BR112016008996B1 - Ligante peptídico específico para calicreína plasmática e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDIOS. A presente invenção refere-se a polipeptídios que são covalentemente ligados a cadafalsos moleculares de modo que duas ou mais alças peptídicas ficam subtendidas entre pontos de ligação ao cadafalso. Em particular, a invenção descreve peptídios que são específicos para a protease calicreína plasmática humana e de rato e são modificados em uma ou duas alças peptídicas para aumentar a potência e/ou a resistência à protease.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos que são covalentemente ligados a arcabouços moleculares de modo que duas ou mais alças peptídicas ficam subtendidas entre pontos de ligação ao arcabouço. Em particular, a invenção descreve peptídeos que são específicos para a protease calicreína plasmática humana e de rato e são modificados em uma ou duas alças peptídicas para aumentar a potência e/ou a resistência à protease.

Antecedentes da Invenção

[002] Peptídeos cíclicos são capazes de se ligar com alta afinidade e especificidade direcionada a alvos proteicos e, por conseguinte, constituem uma classe de moléculas atraentes para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. Na verdade, diversos peptídicos cíclicos já são usados com sucesso na clínica, como, por exemplo, o peptídeo antibacteriano vancomicina, o fármaco imunossupressor ciclosporina ou o fármaco anticâncer octreotídeo (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). As boas propriedades de ligação resultam de uma superfície de interação relativamente grande formada entre o peptídeo e o alvo assim como da flexibilidade conformacional reduzida das estruturas cíclicas. Tipicamente, os macrociclos ligam-se a superfícies de várias centradas de angstrom quadrados, como, por exemplo, o peptídeo cíclico CVX15 antagonista de CXCR4 (400 Â2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), um peptídeo cíclico com o motivo Arg- Gly-Asp ligando-se à integrina αVb3 (355 Â2) (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5) ou o peptídeo cíclico inibidor upaína-1 ligando-se ao ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (603 Â2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).

[003] Devido a sua configuração cíclica, os macrociclos peptídicos são menos flexíveis que os peptídeos lineares, levando a uma menor perda de entropia ao se ligarem aos alvos e resultando em uma maior afinidade de ligação. A flexibilidade reduzida também leva à retenção de conformações alvo-específicas, aumentando a especificidade de ligação em comparação com os peptídeos lineares. Este efeito já fora exemplificado por um inibidor potente e seletivo da metaloproteinase matricial 8, MMP-8) que perdeu sua seletividade sobre outras MMPs quando seu anel foi aberto (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51). As propriedades de ligação vantajosas obtidas através de macrociclização são ainda mais acentuadas em peptídeos multicíclicos tendo mais de um anel peptídico como, por exemplo, na vancomicina, nisina e actinomicina.

[004] Diferentes grupos de pesquisa já amarraram polipeptídeos com resíduos cisteína a uma estrutura molecular sintética (Kemp e McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen e colaboradores usaram tris(bromometil)benzeno e moléculas relacionadas para ciclização rápida e quantitativa de múltiplas alças peptídicas sobre arcabouços sintéticos para mimetização estrutural de superfícies de proteínas (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Métodos para gerar compostos medicamentosos candidatos onde os referidos compostos são gerados por ligação de polipeptídeos contendo cisteína a um arcabouço molecular como, por exemplo, tris(bromometil)benzeno estão descritos nos documentos WO 2004/077062 e WO 2006/078161.

[005] Já foram desenvolvidas abordagens combinatoriais à base de exibição a fagos para gerar e rastrear grandes bibliotecas de peptídeos bicíclicos para alvos de interesse (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 e WO2009/098450). Em suma, bibliotecas combinatoriais de peptídeos lineares contendo três resíduos cisteína e duas regiões de seis aminoácidos aleatórios (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6- Cys) (SEQ ID N°: 97) foram exibidas a fagos e ciclizadas ligando-se covalentemente as cadeias laterais da cisteína a uma molécula pequena (tris-(bromometil)benzeno). Peptídeos bicíclicos isolados em seleções de afinidade às proteases humanas catepsina G e calicreína plasmática (PK) demonstraram constantes inibitórias nanomolares. Os documentos WO 2013/050615 e WO 2013/050616 divulgam outros ligantesligantes peptídicos bicíclicos específicos para calicreína plasmática humana.

Sumário da Invenção

[006] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é oferecido um liganteligante peptídico específico para calicreína plasmática compreendendo um polipeptídeo compreendendo pelo menos três resíduos cisteína, separados por pelo menos duas sequências de alça, e um arcabouço molecular que forma ligações covalentes com os resíduos cisteína do polipeptídeo de modo que pelo menos duas alças polipeptídicas são formadas no arcabouço molecular, onde o ligante ligante peptídico compreende uma sequência peptídica selecionada dentre qualquer uma de:

ou um derivado modificado, ou um sal farmaceuticamente aceitável, do mesmo; onde: Ci, Cii e Ciii representam o primeiro, o segundo e o terceiro resíduos cisteína, respectivamente; o subscrito "a" representa um inteiro selecionado dentre 0 ou 1; X representa qualquer resíduo de aminoácido; O representa um resíduo de aminoácido alifático não polar selecionado dentre G, A, I, L, P e V; J representa um resíduo de aminoácido aromático não polar selecionado dentre F, W e Y; U representa um resíduo de aminoácido não carregado polar selecionado dentre N, C, Q, M, S e T; e B representa um resíduo de aminoácido positivamente carregado polar selecionado dentre R, H e K.

[007] Os novos ligantesligantes peptídicos bicíclicos ligadores de calicreína da invenção foram identificados seguindo-se seleções biológicas como aquelas descritas neste relatório nos Exemplos. Intercalando-se a isca alvo entre calicreína humana e calicreína de rato durante as seleções biológicas, sequências de derivação com boa reatividade cruzada entre as espécies foram identificadas. Modificações de solubilização nas moléculas foram introduzidas a fim de aumentar a capacidade de formular as derivações de peptídeos bicíclicos, e análises farmacocinéticas em ratos revelaram sequências com alta estabilidade metabólica in vivo.

[008] De acordo com um outro aspecto da invenção, é oferecido uma composição farmacêutica compreendendo um liganteligante peptídico definido neste relatório em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[009] De acordo com um outro aspecto da invenção, é oferecido um liganteligante peptídico definido neste relatório para uso na prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, câncer, infecção bacteriana ou viral, e distúrbios autoimunes.

Breve Descrição das Figuras

[0010] Figura 1: Estabilidade comparativa do controle 06-34-18 contra as novas derivações de biciclos ligadores de calicreína de reatividade cruzada em plasma de rato.

[0011] Figura 2: Estabilidade comparativa do controle 06-34-18 contra as novas derivações de biciclos ligadores de calicreína de reatividade cruzada em plasma humano.

[0012] Figura 3: Estabilidade comparativa de um derivado 06-550 em plasma humano (A) e de rato (B) plasma. Amostras das misturas de plasma e peptídeo foram coletadas em 0 (acima), 21 (no centro), e 46 (abaixo) horas. O pico parental do peptídeo ocorre em 2481,9 MH+. Pouca degradação é observada no decorrer de 46 horas, uma vez que a abundância relativa do pico parental permanece alta.

[0013] Figura 4: Perfil farmacocinético in vivo de dois peptídeos selecionados em rato. O derivad 06-259-02 em particular exibe uma estabilidade acentuada na circulação de rato, uma vez que sua depuração é principalmente efetuada por filtração renal.

[0014] Figura 5: Análise farmacocinética in vivo subsequente à injeção intravítrea em coelho de dois peptídeos selecionados. Ambos os peptídeos, inclusive o derivado 06-550, foram depurados lentamente do humor vítreo, com uma meia-vida de eliminação de 20 - 30 horas.

[0015] Figura 6: Efeito de dois peptídeos selecionados sobre edema nas patas induzido por carragenina. Ambos os peptídeos, inclusive o derivado 06-259-02, inibiram o inchaço nas patas induzido pela carragenina em todos os pontos do tempo.

Descrição Detalhada da Invenção

[0016] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o mesmo significado que aquele comumente conhecido pelos versados na técnica, tal como no campo da química de peptídeos, cultura de células e exibição em fagos, química e bioquímica de ácidos nucleicos. Técnicas tradicionais são usadas para métodos de biologia molecular, genéticos e bioquímicos (vide Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.), que estão aqui incorporados a título de referência. Ligantes peptídicos

[0017] Um liganteligante peptídico, conforme usado neste relatório, refere-se a um peptídeo covalentemente ligado a um arcabouço molecular. Tipicamente, tais peptídeos compreendem dois ou mais grupos reativos (isto é, resíduos cisteína) que são capazes de formar ligações covalentes ao arcabouço, e uma sequência subtendida entre os referidos grupos reativos que é chamada de sequência de alça, uma vez que ela forma uma alça quando o peptídeo é ligado ao arcabouço. No presente caso, os peptídeos compreendem pelo menos três resíduos cisteína (neste relatório denominados Ci, Cii e Ciii), e formam pelo menos duas alças sobre o arcabouço.

[0018] Em uma modalidade, o ligante ligante peptídico compreende a sequência de fórmula (a). A sequência de consenso de fórmula (a) contém motivos provenientes tanto do peptídeo bicíclico de derivação inicial 06-259 assim como de cada uma das sequências peptídicas mais promissoras identificadas por maturação da afinidade da derivação inicial descrita no Exemplo 1 e nas Tabelas 2 e 4.

[0019] Em uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (a) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-N-X-W-N-P-W-Cii- O/U-X-X-X-O-X-Ciii- (SEQ ID N°: 7).

[0020] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (a) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-N-T/H/Y-W-N-P-W- Cii-G/S/P-A/V/W/D/S-D/E/V/T/P-A/G/P/I/R/D-G/P/Y/I-F/I/L/V/R/G/D-Ciii- (SEQ ID N°: 8).

[0021] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (a) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-N-T/H/Y-W-N-P-W- Cii-G/S/P-A/V/W-D/E/V-A/G/P-G/P-F/I/L/V-Ciii- (SEQ ID N°: 9).

[0022] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (a) compreende uma sequência selecionada dentre:

[0023] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (a) compreende uma sequência selecionada dentre:

[0024] Os peptídeos desta modalidade foram identificados como sendo um dos candidatos mais potentes subsequente à maturação da afinidade (vide Exemplo 1 e Tabela 4). Além disso, cada um dos peptídeos desta modalidade foi identificado como demonstrando potências elevadas e boa reatividade cruzada entre calicreína de rato e calicreína humana (vide Tabela 5).

[0025] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (a) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-N-T-W-N-P-W-Cii- P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-02) (SEQ ID N°: 12). O peptídeo desta modalidade foi identificado como sendo o membro mais potente, cruzadamente reativo e estável da família de ligantes peptídicos de fórmula (a) (vide Exemplos 1 e 2). Por exemplo, o rastreamento inicial usando o Método #1 descrito neste relatório indicou que o 06-259-02 é mais estável que a maioria das derivações de biciclos restantes, segundo avaliado por uma janela de detecção de até 10 dias (dados não mostrados). Além disso, a estabilidade ex vivo também foi reproduzível in vivo, especificamente no rato, onde o metabolismo do peptídeo estava virtualmente ausente segundo avaliado pela depuração e comparação com a taxa de filtração glomerular conhecida (Exemplo 4).

[0026] Em uma modalidade, o ligante ligante peptídico compreende a sequência de fórmula (b). A sequência de consenso de fórmula (b) contém motivos provenientes tanto dos peptídeos bicíclicos de derivação inicial 06-254 e 06-255 assim como de cada uma das sequências peptídicas mais promissoras identificadas por maturação da afinidade da derivação inicial 06-254 descrita no Exemplo 1 e nas Tabelas 2 e 3.

[0027] Em uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (b) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-K/R-N-Y-W-N-P-Cii- D/T/G-L-I/V/L-E/M/N/P/T/Q/S/Y/G/D/W/R/H/A-D/G/I/T/A/S/P/V-P/S/T/A/ K/G/H/F/Q/D/L/I/M/R/Y-Ciii- (SEQ ID N°: 21).

[0028] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (b) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-K/R-N-Y-W-N-P-Cii- D/T-L-I/V-E/M/N/P/T-D/G/I/T-P/S/T-Ciii- (SEQ ID N°: 22).

[0029] Em uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (b) compreende uma sequência selecionada dentre:

[0030] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (b) compreende uma sequência selecionada dentre:

[0031] Os peptídeos desta modalidade foram identificados como sendo os candidatos mais potentes subsequente à maturação da afinidade (vide Exemplo 1 e Tabela 3). Além disso, cada um dos peptídeos desta modalidade foram identificados como demonstrando potências elevadas e boa reatividade cruzada entre a calicreína de rato e a calicreína humana (vide Tabela 5).

[0032] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (b) compreende uma sequência selecionada dentre:

[0033] Os peptídeos desta modalidade foram identificados como sendo o membro mais potente de cada família de ligantes peptídicos de fórmula (b) (vide Exemplo 2).

[0034] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (b) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-R-N-Y-W-N-P-Cii-T- L-I-N-I-T-Ciii- (06-255) (SEQ ID N°: 47). O rastreamento inicial usando o Método #1 descrito neste relatório indicou que o 06-255 é mais estável que a maioria das derivações de biciclos restantes, segundo avaliado por uma janela de detecção de até 10 dias (dados não mostrados).

[0035] Em uma modalidade, o ligante ligante peptídico compreende a sequência de fórmula (c). A sequência de consenso de fórmula (c) contém o motivo QKFESR fixo (SEQ ID N°: 48) na alça 1 proveniente do peptídeo bicíclico de derivação inicial 06-256 e derivados similares contidos no mesmo, como descrito no Exemplo 1 e na Tabela 2.

[0036] Em uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (c) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-Q-K-F-E-S-R-Cii-R- V-D-T-R-Y-Ciii- (06-256) (SEQ ID N°: 49). Os dados da reatividade cruzada para 06-256 entre homem, rato e coelho estão mostrados nas Tabelas 1 e 5.

[0037] Em uma modalidade, o ligante ligante peptídico compreende a sequência de fórmula (d). A sequência peptídica de fórmula (d) corresponde à sequência do peptídeo bicíclico de derivação inicial 06257 descrito no Exemplo 1 e na Tabela 1. Os dados da reatividade cruzada para 06-257 entre homem, rato e coelho estão mostrados nas Tabelas 1 e 5.

[0038] Em uma modalidade, o ligante ligante peptídico compreende a sequência de fórmula (e). A sequência de consenso de fórmula (e) contém o motivo PYPFR (SEQ ID N°: 50) conservado na alça 1 e um resíduo histidina na posição 2 da alça 2 no peptídeo bicíclico de derivação inicial 06-258 onde o consenso baseia-se em sequências similares identificadas durante as rodadas iniciais de seleção ( Exemplo 1 e Tabela 2).

[0039] Em uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (f) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-(N)a-U-F-P-J-R-Cii- V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (SEQ ID N°: 51).

[0040] Em uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (e) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-P-Y-P-F-R-Cii-L-H- E-N-L-Ciii- (06-258) (SEQ ID N°: 52). O peptídeo desta modalidade foi identificado como demonstrando potência elevada e boa reatividade cruzada entre calicreína de rato e calicreína humana (vide Tabela 5).

[0041] Em uma modalidade, o ligante ligante peptídico compreende a sequência de fórmula (f). A sequência de consenso de fórmula (f) contém motivos provenientes tanto dos peptídeos bicíclicos de derivação inicial 06-261 e 06-550 assim como de cada uma das sequências peptídicas mais promissoras identificadas no rastreamento inicial descritas no Exemplo 1 e nas Tabelas 1 e 2.

[0042] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (f) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-(N)a-N/S-F-P-F/Y- R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (SEQ ID N°: 53).

[0043] Em uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (f) compreende uma sequência selecionada dentre:

[0044] Em ainda uma outra modalidade, o peptídeo de fórmula (f) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-N-N-F-P-F-R-Cii-V- Y-Y-P-D-I-Ciii- (06-261) (SEQ ID N°: 54). O peptídeo desta modalidade foi identificado como sendo um dos candidatos mais potentes subsequente a seleções (vide Exemplo 1 e Tabela 1). Além disso, o peptídeo desta modalidade foi identificado como demonstrando potência elevada e boa reatividade cruzada entre calicreína de rato e calicreína humana (vide Tabela 5).

[0045] Em uma modalidade alternativa, o peptídeo de fórmula (f) compreende uma sequência selecionada dentre -Ci-S-F-P-Y-R-Cii-V-Y- Y-P-D-I-Ciii- (06-550) (SEQ ID N°: 55). Dados demonstrando as vantagens de 06-550 estão descritos nos Exemplos 3 e 4 onde se pode ver que ele é um biciclo quimérico potente. Em particular, a reatividade cruzada entre calicreína humana, calicreína de rato e calicreína de coelho pode ser vista na Tabela 7.

[0046] Em uma modalidade, certos ligantesligantes peptídicos da invenção são específicos para calicreína plasmática humana, de rato e/ou de coelho. Em uma outra modalidade, certos ligantesligantes peptídicos da invenção são específicos para calicreína plasmática humana e/ou de rato. Em ainda uma outra modalidade, certos ligantesligantes peptídicos da invenção são específicos para calicreína plasmática humana.

Vantagens dos ligantesligantes peptídicos

[0047] Certos ligantesligantes peptídicos da presente invenção apresentam inúmeras propriedades vantajosos que permitem que os mesmos sejam considerados como moléculas semelhantes ao fármaco adequadas para administração por injeção, por inalação, nasal, ocular, oral ou tópica. Tais propriedades vantajosas incluem: - Reatividade cruzada entre espécies. Esta é uma exigência típica para avaliação farmacodinâmica e farmacocinética pré-clínica; - Estabilidade a proteases. Ligantes peptídicos candidatos à derivação de peptídeos bicíclicos devem teoricamente demonstrar estabilidade a proteases plasmáticas, proteases epiteliais ("ancoradas em membranas"), proteases gástricas e intestinais, proteases da superfície pulmonar, proteases intracelulares, entre outras. A estabiliddade a proteases deve ser mantida entre espécies diferentes para que um candidato à derivação de biciclo possa ser desenvolvido em modelos animais bem como administrados com segurança a seres humanos; - Perfil de solubilidade desejável. Esta é função da proporção de resíduos carregados e hidrofílicos versus hidrofóbicos e ligação H intra/intermolecular, que é importante para fins de formulação e absorção; e - Uma meia-vida plasmática ótima na circulação. Dependendo da indicação clínica e do regime de tratamento, pode ser necessário desenvolver um peptídeo bicíclico para exposição curta em um cenário de controle de doença aguda, ou desenvolver um peptídeo bicíclico com retenção aumentada na circulação, e é, portanto, ideal para o controle de estados patológicos mais crônicos.

Sais Farmaceuticamente Aceitáveis

[0048] Será apreciado que formas de sal estão dentro do escopo desta invenção, e que referência aos compostos de fórmula (I) incluem as formas de sal dos referidos compostos.

[0049] Os sais da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto parental que contém uma porção básica ou ácida por métodos químicos convencionais tais como os métodos descritos em Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 páginas, Agosto 2002. Geralmente, tais sais podem ser preparados por reação das formas de ácido ou base livre desses compostos com a base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois.

[0050] Sais (monossais ou dissais) de adição de ácido podem ser formados com uma ampla variedade de ácidos, tanto inorgânicos quanto orgânicos. Exemplos de sais de adição de ácido incluem monossais ou dissais formados com um ácido selecionado do grupo que consiste em ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico (por exemplo, L-ascórbico), ácido L-aspártico, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido butanoico, ácido (+) canfórico, ácido canforassulfônico, ácido (+)- (1S)-cânfora-10-sulfônico, ácido capric, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclâmico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-dissulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 2- hidroxietanossulfônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido gluco-heptônico, ácido D-glucônico, ácido glucurônico (por exemplo, D-glucuronic), ácido glutamic (por exemplo L- glutamic), ácido a-oxoglutárico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácidos halídricos (por exemplo ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácido iodídrico), ácido isetiônico, ácido láctico (por exemplo (+)-L-láctico, ácido (±)-DL-láctico), ácido lactobiônico, ácido maleico, ácido málico, ácido (-)-L-málico, ácido malônico, ácido (±)-DL-mandélico, ácido metanossulfônico, ácido naftaleno-2-sulfônico, ácido naftaleno-1,5- disulfônico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido nítrico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido fosfórico, ácido propiônico, ácido pirúvico, ácido L- piroglutâmico, ácido salicílico, ácido 4-amino-salicílico, ácido sebáacico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tânico, ácido (+)- L-tartárico, ácido tiociânico, ácido p-toluenossulfônico, ácido undecilênico e ácido valérico, assim como aminoácidos acilados e resinas trocadoras de cátions.

[0051] Um grupo particular de sais consiste em sais formados a partir de ácido acético, ácido clorídrico, ácido iodídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, ácido maleico, ácido málico, ácido isetiônico, ácido fumárico, ácido benzenosulfônico, ácido toluenossulfônico, ácido sulfúrico, ácido metanossulfônico (mesilato), ácido etanossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido valérico, ácido propanoico, ácido butanoic, malonico, ácido glucurônico e ácido lactobiônico. Um sal particular é o sal de cloridrato. Um outro sal particular é o sal de acetato.

Derivados Modificados

[0052] Será apreciado que derivados modificados dos ligantesligantes peptídicos definidos nesta invenção estão dentro do escopo da presente invenção. Exemplos de tais derivados modificados adequados incluem uma ou mais modificações selecionadas dentre: modificações N-terminais e/ou C-terminais; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais (tal como substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos polares por um ou mais aminoácidos isostéricos ou isoeletrônicos; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos por outros aminoácidos isostéricos ou isoeletrônicos não naturais); adição de um grupo espaçador; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxidação por um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxidação; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por uma alanina, substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos por um ou mais resíduos de D-aminoácidos; N-alquilação de uma ou mais ligações amida no ligante peptídico bicíclico; substituição de uma ou mais ligações peptídicas por uma ligação substituta; modificação no comprimento do esqueleto peptídico; substituição do hidrogênio do α-carbono de um ou mais resvduos aminoacvdicos por um outro grupo químico, e modificação pós-sintética de aminoácidos tais como cisteína, lisina, glutamato/aspartato e tirosina por reagentes reativos com amina, tiol, ácido carboxílico e fenol adequados.

[0053] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação N-terminal e/ou C-terminal.

[0054] Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação N-terminal. Em uma outra modalidade, a modificação N-terminal compreende um grupo acetil N-terminal. Nesta modalidade, o grupo cisteína N-terminal (o grupo denominado Ci neste relatório) é capeado com anidrido acético ou outros reagentes apropriados durante a síntese de peptídeos levando a uma molécula que é acetilada no terminal N. Esta modalidade proporciona a vantagem de remover um potencial ponto de reconhecimento para aminopeptidase e evita o potencial para degradação do peptídeo bicíclico.

[0055] Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação C-terminal. Em uma outra modalidade, a modificação C-terminal compreende um grupo amida. Nesta modalidade, o grupo cisteína C-terminal (o grupo denominado Ciii neste relatório) is synthesized as an amide durante a síntese de peptídeos levando a uma molécula que é amidada no terminal C. Esta modalidade proporciona a vantagem de remover um potencial ponto de reconhecimento para carboxipeptidase e evita o potencial para degradação do peptídeo bicíclico.

[0056] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais. Nesta modalidade, podem ser selecionados aminoácidos não naturais tendo cadeias laterais isostéricas/isoeletrônicas que não são mais reconhecidas pelas proteases degradativas nem têm qualquer efeito sobre a potência do alvo.

[0057] Alternativamente, podem ser usados aminoácidos não naturais tendo cadeias laterais aminoacídicas restritas, de modo que a hidrólise proteolítica da ligação peptídica próxima é conformacionalmente e estericamente impedida. Em particular, estes envolvem análogos de prolina, cadeias laterais volumosas, derivados C-dissubstituídos (por exemplo, ácido aminoisobutírico, Aib), e aminoácidos cíclicos, um derivado simples sendo ácido amino- ciclopropilcarboxílico.

[0058] Em uma outra modalidade, um resíduo prolina pode ser substituído por um resíduo ácido carboxílico de L-azetidina e/ou um resíduo arginina pode ser substituído por um resíduo N-α-metil arginina ou L-homoarginina. Estão representados neste relatório dados que demonstram que a presença de tais aminoácidos não naturais melhora a estabilidade proteolítica e ao mesmo tempo mantém ou aumenta a afinidade dos ligantesligantes peptídicos bicíclicos para o alvo.

[0059] O Exemplo 3 demonstra derivados não naturais selecionados do ligante peptídico 06-550. Por conseguinte, em uma modalidade, a invenção oferece um derivado não natural de fórmula (f) que compreende um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre:

onde Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L- azetidina, hR representa um resíduo L-homoarginina e NMeR representa um resvduo N-α-metil arginina.

[0060] Em uma outra modalidade, a invenção oferece um derivado não natural de fórmula (f) que compreende um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre:

onde Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L- azetidina, hR representa um resíduo L-homoarginina e NMeR representa um resíduo N-α-metil arginina.

[0061] A reatividade cruzada desses peptídeos modificados entre calicreína humana, calicreína de rato e calicreína de coelho pode ser vista na Tabela 7.

[0062] Em ainda uma outra modalidade, a invenção oferece um derivado modificado de fórmula (f) que compreende um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre:

onde Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L- azetidina e hR representa um resíduo L-homoarginina.

[0063] Foi demonstrado que os peptídeos desta modalidade são mais adequados que os derivados N-metil modificados correspondentes (vide Exemplo 3).

[0064] Em ainda uma outra modalidade, a invenção oferece um derivado não natural de fórmula (f) que compreende um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre -Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D- I-Ciii- ((06-550) Aze3 HArg5) (SEQ ID N°: 58) onde Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L-azetidina e hR representa um resíduo L- homoarginina.

[0065] Foi demonstrado que o peptídeo desta modalidade é bem tolerado porque tanto a afinidade humana quanto a afinidade de rato são altas (vide Exemplo 3 e Tabela 7).

[0066] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador. Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador à cisteína N- terminal (Ci) e/ou à cisteína C-terminal (Ciii). Em ainda uma outra modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador à cisteína C-terminal (Ciii). Em ainda uma outra modalidade o grupo espaçador compreende um ou mais grupos sarcosina (adequadamente 3 grupos sarcosina) ligados a dois ou mais resíduos D-arginina (adequadamente 2 resíduos D-arginina). Estão representados neste relatório dados que demonstram que a presença de tal espaçador aumenta a solubilidade aquosa dos ligantesligantes peptídicos bicíclicos.

[0067] Em uma modalidade, a invenção oferece um derivado modificado de fórmula (a) que compreende um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre -Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- Sar3-(D-Arg)2 ((06-259-02 (Sar3-(D-Arg)2) (SEQ ID N°: 61); onde Sar3 representa 3 espaçadores sarcosina e (D-Arg)2 representa 2 resíduos D-arginina.

[0068] O peptídeo desta modalidade demonstrou um perfil farmacocinético in vivo vantajosa como descrito no Exemplo 4. Em particular, o peptídeo demonstrou uma estabilidade acentuada na circulação de rato, uma vez que sua depuração ocorre principalmente por filtração renal. Além disso, o peptídeo desta modalidade também demonstrou inibição altamente significativa de edema das patas induzido por carragenina como descrito no Exemplo 6 que foi equiparável ao padrão-ouro (indometacina) para tal modelo.

[0069] Em uma modalidade, a invenção oferece um derivado modificado de fórmula (f) que compreende um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre:

onde Sar3 representa 3 espaçadores sarcosina, (D-Arg)2 representa 2 resíduos D-arginina, Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L- azetidina e hR representa um resíduo L-homoarginina.

[0070] Foi demonstrado que os peptídeos desta modalidade possuem solubilidade aquosa mais vantajosa (vide Exemplo 3). O mais importante é que a adição do grupo Sar3-(D-Arg)2 (SEQ ID N°: 98) é bem tolerada porque as potências permanecem inalteradas em comparação com os peptídeos que não possuem esta modificação (vide Exemplo 3 e Tabela 7).

[0071] Em uma outra modalidade, a invenção oferece um derivado modificado de fórmula (f) que compreende um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre -Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- Sar3-(D-Arg)2 ((06-550)-Sar3-(DArg2) Aze3 HArg5) (SEQ ID N°: 63); onde Sar3 representa 3 espaçadores sarcosina, (D-Arg)2 representa 2 resíduos D-arginina, Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L- azetidina e hR representa um resíduo L-homoarginina. Foi demonstrado no Exemplo 3 que o peptídeo desta modalidade têm alta estabilidade porque foram observados poucos produtos de degradação. Além disso, o peptídeo desta modalidade também demonstrou um perfil farmacocinético in vivo vantajosa como descrito no Exemplo 4. Além disso, o peptídeo desta modalidade demonstrou depuração lenta a partir do humor vítreo subsequente à injeção intravítrea no olho de um coelho como descrito no Exemplo 5. Sendo em si já vantajosa, esta propriedade oferece adicionalmente a vantagem de ser perfeitamente adequada para uma formulação de liberação lenta para administração ao olho.

[0072] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxidação por um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxidação. Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um resíduo triptofano por um resíduo fenilalanina. Esta modalidade oferece a vantagem de melhorar o perfil de estabilidade farmacêutica do ligante peptídico bicíclico resultante.

[0073] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos carregados por um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Em uma modalidade alternativa, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos por um ou mais resíduos de aminoácidos carregados. O equilíbrio correto de resíduos de aminoácidos carregados versus resíduos de aminoácidos hidrofóbicos é uma característica importante dos ligantesligantes peptídicos bicíclicos. Por exemplo, resíduos de aminoácidos hidrofóbicos influenciam o grau de ligação de proteína plasmática e, portanto, a concentração da fração disponível livre no plasma, enquanto que resíduos de aminoácidos carregados (em particular arginina) podem influenciar a interação do peptídeo com as membranas fosfolipídica nas superfícies celulares. Os dois combinados podem influenciar a meia- vida, o volume de distribuição e a exposição do fármaco peptídico, e podem adaptados de acordo com o objetivo clínico. Além disso, a combinação correta e o número de resíduos de aminoácidos carregados versus resíduos de aminoácidos hidrofóbicos podem reduzir a irritação no sítio de injeção (onde ofármaco peptídico é administrado por via subcutânea).

[0074] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos por um ou mais resíduos de D-aminoácidos. Acredita-se que esta modalidade aumenta a estabilidade proteolítica por bloqueio estérico e por uma tendência dos D-aminoácidos de estabilizar as conformações de voltas β (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).

[0075] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende um derivaddo N-alquilado de uma ou mais ligações amida no ligante peptídico bicíclico. Acredita-se que esta modalidade confere proteção proteolítica por modificação direta da ligação amida císsil (Fiacco et al., Chembiochem. (2008), 9(14), 2200-3). Também se acredita que a N- metilação tenha um efeito forte sobre os ângulos de torção da ligação peptídica, e acredita-se que ela ajuda na penetração celular e disponibilidade oral (Biron et al (2008), Angew. Chem. Int. Ed., 47, 2595 -99).

[0076] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de uma ou mais ligações peptídicas por uma ligação substituta selecionada dentre um ou mais de um derivado N-alquilado (por exemplo, -CO-NR), uma ligação peptídica reduzida (por exemplo - CH2-NH-), uma ligação peptoide (por exemplo -NR-CH2-CO-), uma ligação tioamida (por exemplo -CS-NH-), uma ligação azapeptídica (por exemplo -CO-NH-NR-), uma ligação trans-alqueno (por exemplo - RHC=C-), uma ligação retro-inverso bond (por exemplo -NH-CO-) e uma ligação substituta ureia (por exemplo -NH-CO-NHR-).

[0077] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende remoção de quaiquer resíduos de aminoácidos alanina. Esta modalidade oferece a vantagem de remover potenciais sítios de ataque proteolítico.

[0078] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende modificação no comprimento do esqueleto peptídico. Em uma outra modalidade, a modificação no comprimento do esqueleto peptídico compreende o uso de um ou mais resíduos de e2/3-aminoácidos (tais como -NH-CR-CH2-CO ou -NH-CH2-CHR-CO-).

[0079] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição no α-carbono de um ou mais resíduos de aminoácidos. Esta modalidade oferece a vantagem de restringir conformações de esqueleto. Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por ácido 2-aminoisobutírico (também conhecido como ácido α- aminoisobutvrico (AIB), α-metilalanina ou 2-metilalanina).

[0080] Deve ser observado que cada uma das modificações mencionadas acima serevem para aumentar deliberadamente a potência do peptídeo contra o alvo. Novos aumentos da potência com base em modificações podem ser obtidos através dos seguintes mecanismos: - Incorporação de porções hidrofóbicas que exploram o efeito hidrofóbico e levam a "off rates" mais baixas, de modo que afinidades mais altas são obtidas; - Incorporação de grupos carregados que exploram interações iônicas de longo alcance, levando a "on rates" mais rápidas e afinidades mais altas (vide, por exemplo, Schreiber et al., Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); e - Incorporação de restrição adicional no peptídeo, por exemplo, restrição de cadeias laterais de aminoácidos corretamente de modo que a perda em entropia é mínima mediante ligação do alvo, restrição dos ângulos de torção do esqueleto de modo que a perda em entropia é mínima mediante ligação do alvo e introdução de ciclizações adicionais na moléculas por motivos idênticos. (Para recapitulações vide Gentilucci et al., Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, e Nestor et al., Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

Atividade de Ligação

[0081] Especificidade, no contexto desta invenção, refere-se à capacidade de um ligante para se ligar ou de alguma forma interagir com seu alvo cognato com a exclusão de entidades que são similares ao alvo. Por exemplo, especificidade pode indicar a capacidade de um ligante para inibir a interação de uma enzima humana, mas não uma enzima homóloga de uma espécie diferente. Usando a abordagem descrita neste relatório, a especificidade pode ser modulada, isto é, aumentada ou diminuída, para que os ligantes fiquem mais ou menos capazes de interagir com homólogos ou parálogos do alvo pretendido. Especificidade não se destina a ser usada como sinônimo de atividade, afinidade ou avidez, e a potência da ação de um ligante sobre seu alvo (tal como, por exemplo, afinidade de ligação ou nível de inibição) não está necessariamente relacionada com sua especificidade.

[0082] Atividade de ligação, conforme usado neste relatório, refere- se a medições quantitativas da ligação feitas a partir de ensaios de ligação, por exemplo, como descritos neste relatório. Por conseguinte, atividade de ligação refere-se à quantidade de ligante peptídico que é ligada a uma dada concentração do alvo.

[0083] Multiespecificidade é a capacidade de se ligar a dois ou mais alvos. Tipicamente, os peptídeos ligadores são capazes de se ligar a um único alvo, tal como um epítopo no caso de um anticorpo, devido as suas propriedades conformaconais. No entanto, é possível desenvolver peptídeos que podem ligar-se a dois ou mais alvos; anticorpos específicos duais, por exemplo, conhecidos na literatura como mencionado acima. Na presente invenção, os ligantesligantes peptídicos podem ser capazes de se ligar a dois ou mais alvos e são, por conseguinte, multiespecíficos. Adequadamente, eles ligam-se a dois alvos, e são específicos duais. A ligação pode ser independente, o que significa que os sítios de ligação para os alvos no peptídeo não são estruturalmente bloqueados pela ligação de um alvo ou do outro. Neste caso, ambos os alvos podem ser ligados de forma independente. Mais genericamente, espera-se que a ligação de um alvo seja pelo menos parcialmente impedida pela ligação do outro.

[0084] Há uma diferença fundamental entre um ligante específico dual e um ligante com especificidade que abrange dois alvos relacionados. No primeiro caso, o ligante é específico para ambos os alvos individualmente, e interage com cada um deles de maneira específica. Por exemplo, uma primeira alça de um ligante pode ligar-se a um primeiro alvo, e uma segunda alça a um segundo alvo. No segundo caso, o ligante é inespecífico porque ele não diferencia entre os dois alvos, por exemplo interagindo com um epítopo dos alvos que é comum a ambos.

[0085] No contexto da presente invenção, é possível que um ligante que tenha atividade em relação, por exemplo, a um alvo e a um ortólogo, possa ser um ligante biespecífico. No entanto, em uma modalidade o ligante não é biespecífico, mas tem uma especificidade menos precisa de modo que ele se liga tanto ao alvo quanto a um ou mais ortólogos. Em geral, é menos provável que um ligante que não fora selecionado contra um alvo e seu ortólogo seja biespecífico devido à ausência de pressão seletiva para biespecificidade. O comprimento da alça no peptídeo bicíclico pode ser decisivo para oferecer uma superfície de ligação adaptada de modo que possa ser obtida reatividade cruzada satisfatória do alvo e do ortólogo, mantendo ao mesmo tempo alta seletividade para homólogos menos relacionados.

[0086] Se os ligantes forem realmente biespecíficos, em uma modalidade pelo menos uma das especifidades alvo dos ligantes será comum entre os ligantes selecionados, e o nível daquela especificidade pode ser modulado pelos métodos descritos neste relatório. Segundas especificidades ou outras especificidades não precisam ser compartilhadas, e não devem ser a matéria dos procedimentos descritos neste relatório.

[0087] Um alvo é uma molécula ou parte da mesma à qual os ligantesligantes peptídicos ligam-se ou de alguma forma interagem com a mesma. Embora a ligação seja considerada um pré-requisito para a atividade da maioria dos tipos, e por si só pode ser uma atividade, outras atividades são consideradas. Portanto, a presente invenção não requer a medição direta ou indireta da ligação.

[0088] O arcabouço molecular é qualquer molécula que é capaz de conectar o peptídeo em múltiplos pontos para conferir um ou mais aspectos estruturais ao peptídeo. Preferivelmente, o arcabouço molecular compreende pelo menos três pontos de ligação para o peptídeo, denominados grupos reativos com arcabouço. Estes grupos são capazes de reagir com os resíduos cisteína (Ci, Cii e Ciii) no peptídeo para formar uma ligação covalente. Eles não formam simplesmente uma ligação dissulfeto, que é sujeita à clivagem redutora e concomitante desintegração da molécula, mas formam ligações tioéter covalentes estáveis. As estruturas preferidas para arcabouços moleculares estão descritas abaixo.

Arcabouço molecular

[0089] Arcabouços moleculares estão descritos, por exemplo, no documento WO 2009/098450 e referência ali citadas, particularmente nos documentos WO 2004/077062 e WO 2006/078161.

[0090] Como observado nos documentos acima, o arcabouço molecular pode ser uma molécula pequena, tal como uma molécula orgânica pequena.

[0091] Em uma modalidade o arcabouço molecular pode ser, ou pode ser à base de monômeros naturais tais como nucleosídeos, açúcares ou esteroides. Por exemplo, o arcabouço molecular pode compreender um polímero curto de tais entidades, tal como um dímero ou um trímero.

[0092] Em uma modalidade o arcabouço molecular é um composto de toxicidade conhecida, por exemplo, de baixa toxicidade. Exemplos de tais compostos incluem colesteróis, nucleotídeos, esteroides, ou fármacos existentes tais como tamazepam.

[0093] Em uma modalidade o arcabouço molecular pode ser uma macromolécula. Em uma modalidade o arcabouço molecular é uma macromolécula composta de aminoácido, nucleotídeos ou carboidratos.

[0094] Em uma modalidade o arcabouço molecular compreende grupos reativos que são capazes de reagir com grupos funcionais do polipeptídeo para formar ligações covalentes.

[0095] O arcabouço molecular pode compreender grupos químicos, tais como aminas, tióis, álcoois, cetonas, aldeídos, nitrilas, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, azidas, anidridos, succinimidas, maleimidas, alquil halogenetos e acil halogenetos.

[0096] Em uma modalidade, o arcabouço molecular pode compreender ou pode consistir em tris(bromometil)benzeno, especialmente 1,3,5-tris(bromometil)benzeno (‘TBMB’), ou um derivado do mesmo.

[0097] Em uma modalidade, o arcabouço molecular é 2,4,6-tris(bro- mometil)mesitileno. Esta molécula é similar ao 1,3,5-tris(bromometil) benzeno mas contém três grupos metil adicionais presos ao anel benzeno. Esta apresenta a vantagem que os grupos metil adicionais podem formar outros contatos com o polipeptídeo e, por conseguinte, acrescentar restrição estrutural adicional.

[0098] O arcabouço molecular da invenção contém grupos químicos que permitem que grupos funcionais do polipeptídeo da biblioteca codificada da invenção formem ligações covalentes com o arcabouço molecular. Os referidos grupos químicos são selecionados de uma ampla gama de funcionalidades que incluem aminas, tióis, álcoois, cetonas, aldeídos, nitrilas, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, anidridos, succinimidas, maleimidas, azidas, alquil halogenetos e acil halogenetos.

[0099] Grupos reativos com arcabouço que podem ser usados no arcabouço molecular para reagir com grupos tiol de cisteínas são alquil halogenetos (ou também denominados halogenoalcanos ou haloalcanos).

[00100] Exemplos incluem bromometilbenzeno (o grupo reativo com arcabouço exemplificado por TBMB) ou iodoacetamido. Outros grupos reativos com arcabouço que são usados para acoplar seletivamente compostos a cisteínas em proteínas são maleimidas. Exemplos de maleimidas que podem ser usadas como arcabouços moleculares na invenção incluem: tris-(2-maleimidoetil)amina, tris-(2-maleimidoetil) benzeno, tris-(maleimido)benzeno. Selenocisteína também é um aminoácido natural que tem uma atividade similar à cisteína e pode ser usada para as mesmas reações. Portanto, sempre que cisteína for mencionada, é tipicamente aceitável aceitável substituí-la por selenocisteína a menos que o contexto sugira o contrário.

Grupos Efetores e Funcionais

[00101] Grupos efetores e/ou funcionais podem ser presos, por exemplo, aos terminais N ou C do polipeptídeo, ou ao arcabouço molecular.

[00102] Grupos efetores apropriados incluem anticorpos e partes ou fragmentos dos mesmos. Por exemplo, um grupo efetor pode incluir uma região constante de cadeia leve (CL) de um anticorpo, um domínio de cadeia pesada CH1 de um anticorpo, um domínio de cadeia pesada CH2 de um anticorpo, um domínio de cadeia pesada CH3 de um anticorpo, ou qualquer combinação dos mesmos, além do um ou mais domínios da região constante. Um grupo efetor também pode compreender uma região de dobradiça de um anticorpo (tal região sendo normalmente encontrada entre os domínios CH1 e CH2 de uma molécula de IgG).

[00103] Em uma outra modalidade deste aspecto da invenção, um grupo efetor de acordo com a presente invenção é uma região Fc de uma moléculaa de IgG. Vantajosamente, um liganteligante peptídico- grupo efetor de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma fusão ligante peptídico Fc tendo uma meia-vida tβ de um dia ou mais, dois dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais ou 7 dias ou mais. Mais vantajosamente, o ligante ligante peptídico de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma fusão ligante peptídico Fc tendo uma meia-vida tβ de um dia ou mais.

[00104] Grupos funcionais incluem, em geral, grupos ligadores, fármacos, grupos reativos para a ligação de outras entidades, grupos funcionais que ajudam a absorção dos peptídeos macrocíclicos nas células, entre outros.

[00105] A capacidade dos peptídeos de penetrar nas células vai possibilitar que peptídeos contra alvos intracelulares sejam mais eficazes. Alvos que podem ser acessados por peptídeos com capacidade de penetrar nas células incluem fatores de transcrição, moléculas de sinalização intracelular tais como tirosina quinases e moléculas envolvidas na via apoptótica. Grupos funcionais que possibilitam a penetração de células incluem peptídeos ou grupos químicos que foram acrescentados ao peptídeo ou ao arcabouço molecular. Peptídeos tais como aqueles derivaram de VP22, HIV-Tat, uma proteína homeobox de Drosophila (Antennapedia), por exemplo como descrito por Chen e Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, parte 4, pág. 821; Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637. Exemplos de peptídeos curtos que se mostraram eficientes na translocação através de membranas plasmáticas incluem o peptídeo penetratina de 16 aminoácidos oriundo da proteína de Drosophila Antennapedia (Derossi et al. (1994) J Biol. Chem. Volume 269 pág. 10444), o ‘peptídeo anfipático modelo’ de 18 aminoácidos (Oehlke et al. (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 pág. 127) e regiões ricas em arginina da proteína TAT do HIV. Abordagens não peptídicas incluem o uso de miméticos de moléculas pequenas ou SMOCs que podem ser presos facilmente a biomoléculas (Okuyama et al (2007) Nature Methods Volume 4 pág. 153). Outras estratégias químicas para adicionar grupos guanidínio a moléculas também melhoram a penetração celular (Elson- Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 pág. 13585). Moléculas de baixo peso molecular tais como esteroides podem ser acrescentadas ao arcabouço molecular para melhorar a absorção em células.

[00106] Uma classe de grupos funcionais que podem ser presos aos ligantesligantes peptídicos inclui anticorpos e fragmentos ligadores dos mesmos, tais como Fab, Fv ou fragmentos de domínio único. Em particular, é possível usar anticorpos que se ligam a proteínas capazes de aumentar a meia-vida do ligante peptídico in vivo.

[00107] Peptídeos RGD, que se ligam a integrinas que estão presentes em muitas células, também podem ser incorporados.

[00108] Em uma modalidade, um liganteligante peptídico-grupo efetor de acordo com a invenção tem uma meia-vida tβ selecionada do grupo que consiste em: 12 horas ou mais, 24 horas ou mais, 2 dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais, 7 dias ou mais, 8 dias ou mais, 9 dias ou mais, 10 dias ou mais, 11 dias ou mais, 12 dias ou mais, 13 dias ou mais, 14 dias ou mais, 15 dias ou mais ou 20 dias ou mais. Vantajosamente um liganteligante peptídico- grupo efetor ou composição de acordo com a invenção terá uma meia- vida tβ na faixa de 12 a 60 horas. Em uma outra modalidade, ele terá uma meia-vida tβ de um dia ou mais. Em ainda uma outra modalidade, a meia-vida varia na faixa de 12 a 96 horas.

[00109] Grupos funcionais incluem fármacos, tais como agentes citotóxicos para terapia contra câncer. Estes incluem: agentes alquilantes tais como cisplatina e carboplatina, assim como oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, ifosfamida; antimetabólitos incluindo os análogos de purina azatioprina e mercaptopurina ou análogos de pirimidina; alcaloides e terpenoides de plantas incluindo alcaloides da vinca tais como vincristina, vimblastina, vinorelbina e vindesina; podofilotoxina e seus derivados etoposídeo e teniposídeo; taxanos, incluindo paclitaxel, originalmente conhecido como Taxol; inibidores de topoisomerase incluindo camptotecinas: irinotecano e topotecano, e inibidores tipo II incluindo ansacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo, e teniposídeo. Outros agentes podem incluir antibióticos antitumorais que incluem o imunossupressor dactinomicina (que é usado em transplantes de rim), doxorubicina, epirubicina, bleomicina e outros.

[00110] Grupos efetores possíveis também incluem enzimas, por exemplo, tal como carboxipeptidase G2 para uso em terapia com enzimas/profármacos, onde o ligante ligante peptídico substitui anticorpos em ADEPT.

Síntese

[00111] Os peptídeos da presente invenção podem ser produzidos sinteticamente por técnicas tradicionais seguidas por reação com um arcabouço molecular in vitro. Quando isto é feito, a química tradicional pode ser usada. Isto permite a preparação rápida e em grande escala de material solúvel para outras experiências a jusante ou validação. Tais métodos poderiam ser colocados em prática usando química convencional tal como aquela descrita em Timmerman et al. (supra).

[00112] Assim sendo, a invenção também se refere à produção de polipeptídeos ou conjugados selecionados da maneira descrita neste relatório, onde a produção compreende etapas adicionais opcionais conforme explicado abaixo. Em uma modalidade, estas etapas são realizadas no produto final polipeptídeo/conjugado feito por síntese química.

[00113] Opcionalmente resíduos de aminoácidos no polipeptídeo de interesse podem ser substituídos no momento da produção de um conjugado ou complexo.

[00114] Os peptídeos também podem ser estendidos, para incorporar, por exemplo, uma outra alça e por conseguinte introduzir múltiplas especificidades.

[00115] Para estender o peptídeo, ele pode ser simplesmente estendido quimicamente em seu terminal N ou em seu terminal C ou nas alças usando lisinas ortogonalmente protegidas (e análogos) usando química em fase sólida ou em fase de solução tradicional. A química de proteínas tradicional pode ser usada para introduzir um terminal N ou C ativável. Alternativamente as adições podem ser feitas por condensação de fragmentos ou ligação química nativa, por exemplo, como descrito em (Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779), ou por enzimas, por exemplo usando subtiligase como descrito em (Chang et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20; 91(26):12544-8 ou em Hikari et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, páginas 6000-6003).

[00116] Alternativamente, os peptídeos podem ser estendidos ou modificados por conjugação adicional através de ligações dissulfeto. Esta tem a vantagem adicional de permitir que o primeiro e o segundo peptídeos dissociem-se um do outro uma vez dentro do ambiente redutor da célula. Neste caso, o arcabouço molecular (por exemplo, TBMB) poderia ser acrescentado durante a síntese química do primeiro peptídeo para reagir com os três grupos cisteína; uma cisteína adicional poderia ser então anexada ao terminal N do primeiro peptídeo, para que esta cisteína reagisse apenas com uma cisteína livre do segundo peptídeo.

[00117] Técnicas semelhantes aplicam-se igualmente à síntese/acoplamento de dois macrociclos bicíclicos e biespecíficos, criando potencialmente uma moléculaa tetraespecífica.

[00118] Além disso, a adição de outros grupos funcionais ou grupos efetores podem ser efetuada da mesma maneira, usando a química apropriada, acoplamento nos terminais N ou C ou via cadeias laterais. Em uma modalidade, o acoplamento é conduzido de tal maneira que ele não bloqueia a atividade de nenhuma das entidades.

Composições Farmacêuticas

[00119] De acordo com um outro aspecto da invenção, é oferecido uma composição farmacêutica compreendendo um liganteligante peptídico definido neste relatório em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[00120] Geralmente, os presentes ligantes peptídicos serão utilizados na forma purificada junto com excipientes ou carreadores farmacologicamente apropriados. Tipicamente, estes excipientes ou carreadores incluem soluções, emulsões ou suspensões aquosas ou alcoólicas/aquosas, incluindo soluçãao salina e/ou meios tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e Ringer lactada. Adjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessário para manter um complexo polipeptídico em suspensão, podem ser escolhidos dentre espessantes tais como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos.

[00121] Veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes e repositores de eletrólitos, tais como aqueles à base de dextrose de Ringer. Preservativos e outros aditivos, tais como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes, também podem estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).

[00122] Os ligantesligantes peptídicos da presente invenção podem ser usados como composições administradas separadamente ou em conjunto com outros agentes. Estes podem incluir anticorpos, fragmentos de anticorpos e vários fármacos imunoterapêuticos, tais como ciclosporina, metotrexato, adriamicina ou cisplatina, e imunotoxinas. As composições farmacêuticas podem incluir "coquetéis" de vários agentes citotóxicos ou outros agentes em conjunto com os ligantes proteicos da presente invenção, ou até mesmo combinações de polipeptídeos selecionados de acordo com a presente invenção tendo especificidades diferentes, tais como polipeptídeos selecionados usando diferentes ligandos de alvo, sejam eles juntados ou não antes da administração.

[00123] A via de administração das composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser qualquer uma daquelas comumente conhecidas pelo versados na técnica. Para tearpia, incluindo sem limitação imunoterapia, os ligantesligantes peptídicos da invenção podem ser administrados a qualquer paciente de acordo com técnicas tradicionais. A administração pode ser por qualquer via apropriada, incluindo parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, por via pulmonar, ou também, apropriadamente, por infusão direta com um cateter. A dosagem e frequência de administração vão depender da idade, do sexo e da condição do paciente, da administração concomitante de outros fármacos, das contraindicações e de outros parâmetros a serem considerados pelo clínico.

[00124] Será apreciado que quando os ligantesligantes peptídicos da invenção são formulados como composições oftálmicas para o tratamento de distúrbios oftalmológicos, a via de administração será tipicamente diretamente no sítio do distúrbio oftalmológico, tal como administração por uma via ocular, tal como tópica, subconjuntival, subTenon, intraocular, implantes oculares etc. Em uma modalidade, a via de administração é por injeção intraocular. Em uma modalidade alternativa a composição oftálmica é distribuída topicamente (por exemplo, aplicação extraocular) ou sistemicamente (por exemplo, por via oral ou outra via parenteral tal como, por exemplo, administração subcutânea) contanto que uma quantidade suficiente do peptídeo nas células ou tecido localizado em um olho ou adjacente a um olho entre em contato com o sítio da condição oftalmológica. Em uma modalidade alternativa a composição oftálmica é distribuída por via parenteral. A via de administração precisa ficará imediatamente aparente para o versado na técnica quando abordando o distúrbio oftalmológico a ser tratado de acordo com o conhecimento geral comum e a metodologia descrita no documento WO 2007/104541, cujo teor encontra-se aqui incorporado a título de referência. Os ligantesligantes peptídicos desta invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um carreador adequado antes do uso. Esta técnica já se mostrou eficaz e técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na literatura podem ser empregadas. Será apreciado pelos versados na técnica que liofilização e reconstituição podem levar a graus variáveis de perda de atividade e que os níveis podem ser ajustados para cima a título de compensação.

[00125] As composições contendo os presentes ligantes peptídicos ou um coquetel dos mesmos podem ser administradas para tratamento profilático e/ou terapêutico. Em certas aplicações terapêuticas, uma quantidade adequada para obter inibição pelo menos parcial, supressão, modulação, destruição, ou algum outro parâmetro mensurável, de uma população de células selecionadas é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades necessárias para atingir esta dosagem vão depender da severidade da doença e do estado geral do sistema imunológico do próprio paciente, mas geralmente variam de 0,005 a 5,0 mg do ligante peptídico selecionado por quilo de peso corporal, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais comumente usadas. Para aplicações profiláticas, composições contendo os presentes ligantes peptídicos ou coquetéis dos mesmos também podem ser administradas em dosagens similares ou ligeiramente mais baixas.

[00126] Uma composição contendo um liganteligante peptídico de acordo com a presente invenção pode ser utilizado em cenários profiláticos e terapêuticos para ajudar a alterar, inativar, destruir ou remover uma população de células alvo selecionadas em um mamífero. Além disso, os ligantesligantes peptídicos descritos nesta invenção podem ser usados extracorporalmente ou in vitro seletivamente para destruir, depletar, ou de outra forma remover efetivamente uma população de células alvo de uma coleção heterogênea de células. O sangue de um mamífero pode ser combinado extracorporalmente com os ligantesligantes peptídicos selecionados e com isso as células indesejadas são destruídas ou de alguma forma removidas do sangue para retornar ao mamífero de acordo com técnicas tradicionais.

Usos Terapêuticos

[00127] Ligandos polipeptídicos selecionados de acordo com o método da presente invenção podem ser empregados em aplicações terapêuticas e profiláticas in vivo, em aplicações diagnósticas in vitro e in vivo, em aplicações de ensaio e reagente in vitro, entre outras. Ligandos tendo níveis selecionados de especificidade são úteis em aplicações que envolvem testes em animais não humanos, onde é desejável reatividade cruzada, ou em aplicações diagnósticas, onde a reatividade cruzada com homólogos ou parálogos precisam ser cuidadosamente controlada. Em algumas aplicações, tais como aplicações em vacinas, a capacidade de provocar uma resposta imunológica para gamas predeterminadas de antígenos pode ser explorada para produzir uma vacina para doenças e patógenos específicos.

[00128] Ligantes peptídicos substancialmente puros de pelo menos 90 a 95% de homogeneidade são preferidos para administração a um mamífero, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são mais preferidos para usos farmacêuticos, especialmente quando o mamífero é um ser humano. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogeneidade conforme desejado, os polipeptídeos selecionados por usados com fins diagnósticos ou terapêuticos (incluindo extracorporalmente) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaio, colorações imunofluorescentes entre outros (Lefkovite e Pernis, (1979 e 1981) Immunological Methods, Volumes I e II, Academic Press, NY).

[00129] Os ligantesligantes peptídicos da presente invenção serão úteis tipicamente na prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, câncer, infecção bacteriana ou viral, e distúrbios autoimunes (que incluem, porém sem limitação, diabetes tipo I, esclerose múltipla, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Crohn e miastenia grave).

[00130] Assim sendo, de acordo com um outro aspecto da invenção, é oferecido um liganteligante peptídico definido nesta invenção para uso na prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, câncer, infecção bacteriana ou viral, e distúrbios autoimunes.

[00131] De acordo com um outro aspecto da invenção, é oferecido um método de prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, câncer, infecção bacteriana ou viral, distúrbios oftalmológicos e distúrbios autoimunes o qual compreende administrar a um paciente com necessidade do mesmo um liganteligante peptídico definido nesta invenção.

[00132] Em uma modalidade, os distúrbios oftalmológicos da invenção são distúrbios relacionados com permeabilidade e/ou integridade prejudicadas dos vasos retinianos. Em uma outra modalidade, os distúrbios oftalmológicos da invenção são distúrbios relacionados com ruptura de microvasos retinianos levando a hemorragias focais. Em uma outra modalidade, os distúrbios oftalmológicos da presente invenção são doenças da parte posterior do olho, em particular doenças retinianas. Em uma outra modalidade, os distúrbios oftalmológicos da invenção são doenças da parte anterior do olho. Em uma outra modalidade, os distúrbios oftalmológicos da invenção são distúrbios associados à permeabilidade vascular excessiva e/ou edema no olho.

[00133] Exemplos de "distúrbios oftalmológicos" adequados (incluindo distúrbios oftalmológicos exsudativos e/ou inflamatórios, distúrbios relacionados com permeabilidade e/ou integridade prejudicadas dos vasos retinianos, distúrbios relacionados com ruptura de microvasos retinianos levando a hemorragias focais, doenças da parte posterior do olho, doenças retinianas e doenças da parte anterior do olho) incluem, porém sem limitação: degeneração macular relacionada com a idade (ARMD), degeneração macular exsudativa (também conhecida como degeneração macular relacionada com a idade "molhada" ou neovascular (wet-AMD), edema macular, degeneração macular disciforme relacionada com a idade, edema macular cistoide, edema palpebral, edema retiniano, retinopatia diabética, neuroretinopatia macular aguda, coriorretinopatia serosa central, coriorretinopatia, neovascularização coroidal, maculopatia neovascular, glaucoma neovascular, retinopatias arteriais e venosas obstrutivas (por exemplo oclusão venosa da retina ou oclusão arterial da retina), oclusão da veia central da retina, coagulopatia intravascular disseminada, oclusão de ramo da veia da retina, alterações fundoscópicas em hipertensos, síndrome ocular isquêmica, microaneurismas arteriais retinianos, doença de Coat, telangiectasia parafoveal, oclusão da veia hemirretiniana, papiloflebite, oclusão da artéria central da retina, oclusão de ramo da artéria retiniana, doença da artéria carótida (CAD), angiíte de ramos congelados, retinopatia falciforme e outras hemoglobinopatias, estrias angioides, edema macular ocorrendo como resultado de etiologias tais como doença (por exemplo edema macular diabético), lesão ocular ou cirurgia ocular; isquemia retiniana ou degeneração produzida por exemplo por lesão, trauma ou tumores, uveíte, irite, vasculite retiniana, endoftalmite, panoftalmite, oftalmia metastática, coroidite, epitelite do pigmento retiniano, conjuntivite, ciclite, esclerite, episclerite, neurite óptica, neurite óptica retrobulbar, ceratite, blefarite, descolamento exsudativo da retina, úlcera de córnea, úlcera conjuntival, ceratite numular crônica, ceratite de Thygeson, úlcera de Mooren progressiva, uma doença inflamatória ocular causada por infecção bacteriana ou viral, e por uma operação oftalmológica, uma doença inflamatória ocular causada por uma lesão física ao olho, um sintoma causado por uma doença inflamatória ocular incluindo coceira, rubor, edema e úlcera, eritema, eritema exsudativo multiforme, eritema nodoso, eritema anular, escleredema, dermatite, edema angioneurótico, edema da laringe, edema da glote, laringite subglótica, bronquite, rinite, faringite, sinusite, laringite ou otite média.

[00134] As referências feitas neste relatório a "doenças da parte posterior do olho" incluem doenças que afetam entre outras a retina, macular, fóvea na região posterior do olho. Exemplos de "doenças da parte posterior do olho" incluem, porém sem limitação: edema macular tal como edema macular clínico ou edema macular cistoide angiográfico decorrente e várias etiologias tais como diabetes, degeneração macular exsudativa e edema macular decorrente de tratamento a laser da retina, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia de prematuridade (também conhecida como fibroplasia retrolental), isquemia retiniana e neovascularização coroidal, doenças retinianas (retinopatia diabética, edema retiniano diabético, descolamento da retina, degeneração macular senil devido à neovascularização sub- retiniana, retinopatia miópica); doenças inflamatórias; uveíte associada a neoplasmas tais como retinoblastoma ou pseudoglioma; neovascularização subsequente à vitrectomia; doenças vasculares (isquemia retiniana, insuficiência vascular coroidal, trombose coroidal, retinopatias resultantes de isquemia da artéria carótida); e neovascularização do nervo óptico.

[00135] As referências feitas neste relatório a "doenças da parte anterior do olho" refere-se a doenças que afetam predominantemente os tecidos na parte anterior do olho, tais como a córnea, íris, corpo ciliar, conjuntiva etc. Exemplos de "doenças da parte anterior do olho" adequadas incluem, porém sem limitação: neovascularização da córnea (devido à inflamação, transplante, hipoplasia do desenvolvimento da íris, doenças da córnea ou opacificações com um componente exsudativo ou inflamatório, neovascularização devido à penetração do olho ou lesão ocular por contusão; uveíte crônica; uveíte anterior; condições inflamatórias resultantes de cirurgias tais como LASIK, LASEK, cirurgia refratária, implante de IOL; edema irreversível da córnea como uma complicação de cirurgia de catarata; edema como resultado de insulto ou trauma (físico, químico, farmacológico, etc); inflamação; conjuntivite (por exemplo conjuntivite alérgica persistente, papilar gigante, alérgica intermitente ou sazonal, alérgica perene, tóxica, conjuntivite causada por infecção por bactérias, vírus ou Chlamydia); ceratoconjuntivite (vernal, atópica, seca) ; iridociclite; irite; esclerite; episclerite; ceratite infecciosa; ceratite pontilhada; ceratocone; distrofia polimórfica posterior; distrofias de Fuch (corneana e endotelial); ceratopatia bolhosa afácica e pseudofácica; edema da córnea; doença escleral; penfigoide cicatricial ocular; parte plana; síndrome de Posner Schlossman; doença de Behcet; síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada; reações de hipersensibilidade; distúrbios da superfície ocular; edema da conjuntiva; toxoplasmose choriorretinite; pseudotumor inflamatório da órbita; quemose; congestão venosa conjuntival; celulite periorbital; dacriocistite aguda; vasculite inespecífica; sarcoidose; e infecção por citomegalovírus.

[00136] Exemplos de aceitáveis "distúrbios associados à permeabilidade vascular excessiva e/ou edema no olho", por exemplo, na retina ou no vítreo, incluem, porém sem limitação, degeneração macular relacionada com a idade (AMD), edema da retina, hemorragia retiniana, hemorragia vítrea, edema macular (ME), edema macular diabético (DME), retinopatia diabética proliferativa (PDR) e retinopatia diabética não proliferativa (DR), retinopatia por radiação, telangiectasia, retinopatia serosa central, e oclusões das veias da retina. Edema da retina é o acúmulo de fluido no espaço intrarretiniano. DME é o resultado de alterações microvasculares na retina que ocorrem em pacientes com diabetes. Este comprometimento da barreira hematorretiniana leva ao derrame de constituintes do plasma na retina circundante, resultando em edema da retina. Outros distúrbios da retina incluem oclusões de veias da retina (por exemplo, oclusões de ramo da veia ou da veia central), retinopatia por radiação, retinopatia falciforme, retinopatia de prematuridade, doença de Von Hippie Lindau, uveíte posterior, descolamento crônico da retina, síndrome de Irvine Gass, doença de EaIs, retinite, e/ou coroidite. As referências feitas neste relatório ao termo "prevenção" envolvem a administração da composição protetora antes da indução da doença. "Supressão" refere-se à administração da composição depois de um evento induzido, porém antes da manifestação clínica da doença. "Tratamento" envolve a administração da composição protetora depois que os sintomas da doença se manifestaram.

[00137] Sistemas de modelos animais que podem ser usados para rastrear a eficácia dos ligantesligantes peptídicos em proteger ou tratar a doença encontram-se disponíveis. O uso de sistemas de modelos animais é facilitado pela presente invenção, que permite o desenvolvimento de ligandos polipeptídicos que podem reagir cruzadamente com alvos humanos e animais, para permitir o uso de modelos animais.

[00138] Métodos para testar o lúpus eritematoso sistêmico (SLE) em camundongos suscetíveis são conhecidos na literatura (Knight et al. (1978) J Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J : Med., 299: 515). A miasternia grave (MG) é testada em camundongos SJL/J fêmeas por indução da doença com a proteína AchR solúvel de outra espécie (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). A artrite é induzida em uma linhagem de camundongo suscetível por injeção de colágeno tipo II (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Um modelo pelo qual artrite adjuvante é induzida em ratos suscetíveis por injeção da proteína do choque térmico micobacteriana já foi descrito (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). A tireoidite é induzida em camundongos por administração de tiroglobulina como já descrito (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). O diabetes melito dependente de insulina (IDDM) ocorre naturalmente ou pode ser induzido em certas linhagens de camundongos tais como aquelas descritas por Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113. EAE em camundongo e rato serve como um modelo para MS no homem. Neste modelo, a doença desmielinizante é induzida por administração da proteína básica mielina (vide Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune e Stratton, New York, págs. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: e Satoh et al. (1987) J ; Immunol., 138: 179).

[00139] A invenção é ainda descrita abaixo com referência aos exemplos que se seguem.

Exemplos Materiais e Métodos Clonagem de bibliotecas de fagos

[00140] Bibliotecas de fagos foram geradas de acordo com Heinis et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7.

Seleções de fagos

[00141] Estoques de bibliotecas de fagos em glicerol foram diluídos até OD600=0,1 em 500 ml de culturas de 2YT/cloranfenicol (30 mg/ml) e fagos foram produzidos a 30°C durante a note (15-16 horas). Os foram purificados e quimicamente modificados como descrito por Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7. hPK biotinilada (3 mg) (IHPKA, de plasma humano, Innovative Research, Novi, MI, EUA) foi incubada com 50 ml de contas magnéticas de estreptavidina pré-lavadas (Dynal, M280 da Invitrogen, Paisley, UK) por 10 minutos à temperatura ambiente. As contas foram lavadas 3 vezes antes de serem bloqueadas com 0,5 ml de tampão de lavagem (10 mM de Tris-Cl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2) contendo 1% de BSA e 0,1% de Tween 20 por 30 minutos à temperatura ambiente com rotação. Fagos quimicamente modificados (tipicamente 1010-1011 t.u. dissolvidos em 2 ml de tampão de lavagem) foram concomitantemente bloqueados por adição de 1 ml de tampão de lavagem contendo 3% de BSA e 0,3% de Tween 20. As contas bloqueadas foram misturadas com os fagos quimicamente modificados bloqueados e incubadas por 30 minutos sobre uma roda giratória à temperatura ambiente. As contas foram lavadas 8 vezes com tampão de lavagem contendo 0,1% de Tween 20 e duas vezes com tampão de lavagem antes de incubação com 100 ml de 50 mM de glicina, pH 2,2 por 5 minutos. Os fagos eluídos foram transferidos para 50 ml de Tris-Cloridrato de 1 M, pH 8 para neutralização, incubados com 30 ml de células TG1 a OD600=0,4 por 90 minutos a 37°C e as células foram plaqueadas sobre placas de 2YT/cloranfenicol grandes. Uma ou duas rodadas adicionais de garimpagem foram realizadas usando os mesmos procedimentos. Na segunda rodada de seleção, contas magnéticas revestidas com neutravidina foram usadas para prevenir o enriquecimento de peptídeos estreptavidina-específicos. As contas revestidas com neutravidina foram preparadas por reação de 0,8 mg de neutravidina (Pierce, Rockford, IL, EUA) com 0,5 ml de contas magnéticas ativadas com tosil (Dynal, M-280 da Invitrogen, Paisley, UK) de acordo com as instruções do fabricante.

[00142] O processo de seleção tradicional foi usado com as bibliotecas 5x5 e 6x6 usando concentrações decrescentes de calicreína humana biotinilada para as rodadas um e dois e então calicreína humana ou de rato biotinilada nas rodadas três e quatro. A calicreína humana é não recombinante e portanto a cadeia pesada está presente, a calicreína de rato é recombinante, não possui a cadeia pesada e possivelmente tem uma atividade mais baixa que o esperado (com base na atividade da proteína humana). Como possivelmente há menos atividade, a concentração do alvo de rato não foi reduzida tanto quanto para a proteína humana.

Clonagem e expressão de PK humana, de macaco e de rato

[00143] O domínio catalítico de PK humana, de macaco e de rato foi expresso em células mamíferas como um precursor inativo tendo um pró-peptídeo conectado N-terminalmente via um sítio de clivagem proTEV ao domínio catalítico. O vetor de expressão foi clonado e a proteína foi expressa, ativada e purificada como descrito a seguir. Genes sintéticos codificando para uma sequência sinal de PK, um tag de poli-histidina, um sítio de cilivagem proTEV, um domínio catalítico maduro de PK e um códon de interrupção foram adquiridos na Geneart (Regensburg, Alemanha) (Materiais suplementares). DNA de plasmídeo contendo os genes sintéticos para PK humana, de macaco (Macaca mulatta) e de rato foi preparado e o gene foi transferido para o vetor de expressão mamífero pEXPR-IBA42 (IBA Biotechnology, Gottingen, Alemanha) usando o par de enzimas de restrição XhoI e HindIII (Fermentas, Vilnius, Latvia) e T4 DNA ligase (Fermentas). Os plasmídeos ligados foram transformados em células eletrocompetentes XL-1 azuis (Stratagene, Santa Clara, EUA) e plaqueados sobre placas de ágar 2YT contendo ampicilina (10 μg/ml). DNA dos três vetores de expressão (denominados mPK, rPK e hPK) foi produzido e as sequências corretas foram confirmadas por sequenciamento de DNA (Macrogen, Seul, Coreia do Sul).

[00144] As três calicreínas plasmáticas ortólogas foram expressas em células mamíferas da seguinte maneira. 50 ml de células HEK-293 adaptadas para suspensão foram cultivadas no meio ExCell 293 livre de soro (SAFC Biosciences, St. Louis, MO) na presença de 4 mM de glutamina e do inibidor de histona desacetilase ácido valproico (3,75 mM) em um balão de 100 ml com agitação orbital a 180 rpm em uma incubadora ISF-4-W (Kühner AG, Birsfelden, Suíca) a 37°C na presença de 5% de CO2. As células renais embrionárias (HEK-293) a uma densidade celular alta (20 x 106 células/ml) (Backliwal, et al. Biotechnol Bioeng 2008, 99 (3), 721-7) foram transfectadas com os três plasmídeos (300mg/ml) usando polietilenimina linear (PEI, Polysciences, Eppenheim, Alemanha). No final da fase de produção de 7 dias, as células foram coletadas por centrifugação a 2500 rpm por 15 minutos a 4°C. Todo detrito celular adicional foi removido do meio por filtração através de membranas de PES de 0,45 μm ("Filter-top 250 ml low protein binding TPP"). A protevna tagged com poli-histidina foi purificada por cromatografia por afinidade com Ni usando uma resina de Ni-NTA, tampão de lavagem (500 mM de NaCl, 25 mM de Na2HPO4, pH7,4) e tampão de eluição (500 mM de NaCl, 25 mM de Na2HPO4, pH 7,4, 500 mM de imidazol). A proteína foi parcialmente ativada com (50 unidades) proTEV (Promega, Madison, Wisconsin, EUA) e adicionalmente purificada por cromatografia por afinidade com Ni e filtração em gel (coluna PD10, 150 mM de NaCl, 0,5 mM de EDTA, 50 mM de HEPES, pH 7).

Desenvolvimento de polipeptídeos com atividade de ligação melhorada Randomização de posições individuais

[00145] Construção de bibliotecas: Para mapear os aminoácidos nos peptídeos bicíclicos ligadores de calicreína foi construído um conjunto de pequenas bibliotecas. Para um biciclo compreendido de 2 alças de 5 resíduos, foram geradas 10 bibliotecas separadas cada uma delas com randomização em um códon particular na sequência peptídica. Oligonucleotídeos foram desenhados para cada biblioteca para mutar o DNA do genoma de fago por mutagênese sítio-direcionada. A mutagênese incorporou a randomização do códon de interesse (alterado para NNS), e a remoção de um único sítio de restrição ApaL1 da sequência modelo de genoma. O produto de mutagênese foi purificado usando o kit de purificação de produtos de PCR QIAgen QIAquick com eluição em água ultrapura. Cada biblioteca foi usada para separadamente transformar TG1 E coli por eletroporação com uma máquina Micropulser BioRad (programa Ec1) e uma cubeta BioRad de 1 mm. Depois de 1 hora de recuperação a 37°C em 1 ml de meio SOC media, os transformantes da biblioteca foram cultivados por uma noite em 25 ml de caldo 2TY contendo antibiótico para desenvolver seletivamente somente transformantes da biblioteca. As bactérias foram coletadas por centrifugação e o DNA de fago da biblioteca foi purificado a partir de E. coli usando um kit QIAgen Plasmid Plus Midi e eluído com água destilada. O DNA purificado foi digerido com ApaL1 por 2 horas em tampão England Biolabs 4 para remover o material parental. Depois da digestão, o DNA foi repurificado usando o kit de purificação de produtos de PCR QIAgen (como acima) e usado para transformar TG1 (electroporação; como descrito acima). Subequente à recuperação de 1 hora em SOC, os transformantes foram plaqueados sobre placas de LB- ágar contendo antibiótico seletivo e colônias foram deixadas crescer por uma noite a 37°C.

[00146] Ensaio de ligação de clones individuais: Colônias de transformantes da biblioteca foram apanhadas aleatoriamente e cultivadas como culturas individuais em caldo 2TY contendo antibiótico seletivo. As colônias apanhadas tiveram o DNA sequenciado usando um sequenciador de DNA QIAgen PyroMark Q96 para revelar a substituição aminoacídica presente em cada clone. Onde isolado, um clone de cada substituição única foi analisado quanto à ligação de calicreína plasmática humana da seguinte maneira. O sobrenadante contendo fagos foi coletado da cultura e os fagos foram ciclizados com tris bromometil benzeno (TBMB) com base nos métodos de Heinis et al. (Nature Chemical Biology vol. 5 págs. 502-507 (2009)). Os fagos purificados por este processo foram analisados quanto à ligação à calicreína plasmática humana biotinilada usando um ensaio de ligação baseado em placa homogênea; leitura do ensaio medida em uma leitora de placas BMG Labtech Pherastar FS. A média dos dados quantitativos de ligação provenientes de amostras em triplicata do ensaio foi calculada e expressa como sinal:fundo (onde fundo era uma amostra analisada sem material alvo). A relação sinal:fundo foi expressa como uma % da amostra parental paralela. As barras de erro indicam o desvio padrão da média. Os ensaios mostrados são representativos de pelo menos 2 experiências independentes. Os dados do ensaio foram correlacionados com as sequências peptídicas. As substituições assinaladas em cinza não foram testadas (um clone não foi isolado da amostragem aleatória da biblioteca). Uma amostra de um biciclo (arbitrário) não ligador foi paralelamente analisada para ilustrar a linha basal do ensaio.

Randomização de domínios peptídicos

[00147] Construção de bibliotecas: Pequenas bibliotecas de fagos foram geradas de acordo com os métodos de Heinis et al. como descrito em ‘Cloning of phage libraries’ acima. O iniciador sficx3ba foi modificado para que a porção codificadora de biciclo fosse baseada em uma sequência de DNA de biciclo 5x5 ou 6x6 parental (5x5: duas alças de 5 resíduos, 6x6: duas alças de 6 resíduos) com apenas 4-6 códons randomizados para NNS. Os códons randomizados foram aqueles codificando o domínio/motivo peptídico de interesse.

[00148] Ensaio de ligação de clones individuais: Colônias de transformantes da biblioteca, colônias de saída da seleção, foram apanhadas aleatoriamente e cultivadas como culturas individuais em caldo 2TY contendo antibiótico seletivo. As colônias apanhadas tiveram o DNA sequenciado usando um sequenciador de DNA QIAgen PyroMark Q96 para revelar a substituição aminoacídica presente em cada clone, e foram analisadas quanto à ligação de calicreína plasmática humana da seguinte maneira. O sobrenadante contendo fagos foi coletado da cultura e os fagos foram ciclizados com tris- bromometilbenzeno (TBMB) com base nos métodos de Heinis et al. (Nature Chemical Biology vol. 5 págs. 502-507 (2009)). Os fagos purificados por este processo foram analisados quanto à ligação à calicreína plasmática humana biotinilada usando um ensaio de ligação baseado em placa homogênea; leitura do ensaio medida em uma leitora de placas BMG Labtech Pherastar FS. A média dos dados quantitativos de ligação provenientes de amostras em duplicata do ensaio foi calculada e expressa como sinal:fundo. Os dados do ensaio mostrados são representativos de pelo menos 2 experiências independentes. Os dados do ensaio foram correlacionados com as sequências peptídicas.

Síntese de Peptídeos

[00149] A síntese de peptídeos baseou-se na química de Fmoc, usando um sintetizador de peptídeos Symphony produzido pela Peptide Instruments. Fmoc-aminoácidos padrão foram empregados (Sigma, Merck), com os seguintes grupos protetores de cadeia lateral: Arg(Pbf); Asn(Trt); Asp(OtBu); Cys(Trt); GIu(OtBu); Gln(Trt); His(Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu); Trp(Boc), Tyr(tBu) (Sigma). O reagente de acocplamento foi HCTU (Pepceuticals), di-isopropiletilamina (DIPEA, Sigma) foi empregada como uma base, e a desproteção foi obtida com piperidina a 20% em DMF (AGTC). As sínteses foram efetuadas em uma escala de 100 □ moles usando 0,37 mmol/g de resina Fmoc-Rink amida AM (AGTC), os Fmoc-aminoácidos foram utilizados em um excesso quatro vezes maior, e a base foi utilizada em um excesso quatro vezes maior em relação aos aminoácidos. Os aminoácidos foram dissolvidos a 0,2 M em DMF, HCTU a 0,4 M em DMF, e DIPEA a 1,6 M em N-metilpirrolidona (Alfa Aesar). Os tempos de acoplamento foram em geral de 30 minutos, e os tempos de desproteção de 2 x 2,5 minutos. Fmoc-N-metilglicina (Fmoc-Sar-OH, Merck) foi acoplada por 1 hora, e o tempo de desproteção e acoplamento para o resíduo seguinte foi de 20 minutos e 1 hora, respectivamente. Depois da síntese, a resina foi lavada com diclorometano, e secada. A clivagem dos grupos protetores de cadeia lateral e do suporte foi efetuada usando 10 mL de 95:2,5:2,5:2,5 v/v/v/p de TFA/H2O/iPr3SiH/ditiotreitrol por 3 horas. Subsequente à clivagem, a resina gasta foi removida por filtração, e o filtrado foi adicionado a 35 mL de dietil éter que fora resfriado a -80°C. A pelota de peptídeos foi centrifugada, o sobrenadante etéreo foi descartado, e a pelota de peptídeos foi lavada com éter frio mais duas vezes. Os peptídeos foram então ressolubilizados em 5-10 mL de acetonitrila-água e liofilizados. Uma pequena amostra foi removida para análise da pureza do produto bruto por espectrometria de massas (MALDI-TOF, Voyager DE da Applied Biosystems). Subsequente à liofilização, pós de peptídeos foram recuperados em 10 mL de cloridrato de guanidínio 6 M em H2O, suplementados com 0,5 mL de ditiotreitrol 1 M, e carregados em uma coluna de HPLC preparatória C8 Luna (Phenomenex). Os solventes (H2O, acetonitrila) foram acidificados com de ácido heptafluorobutírico a 0,1 %. O gradiente variou de 30-70 % de acetonitrila em 15 minutos, a uma taxa de fluxo de 15/20 mL/min, usando um sistema de HPLC preparatória Gilson. As frações contendo material peptídico linear puro (identificado por MALDI) foram combinadas, e modificadas com trisbromometilbenzeno (TBMB, Sigma). Para tanto, o peptídeo linear foi diluído com H2O até ~35 mL, ~500 μL de TBMB 100 mM em acetonitrila foram acrescentados, e a reação foi iniciada com 5 mL de NH4HCO3 1 M em H2O. A reação foi deixada prosseguir por ~30 -60 minutos à temperatura ambiente, e liofilizada uma vez depois de chegar ao fim (avaliada por MALDI). Subsequente à liofilização, o peptídeo modificado foi purificado da maneira descrita acima, embora substituindo-se a coluna Luna C8 por uma coluna Gemini C18 (Phenomenex), e trocando-se o ácido por ácido trifluoroacético a 0,1%. As frações puras contendo o material modificado com TMB correto foram reunidas, liofilizadas e mantidas a -20°C para armazenamento.

[00150] Todos os aminoácidos, a menos que observado em contrário, foram usados nas configurações L-.

[00151] Os peptídeos bicíclicos identificados diretamente das seleções de fagos usualmente continham duas alaninas invariantes nos terminais N/C. Para peptídeos visados em estudos de estabilidade no plasma e de farmacocinética, os peptídeos foram ressintetizados da maneira indicada, faltando as alaninas terminais, e N-terminalmente acetilados como indicado.

[00152] Os peptídeos usados para os estudos de farmacocinética no Exemplo 4 foram liofilizados a paritr de HCl 10 mM em água 3 vezes para dar os sais de cloridrato dos compostos. As soluções foram administradas por bolo intravenoso a 1 mg/mL em 50 mM de Hepes pH 7,0, 5% de glicerol, 1,9% de DMSO para os dois compostos (Ac-(06550) Aze3 HArg5 Sar3-(D-Arg2)) e (06-259-02)-Sar3-(D-Arg2)) a 5 mg/kg em ratos Spraguely Dawely. Amostras de sangue seriadas (~0,2 mL) foram coletadas em tubos de EDTA nos tempos indicados, e o plasma foi separado por centrifugação, e congelado a -20°C para análise. Empregando técnicas bioanalíticas tradicionais, as amostras de plasma foram analisadas e quantificadas quanto ao composto parental remanescente usando uma Waters, Xevo TQS LC-MS. Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados usando o pacote de software PK Solutions 2,0 da Summit Research Services.

[00153] Os peptídeos usados para os estudos nos Exemplos 5 e 6 foram obtidos a partir de frações puras (>95%) coletadas de purificações de fase reversa feitas na presença de 0,5% de ácido acético, que, depois de liofilização, deu os sais de acetato dos peptídeos.

Ensaios enzimáticos

[00154] Ensaios enzimáticos funcionais foram conduzidos em Tris HCl 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl210 mM, CaCl2 1 mM e BSA 1 mg/mL (todos Sigma UK) pH 7,4 a 25°C em placas de 96 ou 384 poços pretos sólidos. Em resumo, 26,5 pM de calicreína plasmática humana (adquirida na Stratech, UK) ou 13,25 pM de calicreína plasmática de rato (expressa e purificada internamente) foram incubados na ausência ou presença de concentrações crescentes do peptídeo de teste por 15 minutos antes da adição do substrato fluorogênico Z-PheArg-AMC (Enzo Lifesciences UK) até uma concentração de ensaio final de 100 μM em 4% de DMSO. A liberação de AMC foi medida usando um Pherastar FS (BMG Labtech), excitação 360 nm, emissão 460 nm. A taxa da fase linear da reação, tipicamente 5 a 45 minutos, foi calculado no software de análise de dados de MARS (BMG labtech). A taxa foi então usada para calcular a IC50 e Ki em Prism (GraphPad). Uma equação de regressão não linear da inibição de quatro parâmetros foi usada para calcular a IC50. A equação "One site - fit K" foi usada para calcular a Ki, restringindo a Ki à Km para o substrato que é 150 μM para a enzima humana, e 200 μM para o ortólogo de rato. Todos os valores de Ki/IC50 são a média de pelo menos duas experiências independentes, e pelo menos três para peptídeos com valores de Ki menores que 1 nM. Para calicreína de coelho, foram empregados entre 7 e 14 pM de enzima, com 33 μM de substrato com uma Km de 50 μM.

[00155] Os peptídeos foram dissolidos como os sais de TFA em sua forma de pó, e soluções de estoque foram usualmente preparadas em água. Todas as soluções foram centrifugadas e filtradas (filtros de seringa de 20 μm) antes de medição da absorção a 280 nm. Os coeficientes de extinção foram calculados com base no teor de Trp/Tyr do peptídeo, e com base no teor de TMB (o núcleo de TMB, quando contido em um peptídeo, tem um coeficiente de extinção de ~300 M-1cm- 1).

Perfilamento da estabilidade plasmática Método #1:

[00156] Foi desenvolvido um ensaio rápido de perfilamento da estabilidade plasmático que empregou detecção espectromética de massa (MALDI-TOF, Voyager DE, Applied Biosystems) da massa parental, até que a massa do peptídeo parental não fosse mais observável. Especificamente, 200 μM de peptídeo foram incubados na presença de 35% de plasma de rato ou humano (Sera labs, usando citrato como anticoagulante) a 37°C, que foi suplementado com 1 x PBS (derivado de um estoque de 10 x PBS, Sigma). Em vários pontos do tempo (isto é, t = 0, 3, 24 horas, e depois disso diariamente até dias), 2 μL de amostra foram acrescentados a 18 μL de bicarbonato de amônio 30 mM em uma mistura 1:1 de acetonitrila:H2O. As amostras foram congeladas a -80°C até o momento da análise. Para análise espectromética de massa que determina a janela de detecção aproximada do peptídeo, a amostra diluída em acetonitrila:H2O de um ponto do tempo dado foi aplicada diretamente (0,7μL) sobre a placa de MALDI. Matriz (ácido alfa-cianocinâmico, Sigma, preparado como uma solução saturada em acetonitrila:água 1:1 contendo 0,1% de ácido trifluoroacético) foi colocada em camadas sobre a amostra (1 μL). Em uma configuração da intensidade de laser similar no MALDI TOF, foi possível determinar o tempo até que o peptídeo parental não fosse mais detectável. Deve ser observado que este é um ensaio qualitativo que serve para detectar alterações relativas na estabilidade plasmática. Método #2

[00157] Para obter dados de estabilidade mais rapidamente, os peptídeos também foram avaliados em plasma a 95%. Aqui, o PBS foi omitido, e um estoque de peptídeos 1-5 mM (em DMSO) foi diluído diretamente em plasma (isto é, 2,5 μL estoque em 47,5 μL de plasma), dando uma concentração final de 50 μM. 5 μL de amostras foram coletados nos tempos apropriados e congelados a -80°C. Para análise, as amostras foram descongeladas, misturadas com 25 μL de acetonitrila:metanol:água 3:3:1, e centrifugadas a 13k por 5 minutos. 5 μL de preferência sobrenadante contendo peptídeo foram aspirados e misturas com bicarbonato de amônio 30 mM em uma mistura 1:1 de acetonitrila:H2O. 1 μL desta foi então aplicado sobre a placa MALDI e analisada da maneira descrita acima. Como acima, deve ser observado que este é um ensaio qualitativo que serve para detectar alterações relativas na estabilidade plasmática.

Método #3

[00158] Para obter a estabilidade plasmática quantitativamente, soluções de estoque de peptídeos (1 mM em DMSO) foram enviaadas para Biofocus, UK, que fez a análise. Os peptídeos foram diluídos até 100 μM com água, e diluídos 1:20 em plasma (concentração final de 5 μM, com o plasma a 95%), amostras foram coletadas conforme apropriado, precipitadas como acima, e quantificadas por LC-MS usando um Waters Xevo TQ-MS.

Exemplo 1: Identificação de peptídeos bicíclicos ligadores de calicreína com seletividade homóloga vantajosa e reatividade cruzada entre espécies (a) Identificação de novas e potentes sequências de derivação huma-nas e de rato de reatividade cruzada

[00159] Para um dado peptídeo bicíclico terapêutico, suas propriedades farmacodinâmicos e farmacocinéticas precisam ser avaliadas em espécies animais pré-clínicas. Espécies pré-clínicas comuns incluem rato, camundongo, coelho, cachorro, porquinho-da- índia e cinomolgo.

[00160] Devido à seletividade geralmente alta dos peptídeos bicíclicos, que em parte é facilitada por sua grande área de contato com a proteína alvo, peptídeos bicíclicos de alta afinidade para uma proteína alvo podem não reagir cruzadamente com a mesma proteína alvo derivado de uma dada espécie pré-clínica, dificultando a avaliação pré- clínica de tal derivação. Um exemplo inclui PK15 (descrito no documento WO 2009/098450), que é um peptídeo bicíclico potente (tamanho da alça 6x6) com uma Ki de ~1,2 nM para calicreína humana. A potência da calicreína de rato é acentuadamente diminuída, a uma Ki de ~500 nM, fazendo com que esta derivação não seja adequada para avaliação pré-clínica.

[00161] Para identificar peptídeos bicíclicos de derivação 5x5 e 6x6 com alta potência para calicreína humana, ao mesmo que retém uma potência considerável para calicreína de rato, foram feitas seleções de fagos onde a calicreína de rato e a calicreína humana foram alternadas como iscas durante cada rodada de seleção. Com ajuste das concentrações de isca durante as rodadas de seleção, foi possível identificar diferentes sequências de derivação de reatividade cruzada. Uma amostra de cada saída de seleção foi rastreada quanto à ligação à calicreína humana, e subsequentemente sequenciada.

[00162] Especificamente, as duas primeiras rodadas de seleção foram efetuadas com calicreína humana, a concentrações do alvo variando entre 3 e 100 nM, seguidas por duas primeiras rodadas de seleção usando calicreína de rato, a concentrações do alvo de 30nM.

[00163] Rastreamento de clones de fagos individuais para ligação de calicreína no ensaio de rastreamento homogêneo revelou inúmeras sequências únicas com aumentos de até 50 vezes no sinal em relação ao fundo. Estas foram preparadas como peptídeos sintéticos e avaliadas quanto à inibição da calicreína humana, calicreína de rato e calicreína de coelho (Tabela 1). Tabela 1: Resumo das novas derivações de biciclos de reatividade cruzada

As cisteínas invariantes estão mostradas em cinza, e os resíduos conservados para cada derivação estão sublinhados.

[00165] Várias das derivações apresentam boa reatividade cruzada entre a calicreína de rato e a calicreína humana: 06-254, 06-255, 06-258, e 06-261 (Tabela 1). Avaliando as saídas de sequência para cada família de derivações, os resíduos semiconservados puderam ser identificados e estão sublinhados (Tabela 1).

[00166] 06-254 e 06-255 compartilham uma primeira alça quase idêntica, mas a segunda alça do mesmo é diferente. 06-258 é a única sequência de derivação de reatividade cruzada que foi identificada contendo 5 aminoácidos na alça 1 e na alça 2 (5x5).

Maturação da afinidade das sequências de peptídeos bicíclicos de reatividade cruzada com calicreína de rato-humana

[00167] Peptídeos bicíclicos candidatos seletos (Tabela 1) foram selecionados para maturação da afinidade. Resíduos de consenso foram extrapolados das saídas da seleção inicial. Para maturação da afinidade, os resíduos que pareciam estar fora da região de consenso foram randomizados, de acordo com as informações contidas na Tabela 2. Tabela 2: Bibliotecas de maturação da afinidade para cada derivação de peptídeo bicíclico ligador de calicreína 06-254

Purpose Randomise predicted motif (underlined, ("X")); fix surrounding sequence Legenda: purpose = finalidade; parent sequence = sequência parental; library = biblioteca; fix predicted motif (underlined) = fixar o motivo previsto (sublinhado); randomise surrounding sequence ("X") = randomizar a sequência circundante ("X"); randomise predicted motif (underlined, ("X")) = randomizar o motivo previsto (sublinhado, ("X")); fix surrounding sequence = fixar a sequência circundante.

[00168] Sequência ID Números: 06-254 parental (SEQ ID N°: 23), biblioteca (SEQ ID N°: 64); 06-256 parental (SEQ ID N°: 49), biblioteca (SEQ ID N°: 65); 06-258 parental (SEQ ID N°: 52), biblioteca (SEQ ID N°: 66); 06-259 parental (SEQ ID N°: 10), biblioteca (SEQ ID N°: 67); 06-261 parental (SEQ ID N°: 54), biblioteca (SEQ ID N°: 99).

[00169] Os resíduos fora do motivo de ligação mais conservado foram randomizados ("X"). No caso do 06-261, seu motivo FPFR semelhante ao 06-34-18 (SEQ ID N°: 100) foi randomizado, ao passo que os resíduos circundantes foram fixados.

[00170] A saída de sequências das bibliotecas de afinidade maturada está mostrada em dois exemplos, 06-254 e 06-259: Saída de sequências de 06-254:

[00171] A Tabela 3 mostra as variantes de 06-254 mais potentes identificadas pelo ensaio de rastreamento. Tabela 3: Saída de sequências da biblioteca de afinidade maturada 06-254

S:B refere-se a Sinal:Fundo. Ligadores potentes foram identificados pelo ensaio de rastreamento homogêneo, e comparados com sua sequência parental (06-254) e o ligador de calicreína 6x6 PK15 (WO 2009/098450).

[00172] Os candidatos mais potentes (06-254-01, 06-254-02 e 06254-03) foram selecionados para síntese de peptídeos, e avaliados quanto à inibição da calicreína de rato e da calicreína humana. Saída de sequências de 06-259:

[00173] A Tabela 4 mostra as variantes de 06-259 mais potentes identificadas pelo ensaio de rastreamento. Tabela 4: Saída de sequências da biblioteca de afinidade maturada 06-259

S:B refere-se a Sinal:Fundo. Ligadores potentes foram identificados pelo ensaio de rastreamento homogêneo, e comparados com sua sequência parental (06-259) e o ligador de calicreína 6x6 PK15 (WO 2009/098450).

[00174] Os candidatos mais potentes (06-259-01, 06-259-02, 06259-03 e 06-259-04) foram selecionados para síntese de peptídeos e medição da afinidade para calicreína de rato e calicreína humana.

[00175] As potências in vitro e a reatividade cruzada dos peptídeos sintéticos estão resumidas na Tabela 5. Tabela 5: Resumo das constantes de inibição (Ki) para calicreína humana, calicreína de rato e calicreína de Coelho

[00176] As derivações de peptídeos bicíclicos com taxas de dissociação inferiores a 10/20 nM para calicreína humana/rato, respectivamente, estão indicadas em negrito.

[00177] Ao todo, existem vários candidatos que apresentam potências altas e boa reatividade cruzada entre calicreína de rato e calicreína humana, tais como 06-254-01, 06-254-02, 06-254-03, 06-255, 06-258, 06-259-01, 06-259-02, 06-259-03, 06-259-04 e 06-261 (em negrito, vide Tabela 5).

Exemplo 2: Rastreamento da estabilidade plasmática de peptídeos bicíclicos ligadores de calicreína revela candidatos à derivação promissores

[00178] No Exemplo 1, foram identificadas diversas sequências de derivações bicíclicas novas com potências elevadas para o homem e ratos. O membro mais potente de cada família foi selecionado para comparação da estabilidade plasmática em ratos e no homem. Estes foram 06-254-02, 06-255, 06-259-02 e 06-261. O rastreamento inicial usando o Método #1 indicou que 06-255 e 06-259-02 são mais estáveis que os peptídeos bicíclicos restantes, segundo avaliado por uma janela de detecção mais longaa desses dois peptídeos (até 10 dias, Figuras não mostradas). Os outros peptídeos não eram mais detectáveis depois de 2-3 dias, apresentado uma estabilidade baixa similar àquela da sequência não modificada de 06-34-18.

[00179] Tanto 06-255 quanto 06-259-02 sofriam de um perfil de solubilidade pobre, e, portanto, foram ressintetizados com uma extensão C-terminal solubilizante (Sar3-(D-Arg)2 (SEQ ID N°: 98)). Sarcosina3 (Sar3) neste caso serve como um espaçador molecular, enquanto que as D-argininas conferem maior solubilidade aquosa à molécula devido a sua natureza de complexação com água e fortemente iônica no pH fisiológico.

[00180] A extensão solubilizante não reduziu significativamente as constantes de inibição da enzima, como indicado na Tabela 6. Tabela 6: Resumo das constantes de inibição (Ki) para calicreína humana, calicreína de rato e calicreína de coelho com extensão solubilizante

[00181] Os peptídeos foram analisados em plasma humano e plasma de rato nas condições descritas no Método #2. As estabilidades foram avaliadas comparativamente contra 06-34-18, que tem um t1/2 quantitativo de 2,3 horas em plasma de rato, e 2 horas em plasma humano (WO 2013/050616). As Figuras 1 e 2 demonstram que a derivação de peptídeo bicíclico 06-259-02 tem um perfil de estabilidade plasmática particularmente vantajosa, no sentido de que ela é significativamente mais estável tanto em plasma humano quanto em plasma de rato em comparação com 06-255 e 06-34-18.

Exemplo 3: Enxerto de alças peptídicas entre diferentes derivações de peptídeo bicíclico gera novas construções quiméricas com propriedades vantajosas

[00182] A primeira alça da sequência de 06-34-18 já descrita (WO 2013/050616, sequência: CSWPARCLHQDLC (SEQ ID N°: 86)) compartilha um motivo FPFR similar (SEQ ID N°: 100, sublinhado) com o peptídeo 06-261 identificado neste relatório (sequência: CNNFPFRCVYYPDIC (SEQ ID N°: 54)). Entretanto, foi descrito que 06-34-18 contém dois sítios de reconhecimento proteolíticos que deixam o peptídeo lábil a proteases plasmáticas no sangue e, por conseguinte, inadequados como um terápico inibidor de calicreína. Estes sítios compreendem os resíduos Arg5 e His7 de 06-34-18 (CSWPARCLHQDLC (SEQ ID N°: 86): sublinhado e em negrito). Na sequência 06-261 ora descrita (Exemplo 1), o sítio de reconhecimento proteolítico de histidina equivalente na alça 2 está ausente.

[00183] Devido à falta de His7 na segunda alça de 06-261 (sequência: VYYPDI (SEQ ID N°: 87)), os inventores da presente invenção substituíram a segunda alça contendo histidina proteoliticamente lábil de 06-34-18 pela segunda alça de 06-261 na esperança de produzir um peptídeo quimérico totalmente potente com estabilidade proteolítica melhorada na alça 2. Especificamente, esta sequência compreende a primeira alça de 06-34-18 (sequência: SFPYR (SEQ ID N°: 88)) e a segunda alça de 06-261 (sequência: VYYPDI (SEQ ID N°: 87)), produzindo a sequência completa quimérica CSFPYRCVYYPDIC (SEQ ID N°: 55) (ou o equivalente WPAR, isto é, CSWPARCVYYPDIC (SEQ ID N°: 89)). Este peptídeo quimérico é denominado 06-550, e tem 5 resíduos na alça 1, e 6 resíduos na alça 2.

[00184] Já foi anteriormente descrito (WO 2013/050616) que a labilidade proteolítica induzida pela Arg5 em 06-34-18 pode ser removida ou reduzida com a substituição de Arg5 por N-α-metil arginina (NMe-Arg) ou homoarginina (HArg). Adicionalmente, uma substituição melhoradora de afinidade concomitante de ácido carboxílico de L- azetidina (Aze) pode ser introduzida na posição 3, substituindo a prolina 3 original.

[00185] Como o peptídeo bicíclico quimérico 06-550 conserva a primeira alça de 06-34-18, modificações idênticas em Arg5/Pro3 para HArg5/Aze3 foram implementadas, e este peptídeo é denominado 06550 Aze3 HArg5.

[00186] Devido à ausência de uma histidina 7 melhoradora de solubilidade na sequência, 06-550 (ou 06-550 Aze3 HArg5) todavia exibiu uma solubilidade aquosa significativamente reduzida em comparação com 06-34-18. Para melhorar a solubilidade aquosa dessas moléculas, foram sintetizados derivados que continham extensões C-terminais compreendendo espaçadores sarcosina3 seguidos por duas D-argininas. A inclusão das D-argininas levou a uma solubilidade aquosa mais vantajosa desses peptídeos.

[00187] As constantes de inibição de calicreína desses peptídeos estão resumidas na Tabela 7. Tabela 7: Constantes de inibição dos peptídeos 06-550 para calicreína humana, calicreína de rato e calicreína de Coelho

[00188] A partir dos dados fica claro que a modifcação Aze3-HArg5 é bem tolerada, uma vez que tanto a afinidade humana quanto a de rato são altas. A modificação N-metil é menos adequada. Igualmente, a extensão solubilizante Sar3-(D-Arg2) (SEQ ID N°: 98) é bem tolerada, uma vez que potências permanecem inalteradas em comparação com os peptídeos sem esta extensão.

Perfilamento comparativo da estabilidade plasmática dos derivados 06550

[00189] A estabilidade do peptídeo bicíclico "Ac-(06-550)-Sar3- (DArg2) Aze3 HArg5" (Tabela 7) foi avaliada em termos da estabilidade relativa em plasma humano e plasma de rato de acordo com o Método #2 (Figura 3) e comparada com o 06-34-18 instável (Figuras 1 e 2).

[00190] No plasma de ambas as espécies, o peptídeo exibe alta estabilidade, uma vez que são observados poucos produtos de degradação. A título de comparação, a massa parental do 06-34-18 instável praticamente desapareceu durante o mesmo curso de tempo (dados mostrados no Exemplo 2). Portanto, o conceito de combinar alças derivadas de sequências parentais separadas (06-261 e 06-34-18) produziu uma nova molécula quimérica, potente e proteoliticamente estável.

Exemplo 4: Comportamento farmacocinético in vivo de peptídeos bicíclicos inibidores de calicreína seletos

[00191] Os peptídeos Ac-(06-550)-Sar3-(D-Arg)2 Aze3 HArg5 (que contém as modificações estabilizantes e melhoradoras de afinidade Aze3 e HArg5, e uma extensão C-terminal solubilizante Sar3-(D-Arg)2) (SEQ ID N°: 98) e Ac-(06-259-02)-Sar3-(D-Arg)2 foram selecionados para avaliação farmacocinética em rato. Os peptídeos foram injetados por via intravenosa em solução tamponada a 1 mg/mL a 5 mg/kg em ratos Sprague Dawley, e amostras de sangue foram coletadas e analisadas quanto às concentrações de peptídeo em vários pontos do tempo após a injeção.

[00192] Os dois peptídeos exibiram uma depuração entre 17 (06550) e 7 ml/min/kg (06-259-02) (Tabela 8, Figura 4), que é próxima à taxa de filtração renal publicada em rato (~8-9 mL/min/kg) [Jobin J, Bonjour JP, (1985) Am J Physiol.;248(5 Pt 2):F734-8].

[00193] Isto salienta a estabilidade proteolítica melhorada do Ac-(06- 550)-Sar3-(D-Arg)2 Aze3 HArg5, que as duas modificações estabilizantes Aze3 e HArg5 e uma sequência na alça dois que é inerentemente estável proteoliticamente.

[00194] No caso do Ac-(06-259-02)-Sar3-(D-Arg)2, a sequência natural é suficientemente estável proteoliticamente no rato de modo que sua depuração ocorre principalmente por excreção renal. Tabela 8: Parâmetros farmacocinéticos de Ac-(06-550)-Sar3-(D- Arg)2 Aze3 HArg5 e Ac-(06-259-02)-Sar3-(D-Arg)2 em rato

Exemplo 5: Análise farmacocinética in vivo subsequente à injeção intravítrea de peptídeos bicíclicos inibidores de calicreína seletos

[00195] Nesta análise, o peptídeo Ac-(06-550)-Sar3-(D-Arg)2 Aze3 HArg5 (neste estudo denominado Biciclo 1 e que contém as modificações estabilizantes e modificadoras de afinidade Aze3 e HArg5, e uma extensão C-terminal solubilizante Sar3-(D-Arg)2 (SEQ ID N°: 98); vide Exemplos 3 e 4 neste relatório) foi avaliado comparativamente contra o peptídeo Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 (neste estudo denominado Biciclo 2 e que está descrito na Tabela 26b e Figura 22 do documento PCT/EP2014/057440). Coelhos Nova Zelândia brancos (2-3kg) foram anestesiados e ambos os peptídeos foram administrados por injeção intravítrea (100 μg/olho) de acordo com o protocolo descrito na Tabela 9. Tabela 9: Protocolo de administração para injeção intravítrea

OS = olho esquerdo; OD = olho direito; Min = minutos; h = horas. Veículo = 10 mM de tampão acetato de sódio pH 5,0 em água contendo 2,5% glicerol

[00196] Depois de um tempo apropriado, os coelhos foram abatidos por eutanásia e asmostras do humor vítreo, humor aquoso, retina e plasma foram coletadas. As amostras foram analisadas por LC-MS para determinar a concentração do peptídeo. Os resultados deste estudo estão mostrados na Figura 5 onde se pode observar que ambos os peptídeos foram lentamente depurados do humor vítreo, com meias- vidas de eliminação de 20-30 horas. Esta é significativamente mais lenta que a depuração de moléculas pequenas como o antibiótico ciprofloxacina (meia-vida reportada no vítreo normal de coelho 2,2 horas; Pearson et al. 1993, Retina 13:326-330).

Exemplo 6: Efeito de peptídeos bicíclicos inibidores de calicreína seletos sobre edema de pata induzido por carragenina

[00197] Nesta análise, o peptídeo Ac-(06-259-02)-Sar3-(D-Arg)2 (neste estudo denominado Biciclo 3; vide Exemplo 2 neste relatório) foi avaliado comparativamente contra o peptídeo Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 (neste estudo denominado Biciclo 2 e que está descrito na Tabela 26b e Figura 22 do documento PCT/EP2014/057440). Inflamação foi induzida em ratos Sprague- Dawley machos (n=10 por grupo) por injeção de 100μL de uma solução de carragenina a 1% na região subplantar da pata traseira direita. Os animais receberam tratamento com os peptídeos e com indometacina de acordo com a Tabela 10: Tabela 10: Regime de dosagem para análise induzida por carragenina

*tempos de dosagem em relação à administração de carragenina ip =intraperitoneal Veículo = 50 mM de tampão acetato de sódio pH 5,0, 20% de PEG400 e 10% de Kolliphor EL

[00198] 1, 2, 4 e 6 horas depois da administração de carragenina, o volume da pata foi medido pelo método do deslocamento. Análise estatística foi conduzida usando ANOVA bidirecional com medidas repetidas (GraphPad Prism).

[00199] Os resultados deste estudo estão mostrados na Figura 6 onde se pode observar que ambos os peptídeos inibiram o inchaço da pata induzido por carragenina em todos os pontos do tempo. Tratamento seja com o peptídeo ou com o controle positivo, indometacina, resultou em uma redução altamente significativa no inchaço da pata (p<0,001). Notavelmente, a extensão de inibição foi equiparável entre os dois peptídeos e indometacina, esta última sendo considerada como a porção terapêutica padrão-ouro neste modelo.

Claims (21)

1. Ligante peptídico específico para calicreína plasmática, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo compreendendo pelo menos três resíduos cisteína, separados por pelo menos duas sequências de alça, e um arcabouço molecular que é TBMB e forma ligações covalentes com os resíduos cisteína do polipeptídeo de modo que pelo menos duas alças polipeptídicas são formadas no arcabouço molecular, em que o ligante peptídico compreende a seguinte sequência peptídica:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; onde: Ci, Cii e Ciii representam o primeiro, o segundo e o terceiro resíduos cisteína, respectivamente; 1. subscrito "a" representa um inteiro selecionado dentre 0 ou 1; 2. representa um resíduo de aminoácido aromático não polar selecionado dentre F, W e Y; U representa um resíduo de aminoácido não carregado polar selecionado dentre N, C, Q, M, S e T.

2. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de fórmula (f) compreende uma sequência selecionada de -Ci-(N)a-N/S-F-P-F/Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I- Ciii-(SEQ ID N°: 53).

3. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de fórmula (f) compreende uma sequência selecionada dentre:

4. Ligante peptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais modificações selecionadas dentre: modificações N- terminais e/ou C-terminais; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais (tal como substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos polares por um ou mais aminoácidos isostéricos ou isoeletrônicos; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos por outros aminoácidos isostéricos ou isoeletrônicos não naturais); adição de um grupo espaçador; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxidação por um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxidação; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por uma alanina, substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos por um ou mais resíduos de D-aminoácidos; N- alquilação de uma ou mais ligações amida no ligante peptídico bicíclico; substituição de uma ou mais ligações peptídicas por uma ligação substituta; modificação no comprimento do esqueleto peptídico; substituição do hidrogênio do α-carbono de um ou mais resíduos de aminoácidos por um outro grupo químico, e modificação bio-ortogonal pós-sintética de aminoácidos tais como cisteína, lisina, glutamato e tirosina por reagentes reativos com amina, tiol, ácido carboxílico e fenol adequados.

5. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma ou mais modificações compreendem uma modificação N-terminal, tal como um grupo acetil N-terminal, em particular onde o grupo cisteína N-terminal (Ci) é capeado com anidrido acético.

6. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma ou mais modificações compreende uma modificação C-terminal, tal como um grupo amida C-terminal, em particular amidação do grupo cisteína C-terminal (Ciii).

7. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma ou mais modificações compreendem substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais, tal como substituição de um resíduo prolina por um resíduo de ácido carboxílico de L-azetidina e/ou substituição de um resíduo arginina por um resíduo de N-α-metil arginina ou L-homoarginina.

8. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é um derivado não natural de fórmula (f) compreendendo um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre: -

em que Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L- azetidina, hR e HArg representa um resíduo L-homoarginina e NMeR e NMeArg representa um resíduo N-α-metil arginina; tal como -Ci-S-F-P-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) HArg5) (SEQ ID N°: 56); e

em que Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L- azetidina e hR e HArg representa um resíduo L-homoarginina; em particular -Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06550) Aze3 HArg5) (SEQ ID N°: 58) em que Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L- azetidina e hR e HArg representa um resíduo L-homoarginina.

9. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma ou mais modificações compreendem a adição de um grupo espaçador, tal como adição de um grupo espaçador à cisteína N-terminal (Ci) e/ou à cisteína C-terminal (Ciii).

10. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o grupo espaçador compreende um ou mais grupos sarcosina (adequadamente 3 grupos sarcosina) ligados a dois ou mais resíduos D-arginina (adequadamente 2 resíduos D- arginina).

11. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que é um derivado modificado de fórmula (f) compreendendo um peptídeo tendo uma sequência selecionada dentre:

em que Sar3 representa 3 espaçadores sarcosina, (D-Arg)2 representa 2 resíduos D-arginina, Aze representa um resíduo ácido car- boxílico de L-azetidina e hR e HArg representa um resíduo L-ho- moarginina;

em que Sar3 representa 3 espaçadores sarcosina, (D-Arg)2 representa 2 resíduos D-arginina, Aze representa um resíduo ácido carboxílico de L-azetidina e hR e HArg representa um resíduo L-ho- moarginina.

12. Ligante peptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é selecionado dentre um sal de cloridrato ou acetato.

13. Ligante peptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é específico para calicreína plasmática humana, de rato e/ou de coelho, tal como calicreína plasmática humana e/ou de rato, em particular calicreína plasmática humana.

14. Ligando peptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que está ligado a um anticorpo ou a um fragmento do mesmo.

15. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: o anticorpo ou um fragmento do mesmo é selecionado a partir de uma região constante de cadeia leve (CL) de anticorpo, um domínio de cadeia pesada de CH1 de anticorpo, um domínio de cadeia pesada de CH2 de anticorpo, um domínio de cadeia pesada de CH3 de anticorpo ou qualquer combinação dos mesmos, além de ou mais domínios de região constante; ou o anticorpo ou um fragmento do mesmo compreende a região de dobradiça de um anticorpo; ou o anticorpo ou um fragmento do mesmo compreende uma região Fc de uma molécula de IgG.

16. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende a região entre os domínios CH1 e CH2 de uma molécula de IgG.

17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um ligante peptídico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

18. Ligante peptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, câncer, infecção bacteriana ou viral, distúrbios oftalmológicos e distúrbios autoimunes.

19. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio oftálmico é um edema ocular.

20. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio oftálmico é um distúrbio relacionado com o comprometimento da permeabilidade dos vasos retinianos.

21. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio oftálmico é um edema angioneurótico.

Images