MXPA06011242A - Glicopeptidos anfipaticos. - Google Patents

Abstract

Los glicopeptidos que son anfipaticos y capaces de cruzar la barrera de cerebro-sanguinea se proporcionan. Los glicopeptidos son utiles en el tratamiento de una variedad de desordenes neurologicos y de comportamiento.

Description

término genérico endorfinas, han sido sujeto de intenso estudio desde su descubrimiento a mediados de los años 70's1. Los neuropéptidos tienen el potencia l de intervención farmacológica extremadamente selectiva con menos efectos secundarios . S i estos péptidos opioides naturalmente ocurrentes y sus derivados pudieran volverse permeables a la ba rrera cerebro-sangu ínea (BBB) , entonces se abriría a la exploración una nueva vista de la psicofarmacoiog ía. Después de tres décadas de investigación , se han desarrollado m uchos agonistas y opioides potentes y selectivos y se han superado en gran medida problemas de estabilidad. El principa l problema restante que evita el uso de péptidos opioides como fármacos es la escasa biodisponibilidad, lo cual se debe a la escasa penetración de la BBB2. La BB B se com pone de cél ulas endoteliales en los lechos capilares cerebrovasculares3. La BBB actúa como una barrera a substancias químicas indeseadas y admite nutrientes vitales para la adecuada función del CNS4. El flujo es bi-direcciona l , perm itiendo la exportación de materiales provenientes del CN S (transporte de flujo extern o) y la im portación de materiales proven ientes de la sangre (transporte de flujo interno) . La BBB representa no solo un obstáculo físico, sino también uno metabólico, poseyendo tanto enzimas oxidativas como peptidasas , tales como am inopeptidasa, arilam idasa y encefalinasa. De este modo, las substancias metabólicamente i nestables (por ejemplo , péptidos) se degradan generalmente antes de alcanzar el CNS. También debe observarse q ue la entrada al CNS no garantiza que un fármaco se acum ulará en concentraciones útiles , ya q ue muchos péptidos se exportan rápidamente de regreso a la corriente sanguínea5. Se han reportado varias estrategias para superar el problema de penetración de la BBB, incluyendo la sustitución de aminoácidos no naturales6, el uso de límites conformacionales7, y la adición de cadenas laterales lipofílicas u otros vectores de transporte8. La glicosilación ha demostrado ser una exitosa metodolog ía para mejorar tanto la estabilidad como la biodisponibilidad de "mensajes" de péptidos cortos mediante incorporación del farmacóforo péptido en un glicopéptido9. Los estudios previos de penetración de la BBB con agonistas glicopéptidos opioides en base a encefalinas han demostrado incrementos de hasta tres veces la velocidad de suministro al cerebro de estos compuestos en comparación con .los péptidos principales no glicosilados10. Estudios recientes con glicopéptidos en sistemas de membrana artificiales indican que la anfipaticidad de los glicopéptidos es un factor importante en la penetración de la BBB1 1. Además, existe evidencia que sugiere que el tipo de glicosilación puede alterar patrones de distribución de tejido12, penetración de la BBB13 e interacciones de péptido/receptor1 1 , 14. Péptidos Opioides Endógenos. La ß-endorfina neuropéptida endógena es un agonista de péptido opioide, naturalmente ocurrente, de 31 residuos, que se une a receptores µ y d. Sus 5 residuos de terminal N son idénticos a la secuencia Met-Encefalin y puede considerarse que son el farmacóforo. Se mostró hace tiempo que la región de terminal C de ß-endorfina tiene una estructura a-helicoidal anfipática que desempeña un papel en el enlace a receptor y agonismo opioide15, y puede inducir resistencia a la proteolisis . De acuerdo con Schwyzer, la secuencia de terminal N es el "mensaje" esencial y la región helicoidal de terminal C es la "dirección" que limita el suministro del mensaje a un subconjunto de receptores opioides de otro modo disponibles17. Kaiser y su colaboradores propusieron que la ß-endorfina consiste en la secuencia péptida de Met-encefalin en el término N, una región enlazadora h idrof ílica de residuos 6 a 12, y una región helicoidal anfifílica entre los residuos fraccionadores de hélice Pro(13) y Gly(30)18. Esto se probó más tarde mediante sintetización de un número de imitadores de ß-endorfina con regiones helicoidales de terminal C artificiales con carácter anfipático1 9. Estas hélices anfipáticas de novo fueron no homologas a la región de terminal C de ß-endorfina y demostraron ser enormemente a-helicoidales por mediciones de CD. Estas estructuras híbridas demostraron buen agonismo opioide in vitro cuando se compararon con ß-endorfina. Estos estudios sugirieron fuertemente que la anfipaticidad de la hélice de terminal C desempeña una función clave en la selectividad de estos compuestos, en vez de la identidad de aminoácidos específicos presentes en la terminal C20. La Dinorfina A (1 -1 7) es también un péptido opioide endógeno, pero se enlaza preferentemente al receptor opioide ? y tiene un segmento de mensaje de terminal N idéntico a Le-Encefalin21. Esto ha sugerido que una secuencia de dirección en la región de terminal C imparte selectividad hacia receptores ?22. La Dinorfina A adopta una estructura de bobina extendida y/o aleatoria cuando se sujeta a análisis estructural mediante diversas mediciones espectroscópicas23. Un estudio de 2D 1 H- NMR en micelos DPC muestra que Dinorfina A(1 -7) contiene un segmento de terminal N menos ordenado, un segmento de a-hélice bien definido que abarca entre Phe(4) y Pro (10) o Lys(1 1 ), y un ß-giro de Trp(14) a Gln(1 7)24. En base a resultados de NMR, los autores concluyeron que tanto la hélice-a como el ß-giro de terminal C se deben a las interacciones de dinorfina-micelo y pueden ser características estructurales importantes del péptido de longitud completa cuando se unen a la membrana celular in vivo. Los estudios de Luna25 también soportan la noción de que una estructura helicoidal en el segmento de mensaje de Dinorfina A(1 -17) es significativa. La importancia biológica de la term inal C helicoidal se dirige a segmentos en péptidos opioides mayores que se han soportado además por el trabajo reciente de Kyle y colaboradores26. Ellos sintetizan con éxito varios potentes análogos péptidos de nociceptina (NC) que explotan los residuos promotores de a-hélice de ácido a-aminoisobutír'ico (Aib) y alanina de N-metilo (MeAla) en el término C de NC. La nociceptina es el ligando endógeno para el receptor similar a receptor opioide 1 recientemente identificado (ORL-1 ). De este modo, parece lógico enfocar el diseño de los análogos péptidos de ß-endorfina o dinorfina agonista de opioide mediante combinación de segmentos de dirección helicoidal anfipática de terminal C que también pueden promover la penetración de la BBB en virtud de la glicosilación.

Breve Descripción De La Invención Un objeto de la invención es proporcionar glicopéptidos que son antipáticos. Estos glicopéptidos son esencialmente no helicoidales en agua pura pero adoptan una estructura helicoidal en presencia de una bicapa lípida. La presencia del carbohidrato permite que la estructura helicoidal abandone la membrana para formar una bobina aleatoria soluble en agua, a fin de que el glicopéptido no permanezca incrustado en la membrana, sino que pueda moverse de membrana a membrana, reformando la estructura antipática helicoidal cada vez. Como resultado de esta dinámica estructural, los glicopéptidos de la presente invención son capaces de cruzar la barrera cerebro-sanguínea (BBB). Como resultado, los glicopéptidos para el tratamiento de una variedad de desórdenes neurológicos y comportacionales. De este modo, la presente invención proporciona un glicopéptido anfipático, en donde el glicopéptido comprende al menos 9 residuos aminoácidos, y en donde al menos uno de los residuos aminoácidos se glicosila. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el glicopéptido y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o excipiente. La presente invención también proporciona un método para aliviar el dolor, que comprende la administración de una cantidad eficaz del glicopéptido a un sujeto que necesita del mismo. La presente invención también proporciona un método para la proporción de analgesia, que comprende la administración de una cantidad eficaz del glicopéptido a un sujeto que necesita del mismo. Además, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de ansiedad, depresión, obesidad, anorexia nerviosa, fobias, esquizofrenia, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Aizheimer, que comprende la administración de una cantidad eficaz del glicopéptido a un sujeto que necesita del mismo.

Breve Descripción De Los Dibujos Se obtendrá una apreciación más completa de la invención y muchas de las ventajas que conlleva de la misma, a medida que la misma se entienda mejor por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considere en conexión con los dibujos acompañantes, en donde: Los números de las figuras son los números originales y no se han re-enumerado. Figura 1 . Imitadores de membrana utilizaos en estudios de CD y NMR. Los bicelos tiene mucho menor curvatura de membrana que los micelos, tienen una bicapa de fluido verdadero y son más predictivos de la estructura glicopéptida de unión a membrana. Figura 2. Para diseñar los glicopéptidos de 1 a"3a generación, se ilustraron como ruedas -helicoidales anfipáticas (2y 9 se muestran). Los residuos hidrofílicos se muestran en rojo y los residuos hidrofobicos en azul. El segmento de mensaje YtGF no se muestra como parte de la hélice. La posición de membrana esperada se muestra por una línea gris. Figura 3. El glicopéptido 9 se ilustra como un hélice anfipático "perfecto" (segmento de mensaje de terminal N a la izquierda) , con una superficie Connolly calculada. La superficie se ha coloreado para indicar superficies hidrofílicas (rojo) e hidrofóbicas (azul). Las hélices anfipáticas de "Clase A"y "Clase L" idealizadas se ilustran como diagramas de Edmund (vista extrema) con el mismo esquema de color. . Figura 4. a) Cambios en el ensamble conformacional se promueven por la membrana. La solución de la -hélice puede observarse como un compuesto intermedio de energía elevada que conduce a la interacción de la membrana, o la membrana puede observarse como un catalizador que condice a la formación de hélice, b) Cada glicopéptido tiene un pequeño conjunto de micro-estados unidos a membrana de baja energía (A, B, C...), así como también un conjunto mucho mayor de micro-estados de solución de mayor energ ía (1 , 2, 3...).

Figura 5. Mecanismo de transporte endocitótico putativo. Se tiene la hipótesis de que los glicopéptidos anfipáticos (3 esferas pequeñas a la izquierda) pueden absorber al endotelio de la BBB en el lado de la sangre y experimentar endocitosis para formar vesículas. Después de que las vesículas encuentran su camino al lado del cerebro de la capa endotelial de células, la exocitosis puede suministrar los glicopéptidos al sistema nervioso central. Figura 6. Espectro CD de bastante-UV de glicopéptidos helicoidales de 1 a y 2a generación en medio anfipático de SDS. La concentración de micelos fue de 30 mM, pH=7.0, y T=18°C. El espectro de CD de bastante UV de glicopéptidos 9 y10 en diversos medios solventes. La concentración de glicopéptido utilizada fue de 74-80 µ?. La concentración de micelos fue de 30 mM y la concentración de bicelos fue de 1 0 mM, pH=4.5 a 25°C. El bicelo Z se refiere a bicelos de ión anfotérico. El bicelo A se refiere a bicelos aniónicos. Figura 7. Las gráficas de desviaciones de desplazamiento químico de valores de bobina aleatorios, Los residuos Aib y pAla no se muestran en la gráfica. Las desviaciones negativas consecutivas son características de la conformación helicoidal. Los valores de bobina aleatorios se tomaron de la referencia 70. Figura 8. Una gráfica de tiempos de retención de RP-HPLC contra helicoidicidad porcentual (por residuo) para los glicopéptidos. Figura 9. Sumario de ROEs observados en H20:D20 (9: 1 ) a pH=4.5 y 20°C. Los grosores de la línea indican las intensidades de ROE relativas. Figura 10. Sumario de ROEs observados en TFE/H20 (3:7) y pH=4.5 a 15°C. Los grosores de la línea indican las intensidades aproximadas de ROE. Figura 1 1 . Sumario de NOEs observados en micelos SDS a pH=4.5 y 25°C. Los grosores de la línea indican las intensidades aproximadas de NOE. Figura 12. Sumario de NOEs observados en bicelos iónicos anfotéricos y pH = 4.5 a 25°C. Los grosores de la línea indican las intensidades aproximadas de NOE. Figura 13. Región de huella digital (ccCH-NH) del espectro ROESY en CF3CH2OH: H20 (3:7) y pH=4.5 a 1 5°C (tiempo de mezcla = 150 ms). El daN(i, i+2), daN(i, i+3) y daN(i, i+4) ROEs se subrayan. Figura 14. Región de huella digital de ( CH-NH) del espectro NOESY en micelos de SDS a pH=4.5 y 25°C (tiempo de mezcla = 300 mseg). Se subrayan NOEs de rango medio y largo. Figura 15. Región de huella digital (aCH-NH) del espectro NOESY en bicelo iónico anfotérico a pH=4.5 y 25°C (tiempo de mezcla = 300 mseg). La firma helicoidal daN(i,i+2), daN(i,i+3) y daN(i ,i+4) NOEs en la región de amida indica la conformación helicoidal local. Algo del potencial de los NOEs de dNN(i, i+1 )se encuentran demasiado cerca de la diagonal para cuantificarse. La proporción de glicopéptido-respecto a-bicelo fue de 1 :25. Figura 16. Comparación de sistemas de solvente en 9. Las conformación de energía ínfima derivadas de NOE que resultan de 200 ps simulados que templan dinámicas moleculares. La helicoidicidad se incrementa y las estructuras se vuelven más rígidas a medida que el solvente se cambia de H20 a CF3CH2OH/H2O a micelos SDS a bicelos. Figura 17. Cambios espectrales PWR observados para el regulador (1 ), después de la formación de bicapa lípida (2) e interacción de glicopéptido 9 para luz polarizada p (panel izquierdo) y s (panel derecho). Los datos mostrados son para el estado equilibrado durante 20 nM de cada glicopéptido. Figura 18. Curvas de enlace para la interacción de glicopéptidos 9 y 11 con la bicapa lípida. La constante de disociación dada se calculó mediante ajuste de los datos a través de una sola función hiperbólica.

Descripción Detallada De La Invención Como se discutió arriba, la presente invención proporciona un glicopéptido anfipático, en donde el glicopéptido comprende al menos 9 residuos aminoácidos, y en donde al menos uno de los residuos aminoácidos es glicosilado. Según se utiliza en la presente, el término "antipático" según se usa aquí tiene el mismo significado que se utiliza generalmente en el campo de la química de péptidos y proteínas. De este modo, los glicopéptidos de la presente invención poseen ambos grupos funcionales hidrofílicos e hidrofóbicos. En particular, cuando los glicopéptidos adoptan una conformación helicoidal, como se discute en detalle en la presente, la secuencia exhibe una superficie hidrofóbica y una superficie hidrofílica, como se discute en detalle a continuación. En una modalidad preferida de la presente invención, el glicopéptido adopta una conformación helicoidal en presencia de una bicapa lípida, lo cual refleja su conformación en la capa endotelial de la BBB. Los glicopéptidos también adoptan una conformación helicoidal en presencia de mezclas de TFE-agua, micelos y/o bicelos. La helicoidicidad puede medirse mediante dicroismo circular, mediante NMR, e incluso mediante HPLC de fase inversa. Según se mida de estas maneras, ei glicopéptido tiene una helicoidicidad de al menos 10%. En modalidades preferidas, . el glicopéptido tiene una helicoidicidad de al menos 15%, 20% , 30% , 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o 90%. En otra modalidad, el glicopéptido es substancialmente no helicoidal en agua en la ausencia de una bicapa lípida. La helicoidicidad puede medirse mediante dicroismo circular. Según se mida de esta manera, el glicopéptido tiene una helicoidicidad de cuando mucho 5%. En modalidades preferidas, el glicopéptido tiene una helicoidicidad de cuando mucho 4%, 3% , 2% o 1 %. De hecho, el grado de helicoidicidad puede encontrarse por debajo del nivel de detección de la técnica de ensayo en particular. En una modalidad especialmente preferida, el glicopéptido es substancialmente no helicoidal en agua en ausencia de una bicapa lípida y adopta una conformación helicoidal en presencia de una bicapa lípida. Las modalidades preferidas de tal compuesto son como se describe justo arriba. Como resultado de esta dinámica de conformación , los glicopéptidos de la presente invención pueden ser capaces de cruzar la barrera de cerebro-sanguínea. En modalidades preferidas, los glicopéptidos tienen una captura de BBB de 0.001 hasta .5 microlitros por min por gramo de corteza (ver Tabla 1 a continuación). Este rango incluye todos los rangos específicos y sub-rangos entre los mismos, tal como 0.002, 0.005, 0.01 , 0.02, 0.05, 0.1 , 0.2 y 0.4. En otra modalidad, los glicopéptidos son solubles en agua. En una modalidad preferida de la presente invención, la secuencia amino ácida del glicopéptido comprende una secuencia de mensaje opioide de terminal N , una secuencia de dirección de terminal C y una secuencia enlazadora entre la secuencia de mensaje y la secuencia de dirección. Una amplia variedad de secuencias de mensaje opioide y secuencias de dirección son muy conocidas y pueden utilizarse en la presente invención, además de las secuencias de mensaje no opioide con las mismas secuencias de dirección. Las secuencias de mensaje adecuadas incluyen lo siguiente: Secuencias de Mensaje Delta-Selectivas Met-Encefalin Y-G-G-F-M DSLET Y-Ds-G-F-L-S-DTLET Y-Dt-g-f-l-t DSTBULET Y-dS(OtBu)-G-F-L-T DPDPE Y-dPen-G-F-dPen (SS) Deltorfina Y-dM-F-H-L-M-D-CONH2 Secuencias de Mensaje Mu- y Kappa-Selectivas Leu-Encefalin Y-G-G-F-L LYM-147 Y-dA-G-MeF DAMGO Y-dA— G-MeF-N H-CH2CH2OH Dermofin Y-dA F-G-Y-P-S beta-Endorfina Y-G-G-F-M-T-S-Q-T-P-L-V-T-T-L-F-K-N-A-l-l-K-N-A Y-K-K-G-E alfa-neo-Endorfina Y-G-G-F-L-R-K-Y beta-neo-Endorfina Y-G-G-F-L-R-K-Y-P Péptido E Y-G-G-F-M-R-R-V-G-R-P-E-W-W-M-D-Y-Q-K-R-Y-G G-F-L Péptido F G-G-E-V-L-G-K-R-Y-G-G-F-M Nociceptina (FQ) F-G-G-F-L-R-R-l-R-P-K-L-K-W-N-N-Q Dinorfina A (1 -17) Y-G-G-F-L-R-R-l-R-P-K-L-K-W-D-N-Q Dinorfina A (1 -13) Y-G-G-F-L-R-R-l-R-P-K-L-K Dinorfina B Y-G-G-F-L-R-R-Q-F-K-V-V-T Morficeptina Y-P-F-P beta-Casomorfina Y-P-F-P-G-P-l Endomorfina-1 Y-P-W-F Endomorfina-2 Y-P-F-F Rubiscolin-6 Y-P-L-D-L-F En las secuencias arriba listadas, dA, dS, dT, dM, dPen representan D-alanina, D-serina, D-treonina, D-metionina y D-penicilimina, respectivamente. Con respecto a la secuencia enlazadora, en principio, cualquier secuencia relativamente corta de aminoácidos, o secuencia relativamente corta de átomos de carbono, puede servir como un enlazador. Si uno desea tener una secuencia transporte de hélice antipático en sobreposición con la secuencia de mensaje, un enlazador sin demanda, corto, tal como una sola glicina o dos glicinas, puede utilizarse. Si no desea tener una secuencia transporte de hélice antipático, moderadamente estable, entonces puede utilizarse un amino ácido desestabilizador de hélice, tal como una sola prolina. Si uno desea que termine la región de dirección de hélice, y no se sobreponga al mensaje, entonces puede utilizarse un fracturador de hélice, tal como beta-alanina o dos prolinas o una secuencia mayor. El enlazador puede variar para adecuarse al mensaje en particular, y ha demostrado tener un gran impacto en las velocidades de transporte de BBB. En enlazador óptimo para una dirección y mensaje dados, puede determinarse mediante el uso de experimentación de rutina.

En una modalidad, el glicopéptido comprende al menos 10 residuos aminoácidos. En otras modalidades, el glicopéptido puede contener al menos 1 1 hasta al menos 50 residuos aminoácidos. Este rango incluye todos los valores específicos y sub-rangos entre los mismos. Por ejemplo, el glicopéptido puede contener al menos 1 1 , 12, 14, 1 5, 1 7, 1 9, 20, 25,30, 35, 40, o 45 residuos aminoácidos. En modalidades preferidas, el glicopéptido puede contener cuando mucho 60 residuos am inoácidos. La secuencia también puede comprender cuando mucho 55, 50 o 45 residuos aminoácidos en otras modalidades. De este modo, el glicopéptido de la presente invención puede tener una secuencia amino ácida que es de 10-60 residuos de longitud. Este rango incluye todos los valores específicos y sub-rangos entre lo mismos, tales como 12, 15, 20, 25, 30, 40 y 50 residuos aminoácidos. En una modalidad, el glicopéptido es una encefalina glicosilada. En otra modalidad, el glicopéptido es una endorfina glicosilada. El glicopéptido puede tener la secuencia de terminal N Y-a-G-F-, T-t-G-F-, Y-t-G-F-L-, Y-t-G-F-L-P-, Y-t-G-F-L-ß?-, o Y-t-G-F-L-G-G-. Los símbolos "a", "t" y "ß?" representan D-alanina, D-treonina y ß-alanina, respectivamente. A menos que se anote de otro modo, un solo amino ácido ilustrado en el caso inferior se refiere al D-amino ácido. Otras secuencias de terminal N adecuadas incluyen Y-G-G-, Y-G-G-F-, Y-m-F-, Y-m-F-H-, Y-a-F-, Y-a-F-G-, Y-P-F, Y-P-F-P-, Y-P-F-F-, Y-P-W e Y-P-W-F-. Además, muchas secuencias no opioides pueden utilizarse en la presente invención, incluyendo secuencias de factor de liberación de corticotropina (CRF), hormona de luteinización (LH), corionogonadotropina humana (hCG), hormona estimuladora de folículo (FSH), péptido intestinal vasoactivo (VIP), bradiquinina, vasopresina, neuroquininas, sustancia P, prolactina y muchas otras hormonas de péptido hipotalámico. Según se utiliza en la presente, el término "glicosilado" significa que un residuo amino ácido se funcionaliza con un grupo glicosilo. Un grupo glicosilo se compone de unidades sacáridas. Estos términos son muy conocidos en el campo de la química de péptidos y proteínas y tienen significados tales como los que se utilizan en la presente. En modalidades preferidas, el grupo glicosilo tiene cuando mucho 8 unidades sacáridas. Más preferentemente, el grupo glicosilo tiene cuando mucho 4 unidades sacáridas. En otra modalidad, el grupo glicosilo es cuando mucho un disacárido, es decir, el grupo glicosilo tiene cuando mucho 2 unidades sacáridas. De este modo, el número total de unidades sacáridas puede ser desde 1 hasta 8, incluyendo todos los valores específicos y rangos entre los mismos. Los ejemplos de grupos glicosilos incluyen ß-D-glucosa, ß-maltosa, ß-lactosa, ß-melibiosa y ß-maltotriosa. Otros ejemplos incluyen sucrosa, trehalosa, sacarosa, maltosa, celobiosa, gentibiosa, isomaltosa y primeveosa. Otros grupos glicosilos incluyen galactosa, xilosa, mannosa, ácido manosamínico, fucosa, GalNAc, GIcNAc, idosa, ácido idurónico, ácido glucurónico y ácido siálico. En una modalidad de la invención, un residuo amino ácido se glicosila. En otra modalidad, dos residuos aminoácidos se glicosilan. En otras modalidades, el glicopéptido puede tener 3 o 4 o más residuos aminoácidos glicosilados. En una modalidad preferida, el glicopéptido comprende al menos un residuo de serina que se glicosila. En otra modalidad preferida, el glicopéptido comprende 2 residuos de serina que se glicosilan. En una modalidad específica, el glicopéptido contiene un residuo glucósido de serina. En otra modalidad específica, el glicopéptido contiene 2 residuos glucósidos de serina. Los métodos adecuados para la preparación de glicopéptidos son muy conocidos. Los métodos muy conocidos de síntesis péptida de fase sólida pueden utilizarse para preparar los glicopéptidos de la presente invención. Se prefiere que el grupo glicósilo se enlace a la secuencia amino ácida mediante un enlace-0 a una cadena lateral en el segmento de dirección de la secuencia. Ver Tetrahedron Asymmetry 16, 65-75 (2005), incorporado en la presente para referencia y la E. U . 5,727,254. En una modalidad particular de la presente invención, los glicopéptidos de la presente invención son selectivos para el receptor opioide delta, receptor opioide mu o receptor opioide kappa. En esta modalidad, los glicopéptidos son agonistas receptores. De hecho, cualquier receptor acoplado a proteína g (GPCR) podría ser un objetivo para los glicopéptidos diseñados mediante el uso de estos conceptos. Como resultado, los glicopéptidos de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de una variedad de desórdenes neurológicos y/o comportácionales que se median por aquellos receptores. De este modo, los glicopéptidos pueden utilizarse para aliviar el dolor mediante administración de una cantidad eficaz del glicopéptido a un sujeto que necesita del mismo. Los glicopéptidos también pueden utilizarse para proporcionar analgesia mediante administración de una cantidad eficaz a un sujeto que necesita del mismo. Los glicopéptidos también pueden utilizarse para tratar ansiedad, depresión, obesidad, anorexia nerviosa, fobias, esquizofrenia, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer mediante administración de una cantidad eficaz a un sujeto que necesita del mismo. El sujeto es preferentemente un humano. El sujeto también puede ser un animal no humano, especialmente un mam ífero. Los animales adecuados incluyen ratones, ratas, perros, caballos, cabras y monos. La presente invención también incluye una composición farmacéutica que comprende el glicopéptido y al menos un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptables. Los glicopéptidos de la presente invención pueden prepararse para administración farmacéutica mediante métodos y excipientes generalmente conocidos en la materia (Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martín). Los vehículos y excipientes pueden incluir agua, reguladores de pH, tales como citrato o reguladores de fosfato, 'agentes humectantes' tales como Tweens u otros detergentes, sales tales como cloruro de sodio, agentes reductores tales como tioles, azúcares, tales como dextrosa, lactosa, sucrosa y lo similar, glicerol, glicol, aceites, preservativos, antimicrobianos, etc. La composición puede prepararse como un líquido, polvo, sólido o en forma de gel para administración. La administración puede ser a través de rutas parenterales, tal como intravenosa, de manera intraperitoneal o subcutánea, oral, nasal, inhalación, de manera rectal a través de supositorios u otras rutas conocidas de administración de fármacos. Las dosis y programas de administración se determinan fácilmente por aquellos expertos en farmacología. Un rango de dosis adecuado para los glicopéptidos es de 0.001 microgramos por kilo hasta 30 miligramos por kilo de peso corporal. Principios de Diseño de Glicopéptido. Se han diseñado y sintetizado para estudio tres series de análogos de ß-endorfina glicosilados. Las secuencias péptidas no fueron homologas a ß-endorfina, pero las regiones de terminal C se diseñaron para producir conformaciones de hélice anfipática y contienen uno o más glicósidos de serina. Un estudio completo de barrera de cerebro-sanguínea de estos compuestos en los ratones se publicará por separado27, pero algunos de los resultados de BBB más sobresalientes se presentarán aquí, junto con el enlace de opioide y ensayos funcionales. Es digno de atención el que algunos de los análogos de glicopéptido de endorfina más largos penetren la BBB del ratón a mayores velocidades que los análogos de glicopéptido de encefalina más cortos. En este estudio, no enfocaremos al diseño y análisis conformacional de los análogos de glicopéptido de ß-endorfina, representativos, en agua, mezcla de TFE-agua, micelos SDS y bicelos determinados por 2D-1 HNMR y dicroismo circular (CD). El trifluoroetanol de solvente orgánico (TFE) se ha utilizado tradicionalmente para promover la formación de estructuras secundarias28. Posteriormente, el uso de micelos detergentes se propuso para estudiar las interacciones de péptido-membrana29. Recientemente, con objeto de imitar mejor el ambiente de la membrana más plana, se propuso el uso de bicelos fosfolípidos y gana hasta el momento debido a sus ventajas sobre solventes orgánicos y micelos30. Los bicelos utilizados en los estudios de NMR son agregados en forma de disco, formados por mezcla de fosfolípidos de cadena larga, tal como dimiristoilfosfadilcolina (DMPC) que forma un disco de dominio de bicapa, junto con fosfolípidos surfactantes de cadena corta, tal como dihexanoilfosfatidilcolina (DIC) que sella los bordes de la bicapa30b' 31. A diferencia de los micelos, que muestran curvatura positiva extrema, los bicelos fosfolípidos constituyen un segmento de bicapa de membrana de fluido verdadero con una curvatura muy baja (Figura 1 ). Se ha mostrado que mientras algunas enzimas de unión a membrana pierden su actividad en solución micelar, la actividad con frecuencia se retiene cuando se unen a bicelos fosfolípidos32. También se ha mostrado previamente que Met-encefalina muestra un ensamble conformacional diferente en presencia de los bicelos más fluidos que en un ambiente de micelos33. Los estudios conformacionales de los péptidos que penetran células en sistemas de micelo SDS y bicelo, muestran que estos péptidos adoptan estructura muy similar en ambos sistemas, pero la posición de los péptidos en un micelo difiere significativamente de la posición en la bicapa fosfolípida34. De este modo, con objeto de entender el comportamiento de los glicopéptidos que atraviesan la BBB, es importante estudiar las propiedades conformacionales de los glicopéptidos en mezclas de TFE-agua, así como también en micelos y bicelos que imitan la membrana. Robert Schwyzer señaló la importancia de la membrana en las interacciones de péptido-receptor con el desarrollo de su "teoría de compartimento de membrana ". De acuerdo con esta teoría, la fase I ípida de una mem brana celular actúa como una matriz para el receptor y el ligando14. M ax Del bruck l levó a cabo un estudio teórico de interacciones de receptor-ligando en el contexto de "división por compartimentos de mem brana"35. Encontró q ue una búsqueda en 2D de un receptor era mucho más eficiente que una búsqueda en 3D para un receptor y sugirió q ue la i nteracción inicia l era la adsorción de un ligando hacia la mem brana. La inserción de membrana también puede inducir una conformación específica del ligando, diferente de su conformación en solución y esta conformación unida a membrana es probable que sea la conformación bioactiva. Las hélices son los elementos estructurales , secundarios, más comúnmente ocurrentes , en proteínas g lobulares , sumando un tercio de todos los resid uos36. En 1 974, Seg rest y colaboradores realizaron primero la teoría de la hélice anfipática (a. k. a . anfifílica) como un motivo estructu ral de estructu ra/función ún ica de interacción Iípida involucrada en proteínas37. Estas proteínas son ú nicas ya que poseen regiones hidrofóbicas e hidrofílicas , ya sea por estructura primaria (que tiene térm ino N hidrofílico y térm ino C hidrofóbico) o por estructura secundaria, con residuos polares señalando un frente y residuos no polares en el lado opuesto. Esto les perm ite "flotar" en membranas celulares, exponiendo el lado hidrofílico al exterior acuoso de la célula y el lado hidrofóbico a la membrana lipofílica. Varias propiedades funcionales se asocian con hélices anfipáticas, lo cual incluye asociación de lípidos, perturbación de la membrana en la forma de fusión o lisis, catálisis de hormona-receptor, transducción de señal de transmembrana, regulación de transducción de señal de quinasa- calmodulina, y formación de manojo helicoidal de transmembrana39. Los péptidos de penetración celular anfipática (CPP) se han utilizado para el suministro de fármaco en el citosol40. Estas hélices anfipáticas de clase L (por ejemplo, líticas) se cree que se agregan en la superficie celular, seguidas por rotación para producir poroso a través de la bicapa de lípidos. Esto no sería un buen escenario para penetración de la BBB. Más bien, las hélices anfipáticas de Clase A (por ejemplo, apolipoproteína), que no se agregan ni forman poros parecen desearse con objeto de participar en eventos endocitóticos en el estrato endotelial. Las hélices anfipáticas de Clase A evitarán que los glicopéptidos entren al citosol, o se inserten demasiado profundamente en la membrana - los cuales pueden volverse eventos irreversibles en el contexto de atravesar la BBB. Por lo tanto, los residuos que forman el frente hidrofílico de las hélices anfipáticas utilizadas en estos estudios han elegido obstruir un gran ángulo, de cerca de 1 80°, y deben proporcionar hélices anfipáticas de Clase A que "recorren por lo alto" la membrana y es menos probable que se agreguen para formar poros. Los glicopéptidos helicoidales en estos estudios se diseñaron de acuerdo con estudios clásicos de formación de hélice41 combinados con un enfoque de rueda simple Edmundson para introducir anfipaticidad (Figura 2). Los cálculos de mecánica molecular también soportaron estructuras anfipáticas, helicoidales, para los glicopéptidos (Figura 3).

Las áreas accesibles por solvente (superficie Connolly) se etiquetaron de diferentes colores para residuos hidrofóbicos e hidrofílicos sugiriendo que estas moléculas podrían existir como hélices antipáticas de Clase A cuando se encuentran en un ambiente de membrana, y fue nuestro deseo que pudiéramos lograr velocidades óptimas de encendido y apagado para lograr la penetración de barreras celulares mediante transcitosis10, 1 1. El mismo segmento de mensaje DTLES d-selectivo42 utilizado en trabajos previos se ha utilizado a través de todos estos estudios. Los segmentos de mensaje y de dirección se conectaron a través de un enlazador de péptido en un esfuerzo por "romper" la hélice. Se diseñaron tres conjuntos de glicopéptidos con el segmento de mensaje común YtGFL con diferentes segmentos de enlazador y dirección de hélice anfipática (Tabla 1 ). La primera generación de glicopéptidos helicoidales (1 -4) tienen un enlazador Gly común, pero difieren en la longitud de secuencia de segmento de dirección (simple truncado). Uno o dos sitios de glicosilación se incorporaron para promover el desprendimiento del antipático de la membrana. De estos cuatro glicopéptidos de primera generación, solo el glicopéptido 2 mostró cualquier solubilidad en agua apreciable. Los glicopéptidos de 2a generación (5-8) incorporaron menos regiones hidrofóbicas y un tercer sitio de glicosilación en un esfuerzo por hacerlos más solubles en agua. No obstante, todas las hélices de 2a generación fueron solubles en agua. En ambos glicopéptidos de 1 a y de 2a generación, el enlazador Gly fue ineficaz en terminar la hélice, lo cual se propagó hacia el mensaje de YtGFL En la 3a generación de glicopéptidos helicoidales (9-12), se utilizaron tres diferentes enlazadores, Pro , ß-Ala, Gly-Gly, con el mismo segmento helicoidal, lo cual fue mucho más corto y contuvo Aib, un residuo que se sabe promueve la formación de la hélice. Ni Pro ni Gly-Gly fueron muy eficaces en la terminación de la hélice. La longitud del segmento helicoidal de terminal C se fijó en nueve residuos de longitud en el diseño de la 3a generación, suficiente para formar dos giros a-helicoidales completas. Ninguno de los segmentos de dirección helicoidal de terminal C tienen cualquier homología de secuencia con ß-endorfina natural o segmentos de terminal C de dinorfina. Ya que las fuerzas de estabilización involucradas en la formación de hélices son locales, tal como una red de trabajo regular de enlaces internos de hidrógeno, las interacciones electroestáticas entre cadenas laterales cargadas, el diseño helicoidal es más fácil que el diseño de ß-lámina43. Las estrategias previamente utilizadas para crear péptidos helicoidales, estables, cortos, incluyen: i) la incorporación de residuos Ala estabilizadores de hélice,44 ii) el uso de aminoácidos a-metilados,45 iii) la adición de puentes de sal entre residuos separados por un giro a-helicoidal,46 iv) la incorporación de macrocitos covalentes,47 y v) la adición de patrones no péptidos para iniciar la formación de hélice48. De este modo, n uestro diseño se basa puramente en principios de doblez de proteína y características de amino ácido (por ejemplo, estrategias i-iii). Los residuos hidrofóbicos e hidrofílicos se colocaron de manera adecuada mediante gráfica del segmento helicoidal de terminal C en una gráfica de rueda helicoidal (diagrama de Edmunds).

También colocamos los aminoácidos de tal manera que se facilite la caracterización de NMR. Trp, Phe y Leu se seleccionaron como aminoácidos hidrofóbicos en glicopéptidos de 1 a y 2a generación, mientras que en la 3a generación solo se seleccionó Leu como el residuo hidrofóbico debido a que tiene buena propensión a helicoidal entre los residuos hidrofóbicos49. Glu" y Lys+ se seleccionaron como residuos hidrofílicos para formar puentes de sal cuando se colocan en las posiciones i e i+447.- La presencia de residuos con cadenas laterales que pueden formar enlaces de hidrógeno con los grupos NH de amida de cadena principal o carbonilo, cuando se localizan al inicio (N-tapa) o extremo (C-tapa) de a-hélices, se ha encontrado que estabilizan y nuclean la conformación helicoidal en péptidos y proteínas. Asn seguido por Asp son los residuos de tapa N más favorecidos en las hélices de proteína natural que forman enlaces H de tipo i, i+2 o i+3 con hidrógenos NH de cadena principal50. No obstante, en la 3a generación de glicopéptidos helicoidales, Asn se colocó inmediatamente después del residuo enlazador para iniciar la hélice mediante formación de enlace de hidrógeno tipo Asx entre su amida de cadena lateral con la cadena principal51. Otras características de diseño clave utilizadas en el diseño de segmento helicoidal fueron la colocación del residuo Aib helicogénico en el medio y los residuos Glu y Lys cargados en la posición i e i+4 para tener un puente de sal electroestático con objeto de incrementar la estabilidad y solubilidad y evitar la formación de agregados.

Tabla 1. Secuencias de glicopéptldos y bioactividad.

No. Mensaje-E nlazador-Hélice d µ Aso Captura ICso ic50 /'. C. V. de BBB (nM) (nM) (nmol) 1 YtGFLGELAS*KWF ALE H20 insoluble 2 YtGFLGELAS*KWF ALES* 9.5 144 0.27 — 3 YtGFLGELAS*KWFNALES*F H20 insoluble 4 YtGFLGELAS*KWFNALES*FW H20 insoluble 5 YtGFLGALKS*FAES*LS* A — — — 6 YtGFLGLLKS*FAES*WS* F 11.9 154 0.028 — 7 YtGFLGKS*FAELWS* FLS* 25.6 38.2 0.096 — 8 YtGFLGLLKS*FWES*WS*NF — — — — 9 YtGFLPNLBEKALKS*L 6.15 90.8 0.030 0.390 10 YtGFL ANLBEKALKS*L 108.9 153 0.030 0.183 11 YtGFLGG LBEKALKS*L 32.5 53 0.030 0.002 12 YtGFLP LBEKALKS*+L — — — — S* = ß-?-Glucosil-L-Serina, S** = ß-0-Lactosil-L-Serina.

Discusión Se ha encontrado que el glicopéptido 9 cruza de manera eficiente la barrera cerebro-sanguínea en ratones, mientras que 11 no lo hace, lo cual sugiere que la capacidad de 9 para cruzar la barrera cerebro-sanguínea se correlaciona con su elevada afinidad para la bicapa lípida. Las afinidades de enlace sugieren que la estructura del elemento péptido es responsable de la interacción con la membrana. El péptido no glicosilado relacionado con 9 (9u en la Información de Soporte) muestra un enlace ligeramente reducido hacia la membrana (KD = 400 nM, datos no mostrados). Serán necesarios estudios adicionales que involucran los péptidos no glicosilados para investigar aún más este punto, pero se ha observado anteriormente con glicopéptidos más cortos que el incrementar la glicosilación también mejora las interacciones con liposomas11. Esto podría indicar que el carbohidrato está disminuyendo la velocidad de difusión de la membrana, tal ves mediante interacción con la "capa no agitada" de moléculas de H20 cerca de la superficie de la membrana. La información disponible sugiere que la función del glicósido es simplemente atraer al glicopéptido lejos de la membrana, permitiendo que los fármacos "salten" de membrana en membrana. Estos "saltos" podrían ser cortos, manteniendo la conformación de la estructura helicoidal, o con la transición de bobina de hélice aleatoria en la fase acuosa, podrían ser recorridos largos (Figura 4). La membrana puede observarse como un catalizador que promueve la formación de hélices17 (movimiento de derecha a izquierda), o alternativamente, la formación de hélices en solución acuosa puede observarse como una barrera de energía que debe superarse con objeto de lograr el enlace de membrana (movimiento de izquierda a derecha). Los resultados de CD y NMR muestran que los glicopéptidos tienen dos comportamientos distintos en presencia o ausencia de una bicapa de membrana. En medio acuoso, solo se observan hélices nacientes, con muchas estructuras de bobina aleatoria (por ejemplo, Figura 4b, 1 , 2, 3...) dominando el ensamble conformacional. En presencia de una bicapa de membrana, un número reducido de estructuras antipáticas (por ejemplo, A, B, C) domina el ensamble. A partir de estos y otros estudios, 10 , 1 1 , 27 parece claro que el grado de glicosilación (es decir, disacárido contra monosacárido) no tiene un gran efecto sobre la estructura de los microestados individuales. Por lo tanto, la función principal de la glicosilación incrementada es la disminución de la energía del ensamble acuoso entero. La alteración del grado de glicosilación debería permitir la modulación de densidades de población de estado acuosa contra estado de enlace a membrana. Aunque la interacción del segmento de dirección antipática tiene implicaciones obvias en el enlace de receptor del segmento de mensaje, las implicaciones del anfipático para el transporte de fármaco y la penetración de la BBB son también muy importantes. El transporte de la BBB ocurre a través de un proceso de endocitosis absortivo en el lado sanguíneo del endotelio de las capilaridades cerebrales (Figura 5), seguido por exocitosis en el lado cerebral, conduciendo a un mecanismo transcitótico total. Con objeto de que este proceso sea eficiente, el glicopéptido debe ser capaz de enlazarse a la membrana durante cierto periodo de tiempo, y también debe ser capaz de existir en el estado acuoso por cierto periodo de tiempo. Necesita realizarse trabajo adicional con objeto de obtener información cinética in vivo en el proceso de transporte de BBB con objeto de explotar por completo la estrategia de glicosilación.

Conclusiones. Los estudios de CD y NMR muestran que los glicopéptidos 9-12 forman estructuras nacientes de bobina de hélice- aleatorias en H20, y que la exposición de estas bobinas aleatorias acuosas a imitadores de membrana pueden producir estructuras secundarias altamente anfipáticas y helicoidales. Varias líneas de investigación in vitro (CD, NMR, PWR) muestran que la formación de hélice inducida por membrana ocurre fácilmente en presencia de imitadores de membrana aniónicos y de ión anfotérico. El enlace de la región de dirección helicoidal a la membrana puede modificar el agonismo en el receptor opioide y probablemente influirá en la cinética del enlace de opioide. Las afinidades de enlace a membrana (valores micromolares a nanomolares KD) determ inadas por PWR muestran que la afinidad de la membrana compite o incluso excede la afinidad con el receptor opioide. El enlace antipático a la membrana también parece correlacionar las velocidades de transporte a BBB. Ya que existen algunos 250 neuropéptidos conocidos, producidos en el cerebro humano, un entendimiento más completo de sus contrapartes giicosiladas podría conducir a una nueva vista de la farmacología que explota la selectividad de enlace natural de los neuropéptidos a fin de tratar una amplia variedad de desórdenes neurológicos.

EJEMPLOS Procedimientos Experimentales Materiales. Los aminoácidos, reactivos de acoplamiento y resina de amida-Rink se adquirieron en Advanced ChemTech (Lousville, EUA).

Todos los otros reactivos que incluyen dodecil sulfato-d25 de sodio, utilizados en los experimentos de NM R se adquirieron en Sigma (St. Louis, MO). Los fosfblípidos deuterados, dihexanoil-s/?-glicero-3- fosfatidilcolina-cÍ22 (DHPC), 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina- d54 (D PC) y 1 ^-dimiristoil-sn-glicero-S-fosfo-l -glicerol-ds^ (DMPG) se adquirieron en Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Síntesis y Purificación de Péptidos. Los aminoácidos de glicósilo requeridos se sintetizaron mediante el uso de métodos previamente publicados53. Los glicopéptidos se sintetizaron manualmente mediante métodos de fase sólida estándares que emplean química de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) en resina de amida Rink54. Los grupos protectores de cadena lateral se seleccionaron a fin de retirarse en una sola etapa al final de la síntesis mientras el glicopéptido aún se encuentra anexo a la resina. Los aminoácidos protegidos de cadena lateral, utilizados en la síntesis fueron Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-DThr(But)-OH y Fmoc-Tyr(But)-OH. Los acoplamientos de amida fueron con HBTU/HOBt/DI PEA. Cada acoplamiento se llevó a cabo en un recipiente de síntesis péptida manual mediante el uso de DMF como solvente mediante agitación que utiliza N2 durante 90 minutos. El acoplamiento se monitoreó por la prueba de ninhidrina Kaiser. Los grupos Fmoc se retiraron con una solución de piperidina al 20% en DMF. Una vez que el glicopéptido se ensambló y el grupo Fmoc final se retiró, los grupos protectores -Oac se disociaron del carbohidrato con 80% ?2???2·?20 en CH3OH. El glicopéptido se disoció de la resina con un cocktail F3CCOOH: Et3SiH: H20: PhOMe:CH2CI2 (9:0.5:0.5:0.05: 1 ) que también retiró los grupos protectores de cadena lateral. Los glicopéptidos crudos se precipitaron con éter enfriado en hielo, se filtraron, se re- disolvieron en H20 y se liofilizaron. Los glicopéptidos se purificaron por RP-HPLC con una columna preparativa de RP(C- 8) mediante el uso de gradiente de acetonitrilo-agua que contiene 0.1 % TFA. La homogeneidad de los glicopéptidos finales se aseguró mediante RP- HPLC analítico y espectrometría de masa. Dicroismo Circular. Todos los experimentos de dicroismo circular se llevaron a cabo en Aviv Associates modelo 60DS mediante el uso de un circulador de agua Endcal Model RTE4DD como un vehículo de control de temperatura. El instrumento se calibró mediante el uso de ácido d- 0-canforsulfónico. El espectro se registró entre 200 y 250 nm mediante el uso del modo continuo con una amplitud de banda de 1 .5 nm, una respuesta de tres segundos y una etapa de exploración de 0.5 nm en una célula con una longitud de trayectoria de 0.1 cm. Se acumularon tres o cinco exploraciones y se promediaron para cada espectro. Las soluciones depósito de glicopéptido se prepararon mediante ponderación de la cantidad requerida, usando electrobalance analítico automático de Cahn/Ventron Instrumentos Modelo 21 , para elaborar 1 mL de una solución de 0.5-1 .0 mM y el pH se ajustó al valor deseado. Las muestras se prepararon mediante dilución de la solución depósito hasta 70-80 µ?. Todos los espectros observados se sustrajeron por línea base y se suavizaron mediante promedio adyacente de 5 puntos usando software Microcal Origin Ver.5.0 (Microcal Software Inc., EUA). Las elipticidades molares se determinaron mediante el uso de la fórmula [T] = [e]Obse(MRW)/10»/«C, donde [6]obs observó la elipticidad en miligrados, MRW es el peso de residuo medio, / es la longitud de la trayectoria celular en centímetros y C es la concentración de glicopéptido en mg/mL. La oc-helicoidicidad porcentual se determinó mediante el uso de la fórmula %hélice = (1-2.5/?)·100, donde n representa el número de enlaces de amida (incluyendo la amida de terminal C) en el glicopéptido y [?]?^p* es la elipticidad molar de la banda de transición ?- p* a 222 nm55. Espectroscopia de N R. Todos los espectros de NMR se registraron en un espectrómetro Bruker DRX600 600 MHz. La concentración de glicopéptido para los experimentos de NMR varió desde 2-3 mM. Los glicopéptidos se prepararon en una solución de TFE-agua mediante disolución del péptido en 0.6 mi de solución de una mezcla pre-mezclada al 30% de TFE-agua. Las muestras de micelo se prepararon mediante disolución del glicopéptido y 100 equivalencias de SDS perdeuterado en 0.6 mi de H20/D20 (proporción 9:1 en volumen). Los bicelos se produjeron a partir de fosfolípidos deuterados. Los bicelos iónicos anfotéricos se elaboraron mediante mezcla del dihexanoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina- 22 de fosfolípido de cadena corta (DHPC) y el 1 ,2-dimiristo¡l-s/7-glicero-3-fosfatidilcolina-c/54 de cadena larga (DMPC) en la proporción molar de 2:1 en H20. Los micelos aniónicos se prepararon mediante sustitución de 10% mol de 1,2-dimiristoil-s?-glicero-3-fosfatidilcolina-c54 (DMPG) por DMPC. La proporción de glicopéptido respecto a bicelo fue de 1:25. Después de que el glicopéptido se agregó a la solución de bicelo, el sistema se sometió a una serie de tres ciclos de congelamiento/descongelamiento/ligera agitación en vórtice. El pH de cada muestra se ajustó a 4.5 mediante uso de DCL o NaOD según lo necesario. TSP (3-trimetilsilil)-o'4-ácido propiónico) se agregó como un estándar interno. Los experimentos en mezclas de F3CCD2OD/H20 fueron a 293 K y para experimentos en micelos/bicelos fueron a 298 o 31 1 K. La correlación filtrada por doble quantum de dos dimensiones (DQF-COSY), la mejora Overhauser de estructura giratoria56 (ROESY), la mejora Overhauser nuclear57 (NOESY) y el espectro de correlación total58 (TOCSY) se adquirieron mediante secuencias de impulso estándares y se procesaron mediante uso de XWI NNMR (Bruker Inc) y FELIX2000 (Accelrys Inc, San Diego, CA). Los tiempos de mezcla para espectro TOCSY fueron ya sea de 80 o de 100 ms. Los tiempos de mezcla para espectro ROESY fueron de 150 o 250 ms, y para el espectro NOESY fueron de 200 o 300 ms. Todos los experimentos fueron 750 incrementos en ti, 16/32/64 exploraciones cada uno, 1 .5 s de retraso de relajación , tamaño 2 o 4 K, y el procesamiento espectral fue con multiplicaciones de ventana de seno campana, desplazadas, en ambas dimensiones. La supresión del agua se logró para muestras de F3 C C D2O D/H2O mediante pre-saturación de la señal de H20. Ya que la técnica de supresión de H20 no produjo resultados satisfactorios para los solventes imitadores de membrana, la secuencia de impulso WATERGATE se utiliza para aquellos solventes a fin de suprimir la señal de H 2059. Las constantes de acoplamiento (3J <XH-N H) se midieron a partir de espectros en 2D DQF-COSY.

Determinación de Estructura. Los l ímites de distancia para el cálculo de estructura se obtuvieron de volúmenes integrales de los picos ROESY y NOESY. Los volúmenes integrales NOE se clasificaron en fuertes , medios y débiles con 3.0, 4.0 y 5.0 Á como distancias de enlace superior, respectivamente. La sim ulación de dinámicas moleculares se realizó con el empaque de VISTA I NTERNA/DESCUBRI R (Accelrys I nc. , San Diego, CA) con campo de fuerza de valencia consistente (CBF)60. Todos los cálculos se realizaron ín vacuo. Se utilizó u na constante dieléctrica dependiente de distancia (2.5»R, donde R es la distancia en Á. En base a la g ráfica de CS I de protón aC H y los patrones de NOEs observados, la estructura de inicio de todos los glicopéptidos tienen conformación extendida para el segmento 1 -6 de term inal N y la conformación helicoidal para el segmento de term in al C 7-1 6. La forma cargada de las cadenas laterales Glu y Lys se consideró a través de todos los cálculos . Todos los en laces péptidos se lim itaron a conformación trans mediante una penal idad de energ ía de 1 00 kcal mol" 1. Los l ím ites de distancia con una constante de fuerza de 25 kcal mol"1 se aplicaron en la forma de una cavidad de potencial de fondo plano con un enlace inferior común de 2.0 Á. Solo los límites de distancia provenientes de NOEs de inter-residuo se incluyeron en el cálculo. No se realizaron asig naciones estereoespecíficas y, no obstante, se aplicaron correcciones de pseudo átomo para todos los protones diaestereotópicos cuando se impusieron l ímites NOE61. Las limitaciones de ángulo dihédrico en base a índice de desplazamiento q uímico de aCH (CS I) se impusieron sobre los residuos que exhiben desviación de tipo hélice. Por lo tanto, para un CSI de >-0.1 0 ppm, las limitaciones f y ? se encontraron en el rango de -90° hasta -30° y -60° hasta 0o, respectivamente , mientras que para un CSI de <-0.10 ppm, los rangos correspondientes fueron de -180° hasta -30° para ? y -90° hasta 180° para <j>. Las estructuras de inicio se minimizaron con todos los límites en su lugar, primero con algoritmo descendiente escalonado, después mediante algoritmo gradiente conjugado, y finalmente se sujetaron a un protocolo de templado simulado. Se realizó una ejecución de doscientos picosegundos moleculares a 1 ,000 K, seguida por enfriamiento a 300K en 7 etapas para un total de 35 ps, y después minimización de gradiente conjugada y descenso escalonado. Cien estructuras minimizadas finales se hicieron un muestreo a intervalos de 2 picosegundos. Espectroscopia de resonancia de plasmón-guía de onda (PWR). El instrumento de PWR utilizado para estos experimentos fue dispositivo de versión prototipo Aviv Beta obtenido en Proterion Corp. (Piscataway, NJ) que tiene resolución espectral de 1 miligrado. Las membranas de lípido soportadas por sólidos, auto-ensambladas, se prepararon de acuerdo con el método utilizado para la formación de bicapas lípidas suspendidas libremente62. Esto involucra la difusión de una pequeña cantidad de solución lípida a través de un orificio en una lámina de Teflón que separa la película dieléctrica delgada (Si02) de la fase acuosa. La superficie hidrofílica de Si02 hidratado atrae los grupos polares de las moléculas lípidas, induciendo así una orientación inicial de las moléculas lípidas, señalando las cadenas de hidrocarburo hacia la gotícula de solución lípida en exceso. Las siguientes etapas de formación de bicapa, inducidas por adición de regulador acuoso al compartimento de muestra de la célula de PWR, involucran un proceso de adelgazamiento y la formación de un límite de plató-Gibbs de la solución lípida que ancla la membrana al separador de Teflón. En los presentes experimentos, las películas lípidas se formaron a partir de una solución que contiene 5 mg/ml de fosfatidilcolina de huevo (PC) en escualeno/butanol/metanol (0.05:9.5:0.5, v/v). El lípido se adquirió en Avanti Polar Lipids (Birmingham , AL). Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura constante de 25°C, usando regulador Tris de 10 mM que contiene 0.5 mM EDTA y 1 0 mM KCI (pH = 7.3), en una célula muestra de 1 ml_. Las alícuotas de los péptidos glicosilados, disueltas en agua desionizada, se inyectaron por etapas en la muestra celular de PWR y la señal se monitoreó hasta que se alcanzó el equilibrio (señal PWR uniforme). Finalmente, las constantes de disociación (valores Kd) se obtuvieron de graficar la posición m ínima de resonancia para el espectro PWR como una función de la concentración de péptido en la muestra de célula y el ajuste mediante el uso de una función hiperbólica simple para describir el enlace de un ligando a una bicapa lípida. Los análisis de datos se llevaron a cabo con GraphPad Prism (GraphPad Software, I nc. , CA, EUA). Glicopéptidos Helicoidales de Primera Generación. En la serie de la primera generación, la longitud helicoidal, que comprendió el segmento de dirección, varió con objeto de determinar la longitud m ínima requerida para la formación de hélice estable. Una secuencia anfipática de ocho residuos se utilizó como una unidad de repetición base para la hélice, variando la longitud total usada desde diez hasta catorce residuos. (Tabla 1 ) Los glicopéptidos de primera generación se estudiaron por NM R y CD para determinar el efecto de la longitud sobre la estabilidad de la hélice. Los datos de CD sugieren que estos glicopéptidos se bobinaron de manera aleatoria en agua y se volvieron helicoidales en presencia de micelos SDS. Sin embargo, no pudo hacerse correlación directa entre la longitud de la hélice de dirección y el grado de helicoidicidad del glicopéptido en una base por residuo. De hecho, el más corto de los compuestos, glicopéptido 1 , que tuvo solo 12 residuos en la región de dirección, exhibió el nivel más elevado de helicoidicidad por CD. Ya que estos glicopéptidos no fueron muy solubles en H20, fue imposible comparar las estructuras de enlace a micelo con el estado acuoso. Los estudios de NMR en los compuestos fueron problemáticos debido a la escasa solubilidad a concentración de NMR. Solo uno de los glicopéptidos en la primera generación, el glicopéptido 2, mostró una solubilidad significativa en agua, y se sujetó a estudios de N MR en H20/D20 para obtener propiedades conformaciones específicas de residuo. Se observaron varios picos de diagnóstico helicoidal (datos no mostrados). Algunos de estos NOE's "helicoidales" de rango largo recorrieron a través del residuo separador de glicina, que incluyó G3aH < - > L7NH , F4aH < --> L8NH y L5aH < ~ >A9NH. Esto sugirió que el separador de glicina no terminó la helicoidicidad como se esperaba originalmente y que la conformación del segmento de mensaje se afectó por la helicoidicidad del segmento de dirección. Aunq ue estos y otros NOE's sugirieron cierto grado de helicoidicidad en agua, el espectro de CD del glicopéptido 2 en agua disputó esta conclusión, ya que el compuesto se determinó predominantes de bobinado aleatorio por CD. Ya que el glicopéptido 2 fue el único compuesto soluble en agua de la serie de primera generación, fue el único glicopéptido para realizarse en estudios de antinocicepción in vivo y enlace in vitro. En ambos ensayos de enlace a receptor, se observó que el compuesto fue algo d-selectivo, con buena potencia en ese receptor. Cuando se compara con los glicopéptidos en base a encefalina, previamente estudiados10, la actividad del µ-receptor se disminuyó en ambos ensayos, pero el fármaco aún poseyó suficiente actividad para garantizar experimentación in vivo. Después de la examinación, el valor A50 proporciona la confirmación del éxito de uso de terminal C helicoidal anfipática para penetración de la BBB, y muestra que los análogos dé encefalina de glicopéptido a-helicoidal también pueden proporcionar efectos antinoniceptivos in vivo. Tabla 2. Datos de Dicroismo Circular para Glicopéptidos de 1 a y 2a Generación.

Péptido -[9]n^ 7t*a' b -[0]n^ 7c *a' c Rd % a-heIicoidicidade 222 nm 205 nm 1 29158 28568 1 .02 85 2 23205 23451 0.99 67 3 2271 9 22134 1 .03 65 4 28640 2921 8 0.98 82 5 201 09 20776 0.97 58 6 12628 1 5002 0.84 37 7 5344 1 1642 0.45 15 8 1 3725 16043 0.86 39 a Las unidades para [T] son deg»cm2*dmor1. b La máxima negativa para [?]?- p* se observó entre 205 y 209 nm . 0 La máxima negativa para [?]?^p* se observó entre 222 y 225 nm. dR = [?]??p./[?]?^p*. Un valor inferior de 0. 15-0.40 se observó para 31 0-hélice. e El % de helicoidicidad calculado de acuerdo con la referencia 53. Todos los datos se observaron en presencia de micelos SDS (30 mM) a pH = 7.0 y 1 8°C. Glicopéptidos Helicoidales de Segunda Generación. La principal preocupación con esta generación era la solubilidad en agua y la proporción de lipofilicidad contra hidrofilicidad. Todos los glicopéptidos de esta serie contuvo 3 glucosilserinas y fueron altamente solubles en agua. Las propiedades conformacipnales de estos glicopéptidos se estudiaron por CD. (Figura 6 y Tabla 2). Los glicopéptidos fueron enormemente bobinados de manera aleatoria en agua por CD, pero adoptaron un doblez enormemente helicoidal en micelos SDS. Esta generación de glicopéptidos fue menos helicoidal que la primera generación. El parámetro R, definido como proporción entre [?]?->p*(=222 nm) y [?]?^p*(=205 nm) , es de 0.45 para el glicopéptido 7, lo cual sugiere que la estructura del glicopéptido pudiera experimentar 310-doblez helicoidal. Es interesante observar que aunque el segmento helicoidal de terminal C del glicopéptido 7 tiene los mismos aminoácidos que el glicopéptido 8, pero invertidos, muestran espectros CD diferentes de manera distinta. Este resultado sugiere que la colocación de (os aminoácidos en la secuencia péptida es más importante que las propiedades amino ácidas solas para el logro de un patrón de doblez específico. Los intentos por determinar estructuras tridimensionales por NM R se obstaculizaron por la escasa calidad del espectro TOCSY, lo cual era normalmente esencial para identificación no ambigua de sistema-de giro . El espectro NOESY (pero no el espectro ROESY) fue de alta calidad. La razón probable para esto es el peso molecular, eficaz, incrementado, debido a la asociación glicopéptida con m icelos S DS , lo cual se soporta por tiem pos de correlación ( TC) extremadamente largos . La adm inistración i. c. v. a ratones (resultados por volverse a publicar por separado) demostró que los glicopéptidos 5, 6, y 7 son potentes agentes antinociceptivos con valores A50 por debajo de 1 00 pmoles por ratón . No existió correlación directa entre el grado de hel icoidicidad y el nivel de analgesia que proporcionó el glicopéptido. Los compuestos menos li pofílicos y moderadamente lipof ílicos mostraron todos buena ana lgesia con un tiempo de eficacia normal de 2-3 h . Este no fue el caso para la más lipofílica de las series , glicopéptido 8. Este com puesto dem ostró la potencia ínfima in vivo, pero la mayor duración de acción . Esto se debió probablemente de manera directa a la elevada lipofilicidad del glicopéptido. Este com puesto presum iblemente tendría la afinidad más elevada hacia una mem brana celular. Si el coeficiente de división entre la superficie y el exterior acuoso fuera lo suficientemente elevado, el enlace a la superficie se vuelve menos que un fenómeno reversible. S i esto suced iera, la difusión en el cerebro sería u n proceso más lento, sig nificando que el fármaco no alcanzó el receptor opioide tan rápidamente. Este proceso de difusión lento explica tanto la d uración alargada como la potencia disminuida. La cantidad de fármaco q ue agonizó el receptor fue casi nunca muy elevada en este caso, dando como resultado una potencia inferior. Pero, debido a la e levada lipofilicidad y la lenta difusión resultante en el cerebro, el fármaco permaneció disponible por periodos de tiempo mayores, dando como resu ltado una mayor duración de la acción. G l icopéptidos Helicoidales de Tercera Generación . El éxito parcial de la generación anterior de los g licopéptidos helicoidales anfipáticos dio origen al re-d iseño de la hél ice para producir los g licopéptidos de 3a generación (9-12) . El segmento helicoidal anfipático de terminal C se fijó en 9 residuos de longitud para formar dos giros a-helicoidales com pletos. En esta generación , el residuo de ácido -aminoisobutírico promotor de hélice (Aib) se colocó de m anera central en el segmento de dirección de hélice anfipática. Cuando el residuo Aib se coloca de m anera razonable, los péptidos más cortos de tanto como ocho residuos de long itud se ha observado que adoptan la conformación helicoidal en el estado de cristal así como tam bién en el estado de solución63. Algunos de los gl icopéptidos de novo de 3a generación aquí discutidos mostraron una penetración de BBB mejorada y efecto analgésico en ratones. No obstante, es interesante estudiar sus conformaciones moleculares , particularmente en presencia de sistemas modelo de mem brana con objeto de resaltar el mecanismo de transporte. El dicroismo circular y 2D 1 H-N M R fueron nuestras principales herram ientas en el estudio de la conformación . Análisis Conformaciones por C D, El dicroismo circular (CD) es una herramienta potente y simple para identificar la estructura secundaria en ambos péptidos y proteínas64. Todos ios péptidos se sujetaron a análisis de CD en H20, mezclas de TFE-H20, micelos SDS y bicelos fosfolípidos. Los resultados típicos se muestran en la Figura 6. En H20, se observa una banda negativa de casi 200 nm que surge de la transición electrónica p? p* y es típico de péptidos de bobina aleatoria. Se encontró que las secuencias derivadas de las regiones helicoidales de proteínas con frecuencia debilitan las señales de CD de hélice y pueden dar una serie de dN , N(í, i + 1 ) NOEs, pero no NOEs de rango largo. Este comportamiento se explica como hélices nacientes65. En estas hélices nacientes las señales de CD de hélice podrían inducirse por la adición de TFE66. Todos los glicopéptidos tienen una señal de CD de hélice incrementada en TFE. El porcentaje de helicoidicidad se incrementa a medida que se incrementa la concentración de TFE, pero alcanza un máximo a 30% TFE. El incremento en helicoidicidad en TFE puede atribuirse a competencia dism inuida por H20 para enlace de hidrógeno a las amidas de estructura. Esto, tomado con la observación de NOEs consecutivos de dN> N(i, i+ 1 ), pero NOEs de rango largo en H20, sugiere que los glicopéptidos son hélices nacientes en H20. En presencia de micelos SDS y bicelos aniónicos, la banda a 200 nm experimentó un desplazamiento en rojo (valor mayor) y un soporte adicional aparece alrededor de 222 nm como resultado de la transición n -> p*. La aparición de un soporte adicional sugiere que los glicopéptidos adoptan una conformación enormemente helicoidal que solo se presenta en forma naciente (un giro) en H20. La máxima negativa en 222 nm (banda de transición n - p*) se utiliza para calcular el contenido helicoidal de polipéptidos y proteínas. El valor aceptado para un péptido que es 1 00% helicoidal es de aproximadamente - 35, 000. Se observó que los cambios en amplitud de las bandas de hasta 30% dependen de la longitud de la hélice67. La amplitud se incrementa a medida que se incrementa la longitud de la cadena oc- helicoidal. Por consiguiente, uno tiene que considerar la importancia de la dependencia de la longitud de cadena del CD de a-hélice en el tratamiento cuantitativo de contenido de hélice en proteínas y polipéptidos. El porcentaje de helicoidicidad es independiente de la concentración de S DS y pH (datos no mostrados). En presencia de bicelos iónicos anfotéricos, todos los glicopéptidos produjeron espectros de CD similares a los observados en H20, pero los bicelos aniónicos los forzan a volverse más helicoidales. Las intensidades de la banda [?]p- p* y la banda [?]?- p* se espera sean casi iguales para un péptido a-helicoidal perfecto. En una 31 0-hélice la intensidad de la banda [?]?- p*(222? ??) sé reduce drásticamente con respecto a la banda de transición [?]p->p*(205?G?) y tiende a experimentar un modesto desplazamiento azul68. Este fue el caso con TFE como el solvente. Un desplazamiento azul modesto y la intensidad reducida para las bandas de transición [?]?- p* se observaron para todos los glicopéptidos en TFE. Esto sugiere que los glicopéptidos no adoptan conformaciones a-helicoidales perfectas en solvente de TFE. Los glicopéptidos 9 (Pro/Glc) y 12 (Pro/Lactosa), ios cuales difieren solo por elemento de azúcar anexo, adoptan hélices perfectas en presencia de micelos SDS y en bicelos amónicos. El disacárido incrementó el porcentaje de helicoidicidad en todos los solventes, con relación al monosacárido. Los glicopéptidos 10 (enlazador ß-Ala) y 11 (enlazador Gly-Gly) no adoptaron hélices perfectas en ninguno de los medios. Es notable observar que una sola mutación amino acida en la posición 6 produjo cambios profundos en el espectro de CD. También sugiere esto que la posición del enlazador [es decir, AA(6)] es muy importante para la bioactividad. El glicopéptido 9, el cual adoptó una hélice perfecta en el medio imitador de membrana, mostró velocidades mucho mejores de penetración de BBB en comparación con los otros glicopéptidos. De este modo, parece claro que la conformación a-helicoidal inducida por membrana es crítica para su actividad de transporte. Tabla 3. Datos de Dicroismo Circular para Glicopéptidos de 3a Generación.

Glico Solvente [?]?^p*3'? [?]p^p*?·0 R° % a- % a- péptido _ 222nm = 205nm helicoidicidad helicoidicidad por CDe por NMRf 9 F O ^27 -4942 0.01 >1 20 TFE -6181 -9445 0.60 18 30 SDS -7063 -6660 1.06 24 46 Bicelo A -8499 -4808 1.77 25 44 ?? H¡0 ^61 -6894 0.01 >1 17 TFE -7538 -16203 0.47 22 32 SDS -9892 -18090 0.56 29 55 Bicelo A -8901 -17567 0.51 27 11 H20 -61 -5055 0.01 >1 19 TFE -6094 -11357 0.54 18 28 SDS -5704 -9796 0.58 17 39 Bicelo A -5646 -8394 0.67 17 12 H¡0 -889 -6962 0.13 >1 22 TFE -7753 -11717 0.66 23 34 SDS -10668 -9097 1.17 33 29 Bicelo A -11031 -7960 1.39 33 a Las unidades para [T] son deg.cm2.dmor1. Un mínimo para [?]p- p* se observa entre 205 y 209 nm. c La máxima negativa para el [?]?- p* se observa entre 222 y 225 nm. d R = [?]??p*/[?]p^p*. Un valor menor de 0.15-0.40 se observa para 310-hélice. e El % de hélice calculado de acuerdo con la referencia 53. f Ver texto para el método de cálculo. Análisis Conformacional por NMR. El dicroismo circular proporcionó información general sobre la conformación molecular en general de los glicopéptidos en diferentes solventes. Para obtener la información específica de residuo, requerida para mejor diseño del fármaco, todos los glicopéptidos se analizaron mediante el uso de 1H-N R de 2D en H20/D20, en TFE/H20/D20, y en presencia de micelos SDS y bicelos fosfolípidos. Las asignaciones de desplazamiento químico en todos los medios se realizaron por el uso combinado de espectros TOCSY y NOESY/ROESY. La identificación del sistema de giro se realizó mediante el uso de espectro TOCSY, y las asignaciones secuenciales se realizaron mediante el uso de TOCSY y ROESY/NOESY.

Aunque se observó cierto agrupamiento de los picos de cruce diagonal, se realizaron asignaciones de protón no ambiguas para los glicopéptidos en los diversos solventes en base a la observación de NOEs secuenciales daN(i, i+1 ), dN N(i., i+ 1 ) y dp N(i, i+ 1 )69. Los valores de desplazamiento químico completos de los aminoácidos de todos los glicopéptidos se proporcionan en los datos complementarios. Los experimentos de ROESY estándares produjeron espectros de buena calidad para las muestras en H20 y mezclas de TFE-H20, pero fallaron para los solventes de imitación de membrana. Esto se debe a la asociación de los glicopéptidos con micelos y bicelos, lo cual generó ensambles moleculares de alto peso molecular que incrementaron los tiempo de correlación. Los experimentos NOESY estándares se utilizaron para muestras de SDS y bicelo. La asociación de los antipáticos de glicopéptido con micelos y bicelos originó señales de NMR más amplias en todos los glicopéptidos, sin embargo no oscureció asignaciones secuenciales. índice de Desplazamiento Químico de aCH. Se encuentra ahora bien establecido que las diferencias entre los desplazam ientos químicos aCH observados en comparación con los valores de bobina aleatorios, llamado el índice de desplazamiento químico (CSI), proporcionan una primer indicación confiable de los elementos de estructura secundaria específicos, presentes en un (glico)péptido que es comparable a la calidad de CD70. La observación de desviaciones negativas consecutivas (resonancias de aCH desplazadas hacia arriba) provenientes de bobina aleatoria es indicativa de una conformación a- helicoidal. Los valores de desplazam iento conformacional observados con relación a los valores de bobina a leatorios reportados se resumen en la Figura 7. En este punto , no existen valores otC H de bobina aleatorios , no aceptados, para serina g licosilada, los valores de CS I para esta posición son i nciertos. Los valores de desplazamiento conformaciones para todos los solventes se obtuvieron med iante el uso de valores de bobina aleatorios descritos por Wright y colaboradores72. Aunque estos desplazamientos de referencia se obtuvieron a pH = 5.0 a 4.2°C, parecen ser muy insensibles a las condiciones , ya que se observaron desviaciones m uy pequeñas (±0.04) cuando los valores de bobina aleatorios se obtienen a pH = 7.0 a 35°C por Wuthrich y colaboradores68. La cuantificación de la estructura secundaria en base a desplazamientos quím icos aCH se rechaza en la literatu ra debido a que diversas contribuciones no pueden cuantificarse de manera estricta, tal como para efectos electroestáticos, desplazam ientos de corriente anular y otras anisotrop ías magnéticas. Sin embargo, es posible hacer una comparación cualitativa del co ntenido helicoidal entre los (g lico)péptidos relacionados cercanamente. Ya q ue los g l icopéptidos de 3a generación difieren en solo un am ino ácido en la pos ición 6, el contenido helicoidal se obtuvo en base a los valores de desplazamiento quím ico aCH (Tabla 3) . El método descrito por Gierasch y colaboradores693 se uti lizó. Primero, el desplazamiento conformacional promedio se calculó para cada g licopéptido mediante adición de todos los desplazam ientos de campo ascendente en las regiones helicoidales y mediante división entre el número total de enlaces péptidos.

Entonces, para obtener el contenido helicoidal total para cada glicopéptido, el desplazamiento conformacional promedio se dividió entre 0.35 ppm , lo cual se asignó para helicoidicidad al 100%. Ya que no existen valores de bobina aleatorios disponibles para ß-Alanina y residuos de resina glicosilados, no se incluyeron en el cálculo. El residuo Aib helicogénico carece de un a-protón, y no hubo corrección incluida en el cálculo de la helicoidicidad proporcionada por el residuo Aib. El contenido helicoidal obtenido por este método se correlacionó con el contenido helicoidal obtenido por CD. El contenido helicoidal fue casi el mismo para todos los glicopéptidos en agua y TFE, pero hubo una diferencia significativa en los ambientes de membrana. Esto sugiere que cada glicopéptido interactúa de manera diferente con los micelos SDS o bicelos fosfolípidos. El glicopéptido 1 1 demostró tener menos contenido helicoidal en la membranas en comparación con otros glicopéptidos por ambos CD y NMR, y se sabe que exhibe bajas velocidades de penetración de BBB en comparación con los glicopéptidos 9 y 10. Por lo tanto, parece probable que la hélice inducida por membrana desempeña una función principal en el transporte de los glicopéptidos a través de BBB. La confirmación adicional de la naturaleza helicoidal de los anfipáticos se proporciona mediante comparación del tiempo de retención de HPLC de fase inversa (una medida válida de anfipaticidad) con la helicoidicidad por residuo para cada glicopéptido (Figura 8). Esta correlación es bastante natural debido a que se mide un fenómeno similar en cada caso. Én un caso, (eje y) el equilibrio entre un ensamble conformacional de bobina aleatoria (hélice naciente) y un ensamble anfipático de enlace a micelo helicoidal se mide en términos de elipticidad (datos de CD). En el otro caso (eje x) el equilibrio entre el mismo ensamble de bobina aleatorio y un ensamble anfipático de enlace a sílice-C18 helicoidal se mide en términos de tiempo de retención (datos de HPLC). Se observan dos líneas debido a que se utilizaron dos diferentes sistemas de solvente para elusión (CH3OH/H20 contra CH3CN/H20), pero la correlación lineal es clara en ambos casos. La naturaleza helicoidal del elemento péptido es responsable de la adsorción hacia el límite de la fase, ya sea el glóbulo de sílice modificado por hidrocarburo o micelo, y el grado de -helicoidicidad determina el grado de adsorción. Análisis Conformacional en H20. El desplazamiento químico de todos los glicopéptidos se dispersa bien en agua. Los ROEs observados se resumen en la Figura 9. Los NOEs de daN(i, i+1 ), los cuales se observan generalmente en estructuras extendidas), aparecen a lo largo de casi la longitud entera de los glicopéptidos. Los NOEs de dN N(i, i+1 ), los cuales son indicativos de estados helicoidales locales o conformacionales de giro, se observaron para todos los residuos en todos los glicopéptidos. Ninguna otra firma helicoidal para NOEs de rango largo se observó para ninguno de los glicopéptidos. La observación de NOEs de dN N(i,i + 1 ) consecutivos indicó dobleces conformacionales R transitorios para todos los residuos. Estos definen solo hélices nacientes, dado que no se observaron medios de firmas helicoidales y/o NOEs de rango largo65. Los resultados de NMR en agua implican que todos los glicopéptidos, al menos el segmento de terminal C, tenga propensión helicoidal, como se esperaría de las consideraciones de diseño. Análisis Conformacional en TFE-H20. Las hélices nacientes mostraron firmas helicoidales adicionales (NOEs de rango largo) en presencia de TFE. Los experimentos de CD mostraron que el contenido helicoidal alcanzó un máximo a 30% de TFE. De este modo, el 30% de mezcla de TFE-H20 (v/v) se seleccionó para estudio posterior. Los ROEs observados se resumen en la figura 1 0. Muchos NOEs específicos, que incluyen daN(i,i+3) y daN(i, i+4), además de una tensión continua de NOEs dNN(i, i+1 ), aparecieron en la terminal C de todos los glicopéptidos. La presencia de picos de cruce daN(i, i+4) en el segmento de terminal C de todos los glicopéptidos indicó que cierta población de cada glicopéptido adoptó una conformación a-helicoidal en vez de una conformación 31 0-helicoidal. Ya que el residuo Aib carece de un protón aCH, muchos NOEs de medio potencial y rango largo que se observarían de otro modo no se observaron en la terminal C. La aparición de dN N(i, i+ 1 ) en el segmento G(3)-L(5), junto con la falta de cualquier medio o NOEs de rango largo en la terminal N indicaron que los glicopéptidos podrían encontrarse en la conformación de giro local, o encontrarse en equilibrio entre una hélice local y una conformación extendida. La división de protones aCH Gly observada para todos los glicopéptidos en la mezcla TFE-H20 sugirió que el Gly(3) del segmento de terminal N existe en una conformación fija, rígida. Análisis Conformaciones en Presencia de Micelos SDS. Se utilizó una proporción molar de glicopéptido/micelo de 1 : 1 00 para todos los experimentos. En este solvente, las amplitudes de línea de las resonancias de protón se compararon ampliamente con H20 y mezclas de TFE-H20, lo cual se debe a la asociación de glicopéptidos con micelos SDS - dando como resultado pesos moleculares muy elevados. El micelo S DS promedio se espera que comprenda aproximadamente 60- 70 moléculas detergentes,73 dando como resultado grandes . agregados y correspondientemente una lenta limpieza molecular, lo cual conduce a una excesiva ampliación de las resonancias. Sin embargo, los espectros se dispersaron bien con solo cierto agrupamiento, permitiendo que se elaboraran asignaciones secuenciales completas. Los NOEs observados se resumen en la Figura 1 1 . la evaluación de espectro NOESY de todos los glicopéptidos reveló características consistentes : con la estructura helicoidal. Una tensión continua de NOEs de dN N(i, i+ 1 ) secuenciales se observó para casi toda la longitud de los glicopéptidos, junto con muchas firmas helicoidales, por ejemplo, NOEs dN N(i,i+2) , daN(U+3) y daN(i, i+4) . Los glicopéptidos 9 y 12, que difieren solo por el elemento de azúcar anexo al residuo Ser(15), mostraron patrones NOE ligeramente diferentes. El patrón NOE del monosacárido 9, especialmente la observación de dN N(i, i+2) [2/4 y 3/5], sugiere que el mensaje de terminal N es más ordenado que el disacárido 12. Los análisis de dinámica molecular de templado simulado se realizaron para todos los glicopéptidos a fin de obtener un ensamble de estructuras NMR mediante el uso de los límites de distancia derivados de NOE y los límites de ángulo dihédrico (f y ?). La región de terminal C Leu(8/9)-Ser(1 5/16) de todos los glicopéptidos adoptó una conformación a-helicoidal, mientras que la región de terminal N fue altamente flexible en todos los casos. El segmento de mensaje opioide fue la bobina enormemente aleatoria (es decir, un equilibrio entre la conformación de giro local y la conformación extendida) en cada caso. Análisis conformacional en presencia de Bicelos. El glicopéptido 9 muestra la mejor penetración de BBB entre todos los glicopéptidos helicoidales estudiados. No obstante, se sujetó a análisis de NMR adicional en un mejor medio de bicelo fosfolípido imitador de membrana (Figura 1 ). En bicelos iónicos anfotérico, el glicopéptido 9 exhibió la característica de espectro de CD de una conformación de bobina aleatoria, pero el análisis de NMR sugirió que la estructura del glicopéptido es helicoidal. La gráfica de CSI (Figura 7) y el patrón de NOE (Figura 12) son consistentes con la conformación a-helicoidal. Los NOEs de firma helicoidal daN(i, i+3) y daN(i, i+4) se observaron a través de toda la longitud de la estructura de péptido. Es útil comparar la región de impresión digital aCH-NH del espectro NOSEY/ROESY a medida que el solvente se cambia de CF3CH2OH: H20 a micelos a bicelos para el glicopéptido 9. Gly(3) es particularmente instructivo, como podemos ver cambia de un ambiente no limitado en TFE: H20 (Figura 1 3) a un ambiente algo más limitado en presencia de micelos (Figura 14), hasta un ambiente mucho más limitado en presencia de bicelos (Figura ) donde los protones aCH son distinguibles. Se realizó un análisis de dinámica molecular de templado simulado para obtener un ensamble de estructuras mediante el uso de los límites de distancia derivados de NOE (Figura 16). El glicopéptido 9 adopta una conformación helicoidal continua de residuos 5-16, con inicio de la conformación helicoidal en Leu(5) mientras que el inicio helicoidal se encuentra en Asn(7) en presencia de micelos SDS. El ángulo de torsión f (rotación N-Ca) del residuo Pro se limita a -60°(+20°) y, como consecuencia, las conformaciones locales de Pro se limitan en gran medida a ? « -30° (+20°) [ccR] o ? * +120° (+30°) [conformación de poliprolina]. Cuando Pro adopta una conformación de poliprolina [<f> = -60° (+20°) y ? = +120° (+30°)] en una tensión continua de hélice, esto da como resultado la terminación de la hélice74. Sin embargo, Pro en la conformación f = -60° (+20°) y ? = +120° (+30°) es compatible con una estructura a-helicoidal. No obstante, no es sorprendente que 9 forme una hélice extendida que abarca desde los residuos Leu(5)-Ser(15). La observación de daN(i,i+3) [4/7, 5/8 y 6/9] y daN(i,i+4) [4/8 y 5/9] indica que Pro(6) se encuentra en la tensión helicoidal.

O s? en Tabla 4. Flexibilidad Conformacional de los Glicopéptidos de 3a Generación.* Glicopéptido 9 Glicopéptido 10 Glicopéptido 11 Glicopéptido 12 Segmento de Mensaje de Terminal N Residuo F ? F ? F ? F ? Thr" 151(+35) -94(+9) -16(±125) -89(+)14 128(±15) 60(±6) -107(+23) -87(+59) Gly3 58(+163) 57(+7) -62(±126) -56(±4) -62(+3) -20(±5) -74(±142) -38(+64) Phe4 -122(+5) 19(±4) -81 (±11 ) -37(+16) -88(+4) -53(±4) -69(+112) -40(±44) Leus -81 (±3) -99(±3) -82(+17) -9(+40) -95(±48) -18(±60) 47(±56) -90(±70) Segmento de Dirección Helicoidal Antipático de Terminal C Residuo F ? F ? F ? F ? Asn"B -148(+1) -61(±1) -46(±29) -1(+13) -74(±9) -52(±8) -129(±7) -24(±7) Leu8/9 -71(±3) -26(±2) -81 (±10) -40(+5) -63(+5) -30(+10) -77(+13) -31 (+4) Aiba/1ü -85(+1) -24(±2) -58(±2) -33(+5) -61(+5) -54(±4) -57(±2) -32(±5) -®3í±2) -47(+4) -84(+5) -50(±6) -69(+5) -42(±7) -76(+10) -50(+6) Lysrin* -58(+2) -30(+4) -60(+3) -32(±5) -63(+3) -34(±4) -61 (+5) -29(+6) Ala1 'Vi -67(+8) -33(±4) -75(±7) -30(+4) -70(±5) -31 (±4) -77(±7) -53(+5) Leu1am -73(+6) -33(±5) -76(±6) -52(±4) -75(+4) -51 (±3) -66(+3) -26(+6) Lys14m -76(+6) -32(±5) -64(+2) -28(±4) -64(±2) -42(+3) -76(±6) -32(+6) Seri5/16 -89(±18) -32(±32) -81(±11) -24(±18) -67(±3) -27(+4) -88(+14) -50(+17) Leu16'17 -85(+6) -57(+8) -87(±6) -58(±7) 88(±3) -60(±1) -112(±19) -73(±69) * Los ángulos de torsión de estructura promedio del cálculo de dinámica molecular de templado simulado que utilizan límites de NOE en presencia de micelos SDS. Los valores R S D se dan en paréntesis. Los ángulos de torsión que se desvían más. de 30° se dan en letras negritas. Interacción de Glicopéptidos con Bicapas Lípidas Verdaderas.

La espectroscopia de Resonancia de Guía de Onda de Plasmón75 (PWR) se utilizó para monitorear la interacción de dos bicapas lípidas de glicopéptidos compuestas de fosfatidilcolina de huevo. Una bicapa lípida soportada por sólido se elaboró a través de un pequeño orificio en un bloque de Teflón que se encuentra en contacto directo con la bicapa lípida76 y cantidades crecientes de glicopéptido (disuelto en 1 0 mM Tris-regulador Cl con 0.5 M de EDTA, 10 mM KCI a pH 7.4) se agregaron a la muestra celular y se monitorearon los cambios espectrales. Los resultados de PWR (Figura 17) muestran que la formación de bicapa lípida y la adición de glicopéptido originan un desplazamiento en la posición del ángulo de resonancia hasta mayores ángulos para ambas luces polarizadas p y s. En general, tales incrementos en la posición de . ángulo de resonancia pueden atribuirse a un incremento en el índice refractivo como una consecuencia del incremento de masa en la bicapa de péptido-lípido77. La interacción del glicopéptido 9 con la bicapa lípida sigue un proceso bifásico, produciendo un desplazamiento inicial en el espectro hasta ángulos mayores (datos no mostrados) seguido por un pequeño desplazamiento hacia ángulos menores (aún positivo con relación a la bicapa) que ocurren en un orden de minutos (curva 3). Los desplazamientos en el ángulo de resonancia pueden graficarse para las adiciones increméntales de cada glicopéptido respecto a la bicapa de lípido y adaptarse a través de un ajuste hiperbólico para proporcionar constantes de afinidad. Uno puede ver en la Figura 1 8 que el glicopéptido 9 tiene una afinidad muy elevada para la bicapa de lípido (7-8 nM). Es interesante observar que la interacción del glicopéptido 9 con la bicapa de lípido produce mayores desplazamientos en polarización s que en p, por lo que ocurren cambios estructurales mayores en el lípido/péptido en el plano paralelo respecto a la bicapa de lípido en comparación con el plano perpendicular78. Estos datos, junto con el hecho de que este glicopéptido es anfipático y a-helicoidal, muestra que el glicopéptido está interactuando con la bicapa de lípido con su eje mayor orientado en paralelo a la bicapa de lípido. Esto es consistente con ambos datos de N R, así como también con los principios utilizados para diseñar la región de dirección anfipática. La interacción del glicopéptido 1 1 con la bicapa de lípido es de aproximadamente 4, 000 veces más débil (KD = 30 µ?), observándose desplazamientos espectrales mucho menores, incluso a concentración de µ? del glicopéptido. Los cambios espectrales, contrario a lo que se observó con 9, siguió un proceso menor, monotónico (datos no mostrados).

Tabla 5. Los Ángulos de Torsión de Estructura Promedio del Glicopéptido 9 en Medio de Bicelos.* Residuo F ? Conformación Thr2 62(+9) 61 (±3) Bobina aleatoria Gly3 -4(±2) 62(±1 ) Bobina aleatoria Phe4 -1 62(±6) -52(±9) Bobina aleatoria Leu¾ -54(±5) -55(+7) a-helicoidal Pro6 -61 (±5) -40(±7) a-helicoidal Asn -71 (±3) -46(+5) a-helicoidal Leu8 -63(+3) -34(+4) a-hel icoidal Aib9 -58(±3) -37(+3) a-helicoidal Glu1 ü -82(+6) -44(+9) a-helicoidal Lys1 1 -63(+3) -34(±4) a-helicoidal Ala1 2 -73(±4) -33(+3) a-helicoidal Leü1 3 -72(±3) -36(+3) a-helicoidal Lys1 4 -73(+3) -30(±3) a-helicoidal Ser1 5 -79(±8) -23(+14) a-helicoidal Leu1 6 -89(±4) -59(+6) a-helicoidal * De cálculo de dinámica molecular de tem plado sim ulado mediante el uso de NOEs med idos en presencia de bicelos iónicos anfotéricos. Los valores RMS D se dan en paréntesis. Obviamente , numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores. Por cons ig uiente, debe entenderse que dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede practicarse de otro modo diferentes al específicamente descrito en la presente.

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Soc. 1996, 118, 2744-2745. b) Toniolo, C; Formaggio, F.; Tognon, S.; Broxterman, Q.B.; Huang, R.; Setnicka, V.; Keiderling, T.A.; McColl, I.H.; Hecht, L; Barron, L.D. Biopolymers 2004, 75, 32-45 69. Wuthrich, K. NMR of proteins and nucleic acids; Wiley: New York, 1986. 70. Wishart, D.S.; Sykes, B.D. Methods Enzymol. 1994, 239, 363-393. 71. a) Rizo, J.; Blanco, FJ.; Kobe, B.; Bruch, M.D.; Gierasch, L.M. Biochemistry 1993, 32, 4881-4894. b) erutka, G.; Morikis, D.; Bruschweiler, R.; Wright, P.E. Biochemistry 1993, 32, 13089-13097. 72. Merutka, G.; Dyson, HJ.; Wright, P.E. J. Biomol. NMR. 1995, 5, 14-24. 73. Helenius, A.; McCaslin, D.R.; Fríes, E.; Tanford, C. Methods Enzymol. 1919, 56, 734-749. 74. Gunasekaran, K.; Nagarajaram, H.A.; Ramakrishnan, C; Balaram, P. J. Mol. Biol. 1998, 275, 917-932. 75. La resonancia de guía onda de plasmón (PWR) es ligeramente diferente de la resonancia de plasmón de superficie (SPR) en que uno puede obtener la información tanto en el modo s (paralelo a la superficie de membrana) como el modo p (perpendicular a la superficie de membrana). Schuck, P. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997, 26, 541-66. 76. Salamon, Z.; Macleod, H.A.; Tollin, G. Biophys. J. 1997, 73, 2791-2797. 77. a) Salamon, Z.; Macleod, H. A.; Tollin, G. Biochim. Biophys. Acta. 1997, 1331, 117-129. b) Salamon, Z.; Macleod, H.A.; Tollin, G. Biochim. Biophys. Acta. 1997, 1331, 131-152. 78. Salamon, Z.; Brown, M. F.; Tollin, G. Trends Biochem. Sci. 1999, 24, 213-219.

Claims (1)

1. REIVI NDICACIONES 1 . Un glicopéptido anfipático, caracterizado porque el glicopéptido comprende al menos 9 residuos aminoácidos, y en donde al menos uno de los residuos aminoácidos se glicosila. 2. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia amino ácida comprende una secuencia de mensaje opioide terminal, una secuencia de dirección de terminal C, y una secuencia eniazadora entre la secuencia de mensaje y la secuencia de la dirección. 3. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de terminal N es Y-t-G-F- o Y-a-G-F-. 4. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de terminal N es Y-t-G-F-L-P. 5. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de terminal N es . Y-t-G-F-L-ß?-. 6. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de terminal N es Y-t-G-F-L-G-G. 7. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque es encefalina glicosilada. 8. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque es endorfina glicosilada. 9. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque adopta una conformación helicoidal en presencia de una bicapa lípida. 10. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque es substancialmente no helicoidal en agua en ausencia de una bicapa lípida. 1 1 . El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque es substancialmente no helicoidal en agua en ausencia de una bicapa de lípido y adopta una conformación helicoidal en presencia de una bicapa de lípido. 12. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque un residuo amino ácido se glicosila. 13. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque dos residuos aminoácidos se glicosilan. 14. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprendé al menos un residuo de serina que se glicosila. 15. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende 2 residuos de serina que se glicosilan. 16. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque es se glicosila con una unidad de glicosilo que tiene cuando mucho 8 unidades de sacárido. 17. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque se glicosila con una unidad de glicósilo que tiene cuando mucho 4 unidades de sacáridos. 1 8. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque se glicosila con una unidad de glicósilo que tiene cuando mucho 2 unidades de sacáridos. 1 9. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque se glicosila con una unidad de glicosilo que tiene cuando mucho 1 unidad de sacárido. 20. Ei glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque contiene un residuo glucósido de serina. 21 . El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque contiene 2 residuos de glucósido de serina. 22. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende al menos 1 0 residuos aminoácidos. 23. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende ai menos 12 residuos aminoácidos. 24. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende al menos 14 residuos aminoácidos. 25. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende al menos 1 5 residuos aminoácidos. 26. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende al menos 17 residuos aminoácidos. 27. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende al menos 1 9 residuos aminoácidos. 28. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende cuando mucho 60 residuos aminoácidos. 29. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque tiene cuando mucho 5% de helicoidicidad según se mide por dicroismo circular en agua y al menos 10% de helicoidicidad en presencia de una bicapa lípida. 30. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque cruza la barrera cerebro-sanguínea. 31 . El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque es selectivo para al menos un receptor seleccionado a partir del grupo que consiste en el receptor opioide detal, receptor opioide mu y receptor opioide kappa. 32. El glicopéptido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia amino ácida comprende una secuencia de mensaje no opioide de terminal N, una secuencia de dirección de terminal C, y una secuencia enlazadora entre la secuencia de mensaje y la secuencia de dirección. 33. El glicopéptido según la reivindicación 32, caracterizado porque la secuencia de mensaje no opioide es proveniente del factor de liberación de corticotropina (CRF), hormona de luteinización (LH) , corionogonadotropina humana (hCG), hormona estimuladora de folículo (FSH), péptido intestinal vasoactivo (VI P), bradiquinina, vasopresina, neuroquininas, sustancia P o prolactina. 34. Una composición farmacéutica que comprende ei glicopéptido según la reivindicación 1 y al menos un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptables. 35. Un método de alivio del dolor, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad eficaz del glicopéptido según la reivindicación 1 hacia un sujeto que necesita de la misma. 36. Un método para la proporción de analgesia, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad eficaz del glicopéptido según la reivindicación 1 , a un sujeto que necesita del mismo. 37. Un método para el tratamiento de ansiedad, depresión, obesidad, anorexia, nerviosa, fobias, esquizofrenia, enfermedad de parkinson y enfermedad de Alzheimer, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad eficaz del glicopéptido según la reivindicación 1 a un sujeto que necesita del mismo.