CN114652817A - 用于治疗肌肉疾病和病症的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗肌肉疾病和病症的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗肌肉疾病和病症的方法和组合物。本发明提供通过施用稳定、长效的血管活性肠肽治疗剂治疗肌肉肌病的方法，所述肌肉肌病包括肌营养不良和心肌病。这些作用剂包括一种或多种弹性蛋白样肽且可以低剂量施用。

Description

用于治疗肌肉疾病和病症的方法和组合物
本申请是申请日为2016年2月9日、中国申请号为201680020418.6、发明名称为“用于治疗肌肉疾病和病症的方法和组合物”的发明申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2015年2月9日提交的美国临时申请号62/113,943、2015年4月10日提交的美国临时申请号62/145,770和2015年4月21日提交的62/150,679的权益，其每一篇的内容此处通过提述以其整体并入。
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此处电子提交的文本文件内容在本文通过提述以其整体并入：序列表的计算机可读形式拷贝(文件名:PHAS_032/04WO__SeqList_ST25.txt，记录日期：2016年2月9日，文件大小32千字节)。
背景技术
杜氏和贝克肌营养不良症(DMD和BMD)代表人中最常见的神经肌肉疾病，依赖于研究群体其在出生的男性中发生率为1/6000至1/3500(Bushby等人(2010))。DMD和BMD是肌营养不良蛋白基因中的突变导致的等位基因病症。在DMD中，功能性的肌营养不良蛋白在肌肉中完全不存在，在BMD中尽管存在一定的肌营养不良蛋白，但数量对于正常肌肉功能是不足的。除骨骼肌无力，心肌中的肌营养不良蛋白缺陷还导致进行性心肌病。
目前，不存在批准的特异性治疗DMD/BMD的疗法。高剂量皮质类固醇经常用于治疗肌无力和尽可能地维持行走，但其涉及不可接受的副作用和/或不良响应。这些治疗剂是否帮助或阻碍心脏功能也尚不明确。需要其他治疗方式以治疗肌营养不良的骨骼和心脏异常二者。
发明概述
本发明提供长效的血管活性肠肽(VIP)疗法以治疗、延迟、预防或改善肌肉疾病。肌病肌肉在反复收缩的过程中受到损伤，但由于其缺乏适当自身修复的能力，肌肉发展出缺陷如纤维化病变。这些缺陷经常通过损伤肌肉收缩的能力抑制肌肉功能。预防、延迟或改善这些缺陷的形成可治疗患者中的肌肉肌病。本文公开的VIP治疗剂还可在具有肌肉肌病的患者中改善心脏功能。
一些方面，本发明提供用于治疗肌肉疾病的方法，其包括对有需要的患者施用含有血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的药物组合物。
一些方面，本发明提供在有需要的患者中用于防范肌肉收缩诱导的损伤的方法，其包括施用含有血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的药物组合物。
一些方面，本发明提供用于减缓心肌病进展的方法，其包括对有需要的患者施用含有血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的药物组合物。
一些方面，本发明提供用于治疗心肌病的方法，其包括对有需要的患者施用含有血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的药物组合物。
一些方面，所述药物组合物包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
本发明还包括如下项：
1.用于治疗肌肉肌病的方法，其包括对有需要的患者施用包含血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的药物组合物。
2.用于在有需要的患者中预防肌肉收缩诱导的损伤的方法，其包括施用含有血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的药物组合物。
3.用于减缓心肌病进展的方法，其包括对有需要的患者施用含有血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的药物组合物。
4.用于治疗心肌病的方法，其包括对有需要的患者施用含有血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的药物组合物。
5.项1-4任一项的方法，其中所述药物组合物减少肌肉纤维化。
6.上述项任一项的方法，其中所述ELP包含SEQ ID NO:1-13任一项的重复单元，或其组合。
7.上述项任一项的方法，其中所述ELP包含VPGXG(SEQ ID NO:3)的重复单元。
8.项7的方法，其中所述ELP包含VPGXG的120个重复单元，其中X独立选自Val、Ala和Gly。
9.项8的方法，其中X以约5:2:3的比率独立选自Val、Ala和Gly。
10.项1-4任一项的方法，其中相比于对VPAC1，所述VIP肽对VPAC2具有相对结合偏好。
11.项1-4任一项的方法，其中所述药物组合物经配制用于皮下、肌内或静脉内施用。
12.项11的方法，其中所述药物组合物通过皮下施用。
13.项1-4任一项的方法，其中所述药物组合物以低剂量施用。
14.项13的方法，其中所述剂量为0.1mg/kg每日至10mg/kg每日。
15.项1-4任一项的方法，其中所述药物组合物每日施用。
16.项1-4任一项的方法，其中所述药物组合物每周施用1-3次。
17.项1-4任一项的方法，其中所述药物组合物每周施用。
18.项1-4任一项的方法，其中所述药物组合物每月施用1-2次。
19.项5的方法，其中相比未治疗的患者所述肌肉纤维化减少约5％、10％、20％、30％、40％或50％。
20.项5的方法，其中相比未治疗的患者，所述肌肉纤维化延迟约1个月、6个月、1年或5年。
21.项1-4任一项的方法，其中肌肉收缩性在所述患者中保持。
22.项21的方法，其中相比健康受试者，所述肌肉收缩性在所述患者中以约90％、80％、70％、60％或50％保持。
23.项1-4任一项的方法，其中肌肉强度在所述患者中保持。
24.项23的方法，其中相比健康受试者，所述肌肉强度在所述患者中以约90％、80％、70％、60％或50％保持。
25.项19-24任一项的方法，其中所述肌肉是骨骼肌。
26.项19-24任一项的方法，其中所述肌肉是心肌。
27.项1-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌细胞，所述药物组合物使肌细胞保持缩短。
28.项1-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌细胞，所述药物组合物使肌细胞保持再伸长速度。
29.项1-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌细胞，所述药物组合物使肌细胞保持收缩性。
30.项1-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌细胞，所述药物组合物使肌细胞保持松弛。
31.项27-30任一项的方法，其中所述肌细胞是心肌细胞。
32.项27-30任一项的方法，其中所述肌细胞是骨骼肌肌细胞。
33.项1-4任一项的方法，其中所述患者具有肌营养不良症。
34.项33的方法，其中所述肌营养不良症选自下组：强直性肌营养不良症、杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、肢带肌营养不良症、面肩胛臂肌营养不良症、先天性肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、末梢肌营养不良症和艾-德肌营养不良。
35.项1-4任一项的方法，其中所述患者具有炎症性肌病。
36.项35的方法，其中所述炎症性肌病选自下组：多发性肌炎、皮肌炎和包涵体肌炎。
37.项3-4任一项的方法，其中所述心肌病由肌营养不良症导致。
38.项37的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症或X-连锁扩张型心肌病。
39.项1-4任一项的方法，其中所述药物组合物包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:20。
40.项39的方法，其中所述药物组合物皮下施用至受试者。
41.项40的方法，其中所述药物组合物每月1-2次施用至受试者。
42.项41的方法，其中所述药物组合物以低剂量施用。
43.项42的方法，其中所述药物组合物以1mg/kg每日至9mg/kg每日的剂量施用。
44.项43的方法，其中所述受试者具有肌营养不良症。
45.项44的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症或X-连锁扩张型心肌病。
46.项45的方法，其中所述受试者具有心肌病。
47.项1-4任一项的方法，其中包含血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的所述药物组合物经配制用于持续释放。
48.项3-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，施用所述药物组合物保持缩短分数。
49.项48的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，所述缩短分数保持约20％-50％。
50.项3-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，施用所述药物组合物增加心室充盈速度。
51.项50的方法，其中相比未治疗的肌病受试者，所述心室充盈速度增加约10-50％。
52.项3-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，施用所述药物组合物升高压力上升的最大速率。
53.项52的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，所述压力的最大速率升高约20％至约50％。
54.项3-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，施用所述药物组合物增加松弛的Tau常数。
55.项54的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，所述松弛的Tau常数增加约10％至约50％。
56.项1-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，施用所述药物组合物减少肌肉中的胶原含量。
57.项56的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，所述肌肉中的胶原含量减少约20％至约50％。
58.项1-4任一项的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，施用所述药物组合物减少肌肉中的免疫细胞计数。
59.项58的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞。
60.项59的方法，其中相比于未治疗的肌病受试者，所述肌肉中巨噬细胞的计数减少约20-50％。
61.项56-60任一项的方法，其中所述肌肉是腓肠肌、股四头肌、隔膜肌、胫骨前肌和/或心肌。
62.用于治疗肌肉肌病的方法，其包括对有需要的患者施用包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的药物组合物。
63.用于预防肌肉收缩诱导的损伤的方法，其包括对有需要的受试者施用含有SEQID NO:15的氨基酸序列的药物组合物。
64.用于减缓心肌病进展的方法，其包括对有需要的受试者施用含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的药物组合物。
65.用于治疗心肌病的方法，其包括对有需要的患者施用含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的药物组合物。
66.项62-65任一项的方法，其中所述药物组合物减少肌肉纤维化。
附图简述
图1A-B显示经由超声心动图监测的心脏功能：n＝10-11，*P<0.05vs对照。小图A显示MDX(肌营养不良蛋白缺陷型小鼠)中的分数面积缩短。小图B显示MDX小鼠中的E/A比率。PB1046治疗在治疗的32周后保持分数面积缩短。在mdx和双敲除小鼠中心肌病发展前施用PB1046保持QRS的持续时间，并减缓mdx小鼠中心脏功能的恶化(分数面积缩短和E/A比率)。
图2A-E显示终端步骤中MDX小鼠左心室功能的体内评估。n＝4-5(MDX)且n＝2(DKO)，*P<0.05vs对照。mdx和双敲除治疗的动物都显示保持的dP/dtmax(收缩)和更快的Tau(松弛)。
图3A-B显示从MDX小鼠分离的趾长伸肌中骨骼肌生理评估的结果。n＝4-16。相比未治疗的小鼠，使用PB1046治疗维持偏心收缩，表明治疗组中的肌肉对收缩诱导的损伤更耐受。
图4A-C显示使用天狼星红染色(Sirius Red staining)测量的MDX小鼠中的胶原含量(小图A-B)。巨噬细胞的识别经由免疫组化确定(小图C)n＝4-7，*P<0.05vs对照。如通过胶原沉积所确定，纤维化程度在骨骼肌(腓肠肌)和心肌中都减少。
发明详述
可能影响骨骼肌和心肌的肌肉肌病是其中肌肉纤维不再正确发挥功能的病症，其导致肌肉无力，肌肉无力可使肌肉萎缩、瘫痪，甚至死亡。心脏功能障碍是多种肌肉肌病的常见表现，且是具有这些病况的个体的常见死因。
经常，在遗传性肌病如肌营养不良中，患者在肌营养不良蛋白基因中呈现突变。肌营养不良蛋白基因在肌肉收缩中起结构和调节两种作用。肌营养不良蛋白是较大的跨膜复合物肌营养不良蛋白糖蛋白复合物(DGC)(Lapidos等人(2004))的一部分，其不存在会直接影响收缩性。在许多肌肉疾病患者(例如杜氏或贝克肌营养不良症或肌营养不良蛋白相关心肌病)中，肌营养不良蛋白蛋白可完全不存在或仅发挥部分功能。肌营养不良蛋白不存在增加细胞内的钙并导致一氧化氮的过量产生，其触发蛋白降解、纤维化、坏死、巨噬细胞活化并最终导致骨骼肌和心肌病(Townsend等人(2011)；Judge等人(2011))。
在心肌细胞中，这些病理后果部分由钙渗透性的增加和增加的肌细胞钙浓度介导，其随后初始级联事件，包括肌细胞内炎症细胞因子的表达和炎症细胞对肌细胞坏死的响应(Zhou等人(2010)；Klinger等人(2012))。此外，细胞内环鸟苷酸单磷酸(cGMP)信号通路的破坏直接促使肌肉功能丧失(Lapidos等人(2004))；Townsend等人(2011)；Byers等人(1991))。
除对肌肉功能的直接影响，肌营养不良蛋白的丧失和一氧化氮合酶活性的相应变化导致线粒体和代谢压力，其刺激细胞因子的产生和细胞凋亡。这些事件导致肌肉质量的进一步丧失，肌肉功能的丧失和最终的纤维化。具体而言，心肌细胞压力增加IL-6和TGF-β的产生，其刺激成纤维细胞、胶原合成和巨噬细胞浸润，其全部促使纤维化增加。
在健康肌肉中，急性组织损伤后，浸润性炎症细胞和固有的干细胞恢复组织动态平衡。然而，在长期组织损伤过程如肌营养不良症中，炎症细胞浸润和成纤维细胞活化持续，而干细胞(例如卫星细胞)的修复能力减弱。在多种营养不良症中，肌肉经历与慢性炎症相关的纤维降解的恒定循环。在DMD中，负责修复肌肉损伤的卫星细胞群体随时间枯竭或其丧失介导修复的能力，且肌肉组织逐渐由脂肪和纤维组织替代。肌营养不良症中肌肉组织的纤维化和丧失都减少运动和收缩功能。
肌纤维化是肌肉纤维间疤痕组织纤维带的过度形成。尽管纤维化可在任何器官中发展，但骨骼肌纤维化和心肌纤维化是仅有的已知的肌肉纤维化。纤维疤痕组织在肌肉已损伤后发展以填补损伤肌肉中的开放空间，为与其粘附的再生肌肉纤维提供更多表面积。包含疤痕组织的结缔组织细胞不能收缩和松弛以允许运动。一旦纤维疤痕组织开始过度产生，肌肉逐渐变弱。
血管活性肠肽(VIP)在纤维化发展中起作用。除其他活性外，VIP通过VPAC1和VPAC2受体发挥作用以增加cAMP和cGMP的水平。重要的是，在鼠类巨噬细胞中，VIP已显示减少TGF-β(DMD中心脏纤维化的重要调节因子)的产生(Ameen等人(2010)；Burks等人(2011)；Bujak等人(2007))。VIP还刺激抑制肌营养不良症中的肌肉炎症和损伤的调节性T细胞(Treg)(Villata等人(2014))。
本发明提供通过施用稳定、长效的血管活性肠肽(VIP)治疗剂在肌病患者中预防、延迟或改善症状发作(包括肌肉纤维化的发展)的方法。
血管活性肠肽
血管活性肠肽(VIP)是结合VPAC1和VPAC2两种受体的神经肽。VIP及其功能和结构相关类似物已知具有多种生理功能，包括平滑肌松弛(支气管扩张，肠蠕动)和多种免疫功能的调节(抗炎症，免疫细胞保护)(Hinkle等人(2005))。
成熟的VIP具有28个氨基酸残基，其具有如下序列：HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN(SEQ ID NO:17)。VIP来自于170个氨基酸前体分子前原VIP(prepro-VIP)的加工。VIP的结构和示例性的类似物已描述于美国专利4,835,252、4,939,224、5,141,924、4,734,400、4,605,641、6,080,837、6,316,593、5,677,419、5,972,883、6,489,297、7,094,755和6,608,174。
在一些方面中，本发明提供可包含一种或多种VIP肽、变体或类似物的治疗组合物。在一些实施方案中，VIP肽是变体。在一些实施方案中，VIP肽是类似物。在一些实施方案中，VIP肽是成熟的VIP(例如SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，VIP肽相比成熟的VIP(例如SEQ ID NO:17)是经修饰的。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP(例如SEQID NO:17)是变体。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP(例如SEQ ID NO:17)是功能性变体。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP(例如SEQ ID NO:17)是功能性类似物。
在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP的氨基酸序列(例如SEQ IDNO:17)包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，相比成熟VIP的氨基酸序列(SEQID NO:17)取代了1-20个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP氨基酸序列(SEQ ID NO:17)包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸取代。
在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP氨基酸序列(SEQ ID NO:17)包含一个或多个氨基酸缺失。在一些实施方案中，相比成熟的VIP氨基酸序列(SEQ ID NO:17)缺失了1-20个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP氨基酸序列(SEQID NO:17)具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸缺失。在一些实施方案中，相比成熟的VIP氨基酸序列(SEQ ID NO:17)在任一末端缺失1-10个氨基酸。在一些实施方案中，相比成熟的VIP氨基酸序列(SEQ ID NO:17)在两末端都缺失了1-10个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽的氨基酸序列与成熟的VIP氨基酸序列(SEQ ID NO:17)至少约70％相同。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽的氨基酸序列与成熟的VIP氨基酸序列(SEQ ID NO:17)约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％或约97％相同。百分比同一性可使用能够在http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得的比对程序ClustalW2计算。以下默认参数可用于配对比对：蛋白重量矩阵＝BLOSUM62，缺口开放＝10；缺口延伸＝0.1。
多方面中，本发明提供相比成熟的VIP(即SEQ ID NO:17)对VPAC2或VPAC1具有相对受体偏好的经修饰的VIP肽。例如，经修饰的VIP肽对VPAC2可具有超过VPAC1至少约2:1、约5:1、约10:1、约25:1、约50:1、约100:1、约500:1或更多的相对结合偏好。在其他实施方案中，经修饰的VIP肽对VPAC1可具有超过VPAC2至少约2:1、约5:1、约10:1、约25:1、约50:1、约100:1、约500:1或更多的相对结合偏好。例如，在一些实施方案中，经修饰的VIP肽以成熟人VIP(SEQ ID NO:17)约2-4倍内的EC50活化VPAC2受体。然而，在一些实施方案中，在活化VPAC1受体中，该相同的经修饰的VIP肽比成熟、未修饰的人VIP肽(SEQ ID NO:17)效力少50或100倍或更多。
在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP(SEQ ID NO:17)包含其他氨基酸残基。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽相比成熟的VIP(SEQ ID NO:17)包含在N-和/或C-末端添加的一个或多个氨基酸。这种经修饰的VIP肽可包含经修饰的N末端区，如向VIP的N-末端组氨酸添加1至约500个氨基酸，所添加的氨基酸可包含异源哺乳动物(例如非人)的氨基酸序列。添加至VIP的N末端的额外序列可以是任何序列，包括1至约100、1至约50、1至约20、1至约10和1至约5个氨基酸的生物活性和生物惰性序列。例如，经修饰的VIP可在成熟VIP的天然N末端组氨酸的N末端包含单独的甲硫氨酸。尽管甲硫氨酸有时可由细菌表达系统中的甲硫氨酸氨肽酶(MA)去除，但对于MA组氨酸(H)是在位置2最不利的残基。在一些实施方案中，经修饰的VIP肽是SEQ ID NO:14。这种包含N-末端甲硫氨酸的经修饰的VIP肽可在大肠杆菌或其他细菌或酵母表达系统中制备，这是因为当相邻的氨基酸为组氨酸时，甲硫氨酸将不会由大肠杆菌去除。或者，N-末端氨基酸可以是任何天然存在的氨基酸，即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和脯氨酸。在其他实施方案中，VIP肽可由肽酶或蛋白酶活化，如内源肽酶或蛋白酶。这种可活化的序列描述于例如国际申请号PCT/US2009/068656。如本文使用，术语“肽酶”和“蛋白酶”可以互换。例如，VIP肽可经设计由二肽基肽酶活化。示例性的二肽基肽酶包括二肽基肽酶-1(DPP-I)、二肽基肽酶-3(DPP-III)、二肽基肽酶-4(DPP-IV)、二肽基肽酶-6(DPP-VI)、二肽基肽酶-7(DPP-VII)、二肽基肽酶-8(DPP-VIII)、二肽基肽酶-9(DPP-IX)、二肽基肽酶-10(DPP-X)。这些二肽酶的底物序列是已知的。
在一些实施方案中，可活化的VIP肽的N末端可具有结构Z-N，其中Z是二肽酶的底物(例如，Z由二肽酶的暴露去除)，且N是VIP的N末端。可活化的VIP肽可具有式M-X-N的N末端序列，其中M是甲硫氨酸，X是Pro、Ala或Ser，且N是VIP或VIP类似物的N末端。在这种方式中，M和X将对宿主细胞(例如大肠杆菌)和/或随后的二肽酶(例如DPP-IV)敏感并由其去除。或者，可活化的VIP的N末端序列可以是X1-X2-N，其中X1是Gly、Ala、Ser、Cys、Thr、Val或Pro；X2是Pro、Ala或Ser；且N是VIP的N-末端。X1-X2是二肽酶(例如DPP-IV)的底物，且二肽酶消化将暴露N，其为VIP或VIP类似物预期的N-末端。在这样的实施方案中，VIP肽可通过在宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达编码M-X1-X2-N(其中M是甲硫氨酸)的构建体产生，因为在第二位置的Gly、Ala、Ser、Cys、Thr、Val或Pro将传递去除Met的信号，由此将X1-X2留在N-末端，其在体内可由二肽酶(例如DPP-IV)活化。在一些实施方案中，肽酶可存在于机体中且注射后可作用于可活化的VIP肽。在一些实施方案中，可活化的VIP肽相比成熟的VIP(例如SEQID NO:17)包含添加在N-末端的氨基酸序列MAA。在一些实施方案中，可活化的VIP肽是SEQID NO:18。
在其他实施方案中，经修饰的可活化VIP肽的N-末端具有结构M-Z-N，其中M是甲硫氨酸，Z是二肽酶的底物(例如Z由二肽酶的暴露去除)，且N是可活化VIP的非His的N末端。例如，经修饰的可活化VIP肽可具有式M-X-N的N末端序列，其中M是甲硫氨酸；X是Pro、Ala或Ser；且N是可活化VIP的非His的N末端。在这种方式中，M和X将对宿主细胞(例如大肠杆菌)和/或随后的二肽酶(例如DPP-IV)敏感并由其去除。或者，可活化的VIP肽的N末端序列可以是X1-X2-N，其中X1是Gly、Ala、Ser、Cys、Thr、Val或Pro；X2是Pro、Ala或Ser；且N是可活化VIP的非His的N末端。X1-X2是二肽酶(例如DPP-IV)的底物，且二肽酶消化将暴露N，其为VIP合意的非His的N末端。
在其他实施方案中，可活化VIP肽的N末端具有结构M-Z-S-N，其中M是甲硫氨酸；Z是二肽酶的底物(例如Z由二肽酶的暴露去除)；N是成熟的VIP的N末端(His)；且S是二肽酶消化后将暴露的一个或多个氨基酸，且其如之前所述提供可活化的VIP。例如，可活化的VIP肽可具有式M-X-S-N的N末端序列，其中M是甲硫氨酸，X是Pro、Ala或Ser；N是成熟的VIP(例如SEQ ID NO:17)的N末端；且S是二肽酶消化后将暴露的一个或多个氨基酸，且将提供受体偏好。或者，可活化VIP肽的N末端序列可以是X1-X2-S-N，其中X1是Gly、Ala、Ser、Cys、Thr、Val或Pro；X2是Pro、Ala或Ser；N是VIP的非His的N末端；且S是二肽酶消化后将暴露的一个或多个氨基酸。X1-X2是二肽酶(例如DPP-IV)的底物，且二肽酶消化将暴露S。
在其他实施方案中，VIP肽通过与哺乳动物异源蛋白的融合修饰，如对于延长治疗性分子的半衰期有效的哺乳动物蛋白。这样的序列可以是哺乳动物序列，如白蛋白、转铁蛋白或抗体Fc序列。这样的序列描述于美国专利号7,238,667(特别是对于白蛋白融合物)、美国专利号7,176,278(特别是对于转铁蛋白融合物)和美国专利号5,766,883。在一些实施方案中，VIP肽通过在N末端与哺乳动物异源蛋白融合修饰。在一些实施方案中，VIP通过在C末端与哺乳动物异源蛋白融合修饰。在一些实施方案中，VIP通过在N末端和C末端都与哺乳动物异源蛋白融合修饰。
在一些实施方案中，对VIP肽N末端的N末端化学修饰提供受体偏好。蛋白的化学修饰及其方法为本领域已知。非限制性的示例性化学修饰为聚乙二醇化(PEGylation)、甲基乙醛酸化、还原烷基化、过甲酸氧化、琥珀酰化、氨基乙基化和脂质化(Clifton,NewProtein Techniques,New Jersey:Humana Press,1985.ISBX.0-89603-126-8.Volume.3of.Methods in Molecular Biology)。化学基团如聚乙二醇化可附接之前已描述的半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、羧基修饰(参见Lundblad,Techniques in Protein Modification,CRC Press,1995)。
在其他实施方案中，VIP肽通过与包含重复氨基酸序列的蛋白的融合修饰，如包含脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的序列(例如PASylation(Schlapschy,M.等人(2013))或XTEN序列(Schellenberger,V.等人(2009))。
弹性蛋白样肽
一些方面，本发明提供包含血管活性肠肽和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的治疗性组合物。在一些实施方案中，VIP肽和一种或多种ELP融合在一起。在一些实施方案中，VIP肽和一种或多种ELP作为重组的融合多肽产生。在一些实施方案中，治疗性组合物包含作为单独的分子的血管活性肠肽和一种或多种ELP。在其他实施方案中，组合物包含作为单独的分子的VIP-ELP融合蛋白和ELP。在一些实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，所述组合物包含SEQID NO:16。
ELP序列包含与弹性蛋白相关或为弹性蛋白模拟物的结构性肽单元或序列。ELP序列由3至约20个氨基酸的结构单元构建，或在一些实施方案中，由4-10个氨基酸如4个、5个或6个氨基酸的结构单元构建。单个结构单元的长度可以是变化的或可以是均匀的。例如，结构单元包括由SEQ ID NO:1-13限定的单元，其可作为重复结构单元采用，包括串联重复单元，或可以一些组合采用。因此，ELP包含选自SEQ ID NO:1-13的基本结构单元。
在一些实施方案中，ELP单元的氨基酸序列为约1至约500个结构单元，或在一些实施方案中为约9至约200个结构单元，或在一些实施方案中，为约10至约200个结构单元，或在一些实施方案中为约50至约200个结构单元，或在一些实施方案中为约80至约200个结构单元，或约80至约150个结构单元，如由SEQ ID NO:1-13限定的单元之一或组合。因此，结构单元可统一具有约50至约2000个氨基酸残基的长度，或约100至约800个氨基酸残基的长度，或约200至约700个氨基酸残基的长度，或约400至约600个氨基酸残基的长度。在示例性的实施方案中，ELP结构性单元的氨基酸序列包含约3个结构单元、约7个结构单元、约9个结构单元、约10个结构单元、约15个结构单元、约20个结构单元、约40个结构单元、约80个结构单元、约90个结构单元、约100个结构单元、约120个结构单元、约140个结构单元、约144个结构单元、约160个结构单元、约180个结构单元、约200个结构单元或约500个结构单元。在示例性的实施方案中，结构单元可统一具有约45个氨基酸残基的长度、约90个氨基酸残基的长度、约100个氨基酸残基的长度、约200个氨基酸残基的长度、约300个氨基酸残基的长度、约400个氨基酸残基的长度、约500个氨基酸残基的长度、约600个氨基酸残基的长度、约700个氨基酸残基的长度、约720个氨基酸残基的长度、约800个氨基酸残基的长度或约1000个氨基酸残基的长度。
使用经选择的制剂ELP氨基酸序列可呈现可见和可逆的逆相变。也就是说，ELP氨基酸序列在低于转变温度(Tt)的制剂中可以是结构上无序且高度可溶的，但当制剂温度升高超过Tt时呈现急剧的(2-3℃范围)无序至有序相变。除温度外，氨基酸聚合物的长度、氨基酸组成、离子强度、pH、压力、温度、所选溶剂、有机溶质的存在和蛋白浓度也可影响转变的性质，且为了合意的吸收概貌可在溶剂中对这些进行调整。吸收概貌可通过确定活性剂随时间的血浆浓度和活性容易地测试。
在一些实施方案中，ELP组分可由多肽结构单元(例如四肽、五肽、六肽、八肽或九肽)形成，其包括但不限于：
(a)四肽Val-Pro-Gly-Gly,或VPGG(SEQ ID NO:1)；
(b)四肽Ile-Pro-Gly-Gly,或IPGG(SEQ ID NO:2)；
(c)五肽Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO:3)或VPGXG，其中X是任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合物或低聚重复中变化；
(d)五肽Ala-Val-Gly-Val-Pro或AVGVP(SEQ ID NO:4)；
(e)五肽Ile-Pro-Gly-X-Gly或IPGXG(SEQ ID NO:5)，其中X是任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合物或低聚重复中变化；
(e)五肽Ile-Pro-Gly-Val-Gly或IPGVG(SEQ ID NO:6)；
(f)五肽Leu-Pro-Gly-X-Gly或LPGXG(SEQ ID NO:7)，其中X是任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合物或低聚重复中变化；
(g)五肽Leu-Pro-Gly-Val-Gly或LPGVG(SEQ ID NO:8)；
(h)六肽Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly或VAPGVG(SEQ ID NO:9)；
(i)八肽Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly或GVGVPGVG(SEQ ID NO:10)；
(j)九肽Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly或VPGFGVGAG(SEQ ID NO:11)；
(k)九肽Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly或VPGVGVPGG(SEQ ID NO:12)；和
(l)五肽Xaa-Pro-Gly-Val-Gly或XPGVG(SEQ ID NO:13)，其中X是任何天然或非天然的氨基酸残基，且其中X任选在聚合物或低聚重复中变化。
如SEQ ID NO:1-13中定义的多肽结构单元形成弹性蛋白样肽组件，或可组合使用以形成ELP。在一些实施方案中，ELP包含多于一个结构单元。在一些实施方案中，ELP包含SEQ ID NO:1-13的任两个或多个结构单元，其可以任何方式组合。在一些实施方案中，所述的两个或多个结构单元是相同且串联重复的。在一些实施方案中，所述的两个或多个结构单元是不同且交替重复的。在一些实施方案中，ELP包含序列的一个或多个部分串联重复的结构单元，以及序列的其他部分交替重复的不同结构的单元。在一些实施方案中，ELP组件完全(或几乎完全)由选自SEQ ID NO:1-13的结构单元之一或组合(例如2、3或4个)形成。在其他实施方案中，至少75％或至少80％或至少90％的ELP组件由选自SEQ ID NO:1-13的结构单元之一或组合形成。在一些实施方案中，ELP包含重复单元，所述重复单元含有Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO:3)的串联重复单元，其中X如上文定义，且其中采用的Val-Pro-Gly-X-Gly单元的百分比对于整个ELP组件(其可包含除VPGXG外的结构单元)大于ELP的约50％，或大于约75％，或大于约85％，或大于约95％。ELP可包含SEQ ID NO:3的5-15个结构单元(例如约10个结构单元)的基序，其中客体残基(guest residue)X在基序中至少2个或至少3个单元中不同。客体残基可独立地选自如非极性或疏水残基，如氨基酸V、I、L、A、G和W(且可经选择进而保留合意的逆相变性质)。在一些实施方案中，客体残基选自V、G和A。在一些实施方案中，ELP包含ELP 1系列(VPGXG:V5A2G3)。在一些实施方案中，ELP包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，ELP包含ELP 4系列(VPGXG:V-5)。在一些实施方案中，ELP包含ELP1和ELP4系列的组合。不受理论所限，ELP聚合物疏水性的差异由客体残基和其比率确定，其中ELP 4系列比ELP1系列更疏水。
在一些实施方案中，ELP是ELP-1系列，其包含[VPGXG]m，其中m是1-200的任何数，每个X选自V、G和A，且其中所述V:G:A的比率可以为约5:3:2。在一些实施方案中，ELP包含[VPGXG]90，其中每个X选自V、G和A，且其中所述V:G:A的比率可以为约5:3:2。在一些实施方案中，ELP包含[VPGXG]120，其中每个X选自V、G和A，且其中所述V:G:A的比率可以为约5:3:2。
在一些实施方案中，ELP包含[VPGXG]144，其中每个X选自V、G和A，且其中所述V:G:A的比率可以为约7:2:0。在一些实施方案中，ELP包含[VPGXG]144，其中每个X选自V、G和A，且其中所述V:G:A的比率可以为约7:0:2。在一些实施方案中，ELP包含[VPGXG]144，其中每个X选自V、G和A，且其中所述V:G:A的比率可以为约6:0:3。在一些实施方案中，ELP包含[VPGXG]144，其中每个X选自V、G和A，且其中所述V:G:A的比率可以为约5:2:2。
在一些实施方案中，ELP包含[XPGVG]m，其中m是1-200的任何数，每个X选自V、G和A。在一些实施方案中，ELP包含[XPGVG]144，其中m是1-200的任何数，每个X选自V、G和A且其中V:G:A的比率为约5:0:4。在一些实施方案中，ELP包含[XPGVG]144，其中每个X选自V、G和A且其中V:G:A的比率为约5:0:4。
或者，ELP是包含[VPGVG]90或[VPGVG]120的ELP-4系列。该ELP的120个结构单元可以在约37℃为约0.005至约0.05mg/ml(例如约0.01mg/ml)的蛋白提供转变温度。或者，ELP包含[VPGXG]144或[XPGVG]144。例如，这些ELP的144个结构单元可提供约28℃至35℃的转变温度。
在一些实施方案中，ELP包含重复单元，所述重复单元包括Xaa-Pro-Gly-Val-Gly(SEQ ID NO:13)的串联重复单元，其中X如上文定义，且其中Xaa-Pro-Gly-Val-Gly单元相对于完整ELP组件(其可包括除XPGVG外的结构单元)所占百分比大于约ELP的约50％，或大于约75％，或大于约85％，或大于约95％。ELP可包含SEQ ID NO:13的5-15个结构单元(例如约9个结构单元)的基序，其中客体残基X在所述基序中的至少2个或至少3个单元间变化。客体残基可独立地选自如非极性或疏水残基，如氨基酸V、I、L、A、G和W(且可经选择进而保留合意的逆相变性质)。在一些实施方案中，客体残基选自V和A。
在一些实施方案中，ELP包含重复单元，所述重复单元包含SEQ ID NO:1-13中任一项单独或组合的串联重复单元。在一个实施方案中，ELP包含SEQ ID NO:1-13中任两项或多项组合的重复。在一些实施方案中，ELP包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:13的重复。在一些实施方案中，ELP包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:13的重复，其中所述客体残基独立地选自如非极性或疏水残基，如氨基酸V、I、L、A、G和W(且经选择进而保留合意的逆相变性质)。在一些实施方案中，客体残基选自V和A。在一些实施方案中，ELP包含含有五个本文公开的五肽拷贝的9聚体。在一些实施方案中，ELP包含含有SEQ ID NO:3和13任意组合的9聚体。在一些实施方案中，ELP包含SEQ ID NO：3和13间交替的序列。在一些实施方案中，ELP包含含有9个本文公开的一个或多个ELP结构单元的拷贝的9聚体。在一些实施方案中，ELP包含含有9个本文公开的五肽拷贝的9聚体。在一些实施方案中，ELP包含SEQ ID NO:3和13任意组合的9聚体。在一些实施方案中，ELP包含SEQ ID NO:3和13间交替的序列。不同数目的9聚体的ELP的可经组合以产生具有例如18、27、36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、126、135、144、153、162、171或180个9聚体拷贝的ELP。在一些实施方案中，ELP包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ELP包含含有SEQ ID NO:3的9聚体，其中所述客体残基选自V、G和A。在一些实施方案中，ELP包含含有SEQ ID NO:3的9聚体，其中V、G和A的比率为7:2:0(α)。在一些实施方案中，ELP包含含有SEQ ID NO:3的9聚体，其中V、G和A的比率为7:0:2(βv1)。在一些实施方案中，ELP包含含有SEQ ID NO:3的9聚体，其中V、G和A的比率为6:0:3(βv2)。在一些实施方案中，ELP包含含有SEQ ID NO:3的9聚体，其中V、G和A的比率为5:2:2(γ)。在一些实施方案中，ELP包含含有SEQ ID NO:13的9聚体，其中客体残基选自V、G和A。在一些实施方案中，ELP包含含有SEQ ID NO:13的9聚体，其中V、G和A的比率为5:0:4(δ)。
在一些实施方案中，ELP包含α、βv1、βv2和/或δ9聚体的组合。例如，γELP通过16个α9聚体和βv1 9聚体间交替的拷贝直至构建144聚体来构建。在一些实施方案中，ELP包含α和βv1 9聚体的组合。在一些实施方案中，ELP包含α和βv2 9聚体的组合。在一些实施方案中，ELP包含α和δ9聚体的组合。在一些实施方案中，ELP包含βv1和βv2 9聚体的组合。在一些实施方案中，ELP包含βv1和δ9聚体的组合。在一些实施方案中，ELP包含βv2和δ9聚体的组合。在一些实施方案中，ELP包含α、βv1和βv2 9聚体的组合。在一些实施方案中，ELP包含α、βv1和δ9聚体的组合。在一些实施方案中，ELP包含α、βv2和δ9聚体的组合。例如，在具体的排列中，ELPβv2在结构单元中可包含以下述序列迭代的下列客体残基：A-V-A-V-V-A-V-A-V。ELP中迭代的序列可顺序重复约10次、约15次、约16次、约20次、约25次、约30次或约35次或更多次。一些方面，ELP包含约10至约20个迭代的序列。其他方面，ELP包含约15至20个迭代的序列。一些方面，ELP包含约16个迭代的序列。
在一些实施方案中，ELP包含含有10拷贝本文公开的一种或多种ELP结构单元的10聚体。在一些实施方案中，ELP包含含有10拷贝本文公开的五肽的10聚体。在一些实施方案中，ELP包含含有任意组合的SEQ ID NO:3和13的10聚体，在一些实施方案中，ELP包含SEQID NO:3和13间交替的序列。不同数目的10聚体ELP可经组合以产生具有例如20、30、40、60、90、100、120、150、160或200拷贝的10聚体的ELP。
在一些实施方案中，ELP可形成β-转弯结构。适于产生β-转弯结构的示例性的肽序列描述于国际专利申请PCT/US96/05186中。例如，可改变序列VPGXG中的第4个残基(X)而不消除β-转弯的形成。
示例性的ELP结构可使用符号ELPk[XiYj-n]进行描述，其中k指特定的ELP重复单元，括号的大写字母是单字母氨基酸代码且其对应的下标指每个客体残基X在结构单元中的相对比率(如适用)，且n以结构重复的数目描述ELP的总长度。例如，ELP1[V5A2G3-10]指包含10个五肽VPGXG重复单元的ELP组件，其中X为相对比率约5:2:3的缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；ELP1[K1V2F1-4]指含有4个五肽VPGXG重复单元的ELP组件，其中X是相对比率约1:2:1的赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；ELP1[K1V7F1-9]指包含9个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X是相对比率约1:7:1的赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；ELP1[V-5]指包含5个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X是缬氨酸；ELP1[V-20]指包含20个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X是缬氨酸；ELP2[5]指包含5个五肽AVGVP重复单元的多肽(SEQ ID NO:4)，ELP3[V-5]指包含5个五肽IPGXG重复单元的多肽(SEQ ID NO:5)，其中X是缬氨酸；ELP4[V-5]指包含5个五肽LPGXG重复单元的多肽(SEQ ID NO:7)，其中X是缬氨酸。
对于ELP，Tt是客体残基疏水性的函数。因此，通过改变客体残基的同一性和其摩尔分数，可合成ELP，其在很宽的范围呈现逆转换。因此，给定ELP长度的Tt可通过在ELP序列中并入较大分数的疏水客体残基减少。适当的疏水客体残基的实例包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。也可使用中度疏水的酪氨酸。反过来，Tt可通过并入如选自下述的那些残基增加：谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺。
对于具有>100,000Da分子量的多肽，PCT/US96/05186中公开的疏水性量度提供了用于预测特定ELP序列近似Tt的一种方式。对于具有<100,000Da分子量的多肽，Tt可通过下述二次函数预测或确定：Tt＝M0+M1X+M2X2，其中X是融合蛋白的MW，且M0＝116.21；M1＝-1.7499；M2＝0.010349。
在一些实施方案中，选择或设计ELP以在配制条件提供范围为约10至约37℃的Tt，如约20至约37℃，或约25至约37℃。在一些实施方案中，考虑到周边温度略低，生理条件(例如0.9％盐水)下的转变温度为约34至36℃。
弹性蛋白样-肽(ELP)蛋白聚合物和重组融合蛋白可如美国专利公开号2010/0022455中所述制备。在一些实施方案中，ELP通过递归连接构建以在大范围的分子量下迅速克隆任何序列和指定长度的高度重复多肽。在单个循环中，将各含有寡聚体拷贝的亲本质粒的两半连接在一起，由此使寡聚物二聚化并重构功能性质粒。该过程递归进行以组装具有所需数目的重复序列的寡聚基因。例如，将一个ELP结构亚基(例如五肽或五肽的9聚体)插入载体中。消化载体，并插入另一ELP结构单元(例如五肽或五肽的9聚体)。每次随后的消化和连接循环使包含在所得载体中的ELP结构单元的数目增加一倍，直到ELP聚合物为所需长度。
在其他实施方案中，ELP包括无规卷曲或非球形延伸结构。例如，ELP包括美国专利公开号2008/0286808、WIPO专利公开号2008/155134和美国专利公开号2011/0123487中公开的氨基酸序列。
例如，在一些实施方案中ELP氨基酸序列包括至少40个氨基酸的非结构性重组聚合物。例如，可定义非结构性聚合物，其中非结构性聚合物中包含的甘氨酸(G)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸酯(E)和脯氨酸(P)的总和构成总氨基酸中的大于约80％。在一些实施方案中，至少50％的氨基酸缺乏二级结构，如由Chou-Fasman算法确定。非结构性聚合物包括超过约100、150、200或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸序列形成无规卷曲结构域。特别是，具有或形成“无规卷曲构象”的多肽或氨基酸聚合物基本上缺乏限定的二级和三级结构。
在多个实施方案中，预期受试者是人，且体温为约37℃，因此治疗剂经设计以在该温度或该温度附近提供持续释放(例如约28℃至约37℃间)。即使体温保持恒定，随着产物在注射部位扩散，进入到循环中的具有氢键和/或疏水相互作用逆转的缓慢释放由浓度的下降驱动。在其他实施方案中，受试者是非人哺乳动物，并且治疗剂经设计以在哺乳动物的体温(在一些实施方案中可以为约30至约40℃，如对于一些驯养宠物(例如狗或猫)或家畜(例如牛、马、羊或猪))显示持续释放。一般而言，Tt高于制剂的储存条件(其可以为约2℃至约30℃，或约10℃至约25℃，或约15℃至约22℃，或约2℃至约8℃)，进而治疗剂保留在注射用溶液中。或者，治疗剂可以冷冻储存，例如在约-80℃至约-20℃。
在一些实施方案中，ELP可以提供在27℃至36℃范围内的转变温度。在一些实施方案中，ELP可以提供在28℃至35℃范围内的转变温度。在一些实施方案中，ELP可以提供在29℃至34℃范围内的转变温度。在一些实施方案中，ELP可以提供在27℃至33℃范围内的转变温度。在一些实施方案中，ELP可提供30℃至33℃范围内的转变温度。在一些实施方案中，ELP可提供31℃至31℃范围内的转变温度。在一些实施方案中，ELP可以提供27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或36℃的转换温度。在一些实施方案中，在110mMNaCl中蛋白浓度为10mg/mL时，ELP可提供在28℃至35℃范围内的转变温度。
在一些实施方案中，通过递归连接构建ELP蛋白聚合物以在大范围的分子量下快速克隆编码任何序列和指定长度的高度重复多肽的DNA。在单个循环中，将各含有寡聚体拷贝的亲本质粒的两半连接在一起，由此使寡聚物二聚化并重构功能性质粒。该过程递归进行以组装具有所需数目的重复序列的寡聚基因。例如，将一个ELP结构亚基(例如五肽或五肽的9聚体)插入载体中。消化载体，并插入另一ELP结构单元(例如五肽或五肽的9聚体)。每次随后的消化和连接循环使包含在所得载体中的ELP结构单元的数目增加一倍，直到ELP聚合物为所需长度。通过改变初始结构单元中五肽的数量，可以容易地构建不同长度的ELP。可以使用替代的构建方式(即除了递归连接之外的方式)来产生替代长度的ELP。
在一些实施方案中，载体含有一个或多个另外的氨基酸或ELP结构单元重复。例如，该载体可以向在客体位置具有缬氨酸的ELP的N末端添加额外的五聚体重复序列，并且向在客体基中具有色氨酸的C末端添加额外的五聚体。色氨酸可用作增加分子消光系数的方式，其允许更好地例如在280nm测量吸光度，这可用于确定蛋白浓度或在纯化的过程中用于监测蛋白含量。加入任一末端的五聚体也可以经设计进而编码DNA含有限制酶识别位点用于将融合配偶体克隆到ELP编码序列任一末端上。
在一些实施方案中，治疗组合物包含活性剂和一种或多种ELP。在一些实施方案中，治疗组合物包含在N-或C-末端具有一个或多个ELP的活性剂。在一些实施方案中，治疗组合物包含在N-或C-末端都具有一个或多个ELP的活性剂。在一些实施方案中，ELP的大小大致相同。在一些实施方案中，ELP的大小不同。在一些实施方案中，一个末端的ELP大于另一个末端的ELP。在一些实施方案中，N-末端的ELP大于C-末端的ELP。在一些实施方案中，C-末端的ELP大于N-末端的ELP。
肌病和治疗方法
肌病是神经肌肉疾病，其中肌纤维由于许多原因中的任何一种不起作用，导致肌肉无力。在表型上，这些疾病的特征在于肌肉组织的炎症、骨骼肌的萎缩、肌肉丧失和可通过呼吸和心脏衰竭而引起过早死亡的纤维化。肌肉肌病可影响任何类型的肌肉，包括骨骼肌、心肌和/或平滑肌。在一些实施方案中，肌病的特征在于肌纤维化增加。在一些实施方案中，肌病的特征在于肌肉力量和/或收缩力降低。在一些实施方案中，肌病的特征在于肌细胞缩短减少。在一些实施方案中，肌病的特征在于肌细胞再伸长速度下降。在一些实施方案中，肌病的特征在于肌细胞松弛减少。在一些实施方案中，肌细胞是骨骼肌肌细胞。在一些实施方案中，肌细胞是心肌肌细胞。
一些方面，本公开提供治疗肌肉肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。本公开提供预防肌肉肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。本公开提供延迟肌肉肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本公开提供了减缓肌肉肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本公开提供了改善肌肉肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。
可以通过本文公开的药物组合物治疗、预防、延迟或改善的肌病的类型包括但不限于肌营养不良、肌强直、神经肌肉瘤、先天性肌病(例如纤维状肌病(nemalinemyopathy)、多/微核肌病、中央核肌病)、线粒体肌病、家族性周期性麻痹、炎症性肌病、代谢性肌病(例如糖原贮积症、脂质贮积症)；获得性肌病(例如药物诱导的肌病、糖皮质激素肌病、酒精性肌病)、皮肌炎、多发性肌炎、包涵体肌炎、骨化性肌炎、横纹肌溶解症和肌红蛋白尿。
可以由本文公开的药物组合物治疗、预防、延迟或改善的肌营养不良症的类型包括但不限于BMD(贝克肌营养不良症)、DMD(杜氏肌营养不良症)、强直性营养不良、LGMD(肢带肌营养不良症)、眼咽型肌营养不良症、先天性肌营养不良症、远端肌营养不良症、Landouzy-Dejerine肌营养不良症、Emery-Dreifuss肌营养不良症和面肩肱型肌营养不良症。
心肌病是心肌收缩能力的可测量恶化，其导致心力衰竭。疾病随时间进展，具有心律失常和心室功能障碍的可变发作。可以在疾病早期发现心电图异常并随年龄进展。心肌病发展的特征在于初始舒张功能障碍，随后是偏心性肥大。
一些方面，本公开提供了治疗心肌病的方法，其括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本公开提供预防心肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本公开提供延迟心肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本公开提供减缓心肌病进展的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本公开提供改善心肌病的方法，其包括向有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。
可通过本文公开的药物组合物治疗、预防、延迟或改善的心肌病的类型包括但不限于遗传心肌病(例如肥厚大心肌病(HCM或HOCM)；致心律失常性右心室心肌病(ARVC)；孤立性心室致密化不全；线粒体肌病)，扩张性心肌病(DCM)、限制性心肌病(RCM)、获得性心肌病(例如围产期心肌病(peripartum cardiomyopathy)；Takotsubo心肌病；洛氏心内膜炎(Loeffler endocarditis))、代谢/贮存性心肌病(例如淀粉样变性病、血色素沉着症)、炎症性心肌病(例如"病毒性心肌炎"；由查加斯病(Chagas disease)引起的心肌病)、内分泌心肌病(例如糖尿病心肌病；由甲状腺功能亢进引起的心肌病；肢端肥大症)、由毒性引起的心肌病(例如化疗心肌病、酒精性心肌病)、X-连锁扩张型心肌病和/或神经肌肉性心肌病(例如肌营养不良症)。在一些优选的实施方案中，心肌病由肌营养不良症导致。在一些实施方案中，心肌病由杜氏肌营养不良症导致。在一些实施方案中，心肌病由贝克肌营养不良症导致。
心肌病症状的治疗、预防、延迟或改善可通过本领域已知的任何方式测量。例如，评估可包括超声心动图评估、心脏磁共振成像(MRI)、具有晚期钆增强的心脏MRI。具体而言，可评估LV大小、厚度、体积、EF和心肌的瘢痕/炎症负荷以及应变。应变、LV尺寸和体积的变化以及瘢痕负担是关键的测量。
肌病症状的治疗、预防、延迟或改善可通过本领域已知的任何方式测量。例如，用于评估具有肌病的患者的测试包括但不限于具有同工酶的肌酸激酶(CK)水平、电解质水平、钙和镁、血清肌红蛋白水平、血清肌酐和血尿素氮水平、尿分析(例如在显微镜评估上具有很少红细胞的阳性尿分析所指示的肌红蛋白尿、全血细胞计数、红细胞沉降率、甲状腺功能测试、天冬氨酸氨基转移酶水平、心电图、抗核抗体水平、肌电图、磁共振成像和/或肌肉活检。本文公开的药物组合物的施用效果可在任何相关的肌肉中测量，包括但不限于骨骼肌、心肌、腓肠肌、股四头肌、隔膜肌肉和/或胫骨前肌。
一些方面，本发明提供预防心脏恶化的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。一些方面，本发明提供延迟心脏恶化的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。一些方面，本发明提供减缓心脏恶化进展的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。一些方面，本发明提供改善心脏恶化的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者中的心脏恶化，心脏恶化被预防、延迟或改善达约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者中的心脏恶化，心脏恶化被预防、延迟或改善约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％,或约90％。在一些实施方案中，在本文公开的时间点观察到心脏恶化的预防、延迟或改善。例如，在第32周心脏恶化可延迟约20％。在一些实施方案中，心脏恶化为收缩性的减少。在一些实施方案中，心脏恶化为松弛性的减少。在一些实施方案中，心脏恶化为心脏肌肉增厚。在一些实施方案中，心脏恶化是心脏肥大。
在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者，施用本文公开的药物组合物改善受试者中的心脏功能。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者的心脏功能，心脏功能改善达约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者的心脏功能，心脏功能改善约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一些实施方案中，在本文公开的时间点观察到心脏功能的改善。在一些实施方案中，心脏改善是收缩性的增加。在一些实施方案中，心脏改善是松弛性的增加。在一些实施方案中，心脏改善是相比心肌病受试者心脏肌肉较少的增厚。在一些实施方案中，心脏改善是相比心肌病受试者较少的心脏肥大。
一些方面，本发明提供预防发展纤维化的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。一些方面，本发明提供延迟纤维化发展的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。一些方面，本发明提供减缓纤维化进展的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。一些方面，本发明提供改善纤维化发展的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者中纤维化的发展，纤维化的发展被预防、延迟或改善达约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者中纤维化的发展，纤维化的发展被预防、延迟或改善约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一些实施方案中，在本文公开的时间点观察到纤维化的预防、延迟或改善。在一些实施方案中，使用组织学技术在活组织检查中测量纤维化(例如苏木精和伊红(HE)和三色染色)，其中纤维化可通过确定存在的胶原比总组织面积的百分比评估。
一些方面，本发明提供减少胶原产生的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。一些方面，本发明提供延迟胶原产生的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。一些方面，本发明提供改善胶原产生的方法，其包括将血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者中胶原的产生，胶原的产生被减少、延迟或改善约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年或约10年。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者中胶原的产生，胶原的产生被减少、延迟或改善约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一些实施方案中，在本文公开的时间点观察到该胶原产生的减少、延迟或改善。例如，在第32周在肌病患者中产生的胶原的量可减少约25％。
在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物保持受试者中的肌肉收缩性和/或收缩力。在一些实施方案中，肌肉收缩性和/或收缩力维持在健康受试者肌肉收缩性和/或收缩力的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，相比健康受试者的肌肉收缩性和/或收缩力，施用本文公开的药物组合物使受试者中的肌肉收缩性和/或收缩力保持约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，在本文公开的时间点保持受试者中肌肉收缩性和/或收缩力的程度。健康受试者定义为未患肌营养不良症或其他肌肉萎缩疾病或病症的受试者。
在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物保持受试者中的肌肉力量。在一些实施方案中，肌肉力量保持在健康受试者肌肉力量的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，相比健康受试者的肌肉力量，施用本文公开的药物组合物保持受试者中的肌肉力量达约1周、约1个月、约2个月约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，在本文公开的时间点维持受试者中肌肉力量的程度。肌肉功能可在受试者整体水平、在器官水平和/或肌细胞水平测量。骨骼肌强度可通过本领域已知的任何方式测量，且例如，通过徒手肌肉测试和/或使用测力计。心肌强度可通过本领域已知的任何方式测量，且例如通过使用心电图、超声心动图、磁共振成像(MRI)、压力容积评估(例如射血分数、缩短分数、舒张末期容积(EDV)、收缩末期容积(ESV)、每搏输出量(SV)、心肌应变、舒张末期压力(EDP)、收缩末期压力(ESP))。例如，在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者，施用药物组合物保留分数面积缩短。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者，施用药物组合物保留射血分数。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者，施用药物组合物增加心室充盈速度。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者，施用药物组合物升高压力上升的最大速率。在其他实施方案中，相比未治疗的肌病受试者，施用药物组合物增加松弛的Tau常数。
在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物预防、延迟或改善受试者中收缩诱导的肌肉损伤。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者，施用本文公开的药物组合物预防、延迟或改善约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％和/或约95％的收缩诱导的肌肉损伤。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者，施用本文公开的药物组合物预防、延迟或改善受试者中收缩诱导的肌肉损伤达约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，在本文公开的时间点在受试者中观察到预防、延迟或改善收缩诱导的肌肉损伤的程度。例如，施用本文公开的药物组合物在第10周可减少25％收缩诱导的肌肉损伤。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物预防、延迟或改善受试者中收缩诱导的肌肉损伤而不改变肌肉比力。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物在受试者中预防收缩诱导的肌肉损伤、延迟收缩诱导的肌肉损伤的进展或改善收缩诱导的肌肉损伤并改善肌肉比力。
在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物保持肌细胞功能。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物保持肌细胞缩短、肌细胞再伸长、松弛和/或肌细胞收缩性。在一些实施方案中，肌细胞缩短、肌细胞再伸长、松弛和/或肌细胞收缩性保持在约健康受试者中肌细胞缩短、肌细胞再伸长、松弛和/或肌细胞收缩性的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％和/或约99％。在一些实施方案中，相比健康受试者中的肌细胞缩短、肌细胞再伸长、松弛和/或肌细胞收缩性，施用本文公开的药物组合物在受试者中保持肌细胞缩短、肌细胞再伸长、松弛和/或肌细胞收缩性达约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，在本文公开的时间点在受试者中观察到保持肌细胞缩短、肌细胞再伸长、松弛和/或肌细胞收缩性的程度。肌细胞功能可通过任何本领域已知的方式测定，包括例如测量与功能和/或损伤相关的生物标记物，和/或直接测试肌细胞。在一些实施方案中，肌细胞是骨骼肌细胞。在一些实施方案中，肌细胞是心肌细胞。
在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物影响肌肉中的免疫细胞计数。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物减少肌肉中的免疫细胞计数。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物减少肌肉中的巨噬细胞计数。在一些实施方案中，免疫细胞计数减少未治疗的肌病受试者肌肉中免疫细胞计数的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者肌肉中的免疫细胞计数，施用本文公开的药物组合物减少受试者肌肉中免疫细胞计数达约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，在本文公开的时间点观察到受试者肌肉中免疫细胞计数的这种减少。例如，施用本文公开的药物组合物在第32周可减少肌肉中免疫细胞计数的约25％。
一些方面，本发明提供预防炎症的方法，其包括对有需要的患者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本发明提供延迟炎症的方法，其包括对有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本发明提供减缓炎症进展的方法，其包括对有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本发明提供改善炎症的方法，其包括对有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。一些方面，本发明提供减少炎症的方法，其包括对有需要的受试者施用血管活性肠肽和一种或多种ELP的药物组合物。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者中的炎症，炎症被预防、延迟、减少或改善达约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约1年、约2年、约5年和/或约10年。在一些实施方案中，相比未治疗的肌病受试者中的炎症，炎症被预防、延迟、减少或改善约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一些实施方案中，在本文公开的时间点观察到炎症的预防、延迟、减少或改善。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物通过抑制促炎细胞因子的表达或活性预防、延迟、减少或改善炎症。在一些实施方案中，促炎细胞因子是任何促炎细胞因子，其包括但不限于OPN,LTβ4、TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)和可溶性肿瘤坏死因子-α受体(sTNFR)。
药物组合物及施用
本发明提供包含血管活性肠肽和一种或多种ELP以及一种或多种药物上可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
本发明提供包含本文公开的治疗剂和一种或多种药物上可接受的赋形剂和/或稀释剂的持续释放制剂。例如，这样的赋形剂包括盐、和可作用以稳定氢键的其他赋形剂。可使用任何本领域已知的适当的赋形剂。示例性的赋形剂包括但不限于氨基酸如组氨酸、甘氨酸或精氨酸；甘油；糖如蔗糖；表面活性剂如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；柠檬酸；柠檬酸钠；抗氧化剂；盐包括碱土金属盐如钠、钾和钙；抗衡离子如氯化物和磷酸盐；防腐剂；糖醇(例如甘露醇、山梨糖醇)和缓冲剂。示例性的盐包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物具有增强的效力、生物利用度、治疗半衰期、持久性、抗降解性等。
在一些实施方案中，制剂可包含约5mM组氨酸至约100mM组氨酸。在一些实施方案中，制剂可包含约50mM组氨酸、约40mM组氨酸、约30mM组氨酸、约25mM组氨酸、约20mM组氨酸或约15mM组氨酸。在一些实施方案中，制剂可包含约10mM氯化钠至约200mM氯化钠。在一些实施方案中，制剂包含约20mM氯化钠、约40mM氯化钠、约60mM氯化钠、约75mM氯化钠、约100mM氯化钠、约120mM氯化钠或约150mM氯化钠。在一些实施方案中，制剂可包含约10mM组氨酸至约30mM组氨酸和约60mM氯化钠至约80mM氯化钠。在一些实施方案中，制剂可包含约20mM组氨酸和约75mM氯化钠。
药物组合物在足以允许在体温(例如37℃或在一些实施方案中在34至36℃)形成基质的pH、离子强度配制和一般性使用的赋形剂。一般性制备药物组合物进而其在贮存条件不形成基质。制剂可冷冻、冷藏或室温贮存。贮存条件可低于冰点，如低于约-10℃或低于约-20℃或低于约-40℃或低于约-70℃。贮存条件一般低于制剂的转变温度，如低于约32℃，或低于约30℃，或低于约27℃，或低于约25℃或低于约20℃，或低于约15℃。在一些实施方案中，制剂贮存在2°-8℃。例如，制剂可以与血液等渗或具有模拟生理条件的离子强度。例如，制剂可具有下述离子强度：至少25mM氯化钠的离子强度、至少30mM氯化钠的离子强度、至少40mM氯化钠的离子强度、至少50mM氯化钠的离子强度、至少75mM氯化钠的离子强度或至少100mM氯化钠的离子强度或至少150mM氯化钠的离子强度。在一些实施方案中，制剂具有的离子强度等同于0.9％盐水(154mM氯化钠)的离子强度。
在一些实施方案中，在生理pH配制制剂。在一些实施方案中，在约5.5至约8.5的pH范围配制制剂。在一些实施方案中，在约6.0至约8.0的pH范围配制制剂。在一些实施方案中，在约6.5至约7.5的pH范围配制制剂。在一些实施方案中，在7.5的pH配制制剂。在一些实施方案中，相比在较高的pH的制剂，具有较低pH的制剂表现出改善的制剂稳定性。在一些实施方案中，相比在较低的pH的制剂，具有较高pH的制剂表现出改善的制剂稳定性。
在一些实施方案中，制剂在贮存条件是稳定的。稳定性可使用本领域任何适当的方式测量。一般而言，稳定的制剂是降解产物或杂质的增加少于5％的那些。在一些实施方案中，制剂在贮存条件稳定达至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约一年或至少约2年或更久。在一些实施方案中，制剂在25℃稳定达至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月或至少约一年或更久。
制剂中的蛋白浓度经调整以使凝聚物在施用温度形成。例如，较高的蛋白浓度帮助驱动凝聚物形成，且出于该目的所需的蛋白浓度取决于使用的ELP系列而不同。例如，在使用ELP1-120或具有相当的转换温度的ELP的一些实施方案中，蛋白以约1mg/mL至约200mg/mL的范围存在，或以约5mg/mL至约125mg/mL的范围存在。在使用ELP4-120或具有相当的转换温度的氨基酸序列的实施方案中，蛋白以约0.005mg/mL至约10mg/mL的范围存在，或以约0.01mg/mL至约5mg/mL的范围存在。
在示例性的实施方案中，本发明提供持续释放的药物组合物，其包含本文公开的血管活性肠肽(例如具有N末端部分如甲硫氨酸)和一种或多种含有[VPGXG]90、[VPGXG]120、[VPGXG]160或[VPGXG]180的氨基酸序列，其中每个X选自V、G和A。V、G和A可以约5:3:2、约7:2:0、约7:0:2、约6:0:3或约5:2:2的比率存在。或者，氨基酸序列包含[VPGVG]90或[VPGVG]120。在示例性的实施方案中，本文提供持续释放的药物组合物，其包含血管活性肠肽或其衍生物(例如具有N-末端部分如甲硫氨酸)和一种或多种含有[XPGVG]144的氨基酸序列，其中每个X选自V、G和A。V、G和A可以约5:0:4的比率存在。或者，氨基酸序列含有[XPGVG]144。制剂进一步包含一种或多种药物上可接受的赋形剂和/或稀释剂用于当施用至人受试者时从水性形式形成可逆基质。VIP及其衍生物公开于美国专利公开号2011/0178017。
另一方面，本文提供用于递送本文公开的血管活性肠肽的持续释放的配方的方法。所述方法包括将本文所述的药物组合物施用至有需要的受试者，其中所述药物组合物每月施用约1至约8次。在一些实施方案中，药物组合物每月施用约1次、约2次、约3次和/或约4次。在一些实施方案中，药物组合物每周施用。在一些实施方案中，药物组合物每日施用。在一些实施方案中，药物组合物每周施用1至3次。在一些实施方案中，药物组合物每两周施用一次。在一些实施方案中，药物组合物每月施用1至2次。在具体的实施方案中，药物组合物每月施用约1次。在一些实施方案中，药物组合物每2个月施用约1次、每3个月施用约1次、每4个月施用约1次、每5个月施用约1次和/或每6个月施用约1次。在一些实施方案中，VIP在N末端可具有额外部分如甲硫氨酸以改变受体结合概貌，如美国专利公开号2011/0178017中所述。在一些实施方案中，VIP与ELP1(具有约90至约180个ELP单元)融合。在一些实施方案中，VIP与ELP4(具有约(具有约90至约180个ELP单元)融合。在一些实施方案中，VIP与ELPβv2(具有约90至约180个ELP单元)融合。药物组合物可以预填充笔或注射器的形式包装用于每周1次、每周2次、或每月1-8次施用，或可替换地填充在常规小瓶等中。
有利的是，组合物由于活性剂的持续释放提供延长的药代动力学暴露。在特定方面，最大暴露水平可在施用后约10小时、约24小时、约48小时或约72小时实现；通常最大暴露水平在施用后约10小时至约48小时间实现。实现最大暴露水平后，组合物可实现持续的释放水平，由此在一段时间内获得相当大百分比的最大水平。例如，持续水平可以为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。用于保持持续速率的示例性时间段为实现最大暴露速率后约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约4周、约6周或约8周。随后，持续水平可降低至减少的暴露水平。这种减少的暴露速率可以为约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％或约60％。
在一些实施方案中，长期施用本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物达约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年或更久。药物组合物可以本文公开的任何所需剂量和/或频率施用。
在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物直至肌病症状改善。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物直至肌病症状改善。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物直至肌病症状延迟。在一些实施方案中，施用本文公开的药物组合物直至肌病症状痊愈。
在一些实施方案中，在患者开始呈现一种或多种肌病症状前施用本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，在肌病症状发作时施用本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，在患者开始呈现心肌病前施用本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，在心肌病症状发作时施用本文公开的药物组合物。
在一些实施方案中，将药物组合物施用至确定具有肌肉萎缩的受试者。在一些实施方案中，将药物组合物施用至确定具有肌肉肌病的受试者。在一些实施方案中，相比非肌病受试者，确定受试者血液中具有增加水平的肌肉蛋白循环。在一些实施方案中，相比非肌病受试者，确定受试者血液中具有增加水平的肌酸激酶(CK)循环。在一些实施方案中，相比非肌病受试者，确定受试者血液中具有增加水平的乳酸脱氢酶(LDH)循环。在一些实施方案中，相比非肌病受试者，确定受试者血液中具有增加水平的丙酮酸激酶(PK)循环。肌肉蛋白水平可使用血清酶测试确定。
在一些实施方案中，确定受试者在尿液中具有改变水平的电解质。在一些实施方案中，相比非肌病受试者，确定受试者在尿液中具有增加水平的钙。在一些实施方案中，相比非肌病受试者，确定受试者在尿液中具有增加水平的镁。尿电解质水平可使用尿测试确定。
在一些实施方案中，将药物组合物施用至确定具有炎症肌病的受试者。在一些实施方案中，相比非肌病受试者，确定受试者在血液中具有增加水平的抗体循环。在一些实施方案中，相比非肌病受试者，确定受试者在血液中具有增加水平的肌炎相关抗体循环。在一些实施方案中，肌炎相关抗体包括但不限于Jo-1、PL-7、Pl-12、EK、OJ、KS、Zo和Ha。在一些实施方案中，肌炎相关抗体结合抗原，所述抗原包括但不限于由抗体Jo-1、PL-7、Pl-12、EK、OJ、KS、Zo和Ha结合的那些。在一些实施方案中，抗体包括但不限于SRP、Mi-2、PMS1、P155、p140、CADM-140、MJ(p140)、MU、SAE、核心蛋白聚糖、KU、KJ、HMGCR、Mup44、皮层蛋白、核孔、FHL1、PM-Scl、56kD、SSA/ro、U1-nRNP、U2-NRNP、Fer、MAS和线粒体。在一些实施方案中，抗体结合抗原，所述抗原包括但不限于由SRP、Mi-2、PMS1、P155、p140、CADM-140、MJ(p140)、MU、SAE、核心蛋白聚糖、KU、KJ、HMGCR、Mup44、皮层蛋白、核孔、FHL1、PM-Scl、56kD、SSA/ro、U1-nRNP、U2-NRNP、Fer、MAS和线粒体抗体结合的那些。
在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有异常的超声心动图。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者在心脏性能上具有变化。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有增加的P-R间隔。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有增加的U波。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有宽QRS。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有非特异性ST-T变化。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有窦性心律失常。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者在心前区具有深Q波和升高的R波。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有异常强直收缩(TC)。在一些实施方案中，强直收缩来自钙失调期，其表现为持续的离子驱动的肌细胞收缩，导致显示左心室“未充盈”的超声心动图(Su等人(2015)。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有心律失常。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有窦性心动过速。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有收缩功能障碍。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有舒张功能障碍。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有降低的二尖瓣收缩波速度。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有壁运动异常。心脏功能和/或特征可使用心电图测量。
在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有增加的促炎细胞因子的表达。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有增加的促炎细胞因子活性。在一些实施方案中，促炎细胞因子是任何促炎细胞因子，其包括但不限于OPN、LTβ4、TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)和可溶性肿瘤坏死因子-α受体(sTNFR)。受试者中促炎细胞因子的表达或活性可通过细胞因子测定测量。
在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有减少的nNOS蛋白表达。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有减少的nNOS活性。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者具有改变的nNOS蛋白积累。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者在骨骼肌细胞质中具有增加的nNOS蛋白积累。在一些实施方案中，相比非心肌病受试者，确定受试者在骨骼肌肌膜中具有减少的nNOS蛋白积累。蛋白积累可通过组织学技术测定。蛋白表达可通过免疫沉淀技术测定。蛋白活性可通过NOS催化测定测量。
药物组合物一般用于“系统性递送”，其意为作用剂不会局部递送至病理性位点或作用位点。取而代之的是，作用剂从注射位点吸收入血流，其中作用剂系统性作用或经由循环转运至作用位点。治疗剂可通过任何已知的途径施用，如例如口服、静脉内、肌内、鼻内、皮下、阴道内和直肠内。在一个实施方案中，制剂一般用于皮下施用。在一个实施方案中，当作用剂皮下施用时，将延长药代动力学(PK)参数。在一个实施方案中，融合蛋白的半衰期延长。在一个实施方案中，相比通过其他方式(例如静脉内)施用作用剂，当皮下施用作用剂时将延长PK参数。在一个实施方案中，相比通过其他方式(例如静脉内)施用作用剂，当皮下施用作用剂时将延长作用剂的储存。
在一些实施方案中，大致每月施用制剂，且可皮下或肌内施用。在一些实施方案中，大致每周施用制剂，且可皮下或肌内施用。在一些实施方案中，施用位点并非病理位点，例如并非意向治疗的位点。
在多个实施方案中，在多次施用的过程中(如至少2次、至少约5次、至少约10次施用制剂)，活性剂的血浆浓度改变不超过约10倍、约5倍或约3倍。施用基本上均匀分布，如例如约每日，或约每周一次，或每月1次至5次，或约每2个月1次，或约每3个月1次。
本文公开的药物组合物相比未融合或未偶联的对应物可以较小剂量和/或较少频率施用。尽管本领域的技术人员可确定每个病例中合意的剂量，但治疗剂用于实现治疗益处的适当剂量可以在例如1微克(μg)至约100毫克(mg)每千克接受者的体重每日的范围，优选在约10μg至约50mg每千克体重每日的范围，且最优选在约100μg至约10mg每千克体重每日的范围。在一些实施方案中，以低剂量施用药物组合物。在一些实施方案中，以1mg每千克体重每日至约9mg每千克体重每日间的剂量施用药物组合物。在一些实施方案中，以约1mg每千克体重每日、约3mg每千克体重每日和/或约9mg每千克体重每日施用药物组合物。合意的剂量可以表示为贯穿整日以适当时间间隔施用的一个剂量或两个或多个亚剂量。这些亚剂量可以单位剂型施用，例如含有约10μg至约1000mg，优选约50μg至约500mg，且最优选约50μg至约250mg活性剂的每单位剂型。或者，如果接受者的病况十分需要，则剂量可以作为连续输注施用。
在一些实施方案中，受试者是人，但在其他实施方案中可以是非人哺乳动物，如驯养宠物(例如狗或猫)，或牲畜或农场动物(例如马、牛、羊或猪)。
组合疗法
本文公开的组合物可与用于治疗、预防、延迟或改善肌病、肌营养不良和/或心肌病的多种疗法施用，所述疗法包括但不限于物理疗法、呼吸疗法、言语疗法、职业疗法、矫正手术和/或治疗剂。本文公开的药物组合物可单独使用或与一种或多种治疗剂组合使用。所述一种或多种治疗剂可以是任何对有需要的受试者发挥治疗效果的化合物、分子或物质。
所述一种或多种治疗剂可作为单独的药物组合物或混合在单一药物组合物中“共同施用”，即以协调的方式共同施用至受试者。通过“共同施用”，所述一种或多种治疗剂也可以与本发明的药物组合物同时施用，或者分开施用，包括在不同时间以不同的频率施用。所述一种或多种治疗剂可通过任何已知的途径施用，如口服、静脉内、肌内、鼻内、皮下、阴道内、直肠内等；且治疗剂还可通过任何常规途径施用。在多个实施方案中，可皮下施用至少一种治疗剂。
这些一种或多种治疗剂包括但不限于糖皮质激素；类固醇、苯妥英(phenytoin)；普鲁卡因胺(procainamide)；奎宁(quinine)；糖皮质激素(例如地夫可特(deflazacort)、VBP15、泼尼松曲安奈德(prednisone triamcinolone)、全身性甲泼尼龙(methylprednisolone systemic)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、泼尼松龙(prednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)和/或可的松(cortisone))；抗惊厥药；免疫抑制剂(例如环孢素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、泼尼松龙(prednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、硫唑嘌呤(azathioprine)、霉酚酸(mycophenolicacid)、氨甲喋呤(methotrexate)、巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、抗胸腺细胞球蛋白(anti-thymocyte globulin)、抗淋巴细胞球蛋白(anti-lymphocyte globulin))；青霉素类(例如青霉素和阿莫西林)；头孢菌素类(例如头孢氨苄)；大环内酯类(例如红霉素、克拉霉素(clarithromycin)和阿奇霉素(azithromycin))；氟喹诺酮类(例如氧氟沙星(ofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)和氧氟沙星(ofloxacin))；磺胺类(例如复方新诺明(co-trimoxazole)和甲氧苄啶(trimethoprim))；四环素类(例如四环素(tetracycline)和多西环素(doxycycline))；氨基糖苷类(例如庆大霉素(gentamicin)和妥布霉素(tobramycin)))；ACE抑制剂(例如培哚普利(perindopril)和依那普利(enalapril))；血管紧张素II受体阻断剂；β阻断剂；钙通道阻断剂；地高辛(digoxin)；抗心律失常药(antiarrhythmic)；抗凝血药(anticoagulant)；抗生素；利尿剂(例如螺内酯(spironolactone)、依普利酮(eplerenone))；外显子跳跃疗法(例如eteplirsen、drisapersen)；抗肌生成抑制素抗体(例如PF-06252616)；抗结缔组织生长因子抗体(例如FG-3019)、PDE5抑制剂(例如他达拉非、西地那非)；PDE9抑制剂；NF-κB抑制剂；终止密码子通读药物(例如ataluren)；肌营养相关蛋白调节剂(例如SMT C1100、SMT022357)；抗纤维化剂(例如卤夫酮(halofuginone)、血管紧张素[1-7])；辅酶Q10的合成类似物(例如艾地苯醌(idebenone))；同种异体心脏细胞治疗(例如CAP-1002；Toll-样受体拮抗剂(例如IMO-8400)；盐皮质激素受体拮抗剂；β-肾上腺素受体拮抗剂；白藜芦醇；SIRT1活化剂。
当两种或多种治疗剂组合使用时，每种治疗剂的剂量通常与独立使用时治疗剂的剂量相同。然而，当治疗剂干扰其他治疗剂的代谢时，每种治疗剂的剂量应适当调整。或者，当两种或多种治疗剂显示协同效应时，可减少一种或多种的剂量。每种治疗剂可同时或以适当的时间间隔分开施用。
应该理解的是，为方便起见，贯穿本申请使用了单数形式如“一种”、“一个”和“所述”，然而，除非上下文表明或明确陈述表明，否则单数形式也意在包括复数形式。全部的数字范围应理解为包括每个和各个数字范围内的数字点，且应理解为单独记载每个和各个数字点。对于相同组分或特征的全部范围的端点都是包括性的，且目的在于可独立地组合。
当与参考的数字指示共同使用时，术语“约”意为参考的数字指示加或减参考的数值指示的10％。例如，表述“约50”覆盖45-55的范围。
如本文使用的词语“包括”及其变化目的不在于限制，由此列举的项目记载并不排除其他可在本技术的材料、组合物、装置和方法中使用的项目。相似地，术语“能够”和“可以”及其变化目的不在于限制，进而能够或可以包含一些元素或特征的实施方案的记载并不排除不包含那些元素或特征的本技术的其他实施方案。尽管作为包括、、含有或具有的术语的同义词，开放末端术语“包含”在本文用于描述和要求保护公开内容，本发明的技术或其实施方案可替换地使用更加限制性的术语如“由所记载的成分组成”或“基本上由所记载的成分组成”来进行描述。
除非另外定义，否则本文所述的全部技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。尽管任何与本文所述那些相似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明，但本文对优选的方法和材料进行了描述。
本文进一步用过下述非限制性实施例阐述。
实施例1
实施例1-肌营养不良症患者中PB1046对心肌病和骨骼肌肉肌病的影响
在杜氏肌营养不良症和贝克肌营养不良症患者中实施临床试验以测试PB1046治疗对延迟骨骼和心脏症状发作的效力。
设计：这是一项随机化的(2:1)、双盲、安慰剂对照试验。初始将评估18岁或年纪更大的患者，但研究对12岁或更大的青少年也是开放的。为评估剂量响应，将评估至少两种剂量水平，例如0.4mg/kg至3.2mg/kg间的剂量，例如0.8mg/kg和1.6mg/kg。根据安全考虑，也可评估较高或较低的剂量。在每个剂量水平将治疗至少6位患者。
首要治疗终点是效力，其测量为治疗12周后整体心脏/区域功能特性自基线的变化。该功能将在第24周额外评估。将超声心动图和具有晚期钆增强的心脏MRI用于评估。将测量治疗对左心室周围应变的效果。将测量左心室舒张末期容积(LVEDV)、右心室舒张末期容积(RVEDV)、作为心脏纤维化测量的增强程度、缩短分数(FS)和/或心输出量(CO)。LV大小、厚度、体积、射血分数和心肌的瘢痕/炎症负担、应变，以及LV的尺寸和体积的变化和瘢痕负担是关键测量。
次要效力终点是呼吸功能、定量肌肉力量、功能和质量评估。
一旦研究结束，将基于数据安全监控委员会的推荐将连续的开放标签疗法提供给患者。
实施例2-使用PB1046(一种稳定且长效的血管活性肠肽受体激动剂)长期治疗在杜氏肌营养不良症小鼠中改善心脏和骨骼肌肉的功能
材料和方法：使用PB1046(1.5mg/kg)或0.9％NaCl盐水(对照)皮下每周三次施用MDX(C57BL10/ScSnDMDmdx，肌营养不良蛋白缺陷，n＝21)和DKO(双敲除)mdx/utrn-/-(抗肌萎缩蛋白(dystrophin)/抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)缺陷，n＝13)小鼠达研究持续的时间(对于MDX为32周且对于DKO至多4周)。在常规检查过程中监测左心室功能(经由超声心动图；ECHO)和心电图(ECG)的变化。终点评估包括使用压力导管在检测动物中麻醉准备以测量系统/左心室血流动力学或趾长伸肌(EDL)上骨骼肌力量的评估(仅MDX)。将组织样品快速冷冻或固定在福尔马林中用于组织学评估(天狼星染色和巨噬细胞和CD计数)。
最通用的心室超声心动图参数是缩短分数(FS％)，其用作估计心肌收缩性且为左心室舒张末期的直径及其收缩末期的直径的比率。测量了分数面积缩短(FAS)和缩短分数。为计算FAS，以乳头水平并使用截面成像在短轴中可视化左心室区，手动追踪舒张末期和收缩期心内膜的边界。治疗过程之前和过程中在动物中确定FAS。在早期收缩中左室压(LV)压力升高的速率(dP/dt max)测量LV整体的收缩性。收缩力作用越大，左心室压力增加的速率越高。该速率可以侵入性测量(例如在LV内使用高保真微量管导管)，以及非侵入性测量(来自二尖瓣反流喷射的连续波多普勒检查)。Tau代表在等容松弛过程中心室压力的指数衰减，也对其进行了测量。较长的Tau代表心脏功能障碍。
在根腱处解剖来自小鼠两条腿的趾长伸肌(EDL)肌肉并置于Krebs-Henselet(K-H)缓冲液中。如Heller等人(2013)和Rodino-Klapac等人(2007)的公开内容分析肌肉并伴随一些调整。简而言之，一条根腱绑在力传感器的杠杆臂上，另一条根腱绑在线性伺服电机上。一旦肌肉稳定化，设置最佳长度为1克并进行预热，其由每30秒进行三个1Hz抽搐随后每分钟进行三次150Hz抽搐构成。3分钟休息期后，在50、100、150和200Hz刺激EDL，在每次刺激间伴随1分钟休息期以确定最大强直性张力。刺激后测量肌肉长度。5分钟休息后，评估了EDL肌肉对收缩诱导的损伤的敏感性。500ms的刺激后，将肌肉伸长最佳长度的10％并以150Hz刺激700ms。该刺激后，肌肉返回最佳长度。每分钟重复该循环共10个循环。
通过以最大强直性张力除以EDL肌肉截面积计算比力。为比较目的，所有力的测量都以收缩材料的每单位截面积(CSA)(标准化的等长收缩力或张力，mN/mm2)表示。使用下述等式计算CSA：
Figure BDA0003499971790000371
此外，通过使用天狼星红染色分析组织样品以确定作为纤维化标志物的胶原沉积程度。
结果:长期的PB1046减缓MDX小鼠中的心脏恶化。在研究持续期间保持分数面积缩短(收缩功能指数)(P<0.05)(图1A)。心室充盈速度(E/A比率–舒张功能指数)在研究过程中倾向于更快，但未实现统计学差异(图1B)。在研究持续期间还保持缩短分数(FS)(数据未显示)。
还在这些时间点评估了心电图。贯穿研究，当与安慰剂治疗的动物比较时，PB1046治疗的MDX小鼠易于具有较短的QRS(保留的心室传导)，但未实现统计学差异(数据未显示)。在DKO小鼠中注意到了相似的趋势，其中PB1046治疗钝化了对照组中注意到的QRS延长(数据未显示)。
体内分析显示，在MDX小鼠中使用PB1046治疗，压力上升升高的最大速率(dP/dtmax-收缩功能指数)显著更大(图2A-B)且松弛的Tau常数更快(P<0.05)(图2C-E)。
在骨骼肌功能评估中，PB1046的治疗在分离的EDL肌肉上防范收缩诱导的损伤而不改变MDX小鼠中的比力(图3A-B)。
与增加的骨骼和心脏功能一致，PB1046显著减少MDX小鼠腓肠肌中纤维化的程度(胶原含量)(四头肌、隔膜或胫骨前肌中无统计学意义，尽管趋势是明显的)(图4A)。此外MDX心脏肌肉中存在胶原含量减少的趋势(图4B)。尽管n很小，在DKO小鼠心脏中注意到相似的纤维化趋势(数据未显示)。
使用PB1046治疗后观察到总巨噬细胞计数的显著减少(图4C)。但在其他免疫细胞中未观察到差异(CD3、CD4、CD8；数据未显示)。
结论：使用新型VIP受体激动剂PB1046的长期治疗通过减缓心脏恶化并防范骨骼肌中收缩诱导的损伤缓解DMD疾病。除了对心脏功能的正性肌力和舒张作用外，减少的纤维化(胶原含量)也可能有助于PB1046对心脏和骨骼肌肉二者的阳性效果。
通过引用并入
引用的全部出版物、专利和专利出版物在本文通过提述以其整体并入。
出于全部目的，本申请通过提述以整体并入下述出版物：US 2001/0034050；US2009/0220455；US 8,334,257；US 2013/0310538；US 2013/0172274；US 2011/0236384；US6,582,926；US 7,429,458；US 7,364,859；US 8,178,495；US 2013/0079277；US 2013/0085099；US 2013/0143802；US2014/0024600；US 2011/0178017；US 7,709,227；US 2011/0123487；US 8,729,018；US 2014/0171370；US 2013/0150291；WO/2014/113434；US 2014/0213516；和2014年11月21日提交的US申请号62/082,945。
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序列表
<110> 费斯生物制药公司
Georgopoulos, Lynne M.
Arnold, Susan
Ballance, David James
<120> 用于治疗肌肉疾病和病症的方法和组合物
<130> PHAS-032/04WO 309646-309646
<150> 62/113,943
<151> 2015-02-09
<150> 62/145,770
<151> 2015-04-10
<150> 62/150,679
<151> 2015-04-21
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
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Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly
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Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
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Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
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Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro
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Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly
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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly
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Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly
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<213> 人工序列
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Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
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Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
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Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
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Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
515 520 525
Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala
530 535 540
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly
545 550 555 560
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
565 570 575
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
580 585 590
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
595 600 605
Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala
610 615 620
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly
625 630 635 640
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
645 650 655
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
660 665 670
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
675 680 685
Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
690 695 700
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly
705 710 715 720
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly
725 730
<210> 21
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ELP1-120
<400> 21
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
20 25 30
Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
35 40 45
Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
50 55 60
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
85 90 95
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
100 105 110
Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
115 120 125
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
130 135 140
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
145 150 155 160
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
165 170 175
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro
180 185 190
Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
195 200 205
Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
210 215 220
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly
225 230 235 240
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val
245 250 255
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
260 265 270
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
275 280 285
Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val
290 295 300
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly
305 310 315 320
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
325 330 335
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro
340 345 350
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly
355 360 365
Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
370 375 380
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly
385 390 395 400
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
405 410 415
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
420 425 430
Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
435 440 445
Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
450 455 460
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
465 470 475 480
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
485 490 495
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
500 505 510
Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
515 520 525
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
530 535 540
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
565 570 575
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro
580 585 590
Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Trp Pro
595 600 605

Claims (29)

1.一种组合物在制备用于治疗或延迟有需要的患者中肌营养不良症的进展的药物中的用途，所述组合物包含含有VPAC-2选择性血管活性肠肽(VIP)和弹性蛋白样肽(ELP)的融合蛋白，所述弹性蛋白样肽(ELP)由VPGXG(SEQ ID NO:3)的至少90个重复单元组成。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物减少腓肠肌纤维化。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述ELP由VPGXG的120个重复单元组成，其中X独立选自Val、Ala和Gly。
4.根据权利要求1所述的用途，其中X独立选自Val、Ala和Gly，其比率为约5:2:3。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物经配制用于皮下、肌内或静脉内施用。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述组合物通过皮下施用。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物的施用剂量为每日0.1mg/kg至每日10mg/kg。
8.根据权利要求1所述的用途，其中每日施用所述组合物。
9.根据权利要求1所述的用途，其中每周1-3次施用所述组合物。
10.根据权利要求1所述的用途，其中每周施用所述组合物。
11.根据权利要求1所述的用途，其中每月1-2次施用所述组合物。
12.根据权利要求1所述的用途，其中肌肉收缩性在所述患者中保持。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述肌肉是骨骼肌。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述肌肉是心肌。
15.根据权利要求1所述的用途，其中相比于未治疗的肌细胞，所述组合物使肌细胞保持收缩性。
16.根据权利要求1所述的用途，其中相比于未治疗的肌细胞，所述组合物使肌细胞保持松弛。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述肌细胞是心肌细胞。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述肌细胞是心肌细胞。
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述肌细胞是骨骼肌肌细胞。
20.根据权利要求16所述的用途，其中所述肌细胞是骨骼肌肌细胞。
21.根据权利要求1所述的用途，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症或贝克肌营养不良症。
22.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含氨基酸序列为SEQ ID NO:15的蛋白。
23.根据权利要求22所述的用途，其中将所述组合物皮下施用至受试者。
24.根据权利要求23所述的用途，其中将所述组合物每月1-2次施用至受试者。
25.根据权利要求24所述的用途，其中以每日1mg/kg至每日9mg/kg的剂量施用所述组合物。
26.根据权利要求1所述的用途，其中包含血管活性肠肽(VIP)和一种或多种弹性蛋白样肽(ELP)的所述组合物经配制用于持续释放。
27.根据权利要求1所述的用途，其中相比于未治疗的肌病受试者，施用所述组合物减少肌肉中的巨噬细胞计数。
28.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含以25mM至150mM范围存在的氯化钠、以10mM至20mM范围存在的组氨酸和以1mg/mL至200mg/mL范围存在的融合蛋白。
29.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含75mM氯化钠、20mM组氨酸和总计100mg/mL的包含VIP和ELP的融合蛋白。
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