachem) käsiteltiin, kuten esimerkissä 22, paitsi että käytettiin 19,9 g Boc-Thr(Bzl) (64,3 mmol) ja 6,6 g disykloheksyylikarbodi-imidiä (32,1 mmol). Tätä seosta ravistettiin 18 tunnin ajan huoneenlämpötilas-• 25 sa, suodatettiin ja sitten suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 - 14. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 8 ml:lla etikkahappoanhydridiä ja 8 ml:11a DIPEA 200 ml:ssa metyleenikloridia 60 minuutin ajan, suodatettiin ja 30 pestiin ohjeen vaiheiden 13 - 14 mukaan. Hartsia kuivat- 4 tiin tyhjössä yön ajan, jolloin saatiin 34,2 g Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti kuormauksen olevan 0,47 mmoolia Thr/g.

35 0,85 g:n (0,4 mmol) osalle tätä Boc-Thr (Bzl)-BHA- hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Ap- 45 plied Biosystems malli · 430A-peptidisyntetisoijaa. Kaikki kytkemiset suoritettiin käyttäen ennalta muodostettuja symmetrisiä anhydridejä, jotka oli valmistettu Boc-aminohaposta ja disykloheksyylikarbodi-imidistä. Boc-5 asparagiini, Boc-glutamiini ja Boc-arginiini(tosyyli) kytkettiin rutiininomaisesti vastaavina HOBT- aktiivisina estereinä. Suoritettiin yksitoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 10 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol) ja Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin 15 saatiin Boc-dodekapeptidihartsi.

Tälle hartsille suoritettiin sitten viisi kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 2, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys (2-Cl-Z) (664 mg, 1,6 mmol), Boc-Arg(Tos) (685 mg, 1,6 20 mmol), Boc-Leu (398 mg, 1,6 mmol) ja Boc-Lys (Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol) kanssa. Hartsi kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 2,12 g Boc-heptadekapeptidihartsia.

1,06 g:n (0,2 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä oh-25 jeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida kaksi krtaa BOP:n (177 mg, 0,4 mmol) ja 200 ml:n DIPEA kanssa 20 mlrssa tislattua DMF 2 ja 8 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli heikosti positiivinen. Reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 0,5 30 ml:11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DI-PEA/metyleenikloridia 10 minuutin ajan, suodatettiin ja pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan. Tälle hartsille suoritettiin sitten yksi kytkentäjakso Boc-Thr(Bzl):n (495 mg, 1,6 mmol) kanssa ja se pantiin sitten takaisin Applied 35 Biosystems 430A-peptidisyntetisoijaan kuten yllä. Suoritettiin kymmenen kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jak- 111646 46 so kunkin aminohapoista Boc-Tyr(2,β-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala 5 (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-

Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) kanssa. Peptidi-hartsille suoritettiin sitten ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sen annettiin reagoida 0,5 ml:n etikka-happoanhydridiä ja 100 ml: n DIPEA kanssa 20 ml:ssa mety-10 leenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi'pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä.

Peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 340 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkis-15 sä 3, jolloin saatiin 35 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 15,6 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogee-20 ninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoanalyy-sin. FAB-MS: MH laskettuna 3276,6, saatu 3278,0.

Esimerkki 9

Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Asp24, Vai26, Thr28]-VIP- syklo- (Lys20 Asp24) [Ac-(SEQ ID No:27)-NH2] val-25 mistus 0,42 g:n (0,2 mmol) osalle esimerkistä 8 saatua Boc-Thr(Bzl)-hartsia suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-30 Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp (OFm) (329 mg, 0,8 « mmol), Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmol), Boc-

Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol) ja Boc-Val (174 mg, 0,8'mmol) kanssa.

35 Tästä hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan 47 111646 ja sen annettiin reagoida BOP:n (177 mg, 0,4 mmol) ja 200 ml: n DIPEA kanssa 20 mlrssa tislattua DMF 6 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen.

Tälle hartsille suoritettiin sitten kiinteän faa-5 sin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin seitsemäntoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-10 Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 15 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) kanssa. Tälle hartsille suoritettiin yksi kytkentäjakso Boc-His(Tos):n (164 mg, 0,4 mmol) kanssa ja sille suoritettiin sitten oh-20 jeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 1 ml :11a etikka-happoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,94 g.

0,97 g:n (0,1 mmol) osasta tätä peptidi-hartsia 25 poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 265 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuoda-tuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 149 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi 30 että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 -*!' 35 %, jolloin saatiin 28,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta.

Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3278,6, saatu 3278,8 .

35 111646 48

Esimerkki 10

Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac- (SEQ ID No:28)-NH2] valmistus 5 Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli- bentseeniristikytkyhartsia (5,0 g, 2,6 milliekvivalenttia, 200 - 400 ASTM mesh, Vega Biochem) turvotettiin 50 mlrssa metyleenikloridia, suodatettiin ja pestiin ohjeen 1 vaiheiden 7 - 8 mukaan. Hartsi uudelleensuspendoitiin 60 10 ml:aan metyleenikloridia ja tähän lisättiin Boc-Thr(Bzl) (2,32 g, 7,5 mmol) ja disykloheksyylikarbodi-imidiä (774 mg, 3,75 mmol). Tätä seosta ravistettiin 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, suodatettiin ja sitten suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 - 14. Kaiser-ninhydriinianalyysi 15 oli negatiivinen. Kaikki reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 5 ml :11a etikkahappoanhyd-ridiä ja 5 ml:11a DIPEA 50 ml:ssa metyleenikloridia 60 minuutin ajan, suodatettiin ja pestiin ohjeen vaiheiden 13 -14 mukaan. Hartsia kuivattiin tyhjössä yön ajan, jolloin 20 saatiin 5,8 g Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti kuormituksen olevan 0,276 mmoolia Thr/g.

1,44 g:n (0,4 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen yllä olevaa oh-‘ 25 jetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kolme kytkentä- jaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Leu (399 mg, 1,6 mmol), Boc-Val (348 mg, 1,6 mmol) ja Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol) kanssa. Puolelle tästä hartsista (0,2 mmol) suoritettiin neljä kytkentäjaksoa, 30 joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Asn ·· (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Leu (199 mg, 0,8 mmol), Boc-

Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol) ja Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol) kanssa.

Tästä hartsista poistettiin sitten selektiivisesti 35 suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida BOP:n (177 mg, 0,4 mmol) kanssa 111646 49 20 ml:ssa 1 % DIPEA/DMF 2 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen.

Hartsille suoritettiin yksi kytkentäjakso Boc-Lys(2-Cl-Z):n (332 mg, 0,8 mmol) kanssa ja sille suoritet-5 tiin sitten kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Bio-systems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin yhdeksäntoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 10 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-15 Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) kanssa ja sitten suoritettiin ohjeen 1 20 vaiheet 1 - 8 ja käsiteltiin 1 ml:11a etikkahappoanhydri-diä 20 mlrssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä.

Tästä peptidihartsista poistettiin suojaus, kuten 25 esimerkissä 7, jolloin saatiin 210 mg raakaa peptidiä.

Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 93 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-30 aarista gradienttia, joka käsitti 27 - 37 %, jolloin saa-tiin 26,2 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohap-poanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3305,8, saatu 3305,8.

111646 50

Esimerkki 11

Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26,

Thr28] -VIP-syklo- (Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID

No:29) -NH2] valmistus 5 0,4 g:n (0,1 mmol) osalle bentshydryyliamiinihart- sia (100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen yllä ilmoitettua ohjetta. Kaikki kytkemiset suoritettiin käyttäen ekvivalenttisia moolimää-riä Boc-aminohappoa ja di-isopropyylikarbodi-imidiä. Boc-10 asparagiini ja Boc-glutamiini yhdistettiin vastaavina aktiivisina estereinä lisäämällä 1,5-kertainen mooliylimäärä HOBT kytkentäseokseen. Reaktioajat olivat yleensä 2-18 tuntia kytkentävaiheen loppuunsuorittamiseksi. Suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso 15 kunkin aminohapoista Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (206 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0,5 mmol) ja Boc-Lys(2-Cl-Z) 20 (415 mg, 1,0 mmol) kanssa.

Tästä hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida BOP:n (88 mg, 0,2 mmol) kanssa 20 ml:ssa 1 % DIPEA/DMF 2 tunnin ajan. Kaiser- 25 ninhydriinianalyysi oli negatiivinen.

Suoritettiin yhdeksäntoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1.0 mmol), Boc-Gln (246 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) 30 (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-

Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 35 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 51 111646 1.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol) kanssa. Peptidi-hartsille suoritettiin sitten ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä 10 ml:ssa 6 % DI- 5 PEA/metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 304 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistetiin geelisuodatuksen avulla, kuten esi-10 merkissä 3, jolloin saatiin 215 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 26 - 36 %, jolloin saatiin 20,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-15 mogeeninen HPLCzn perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,6, saatu 3277,7. Esimerkki 12

Yhdisteen Ac-[p-F-Phe6, 2-Nal10, Lys12, Nle17, Asp25, Vai26, Thr28, Gly29,30, Met31]-VIP-(1 - 31) -NH2-syklo-20 (Lys21 -> Asp25) [Ac-SEQ ID No:30)-NH2] valmistus 0,4 g:n (0,1 mmol) osalle bentshydryyliamiinihart-sia (100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi, kuten esimerkissä 11. Suoritettiin kolme kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin ami-• 25 nohapoista Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1.0 mmol) ja Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) kanssa. Suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa ja rengasmuotoon saattaminen, kuten esimerkissä 11. Suoritettiin yhdeksäntoista kytken-täjaksoa, kuten esimerkissä 11, paitsi että Boc-Ala kymme- 30 nennessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Val (217 mg, 1.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) 19. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-2-Nal (158 mg, 0,5 mmol) ja Boc-Phe 23. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol).

35 52 111646 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 345 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 215 mg puolipuhdasta tuotetta.

5 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3 paitsi, että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 30 - 40 %, jolloin saatiin 16,4 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-10 analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3574,7, saatu 3575,1.

Esimerkki 13

Yhdisteen Ac-[Glu8, Orn12, Nle17, Asp25, Vai26,

Thr28] -VIP-syklo- (Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ ID

No: 31) -NH2] valmistus 15 0,4 g:n (0,1 mmol) osalle bentshydryyliamiinihart- sia (100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi, kuten esimerkissä 11. Yhdeksän kytkentä-jaksoa ja renkaanmuodostus suoritettiin, kuten esimerkissä 11. Yhdeksäntoista kytkentäjaksoa suoritettiin, kuten esi-20 merkissä 11, paitsi että Boc-Ala kymmenennessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) 17. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Orn(Z) (366 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Asp(OcHx) 21. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol).

25 Tästä petidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 255 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 200 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 30 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-aarista gradienttia, joka käsitti 28 - 38 %, jolloin saatiin 30,7 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3305,8, saatu 3305,5.

35 111646 53

Esimerkki 14

Yhdisteen Ac-[p-F-Phe6, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25,

Vai26, Thr28, Gly29'30, Cys (Acm) 31]-VIP-(1 - 31) -NH2- syklo- (Lys21 -» Ap25) [Ac-(SEQ ID No:32)-NH2] val-5 mistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,4 g, 0,1 mmoolia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi, kuten esimerkissä 11. Suoritettiin kolme kytkentä jaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminoha-10 poista Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) kanssa. Yhdeksän kytkentäjaksoa ja renkaanmuodostus suoritettiin, kuten esimerkissä 11. Yhdeksäntoista kytkentäjaksoa suoritettiin, kuten esimerkissä 11, paitsi että Boc-Phe 23. jak-15 sossa korvattiin aminohapolla Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol).

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 268 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esi-20 merkissä 3, jolloin saatiin 165 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 28,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-25 mogeeninen HPLCrn perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3584,1, saatu 3584,0.

Esimerkki 15

Yhdisteen Ac-[Ala2, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26,

Thr28] -VIP-syklo- (Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID 30 No:33)-NH2] valmistus *·; Bentshydryyliamiinihartsille (1,5 g, 0,4 mmoolia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 11. Suoritettiin 35 kahdeksan kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu 111646 54 (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (822 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (4 64 mg, 2,0 mmol) , Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Lys(Fmoc) (938 mg, 2,0 mmol) kanssa.

5 Tästä hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida BOP:n (356 mg, 0,8 mmol) kanssa 20 ml:ssa 1 % DIPEA/DMF 2 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsia pestiin oh-10 jeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,9 g Boc-oktapeptidihartsia.

0,95 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin jälleen kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimer-15 kissä 11. Suoritettiin kahdeksantoista kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) 20 (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-

Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (4 64 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 V 25 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 1,54 g Boc- heksakosapeptidihartsia.

0,77 g:n (0,1 mmol) osalle tästä hartsista suori-30 tettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen yllä olevaa oh-jetta, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksi kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kummankin aminohapoista Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol) ja Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol) kanssa. Peptidi-hartsille suoritettiin ohjeen 1 35 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahap-poanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 mi- 111646 55 nuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,74 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 172 mg raakaa peptidiä.

5 Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 110 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 22 - 37 %, jolloin saa-10 tiin 40,0 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3261,7, saatu 3261,8.

Esimerkki 16

Yhdisteen Ac-[N-Me-Ala1, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, 15 Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID

No:34)-NH2] valmistus 0,77 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkistä 15 saatua Boc-heksakosapeptidihartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen yllä olevaa ohjetta, kuten esimerkissä 20 2. Suoritettiin kaksi kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yh den jakson kummankin aminohapoista Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) ja Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0,4 mmol) kanssa. Peptidi-hartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin BOP:lla (442 mg, 1,0 mmol), etikkahapolla 25 (57 ml, 1,0 mmol) ja DIPEA:lla (523 ml, 3,0 mmol) 20 ml:ssa DM F 6 tunnin ajan ja sitten 0,5 ml :11a etikka-happoanhydridiä 20 ml-.ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,73 g.

30 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten *·; esimerkissä 7, jolloin saatiin 191 mg raakaa peptidiä.

Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 138 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 35 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 22 - 37 %, jolloin saa- 111646 56 tiin 28,0 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3225,4, saatu 3225,8.

Esimerkki 17 5 Yhdisteen Ac-[2-Nal10, Leu12, Nle17, Ala19, Asp25,

Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ ID

No:35)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (4,0 g, 1,08 mmoolia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin 10 synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kahdeksan kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Thr(Bzl) (1,34 g, 4,3 mmol) , Boc-Leu (925 mg, 4,3 mmol) , Boc-Val (938 mg, 4,3 mmol), Boc-Asp(OFm) (889 mg, 2,1 mmol), Boc-Asn (557 mg, 15 2,4 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,3 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,9 g, 4,3 mmol) ja Boc-Lys(Fmoc) (1,1 g, 4,3 mmol) kanssa .

Tästä hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan 20 ja sen annettiin reagoida B0P:n (885 mg, 2,0 mmol) kanssa 20 ml:ssa 1 % DIPEA/DMF 2 tunnin ajan. Kaiser- ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan.

Tälle hartsille suoritettiin yksi kytkentäjakso 25 aminohapon Boc-Lys(2-C1-Z) (1,79 g, 4,3 mmol) kanssa ja se kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 6,3 g Boc- nonapeptidi-hartsia.

1,89 g:n (0,3 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jak-30 so kunkin aminohapoista Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-** Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmol), Boc-

Gln (325 mg, 1,32 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (498 mg, 1,2 mmol), Boc-Arg(Tos) (514 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (498 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Thr(Bzl) 35 (371 mg, 1,2 mmol) kanssa, jolloin saatiin 2,06 g Boc- oktadekapeptidi-hartsia.

111646 57 0,68 g:n (0,1 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kymmenen kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-2-Nal (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), 5 Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) ja Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol) kanssa. Peptidi-hartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,82 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten 15 esimerkissä 7, jolloin saatiin 261 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 186 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n' avulla, kuten esimerkissä 3 paitsi, että käytettiin line-20 aarista gradienttia, joka käsitti 30 - 40 %, jolloin saatiin 60,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLCrn perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3296,8, saatu 3295,6.

Esimerkki 18 25 Yhdisteen Ac- [O-Me-Tyr10, Leu12, Nle17, Ala19, Asp25,

Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID

No: 36) -NH2] valmistus 0,68 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkistä 17 saatua Boc-oktadekapeptidi-hartsia suoritettiin kymmenen kytken-30 täjaksoa, kuten esimerkissä 17, paitsi että Boc-2-Nal 19.

*; jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol), jolloin saatiin 0,61 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 175 mg raakaa peptidiä. 35 Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 136 mg puolipuhdasta tuotetta.

111646 58 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi prpeparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 28 - 38 %, jolloin saatiin 42,4 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-5 mogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3276,7, saatu 3276,0.

Esimerkki 19

Yhdisteen Ac-[p-F-Phe6, p-NH2-Phe10, Leu12, Nle17,

Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) 10 [Ac- (SEQ ID No: 37) -NH2] valmistus 0,625 g:n (0,09 mmol) osalle Boc-oktadekapeptidi-hartsista suoritettiin kymmenen kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 17, paitsi että Boc-2-Nal 19. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-p-NH(Z)-Phe (166 mg, 0,4 mmol) ja Boc-Phe 15 23. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-p-F-Phe (113 mg, 0,4 mmol), jolloin saatiin 0,84 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 182 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esi-20 merkissä 3, jolloin saatiin 160 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 47,2 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-• 25 mogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo- analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3279,7, saatu 3279,8.

Esimerkki 20

Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26,

Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID 30 No:38)-NH2] valmistus ·· Bentshydryyliamiinihartsille (1,25 g, 1,0 mmoolia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kahdeksan kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi 35 111646 59 jakso kunkin aminohapoista Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg,· 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-5 Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol) ja'Boc-Lys(Fmoc) (937 mg, 2.0 mmol) kanssa.

Tästä hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida BOP:n (885 mg, 2,0 mmol) kanssa 10 20 ml:ssa 1 % DIPEA/DMF 2 tunnin ajan. Kaiser- ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan.

Tälle hartsille suoritettiin yksi kytkentävaihe aminohapon Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol) kanssa ja 15 kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 2,7 g Boc- nonapeptidi-hartsia.

0,54 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosys-tems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimekrissä 8. 20 Suoritettiin kahdeksantoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu • 25 (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol),

Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala 30 (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp (OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) ja

Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 1,16 g Boc-heptakosapeptidi-hartsia.

0,54 g:n (0,1 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin yksi kytkentäjakso aminohapon Boc-His(Tos) 35 (819 mg, 2,0 mmol) kanssa ja sitten sille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etik- 60 111646 kahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,5 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten 5 esimerkissä 7, paitsi että käytettiin 5 ml HF ja 0,5 ml anisolia, jolloin saatiin 127 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 74,6 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avul-10 la, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 24 - 34 %, jolloin saatiin 17,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoanalyy-sin. FAB-MS: MH laskettuna 3333,8, saatu 3333,4.

15 Esimerkki 21

Yhdisteen Ac-[N-Me-Ala1, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25,

Leu26, Lys27, 28]-VIP-syklo-(Lys21 —> Asp25) [Ac-(SEQ

ID No:39)-NH2] valmistus 0,58 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkistä 20 saatua 20 Boc-heptakosapeptidi-hartsia suoritettiin yksi kytkentä-jakso aminohapon Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0,4 mmol) kanssa ja sitten sille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin BOP:lla (443 mg, 1,0 mmol), etikkahapolla (57 ml, 1,0 mmol) ja DIPEA:lla (523 ml, 3,0 mmol) 20 • 25 ml:ssa DMF 6 tunnin ajan ja 0,5 ml:11a etikkahappoanhydri- diä 20 mlrssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,4 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten 30 esimerkissä 20, jolloin saatiin 165 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 101 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-35 aarista gradienttia, joka käsitti 24 - 34 %, jolloin saatiin 19,8 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho- 111646 61 mogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3281,8, saatu 3281,9.

Esimerkki 22

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26,

5 Lys27'28] -VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID

No:40)-NH2] valmistus 0,54 g:n (0,2 mmol) osalle esimerkistä 20 saatua Boc-nonapeptidi-hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applid Biosystems malli 430A- 10 peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin kahdeksantoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (4 62 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), 15 Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-As.n (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(OBzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 20 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 0,58 g Boc-heptakosapeptidi-hartsia.

Tälle hartsille suoritettiin yksi kytkentäjakso * 25 aminohapon Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol) kanssa ja sille suoritettiin sitten ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DI-PEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, 30 jolloin saatiin 0,53 g.

« Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, paitsi että käytettiin 5 ml HF ja 0,5 ml anisolia, jolloin saatiin 151 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 35 3, jolloin saatiin 110 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ai netta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, 62 111646 kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 23,5 - 33,5 %, jolloin saatiin 22,8 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoanalyy-5 sin. FAB-MS: MH laskettuna 3347,9, saatu 3347,0.

Esimerkki 23

Yhdisteen Ac- [O-Me-Tyr10, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25,

Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID

No:41)-NH2] valmistus 10 1,84 g:n (0,3 mmol) osalle esimerkistä 17 saatua

Boc-nonapeptidi-hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A- peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin 15 aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 millimolia) ja Boc-Thr(Bzl) 20 (618 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 2,2 g Boc-oktadekapeptidi-hartsia.

0,73 g:n (0,1 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kymmenen kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol), • 25 Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp (OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) ja Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol) kanssa.

30 Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja *·· sitä käsiteltiin 0,5 ml :11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,77 g.

35 63 111646 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 187 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 131 mg puolipuhdasta tuotetta.

5 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 26 - 36 %, jolloin saatiin 5,3 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoana-10 lyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3291,8, saatu 3291,7.

Esimerkki 24

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26,

Lys27' 28, Ala29 - 31]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac- (SEQ ID No: 42) -NH2] valmistus 15 Bentshydryyliamiinihartsille (1,1 g, 0,5 mmoolia, 200 - 400 ASTM mesh, Biomega) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kolmetoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), 20 Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol),

Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-

Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (881 mg, 25 2,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (936 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1- Z) (830 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) kanssa .

Tästä hartsista poistettiin selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja 30 sen annettiin reagoida B0P:n (443 mg, 1,0 mmol) kanssa **· 20 ml:ssa 1 % DIPEA/DMF 1 tunnin ajan. Kaiser- ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 2,02 g Boc-tridekapeptidi-hartsia.

35 64 111646 0,8 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosys-tems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin kuusitoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi 5 yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) , Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) , Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol) , Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), 10 Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 1,2 g 15 Boc-nonakosapeptidi-hartsia.

0,6 g:n (0,1 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kaksi kytkentäjaksoa, kuten yllä, aminohapon Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) ja aminohapon Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 0,72 g. Tälle 20 hartsille suoritettiin sitten ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml :11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,645 g.

25 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 280 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 160 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 30 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-·· aarista gradienttia, joka käsitti 22 - 32 %, jolloin saa tiin 23,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3561,1, saatu 3560,8.

35 111646 65

Esimerkki 25

Yhdisteen Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28, Ala29 - 31]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID No: 43) -NH2] valmistus 5 0,6 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkistä 24 saatua

Boc-nonakosapeptidi-hartsia suoritettiin kaksi kytkentä-jaksoa kuten yllä aminohapon Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) ja aminohapon Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 0,68 g. Tälle hartsille suoritettiin 10 sitten ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä 20 mlrssa 6 % DIPEA/mety-leenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,56 g.

15 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 160 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 70 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 20 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 21,8 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n peusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3545,1, saatu 3545,3.

• 25 Esimerkki 26

Yhdisteen Ac- [N-Me-Ala1, Glu8 , Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27' 28]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID No:44)-NH2] valmistus 1,1 g:n (0,4 mmol) osalle esimerkistä 20 saatua 30 Boc-nonapeptidi-hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A-pepti-disyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin seitsemäntoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso ' kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 35 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc- 111646 66

Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-5 Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 2,24 g Boc-heksakosapeptidi-hartsia.

1,1 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suori-10 tettiin kaksi kytkentäjaksoa aminohapon Boc-Ser(Bzl) (238 mg, 0,8 mmol) ja aminohapon Boc-N-Me-Ala (163 mg, 0,8 mmol) kanssa ja sitten sille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin B0P-Cl:lla (100 mg, 0,2 mmol), etikkahapolla (23 ml, 0,2 mmol) ja DIPEA:11a (140 ml, 0,4 15 mmol) 20 ml:ssa DMF 1 tunnin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,95 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 245 mg raakaa peptidiä.

20 Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 165 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saa-25 tiin 33,7 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3295,8, saatu 3294,5.

Esimerkki 27

Yhdisteen Ac-[p-F-Phe6, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, 30 Asp25, Leu26, Lys27,28] -VIP-syklo- (Lys21 -> Asp25) [Ac- (SEQ ID No:45)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (2,49 g, 2,0 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suori-35 tettiin kuusi kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Lys(2-Cl-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), 111646 67

Boc-Lys(2-C1-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), Boc-Leu (1,85 g, 8,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (1,02 g, 4.4 mmol) ja Boc-Leu (1,05 g, 8,0 mmol) kanssa. Hartsi kuivattiin ja 0,4 mmoolia poistettiin. Suoritettiin kolme 5 kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Tyr(2,6-DCB) (2,52 g, 6,4 mmol) ja Boc-Lys (Fmoc) (1,87 g, 6,4 mmol) ja Boc-Lys(2-C1-Z) (2,65 g, 6.4 mmol) kanssa.

Tästä hartsista poistettiin sitten selektiivisesti 10 suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida BOP:n (1,42 g, 3,2 mmol) kanssa 20 ml:ssa 1 % DIPEA/DMF 4,5 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin, jolloin 15 saatiin 6,56 g Boc-nonapeptidi-hartsia.

1,64 g:n (0,4 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosys-tems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin kolmetoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi 20 yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 25 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 -mmol) kanssa, jolloin saatiin 2,56 g Boc-dokosapeptidi-hartsia.

30 0,64 g:n (0,1 mmol) osalle tästä hartsista suori- • *1 tettiin kuusi kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-p-F-Phe (283 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (218 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 35 1,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol) kanssa. Pep tidi-hartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä 111646 68 käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,69 g.

5 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 224 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 213 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLCrn 10 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 27 - 37 %, jolloin saatiin 70,5 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLCrn perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3365,9, saatu 3365,6.

15 Esimerkki 28

Yhdisteen Ac-[1-Nal6, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19,

Asp25, Leu26, Lys27' 28]-VIP-syklo-(Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ ID No:46)-NH2] valmistus 1,28 g:n (0,2 mmol) osalle esimerkistä 27 saatua 20 Boc-dokosapeptidi-hartsia suoritettiin kuusi kytkentäjak-soa, kuten esimerkissä 27, paitsi että Boc-p-F-Phe ensimmäisessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-l-Nal (315 mg, 1,0 mmol). Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahap-' 25 poanhydridiä 20 mlrssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 mi nuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,41 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 420 mg raakaa peptidiä.

30 Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esi-merkissä 3, jolloin saatiin 305 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLCrn avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saa-35 tiin 66,9 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho- 111646 69 mogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3398,0, saatu 3398,8. Esimerkki 29

Yhdisteen Ac-[Gin8, p-NH2-Phe10, Lys12, Nle17, Ala19, 5 Asp25, Len26, Lys27' 28] -VIP-syklo- (Lys21 -» Asp25) [Ac- (SEQ ID No :47)-11¾] valmistus 1,64 g:n (0,4 mmol) osalle esimerkistä 27 saatua Boc-nonapeptidi-hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A-10 peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc- 15 Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol),

Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 2,2 g Boc- oktadekapeptidi-hartsia.

1,1 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suori-20 tettiin kymmenen kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-p-NH(CBZ)-Phe (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (512 mg, 2,2 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (620 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (532 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (436 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 - 25 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp (OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-

Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (1,64 g, 4,0 mmol) kanssa. Peptidi-hartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml :11a etikkahappoan-hydridiä 20 mlrssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin 30 ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivat-’·. tiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,45 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 580 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esi-35 merkissä 3, jolloin saatiin 400 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 111646 70 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 22 - 32 %, jolloin saatiin 60,9 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-5 analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3346,9, saatu 3346,8. Esimerkki 30

Yhdisteen Ac-[Glu8, O-Me-Tyr10, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27' 28]-VIP-syklo-(Lys21 —» Asp25) [Ac-(SEQ ID No:48)-NH2] valmistus 10 1,1 g:n (0,2 mmol) osalle esimerkistä 29 saatua

Boc-oktadekapeptidi-hartsia suoritettiin kymmenen kytken-täjaksoa, kuten esimerkissä 29, paitsi että Boc-p-NH(CBZ)-Phe ensimmäisessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-O-Me-Tyr (148 mg, 0,5 mmol). Peptidi-hartsille suoritettiin 15 ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml :11a etikkahappoanhydridiä 20 mlrssa 6 % DIPEA/metyleeniklo-ridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,45 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten 20 esimerkissä 7, jolloin saatiin 555 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 460 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-« 25 aarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saa tiin 152,9 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3361,9, saatu 3361,7. Esimerkki 31 30 Yhdisteen Ac-(p-F-Phe6, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25,

7. Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID

No:49)-NH2] valmistus 1,2 g:n (0,2 mmol) osalle esimerkin 17 Boc-nonapeptidi-hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi 35 käyttäen Applied Biosystems malli 430A-peptidisynte-tisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin kolmetoista 111646 71 kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) 5 (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-

Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 1,3 g Boc-10 dokosapeptidi-hartsia.

0,65 g:n (0,1 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kuusi kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 27. Peptidi-hartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % 15 DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,856 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 550 mg raakaa peptidiä.

20 Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 225 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 27 - 37 %, jolloin saa-• 25 tiin 80,9 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho mogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3295,7, saatu 3296,2.

Esimerkki 32

Yhdisteen Ac-[1-Nal6, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25,

30 Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac- (SEQ ID

·· No:50)-NH2] valmistus 0,65 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkin 31 Boc-dokosapeptidi-hartsia suoritettiin kuusi kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 27, paitsi että Boc-p-F-Phe ensimmäises-35 sä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-l-Nal (315 mg, 1,0 mmol). Peptidi-hartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 111646 72 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä 20 mlrssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,801 g.

5 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 250 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 188 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 10 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 27 - 37 %, jolloin saatiin 28,0 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3327,8, saatu 3328,5.

15 Esimerkki 33

Yhdisteen Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25,

Leu26, Lys27'28, Gly29'30, Thr31]-VIP-syklo-(Lys21

Asp25) [Ac- (SEQ ID No:51)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (1,1 g, 0,5 mmoolia, 20 200 - 400 ASTM mesh, Biomega) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kolmetoista kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 24, paitsi että Boc-Ala ensimmäisessä jakossa korvattiin aminohapolla Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala toises-• 25 sa jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Gly (350 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Ala kolmannessa jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Gly (350 mg, 2,0 mmol), jolloin saatiin 2,03 g Boc-tridekapeptidi-hartsia.

1,22 g:n (0,3 mmol) osalle tästä hartsista suori-30 tettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosys-.. tems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8.

Suoritettiin kuusitoista kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 24, paitsi että Boc-Asp(OcHx) yhdennessätoista jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), 35 jolloin saatiin 1,95 g Boc-nonakosapeptidi-hartsia..

111646 73 0,975 g:n (0,15 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kaksi kytkentäjakosa kuten yllä aminohapon Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) ja aminohapon Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 1,05 g. Tälle hartsille 5 suoritettiin sitten ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DI-PEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,897 g.

10 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 270 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 150 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLCrn 15 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 24 - 34 %, jolloin saatiin 28,7 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3547,1, saatu 3546,9.

20 Esimerkki 34

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26,

Lys27, 28, Gly29' 30, Thr31] -VIP-syklo- (Lys21 -» Asp25) [Ac- (SEQ ID No:52)-NH2] valmistus 0,975 g:n (0,15 mmol) osalle esimerkin 33 Boc-• 25 nonakosapeptidi-hartsia suoritettiin kaksi kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 33, paitsi että Boc-Ala ensimmäisessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), jolloin saatiin 0,915 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten 30 esimerkissä 7, jolloin saatiin 303 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 180 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLCrn avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytetiin lineaa-35 rista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 42,8 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogee- 111646 74 ninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoanalyy-sin. FAB-MS: MH laskettuna 3563,1, saatu 3562,6.

Esimerkki 35

Yhdisteen Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25,

5 Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac- (SEQ

ID No:53)-NH2] valmistus 0,27 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkin 20 Boc- nonapeptidi-hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A-peptidisyn-10 tetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin yhdeksäntoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (378 mg, 2,0 milimoolia), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), 15 Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 20 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala ( 378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 0,57 g Boc-oktakosapeptidi-hartsia.

< 25 Tälle hartsille suoritettiin sitten ohjeen 1 vai heet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoan-hydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,506 g.

30 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten ·· esimerkissä 7, jolloin saatiin 160 mg raakaa peptidiä.

Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 100 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 35 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saa- 111646 75 tiin 17,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3331,9, saatu 3332,0. Esimerkki 36 5 Yhdisteen Ac- [p-NH2-Phe10, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25,

Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ ID No: 54) -NH2] valmistus 0,6 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkin 17 Boc-nonapeptidi-hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi 10 käyttäen Applied Biosystems malli 430A-peptidi-syntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 23, jolloin saatiin 0,72 g Boc-oktadekapeptidi-hartsia. Tälle hartsille suoritettiin yksi kytkentäjakso aminohapon Boc-p-NH(CBZ)-Phe (166 15 mg, 0,4 mmol) kanssa, jolloin saatiin 0,79 g Boc-nonadekapeptidi-hartsia. Tälle hartsille suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 23, jol-20 loin saatiin 0,72 g Boc-oktadekapeptidi-hartsia. Tälle hartsille suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Applied Biosystems malli 430A-peptidisyntetisoijaa, kuten esimerkissä 8. Suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Asn (464 25 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp (OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp (OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) kanssa, jol-30 loin saatiin 0,91 g. Tälle hartsille suoritettiin sitten • · ... ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml :11a etikkahappoanhydridiä 20 ml:ssa 6 % DIPEA/metylee-nikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saa-35 tiin 0,85 g.

111646 76 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 350 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 138 mg puolipuhdasta tuotetta.

5 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-aarsita gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin sa-tiin 25,2 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-10 analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3276,8, saatu 3276,2. Esimerkki 37

Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, m-OCH3-Tyr22, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ ID No: 55) -NH2] valmistus 15 Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), 20 Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp (OFm) (212 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (255 mg, 1,1 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-m-OCH3-Tyr(Bzl) (80 mg, 0,2 mmol), Boc-Lys (Fmoc) (234 mg, 0,5 mmol) ja

Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol) kanssa.

‘ 25 Tästä hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida BOP:n (132 mg, 0,3 mmol) kanssa . 10 ml:ssa 1 % DIPEA/DMF 3,5 tunnin ajan. Kaiser- ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin oh-30 jeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan.

Suoritettiin yhdeksäntoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1.0 mmol), Boc-Gln (270 mg, 1,1 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) 35 (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-

Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys (2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 111646 77 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (256 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 5 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol) kanssa.

Tälle hartsille suoritettiin sitten ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoan-10 hydridiä 10 ml:ssa 6 % DIPEA/metyleenikloridia 60 minuutin ajan. Hartsi pestiin ohjeen 1 .vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,814 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 265 mg raakaa peptidiä.

15 Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 150 mg puolittain puhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivi-sen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 23 - 33 %, 20 jolloin saatiin 8,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3307,8, saatu 3306,8.

Esimerkki 38 * 25 Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, m-F-L-Tyr22,

Asp25, Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Lys21 —» Asp25) [Ac- (SEQ ID No:56)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin 30 synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 37, paitsi että Boc-m-0CH3-Tyr(Bzl) seitsemännessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) (78 mg, 0,2 mmol), jolloin saatiin 0,754 g.

35 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin satiin 254 mg raakaa peptidiä. Pep- 78 111646 tidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 114 mg puolipuhdasta tuotetta.

Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLCrn avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-5 aarista gradienttia, joka käsitti 27 - 37 %, jolloin saatiin 15,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-mogeeinen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3295,7, saatu 3295,5. Esimerkki 39 10 Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, 111-OCH3-

Tyr22, Asp25, Leu26, Lys27' 28]-VIP-syklo-(Lys21 —» Asp25) [Ac- (SEQ-ID No:57)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin 15 synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 37, paitsi että Boc-Thr(Bzl) ensimmäisessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1.0 mmol), Boc-Leu toisessa jaksossa korvattiin aminoha- 20 polla Boc-Lys (2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Val kolman nessa jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Leu (268 mg, 1.0 mmol) ja Boc-Asp(OcHx) 21. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Glu (O-Bzl) (337 mg, 1,0 mmol), jolloin saatiin 0,90 g.

v 25 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 270 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin satiin 155 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 30 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-*·> aarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saa tiin 29,6 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3377,9, saatu 3377,9.

35 111646 79

Esimerkki 40

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, m-F-L-Tyr22,

Asp25, Leu26, Lys27'28] -VIP-syklo- (Lys21 -» Asp25) [Ac- (SEQ ID No: 58)-NH2] valmistus 5 Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmoo- lia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachein) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käytäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 39, paitsi että Boc-m-OCH3~Tyr (Bzl) seitsemän-10 nessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) (78 mg, 0,2 mmol), jolloin saatiin 0,83 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 240 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esi-15 merkissä 3, jolloin saatiin 100 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 37,2 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-20 mogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3365,9, satu 3365,8.

Esimerkki 41

Yhdisteen Ac-[Ala8, Lys12, Nle17, Ala19, Ala24, Asp25,

Leu26, Lys27,28]-VIP-syklo-(Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ * 25 ID No:59)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 rtimoo-lia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten 30 esimerkissä 39, paitsi että Boc-Asn viidennessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-m-0CH3-Tyr(Bzl) seitsemännessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Glu(OBzl) 21. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 35 mmol), jolloin saatiin 0,85 g.

111646 80 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 255 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 112 mg puolipuhdasta tuotetta.

5 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gardienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 12,0 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappo-10 analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3246,8, saatu 3246,7.

Esimerkki 42

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Ala16'17'19, Asp25, Leu26,

Lys27,28] -VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac- (SEQ ID

No: 60) -NH2] valmistus 15 Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmoo- lia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 41, paitsi että Boc-Ala viidennessä jaksossa 20 korvattiin aminohapolla Boc-Asn (256 mg, 1,1 mmol), Boc-Nle 12. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln 13. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Ala 21. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1,0 mmol), jol-*: 25 loin saatiin 0,80 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 254 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 115 mg puolipuhdasta tuotetta.

30 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n ·· avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line aarista gradienttia, joka käsitti 20 - 30 %, jolloin saatiin 32,1 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappo-35 analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3248,7, saatu 3248,3.

111646 81

Esimerkki 43

Yhdisteen Ac- [Ala8, Lys12, Ala16, Nle17, Ala19, Ala24,

Asp25, Leu26, Lys27'28] -VIP-syklo- (Lys21 -► Asp25) [Ac- (SEQ ID No:61)-NH2] valmistus 5 Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmoo- lia, 100 - 200 AS TM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 41, paitsi että Boc-Gln kolmannessatoista jak-10 sossa korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), jolloin saatiin 0,93 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 250 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esi-15 merkissä 3, jolloin saatiin 100 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 27 - 37 %, jolloin saatiin 23,6 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-20 mogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3189,8, saatu 3189,9.

Esimerkki 44

Yhdisteen Ac-[Ala8, Lys12, Ala16'17'19, Ala24, Asp25,

Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 -» Asp25) [Ac- (SEQ 25 ID No:62)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten esi-30 merkissä 43, paitsi että Boc-Nle kahdennessatoista jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), jolloin saatiin 0,762 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 240 mg raakaa peptidiä.

35 Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 150 mg puolipuhdasta tuotetta.

111646 82 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, jka käsitti 22 - 32 %, jolloin saatiin 55,3 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-5 mogeeninen HPLCrn perusteella ja tuotti oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3147,7, saatu 3148,0.

Esimerkki 45

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Ala16, Nle17, Ala19, Asp25,

Leu26, Lys27'28] -VIP-syklo- (Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ 10 ID No:63)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten esi-15 merkissä 42, paitsi että Boc-Ala kahdennessatoista jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol), jolloin saatiin 0,775 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 203 mg raakaa peptidiä.

20 Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 100 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 27 - 37 %, jolloin saa-25 tiin 40,0 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3290,8, saatu 3290,5.

Esimerkki 46

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Ala16'17'19, Ala24, Asp25,

30 Leu26, Lys27,28] -VIP-syklo- (Lys21 —» Asp25) [Ac-(SEQ

·* ID No:64)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmoo-lia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2.

35 Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 43, paitsi että Boc-Ala 21. jaksossa korvat- 83 717646 tiin aminohapolla Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1,0 mmol) , jolloin saatiin 0,837 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin satiin 178 mg raakaa peptidiä. Pep-5 tidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 126 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 20 - 30 %, jolloin saa-10 tiin 24,9 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3205,7, saatu 3205,2.

Esimerkki 47

Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, 15 Thr28, Gly29'30, Thr31]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25 ) [Ac-(SEQ ID No:65)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmoo-lia, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2.

20 Suoritettiin kolme kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) kanssa. Suoritettiin kaksikymmentäkahdeksan kytken-täjaksoa, kuten esimerkissä 37, paitsi että Boc-m-0CH3-·; 25 Tyr(Bzl) seitsemännessä jaksossa korvattiin aminohapolla

Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Asp(OcHx) 21. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Glu(O-Bzl) (337 mg, 1,0 mmol), jolloin saatiin 0,895 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten 30 esimerkissä 7, jolloin saatiin 440 mg raaka peptidiä. Pep->·· tidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimer kissä 3, jolloin saatiin 120 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLCrn avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin line-35 aarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 27,7 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho- 111646 84 mogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3506,9, saatu 3205,8. Esimerkki 48

Yhdisteen Ac-[p-F-Phe6, Glu8, Lys12, Nle17, Asp25, 5 Vai26, Thr28, Gly29'30, Thr31]-VIP-syklo-(Lys21 -»Asp25) [Ac- (SEQ ID No:66)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachein) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suori-10 tettiin kolmekymmentäyksi kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 47, paitsi että Boc-Ala 13. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Phe 26. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol), jolloin saatiin 0,754 g.

15 Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 280 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 152 mg puolipuhdasta tuotetta.

Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 20 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 27 - 38 %, jolloin saatiin 53,4 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLCrn perusteella ja tuotti oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3553,0, saatu 3552,2.

• 25 Esimerkki 49

Yhdisteen Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Asp25, Leu26, Lys27'28, Gly29'30, Thr31]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID No:67)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 30 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin ··> synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suori tettiin kolmekymmentäyksi kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 47, paitsi että Boc-Thr(Bzl) neljännessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Lys(2-C1-Z) (414 mg, 1,0 mmol), 35 Boc-Leu viidennessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Lys (2-Cl-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Val kuudennessa jak- 111646 85 sossa korvattiin aminohapolla Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala 13. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Ser(Bzl) 30. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), jolloin saatiin 5 0,838 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 370 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 196 mg puolipuhdasta tuotetta. 10 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLCrn avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 23 - 33 %, jolloin saatiin 48,4 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappo-15 analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3575,1, saatu 3574,0.

Esimerkki 50

Yhdisteen Ac-[Gin8, Lys12, Nle17, Asp25, Leu26, Lys27' 28, Gly29'30, Thr31] -VIP-syklo- (Lys21 -» Asp25) [Ac- (SEQ ID No:68)-NH2] valmistus 20 Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachem) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kolmekymmentäyksi kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 49, paitsi että Boc-Ala 30. jaksossa korvattiin amino-25 hapolla Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol), jolloin saatiin 0,913 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin saatiin 378 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esi-30 merkissä 3, jolloin saatiin 240 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 28,8 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli ho-35 mogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean aminohappo-analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3591,1, saatu 3590,3.

111646 86

Esimerkki 51

Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26,

Lys27' 28, Ala29”31] -VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac- (SEQ ID No:69)-NH2] valmistus 5 Bentshydryyliamiinihartsille (0,125 g, 0,1 mmol, 100 - 200 ASTM mesh, Bachein) suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen ohjetta 1, kuten esimerkissä 2. Suoritettiin kolmekymmentäyksi kytkentäjaksoa, kuten esimerkissä 47, paitsi että Boc-Thr(Bzl) ensimmäisessä jaksossa 10 korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly toisessa jaksossa korvattiin amninohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly kolmannessa jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) neljännessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Lys(2-C1-15 Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu viidennessä jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Lys(2-C1-Z) (414 mg, 1,0 mmol),

Boc-Val kuudennessa jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol) ja Boc-Glu(OBzl) 24. jaksossa korvattiin aminohapolla Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), 20 jolloin satiin 0,844 g.

Tästä peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esimerkissä 7, jolloin satiin 360 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 115 mg puolipuhdasta tuotetta. 25 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 24 - 34 %, jolloin saatiin 34,7 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLCrn perusteella ja tuotti oikean aminohappo-30 analyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3547,1, saatu 3546,0.

Esimerkki 52 VIP-analogien henkitorvea rentouttava vaikutus VIP-analogien rentouttavaa aktiivisuutta tutkittiin mallissa, jossa käytettiin marsun henkitorvea. 35 [Wasserman, M.A. et ai., teoksessa Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, toim., Raven Press, N.Y. 1982, s.

111646 87 177 - 184]. Kaikki kudokset otettiin urospuolisilta al- biinomarsuilta, jotka painoivat 400 - 600 g ja jotka oli nukutettu uretaanin avulla (2 g/kg, ip.)· Sen jälkeen kun ruumiinosa oli saatettu verettömäksi, henkitorvi poistet-5 tiin ja jaettiin neljäksi rengaslöhkoksi (pituus 3 mm). Kukin rengas ripustettiin läpimitan 30 omaavien ruostumatonta terästä olevien lankojen avulla 10 ml:n vaipalliseen kudoshauteeseen ja kiinnitettiin 4 - 0-silkkilangan avulla Grass-voimasiirtymäanturiin (malli FT03C, Grass Instru-10 ments Co., Quincy, MA) jännityksen isometristä rekisteröintiä varten. Sileän lihaksen haudenesteenä oli muunnettu Krebsin liuos, jolla oli seuraava koostumus: NaCl 120 mM; KC1 4,7 mM; CaCl2 2,5 mM; MgS04.7H20 1,2 mM; NaHC03 25 mM; K2HPO4 yksiemäksinen 1,2 mM ja dekstroosi 10 mM. Ku-15 doshauteita pidettiin 37 °C:ssa ja niihin pulputettiin jatkuvasti 95 % 02 ja 5 % CO2. Vasteet rekisteröitiin 8 kanavan ja 4 kanavan Hewlett-Packard (vastaavasti mallit 7702B ja 7754A) rekisteröintilaitteen avulla (Hewlett-Packard, Paramus, NJ) . Henkitorvirenkaat pantiin 1,5 g:n 20 lepojännitykseen, jonka oli esikokeissa määritetty olevan optimaalinen tai lähes optimaalinen. Vaadittiin lukuisia jännityksen uudelleensäätöjä seuranneen 60 minuutin stabilointia jän aikana. Kudoksia huuhdottiin 15 minuutin väliajoin.

• 25 Kullekin kudokselle aikaansaatiin kumulatiivinen pitoisuusvastekäyrä hauteen VIP:n tai VIP-analogien pitoisuuden peräkkäisten yl:n lisäysten avulla VanRossumin menetelmän mukaan [Arch. Int. Pharmacodyn. 143 (1963) 299 -330] . Ainoastaan yksi kumulatiivinen annosvastekäyrä ai-30 kaansaatiin yhdellä yksittäisellä kudoksella. Kudosten vä-·· lisen vaihtelevuuden minimoimiseksi rentoutusvasteet il maistiin prosenttimääränä maksimivasteesta, joka saatiin kunkin pitoisuusvastekokeen lopussa lisätylle VIP:lie (10-6 M = 100 %) . Kolmelta kudokselta saadut vasteet yh-35 distettiin ja ECso-arvot määritettiin lineaarisen regression avulla.

88 111646

Tulokset, joista on yhteenveto taulukossa I, osoittavat kaavojen IV ja V mukaisten VIP-analogien henki-torvea rentouttavan vaikutuksen verrattuna alkuperäiseen VIP:iin.

5 Taulukko I

VIP-analogien rentouttava vaikutus marsun henkitorven si-leään lihakseen EC50

Yhdiste (nM) 10 VIP[(Seq ID N0:1)-NH2] 10

Ac-[Lys12,Nle17,Asp24,Vai26, Thr28]-viP-syklo-15 (Lys20-*Asp24) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH2] 53

Ac-[Lys12,Nle17,Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH2] 3 1 20

Ac-[Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VlP-sykio-(Lys21—»Asp25) [AC-(SEQ ID NO:29)-NH2] 0,70

Ac-[p-F-Phe6,2-Nal10,Lys12.Nle17,Asp25,Vai26, 25 Thr28,Gly29' 30, Met31]-VIP-syklo-(Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH2] 13

Ac-[Glu8, Orn12,Nle17,Asp25,Vai26, Thr28]-Vip-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH2] 2f2 30 *». Ac- [p-F-Phe6, Lys12,Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28,

Gly29, 30/Cys (Acm) 31] -νΐΡ-syklo- (Lys21-» Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2] 0,44 35 Ac-[Ala2,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Vai26,Thr28]-VIP- syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH2] lf2

Ac-[N-Me-Ala1/Lysl2,Nle17,Ala19,Asp25,Vai26,

Thr28]-VIP -syklo-(Lys2l--»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH2] 0,71 89 111646 5 Ac-[2-Nal10,Leu12,Nle17,Ala19,Asp25,Vai26,Thr28]- VIP-syklo-(Lys21-4Asp25) [Ac-{SEQ ID NO:35)-NH2] 4,2

Ac-[0-CH3-Tyr10,Leu12,Nle17, Ala19, Asp25,Vai26,

Thr28] -VIP -syklo-{Lys21—>Asp25) 10 [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH2 3 0;84

Ac-[p-F-Phe6,p-NH2-Phe10, Leu12, Nle17, Ala19,Asp25,

Vai2 6, Thr28] -VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) 15 [AC-(SEQ ID NO:37)-NH2] 44

Ac-[Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Leu26, Lys27' 28 ]-VIP^· syklo-(Lys21-4Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH2] 0,13 2o Ac- [N-Me-Ala1, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26,

Lys27,28j_VIP.syklo_(Lys21^Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH2] 0,95

Ac- [Glu8., Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27> 2 8 ] -25 VIP-syklo-(Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH2] o, 45

Ac-[O-Me-Tyr10,Lys12,Nle17, Ala19, Asp25,Vai26,

Thr28] -VIP-syklo- (Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH2] 2,6

Ac- [Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu2 6, Lys27'2 8,

Ala29-21 ] - VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH2] 0 gl

Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,

Lys27'28,Ala2 9-21]-VIP—syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH2] 0,55

Ac-[N-Me-Ala1,Glu8,Lysl2,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,

Lys27'28 ] - VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :44)-NH2] 0,36 90 111646

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19, Asp25, Leu2 6,

Lys27'28 ] - VIP-syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH2] 0,47 ^ Ac-[1-Nal6,Glu8,Lys12,Nle17, Ala19,Asp25,Leu26,

Lys27'28 ] -VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac—(SEQ ID NO:4 6)-NH2] 0,26

Ac- [Glu8,p-NH2-Phel0,Lys12,Nle17, Ala19,Asp25, 15 Leu26, Lys27'28 ] -VIP -syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH2] 0,32

Ac-[Glu8,0-CH3-Tyr10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,

Leu26, Lys27'28] - VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) 20 [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH2] 0,41

Ac-[p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP-syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH2] 0,39 ” 25 Ac- [ 1-NaJL6, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Val26, Thr28] - VIP-syklo-(Lys2 »Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH2] 2 9

Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,

Lys27'28, Gly29' 28,Thr21]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) 30' [Ac-(SEQ ID NO :51)-NH2] 0 92 • )

Ac- [Glu8, Lys12, Nle17, Ala.19, Asp25, Leu26, Lys27 · 28,

Gly29' 2®,Thr21] -VIP-syklo-Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :52)-NH2] 0,35

Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,

Lys27'28] -VIP-syklo- (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ·ID NO:53)-NH2] 0,78

Ac-[p-NH2-Phe10,Lys12,Nle27, Ala28, Asp25,Val25,

Thr28]-VIP-syklo-(Lys22~*Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :54)-NH2] 0,96 91 ΉΊ646 5

Ac- [Lys 22, Nle27, Ala28, m-OCH3-Tyr22, Asp25, Val25,

Thr28] -VIP-syklo-(Lys22-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2] 0,31

Ac- [Lys22, Nle27,Ala28,m-F-L-Tyr22, Asp25, Val25,

Thr28] -VIP-syklo-(Lys22—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NR2] 0,52

Ac- [Glu8, Lys22,Nle27,Ala28,m-OCH3-Tyr22,Asp25, 25 Leu25, Lys27'28] -VIP-syklo-(Lys22—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH2] 0,29

Ac-[Glu8,Lys22,Nle27. Ala28, m-F-L-Tyr22,Asp25, •Leu2 5, Lys27'28] -VIP-syklo- (Lys22—»Asp25) 20 [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH2] 0,31

Ac-[Ala8,Lys22,Nle17,Ala28,Ala24,Asp25,Leu25,

Lys27'28]-VIP -syklo-(Lys22-*Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:5 9)-NH2] l χ ·:· 25

Ac-[Glu8,Lys22,Ala25'27'28, Asp25, Leu25,Lys27'28] - VIP -syklo-(Lys2:i"->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH2) 0;26

Ac-[Ala8,Lys22,Ala25,Nle27, Ala28, Ala2^, Asp25,

Leu25,Lys27,28]-VIP-syklo-(Lys22—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2] 2,4

Ac-Ala8,Lys22, Ala25'27'28,Ala24, Asp25, Leu2 5,

Lys27'28 ] - VIP -syklo-(Lys22—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH2) 0,1

Ac- [Glu8, Lys^·2, Ala 16, Nle^-7, Ala^9, Asp28, Leu28,

Lys27'28] -viP-syklo- (Lys27—>Asp25) [Ac-SEQ ID NO:63)-NH2] 0,9 92 5

Ac-[Glu8,Lys12,Ala78'17,19,Ala2^, Asp28, Leu28,

Lys27' 28] -VIP-syklo- (Lys27—»Asp28) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2] 0,22 10 Ac-[Glu8,Lysl2,Nle17,Ala19Asp25,Val28,Thr28,

Gly2 9,30i Thr31]_vip-syklo-(Lys21->Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2] 0,88

Ac- [p-F-Phe8, Glu8, Lys12, Nle17, Asp28, Val26, Thr28, 15 Gly29'30,Thr31]-VIP-syklo-Lys21-^Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2] 0,57

Ac-[Ala2,Glu8,Lys72,Nle77,Asp28,Leu28,Lys27'28,

Gly2 9 ' 38, Thr37] -VIP-syklo-Lys27—»Asp28) 20 [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2] 0,19

Ac- [Glu8, Lys72,Nle77, Asd28, Leu2 8, Lys27 > 28,

Gly29' 38, Thr37] -VIP-syklo-Lys27—» Asp28)

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2] 0,43 25

Ac- [LysI2,Nle77,Ala19, Asp28, Leu28, Lys27,28,£ia29-31] ~vip -syklo-(Lys—»Asp28)

Ac-(SEQ ID NO :69)-NH2] 0,42 111646 93

Esimerkki 53 VIP-analogien keuhkoputkea laajentava vaikutus VIP: n ja VIP-analogien keuhkoputkea laajentavaa vaikutusta in vivo marsuilla tutkittiin käyttäen antamista 5 tiputtamalla henkitorveen. Tässä tekniikassa käytettiin urosmarsuja (Hartley-kanta, Charles River), jotka painoi-vat 400 - 600 g. Eläimet nukutettiin uretaanin avulla (2 g/kg) antamalla se vatsaontelon sisään ja polyeteenika-nyyli sijoitettiin kaulalaskimoon lääkkeen antamiseksi 10 laskimoon.

Eläimille tehtiin henkitorven leikkaus ja annos-tusliuoksia, joissa oli tislattua vettä tai koeyhdistettä liuotettuna tislattuun veteen, annettiin henkitorveen kohtaan, joka sijaitsi suunnilleen kolme neljäsosaa henkitor-15 ven alaosassa olevan harjun etäisyydestä, pipetin avulla. Annostusliuoksen pitoisuus säädettiin siten, että voitiin antaa 100 ml: n vakiotilavuus. Eläimet pantiin selälleen yhden minuutin ajaksi, jotta edistettäisiin lääkkeen toimittamista keuhkoihin. Yksi minuutti myöhemmin spontaani 20 hengitys keskeytettiin laskimoon annetun sukkinyylikolii-nikloridin avulla (1,2 mg/kg) ja eläimiä autettiin hengittämään Harvard Model 680 - pienten eläinten hengitysköjeen avulla, joka oli säädetty tehokkuudelle 40 henkäystä/min ja sylinterin iskun tilavuus 4,0 cm3. Eläimille annettiin · 25 haasteeksi maksimaalinen kuristava annos histamiinia (50 mg/kg, laskimoon) ja henkitorven paine (cm vettä) rekisteröitiin Statham-paineanturin (P 32 AA) avulla.

Henkitorven paineen muutoksen keskiarvo laskettiin vähintään kolmelle kontrolli- ja kolmelle lääkkeellä käsi-30 tellylle eläimelle ja laskettiin prosenttinen estäminen.

··· Tiputtamistietä annettujen yhdisteiden suhteellinen tehok kuus määritettiin antamalla erilaisia annoksia koeyhdistettä ja laskemalla tehokkaan annoksen keskusarvo (ED50-arvo). ED50 määritettiin annoksen logaritmi-vastekäyriltä, 35 jotka oli -aikaansaatu vähintään kolmen sellaisen annoksen avulla, jotka aiheuttivat 10 %:n ja 90 %:n väliltä olevia 111646 94 estäviä vaikutuksia. Kunkin yhdisteen regressiosuoran kor-relaatiokerroin oli aina suurempi kuin 0,95.

Estämisen muuttumisen ajan mukana määrittämiseksi eri yhdisteille vaihdeltiin yhdisteen antamisen ja hista-5 miinilla ärsyttämisen välistä aikaa. Aktiivisuuden muuttuminen ajan mukana laskettiin siksi ajaksi, jona estäminen väheni 40 %:ksi.

Tulokset, joista on yhteenveto taulukossa II, osoittavat kaavan V mukaisten VIP-analogien keuhkoputkea 10 laajentavan vaikutuksen in vivo verrattuna alkuperäiseen VIP:iin. 1 € 95 111640

Taulukko II

VIP—analogien, keuhkoputkea laajentava vaikutus marsuilla ED50 5 Yhdiste (pg) VIP[(Seq ID N0:l)-NH2l 7^3 10 Ac-[Lys12,Nle17, Asp24,Vai26,Thr28]-VIP-syklo- (Lys20-»Asp24) [Ac-(SEQ ID NO;27)-NH2] 2,3

Ac-[Lys12,Nle17,Asp25,Vai2 6,Thr28]-VIP-syklo-(Ly s21—»Asp25) [AC-(SEQ ID NO:28)-NH2] 1,2 15

Ac-[Lys12,Nle17,Ala18,Asp25,Vai28,Thr28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH2] 0,34

Ac-[p-F-Phe6,2-Nal10,Lys12,Nle17,Asp25,Vai28, 20 Thr28,Gly29' 38,Met31) -VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH2] 0,90

Ac-[Glu8,Orn12,Nle17,Asp25,Vai26,Thr28]-VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [AC- (SEQ ID NO:3l)-NH2] 0,19 25

Ac-[p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Vai26,Thr28,

Gly29' 30f Cys (Acm) 31] -VIP -syklo-(Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2] 0,19 30 Ac-[Ala2,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25, Vai26,Thr28)-VIP- syklo- (Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH2) 0 6

Ac-[N-Me-Ala1,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Vai26,

Thr28] -VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) 35 [Ac—(SEQ ID NO:34)-NH2] 1>0

Ac-[Lysl2,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26, Lys27/ 28]-VIP-' syklo-(Lys21—*Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH2] 0,09 96 111646

Ac- [N-Me-Ala1, Lys I·.2, Nle17, Ala 19, Asp25, Leu2 6, 5 Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH2] 0,06

Ac- [Glu8, Lys I·2, Nle17, Ala 19, Asp25, Leu2 6, Lys27 > 25 ] - VIP -syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH2] 0,022 10

Ac- [Glu8, Lys I·2, Nle^·7, Ala I·5, Asp25, Leu2 6, Lys27'2 8,

Ala2 9-31 ] -VIP -syklo-(Lys21-»Asp2 5) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH2] 0,072 15 Ac-[Ala2,Glu8,Lysl2,Nlel7, Alai9,Asp25, Leu26,

Lys27,28/Aia29-31]_vip_sykio-(Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :43)-NH2] 0,14

Ac-[N-Me-Alal,Glu8,Lys12,Nlel7,Alai9,Asp25,Leu26, 20 Lys27'28] -VIP-syklo- (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :44)-NH2] 0,097

Ac- [p-F-Phe6, Glu8., Lys I2, Nlel7,Alal9, Asp25, Leu2 6,

Lys27'28] - VIP-syklo- (Lys2!—»Asp25) 25 [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH2] 0,026

Ac-[1-Nal6,Glu8,Lys12,Nle17, Ala19,Asp25, Leu26,

Lys27'28] - VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH2] 0 036 30 ’

Ac-[Glu8,p-NH2-Phe10,Lys12.Nle17,Ala19,Asp25,

Leu26, Lys27'28] - VIP -syklo-(Lys2l—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO :47)-NH2] 0,075 35 Ac-[Glu8,O-CH3-Tyr10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,

Leu26, Lys27'28] -VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH2] 0,094

Ac-[p-F-Phe8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val28,Thr28)- VIP-syklo-(Lys27-4Asp23) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH2) 0,26 97 111640

Ac-[Ala2,Glu8,Lys72,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26, 5 Lys27'28,Gly29'30,Thr37)-VlP-syklo-(Lys21-»Asp23) [AC-(SEQ ID NO:51)-NH2) 0,1

Ac-[Glu8, Lys72,Nle17,Ala19,Asp23,Leu28,Lys27'28,

Gly2 9,30/Thr31]_vip-syklo-Lys21->Asp25) 10 [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2] 0,1

Ac- [Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19, Asp23, Leu28,

LyS27,28] -vip-syklo- (Lys21-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH2] 0,14 15

Ac-[p-NH2-Phe10,Lysl2,Nle17,Ala19,Asp23, Val28,

Thr2 8 ] -VIP -syklo-(Ly s2l-»Asp23) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH2] 0,35 2® Ac-[Lys72,Nle77,Ala79,m-OCH3~Tyr22, Asp23,Val28,

Thr28)-VIP-syklo-(Lys21—»Asp23) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2) 0,14

Ac-[Lys12,Nle17. Ala19,m-F-L-Tyr22,Asp25,Val28, , 25 Thr28) -VIP-syklo-(Lys27—»Asp23) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH2) 7>2

Ac-[Glu8,Lys72,Nle77,Alal9,m-OCH3-Tyr22, Asp23,

Leu28,Lys27'28) -VIP~syklo-(Lys21—»Asp23) 30 [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH2) 0,019 • ·

Ac-[Glu8, Lys12,Nle17,Ala19,m-F-L-Tyr22, Asp23,

Leu2 8, Lys27'28) -VIP-syklo-(Lys27~»Asp23) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH2 J 0(03

Ac-[Ala8, Lys72,Nle17,Ala19,Ala24,Asp23,Leu28,

Lys27'28) - VIP -syklo-(Lys21—»Asp23) [Ac-(SEQ ID NO:5 9)-NH2) 0,17 35

Ac-[Glu8,Lysl2,Ala16'17·19,Asp25,Leu26,Lys27'28) - VIP-syklo-(Lys21—>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH2] 0,17 98 111646

Ac-[Ala8, Lys12, Ala16,Nle17,Ala19,Ala24,Asp25, 5 Leu28,Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21—>Asp26) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2] 0,045

Ac-Ala8,Lys12,Ala16'17'19,Ala24,Asp25,Leu26,

Lys27'28 ] -VIP-syklo-(Lys21—»Asp25) XO [AC-(SEQ ID NO:62)-NH2] 0,24

Ac-[Glu8,Lys12,Ala18'17'19,Ala24, Asp25,Leu26,

Lys27'28)-VIP-syklo- (Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2) 0,13 15

Ac-[Glu8, Lys12, Nle17,Ala19Asp25,Val26, Thr28,

Giy29,30/Thr1)-VIP-syklo-(Lys2l-»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2J 0,84

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17, Asp28, Val26,Thr28, ^ Gly29' 28, Thr21) -VlP-syklo-Lys21—»Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2) 0,12

Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Asp22,Leu26, Lys27'28,

Gly29'28, Thr21] -VIP-syklo-Lys21-» Asp25) 25 [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2) 0,077

Ac-[Glu8,Lys12, Nle17,Asp25,Leu26,Lys27'28,

Gly29/ 20, Thr21) -VIP-syklo-Lys21—»Asp25)

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2) 0,04 30 V Ac-[Lys12,Nle17, Ala19,Asp25,Leu26, Lys27'28'Ala29- 31) ~viP-syklo-(Lys—»Asp25)

Ac-(SEQ ID NO:69)-NH2) 0^04

Claims (61)

111646

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen syklisen peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava IV 5 X-His-Ser-Asp-AIa-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Ri2- Leu-Arg-Lys-Gln-Ri7-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- (IV)

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan IV mukainen syklinen peptidi, joka on Ac-[Lys12, Nle17, Asp24, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys20 _>. Asp24) [Ac-(SEQ ID NO:27)- nh2] .

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan V mukai nen syklinen peptidi, jossa Q on metyylisykloheksyyli.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan V mukainen syklinen peptdidi, jossa Q on Ci-2-alkyyliaryyli.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä Q on Ci-2-alkyylifenyyli, jossa fenyylirengas on substituoimaton tai substituoitu yhdellä tai useammalla substituentilla, jotka on valittu ryhmistä OH, OCH3, F, Cl, I, CH3, CF3, 35 N02, NH2, N(CH3)2, NHCOCH3, NHCOCgHs ja C(CH3)3.

6. Patenttivaatimuksen -4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä Q on 111646 Ci-2-alkyylinaftyyli, jossa naftyylirenkaat ovat substitu-oimattomia tai substituoituja yhdellä tai useammalla substituentilla, jotka on valittu ryhmistä OH, OCH3, F, Cl, I, CH3, CF3, NO2, NH2, N(CH3)2, NHCOCH3, NHCOCeHs ja 5 C (CH3) 3.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä R26 on Vai ja R28 on Thr [X-(SEQ ID NO:.ll)-Y].

8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä R17 on Nle, R26 on Vai ja R28 on Thr [X-(SEQ ID NO:12)-Y].

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Äc-[Glu8, Orn12, Nle17, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 -» Asp25) 15 [Ac- (SEQ ID NO: 31) -NH2] .

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, t u n e t t u siitä, että syklisessä peptidissä Ri2 on Leu, Ri7 on Nle, R19 on Ala, R26 on Vai ja R28 on Thr [X-(SEQ ID NO:13)-Y].

10 Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R28-Y [X-(SEQ ID N0:8)-Y] jossa R12 on Arg tai Lys; R17 on Met tai Nle; R26 on Ile tai Vai; R28 on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa 15 oleva aminon suojaryhmä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai kaava V X-Ri-Rz-Asp-Ala-Val-Re-Thr-Re-Asn-RurThr-R^ I-1

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[2-Nal10, Leu12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 _> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH2].

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[0-Me- Tyr10, Leu12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo [Ac-(SEQ ID NO: 36) -NH2] .

13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[p-F-

14. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä Ri2 on Lys, R17 on Nle, R28 on Vai ja R28 on Thr [X-(SEQ ID

15 Lys12, Nle17, Ala19, Ala24, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 _> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH2] .

15 Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28, Ala29-31]-VIP-syklo [Ac- (SEQ ID NO: 42) -NH2] .

15 Lys, R17 on Nle, R26 on Leu ja R27 ja R28 ovat kummatkin Lys [X-(SEQ ID NO:18)-Y].

15 NH2-Phe10, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [Ac- (SEQ ID NO:54)-NH2].

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Lys12, Nle17, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [Ac- (SEQ ID NO: 28) -NH2] .

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[p-F-Phe6, 2-Nal10, Lys12, Nle17, Asp25, Vai26, Thr28, Gly29'30, Met31]-VIP-(1 - 31) -NH2-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:30) -NH2] .

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[p-F-Phe6, Glu8, Lys12, Nle17, Asp25, Vai26, Thr28, Gly29'30, Thr31]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2].

18. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että. syklisessä peptidissä Ri2 on Lys, R17 on Nle, Rig on Ala, R26 on Vai ja R28 on Thr [X-(SEQ ID NO:15)-Y].

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac- 20 [Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH2].

20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[p-F-Phe6, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28, Gly29'30,

20 Leu-Afg-LyS'Ri6-Ri7-AIa-Rig-Lys-Lys-R22" (V) I — J Leu-R24-Asp-R2B“R27-R2a-Y [X-(SEQ ID NO: 10) -Y] 25 jossa Rx on His, N-CH3~Ala; R2 on Ser tai Ala; R6 on Q H 11 O 1 2 3 4 5 6 jossa Q on alempialkyylisykloheksyyli tai alempialkyyli- 2 .. aryyli; Rs on Asp, Glu tai Ala; Rio on Tyr tai Rg; R12 on 3 Arg tai Lys; Rie on Gin tai Ala; Rn on Met, Nle tai Ala; 4 R19 on Vai tai Ala; R22 on Tyr tai Rg; R24 on Asn tai Ala; 5 R26 on Ile, Vai tai Leu; R27 on Leu tai Lys; R28 on Asn, Thr 6 tai Lys; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryhmä; Y on hydroksyyli, hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä tai R29-R30-R3i-Z; R29 on Gly tai Ala; 111646 R3o on Gly tai Ala; R31 on Ala, Met, Cys (Acm) tai Thr; Z on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suoja-ryhmä; tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistami-5 seksi, tunnettu siitä, että a) suojatusta ja hartsiin sidotusta peptidistä, jolla on vastaava aminohapposekvenssi, poistetaan selektiivisesti suojausta vapaan sivuketjuaminoryhmän ja vapaan sivuketjukarboksyyliryhmän aikaansaamiseksi; 10 b) vapaa sivuketjuaminoryhmä ja vapaa sivuketju- karboksyyliryhmä kytketään kovalenttisesti sopivan ami-dinmuodostusreagenssin avulla ja c) peptidistä, jolle on suoritettu renkaanmuodos-tus, poistetaan suojaus ja se lohkaistaan hartsista käsit-15 telemällä sopivalla suojauksenpoisto- ja lohkaisureagens- silla, haluttaessa muiden sopivien lisäaineiden ollessa läsnä kationinpoistajina, ja haluttaessa muutetaan syklinen peptidi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

21. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Ala2, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21

22. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[N-Me-Ala1, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys21 _> Asp25) [Ac- (SEQ ID NO:34)-NH2]. 35 111646

23. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[O-Me-. Tyr10, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH2].

24. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[p-F-Phe6, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Lys21 -> Asp25) [Ac- (SEQ ID NO:49)-NH2].

25. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, 10 tunnettu silitä, että syklinen peptidi on Ac-[1- Nal6, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Lys21 _> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH2].

25 Cys (Acm) 31]-VIP-(1 - 31) -NH2-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO: 32) -NH2] .

26. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[p-

27. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, m-OCH3-Tyr22, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP- 20 syklo-(Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2].

28. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, m-F-L-Tyr22, Asp25, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH2].

29. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, * tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28, Gly29'30, Thr31]-VIP- syklo-(Lys21 _> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2].

30. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä R26 on Leu ja R27 ja R2s ovat kummatkin Lys [X-(SEQ ID NO:16)-Y].

** 31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä Ri2 on Lys, R17 on Ala, Rig on Ala, R26 on Leu ja R27 ja R2s ovat 35 kummatkin Lys [X-(SEQ ID NO:17)-Y]. 111646

30 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH2].

30 Phe6, p-NH2-Phe10, Leu12, Nle17, Ala19, Asp25, Vai26, Thr28]- VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH2].

32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu, Lys12, Ala16'17'19, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH2] .

33. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Ala8, Lys12, Ala16'17'19, Ala24, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [AC-(SEQ ID NO:62)-NH2].

34. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Ala16'17'19, Ala24, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac- (SEQ ID NO:64)-NH2].

35 Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 _> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH2]. 111646

35 Ser, Ri2 on Lys, Ri6 on Gin, R17 on Nle, R19 on Ala, R26 on Leu ja R27 ja R28 ovat kummatkin Lys [X-(SEQ ID NO:71)-Y]. 111646

35. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä R12 on

35 NO:14)Y]. 111646

36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Asp25, Leu25, Lys27'28, Gly29'30, Thr31]-VIP- 20 syklo-(Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2].

37. Patenttivaatimuksen 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Asp25, Leu26, Lys27'28, Gly29'30, Thr31]-VIP- syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2].

38. Patenttivaatimuksen 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä R12 on Lys, R17 on Nle, R19 on Ala, R26 on Leu ja R27 ja R2e ovat kummatkin Lys [X-(SEQ ID NO:19)-Y].

39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä Ri2 on .... Lys, Ri6 on Gin, R17 on Nle, R19 on Ala, R26 on Leu ja R27 ja '* R28 ovat kummatkin Lys [X-(SEQ ID NO:70)-Y].

40. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä R2 on

41. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27,28] -VIP-syklo-(Lys21 _> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH2].

42. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[N-Me-Ala1, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [Ac- (SEQ ID NO:39)-NH2J.

43. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 -» Asp25) [Ac- (SEQ ID NO:40)-NH2] :

44. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8,

45. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[N-Me-Ala1, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP- 20 syklo-(Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH2].

46. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[p-F-Phe6, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28] -VIP-syklo-(Lys21 -* Asp25) [Ac- (SEQ ID NO: 45) -NH2] .

47. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[1-Nal6, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo-(Lys21 -> Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH2].

48. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, p-NH2-Phe10, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27' 28] -VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH2].

49. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac- 35 [Glu8, O-Me-Tyr10, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28]- VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH2]. 111646

50. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28, Gly29'30, Thr31]- VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2].

51. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, m-OCH3-Tyr22, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH2].

52. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, m-F-L-Tyr22, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH2].

53. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Ala8,

54. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28, Ala29-31] -VIP-syk- 20 lo- (Lys21 Asp25) [Ac-SEQ ID NO:69)-NH2].

55. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä R2 on Ala, Ri2 on Lys, Ri6 on Gin, Rn on Nle, Rig on Ala, R26 on Leu ja R27 ja R2s ovat kummatkin Lys [X-(SEQ ID NO:72)-Y].

56. Patenttivaatimuksen 55 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28, Ala29-31]-VIP-syklo- (Lys21 -» Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH2].

57. Patenttivaatimuksen 55 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Ala2, Glu8, Lys12, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27'28, Gly29'30, Thr31]-VIP-syklo-(Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH2].

58. Patenttivaatimuksen 55 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Ala2,

59. Patenttivaatimuksen 38 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklisessä peptidissä R12 on Lys, Ri6 on Ala, Rn on Nle, R19 on Ala, R26 on Leu ja R27 ja R28 ovat kummatkin Lys [X-(SEQ ID NO:73)-Y].

60. Patenttivaatimuksen 59 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Ala8, Lys12, Ala16, Nle17, Ala19, Ala24, Asp25, Leu26, Lys27'28]-VIP-syklo- (Lys21 Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2].

61. Patenttivaatimuksen 59 mukainen menetelmä, 10 tunnetu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Ala16, Nle17, Ala19, Asp25, Leu26, Lys27,28]-VIP-syklo-(Lys21 _> Asp25) [Ac- (SEQ ID NO:63)-NH2]. 1 · • « 111646