CN116209671A - 补体因子c3的抑制剂及其医学用途 - Google Patents

补体因子c3的抑制剂及其医学用途 Download PDF

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Abstract

描述了与13个氨基酸的补体抑制素肽相比具有改善的物理化学性质，例如增加的稳定性和/或溶解性的补体抑制素类似物，特别是另外具有有用的结合和补体抑制活性的补体抑制素类似物。这些类似物在半胱氨酸残基的硫原子之间具有亚烷基桥，并且包括在位置3处具有异亮氨酸残基代替野生型缬氨酸残基的变体，这提供了具有改善的结合和补体抑制活性的补体抑制素肽，并且还能够引入其他修饰，例如能够增加稳定性的修饰，例如在位置11处引入赖氨酸或丝氨酸。

Description

补体因子C3的抑制剂及其医学用途
技术领域
本发明涉及抑制体内补体级联的活化，并且更特别地涉及能结合至C3蛋白且抑制补体活化的补体抑制素(compstatin)类似物。本发明还涉及补体抑制素类似物的医学用途，特别地用于治疗以补体级联不期望的活化为特征的病症，例如自身免疫病和炎性疾病。
背景技术
人类补体系统是防御病原生物体和介导免疫反应的有力参与者。补体可通过三种不同途径活化：经典途径、凝集素途径和替代途径。所有三种途径共有的主要活化事件是补体系统的中心蛋白C3被C3转化酶蛋白水解裂解成其活化产物C3a和C3b。这些片段的产生导致C3b和iC3b对致病细胞的调理作用(一种使其易于吞噬或清除的过程)，并且导致通过与补体相互作用而活化免疫细胞。C3b在靶细胞上的沉积还诱导新转化酶复合物的形成，从而起始自扩增环。血浆和细胞表面结合蛋白系综仔细地调控补体活化，以防止宿主细胞通过补体级联自攻击。然而，补体的过度活化或不适当调控可导致许多病理状况，范围为自身免疫病至炎性疾病。因此，非常需要开发治疗性补体抑制剂。在此背景下，C3和C3b已作为有前景的靶标出现，因为它们在级联中的中心作用允许同时抑制补体的起始、扩增和下游活化。
鉴于治疗潜能，本领域仍存在进一步优化补体因子C3的抑制剂的问题，例如以实现甚至更高的活性和/或调节药代动力学特性(例如增加的体内半衰期)和/或物理化学特性(例如增加的稳定性或溶解性)。
发明内容
广义地说，本发明涉及在半胱氨酸残基的硫原子之间具有亚烷基桥而不是在补体抑制素中发现的二硫键的补体抑制素类似物。与补体抑制素相比，这些补体抑制素类似物具有改善的物理化学稳定性，例如增加的稳定性和/或溶解度。在其他优点中，据信与在相应位置处含有二硫键的等效分子相比，它可提供稳定性(例如物理或化学稳定性)的改善。与13个氨基酸的补体抑制素肽(ICVVQDWGHHRCT(环状C2-C12))相比，这些补体抑制素类似物可另外具有改善的结合和补体抑制活性，尤其是在体内，因为增加的稳定性可补偿由纳入亚烷基桥而不是二硫键导致的绝对效力的任何降低。在位置2和12的半胱氨酸残基之间引入这种亚烷基结合(桥)，例如通过使用硫缩醛键(例如亚甲基硫缩醛)，因此改善了补体抑制素类似物的总体物理化学特性。
与二硫化物桥相比，亚烷基桥在两个硫原子之间引入了一个或多个另外的脂肪族碳。亚烷基桥合适地是C1-3亚烷基，其可以任选地被取代。优选的桥是两个硫原子之间的C1-亚烷基，优选亚甲基。换言之，半胱氨酸残基之间优选地存在亚甲基硫缩醛键(–S–CH2–S–)。亚甲基部分的添加使桥的长度增加了大约1.6埃，并引入了另外的自由度。从分子动力学模拟中，我们观察到具有硫缩醛桥的补体抑制素类似物可以保持在结合至C3的补体抑制素的晶体结构中发现的类似二级结构(pdb-编码：2QKI)。从另外的分子动力学模拟中，我们已经看到具有硫缩醛桥的补体抑制素类似物可以保持与如在补体抑制素中所见相同的与C3的分子间相互作用。在同一模拟过程中，我们观察到半胱氨酸12的脂肪族β-碳和色氨酸4的芳香族侧链之间的脂肪族-π堆积相互作用。有趣的是，这种相互作用也存在于结合至C3的补体抑制素的晶体结构中(pdb-编码：2QKI)。不希望受限于理论，这些发现表明可以在补体抑制素类似物中引入硫缩醛键，同时保持与如在补体抑制素中所见相同的与C3的分子间和分子内相互作用。
因此，在一方面，本发明提供了由式I表示的补体抑制素类似物：
Y1-R1-X1-C-X3-X4-Q-X6-W-X8-X9-H-X11-C-X13-R2-Y2 (I)
其中：
Y1是氢、乙酰基或亲脂基团Φ；
X1是I、Y、F或Sar；
X3是I或V；
X4是W、F、V、Y、1-Me-Trp、D-Trp、N-Me-Trp、1-For-Trp、1-Nal、2-Nal、5MeTrp、Bpa或2Igl；
X6是E或D；
X8是G或Sar；
X9是H、A、E、D、K、R或S；
X11是R、K或S；
X13是T、S、E、F、H、K、Sar、G、I、D、N-Me-Ile或N-Me-Thr；
Y2是NH2、OH或亲脂基团Φ；
R1不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、Q、Y、V或Sar、或其相应D形式；并且
R2不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、V、8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基(Peg3)、Sar、γGlu、或其相应D形式；
其中该补体抑制素类似物任选地包含至少一个共价连接至一个或多个氨基酸残基的侧链的亲脂基团Φ；并且
其中所述补体抑制素类似物在位置2和12处的半胱氨酸残基的硫原子之间具有C1-3亚烷基桥；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
例如，发现在位置3处引入异亮氨酸残基代替野生型缬氨酸残基导致具有改善的结合和补体抑制活性的补体抑制素肽。在位置3处引入异亮氨酸还可以引入其他修饰，例如能够增加稳定性和/或溶解性的修饰，例如在位置11处引入赖氨酸或丝氨酸，并用Ser、Glu、Sar或Ile置换位置13处的Thr。例如，与补体抑制素(1-13)肽(ICVVQDWGHHRCT(在C2和C12之间具有二硫键))或已知的补体抑制素类似物Cp40相比，包含一个或多个这些修饰的优选补体抑制素肽具有改善的溶解性和/或活性。
因此，在另一方面，本发明提供了由式II表示的补体抑制素类似物：
Y1-R1-X1-C-I-X4-Q-X6-W-X8-X9-H-X11-C-X13-R2-Y2 (II)
其中：
Y1是氢、乙酰基或亲脂基团Φ；
X1是I、Y、F或Sar；
X4是W、F、V、Y、1-Me-Trp、D-Trp、N-Me-Trp、1-For-Trp、1-Nal、2-Nal、5MeTrp、Bpa或2Igl；
X6是E或D；
X8是G或Sar；
X9是H、A、E、D、K、R或S；
X11是R、K或S；
X13是T、S、E、F、H、K、Sar、G、I、D、N-Me-Ile或N-Me-Thr；
Y2是NH2或OH；
R1不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、Q、Y、V或Sar、或其相应D形式；并且
R2不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、V、8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基(Peg3)、Sar、γGlu、或其相应D形式；
其中该补体抑制素类似物任选地包含至少一个共价连接至一个或多个氨基酸残基的侧链的亲脂基团Φ；并且
其中所述补体抑制素类似物在位置2和12处的半胱氨酸残基的硫原子之间具有C1-3亚烷基桥；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在式I和II的一些实施例中：
X1是I、Y或F；
X4是W、Y、1-Me-Trp、1-Nal、2-Nal；
X6是E或D；
X8是G或Sar；
X9是A或E；
X11是R或K；并且
X13是T、S、E、F、H、K、Sar、G、I、D、N-Me-Ile或N-Me-Thr。
本发明进一步提供了由式III表示的补体抑制素类似物：
Y1-R1-F-C-I-1-Me-Trp-Q-X6-W-X8-E-H-R-C-X13-R2-Y2 (III)
其中：
Y1是氢、乙酰基或亲脂基团Φ；
X6是E或D；
X8是G或Sar；
X13是T或Sar；
Y2是NH2、OH或亲脂基团Φ；
R1不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、Q、Y、V或Sar、或其相应D形式；并且
R2不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、V、8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基(Peg3)、Sar、γGlu、或其相应D形式；
其中该补体抑制素类似物任选地包含至少一个共价连接至一个或多个氨基酸残基的侧链的亲脂基团Φ；并且
其中所述补体抑制素类似物在位置2和12处的半胱氨酸残基的硫原子之间具有C1-3亚烷基桥；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
基团R1的序列的实例包括：
SE、EGSA、GE、E、{d}Y、EGSE、KSGE、EQEV、ESQV、ESEQV、SEQA、SKQE、EGESG、GQSA、ESGV和YEQA。
不希望受限于理论，结构上的考虑表明包括谷氨酰胺(Q)残基的R1基团可以与C3特别好地相互作用，导致补体抑制的效力增加。与二硫键相比，这可能有助于补偿由半胱氨酸侧链之间的亚烷基键导致的任何效力降低。
基团R2的序列的实例包括：
GAES、EGE[Peg3][Peg3]-K*、EK[γGlu]-K*、
EGA-K*、EGE[Peg3]ES-K*、
EAE[Peg3][Peg3]-K*、E[Peg3][Peg3]-K*、EA[Peg3][Peg3]-K*、GAES[Peg3][Peg3]-K*和EGE，其中*指示该氨基酸残基带有共价连接至其侧链的亲脂基团Φ。
亲脂基团Φ可共价连接至R2中的一个或多个残基的侧链、尤其是赖氨酸残基的侧链。X*指示该氨基酸残基X带有共价连接至其侧链的亲脂基团Φ。可期望带有Φ的残基在R2的C-末端，例如在R2的C-末端的Lys残基。
补体抑制素类似物的肽骨架(即不包括Y1和Y2基团)可由下式表示：
1；31 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDWGEHR[C(x)]TGAES
2 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDWGEHR[C(x)][Sar]EGE[Peg3][Peg3]-[K*]
3 EGSAY[C(x)]I[1-Me-Trp]QDWGEHR[C(x)][Sar]EK[γGlu]-[K*]
4 Ac-SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDWGEHR[C(x)][Sar]EGA-[K*]
5 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDWGEHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
6 GEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDWGEHR[C(x)][Sar]EAE[Peg3][Peg3]-[K*]
7 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)][Sar]E[Peg3][Peg3]-[K*]
8 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)][Sar]E[Peg3][Peg3]-[K*]
9 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
10 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TE[Peg3][Peg3]-[K*]
11 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
12 EF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEA[Peg3][Peg3]-[K*]
13 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]AHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
14 SEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDWGEHR[C(x)]TGAES[Peg3][Peg3]-[K*]
15 {d}YI[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
16 SEF[C(x)]IWQDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
17 SEF[C(x)]IYQDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
18 SEY[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
19 EGSEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE
20 EGSEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
21 KSGEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
22 EQEVF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
23 ESQVF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
24 ESEQVF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
25 SEQAF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
26 SKQEF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
27 EGESGF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
28 GQSAF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
29 ESGVF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3][Peg3]-[K*]
30 YEQAF[C(x)]I[1-Me-Trp]QDW[Sar]EHR[C(x)]TEGE[Peg3]ES-[K*]
其中[C(x)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚烷基(例如亚甲基(x＝1)、亚乙基(x＝2)或亚丙基(x＝3))桥的半胱氨酸残基对，并且其中*指示该氨基酸残基带有共价连接至其侧链的亲脂基团Φ。
补体抑制素类似物的肽骨架(即不包括Y1和Y2基团)可由下式表示：
Figure BDA0004122581110000071
/>
Figure BDA0004122581110000081
其中[C(1)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚甲基桥连基团的半胱氨酸残基对，其中[C(2)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚乙基桥连基团的半胱氨酸残基对，并且其中*指示该氨基酸残基带有共价连接至其侧链的亲脂基团Φ。
补体抑制素类似物的肽骨架(即不包括Y1和Y2基团)可由下式表示：
Figure BDA0004122581110000082
/>
Figure BDA0004122581110000091
/>
Figure BDA0004122581110000101
其中[C(x)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚烷基(例如亚甲基、亚乙基或亚丙基)桥的半胱氨酸残基对，并且其中*指示该氨基酸残基带有共价连接至其侧链的亲脂基团Φ。
补体抑制素类似物的肽骨架(即不包括Y1和Y2基团)可由下式表示：
Figure BDA0004122581110000102
/>
Figure BDA0004122581110000111
/>
Figure BDA0004122581110000121
其中[C(1)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚甲基桥连基团的半胱氨酸残基对，并且[C(2)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚乙基桥连基团的半胱氨酸残基对。
补体抑制素类似物可由下式表示：
Figure BDA0004122581110000122
/>
Figure BDA0004122581110000131
/>
Figure BDA0004122581110000141
其中[C(1)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚甲基桥的半胱氨酸残基对(也就是说，[C(1)]残基具有–S–CH2–S–键)，并且[C(2)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚乙基桥连基团的半胱氨酸残基对(也就是说，[C(2)]残基具有–S-CH2-CH2-S-键)。
在另一方面，本文描述了组合物，其包含与载体混合的补体抑制素类似物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些情况下，组合物是药物组合物且载体是药学上可接受的载体。
在另一方面，本文描述了药物组合物，其包含与药学上可接受的载体、赋形剂或运载体混合的补体抑制素类似物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一方面，本文描述了用于在疗法中使用的补体抑制素类似物。
在另一方面，本文描述了用于在抑制补体活化的方法中使用的补体抑制素类似物。例如，抑制补体活化包括一种或多种选自以下的生物活性：(1)结合至C3蛋白，(2)结合至C3b蛋白和/或(3)抑制天然C3被C3转化酶裂解。下文讨论可使用补体抑制素类似物治疗的疾病或病症的实例。
在另一方面，本文描述了补体抑制素类似物，其用于在抑制在细胞或器官移植期间发生的补体活化的方法中使用。
在另一方面，本文描述了用于治疗有需要的受试者的抑制补体活化的方法，该方法包括向该受试者施用补体抑制素类似物，从而抑制该受试者中的补体活化。下文讨论可使用补体抑制素类似物治疗的疾病或病症的实例。
在另一方面，本文描述了在生理液的体外分流期间抑制补体活化的离体方法，该方法包括使生理液与补体抑制素类似物接触，从而抑制补体活化。
在另一方面，本文描述了补体抑制素类似物在制备用于抑制补体活化的药物中的用途。下文讨论可使用本发明的补体抑制素类似物治疗的疾病或病症的实例。
附图说明
图1
在时间0向非人灵长类动物施用测试化合物后，随时间的替代补体途径的归一化“离体”活性。化合物以1840nmol/kg的剂量皮下给予。使用Wieslab试剂盒测量补体活性(替代途径)。使用预剂量(0)样品(设定为100％)和试剂盒中包括的阴性对照将活性归一化。显示归一化活性或平均归一化活性和标准偏差。(a)化合物2、化合物5、化合物7(每个化合物均为一只动物)和Cp40(4只动物)；(b)化合物12、化合物20和化合物25，每个化合物均为一只动物和Cp40(4只动物)。
具体实施方式
如本文所用，“和/或”被认为是两个指定特征或组分中的每个的具体披露内容，具有或不具有另一个。例如，“A和/或B”应视为(i)A、(ii)B以及(iii)A和B的具体披露内容，如同每个在本文中单独地陈述一般。
除非上下文另有说明，否则上文所述特征的说明和定义不限于任一特定方面或实施例且同样地适用于所述的所有方面和实施例。
在整个说明书中引用各种出版物，包括专利、公开的申请、技术文章和学术文章。这些引用的出版物中的每个均以其全文通过引用并入本文。
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文所述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学相关使用的命名法和技术是本领域已知且常用的。
本文所述的每个实施例可单独或与一个或多个其他实施例组合实施。
除非另有说明，否则为本书面说明中使用的具体术语提供以下定义。
定义
在整个本说明书中，词语“包含”及其语法变体(例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”)将理解为暗指包括所述整体或组分或整体或组分的组，但不包括任何其他整体或组分或整体或组分的组。
除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a，an)”和“该(the)”包括复数。
术语“包括”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“患者”、“受试者”和“个体”可互换使用。受试者可为哺乳动物，包括人类或非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物(例如猿、旧大陆猴或新世界猴)、家畜动物(例如牛或猪)、伴侣动物(例如犬或猫)或实验室动物(例如啮齿类动物(例如小鼠或大鼠))。
在整个本说明书和权利要求中使用天然存在的氨基酸的常规三字母和单字母代码，即A(Ala)、G(Gly)、L(Leu)、I(Ile)、V(Val)、F(Phe)、W(Trp)、S(Ser)、T(Thr)、Y(Tyr)、N(Asn)、Q(Gln)、D(Asp)、E(Glu)、K(Lys)、R(Arg)、H(His)、M(Met)、C(Cys)和P(Pro)；以及其他α-氨基酸的广泛接受的三字母代码，例如正亮氨酸(Nle)、肌氨酸(Sar)、α-氨基异丁酸(Aib)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、2,4-二氨基丁酸(Dab)和2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸；Orn)、1-甲基-色氨酸(1-Me-Trp、1Me-Trp或1MeTrp)、1-甲酰基-色氨酸(1-For-Trp或1For-Trp或1ForTrp)、1-萘(1-Nal或1Nal)、2-萘(2-Nal或2Nal)、5-甲基-色氨酸(5-Me-Trp或5Me-Trp或5MeTrp)、对-苯甲酰基-苯丙氨酸(Bpa)2-二氢茚基甘氨酸(2Igl或2-Igl)。当在本说明书中用于通式或序列时，尤其是当式或序列的其余部分使用单字母代码显示时，其他α-氨基酸可显示在方括号“[]”中(例如“[Nle]”)。上文所列示的20种“天然存在的”氨基酸是由标准遗传密码编码的那些，并且还可称为“蛋白”氨基酸。
伽马(Gamma)-Glu和贝塔(beta)-Asp(还称为γGlu(γ-Glu)和βAsp(β-Asp)(或isoGlu和isoAsp))是指分别经由γ-或β-甲酸(通常视为侧链羧基)而非常规构型参与肽键的谷氨酸盐或天冬氨酸盐。类似地，εLys或isoLys是指经由ε氨基(通常视为侧链氨基)而非α氨基参与肽键的赖氨酸。
贝塔-Ala(还称为β-Ala或βAla)是指3-氨基丙酸。
Peg3是指8-氨基-3,6-二氧杂辛酸的残基(还称为{2-[2-氨基乙氧基]乙氧基}乙酸)且Peg4是指11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷酸的残基。该残基还可表示为[8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基]。
Figure BDA0004122581110000171
除非另外规定，否则本文所述肽中的氨基酸残基呈L-构型。然而，在一些情况下，可纳入D-构型氨基酸。在本发明的上下文中，用小写字母书写的氨基酸代码表示所述氨基酸的D-构型，例如“K”表示赖氨酸(K)的D-构型，或D-构型氨基酸可写为(d)X或{d}X，其中X是氨基酸，例如(d)Y或{d}Y表示酪氨酸(Y)的D-构型。
显示为“C(x)”的半胱氨酸残基表明它们的侧链参与了二硫醚键。也就是说，它们是桥接的。因此，在任何给定的分子中通常将有两个这样的残基。该桥是连接半胱氨酸残基的硫原子的亚烷基。合适地，脂族基团是短(C1-3-亚烷基)部分，其可以是未取代的或任选取代的。优选地，它是未取代的。在一些情况下，两个[C(x)]残基可通过–S–(CH2)n–S–桥接，其中n是1、2或3，并且硫原子是半胱氨酸残基侧链的一部分。优选地，n是1或2(也就是说，亚甲基或亚乙基桥连基团)，更优选地，n是1。当n是1时，该键可称为硫缩醛。这种硫缩醛在本领域中也可称为二硫缩醛。
硫缩醛可以是亚甲基硫缩醛。也就是说，该桥是亚甲基，并且两个[C(x)]残基通过–S–CH2–S–键连接。这通常用显示为C(1)的残基来指名。
桥接基团可以是亚乙基桥接基团，即两个[C(x)]残基通过–S–CH2-CH2–S–键连接。这通常用显示为C(2)的残基来指名。
桥接基团可以是丙烯桥接基团，即两个[C(x)]残基通过–S–CH2-CH2–CH2–S–键连接。这通常用显示为C(3)的残基来指名。
在半胱氨酸残基之间引入这种桥的方法对技术人员来说将是显而易见的，并且可以包括用半胱氨酸残基的硫原子亲核取代离去基团。例如，可以通过二碘甲烷的双重置换来插入亚甲基硫缩醛键。
以类似的方式，显示为“C(*)”的半胱氨酸残基表明它们的侧链参与了二硫键。
在肽主链的N-和C-末端存在的末端基团分别指名为Y1和Y2。因此，Y1键合至N-末端氨基的氮原子且Y2键结至C-末端羰基碳原子。
Y1＝氢(还指示为“H-”或“Hy-”)指示氢原子，对应于在N-末端存在游离一级或二级氨基。Y1＝乙酰基(“Ac”)指示存在N-末端二级乙酰基酰胺基团。
Y2＝“OH”或“NH2”指示在分子的C-末端存在羧基(COOH)基团或酰胺基(CONH2)基团。
在一些实施例中，Y1是氢或乙酰基，并且Y2是NH2。
可替代地，Y1和Y2基团中的一个或两个可以独立地是亲脂基团
Figure BDA0004122581110000181
如本说明书中其他地方所述。
亲脂性取代基
补体抑制素类似物可带有亲脂基团，指名为Φ。
亲脂基团可共价连接至分子的N-末端和/或C-末端，即Y1可为Φ(代替H或Ac)和/或Y2可为Φ(代替OH或NH2)。通常，Y1和Y2中仅一个是亲脂基团
Figure BDA0004122581110000191
特别是Y1。
另外或可替代地，亲脂基团可共价连接至类似物内的氨基酸残基的侧链。残基可为R1、R2的部分或分子的补体抑制素类似物部分X1-X13。当是R2的一部分时，可期望该残基是R2的C-末端残基。在该分子的补体抑制素类似物部分X1-X13中，位置X11可能是特别合适的。
亲脂基团Φ通常经由酰基附接。因此，修饰可称为酰化，但还可称为脂化。
亲脂基团包括衍生自脂肪酸的长链亚烷基，本文称为Z1且称为亲脂性取代基。不希望受限于理论，据信亲脂性取代基结合血流中的血浆蛋白(例如白蛋白)，因此保护本发明上下文中采用的化合物免于酶促降解，从而提高化合物的半衰期。亲脂性取代基还可调节化合物的功效。
Z1可直接附接至氨基酸序列(包括R1和R2延伸物，或作为Y1)或经由如本文定义的间隔子Z2附接至氨基酸序列。
换言之，Φ可为Z1-或Z1-Z2-。
在Y1是Φ的情况下，Φ优选是Z1-。
在亲脂基团Φ连接至氨基酸侧链的情况下(即在Y1是氢或Ac的情况下)，Φ可优选为Z1-Z2-。
在某些实施例中，仅一个氨基酸侧链缀合至亲脂性取代基。在其他实施例中，两个氨基酸侧链各自缀合至亲脂性取代基。在另外实施例中，三个或甚至更多个氨基酸侧链各自缀合至亲脂性取代基。当化合物含有两个或更多个亲脂性取代基时，其可为相同或不同的取代基。
在某些实施例中，分子中存在仅一个亲脂基团Φ。
术语“缀合”在本文中用于描述一个可鉴别化学部分与另一个的共价连接，以及这样的部分之间的结构关系。不应将其视为暗指任一特定合成方法。当存在时，一个或多个间隔子Z2用于提供化合物与亲脂性取代基Z1之间的间距。
亲脂性取代基可经由酯、磺酰基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺附接至N-末端氮、或附接至氨基酸侧链或附接至间隔子。因此，应理解，亲脂性取代基可包括酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子，其形成酯、磺酰基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺的一部分。
合适地，亲脂性取代基中的酰基与N-末端氮、或氨基酸侧链、或间隔子形成酰胺或酯的一部分。亲脂性取代基可包括具有10至24个碳(C)原子，例如10至22个C原子、例如10至20个C原子的烃链。优选地，其具有至少11个C原子，并且优选其具有18个C原子或更少C原子。例如，烃链可含有12、13、14、15、16、17或18个碳原子。烃链可为直链或支链且可为饱和或不饱和的。
烃链可在其长度中纳入亚苯基或吡嗪亚基部分，例如如下所示(其中---表示链内的连接点)。这些基团应“计数”为链长度中的4个碳原子。
Figure BDA0004122581110000201
自上文讨论可了解，烃链可被形成与氨基酸侧链或间隔子的连接的一部分的部分(例如酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子)取代。最优选地，烃链被酰基取代，并且因此，烃链可为烷酰基的一部分，例如十二烷酰基、2-丁基辛酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷酰基或二十烷酰基。可替代地，Z1基团衍生自式HOOC–(CH2)12-22–COOH的长链饱和α,ω-二羧酸、优选脂肪族链中具有偶数个碳原子的长链饱和α,ω-二羧酸。
换言之，Z1可为A–C12-22亚烷基-(CO)-，其中A是H或-COOH，并且其中亚烷基可为直链或支链且可为饱和或不饱和的，并且可任选地在其长度中纳入亚苯基或吡嗪亚基部分。
例如，Z1可为
十二烷酰基，即H–(CH2)11–(CO)–；
十四烷酰基，即H–(CH2)13–(CO)–；
十六烷酰基，即H-(CH2)15-(CO)-；
13-羧基十三烷酰基，即HOOC–(CH2)12–(CO)–；
15-羧基十五烷酰基，即HOOC–(CH2)14–(CO)–；
17-羧基十七烷酰基，即HOOC–(CH2)16–(CO)–；
19-羧基十九烷酰基，即HOOC–(CH2)18–(CO)–；或
21-羧基二十一烷酰基，即HOOC–(CH2)20–(CO)–。
羧酸(若存在)可由生物等排体、磷酸酯或磺酸酯置换。羧酸的合适的生物等排体为本领域已知且包括四唑、酰基磺酰胺、酰基羟基氨和方酸衍生物。
如上文所提及，亲脂性取代基Z1可通过一个或多个间隔子Z2缀合至氨基酸侧链或N-末端氮。
在存在间隔子时，其是附接至亲脂性取代基且附接至氨基酸侧链或N-末端氮。间隔子可独立地通过酯、磺酰基酯、硫酯、酰胺或磺酰胺附接至亲脂性取代基和附接至氨基酸侧链。因此，其可包括两个独立地选自酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子的部分。间隔子可由直链C1-10烃链或更优选直链C1-5烃链组成。此外，间隔子可被一个或多个选自C1-6烷基、C1-6烷基氨、C1-6烷基羟基和C1-6烷基羧基的取代基取代。
间隔子可为(例如)任何天然存在或非天然氨基酸的残基。例如，间隔子可为Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、γ-Glu、β-Asp、ε-Lys、Asp、Ser、Thr、Dapa、Gaba、Aib、β-Ala(即，3-氨基丙酰基)、4-氨基丁酰基、5-氨基戊酰基、6-氨基己酰基、7-氨基庚酰基、8-氨基辛酰基、9-氨基壬酰基、10-氨基癸酰基、8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基的残基。在某些实施例中，间隔子是Glu、γ-Glu、ε-Lys、β-Ala(即，3-氨基丙酰基)、4-氨基丁酰基、8-氨基辛酰基或8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基(Peg3)、11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷酸(Peg4)或(哌嗪-1-基)-甲酸的残基。在本发明中，γGlu和isoGlu可互换使用。
Z2是选自以下的1至6个化合物的残基的序列：γGlu、βAsp,D、E、K、Orn、S、T、A、βAla、G、P、V、L、I、Y、Q、N、Dapa、Gaba或Aib或其相应D形式、5-氨基戊酰基、6-氨基己酰基、7-氨基庚酰基、8-氨基辛酰基、9-氨基壬酰基和10-氨基癸酰基、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(Peg3)、11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷酸(Peg4)或(哌嗪-1-基)-甲酸。
例如，Z2可为或可包含：
[γGlu]；
[γGlu][Peg3][Peg3]-；
[(哌嗪-1-基)-乙酰基][Peg3][Peg3]；
[γGlu]-G-[γGlu]；
[γGlu]-K-[γGlu]；
[γGlu]-KG-[γGlu]；或
[γGlu]-G-[Peg3][γGlu][Peg3]。
Z2合适地利用酰胺键联结合在每侧。可使用其他合适的键联，使用相称的原子置换；例如可考虑使用亚磺酰胺、磺酰胺、或酯键联或氨基、醚、或硫醚键联。
换言之，在一些方面中，亲脂基团Φ是Z1-或Z1-Z2-；其中
Z1是A–C12-22亚烷基–(CO)–；
其中A是H或–COOH，并且其中亚烷基可为直链或支链且可为饱和或不饱和，并且可任选地在其长度中纳入亚苯基或吡嗪亚基部分；并且
Z2是选自以下的1至6个化合物的残基的序列：γ-Glu、βAsp,D、E、K、Orn、S、T、A、β-Ala、G、P、V、L、I、Y、Q、N、Dapa、Gaba或Aib或其相应D形式、5-氨基戊酰基、6-氨基己酰基、7-氨基庚酰基、8-氨基辛酰基、9-氨基壬酰基和10-氨基癸酰基、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(Peg3)、11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷酸(Peg4)或(哌嗪-1-基)-甲酸，例如选自以下的接头：
[Glu]，
[γGlu][Peg3][Peg3]-；
[(哌嗪-1-基)-乙酰基][Peg3][Peg3]；
[γGlu]-G-[γGlu]；
[γGlu)-K-[γGlu]；
[γGlu]-KG-[γGlu]；并且
[γGlu]-G-[Peg3][γGlu][Peg3]。
亲脂性取代基所缀合的氨基酸侧链通常包括羧基、羟基、硫醇、酰胺或氨基团，用于与间隔子或亲脂性取代基形成酯、磺酰基酯、硫酯、酰胺、或磺酰胺。酰胺键联可以是特别优选的，并且因此氨基酸可为其侧链具有氨基团的任何氨基酸，但应清楚，考虑了具有其他官能团的侧链。因此，例如，氨基酸侧链可为Glu、Lys或Ser残基的侧链。例如，其可为Lys或Glu残基的侧链。在两个或更多个侧链携带亲脂性取代基的情况下，其可独立地选自那些残基。
通常，氨基酸侧链是Lys残基的侧链。
包含亲脂性部分Z1和间隔子Z2的亲脂性取代基的实例示于下式中：
Figure BDA0004122581110000231
下文显示亲脂基团的说明性结构，其中波形线指示与肽(即与氨基酸侧链)的键联：
[19-羧基-十九烷酰基][γGlu]G[γGlu]：
Figure BDA0004122581110000232
[17-羧基-十七烷酰基][γGlu]G[γGlu]：
Figure BDA0004122581110000233
[17-羧基-十七烷酰基][γGlu]：
Figure BDA0004122581110000234
[17-羧基-十七烷酰基][γGlu][Peg3][Peg3]：
Figure BDA0004122581110000241
[17-羧基-十七烷酰基]：
Figure BDA0004122581110000242
在整个说明书和权利要求中使用与本文所述的方法和其他方面相关的各种术语。除非另有指示，否则这样的术语将被赋予其在本领域的普通含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式来解释。当提及可测量值(例如量、短暂持续时间等)时，本文所用的术语“约”意指涵盖相对于指定值±20％或±10％、在一些实施例中±5％、在一些实施例中±1％且在一些实施例中±0.1％的变化，因为这样的变化适于制得且使用所披露的化合物和组合物。
如本文所用的术语“全长补体抑制素”是指具有序列IC(*)VVQDWGHHRC(*)TAGHMANLTSHASAI的27个氨基酸的肽，其中C(*)表示通过二硫键连接的半胱氨酸残基。如上所述，通过位置2和12处的半胱氨酸残基之间的二硫键连接的全长补体抑制素的截短形式十三肽H-Ile1-Cys2-Val3-Val4-Gln5-Asp6-Trp7-Gly8-His9-His10-Arg11-Cys12-Thr13-NH2保留全长肽的活性。此十三肽的N-末端酰化形式在本文中称为“Ac-补体抑制素”。
术语“补体抑制素类似物”是指经修饰的Ac-补体抑制素类似物，其包含天然和非天然氨基酸或氨基酸类似物的一个或多个取代、以及在各种氨基酸内或之间的修饰，如本文更详细地描述。补体抑制素类似物可包含相对于Ac-补体抑制素的约1、2、3、4或5个氨基酸修饰。补体抑制素类似物可包含相对于Ac-补体抑制素的5、6、7、8个或更多个氨基酸修饰。补体抑制素类似物可包含相对于Ac-补体抑制素的约5、6、7或8个氨基酸修饰。
术语“类似物”通常用于在其经历进一步的化学修饰(衍生化)且具体地酰化之前所讨论的蛋白质或肽。由这样的化学修饰(衍生化)产生的产物有时称为“衍生物”或“酰化类似物”。然而，在本申请的上下文中，术语“类似物”指名Ac-补体抑制素类似物以及这样的Ac-补体抑制素类似物的(酰化)衍生物。
当提及Ac-补体抑制素或补体抑制素类似物内的氨基酸或类似物的位置时，这些位置编号为1(在补体抑制素中为Ile)至13(在补体抑制素中为Thr)。例如，GIy残基占据“位置8”。
术语“药物活性”和“生物活性”是指化合物结合C3或其片段并抑制补体活化的能力。补体抑制素类似物的生物活性可通过若干本领域公认的测定中的一个或多个来测量，如本文更详细地描述。
如本文所用，“L-氨基酸”是指通常存在于蛋白质中的任何天然存在的左旋α-氨基酸或那些α-氨基酸的烷基酯。术语“D-氨基酸”是指右旋α-氨基酸。除非另有说明，否则本文中提及的所有氨基酸均为L-氨基酸。
“疏水”或“非极性”在本文中同义使用，并且是指任何不以偶极为特征的分子间或分子内相互作用。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所披露化合物的衍生物，其中母体化合物是通过制备其酸或碱盐而经修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基例如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐；等等。因此，术语“酸加成盐”是指通过添加酸制备的母体化合物的相应盐衍生物。药学上可接受的盐包括，例如由无机或有机酸形成的母体化合物的常规盐或季铵盐。例如，这样的常规无毒盐包括(但不限于)衍生自无机酸的那些盐，这些无机酸是例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；和自有机酸制备的盐，这些有机酸是例如乙酸、丙酸、琥珀酸、羟乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘甲酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。某些酸性或碱性化合物可作为两性离子存在。所有形式的化合物(包括游离酸、游离碱和两性离子)都被考虑在本披露的范围内。
补体抑制素类似物
补体抑制素首先被鉴别为27个氨基酸的肽，并且是第一个非宿主来源的补体抑制剂，其显示能够阻断所有三种活化途径(Sahu等人,1996,J.Immunol.[免疫学杂志],157:884-91；美国专利号6,319,897)。有可能将补体抑制素截短成13个氨基酸的肽而不损失活性。然而，试图进一步截短此肽导致了活性的损失。13个氨基酸截短的(或“核心”)补体抑制素肽的序列是H-Ile1-Cys2-Val3-Val4-Gln5-Asp6-Trp7-Gly8-His9-His10-Arg11-Cys12-Thr13-NH2，其中Cys2和Cys12是二硫键。此环状十三肽结合至C3(和C3的片段)，从而抑制下游补体级联的活化并防止天然C3被C3转化酶裂解。通过使用实验模型的一系列研究证实了其抑制效力，这些研究指出了其作为治疗剂的潜力(Fiane等人,1999a,Xenotransplantation[异种器官移植],6:52-65；Fiane等人,1999b,Transplant Proc.[移植学会会报],31:934-935；Nilsson等人,1998,Blood[血液],92:1661-1667；Ricklin和Lambris,2008,Adv.Exp.Med..Biol.[实验医学与生物学进展],632:273-292；Schmidt等人,2003,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究杂志],A66:491-499；Soulika等人,2000,Clin.Immunol.[临床免疫学],96:212-221)。
13个氨基酸的补体抑制素肽的逐步优化已产生具有改善的生物活性的类似物(Ricklin和Lambris,2008,同上；WO 2004/026328；WO 2007/062249、WO 2013/036778、WO2014/100407)。结构-活性研究已将补体抑制素肽的环状性质以及β-转角和疏水簇二者的存在鉴别为分子的关键特征(Morikis等人,1998,Protein Sci.[蛋白质科学],7:619-627；WO 99/13899；Morikis等人,2002,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],277:14942-14953；Ricklin和Lambris,2008,同上)。发现位置4和7处的疏水性残基特别重要，并且具有非天然氨基酸的其修饰产生具有比初始补体抑制素肽提高264倍的活性的类似物(Katragadda等人,2006,J.Med.Chem.,49:4616-4622；WO 2007/062249)。在WO 2007/044668中描述了优化补体抑制素用于在治疗眼部障碍中使用的进一步尝试。
尽管先前的优化步骤是基于组合筛选研究、溶液结构和计算模型(Chiu等人,2008,Chem.Biol.Drug Des.[化学生物学与药物设计],72:249-256；Mulakala等人,2007,Bioorg.Med.Chem.[生物有机和药物化学],15:1638-1644；Ricklin和Lambris,2008,supra)，但与补体片段C3c复合的补体抑制素的共晶体结构的公开(Janssen等人,2007,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],282:29241-29247；WO 2008/153963)提供了启动合理优化的基础。晶体结构披露在C3c的巨球蛋白(MG)结构域4和5的界面处的浅结合位点，并且显示13个氨基酸中的9个通过氢键或疏水相互作用直接参与结合。与溶液中的补体抑制素肽的结构相比(Morikis等人,1998,同上)，补体抑制素的结合形式经历构型变化，其中β-转角的位置自残基5-8移位至8-11(Janssen等人,2007,同上；WO 2008/153963)。
Ac-补体抑制素(一种N-末端酰化的13个氨基酸的肽)结合至C3并阻止C3转化酶介导的裂解。自从通过噬菌体展示发现其以来，已对13个氨基酸的Ac-补体抑制素序列实施修饰，以发现具有增加的生物活性的类似物。然而，在位置2和12处的两个半胱氨酸残基之间的核心序列中，丙氨酸扫描实验先前已产生仅显示生物活性中等改善的类似物，其中可耐受极少修饰。修饰包括将位置4处的缬氨酸改变为色氨酸或色氨酸类似物，这导致生物活性的增加，以及将位置9处的组氨酸改变为丙氨酸或其类似物。
试图在位置3处引入缬氨酸残基的修饰，用甘氨酸、丙氨酸、D-缬氨酸或亮氨酸置换其导致生物活性降低。与这些发现相反，我们的研究已经显示缬氨酸至异亮氨酸的改变是良好耐受的，并且提供生物活性的改善。
不希望受任何特定理论限制，此修饰可与在核心序列中引入一个或多个极性或带电氨基酸组合，并且可用作增加补体抑制素肽溶解能力的方法。例如，位置9处的谷氨酸或丝氨酸可能特别适合与异亮氨酸3组合，尽管它们在与缬氨酸3组合时可能导致活性降低。这些观察结果与如通过表面等离子体共振(SPR)测量的改善与C3的结合有关。
此外，这些改变可容易地与补体抑制素类似物的核心序列中的其他修饰组合，并且与N-末端和C-末端序列的添加组合，例如用于改善补体抑制素肽的溶解性，例如在较高浓度下。
本文所述的补体抑制素类似物通常具有高于Ac-补体抑制素的活性，例如，比Ac-补体抑制素高至少10倍的活性、至少20倍的活性、至少30倍的活性。在其他实施例中，利用实例中所述的测定来比较，类似物的活性比Ac-补体抑制素高至少40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍或更多倍。
在位置X3处具有Ile的化合物可能比原本相同但在位置X3(即对应于补体抑制素的Val3的位置)处具有缬氨酸的化合物具有更大活性。
补体抑制素类似物能够结合至C3和/或C3b，并且能够例如通过抑制C3被C3转化酶裂解来抑制补体级联，特别是C3的下游的活化。
补体抑制素类似物通常还能够抑制补体驱动的溶血。补体驱动的溶血的典型评估法(在“溶血测定”中)是由来自第一哺乳动物物种的血清(例如人类血清)与来自第二哺乳动物物种(例如绵羊或任何其他合适的物种)的红血球(erythrocyte)(红血球(red bloodcell)；RBC)，通常在能够结合至红血球的哺乳动物免疫球蛋白的存在下接触。血清中的补体被与细胞结合的免疫球蛋白活化，从而导致红血球的溶解，即溶血。免疫球蛋白可来自第一物种，或可来自第三哺乳动物物种，只要其能够活化来自第一物种的补体即可。
在这样的测定中，通常将测试化合物与血清一起预孵育，之后使血清与红血球接触。红血球还可在与血清接触之前与免疫球蛋白一起预孵育。
在以下实例中，将人类血清与测试化合物一起预孵育，并且绵羊红血球与针对绵羊红血球的兔抗血清一起预孵育，之后合并血清和红血球。
因此，补体抑制素类似物的活性可参考一种或多种选自以下的生物活性来确定：(1)结合至C3蛋白，(2)结合至C3b蛋白，(3)抑制天然C3被C3转化酶裂解，和(4)抑制补体系统的活化。
本文所述的补体抑制素类似物可以比补体抑制素更高的亲和力结合C3或C3b。例如，其Kd可比Ac-补体抑制素低至少10倍、低至少20倍或低至少30倍，例如比Ac-补体抑制素低至少40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或150倍。Kd可例如通过表面等离子体共振(SPR)例如使用如实例3中所述的测定来确定。
本文所述的补体抑制素类似物通常以比在对应于补体抑制素的Val3的位置处具有缬氨酸而非异亮氨酸的其他方面相同的化合物更高的亲和力(即，更低的Kd)结合C3或C3b。
本文所述的补体抑制素类似物可具有比Ac-补体抑制素更大的抑制溶血的能力。例如，其可以比Ac-补体抑制素低至少10倍、至少20倍或至少30倍，例如比Ac-补体抑制素低至少40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍的IC50抑制溶血。
在位置3处具有异亮氨酸的补体抑制素类似物通常具有比在对应于补体抑制素的Val3的位置处具有缬氨酸而非异亮氨酸的其他方面相同的化合物更大的抑制溶血的能力(即，更低的IC50)。
优选地，通过在溶血测定中，例如使用实例2中所述的测定测量本文所述化合物对经典补体途径的抑制作用来评估其体外作用。
具有酰化的补体抑制素类似物的绝对活性可低于其他方面相同但缺乏酰化的化合物，但具有额外益处，包括延长的体内半衰期，这可抵消绝对活性的任何明显降低。
补体抑制素类似物的合成
本文所述的补体抑制素类似物可例如，借助固相或液相肽合成方法来合成。在此上下文中，可参照WO 98/11125和尤其Fields,G.B.等人,2002,“Principles and practiceof solid-phase peptide synthesis[固相多肽合成原理与实践]”于：SyntheticPeptides[合成肽](第2版)中，和本文中的实例。
本文所述的补体抑制素类似物可以多种方式合成或产生，包括例如包括以下的方法：(a)借助固相或液相肽合成方法合成补体抑制素类似物，并回收由此获得的合成的补体抑制素类似物；或(b)自编码前体肽的核酸构建体表达前体肽序列、回收表达产物和修饰前体肽以产生补体抑制素类似物。
前体肽可通过引入一个或多个非蛋白氨基酸(例如Aib、Orn、Dap、1-Me-Trp、1-Nal、2-Nal、Sar、γGlu或Dab)或通过引入适当末端基团Y1和/或Y2而经修饰。
表达通常自编码前体肽的核酸实施，其可在包含这样的核酸的细胞或无细胞表达系统中实施。
对于重组表达，通常将编码前体肽的核酸片段插入合适的载体中以形成克隆或表达载体。根据应用的目的和类型，载体可为质体、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒的形式，但仅在某些细胞中瞬时表达的裸DNA还是重要载体。优选克隆和表达载体(质体载体)能够自主复制，从而能够实现高拷贝数，以用于随后克隆的高程度表达或高程度复制目的。
通常，表达载体可包含一个或多个以下特征：用于驱动核酸表达的启动子、任选地编码使得能够分泌(至细胞外相或在适用的情况下，至周质中)的前导肽的核酸序列、编码肽的核酸片段和任选的终止子。载体可包含额外特征，例如像可选标记物和复制起点。当在生产菌株或细胞系中用表达载体操作时，载体可优选能够整合至宿主细胞基因组中。技术人员熟悉合适的载体，并且能够根据其具体要求设计一种载体。
载体可用于转化宿主细胞以产生肽。这样的转变细胞可为用于繁殖核酸片段和载体和/或用于重组产生肽的培养细胞或细胞系。
优选的转变细胞是微生物，例如细菌[例如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、杆菌属(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、沙门杆菌属(Salmonella)或分枝杆菌属(Mycobacterium)(优选非致病性，例如牛分枝杆菌BCG)、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))和原生动物。可替代地，转变细胞可来源于多细胞生物，例如，它可以是真菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞、植物细胞、或动物细胞(例如哺乳动物细胞)。出于克隆和/或优化表达的目的，优选的是转变细胞能够复制核酸。表达核酸的细胞可用于小规模或大规模制备肽。
当借助转变的细胞产生肽时，表达产物分泌至培养基中是方便的，但远非必需的。
医学病症
在广义方面，本文描述了用作药物或用于在疗法中使用的补体抑制素类似物。
本文所述的补体抑制素类似物具有结合至C3蛋白和/或抑制补体活化的生物活性。通常，本文所述的补体抑制素类似物可用于治疗或预防与补体系统的过度或不期望活化相关的病症。补体可通过三种不同途径活化：经典途径、凝集素途径和替代途径。所有三种途径共有的主要活化事件是补体系统的中心蛋白C3被C3转化酶蛋白水解裂解成其活化产物C3a和C3b。这些片段的产生导致C3b和iC3b对致病细胞的调理作用(一种使其易于吞噬或清除的过程)，并且导致通过与补体受体相互作用而活化免疫细胞(Markiewski和Lambris,2007,Am.J.Pathol.[美国病理学杂志],171:715-727)。C3b在靶细胞上的沉积还诱导新转化酶复合物的形成，从而起始自扩增环。血浆和细胞表面结合蛋白系综仔细地调控补体活化，以防止宿主细胞通过补体级联自攻击。用作设计本文所述的补体抑制素类似物的参考点的13个氨基酸的环状十三肽通过结合至C3和/或C3b抑制补体活化，从而防止天然C3被C3转化酶裂解。本文所述的补体抑制素类似物的生物活性可通过例如，在溶血测定中、例如使用下文实例中所描述的方案测量其对经典补体途径的抑制作用而在体外确定。
补体的过度活化或不适当调控可导致许多病理状况，范围为自身免疫病至炎性疾病(Holers,2003,Clin.Immunol.[临床免疫杂志],107:140-51；Markiewski和Lambris,2007,同上；Ricklin和Lambris,2007,Nat.Biotechnol.[自然生物技术杂志],25:1265-75；Sahu等人,2000,J.Immunol.[免疫学杂志],165:2491-9)。这些病症包括：(1)抑制补体活化以促进疾病或病症的治疗，这些疾病或病症包括年龄相关性黄斑变性、眼底黄色斑点症、牙周炎、糖尿病视网膜病变、青光眼、葡萄膜炎、类风湿性关节炎、脊髓损伤、中风、多发性硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病、癌症、和呼吸障碍，例如气喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性炎症、肺气肿、支气管炎、支气管扩张症、囊性纤维化、结核病、肺炎、呼吸窘迫综合征(RDS-新生儿和成人)、鼻炎和窦炎；细菌感染如败血症、各种组织中的缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、过敏反应、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、自身免疫性溶血性贫血、牛皮癣、化脓性汗腺炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、CHAPLE综合征、C3肾小球病、IgA肾病变、非典型溶血性尿毒综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合征，或(2)抑制在细胞或实质器官移植期间或在人工器官或植入物的使用中发生的补体活化(例如，通过用本发明的肽涂覆或以其他方式处理细胞、器官、人工器官或植入物)；或(3)抑制在生理液(血液、尿液)的体外分流期间发生的补体活化(例如，通过用本文所述的补体抑制素类似物涂覆流体分流所通过的管道)。
药物组合物和施用
本文描述了一种或多种组合物，其包含补体抑制素类似物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及载体。在一个实施例中，组合物是药物组合物且载体是药学上可接受的载体。本文还描述了一种或多种药物组合物，其包含补体抑制素类似物或其盐和/或溶剂化物，以及载体、赋形剂或运载体。因此，补体抑制素类似物或其盐或溶剂化物、尤其其药学上可接受的盐和/或溶剂化物可调配为组合物或药物组合物，其经制备以用于储存或施用，并且包含治疗有效量的补体抑制素类似物或其盐或溶剂化物。
与碱形成的合适的盐包括金属盐，例如碱金属盐或碱土金属盐。
在一个实施例中，药物组合物是其中补体抑制素类似物呈药学上可接受的酸加成盐形式。
如医学领域的技术人员将明了，补体抑制素类似物化合物或药物组合物的“治疗有效量”可尤其根据待治疗的受试者(患者)的年龄、体重和/或性别而变化。可能相关的其他因素包括所考虑的特定患者的身体特征、患者的饮食、任何同时用药的性质、所采用的特定化合物、特定施用方式、期望药理学作用和特定治疗适应症。由于这些因素和其在确定该量中的关系是医学领域已知的，因此治疗有效剂量水平的测定、实现治疗和/或预防和/或补救本文所述的吸收不良和/或低级炎症的期望结果所需的量以及本文披露的其他医学适应症将在本领域技术人员的范围内。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指减轻给定病症或病状的症状且使具有该病症或病状的个体中的生理反应正常化的量。症状的减轻或生理反应的正常化可使用本领域常见的方法来确定，并且可随给定病症或病状而变化。在一方面，一种或多种补体抑制素类似物或其药物组合物的治疗有效量是在没有所讨论的病症或病状的个体中使可测量的生理参数恢复至与参数基本上相同的值(优选地在值的30％内、更优选地在20％内且仍更优选地在10％内)的量。
在一个实施例中，化合物或药物组合物的施用以较低的剂量水平开始，其中剂量水平增加直至实现预防/治疗相关医学适应症的期望作用。这定义了治疗有效量。对于单独或作为药物组合物的一部分的本文所述的补体抑制素类似物，活性补体抑制素类似物的这样的人类剂量可介于约0.01pmol/kg与500μmol/kg体重之间、介于约0.01pmol/kg与300μmol/kg体重之间、介于0.01pmol/kg与100μmol/kg体重之间、介于0.1pmol/kg与50μmol/kg体重之间、介于1pmol/kg与10μmol/kg体重之间、介于5pmol/kg与5μmol/kg体重之间、介于10pmol/kg与1μmol/kg体重之间、介于50pmol/kg与0.1μmol/kg体重之间、介于100pmol/kg与0.01μmol/kg体重之间、介于0.001μmol/kg与0.5μmol/kg体重之间、介于0.05μmol/kg与0.1μmol/kg体重之间。
当然，最适合于患者治疗的治疗剂量和方案将随待治疗的疾病或病症并根据患者的体重和其他参数而变化。不希望受限于任何具体理论，预期在mg/kg范围内的剂量和较短或较长的持续时间或治疗频率可产生治疗上有用的结果，例如对替代和经典补体途径的统计学显著抑制。最适合于人类使用的剂量大小和给药方案可由通过本领域已知或本文所述的方法获得的结果指导，并且可在适当设计的临床试验中确认。
有效剂量和治疗方案可通过常规方式来确定，其中在实验室动物中以低剂量开始且随后增加剂量，同时监测作用，并且还系统地改变剂量方案。临床医师在确定给定受试者的最优选剂量时可考虑众多因素。
对于局部递送至眼，一种或多种药学上可接受的组合物可调配于等渗、pH调节的无菌盐水或水中，具有或无防腐剂(例如苯扎氯铵)。可替代地，对于眼科应用，药学上可接受的组合物可调配于软膏(例如石蜡)中或调配为滴眼剂。局部施用至眼的方法包括，例如脉络膜注射、经巩膜注射或放置巩膜贴片、选择性动脉导管插入术、滴眼剂或眼用软膏剂、眼内施用，包括经视网膜、球结膜下、玻璃体内注射、脉络膜上注射、筋膜下注射、巩膜袋和巩膜切开注射、通过渗透泵等。可替代地，一种或多种组合物还可血管内施用，例如静脉内(IV)或动脉内施用。在脉络膜注射和巩膜贴片中，临床医师在开始适当麻醉(包括止痛药和眼肌麻痹)之后对眼使用局部方法。将含有治疗化合物的针引导至受试者的脉络膜或巩膜中，并在无菌条件下插入。当针被适当地定位时，化合物注射至脉络膜或巩膜中的任一个或两个中。当使用这些方法中的任一个时，临床医师可选择持续释放或更长作用的配制品。因此，根据受试者对治疗和反应的耐受性，仅可每若干月或若干年重复一次该程序。
所述化合物由于其特定氨基酸序列和/或酰化而具有特别有利的特性。它们在对应于补体抑制素位置2和12的位置处具有通过二硫键连接的半胱氨酸残基。据信，含有硫醚键联的类似或其他方面相同的化合物将具有类似的有利特性，和/或将显示稳定性(例如化学稳定性(抗降解性)或物理稳定性(抗聚集性))的改善。
提供以下实例以更详细地描述实施例。它们旨在说明而非限制本披露的范围。
实例
实例1：补体抑制素类似物的合成
一般肽合成
Figure BDA0004122581110000341
/>
Figure BDA0004122581110000351
装置和合成策略
根据固相肽合成程序使用9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)作为N-α-氨基保护基团和侧链官能团的合适的常见保护基团，在肽合成仪(例如CEM Liberty肽合成仪或Symphony X合成仪)上分批合成肽。
使用基于聚合物支持物的树脂，例如像TentaGelTM。该合成仪装有树脂，该树脂在使用前在DMF中溶胀。
偶联
CEM Liberty肽合成仪
向树脂中添加Fmoc保护的氨基酸溶液(4当量)以及偶联试剂溶液(4当量)和碱溶液(8当量)。通过微波单元将混合物加热至70℃-75℃并偶联5分钟，或在无加热下偶联60分钟。在偶联期间，使氮气鼓泡通过混合物。
Symphony X合成仪
将偶联溶液按以下顺序转移至反应容器：氨基酸(4当量)、HATU(4当量)和DIPEA(8当量)。除非另有说明，否则偶联时间在室温(RT)下为10min。用DMF(5×0,5min)洗涤树脂。在重复偶联的情况下，偶联时间在所有情况下在RT下均为45min。
脱保护
CEM Liberty肽合成仪
使用DMF或其他合适的溶剂中的哌啶使Fmoc基团脱保护。向反应容器中添加脱保护溶液，并将混合物加热30sec，达到约40℃。将反应容器排干且添加新鲜脱保护溶液且随后加热至70℃-75℃保持3min。在将反应容器排空后，用DMF或其他合适的溶剂洗涤树脂。
Symphony X合成仪
使用DMF中的40％哌啶进行Fmoc脱保护2.5分钟，并使用相同条件重复。用DMF(5×0.5min)洗涤树脂。
侧链酰化
在酰化(侧链脂化)位置处引入Fmoc-Lys(Dde)-OH或具有正交侧链保护基团的另一种替代氨基酸。用Ac或Boc保护线性肽的N-末端。当肽仍附接至树脂时，使用新鲜制备的NMP中的水合肼(2％-4％)将正交侧链保护基团选择性裂解2×15min。然后使用标准偶联条件和Fmoc-脱保护，用期望的构建单元延长未保护的赖氨酸侧链。偶联脂化部分作为最后一个步骤。
裂解
用TFA和合适的清除剂处理干燥的肽树脂大约2小时。滤液的体积减少且在添加二乙醚后粗制肽沉淀。用二乙醚洗涤粗制肽沉淀若干次且最后干燥。
粗制肽的HPLC纯化
通过制备型反相HPLC使用常规HPLC装置(例如Gilson GX-281与331/332泵的组合，用于二元梯度应用，该装置配备有柱(例如5×25cm Gemini NX 5u C18 110A柱)和级分收集器，使用20-40ml/min的流速，具有缓冲液A(0.1％甲酸，水溶液)或A(0.1％ TFA，水溶液)和缓冲液B(0.1％甲酸，90％ MeCN，水溶液)或B(0.1％TFA、90％ MeCN，水溶液)的合适的梯度)纯化粗制肽。通过分析型HPLC和MS分析级分，并且汇集所选级分并冻干。通过HPLC和MS表征最终产物。
亚甲基硫缩醛S-CH2-S的形成
在粗制线性肽纯化和冻干后，将肽重新溶解在水和乙腈中，直到溶液澄清。将肽溶液的浓度保持在大约5-6mg/ml，取决于肽的溶解能力。使反应在密闭容器中进行，以减少不必要的空气氧化。搅拌肽溶液，同时将二碘甲烷(大约20-30当量)和DIPEA(20当量)添加至肽溶液中。在2-5小时后，反应结束，并且用TFA将反应混合物的pH调节至pH3。将肽溶液在制备型HPLC纯化前用水稀释。
分析型HPLC
通过配备有自动取样器、脱气器、20μl流动槽和Chromeleon软件的分析型HPLC(Agilent 1100/1200系列)确定最终纯度。使用分析柱(例如Kinetex 2.6μm XB-C18100A100X8,6mm柱)于40℃下以1.2ml/min的流速操作HPLC。在215nm下检测和定量化合物。缓冲液A(0.1％ TFA，水溶液)和缓冲液B(0.1％ TFA，90％ MeCN水溶液)。
质谱
利用常规质谱术(例如Waters Xevo G2 TOF，配备有具有锁定质量校正的电喷雾电离和MassLynx软件)确定最终MS分析。其以正向模式使用直接注射和如层析图上规定的15V(1TOF)、30V(2TOF)或45V(3TOF)的锥体电压操作。精密度为5ppm，典型分辨率为15,000-20,000。
化合物24的合成
在Symphony X合成仪上使用标准Fmoc化学实施固相肽合成。在使用之前将TentaGel S RAM(1.3g；0.23mmol/g)在DMF(3×10ml)中溶胀，并根据上述程序将Fmoc-基团脱保护。
偶联
如上所述使用HATU作为偶联试剂偶联根据序列的合适的保护的Fmoc-氨基酸。所有偶联均于R.T下实施。纳入用于纳入支链部分的赖氨酸作为Fmoc-Lys(Dde)-OH用于正交偶联。
脱保护
根据上述程序实施Fmoc脱保护。
侧链酰化
当肽仍附接至树脂时，使用新鲜制备的NMP中的水合肼(2％-4％)将正交侧链保护基团(Dde)选择性裂解2×15min。使用标准偶联条件，将未保护的赖氨酸侧链与Fmoc-Glu-OtBu双偶联，随后与Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu-OtBu单偶联，并且最后与脂肪酸部分17-羧基-十七烷酸单叔丁酯偶联。
从固体支持物的肽的裂解
用EtOH(3×15ml)和Et2O(3×150ml)洗涤肽树脂，并在室温(r.t.)下干燥至恒重。通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5；40ml，2h；r.t.)处理从树脂裂解肽。滤液的体积减少且在添加二乙醚后粗制肽沉淀。用二乙醚洗涤粗制肽沉淀若干次，并且最后在室温下干燥至恒重，得到913mg粗制肽产物(纯度约37％)。
粗制线性肽的HPLC纯化
通过制备型反相HPLC使用Gilson GX-281和331/332泵组合用于二元梯度应用来纯化粗制肽，该组合配备有5×25cm Gemini NX 5u C18 110A柱和级分收集器，并以35ml/min用缓冲液A(0.1％ TFA，水溶液)和缓冲液B(0.1％ TFA，90％ MeCN，水溶液)梯度在47min内自44％ B至69％ B的梯度运行。通过分析型HPLC和MS分析级分，并且汇集相关级分并冻干以得到167mg，其纯度为90％，如上文所述通过HPLC和MS所表征。计算的单同位素MW＝3665.67实测值3665.66。
在粗制线性肽上形成亚甲基硫缩醛键
将167mg纯化的线性肽溶解于40ml水/乙腈(1:1)中。将肽溶液的浓度保持在大约6mg/ml，取决于肽的溶解能力。使反应在密闭容器中进行，以减少不必要的空气氧化。搅拌肽溶液，同时将二碘甲烷(大约20-30当量)和DIPEA(20当量)添加至肽溶液中。用分析型HPLC跟踪反应，但在3小时后，反应结束，并且用TFA将反应混合物的pH调节至pH 3。将肽溶液在制备型HPLC纯化前用水稀释。
氧化肽的HPLC纯化
通过制备型反相HPLC使用Gilson GX-281和331/332泵组合用于二元梯度应用来纯化粗制肽，该组合配备有5×25cm Gemini NX 5u C18 110A柱和级分收集器，并以35ml/min用缓冲液A(0.1％ TFA，水溶液)和缓冲液B(0.1％ TFA，90％ MeCN，水溶液)梯度在47min内自30％ B至60％ B的梯度运行。通过分析型HPLC和MS分析级分，并且汇集相关级分并冻干以得到99.6mg，其纯度为90％，如上文所述通过HPLC和MS所表征。计算的单同位素MW＝3677.69实测值3677.60。
表1：合成的化合物
Figure BDA0004122581110000391
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Figure BDA0004122581110000401
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Figure BDA0004122581110000411
*Cp40-由Qu等人,Immunobiology[免疫生物学]2013,281(4):496-505描述(在该文件中还称为“肽14)。
指名为“C(1)”的半胱氨酸残基的侧链通过亚甲基硫缩醛键连接；也就是说，每个半胱氨酸残基的硫原子经由亚甲基桥接，即–S-CH2-S-。
指名为“C(2)”的半胱氨酸残基的侧链通过乙烯键连接；也就是说，每个半胱氨酸残基的硫原子经由亚乙基桥接，即–S-CH2-CH2-S-。
指名为“C(*)”的半胱氨酸残基的侧链通过二硫键连接。
实例2：体外溶血测定
方法
通过在溶血测定中测量本文所述一些化合物对经典补体途径的抑制作用来评估这些化合物的体外作用。
简言之，将本文所述的化合物和参考化合物溶解于DMSO中，并在96孔板中稀释于Tris/酪蛋白测定缓冲液(10mM Tris、145mM NaCl、0.5mM MgCl2、0.15mM CaCl2和0.1％W/V酪蛋白，调节至pH 7.4)中作为9点连续稀释液。在Tris/酪蛋白测定缓冲液中洗涤用兔抗绵羊红血球抗血清(美国德克萨斯州的康普力技术公司(Complement Technology,Inc.))涂覆的敏化绵羊红血球(RBC)。将每孔50μL的稀释化合物添加至含有50μL稀释的人类血清(美国德克萨斯州的康普力技术公司)的96孔板中，并在室温下孵育15分钟。使用该方案对每个血清批次的血清稀释因子优化以获得最大溶血的70％-90％。然后将50μL敏化绵羊RBC添加至所有孔中(每孔107个)。
在37℃下轻柔搅拌下孵育30分钟后，通过每孔添加50μL Tris STOP缓冲液(10mMEDTA、10mM Tris、145mM NaCl，调节至pH 7.4)终止反应。然后通过离心去除RBC，并通过405nm的吸光度测量所得上清液的溶血。
将反应相对于阳性和阴性对照(运载体)归一化，以使用用于曲线拟合的4参数对数(4PL)非线性模型自浓度反应曲线计算IC50(nM)(表2)。所有值均为基于N＝>2个独立测定。
表2：溶血的抑制的体外分析
Figure BDA0004122581110000421
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Figure BDA0004122581110000431
实例3：通过表面等离子体共振(SPR)的亲和力测量
方法
使用表面等离子体共振(SPR)以表征肽对C3的结合亲和力(Kd)。在由10mM磷酸盐pH 7.4、150mM NaCl、0.05％ Tween20组成的缓冲液中使用标准氨偶联至大约3000共振单位(RU)的密度，将人类C3(康普力技术公司(Complement tech)目录号A113c)固定于CM5传感器芯片(通用医疗公司(GE Healthcare))的活动流动槽上。
对于相互作用实验，使用多循环实验方法，并且在25℃下使用BiacoreX100TM仪器(通用医疗公司)进行。以30μL/min的流速在由pH 7.4的50mM Tris缓冲液、150mM NaCl和0.05％ Tween20组成的缓冲液中，以递增的浓度系列(5个不同浓度和缓冲液参考)注射肽180秒。随后是10分钟的解离期。通过两次连续注射3M MgCl2，每次45秒，C3表面在运行之间再生。
在通过将数据全面拟合至1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型以获得用于计算平衡解离常数Kd的结合和解离速率来分析动力学曲线之前，将传感图双重参照(参照表面，空白)(表3)。在至少2个独立实验中测试每个肽。
表3：如通过表面等离子体共振测定用固定的C3所确定的补体抑制素类似物对C3的结合亲和力。
Figure BDA0004122581110000441
/>
Figure BDA0004122581110000451
NT＝未测试
所有值均为基于n＝>2个独立测定
实例4：非人类灵长类动物(NHP)中测试化合物的概况
健康雄性食蟹猴(长尾猕猴(Macaca fascicularis))接受每个测试物质的单次皮下施用。将化合物调配于20mM磷酸盐中，用NaOH调节pH至7.5，并用甘露醇等渗，并且以1840nmol/kg给药。在以下时间自每只动物的股静脉收集血液：给药前、1、2、4、8、24、48、72、96和120h(10个取样时间)。将血液收集至血清分离管中，并使其在室温下凝结。将管离心，并将所得血清等分且在干冰上速冻，并在标称-80℃下储存直至分析。所有NHP研究均为根据动物福利法律和规章实施，包括通过当地伦理审查过程批准该研究。
按照制造商的方案，使用来自斯瓦尔生命科学公司(Svar Life Science)(先前为瑞典的欧罗诊断公司(Euro diagnostic AB))的补体系统替代途径
Figure BDA0004122581110000452
试剂盒分析在给药后特定时间点自非人灵长类动物分离的血清的替代途径补体活性。简言之，将血清样品或对照稀释于缓冲液中并在用替代途径的特异性活化剂涂覆的微量滴定条中孵育。洗涤孔且用包括的比色试剂检测形成的C5b-9。测定405nm下的吸光度。针对每只动物和时间点相对于减去阴性对照的个体动物的给药前活性(0小时)计算替代补体途径的活性百分比。这反映了化合物的药理学活性。
替代途径
Figure BDA0004122581110000453
试剂盒的结果示于图1a和1b中。/>

Claims (23)

1.一种由式I表示的补体抑制素类似物：
Y1-R1-X1-C-X3-X4-Q-X6-W-X8-X9-H-X11-C-X13-R2-Y2 (I)
其中：
Y1是氢、乙酰基或亲脂基团Φ；
X1是I、Y、F或Sar；
X3是I或V；
X4是W、F、V、Y、1-Me-Trp、D-Trp、N-Me-Trp、1-For-Trp、1-Nal、2-Nal、5MeTrp、Bpa或2Igl；
X6是E或D；
X8是G或Sar；
X9是H、A、E、D、K、R或S；
X11是R、K或S；
X13是T、S、E、F、H、K、Sar、G、I、D、N-Me-Ile或N-Me-Thr；
Y2是NH2、OH或亲脂基团Φ；
R1不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、Q、Y、V或Sar、或其相应D形式；并且
R2不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、V、8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基(Peg3)、Sar、γGlu、或其相应D形式；
其中该补体抑制素类似物任选地包含至少一个共价连接至一个或多个氨基酸残基的侧链的亲脂基团Φ；并且
其中所述补体抑制素类似物在位置2和12处的半胱氨酸残基的硫原子之间具有C1-3亚烷基桥；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
2.一种由式II表示的补体抑制素类似物：
Y1-R1-X1-C-I-X4-Q-X6-W-X8-X9-H-X11-C-X13-R2-Y2 (II)
其中：
Y1是氢、乙酰基或亲脂基团Φ；
X1是I、Y、F或Sar；
X4是W、F、V、Y、1-Me-Trp、D-Trp、N-Me-Trp、1-For-Trp、1-Nal、2-Nal、5MeTrp、Bpa或2Igl；
X6是E或D；
X8是G或Sar；
X9是H、A、E、D、K、R或S；
X11是R、K或S；
X13是T、S、E、F、H、K、Sar、G、I、D、N-Me-Ile或N-Me-Thr；
Y2是NH2、OH或亲脂基团Φ；
R1不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、Q、Y、V或Sar、或其相应D形式；并且
R2不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、V、8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基(Peg3)、Sar、γGlu、或其相应D形式；
其中该补体抑制素类似物任选地包含至少一个共价连接至一个或多个氨基酸残基的侧链的亲脂基团Φ；并且
其中所述补体抑制素类似物在位置2和12处的半胱氨酸残基的硫原子之间具有C1-3亚烷基桥；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
3.如权利要求1或权利要求2所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
X1是I、Y或F；
X4是W、Y、1-Me-Trp、1-Nal、2-Nal；
X6是E或D；
X8是G或Sar；
X9是A或E；
X11是R或K；并且
X13是T、S、E、F、H、K、Sar、G、I、D、N-Me-Ile或N-Me-Thr。
4.一种由式III表示的补体抑制素类似物：
Y1-R1-F-C-I-1-Me-Trp-Q-X6-W-X8-E-H-R-C-X13-R2-Y2 (III)
其中：
Y1是氢、乙酰基或亲脂基团Φ；
X6是E或D；
X8是G或Sar；
X13是T或Sar；
Y2是NH2、OH或亲脂基团Φ；
R1不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、Q、Y、V或Sar、或其相应D形式；并且
R2不存在或是选自以下的1至6个氨基酸残基的序列：A、E、G、L、K、F、P、S、T、W、R、V、8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基(Peg3)、Sar、γGlu、或其相应D形式；
其中该补体抑制素类似物任选地包含至少一个共价连接至一个或多个氨基酸残基的侧链的亲脂基团Φ；并且
其中所述补体抑制素类似物在位置2和12处的半胱氨酸残基的硫原子之间具有C1-3亚烷基桥；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
5.如前述权利要求中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R1选自
SE、EGSA、GE、E、{d}Y、EGSE、KSGE、EQEV、ESQV、ESEQV、SEQA、SKQE、EGESG、GQSA、ESGV和YEQA。
6.如前述权利要求中任一项所述的补体抑制素类似物，其中R2选自
GAES、
EGE[Peg3][Peg3]-K*、
EK[γGlu]-K*、
EGA-K*
EGE[Peg3]ES-K*、
EAE[Peg3][Peg3]-K*、
E[Peg3][Peg3]-K*、
EA[Peg3][Peg3]-K*、和
GAES[Peg3][Peg3]-K*。
7.如前述权利要求中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中该肽骨架选自：
Figure FDA0004122581100000041
/>
Figure FDA0004122581100000051
其中[C(1)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚甲基桥连基团的半胱氨酸残基对，其中[C(2)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚乙基桥连基团的半胱氨酸残基对，并且其中*指示该氨基酸残基带有共价连接至其侧链的亲脂基团Φ。
8.如权利要求7所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中该肽骨架选自：
Figure FDA0004122581100000052
/>
Figure FDA0004122581100000061
/>
Figure FDA0004122581100000071
其中[C(1)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚甲基桥连基团的半胱氨酸残基对，并且[C(2)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚乙基桥连基团的半胱氨酸残基对。
9.如权利要求8所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其选自：
Figure FDA0004122581100000072
/>
Figure FDA0004122581100000081
/>
Figure FDA0004122581100000091
其中[C(1)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚甲基桥连基团的半胱氨酸残基对，并且[C(2)]指示在其侧链的硫原子之间具有亚乙基桥连基团的半胱氨酸残基对。
10.如权利要求1至6中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中该亚烷基桥是–CH2–或–CH2-CH2-；也就是说，该键是–S-CH2-S-或–S-CH2-CH2-S-。
11.一种组合物，其包含与载体混合的如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物。
12.如权利要求11所述的组合物，其中该组合物是药物组合物且该载体是药学上可接受的载体。
13.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体、赋形剂或运载体混合的如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物。
14.如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其用于在疗法中使用。
15.如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其用于在抑制补体活化的方法中使用。
16.如权利要求15所述使用的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中抑制补体活化包含一种或多种选自以下的生物活性：(1)结合至C3蛋白，(2)结合至C3b蛋白和/或(3)抑制天然C3被C3转化酶裂解。
17.如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其用于在预防或治疗以下疾病的方法中使用：年龄相关性黄斑变性、眼底黄色斑点症、牙周炎、糖尿病视网膜病变、青光眼、葡萄膜炎、类风湿性关节炎、脊髓损伤、中风、多发性硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病、癌症、和呼吸障碍，例如气喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性炎症、肺气肿、支气管炎、支气管扩张症、囊性纤维化、结核病、肺炎、呼吸窘迫综合征(RDS-新生儿和成人)、鼻炎和窦炎；细菌感染例如败血症、各种组织中的缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、过敏反应、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、自身免疫性溶血性贫血、牛皮癣、化脓性汗腺炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、CHAPLE综合征、C3肾小球病、IgA肾病变、非典型溶血性尿毒综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎或抗磷脂综合征。
18.如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，其用于在抑制在细胞或器官移植期间发生的补体活化的方法中使用。
19.一种用于治疗有需要的受试者的抑制补体活化的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物，以抑制该受试者中的补体活化。
20.如权利要求19所述的方法，其中该受试者患有年龄相关性黄斑变性、眼底黄色斑点症、牙周炎、糖尿病视网膜病变、青光眼、葡萄膜炎、类风湿性关节炎、脊髓损伤、中风、多发性硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病、癌症、和呼吸障碍，例如气喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性炎症、肺气肿、支气管炎、支气管扩张症、囊性纤维化、结核病、肺炎、呼吸窘迫综合征(RDS-新生儿和成人)、鼻炎和窦炎；细菌感染例如败血症、各种组织中的缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、过敏反应、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、自身免疫性溶血性贫血、牛皮癣、化脓性汗腺炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、CHAPLE综合征、C3肾小球病、IgA肾病变、非典型溶血性尿毒综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎或抗磷脂综合征。
21.一种在生理液的体外分流期间抑制补体活化的离体方法，该方法包括使该生理液与如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物接触，从而抑制补体活化。
22.如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于抑制补体活化的药物中的用途。
23.如权利要求1至10中任一项所述的补体抑制素类似物或药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于治疗以下疾病的药物中的用途：年龄相关性黄斑变性、眼底黄色斑点症、牙周炎、糖尿病视网膜病变、青光眼、葡萄膜炎、类风湿性关节炎、脊髓损伤、中风、多发性硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病、癌症、和呼吸障碍，例如气喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性炎症、肺气肿、支气管炎、支气管扩张症、囊性纤维化、结核病、肺炎、呼吸窘迫综合征(RDS-新生儿和成人)、鼻炎和窦炎；细菌感染例如败血症、各种组织中的缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、过敏反应、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、自身免疫性溶血性贫血、牛皮癣、化脓性汗腺炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、CHAPLE综合征、C3肾小球病、IgA肾病变、非典型溶血性尿毒综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎或抗磷脂综合征。
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