JP7170081B2 - 新規なポリペプチド - Google Patents

Description

本発明は、２個以上のペプチドループが分子足場への結合点の間に内在するように、分
子足場に共有結合しているポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、ヒトおよびラ
ットプロテアーゼ血漿カリクレインに特異的であり、力価および／またはプロテアーゼ耐
性を向上させるように１つまたは２つのペプチドループにおいて修飾されているペプチド
を記載する。

環状ペプチドは、タンパク質標的に高い親和性および標的特異性で結合することができ
、したがって治療法の開発のために魅力的な分子クラスである。実際に、例えば、抗菌性
ペプチドのバンコマイシン、免疫抑制薬のシクロスポリンまたは抗癌薬のオクトレオチド
（octreotide）のように、数種の環状ペプチドが、既に診療所において使用することに成
功している（Driggers et al. (2008),Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24）。優れた結
合特性は、ペプチドと標的との間に形成された相対的に大きな相互作用表面と共に、環状
構造のコンホメーション上の柔軟性の低下に起因する。通常、大環状分子は、例えば、環
状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å^２；Wu et al. (2007), Scie
nce 330, 1066-71）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐモチーフ
を有する環状ペプチド（３５５Å^２）（Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151
-5）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウ
パイン（upain）－１（６０３Å^２；Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10
）のように、数百平方オングストロームの表面に結合する。

その環状立体配置のため、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドよりも柔軟性が低く
、標的への結合によるエントロピー損失がより小さくなり、より高い結合親和性をもたら
す。柔軟性の低下は、標的特異的コンホメーションをロックし、直鎖状ペプチドと比較し
て結合特異性を増加させる。このような効果は、その環が開環されると他のＭＭＰに及ぶ
その選択性を失う、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ－８）の強力かつ選択
的な阻害剤により例証されてきた（Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-
51）。大環状化により達成される有利な結合特性は、例えばバンコマイシン、ナイシンお
よびアクチノマイシン等、２個以上のペプチド環を有する多環性ペプチドにおいてさらに
より明らかである。

様々な研究チームが、以前に、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に
繋いでいる（Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), Che
mBioChem）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造を模倣するため
に、合成足場上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス（ブロ
モメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用している（Timmerman et al. (2005), ChemBio
Chem）。システイン含有ポリペプチドを分子足場、例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼ
ンに連結させることによって作製される候補薬物化合物を作製する方法は、ＷＯ２００４
／０７７０６２号およびＷＯ２００６／０７８１６１号に開示されている。

ファージディスプレイベースのコンビナトリアルアプローチが開発され、目的の標的に
対する二環性ペプチドの大型のライブラリが生成されてスクリーニングされた（Heinis e
t al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7およびWO2009/098450）。要約すると、３個
のシステイン残基と、２個のランダムな６アミノ酸領域とを含有する（Ｃｙｓ－（Ｘａａ
）_６－Ｃｙｓ－（Ｘａａ）_６－Ｃｙｓ）（配列番号９７）直鎖状ペプチドのコンビナトリ
アルライブラリをファージ上に提示させ、システイン側鎖を小分子（トリス－（ブロモメ
チル）ベンゼン）に共有結合させることにより環化させた。ヒトプロテアーゼカテプシン
Ｇおよび血漿カリクレイン（ＰＫ）に対する親和性選択で単離した二環性ペプチドは、ナ
ノモルの阻害定数を実証した。ＷＯ２０１３／０５０６１５およびＷＯ２０１３／０５０
６１６は、ヒト血漿カリクレインに特異的なさらなる二環性ペプチドリガンドを開示して
いる。

本発明の第１の態様によれば、血漿カリクレインに特異的なペプチドリガンドであって
、少なくとも２つのループ配列によって隔てられる少なくとも３つのシステイン残基を含
むポリペプチド、および上記ポリペプチドの上記システイン残基と共有結合を形成する分
子足場を含み、その結果、少なくとも２つのポリペプチドループが上記分子足場上に形成
され、上記ペプチドリガンドが、
(a)-C_i-N-X-W-N-P-W-C_ii-O/U-X-X-X-O/J-X-C_iii- (配列番号１);
(b)-C_i-B-N-J-W-N-P-C_ii-X-L-O-X-X-X-C_iii- (配列番号２);
(c)-C_i-Q-K-F-E-S-R-C_ii-X-X-X-X-X-X-C_iii- (配列番号３);
(d)-C_i-P-L-S-D-T-L-C_ii-Y-R-R-M-P-P-C_iii- (配列番号４);
(e)-C_i-P-Y-P-F-R-C_ii-X-H-X-X-X-C_iii- (配列番号５);および
(f)-C_i-(N)_a-U-J-P-J-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (配列番号６);
もしくはその修飾誘導体、または薬学的に許容される塩
のいずれかから選択されるペプチド配列を含み、
ここで、
Ｃ_ｉ、Ｃ_ｉｉおよびＣ_ｉｉｉはそれぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し
、
下付き文字「ａ」は、０または１から選択される整数を表し、
Ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表し、
Ｊは、Ｆ、ＷおよびＹから選択される非極性の芳香族アミノ酸残基を表し、
Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、
Ｂは、Ｒ、ＨおよびＫから選択される極性の正に荷電されたアミノ酸残基を表す、
ペプチドリガンドが提供される。

本発明の新規なカリクレイン結合性二環性ペプチドリガンドを、本明細書で実施例にお
いて記載される生物学的選択に従って特定した。生物学的選択の間のヒトカリクレインと
ラットカリクレインとの間の標的バイトを切り替えることによって、種間で良好な交差反
応性を有するリード配列を特定した。分子に対する可溶性の修飾を導入して、二環性ペプ
チドリードを形成する能力を向上し、ラットの薬物動態学的分析によって、ｉｎ ｖｉｖ
ｏで高い代謝安定性を有する配列が明らかになった。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義されるペプチドリガンドを１つまたは
複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウ
イルス感染、および自己免疫障害の予防、抑制または処置における使用のための、本明細
書に定義されるペプチドリガンドが提供される。

交差反応性の新規なカリクレイン結合性バイシクルリードに対する０６－３４－１８コントロールの比較のラット血漿安定性を示す図である。 交差反応性の新規なカリクレイン結合性バイシクルリードに対する０６－３４－１８コントロールの比較のラット血漿安定性を示す図である。 交差反応性の新規なカリクレイン結合性バイシクルリードに対する０６－３４－１８コントロールの比較のラット血漿安定性を示す図である。 交差反応性の新規なカリクレイン結合性バイシクルリードに対する０６－３４－１８コントロールの比較のヒト血漿安定性を示す図である。 交差反応性の新規なカリクレイン結合性バイシクルリードに対する０６－３４－１８コントロールの比較のヒト血漿安定性を示す図である。 交差反応性の新規なカリクレイン結合性バイシクルリードに対する０６－３４－１８コントロールの比較のヒト血漿安定性を示す図である。 ヒト（Ａ）およびラット（Ｂ）血漿中の０６－５５０誘導体の比較の安定性を示す図である。血漿およびペプチド混合物は、０時間（上部）、２１時間（中央）、および４６時間（下部）でサンプリングした。ペプチドの親ピークは、２４８１．９ＭＨ^＋である。親ピークの相対的な量が高いままであるように、４６時間の時間経過にまたがって観察される分解はわずかである。 ヒト（Ａ）およびラット（Ｂ）血漿中の０６－５５０誘導体の比較の安定性を示す図である。血漿およびペプチド混合物は、０時間（上部）、２１時間（中央）、および４６時間（下部）でサンプリングした。ペプチドの親ピークは、２４８１．９ＭＨ^＋である。親ピークの相対的な量が高いままであるように、４６時間の時間経過にまたがって観察される分解はわずかである。 ラットにおける２つの選択されたペプチドのｉｎ ｖｉｖｏの薬物動態学的プロファイルを示す図である。０６－２５９－０２誘導体は特に、そのクリアランスがほとんど腎濾過によって駆動されるので、ラットの循環で顕著な安定性を示す。 ２つの選択されたペプチドのウサギにおける硝子体内注射後のｉｎ ｖｉｖｏの薬物動態学的解析を示す図である。０６－５５０誘導体を含む両方のペプチドとも、２０～３０時間の排出半減期で、硝子体液から緩徐に排出された。 カラギーナン誘導性の足の浮腫に対する２つの選択されたペプチドの効果を示す図である。０６－２５９－０２誘導体を含む両方のペプチドとも、全ての時点でカラギーナンによって誘導される足の腫脹を阻害した。

別段に定義しない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、ペ
プチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学ならびに生化学の分野など
の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学、遺伝子学および生化
学的の方法には、本明細書中に参考として組み込まれている（Sambrook et al., Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biolog
y (1999) 4^th ed., John Wiley & Sons, Inc.を参照）標準の技法が使用される。

ペプチドリガンド
本明細書中で言及するペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドをいう
。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる２つ以上
の反応基（すなわちシステイン残基）、および、ペプチドが足場と結合した際にループを
形成することからループ配列と呼ばれる、前記反応基間に内在する配列を含む。本事例に
おいて、ペプチドは、少なくとも３個のシステイン残基（本明細書中で言及するＣ_ｉ、Ｃ
_ｉｉ、およびＣ_ｉｉｉ）を含み、足場上に少なくとも２個のループを形成する。

一実施形態では、上記ペプチドリガンドは、式（ａ）の配列を含む。式（ａ）のコンセ
ンサス配列は、最初のリードバイシクルペプチド０６－２５９、ならびに実施例１および
表２および４に記載の最初のリードの親和性成熟によって特定された最も見込みのあるペ
プチド配列の各々の両方由来のモチーフを含む。

さらなる実施形態では、式（ａ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｘ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ
_ｉｉ－Ｏ／Ｕ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｏ－Ｘ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号７）から選択される配列を含
む。

なおさらなる実施形態では、式（ａ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ／Ｈ／Ｙ－Ｗ－Ｎ
－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｇ／Ｓ／Ｐ－Ａ／Ｖ／Ｗ／Ｄ／Ｓ－Ｄ／Ｅ／Ｖ／Ｔ／Ｐ－Ａ／Ｇ／Ｐ
／Ｉ／Ｒ／Ｄ－Ｇ／Ｐ／Ｙ／Ｉ－Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｒ／Ｇ／Ｄ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号８
）から選択される配列を含む。

なおさらなる実施形態では、式（ａ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ／Ｈ／Ｙ－Ｗ－Ｎ
－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｇ／Ｓ／Ｐ－Ａ／Ｖ／Ｗ－Ｄ／Ｅ／Ｖ－Ａ／Ｇ／Ｐ－Ｇ／Ｐ－Ｆ／Ｉ
／Ｌ／Ｖ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号９）から選択される配列を含む。

なおさらなる実施形態では、式（ａ）のペプチドは、
-C_i-N-T-W-N-P-W-C_ii-G-W-V-G-G-F-C_iii- (06-259)(配列番号１０);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-V-E-P-P-V-C_iii- (06-259-01)(配列番号１１);
-C_i-N-T-W-N-P-W-C_ii-P-W-D-A-P-L-C_iii- (06-259-02)(配列番号１２);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-A-D-P-P-I-C_iii- (06-259-03)(配列番号１３);
-C_i-N-Y-W-N-P-W-C_ii-P-W-D-A-P-L-C_iii- (06-259-04)(配列番号１４);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-A-D-P-P-R-C_iii- (06-259-F1)(配列番号１５);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-P-A-D-I-P-V-C_iii- (06-259-E2)(配列番号１６);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-D-D-P-Y-I-C_iii- (06-259-H3)(配列番号１７)
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-S-D-P-P-V-C_iii- (06-259-H4)(配列番号１８)
-C_i-N-Y-W-N-P-W-C_ii-S-D-T-R-I-G-C_iii- (06-259-A6)(配列番号１９);および
-C_i-N-T-W-N-P-W-C_ii-S-W-P-D-I-D-C_iii- (06-259-F2)(配列番号２０)
から選択される配列を含む。

なおまださらなる実施形態では、式（ａ）のペプチドは、
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-V-E-P-P-V-C_iii- (06-259-01)(配列番号１１);
-C_i-N-T-W-N-P-W-C_ii-P-W-D-A-P-L-C_iii- (06-259-02)(配列番号１２);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-A-D-P-P-I-C_iii- (06-259-03)(配列番号１３);および
-C_i-N-Y-W-N-P-W-C_ii-P-W-D-A-P-L-C_iii- (06-259-04)(配列番号１４)
から選択される配列を含む。

この実施形態のペプチドは、親和性成熟によって、最も強力な候補の１つであることが
特定された（実施例１および表４を参照のこと）。さらに、この実施形態の各々のペプチ
ドは、ラットとヒトカリクレインとの間で、高い力価および良好な交差反応性の両方を実
証することが特定された（表５を参照のこと）。

なおまださらなる実施形態では、式（ａ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ－Ｗ－Ｎ－Ｐ
－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｐ－Ｗ－Ｄ－Ａ－Ｐ－Ｌ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５９－０２）（配列番号
１２）から選択される配列を含む。この実施形態のペプチドは、式（ａ）内のペプチドリ
ガンドの最も強力で、交差反応性で安定なメンバーであることが特定された（実施例１お
よび２を参照のこと）。例えば、本明細書に記載される方法番号１を用いる最初のスクリ
ーニングでは、０６－２５９－０２は、最大１０日までの検出ウインドウで判定した場合
、残りのバイシクルリードのほとんどよりも安定であることが示された（データ示さず）
。さらに、ｅｘ ｖｉｖｏの安定性はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで、特にラットで再現可能で
あって、ここではペプチドの代謝物は、クリアランスおよび既知の糸球体濾過速度と比較
して判定して事実上存在しなかった（実施例４）。

一実施形態では、ペプチドリガンドは、式（ｂ）の配列を含む。式（ｂ）のコンセンサ
ス配列は、最初のリードバイシクルペプチド０６－２５４および０６－２５５の両方由来
のモチーフ、ならびに実施例１ならびに表２および３に記載の最初のリード０６－２５４
の親和性成熟で特定された最も見込みのあるペプチド配列の各々を含む。

さらなる実施形態では、式（ｂ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｋ／Ｒ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ
－Ｃ_ｉｉ－Ｄ／Ｔ／Ｇ－Ｌ－Ｉ／Ｖ／Ｌ－Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ／Ｑ／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ／Ｗ
／Ｒ／Ｈ／Ａ－Ｄ／Ｇ／Ｉ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｐ／Ｖ－Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｋ／Ｇ／Ｈ／Ｆ／Ｑ
／Ｄ／Ｌ／Ｉ／Ｍ／Ｒ／Ｙ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号２１）から選択される配列を含む。

なおさらなる実施形態では、式（ｂ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｋ／Ｒ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ
－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｄ／Ｔ－Ｌ－Ｉ／Ｖ－Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ－Ｄ／Ｇ／Ｉ／Ｔ－Ｐ／Ｓ／Ｔ
－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号２２）から選択される配列を含む。

さらなる実施形態では、式（ｂ）のペプチドは、
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-T-I-S-C_iii- (06-254)(配列番号２３);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-E-T-T-C_iii- (06-254-01)(配列番号２４);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-G-P-C_iii- (06-254-02)(配列番号２５);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-M-D-T-C_iii- (06-254-03)(配列番号２６);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-Q-D-A-C_iii- (06-254-F4)(配列番号２７);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-S-I-K-C_iii- (06-254-B3)(配列番号２８);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-T-G-C_iii- (06-254-G3)(配列番号２９);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-Q-I-H-C_iii- (06-254-H4)(配列番号３０);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-G-I-T-C_iii- (06-254-G2)(配列番号３１);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-D-T-F-C_iii- (06-254-A4)(配列番号３２);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-E-A-Q-C_iii- (06-254-G4)(配列番号３３);
-C_i-K-N-F-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-I-S-C_iii- (06-254-D3)(配列番号３４);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-W-T-D-C_iii- (06-254-E2)(配列番号３５);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-D-L-C_iii- (06-254-F5)(配列番号３６);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-L-E-S-T-C_iii- (06-254-E5)(配列番号３７);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-R-P-P-C_iii- (06-254-D1)(配列番号３８);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-L-G-I-A-C_iii- (06-254-B9)(配列番号３９);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-H-D-I-C_iii- (06-254-E3)(配列番号４０);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-D-M-C_iii- (06-254-D6)(配列番号４１);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-A-D-L-C_iii- (06-254-H3)(配列番号４２);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-L-H-V-R-C_iii- (06-254-A7)(配列番号４３);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-A-P-Y-C_iii- (06-254-C1)(配列番号４４);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-G-L-V-Y-S-T-C_iii- (06-254-E6)(配列番号４５);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-L-P-D-L-C_iii- (06-254-B1)(配列番号４６);および
-C_i-R-N-Y-W-N-P-C_ii-T-L-I-N-I-T-C_iii- (06-255)(配列番号４７)
から選択される配列を含む。

なおまださらなる実施形態では、式（ｂ）のペプチドは、
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-E-T-T-C_iii- (06-254-01)(配列番号２４);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-G-P-C_iii- (06-254-02)(配列番号２５);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-M-D-T-C_iii- (06-254-03)(配列番号２６);および
-C_i-R-N-Y-W-N-P-C_ii-T-L-I-N-I-T-C_iii- (06-255)(配列番号４７)
から選択される配列を含む。

この実施形態のペプチドは、親和性成熟に従って最も強力な候補であることが特定され
た（実施例１および表３を参照のこと）。さらに、この実施形態の各々のペプチドは、ラ
ットとヒトカリクレインとの間で高い力価および良好な交差反応性の両方を実証すること
が特定された（表５を参照のこと）。

なおまださらなる実施形態では、式（ｂ）のペプチドは、
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-G-P-C_iii- (06-254-02)(配列番号２５);および
-C_i-R-N-Y-W-N-P-C_ii-T-L-I-N-I-T-C_iii- (06-255)(配列番号４７)
から選択される配列を含む。

この実施形態のペプチドは、式（ｂ）内のペプチドリガンドの各々のファミリーの最も
強力なメンバーであることが特定された（実施例２を参照のこと）。

なおまださらなる実施形態では、式（ｂ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｒ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ
－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｔ－Ｌ－Ｉ－Ｎ－Ｉ－Ｔ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５５）（配列番号４７）
から選択される配列を含む。本明細書に記載される方法番号１を用いる最初のスクリーニ
ングによって、０６－２５５は、最大１０日までの検出のウインドウで判定した場合、残
りのバイシクルリードのほとんどよりも安定であることが示された（データ示さず）。

一実施形態では、ペプチドリガンドは、式（ｃ）の配列を含む。式（ｃ）のコンセンサ
ス配列は、最初のリードバイシクルペプチド０６－２５６由来のループ１内の固定された
ＱＫＦＥＳＲ（配列番号４８）モチーフ、およびそこに含まれる同様の誘導体を、実施例
１および表２に記載のとおり含む。

さらなる実施形態では、式（ｃ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｑ－Ｋ－Ｆ－Ｅ－Ｓ－Ｒ－Ｃ
_ｉｉ－Ｒ－Ｖ－Ｄ－Ｔ－Ｒ－Ｙ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５６）（配列番号４９）から選択
される配列を含む。ヒトと、ラットと、ウサギとの間の０６－２５６に関する交差反応性
データを、表１および５に示す。

一実施形態では、ペプチドリガンドは、式（ｄ）の配列を含む。式（ｄ）のペプチド配
列は、実施例１および表１に記載のとおり、最初のリードバイシクルペプチド０６－２５
７の配列に相当する。ヒトと、ラットと、ウサギとの間の０６－２５７に関する交差反応
性データは、表１および５に示す。

一実施形態では、ペプチドリガンドは、式（ｅ）の配列を含む。式（ｅ）のコンセンサ
ス配列は、ループ１内の保存されたＰＹＰＥＲ（配列番号５０）モチーフ、およびループ
２内の２位のヒスチジン残基を、最初のリードバイシクルペプチド０６－２５８中に含み
、ここでこのコンセンサスは、最初の選択の回の間に特定された同様の配列に基づく（実
施例１および表２）。

さらなる実施形態では、式（ｆ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－（Ｎ）_ａ－Ｕ－Ｆ－Ｐ－Ｊ－
Ｒ－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号５１）から選択される配列
を含む。

さらなる実施形態では、式（ｅ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｐ－Ｙ－Ｐ－Ｆ－Ｒ－Ｃ_ｉｉ
－Ｌ－Ｈ－Ｅ－Ｎ－Ｌ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５８）（配列番号５２）から選択される配
列を含む。この実施形態のペプチドは、ラットとヒトカリクレインとの間で高い力価およ
び良好な交差反応性の両方を実証することが特定された（表５を参照のこと）。

一実施形態では、ペプチドリガンドは、式（ｆ）の配列を含む。式（ｆ）のコンセンサ
ス配列は、最初のリードバイシクルペプチド０６－２６１および０６－５５０の両方に由
来するモチーフ、ならびに実施例１ならびに表１および２に記載のように最初のスクリー
ニングから特定される最も見込みのあるペプチド配列の各々を含む。

なおさらなる実施形態では、式（ｆ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－（Ｎ）_ａ－Ｎ／Ｓ－Ｆ－
Ｐ－Ｆ／Ｙ－Ｒ－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号５３）から選
択される配列を含む。

さらなる実施形態では、式（ｆ）のペプチドは、
-C_i-N-N-F-P-F-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (06-261)(配列番号５４);または
-C_i-S-F-P-Y-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (06-550)(配列番号５５)
から選択される配列を含む。

なおまださらなる実施形態では、式（ｆ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｎ－Ｆ－Ｐ－Ｆ
－Ｒ－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２６１）（配列番号５４）
から選択される配列を含む。この実施形態のペプチドは、選択後に最も強力な候補の１つ
であることが特定された（実施例１および表１を参照のこと）。さらに、この実施形態の
ペプチドは、ラットとヒトカリクレインとの間で高い力価および良好な交差反応性の両方
を実証することが特定された（表５を参照のこと）。

別の実施形態では、式（ｆ）のペプチドは、－Ｃ_ｉ－Ｓ－Ｆ－Ｐ－Ｙ－Ｒ－Ｃ_ｉｉ－Ｖ
－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－５５０）（配列番号５５）から選択される配
列を含む。０６－５５０の利点を実証するデータは、実施例３および４に記載しており、
ここでは、０６－５５０が強力なキメラバイシクルであることが見出され得る。具体的に
は、ヒト、ラットおよびウサギカリクレインの間の交差反応性は、表７に見ることができ
る。

一実施形態では、本発明の特定のペプチドリガンドは、ヒト、ラットおよび／またはウ
サギの血漿カリクレインに特異的である。さらなる実施形態では、本発明の特定のペプチ
ドリガンドは、ヒトおよび／またはラットの血漿カリクレインに特異的である。なおさら
なる実施形態では、本発明の特定のペプチドリガンドは、ヒト血漿カリクレインに特異的
である。

ペプチドリガンドの利点
本発明の特定の二環性ペプチドは、多数の有利な特性を有しており、これによって、注
射、吸入、経鼻、眼、口腔または局所投与について適切な薬物様の分子とみなすことがで
きる。このような有利な特性としては以下が挙げられる。
－ 種交差反応性。これは、前臨床の薬力学および薬物動態学的評価のための典型的な
要件である。
－ プロテアーゼ安定性。二環性ペプチドリード候補ペプチドリガンドは理想的には、
血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー型（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｎｃｈｏｒｅｄ）」）
プロテアーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼな
どに対する安定性を実証するべきである。プロテアーゼ安定性は、バイシクルリード候補
が動物モデルで開発可能であり、ヒトに信頼性をもって投与可能であるように、異なる種
の間で維持されなければならない。
－ 望ましい溶解度プロファイル。これは、製剤化および吸収の目的に重要である、荷
電および親水性対疎水性残基の割合、ならびに分子内／分子間のＨ結合の関数である。
－ 循環中の最適血漿半減期。臨床指標および処置計画次第で、急性の疾患管理の状況
では、短い曝露用の二環性ペプチドを開発する必要がある場合もあるし、または循環中で
保持を増強している二環性ペプチドを開発する必要がある場合があり、したがって、より
慢性の疾患状態の管理に最適である。

薬学的に許容される塩
塩形態は、本発明の範囲内であることが理解され、式（Ｉ）の化合物に対する言及はこ
のような化合物の塩形態を含む。

本発明の塩は、Pharmaceutical Salts: Properties, Selection,and Use, P. Heinrich
Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 38
8 pages, August 2002に記載の方法などの従来の化学的方法によって、塩基性または酸性
の部分を含む親化合物から合成してもよい。一般には、このような塩は、これらの化合物
の遊離の酸または塩基形態と、適切な塩基または酸とを水中で、もしくは有機溶媒中で、
または２つの混合物中で反応させることによって調製され得る。

酸付加塩（一塩または二塩）は、無機および有機の両方の広範な種々の酸と形成されて
もよい。酸付加塩の例としては、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸
、アスコルビン酸（例えば、Ｌ－アスコルビン酸）、Ｌ－アスパラギン酸、ベンゼンスル
ホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）ショウノウ酸、ショウ
ノウ－スルホン酸、（＋）－（１Ｓ）－ショウノウ－１０－スルホン酸、カプリン酸、カ
プロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１
，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマ
ル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ－グルコン酸、グルクロン酸
（例えば、Ｄ－グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ－グルタミン酸）、α－オキ
ソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、
ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）－Ｌ－乳酸および（±）－ＤＬ－
乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（－）－Ｌ－リンゴ酸、マロン酸、（
±）－ＤＬ－マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ナフタレン
－１，５－ジスルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイ
ン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン
酸、Ｌ－ピログルタミン酸、サリチル酸、４－アミノ－サリチル酸、セバシン酸、ステア
リン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）－Ｌ－酒石酸、チオシアン酸、ｐ－トルエ
ンスルホン酸、ウンデシレン酸、および吉草酸からなる群から選択される酸、ならびにア
シル化アミノ酸および陽イオン交換樹脂を用いて形成された一塩または二塩が挙げられる
。

塩の具体的な１グループは、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン
酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホ
ン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシラート）、エタンスルホン酸
、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸、お
よびラクトビオン酸から形成された塩からなる。１つの具体的な塩は、塩酸塩である。別
の具体的な塩は、酢酸塩である。

修飾誘導体
本明細書に定義されるペプチドリガンドの修飾誘導体は、本発明の範囲内であることが
理解される。このような適切な修飾誘導体の例としては、Ｎ末端修飾および／またはＣ末
端修飾、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置
換（例えば、１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等比体積または等電
子アミノ酸での置換、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の等比体積また
は等電子アミノ酸での置換）、スペーサー基の付加、１つまたは複数の酸化感受性アミノ
酸残基の１つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基での置換、１つまたは複数のアミノ酸残
基のアラニンでの置換、１つまたは複数のＬ－アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ－アミ
ノ酸残基での置換、二環性ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮ－アル
キル化、１つまたは複数のペプチド結合の代用結合での置換、ペプチド骨格長改変、１つ
または複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の別の化学基での置換、ならびにシステイン
、リジン、グルタミン酸塩／アスパラギン酸塩およびチロシンなどのアミノ酸の、適切な
アミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬での合成後修飾から選択され
る１つまたは複数の修飾が挙げられる。

一実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端修飾および／またはＣ末端修飾を含む。

さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｎ
末端修飾は、Ｎ末端アセチル基を含む。この実施形態では、Ｎ末端システイン基（本明細
書ではＣ_ｉと呼ばれる基）は、無水酢酸または他の適切な試薬で、ペプチド合成の間にキ
ャップされて、Ｎ末端アセチル化されている分子がもたらされる。この実施形態は、アミ
ノペプチダーゼの潜在的認識ポイントを除去するという利点を提供し、二環性ペプチドの
分解の可能性を回避する。

さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｃ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｃ
末端修飾は、アミド基を含む。この実施形態では、Ｃ末端システイン基（本明細書ではＣ
_ｉｉｉと呼ばれる基）は、ペプチド合成の間、アミドとして合成されて、Ｃ末端アミド化
されている分子がもたらされる。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認
識ポイントを除去するという利点を提供し、二環性ペプチドの分解の可能性を回避する。

一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非
天然のアミノ酸残基での置換を含む。この実施形態では、分解性のプロテアーゼによって
さらに認識もされず、標的力価になんら効果も有さない等比体積／等電子側鎖を有する非
天然のアミノ酸が選択され得る。

あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質分解による加水分解がコンホメーション的
および立体的に妨害されるような、制約されたアミノ酸側鎖を有する非天然のアミノ酸を
用いてもよい。具体的には、これらは、プロリンアナログ、巨大な（bulky）側鎖、Ｃα
－二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）、およびシクロアミノ酸、単純な誘
導体（アミノ－シクロプロピルカルボン酸である）に関する。

さらなる実施形態では、プロリン残基は、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基で置換されて
もよく、および／またはアルギニン残基は、Ｎ－α－メチルアルギニンまたはＬ－ホモア
ルギニン残基で置換されてもよい。本明細書に示されているデータによって、このような
非天然のアミノ酸の存在は、タンパク質分解性の安定性を向上し、一方では、二環性ペプ
チドリガンドの標的親和性を維持するかまたは向上することが実証される。

実施例３は、０６－５５０ペプチドリガンドの選択された非天然の誘導体を実証する。
したがって、一実施形態では、本発明は、式（ｆ）の非天然の誘導体であって、
-C_i-S-F-P-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) HArg5)(配列番号５６);
-C_i-S-F-[Aze]-Y-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (配列番号５７);
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号５
８);
-C_i-S-F-P-Y-[NMeR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) NMeArg5)(配列番号５９);お
よび
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[NMeR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) Aze3 NMeArg5)(配列番
号６０);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでＡｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲはＬ－ホモアルギニン残基
を表し、ＮＭｅＲがＮ－α－メチルアルギニン残基を表す非天然の誘導体を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、式（ｆ）の非天然の誘導体であって、
-C_i-S-F-P-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) HArg5)(配列番号５６);
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号５
８);
-C_i-S-F-P-Y-[NMeR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) NMeArg5)(配列番号５９);お
よび
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[NMeR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) Aze3 NMeArg5)(配列番
号６０);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでＡｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲがＬ－ホモアルギニン残基
を表し、ＮＭｅＲがＮ－α－メチルアルギニン残基を表す、非天然の誘導体を提供する。

ヒト、ラットおよびウサギカリクレインの間のこれらの修飾されたペプチドの交差反応
性は表７に見出され得る。

なおさらなる実施形態では、本発明は、式（ｆ）の修飾誘導体であって、
-C_i-S-F-P-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) HArg5)(配列番号５６);および
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号５
８);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでＡｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲはＬ－ホモアルギニン残基
を表す、修飾誘導体を提供する。

この実施形態のペプチドは、対応するＮ－メチル修飾誘導体よりも安定であることが実
証されている（実施例３を参照のこと）。

なおまださらなる実施形態では、本発明は、式（ｆ）の非天然の誘導体であって、－Ｃ
_ｉ－Ｓ－Ｆ－［Ａｚｅ］－Ｙ－［ｈＲ］－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－
（（０６－５５０）Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ５）（配列番号５８）（ここでＡｚｅは、Ｌ－ア
ゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲはＬ－ホモアルギニン残基を表す）から選択される
配列を有するペプチドを含む非天然の誘導体を提供する。

この実施形態のペプチドは、ヒトおよびラットの両方の親和性が高いので、十分耐容さ
れることが実証されている（実施例３および表７を参照のこと）。

一実施形態では、修飾誘導体は、スペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、
修飾誘導体は、Ｎ末端システイン（Ｃ_ｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃ_ｉｉｉ）
に対するスペーサー基の付加を含む。なおさらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｃ末端
システイン（Ｃ_ｉｉｉ）に対するスペーサー基の付加を含む。なおまださらなる実施形態
では、スペーサー基は、２つ以上のＤ－アルギニン残基（適切には２つのＤ－アルギニン
残基）に連結された１つまたは複数のサルコシン基（適切には３つのサルコシン基）を含
む。本明細書に示すデータでは、このようなスペーサーの存在が、二環性ペプチドリガン
ドの水溶性を向上することが示される。

一実施形態では、本発明は、式（ａ）の修飾誘導体であって、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ－Ｗ－Ｎ
－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｐ－Ｗ－Ｄ－Ａ－Ｐ－Ｌ－Ｃ_ｉｉｉ－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２（
（０６－２５９－０２（Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２）（配列番号６１）（ここでＳａｒ
_３は、３つのサルコシンスペーサーを表し、（Ｄ－Ａｒｇ）_２は２つのＤ－アルギニン残
基を表す）から選択される配列を有するペプチドを含む修飾誘導体を提供する。

この実施形態のペプチドによって、実施例４に記載の好適なｉｎ ｖｉｖｏの薬物動態
学的プロファイルが実証された。具体的には、このペプチドは、そのクリアランスのほと
んどが腎濾過によって駆動されるという理由で、ラットの循環中で顕著な安定性を実証し
た。さらに、この実施形態のペプチドはまた、このようなモデルについてのゴールデンス
タンダード（インドメタシン）に匹敵した実施例６に記載のようなカラギーナン誘導性の
足の腫脹の高度に有意な阻害も実証した。

一実施形態では、本発明は、式（ｆ）の修飾誘導体であって、
-C_i-S-F-P-Y-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii-Sar₃-(D-Arg)₂((06-550)-Sar₃-(DArg₂))(配列
番号６２);および
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii-Sar₃-(D-Arg)₂((06-550)-Sar₃-(DArg₂
) Aze3 HArg5)(配列番号６３);
から選択される配列を有するペプチドを表し、
ここでＳａｒ_３は、３つのサルコシンスペーサーを表し、（Ｄ－Ａｒｇ）_２は２つのＤ－
アルギニン残基を表し、ＡｚｅはＬ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲはＬ－ホモ
アルギニン残基を表す。

この実施形態のペプチドは、より好適な水溶性を有することが実証されている（実施例
３を参照のこと）。さらに重要なことに、Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２（配列番号９８）
基の追加は、十分耐容され、その理由は、この修飾を欠いているペプチドと比較して力価
が未変化のままであるからである（実施例３および表７を参照のこと）。

さらなる実施形態では、本発明は、式（ｆ）の修飾誘導体であって、－Ｃ_ｉ－Ｓ－Ｆ－
［Ａｚｅ］－Ｙ－［ｈＲ］－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－Ｓａｒ_３－（
Ｄ－Ａｒｇ）_２（（０６－５５０）－Ｓａｒ_３－（ＤＡｒｇ_２）Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ５）
（配列番号６３）から選択される配列を有しているペプチドを含み、ここでＳａｒ_３は、
３サルコシンスペーサーを表し、（Ｄ－Ａｒｇ）_２は２つのＤ－アルギニン残基を表し、
ＡｚｅはＬ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲはＬ－ホモアルギニン残基を表す修
飾誘導体を提供する。この実施形態のペプチドは、実施例３において、分解生成物はほと
んど観察されなかったので、高度な安定性を有することが実証されている。さらに、この
実施形態のペプチドはまた、実施例４に記載のような好適なｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学的
プロファイルを実証した。さらに、この実施形態のペプチドは、実施例５に記載されると
おり、ウサギの眼への硝子体内注射後に硝子体液からのクリアランスが遅いことを実証し
た。それ自体が既に有利であるが、この特性によってさらに、眼への投与のための徐放性
の処方物に理想的に適しているという利点が得られる。

一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまた
は複数の酸化耐性アミノ酸残基での置換を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、
トリプトファン残基のフェニルアラニン残基での置換を含む。この実施形態によって、得
られた二環性ペプチドリガンドの医薬品安定性プロファイルを改善するという利点が得ら
れる。

一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の荷電アミノ酸残基の１つまたは複数
の疎水性アミノ酸残基での置換を含む。別の実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複
数の疎水性アミノ酸残基の１つまたは複数の荷電アミノ酸残基での置換を含む。荷電対疎
水性アミノ酸残基の正確な均衡は、二環性ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば
、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度に対して、したがって、血漿におけ
る遊離した利用できる画分の濃度に影響を与え、一方、荷電アミノ酸残基（特にアルギニ
ン）は、細胞表面におけるリン脂質膜とペプチドとの相互作用に影響を与え得る。組み合
わせた両者は、半減期、分布の体積およびペプチド薬物への曝露に影響を与えることがで
き、臨床エンドポイントに応じて目的に合わせて作製することができる。加えて、荷電対
疎水性アミノ酸残基の正確な組合せおよび数は、注射部位における刺激作用を低下させる
ことができる（ペプチド薬物を皮下投与した場合）。

一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のＬ－アミノ酸残基の１つまたは複数
のＤ－アミノ酸残基での置換を含む。この実施形態は、立体障害によって、およびＤ－ア
ミノ酸の傾向によって（βターンコンホメーションを安定化させる）タンパク質分解安定
性を増加させるためと考えられる（Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418）。

一実施形態では、修飾誘導体は、二環性ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド
結合のＮ－アルキル化誘導体を含む。この実施形態は、解離しやすいアミド結合の直接的
な修飾によりタンパク質分解からの保護を与えることであると考えられる（Fiacco et al
, Chembiochem. (2008), 9(14), 2200-3）。Ｎ－メチル化は、ペプチド結合のねじれ角に
対する強力な効果も有し、細胞浸透＆経口利用能を助けると考えられる（Biron et al (2
008), Angew. Chem. Int. Ed., 47, 2595 -99）。

一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のＮ－アルキル化誘導体（例えば、－
ＣＯ－ＮＲ）還元ペプチド結合（例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ－）、ペプトイド結合（例えば
、－ＮＲ－ＣＨ_２－ＣＯ－）、チオアミド結合（例えば、－ＣＳ－ＮＨ－）、アザペプチ
ド結合（例えば、－ＣＯ－ＮＨ－ＮＲ－）、トランス－アルケン結合（例えば、－ＲＨＣ
＝Ｃ－）、レトロ－インベルソ結合（例えば、－ＮＨ－ＣＯ－）および尿素代用結合（例
えば、－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨＲ－）から選択される代用結合による１つまたは複数のペプチ
ド結合の置換を含む。

一実施形態では、修飾誘導体は、任意のアラニンアミノ酸残基の除去を含む。この実施
形態は、潜在的なタンパク質分解性攻撃部位を除去するという利点を提供する。

一実施形態では、修飾誘導体は、ペプチド骨格長改変を含む。さらなる実施形態では、
ペプチド骨格長改変は、１つまたは複数のβ^２／３－アミノ酸残基（例えば、－ＮＨ－Ｃ
Ｒ－ＣＨ_２－ＣＯまたは－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨＲ－ＣＯ－）の使用を含む。

一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上に置換を含
む。この実施形態は、骨格のコンホメーションを制約するという利点を提供する。さらな
る実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の２－アミノイソ酪酸（
α－アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、α－メチルアラニンまたは２－メチルアラニンとしても
公知）での置換を含む。

上述の修飾の各々は、標的に対するペプチドの効力の計画的な改善になることを留意さ
れたい。さらに修飾に基づく力価改善は、以下の機序を通じて達成され得る。
－ より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活かし、より低いオフレートに
つながる疎水性部分を組み込むこと
－ 長期にわたるイオン性相互作用を活用する荷電された基を組み込み、より速いオン
レートおよびより高い親和性をもたらすこと（例えば、Schreiber et al,Rapid, electro
statically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-
31を参照のこと、および
－ 例えば、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、アミノ酸の側鎖
を正確に制約すること、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、骨格の
二面角を制約すること、および同一の理由のために分子中に追加の環化を導入すること、
によって、ペプチドに追加的な制約を組み込むこと。

（総説のため、Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-
203およびNestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418を参照）。

結合活性
本明細書の文脈における特異性は、標的と類似の実体を除外したその同族標的と結合す
る、さもなければこれと相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵
素の相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの
能力を指すことができる。本明細書に記載されているアプローチを用いて、企図される標
的のホモログまたはパラログとリガンドがより相互作用できるようにまたはできなくなる
ように、特異性が増加または減少するようモジュレートすることができる。特異性は、活
性、親和性またはアビディティーと同義であるとは企図されておらず、その標的における
リガンドの作用の効力（例えば、結合親和性または阻害のレベル等）は、必ずしもその特
異性に関係しない。

本明細書における結合活性は、例えば、本明細書に記載されている結合アッセイから得
られる定量的結合測定値を指す。したがって、結合活性は、所定の標的濃度で結合してい
るペプチドリガンドの量を指す。

多重特異性は、２種以上の標的に結合する能力である。通常、結合ペプチドは、そのコ
ンホメーション特性により、抗体の場合はエピトープ等、単一の標的と結合することがで
きる。しかし、２種以上の標的に結合することができるペプチド、例えば、上記のように
当技術分野において既知の通り、二重特異的抗体を開発することができる。本発明におい
て、ペプチドリガンドは、２種以上の標的に結合することができ、したがって多重特異的
となり得る。好適には、これは、２種の標的に結合し、二重特異的である。結合は、独立
的となることができ、これは、ペプチドにおける標的に対する結合部位が、標的の一方ま
たは他方の結合により構造的に妨げられないことを意味する。この場合、両方の標的が独
立的に結合していてよい。より一般的には、一方の標的の結合が、他方の結合を少なくと
も部分的に妨害するであろうと予想される。

二重特異的リガンドと２つの関連の標的を含む特異性を有するリガンドとの間に基本的
な相違が存在する。第１の事例では、リガンドは両方の標的について個々に特異的であり
、お互いと特異的な方式で相互作用する。例えば、リガンド中の第１のループは、第１の
標的に結合し得、第２のループは第２の標的に結合し得る。第２の事例では、リガンドは
非特異的である。なぜなら、リガンドは、例えば、両方に共通の標的のエピトープとの相
互作用によって、２つの標的の間で違いがあることはないからである。

本発明の状況では、例えば、標的およびオルソログについて活性を有するリガンドは、
二重特異性リガンドであり得ることが可能である。しかし、一実施形態では、このリガン
ドは二重特異性ではなく、有する特異性の正確性が少なく、その結果、このリガンドは、
標的と１つまたは複数のオルソログの両方に結合する。一般には、標的とそのオルソログ
の両方に対して選択されていないリガンドは、二重特異性に向かう選択的圧力がないせい
で、二重特異性である可能性が低い。二環性ペプチドのループ長は、関連の少ないホモロ
グに対する高い選択性を維持したままで、良好な標的およびオルソログの交差反応性が得
られるように、仕立てられた結合表面を提供するのには決定的であり得る。

このリガンドが真に二重特異性である場合、一実施形態では、リガンドの標的特異性の
うちの少なくとも１つは、選択されるリガンドのうちでも一般的であり、その特異性のレ
ベルは、本明細書に開示される方法によってモジュレートされ得る。第２のまたはさらな
る特異性は共有される必要はなく、本明細書に示される手順の対象となる必要もない。

標的は、ペプチドリガンドが結合する、さもなければ相互作用する分子またはその一部
である。結合は、多くの種類の活性に必須のものと理解され、それ自体が活性となり得る
が、他の活性が想定される。よって、本発明は、直接的または間接的な結合の測定を必要
としない。

分子足場とは、複数の点でペプチドと接続して、ペプチドに１つまたは複数の構造的特
長を与えることができる、任意の分子である。好ましくは、分子足場は、足場反応基と呼
ばれる、ペプチドの結合点を少なくとも３つ含む。これらの基は、ペプチド上のシステイ
ン残基（Ｃ_ｉ、Ｃ_ｉｉ、およびＣ_ｉｉｉ）と反応して共有結合を形成することができる。
それらは、単にジスルフィド結合（分子の還元性の切断および付随する分解に供される）
を形成するのではなく、安定な共有チオエーテル連結を形成する。分子足場の好ましい構
造を以下に記載する。

分子足場
分子足場は、例えば、ＷＯ２００９／０９８４５０ならびにそこに引用されている参考
文献、特に、ＷＯ２００４／０７７０６２およびＷＯ２００６／０７８１６１において記
載されている。

前述の文書に記されている通り、分子足場は、有機小分子等、小分子でもよい。

一実施形態では、分子足場は、ヌクレオシド、糖、またはステロイドなどの天然の単量
体であり得る、またはそれに基づき得る。例えば、分子足場は、二量体または三量体など
の、そのような実体の短いポリマーを含み得る。

一実施形態では、分子足場は、既知の毒性、例えば低い毒性の化合物である。適切な化
合物の例には、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはタマゼパム（ｔａｍ
ａｚｅｐａｍ）などの既存の薬物が含まれる。

一実施形態では、分子足場は巨大分子であり得る。一実施形態では、分子足場は、アミ
ノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。

一実施形態では、分子足場は、ポリペプチドの官能基（複数可）と反応して共有結合を
形成することができる反応基を含む。

分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボ
ン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、酸無水物、スクシンイミド、マレイミド
、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの化学基を含有し得る。

一実施形態では、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５－ト
リス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、またはその誘導体を含み得る、または
それからなり得る。

一実施形態では、分子足場は２，４，６－トリス（ブロモメチル）メシチレンである。
この分子は、１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似であるが、ベンゼン環
に結合した３つの追加的なメチル基を含有する。これは、追加的なメチル基が、ポリペプ
チドとのさらに別の接触を形成し、したがって追加的な構造的制約を加え得るという利点
を有する。

本発明の分子足場は、本発明のコードされたライブラリのポリペプチドの官能基が分子
足場と共有結合を形成することのできる化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオ
ール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、
アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジ化物、ハロゲン化アルキルおよび
ハロゲン化アシルを含む広範な官能基から選択される。

システインのチオール基と反応させるために分子足場上で使用することができる足場反
応基は、アルキルハロゲン化物、（またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも命
名される）。

具体例は、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢにより例証される足場反応基）またはヨー
ドアセトアミドである。化合物をタンパク質中のシステインと選択的にカップリングさせ
るために使用される他の足場反応基はマレイミドである。本発明において分子足場として
使用され得るマレイミドの例には、トリス－（２－マレイミドエチル）アミン、トリス－
（２－マレイミドエチル）ベンゼン、トリス－（マレイミド）ベンゼンが含まれる。セレ
ノシステインは、また、システインと類似の反応性を有しており、同じ反応に使用するこ
とができる天然アミノ酸である。したがって、システインに言及する場合はいつでも、文
脈によりそうでないと示唆される場合以外は、セレノシステインを置換することが典型的
には許容される。

エフェクターおよび官能基
エフェクターおよび／または官能基を、例えば、ポリペプチドのＮもしくはＣ末端にま
たは分子足場に付けることができる。

適切なエフェクター基は、抗体およびその部分または断片を含む。例えば、エフェクタ
ー基は、１種または複数種の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗
体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメインまたはこれら
のいずれかの組合せを含むことができる。エフェクター基は、抗体のヒンジ領域（ＩｇＧ
分子のＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間に通常存在する領域等）を含むこともできる。

本発明の本態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基は、ＩｇＧ分子
のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基は、１日間
以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上または７日間以上
のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、あるいはこれからなる。最も
有利には、本発明によるペプチドリガンドは、１日間以上のｔβ半減期を有するペプチド
リガンドＦｃ融合体を含む、あるいはこれからなる。

官能基は、一般に、結合基、薬物、他の実体を付けるための反応基、細胞への大環状ペ
プチドの取り込みを助ける官能基その他を含む。

細胞へと浸透するペプチドの能力は、細胞内標的に対するペプチドを有効なものとする
ことができる。細胞へと浸透する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的は、
転写因子、チロシンキナーゼ等の細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与
する分子を含む。細胞の浸透を可能にする官能基は、ペプチドまたは分子足場のいずれか
に付加されたペプチドまたは化学基を含む。ＶＰ２２、ＨＩＶ－Ｔａｔ、ショウジョウバ
エ（Drosophila）のホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）等に由来するペプチ
ド等、ペプチドは、例えば、Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2
007) Volume 35巻, Part 4, p821;Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (
2004) Volume 57 9637に記載されている。細胞膜を通した転位置において効率的であるこ
とが示された短いペプチドの例として、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由
来の１６アミノ酸ペネトラチン（penetratin）ペプチド（Derossi et al (1994) J Biol.
Chem. Volume 269 p10444頁）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Oehlke et
al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127頁）およびＨＩＶ ＴＡＴタンパク
質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチは、生体分子に容易に
付けることができる小分子模倣物またはＳＭＯＣの使用を含む（Okuyama et al (2007) N
ature Methods Volume 4 p153）。分子にグアニジウム基を付加する他の化学的戦略も、
細胞浸透を増強させる（Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585）。
ステロイド等、低分子量の分子を分子足場に付加して、細胞への取り込みを増強させるこ
とができる。

ペプチドリガンドに付けることのできる官能基の一クラスは、抗体、およびＦａｂ、Ｆ
ｖまたはシングルドメイン断片等、その結合断片を含む。特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける
ペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体を用いる
ことができる。

多くの細胞上に存在するインテグリンに結合するＲＧＤペプチドを組み入れることもで
きる。

一実施形態では、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基は、１２時間以上、２
４時間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、７日間以
上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上、１１日間以上、１２日間以上、１３日間以
上、１４日間以上、１５日間以上または２０日間以上からなる群から選択されるｔβ半減
期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基または組成物は、
１２～６０時間の範囲内のｔβ半減期を有するであろう。さらに別の実施形態では、これ
は、１日間以上のｔβ半減期を有するであろう。さらにまた別の実施形態では、これは、
１２～２６時間の範囲内であろう。

官能基は、癌治療のための細胞傷害性薬剤等、薬物を含む。これは、シスプラチンおよ
びカルボプラチン等のアルキル化剤ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロ
ホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド；プリンアナログ、アザチオプリンおよ
びメルカプトプリンを含む抗代謝剤またはピリミジンアナログ；ビンクリスチン、ビンブ
ラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン等、ビンカアルカロイドを含む植物アルカロイ
ドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシ
ド；本来タキソールとして知られた、パクリタキセルを含むタキサン；カンプトテシンを
含むトポイソメラーゼ阻害剤；イリノテカンおよびトポテカン、ならびにアムサクリン、
エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシドを含むＩＩ型阻害剤を含む。さらに別
の薬剤は、免疫抑制薬ダクチノマイシン（腎臓移植において用いられる）、ドキソルビシ
ン、エピルビシン、ブレオマイシンなどを含む抗腫瘍抗生物質を含むことができる。

可能なエフェクター基は、例えば、ペプチドリガンドが、ＡＤＥＰＴにおいて抗体を置
き換える、酵素／プロドラッグ治療法において用いるためのカルボキシペプチダーゼＧ２
等、酵素も含む。

合成
本発明のペプチドは、標準的な技術によって、続いてインビトロでの分子足場での反応
によって、合成的に製造されてもよい。これが行われる場合、標準的な化学が用いられて
もよい。これによって、さらなる下流の実験またはバリデーションのために可溶性の材料
の迅速な大規模調製が可能になる。このような方法は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（上述）に
開示されるもののような従来の化学を用いて達成され得る。

したがって、本発明はまた、本明細書に示されるように選択されたポリペプチドまたは
コンジュゲートの製造であって、下に説明されるような任意選択のさらなるステップを含
む製造に関する。一実施形態では、これらのステップは、化学合成によって作製された最
終生成物のポリペプチド／コンジュゲートで行われる。

任意選択で、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を
製造する場合、置換されてもよい。

ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、それによって複数の特異性を導入す
るために伸長されてもよい。

ペプチドを伸長するために、これは、標準的な固相または溶液相化学を用い、直交的に
保護されたリジン（およびアナログ）を用いて、ループのＮ末端もしくはＣ末端で、また
はループ内で化学的に、伸長されてもよい。標準的なタンパク質化学を、活性化可能なＮ
末端またはＣ末端を導入するために用いてもよい。あるいは、追加は、例えば、（Dawson
et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776
-779）に記載のように断片縮合もしくは天然の化学的ライゲーションによって、または酵
素によって、例えば、（Chang et al Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20;91(26):1
2544-8、またはHikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, I
ssue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003）に記載のようにサブチリガーゼを用いて
行ってもよい。

あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を通じてさらなるコンジュゲーションによっ
て伸長または修飾されてもよい。これは、第１および第２のペプチドが、細胞の還元性環
境内でお互いから一度解離することが可能になるという追加の利点を有する。この場合、
分子足場（例えば、ＴＢＭＢ）が、３つのシステイン基と反応するように第１のペプチド
の化学合成の間に追加され得る；次いで、さらなるシステインが、このシステインが第２
のペプチドの遊離のシステインとのみ反応するように、第１のペプチドのＮ末端に追加さ
れてもよい。

同様の技術を、２つの二環性および二重特異性の大員環の合成／カップリングに等しく
適用して、可能性としては四重特異的な分子を作成する。

さらに、他の官能基またはエフェクター基の追加は、適切な化学を用いて同じ方式で達
成され得、Ｎ末端もしくはＣ末端で、または側鎖を介してカップリングする。一実施形態
では、このカップリングは、これがいずれの実体の活性もブロックしないような方式で行
われる。

医薬組成物
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義されるペプチドリガンドを１つまたは
複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。

一般に、本発明のペプチドリガンドは、精製された形態で、薬理学的に適切な賦形剤ま
たは担体と共に利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体には、生理食塩水お
よび／または緩衝媒体を含めた、水性またはアルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁
液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デ
キストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが含まれる。ポリペプチド複
合体を懸濁液に保つために必要な場合は、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カ
ルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどの
シックナーから選択し得る。

静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液および栄養素
補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物、抗酸化剤、キレート化剤およ
び不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る（Mack (1982) Remington’s P
harmaceutical Sciences, 16th Edition）。

本発明のペプチドリガンドは、別々に投与する組成物として、または他の薬剤と併せて
使用し得る。これらには、シルコスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたは
シスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれ
る場合がある。医薬組成物に様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明のタン
パク質リガンド、またはさらには標的リガンドを用いて選択されたポリペプチドなどの様
々な特異性を有する本発明によって選択されたポリペプチド）の組み合わせとを併せた「
カクテル」が含まれる場合があり、これらを投与前にプールするかどうかに拘らない。

本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののうちの任
意のものであり得る。これに限定されないが免疫療法を含む治療のために、本発明のペプ
チドリガンドは、標準の技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経
口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、また、適切には、カテーテルを用いた直
接輸液によるものを含めた、任意の適切な様式であることができる。用量および投与頻度
は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、対抗適応症ならびに臨床家が考
慮すべき他のパラメータに依存する。

本発明のペプチドリガンドは、眼科障害の処置のための眼科用組成物として製剤化され
るとき、その投与経路は典型的には、局所、結膜下、テノン下、眼内、眼科インプラント
などの眼科経路による投与など、その眼科障害の部位に直接であることが理解される。一
実施形態では、投与の経路は、眼内注射による。別の実施形態では、その眼科用組成物は
、局所に（例えば、眼球外適用）または全身的（例えば、口腔または他の非経口経路、例
えば、皮下投与など）であり、ただし、眼の中または眼に隣接して位置する細胞または組
織内の十分な量のペプチドが、眼科状態の部位との接触を達成する条件である。別の実施
形態では、眼科用組成物は、非経口的に送達される。投与の正確な経路は、ＷＯ２００７
／１０４５４１（その内容は、参照によって本明細書に援用される）に記載の共通の一般
的知識および方法論に従って、処置されるべき眼科障害に取り組めば、当業者には直ちに
明らかになる。

本発明のペプチドリガンドは、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成する
ことができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾
燥および再構成の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および再構成は様々
な度合の活性の損失をもたらす場合があり、補償するためにレベルを上方調節する必要が
あり得ることが理解されよう。

本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／ま
たは治療的な処置のために投与することができる。特定の治療的の応用では、選択された
細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、変調、死滅、または何らかの他の測定可能
なパラメータを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。こ
の用量を達成するために必要な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態
に依存するが、一般に体重１キログラム当たり０．００５～５．０ｍｇの選択されたペプ
チドリガンドの範囲であり、０．０５～２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使
用される。予防的な応用では、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する
組成物を、同様または僅かに低い用量で投与してもよい。

本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的
細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設
定で利用し得る。さらに、本明細書中に記載のペプチドリガンドは、不均一な細胞のコレ
クションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除去するために、体外ま
たはｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に使用し得る。哺乳動物からの血液を体外で選択されたペ
プチドリガンドと合わせ、これにより所望しない細胞を死滅させるまたは他の様式で血液
から除去して、標準の技法に従って哺乳動物に戻し得る。

治療的な使用
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、ｉｎ ｖｉｖｏ治療および
予防適用、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ診断適用、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
および試薬適用その他において用いることができる。選択されたレベルの特異性を有する
リガンドは、交差反応性が望ましい非ヒト動物における検査に関与する適用において、あ
るいはホモログまたはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断適用に
おいて有用である。ワクチン適用等、一部の適用において、所定の範囲の抗原に対する免
疫応答を誘発する能力を活用して、ワクチンを特異的疾患および病原体の目的に合わせる
ことができる。

少なくとも９０～９５％の均一性の実質的に純粋なペプチドリガンドが哺乳動物への投
与に好ましく、９８～９９％またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場
合に製薬的な使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、
選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療（体外が含まれる）において、またはアッ
セイ手順、免疫蛍光染色などの展開および実行において使用し得る（Lefkovite and Pern
is, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY
）。

本発明のペプチドリガンドは、典型的には、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細
菌またはウイルス感染、および自己免疫障害（これらに限定されないが、Ｉ型糖尿病、多
発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症を
含む）の予防、抑制または処置において使用が見つかる。

したがって、本発明のさらなる態様によれば、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、
細菌またはウイルス感染、および自己免疫障害を予防、抑制または処置するのにおける使
用のための、本明細書において定義されたようなペプチドリガンドが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウ
イルス感染、眼科障害、および自己免疫障害を予防、抑制または処置する方法であって、
本明細書に定義されるペプチドリガンドの必要な患者に対して投与することを含む方法が
提供される。

一実施形態では、本発明の眼科障害は、網膜の血管の透過性および／または完全性の損
傷に関連する障害である。さらなる実施形態では、本発明の眼科障害は、局所出血を引き
起こす網膜微小血管の破裂に関連する障害である。さらなる実施形態では、本発明の眼科
障害は、眼後部の疾患、具体的には網膜疾患である。さらなる実施形態では、本発明の眼
科障害は、前眼部の疾患である。さらなる実施形態では、本発明の眼科障害は、眼の過剰
な血管透過性および／または浮腫に関連する障害である。

適切な「眼科の障害」の例（これには、滲出性および／または炎症性の眼科の障害、網
膜の血管の透過性および／または完全性の損傷に関連する障害、局所出血を引き起こす網
膜微小血管の破裂に関連する障害、眼後部の疾患、網膜疾患、および前眼部の疾患を含む
）は、これらに限定されないが、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、滲出性黄斑変性（「ウェッ
ト（滲出型）（ｗｅｔ）」または新血管性加齢性黄斑変性症（ｗｅｔ－ＡＭＤ）としても
公知である）、黄斑浮腫、老人性円板状黄斑変性症、嚢胞様黄斑浮腫、眼瞼浮腫、網膜浮
腫、糖尿病網膜症、急性黄斑神経網膜症、中心性漿液性網膜脈絡膜症、網脈絡膜炎、脈絡
叢新血管新生、血管新生黄斑症、新生血管緑内障、動脈閉塞性および静脈閉塞性網膜症（
例えば、網膜静脈閉塞症または網膜動脈閉塞症）、網膜中心静脈閉塞症、播種性血管内凝
固症候群、網膜分枝静脈閉塞症、高血圧性眼底変化、眼性虚血発作、網膜動脈小動脈瘤、
コーツ病、傍中心窩毛細血管拡張症、半側網膜静脈閉塞症、乳頭血管炎、網膜中心動脈閉
塞症、網膜動脈分枝閉塞症、頚動脈疾患（ＣＡＤ）、霜状分枝血管炎（ｆｒｏｓｔｅｄ
ｂｒａｎｃｈ ａｎｇｉｔｉｓ）、鎌状赤血球網膜症および他のヘモグロビン異常症、網
膜色素線条症、疾患を病因とする黄斑浮腫（例えば、糖尿病黄斑浮腫）、眼部の損傷もし
くは眼部の外科手術；例えば、損傷、外傷もしくは腫瘍により引き起こされる網膜の虚血
もしくは網膜変性、ブドウ膜炎、虹彩炎、網膜血管炎、眼内炎、全眼球炎、転移性眼炎、
脈絡膜炎、網膜色素上皮炎、結膜炎、毛様体炎、強膜炎、上強膜炎、視神経炎、球後視神
経炎、角膜炎、眼瞼炎、滲出性網膜剥離、角膜潰瘍、結膜潰瘍、慢性貨幣状角膜炎、タイ
ゲソン角膜炎、進行性モーレン潰瘍、細菌もしくはウイルス感染によって、および眼部の
外科手術によって引き起こされる眼部の炎症性疾患、眼部の物理的な損傷により引き起こ
される眼部の炎症性疾患、掻痒、発赤、浮腫および潰瘍を含む眼部の炎症性疾患により引
き起こされる症状、紅斑症、多形滲出性紅斑、結節性紅斑、環状紅斑、浮腫性硬化症、皮
膚炎、血管神経性浮腫、咽頭水腫、声門水腫、声門下喉頭炎、気管支炎、鼻炎、咽頭炎、
副鼻腔炎、喉頭炎または中耳炎を含む。

本明細書で言及される「眼の後部の疾患（back-of-eye diseases）」としては、とりわ
け、眼の後部領域における網膜、黄斑、窩に影響する疾患が挙げられる。適切な「眼の後
部の疾患」の例は、これらに限定されないが、黄斑浮腫、例えば、臨床上の黄斑浮腫また
は血管造影の類嚢胞黄斑浮腫（種々の病因論、例えば、糖尿病で生じる）、滲出性黄斑変
性症および黄斑浮腫（網膜のレーザー処置から生じる）、加齢性黄斑変性症、未熟児の網
膜症（水晶体後部線維増殖症としても公知）、網膜虚血および脈絡膜血管新生、網膜の疾
患（糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜浮腫、網膜剥離、網膜下新血管形成による老年性黄斑
変性症、近視性網膜症）；炎症性疾患；腫瘍に関連するブドウ膜炎、例えば、網膜芽細胞
腫または偽網膜膠腫；硝子体切除術後の新血管形成；血管疾患（網膜虚血、脈絡膜血管不
全、脈絡膜血栓症、頸動脈虚血から生じる網膜症）；ならびに視神経の新血管形成を含む
。

本明細書で言及される「眼の前部の疾患（front-of-eye diseases）」とは、眼の前部
の組織、例えば、角膜、光彩、毛様体、結膜などに主に影響する疾患を指す。適切な「眼
の前部の疾患」の例は、これらに限定されないが、角膜の新血管形成（炎症、移植、虹彩
の発達不全、滲出性または炎症性の要素を有する角膜疾患または混濁化、眼の穿通または
眼球の挫傷性傷害に起因する血管新生に起因する）；慢性ブドウ膜炎；前ブドウ膜炎；Ｌ
ＡＳＩＫ、ＬＡＳＥＫ、屈折矯正手術、ＩＯＬ移植のような手術によってもたらされる炎
症性状態；白内障手術の合併症としての不可逆性角膜浮腫；傷害または外傷（物理的、化
学的、薬理学的など）の結果としての浮腫；炎症；結膜炎（例えば、持続的アレルギー性
、巨大乳頭性、季節周期的アレルギー性、通年性アレルギー性、毒性の結膜炎（細菌、ウ
イルスまたはクラミジアの感染により引き起こされる））；角結膜炎（春季、アトピー性
、乾燥）；虹彩毛様体炎；虹彩炎；強膜炎；上強膜炎；感染性角膜炎；点状表層角膜炎；
円錐角膜；後部多形性角膜ジストロフィー；フックスジストロフィー（角膜および内皮）
；無水晶体および偽水晶体水疱性角膜症；角膜浮腫；強膜疾患；眼部瘢痕性類天疱瘡；毛
様体扁平部炎；ポスナーシュロスマン症候群；ベーチェット病；フォークト・小柳・原田
症候群；過敏反応；眼球表面障害；結膜浮腫；トキソプラズマ網脈絡膜炎；眼窩の炎症性
偽腫瘍；結膜浮腫；結膜静脈鬱血；眼窩周囲蜂巣炎；急性涙嚢炎；非特異的血管炎；サル
コイドーシス；ならびにサイトメガロウイルス感染を含む。

例えば、網膜または硝子体における、適切な「眼の過剰な血管透過性および／または浮
腫に関連する障害」の例は、これらに限定されないが、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、網
膜浮腫、網膜出血、硝子体出血、黄斑浮腫（ＭＥ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、増殖
性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）および非増殖性糖尿病性網膜症（ＤＲ）、放射線網膜症、毛
細血管拡張症、中心性漿液性網膜症、および網膜静脈閉塞を含む。網膜浮腫は、網膜内空
間における液体の蓄積である。ＤＭＥは、糖尿病を有する患者で生じる網膜微小血管変化
の結果である。血液－網膜障壁のこの妥協によって網膜の周囲への血漿構成要素の漏出が
もたらされて、網膜浮腫が生じる。網膜の他の障害としては、網膜静脈閉塞（例えば、血
管枝または中心静脈閉塞）、放射線網膜症、鎌状赤血球網膜症、未熟児網膜症、フォン・
ヒッペル・リンドウ病、後部ブドウ膜炎、慢性網膜剥離、アーヴァイン・ガス症候群、イ
ールズ病、網膜炎および／または脈絡膜炎が挙げられる。

本明細書における「予防」という用語の言及には、疾患の誘導前の保護的組成物の投与
を含む。「抑制」とは、誘導現象の後であるが、疾患の臨床的所見の前に組成物を投与す
ることをいう。「処置」とは、疾患の症状が顕性となった後に保護的組成物を投与するこ
とを含む。

疾患に対する保護、またはその処置におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニン
グするために使用できる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、本発明
により促進されて、ヒトおよび動物標的と交差反応し得るポリペプチドリガンドの開発を
可能にし、動物モデルの使用を可能にする。

感受性マウスにおいて全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を試験する方法は当分野で知
られている（Knight et al. (1978) J Exp. Med., 147: 1653, Reinersten et al. (1978
) New Eng. J : Med., 299: 515）。重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにお
いて、別の種からの可溶性ＡｃｈＲタンパク質を用いて疾患を誘導することによって試験
する（Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233）。関節炎は、マウスの感受性
株においてＩＩ型コラーゲンを注射することによって誘導する（Stuart et al. (1984) A
nn. Rev. Immunol., 42: 233）。感受性ラットにおいてマイコバクテリア熱ショックタン
パク質を注射することによってアジュバント関節炎を誘導するモデルが記載されている（
Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171）。甲状腺炎は、マウスにおいて記載のよう
にサイログロブリンを投与することによって誘導する（Maron et al. (1980) J. Exp. Me
d., 152: 1115）。インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、Kanasawa et al. (1984
) Diabetologia, 27:113によって記載されているものなどの特定のマウス株において自然
に発生するか、または誘導することができる。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒ
トにおけるＭＳのモデルとして役割を果たす。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク
質を投与することによって脱髄性疾患が誘導される（Paterson (1986) Textbook of Immu
nopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; Mc
Farlin et al. (1973) Science, 179: 478、ならびにSatoh et al. (1987) J ; Immunol.
, 138: 179を参照）。

次の実施例を参照することにより、次に、本発明をさらに説明する。

材料および方法
ファージライブラリのクローニング
ファージライブラリは、Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ
２００９， ５ （７）， ５０２－７）に従って作成した。

ファージ選択
ファージライブラリのグリセロールストックを、５００ｍｌの２ＹＴ／クロラムフェニ
コール（３０ｍｇ／ｍｌ）培養中でＯＤ_６００＝０．１まで希釈して、ファージを、３０
℃で一晩（１５～１６時間）生成した。ファージを、Ｈｅｉｎｉｓ， ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９， ５ （７）， ５０２－７に記載のように精
製して、化学的に修飾した。ビオチン化ｈＰＫ（３ｍｇ）（ＩＨＰＫＡ、ヒト血漿由来、
Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖｉ、ＭＩ、ＵＳＡ）を、５０ｍｌの予
備洗浄した磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｍ－２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ））とともにＲＴで１０分間インキュベートした。ビーズを
、３回洗浄した後に、１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する０．５ｍ
ｌの洗浄バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、
１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＣａＣｌ_２）を用いて３０分間ＲＴで回転しながらブロ
ックした。化学的に修飾されたファージ（典型的には、２ｍｌの洗浄バッファー中で１０
^１０～１０^１１ｔ．ｕ．に溶解）を、３％のＢＳＡおよび０．３％のＴｗｅｅｎ２０を含
有する１ｍｌの洗浄バッファーの添加によって、同時にブロックした。次いで、ブロック
したビーズをブロックした化学的に修飾されたファージと混合して、回転ホイール上で、
ＲＴで３０分間インキュベートした。ビーズを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する洗
浄バッファーを用いて８回洗浄し、洗浄バッファーで２回洗浄した後、１００ｍｌの５０
ｍＭグリシン、ｐＨ２．２とともに５分間インキュベートした。溶出されたファージを５
０ｍｌの１ＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８に中和のために移して、３０ｍｌのＴＧ１細胞と
ともにＯＤ_６００＝０．４で９０分間３７℃でインキュベートして、細胞を大きい２ＹＴ
／クロラムフェニコールプレート上にプレートした。同じ手順を用いて、１回または２回
の追加の回のパンニングを行った。２回目の選択では、ニュートラアビジンコーティング
の磁性ビーズを用いて、ストレプトアビジン特異的なペプチドの富化を防止した。このニ
ュートラアビジンビーズは、０．８ｍｇのニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）と０．５ｍｌのトシル－活性化磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｍ－
２８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）とを、供給業者の指示に従って
反応させることによって調製した。

標準的な選択プロセスを、１回目および２回目に関してはビオチン化ヒトカリクレイン
の漸減濃度を用い、次いで、３回目および４回目にはヒトまたはラットのいずれかのビオ
チン化カリクレインの漸減濃度を用いて、５×５および６×６のライブラリで用いた。ヒ
トカリクレインは組み換えではなく、したがって、重鎖が存在し、ラットカリクレインは
組み換えであり、重鎖を欠き、可能性としては、（ヒトタンパク質の活性に基づいて）予
想されるよりも低い活性である。活性が低い可能性があるので、ラットの標的の濃度は、
ヒトタンパク質のところまでは、低下されなかった。

ヒト、サルおよびラットのＰＫのクローニングおよび発現
ヒト、サルおよびラットＰＫの触媒性ドメインを、哺乳動物細胞中で、その触媒性ドメ
インに対してｐｒｏＴＥＶ切断部位を介してＮ末端で接続されたプロペプチドを有する不
活性前駆体として発現させた。発現ベクターをクローニングして、下記のとおり、タンパ
ク質を発現し、活性化して、精製した。ＰＫシグナル配列、ポリヒスチジンタグ、ｐｒｏ
ＴＥＶ切断部位、ＰＫの成熟触媒性ドメインおよび終止コドンをコードする合成遺伝子は
、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａ
ｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）から購入した。ヒト、サル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ
）およびラットのＰＫの合成遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを調製して、遺伝子をｐＥＸ
ＰＲ－ＩＢＡ４２哺乳動物発現ベクター（ＩＢＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｏｅ
ｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、制限酵素対のＸｈｏｌおよびＨｉｎｄＩＩＩ（
Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌａｔｖｉａ）ならびにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（
Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて移動した。連結されたプラスミドを、ＸＬ－１ブルーエレ
クトロコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）に
形質転換して、アンピシリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有する２ＹＴ寒天プレート上にプレ
ートした。３つの発現ベクター（命名はｍＰＫ、ｒＰＫおよびｈＰＫ）由来のＤＮＡを生
成して、正確な配列を、ＤＮＡシーケンシング（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕ
ｔｈ Ｋｏｒｅａ）によって確認した。

３つのオーソロガス（同じ遺伝子座）の血漿カリクレインを、以下のように哺乳動物細
胞中で発現した。５０ｍｌの懸濁－適合のＨＥＫ－２９３細胞を、４ｍＭのグルタミンお
よびヒストンデアセチラーゼ阻害剤バルプロ酸（３．７５ｍＭ）の存在下で、オービター
振盪１００ｍｌフラスコ中で、１８０ｒｐｍで、ＩＳＦ－４－Ｗインキュベーター（Ｋｕ
ｅｈｎｅｒ ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の中で、３７℃で
、５％ＣＯ_２の存在中で、無血清のＥｘＣｅｌｌ ２９３培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の中で、増殖させた。胚性腎細胞（ＨＥＫ－２９
３）を高い細胞密度（２０×１０^６細胞／ｍｌ）で（Backliwal, et al. Biotechnol Bio
eng 2008, 99 (3), 721-7）、３つのプラスミド（３００ｍｇ／ｍｌ）を用い、直鎖のポ
リエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｐｐｅｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）を用いてトランスフェクトした。７日の産生段階の終わりに、細胞を４℃で１５
分間２５００ｒｐｍの遠心分離によって回収した。追加の細胞破片を、０．４５μｍのＰ
ＥＳ膜（Ｆｉｌｔｅｒ－ｔｏｐ ２５０ｍｌ低タンパク質結合ＴＰＰ）を通した濾過によ
って培地から除去した。ポリヒスチジン－タグ化タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂、洗浄
バッファー（５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４）および溶
出バッファー（５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４、５００
ｍＭのイミダゾール）を用いて、Ｎｉ－アフィニティークロマトグラフィーによって精製
した。タンパク質を、（５０単位）のｐｒｏＴＥＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を用いて部分的に活性化し、さらにＮｉ－アフィニティー
クロマトグラフィーおよびゲル濾過（ＰＤ１０カラム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍ
ＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）によって精製した。

結合活性の改善されたポリペプチドの開発
個々の位置のランダム化
ライブラリの構築：カリクレイン結合性二環性ペプチド中のアミノ酸をマッピングする
ために、１セットの小さいライブラリを構築した。５つの残基の２つのループから構成さ
れるバイシクルに関しては、各々がペプチド配列中の特定のコドンでランダム化された１
０の別個のライブラリを生成した。各々のライブラリについてオリゴヌクレオチドを設計
して、部位指向性の突然変異誘発によってファージゲノムＤＮＡを変異させた。目的のコ
ドンの突然変異誘発組み込みランダム化（ＮＮＳに変化）、およびテンプレートゲノム配
列からの固有のＡｐａＬ１制限部位の除去。突然変異誘発生成物は、超純水への溶出を用
いるＱＩＡｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。各々のライ
ブラリを用いて、別々に、ＴＧ１ Ｅ ｃｏｌｉを、エレクトロポレーションによって、
ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｅｃ１ ｐｒｏｇｒａｍ）お
よび１ｍｍのＢｉｏＲａｄのキュベットを用いて形質転換した。１ｍｌのＳＯＣ培地中で
３７℃で１時間回復させた後、ライブラリの形質転換体を、抗生物質を含む２５ｍｌの２
ＴＹブロス中で一晩増殖させて、ライブラリの形質転換体のみを選択的に増殖させた。細
菌を、遠心分離によって回収して、ライブラリのファージＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉから、
ＱＩＡｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉキットを用いて精製して、蒸留水中
に溶出した。精製されたＤＮＡを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓバッファー
４の中で２時間ＡｐａＬ１を用いて消化して、親物質を除去した。消化後、ＤＮＡを、Ｑ
ＩＡｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（上記のとおり）を用いて再精製し、これを用いてＴＧ１
を形質転換した（エレクトロポレーション；上記のとおり）。ＳＯＣ中での１時間の回復
後、形質転換体を、選択性抗生物質を含有するＬＢ－寒天プレートの上にプレートして、
コロニーを３７℃で一晩成長させた。

個々のクローンの結合のアッセイ：ライブラリ形質転換体クローンは、ランダムに採取
して、個々の培養物として、選択性の抗生物質を含有する２ＴＹブロス中で増殖させた。
採取したコロニーを、ＱＩＡｇｅｎ ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６ ＤＮＡシーケンサーを
用いてＤＮＡ配列決定して、各々のクローンに存在するアミノ酸置換を明らかにした。単
離された場合、各々の固有の置換のクローンを、以下のようにヒト血漿カリクレイン結合
についてアッセイした。ファージを含有している上清を、培養物から回収して、ファージ
を、Heinis et al (Nature Chemical Biology vol. 5 pp 502-507 (2009)）の方法に基づ
いて、トリスブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢ）で環化した。このプロセスから精製され
たファージを、プレートベースのホモジニアス結合アッセイを用いて、ビオチン化ヒト血
漿カリクレインに対する結合についてアッセイした；ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒ
ａｓｔａｒ ＦＳプレートリーダーで測定したアッセイ読み出し。三連のアッセイ試料か
らの定量的結合データを平均し（平均）、シグナル：バックグラウンドとして表現した（
ここで、バックグラウンドとは、標的物質なしでアッセイした試料であった）。シグナル
：バックグラウンドを、並行な親の試料の％として表現した。エラーバーは、平均の標準
偏差を示す。示したアッセイは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。このアッ
セイデータは、ペプチド配列と相互に関連した。灰色で印した置換は、試験しなかった（
クローンは、ランダムライブラリサンプリングからは単離しなかった）。非結合（任意）
バイシクルの試料を、並行してアッセイして、アッセイベースラインを図示した。

ペプチドドメインのランダム化
ライブラリ構築：小さいファージライブラリを、上記の「ファージライブラリのクロー
ニング」に記載されるようにＨｅｉｎｉｓらの方法に従って生成した。バイシクルコード
部分が、ＮＮＳにランダム化された４～６のコドンのみを有する、親の５×５または６×
６バイシクル（５×５：２つの５残基ループ、６×６：２つの６残基ループ）ＤＮＡ配列
に基づくように、ｓｆｉｃｘ３ｂａプライマーを修飾した。ランダム化コドンは、目的の
ペプチドドメイン／モチーフをコードするものであった。

個々のクローンの結合のアッセイ：ライブラリ形質転換体コロニー、または選択アウト
プットコロニーを、採取して、個々の培養物として、選択性の抗生物質を含有する２ＴＹ
ブロス中で増殖させた。採取したコロニーを、ＱＩＡｇｅｎ ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６
ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡ配列決定して、各々のクローンに存在するアミノ酸
置換を明らかにし、以下のとおり、ヒト血漿カリクレイン結合についてアッセイした。フ
ァージを含有している上清を、培養物から回収して、ファージを、Heinis et al (Nature
Chemical Biology vol. 5 pp 502-507 (2009)）の方法に基づいて、トリスブロモメチル
ベンゼン（ＴＢＭＢ）で環化した。このプロセスから精製されたファージを、プレートベ
ースのホモジニアス結合アッセイを用いて、ビオチン化ヒト血漿カリクレインに対する結
合についてアッセイした；ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳプレート
リーダーで測定したアッセイ読み出し。二連のアッセイ試料からの定量的結合データを平
均し（平均）、シグナル：バックグラウンドとして表現した。示したアッセイデータは、
少なくとも２つの独立した実験の代表である。このアッセイデータは、ペプチド配列と相
互に関連した。

ペプチド合成
ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが製造した、Ｓｙｍｐｈｏ
ｎｙペプチドシンセサイザーを用いる、Ｆｍｏｃ化学に基づいた。標準のＦｍｏｃ－アミ
ノ酸類を使用し（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）、以下の側鎖保護基を用いた、Ａｒｇ（Ｐｂ
ｆ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；ＧＩｕ（ＯｔＢｕ）
；Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）；Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ
（ｔＢｕ）；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（Ｓｉｇｍａ）。カップリング試薬は
、ＨＣＴＵ（Ｐｅｐｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であって、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩ
ＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を、ベースとして使用し、脱保護は、ＤＭＦ（ＡＧＴＣ）中の２０
％のピペリジンで達成した。合成は、０．３７ｍｍｏｌ／ｇｒ Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ ア
ミドＡＭ樹脂（ＡＧＴＣ）を用いて１００μｍｏｌｅ規模で行い、Ｆｍｏｃ－アミノ酸を
４倍過剰で利用して、ベースはアミノ酸に関して４倍過剰であった。アミノ酸を、０．２
ＭでＤＭＦ中に、ＨＣＴＵ（０．４ＭでＤＭＦ中に）、およびＤＩＰＥＡ（１．６ＭでＮ
－メチルピロリドン中に）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）に溶解した。カップリング時間は一
般には３０分であって、脱保護時間は２×２．５分間であった。Ｆｍｏｃ－Ｎ－メチルグ
リシン（Ｆｍｏｃ－Ｓａｒ－ＯＨ、Ｍｅｒｃｋ）を、１時間カップリングして、以下の残
基についての脱保護およびカップリング時間はそれぞれ２０分および１時間であった。合
成後、樹脂をジクロロメタンで洗浄して、乾燥した。側鎖保護基のおよび支持体からの切
断は、１０ｍＬの９５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）のＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／
ｉＰｒ_３ＳｉＨ／ジチオスレイトールを用いて３時間達成した。切断後、使用済みの樹脂
を濾過によって取り除き、濾液を、－８０℃で冷却された３５ｍＬのジエチルエーテルに
添加した。ペプチドペレットを遠心分離して、エーテルの上清を廃棄して、ペプチドペレ
ットを、冷エーテルを用いて２回以上洗浄した。次いで、ペプチドを５～１０ｍＬのアセ
トニトリル－水中に再溶解して、凍結乾燥した。わずかな試料を、質量分析法（ＭＡＬＤ
Ｉ－ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））による
粗生成物の純度の分析のために取り出した。凍結乾燥後、ペプチド粉末を１０ｍＬの６Ｍ
塩酸グアニジウム（Ｈ_２Ｏ中に含まれる）中に採取し、０．５ｍＬの１Ｍのジチオスレイ
トールを補充し、Ｃ８ Ｌｕｎａ分取ＨＰＬＣ カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上にロ
ードした。溶媒（Ｈ_２Ｏ、アセトニトリル）を０．１％のヘプタフルオロ酪酸を用いて酸
性化した。勾配は、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムを用いて、１５／２０ｍＬ／分の
流速で、１５分で３０～７０％のアセトニトリルにわたった。純粋な直鎖のペプチド物質
を含有する画分（ＭＡＬＤＩによって特定されるとおり）を合わせて、トリスブロモメチ
ルベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）で修飾した。このために、直鎖のペプチドを、Ｈ_２
Ｏを用いて最大約３５ｍＬまで希釈し、アセトニトリル中に含まれる約５００μＬの１０
０ｍＭのＴＢＭＢを添加して、その反応を、Ｈ_２Ｏに含まれる５ｍＬの１ＭのＮＨ_４ＨＣ
Ｏ_３で開始した。その反応を、ＲＴで約３０～６０分間進行させて、一旦凍結乾燥させ、
その反応を終わらせた（ＭＡＬＤＩで判定）。凍結乾燥後、修飾されたペプチドを、上記
のとおり精製したが、ただしＬｕｎａ Ｃ８はＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏ
ｍｅｎｅｘ）で置き換え、酸は０．１％トリフルオロ酢酸に変えた。正確なＴＭＢ－修飾
物質を含有する純粋な画分をプールして、凍結乾燥して、貯蔵のために－２０℃で保持し
た。

全てのアミノ酸は、他に注記しない限り、Ｌ－コンホメーションで用いた。

二環性ペプチドはＮ／Ｃ末端上の２つの不変のアラニンを通常含んでいるファージ選択か
ら直接特定した。血漿安定性および薬物動態学的研究を追求するためのペプチドに関して
は、ペプチドを示したとおり再合成し（末端アラニンを欠いている）、示したとおりＮ末
端アセチル化した。

実施例４の薬物動態学的研究に用いたペプチドは、水に含まれる１０ｍＭのＨＣｌから
３回凍結乾燥して、化合物の塩酸塩を得た。溶液は、１ｍｇ／ｍＬで、５０ｍＭのＨｅｐ
ｅｓ（ｐＨ７．０）、５％グリセロール、１．９％ＤＭＳＯの中で、２つの化合物（Ａｃ
－（０６－５５０）Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ５ Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ２））および（０６
－２５９－０２）－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ２））について、５ｍｇ／ｋｇで、Ｓｐｒａ
ｇｕｅｌｙ Ｄａｗｅｌｙラットに静脈内ボーラスで投与した。連続血液サンプル（約０
．２ｍＬ）を、ＥＤＴＡチューブ中に、示した時点で採取し、血漿を遠心分離によって分
離して、分析のために－２０℃で凍結した。標準的な生体分析技術を使用して、次に、血
漿サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ，Ｘｅｖｏ ＴＱＳ ＬＣ－ＭＳを用いて親の残りの化合物
について分析して定量した。ＰＫパラメータは、Ｓｕｍｍｉｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅ
ｒｖｉｃｅｓのソフトウェアパッケージＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ２．０を用いて決定
した。

実施例５および６の研究に用いたペプチドは、０．５％酢酸の存在下において逆相精製
試行で収集した純粋（＞９５％）画分から得て、ここでは、凍結乾燥後にペプチドの酢酸
塩を得た。

酵素アッセイ
機能的な酵素アッセイを、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０
ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＣａＣｌ_２および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（全てＳｉｇｍａ
ＵＫ）（ｐＨ７．４）の中で、２５℃で、ソリッドブラック（ｓｏｌｉｄ ｂｌａｃｋ）
９６または３８４ウェルプレートの中で行った。要するに、２６．５ｐＭヒト血漿カリク
レイン（Ｓｔｒａｔｅｃｈ、ＵＫより購入）または１３．２５ｐＭラット血漿カリクレイ
ン（社内で発現および精製した）を、漸増濃度の試験ペプチドの存在または不存在のもと
で１５分間インキュベートし、その後に蛍光発生的な基質Ｚ－ＰｈｅＡｒｇ－ＡＭＣ（Ｅ
ｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＫ）を、１００μＭ（４％のＤＭＳＯの中に含有
）の最終アッセイ濃度まで添加した。ＡＭＣの遊離は、Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳ（ＢＭ
Ｇ Ｌａｂｔｅｃｈ）、励起３６０ｎｍ、発光４６０ｎｍを用いて測定した。反応の直線
段階（典型的には５～４５分）の速度は、ＭＡＲＳデータ解析ソフトウェア（ＢＭＧ ｌ
ａｂｔｅｃｈ）で算出した。次いで、その速度を用いて、ＩＣ_５０およびＫ_ｉをＰｒｉｓ
ｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）中で算出した。４つのパラメータ阻害非線形回帰式を用いて、Ｉ
Ｃ_５０を算出した。ワンサイト（Ｏｎｅ ｓｉｔｅ）－適合Ｋ_ｉ式を用いてＫｉを算出し
、これは、Ｋ_ｉを基質についてのＫ_ｍ（ヒト酵素に関しては１５０μＭ、ラットオルソロ
グに関しては２００μＭである）に制約する。全てのＫ_ｉ／ＩＣ_５０値は、少なくとも２
つの独立した実験の平均である（１ｎＭより低いＫ_ｉ値を有するペプチドについては少な
くとも３つの平均）。ウサギカリクレインに関しては、７～１４ｐＭの間の酵素を使用し
、ここで５０μＭのＫｍで３３μＭの基質である。

ペプチドは、ＴＦＡ塩としてそれらの粉末型で溶解し、ストック溶液は通常は水中で調
製した。全ての溶液を遠心分離して、濾過した（２０μｍのシリンジフィルター）後に、
２８０ｎｍで吸収を測定した。吸光係数は、ペプチドのＴｒｐ／Ｔｙｒ含量、およびＴＭ
Ｂのもの（ＴＭＢコアは、ペプチドに含まれる場合、約３００Ｍ^－１ｃｍ^－１という吸光
係数を有する）に基づいて算出した。

血漿安定性プロファイリング
方法番号１：
迅速血漿安定性プロファイリングアッセイ（rapid plasma stability profiling assay
）を開発し、これには親ペプチドの質量がもはや観察不能になる時点まで、親の質量の質
量分析検出（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）を使用した。具体的には、２００μＭのペプチドを、３５％ラットまたはヒ
ト血漿（Ｓｅｒａ ｌａｂｓ、抗凝固薬としてクエン酸塩を使用）の存在下で、１×ＰＢ
Ｓ（１０×ＰＢＳ Ｓｔｏｃｋ、Ｓｉｇｍａ由来）を補充して、３７℃でインキュベート
した。種々の時点（すなわち、ｔ＝０、３、２４時間、その後は１０日まで毎日）、２μ
Ｌの試料を、アセトニトリル：Ｈ_２Ｏの１：１混合物中に含有される、１８μＬの３０ｍ
Ｍの重炭酸アンモニウムに添加した。試料は分析の時点まで－８０℃で凍結した。ペプチ
ドの適切な検出ウインドウを決定する質量分光分析のために、所定の時点のアセトニトリ
ル：Ｈ_２Ｏ希釈試料を、ＭＡＬＤＩプレートの上に直接（０．７μＬ）スポットした。マ
トリックス（α－シアノ桂皮酸、Ｓｉｇｍａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含有する１：
１のアセトニトリル：水の中の飽和溶液として調製））を、試料上に積層した（１μＬ）
。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ上の同様のレーザー強度設定で、次に、親ペプチドがもはや検出不
能になるまで時間を決定してもよい。これは、血漿安定性における相対的変化を検出する
ように機能する定量アッセイであることに留意されたい。

方法番号２：
安定性のデータをより迅速に得るために、ペプチドをまた９５％血漿中でも評価した。
ここでは、ＰＢＳを省き、１～５ｍＭペプチドストック（ＤＭＳＯ中に含まれる）を直接
、血漿中に希釈し（すなわち、４７．５μＬ血漿中に２．５μＬのストック）、５０μＭ
の最終濃度を得た。５μＬの試料を適切な時点で採取して、－８０℃で凍結した。分析の
ために、試料を解凍して、２５μＬの３：３：１のアセトニトリル：メタノール：水と混
合し、１３ｋで５分間遠心分離した。５μＬのペプチド含有上清を吸引して、アセトニト
リル：Ｈ_２Ｏの１：１混合物中に含有される３０ｍＭの重炭酸アンモニウムと混合した。
次いで、この１μＬを、ＭＡＬＤＩプレート上にスポットして、上記のとおり解析した。
上記のとおり、これは、血漿安定性の相対的な変化を検出するように機能する定量的アッ
セイであることに注目すべきである。

方法番号３：
血漿安定性を定量的に得るために、ペプチドストック溶液（ＤＭＳＯ中に１ｍＭ含有）
を、Ｂｉｏｆｏｃｕｓ、ＵＫに送り、ここで分析を行った。ペプチドを、水を用いて１０
０μＭに希釈して、血漿中で１：２０希釈し（５μＭの最終濃度、血漿を９５％で使用）
、必要に応じてサンプリングして、上記のとおり沈殿させて、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ
ＴＱ－ＭＳを用いてＬＣ－ＭＳで定量した。

都合の良いホモログ選択性および種交差反応性を有するカリクレイン結合性二環性ペプチ
ドの特定
（ａ）新規の強力なヒトおよびラットの交差反応性のリード配列の特定
任意の所定の治療的二環性ペプチドに関しては、その薬理学的および薬物動態学的特性
を、前臨床動物種で評価する必要がある。一般的な前臨床の種としては、ラット、マウス
、ウサギ、イヌ、ミニブタ、およびカニクイザルが挙げられる。

二環性ペプチドの一般的に高い選択性（部分的には、標的タンパク質に対するそれらの
大きい接触面積によって容易になる）に起因して、ヒト標的タンパク質に対する高い親和
性の二環性ペプチドは、所定の前臨床種由来の同じ標的タンパク質と交差反応し得ず、こ
のようなリードの前臨床評価が困難になる。ある例としては、ヒトカリクレインに対して
約１．２ｎＭのＫ_ｉを有する強力な二環性ペプチド（６×６ループサイズ）である、ＰＫ
１５（ＷＯ２００９／０９８４５０に開示される）が挙げられる。ラットカリクレインに
対する力価は、約５００ｎＭのＫ_ｉで顕著に低下されて、これによって、このリードは、
前臨床評価に適切でなくなる。

ラットカリクレインに対してかなりの力価を保持したままで、ヒトカリクレインに対す
る高い力価を有する５×５および６×６リード二環性ペプチドを特定するために、ファー
ジ選択を行い、ここではラットおよびヒトの両方のカリクレインを、各々の選択の回の間
にベイトとして入れ替えた。選択の回の間のベイトの濃度を調節することによって、異な
る交差反応性のリード配列を特定してもよい。各々の選択アウトプットのサンプルを、ヒ
トカリクレインに対する結合についてスクリーニングして、引き続き配列決定した。

具体的には、第１の２回の選択を、ヒトカリクレインで、３～１００ｎＭの間におよぶ
標的濃度で行い、続いて、ラットカリクレインを、３０ｎＭの標的濃度で用いて２回の選
択を行う。

相同スクリーニングアッセイでカリクレイン結合について個々のファージクローンをス
クリーニングすることによって、バックグラウンドを超えるシグナルの最大５０倍増大を
ともなう、多数の固有の配列が明らかになった。それらを、ヒト、ラットおよびウサギカ
リクレインを阻害するために、合成ペプチドとして調製して評価した（表１）。

リードのいくつかは、ラットとヒトカリクレインとの間で良好な交差反応性（０６－２
５４、０６－２５５、０６－２５８、および０６－２６１）（表１）を示す。各々のリー
ドファミリーについての配列アウトプットを評価することによって、半保存された残基が
特定され得、下線を付される（表１）。

０６－２５４および０６－２５５は、ほとんど同一の第１のループを共有するが、それ
らの第２のループは異なる。０６－２５８は、ループ１およびループ２の両方で５アミノ
酸を含んでいる、特定された唯一の交差反応性のリードである（５ｘ５）。

（ｂ）ラット－ヒトカリクレイン交差反応性の二環性ペプチド配列の親和性成熟
選択二環性ペプチド候補（表１）を、親和性成熟について選択した。コンセンサス残基
は、最初の選択のアウトプットから推定した。親和性成熟のために、コンセンサス領域の
外側であると考えられる残基を、表２内の情報に従って無作為化した。

より多い保存された結合モチーフの外側残基を無作為化した（「Ｘ」）。０６－２６１
の場合、その０６－３４－１８－様ＦＰＦＲモチーフ（配列番号１００）を無作為化した
が、周囲の残基は固定した。

親和性成熟したライブラリの配列アウトプットを、２つの実施例０６－２５４および０
６－２５９で示す。

０６－２５４配列アウトプット：
表３は、スクリーニングアッセイで特定された最も強力な０６－２５４バリアントを示
す。

最も強力な候補（０６－２５４－０１、０６－２５４－０２および０６－２５４－０３
）を、ペプチド合成について選択し、ラットおよびヒトカリクレイン阻害について評価し
た。

０６－２５９配列アウトプット：
表４では、スクリーニングアッセイで特定された最も強力な０６－２５９バリアントを
示す。

最も強力な候補（０６－２５９－０１、０６－２５９－０２、０６－２５９－０３およ
び０６－２５９－０４）を、ペプチド合成、ならびにラットおよびヒトカリクレインに対
する親和性測定のために選択した。

合成ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏの力価および交差反応性を表５にまとめる。

まとめると、０６－２５４－０１、０６－２５４－０２、０６－２５４－０３、０６－
２５５、０６－２５８、０６－２５９－０１、０６－２５９－０２、０６－２５９－０３
、０６－２５９－０４および０６－２６１などの、ラットとヒトカリクレインとの間での
高い力価および良好な交差反応性を示すいくつかの候補がある（太字、表５を参照のこと
）。

カリクレイン結合性二環性ペプチドの血漿安定性スクリーニングによって、見込みのある
リード候補が明らかになる
実施例１では、いくつかの新規な二環性リード配列が、高いヒトおよびラット力価で特
定された。各々のファミリーの最も強力なメンバーを、ラットおよびヒトの血漿安定性の
比較のために選択した。これらは、０６－２５４－０２、０６－２５５、０６－２５９－
０２および０６－２６１であった。方法番号１を用いる最初のスクリーニングによって、
０６－２５５および０６－２５９－０２は、これらの２つのペプチドの検出のより長いウ
インドウによって判定した場合（最大１０日まで、図は示さず）、残っている二環性ペプ
チドよりも安定であることが示された。残りのペプチドは、２～３日後にはそれ以上検出
できず、これによって、０６－３４－１８の未修飾の配列と同様の低い安定性が示されて
いる。０６－２５５および０６－２５９－０２は両方とも、安定性プロファイルが劣って
おり、したがって、可溶性Ｃ末端伸長で再合成された（Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２（配
列番号９８））。それによって、サルコシン_３（Ｓａｒ_３）は、分子スペーサーとして機
能するが、Ｄ－アルギニンは、それらが生理学的ｐＨで強力にイオン性の水錯体の性質で
あることに起因して、より高い水溶性をその分子に対して付与する。

可溶性伸長は、表６に示されるとおり、酵素阻害定数を有意に妨害しなかった。

ペプチドは、方法番号２に記載の条件下でヒトおよびラットの血漿中でアッセイした。
安定性は、０６－３４－１８に対して比較して評価し、これは、ラット血漿では、２．３
時間、およびヒト血漿では２時間という定量的ｔ_１／２を有する（ＷＯ２０１３／０５０
６１６）。図１および図２によって、二環性ペプチドリード０６－２５９－０２が、特に
都合の良い血漿安定性プロファイルを有しており、すなわち、０６－２５５および０６－
３４－１８に比較してヒトおよびラット血漿の両方に対して有意にさらに安定であること
が示される。

異なる二環性ペプチドリードの間のペプチドループをグラフトすることで、都合のよい特
性を有する新規なキメラ構築物が生成される
以前に開示された０６－３４－１８配列の第１のループ（ＷＯ２０１３／０５０６１６
、配列：

（配列番号８６））は、本明細書で特定された０６－２６１ペプチド、（配列：

（配列番号５４））と同様のＦＰＦＲモチーフ（配列番号１００、下線）を共有する。し
かし、０６－３４－１８は、血漿プロテアーゼにむかってペプチドを変化しやすくする２
つのタンパク質分解性認識部位を含み、したがってカリクレイン阻害性治療として不適切
であることが記載されている。これらの部位は、０６－３４－１８の残基Ａｒｇ５および
Ｈｉｓ７

（配列番号８６）：下線および太字）を含む。現在開示されている０６－２６１配列（実
施例１）では、ループ２中に等価なヒスチジンタンパク質分解性認識部位は存在しない。

０６－２６１の第２のループ（配列：ＶＹＹＰＤＩ（配列番号８７））中のＨｉｓ７の
欠失に起因して、本発明の研究者らは、ループ２におけるタンパク質分解性の安定性が向
上した十分強力なキメラペプチドを生じることを期待して、タンパク質分解を受けやすい
ヒスチジン含有の０６－３４－１８の第２のループを、０６－２６１の第２のループで置
き換えた。具体的には、この配列は、０６－３４－１８の第１のループ（配列：ＳＦＰＹ
Ｒ（配列番号８８））および０６－２６１の第２のループ（配列：ＶＹＹＰＤＩ（配列番
号８７））を含み、キメラの全長配列ＣＳＦＰＹＲＣＶＹＹＰＤＩＣ（配列番号５５）（
またはＷＰＡＲ等価物、すなわちＣＳＷＰＡＲＣＶＹＹＰＤＩＣ（配列番号８９））を生
じる。このキメラペプチドは、０６－５５０と名付けられ、ループ１中に５つの残基、お
よびループ２中に６つの残基を有する。

０６－３４－１８におけるＡｒｇ５誘導性のタンパク質分解不安定性は、Ａｒｇ５をＮ
－α－メチルアルギニン（ＮＭｅ－Ａｒｇ）またはホモアルギニン（ＨＡｒｇ）で置き換
えることによって取り除かれるかまたは減少され得ることが以前に開示された（ＷＯ２０
１３／０５０６１６）。さらに、Ｌ－アゼチジンカルボン酸（Ａｚｅ）の付随する親和性
向上置換が、３位に導入されてもよく、これがもとのプロリン３を置き換える。

キメラの二環ペプチド０６－５５０が０６－３４－１８の第１のループを保持するので
、Ａｒｇ５／Ｐｒｏ３上でのＨＡｒｇ５／Ａｚｅ３への同一の修飾を行い、このペプチド
を０６－５５０ Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ５と命名する。

しかし、配列中に溶解性を向上するヒスチジン７がないせいで、０６－５５０（または
０６－５５０ Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ５）は、０６－３４－１８に比較して有意な水溶性の
低下を示した。これらの分子の水溶性を向上するために、サルコシン_３－スペーサーに続
いて２つのＤ－アルギニンを含んでいる、Ｃ末端伸長を含んだ誘導体を合成した。Ｄ－ア
ルギニンを含めることにより、これらのペプチドのさらに好適な水溶性がもたらされた。

これらのペプチドのカリクレイン阻害定数を表７にまとめる。

このデータから、ヒトおよびラットの両方の親和性とも高いという理由で、Ａｚｅ３－
ＨＡｒｇ５修飾は十分に耐容されることが明らかである。Ｎ－メチル修飾は、それほど適
切ではない。同様に、Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ_２）（配列番号９８）溶解性伸長は、この
伸長を欠いているペプチドと比較して力価が不変のままであるので、十分に耐容される。

０６－５５０誘導体の比較の血漿安定性プロファイリング
二環性ペプチド「Ａｃ－（０６－５５０）－Ｓａｒ_３－（ＤＡｒｇ２）Ａｚｅ３ ＨＡ
ｒｇ５」（表７）の安定性を、ヒトおよびラットの血漿における相対的な安定性について
方法番号２によって評価して、不安定な０６－３４－１８（図１および２）と比較した。

両方の種由来の血漿中で、分解産物はわずかにしか観察されないので、ペプチドは、高
い安定性を示す。比較によって、不安定な０６－３４－１８の親の質量は、同じ時間経過
の間に大きく消失した（実施例２に示されるデータ）。したがって、別の親配列（０６－
２６１および０６－３４－１８）由来のループを組み合わせるという概念で、新規な、キ
メラの、強力でかつ、タンパク質分解に対して安定な分子が得られた。

選択カリクレイン阻害性二環性ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏの薬物動態学的挙動
ペプチドＡｃ－（０６－５５０）－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２ Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ
５（これは、安定性および親和性向上修飾Ａｚｅ３およびＨＡｒｇ５、ならびに可溶性Ｃ
末端伸長Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２）（配列番号９８）およびＡｃ－（０６－２５９－
０２）－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２を含む）を、ラットでの薬物動態学的アセスメント
のために選択した。ペプチドを、緩衝化溶液中で１ｍｇ／ｍＬで、５ｍｇ／ｋｇとしてＳ
ｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内注射し、血液をサンプリングして、ペプチド
濃度を注射後、多数の時点で解析した。

両方のペプチドとも、１７ｍｌ／分／ｋｇ（０６－５５０）～７ｍｌ／分／ｋｇ（０６
－２５９－０２）の間のクリアランスを示し（表８、図４）、これはラットで公表されて
いる腎濾過速度（約８～９ｍＬ／分／ｋｇ）に近い［Ｊｏｂｉｎ Ｊ， Ｂｏｎｊｏｕｒ
ＪＰ， （１９８５） Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．；２４８（５ Ｐｔ ２）：Ｆ７
３４－８］。

これは、Ａｃ－（０６－５５０）－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２ Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ
５（これは、２つの安定性修飾Ａｚｅ３およびＨＡｒｇ５、ならびに本質的にタンパク質
分解性で安定であるループ２中の配列を含む）の向上されたタンパク質分解安定性を強調
する。

Ａｃ－（０６－２５９－０２）－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２の場合は、天然の配列は
、ラットでタンパク質分解的に十分安定であり、その結果、そのクリアランスはほとんど
が腎排出によって駆動される。

選択カリクレイン阻害性二環性ペプチドの硝子体内注射後のｉｎ ｖｉｖｏの薬物動態学
的解析
この解析では、ペプチドＡｃ－（０６－５５０）－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２ Ａｚ
ｅ３ ＨＡｒｇ５（本研究においてはバイシクル１と呼び、これは、安定性および親和性
向上修飾Ａｚｅ３およびＨＡｒｇ５、ならびに可溶性Ｃ末端伸長Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ
）_２（配列番号９８）を含む、本明細書における実施例３および４を参照のこと）を、ペ
プチドＡｃ－（０６－３４－１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ
（ψＣＨ_２ＮＨ）６（本研究においてはバイシクル２と呼び、これはＰＣＴ／ＥＰ２０１
４／０５７４４０の表２６ｂおよび図２に開示される）に対して比較して評価した。ニュ
ージーランドホワイトウサギ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔ）（
２～３ｋｇ）を麻酔して、両方のペプチドを硝子体内注射（１００μｇ／眼）によって、
表９に記載のプロトコールに従って投与した。

適切な時間後、ウサギを安楽死させて、硝子体液、眼房水、網膜および血漿のサンプル
を採取した。サンプルをＬＣ－ＭＳによって分析して、ペプチドの濃度を決定した。本研
究の結果を、図５に示しており、ここでは、両方のペプチドとも硝子体液から緩徐に排出
され、この排出半減期は２０～３０時間であったことが観察できる。これは、抗生物質シ
プロフロキサシンなどの小分子のクリアランスよりも有意に遅い（報告された正常なウサ
ギの硝子体での半減期は２．２時間；Pearson et al. 1993, Retina 13:326-330）。

カラギーナン誘導性の足浮腫に対する選択カリクレイン阻害性二環性ペプチドの効果
この解析では、ペプチドＡｃ－（０６－２５９－０２）－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２
（本研究では、バイシクル３と呼ぶ；本明細書の実施例２を参照のこと）を、ペプチドＡ
ｃ－（０６－３４－１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ
_２ＮＨ）６（本研究ではバイシクル２と呼び、これはＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５７４４
０の表２６ｂおよび図２２に開示されている）に対して比較して評価した。炎症は、雄性
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（１群あたりｎ＝１０）で、右後ろ足の足底下で１
００μＬの１％カラギーナン溶液の注射によって誘導した。動物には、表１０に従ってペ
プチドおよびインドメタシンでの処置を与えた。

カラギーナン投与の１、２、４および６時間後、足の容積を、水置換法で測定した。統
計学的解析を、反復測定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって２元配置ＡＮＯＶＡ
を用いて行った。

本研究の結果を、図６に示しており、ここでは、両方のペプチドが全ての時点でカラギーナンによって誘導された足の腫脹を阻害したことが観察され得る。ペプチドまたは陽性コントロールであるインドメタシンのいずれかでの処置によって、足の腫脹における高度に有意な低下が生じた（ｐ＜０．００１）。重要なことに、阻害の程度は、２つのペプチドとインドメタシンとの間で匹敵する（インドメタシンは、このモデルでのゴールデンスタンダードの治療部分とみなされている）。
出願時の特許請求の範囲は以下の通り。
［請求項１］
血漿カリクレインに特異的なペプチドリガンドであって、少なくとも２つのループ配列によって隔てられる少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する分子足場を含み、その結果、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成され、前記ペプチドリガンドが、
(a)-C_i-N-X-W-N-P-W-C_ii-O/U-X-X-X-O/J-X-C_iii- (配列番号１);
(b)-C_i-B-N-J-W-N-P-C_ii-X-L-O-X-X-X-C_iii- (配列番号２);
(c)-C_i-Q-K-F-E-S-R-C_ii-X-X-X-X-X-X-C_iii- (配列番号３);
(d)-C_i-P-L-S-D-T-L-C_ii-Y-R-R-M-P-P-C_iii- (配列番号４);
(e)-C_i-P-Y-P-F-R-C_ii-X-H-X-X-X-C_iii- (配列番号５);および
(f)-C_i-(N)_a-U-J-P-J-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (配列番号６);
もしくはその修飾誘導体、または薬学的に許容される塩
のいずれかから選択されるペプチド配列を含み、
ここで、
Ｃ_ｉ、Ｃ_ｉｉおよびＣ_ｉｉｉはそれぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し、
下付き文字「ａ」は、０または１から選択される整数を表し、
Ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表し、
Ｊは、Ｆ、ＷおよびＹから選択される非極性の芳香族アミノ酸残基を表し、
Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、
Ｂは、Ｒ、ＨおよびＫから選択される極性の正に荷電されたアミノ酸残基を表す、
ペプチドリガンド。
［請求項２］
式（ａ）の配列を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
［請求項３］
式（ａ）のペプチドが、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｘ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｏ／Ｕ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｏ－Ｘ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号７）、例えば、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ／Ｈ／Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｇ／Ｓ／Ｐ－Ａ／Ｖ／Ｗ／Ｄ／Ｓ－Ｄ／Ｅ／Ｖ／Ｔ／Ｐ－Ａ／Ｇ／Ｐ／Ｉ／Ｒ／Ｄ－Ｇ／Ｐ／Ｙ／Ｉ－Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｒ／Ｇ／Ｄ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号８）、具体的には、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ／Ｈ／Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｇ／Ｓ／Ｐ－Ａ／Ｖ／Ｗ－Ｄ／Ｅ／Ｖ－Ａ／Ｇ／Ｐ－Ｇ／Ｐ－Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号９）から選択される配列を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
［請求項４］
式（ａ）のペプチドが、
-C_i-N-T-W-N-P-W-C_ii-G-W-V-G-G-F-C_iii- (06-259)(配列番号１０);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-V-E-P-P-V-C_iii- (06-259-01)(配列番号１１);
-C_i-N-T-W-N-P-W-C_ii-P-W-D-A-P-L-C_iii- (06-259-02)(配列番号１２);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-A-D-P-P-I-C_iii- (06-259-03)(配列番号１３);
-C_i-N-Y-W-N-P-W-C_ii-P-W-D-A-P-L-C_iii- (06-259-04)(配列番号１４);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-A-D-P-P-R-C_iii- (06-259-F1)(配列番号１５);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-P-A-D-I-P-V-C_iii- (06-259-E2)(配列番号１６);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-D-D-P-Y-I-C_iii- (06-259-H3)(配列番号１７);
-C_i-N-H-W-N-P-W-C_ii-S-S-D-P-P-V-C_iii- (06-259-H4)(配列番号１８);
-C_i-N-Y-W-N-P-W-C_ii-S-D-T-R-I-G-C_iii- (06-259-A6)(配列番号１９);および
-C_i-N-T-W-N-P-W-C_ii-S-W-P-D-I-D-C_iii- (06-259-F2)(配列番号２０);
例えば、
－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｈ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｓ－Ｖ－Ｅ－Ｐ－Ｐ－Ｖ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５９－０１）（配列番号１１）、
－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｐ－Ｗ－Ｄ－Ａ－Ｐ－Ｌ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５９－０２）（配列番号１２）、
－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｈ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｓ－Ａ－Ｄ－Ｐ－Ｐ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５９－０３）（配列番号１３）、
および
－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｐ－Ｗ－Ｄ－Ａ－Ｐ－Ｌ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５９－０４）（配列番号１４）、
具体的には－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｐ－Ｗ－Ｄ－Ａ－Ｐ－Ｌ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５９－０２）（配列番号１２）
から選択される配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
［請求項５］
式（ｂ）の配列を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
［請求項６］
式（ｂ）のペプチドが、－Ｃ_ｉ－Ｋ／Ｒ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｄ／Ｔ／Ｇ－Ｌ－Ｉ／Ｖ／Ｌ－Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ／Ｑ／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ／Ｗ／Ｒ／Ｈ／Ａ－Ｄ／Ｇ／Ｉ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｐ／Ｖ－Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｋ／Ｇ／Ｈ／Ｆ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｉ／Ｍ／Ｒ／Ｙ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号２１）、例えば－Ｃ_ｉ－Ｋ／Ｒ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｄ／Ｔ－Ｌ－Ｉ／Ｖ－Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ－Ｄ／Ｇ／Ｉ／Ｔ－Ｐ／Ｓ／Ｔ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号２２）から選択される配列を含む、請求項１または請求項５に記載のペプチドリガンド。
［請求項７］
式（ｂ）のペプチドが、
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-T-I-S-C_iii- (06-254)(配列番号２３);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-E-T-T-C_iii- (06-254-01)(配列番号２４);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-G-P-C_iii- (06-254-02)(配列番号２５);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-M-D-T-C_iii- (06-254-03)(配列番号２６);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-Q-D-A-C_iii- (06-254-F4)(配列番号２７);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-S-I-K-C_iii- (06-254-B3)(配列番号２８);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-T-G-C_iii- (06-254-G3)(配列番号２９);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-Q-I-H-C_iii- (06-254-H4)(配列番号３０);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-G-I-T-C_iii- (06-254-G2)(配列番号３１);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-D-T-F-C_iii- (06-254-A4)(配列番号３２);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-E-A-Q-C_iii- (06-254-G4)(配列番号３３);
-C_i-K-N-F-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-I-S-C_iii- (06-254-D3)(配列番号３４);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-W-T-D-C_iii- (06-254-E2)(配列番号３５);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-D-L-C_iii- (06-254-F5)(配列番号３６);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-L-E-S-T-C_iii- (06-254-E5)(配列番号３７);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-R-P-P-C_iii- (06-254-D1)(配列番号３８);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-L-G-I-A-C_iii- (06-254-B9)(配列番号３９);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-V-H-D-I-C_iii- (06-254-E3)(配列番号４０);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-P-D-M-C_iii- (06-254-D6)(配列番号４１);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-A-D-L-C_iii- (06-254-H3)(配列番号４２);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-L-H-V-R-C_iii- (06-254-A7)(配列番号４３);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-I-A-P-Y-C_iii- (06-254-C1)(配列番号４４);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-G-L-V-Y-S-T-C_iii- (06-254-E6)(配列番号４５);
-C_i-K-N-Y-W-N-P-C_ii-D-L-L-P-D-L-C_iii- (06-254-B1)(配列番号４６);および
-C_i-R-N-Y-W-N-P-C_ii-T-L-I-N-I-T-C_iii- (06-255)(配列番号４７);
例えば、－Ｃ_ｉ－Ｋ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｄ－Ｌ－Ｉ－Ｅ－Ｔ－Ｔ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５４－０１）（配列番号２４）、
－Ｃ_ｉ－Ｋ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｄ－Ｌ－Ｉ－Ｐ－Ｇ－Ｐ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５４－０２）（配列番号２５）、
－Ｃ_ｉ－Ｋ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｄ－Ｌ－Ｖ－Ｍ－Ｄ－Ｔ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５４－０３）（配列番号２６）、および
－Ｃ_ｉ－Ｒ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｔ－Ｌ－Ｉ－Ｎ－Ｉ－Ｔ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５５）（配列番号４７）、
具体的には－Ｃ_ｉ－Ｋ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｄ－Ｌ－Ｉ－Ｐ－Ｇ－Ｐ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５４－０２）（配列番号２５）、および
－Ｃ_ｉ－Ｒ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｔ－Ｌ－Ｉ－Ｎ－Ｉ－Ｔ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５５）（配列番号４７）、
さらに具体的には－Ｃ_ｉ－Ｒ－Ｎ－Ｙ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｃ_ｉｉ－Ｔ－Ｌ－Ｉ－Ｎ－Ｉ－Ｔ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５５）（配列番号４７）
から選択される配列を含む、請求項５または請求項６に記載のペプチドリガンド。
［請求項８］
式（ｃ）の配列を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
［請求項９］
式（ｃ）のペプチドが、－Ｃ_ｉ－Ｑ－Ｋ－Ｆ－Ｅ－Ｓ－Ｒ－Ｃ_ｉｉ－Ｒ－Ｖ－Ｄ－Ｔ－Ｒ－Ｙ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５６）（配列番号４９）から選択される配列を含む、請求項８に記載のペプチドリガンド。
［請求項１０］
式（ｄ）の配列を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
［請求項１１］
式（ｅ）の配列を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
［請求項１２］
式（ｅ）の前記ペプチドが、－Ｃ_ｉ－Ｐ－Ｙ－Ｐ－Ｆ－Ｒ－Ｃ_ｉｉ－Ｌ－Ｈ－Ｅ－Ｎ－Ｌ－Ｃ_ｉｉｉ－（０６－２５８）（配列番号５２）から選択される配列を含む、請求項１１に記載のペプチドリガンド。
［請求項１３］
式（ｆ）の配列を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
［請求項１４］
式（ｆ）の前記ペプチドが、－Ｃ_ｉ－（Ｎ）_ａ－Ｎ／Ｓ－Ｆ－Ｐ－Ｆ／Ｙ－Ｒ－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（配列番号５３）から選択される配列を含む、請求項１または請求項１３に記載のペプチドリガンド。
［請求項１５］
式（ｆ）の前記ペプチドが、
-C_i-N-N-F-P-F-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (06-261)(配列番号５４);または
-C_i-S-F-P-Y-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (06-550)(配列番号５５)
から選択される配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載のペプチドリガンド。
［請求項１６］
前記修飾誘導体が、Ｎ末端修飾および／またはＣ末端修飾、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換（例えば、１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等比体積または等電子アミノ酸での置換、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の等比体積または等電子アミノ酸での置換）、スペーサー基の付加、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基での置換、１つまたは複数のアミノ酸残基のアラニンでの置換、１つまたは複数のＬ－アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ－アミノ酸残基での置換、二環性ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮ－アルキル化、１つまたは複数のペプチド結合の代用結合での置換、ペプチド骨格長改変、１つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の別の化学基での置換、ならびにシステイン、リジン、グルタミン酸塩およびチロシンなどのアミノ酸の、適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬での合成後生体直交型修飾から選択される１つまたは複数の修飾を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
［請求項１７］
前記修飾誘導体が、Ｎ末端修飾、例えば、Ｎ末端アセチル基を含み、具体的には前記Ｎ末端システイン基（Ｃ_ｉ）は、無水酢酸でキャップされる、請求項１６に記載のペプチドリガンド。
［請求項１８］
前記修飾誘導体が、Ｃ末端修飾、例えば、Ｃ末端アミド基、具体的にはＣ末端システイン基（Ｃ_ｉｉｉ）のアミド化を含む、請求項１６に記載のペプチドリガンド。
［請求項１９］
前記修飾誘導体が、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換、例えば、プロリン残基のＬ－アゼチジンカルボン酸残基による置換、および／またはアルギニン残基のＮ－α－メチルアルギニンもしくはＬ－ホモアルギニン残基による置換を含む、請求項１６に記載のペプチドリガンド。
［請求項２０］
前記ペプチドリガンドが、
-C_i-S-F-P-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) HArg5)(配列番号５６);
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号５８);
-C_i-S-F-P-Y-[NMeR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) NMeArg5)(配列番号５９);および
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[NMeR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- ((06-550) Aze3 NMeArg5)(配列番号６０;
から選択される配列を有するペプチドを含む、式（ｆ）の非天然の誘導体であり、
ここでＡｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲおよびＨＡｒｇは、Ｌ－ホモアルギニン残基を表し、ＮＭｅＲおよびＮＭｅＡｒｇは、Ｎ－α－メチルアルギニン残基、
例えば、－Ｃ_ｉ－Ｓ－Ｆ－Ｐ－Ｙ－［ｈＲ］－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（（０６－５５０）ＨＡｒｇ５）（配列番号５６）、および
－Ｃ_ｉ－Ｓ－Ｆ－［Ａｚｅ］－Ｙ－［ｈＲ］－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（（０６－５５０）Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ５）（配列番号５８）であり、
ここでＡｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲおよびＨＡｒｇはＬ－ホモアルギニン残基を表し、
具体的には、－Ｃ_ｉ－Ｓ－Ｆ－［Ａｚｅ］－Ｙ－［ｈＲ］－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－（（０６－５５０）Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ５）（配列番号５８）を表し、
ここでＡｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲおよびＨＡｒｇは、Ｌ－ホモアルギニン残基を表す、請求項１９に記載のペプチドリガンド。
［請求項２１］
前記修飾誘導体が、スペーサー基の付加、例えば、Ｎ末端システイン（Ｃ_ｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃ_ｉｉｉ）に対するスペーサー基の付加を含む、請求項１６に記載のペプチドリガンド。
［請求項２２］
前記スペーサー基が、２つ以上のＤ－アルギニン残基（適切には２つのＤ－アルギニン残基）に連結された１つまたは複数のサルコシン基（適切には３つのサルコシン基）を含む、請求項２１に記載のペプチドリガンド。
［請求項２３］
前記ペプチドリガンドが、－Ｃ_ｉ－Ｎ－Ｔ－Ｗ－Ｎ－Ｐ－Ｗ－Ｃ_ｉｉ－Ｐ－Ｗ－Ｄ－Ａ－Ｐ－Ｌ－Ｃ_ｉｉｉ－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２（（０６－２５９－０２（Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２）（配列番号６１）から選択される配列を有するペプチドを含む、式（ａ）の修飾誘導体であり、ここでＳａｒ_３は、３つのサルコシンスペーサーを表し、（Ｄ－Ａｒｇ）_２は２つのＤ－アルギニン残基を表す、請求項２１または請求項２２に記載のペプチドリガンド。
［請求項２４］
前記ペプチドリガンドが、
-C_i-S-F-P-Y-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii-Sar₃-(D-Arg)₂((06-550)-Sar₃-(DArg₂))(配列番号６２);および
-C_i-S-F-[Aze]-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii-Sar₃-(D-Arg)₂((06-550)-Sar₃-(DArg₂) Aze3 HArg5)(配列番号６３);
から選択される配列を有するペプチドを含む式（ｆ）の修飾誘導体であり、
ここでＳａｒ_３は３つのサルコシンスペーサーを表し、（Ｄ－Ａｒｇ）_２は２つのＤ－アルギニン残基を表し、Ａｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲおよびＨＡｒｇは、Ｌ－ホモアルギニン残基を表し、
例えば、－Ｃ_ｉ－Ｓ－Ｆ－［Ａｚｅ］－Ｙ－［ｈＲ］－Ｃ_ｉｉ－Ｖ－Ｙ－Ｙ－Ｐ－Ｄ－Ｉ－Ｃ_ｉｉｉ－Ｓａｒ_３－（Ｄ－Ａｒｇ）_２（（０６－５５０）－Ｓａｒ_３－（ＤＡｒｇ_２）Ａｚｅ３ ＨＡｒｇ５）（配列番号６３）を表し、
ここでＳａｒ_３は、３つのサルコシンスペーサーを表し、（Ｄ－Ａｒｇ）_２は、２つのＤ－アルギニン残基を表し、Ａｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲおよびＨＡｒｇは、Ｌ－ホモアルギニン残基を表す、請求項２１または請求項２２に記載のペプチドリガンド。
［請求項２５］
前記薬学的に許容される塩が、塩酸塩または酢酸塩から選択される、請求項１～２４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
［請求項２６］
ヒト、ラットおよび／またはウサギ血漿カリクレイン、例えば、ヒトおよび／またはラット血漿カリクレイン、具体的にはヒト血漿カリクレインに特異的である、請求項１～２５のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
［請求項２７］
請求項１～２６のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
［請求項２８］
炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、眼科障害および自己免疫障害の予防、抑制または処置における使用のための、請求項１～２６のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。

Claims (12)

1. 血漿カリクレインに特異的なペプチドリガンドであって、少なくとも２つのループ配列によって隔てられる少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する分子足場を含み、その結果、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成され、前記ペプチドリガンドが、
   -C_i-N-N-F-P-F-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (06-261)(配列番号５４);
   -C_i-S-F-P-Y-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii- (06-550)(配列番号５５);
   -C_i-S-F-P-Y-R-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii-A-Sar₃-(D-Arg)₂((06-550)-Sar₃-(DArg₂))(配列番号６２);および
   -C_i-S-F-[Aze]-Y-[hR]-C_ii-V-Y-Y-P-D-I-C_iii-A-Sar₃-(D-Arg)₂((06-550)-Sar₃-(DArg₂) Aze3 HArg5)(配列番号６３);
   から選択される配列、またはその薬学的に許容される塩を含み、
   ここでＳａｒ_３は３つのサルコシンスペーサーを表し、（Ｄ－Ａｒｇ）_２は２つのＤ－アルギニン残基を表し、Ａｚｅは、Ｌ－アゼチジンカルボン酸残基を表し、ｈＲおよびＨＡｒｇは、Ｌ－ホモアルギニン残基を表す、ペプチドリガンド。
2. 前記薬学的に許容される塩が、塩酸塩または酢酸塩から選択される、請求項１に記載のペプチドリガンド。
3. ヒト、ラットおよび／またはウサギ血漿カリクレイン、例えば、ヒトおよび／またはラット血漿カリクレイン、具体的にはヒト血漿カリクレインに特異的である、請求項１または２に記載のペプチドリガンド。
4. 抗体またはその断片に結合された、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
5. 前記抗体またはその断片が、１種または複数種の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメインまたはこれらのいずれかの組合せを含み；または、
   前記抗体またはその断片が、抗体のヒンジ領域を含み；または、
   前記抗体またはその断片が、ＩｇＧ分子のＦｃ領域を含む、請求項４に記載のペプチドリガンド。
6. 前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ分子のＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間に存在する領域を含む、請求項５に記載のペプチドリガンド。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
8. 炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、眼科障害および自己免疫障害の予防、抑制または処置における使用のための、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 眼科障害の予防、抑制または処置における使用のための、請求項７に記載の医薬組成物。
10. 前記眼科障害が、眼の浮腫である、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
11. 前記眼科障害が、網膜の血管の透過性の損傷に関連する障害である、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
12. 前記眼科障害が、血管神経性浮腫である、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。

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