KR970001580B1 - 환상 혈관활성 펩티드 - Google Patents

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Description

환상 혈관혈성 펩티드

본 발명은 혈관활성 펩티드(VIP) 유상체인 환상 펩티드 및 상기 환상 펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 기관지기관 협착성 질환의 치료에 유용하다.

혈관활성 장 펩티드(VIP)가 먼저 발견되었으며, 이를 돼지의 장으로부터 단리하고 정제하였다[미합중국 특허 제3,879,371호]. 상기 펩티드는 28개의 아미노산을 가지며 세크레틴 및 글루카곤과 광범위한 상동성을 갖는다[Carlquist et al., Horm. Metab. Res., 14, 28-29(1982)]. VIP의 아미노산 서열은 다음과 같다 :

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-

Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-

Leu-Asn-NH₂ [(SEQ ID : 1)-NH₂]

VIP는 위장관 및 순환계 전체를 통해 광범위한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 공지되어 있다. 위장 호르몬에 대한 그의 유사성에 비추어, VIP는 췌장 및 담즙 분비, 간의 글리코겐 분해, 글루카곤 및 인슐린 분비를 자극하고, 췌장의 디카보네이트 방출을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다[Kerrins, C. and Said, S. I., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 142, 1014-1417(1972) ; Domschke, S. et al., Gastroenterology, 73, 478-480(1977)].

VIP를 함유하는 뉴런이 내분비 및 외분비계, 장 및 평활근의 세포에서 면역분석에 의해 정위되었다[Polak, J. M. et al., Gut, 15, 720-724(1974)]. VIP는 프롤락틴[Frawley, L. S., et al., Neuroendocrinology, 33, 79-83(1981)], 티록신[Ahren, B., et al., Nature, 287, 343-345(1980)], 및 인슐린 및 글루카곤[Schebalin, M., et al., Am. J. Physiology E., 232, 197-200(1977)]을 비롯한 여러 호르몬의 방출을 일으키는 신경작동체인 것으로 밝혀졌다. VIP는 또한 생체내 및 생체외에서 신장으로부터의 레닌 방출을 자극하는 것으로 밝혀졌다[Porter, J. P., et al., Neuroendocrinology, 36, 404-408(1983)]. VIP는 다양한 동물종 및 인간의 기도에서 신경 및 신경 말단에 존재하는 것으로 밝혀졌다[Dey, R. D., and Said, S. I., Fed. Proc., 39, 1062(1980) ; Said, S. I., et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 221, 103-114(1974)]. VIP의 심혈관 및 기관지폐 작용은 VIP가 강력한 혈관확장제 및 유능한 평활근 이완제이고, 말초, 폐 및 관상 혈관상에서 작용하는 것으로 밝혀졌으므로 중요하다[Said, S. I., et al., Clin. Res., 20, 29(1972)]. VIP는 대뇌혈관에 대해 혈관확장 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다[Lee, T.J. and Berszin, I., Science, 224, 898-900(1984)]. 생체의 연구는 대뇌 동맥에 외적으로 적용된 혈관활성 장 펩티드가 혈관확장을 유발시킴을 입증하였으며, VIP가 대뇌 혈관확장에 대해 가능한 전달물질로서 제안되었다[Lee, T. and Saito, A., Science, 224, 898-901(1984)]. 눈에서, VIP는 또한 유능한 혈관확장제임을 보였다[Nilsson, S. F. E. and Bill, A., Acta Physiol. Scand., 121, 385-395(1984)].

VIP는 면역 시스템에 대해 조절 작용을 가질 수도 있다. 오'도리시오 등(O'Dorisio et al.)은 VIP가 림프구의 증식 및 이동을 조정할 수 있음을 보였다[J. Immunol., 135, 792s-796s(1985)].

VIP는 상기 나타낸 바와 같이 평활근을 이완시키는 것으로 밝혀졌고, 통상적으로 기도 조직에 존재하므로, VIP가 기관지 평활근 이완의 외적인 매개자일 수도 있음이 가정되었다[Dey, R. D. and Said, S. I., Fed. Proc. 39, 1962(1980)]. 천식 환자의 조직은 통상적인 환자의 조직에 비해서 면역반응성 VIP를 함유하지 않는 것으로 나타났다. 이는 천식과 관련되 VIP 또는 VIP성 신경 섬유의 손실을 나타내는 것일 수도 있다[Ollerenshaw, S. et al., New England J. Med., 320, 1244-1248(1989)]. 생체외 및 생체내 시험은 VIP가 기관 평활근을 이완시키고 히스타민 및 프로스타글란딘 F2a와 같은 기관지수축제에 대해 보호함을 나타내었다[Wasserman, M. A. et al., in Vasoactive Intestinal Peptide, S. I., Said, ed., Raven Press, N. Y., 1982, pp 177-184 : Said, S. I. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 221, 103-114(1974)]. VIP는 정맥내로 투여되었을 때, 히스타민, 프로스타글란딘 F_2a, 류코트리엔, 혈소판 활성인자와 같은 기관지수축제 뿐만 아니라 항원-유발된 기관지수축을 방지하는 것으로 밝혀졌다[상기, Said, S. I., et al., (1982)]. VIP는 또한 생체외에서 인간 기도 조직에서 점액 분비를 억제하는 것으로 밝혀졌다[Coles, S. J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 124, 531-536(1981)].

인간에서, VIP는 정맥내 주입에 의해 천식환자에 투여시, 호기(呼氣)의 흐름속도의 절정을 증가시키고 히스타민-유발된 기관지확장을 방지하는 것으로 나타났다[Morice, A. H. and Sever, P. S., Peptides, 7, 279-280(1986) ; Morice, A. et al., The Lancet, Ⅱ 1225-1227(1983)]. 그러나 VIP의 이러한 정맥내 주입에 의해 관찰된 폐 작용은 심혈관 부작용, 가장 현저하게는 저혈압 및 빈박, 및 또한 안면 조흥을 수반한다. 심혈관 작용을 야기시키지 않는정맥내 투여량으로 투여시, VIP는 특별한 기도 전달능력을 변경시키지 못한다[Palmer, J. B. D., et al., Thorax, 41, 663-666(1986)]. 활성의 부족은 적은 투여용량 및 아마도 상기 화합물의 급속한 분해에 기인하는 것으로 설명된다.

고유 VIP는 인간에게 에어로졸로 투여시, 히스타민-유발된 기관지 수축을 방지하는데 단지 약간 유효할 뿐이었다. VIP는 기도 변수의 기본선에 현저한 영향을 미치지는 않지만 인간에게 흡입 투여시 히스타민-유발된 기관지수축에 대한 보호작용을 갖는 것으로 밝혀졌다[Barnes, P. J. and Dixon, C. M. S., Am. Rev. Respir. Dis., 130, 162-166(1984)]. VIP는 에어로졸로 투여시 기관지확장과 함께 박막 또는 저혈압 효과를 나타내지 않는 것으로 보고되었다[Said, S. I. et al., in Vasoactive Intestinal Peptide, S. I. Said, ed., Raven Press, N. Y., 1928, pp 185-191].

VIP의 중요하고 잠재적인 임상적으로 유용한 생물학적 활성 때문에, 상기 물질은 상기 분자의 하나 이상의 성질을 증진시키려는 목표를 갖는 다수의 보고된 합성 프로그램의 표적이 되어 왔다. 다케야마 등(Takeyama et al.)은 8번 위치에서 아스파르트산이 글루탐산으로 치환된 VIP유사체를 보고하였다. 상기 화합물은 고유 VIP보다 효능이 적은 것으로 밝혀졌다[Chem. Pharm. Bull., 28, 2265-2269(1980)]. 웬들버거 등(Wendlberger et al.)은 17번 위치에서 메티오닌이 노르류신으로 치환된 VIP 유사체의 제조를 기술하였다[Peptide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290-295(1980)]. 상기 펩티드는 간 멤브레인 제제로부터 방사성 요오드화된 VIP를 나타내는 그의 능력에 대해서 고유 VIP와 동등한 효능이 있는 것으로 밝혀졌다. 와츠 및 우튼(Watts and Wooten)은 고유 서열로부터 6 내지 12개의 잔기를 함유하는 일련의 선형 및 환상 VIP 단편들을 보고하였다(유럽특허 제184309호 및 제325044호; 미합중국 특허 제4,737,487호 및 제4,866,039호]. 터너 등(Turner et al.)은 VIP단편(10-28)이 VIP에 대한 길항물질임을 보고하였다[Peptides, 7, 849-854(1986)]. 치환된 유사체(4-Cl-D-Phe⁶, Leu¹⁷]-VIP는 또한 VIP 수용체에 결합하고 VIP의 활성에 길항작용을 하는 것으로 보고되었다[Pandol, S. et al., Gastrointest. Liver Physiol., 13, G556-G557(1986)]. 고제스 등(Gozes et al.)은 유사체[Lys¹, Pro², Arg³, Arg⁴, Pro⁶, Tyr⁶]-VIP가 신경교 세포상에서 그의 수용체에 대한 VIP 결합의 경쟁적인 억제제임을 보고하였다[Endocrinology, 125, 2945-2949(1989)]. 로버렉트 등(Robberecht et al.)은 고유 VIP의 N-말단에서 치환된 D-잔기를 갖는 여러 VIP 유사체를 보고하였다.[Peptides, 9, 339-345(1988)]. 이러한 유사체들은 모두 VIP 수용체에 덜 밀접하게 결합하며 c-AMP 활성에서 고유 VIP보다 적은 활성을 나타낸다. 타키바나와 이토(Tachibana and Ito)는 전구체 분자의 여러 VIP 유사체를 보고하였다[in Peptide Chem., T. Shiba and S. Sakakibara, eds., Prot. Res. Foundation, 1998, pp. 481-486, Jap. Pat. No. 1083012, 미합중국 특허 제4,822,744호]. 이러한 화합물들은 VIP보다 1내지 3배 더 효능이 있는 기관지 확장제이고 1내지 2배 더 높은 수준의 저혈압 활성을 갖는 것으로 나타났다. 무소등(Musso et al.)은 또한 6∼7, 9∼13, 15∼17 및 19∼28번 위치에서 치환된 여러 VIP 유사체를 보고하였다[Biochemistry, 27, 8174-8181(1988) ; 유럽특허 제8271141호; 미합중국 특허 제4,835,252호]. 상기 화합물들은 VIP 수용체에 대한 결합 및 생물학적 반응에 있어서 고유 VIP와 동등하거나 이보다 효능이 적은 것으로 밝혀졌다. 발트파이 등(Bartfai et al.)은 일련의 다수 치환된[Leu¹⁷]-VIP 유사체를 보고하였다[국제 특허출원 제WO 89/05857호].

본 발명은 환상 혈관활성 펩티드 유사체를 포함한다. 환상 펩티드는 펩티드 쇄에서 한 아미노산의 측쇄 카복시 말단이 아미드 결합의 형성을 통해 펩티드 쇄에서 또다른 아미노산의 측쇄 아미노 말단에 공유적으로 결합된 펩티드이다. 펩티드 쇄에서 2개의 아미노산 잔기들간의 공유결합으로 고리 구조가 스득된다.

환상 펩티드의 생물학적 활성은 모 선형 유사체의 활성과 실질적으로 상이할 수도 있다. 환상 펩티드는 구조적으로 보다 엄격하며, 보다 잘 한정된 구조를 갖는다. 이러한 변화는 환상 펩티드의 생물학적 프로파일에 영향을 준다. 펩티드 유사체의 환화는 펩티드의 화학적 및 효소적 분해에 덜 민감하게 하는 증가된 엄격성에 기인하여 상기 펩티드의 작용 지속성을 연장시킬 수 있다. 환상 펩티드의 생체내 이용효율은 상기 구조의 엄격화의 결과로서 상기 펩티드의 물리적 성질 변화에 기인하여 증가될 수도 있다. 또한, 상기 환상 펩티드의 잘 한정된 모양은 선형 펩티드 보다 표적 수용체에 대한 특이성을 더욱 증가시켜, 바람직한 활성과 공존하는 바람직하지 못한 생물학적 활성에 대한 성질을 감소시킬 수도 있다.

본 발명은 하기 일반식(I)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다 :

상기식에서, R₈은 Asp, Glu 또는 Lys이고; R₁₂는 Arg, Lys, Orn 또는 Asp이고; R₁₇은 Met 또는 Nle이고; R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

하기 일반식의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식에서, X, Y, R₈및 R₁₂는 일반식 (Ⅰ)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 하기 일반식 (Ⅱ)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

상기 식에서, R₈은 Asp 또는 Asn이고; R₁₇는 Met 또는 Nle 이고, R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

하기 일반식의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식에서, X 및 Y 일반식 (Ⅱ)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 하기 일반식 (Ⅲ)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

상기 식에서, R₁₇는 Met 또는 Nle 이고, R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

하기 일반식의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식에서, X 및 Y 일반식 (Ⅲ)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 하기 일반식 (Ⅳ)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

상기 식에서, R₁₂은 Arg 또는 Lys이고; R₁₇는 Met 또는 Nle 이고, R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

하기 일반식의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식에서, X 및 Y 일반식 (Ⅳ)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 하기 일반식 (Ⅴ)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

상기 식에서, R₁은 His, N-CH₃-Ala이고; R₂는 Ser 또는 Ala이고; R₆은

(상기 식에서, Q는 사이클로헥실 저급 알킬 또는 아릴 저급 알킬이다)이고; R₈은 Asp, Glu 또는 Ala이고; R₁₀은 Tyr 또는 R₆이고; R₁₂은 Arg 또는 Lys이고; R₁₆은 Gln 또는 Ala이고; R₁₇은 Met, Nle 또는 Ala이고; R₁₉은Val 또는 Ala이고; R₂₂은 Tyr 또는 R₆이고; R₂₄은 Asn 또는 Ala이고; R₂₆은 Ile, Val 또는 Leu이고; R₂₇은 Leu 또는 Lys이고; R₂₈은 Asn, Thr 또는 Lys이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹 또는 R₂₉-R₃₀-R₃₁-Z이고; R₂₉는 Gly 또는 Ala이고; R₃₀은 Gly 또는 Ala이고; R₃₁은 Ala, Met, Cy s(Acm) 또는 Thr이고; Z는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

Q는 하기 일반식들이 바람직하다 :

상기 식들에서, n은 1,2이고 ; X₁및 X₂는 서로 독립적으로 수소, OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, NO₂, NH₂, N(CH₃)₂, NHCOOH₃, NHCOC₆H₅또는 C(CH₃)₃이다.

보다 바람직하게, Q는 벤질, p-플루오로 벤질, p-아미노 벤질, p-하이드록시 벤질, o-메틸, l-메틸나프틸 또는 2-메틸 나프틸이다. Q는 벤질이 가장 바람직하다.

하기 일반식들의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식들에서, X, Y, R₁, R₂, R₆, R₈, R₁₀, R₁₂, R₁₆, R₁₇, R₁₉, R₂₂, R₂₄및 R₂₇은 일반식(V)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

가장 바람직한 환상 펩티드는 Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵ _,Leu²⁶, Lys^27,28, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP 사이클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 52)-NH₂]이다.

본 발명의 펩티드는 심혈관 부작용 없이 기관지기관 평활근의 지속된 이완을 생성시키며, 따라서 천식과 같은 기관지 수축성 질환의 치료에 유용하다.

본 발명은 혈관혈성 장 펩티드(VIP)의 신규한 유사체에 관한 것이며, 이는 현저한 부작용없이 지속적인 기관지확장 활성을 증가시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 저급 알킬이라는 용어는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 측쇄 포화된 지방족 탄화수소를 포함한다. 바람직한 저급 알킬 그룹을 메틸이다.

본원에 사용된 바와 같이, 아릴이라는 용어는 페닐과 같은 단핵성 방향족 탄화수소 그룹을 나타내며, 상기를 불포화시키거나 또는 하나 이상의 위치에서 저급 알킬, 저급 알콕시, 아미노, 니트로, 모노-또는 디-저급 알킬아미노, 저급 알킬 아미노 또는 페닐 아미도로 치환시킬 수 있다. 아릴은 또한 다핵성 아릴 그룹, 예를 들어 나프틸을 나타내며, 상기를 하나 이상의 상기 언급한 잔기로 치환시킬 수도 있다. 바람직한 아릴그룹은 비치환되거나 또는 불소로 일치환된 페닐, 또는 비치환된 나프틸이다.

본원에 사용된 바와 같이, X는 아미노-말단 아미노산의 아미노 질소상의 치환체이고, Y는 카복실 말단 아미노산의 카보닐 그룹상의 치환체이다. X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹일 수도 있다. Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복실 보호 그룹일 수도 있다.

가수분해가능한 아미노 보호 그룹 및 가수분해가능한 카복실 보호 그룹이라는 용어에 관해서, 가수분해에 의해 제거시킬 수 있는 임의의 통상적인 보호 그룹을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 이러한 그룹들의 예는 이후에 나타나 있다. 바람직한 아미노 보호 그룹은(여기에서, X₃는 저급 알킬 또는 할로 적브 알킬이다)이다. 이 보호 그룹들중에서, X₃이 C_1-3알킬 또는 할로 C_1-3알킬인 것이 특히 바람직하다.

바람직한 카복시 보호 그룹은 저급 알킬 에스테르, NH₂및 저급 알킬 아미드이고, C_1-3알킬 에스테르, NH₂및 C_1-3알킬 아미드가 특히 바람직하다.

본 발명은 하기 일반식(Ⅰ)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다 :

상기 식에서, R₈은 Asp, Glu 또는 Lys이고; R₁₂는 Arg, Lys, Orn 또는 Asp이고 ; R₁₇은 Met 또는 Nle이고; R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고 ;X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

하기 일반식의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식에서, X, Y, R₈및 R₁₂는 일반식(Ⅰ)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 하기 일반식(Ⅱ)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다 :

상기 식에서, R₈은 Asp 또는 Asn이고; R₁₇는 Met 또는 Nle이고 ; R₂₆은Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고 ; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

하기 일반식의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식에서, X 및 Y는 일반식(Ⅱ)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 하기 일반식(III)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다 :

상기 식에서, R₁₇은 Met 또는 Nle이고; R₂₆는 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고 ; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

하기 일반식의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식에서, X 및 Y는 일반식(Ⅲ)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 하기 일반식(Ⅳ)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다 :

상기 식에서, R₁₂은 Arg 또는 Lys이고; R₁₇는 Met 또는 Nle이고; R₂₆는 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고 ; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

하기 일반식의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식에서, X 및 Y는 일반식(Ⅳ)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 하기 일반식(Ⅴ)의 신규한 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다 :

상기 식에서, R₁은 His, N-CH₃-Ala이고; R₂는 Ser 또는 Ala이고; R₆은

(상기 식에서, Q는 사이클로헥실 저급 알킬 또는 아릴 저급 알킬이다)이고; R₈은 Asp, Glu 또는 Ala이고; R₁₀은 Tyr 또는 R₆이고; R₁₂은 Arg 또는 Lys이고; R₁₆은 Gln 또는 Ala이고; R₁₇은 Met, Nle 또는 Ala이고; R₁₉은 Val 또는 Ala이고; R₂₂은 Tyr 또는 R₆이고; R₂₄은 Asn 또는 Ala이고; R₂₆은 Ile, Val 또는 Leu이고; R₂₇은 Leu 또는 Lys이고; R₂₈은 Asn, Thr 또는 Lys이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹 또는 R₂₉-R₃₀-R₃₁-Z이고; R₂₉는 Gly 또는 Ala이고; R₃₀은 Gly 또는 Ala이고; R₃₁은 Ala, Met, Cys(Acm) 또는 Thr이고; Z는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.

Q는 하기 일반식들이 바람직하다 :

상기 식들에서, n은 1,2이고 ; X₁및 X₂는 서로 독립적으로 수소, OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, NO₂, NH₂, N(CH₃)₂, NHCOCH₃, NHCOC₆H₅또는 C(CH₃)₃이다.

보다 바람직하게, Q는 벤질, p-플루오르 벤질, p-아미노 벤질, p-하이드록시 벤질, o-메틸, l-메틸나프틸 또는 2-메틸 나프틸이다. Q는 벤질이 가장 바람직하다.

하기 일반식들의 펩티드가 바람직하다 :

상기 식들에서, X, Y, R₁, R₂, R₆, R₈, R₁₀, R₁₂, R₁₆, R₁₇, R₁₉, R₂₂, R₂₄및 R₂₇은 일반식(V)에 대해서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한 상기 펩티드들의 제조방법, 상기 펩티드들을 함유하는 약학 조성물 뿐만 아니라 상기 펩티드 및 기관지기관 협착성 질환의 치료를 위한 비-독성, 불활성의 약학적으로 허용가능한 담체 물질의 사용방법에 관한 것이다. 상기 환상 폴리펩티드의 상기 제조 방법은 하기 (a) 내지 (c)를 특징으로 한다 : (a) 상응하는 아미노산 서열의 보호되고 수지결합된 펩티드를 선택적으로 탈보호시켜 유리 측쇄 아미노 그룹과 유리 측쇄 카복실 그룹을 생성시키고; (b) 상기 유리 측쇄 아미노 그룹과 유리 측쇄 카복실 그룹을 적합한 아미드 형성 시약과 공유결합시키고; (c) 경우에 따라, 양이온 제거제와 같은 추가의 적합한 첨가제의 존재하에서 적합한 탈보호 및 절단 시약으로 처리하여 상기 수지로부터 환화된 펩티드를 탈보호 및 절단시키고, 경우에 따라, 상기 환상 펩티드를 약학적으로 허용가능한 염으로 전환시킨다.

본 발명은 또한 기관지기관 협착성 질환의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 상기 환상 펩티드의 용도에 관한 것이다.

상기 펩티드들을 정의하기 위해 사용된 명명법은 전형적으로 당해분야에서 사용되는 것이며, 여기에서, N-말단에서의 아미노 그룹은 왼쪽에 나타내고 C-말단에서의 카복실 그룹은 오른쪽에 나타낸다. 천연 아미노산이란 단백질에서 발견되는 천연적으로 발생하는 아미노산들중의 하나, 즉, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His를 의미한다. 아미노산이 이성체 형태인 경우에, 이는 달리 표현하지 않는한 L 형태의 아미노산을 나타낸다.

상기 기술한 것 이외의 아미노산, 보호 그룹, 용매, 시약 등을 나타내는데 하기의 약어 및 기호들을 사용한다.

기호 의미

Ac 아세틸

Orn 오르니틴

Nle 노르류신

Fmoc 9-플루오레닐메틸옥시카보닐

Fm 9-플루오레닐메틸

Boc t-부틸옥시카보닐

Bom 벤질옥시메틸

CH₂Cl₂메틸렌 클로라이드

CH₃CN 아세토니트릴

DMF 디메틸포름아미드

DIPEA N, N-디이소프로필에틸아민

TFA 트리플루오로아세트산

HOBT N-하이드록시벤조트리아졸

DCC N, N'-디사이클로헥실카보디이미드

DIC N, N'-디이소프로필카보디이미드

BOP 벤조트리아졸-1-일옥시-트리(디메틸아미노)

포스포늄 헥사플루오로포스페이트

FAB-MS 고속 원자 충격 질량 분광 측정법

고유 VIP펩티드 서열의 유사체는 VIP앞의 괄호안에 치환된 아미노산을 열거함으로써 나타낸다. N-말단 아미노 그룹의 유도체, 즉 상기 X와 같은 유도체는 괄호 치환의 왼쪽에 나타낸다. VIP 오른쪽의 괄호안에 나타낸 서열 번호는 고유 서열 넘버링에 대한 아미노산 결실 및 부가를 나타낸다. 즉, 예를 들면 Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Gly²⁹]-VIP(1-29)-NH₂는 아세틸 그룹이 N-말단에서 수소 대신 치환되고, 리신이 12번 위치에서 아르기닌 대신 치환되고, 노르류신이 17번 위치에서 메티오닌 대신 치환된 고유 인간 VIP에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, 글리신은 29번 위치로 칭하는 아스파라진 28번의 카복실 부위로 커플링되었다. VIP 또는 괄호에 이은 접미사-OH 및 -NH₂는 각각 폴리펩티드의 유리산과 아미드형태를 지칭한다. 어떠한 접미사도 사용하지 않은 경우, 상기 표현은 상기 두가지 형태를 모두 포함한다.

상기 기술한 바와 같이, 본원에서 정의된 환상 펩티드는 펩티드에서한 아미노산의 측쇄 카복시 말단이 아미드 결합의 형성을 통해 펩티드쇄에서 또다른 아미노산의 측쇄 아미노 말단에 공유적으로 결합된 펩티드이다.

다수의 명명법 및 기호를 사용하여 환상 펩티드를 나타낸다.

그 예는 다음과 같다:

상기 3개의 구조(a-c), 및 서열식별번호(SEQ ID NO : )를 사용한 첨부된 표시 및 하기 서열 목록은 각각 아세틸 그룹이 N-말단에서 수소 대신 치환되고, 리신이 12번 위치에서 아르기닌 대신 치환되고, 노르류신이 17번 위치에서 메티오닌 대신 치환되고, 발린이 26번 위치에서 이소류신 대신 치환되고, 쓰레오닌이 28번 위치에서 아스파라진 대신 치환된 고유 인간 VIP에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 동일한 폴리텝티드를 나타내고 정의한다. 또한 아미드결합은 8번 위치에서 아스파르트산의 측쇄 카복실과 12번 위치에서 리신의 측쇄 아민간에 형성되었으며, 따라서, 환상펩티드 유사체가 형성되었다. 펩티드 구조에 대한 상기 표현들은 동등하고 치환가능한 것으로 간주된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본원에 나타낸 구조들 중 하나에서 n번 위치의 아미노산에 대한 Rn 및 하기 서열 목록에서 상응하는 서열에서 n번 위치의 아미노산에 대한 Xaa라는 용어는 Xaa가 2개 이상의 아미노산들로부터 선별을 나타내는 경우에 동등하고 치환가능하다.

본 발명의 환상 펩티드에서, 달리 언급하지 않는한 하기 배위를 적용한다.

본 발명의 대표적인 화합물들은 하기 아미노산 서열을 갖는 펩티드들을 포함한다 :

본 발명의 화합물은 공지된 통상의 아미노산들간의 펩티드 결합 형성 방법에 의해 쉽게 합성될 수 있다.

상기 통상의 방법은 예를 들면 카복실 그룹 또는 보호된 다른 반응성 그룹을 갖는 아미노산 또는 그의 잔기의 유리 알파 아미노 그룹과 아미노 그룹 또는 보호된 반응성 그룹을 갖는 또다른 아미노산 또는 그의 잔기의 1차 유리 카복실 그룹을 축합시킬 수 있는 임의의 엑상 공정을 포함한다.

본 발명의 화합물의 합성방법은 목적하는 서열의 아미노산 각각을 하나하나씩 연속적으로 다른 아미노산 또는 그의 잔기에 첨가하는 방법 또는 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 단편을 우선 통상의 방법으로 합성한 후 축합시켜 목적하는 펩티드를 수득하는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 신규한 화합물은 합성하기 위한 통상의 방법으로는 예를 들면 임의의 고상 펩티드 합성법이 포함된다. 상기 방법의 경우, 목적하는 아미노산 잔기를 고상 합성법의 기본원리[Merrifield, R. B., J. Amer. Chem, Soc. 85, 2149-2154(1963) ; Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol2, Gross, E. and Meienhofer, J. Eds. Academic Press 1-284(1980) 참조]에 따라 성장하는 쇄에 하나하나씩 연속적으로 도입시킴으로써 신규 화합물을 합성할 수 있다.

펩티드의 화학적 합성에 있어서 각종 아미노산 잔기의 반응성 측쇄 그룹을 적절한 보호 그룹으로 보호시켜 보호 그룹이 결국 제거될 때까지 그 부위에서 일어나는 화학반응을 방지하는 것은 통상적이다. 일반적으로, 카복실그룹에서 반응이 일어나는 동안 아미노산 또는 단편의 알파 아미노 그룹을 보호시킨 다음, 알파 아미노 보호그룹을 선택적으로 제거하여 그 부위에서 후속반응이 일어나도록 하는 것도 통상적이다. 고상 합성법과 관련하여 특정의 보호그룹을 기술하였지만, 각각의 아미노산은 액상 합성시 각각의 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 보호 그룹으로 보호될 수 있다.

알파 아미노 그룹은 방향족 우레탄계 보호그룹, 예를 들면 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 벤질옥시카보닐, 즉, p-클로로벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-비페닐-이소프로필옥시카보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 및 p-메톡시벤질옥시카보닐(Moz); 지방산 우레탄계 보호 그룹, 예를 들면 t-부틸옥시카보닐(Boc), 디이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐 및 알릴옥시카보닐중에서 선택된 적절한 보호그룹으로 보호될 수 있다. 알파 아미노산을 보호하는 경우에는 Boc가 가장 바람직하다.

카복실 그룹은 방향족 에스테르, 예를 들면 벤질(OBzl) 또는 저급 알킬, 할로, 니트로, 티오 또는 치환된 티오, 즉 저급 알킬(C₁-C₇) 티오로 치환된 벤질; 지방족 에스테르; 예를 들면 저급 알킬, t-부틸(Ot-Bu), 시클로펜틸, 시클로헥실(OChx), 시클로헵틸 및 9-플루오레닐메틸(OFm)중에서 선택된 적절한 보호그룹으로 보호될 수 있다. 글루탐산(Glu)의 경우에는 OBzl 및 OFm이 가장 바람직하고, 아스파르트산의 경우에는 OChx, OBzl 및 OFm이 가장 바람직하다.

히드록실 그룹은 에테르, 예를 들면 벤질(Bzl) 또는 저급 알킬, 니트로, 메톡시 또는 할로로 치환된 벤질(예 : 2, 6-디클로로 벤질); t-부틸(t-Bu), 테트라히드로피라닐 및 트리페닐메틸(트리틸) 중에서 선택된 적절한 보호 그룹으로 보호될 수 있다. 세린(Ser)의 경우 Bzl이 가장 바람직하고, 티로신(Tyr)의 경우 Bzl 및 DCB가 가장 바람직하다.

측쇄 아미노 그룹은 방향족 우레탄계 보호 그룹, 예를 들면 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 벤질옥시카보닐, 즉 p-클로로벤질옥시카보닐, 2-클로로벤질옥시카보닐(2-Cl-Z), p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-비페닐이소프로필옥시카보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 및 p-메톡시벤질옥시카보닐(Moz); 및 지방족 우레탄계 보호 그룹, 예를 들면 t-부틸옥시카보닐(Boc), 디이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐 및 알릴옥시카보닐중에서 선택된 적절한 보호 그룹으로 보호될 수 있다. 오르니틴(Orn)의 경우에는 Z가 가장 바람직하고, 리신(Lys)의 경우에는 2-Cl-Z 및 Fmoc가 가장 바람직하다.

구아니디노 그룹은 니트로, p-톨루엔설포닐(Tos), Z, 아다만틸옥시카보닐 및 Boc중에서 선택된 적절한 보호 그룹으로 보호될 수 있다. 아르기닌(Arg)의 경우 Tos가 가장 바람직하다.

측쇄 아미드 그룹은 크산틸(Xan)로 보호될 수 있다. 아스파라진(Asn) 및 글루타민(Gln)의 경우에는 보호시키지 않는 것이 바람직하다.

이미다졸 그룹은 p-톨루엔설포닐(Tos), 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), 트리페닐메틸(트리틸), 2, 4-디니트로페닐(Dnp), Boc 및 벤질옥시메틸(Bom)중에서 선택된 적절한 보호기로 보호될 수 있다. 히스티딘(His)의 경우 Tos 및 Bom이 가장 바람직하다.

구체적으로 달리 언급하지 않는한, 고형 혼합물중의 고형분, 액체중의 액체 성분 및 액체중의 고형분에 대한 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피를 기준으로 한 것이며, 하기 언급한 시약 및 기기의 공급처가 필수적인 것은 아니다. 당 분야의 숙련가는 다른 공급처의 유사한 시약 또는 기기를 선택할 수 있다.

모든 용매, 즉 이소프로판올(iPrOH), 메틸렌 클로라이드(CH₂C_l2) 및 디메틸포름아미드(DMF)는 피셔(Fisher) 또는 부르딕 앤드 잭슨(Burdick Jackson)에서 구입하였으며 추가로 증류시키지 않고 사용하였다. 디이소프로필에틸아민(DIPEA)은 팔쯔 앤드 바우어(Pfaltz and Bauer)에서 구입하였고 사용하기 전에 CaO 및 닌히드린으로부터 증류하였다. 디시클로헥실카보디이미드(DCC) 및 디이소프로필카보디이미드(DIC)는 플루카(Fluka)에서 구입하였으며 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 히드록시벤조트리아졸(HOBT) 및 1, 2-에탄디올(EDT)은 시그마 케미칼 캄파니에서 구입하였으며 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 보호된 아미노산은 일반적으로 L배위이고 케미칼 다이나믹스 코포레이션(Chemical Dynamics Corp.) 또는 바켐(Bachem)에서 구입하였다. 이들 시약의 순도는 사용하기 전에 박층 크로마토그라피, NMR 및 융점을 측정하여 확인하였다. Boc-O-Me-Tyr, Boc-2-Nal 및 Boc-p-F-Phe는 보고된 바와 같이 준비하였다(Bolin, D. R., U.S.Pat. Appl. No. 374, 503 참조). Boc-Asp(OFm) 및 Boc-Glu(OFm)는 보고된 바와 같이 준비하였다[Bolin, D. R., et al., Org. Prep. Proc. Int., 21, 67-74(1989)참조]. 벤즈히드릴아민수지(BHA)는 바이오메가(Biomega), 바켐(Bachem), 옴니(Omni) 또는 어드벤스드켐테크(Advanced Chemtech)에서 구입한 스티렌-1% 디비닐벤젠의 공중합체(100 내지 200 또는 200 내지 400메쉬)이다. 이들 수지중의 전체 질소 함량은 일반적으로 0.3 내지 1.2meq/g이다.

박층 크로마토그라피(TLC)는 적절한 용매계를 사용하여 유리 지지된 예비피복 실리카겔 60 F254 플레이트(Merck)상에서 실시하였다. 화합물의 검출은 UV 형광 소광(254nm 흡광), 요오드 염색, 또는 닌히드린 분무(1차 및 2차 아민의 경우)에 의해 수행하였다.

아미노산 조성 분석을 위해, 펩티드를 밀봉된 가수 분해용 탈기 튜브내, 115℃에서 페놀 1 내지 4㎎을 함유하는 6N HCI중에서 가수분해하였다. 아미노산 분석은 워터스 캐트엑스(Waters Cat Ex) 수지 또는 피어스(Pierce) AA511 컬럼 및 닌히드린 검출을 이용하여 벡크만(Beckman) 121M 아미노산 분석기 또는 워터스 HPLC-기본 아미노산 분석 장치(Waters HPLC- based amino acid analysis system)상에서 수행하였다.

고성능 액체 크로마토그라피는 콘스타메트릭 Ⅰ 및 Ⅲ(Constametric Ⅰ and Ⅲ) 펌프, 그래디언트 매스터 용매 프로그래머 및 믹서(Gradient Master solvent programmer and mixer), 및 분광 모니터 Ⅲ 가변 파장 UV검출기(Spectromonitor Ⅲ variable wavelength UV detector)로 구성된 LDC 장치사에서 수행하였다. 분석용 HPLC는 원터스 μ본다팩(Waters μBondpak) C₁₈컬럼(0.4×30㎝)을 이용하여 역상 방식으로 수행하였다. 정제용 HPLC 분리는 워터스 가드팩 C₁₈예비컬럼(Waters Guardpack C₁₈precolumn)이 장착된 와트만 마그늄 20 파티실(Whatman Maanum 20 partisil) 10 ODS-3컬럼(2×25㎝ 또는 2×50㎝)상에서 실시하였다. 겔 크로마토그라피는 2×85㎝ 컬럼, LKB 베리오퍼팩스 페리스탈틱 펌프(varioperpex peristaltic pump) 및 IBM 가변 파장 UV 검출기를 이용하여 실시하였다.

메리필드가 기술한 일반적인 방법[J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149(1963)참조] 에 따라 고상 합성법을 사용하여 펩티드를 제조하는 것이 바람직하지만, 이미 언급한 바와 같이 당 분야에 공지된 다른 등가적 화학 합성법을 사용할 수도 있다. 고상 합성은 보호된 알파-아미노산을 적절한 수지에 커플링시킴으로써 펩티드의 C-말단에서부터 시작한다. 상기 출발물질은 알파-아미노 보호된 아미노산을 에스테르 결합에 의해 클로로메틸화 수지 또는 히드록시메틸 수지에 결합시키거나 또는 아미드 결합에 의해 벤즈히드릴아민(BHA) 또는 파라-메틸벤즈히드릴아민(MBHA) 수지에 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 히드록시메틸 수지의 제조방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 클로로메틸화 수지는 시판되고 있으며 그 제조방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. BHA 및 MBHA 수지 지지체는 시판되고 있으며 합성되는 목적 펩티드가 C-말단에 비치환된 아미드를 갖는 경우에 보통 사용된다.

일반적으로, BHA 수지상에 커플링되는 제1아미노산은 수지 질소 당량에 대해 활성화 아미노산 2 내지 10당량을 사용하여 Boc-아미노산 대칭성 무수물로서 첨가하였다. 커플링 후, 수지를 세척하고 진공하에 건조시켰다. 수지상에 아미노산의 부하는 Boc-아미노산 수지 일정량을 아미노산 분석하여 측정할 수 있다. 부하량은 일반적으로 0.2 내지 0.4mmol/수지 g 범위이다. 모든 미반응 아미노 그룹은 수지를 메틸렌 클로라이드 중에서 아세트산 무수물 및 디오소프로필에틸아민과 반응시킴으로서 캡핑시킬 수 있다.

Boc-아미노산을 첨가한 후, 수지를 여러 반복 사이클로 옮겨 연속적으로 산성조건하에서 제거하였으며, 이때 메틸렌 클로라이드중의 트리플루오로아세트산(TFA), 디옥산중의 HCL 또는 포름산/아세트산 혼합물을 사용할 수 있다. 메틸렌 클로라이드중의 50% TFA(v/v)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 t-부틸 카르보늄이온의 소거제로서 EDT 또는 디메틸설파이드 1 내지 5v%를 함유할 수 있다. 당 분야에 공지된 바와 같은 다른 표준 분해시약을 사용할 수 있다.

알파 아미노 보호 그룹의 제거후, 후속 보호 아미노산을 목적하는 순서대로 단계적으로 커플링시켜 중간체, 즉 보호된 펩티드-수지를 수득한다. 펩티드의 고상 합성시 아미노산을 커플링시키기 위해 사용되는 활성화제는 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 상기 합성에 적절한 시약으로는 벤조트리아졸-1-일옥시-트리-(디메틸아미노)포스포늄 헥사 플루오로포스페이트(Bop), 디시클로헥실카보디이미드(DCC) 및 디이소프로필카보디이미드(DIC)가 있으며, DCC 및 DIC가 바람직하다. 문헌[Barany and Merrifield, The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284]에 기술된 다른 활성화제를 사용할 수도 있다. 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT), N-히드록시숙신이미드(HOSu) 및 3, 4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트라아진(HOOBT)과 같은 다양한 시약을 커플링 혼합물에 첨가하여 합성 사이클을 최적화 시킬 수 있는데, 이때 바람직한 것은 HOBT이다.

대표적인 합성 사이클의 프로토콜은 다음과 같다.

프로토콜 1

모든 세척 및 커플링용 용매를 10 내지 40㎖/수지 g의 양으로 계량하였다. Boc-아미노산의 예비형성된 대칭성 무수물 또는 o-아실 이소우레아 유도체를 사용하여 커플링을 수행하였다. 일반적으로 아미노산의 당량당 2 내지 10당량의 활성화된 Boc-아미노산을 가했으며 용매로서 메틸렌 클로라이드를 사용하였다. 20 내지 25%의 DMF/CH₂Cl₂중에서 Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) 및 Boc-Asn, Boc-Gln 및 Boc-His(Bom)을 그의 HOBT활성 에스테르로서 커플링시켰다.

일반적으로 본 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 하기 방식으로 펩티드를 환화하였다. 측쇄가 결합될 펩티드내의 아미노산 부위에 다른 보호 그룹들을 사용하였다. 아미노 부위 아미노산을 위해서는 Lys 및 Orn, N^ε- 및 N^δ-Fmoc 유도체들을 펩티드 쇄내로 혼입시켰다. 카복실 부위 아미노산을 위해서는, Asp 및 Glu, O^β- 및 O^γ-Fm 유도체들을 도입시켰다. 펩티드가 아직 수지에 결합되어 있는 동안 펩티드를 DMF 중의 20 내지 40% 피페리딘으로 처리하여 선택적으로 Fmoc 및 Fm보호 그룹들을 제거하였다. 이어서, 유리 측쇄 아미노 및 카복실 그룹들을 디페닐포스포릴 아지드(DPPA), DCC, DIC 또는 BOP와 같은 적합한 아미드 형성제로 처리함으로써 분자내에서 공유결합시켰다. 본 발명에는 DCC 및 BOP가 바람직하다.

전형적인 환화 공정의 프로토콜을 다음과 같다.

프로토콜 2

합성 전반에 걸친 커플링 반응을 카이저(Kaiser) 닌히드린 시험에 의해 관측하여 완결 정도를 결정하였다(참조예[Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595-598(1980)]. Boc-Arg(Tos), Boc-Asn 및 Boc-Gln의 경우 느린 반응 역학이 관측되었다. 불완전한 커플링 반응은 새로 제조한 활성화 아미노산과 재커플링시키거나, 상술한 바와 같이 펩티드 수지를 아세트산 무수물로 처리함으로서 캡핑시켰다. 완전히 결합된 펩티드-수지를 몇시간 동안 진공에서 건조시켰다.

각각의 화합물에 대해, 차단 그룹들을 제거하고 하기 공정에 의해 수지로부터 펩티드를 제거하였다. 일반적으로, 펩티드-수지를, 테플론 HF 장치 [페닌슐라(Peninsula)]에서 0℃에서 45 내지 60분동안 수지의 g당 25 내지 100㎕의 에탄디티올, 1㎖의 아니솔 및 9㎖의 액체 불화 수소로 처리하였다. 달리, 펩티드-수지를 3㎖의 디메틸 설파이드 및 1㎖의 불화수소로 0℃에서 2시간동안 처리하고 증발시킨 다음 90% HF로 처리하는 변형된 2단계 제거공정(참고예 : [Tam et al., Tetrahedron Letters, 23, 2939-2940(1982)]을 사용할 수도 있다. 이어서, 얼음욕에서 진공하에 휘발성 물질들을 제거하였다. 잔류물을 디에틸에티르 및 에틸 아세테이트로 각각 20㎖씩 2 또는 3회 세척하였다. 20㎖의 10% AcOH로 3 또는 4회 세척함으로써 수지로부터 펩티드를 추출한 후 여과하였다. 합한 수성 여액을 동결 건조시켜 조 생성물을 수득하였다.

조 펩티드를 우선 세파덱스(Sephadex) G-25 미세 매질상에서 겔 크로마토그래피시킴으로써 우선 정제하여 올리고머성 물질로부터 단량체성 물질을 분리하였다. 펩티드를 소량의 10% AcOH에 용해시킨후 겔 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 10% AcOH로 0.5 내지 1.5㎖/분의 유속으로 용출시켰다. 용출물을 254nm에서 검사하고 원하는 밴드를 가진 분획을 수거하고 동결건조시켜 반-정제된 생성물을 수득하였다.

상기 반-정제된 펩티드를 일반적으로 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 펩티드를, 소량의 1% AcOH 또는 0.1% TFA를 사용하여 컬럼에 적용시켰다. 용출구배는 일반적으로 8.0㎖/분의 유속으로 10% B완충용액으로 시작하여 10분간은 10 내지 25% B, 3시간동안 25 내지 35% B로 하였다(완충용액 A : 0.1% TFA/H₂O, 완충용액 B : 0.1% TFA/CH₃CN). UV 검출은 220nm에서 수행하였다. 1.5 내지 2.5분 간격으로 분획들을 수거하여 분석용 HPLC로 검사하였다. 고속도로 판정된 분획들을 수거하여 동결건조시켰다.

최종 생성물의 순도를 상기에 언급한 바와 같이 역상 컬럼상에서 분석용 HPLC로 검사하였다. 일반적으로, 2.0㎖/분의 유속으로 15분 동안에 20 내지 40% B의 용출 구배를 사용하였다(완충용액 A : 0.022% TFA/H₂O, 완충용액 B : 0.022% TFA/CH₃CN). 210nm에서 UV 검출을 수행하였다. 모든 생성물의 순도는 약 97 내지 99%인 것으로 판정되었다. 개개의 펩티드의 아미노산분석을 수행하였으며, 수득된 값들은 허용치내에 들었다.

본 발명의 신규한 화합물들은 가치있는 약리학적 특성들을 갖는다. 이들은 기관지 확장제 작용을 가지며 강력한 기관지 확장제이다. 이들 화합물은 또한 심장 부작용이 없다. 이들 신규한 펩티드에 의해 생성되는 기관지 확장 작용은 2시간 이상 유지될 수 있다. 따라서, 이들 화합물은 매우 활성이 큰 기관지 확장제이며, 기관지 협착성 질환, 예를 들면, 천식의 치료에 유용한 약제이다.

상기 일반식(Ⅰ) 내지 (Ⅴ)의 신규한 화합물들은 다양한 전형적인 약학적 담체, 바람직하게는 무독성이고 불활성이며 치료학적으로 허용가능한 담체 물질과 배합되어 천식과 같은 기관지 협착성 질환의 치료에 사용하기에 적합한 조성물을 제공할 수 있다. 이들 화합물의 생약 투여 형태 용량은 사용된 특정 화합물 및 특정 제형과 같은 다양한 인자에 좌우된다. 유효 용량은 본 분야의 숙련가들이라면 본 명세서에 기술한 유효 농도(EC₅₀)로부터 결정할 수 있을 것이다. 인간에 대한 전형적인 투여용량은 0.1 내지 100㎍/㎏이다. 0.1㎍과 같이 낮은 ED₅₀을 가진 화합물의 경우 인간에 대한 전형적인 투여 용량은 약 0.02 내지 20㎍/㎏이다.

상기 일반식 (Ⅰ) 내지 (Ⅴ)의 신규한 화합물들은 다양한 무기산 및 유기산, 예를 들면, 황상, 인산, 염산, 브롬산, 요오드산, 질산, 설팜산, 시트르산, 락트산, 피루브산, 옥실산, 말레산, 석신산, 타타르산, 신남산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 살리실산, 글루콘산, 아스코르브산 및 기타 관련된 산과 약제학적으로 허용가능한 산 부가염을 형성한다.

본 발명이 화합물은 정맥내투여, 피하투여, 근육내투여, 경구투여 또는 비강내투여와 같은 투여법에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 투여하기에 바람직한 방법은 에어로졸로 경구 또는 비강내 투여하는 것이다.

본 발명은 이하 실시예에 의해 더 설명한다.

[실시예 1]

Boc-Thr(Bzl)-BHA 수지의 제조

벤즈히드릴아민 코폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 가교결합수지(9.5g, 3.6 밀리당량, 200 내지 400ASTM 메쉬, 베가 바이오켐(Vega Biochem)사 제품)을 100㎖의 메틸렌 클로라이드중에서 팽윤시킨후, 여과시켜, 프로토콜 1의 단계 7 내지 8을 사용하여 세척하였다. Boc-Thr(Bzl)(3.35g, 10.8 밀리몰)과 디시클로헥실 카보디이미드(1.12g, 5.42밀리몰)을 50㎖의 CH₂Cl₂에서 1시간동안 반응시키고 여과시킨 다음 50㎖의 CH₂Cl₂에 넣어 상기 팽윤된 수지에 가하였다. 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 진탕시켰다. DIPEA(630㎖, 3.6 밀리몰)을 가한 후 1시간 더 진탕시키고 여과한 후 프로토콜 1의 단계 10 내지 14를 수행하였다. 카이저 니니히드린 시험은 음성이었다. 수지를 50㎖의 메틸렌클로라이드중의 1㎖의 아세틴 무수물 및 1㎖의 DIPEA로 30분 동안 처리함으로써 미반응된 아민 그룹들을 캡핑시킨 후 여과시키고 프로토콜 1의 단계 13 내지 14에 의해 세척하였다. 수지를 진공하에서 밤새 건조시켜 Boc-Thr(Bzl)-BHA수지 9.8g을 수득하였다. 이 수지 일정량을 아미노산 분석하였더니 0.17 밀리몰 Thr/g의 값을 나타내었다.

[실시예 2]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Asp⁸→Lys¹²)[Ac-(SEQ ID NO : 20)-NH₂]의 제조

상기 프로토콜 1을 사용하여 실시예 1에서 수득한 Boc-Thr(Bzl)-BHA 수지(9.8g, 1.7 밀리몰)를 고상합성하였다. 모든 커플링은 Boc-아미노산과 디사이클로헥실카보디이미드부터 제조된 예비성형된 대칭성 무수물을 사용하여 수행하였다. 각각의 HOBT활성 에스테르로서 Boc-아스파라긴, Boc-글루타민 및 Boc-히스티딘(벤질옥시메틸)을 커플링하였다. 커플링 단계의 완결에 필요한 반응시간은 일반적으로 1 내지 18시간이었다. Boc-Leu(1.5g, 6.0 밀리몰), Boc-Val(1.3g, 6.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(1.8g, 6.0 밀리몰), Boc-Asn(773㎎, 3.3 밀리몰), 및 Boc-Leu(1.5g, 6.0 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 5회 커플링 사이클을 수행하였다. 수지를 진공하에서 건조시켜 Boc-헥사펩티드 수지 12.2g을 수득하였다.

상기 수지 8.2g(1.13밀리몰)을 Boc-Tyr(2,6-DCB)(1.77g, 4.0 밀리몰)을 Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.67g, 4.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.67g, 4.0 밀리몰), Boc-Val(876㎎, 4.0 밀리몰), Boc-Ala(762㎎, 4.0 밀리몰), 및 Boc-Nle(932㎎, 4.0 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 6회 사이클로 커플링시켜 Boc-도데카펩티드수지 10.2g을 수득하였다.

이 수지 1.26g(0.139 밀리몰)을 Boc-Gln(205㎎, 0.93 밀리몰) 및 Boc-Lys(2-Cl-Z)(627㎎, 1.5 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 2회 커플링 사이클에 의해 커플링시켰다. 이 수지의 반(0.069 몰)을, Boc-Arg(Tos)(324㎎, 0.75 밀리몰), Boc-Leu(188㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Lys(Fmoc)(354㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(234㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(333㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Asn(97㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(311㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(234㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Phe(201㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Val(164㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Ala(143㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(238㎎, 0.76 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(223㎎, 0.76 밀리몰), 및 Boc-His(Bom)(156㎎, 0.41 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 14회 커플링 사이클을 통해 커플링시켰다. 이 펩티드 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8에 의해 수행한 후 20㎖의 메틸렌 클로라이드중의 1.0㎖ 아세트산 무수물 및 66㎖의 DIPEA(0.38 밀리몰)로 30분동안 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14에 의해 세척하였다.

이어서, 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11로 처리함으로써 선택적으로 탈보호시키고 20㎖의 증류된 DMF 중의 DCC(49㎎, 0.24 밀리몰) 및 HOBT(32㎎, 0.24 밀리몰)로 24시간동안 7회반응시켰다. 카이저 닌히드린분석은 음성이었다. 수지를 프로토콜 2의 단계 13 내지 16에 의해 세척한 후 진공하에서 건조시켜 0.72g을 수득하였다.

이 수지를 0℃에서 2시간동안 6㎖의 디메틸 설파이드 및 2㎖의 액체 HF로 처리하였다. 반응 혼합물을 농축시키고 잔사를 0℃에서 45분동안 0.7㎖의 아니솔 및 6㎖의 액체 HF로 처리하였다. 반응 혼합물을 농축시키고 잔사를 디에틸에테르 15㎖로 1회, 에틸 아세테이트 15㎖로 3회 세척하였다. 수지를 10% AcOH 20㎖로 3회 추출하였다. 합한 수성 여액을 동결건조시켜 백색 고체 227㎎을 수득하였다.

이 조 물질을 와트만 마그님-20(Whatman Magnum-20) ODS-3 컬럼(2×25㎝)상에서 예비 HPLC에 의해 4시간동안에 10 내지 40% B의 선형 구배로 용출시킴으로써 정제하였다(완충용액 A : 0.1% TFA/H₂O, 완충용액 B : 0.1% TFA/CH₃CN). 수거한 분획의 분석용 HPLG 분석에 의해 주 피크를 잘라 분획을 수집하고 이를 동결건조시켜 반-정제된 생성물 26.7㎎을 수득하였다. 이 물질을 상기 마그넘-20 ODS-3 컬럼(2×50㎝)에 동일한 용출구배로 다시 적용하였다. 주 피이크를 잘라 분획을 동결 건조시켜 백색 무정질 분말 9.5㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하여 균질하였으며 보정 아미노산 분석을 수행하였다. FAB-MS 계산치 3277.8, 실측치 3276.1.

[실시예 3]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Glu⁸→Lys¹²)[Ac-(SEQ ID NO. : 21)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 코폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 가교결합수지(17.7g, 2.6밀리당량, 200내지 400 ASTM메쉬, 베가바이오켐사 제품)을 160㎖의 메틸렌 클로라이드중에서 팽윤시킨후, 여과시켜, 프로토콜 1의 단계 7 내지 8을 사용하여 세척하였다. 이 수지를 160㎖의 메틸렌 클로라이드에 재현탁시키고, 여기에 Boc-Thr(Bzl)(6.25g, 20.2 밀리몰)과 디시클로헥실카보디이미드(2.10g, 10.1밀리몰)을 가하였다. 이 혼합물을 실온에서 8시간동안 여과시킨 다음 프로토콜의 1의 단계 10 내지 14를 수행하였다. 카이저 닌히드린 시험은 음성이었다. 수지를 150㎖의 메틸렌클로라이드중의 5㎖의 아세트산 무수물 및 5㎖의 DIPEA로 60분 동안 처리함으로써 미반응된 아민 그룹들을 캡핑시킨후 여과시키고 프로토콜 1의 단계 13 내지 14에 의해 세척하였다. 수지를 진공하에서 밤새 건조시켜 Boc-Thr(Bzl)-BHA수지 18.0g을 수득하였다. 이 수지 일정량을 아미노산 분석하였더니 0.17 밀리몰 Thr/g의 값을 나타내었다.

상기 프로토콜 1을 사용하여 Boc-Thr(Bzl)-BHA 수지(18.0g, 3.06 밀리몰)를 고상합성하였다. 모든 커플링은 Boc-아미노산과 디시클로헥실카보디이미드로부터 제조된 예비성형된 대칭성 무수물을 사용하여 수행하였다. 각각의 HOBT 활성 에스테르로서 Boc-아스파라긴, Boc-글루타민 및 Boc-히스티딘(벤질옥시메틸)을 커플링하였다. Boc-Leu(6.1g, 24.5 밀리몰), Boc-Val(5.32g, 24.6 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(7.23g, 24.5 밀리몰), Boc-Asn(3.13g, 13.5 밀리몰), 및 Boc-Leu(6.1g, 24.5 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 5회 커플링 사이클을 수행하였다. 수지를 진공하에서 건조시켜 Boc-헥사펩티드 수지 22.9g을 수득하였다.

상기 수지 7.48g(1.0밀리몰)을 Boc-Tyr(2,6-DCB)(1.76g, 4.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g, 4.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g, 4.0 밀리몰), Boc-Val(869㎎, 4.0 밀리몰), Boc-Ala(1.5g, 8.0 밀리몰), Boc-Nle(925㎎, 4.0 밀리몰), Boc-Gln(1.08g, 4.4 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g, 4.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(1.71g, 4.0 밀리몰) 및 Boc-Leu(998㎎, 4.0 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 10회 사이클로 커플링시켜 Boc-헥사데카펩티드수지 9.6g을 수득하였다.

이 수지 7.68g(0.8 밀리몰)을 Boc-Lys(Fmoc)(1.5g, 3.2 밀리몰)로 1회 커플링시켜 Boc-헵타데카펩티드 수지 8.32g을 수득하였다.

이 수지 6.24g(0.6 밀리몰)을 Boc-Thr(Bzl)(742㎎, 2.4 밀리몰) 및 Boc-Thr(2, 6-DCB)(1.06g, 2.4 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 2회 커플링 사이클에 의해 커플링시켜 Boc-노나데카펩티드 수지를 수득하였다.

이 수지 2.09g(0.2 밀리몰)을, Boc-Asn(204㎎, 0.88 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(304㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(248㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Phe(212㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Ala(151㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(258㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(236㎎, 0.8 밀리몰), 및 Boc-His(Bom)(330㎎, 0.8 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 9회 커플링 사이클을 통해 커프링시켰다. 이 펩티드 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8에 의해 수행한 후 20㎖의 메틸렌 클로라이드중의 0.25㎖ 아세트산 무수물 및 70㎖의 DIPEA로 20분동안 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14에 의해 세척하였다.

이어서, 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11로 처리함으로써 선택적으로 탈보호시키고 이 수지의 3/4(01.15밀리몰)를, 20㎖의 증류된 DMF 중의 DCC(77㎖, 0.37 밀리몰) 및 HOBT(51㎖, 0.37 밀리몰)로 72시간동안 반응시키고 20㎖의 톨루엔중에서 24시간동안 반응시켰다. 카이저 닌히드린분석은 음성이었다. 수지를 프로토콜 2의 단계 13 내지 16에 의해 세척한 후 진공하에서 건조시켜 1.72g을 수득하였다.

이 수지 1.14g(0.099 밀리몰)을 단계 2에서 1㎖의 아니솔 및 9㎖의 액체 HF를 사용함을 제외하고는 실시예2에서와 동일하게 처리하여 탈보호시켰다. 반응 혼합물을 농충시키고 잔사를 디에텔에테르 15㎖로 1회, 에틸아세테이트 15㎖로 3회 세척하였다. 수지를 10% AcOH 20㎖로 3회 추출하였다. 합한 수성 여액을 동결건조시켜 백색 고체 535㎖을 수득하였다.

이 조 물질을 세파덱스 G-25 미세 컬럼(2×100㎝)상에서 10% AcOH로 용출시키면서 겔 여과시킴으로써 정제하였다.

수거한 분획을 분석용 HPLC 분석에 의해 주 피크를 잘라 분획을 수집하고 이를 동결 건조시켜 반-정제된 생성된 83.5㎎을 수득하였다. 이 물질을 3시간동안 20 내지 40%의 선형 구배로 실시하는 것을 제외하고는 실시예 2에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하였다. 수집한 분획의 분석용 HPLC 분석에 의해 주피이크를 잘라 분획을 동결 건조시켜 백색 무정질 분말 18.9㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며 보정된 아미노산 분석을 실시하였다. FAB-MS : MH 계산치 3292.0, 실측치 3291.8.

[실시예 4]

Ac-[Asn⁸, Asp⁹, Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Asp⁹→s¹²)[Ac-(SEQ ID NO : 22)-NH₂]의 제조

실시예 3에서 수득한 Boc-노나데카펩티드 1.55g(0.15 밀리몰)을 Boc-Asp(OFm)(247㎎, 0.6 밀리몰), Boc-Asn(153㎎, 0.66 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(248㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Phe(159㎎, 0.6 밀리몰), Boc-Val(130㎎, 0.6 밀리몰), Boc-Ala(113㎎, 0.6 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(189㎎, 0.6 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(177㎎, 0.6 밀리몰) 및 Boc-His(Bom)(248㎎, 0.66 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 9개의 커플링 사이클을 통해 커플링시켰다. 이 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8에 따라 처리한 다음 20㎖이 메틸렌 클로라이드중에서 0.25㎖ 무수 아세트산 및 70㎖의 DIPEA로 30분동안 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14에 따라 세척하였다.

그런 다음, 이 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시키고 20㎖의 증류 DMF 중의 DCC(77㎎, 0.37 밀리몰) 및 HOBT(51㎎, 0.37 밀리몰)로 24 및 72시간 동안 2회반응시키고, 이어서 20㎖의 톨루엔중에서 24 및 48시간동안 2회 반응시켰다. 카이저 닌히드린분석결과 음성이었다. 이 수지를 프로토콜 2의 단계 13 내지 15에서 따라 세척하고 진공하에서 건조시켜 1.54g을 수득하였다.

이렇게하여 얻어진 수지 1.26g(0.122 밀리몰)을 실시예 3에서와 같이 HF로 처리하여 탈보호시켰다. 반응 혼합물을 증발시키고 그 잔사를 15㎖의 Et₂O로 1회, 15㎖의 EtOAc로 3회 세척한 다음, 20㎖의 10% AcOH로 3회 추출하였다. 그 여액을 합하여 동결건조시켜서 백색고체 485㎎을 수득하였다.

이 조물질을 실시예 3에서와 같이 세파덱스 G-25 미세컬럼상에서의 겔 여과에 의해 정제시켜서 반-정제된 생성물 83.5㎎을 얻었다. 이어서, 이 물질을 3시간동안 20 내지 45%의 선형 구배로 전개시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC하여 더 정제하였다. 수집된 분획들을 분석 HPLC로 분석하여 주 피크를 자르고, 이들을 모다 동결건조하에서 백색 무정형 분말을 11.5㎎얻었다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3277.8, 실측치 3277.6.

[실시예 5]

Ac-[Orn¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Asp⁸→Orn¹²)[Ac-(SEQ ID NO : 23)-NH₂]의 제조

실시예 3에서 수득한 Boc-헥사데카펩티드 수지 1.92g(0.2 밀리몰)을 Boc-Orn(Fmoc)(364㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(495㎎, 1.6 밀리몰), Boc-Tyr(2, 6-DCB)(352㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Asn(102㎎, 0.44 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(329㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(495㎎, 1.6 밀리몰), Boc-Phe(212㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Val(174㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Ala(151㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(252㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(236㎎, 0.8 밀리몰), 및 Boc-His(Bom)(330㎎, 0.88 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 12개의 커플링 사이클을 통해 커플링시켰다. 이 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8의 따라 처리한 다음, 20㎖의 메틸렌 클로라이드중에서 0.25㎖ 무수 아세트산 및 70㎖의 DIPEA로 30분동안 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14에 따라 세척하고, 밤새 건조하여 2.38g을 수득하였다.

그런 다음, 이 수지 1.38g(0.11 밀리몰)을 프로토콜 2의 단계 1 내지 11로 처리하여 선택적으로 탈보호시키고 20㎖의 증류 DMF중에서 DCC(55㎎. 0.27 밀리몰) 및 HOBT(37㎎, 0.27 밀리몰)로 24시간동안 반응시키고, 20㎖의 톨루엔중에서 24시간동안 반응시킨후, 20㎖의 증류 DMF중에서 24시간동안 5회 반응시켰다. 카이저 닌히드린분석 결과 미약하게 양성으로 나타났다.이 수지를 프로토콜 2의 단계 13 내지 16에 의해 세척한후 진공하에서 건조하였다.

이렇게하여 얻어진 수지 0.8g(0.05 밀리몰)을 실시예 3에서와 같이 HF로 처리하여 탈보호시켰다. 반응 혼합물을 증발시키고 그 잔사를 15㎖의 Et₂O로 1회, 15㎖의 EtOAc로 3회 세척한 다음, 20㎖의 10% AcOH로 3회 추출하였다. 그 여액을 합하여 동결건조시켜서 고무와 같은 고체 429㎎을 수득하였다.

이 조물질을 실시예 3에서와 같이 세파덱스 G-25 미세컬럼상에서의 겔 여과에 의해 정제시켜서 반-정제된 생성물 107㎎을 얻었다. 이어서, 이 물질을 3시간동안 10 내지 40%의 선형 구배로 전개시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC하여 더 정제하였다. 수집된 분획들을 분석 HPLC로 분석하여 주 피크를 자르고, 이들을 모아 동결건조하여서 백색 무정형 분말을 17.5㎎얻었다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산값 3263.7, 실측값 3264.1.

[실시예 6]

Ac-[ Lys⁸, Asp¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Asp⁸→Asp¹²)[Ac-(SEQ ID NO : 24)-NH₂]의 제조

실시예 3에서 수득한 Boc-헥사데카펩티드 수지 1.0g(0.1 밀리몰)을 Boc-Asp(OFm)(165㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(124㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Tyr(2, 6-DCB)(176㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Asn(102㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Lys(Fmoc)(187㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(124㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Phe(106㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Val(87㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Ala(76㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(126㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(118㎎, 0.4 밀리몰) 및 Boc-His(Bom)(150㎎, 0.4 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 12개의 커플링 사이클을 통해 커플링시켰다. 이 수지를 프로토콜 1의 단계 1∼ 8의 따라 처리한 다음, 20㎖의 메틸렌 클로라이드중에서 0.5㎖의 무수 아세트산 및 35㎖의 DIPET로 30분동안 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14에 따라 세척하고, 밤새 건조하여 1.2g을 수득하였다.

그런 다음, 이 수지 0.8g(0.066 밀리몰)을 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시키고 20㎖의 증류 DMF중에서 BOP(58㎎. 0.13 밀리몰)로 24시간동안 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석 결과 음성이었다. 이 수지를 프로토콜 2의 단계 13 내지 16에 따라 세척한후 진공하에서 건조하였다.

이렇게하여 얻어진 수지를 실시예 3에서와 같이 HF로 처리하여 탈보호시켰다. 반응 혼합물을 증발시키고 그 잔사를 15㎖의 Et₂O로 1회, 15㎖의 EtOAc로 3회 세척한 다음, 20㎖의 10% AcOH로 3회 추출하였다. 그 여액을 합하여 동결건조시켜서 고무상의 고체를 수득하였다.

이 조물질을 실시예 3에서와 같이 세파덱스 G-25 미세컬럼상에서의 겔 여과에 의해 정제하여 반-정제된 생성물 43.8㎎을 얻었다. 이어서, 이 물질을 3시간동안 10 내지 40%의 선형 구배로 전개시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC하여 더 정제하였다. 수집된 분획들은 분석 HPLC로 분석하여 주 피크를 자르고, 이들을 모아 동결건조하여서 백색 무정형 분말을 7.5㎎얻었다. 이 화합물은 HPLC에 의하여 균질하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산값 3277.8, 실측값 3276.4.

[실시예 7]

Ac-[Glu⁸, Orn¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Glu⁸→Orn¹²)[Ac-(SEQID NO : 25)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 코폴리스티렌-1% 디비닐벤젤 가교결합수지(25.0g 17.5밀리당량, 200내지 400 ASTM메쉬, 바켐사 제품)을 160㎖의 메틸렌 클로라이드중에서 팽윤시킨후 여과시켜, 표 1에 개시된 프로토콜의 단계 7 내지 8을 사용하여 세척하였다. 이 수지를 160㎖의 메틸렌 클로라이드에 다시 현탁시킨후, 여기에 Boc-Thr(Bzl)(16.2g, 52.5 밀리몰)과 디시클로헥실디카보디이미드(5.4g, 26.2밀리몰)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 6시간동안 진탕시킨후 여과하고, 프로토콜 1의 단계 10 내지 14에 따라 실시하였다. 카이저 닌히드린 시험은 음성이었다. 이 수지를 150㎖의 메틸렌클로라이드중에서 5㎖의 무수 아세트산 및 5㎖의 DIPEA로 60분동안 처리하여 미반응된 아미 그룹들을 캡핑시킨후 여과시키고 프로토콜의 단계 13 내지 14에 따라 세척하였다. 수지를 진공하에서 밤새 건조시켜서 Boc-Thr(Bzl)-BHA수지 29.6g을 수득하였다. 이 수지 일정량을 아미노산 분석한 결과 0.21 밀리몰 Thr/g의 값을 나타내었다.

이 수지 14.0g(2.94 밀리몰)을 실시예 2에서와 같이 상기 프로토콜을 이용하여 고상합성한 다음, Boc-Leu(5.9g, 23.5 밀리몰), Boc-Val(5.1g, 23.5 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(6.9g, 23.5 밀리몰), Boc-Asn(3.0g, 13.0 밀리몰), Boc-Leu(5.9g, 23.5 밀리몰), Boc-Try(2,6-DCB)(10.3g, 23.5 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(9.8g, 23.5 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(9.8g, 23.5 밀리몰), Boc-Val(5.1g, 23.5 밀리몰), Boc-Ala(4.4g, 23.5 밀리몰), Boc-Val(5.1g, 23.5 밀리몰), Boc-Ala(4.4g, 23.5 밀리몰) 및 Boc-Nle(5.4g, 23.5 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 11개의 커플링 사이클을 실시하여 Boc-데카펩티드 수지를 26g을 수득하였다.

이 수지 5.5g(0.61 밀리몰)을 Boc-Gln(655㎎, 2.7 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(2.0g, 4.8 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(2.1g, 4.8 밀리몰) 및 Boc-Leu(1.2g, 4.8 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 4개의 커플링 사이클을 통해 커플링시킨 후 진공하에서 건조시켜서 Boc-헥사데카펩티드 수지를 6.12g 수득하였다.

이 수지 2.0g(0.2 밀리몰)을 Boc-Orn(Fmoc)(91㎎, 0.2 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(250㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Tyr(2, 6-DCB)(352㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Asn(102㎎, 0.44 밀리몰), Boc-Glu(OFm)(340㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(248㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Phe(212㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Val(174㎎, 0.8 밀리몰),Boc-Ala(152㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(252㎎, 0.8 밀리몰),Boc-Ser(Bzl)(236㎎, 0.8 밀리몰) 및 Boc-His(Bom)(150㎎, 0.4 밀리몰)의 각각의 한 사이클로 된 12개의 커플링 사이클을 통해 커플링시켰다. 이 펩티드 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8에 따라 처리한 다음, 30㎖이 메틸렌 클로라이드중에서 0.5㎖의 무수 아세트산 및 38㎖의 DIPEA로 180분동안 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14에 따라 세척하고 진공하에서 건조하여 2.4g수득하였다.

그런 다음, 이 수지 1.15g(0.1 밀리몰)을 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시키고 20㎖의 증류 DMF중에서 BOP(58㎎. 0.13 밀리몰) 및 400㎖의 DIPEA로 24 및 6시간동안 2회 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석 결과 음성이었다. 이 수지를 프로토콜 2의 단계 13 내지 16에 따라 세척하고 진공하에서 건조하여 1.05g을 수득하였다.

이렇게 하여 얻어진 수지를 9㎖ HF, 1㎖의 아니졸 및 100㎖의 에탄디티올로 0℃에서 1시간 처리하여 탈보호시켰다. 반응 혼합물을 증발시키고 그 잔사를 15㎖의 Et₂O로 2회, 15㎖의 EtOAc로 2회 세척한 다음, 20㎖의 10% AcOH로 4회 추출하였다. 그 여액을 합하여 동결건조시켜서 밝은 황색 고체 385㎎을 수득하였다.

이 조물질을 실시예 3에서와 같이 세파덱스 G-25 미세컬럼상에서의 겔 여과에 의해 정제하여서 반-정제된 생성물 134㎎을 얻었다. 이어서, 이 물질을 3시간동안 26 내지 36%의 선형 구배로 전개시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC하여 더 정제하였다. 수집된 분획들을 분석 HPLC로 분석하여 주 피크를 자르고, 이들을 모아 동결건조하에서 백색 무정형 분말을 23.2㎎얻었다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산값 3277.8, 실측값 3276.3.

[실시예 8]

Ac-[Lys^12,Glu⁸, Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys¹²→Glu¹⁶)[Ac-(SEQID NO : 25)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 코폴리스티렌-1% 디비닐벤젤 가교결합수지(30g, 21.4 밀리당량, 200내지 400 ASTM메쉬, 바켐사 제품)을 19.9g의 Boc-Thr(Bzl)(64.3 밀리몰)과 6.6g 디시클로헥실디카보디이미드(32.1 밀리몰)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 22에서와 같이 처리하였다. 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 진탕시킨 후 여과하고, 프로토콜 1의 단계 10 내지 14에 따라 실시하였다. 카이저 닌히드린 시험은 음성이었다. 이 수지를 200㎖의 메틸렌 클로라이드중에서 8㎖의 무수 아세트산 및 8㎖의 DIPEA로 60분동안 처리한후 여과시키고 프로토콜의 단계 13 내지 14에 의해 세척하였다. 이 수지를 진공하에서 밤새 건조시켜 Boc-Thr(Bzl)-BHA수지 34.2g을 수득하였다. 이 수지 일정량을 아미노산 분석한 결과 0.47 밀리몰 Thr/g의 값을 나타내었다.

이 Boc-Thr(Bzl)수지 -BHA 수지 0.85g(0.4 밀리몰)을 어플라이드 바이오시스템스 모델 430A 펩티드 합성기상에서 고상합성하였다. 모든 커플링을 Boc-아미노산 및 디시클로헥실 카보디이미드로부터 제조된 미리 형성된 대칭 무수물을 이용하여 실시하였다. Boc-아스파라긴, Boc-글루타민 및 Boc-아르기닌(토실)을 각 HOBT 활성 에스테르들로서, 통상적으로 커플링시켰다. Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(830mg, 2.0 밀리몰)

Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰)이 각각의 한 사이클로된 11개의 커플링 사이클을 실시하여 Boc-도데카펩티드 수지를 수득하였다.

그런 다음, 이 수지를 실시예 2에서와 같이 Boc-Glu(OFm)(340㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(664㎎, 1.6 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(685㎎, 1.6 밀리몰), Boc-Leu(398㎎, 1.6 밀리몰), 및 Boc-Lys(Fmoc)(375㎎, 0.8 밀리몰)이 각각의 한 사이클로된 5개의 커플링 사이클을 커플링시킨 후, 진공하에서 건조하여 Boc-헵타데카펩티드 수지를 2.12g 수득하였다.

이렇게 하여 얻어진 수지를 1.06g(0.2밀리몰)을 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시키고, 20㎖의 증류 DMF중에서 BOP(177㎖, 0.4 밀리몰) 및 20㎖의 DIPEA로 2 및 8시간동안 2회반응시켰다.카이저 닌히드린 분석 결과 매우 미약하게 양성으로 나타났다. 이 수지를 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌클로라이드중에서 0.5㎖의 무수 아세트산으로 10분간 처리하여 미반응된 아민그룹들을 팹핑시킨 후, 프로토콜 2의 단계 13 내지 16에 따라 세척하였다. 이어서, 이 수지를 Boc-Thr(Bzl)(495㎎, 1.6 밀리몰) 로 된 하나의 커플링 사이클을 통해 커플링 시킨후, 상기에서와 같이 어플라이드 바이오시스템스 430A 펩티드 합성기상에 다시 놓았다. Boc-Tyr(2,6- DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰), Boc-His(Tos)(819㎎, 2.0 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 10개의 커플링 사이클을 실시한 후, 이 펩티드 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8의 따라 처리하고, 20㎖의 메틸렌 클로라이드중에서 0.5㎖의 무수 아세트산 및 100㎖의 DIPEA로 30분간 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14에 따라 세척하고 진공하에서 건조하였다.

그런 다음, 이 펩티드 수지를 실시예 7에서와 같이 블록을 제거시켜 조펩티드를 340㎎수득하고, 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 젤 여과로 정제하여 반-정제된 생성물 35㎎을 얻은 후, 이 물질을 25-35%의 선형구배로 전개시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC하여 백색 무정형 분말 15.6㎎을 얻었다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산값 3276.6, 실측값 3278.0.

[실시예 9]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁴, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²⁰→Asp²⁴)[Ac-(SEQ ID NO : 27)-NH₂]의 제조

실시예 8에서 수득한 Boc-Thr(Bzl)수지 0.42g(0.2 밀리몰), Boc-Leu(200㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Val(174㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(236㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(329㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Leu(200㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(352㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(332㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Lys(Fmoc)(375㎎, 0.8 밀리몰), 및 Boc-Val(174㎎, 0.8 밀리몰)이 각각의 한 사이클로된 9개의 커플링 사이클을 통해 커플링시켰다.

이 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시키고 20㎖의 증류 DMF중에서 BOP(177㎎, 0.4 밀리몰) 및 200㎖의 DIPEA로 6시간동안 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석 결과 음성이었다.

그런 다음, 이 수지를 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템스 모델 430A 펩티드 합성기상에서 고상 합성한 후 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰)이 각각 한 사이클로 된 17개의 커플링 사이클을 실시하였다. 이어서, 이 수지를 Boc-His(Tos)(164㎎, 0.4 밀리몰)로 된 하나 이 사이클을 실시하여 커플링시킨 후, 프로토콜 1의 단계 1 내지 8에 따라 실시하고 20㎖ 6% DIPEA/메틸렌클로라이드중에서 1㎖의 무수 아세트산으로 30분간 처리하였다. 이수지를 프로토콜 1의 단계 10 내지 14에 따라 세척한 후 진공하에서 건조하여서 1.94g을 수득하였다.

이렇게 하여 얻어진 펩티드 수지 0.97g(0.1밀리몰)을 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 265㎎을 얻은 다음, 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-정제된 생성물을 149㎎얻었다. 그런다음 이 물질을 25 내지 35%의 선형구배로 전개시키는 것을 제외하고는 실시예3에서와 같이 예비 HPLC하여 더 정제시켜서 백색 무정형 분말 28.1㎎을 얻었다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산값 3278.6, 실측값 3278.8.

[실시예 10]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 28)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 코폴리스티렌-1% 디비닐벤젤 가교결합수지(5.0g 2.6 밀리당량, 200내지 400 ASTM메쉬, 바켐사 제품)을 50㎖의 메틸렌 클로라이드 중에서 팽윤시킨 후 여과시켜, 프로토콜의 1의 단계 7 내지 8에 따라 세척하였다. 이 수지를 60㎖의 메틸렌 클로라이드에 다시 현탁시킨 후, 여기에 Boc-Thr(Bzl)(2.32g, 7.5 밀리몰)과 디시클로헥실디카보디이미드(774㎎, 3.75 밀리몰)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 4시간동안 진탕시킨 후 여과하고, 프로토콜 1의 단계 10 내지 14에 따라 실시하였다. 카이저 닌히드린 시험은 음성이었다. 이 수지를 50㎖의 메틸렌 클로라이드중에서 5㎖의 무수 아세트산 및 5㎖의 DIPEA로 60분동안 처리하여 미반응된 아민기들을 캡핑시킨 후 여과시키고 프로토콜의 단계 13 내지 14에 의해 세척하였다. 수지를 진공하에서 밤새 건조시켜 Boc-Thr(Bzl)-BHA수지 5.8g을 수득하였다. 이 수지 일정량을 아미노산 분석한 결과 0.276 밀리몰 Thr/g의 값을 나타내었다.

이 수지 1.44g(0.4 밀리몰)을 실시예 2에서와 같이 상기 프로토콜 1에 따라 고상합성한 후, Boc-Leu(399㎎, 1.6 밀리몰), Boc-Val(348㎎, 1.6 밀리몰) 및 Boc-Asp(OFm)(329㎎, 0.8 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 3개의 커플링 사이클을 실시하였다. 그런 다음, 이 수지의 반(0.2 밀리몰)을 Boc-Asn(204㎎, 0.88 밀리몰), Boc-Leu(199㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Tyr(2, 6-DCB)(352㎎, 0.8 밀리몰), 및 Boc-Lys(Fmoc)(375㎎, 0.8 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 4개의 커플링 사이클을 통해 커플링시켰다.

이렇게 하여 얻어진 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시킨 뒤, 20㎖의 1% DIPEA/DMF중에서 Bop(177㎎, 0.4 밀리몰)로 2시간 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석 결과 음성이었다.

이 수지를 Boc-Lys(2-Cl-z)(332㎎, 0.8 밀리몰)로 된 하나의 커플링 사이클을 통해 커플링시킨 후, 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템도 모델 430A 펩티드 합성기상에서 고상 합성하였다.

Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2, 6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 0.8 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰),Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰)및 Boc-His(Tos)(819㎎, 2.0 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 19개의 커플링 사이클을 실시한 다음, 프로토콜 1의 단계 1 내지 8에 따라 처리하고 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 중에서 1㎖의 무수 아세트산으로 30분간 처리하였다. 이 수지를 프로토콜 1의 단계 10 내지 14에 따라 세척하고 진공하에서 건조하였다.

이렇게 하여 얻어진 수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조펩티드를 210㎎얻은후, 이 펩티드를 실시예3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 정제된 생성물 93㎎을 얻었다. 이 물질을 27 내지 37%의 선형구배로 정제시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같은 예비 HPLC에 의해 더 정제시켜 백색의 무정형 분말을 26.2㎎얻었다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질 하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산값 3305.8, 실측값 3305.8.

[실시예 11]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 29)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(100 내지 200 ASTM 메쉬, 바켐사 제품) 0.4g(0.1 밀리몰)을 상기에서 언급한 프로토콜에 따라 고상합성하였다. 모든 커플링을 등물량의 Boc-아미노산과 디이소프로필카보이미드를 이용하여 실시하였다. 커플링 혼합물에 1.5몰량 이상의 HOBT를 첨가하여 Boc-아스파라진 및 Boc-글루타민을 각 활성 에스테르들로서 조합하였다. 반응시간들은 커플링 단계를 완료하는데 일반적으로 2 내지 18시간이었다. Boc-Thr(Bzl)(309㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Leu(249㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Val(217㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(206㎎, 0.5 밀리몰), Boc-Asn(232㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Leu(249㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(440㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Lys(Fmoc)(234㎎, 0.5 밀리몰), 및 Boc-Lys(2-Cl-z)(415㎎, 1.0 밀리몰)이 각각 한 사이클로된 9개의 커플링 사이클을 실시하였다.

이 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시키고 20㎖의 1% DIPEA/DMF중에서 Bop(88㎎, 0.2 밀리몰)2시간 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석 결과 음성이었다.

Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Nle(231㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Gln(246㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(415㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(428㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Leu(249㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(415㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(309㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(440㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Asn(232㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(315㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Val(217㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(315㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(295㎎, 1.0 밀리몰), 및 Boc-Hos(Tos)(409㎎, 1.0 밀리몰)이 각각의 한 사이클로 된 19개의 커플링 사이클을 실시한 다음, 프로토콜 1의 단계 1 내지 8에 따라 처리하고 10㎖의 6% DIPEA/메틸렌클로라이드중에서 0.5㎖의 무수 아세트산으로 30분간 처리하였다. 이 수지를 프로토콜 1의 단계 10 내지 14에 따라 세척하고 진공하에서 건조하였다.

이렇게하여 얻어진 수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조펩티드를 304㎎얻은 후, 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 정제된 215㎎을 얻었다. 이 물질을 26 내지 36%의 선형구배로 정제시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같은 예비 HPLC에 의해 더 정제시켜 백색의 무정형 분말을 20.1㎎얻었다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산값 3277.6, 실측값 3277.7.

[실시예 12]

Ac-[p-F-Phe⁶, 2-Nal¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹, Met³¹]-VIP(1-31)-NH₂시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-SEQ ID NO :30-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(100 내지 200ASTM 메쉬, 바켐사제품)0.4g (0.1밀리몰)을 실시예 11에서와 같이 고상합성하였다. Boc-Met(249㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Gly(175㎎, 1.0 밀리몰) 및 Boc-Gly(175㎎, 1.0 밀리몰)이 각각의 한 사이클로된 3개의 사이클을 실시한 후, 실시예 11에서와 같은 9개의 커플링 사이클 및 환화 반응을 실시하였다. 그런 다음, 10번째 사이클에서 Boc-Ala가 Boc-Val(217㎎, 1.0 밀리몰)로, 19번째 사이클에서 Boc-Tyr(2,6-DCB)가 Boc-2-Nal(158㎎, 0.5 밀리몰)로, 그리고 23번째 사이클에서 Boc-Phe가 Boc-p-F-Phe(142㎎, 0.5 밀리몰)로 대체된 것을 제외하고는 실시예 11에서와 같이 19개의 커플링 사이클을 실시하였다.

이렇게 하여 얻어진 수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호기켜 조펩티드를 345㎎ 얻은 후, 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 정제된 생성물 215㎎을 얻었다. 이 물질을 30 내지 40%의 선형구배로 정제시키는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같은 예비 HPLC에 의해 더 정제시켜 백색의 무정형 분말을 16.4㎎ 얻었다. 이 화합물을 HPLC에 의하면 균질하였으며 바른 아미노산 분석 결과를 나타내었다. FAB-MS : MH 계산값 3574.7, 실측값 3575.1.

[실시예 13]

Ac-[Glu⁸, Orn¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 31)-NH₂]의 제조

실시예 11에서와 같이 벤즈히드릴아민 수지(100 내지 200 ASTM 메쉬, Bachem)의 0.4g(0.1밀리몰) 분획을 고상 합성하였다. 실시예 11에서와 같이 9회 커플링 사이클 및 환화 반응을 수행하였다. 10번째 사이클에서의 Boc-Ala를 Boc-Val(217㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고, 17번째 사이클에서 Boc-Lys(2-Cl-z)를 Boc-Orn(Z)(366㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고 21번째 사이클에서의 Boc-Asp(OcHx)를 Boc-Glu(Bzl)(337㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하였다는 것을 제외하고는, 실시예 11에서와 같이 19회의 커플링 사이클을 수행하였다.

생성된 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈차단시켜 조 펩티드 255㎎을 수득하였다. 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과하여 정제하여 반-순수 생성물 200㎎을 수득하였다. 이 물질을 28 내지 30%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말30.7㎎을 수득하였다. 수득된 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3305.8, 실측치: 3305.5.

[실시예 14]

Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly^29,30, Cys(Acm)³¹]-VIP(1-31)-NH₂시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO :32-NH2]의 제조

실시예 11에서와 같이 벤즈히드릴아민 수지(0.4g, 0.1밀리몰, 100 내지 200 ASTM 메쉬, Bachem)를 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Cys(Acm)(292㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Gly(175㎎, 1.0 밀리몰) 및 Boc-Gly(175㎎, 1.0 밀리몰)를 각각 사용하여 3회의 커플링 사이클 및 환화 반응을 수행하였다. 23번째 사이클에서의 Boc-Phe를 Boc-p-F-Phe(142㎎, 0.5 밀리몰)로 대체하였다는 것을 제외하고는, 실시예 11에서와 같이 19회의 커플링 사이클을 수행하였다.

생성된 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 268㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과하여 정제하여 반-순수 생성물 165㎎을 수득하였다. 이 물질을 25 내지 35%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말28.1㎎을 수득하였다. 수득된 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3584.1, 실측치: 3584.0.

[실시예 15]

Ac-[Ala², Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 33)-NH₂]의 제조

실시예 11에서와 같이 벤즈히드릴아민 수지(1.5g, 0.4밀리몰, 100 내지 200 ASTM 메쉬, Bachem)를 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성장치상에서 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Thr(Bzl)(619㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(822㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), 및 Boc-Lys(Fmoc)(938㎎, 2.0 밀리몰)을 각각 사용하여 8회의 커플링 사이클을 수행하였다.

생성된 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈차단시킨 다음, 1% DIPEA/DMF 20㎖중에서 2시간동안 Bop(356㎎,0.8 밀리몰)와 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석값은 음(-)의 값이었다. 프로토콜 2의 단계 3 내지 16을 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 Boc-옥타펩티드 수지 1.9g을 수득하였다.

상기 수득된 수지의 0.95g(0.2 밀리몰)분획을 다시 실시예 11에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성 장치상에서 다시 고상 합성하였다. 각각의 하나의 사이클에 대해 Boc-Lys(2-Cl-z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), 및 Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰)을 각각 사용하여 18회의 커플링 사이클을 수행하여 Boc-헥사코사 펩티드 수지를 1.54g을 수득하였다.

상기 수득된 수지의 0.77g(0.1 밀리몰)분획을 실시예 2에서와 같이 상기 프로토콜을 이용하여 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Ala(76㎎, 0.4 밀리몰) 및 Boc-His(Tos)(328㎎, 0.8 밀리몰)을 각각 사용하여 2회의 커플링 사이클을 수행하였다. 펩티드 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 수행한 다음, 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖중에서 60분간 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.74g을 수득하였다.

이 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈차단시켜 조 펩티드 172㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 110㎎을 수득하였다. 이 물질을 22 내지 37%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 40.0㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석 값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3261.7, 실측치: 3261.8.

[실시예 16]

Ac-[N-Me-Ala¹, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 34)-NH₂]의 제조

실시예 15로부터 수득된 Boc-헥사코사 펩티드 수지의 0.77g(0.1 밀리몰)분획을 실시예 2에서와 같이 상기 프로토콜을 이용하여 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Ser(Bzl)(118㎎,0.4 밀리몰) 및 Boc-N-Me-Ala(81㎎, 0.4 밀리몰)을 각각 사용하여 2회의 커플링 사이클을 수행하였다. 펩티드 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 수행한 다음, DMF 20㎖중에서 6시간 동안 BOP(442㎎, 1.0 밀리몰), 아세트산(57㎖, 1.0 밀리몰) 및 DIPEA(523㎖, 3.0 밀리몰)로 처리하고, 이어서 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖중에서 60분동안 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.73g을 수득하였다.

이 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 191㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 138㎎을 수득하였다. 이 물질을 22내지 37%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 28.0㎎을 수득하였다. 이화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석 값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3225.4, 실측치: 3225.8.

[실시예 17]

Ac-[2-Nal¹⁰, Leu¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys21→Asp²⁵)[Ac-(SEQID NO : 35)-NH₂]의 제조

실시예 2에서와 같이 프로토콜 1을 이용하여 벤즈히드릴아민 수지(4.0g,1.08 밀리몰, 100 내지 200 ASTM매쉬, Bachem)를 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Thr(Bzl)(1.34g, 4.3 밀리몰), Boc-Leu(925㎎, 4.3 밀리몰), Boc-Val(938㎎, 4.3 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(889㎎, 2.1 밀리몰), Boc-Asn(557㎎, 2.4 밀리몰), Boc-Leu(925㎎, 4.3 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(1.9g, 4.3 밀리몰), 및 Boc-Lys(Fmoc)(1.1g, 4.3 밀리몰)을 각각 사용하여 8회의 커플링 사이클을 수행하였다.

이 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시킨 다음, 1% DIPEA/DMF 20㎖ 중에서 2시간동안 BOP(885㎎, 2.0밀리몰)와 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석값은(-)값이었다. 프로토콜 2의 단계 3 내지 16을 사용하여 수지를 세척하였다.

이 수지를 Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.79g, 4.3 밀리몰)을 사용하여 1회의 커플링 사이클을 수행한 다음 진공건조시켜 Boc-노나펩티드 수지 6.3g을 수득하였다.

상기 수득된 수지의 1.89g(0.3 밀리몰) 분획을 하나의 사이클에 대해 Boc-Ala(227㎎, 1.2 밀리몰), Boc-Ala(227㎎, 1.2 밀리몰), Boc-Nle(278㎎, 1.2 밀리몰), Boc-Gln(325㎎, 1.32 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(498㎎, 1.2 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(514㎎, 1.2 밀리몰), Boc-Leu(299㎎, 1.2 밀리몰), Boc-Leu(498㎎, 1.2 밀리몰), 및 Boc-Thr(Bzl)(371㎎, 1.2 밀리몰)을 각각 사용하여 9회의 커플링 사이클을 수행하여 Boc-옥타데카펩티드 수지 2.06g을 수득하였다,

상기 수지의 0.68g(0.1 밀리몰) 분획을 하나의 사이클에 대해 Boc-2-Nal(126㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Asn(102㎎, 0.44 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(126㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(124㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Phe(106㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Val(87㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Ala(76㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Asp(126㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(118㎎, 0.4 밀리몰) 및 Boc-His(Tos)(164㎎, 0.4 밀리몰)을 각각 사용하여 10회의 커플링 사이클을 수행하였다. 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8에 따라 처리한 다음, 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖ 중에서 60분동안 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14를 이용하여 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.82g을 수득하였다.

생성된 펩티드-수지를 실시에 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 261㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과하여 정제하여 반-순수 생성물 186㎎을 수득하였다. 이 물질을 30 내지 40%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 60.1㎎을 수득하였다. 수득된 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3296.8, 실측치: 3295.6.

[실시예 18]

Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Leu¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 36)-NH₂]의 제조

19번째 사이클에서의 Boc-2-Nal을 Boc-Tyr(O-Me)(59㎎, 0.2 밀리몰)로 대체시켰다는 것을 제외하고는, 실시예 17로부터 수득된 Boc-옥타데카펩티드 수지의 0.68g(0.1 밀리몰)의 분획을 실시예 17에서와 같이 910회의 커플링 사이클을 수행하여 생성물 0.61g의 수득하였다.

생성된 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 175㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 136㎎을 수득하였다. 이 물질을 28 내지 38%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 42.4㎎을 수득하였다. 수득된 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3276.7, 실측치: 3276.0.

[실시예 19]

Ac-[p-F-Phe⁶, p-NH₂-Phe¹⁰, Leu¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 37)-NH₂]의 제조

19번째 사이클에서의 Boc-2-Nal을 Boc-p-NH(Z)-Phe(166㎎, 0.4 밀리몰)로 대체하고, 23번째 사이클에서의 Boc-Phe를 Boc-p-F-Phe(113㎎, 0.4 밀리몰)로 대체하는 것을 제외하고는, 실시예 17에서와 같이 Boc-옥타데카펩티드 수지의 0.625g(0.09 밀리몰)을 사용하여 10회 커플링 사이클을 수행하여 생성물 0.84g을 수득하였다.

생성된 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 182㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 160㎎을 수득하였다. 이 물질을 25 내지 35%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 47.2㎎을 수득하였다. 수득된 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3279.7, 실측치: 3279.8.

[실시예 20]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 38)-NH₂]의 제조

실시예 2에서와 같이 프로토콜 1을 이용하여 벤즈히드릴아민 수지(1.25g, 1.0 밀리몰, 100 내지 200 ASTM메쉬, Bachem)를 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g, 4.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g, 4.0 밀리몰), Boc-Leu(925㎎, 4.0 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(823㎎, 2.0 밀리몰),Boc-Asn(5ℓ1㎎, 2.2 밀리몰), Boc-Leu(925㎎, 4.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(1.76g, 4.0 밀리몰), 및 Boc-Lys(Fmoc)(937㎎, 2.0 밀리몰)을 각각 사용하여 8회의 커플링 사이클을 수행하였다.

생성된 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈차단시킨 다음, 1% DIPEA/DMF 20㎖ 중에서 2시간동안 BOP(885㎎, 2.0밀미몰)와 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석값은 음(-)의 값이었다. 프로토콜 2의 단계 3 내지 16을 사용하여 수지를 세척하였다.

이 수지를 Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g, 4.0 밀리몰)을 사용하여 1회의 커플링 사이클을 수행한 다음 진공건조시켜 Boc-노나펩티드 수지 2.7g을 수득하였다.

상기 수득된 수지의 0.54g(0.2 밀리몰) 분획을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성 장치상에서 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰)을 각각 사용하여 18회의 커플링 사이클을 수행하여 Boc-헥사코사 펩티드 수지를 1.16g을 수득하였다.

상기 수득된 수지의 0.54g(0.1 밀리몰) 분획을 Boc-His(Tos)(819㎎, 2.0 밀리몰)을 사용하여 1회의 커플링 사이클을 행한 다음 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 수행하고, 이어서 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖ 중에서 60분간 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 프로토콜 1의 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.5g을 수득하였다.

HF 5㎖ 및 애니솔 0.5㎖를 사용했다는 것 외에는, 이 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조펩티드 127㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 74.6㎎을 수득하였다. 이 물질을 24 내지 34%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 17.1㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3333.8, 실측치: 3333.4.

[실시예 21]

Ac-[N-Me-Ala¹, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 39)-NH₂]의 제조

실시예 20로부터 수득된 Boc-헵타코사펩티드 수지의 0.58g(0.1 밀리몰) 분획을 Noc-N-Me-Ala(81㎎, 0.4 밀리몰)을 사용하여 1회의 커플링 사이클을 수행하고 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 수행한 다음, DMF 20㎖중에서 6시간 동안 BOP(443㎎, 1.0 밀리몰), 아세트산(57㎖, 1.0 밀리몰) 및 DIPEA(523㎖, 3.0 밀리몰)로 처리하고, 이어서 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖중에서 60분동안 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 프로토콜 1의 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.4g을 수득하였다.

이 펩티드-수지를 실시예 20에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 165㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 101㎎을 수득하였다. 이 물질을 24 내지 34%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 19.8㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3281.8, 실측치: 3281.9.

[실시예 22]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 40)-NH₂]의 제조

실시예 20으로부터 수득된 Boc-노나펩티드 수지의 0.54g(0.2 밀리몰) 분획을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성 장치상에서 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Glu(OBzl)(675㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Glu(OBzl) (675㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), (Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val (435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰)을 각각 사용하여 18회의 커플링 사이클을 수행하여 Boc-헵타코사 펩티드 수지 0.58g을 수득하였다.

상기 수득된 수지를 Boc-His(Tos)(164㎎, 0.4 밀리몰)를 사용하여 1회의 커플링 사이클을 행하고, 이어서 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 수행한 다음, 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖ 중에서 60분간 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 프로토콜 1의 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.53g을 수득하였다.

이 펩티드-수지를 HF 5㎖ 및 애니솔 0.5㎖를 사용했다는 것 외에는 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조펩티드 151㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 110㎎을 수득하였다. 이 물질을 23.5 내지 33.5%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 22.8㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3347.9, 실측치: 3347.0.

[실시예 23]

Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 41)-NH₂]의 제조

실시예 17로부터 수득된 Boc-노나코사펩티드 수지의 1.84g(0.3 밀리몰) 분획을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성 장치상에서 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰)을 각각 사용하여 9회의 커플링 사이클을 수행하여 Boc-옥타데카 펩티드 수지 2.2g을 수득하였다.

상기 수지의 0.73g(0.1 밀리몰) 분획을 하나의 사이클에 대해 Boc-Tyr(O-ME)(59㎎, 0.2 밀리몰), Boc-Asn(102㎎, 0.44 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(126㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(124㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Phe(106㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Val(87㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Ala(76㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(126㎎, 0.4 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(118㎎, 0.4 밀리몰) 및 Boc-His(Tos)(164㎎, 0.4 밀리몰)을 각각 사용하여 10회의 커플링 사이클을 수행하였다. 이 펩티드 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 행한 다음, 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖중에서 60분동안 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 이 수지를 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.77g을 수득하였다.

생성된 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 187㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 131㎎을 수득하였다. 이 물질을 26 내지 36%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 5.3㎎을 수득하였다. 수득된 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3291.8, 실측치: 3291.7.

[실시예 24]

Ac-[Glu⁸, Leu¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 42)-NH₂]의 제조

실시예 2에서와 같이 프로토콜 1을 이용하여 벤즈히드릴아민 수지(1.1g, 0.5 밀리몰, 200 내지 400 ASTM매쉬, Bachem)를 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(823㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(511㎎, 2.2 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(881㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(Fmoc)(936㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), 및 Boc-Ala(378g, 2.0 밀리몰)을 사용하여 13회의 커플링 사이클을 수행하였다.

생성된 수지를 프로토콜 2의 단계 1 내지 11에 따라 처리하여 선택적으로 탈보호시킨 다음, 1% DIPEA/DMF 20㎖ 중에서 2시간동안 BOP(443㎎, 1.0밀리몰)와 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석값은(-)값이었다. 프로토콜 2의 단계 3 내지 16을 이용하여 수지를 세척하여 Boc-트리데카펩티드 2.02g을 수득하였다.

상기 수득된 수지의 0.89g(0.3 밀리몰) 분획을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템스 모델 430A 펩티드 합성 장치상에서 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰)을 각각 사용하여 16회의 커플링 사이클을 수행하여 Boc-노나데카 펩티드 수지 1.2g을 수득하였다.

이 수지의 0.6g(0.1 밀리몰) 분획을 Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0밀리몰) 및 Boc-His(Tos)(819㎎, 2.0밀리몰)을 사용하여 상기에서와 같이 2회의 커플링을 행하여 수지 0.72g을 수득하였다. 이 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 수행한 다음, 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖중에서 60분간 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 프로토콜 1의 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.645g을 수득하였다.

이 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 280㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 160㎎을 수득하였다. 이 물질을 22 내지 32%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 23.1㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3561.1, 실측치: 3560.8.

[실시예 25]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Ala^29-30]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 43)-NH₂]의 제조

실시예 24로부터 수득된 Boc-노나코사 펩티드 수지의 0.6g(0.1 밀리몰) 분획을 Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-His(Tos)(819㎎, 2.0 밀리몰)를 사용하여 상기에서와 같이 2회의 커플링 사이클을 행하여 수지 0.68g을 수득하였다. 이 수지를 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 수행한 다음, 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드 20㎖중에서 60분간 무수 아세트산 0.5㎖로 처리하였다. 프로토콜 1의 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.56g을 수득하였다.

이 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 160㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 70㎎을 수득하였다. 이 물질을 22 내지 35%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 예비 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 21.8㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3545.1, 실측치: 3545.3.

[실시예 26]

Ac-[N-Me-Ala¹, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 44)-NH₂]의 제조

실시예 20으로부터 수득된 Boc-노나펩티드 수지의 1.1(0.4 밀리몰) 분획을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템스 모델 430A 펩티드 합성 장치상에서 고상 합성하였다. 하나의 사이클에 대해 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰)을 각각 사용하여 17회의 커플링 사이클을 수행하여 Boc-헥사코펩티드 수지 2.24g을 수득하였다.

상기 수득된 수지의 1.1g(0.2 밀리몰) 분획을 하나의 사이클에 대해 Boc-Ser(Bzl)(238㎎, 0.8밀리몰) 및 Boc-N-Me-Ala(163㎎, 0.8밀리몰)을 각각 사용하여 2회의 커플링 사이클을 수행하고, 이어서 프로토콜 1의 단계 1 내지 8을 수행한 다음, DMF 20㎖ 중에서 1시간동안 BOP-Cl(100㎎, 0.2 밀리몰), 아세트산(23㎖. 0.2 밀리몰) 및 DIPEA(140㎖, 0.4 밀리몰)로 처리하였다. 프로토콜 1의 단계 10 내지 14를 이용하여 수지를 세척한 다음 진공 건조시켜 생성물 0.95g을 수득하였다.

이 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈차단시켜 조 펩티드 245㎎을 수득하였다. 이 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반-순수 생성물 165㎎을 수득하였다. 이 물질을 25 내지 35%의 선형 구배를 시행한다는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC에 의해 더 정제하여 백색의 무정형 분말 33.7㎎을 수득하였다. 이 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 얻었다. FAB-MS : MH 계산치: 3295.8, 실측치: 3294.5.

[실시예 27 ]

Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 45)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(2.49g, 2.0 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, 바켐(Bachem))를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 하나의 사이클당 각각 Boc-Lys(2-Cl-Z)(3.32g, 8.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(3.32g, 8.0 밀리몰), Boc-Leu(1.85g, 8.0 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(823㎖, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(1.02g, 4.4 밀리몰) 및 Boc-Leu(1.05g, 8.0 밀리몰)을 사용하여 6회 커플링 사이클을 수행하였다. 상기 수지를 건조하여 수지 0.4 밀리몰을 제지했다. 하나의 사이클당 각각 Boc-Tyr(2,6-DCB)(2.52g, 6.4 밀리몰), Boc-Lys(Fmoc)(1.87g, 6.4 밀리몰) 및 Boc-Lys(2-Cl-Z)(2.65g, 6.4 밀리몰)을 사용하여 3회 커플링 사이클을 수행했다.

그다음, 이러한 수지를 프로토콜 2의 제1단계 내지 제11단계로 처리하여 선택적으로 탈보호시키고, 20㎖의 1% DIPEA/DMF 중의 BOP(1.42g, 3.2 밀리몰)과 4.5 시간동안 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석은 음성이었다. 프로토콜 2의 제13단계 내지 제16단계를 사용하여 수지를 세척하고, 건조하여 6.56g의 Boc-노나펩티드 수지를 수득하였다.

이러한 수지 1.64g(0.4 밀리몰)을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A(Applied Biosystems model 430A) 펩티드 합성기상에서 고상 합성시켰다. 하나의 사이클당 각각 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰)을 사용하는 13회의 커플링 사이클을 수행하여 2.56g의 Boc-도코사펩티드 수지를 수득했다.

하나의 사이클당 각각 Boc-p-F-Phe(283㎎. 1.0 밀리몰), Boc-Val(218㎎. 1.0 밀리몰), Boc-Ala(189㎎. 1.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(315㎎. 1.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(295㎎. 1.0 밀리몰) 및 Boc-His(Tos)(818㎎. 2.0 밀리몰)을 사용하는 6회 커플링 사이클을 통해 상기 수지 0.64g(0.1밀리몰)을 수득했다.

펩티드 수지를 프로토콜 1의 제1 단계 내지 제8단계를 통해 수득하고, 이것을 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 0.5㎖ 아세트산 무수물로 60분동안 처리하였다. 그 수지를 제10단계 내지 제14단계를 사용하여 세척하고 진공 건조하여 0.6g을 수득하였다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 224㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반순수한 생성물 213㎎을 수득했다.

이러한 물질을 27 내지 37%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 70.5㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의하면 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치: 3365.9, 실측치: 3365.6.

[실시예 28]

Ac-[1-Nal⁶, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 46)-NH₂]의 제조

1회 사이클에서 Boc-p-F-Phe를 Boc-1-Nal(315㎎, 1.0밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 실시예 27의 Boc-도코사펩티드수지 1.28g(0.2 밀리몰)을 실시예 27에서와 같이 6회 커플링 사이클시켰다. 펩티드 수지를 프로토콜 1의 제1단계 내지 제8단계를 통해 수득하고, 이것을 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 0.5㎖의 아세트산 무수물로 60분동안 처리하였다. 그 수지를 제10단계 내지 제14단계에 의해 세척하고, 진공하에 건조하여 1.41g을 수득했다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 420㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제시켜 반순수한 생성물 305㎎을 수득했다. 이러한 물질을 25 내지 35%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 66.9㎎을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하면 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3398.0, 실측치 3398.8.

[실시예 29]

Ac-[Glu⁸, p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 47)-NH₂]의 제조

실시예 27의 Boc-노나펩티드 수지 1.64g(0.4 밀리몰)을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성기 상에서 고상 합성하였다. 하나의 사이클당 각각 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰)을 사용하는 9회 커플링 사이클을 수행하여 Boc-옥타데카펩티드 수지 2.2g을 수득하였다.

이러한 수지 1.1g(0.2 밀리몰)을, 하나의 사이클당 각각 Boc-p-NH(CBZ)-Phe(415㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Asn(512㎎, 2.2 밀리몰), Boc-Glu(Bzl)(675㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(620㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(532㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(436㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰), 및 Boc-His(Tos)(1.64g, 4.0 밀리몰)을 사용하여 10회 사이클시켰다. 그 펩티드 수지에 프로토콜 1의 제1단계 내지 제8단계를 수행하고, 이것을 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 아세트산 무수물 0.5㎖로 60분동안 처리하였다. 그 수지를 제10단계 내지 제14단계를 사용하여 세척하고, 진공하에 건조하여 1.45g을 수득했다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 580㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반순수한 생성물 400㎎을 수득했다. 이러한 물질 22 내지 32%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 60.9㎎을 수득하였다. 그 화합물은 HPLC에 의하면 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공했다. FAB-MS : MH 계산치 3346.9, 실측치 3346.8.

[실시예 30]

Ac-[Glu⁸, O-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 48)-NH₂]의 제조

1회 사이클에서 Boc-p-NH(CBZ)-Phe를 Boc-O-Me-Tyr(148㎎, 0.5 밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 실시예 29의 Boc-옥타데카펩티드 수지 1.1g(0.2 밀리몰)을 실시예 29에서와 같이 10회 커플링 사이클시켰다. 펩티드 수지를 프로토콜 1의 제1단계 내지 제8단계를 통해 수득하고, 이것을 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 0.5㎖의 아세트산 무수물로 60분간 처리하였다. 그 수지를 제10단계 내지 제14단계에 의해 세척하고, 진공하에 건조하여 1.45g을 수득했다.

이러한 펩티드 수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 555㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제시켜 반 순수한 생성물 460㎎을 수득했다. 이러한 물질을 25 내지 35%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 152.9㎎을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하면 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3361.9, 실측치 3361.7.

[실시예 31]

Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 49)-NH₂]의 제조

실시예 17의 Boc-노나펩티드 수지 1.2g(0.2 밀리몰)을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성기 상에서 고상 합성시켰다. 하나의 사이클당 각각 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰)을 사용하는 13회의 커플링 사이클을 수행하여 Boc-도카사펩티드 수지 1.3g을 수득하였다.

이러한 수지 0.65g(0.1 밀리몰)을 실시예 27에서와 같이 6회 커플링 사이클시켰다. 그 펩티드 수지를 프로토콜 1의 제1단계 내지 제8단계를 통해 수득하고, 이것을 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 아세트산 무수물 0.5㎖로 60분간 처리하였다. 그 수지를 제10단계 내지 제14단계에 의해 사용하여 세척하고, 진공하에 건조하여 0.856g을 수득했다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 550㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 225㎎을 수득했다. 이러한 물질을 27 내지 37%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 80.9㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의하면 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공했다. FAB-MS : MH 계산치 3295.7, 실측치 3296.2.

[실시예 32]

Ac-[1-Nal⁶, Lys¹², Nle^17,Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQID NO : 50)-NH₂]의 제조

1회 사이클에서 Boc-p-F-Phe를 Boc-1-Nal(315㎎, 1.0 밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 실시예 31의 Boc-도코사펩티드 수지 0.65g(0.1 밀리몰)을 실시예 27에서와 같이 6회 커플링 사이클시켰다. 펩티드 수지를 프로토콜 1의 제1단계 내지 제8단계를 통해 수득하고, 이것을 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 0.5㎖ 아세트산 무수물로 60분동안 처리하였다. 그 수지를 제10단계 내지 제14단계에 의해 세척하고, 진공하에 건조하여 0.801g을 수득했다.

이러한 펩티드 수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 250㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제시켜 반 순수한 생성물 188㎎을 수득했다. 이러한 물질 27 내지 37%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 28.0㎎을 수득했다. 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공했다. FAB-MS : MH 계산치 3327.8, 실측치 3328.5.

[실시예 33]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 51)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(1.1g, 0.5 밀리몰, 200∼400 ASTM 메쉬, 바켐)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 1회 사이클에서 Boc-Ala를 Boc-Thr(Bzl)(619㎎, 2.0 밀리몰)로 대체하고, 2회 사이클에서 Boc-Ala를 Boc-Gly(350㎎, 2.0 밀리몰)로 대체하고, 3회 사이클에서 Boc-Ala를 Boc-Gly(350㎎, 2.0 밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 13회 커플링 사이클을 실시예 24에서와 같이 수행하여 Boc-트리데카펩티드 수지 2.03g을 수득하였다.

이러한 수지 1.22g(0.3 밀리몰)을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 340A 펩티드 합성기상에서 고상 합성시켰다. 11회 사이클에서 Boc-Asp(OcHx)를 Boc-Glu(Bzl)(675㎎, 2.0 밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 6회 커플링 사이클을 실시예 24에서와 같이 수행하여 Boc-노나코사 펩티드 수지 1.95g을 수득하였다. 이러한 수지 0.975g(0.15 밀리몰)을 하나의 사이클당 각각 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-His(Tos)(891㎎, 2.0 밀리몰)을 사용하여 2회 커플링 사이클시킨 다음, 상기 수지에 프로토콜 1의 제1단계 내지 제8단계를 수행하고, 이것을 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 0.5㎖의 아세트산 무수물로 60분간 처리하였다. 그 수지를 프로토콜 1의 제10단계 내지 제14단계를 사용하여 세척하고 진공하에 건조하여 0.897g을 수득하였다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 270㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 150㎎을 수득했다.

이러한 물질 24 내지 34%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 28.7㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3547.1, 실측치 3546.9.

[실시예 34]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 52)-NH₂]의 제조

1회 사이클에서 Boc-Ala를 Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 실시예 33의 Boc-노나코사펩티드 수지 0.975g(0.15 밀리몰)을 실시예 33에서와 같이 2회 커플링 사이클시켜 0.915g을 얻었다.

이러한 펩티드 수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 303㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제시켜 반 순수한 생성물 180㎎을 수득했다. 이러한 물질을 25 내지 35%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 42.8㎎을 수득했다. 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3563.1, 실측치 3562.6.

[실시예 35]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28,]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 53)-NH₂]의 제조

실시예 30의 Boc-노나펩티드 수지 0.27g(0.1 밀리몰)을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성기 상에서 고상 합성시켰다. 하나의 사이클당 각각 Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Nle(462㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Gln(493㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(856㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Leu(499㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(830㎎, 2.0 밀리몰),Boc-Thr(Bzl)(618mg, 2.0밀리몰) Boc-Tyr(2,6-DCB)(880㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Glu(Bzl)(675㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Tyr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰) 및 Bov-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰), 및 Boc-His(Tos)(818㎎, 2.0 밀리몰)을 사용하는 9회 커플링 사이클을 수행하여 Boc-옥타코사펩티드 수지 0.57g을 수득하였다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 160㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 100㎎을 수득했다. 이러한 물질 25 내지 35%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 17.1㎎을 수득했다. 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3331.9, 실측치 3332.0.

[실시예 36]

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸,]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 54)-NH₂]의 제조

실시예 17의 Boc-노나펩티드 수지 0.6g(0.1 밀리몰)을 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성기 상에서 고상 합성하였다. 9회 커플링 사이클을 실시예 23에서와 같이 수행하여 Boc-옥타데카펩티드 수지 0.72g을 수득하였다.

이러한 수지를 Boc-p-NH(CBZ)-Phe(166㎎, 0.4 밀리몰)로 10회 사이클시켜 Boc-노나데카펩티드 수지 0.79g을 수득했다. 그 수지를 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성기상에서 고상 합성시켰다. 실시예 23에서와 같이 9회 커플링 사이클을 수행하여 Boc-옥타데카펩티드 수지 0.72g을 수득하였다. 이 수지를 실시예 8에서와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A 펩티드 합성기상에서 고상 합성시켰다. 하나의 사이클당 각각 Boc-Asn(464㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(618㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Phe(531㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Val(435㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ala(378㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(630㎎, 2.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(590㎎, 2.0 밀리몰) 및 Boc-His(Tos)(819㎎, 2.0 밀리몰)을 사용하는 9회 커플링 사이클을 수행하여 0.91g을 수득했다. 그 다음, 이러한 수지를 프로토콜 1의 제1단계 내지 제8단계를 통해 수득하고, 이것을 20㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 아세트산 무수물 0.5㎖로 60분간 처리하였다. 그 수지를 프로토콜 1의 제10단계 내지 제14단계를 사용하여 세척하고, 진공하에 건조하여 0.85g을 수득했다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 350㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 138㎎을 수득했다. 이러한 물질을 25 내지 35%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 25.2㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3276.8, 실측치 3276.2.

[실시예 37]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, m-OCH₃-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸,]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 55)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 1.0 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, 바켐)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 하나의 사이클당 각각 Boc-Thr(Bzl)(310㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Leu(267㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Val(217㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Asp(OFm)(212㎎, 0.5 밀리몰), Boc-Asn(255㎎, 1.1 밀리몰), Boc-Leu(249㎎, 1.0 밀리몰), Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl)(80㎎, 0.2 밀리몰), Boc-Lys(Fmoc)(234㎎, 0.5 밀리몰) 및 Boc-Lys(2-Cl-Z)(415㎎, 1.0 밀리몰)을 사용하여 9회 커플링 사이클을 수행하였다.

그다음, 이러한 수지를 프로토콜 2의 제1단계 내지 제11단계로 처리하여 선택적으로 탈보호시키고, 10㎖의 1% DIPEA/DMF 중의 BOP(132g, 0.3 밀리몰)과 3.5 시간동안 반응시켰다. 카이저 닌히드린 분석은 음성이었다. 프로토콜 2의 제13단계 내지 제16단계를 사용하여 수지를 세척하였다.

하나의 사이클당 각각 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Nle(231㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Gln(270㎎, 1.1 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(415㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Arg(Tos)(428㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Leu(267㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Lys(2-Cl-Z)(415㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(310㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Tyr(2,6-DCB)(220㎎, 0.5 밀리몰), Boc-Asn(256㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(315㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Thr(Bzl)(310㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Phe(265㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Val(217㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Asp(OcHx)(315㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Ser(Bzl)(295㎎, 1.0 밀리몰), 및 Boc-His(Tos)(409㎎, 1.0 밀리몰)을 사용하여 19회 커플링 사이클을 수행했다.

그 다음, 이러한 수지를 프로토콜 1의 제1단계 내지 제8단계를 통해 수득하고, 이것을 10㎖의 6% DIPEA/메틸렌 클로라이드중의 0.5㎖의 아세트산 무수물로 60분간 처리하였다. 그 수지를 프로토콜 1의 제10단계 내지 제14단계를 사용하여 세척하고 진공하에 건조하여 0.814g을 수득했다

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 265㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 150㎎을 수득했다.

이러한 물질 23 내지 33%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 8.1㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의하면 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3307.8, 실측치 3306.8.

[실시예 38]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 56)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, 바켐)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 11회 사이클에서 Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl)을 Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl)(78㎎, 0.2 밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 29회 커플링 사이클을 실시예 37에서와 같이 수행하여 0.754g을 수득하였다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 254㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 114㎎을 수득했다.

이러한 물질 27 내지 37%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 15.1㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의하면 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3395.7, 실측치 3395.5.

[실시예 39]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, m-OCH₃-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 57)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, 바켐)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 1회 사이클에서 Boc-Thr(Bzl)을 Boc-Lys(2-Cl-Z)(415㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고, 2회 사이클에서 Boc-Leu를 Boc-Lys(2-Cl-Z)(415㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고, 3회 사이클에서 Boc-Val를 Boc-Leu(268㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고, 21회 사이클에서 Boc-Asp(OcHx)를 Boc-Glu(O-Bzl)(337㎎, 1.0 밀리몰)으로 대체한 것을 제외하곤, 29회 커플링 사이클을 실시예 37에서와 같이 수행하여 0.90g을 수득하였다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 270㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 155㎎을 수득했다. 이러한 물질을 25 내지 35%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 29.6㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3377.9, 실측치 3377.9.

[실시예 40]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 58)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, 바켐)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 7회 사이클에서 Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl)을 Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl)(78㎎, 0.2 밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 29회 커플링 사이클을 실시예 39에서와 같이 수행하여 0.84g을 수득하였다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 240㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 100㎎을 수득했다.

이러한 물질 25 내지 35%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 37.2㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3365.9, 실측치 3365.8.

[실시예 41]

Ac-[Ala⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 59)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, 바켐)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 5회 사이클에서 Boc-Asn을 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고, 7회 사이클에서 Boc-m-OCH₃-(Bzl)을 Boc-Tyr(2,6-DCB)(440㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고, 21회 사이클에서 Boc-Glu(OBzl)을 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로 대체한 것을 제외하곤, 29회 커플링 사이클을 실시예 39에서와 같이 수행하여 0.85g을 수득하였다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 255㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 112㎎을 수득했다.

이러한 물질 25 내지 35%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 12.0㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3246.8, 실측치 3246.7.

[실시예 42]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala^16,17,18, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 60)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, 바켐)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 5회 사이클에서 Boc-Ala를 Boc-Asn(256㎎, 1.1 밀리몰)로 대체하고, 12회 사이클에서 Boc-Nle를 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고, 13회 사이클에서 Boc-Gln을 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로 대체하고, 21회 사이클에서 Boc-Ala를 Boc-Glu(O-Bzl)(337㎎, 1.0 밀리몰)으로 대체한 것을 제외하곤, 29회 커플링 사이클을 실시예 41에서와 같이 수행하여 0.80g을 수득하였다.

이러한 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호시켜 조 펩티드 254㎎을 수득했다. 그 펩티드를 실시예 3에서와 같이 겔 여과에 의해 정제하여 반 순수한 생성물 115㎎을 수득했다.

이러한 물질 20 내지 30%의 선형 구배를 이용한 것을 제외하곤, 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 예비용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 백색의 무정형 분말 32.1㎎을 수득했다. 그 화합물은 HPLC에 의해 균질화되었으며, 정확한 아미노산 분석값을 제공하였다. FAB-MS : MH 계산치 3248.7, 실측치 3248.3.

[실시예 43]

Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nle¹⁷, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 61)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성하였다. 제13회 사이클의 Boc-Gln을 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 41에서와 같이 28회의 커플링 사이클을 수행하여 0.93g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 250㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 100㎎ 반- 순수 생성물을 수득하였다. 27 내지 37%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 23.6㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하여 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3189.8, 실측치 3198.9.

[실시예 44]

Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala^16,17,19, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 62)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 제20회 사이클의 Boc-Nle를 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 43에서와 같이 28회의 커플링 사이클을 수행하여 0.762g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 240㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 150㎎의 반- 순수 생성물을 수득하였다. 22 내지 32%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 55.3㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하여 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3147.7, 실측치 3148.0.

[실시예 45]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 63)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성하였다. 제20회 사이클의 Boc-Ala를 Boc-Nle(231㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 42에서와 같이 28회의 커플링 사이클을 수행하여 0.775g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 203㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 100㎎ 반- 순수 생성물을 수득하였다. 27 내지 37%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 40.0㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3290.8, 실측치 3290.5.

[실시예 46]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala^16,17,19, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 64)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성하였다. 제21회 사이클의 Boc-Ala를 Boc-Glu(OBzl)(337㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 43에서와 같이 28회의 커플링 사이클을 수행하여 0.837g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 178㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 126㎎ 반- 순수 생성물을 수득하였다. 20 내지 30%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 24.9㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하여 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3205.7, 실측치 3205.2.

[실시예 47]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 65)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성하였다. 한 사이클당 각각 Boc-Thr(Bzl)(310㎎, 1.0 밀리몰), Boc-Gly(175㎎, 1.0 밀리몰) 및 Boc-Gly(175㎎, 1.0 밀리몰)을 사용하여 3회의 커플링 사이클을 수행하였다, 제7회 사이클의 Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl)을 Boc-Tyr(2,6-DCB)(440㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시키고 제21회 사이클의 Boc-Asp(OcHx)를 Boc-Glu(O-Bzl)(337㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 37에서와 같이 28회의 커플링 사이클을 수행하여 0.895g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 440㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 120㎎ 반- 순수 생성물을 수득하였다. 25 내지 35%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 27.7㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3506.9, 실측치 3205.8.

[실시예 48]

Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 66)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 제13회 사이클의 Boc-Ala를 Boc-Val(217㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시키고 제26회 사이클의 Boc-Phe를 Boc-p-F-Phe(142㎎, 0.5 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 47에서와 같이 31회의 커플링 사이클을 수행하여 0.754g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 280㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 152㎎의 반- 순수 생성물을 수득하였다. 27 내지 37%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 53.4㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하면 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3553.0, 실측치 3552.2.

[실시예 49]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 67)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 제4회 사이클의 Boc-Thr(Bzl)을 Boc-Lys(2-Cl-Z)(414㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시키고, 제5회 사이클의 Boc-Leu를 Boc-Lys(2-Cl-Z)(414㎎, 1.0 밀리몰)로, 제6회 사이클의 Boc-Val을 Boc-Leu(249㎎, 1.0 밀리몰)로, 제13회 사이클의 Boc-Ala를 Boc-Val(217㎎, 1.0 밀리몰)로, 및 제30회의 사이클의 Boc-Ser(Bzl) (189㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 47에서와 같이 31회의 커플링 사이클을 수행하여 0.838g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 370㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 196㎎ 반- 순수 생성물을 수득하였다. 23 내지 33%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 48.4㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하여 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3575.1, 실측치 3574.0.

[실시예 50]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 68)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성시켰다. 제30회 사이클의 Boc-Ala를 Boc-Ser(295㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 49에서와 같이 31회의 커플링 사이클을 수행하여 0.913g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 378㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 240㎎ 반- 순수 생성물을 수득하였다. 25 내지 35%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 28.8㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하여 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3591.1, 실측치 3590.3.

[실시예 51]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Ala^29-31]-VIP시클로(Lys²¹→Asp²⁵)[Ac-(SEQ ID NO : 69)-NH₂]의 제조

벤즈히드릴아민 수지(0.125g, 0.1 밀리몰, 100∼200 ASTM 메쉬, Bachem)를 실시예 2에서와 같은 프로토콜 1을 사용하여 고상 합성하였다. 제1회 사이클의 Boc-Thr(Bzl)을 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시키고, 제2회 사이클의 Boc-Gly를 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로, 제3회 사이클의 Boc-Gly를 Boc-Ala(189㎎, 1.0 밀리몰)로, 제4회 사이클의 Boc-Thr(Bzl)을 Boc-Lys(2-Cl-Z)(414㎎, 1.0 밀리몰)로, 제5회 사이클의 Boc-Leu를 Boc-Lys(2-Cl-Z)(414㎎, 1.0 밀리몰)로, 제6회 사이클의 Boc-Val을 Boc-Leu(249㎎, 1.0 밀리몰)로, 및 제24회 사이클의 Boc-Glu(OBzl)을 Boc-Asp(OcHx)(315㎎, 1.0 밀리몰)로 치환시킴을 제외하고 실시예 47에서와 같이 31회의 커플링 사이클을 수행하여 0.844g을 수득하였다.

상기 펩티드-수지를 실시예 7에서와 같이 탈보호하여 360㎎의 조 펩티드를 수득하였다. 실시예 3에서와 같이 펩티드를 겔 여과에 의해 정제하여 115㎎ 반- 순수 생성물을 수득하였다. 24 내지 34%의 선형 구배를 실시함을 제외하고 상기 물질을 실시예 3에서와 같이 제조용 HPLC로 더 정제하여 34.7㎎의 백색 무정형 분말을 수득하였다. 화합물은 HPLC에 의하여 균질하였으며, 정확한 아미노산 분석값을 나타내었다. FAB-MS : MH 계산치 3547.1, 실측치 3546.0.

[실시예 52]

VIP 유사체의 기관지 이완 활성

VIP 유사체의 이완 활성을 기니 피그 기관지를 사용하는 모델에서 연구하였다[Wasserman, M.A. et al., in Vasoactive Intestinal Peptide, S.I.Said., ed., Raven Press, N. Y. 1982, pp 177-184]. 우레탄(2g/㎏, 복강내)으로 마취시킨, 400 내지 600g으로 계량된 백색 기니 피크 수컷으로부터 모든 조직을 취하였다. 혈관확장된 후에, 기관지를 떼어내어 4개의 환형 단편(3㎜ 길이)으로 나누었다. 각각의 환을 10㎖의 재킷이 장착된 조직 욕조에서 30게이지의 스테인레스 스틸 와이어로 현탁시킨 후, 장력을 등축 기록하기 위해 4 내지 0의 견사로 그래스(Grass) 힘 거리 변환기(메사추세츠 퀸시 소재의 그레스인스트루먼츠 캄파니(Grass Instruments Co.) 사의 모델 FTO3C)에 부착하였다. 평활근을 하기 조성을 갖는 변형된 크랩스(Krebs) 용액중에서 욕조에 담그었다 : NaCl 120mM ; KCl 4.7mM ; CaCl₂2.5mM ; MaSO₄·7H₂O 1.2mM ; NaHCO₃25mM ; 1가 K₂HPO₄1.2mM ; 및 덱스트로즈 10mM. 조직 욕조는 37℃에서 유지시켰으며 95% O₂및 5% CO₂를 지속적으로 발포시켰다. 반응은 8채널 및 4 채널 휴렛-팩카드(Hewlett-Packard)(각각 모델 7702B 및 7754A) 기록기 (뉴저지 파라무스 소재의 휴렛-팩카드)상에서 기록하였다. 기관지 환을 예비 실험에서 최적 내지 거의 최적인 것으로 측정된 1.5g의 정지 장력하에 놓는다. 뒤이은 60분의 안정화 기간동안 장력의 빈번한 재조정이 필요하였다. 조직을 15분 간격으로 헹구었다.

반로슘(VanRossum)의 방법에 따라 VIP 또는 VIP 유사체의 욕조 농도를 연속적으로 μℓ로 증가시킴으로써 각 조직에 대해 누적 농도 반응 곡선을 수득하였다(Arch. Int. Pharmacodyn., 143, 299~330(1963)]. 단일 조직에 대해서는 단지 1개의 누적 투여량 반응 곡선을 수득하였다. 조직간의 가변성을 최소화하기 위해, 이완 반응은 각 농도 반응 실험 말기에 첨가된 VIP(10^-6M=100%)에 대해 수득된 최대 반응의 %로서 나타내었다.

이들 조직으로부터 수득된 반응을 수집하여 1차 회귀에 의해 EC₅₀값을 측정하였다.

표Ⅰ에 요약된 결과는 천연 VIP에 비해 VIP 유사체의 기관지 이완 활성을 나타낸다.

[실시예 53]

VIP 유사체의 기관지 확장 활성

기니 피그에서 VIP 및 VIP 유사체의 생체내 기관지 확장 활성을 기관지 적하 투여 경로에 의해 조사하였다. 상기 기법에는 400 내지 600g으로 계량되는 기니 피그 수컷(챨스 리버(Charies River)의 하틀리(Hartley) 변종)을 이용하였다. 동물을 우레탄(2g/㎏)으로 복강내에 마취시키고, 정맥내로 약물을 투여하기 위해 폴리에틸렌 캐뉼라를 경정맥내로 삽입하였다.

동물을 기관개구하고 증류수의 투여 용액 또는 증류수에 용해된 시험 화합물을 피펫으로 분기부에 대략 3/4떨어져 기관지에 투여하였다. 투여 용액의 농도는 100㎖의 일정 부피로 유지되도록 조정하였다. 동물을 1분간 반듯이 뒤로 뉘어놓아 약물이 폐로 전달되는 것을 용이하게 하였다. 1분 후에, 숙시닐콜린 클로라이드(1.2㎎/㎏)를 정맥내 투여하여 자발적 호흡을 억제하고, 동물을 40 호흡/분 및 4.0cm³스트로크 용적으로 고정시킨 하바드(Harvard) 모델 608 소 동물 인공호흡기로 인공호흡시켰다. 동물을 최대 수축 용량의 히스타민(50㎎/㎏, 정맥내)으로 자극하고 기관지압(물의 ㎝)을 스태텀(Statham) 압력 변환기(P32AA)로부터 기록하였다.

기관지압의 변화를 적어도 3마리 대조용 및 3마리 약물-치료 동물에 대해 평균내고 억제율%을 계산하였다. 적하경로에 의해 투여된 화합물의 상대 효능을 다양한 용량의 시험 화합물을 투여하고 중간 효과 용량(ED₅₀값)을 계산하여 측정하였다. ED₅₀값은 10%내지 90%의 억제 효과를 유발하는 적어도 3가지 용량에 의해 산출된 대수 용량-반응 곡선으로부터 측정하였다. 각 화합물의 회귀선에 대한 상관 계수는 항상 0.95보다 컸다.

다양한 화합물에 대한 억제 시간 경과과정을 측정하기 위해, 화합물 투여와 히스타민으로 자극한 사이의 시간을 변화시켰다. 활성의 시간 경과 과정은 억제율이 40%로 감소할 때로 계산하였다.

표 Ⅱ에 요약된 결과는 천연 VIP에 비해 VIP 유사체의 생체내 기관지 확장 활성을 나타낸다.

Claims (25)

1. 하기 일반식(Ⅰ)의 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 :

   상기 식에서, R₈은 Asp, Glu 또는 Lys이고; R₁₂는 Arg, Lys, Orn 또는 Asp이고; R₁₇은 Met 또는 Nle이고; R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.
2. 제1항에 있어서, R₁₇이 Nle이고, R₂₆이 Val이고, R₂₈이 Thr인 펩티드.
3. 하기 일반식(Ⅱ)의 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 :

   상기 식에서, R₈은 Asp 또는 Asn이고; R₁₇은 Met 또는 Nle이고; R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.
4. 제3항에 있어서, 상기 펩티드가 Ac-[Asn⁸, Asp⁹, Lys¹², Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP 시클로(Asp⁹→Lys¹²)[Ac-(SEQ ID NO : 22)-NH₂]인 펩티드.
5. 하기 일반식(Ⅲ)의 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 :

   상기 식에서, R₁₇은 Met 또는 Nle이고; R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.
6. 하기 일반식(Ⅳ)의 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 :

   상기 식에서, R₁₂는 Arg 또는 Lys이고; R₁₇은 Met 또는 Nle이고; R₂₆은 Ile 또는 Val이고; R₂₈은 Asn 또는 Thr이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.
7. 하기 일반식(Ⅴ)의 환상 펩티드 또는 그의 약학적으로 허영가능한 염 :

   상기 식에서, R₁은 His, N-CH₃-Ala이고 ; R₂는 Ser 또는 Ala이고 ; R₆은이고; Q는 저급알킬 사이클로헥실 또는 저급 알킬 아릴이고 ; R₈은 Asp, Glu 또는 Ala이고 ; R¹⁰은 Tyr 또는 R₆이고 R₁₂는 Arg 또는 Lys이고 ; R₁₆은 Gln 또는 Ala이고 ; R₁₇은 Met, Nle 또는 Ala이고; R₁₉은 Val 또는 Ala이고; R₂₂은 Tyr 또는 R₆이고; R₂₄은 Asn 또는 Ala이고; R₂₆은 Ile, Val 또는 Leu이고; R₂₇은 Leu 또는 Lys이고; R₂₈은 Asn, Thr 또는 Lys이고; X는 수소 또는 가수분해가능한 아미노 보호 그룹이고; Y는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이거나, 또는 R₂₉-R₃₀-R₃₁-Z이고; R₂₉은 Gly 또는 Ala이고; R₃₀은 Gly 또는 Ala이고; R₃₁은 Ala, Met, Cys(Acm), 또는 Thr이고 ; Z는 하이드록실 또는 가수분해가능한 카복시 보호 그룹이다.
8. 제7항에 있어서, Q가 메틸 사이클로헥실인 환상 펩티드.
9. 제7항에 있어서, Q가 C_1-2알킬 아릴인 환상 펩티드.
10. 제9항에 있어서, Q가 C_1-2알킬 페닐(이때, 페닐 고리는 치환되지 않거나 또는 OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, NO₂, NH₂, N(CH₃)₂, NHCOCH₃, NHCOC₆H₅또는 C(CH₃)₃중에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된다)인 환상 펩티드.
11. 제9항에 있어서, Q가 C_1-2알킬 나프틸(이때, 나프틸 고리는 치환되지 않거나 또는 OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, NO₂, HN₂, N(CH₃)₂, NHCOCH₃, NHCOC₆H₅또는 C(CH₃)₃중에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된다)인 환상 펩티드.
12. 제7항에 있어서, R₂₆이 Val이고, R₂₈이 Thr[X-(SEQ ID NO : 11)-Y]인 펩티드.
13. 제7항에 있어서, R₁₇이 Nle이고, R₂₆이 Val이고, R₂₈이 Thr[X-(SEQ ID NO : 12)-Y]인 펩티드.
14. 제13항에 있어서, R₁₂이 Leu이고, R₁₇이 Ala이고, R₁₉이 Ala이고, R₂₆이 Val이고, R₂₈이 Thr[X-(SEQ ID NO : 13)-Y]인 펩티드
15. 제13항에 있어서, R₁₂이 Lys이고, R₁₇이 Nle이고, R₂₆이 Nle이고, R₂₈이 Thr[X-(SEQ ID NO : 14)-Y]인 펩티드.
16. 제13항에 있어서, R₁₂이 Lys이고, R₁₇이 Nle이고, R₁₉이 Ala이고, R₂₆이 Val이고, R₂₈이 Thr[X-(SEQ ID NO : 15)-Y]인 펩티드.
17. 제7항에 있어서, R₂₆이 Leu이고, R₂₇및 R₂₈이 모두 Lys[X-(SEQ ID NO : 16)-Y]인 펩티드.
18. 제17항에 있어서, R₁₂이 Lys이고, R₁₇이 Ala이고, R₁₉가 Ala이고, R₂₆이 Leu이고, R₂₇및 R₂₈이 모두 Lys[X-(SEQ ID NO : 17)-Y]인 펩티드.
19. 제17항에 있어서, R₁₂이 Lys이고, R₁₇이 Nle이고, R₂₆이 Leu이고, R₂₇및 R₂₈이 모두 Lys[X-(SEQ ID NO : 18)-Y]인 펩티드.
20. 제19항에 있어서, R₁₂이 Lys이고, R₁₇이 Nle이고, R₁₉이 Ala이고, R₂₆이 Leu이고, R₂₇및 R₂₈이 모두 Lys[X-(SEQ ID NO : 19)-Y]인 펩티드.
21. 제20항에 있어서, R₁₂이 Lys이고, R₁₆이 Gln이고, R₁₇이 Nle이고, R₁₉이 Ala이고, R₂₆이 Leu이고, R₂₇및 R₂₈이 모두 Lys[X-(SEQ ID NO : 70)-Y]인 펩티드.
22. 제21항에 있어서, R₂이 Ser이고, R₁₂이 Lys이고, R₁₆이 Gln이고, R₁₇이 Nle이고, R₁₉가 Ala이고, R₂₆이 Leu이고, R₂₇및 R₂₈이 모두 Lys[X-(SEQ ID NO : 71)-Y]인 펩티드.
23. 제22항에 있어서, 상기 펩티드가 Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP 시클로(Lys²¹→Asp|²⁵)[Ac-(SEQID NO : 52)-NH₂]인 펩티드.
24. 제21항에 있어서, R₂이 Ala이고, R₁₂이 Lys이고, R₁₆이 Gln이고, R₁₇이 Nle이고, R₁₉가 Ala이고, R₂₆이 Leu이고, R₂₇및 R₂₈이 모두 Lys[X-(SEQ ID NO : 72)-Y]인 펩티드.
25. 제20항에 있어서, R₁₂이 Lys이고, R₁₆이 Ala이고, R₁₇이 Nle이고, R₁₉가 Ala이고, R₂₆이 Leu이고, R₂₇및 R₂₈모두 Lys[X-(SEQ ID NO : 73)-Y]인 펩티드.