BR112015025699B1 - Ligante de peptídeo específico para calicreína humana e composição compreendendo o mesmo - Google Patents

Abstract

MODULAÇÃO DE ESPECIFICIDADE DE POLIPEPTÍDEO ESTRUTURADO. A invenção descreve ligantes de peptídeo específicos para calicreína de plasma humano.

Description

[001] A presente invenção se relaciona a polipeptídeos que são covalentemente ligados a suportes moleculares, tais como dois ou mais ciclos de peptídeo são subtendidos entre pontos de fixação ao suporte. Em particular, a invenção descreve peptídeos que são específicos para a calicreína de plasma de protease humana, e são modificados em um ou dois ciclos de peptídeo para intensificar potência e/ou resistência à protease.

[002] Os peptídeos cíclicos são capazes de se ligar com alta afinidade e especificidade alvo para proteínas alvos e, consequentemente, são uma classe de molécula atrativa para o desenvolvimento de terapêuticos. De fato, vários peptídeos cíclicos já são usados com sucesso na clínica, como, por exemplo, o peptídeo antibacterial vanco- micina, a droga imunossupressora ciclosporina ou a droga anti-câncer octreotídeo (Driggers, et al., Nat Rev Drug Discov 2008, 7 (7), 608-24). Boas propriedades de ligação resultam de uma superfície de interação relativamente grande formada entre o peptídeo e o alvo, bem como a flexibilidade conformacional reduzida das estruturas cíclicas. Tipicamente, os macrociclos se ligam a superfícies de várias centenas de angstrom quadrado, como, por exemplo, o antagonista CXCR4 de peptídeo cíclico CVX15 (400 A2; Wu, B., et al., Science 330 (6007), 1066-71), um peptídeo cíclico com a ligação de motivo Arg-Gly-Asp a integrina αVb3 (355 A2) (Xiong, J. P., et al., Science 2002, 296 (5565), 151-5), ou o inibidor de peptídeo cíclico upain-1 se ligando a ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (603 A2; Zhao, G., et al., J Struct Biol 2007, 160 (1), 1-10).

[003] Devido a sua configuração cíclica, os macrociclos de peptí- deo são menos flexíveis do que os peptídeos lineares, conduzindo a uma perda menor de entropia sob ligação a alvos, e resultando em uma afinidade de ligação mais alta. A flexibilidade reduzida também conduz a travamento de conformações específicas de alvo, aumentando a especificidade de ligação comparada a peptídeos lineares. Este efeito foi exemplificado por um inibidor potente e seletivo de matriz metaloproteinase 8, MMP-8) que perde sua seletividade sobre outros MMPs quando seu anel foi aberto (Cherney, R. J., et al., J Med Chem 1998, 41 (11), 1749-51). As propriedades de ligação favoráveis alcançadas através de macrociclização são ainda mais pronunciadas em multipeptídeos cíclicos tendo mais do que um anel de peptídeo como, por exemplo, em vancomicina, nisina ou actinomicina.

[004] Equipes de pesquisa diferentes têm previamente ligado po- lipeptídeos com resíduos de cisteína a uma estrutura molecular sintética (Kemp, D. S. and McNamara, P. E., J. Org. Chem, 1985; Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005). Meloen and co-operadores usaram tris(bromometil)benzeno e moléculas relacionadas a ciclização rápida e quantitativa de múltiplos ciclos de peptídeo nos suportes sintéticos para mímicas estruturais de superfícies de proteína (Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005). Métodos para a geração de compostos de droga candidatos no qual referidos compostos são gerados por ligação de cisteína contendo polipeptídeos a um suporte molecular como, por exemplo, tris(bromometil)benzeno, são revelados em WO 2004/077062 e WO 2006/078161.

[005] O WO2004/077062 revela um método de seleção de um composto de droga candidato. Em particular, este documento revela várias moléculas de suporte compreendendo primeiro e segundo grupos reativos, e contendo referido suporte com uma molécula adicional para formar pelo menos duas ligações entre o suporte e a molécula adicional em uma reação de acoplamento.

[006] O WO2006/078161 revela compostos de ligação, compos- tos imunogênicos e peptidomiméticos. Este documento revela a síntese artificial de várias coleções de peptídeos tomadas das proteínas existentes. Estes peptídeos são, em seguida, combinados com um peptídeo sintético constante tendo algumas mudanças de aminoácido introduzidas de modo a produzir bibliotecas combinatoriais. Pela introdução desta diversidade, via a ligação química para separar peptídeos que caracterizam várias mudanças de aminoácido, uma oportunidade aumentada para encontrar a atividade de ligação desejada, é proporcionada. A Figura 1 deste documento mostra uma representação esquemática da síntese de vários construtos de peptídeo de ciclo. Os construtos revelados neste documento dependem de peptídeos funci- onalizados SH, tipicamente compreendendo resíduos de cisteína, e grupos heteroaromáticos no suporte, tipicamente compreendendo substituintes de halogênio benzílico, tais como bis- ou tris- bromofenilbenzeno. Tais grupos reagem para formar uma ligação de tio éter entre o peptídeo e o suporte.

[007] Nós recentemente desenvolvemos uma abordagem combinatorial à base de revelação de fago para gerar e classificar grandes bibliotecas de peptídeos bicíclicos a alvos de interesse (Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7; ver também pedido de patente internacional WO2009/098450). Brevemente, bibliotecas combinatoriais de peptídeos lineares contendo três resíduos de cisteína e duas regiões de seis aminoácidos aleatórios (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys) foram reveladas no fago, e ciclizadas por ligação covalentemente das cadeias laterais de cisteína a uma molécula pequena (tris- (bromometil)benzeno). Peptídeos bicíclicos isolados em seleções de afinidade às proteases humanas catepsina G e Calicreína de plasma (PK) têm constantes inibitórias nanomolares. O melhor inibidor, PK15, inibe PK humana (hPK) com uma Ki de 3 nM. Similaridades das sequências de aminoácido de vários peptídeos bicíclicos isolados suge- rem que ambos ciclos de peptídeo contribuem para a ligação. PK15 não inibe PK de rato (81% de identidade de sequência), nem o fator XIa de serina proteases humanas homólogas (hfXIa; 69% de identidade de sequência), ou trombina (36% de identidade de sequência) na concentração mais alta testada (10 μM) (Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7). Esta descoberta sugere que o inibidor bicíclico é altamente específico, e que outras serinas proteases similares a tripsi- na humana não serão inibidas. Um inibidor peptídico pequeno sintético, tal como PK15 tendo a potência e seletividade alvo acima descritas, tem aplicação potencial como um terapêutico para controlar a atividade de PK em angioedema hereditário, uma doença mortal que é caracterizada por episódios recorrentes de edema, ou para prevenir ativação de contato em cirurgia de by-pass cardiopulmonar.

[008] O peptídeo PK15 foi isolado de uma biblioteca baseada no peptídeo PK2, H-ACSDRFRNCPLWSGTCG-NH2, em que o segundo ciclo de 6-aminoácido foi randomizado. A sequência de PK15 foi H- ACSDRFRNCPADEALCG-NH2, e a constante de ligação IC50 para calicreína humana foi 1,7 nM.

Sumário da Invenção

[009] Nós analisamos reagentes de ligação de calicreína de modo a otimizar afinidade e atividade. Em nosso pedido de patente não publicado copendente PCT/EP2012/069898, ligantes de peptídeo bicí- clicos seletivos que são Inibidores de calicreína de plasma humano foram descritos.

[0010] Em uma concretização descrita no mesmo, os ciclos do li- gante de peptídeo compreendem cinco aminoácidos e um primeiro ciclo compreende o motivo GrxW/FPxK/RGr, no qual Gr é um grupo reativo. No presente contexto, a referência a um "primeiro" ciclo não necessariamente denota uma posição particular do ciclo em uma sequência. Em algumas concretizações, contudo, o primeiro ciclo pode ser ciclo proximal em um amino terminal para sequência de peptídeo carboxi terminal. Por exemplo, o polipeptídeo compreende adicionalmente um segundo ciclo distal que compreende o motivo GrT/LHQ/TxLGr. Exemplos de sequências do primeiro ciclo incluem GrxWPARGr, GrxWPS- RGr, GrxFPFRGr e GrxFPYRGr. Nestes exemplos, x pode ser qualquer aminoácido, mas é, por exemplo, S ou R.

[0011] Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um dos polipeptídeos colocados na Tabela 4, Tabela 5, ou Tabela 6.

[0012] O grupo reativo pode ser um aminoácido reativo. Por exemplo, o aminoácido reativo é cisteína.

[0013] Variantes dos polipeptídeos podem ser preparadas por identificação daqueles resíduos que são disponíveis para mutação e preparação de bibliotecas que incluem mutações naquelas posições. Por exemplo, o polipeptídeo 06-56 na Tabela 4, Figuras 5, 6, pode ser mutado sem perda de atividade nas posições Q4 e T10 (ver Exemplos abaixo). Os ligantes de polipeptídeo compreendendo mutações nestas posições podem ser selecionados, que têm atividade de ligação aperfeiçoada em comparação com 06-56.

[0014] Para um biciclo de inibição de calicreína, é pertinente obter um perfil de estabilidade de protease adequado, tal que ele tem uma baixa eliminação de acionamento de protease no plasma ou outros ambientes relevantes. Em um ensaio de estabilidade de plasma comparativo rápido (Método #1) que observou o desaparecimento progressivo de peptídeo de origem no plasma de rato, foi verificado que a ala- nina N-terminal (que está presente no momento de seleções, e foi ori-ginalmente incluída em peptídeos sintéticos de sequências condutoras) é rapidamente removida através de todos os biciclos de sequência testados por ambos, plasma humano e de rato. Esta degradação foi evitada por sintetização de um candidato condutor que carece ambas de alaninas N- e C-terminal. Para remover pontos de reconhecimento potenciais para amino- e carboxipeptidases, o amino-terminal livre que agora reside em Cys 1 no candidato condutor é coberto com anidrido acético durante síntese de peptídeo, conduzindo a uma molécula que é N-terminalmente acetilatada. Em uma medida igual, a cisteína C- terminal é sintetizada como o amido, de modo a remover um ponto de reconhecimento potencial para carboxipeptidases.

[0015] Desse modo, em um exemplo, os candidatos condutores bicíclicos têm a seguinte sequência genérica: Ac-C1AA1AA2AAnC2AAn+1AAn+2AAn+3C3(TMB)-NH2

[0016] onde "Ac" se refere a acetilação N-terminal, "-NH2" se refere a amidação C-terminal, onde "C1, C2, C3" se referem a primeira, segunda e terceira cisteína na sequência, onde "AA1" a "AAn" se referem à posição do aminoácido (cuja natureza "AA" é definida pelas seleções acima descritas), e onde "(TMB)" indica que a sequência de peptídeo foi ciclizada com TBMB (trisbromometilbenzeno), ou qualquer outro suporte reativo adequado.

[0017] Neste contexto, os peptídeos condutores "Ac-(06-34- 18)(TMB)" e "Ac-(06-34-18)(TMB) Phe2 Tyr4" têm as sequências Ac- CSWPARCLHQDLC-NH2 e Ac-CSFPYRCLHQDLC-NH2, respectiva-mente. Estes podem ser numerados de acordo com o esquema acima como 1) AC-C1S1W2P3A4R5C2L6H7Q8D9L10C3-NH2 denotado como Ac-(06-34-18)(TMB) 2) AC-C1S1F2P3Y4R5C2L6H7Q8D9L10C3-NH2 denotado como Ac-(06-34-18)(TMB) Phe2 Tyr4 onde as cisteínas invariantes são sublinhadas. Estes peptí- deos foram caracterizados em detalhe, e mostram ter potência subnanomolar contra calicreína, com perfis de seletividade muito favoráveis em direção a proteínas homólogas de calicreína, enquanto que retém boa reatividade cruzada em direção a calicreína de rato. O últi- mo é valioso para estabelecer farmacodinâmicas em modelos de animal.

[0018] O peptídeo não modificado Ac-06-34-18(TMB)-NH2 tem uma meia vida de 2,3 horas em plasma de rato, enquanto que aquela de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2 Tyr4 é levemente mais curta, a 0,9 horas (Tabela 1). Em um esforço para identificar o(s) local(is) de reconhecimento proteolítico em Ac-06-34-18(TMB)-NH2, o peptídeo foi amostrado em plasma de rato sobre o tempo (método #1), e cada amostra foi analisada para o aparecimento progressivo de fragmentos de peptídeo usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Isto revelou Arg 5 no Ciclo 1 para ser o local principal de reconhecimento de protease, e subsequente degradação de peptídeo.

[0019] Um processo de síntese química foi suportado para identificar substituintes de Arginina 5 que protegeriam suficientemente o pep- tídeo de degradação de protease de plasma de rato. Foi verificado que a remoção de Arg 5 no ciclo 1, ou substituição da cadeia lateral de Arg com quaisquer entidades químicas não carregadas ou carregadas, intensifica a estabilidade do ligante de peptídeo.

[0020] Além disso, a estabilidade proteolítica é intensificada por modificação química das ligações peptídeo N- ou C-terminalmente adjacentes a Arg 5. A modificação química é, por exemplo, α-N- alquilatação, ou modificação da ligação de peptídeo com sua forma de amida reduzida.

[0021] Em uma concretização, a estabilidade proteolítica é intensificada por obstrução estérica de aminoácidos perto de Arg 5. Por exemplo, a obstrução estérica resulta de a-N-alquilatação.

[0022] Estes candidatos de bipeptídeo cíclico foram, em seguida, avaliados para as seguintes características: 1) manutenção de potência contra calicreína humana (procurando uma Ki de 10 nM ou mais baixa); 2) manutenção de potência contra calicreína do rato (procurando uma Ki de 50 nM ou mais baixa); 3) estabilidade intensificada no plasma de rato (maior t1/2 desejável comparado ao peptídeo tipo selvagem); 4) manutenção de perfil de seletividade contra outras enzimas e proteínas relacionadas calicreína.

[0023] No curso das investigações no PCT/EP2012/069898, foi determinado que as seguintes modificações de Arginina ou mímicos preenchem os 4 critérios acima, estes sendo a) 4-guanidilfenilalanina (4-GuanPhe: t1/2 aumenta no plasma de rato: 1-5 vezes); b) homoarginina (HArg: t1/2 aumenta no plasma de rato: ~2- 5 vezes); e c) α-N-metilarginina (NMe-Arg: t1/2 aumenta no plasma de rato: >10 vezes).

[0024] Nós verificamos que certos aminoácidos não naturais permitem ligação a Calicreína de plasma com nM Ki, enquanto que aumenta o tempo de residência no plasma significantemente. Os dados são resumidos na Tabela 1 e Figura 17.

[0025] Além disso, o PCT/EP2012/069898 também revela uma modificação adicional na posição 3 em 06-34-18, onde a prolina foi substituída com azetidina ácido carboxílico (Aze3). Esta modificação, provavelmente devido a sua maior restrição e entropia reduzida, invariavelmente intensifica a potência de um peptídeo à base de 06-34-18 por um fator de 2 a 5 (Tabela 1). Em combinação com as modificações de intensificação de estabilidade na Arg 5 (especificamente, HArg, NMe-Arg e 4GuanPhe), derivados de bipeptídeo cíclico mais potentes são obtidos.

[0026] Os aminoácidos não naturais exemplares são selecionados de N-metil Arginina, homo-arginina e hidroxiprolina. N-metil e homo- derivados de Arginina são usados para substituir Arginina, e prolina 3 pode ser substituída por, por exemplo, hidroxiprolina, azetidina ácido carboxílico, ou um aminoácido alfa-substituído, tal como ácido aminoi- sobutírico. Em outra concretização, arginina pode ser substituída com guanidil-fenilalanina.

[0027] Em uma concretização, o polipeptídeo compreende um primeiro ciclo que compreende o motivo GrxWPARGr, no qual P é substituído com azetidina ácido carboxílico; e/ou R é substituído com N-metil arginina; e/ou R é substituído com homoarginina; e/ou R é substituído com guanidil-fenilalanina.

[0028] Em uma concretização, o polipeptídeo compreende um primeiro ciclo que compreende o motivo GrxFPYRGr, no qual R é substituído com N-metil arginina; e/ou R é substituído com homoarginina, e no qual prolina é substituída por azetidina ácido carboxílico; e/ou R é substituído com guanidil-fenilalanina.

[0029] Nós agora desenvolvemos as abordagens usadas no PCT/EP2102/069898, e aqui colocadas, conforme aplicado para a otimização do segundo ciclo. De acordo com a presente invenção, nós identificamos um local de reconhecimento de rato adicional no ciclo 2, que está localizado na Histidina 7 na sequência de 06-34-18. Este resíduo é, em particular, reconhecido por proteases contidas em plasma humano ex vivo. Além disso, este local é também reconhecido por proteases ligadas a membrana de rato conforme determinado em um estudo farmacocinético de rato in vivo. Desse modo, para 06-34-18 alcançar um perfil de estabilidade farmacocinético adequado conforme requerido para proposta terapêutica, ambos locais de reconhecimento de rato (Arg 5 no Ciclo 1 e His7 no Ciclo 2) têm que ser estabelecidos tal que o peptídeo é resistente a proteases de plasma humano, e o ambiente proteoliticamente agressivo encontrado ambos em rato e humano in vivo.

[0030] Consequentemente, em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um ligante de peptídeo específico para calicreí- na humana compreendendo um polipeptídeo compreendendo pelo menos três grupos reativos, separados por pelo menos duas sequências de ciclo, e um suporte molecular que forma ligações covalentes com os grupos reativos do polipeptídeo, tal que pelo menos dois ciclos de polipeptídeo são formados no suporte molecular, no qual os ciclos do ligante de peptídeo compreendem cinco aminoácidos e um ciclo compreende o motivo GrT/LHQ/TxLGr.

[0031] No contexto de peptídeo 06-34-18, este ciclo é o segundo ciclo, posicionado C-terminal a um primeiro ciclo.

[0032] Por exemplo, o motivo é GrxHxDLGr, no qual Gr é um grupo reativo. Por exemplo, o motivo GrTHxxLGr.

[0033] Em uma concretização, dois ciclos adjacentes do polipeptí- deo compreendem o motivo GrxW/FPxK/RGrT/LHQ/TDLGr.

[0034] Exemplos de tais polipeptídeos são colocados na Tabela 4, Tabela 5, ou Tabela 6.

[0035] Em um segundo aspecto, a invenção se relaciona a um li- gante de peptídeo conforme descrito no primeiro aspecto da invenção, no qual a remoção de His 7 no ciclo 2, ou substituição da cadeia lateral de histidina com quaisquer entidades químicas não carregadas ou carregadas, intensifica a estabilidade do ligante de peptídeo.

[0036] Por exemplo, a estabilidade proteolítica é intensificada por modificação química das ligações de peptídeo N- ou C-terminalmente adjacentes a His7. A modificação química é, por exemplo, α-N- alquilatação, ou modificação da ligação de peptídeo com sua forma de amida reduzida.

[0037] Em uma concretização, a estabilidade proteolítica é intensificada por obstrução estérica de aminoácidos mais próximos a His 7. Por exemplo, a obstrução estérica resulta da substituição da posição 9 com seu enantiômero D- aminoácido, ou a-N-alquilatação.

[0038] Em outra concretização, a estabilidade proteolítica é intensificada por introdução de aminoácidos estericamente obstrutivos na posição 6. Por exemplo, a estabilidade proteolítica é intensificada por introdução de aminoácidos Cβ-derivatizados, tais como fenilglicina ou ciclohexilglicina na posição 6, que intensifica a potência da sequência de ligante de peptídeo em direção a calicreína de plasma humano, e reduz a hidrólise proteolítica da ligação de peptídeo C-terminal.

[0039] O ensinamento da presente invenção pode ser combinado com o ensinamento do PCT/EP2012/06989, tal que o polipeptídeo, de acordo com a invenção, pode compreender um primeiro ciclo que compreende o motivo GrxWPARGr ou GrxFPYRGr, e um segundo ciclo compreendendo o motivo GrT/LHQ/TxLGr.

[0040] Em um exemplo, no primeiro ciclo, Pro 3 é substituído com azetidina ácido carboxílico; e/ou Arg 5 é substituído com N-metil argi- nina; e/ou Arg 5 é substituído com homoarginina; e/ou Arg 5 é substituído com guanidilfenilalanina.

Breve descrição das figuras

[0041] Figura 1 Seleção de fago de bipeptídeos cíclicos. (a) Bibliotecas de fago de bipeptídeo cíclico. Os aminoácidos aleatórios são indicados como 'X', alanina como 'A', e os três resíduos de cisteína constantes como 'C'. (b) Formato de estruturas de bipeptídeo cíclico quimicamente sintetizado tendo ciclos de 3, 5 ou 6 aminoácidos. As estruturas são geradas por ligação de peptídeos lineares, via três cadeias laterais de cisteína para tris-(bromometil)benzeno (TBMB). Os aminoácidos que variam nos bipeptídeos cíclicos são indicados com 'Xaa'. (c-e) Sequências de bipeptídeos cíclicos isolados da biblioteca 5x5 (c), biblioteca 3x3 A (d) e biblioteca 3x3 B (e). Similaridades nos aminoácidos são realçadas por sombreamento.

[0042] Figura 2 Comparação dos aminoácidos superficiais de hPK e serina proteases homólogas. (a) Estrutura de hPK (PDB entrada 2ANW) com representação superficial. Átomos de aminoácidos sendo expostos à superfície e mais próximos do que 4, 8 e 12 Â para benza- midina (em cinza) ligada ao pacote S1 são manchados mais escuramente. (b) Estrutura de hPK. As cadeias laterais de aminoácidos que são diferentes em hfXIa são realçadas. (c) Estrutura de hPK. As cadeias laterais de aminoácidos que são diferentes em rPK são realçadas.

[0043] Figura 3 Representação pictorial do método usado para determinação de resíduos preferidos para mutação em ligantes de po- lipeptídeo.

[0044] Figura 4 Análise de substituições de aminoácido no peptí- deo 06-34 (Tabela 4) na ligação do peptídeo para calicreína de plasma a 2 nM. Para cada posição, o efeito de várias mutações naquela posição é mostrado, em comparação à sequência de origem.

[0045] Figura 5 Análise de substituições de aminoácido no peptí- deo 06-56 (Tabela 4) na ligação do peptídeo para Calicreína de plasma a 2 nM. Para cada posição, o efeito de várias mutações naquela posição é mostrado, em comparação a sequência de origem.

[0046] Figura 6 Análise de substituições de aminoácido no peptí- deo 06-56 (Tabela 4) na ligação do peptídeo a calicreína de plasma a 10 nM. Para cada posição, o efeito de várias mutações naquela posição é mostrado, em comparação a sequência de origem.

[0047] Figura 7 Saída espectrométrica de massa mostrando o espectro de massa de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 após expressão a 35% de plasma de rato, a t0, 1 dia, 2 dias e 3 dias (método #1). As precisões de massa variam um tanto devido a íons de interferência e baixas concentrações de fragmentos; contudo, identificação de fragmentos prote- olíticos discretos é possível.

[0048] Figura 8 Estruturas químicas de metabólitos M1, M2, M3 de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 identificadas após exposição a plasma de rato.

[0049] Figura 9 Estrutura de rato do Ac-06-34-18(TMB)-NH2 condutor.

[0050] Figura 10 Ensaio de inibição de enzima de Calicreína pelo Ac-06-34-18(TMB)-NH2 condutor e seus derivados misturados de 1° ciclo. Uma redução dramática na afinidade é observada, sublinhando- se a importância da integridade do farmacóforo de WPAR.

[0051] Figura 11 Estruturas químicas de arginina e seus análogos.

[0052] Figura 12 Estruturas químicas de Trp e análogos hidrofóbi- cos potenciais.

[0053] Figura 13 Estruturas químicas de Pro e análogos restritos potenciais.

[0054] Figura 14 Inibição comparativa de Calicreína por Aze3, NMeArg 5 e Ac-06-34-18(TMB)-NH2 duplamente modificado.

[0055] Figura 15 Estruturas químicas de Alanina e derivados destes.

[0056] Figura 16 Inibição comparativa de Calicreína por F2Y4, F2Y4 HR5 e Ac-06-34-18(TMB)-NH2 duplamente modificado.

[0057] Figura 17 Estruturas químicas de modificações de Ciclo 1 em Ac-(06-34-18) que concede estabilidade favorável de plasma de rato e/ou intensificação de potência (Aze3 no lugar de Pro3, 4GuanPhe no lugar de Arg 5, HArg no lugar de Arg 5, NMe-Arg 5 no lugar de Arg 5).

[0058] Figura 18a Peptídeo tipo selvagem é submetido a plasma humana. Nota-se o aparecimento de fragmentos com His7-Gln8, Leu6, e Leu6-His7-Gln8 removidos. Devido à natureza de MALDI-TOF, a intensidade dos sinais não é quantitativa. Os locais de hidrólise possíveis na sequência são indicados com as setas no diagrama, com a direção de degradação subsequente indicada pelas setas horizontais acima da sequência.

[0059] Figura 18b Arg 5 N-metilatda 06-34-18 é submetida a plasma humana. Este peptídeo tem estabilidade intensificada no plasma de rato. No plasma humana, contudo, o peptídeo não é estável, conforme exemplificado pelo aparecimento de fragmentos carecendo de His7-Gln8, Leu6, e Leu6-His7-Gln8 no Ciclo 2. Devido à natureza de MALDI-TOF, a intensidade dos sinais não é quantitativa.

[0060] Figura 19a Estrutura química de Ciclo 2 de 06-34-18

[0061] Figura 19b Sumário de estruturas empregadas na posição 6 no Ciclo 2. Os acrônimos de aminoácido não padronizados são definidos nos Métodos e Tabela 7.

[0062] Figura 19c Sumário de estruturas empregadas na posição 7 no Ciclo 2. Os acrônimos de aminoácido não padronizados são definidos nos Métodos e Tabela 7.

[0063] Figura 19d Sumário de estruturas empregadas na posição 8 no Ciclo 2. Os acrônimos de aminoácido não padronizados são definidos nos Métodos e Tabela 7.

[0064] Figura 20a Estrutura de N-His Peptoide dentro do Ciclo 2 de 06-34-18. Uma cadeia homolateral de histidina foi introduzida no Nα, enquanto que Cα perde seu centro quiral.

[0065] Figura 20b Estrutura da amida reduzida entre posição 6 e 7 no Ciclo 2 de 06-34-18. O metileno no lugar do carbonil remove a ligação de peptídeo.

[0066] Figura 21a Estabilidade comparativa de tipo selvagem (0634-18) a t = 0, 21 e 46 horas em plasma humana.

[0067] Figura 21b Estabilidade comparativa de tipo selvagem (0634-18) a t = 0, 21 e 46 horas em plasma de rato.

[0068] Figura 21c Estabilidade comparativa de (06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 D-Asp9 a t = 0, 21 e 46 horas em plasma humana.

[0069] Figura 21d Estabilidade comparativa de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 a t = 0, 21 e 46 horas em plasma humana.

[0070] Figura 21e Estabilidade comparativa de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 a t = 0, 21 e 46 horas em plasma de rato.

[0071] Figura 22 Estrutura química total de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6- Todos os aminoácidos estão na forma L-enantiomérica.

[0072] Figura 23 Análise farmacocinética de peptídeos Ac-(06-3418) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 e Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 D-Asp9 comparada a proteoliticamente estável, mas far- macocineticamente inerte todo D-enantiômero de Ac-(06-34-18). Nota- se que a eliminação de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 está se assemelhando proximamente àquela do peptí- deo de controle de D aminoácido "Ac-(06-34-18) todo D". As linhas tracejadas horizontais indicam o limite de quantificação para cada um dos respectivos peptídeos.

Descrição Detalhada da Invenção

[0073] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados conforme comumente compreendidos por aqueles técnicos no assunto, tal como nas técnicas de química de peptídeo, cultura de célula e revelação de fago, química de ácido nucleico e bioquímica. Técnicas padrões são usadas para biologia molecular, métodos genéticos e bioquímicos (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.), que são aqui incorporados por referência.

[0074] Um ligante de peptídeo, conforme referido aqui, se refere a um peptídeo covalentemente ligado a um suporte molecular. Tipicamente, tais peptídeos compreendem dois ou mais grupos reativos que são capazes de formarem ligações covalentes para o suporte, e uma sequência subtendida entre referidos grupos reativos que é referida como a sequência de ciclo, visto que ela forma um ciclo quando o pep- tídeo é ligado ao suporte. No presente caso, os peptídeos compreendem pelo menos três grupos reativos, e formam pelo menos dois ciclos no suporte.

[0075] Os grupos reativos são grupos capazes de formarem uma ligação covalente com o suporte molecular. Tipicamente, os grupos reativos estão presentes nas cadeias laterais de aminoácido no peptí- deo. Exemplos são grupos contendo amino, tais como cisteína, lisina e selenocisteína.

[0076] Especificidade, no contexto aqui, se refere a capacidade de um ligante se ligar ou, de outro modo, interagir com seu alvo cognato para a exclusão de entidades que são similares ao alvo. Por exemplo, a especificidade pode se referir a capacidade de um ligante inibir a interação de uma enzima humana, mas não uma enzima homóloga de uma espécie diferente. Usando a abordagem aqui descrita, a especificidade pode ser modulada, que é aumentada ou diminuída, de modo a tornar os ligantes mais ou menos capazes de interagirem com homólogos ou parálogos do alvo pretendido. A especificidade não é pretendida para ser sinônimo com atividade, afinidade ou avidez, e a potência da ação de um ligante em seu alvo (tal como, por exemplo, afinidade de ligação ou nível de inibição) não são necessariamente relacionados a sua especificidade.

[0077] Atividade de ligação, conforme aqui usado, se refere a medições de ligação quantitativas tomadas de ensaios de ligação, por exemplo, conforme aqui descrito. Portanto, a atividade de ligação se refere a quantidade de ligante de peptídeo que é ligada a uma dada concentração alvo.

[0078] Multiespecificidade é a capacidade de se ligar a dois ou mais alvos. Tipicamente, peptídeos de ligação são capazes de se ligarem a um alvo simples, tal como um epítopo no caso de um anticorpo, devido a suas propriedades conformacionais. Contudo, os peptídeos podem ser desenvolvidos, que podem se ligar a dois ou mais alvos; anticorpos específicos alvos, por exemplo, conforme conhecido na técnica conforme referido acima. Na presente invenção, os ligantes de peptídeo podem ser capazes de se ligarem a dois ou mais alvos, e são, portanto, para serem multiespecíficos. Por exemplo, eles se ligam a dois alvos, e são específicos duplos. A ligação pode ser independente, que significaria que os locais de ligação para o alvo no peptídeo não são estruturalmente impedidos pela ligação de um ou outro dos alvos. Neste caso, ambos alvos podem ser ligados independentemente. Mais geralmente, é esperado que a ligação de um alvo impedirá pelo menos parcialmente a ligação do outro.

[0079] Existe uma diferença fundamental entre um ligante específico duplo e um ligante com especificidade que envolve dois alvos relacionados. No primeiro caso, o ligante é específico para ambos os alvos individualmente, e interagem entre si em uma maneira específica. Por exemplo, um primeiro ciclo no ligante pode se ligar a um primeiro alvo, e um segundo ciclo a um segundo alvo. No segundo caso, o ligante é não específico porque ele não se diferencia entre os dois alvos, por exemplo, por interação com um epítopo dos alvos que é comum a ambos.

[0080] No contexto da presente invenção, é possível que um ligan- te que tem atividade em relação de, por exemplo, um alvo e um ortólo- go, possa ser um ligante biespecífico. Contudo, em uma concretização, o ligante é não biespecífico, mas tem uma especificidade menos precisa, tal que ele se liga a ambos o alvo e o um ou mais ortólogos. Em geral, um ligante que não foi selecionado contra ambos um alvo e seu ortólogo é menos provável de ser biespecífico como um resultado de modulação de comprimento de ciclo.

[0081] Se os ligantes são verdadeiramente biespecíficos, em uma concretização, pelo menos uma das especificidades de alvo dos ligan- tes será comum contra os ligantes selecionados, e o nível daquela especificidade pode ser modulado pelos métodos aqui revelados. Segundas especificidades ou especificidades adicionais não necessitam serem compartilhadas, e não necessitam serem o objetivo dos procedimentos aqui colocados.

[0082] Um alvo é uma molécula ou parte desta a qual os ligantes de peptídeo se ligam, ou, de outro modo, interagem. Embora a ligação seja vista como um pré-requisito para atividades de muitos tipos, e possa ser uma atividade em si, outras atividades são consideradas. Desse modo, a presente invenção não requer a medição de ligação diretamente ou indiretamente.

[0083] O suporte molecular é qualquer molécula que é capaz de conectar o peptídeo em pontos múltiplos para conceder uma ou mais características estruturais ao peptídeo. Ele não é um reticulador, em que ele não substitui meramente uma ligação de disulfito; ao invés, ele proporciona dois ou mais pontos de fixação para o peptídeo. Adequadamente, o suporte molecular compreende pelo menos três pontos de fixação para o peptídeo, referidos como grupos reativos de suporte. Estes grupos são capazes de reagirem aos grupos reativos no peptí- deo para formar uma ligação covalente. Estruturas preferidas para suportes moleculares são descritas abaixo.

[0084] A classificação para atividade de ligação (ou qualquer outra atividade desejada) é conduzida de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, de tecnologia de revelação de fago. Por exemplo, alvos imobilizados a uma fase sólida podem ser usados para identificar e isolar membros de ligação de um repertório. A classificação permite seleção de membros de um repertório de acordo com ca- racterísticas desejadas.

[0085] O termo biblioteca se refere a uma mistura de polipeptídeos ou ácidos nucleicos heterogêneos. A biblioteca é composta de membros, que não são idênticos. A esta extensão, biblioteca é sinônimo de repertório. As diferenças de sequência entre membros de biblioteca são responsáveis pela diversidade presente na biblioteca. A biblioteca pode tomar a forma de uma mistura simples de polipeptídeos ou ácidos nucleicos, ou pode estar na forma de organismos ou células, por exemplo, bactéria, vírus, células de animal ou de planta, e similares, transformadas com uma biblioteca de ácidos nucleicos. Sob algumas condições, cada organismo individual ou célula contém somente um ou um número limitado de membros de biblioteca.

[0086] Em uma concretização, os ácido nucleicos são incorporados em vetores de expressão, de modo a permitir expressão dos poli- peptídeos codificados pelos ácidos nucleicos. Em um aspecto preferido, portanto, uma biblioteca pode tomar a forma de uma população de organismos hospedeiros, cada organismo contendo uma ou mais cópias de um vetor de expressão contendo um membro único da biblioteca na forma de ácido nucleico que pode ser expresso para produzir seu correspondente membro de polipeptídeo. Desse modo, a população de organismos hospedeiros tem o potencial de codificar um grande repertório de variantes de polipeptídeo geneticamente diversas.

[0087] Em uma concretização, uma biblioteca de ácidos nucleicos codifica um repertório de polipeptídeos. Cada membro de ácido nuclei- co da biblioteca tipicamente tem uma sequência relacionada a um ou mais outros membros da biblioteca. Por sequência relacionada é significativo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 50% de identidade, por exemplo, pelo menos 60% de identidade, por exemplo, pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 80% de identidade, por exemplo, pelo menos 90% de identidade, por exemplo, pelo menos 95% de identidade, por exemplo, pelo menos 98% de identidade, por exemplo, pelo menos 99% de identidade, para pelo menos um outro membro da biblioteca. A identidade pode ser julgada através de um segmento contíguo de pelo menos 3 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 12 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 14 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 16 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 17 aminoácidos, ou o comprimento total da sequência de referência.

[0088] Um repertório é uma coleção de variantes, neste caso, variantes de polipeptídeo, que diferem em sua sequência. Tipicamente, a localização e natureza dos grupos reativos não variarão, mas as sequências que formam os ciclos entre eles podem ser randomizadas. Os repertórios diferem em tamanho, mas devem ser considerados para compreender pelo menos 102 membros. Os repertórios de 1011 ou mais membros podem ser construídos.

[0089] Um conjunto de ligantes de polipeptídeo, conforme aqui usado, se refere a uma pluralidade de ligantes de polipeptídeo que podem ser submetidos a seleção nos métodos descritos. Potencialmente, um conjunto pode ser um repertório, mas pode também ser uma pequena coleção de polipeptídeos, de pelo menos 2 até 10, 20, 50, 100 ou mais.

[0090] Um grupo de ligantes de polipeptídeo, conforme aqui usado, se refere a dois ou mais ligantes. Em uma concretização, um grupo de ligantes compreende somente ligantes que compartilham pelo menos uma especificidade alvo. Tipicamente, um grupo consistirá de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, 20, 50, 100 ou mais ligantes. Em uma concretização, um grupo consiste de 2 ligantes.

(A) Construção de Ligantes de Peptídeo (i) Suporte molecular

[0091] Suportes moleculares são descritos em, por exemplo, WO2009098450 e referências aqui citadas no mesmo, particularmente, WO2004077062 e WO2006078161.

[0092] Conforme notado nos documentos precedentes, o suporte molecular pode ser uma molécula pequena, tal como uma molécula orgânica pequena.

[0093] Em uma concretização, o suporte molecular pode ser, ou pode ser baseado em, monômeros naturais, tais como nucleosídeos, açúcares, ou esteroides. Por exemplo, o suporte molecular pode compreender um polímero curto de tais entidades, tal como um dímero ou um trímero.

[0094] Em uma concretização, o suporte molecular é um composto de toxicidade conhecida, por exemplo, de baixa toxicidade. Exemplos de compostos adequados incluem colesteróis, nucleotídeos, esteroi- des, ou drogas existentes, tal como tamazepam.

[0095] Em uma concretização, o suporte molecular pode ser uma macromolécula. Em uma concretização, o suporte molecular é uma macromolécula composta de aminoácidos, nucleotídeos, ou hidratos de carbono.

[0096] Em uma concretização, o suporte molecular compreende grupos reativos que são capazes de reagirem com grupo(s) funcio- nal(is) do polipeptídeo para formar ligações covalentes.

[0097] O suporte molecular pode compreender grupos químicos como aminas, tióis, álcoois, cetonas, aldeídos, nitrilas, ácidos carboxí- licos, ésteres, alquenos, alquinos, azidas, anidridos, succinimidas, ma- leimidas, haletos de alquila, e haletos de acila.

[0098] Em uma concretização, o suporte molecular pode compreender ou pode consistir de tris(bromometil)benzeno, especialmente 1,3,5-Tris(bromometil)benzeno (‘TBMB’), ou um derivado destes.

[0099] Em uma concretização, o suporte molecular é 2,4,6- Tris(bromometil)mesitileno. Ele é similar a 1,3,5- Tris(bromometil)benzeno, mas contém adicionalmente três grupos me- til fixados ao anel benzeno. Isto tem a vantagem que os grupos metil adicionais podem formar contatos adicionais com o polipeptídeo e, consequentemente, adiciona restrição estrutural adicional.

[00100] O suporte molecular da invenção contém grupos químicos que permitem que os grupos funcionais do polipeptídeo da biblioteca codificada da invenção formem ligações covalentes com o suporte molecular. Referidos grupos químicos são selecionados de uma ampla faixa de funcionalidades incluindo aminas, tióis, álcoois, cetonas, aldeídos, nitrilas, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, anidri- dos, succinimidas, maleimidas, azidas, haletos de alquila, e haletos de acila.

(ii) Polipeptídeo

[00101] Os grupos reativos dos polipeptídeos podem ser proporcionados por cadeias laterais de aminoácidos naturais ou não naturais. Os grupos reativos dos polipeptídeos podem ser selecionados de grupos tiol, grupos amino, grupos carboxila, grupos guanidinium, grupos fenólicos ou grupos hidroxil. Os grupos reativos dos polipeptídeos podem ser selecionados de grupos azida, ceto-carbonila, alquino, vinila, ou haleto de arila. Os grupos reativos dos polipeptídeos para ligação a um suporte molecular podem ser os amino ou carboxi terminais do po- lipeptídeo.

[00102] Em algumas concretizações, cada um dos grupos reativos do polipeptídeo para ligação a um suporte molecular é do mesmo tipo. Por exemplo, cada grupo reativo pode ser um resíduo de cisteína. Detalhes adicionais são proporcionados em WO2009098450.

[00103] Em algumas concretizações, os grupos reativos para ligação a um suporte molecular podem compreender dois ou mais tipos diferentes, ou podem compreender três ou mais tipos diferentes. Por exemplo, os grupos reativos podem compreender dois resíduos de cis- teína e um resíduo de lisina, ou podem compreender um resíduo de cisteína, um resíduo de lisina, e uma amina N-terminal.

[00104] A cisteína pode ser empregada porque ela tem a vantagem que sua reatividade é mais diferente de todos os outros aminoácidos. Os grupos reativos de suporte que podem ser usados no suporte molecular para reagirem com grupos tiol de cisteínas são haletos de alquila (ou também denominados halogenoalcanos ou haloalcanos). Exemplos são bromometilbenzeno (o grupo reativo de suporte exemplificado por TBMB), ou iodoacetamida. Outros grupos reativos de suporte que são usados para acoplar seletivamente compostos a cisteí- nas em proteínas são maleimidas. Exemplos de maleimidas que podem ser usados como suportes moleculares na invenção incluem: tris- (2-maleimidoetil)amina, tris-(2-maleimidoetil)benzeno, tris- (maleimido)benzeno. Selenocisteína é também um aminoácido natural que tem uma reatividade similar a cisteína, e pode ser usada para as mesmas reações. Desse modo, sempre que cisteína é mencionada, ela é tipicamente aceitável para substituir selenocisteína, a menos que o contexto sugira de outro modo.

[00105] Lisinas (e aminas primárias do N-terminal de peptídeos) são também adequadas como grupos reativos para modificar peptí- deos em fago por ligação a um suporte molecular. Contudo, elas são mais abundantes em proteínas de fago do que cisteínas, e existe um risco mais alto que partículas de fago possam se tornar reticuladas, ou que elas possam perder sua infectividade. Não obstante, verificou-se que lisinas são especialmente úteis em reações intramoleculares (por exemplo, quando um suporte molecular já está ligado ao peptídeo de fago) para formar uma segunda ou ligação consecutiva com o suporte molecular. Neste caso, o suporte molecular reage preferencialmente com lisinas do peptídeo revelado (em particular, lisinas que estão em proximidade íntima). Os grupos reativos de suporte que reagem seleti- vamente com aminas primárias são succinimidas, aldeídos ou haletos de alquila. No grupo bromometil que é usado em um número dos exemplos acompanhantes, os elétrons do anel de benzeno podem estabilizar o estado de transição catiônico. Este haleto de arila particular é, portanto, 100-1000 vezes mais reativo do que os haletos de alquila. Exemplos de succinimidas para uso como suporte molecular incluem tris-(succinimidil aminotriacetato), 1,3,5-Ácido benzenotriacético. Exemplos de aldeídos para uso como suporte molecular incluem Tri- formilmetano. Exemplos de haletos de alquila para uso como suporte molecular incluem 1,3,5-Tris(bromometil)-2,4,6-trimetilbenzeno, 1,3,5- Tris(bromometil) benzeno, 1,3,5-Tris(bromometil)-2,4,6-trietilbenzeno.

[00106] Os aminoácidos com grupos reativos para ligação a um suporte molecular podem estar localizados em quaisquer posições adequadas dentro do polipeptídeo. De modo a influenciar as estruturas particulares ou ciclos criados, as posições dos aminoácidos tendo os grupos reativos podem ser variadas pelo operador técnico, por exemplo, por manipulação do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de modo a mudar o polipeptídeo produzido. Por tais meios, o comprimento do ciclo pode ser manipulado de acordo com o presente ensinamento.

[00107] Por exemplo, o polipeptídeo pode compreender a sequência AC(X)nC(X)mCG, no qual X suporta um aminoácido natural aleatório, A para alanina, C para cisteína e G para glicina e n e m, que podem ser os mesmos ou diferentes, são números entre 3 e 6.

(iii) Grupos reativos do polipeptídeo

[00108] O suporte molecular da invenção pode ser ligado ao poli- peptídeo, via grupos funcionais ou grupos reativos no polipeptídeo. Estes são tipicamente formados a partir das cadeias laterais de ami- noácidos particulares encontrados no polímero de polipeptídeo. Tais grupos reativos podem ser uma cadeia lateral de cisteína, uma cadeia lateral de lisina, ou um grupo amina N-terminal, ou qualquer outro grupo reativo adequado. Novamente, detalhes podem ser encontrados em WO2009098450.

[00109] Exemplos de grupos reativos de aminoácidos naturais são o grupo de cisteína tiol, o grupo de lisina amino, o grupo carboxil de aspartato, ou glutamato, o grupo guanidinium de arginina, o grupo fe- nólico de tirosina, ou o grupo hidroxil de serina. Os aminoácidos não naturais podem proporcionar uma ampla faixa de grupos reativos incluindo uma azida, um ceto-carbonila, um alcino, um vinila, ou um grupo de haleto de arila. O grupo amino e carboxil dos terminais do polipep- tídeo pode também servir como grupos reativos para formar ligações covalentes a um suporte molecular/núcleo molecular.

[00110] Os polipeptídeos da invenção contêm pelo menos três grupos reativos. Referidos polipeptídeos podem também conter quatro ou mais grupos reativos. Os grupos mais reativos são usados, os mais ciclos podem ser formados no suporte molecular.

[00111] Em uma concretização preferida, os polipeptídeos com três grupos reativos são gerados. A reação de referidos polipeptídeos com um suporte molecular/núcleo molecular tendo uma simetria rotacional três vezes, gera um isômero de produto simples. A geração de um isômero de produto simples é favorável por várias razões. Os ácidos nucleicos das bibliotecas de composto codificam somente as sequências primárias do polipeptídeo, mas não o estado isomérico das moléculas que são formadas após a reação do polipeptídeo com o núcleo molecular. Se somente um isômero de produto pode ser formado, a distribuição do ácido nucleico ao isômero de produto é claramente definida. Se isômeros de produto múltiplos são formados, o ácido nuclei- co não pode dar informação sobre a natureza do isômero de produto que foi isolado em um processo de classificação ou seleção. A formação de um isômero de produto simples é também vantajosa se um membro específico de uma biblioteca da invenção é sintetizado. Neste caso, a reação química do polipeptídeo com o suporte molecular suporta um isômero de produto simples preferivelmente do que uma mistura de isômeros.

[00112] Em outra concretização da invenção, os polipeptídeos com quatro grupos reativos são gerados. A reação de referidos polipeptí- deos com um suporte molecular/núcleo molecular tendo uma simetria tetrahedral gera dois isômeros de produto. Mesmo através dos dois isômeros de produto diferentes são codificados por um e o mesmo ácido nucleico, a natureza isomérica do isômero isolado pode ser determinada por sintetização química de ambos os isômeros, separando os dois isômeros e testando ambos os isômeros para ligação a um li- gante alvo.

[00113] Em uma concretização da invenção, pelo menos um dos grupos reativos dos polipeptídeos é ortogonal aos grupos reativos remanescentes. O uso de grupos reativos ortogonais permitem o direcionamento de referidos grupos reativos ortogonais a locais específicos do núcleo molecular. As estratégias de ligação envolvendo grupos reativos ortogonais podem ser usadas para limitar o número de isômeros de produto formados. Em outras palavras, pela escolha de grupos reativos distintos ou reativos para uma ou mais das pelo menos três liga-ções para aquelas escolhidas do restante das pelo menos três ligações, uma ordem particular de ligação ou direcionamento de grupos reativos específicos do polipeptídeo para posições específicas no suporte molecular podem ser utilmente alcançadas.

[00114] Em outra concretização, os grupos reativos do polipeptídeo da invenção são reagidos com ligadores moleculares no qual referidos ligadores são capazes de reagirem com um suporte molecular, de modo que o ligador intervirá entre o suporte molecular e o polipeptídeo no estado final ligado.

[00115] Em algumas concretizações, os aminoácidos dos membros das bibliotecas ou conjuntos de polipeptídeos podem ser substituído por qualquer aminoácido natural ou não natural. Excluídos destes ami- noácidos trocáveis estão os aminoácidos que abrigam grupos funcionais para reticulação dos polipeptídeos a um núcleo molecular, tal que as sequências de ciclo sozinhas são trocáveis. As sequências de poli- peptídeos trocáveis têm ou sequências aleatórias, sequências constantes, ou sequências com aminoácidos aleatórios e constantes. Os aminoácidos com grupos reativos são localizados em posições definidas dentro do polipeptídeo, visto que a posição destes aminoácidos determina o tamanho do ciclo.

[00116] Em uma concretização, um polipeptídeo com três grupos reativos têm a sequência (X)lY(X)mY(X)nY(X)o, no qual Y representa um aminoácido com um grupo reativo, X representa um aminoácido aleatório, m e n são números entre 3 e 6 definindo o comprimento de segmentos de polipeptídeo de intervenção, que podem ser os mesmos ou diferentes, e l e o são números entre 0 e 20 definindo o comprimento de segmentos de polipeptídeo de flanqueamento.

[00117] Alternativas para conjugações mediadas por tiol podem ser usadas para fixar o suporte molecular ao peptídeo, via interações covalentes. Alternativamente, estas técnicas podem ser usadas na modificação ou fixação de frações adicionais (tal como moléculas pequenas de interesse que são distintas do suporte molecular) ao polipeptídeo após elas terem sido selecionadas ou isoladas de acordo com a presente invenção - nesta concretização em seguida claramente a fixação não necessita ser covalente, e pode envolver fixação não covalente. Estes métodos podem ser usados ao invés de (ou em combinação com) os métodos mediados por tiol por produção de fago que revela proteínas e peptídeos que suportam aminoácidos não naturais com os grupos reativos químicos requisitados, em combinação com moléculas pequenas que suportam o grupo reativo complementar, ou por incorporação dos aminoácidos não naturais em um polipeptídeo quimicamente ou recombinantemente sintetizado quando a molécula está sendo produzida após a fase de seleção/isolamento. Detalhes adicionais podem ser encontrados em WO2009098450 ou Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7.

(iv) Combinação de ciclos para formar moléculas multiespecíficas

[00118] Ciclos de ligantes de peptídeo, ou repertórios de ligantes de peptídeo, são vantajosamente combinados por sequenciamento e de novo síntese de um polipeptídeo incorporando os ciclos combinados. Alternativamente, os ácidos nucleicos que codificam tais polipeptídeos podem ser sintetizados.

[00119] Onde os repertórios são para serem combinados, repertórios de ciclo particularmente simples, os ácidos nucleicos que codificam os repertórios, são vantajosamente digeridos e re-ligados, para formar um novo repertório tendo combinações diferentes de ciclos a partir dos repertórios constituintes. Os vetores de fago podem incluir poliligadores e outros locais para enzimas de restrição que podem proporcionar pontos únicos para corte e relegação dos vetores, para criar os ligantes de peptídeo miltiespecíficos desejados. Métodos para manipulação de bibliotecas de fago são bem conhecidos em relação aos anticorpos, e podem ser aplicados no presente caso também.

(v) Fixação de Grupos Efetores e Grupos Funcionais

[00120] Grupos efetores e/ou funcionais podem ser fixados, por exemplo, aos N ou C terminais do polipeptídeo, ou ao suporte molecular.

[00121] Os grupos efetores apropriados incluem anticorpos e partes ou fragmentos destes. Por exemplo, um grupo efetor pode incluir uma região constante de cadeia leve de anticorpo (CL), um domínio de cadeia pesada CH1 de anticorpo, um domínio de cadeia pesada CH2 de anticorpo, um domínio de cadeia pesada CH3 de anticorpo, ou qualquer combinação destes, em adição ao um ou mais domínios de região constante. Um grupo efetor pode também compreender uma região de articulação de um anticorpo (tal uma região normalmente sendo encontrada entre os domínios CH1 e CH2 de uma molécula de IgG).

[00122] Em uma concretização preferida adicional deste aspecto da invenção, um grupo efetor de acordo com a presente invenção é uma região Fc de uma molécula de IgG. Vantajosamente, um ligante de peptídeo-grupo efetor, de acordo com a presente invenção, compreende ou consiste de uma fusão Fc de ligante de peptídeo tendo uma meia vida tβ de um dia ou mais, dois dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais, ou 7 dias ou mais. Mais vantajosamente, o ligante de peptídeo de acordo com a presente invenção compreende ou consiste de uma fusão Fc de ligante de peptí- deo tendo uma meia vida tβ de um dia ou mais.

[00123] Os grupos funcionais incluem, em geral, grupos de ligação, drogas, grupos reativos para a fixação de outras entidades, grupos funcionais que auxiliam a captação dos macropeptídeos cíclicos nas células, e similares.

[00124] A capacidade dos peptídeos penetrarem nas células permitirá que os peptídeos contra alvos intracelulares sejam efetivos. Os alvos que podem ser acessados pelos peptídeos com a capacidade de penetrarem nas células incluem fatores de transcrição, moléculas de sinalização intracelulares, tais como tirosina quinases, e moléculas envolvidas na trajetória apoptótica. Os grupos funcionais que capacitam a penetração de células incluem peptídeos ou grupos químicos que foram adicionados ou ao peptídeo, ou ao suporte molecular. Os peptí- deos tais como aqueles derivados de tais VP22, HIV-Tat, uma proteína homeobox de Drosophila (Antennapedia), por exemplo, conforme descrito em Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, p821 "Cell-penetrating peptides in drug development: enabling intracellular targets" e "Intracellular delivery of large molecules e small peptides by cell penetrating peptides" por Gupta et al. em Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637. Exemplos de peptídeos curtos que se mostraram serem eficientes na translocalização através de membranas de plasma incluem os 16 ami- noácido de pepetídeo penetratina de proteína Drosophila Antennape- dia (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444 ‘’The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes’’), os 18 aminoácido ‘peptídeo modelo anfifático’ (Oeh- lke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127 "Cellular uptake of an alpha-helical amphipathic model peptide with the potential to deliver polar compounds into the cell interior non-endocytically’’), e regiões ricas em arginina da proteína HIV TAT. Abordagens não peptí- dicas incluem o uso de miméticos de molécula pequena ou SMOCs que podem ser facilmente fixados a biomoléculas (Okuyama et al (2007) Nature Métodos Volume 4 p153 ‘Small-molecule mimics of an a-helix for efficient transport of proteins into cells’. Outras estratégias químicas para adicionar grupos guanidinium às moléculas também intensificam penetração da célula (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585 "Guanidinylated Neomcyin Delivers Large Bioactive Cargo into cells through a heparin Sulphate Dependent Pathway"). As moléculas de peso molecular pequenas, tais como esteroides, podem ser adicionadas ao suporte molecular para intensificar a captação nas células.

[00125] Uma classe de grupos funcionais que pode ser fixada aos ligantes de peptídeo inclui anticorpos e fragmentos de ligação destes, tais como Fab, Fv, ou fragmentos de domínio simples. Em particular, os anticorpos que se ligam a proteínas capazes de aumentarem a meia vida do ligante de peptídeo in vivo podem ser usados.

[00126] Os peptídeos RGD, que se ligam a integrinas que estão presentes em muitas células, podem também serem incorporados.

[00127] Em uma concretização, um grupo ligante de peptídeo efe- tor, de acordo com a invenção, tem uma meia vida tβ selecionada a partir do grupo consistindo de: 12 horas ou mais, 24 horas ou mais, 2 dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais, 7 dias ou mais, 8 dias ou mais, 9 dias ou mais, 10 dias ou mais, 11 dias ou mais, 12 dias ou mais, 13 dias ou mais, 14 dias ou mais, 15 dias ou mais, ou 20 dias ou mais. Vantajosamente, um ligante de pep- tídeo-grupo efetor, ou composição de acordo com a invenção, terão uma meia vida tβ na faixa de 12 a 60 horas. Em uma concretização adicional, ele terá uma meia vida t de um dia ou mais. Em ainda uma concretização adicional, ele estará na faixa de 12 a 26 horas.

[00128] Os grupos funcionais incluem drogas, tais como agentes citotóxicos para terapia de câncer. Estes incluem agentes de alquilata- ção tais como Cisplatina e carboplatina, bem como oxaliplatina, meclo- retamina, ciclofosfamida, clorambucila, ifosfamida; Anti-metabólitos incluindo análogos de purina azatioprina e mercaptopurina)) ou análogos de pirimidina; alcaloides de planta e terpenoides incluindo alcaloides de vinca, tais como Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina e Vindesi- na; Podofilotoxina e seus derivados etoposídeo e teniposídeo; Taxa- nos, incluindo paclitaxel, originalmente conhecido como Taxol; inibidores de topoisomerase incluindo camptotecinas: irinotecan e topotecan, e inibidores tipo II incluindo amsacrina, etoposídeo, fosfato de etoposí- deo, e teniposídeo. Agentes adicionais podem incluir antibióticos de antitumour que incluem o imunossupressor dactinomicina (que é usada em transplantes de rim), doxorubicina, epirubicina, bleomicina, e outros.

[00129] Os grupos efetores possíveis também incluem enzimas, por exemplo, tal como carboxipeptidase G2 para uso na terapia de enzi- ma/pró-droga, onde o ligante de peptídeo substitui anticorpos em ADEPT.

(vi) Síntese

[00130] Deve ser notado que uma vez que um polipeptídeo de interesse é isolado ou identificado de acordo com a presente invenção, em seguida sua síntese subsequente pode ser simplificada se possível. Desse modo, grupos ou conjuntos de polipeptídeos não necessitam serem produzidos por técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, a sequência de polipeptídeos de interesse pode ser determinada, e elas podem ser produzidas sinteticamente por técnicas padrões seguidas por reação com um suporte molecular in vitro. Quando isto é realizado, química padrão pode ser usada, visto que não existe mais qualquer necessidade de preservar a funcionalidade ou integridade da partícula de transportador geneticamente codificada, tal como fago. Isto capacita a rápida preparação de larga escala de material solúvel para experimentos à jusante adicionais ou validação. Neste particular, a preparação de grande escala dos candidatos ou condutores identificados pelos métodos da presente invenção podem ser efetuados usando química convencional, tal como aquela revelada em Timmerman et al.

[00131] Desse modo, a invenção também se relaciona a produção de polipeptídeos ou conjugados selecionados conforme colocado aqui, no qual a produção compreende as etapas adicionais opcionais conforme explanadas abaixo. Em uma concretização, estas etapas são efetuadas no polipeptídeo/conjugado de produto final produzido por síntese química, preferivelmente do que no fago.

[00132] Opcionalmente, os resíduos de aminoácido no polipeptídeo de interesse podem ser substituídos quando da produção de um conjugado ou complexo, por exemplo, após a etapa de isolamento inici- al/identificação.

[00133] Os peptídeos pode também serem extendidos, para incor- porar, por exemplo, outro ciclo e, portanto, introduzir especificidades múltiplas.

[00134] Para extender o peptídeo, ele pode ser simplesmente ex- tendido quimicamente em seu N-terminal ou C-terminal, ou dentro de ciclos usando lisinas ortogonalmente protegidas (e análogos) usando química de fase sólida ou de solução sólida padrão. A química de proteína padrão pode ser usada para introduzir um N- ou C-terminal ati- vável. Alternativamente adições podem ser feitas por condensação de fragmento ou ligação química nativa, por exemplo, conforme descrito em (Dawson PE, Muir TW, Clark-Lewis I, Kent, SBH. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779), ou por enzimas, por exemplo, usando subtiligase, conforme descrito em (Sub- tiligase: a tool for semisynthesis of proteins Chang TK, Jackson DY, Burnier JP, Wells JA Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20;91(26):12544-8, ou em Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Tags for labelling protein N-termini with subtiligase for proteomics Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003 Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics; Hikari A.I. Yoshihara, Sami Mahrus e James A. Wells).

[00135] Alternativamente, os peptídeos podem ser extendidos ou modificados por conjugação adicional através de ligações de disulfeto. Isto tem a vantagem adicional de permitir que o primeiro e segundo peptídeos se dissociem entre si uma vez que dentro do ambiente de redução da célula. Neste caso, o suporte molecular (por exemplo, TBMB) pode ser adicionado durante a síntese química do primeiro peptídeo de modo a reagir com os três grupos de cisteína; uma cisteí- na adicional pode, em seguida, ser anexada ao N-terminal do primeiro peptídeo, de modo que esta cisteína somente reage com uma cisteína livre do segundo peptídeo.

[00136] Técnicas similares se aplicam igualmente à sínte- se/acoplamento de dois macrociclos bicíclicos e biespecíficos, potencialmente criando uma molécula tetraespecífica.

[00137] Além disso, a adição de outros grupos funcionais ou grupos efetores pode ser efetuada na mesma maneira, usando acoplamento químico apropriado nos N- ou C-terminais, ou via cadeias laterais. Em uma concretização, o acoplamento é conduzido de tal maneira que ele não bloqueia a atividade de qualquer entidade.

(vii) Modificação do Peptídeo

[00138] Para desenvolver os bipeptídeos cíclicos (Biciclos; peptí- deos conjugados a suportes moleculares) em uma molécula similar à droga adequada, se para administração por injeção, inalação, nasal, ocular, oral ou tópica, um número de propriedades necessitam serem considerados. O seguinte pelo menos necessita se ser designado em um dado Biciclo condutor: • estabilidade de protease, se isto se refere a estabilidade de Biciclo para proteases de plasma, proteases epiteliais ("ancorada por membrana") proteases gástricas e intestinais, proteases de superfície do pulmão, proteases intracelulraes, e similares. A estabilidade da protease deve ser mantida entre espécies diferentes tal que um candidato principal de Biciclo pode ser desenvolvido em modelos de animal, bem como administrados com confidência a humanos. • substituição de resíduos sensíveis à oxidação, tais como triptofano e metionina com análogos resistentes à oxidação, de modo a aperfeiçoar o perfil de estabilidade farmacêutica da molécula. • um perfil de solubilidade desejável, que é uma função da proporção de resíduos carregados e hidrofílicos versus resíduos hidro- fóbicos, que é importante para proposta de formulação e absorção. • equilíbrio correto de resíduos carregados versus resíduos hidrofóbicos, visto que os resíduos hidrofóbicos influenciam o grau de ligação de proteína de plasma e, desse modo, a concentração da fra ção disponível livre no plasma, enquanto que resíduos carregados (em particular argininas) podem influenciar a interação do peptídeo com as membranas de fosfolipídeo nas superfícies da célula. Os dois em combinação podem influenciar a meia vida, volume de distribuição e exposição da droga de peptídeo, e podem ser proporcionados de acordo com o ponto de vista clínico. Em adição, a combinação correta e número de resíduos carregados versus resíduos hidrofóbicos pode reduzir a irritação no local de injeção (as drogas de peptídeo foram administradas subcutaneamente). • uma meia vida proporcionada, dependendo da indicação clínica e regime de tratamento. Pode ser prudente desenvolver uma molécula não modificada para curta exposição em um ajuste de controle de doença aguda, ou desenvolver um bipeptídeo cíclico com modificações químicas que intensificam a meia vida do plasma, e, consequentemente, seja ótimo para o controle de estados de doença mais crônicos.

[00139] As abordagens para estabilizar os candidatos de peptídeo terapêuticos contra degradação proteolítica são numerosas, e se sobrepõem com o campo de peptidomiméticos (para revisões ver Genti- lucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, e Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

[00140] Estas incluem • Ciclização de peptídeo. • Capeamento N- e C-terminal, usualmente acetilação N- terminal e amidação C-terminal. • Varreduras de alanina, para revelar e potencialmente remover o(s) local(is) de ataque proteolítico. • Substituição de D-aminoácido, para sondar as requisições estéricas da cadeia lateral de aminoácido, para aumentar a estabilidade proteolítica por impedimento estérico e por uma propensidade de D-aminoácidos para estabilizar conformações β-giro (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418). • Substituição de N-metil/N-alquil aminoácido, para conceder proteção proteolítica por modificação direta da ligação de amida (Fiacco et al, Chembiochem. (2008), 9(14), 2200-3). N-metilação também tem forte efeito nos ângulos torsionais da ligação de peptídeo, e acredita-se auxiliar na penetração da célula & disponibilidade oral (Biron et al (2008), Angew. Chem. Int. Ed., 47, 2595 -99) • Incorporação de aminoácidos não naturais, isto é, pelo emprego de • Cadeias laterais isostéricas/isoeletrônicas que não são reconhecidas por proteases, ainda não tem efeito na potência alvo. • Cadeias laterais de aminoácido restringidas, tal que hidrólise proteolítica da ligação de peptídeo é conformacionalmente e este- ricamente impedida. Em particular, estes se referem a análogos de prolina, cadeias laterais volumosas, derivados Ca-disubstituídos (onde o derivado mais simples é Aib, H2N-C(CH3)2-COOH), e aminoácidos de ciclo, um derivado simples sendo amino-ciclopropilácido carboxílico). • Ligação de peptídeo substituta, e exemplos incluem • N-alquilatação (ver acima, isto é, CO-NR) • Ligações de peptídeos reduzidas (CH2-NH-) • Peptoides (N-alquil aminoácidos, NR-CH2-CO) • Tio-amidas (CS-NH) • Azapeptídeos (CO-NH-NR) • Trans-alqueno (RHC=C-) • Retro-inverso (NH-CO) • Ureia substituta (NH-CO-NHR) • Modulação de comprimento de suporte de peptídeo • isto é, β2/3 aminoácidos, (NH-CR-CH2-CO, NH-CH2-CHR- CO), • Substituições no alfa-carbono em aminoácidos, que restringem conformações de suporte, o derivado mais simples sendo Ácido aminoisobutírico (Aib).

[00141] Deve ser explicitamente notado que algumas destas modificações podem também servir para aperfeiçoar deliberadamente a potência do peptídeo contra o alvo, ou, por exemplo, para identificar substitutos potentes para os aminoácidos sensíveis à oxidação (Trp e Met). Deve também ser notado que o condutor Biciclo Ac-06-34- 18(TMB)-NH2 já abriga duas modificações que concedem resistência a degradação proteolítica, estes sendo capeamento N/C-terminal, e (bi)ciclização.

(B) Repertórios, conjuntos e grupos de ligantes de polipeptídeo (i) Construção de Bibliotecas

[00142] As bibliotecas pretendidas para seleção podem ser construídas usando técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, conforme colocado em WO2004/077062, ou sistemas biológicos, incluindo sistemas de vetor de fago, conforme aqui descrito. Outros sistemas de vetor são conhecidos na técnica, e incluem outro fago (por exemplo, fago lambda), vetores de expressão de plasmídeo bacterial, vetores de expressão à base de célula eucariótica, e similares. Por exemplo, ver WO2009098450 ou Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7.

[00143] Sistemas não biológicos, tais como aqueles colocados em WO2004/077062, são baseados nas abordagens de classificação química convencionais. Eles são simples, mas carecem da energia de sistemas biológicos, visto que é impossível, ou pelo menos impratica- velmente oneroso, para classificar grandes bibliotecas de ligantes de peptídeo. Contudo, eles são úteis onde, por exemplo, somente um pequeno número de ligantes de peptídeo necessita ser classificado. A classificação por tais ensaios individuais, contudo, pode consumir tempo, e o número de moléculas únicas que podem ser testadas para ligação a um alvo específico geralmente não excede 106 entidades químicas.

[00144] Em contraste, métodos de classificação biológica ou seleção geralmente permitem a amostragem de um número muito maior de moléculas diferentes. Desse modo, métodos biológicos podem ser usados na aplicação da invenção. Nos procedimentos biológicos, as moléculas são ensaiadas em um vaso de reação único e as moléculas com propriedades favoráveis (isto é, ligação) são fisicamente separadas das moléculas inativas. As estratégias de seleção são disponíveis que permitem gerar e ensaiar simultaneamente mais do que 1013 com-postos individuais. Exemplos para técnicas de seleção de afinidade poderosos são revelação de fago, revelação de ribossomo, revelação de mRNA, revelação de levedura, revelação bacterial, ou métodos de aptâmero de RNA/DNA. Estes métodos de seleção biológicos in vitro têm em comum que os repertórios de ligante são codificados por DNA ou RNA. Eles permitem a propagação e a identificação de ligantes selecionados por sequenciamento. A tecnologia de revelação de fago tem, por exemplo, sido usada para o isolamento de anticorpos com afinidades de ligação muito altas a virtualmente qualquer alvo.

[00145] Quando se usa um sistema biológico, uma vez que um sistema de vetor é escolhido e uma ou mais sequências de ácido nuclei- co que codificam polipeptídeos de interesse são clonadas no vetor de biblioteca, pode-se gerar diversidade dentro das moléculas clonadas por suportarem mutagênese antes da expressão; alternativamente, as proteínas codificadas podem ser expressas e selecionadas antes da mutagênese, e etapas adicionais de seleção são realizadas.

[00146] A mutagênese de sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos estruturalmente otimizados é efetuada por métodos moleculares padrões. De uso particular é a reação de cadeia de poli- merase, ou PCR, (Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol, 155: 335, aqui incorporado por referência). PCR, que usa ciclos múltiplos de DNA catalisados por replicação por uma polimerase de DNA dependente de DNA, termoestável, para amplificar a sequência alvo de interesse, é bem conhecida na técnica. A construção de várias bibliotecas de anticorpo foi discutida em Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, e referências citadas no mesmo.

[00147] Alternativamente, dados os comprimentos de cadeia curta dos polipeptídeos de acordo com a invenção, as variantes podem ser sintetizadas de novo e inseridas nos vetores de expressão adequados. A síntese de peptídeo pode ser efetuada por técnicas padrões conhecidas na técnica, conforme descrito acima. Sintetizadores de peptídeos automáticos são amplamente disponíveis, tal como o Applied Biosystems ABI 433 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

(ii) Diversidade geneticamente codificada

[00148] Em uma concretização, os polipeptídeos de interesse são geneticamente codificados. Isto oferece a vantagem de diversidade intensificada junto com facilidade de manuseio. Um exemplo de uma biblioteca de polipeptídeo geneticamente é uma biblioteca de revelação de mRNA. Outro exemplo é uma biblioteca de pacote de revelação genética replicável (rgdp), tal como uma biblioteca de revelação de fa- go. Em uma concretização, os polipeptídeos de interesse são geneticamente codificados como uma biblioteca de revelação de fago.

[00149] Desse modo, em uma concretização, o complexo da invenção compreende um pacote de revelação genética replicável (rgdp), tal como uma partícula de fago. Nestas concretizações, o ácido nucleico pode ser compreendido pelo genoma de fago. Nestas concretizações, o polipeptídeo pode ser compreendido pela camada de fago.

[00150] Em algumas concretizações, a invenção pode ser usada para produzir uma biblioteca combinatorial geneticamente codificada de polipeptídeos que são gerados por translação de um número de ácidos nucleicos nos polipeptídeos correspondentes e moléculas de ligação de referido suporte molecular a referidos polipeptídeos.

[00151] A biblioteca combinatorial geneticamente modificada de po- lipeptídeos pode ser gerada por revelação de fago, revelação de levedura, revelação de ribossomo, revelação bacterial, ou revelação de mRNA.

[00152] Técnicas e metodologia para realização de revelação de fago podem ser encontradas em WO2009098450.

[00153] Em uma concretização, a classificação pode ser realizada por contato de uma biblioteca, conjunto ou grupo de ligantes de poli- peptídeo com um alvo, e isolamento de um ou mais membro(s) que se liga(m) a referido alvo.

[00154] Em outra concretização, membros individuais de referida biblioteca, conjunto ou grupo são contatados com um alvo em uma classificação e membros de referida biblioteca que se ligam a referido alvo, são identificados.

[00155] Em outra concretização, os membros de referida biblioteca, conjunto ou grupo são simultaneamente contatados com um alvo, e membros que se ligam a referido alvo, são selecionados.

[00156] O(s) alvo(s) pode(m) ser um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um lipídeo, um DNA, ou um RNA.

[00157] O alvo pode ser um receptor, um ligante de receptor, uma enzima, um hormônio, ou uma citocina.

[00158] O alvo pode ser uma proteína procariótica, uma proteína eucariótica, ou uma proteína arqueal. Mais especificamente, o ligante alvo pode ser uma proteína de mamífero, ou uma proteína de inseto, ou uma proteína bacterial, ou uma proteína fungal, ou uma proteína viral.

[00159] O ligante alvo pode ser uma enzima, tal como uma protease.

[00160] Deve ser notado que a invenção também envolve ligantes de polipeptídeo isolados de uma classificação de acordo com a invenção. Em uma concretização, o(s) método(s) de classificação da invenção compreendem adicionalmente a etapa de: produção de uma quantidade do polipeptídeo isolado como capaz de se ligar a referidos alvos.

[00161] A invenção também se relaciona a ligantes de peptídeo tendo mais do que dois ciclos. Por exemplo, polipeptídeos tricíclicos unidos a um suporte molecular podem ser criados por união dos N- e C- terminais de polipeptídeo bicíclico unidos a um suporte molecular de acordo com a presente invenção. Dessa maneira, os N e C terminais unidos criam um terceiro ciclo, produzindo um polipeptídeo tricícli- co. Esta concretização não necessita ser efetuada no fago, mas pode ser efetuada em um polipeptídeo-suporte molecular conjugado, conforme aqui descrito. A união dos N- e C- terminais é uma matéria de rotina de química de peptídeo. No caso de qualquer guia ser necessária, o C-terminal pode ser ativado, e/ou os N- e C- terminais podem ser extendidos, por exemplo, para adicionar uma cisteína a cada extremidade e, em seguida, uni-las por ligação de disulfeto. Alternativamente, a união pode ser efetuada pelo uso de uma região ligadora incorpora-da nos N/C terminais. Alternativamente os N e C terminais podem ser unidos por uma ligação de peptídeo convencional. Alternativamente, quaisquer outros meios adequados para união dos N e C terminais podem ser empregados, por exemplo, N-C-ciclização pode ser feita por técnicas padrões, por exemplo, conforme revelado em Linde et al. Peptide Science 90, 671-682 (2008) "Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbone cyclization and N-metilation of melanocortin peptides", ou como em Hess et al. J. Med. Chem. 51, 1026-1034 (2008) "backbone cyclic peptidomimetic melanocortin-4 receptor agonist as a novel orally administered drug lead for treating obesity". Uma vantagem de tais moléculas tricíclicas é o evitamento da degradação proteolítica das extremidades livres, em particular, por ação de exoprotease. Outra vantagem de um polipeptídeo tricíclico desta natureza é que o terceiro ciclo pode ser utilizado para funções geralmente aplicáveis, tais como ligação de BSA, entrada de célula ou efeitos de transporte, etiquetamento, ou qualquer outro tal uso. Será notado que este terceiro ciclo não estará tipicamente disponível para seleção (porque ele não é produzido no fago, mas somente no poli- peptídeo-suporte molecular conjugado), e assim seu uso para outras funções biológicas ainda vantajosamente deixa ambos os ciclos 1 e 2 para seleção/criação de especificidade.

(iii) Purificação do fago

[00162] Qualquer meio adequado para purificação do fago pode ser usado. Técnicas padrões podem ser aplicadas na presente invenção. Por exemplo, o fago pode ser purificado por filtração ou por precipitação tal como precipitação de PEG; partículas de fago podem ser produzidas e purificadas por precipitação de polietileno-glicol (PEG), conforme descrito previamente. Detalhes podem ser encontrados em WO2009098450.

[00163] No caso de guia adicional ser necessária, referência é feita a Jespers et al (Protein Engineering Design and Selection 2004 17(10):709-713. Selection of optical biosensors from chemisynthetic antibody libraries). Em uma concretização, o fago pode ser purificado conforme ensinado no mesmo. O texto desta publicação é especificamente aqui incorporado por referência para o método de purificação de fago; em particular, referência é feita aos materiais e seção de métodos que se iniciam na coluna direita na página 709 de Jespers et al.

[00164] Além disso, o fago pode ser purificado conforme publicado por Marks et al J.Mol.Biol vol 222 pp581-597, que é especificamente incorporado por referência para a descrição particular de como a pro- dução/purificação do fago é efetuada.

(iv) Reação química

[00165] A presente invenção faz uso de condições químicas para a modificação de polipeptídeos que vantajosamente retêm a função e integridade do elemento geneticamente codificado do produto. Especificamente, quando o elemento geneticamente codificado é um polipep- tídeo revelado na superfície de um fago que codifica o mesmo, a química vantajosamente não compromete a integridade biológica do fago. Em geral, as condições são colocadas em WO2009098450.

(C) Uso de ligantes de polipeptídeo de acordo com a invenção

[00166] Os ligantes de polipeptídeo selecionados para o método da presente invenção pode ser empregados em aplicações terapêuticas e profiláticas in vivo, aplicações diagnósticas in vitro e in vivo, aplicações de ensaio e de reagente in vitro, e similares. Os ligantes tendo níveis selecionados de especificidade são úteis em aplicações que envolvem teste em animais não humanos, onde reatividade cruzada é desejável, ou em aplicações diagnósticas, onde reatividade cruzada com homólogos ou parálogos necessita ser cuidadosamente controlada. Em algumas aplicações, tais como aplicações de vacina, a capacidade de induzir uma resposta imune a faixas pré-determinadas de antígenos pode ser explorada para produzir uma vacina para doenças específicas e patógenos.

[00167] Os ligantes de peptídeo substancialmente puros de pelo menos 90 a 95% de homogeneidade são preferidos para administração a um mamífero, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade é mais preferido para usos farmacêuticos, especialmente quando o mamífero é um humano. Uma vez purificado, parcialmente ou para homogeneidade conforme desejado, os polipeptídeos selecionados podem ser usados diagnosticamente ou terapeuticamente (incluindo extracorpo- realmente), ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaio, manchamentos imunofluorescentes e similares (Lefkovite and Pernis, (1979 e 1981) Immunological Methods, Volumes I e II, Academic Press, NY).

[00168] Os ligantes de peptídeo da presente invenção tipicamente encontrarão uso na prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, câncer, infecção bacterial ou viral, e distúrbios autoimunes (que incluem, mas não são limitados a, diabetes Tipo I, esclerose múltipla, artrite reumatoide, lúpus eritrema- toso sistêmico, doença de Crohn e miastenia gravis).

[00169] No presente pedido, o termo "prevenção" envolve administração da composição protetora antes da indução da doença. "Supressão" se refere a administração da composição após um evento indutivo, mas antes do aparecimento clínico da doença. "Tratamento" envolve administração da composição protetora após manifestação dos sintomas da doença.

[00170] Os sistemas de modelo de animal que podem ser usados para classificar a efetividade dos ligantes de peptídeo na proteção contra ou tratamento das doenças são disponíveis. O uso de sistemas de modelo de animal é facilitado pela presente invenção, que permite o desenvolvimento de ligantes de polipeptídeo que podem reagir por cruzamento com alvos humanes e animais, para permitir o uso de modelos de animal.

[00171] Métodos para o teste de lúpus sistêmico eritematoso (SLE) em camundongos susceptíveis são conhecidos na técnica (Knight et al. (1978) J Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J: Med., 299: 515). Miastenia Gravis (MG) é testada em camundongos fêmeas SJL/J por indução da doença com proteína AchR solúvel de outra espécie (Lindstrom et al. (1988) Adv. Inzn7unol., 42: 233). Artrite é induzida em uma estirpe susceptível de camundongos por injeção de colágeno Tipo II (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Um modelo pelo qual artrite adjuvante é induzida em ratos susceptíveis por injeção de proteína de choque de calor micobacterial foi descrito (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). Tireoidite é induzida em camundongos por administração de tiroglobulina conforme descrito (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). Diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) ocorre naturalmente, ou pode ser induzida em certas estirpes de camundongos, tais como aqueles descritos por Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113. EAE em camundongo e rato serve como um modelo para MS em humano. Neste modelo, a doença de demielinação é induzida por administração de proteína básica de mie- lina (ver Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al. (1987) J; Immunol, 138: 179).

[00172] Geralmente, os presentes ligantes de peptídeo serão utilizados na forma purificada juntos com transportadores farmacologica- mente apropriados. Tipicamente, estes transportadores incluem soluções aquosas ou alcoólicas/soluções aquosas, emulsões ou suspensões, qualquer incluindo salina e/ou meio tamponado. Veículos paren- terais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e Ringer lactatado. Adjuvantes fisiologicamente adequados, se necessário para manter um complexo de polipeptídeo em suspensão, podem ser escolhidos de espessantes, tais como car- boximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos.

[00173] Veículos intravenosos incluem fluido e restabelecedores de nutriente e restabelecedores de eletrólito, tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer. Conservantes e outros aditivos, tais como an- timicrobiais, antioxidantes, agentes quelatantes e gases inertes, podem também estarem presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).

[00174] Os ligantes de peptídeo da presente invenção podem ser usados como composições separadamente administradas, ou em conjunto com outros agentes. Estes podem incluir anticorpos, fragmentos de anticorpo, e várias drogas imunoterapêuticas, tais como cilcospori- na, metotrexato, adriamicina ou cisplatina, e imunotoxinas. As composições farmacêuticas podem incluir "coquetéis" de vários citotóxicos ou outros agentes em conjunto com os anticorpos selecionados, receptores ou proteínas de ligação destes da presente invenção, ou ainda combinações de polipeptídeos selecionados de acordo com a presente invenção tendo especificidades diferentes, tais como polipeptídeos selecionados usando ligantes alvos diferentes, se ou não eles são reunidos antes da administração.

[00175] A rota de administração das composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser qualquer daquelas comumente conhecidas àqueles técnicos no assunto. Para terapia, incluindo sem limitação, imunoterapia, os anticorpos selecionados, receptores ou proteínas de ligação destes, da invenção, podem ser administrados a qualquer paciente de acordo com técnicas padrões. A administração pode ser por qualquer modo apropriado, incluindo, parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, trans- dermalmente, via a rota pulmonar, ou também, apropriadamente, por infusão direta com um cateter. A dosagem e frequência de administração dependerão da idade, sexo e condição do paciente, administração concorrente de outras drogas, contraindicações e outros parâmetros a serem levados em conta pelo médico.

[00176] Os ligantes de peptídeo desta invenção podem ser liofiliza- dos para armazenagem e reconstituídos em um transportador adequado antes do uso. Esta técnica foi mostrada ser efetiva e técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na técnica podem ser empregadas. Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que a liofi- lização e reconstituição podem conduzir a graus variantes de perda de atividade, e que níveis de uso podem ter que serem ajustados para cima para compensar.

[00177] As composições contendo os presentes ligantes de peptí- deo, ou um coquetel destes, podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em certas aplicações terapêuticas, uma quantidade adequada para efetuar pelo menos inibição parcial, supressão, modulação, morte, ou algum outro parâmetro mensurável, de uma população de células selecionadas, é definida como uma "dose terapeuticamentre efetiva". Quantidades necessárias para alcançar esta dosagem dependerão da severidade da doença e do estado geral do próprio sistema imune do paciente, mas geralmente varia de 0,005 a 5,0 mg de ligante de peptídeo selecionado por quilograma de peso corpóreo, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais comumen- te usadas. Para aplicações profiláticas, as composições contendo os presentes ligantes de peptídeo ou coquetéis destes podem também serem administradas em dosagens similares ou levemente mais baixas.

[00178] Uma composição contendo um ligante de peptídeo de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em ajustes profiláticos e terapêuticos para auxiliar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de célula alvo selecionada em um mamífero. Em adição, os repertórios selecionados de polipeptídeos aqui descritos podem ser usados extracorporealmente, ou in vitro seletivamente, para matar, anular ou, de outro modo, remover efetivamente uma população de célula alvo de uma coleção heterogênea de células. O sangue de um mamífero pode ser combinado extracorporealmente com os ligantes de peptídeo selecionados, pelo que as células indese- jadas são mortas ou, de outro modo, removidas a partir do sangue para retornar ao mamífero de acordo técnicas padrões.

[00179] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido um método de prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, câncer, infecção bacterial ou viral, distúrbios oftálmicos e distúrbios autoimunes que compreendem administração a um paciente em necessidade deste de um ligante de peptídeo conforme aqui definido.

[00180] Exemplos de "distúrbios oftálmicos" adequados (incluindo distúrbios oftálmicos exudativos e/ou inflamatórios, distúrbios relacionados a permeabilidade e/ou integridade de vaso retinal prejudicada, distúrbios relacionados a ruptura de microvaso retinal que conduzem a hemorragias focais, apoio das doenças do olho, doenças retinais e parte dianteira das doenças do olho) incluem, mas não são limitadas a: degeneração macular relacionada à idade (ARMD), degeneração macular exudativa (também conhecida como degeneração macular relacionada à idade "molhada" ou neovascular (AMD-molhada), edema macular, degeneração macular desconforme com a idade, edema macular cistoide, edema palpebral, edema retinal, retinopatia diabética, neuroretinopatia macular aguda, corioretinopatia serosa central, neo- vascularização coroidal, macolopatia neovascular, glaucoma neovas- cular, retinopatias obstrutivas arterial e venosa (por exemplo, oclusão venosa retinal ou oclusão arterial retinal), oclusão de veia central retinal, coagulopatia intravascular disseminada, oclusão de veia retinal de ramificação, mudanças de fundo hipertensivo, síndrome isquêmica ocular, micro aneurisma retinal arterial, doença de Coat, telangiectase parafoveal, oclusão de veia hemi-retinal, papilloflebite, oclusão de artéria central retinal, oclusão de artéria retinal de ramificação, doença de artéria carótida (CAD), angite de ramificação congelada, retinopatia de célula de foice e outras hemoglobinopatias, linhas angióides, edema macular que ocorre como um resultado de etiologias tal como doença (por exemplo, edema macular diabético), lesão do olho ou cirurgia do olho; isquemia retinal ou degeneração produzida, por exemplo, por lesão, trauma ou tumores, uveíte, irite, vasculite retinal, endoftalmite, panoftalmites, oftalmia metastática, coroidite, epitelite de pigmento retinal, conjuntivite, ciclite, esclerite, episclerite, neurite ótica, neurite ótica retrobulbar, queratite, blefarite, descolamento retinal exudativo, úlcera corneal, úlcera conjuntival, queratite numular crônica, ceratite thygeson, úlcera de mooren progressiva, uma doença inflamatória ocular causada por infecção bacterial ou viral, e por uma operação oftálmica, uma doença inflamatória ocular causada por uma lesão física ao olho, um sintoma causado por uma doença inflamatória ocular incluindo prurido, edema e úlcera, eritema, eritema exsudativum multiforme, eritema nodosum, eritema annulare, esclerodema, dermatite, edema angioneurótico, edema laringeal, edema glótico, laringite subglótica, bronquite, rinite, faringite, sinusite, laringite ou otite média.

[00181] Referências aqui a "doenças da parte posterior do olho" incluem doenças que afetam, entre outros, a retina, macular, fóvea na região posterior do olho. Exemplos de "doenças da parte posterior do olho" adequados incluem, mas não são limitadas a: edema macular, tais como edema macular clínico ou edema macular de cistóide angio- gráfico que ocorre de várias etiologias tais como diabetes, degeneração macular exudativa e edema macular que ocorre de tratamento de laser da retina, degeneração macular relacionada à idade, retinopatia de prematuridade (também conhecida como fibroplasia retrolantal), isquemia retinal e neovascularização coroidal, doenças retinais (reti- nopatia diabética, edema retinal diabético, descolamento retinal, degeneração macular senil devido a neovascularização sub-retinal, retino- patia miópica); doenças inflamatórias; uveíte associada com neoplasmas tais como retinoblastoma ou pseudoglioma; neovascularização após vitrectomia; doenças vasculares (isquemia retinal, insuficiência vascular coroidal, trombose coroidal, retinopatias resultantes de is- quemia da artéria carótida); e neovascularização do nervo ótico.

[00182] Referências aqui a "doenças frontais do olho" se refere a doenças que afetam predominantemente os tecidos na frontal do olho, tais como córnea, íris, corpo ciliar, conjuntiva, etc.. Exemplos "doenças frontais do olho" adequadas incluem, mas não são limitadas a: neo- vascularização da córnea (devido a inflamação, transplante, hipoplasia de desenvolvimento da íris, doenças da córnea ou opacificações com um componente exudativo ou inflamatório, neovascularização devido a penetração do olho, ou lesão ocular contusiva; uveíte crônica; uveíte anterior; condições inflamatórias resultantes de cirurgias, tais como LASIK, LASEK, cirurgia refrativa, implantação de IOL; edema de córnea irreversível, tal como um complicação de cirurgia de catarata; edema como um resultado de insulto ou trauma (físico, químico, farmacológico, etc); inflamação; conjuntivite (por exemplo alérgica persistente, papilar gigante, alérgica intermitente sazonal, alérgica perenial, tóxica, conjuntivite causada por infecção por bactéria, vírus ou Chlamydia); queratoconjuntivite (vernal, atópica, seca); iridociclite; irite; esclerite; episclerite; queratite infecciosa; queratite pontuada superficial; queratoconus; distrofia polimorfa posterior; distrofias de Fuch (corneal e endotelial); queratopatia bulhosa afácica e pseudofácica; edema corneal; doença escleral; penfigóide cicatricial ocular; pars planitis; síndrome de Posner Schlossman; doença de Behcet; síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada; reações de hipersensibilidade; distúrbios de superfície ocular; edema conjuntival; corioretinite de toxoplasmose; pseudotumor inflamatório da órbita; quemose; congestão venosa con- juntival; celulite periorbital; dacriocistite aguda; vasculite não específica; sarcoidose; e infecção de citomegalovírus.

[00183] Exemplos de "distúrbios associados com permeabilidade vascular excessiva e/ou edema no olho" adequados, por exemplo, na retina ou vítreo, incluem, mas não são limitados a, degeneração macu lar relacionada à idade (AMD), edema retinal, hemorragia retinal, hemorragia vítrea, edema macular (ME), edema macular diabético (DME), retinopatia diabética proliferativa (PDR) e retinopatia diabética não proliferativa (DR), retinopatia de radiação, telangiectase, retinopa- tia serosa central, e oclusões de veia retinal. O edema retinal é o acúmulo de fluido no espaço intraretinal. DME é o resultado de mudanças microvasculares retinais que ocorrem em pacientes com diabete. Este compromisso da barreira sangue-retinal conduz ao vazamento de constituintes de plasma na retina circundante, resultando em edema retinal. Outros distúrbios da retina incluem oclusões de veia retinal (por exemplo, oclusões de veia de ramificação ou central), retinopatia de radiação, retinopatia de célula de foice, retinopatia de prematuridade, doença de Von Hippie Lindau, uveíte posterior, descolamento retinal crônico, Síndrome de Irvine Gass, doença de EaIs, retinite, e/ou coroi- dite.

(D) Mutação de Polipeptídeos

[00184] A diversidade desejada é tipicamente gerada por variação da molécula selecionada em uma ou mais posições. As posições a serem mudadas são selecionadas, tal que as bibliotecas são construídas para cada posição individual nas sequências de ciclo. Onde apropriado, uma ou mais posições podem ser omitidas do procedimento de seleção, por exemplo, se torna-se aparente que aquelas posições não são disponíveis para mutação sem perda de atividade.

[00185] A variação pode, em seguida, ser alcançada, ou por ran- domização, durante qual o aminoácido residente é substituído por qualquer aminoácido ou análogo deste, natural ou sintético, produzindo um número muito grande de variantes, ou por substituição do ami- noácido residente com um ou mais de um subconjunto definido de aminoácidos, produzindo um número mais limitado de variantes.

[00186] Vários métodos foram reportados para introdução de tal di- versidade. Métodos para mutação das posições selecionadas são também bem conhecidos na técnica, e incluem o uso de oligonucleotí- deos desequipados, ou oligonucleotídeos degenerados, com ou sem o uso de PCR. Por exemplo, várias bibliotecas de anticorpo sintético foram criadas por direcionamento de mutações aos ciclos de ligação de antígeno. As mesmas técnicas podem ser usadas no contexto da pre-sente invenção. Por exemplo, a região H3 de um Fab de ligação de toxoide de tétano humano foi randomizado para criar uma faixa de novas especificidades de ligação (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Regiões H3 e L3 aleatórias ou semi-aleatórias foram anexadas a segmentos de gene V de linha de germe para produzir grandes bibliotecas com regiões de enquadramento mudadas (Hoogenboom- & Winter (1992) R Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EM- BO J, 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J, 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Tal diversificação foi extendida para incluir alguns ou todos dos outros ciclos de ligação de antígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) BiolTechno- logy, 13: 475; Morphosys, W097/08320, supra).

[00187] Contudo, visto que os polipeptídeos usados na presente invenção são muito menores do que os anticorpos, o método preferido é sintetizar polipeptídeos mutantes de novo. A mutagênese dos poli- peptídeos estruturados é descrita acima, em conjunto com construção de biblioteca.

[00188] A invenção é adicionalmente descrita abaixo com referência aos seguintes exemplos.

Exemplos Materiais e Métodos Clonagem de bibliotecas de fago

[00189] As bibliotecas de fago foram geradas de acordo com Heinis et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7). Em Heinis et al, os genes que codificam um peptídeo semi-aleatório com a sequência Xaa-Cys- (Xaa)3-Cys-(Xaa)3-, o ligador Gly-Gly-Ser-Gly, e os dois domínios livres de disulfeto D1 e D2 (Kather, et al., J Mol Biol 2005, 354 (3), 666-78) foram clonadas na orientação correta no vetor de fago fd0D12 para obter ‘biblioteca 3x3’. Os genes que codificam o repertório de peptídeo e os dois domínios de gene 3 foram criados em duas reações de PCR consecutivas. Primeiro, os genes de D1 e D2 foram PCR amplificados com os dois primeres prepcr (5’- GGCGGTTCTGGCGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3’) e sfi2fo (5’- GAAGÇÇATGGÇÇÇÇÇGAGGÇÇÇÇGGAÇGGAGÇATTGAÇAGG-3’; o local de restrição é sublinhado) usando o vetor fdg3p0ss21 (Kather, et al., J Mol Biol 2005, 354 (3), 666-78) como um gabarito. Segundo, o DNA que codifica os peptídeos aleatórios foi anexado em uma reação de PCR usando o primer sficx3ba: 5’- TATGCGGÇÇÇAGÇÇGGÇÇATGGCAN N KTGTN NKNNKNN KTGC- NNKNNKNNKNNKTGTNNKGGGCGGTTCTGGCGCTG-3’ (o local de restrição está sublinhado), e sfi2fo. A ligação de 55 e 11 μg de plasmí- deo de SfiI-digerido fd0D12 e produto de PÇR produziu 5,6x108 colônias em 10 20x20 cm de cloranfenicol (30 μg/ml) placas 2YT. As colônias foram raspadas da placa com meio 2YT, suplementado com 15% de glicerol e armazenadas a -80°Ç. A construção das bibliotecas aqui descritas emprega a mesma técnica para gerar o peptídeo semi- aleatório Pro-Ala-Met-Ala-Çys-(Xaa)3-Çys-(Xaa)3-Çys para uma biblioteca 3x3, por exemplo, e, portanto, substituída na sequência primer sficx3ba com: 5’- TATGÇGGÇÇÇAGÇÇGGÇÇATGGÇATGTN NKNNKNN KTGÇ- NNKNNKNNKTGTGGÇGGTTÇTGGÇGÇTG-3’. As bibliotecas com outros comprimentos de ciclo foram geradas seguindo a mesma metodologia.

Seleções de fago

[00190] Estoques de glicerol de bibliotecas de fago foram diluídos a OD600=0,1 em 500 ml de culturas de 2YT/cloranfenicol (30 μg/ml), e fagos foram produzidos a 30°C durante a noite (15-16 horas). Os fagos foram purificados e quimicamente modificados conforme descrito em Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7 hPK Biotinilatado (3 μg) (IHPKA, de plasma humana, Innovative Research, Novi, MI, USA) foi incubado com 50 μl de contas de estreptavidina magnética pré-lavada (Dynal, M-280 from Invitrogen, Paisley, UK) por 10 minutos à temperatura ambiente. As contas foram lavadas três vezes antes do bloqueio com 0,5 ml de tampão de lavagem (10 mM de Tris-Cl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 1mM de CaCl2) contendo 1% de BSA e 0,1% de Tween 20 por 30 minutos à temperatura ambiente com rotação. Os fagos quimicamente modificados (tipicamente 1010-1011 t.u. dissolvidos em 2 ml de tampão de lavagem) foram concomitantemente bloqueados por adição de 1 ml de tampão de lavagem contendo 3% de BSA e 0,3% de Tween 20. As contas bloqueadas foram, em seguida, misturadas com o fago quimicamente bloqueado modificado e incubadas por 30 minutos em uma roda giratória à temperatura ambiente. As contas foram lavadas 8 vezes com tampão de lavagem contendo 0,1% de Tween 20 e duas vezes com tampão de lavagem antes da incubação com 100 μl de 50 mM de glicina, pH 2,2, por 5 minutos. Os fagos eluídos foram transferidos para 50 μl de 1 M de Tris-Cl, pH 8, para neutralização, incubados com 30 ml de células TG1 a OD600=0,4 por 90 minutos a 37DC, e as células foram colocadas em placas grandes de 2YT/cloranfenicol. Uma ou duas etapas adicionais de balanço foram realizadas usando os mesmos procedimentos. Na segunda etapa de seleção, contas magnéticas revestidas com neutravidina foram usadas para impedir o enriquecimento de peptídeos específicos de estreptavidina. As contas de neutravidina foram preparadas por reação de 0,8 mg de neutravidina (Pierce, Rockford, IL, USA) com 0,5 ml de contas magnéticas ativadas com tosila (Dynal, M-280 from Invitrogen, Paisley, UK), de acordo com as instruções do fornecedor.

Clonagem e expressão de PK de humano, macaco e rato

[00191] O domínio catalítico de PK humano, de macaco e de rato foi expresso em células de mamífero como um precursor inativo tendo um pró-peptídeo conectado N-terminalmente, via um local de clivagem proTEV para o domínio catalítico. O vetor de expressão foi clonado e a proteína expressa, ativada e purificada conforme descrito conforme segue. Os genes sintéticos que codificam para uma sequência de sinal de PK, uma etiqueta de polihistidina, um local de clivagem proTEV, domínio catalítico maturo de PK, e um códon de parada foram comprados de Geneart (Regensburg, Germany) (Supplementary materials). O DNA de plasmídeo contendo os genes sintéticos para PK de humano, macaco (Macaca mulatta) e de rato foi preparado e o gene transferido no vetor de expressão de mamífero pEXPR-IBA42 (IBA Biotechnology, Gottingen, Germany) usando o par de enzima de restrição XhoI e HindIII (Fermentas, Vilnius, Latvia) e T4 DNA ligase (Fermentas). Os plasmídeos ligados foram transformados em células ele- trocompetentes XL-1 blue (Stratagene, Santa Clara, USA) e colocados em placas 2YT agar contendo ampicilina (10 μg/ml). O DNA a partir dos três vetores de expressão (denominado mPK, rPK e hPK) foi pro-duzido, e as sequências corretas confirmadas por sequenciamento de DNA (Macrogen, Seoul, South Korea).

[00192] As três calicreínas de plasma ortólogas foram expressas em células de mamífero conforme segue. 50 ml de células HEK-293 adaptadas em suspensão foram crescidas em meio de ExCell 293 livre de soro (SAFC Biosciences, St. Louis, MO) na presença de 4 mM de glutamina, e o inibidor de histona deacetilase ácido valpróico (3,75 mM) em um frasco orbitalmente sacudido de 100 ml a 180 rpm em uma incubadora ISF-4-W (Kühner AG, Birsfelden, Switzerland) a 37 °C na presença de 5% de CO2. As células de rim embriônicas (HEK-293) a alta densidade de célula (20 x 106 células/ml) (Backliwal, et al/. Bio- technol Bioeng 2008, 99 (3), 721-7) foram transfectadas com os três plasmídeos (300 μg/ml) usando polietilenimina linear (PEI, Polysciences, Eppenheim, Germany). No final da fase de produção de 7 dias, as células foram coletadas por centrifugação a 2.500 rpm por 15 min a 4°C. Qualquer fragmento de célula adicional foi removido a partir do meio por filtração através de membranas de PES de 0,45 μm (Filter- top 250 ml de TPP de ligação de proteína baixa). A proteína etiquetada com polihistidina foi purificada por cromatografia de afinidade de Ni usando resina de Ni-NTA, tampão de lavagem (500 mM de NaCl, 25 mM de Na2HPO4, pH 7,4), e tampão de eluição (500 mM de NaCl, 25 mM de Na2HPO4, pH 7,4, 500 mM de imidazole). A proteína foi parcialmente ativada com (50 unidades) proTEV (Promega, Madison, Wisconsin, USA) e adicionalmente purificada por cromatografia de afinidade de Ni e filtração de gel (coluna PD10, 150 mM de NaCl, 0,5 mM de EDTA, 50 mM de HEPES, pH 7).

Desenvolvimento de polipeptídeos com atividade de ligação aperfeiçoada Randomização de posições individuais

[00193] Construção de biblioteca: de modo a mapear os aminoáci- dos nos peptídeos cíclicos da Ligação de calicreína, um conjunto de pequenas bibliotecas foi construído. Para um biciclo compreendido de 2 ciclos de 5 resíduos, 10 bibliotecas separadas foram geradas cada uma com randomização a um códon particular na sequência de peptí- deo. Os oligonucleotídeos foram designados para cada biblioteca de modo a mudar o DNA do genoma de fago por mutagênese direcionada de local. A mutagênese incorporou randomização do códon de interesse (mudança para NNS), e remoção de um local de restrição de ApaL1 único a partir da sequência de genoma de gabarito. O produto de mu- tagênese foi purificado usando kit de purificação de PCR QIAgen QIA- quick com eluição em água ultrapura. Cada biblioteca foi usada para transformar separadamente TG1 E coli por eletroporação com uma máquina BioRad Micropulser (programa Ec1) e 1 mm de BioRad cuvette. Após 1 hora de recuperação a 37C em 1 ml de meio SOC, os transformantes da biblioteca foram crescidos durante a noite em 25 ml de caldo 2TY contendo antibiótico para crescer seletivamente trans- formantes de biblioteca somente. As bactérias foram coletadas por centrifugação, e o DNA de fago da biblioteca foi purificada a partir de E coli usando um kit QIAgen Plasmid Plus Midi e eluído em água destilada. O DNA purificado foi digerido com ApaL1 por 2 horas em tampão New England Biolabs 4 para remover o material de origem. Após digestão, o DNA foi repurificado usando kit de purificação de PCR QIAgen (conforme acima) e usado para transformar TG1 (eletroporação; conforme descrito acima). Seguindo 1 hora de recuperação em SOC, os transformantes foram colocados em placas LB-agar contendo antibióticos e colônias seletivos e permitidas crescerem durante a noite a 37°C.

[00194] Ensaio de ligação de clones individuais: Colônias transfor- mantes de biblioteca foram captadas aleatoriamente e crescidas como culturas individuais em caldo 2TY contendo antibiótico seletivo. As colônias captadas foram sequenciadas com DNA usando um sequencia- dor QIAgen PyroMark Q96 DNA para revelar a substituição de amino- ácido presente em cada clone. Onde isolado, um clone de cada substituição única foi ensaiado para ligação de calicreína de plasma humano conforme segue. O sobrenadante contendo fagos foi coletado a partir da cultura e os fagos foram ciclizados com tris bromometil benze- no(TBMB) baseado nos métodos de Heinis et al (Nature Chemical Biology vol. 5 pp 502-507 (2009)). Os fagos purificados deste processo foram ensaiados para ligação a calicreína de plasma humano biotinila- tado usando um ensaio de ligação à base de placa homogênea; leitura de ensaio medida em uma leitora de placa BMG Labtech Pherastar FS. O dado de ligação quantitativo de amostras de ensaio em triplicata foi classificado (média) e expresso como sinal:antecedente (onde o antecedente foi uma amostra ensaiada com nenhum material alvo). O sinal:antecedente foi expresso como uma % da amostra de origem paralela. As barras de erro denotam desvio padrão da média. Os ensaios mostrados são representativos de pelo menos 2 experimentos independentes. O dado de ensaio foi correlacionado com as sequências de peptídeo. As substituições marcadas em cinza não foram testadas (um clone não foi isolado a partir da amostragem de biblioteca aleatória). Uma amostra de um biciclo de não ligação (arbitrária) foi ensaiada em paralelo para ilustrar a linha de base do ensaio.

Randomização de domínios de peptídeo

[00195] Construção de biblioteca: Bibliotecas de fago pequenas foram geradas de acordo com os métodos de Heinis et al conforme descrito em ‘Cloning of phage libraries’ acima. O primer sficx3ba foi modificado tal que a porção de codificação de biciclo foi baseada em um biciclo de sequência de DNA de origem 5x5 (5x5: dois ciclos de 5- resíduos) com somente 4-6 códons randomizados para NNS. Os codons randomizados foram aqueles que codificam o domínio de peptí- deo/motivo de interesse.

[00196] Ensaio de ligação de clones individuais: Colônias transfor- mantes de biblioteca, ou colônias de saída de seleção, foram captadas e crescidas como culturas individuais em caldo de 2TY contendo antibiótico seletivo. As colônias captadas foram sequenciadas por DNA usando um sequenciador de DNA QIAgen PyroMark Q96 para revelar a substituição de amino-ácido presente em cada clone, e foram ensaiadas para ligação de calicreína de plasma humano conforme segue. O sobrenadante contendo fago foi coletado a partir da cultura e fagos foram ciclizados com tris bromometil benzeno (TBMB) baseado nos métodos de Heinis et al (Nature Chemical Biology vol. 5 pp 502-507 (2009)). Os fagos purificados deste processo foram ensaiados para ligação a calicreína de plasma humano biotinilatada usando um ensaio de ligação à base de placa homogênea; leitura de ensaio medida em uma leitora de placa BMG Labtech Pherastar FS. O dado de ligação quantitativa de amostras de ensaio em duplicata foi classificado (média) e expresso como sinal:antecedente. O dado do ensaio mostrado é representativo de pelo menos 2 experimentos independentes. O dado de ensaio foi correlacionado com as sequências de peptídeo.

Síntese e purificação de peptídeos bicíclicos

[00197] Sequências de peptídeo são mostradas nas Tabelas 4 a 6. As sequências de peptídeo de núcleo foram Ac- C1S1W2P3A4R5C2L6H7Q8D9L10C3-NH2 (denotadas como Ac-(06-34- 18)(TMB)-NH2) e AC-CISIF2P3Y4R5C2L6H7Q8D9LIOC3-NH2 (denotadas como Ac-(06-34-18)(TMB)-NH2 Phe2 Tyr4).

[00198] A síntese de peptídeo foi baseada na química de Fmoc, usando um sintetizador de peptídeo Symphony produzido por Peptide Instruments. Fmoc-aminoácidos padrões foram empregados (Sigma, Merck), com os seguintes grupos de proteção de cadeia lateral: Arg(Pbf); Asn(Trt); Asp(OtBu); Cys(Trt); GIu(OtBu); Gln(Trt); His(Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu); Trp(Boc), Tyr(tBu) (Sigma). O reagente de acoplamento foi HCTU (Pepcêuticos), di-isopropiletilamina (DIPEA, Sigma) foi empregado como uma base, e desproteção foi alcançada com 20% de piperidina em DMF (AGTC). As sínteses foram realizadas a 100 umole de escala usando 0,37 mmole/gr de resina AM de amida Fmoc-Rink (AGTC), Fmoc-aminoácidos foram utilizados a um excesso de 4 vezes, e a base estava em um excesso de quatro vezes com relação aos aminoácidos. Os aminoácidos foram dissolvidos a 0,2 M em DMF, HCTU a 0,4 M em DMF, e DIPEA a 1,6 M em N-metilpirrolidona (Alfa Aesar). Os tempos de acoplamento foram geralmente 30 minutos, e os tempos de desproteção 2 x 2,5 minutos. Fmoc-N-metilglicina (Fmoc-Sar-OH, Merck) foi acoplada por 1 hora, e desproteção e tempos de acoplamento para o seguinte resíduo foram 20 min e 1 hora, respectivamente. Após síntese, a resina foi lavada com diclorometano, e secada. A clivagem de grupos de proteção de cadeia lateral e do suporte foi efetuada usando 10 mL de 95:2.5:2.5:2.5 v/v/v/p de TFA/H2O/iPr3SiH/ditiotreitol por 3 horas. Em seguida a clivagem, a resina gasta foi removida por filtração, e o filtrado foi adicionado a 35 mL de dietiléter que foi resfriado a -80°C. A pelota de peptídeo foi centrifugada, o sobrenadante etérico descartado, e a pelota de peptídeo lavada com éter frio duas vezes. Os peptídeos foram, em seguida, resolu- bilizados em 5-10 mL de acetonitrila-água, e liofilizados. Uma pequena amostra foi removida para análise de pureza do produto bruto por es- pectrometria de massa (MALDI-TOF, Voyager DE de Applied Biosystems). Em seguida à liofilização, pós de peptídeo foram tomados em 10 mL de 6 M guanidinium hidrocloreto em H2O, suplementado com 0,5 mL de 1 M ditiotreitrol, e carregados em uma coluna de HPLC preparativa C8 Luna (Phenomenex). Solventes (H2O, acetonitrila) foram acidificados com 0,1% de ácido heptafluorobutírico. O gradiente variou de 30-70% de acetonitrila em 15 minutos, a uma taxa de fluxo de 15/20 mL /min, usando um sistema de HPLC preparativa Gilson. Frações contendo material de peptídeo linear puro (conforme identificado por MALDI) foram combinadas, e modificadas com trisbromometilben- zeno (TBMB, Sigma). Para isto, peptídeo linear foi diluído com H2O até ~35 mL, ~500 uL de 100 mM de TBMB em acetonitrila foi adicionado, e a reação foi iniciada com 5 mL de 1 M NH4HCO3 em H2O (pH 8). A reação foi permitida proceder por ~30 -60 min a temperatura ambiente, e liofilizada uma vez que a reação tenha completada (julgada por MALDI). Em seguida a liofilização, o peptídeo modificado foi purificado conforme acima, enquanto que substituindo a Luna C8 com uma coluna Gemini C18 (Phenomenex), e mudando o ácido para 0,1% de ácido trifluoroacético. Frações puras contendo o material modificado de TMB correto foram reunidas, liofilizadas e mantidas a -20 graus C para armazenagem.

[00199] Amino ácidos não naturais foram adquiridos a partir das fontes colocadas na Tabela 7.

[00200] Amino ácidos volumosos ou impedidos (NMe-Ser, NMe-Trp, NorHar, 4FenilPro, Agb, Agp, NMe-Arg, Pen, Tic, Aib, Hyp, NMe-Ala, NMe-Cys, 4,4-BPAl, 3,3-DPA, Dpg, 1NAl, 2NAl, Aze, 4BenzylPro, Ind) foram usualmente acoplados por 1 hora (20 min de desproteção), e 6 horas para o resíduo que seguiu (20 min de desproteção). HCTU foi usado como um reagente de acoplamento como antes. A escala foi usualmente a 50 umole.

Síntese de peptoides, ligações de amida reduzidas e peptídeos α-N- metilatados

[00201] Peptoides (isto é, N-His7) foram sintetizados de acordo com o esquema desenvolvido por Zuckermann et al. (Ronald N. Zucker- mann, Janice M. Kerr, Stephen B. H. Kent, Walter H. Moos, Método eficiente para a preparação de peptoides [glicinas oligo(N- substituídas)] por síntese de fase sólida de submonômero Journal of the American Chemical Society, (1992), 114(26), 10646-10647).

[00202] Pseudo ligações de peptídeo de amida reduzida foram sintetizadas de acordo com o esquema em Sasaki Y, Coy DH., Solid phase synthesis of peptides containing the CH2NH peptide binding isostere, Peptides. 1987 Jan-Feb;8(1):119-21.

[00203] Peptídeos N-metilatados (NMe-His, NMe-Gln) foram sintetizados usando uma forma modificada da reação de Mitsunobu, de acordo com um esquema descrito em Nature Protocols, "Synthesis of N-metilated cyclic peptides", por Chatterjee et al, 7(3) 2012, pp432. Todos os outros aminoácidos N-metilatados (NMe-Leu, NMe-Asp) foram obtidos como precursores Fmoc de fontes comerciais.

Ensaios de enzima

[00204] Ensaios de enzima funcional foram conduzidos em 10 mM de Tris HCl, 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2 e 1mg/mL de BSA (todos de Sigma UK) pH 7,4 a 25°C em placas de 96 cavidades negras sólida. Brevemente, 26,5 pM de calicreína de plasma humano (comprada de Stratech, UK) ou 500 pM de Calicreína de plasma de rato (expressa e purificada em casa) foi incubada na ausência ou presença de concentrações aumentadas de peptídeo de teste por 15 minutos antes da adição do substrato fluorogênico Z-PheArg- AMC (Enzo Lifesciences UK) a uma concentração de ensaio final de 100 μM em 4% de DMSO. A liberação de AMC foi medida usando um Pherastar FS (BMG Labtech), excitação de 360 nm, emissão de 460 nm. A taxa da fase linear da reação, tipicamente 5 a 45 minutos, foi calculada em software de análise de dados MARS (BMG labtech). A taxa foi, em seguida, usada para calcular o IC50 e Ki no Prisma (GraphPad). Uma equação de regressão não linear de inibição de quatro parâmetros foi usada para calcular o IC50. A equação de Ki ajustada de Um local foi usada para calcular a Ki, restringindo a Ki ao Km para o substrato que é 150 μM. Todos os valores de Ki/IC50 são a média de pelo menos dois experimentos independentes, e pelo menos três para peptídeos com valores de Ki mais baixos do que 1 nM.

[00205] Os peptídeos foram dissolvidos como os sais de TFA em sua forma de pó, e soluções de estoque foram usualmente preparadas em água. Todas as soluções foram centrifugadas e filtradas (filtros de seringa de 20 μm) antes da medição da absorção a 280 nm. Os coeficientes de extinção foram calculados baseados no teor de Trp/Tyr do peptídeo, e aquele de TMB (o núcleo de TMB, quando contido em um peptídeo, tem um ε de ~300 M-1cm-1). Para peptídeos contendo ami- noácidos não naturais com propriedades cromafóricas suspeitas (isto é, NorHar, 4FenilPro, 3Pal, 4Pal, Tic, 4GuanPhe, 4,4-BPAl, 3,3-DPA, 1NAl, 2NAl, 4BenzylPro, Ind), concentrações foram determinadas por pesagem do pó e dissolução do peptídeo em uma quantidade definida de água. Estes foram preparados independentemente, duas vezes, para peptídeos com uma Ki para Calicreína a 1 nM ou menos.

Perfilação de estabilidade de plasma

[00206] Três métodos foram empregados para avaliar a estabilidade de biciclos (peptídeos conjugados para suportes moleculares) no plasma.

Método #1:

[00207] Um ensaio de perfilação de estabilidade de plasma rápido foi desenvolvido que emprega detecção de espectrometria de massa (MALDI-TOF, Voyager DE, Applied Biosystems) da massa de origem, até o momento quando a massa de peptídeo de origem não foi mais observável. Especificamente, 200 uM de peptídeo foi incubado na presença de 35% de plasma de rato ou plasma humano (Sera labs, usando citrato como anticoagulante) a 37°C, que foi suplementado com 1 x PBS (derivado de um Estoque de 10 x PBS, Sigma). Em vários pontos de tempo (isto é, t = 0, 3, 24 horas, consequentemente após diariamente até 10 dias), 2 uL de amostra foi adicionado a 18 uL de 30 mM de bicarbonato de amônia em uma mistura 1:1 de acetonitrila:H2O. As amostras foram congeladas a -80 graus C até o momento de análise. Para análise de espectrometria de massa que determina a janela de detecção aproximada do peptídeo, a amostra diluída de acetonitri- la:H2O de um dado ponto de tempo foi manchada diretamente (0,7 uL) na placa MALDI. A matriz (ácido alfa-cianocinâmico, Sigma, preparada como uma solução saturada em 1:1 de acetonitrila:água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético) foi colocada em camadas sobre a amostra (1 uL). A um ajuste de intensidade a laser similar no MALDI TOF, o tempo pode, em seguida, ser determinado até que o peptídeo de origem não foi mais detectável. Deve ser notado que isto é um ensaio qualitativo que serve para detectar mudanças relativas na estabilidade do plasma.

Método #2:

[00208] Para obter dados de estabilidade mais rapidamente, os peptídeos foram também avaliados em 95% de plasma. Aqui, PBS foi omitido, e um estoque de peptídeo de 1 mM (em DMSO) foi diretamente diluído no plasma (isto é, 2,5 uL de estoque em 47,5 uL de plasma), dando uma concentração final de 50 uM. Amostras de 5 uL foram tomadas em pontos de tempo apropriados e congeladas a -80 graus C. Para análise, as amostras foram descongeladas, misturadas com 15 uL de 1:1 de acetonitrila:metanol, e centrifugadas a 13k por 5 min. 5 uL do sobrenadante contendo peptídeo foi aspirado e misturado com 30 mM de bicarbonato de amônia em uma mistura 1:1 de acetonitrila:H2O. 1 uL deste foi, em seguida, manchado na placa MALDI e analisado conforme descrito acima. Conforme acima, deve ser notado que este é um ensaio qualitativa que serve para detectar mudanças relativas na estabilidade do plasma.

Método #3:

[00209] Para obter estabilidade de plasma quantitativamente, soluções de estoque de peptídeo (1 mM em DMSO) foram carregadas a Biofocus, UK, que realizaram a análise. Os peptídeos foram diluídos a 100 uM com água, e diluídas 1:20 em plasma (5 uM de concentração final, com o plasma a 95%), amostrados conforme apropriado, precipitados conforme acima, e quantificados usando um Waters Xevo TQ- MS.

Exemplo 1: Identificação de resíduos preferidos para atividade de ligação

[00210] A partir dos exemplos de 5x5 peptídeos mostrados na Tabela 4, é possível identificar aminoácidos que são conservados entre peptídeos com atividade de ligação. Para determinar quais resíduos foram preferidos para atividade de ligação, representativos de duas das famílias identificadas de peptídeos foram estudados adicionalmente. Estes eram peptídeos 06-34, que compreendem um motivo de CXWPARC no primeiro ciclo do biciclo, e peptídeo 06-56, que compreende um motivo de CGGxxNCR através de ambos ciclos do biciclo. Para cada sequência de peptídeo, um conjunto de 10 bibliotecas de fago foi criado em que 9 dos resíduos de ciclo foram mantidos constantes, e o outro resíduo foi randomizado de modo que qualquer ami- no-ácido pode ser expresso na biblioteca naquela posição. (Ver ‘Randomisation of individual positions - Library construction’ nos Métodos acima). Para cada biblioteca, um conjunto de 20 clones de fago aleatoriamente selecionados foi classificado para ligação a calicreína humana em um ensaio de ligação de fago para identificar os resíduos críticos para ligação alvo. (Ver ‘Randomisation of individual positions - Assay of binding of individual clones’ nos Métodos acima). Os dados deste experimento são mostrados nas Figuras 4 e 6.

[00211] Para peptídeo 06-34 (Figura 4), fica claro que Arg1 do bici- clo pode ser substituído com uma variedade de aminoácidos diferentes e ligação a calicreína de plasma humano é retida ou intensificada. Por contraste, a substituição de resíduos 2, 3, 4, 5 (Trp2, Pro3, Ala4, Arg5) por muitos aminoácidos reduz grandemente o sinal visto em um ensaio que foi composto com um corte estringente para ligantes de alta afinidade. Val6 pode ser substituído por muitos aminoácidos diferentes, e a atividade de ligação é retida ou intensificada. A substituição de outros resíduos no segundo ciclo indica que somente Leu10 pode ser substituído por uma variedade de aminoácidos diferentes, enquanto que retendo a atividade. As posições 7, 8, e 9 têm capacidade limitada para substituição, e nenhuma substituição foi identificada que intensifica a ligação.

[00212] Para o peptídeo 06-56 (Figuras 5 e 6), fica claro que as gli- cinas na posição 1 e 2 são os resíduos grandemente preferidos para ligação a calicreína de plasma como são arginina, triptofano e treonina nas posições 6, 8, e 9. Glutamina na posição 4 e treonina na posição 10 podem ser substituídas por uma variedade de resíduos, enquanto que retém boa atividade de ligação. Os três resíduos remanescentes - prolina na posição 1, asparagina na posição 5 e treonina na posição 7 têm capacidade limitada para substituição.

Análise de substituições de amino-ácido

[00213] A partir da análise precedente, é aparente que para 06-34, posição um e posição seis podem ser substituídas por uma variedade de aminoácidos e ainda retém atividade de ligação igual ou maior do que aquela do peptídeo de origem. Para avaliar se estas observações manteriam os peptídeos sintéticos isolados, um conjunto de peptídeos foi designado de acordo com as descobertas na Figura 4, onde Arg1 foi substituído por uma serina, e onde Val6 foi substituído por, ou treo- nina, metionina ou leucina. Os peptídeos empregando as várias combinações destas substituições foram também sintetizadas. Estas substituições produzem um maior sinal de ligação no ensaio (Tabela 5).

[00214] Todos dos peptídeos variantes sintéticos têm atividade aproximadamente equivalente, ou atividade intensificada contra cali- creína de plasma humano em ensaios de inibição de enzima comparado ao peptídeo de origem 06-34, indicando que este tipo de análise pode ser usado para afinidades de ligação alvo de sintonia fina, e sugerindo uma rota para identificar candidatos de peptídeo condutor de potências muito altas.

[00215] Os peptídeos foram também testados contra Calicreína de plasma de rato em ensaios de enzima isolados. A substituição de Arg1 por Ser1 tem um impacto marginal na atividade contra calicreína do rato, onde substituições de Val6 por treonina, metionina ou leucina geram peptídeos com potência marcadamente aumentada contra Cali- creína de plasma de rato. A atividade para calicreína humana foi totalmente retida. Desse modo, pela determinação das posições receptivas a substituições, os peptídeos com propriedades desejáveis, tais como reatividade cruzada ortóloga alvo, podem ser identificados.

[00216] Para demonstrar a possibilidade de substituição destas duas posições com aminoácidos não naturais de modo a ter a capacidade de introduzir funcionalidades ou propriedades que não estão presentes no peptídeo de origem, Arg1 e Val6 no 06-34-03 foram substituído com ou alanina ou N-metilglicina (sarcosina), ou com N-metil serina na posição 1, e avaliados para ligação. Remarcadamente, conforme mostrado na Tabela 6, as posições 1/6 são receptivas à remoção da cadeia lateral, à medida que os peptídeos R1A/V6A (06-34-03 Ala1,6) retêm potência total comparada à origem. A substituição de resíduos 1,6 com N-metilglicina (06-34-03 NMeGly1,6) causa uma redução na potência; contudo, a afinidade de ligação permaneceu na faixa nanomolar baixa. A introdução de uma N-metilserina na posição 1 causa uma perda de dez vezes na potência, mas a ligação permanece na faixa picomolar. Desse modo, certas posições no biciclo podem ser identificadas, que permitem mudanças na estrutura de suporte de pep- tídeo ou cadeias laterais, que podem permitir intensificação deliberada de estabilidade de protease, solubilidade intensificada, potencial de agregação reduzido, e introdução de grupos funcionais ortólogos.

Exemplo 2: Análise detalhada de domínio de WPAR.

[00217] O motivo de WPAR identificado do Exemplo 1 foi analisado no contexto do peptídeo 06-34-03, de modo a identificar alternativas ou aperfeiçoamentos ao motivo de WPAR. Uma biblioteca foi construída onde as posições 1, 6, 7, 8, 9 &10 de 06-34-03 foram fixadas e po- sições 2, 3, 4 & 5 foram randomizadas (ver ‘Randomisation of peptide domains - Library construction’ nos Métodos acima). Seleções contra calicreína de plasma humano foram realizadas a uma variedade de estringências (ver Phage selections’ nos Métodos acima). Todas as sequências de saída foram identificadas e analisadas para ligação alvo (ver ‘Randomisation of peptide domains - Assay of binding of individual clones’ nos Métodos acima). A Tabela 17 lista cada sequência única, sua abundância relativa na saída de seleção (frequência), e um número de ranque de acordo com a resistência de ligação alvo.

[00218] A Tabela 17 mostra que o motivo de WPAR confere a melhor ligação a calicreína de plasma humano, embora outras sequências de Ligação de calicreína são recuperadas de seleções em alta abundância. Estes incluem, mas não são restritos a: WPSR, WPAR, WSAR, WPFR, WPYR, FPFR, & FPFR. Os motivos mais efetivos e abundantes nas posições 2, 3, 4 & 5 podem ser resumidos como: W/F P x K/R.

[00219] A Tabela 18(A) mostra que WPAR & WPSR foram mais abundantes nas saídas de seleção mais estringentes; FPFR & FPYR foram abundantes nas saídas de seleção de estringência mais baixa. Isto indicaria que sequências similares à WPAR são ligantes mais fortes do que as sequências similares à FPFR. A análise de cada motivo (dentro do contexto de 06-34-03) no ensaio de ligação alvo (Tabela 18(B)), revela que WPAR nas posições 2, 3, 4 & 5 da sequência de 0634-03 é a sequência ótima para Ligação de calicreína.

Exemplo 3: Otimização da sequência fora do farmacóforo de WPAR

[00220] O motivo de WPAR e suas variantes foram estudados dentro do contexto de peptídeo 06-34-03. A Figura 1 demonstra que algumas posições fora do motivo de WPAR podem manter uma Ligação de calicreína quando substituídas por outros resíduos. De modo a estudar os determinantes de não WPAR de Ligação de calicreína, uma biblio- teca de fago foi gerada com uma sequência de WPAR fixa e todas as outras posições randomizadas (CxWPARCxxxxxC) conforme descrito em ‘Randomisation of peptide domains - Biblioteca construction’ nos Métodos acima.

[00221] 80 membros de biblioteca aleatórios foram isolados direta mente a partir da reunião de biblioteca (nenhuma seleção) e ensaiados para ligação a Calicreína em ambas alta e baixa estringência (ver ‘Randomisation of peptide domains - Assay of binding of individual clones’ nos Métodos acima). Estes membros de biblioteca, que contêm sequências aleatórias fora do WPAR, mostraram pouca ou nenhuma ligação a calicreína de plasma humano (dados não mostrados), indicando que a presença de um motivo de WPAR sozinha não é suficien-te para reter Ligação de calicreína mensurável: o restante da sequência de biciclo deve também contribuir ou influenciar a interação.

[00222] As seleções contra calicreína de plasma humano foram realizadas com esta biblioteca de modo a estudar os determinantes não WPAR de Ligação de calicreína, e para isolar a sequência de peptídeo contendo WPAR ótimo. Acima de 150 sequências de saída de seleção foram isoladas e classificadas para ligação a calicreína de plasma humano (conforme descrito nos Métodos acima). As sequências foram ranqueadas de modo a Ligação de calicreína e as 50 sequências superiores foram alinhadas na Tabela 19. A Tabela 19 mostra que o resíduo na posição 1 não afeta a Ligação de calicreína, mas um forte consenso para Histidina é visto na posição 7 (que suporta as descobertas no Exemplo 1 acima). O peptídeo 06-34-03 - derivado da operação no Exemplo 1 - é uma das melhores sequências. A composição do segundo ciclo mostra clara tendência que confere forte Ligação de cali- creína quando com um motivo de WPAR.

[00223] Os melhores ligantes contendo WPAR para a calicreína de plasma humano tem a tendência: C X W P A R C T/L H Q/T D L C

[00224] H7, D9 e L10 são pesadamente conservados em sequên cias de ligação de calicreína contendo WPAR.

[00225] Dois motivos dentro do segundo ciclo de biciclo (posições 6 a 10) foram identificados: 1. C X W P A R C TH Q/T D L C (posições 6, 7 &10: "THxxL") 2. C X W P A R C T/L H Q/T D L C (posições 7, 8, & 10: "xHxDL")

[00226] Acima de 120 ligantes de calicreína de plasma humano identificados (sequências de saída de seleção) foram agrupados de 2 modos diferentes, de acordo com sua derivação de motivos "THxxL" ou "xHxDL". Para todos os grupos, o sinal de ensaio de ligação de ca- licreína médio para sequências de saída foi notado como uma medida de ligação de calicreína para um dado grupo (Tabela 20).

[00227] Os dados de Ensaio de ligação de calicreína mostrados na Tabela 20 demonstram que os motivos ‘THxxL’ e ‘xHxDL’ resultam na melhor ligação de calicreína quando em um peptídeo bicíclico com um motivo de WPAR. A combinação dos 2 motivos, ‘THxDL’, dá a ligação mais alta para calicreína de plasma humano, e inclui a sequência de segundo ciclo ‘THQDL’ do peptídeo 06-34-03.

Exemplo 4: Análise sistêmica de estabilidade de plasma.

[00228] Para um biciclo de inibição de calicreína, é pertinente obter um perfil de estabilidade de protease adequado, tal que ele tem uma baixa eliminação acionada por protease em plasma ou outros ambientes relevantes. Em um ensaio de estabilidade de plasma comparativo rápido (seção de métodos, método #1) que observou o desaparecimento progressivo de peptídeo de origem em plasma de rato, foi verificado que a alanina N-terminal (que está presente no momento de seleções e foi originalmente incluída em peptídeos sintéticos de sequências condutoras), é rapidamente removida através de todas as sequências de biciclo testadas por ambos plasma de rato e plasma hu- mana. Esta degradação foi evitada por sintetização de um candidato principal carecendo de ambas alaninas N- e C-terminal. Para remover pontos de reconhecimento potenciais para amino- e carboxipeptida- ses, o amino-terminal livre que agora reside em Cys 1 do candidato principal é coberto com anidrido acético durante síntese de peptídeo, conduzindo a uma molécula que é N-terminalmente acetilatada. Em uma medida igual, a cisteína C-terminal é sintetizada como a amida de modo a remover um ponto de reconhecimento potencial para carboxi- peptidase. Desse modo, os candidatos principais bicíclicos têm a seguinte sequência genérica: Ac- C1AA1AA2AAnC2AAn+1AAn+2AAn+3C3(TMB)-NH2, onde "Ac" se refere a acetilação N-terminal, "-NH2" se refere a amidação C-terminal, onde "C1, C2, C3" se refere a primeira, segunda e terceira cisteína na sequência, onde "AA1" a "AAn" se refere à posição do aminoácido (cuja natureza "AA" é definida pelas seleções acima descritas), e onde "(TMB)" indica que a sequência de peptídeo foi ciclizada com TBMB ou qualquer outro suporte reativo adequado.

[00229] Devido à alta afinidade de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 a ambas calicreína humana (Ki = 0,17 nM) e calicreína do rato (IC50 = 1,7 nM), nós escolhemos este Biciclo para desenvolvimento de condução (Figura 9, Tabela 1, Tabela 5). Usando o mesmo ensaio de perfilação de estabilidade de plasma rápido acima, Ac-06-34-18(TMB)-NH2 tem uma janela de observabilidade de cerca de 2 dias (seção de métodos, método #1), que se iguala a uma meia vida de plasma de rato de ~ 2 horas (conforme determinado quantitativamente por LC/MS, ver abaixo, tabela 23, método #3).

[00230] Em um esforço para identificar o(s) local(is) de reconhecimento proteolítico em Ac-06-34-18(TMB)-NH2, o peptídeo foi amostrado em 35% de plasma de rato com o tempo (método #1), e cada amostra foi analisada para o aparecimento progressivo de fragmentos de peptídeo usando espectrometria de massa de MALDI-TOF. A massa de origem de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 é 1687 Da. Com o tempo (Figura 7, 8), os fragmentos aparecem das massas 1548,6 (M1), 1194,5 (M2), e 1107,2 (M3). Da sequência de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 (Ac- C1S1W2P3A4R5C2L6H7Q8D9L10C3-NH2), pode ser calculado que o pico de M1 corresponde a Ac-06-34-18(TMB)-NH2 carecendo de Arg 5 (- R5). Isto parece ser o evento proteolítico inicial, que é seguido por remoção do segmento de 4-aminoácido WPAR em Ac-06-34-18(TMB)- NH2 (M2, -WPAR), e finalmente o primeiro ciclo total de Ac-06-34- 18(TMB)-NH2 é excisado (M3, -SWPAR) (Figura 8). A partir deste dado, é evidente que Arg 5 de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 é o local de reco-nhecimento de plasma de rato principal que é responsável pela degradação do Biciclo.

Substituições de alanina e mistura de primeiro ciclo:

[00231] Tendo identificado Arg 5 na constituição do local de reconhecimento para proteases de plasma de rato, uma campanha de síntese química de derivados de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 foi suportada com o objetivo de identificar candidatos com estabilidade proteolítica de plasma mais alta. Crucialmente, tais modificações não devem afetar a potência contra calicreína humana ou calicreína do rato. Uma exploração inicial relacionada ao papel da sequência/farmacóforo de WPAR (Figura 9, 10) foi realizada por substituição de W2P3 com A2A3 ou A2Q3 e por mistura de partes ou o primeiro ciclo total do biciclo. A Tabela 8 abaixo mostra as sequências e as respectivas afinidades contra Calicreína.

[00232] A partir destes dados fica claro que a remoção concomitante de W2P3 reduz dramaticamente a ligação a Calicreína por um fator de ~100000, tornando efetivamente a molécula farmacologicamente inerte. A importância da sequência correta dos aminoácidos é realçada pelos quatro peptídeos misturados (Scram 1-4), a medida que todos deles revelam uma redução substancial na afinidade em direção a Ca- licreína (Figura 10). Curiosamente, todos os peptídeos têm um perfil de estabilidade de plasma de rato grosseiramente idêntico (entre 1 a 2 dias, método #1), indicando que o reconhecimento de protease de plasma ocorre na presença da arginina (produzindo um padrão de degradação similar à Figura 7), e não em sua posição dentro da sequência.

[00233] Em seguida, cinco derivados de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 foram gerados onde W2, P3, A4, R5, e C2 foram substituídos com suas respectivas contrapartes D-enantioméricas (Tabela 9).

[00234] A partir dos dados, fica claro que a substituição de D- aminoácido de A4, R5, e C2 aumenta a estabilidade de peptídeo em direção a proteases de plasma. Conforme a excisão de Arg 5 por proteases de plasma de rato parece ser o primeiro evento na degradação de peptídeo, a hidrólise inicial de ligações de peptídeos ocorrerá no lado N- e/ou C-terminal de Arg 5. É plausível que a substituição dos aminoácidos a qualquer lado de Arg 5 com seus D-D-enantiômeros bloqueie hidrólise de ligação de peptídeo adjacente através de impedimento estérico. De fato, este é um efeito que foi observado previamente (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).

[00235] O efeito nocivo de substituição de D-aminoácido nas afinidades para Calicreína é surpreendente em todos os casos; perdas nas faixas de potência de 300 (D-Arg 5) a 45000 vezes (D-Trp2). Isto realça a importância da revelação tridimensional correta destas cadeias laterais ao pacote de ligação de biciclo de Calicreína. Igualmente surpreendente é o efeito de D-Ala4: aqui, a mudança da orientação de um grupo metil único (sendo a cadeia lateral de Ala) reduz a afinidade 7000 vezes.

N-metilações:

[00236] Em seguida, os resíduos no primeiro ciclo foram sistemati- camente substituídos com suas contrapartes de N-metil. A N-metilação serve como uma proteção simples da própria ligação de peptídeo; contudo, devido a ausência da amida hidrogênio, a adição de volume es- térico (o grupo metila) e mudanças nos ângulos torsionais, perdas nas potências são esperadas.

[00237] A Tabela 10 sumariza os dados.

[00238] N-metilação de aminoácidos no ciclo 1 revela um efeito nocivo menos drástico na potência. Em particular, a N-metilação de Arg 5 ainda produz um ligante nanomolar de dígito único (redução de 20 vezes na afinidade comparada a peptídeo tipo selvagem), e sua estabilidade de plasma de rato excede no tempo de ensaio (fragmentação do peptídeo no MS não foi observável), tornando isto um candidato principal aperfeiçoado atrativo. Como com as substituições de D- aminoácido, a N-metilação de resíduos adjacentes a Arg 5 concede estabilidade intensificada ao peptídeo, presumivelmente através de interferência estérica que afeta hidrólise catalisada por protease de ligação de peptídeos N e/ou C-terminal para Arg 5. De nota, Ser1 pode ser N-metilatado sem uma perda significante na potência, indicando que a integridade do suporte de peptídeo nesta posição não é essencial para ligação.

Substituições de arginina:

[00239] Dada a importância de Arg 5 no reconhecimento por proteases de plasma de rato, um conjunto de análogos de arginina foi testado no condutor de Ac-06-34-18(TMB)-NH2. As estruturas químicas são mostradas na Figura 11, e os dados de potência versus estabilidade são mostrados na Tabela 11.

[00240] Surpreendentemente, todos os análogos de arginina aumentam a estabilidade do peptídeo além do tempo de janela de ensaio, confirmando a importância da integridade de Arg 5 no reconhecimento de protease de plasma. O aumento (HomoArg) ou diminuição do comprimento da cadeia lateral (Agb, Agp) ambos diminuem a afinidade; contudo, a análogo de HomoArg ainda produz um ligante muito bom (Ki = 2,1 nM), com estabilidade intensificada. Aumentando-se o suporte de aminoácido por um grupo de metileno em Arg 5 (um assim denominado beta-aminoácido), enquanto que retendo a mesma cadeia lateral (β-homoArg 5) também produz um ligante com estabilidade intensificada; contudo, às custas de uma redução mais significante na afinidade (Ki = 8,2 nM). A substituição da parte alifática da cadeia lateral de Arg com um anel fenil produz uma ressonância estabilizada, cadeia lateral contendo guanidil mais volumosa e rigidificada (4GuanPhe). De todos os análogos de Arg testados, 4GuanPhe tem a maior afinidade (redução de 2 vezes comparada a um tipo selvagem), a uma estabilidade de plasma intensificada. Interessantemente, o grupo guanidilfenil está estruturalmente próximo ao inibidor de molécula de Calicreína pequena conhecida benzamidina (Stürzebecher et al (1994), Novel plasm kalacrein inhibitors of the benzamidine type. Braz J Med Biol Res. 27(8):1929-34; Tang et al (2005), Expression, crystallization, and three-dimensional structure of the catalytic domain of human plasm Kalacrein. J.Biol.Chem. 280: 41077-89). Além disso, Fenil- guanidinas derivatizadas foram empregadas como inibidores seletivos e inibidores de outra serina protease, uPA (Sperl et al, (derivados de 4- aminometil)fenilguanidina como inibidores seletivos altamente não peptídicos de uroquinase humana (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97(10):5113-8.). Desse modo, Ac-06-34-18(TMB)-NH2 contendo 4GuanPhe5 pode ser visto como um inibidor de molécula pequena, cuja seletividade é concedida pelo Bipeptídeo cíclico circundante. Isto pode compreender um princípio para outros inibidores à base de bici- clo, onde um inibidor de molécula pequena conhecido de baixa seletividade é "enxertado" em um Biciclo na posição correta, conduzindo a uma molécula de potência e seletividade superiores.

[00241] A modificação do próprio grupo Arg guanidila, ou por meti- lação (SDMA, NDMA), remoção da carga positiva (Cit, onde o grupo guanidil é substituído pelo isostérico, mas grupo de ureia não carregado) ou anulação do Arg (Δ Arg) tem efeitos fortemente nocivos na potência de ligação de Calicreína. Desse modo, a integridade e presença do grupo guanidil é crucial, enquanto que a natureza da cadeia lateral que se liga ao grupo guanidil ou suporte em Arg 5 não é. De nota, Arg 5 pode também ser substituído por lisina; contudo, novamente em afinidades reduzidas (ver, WPAK peptide).

[00242] Em sumário, os dados indicam que Ac-06-34-18(TMB)-NH2 empregando ou HomoArg, NMeArg ou 4GuanPhe como substituições de arginina podem constituir candidatos de estabilidade de plasma intensificada com altas afinidades.

Exemplo 5: Aperfeiçoamento da potência de um candidato principal através de modificações não naturais e combinação com modificações de intensificação de estabilidade de plasma.

[00243] O aperfeiçoamento da potência de um dado candidato bicí- clico pode ser viavelmente alcançado através de vários mecanismos. Estes foram parcialmente determinados no Exemplo 4, e podem ser reescritos conforme segue:

[00244] 1. Incorporação de frações hidrofóbicas que exploram o efeito hidrofóbico, e conduzem a taxas mais baixas, tal que afinidades mais altas são alcançadas.

[00245] 2. Incorporação de grupos carregados que exploram intera ções iônicas de longa faixa, conduzindo a mais rapidez nas taxas e a afinidades mais altas (ver, por exemplo, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31)

[00246] 3. Incorporação de restrição adicional no peptídeo, por, isto é

[00247] - Restrição das cadeias laterais de aminoácidos correta mente tal que a perda na entropia é mínima sob ligação alvo;

[00248] - Restrição dos ângulos torcionais do suporte, tal que a perda na entropia é mínima sob ligação alvo;

[00249] - Introdução de ciclizações adicionais na molécula por ra zões idênticas.

[00250] (para revisões, ver Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, e Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

Triptofano e substituições análogas hidrofóbicas:

[00251] Inicialmente, uma faixa de aminoácidos hidrofóbicos foi substituída no local de Trp2 para identificar candidatos que podem substituir o triptofano sensível à oxidação, e para identificar candidatos que podem aumentar as potências (determinando o primeiro ponto acima). As cadeias laterais destes aminoácidos são mostradas na Figura 12, e o dado de afinidade é sumarizada na Tabela 12 abaixo.

[00252] Conforme esperado, nenhuma das modificações aumenta a estabilidade do plasma. 2-Naftilalanina é mais proximamente relacionada a Trp2 e revela uma potência levemente mais fraca do que tipo selvagem, tornando esta uma boa substituição resistente à oxidação para Trp2. Interessantemente, 3,3-DPA2 tem uma estrutura que é muito dissimilar a Trp, ainda o peptídeo correspondente retém alta potência. Isto pode indicar que o pacote de contato de Trp na Calicreína pode ser explorado para ligação de afinidade mais alta por identificação de uma entidade hidrofóbica corretamente designada.

Análogos de prolina:

[00253] Em seguida, nós nos interessamos na determinação do papel de Pro3 no farmacóforo de WPAR em Ac-06-34-18(TMB)-NH2. 4- hidroxi- ou 4-fluoro-trans (L)-prolina (HyP3, 4FluoPro3) foram escolhidos por sua propriedade conhecida na indução de rigidez adicional e helicidade no suporte de peptídeo (Figura 13, Tabela 13). Adicionalmente, a presença do hidroxil no HyP sonda a acessibilidade do solvente da cadeia lateral de prolina. A Ki dos respectivos derivados foram quase idênticas àquele de tipo selvagem, indicando que quaisquer efeitos no suporte de peptídeo são negligíveis, mas também demonstrando que a cadeia lateral é acessível. Para elaborar isto adicionalmente, dois derivados adicionais de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 foram tes-tados, que contêm extensão volumosa no Y-carbono da cadeia lateral de Pro3 (4Fenil-Pro, 4Benzil-Pro). O primeiro revela uma preservação surpreendente de potência, enquanto que o último foi severamente impactado, demonstrando que a cadeia lateral de Pro é acessível, mas limitada a modificações distintas somente. Apesar do volume estérico nestas modificações, a estabilidade do plasma foi idêntica àquela de tipo selvagem. Desse modo, estas modificações não aperfeiçoam a seletividade contra outras proteases.

[00254] Para sondar o efeito de tamanho de anel de prolina na ligação, o análogo de Pro de 4 membros altamente restrito de azetidina ácido carboxílico (Aze), e o anel de 6 membros mais flexíveis (ácido pipecólico, Pip), foram substituídos por Pro3. Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Aze3 se liga a Calicreína com a afinidade mais alta de todos os derivados, superando aquela de tipo selvagem por um fator de 3 (Figura 14, Tabela 13). Parece existir um relacionamento inverso entre o tamanho de anel e Ki, que sugeriria que restrição conformacional na posição 3 de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 é chave para uma molécula de ligação hermética.

[00255] A flexibilidade da cadeia lateral de prolina na toleração de grandes grupos volumosos é realçada pelos análogos de prolina bi/tricíclica Tic, NorHar e Ind (Figura 13). Particularmente para os dois últimos casos, as afinidades são ainda bem na faixa de um dígito nanomolar.

[00256] Finalmente, nós procuramos sondar a requisição da estrutura de anel em Pro3. Para esta finalidade, nós escolhemos ácido aminoisobutírico (Aib, Figura 15, Tabela 13), que, devido a sua substituição metil dupla no carbono alfa, tem um forte efeito estrutural nos aminoácidos vizinhos induzindo α ou 310 helicidade (Toniolo et al (1993), Biopolymers 33, 1061-72; Karle et al (1990), Biochemistry 29, 6747-56). Remarcadamente, este aminoácido não cíclico não natural é bem tolerado no lugar de Pro3, em uma Ki de 1,2 nM. Desse modo, o papel de Pro3 no farmacóforo de WPAR é introduzir uma restrição no suporte de peptídeo. Esta restrição pode ser intensificada pelo emprego de uma análogo de prolina com um tamanho de anel reduzido (ver Aze3). Inversamente, o anel de prolina pode ser substituído relativamente eficientemente com aminoácidos de indução de estrutura não cíclicos, mas aminoácidos de indução de estrutura, tais como Aib.

Análogos Diversos:

[00257] Na tabela 10, foi mostrado que Ser1 no ciclo 1 de Ac-06-34- 18(TMB)-NH2 pode ser N-metilatado com impacto muito menor na potência (0,5 versus 0,17 nM Ki em WT). Nós procuramos determinar se esta localização tolera uma grande substituição dupla no Cα na posição 1. Para esta finalidade, Ser1 foi substituído com Dpg (dipropilglici- na) (Figura 15). A afinidade deste peptídeo a Calicreína é em 1,1 nM, indicando que a posição 1 é muito flexível na acomodação virtualmente de qualquer resíduo volumoso. Desse modo, esta posição no ciclo 1 pode ser explorada para inclusão deliberada de funcionalidades químicas desejáveis ou grupos, incluindo solubilização de aminoácidos, rádio etiquetas, etiquetas de corante, ligadores, locais de conjugação, et cetera.

[00258] Vários análogos de alanina foram também testados na posição 4. Conforme já visto com os N-metil e D-alaninas (Tabela 10, 9), Ala4 é altamente sensível a orientação estérica em Ca, ou para modi- ficação no próprio suporte. Dois mais derivados desta classe realçam isto, como alongamento do suporte de peptídeo em Ala4 (β-Ala4) reduz dramaticamente a afinidade (~20 μM). Conforme esperado de D- Ala4, Aib4 reduz a afinidade a quase a mesma extensão (289 nM, Figura 15 e Tabela 14). Remarcadamente, a extensão da cadeia lateral de Ala por um metileno (Aba4) parece intensificar a afinidade de Cali- creína.

[00259] Finalmente, a cisteína central (Cys2) foi substituída com um análogo mais volumoso e mais restrito, penicilamina (Pen, Figura 15) na esperança de aumentar a estabilidade proteolítica devido ao acesso parcial reduzido ao ponto de reconhecimento de Arg 5 protease vizinha. De fato, a estabilidade do plasma de rato foi levemente intensificada; contudo, a potência caiu significantemente, realçando a importância da integridade total deste resíduo que conecta suporte estrutural.

[00260] Combinação de intensificação de estabilidade de plasma e intensificação de potência de aminoácidos não naturais em um condutor de biciclo simples

[00261] Substituições não naturais em Ac-06-34-18(TMB)-NH2 que retêm potência apreciável e estabilidade máxima de plasma de rato (conforme determinado pelo método #1) foram as variantes Arg 5 ho- moarginina (HomoArg 5), 4-guanidilfenilalanina (4GuanPhe5) e N-metil arginina (NMeArg 5). Substituições não naturais em Ac-06-34- 18(TMB)-NH2 que aumentam a potência comparada ao peptídeo tipo selvagem foi o análogo de Pro3 azetidina ácido carboxílico (Aze3) e o análogo Ala4 2-ácido aminobutírico (Aba4). Desse modo, Aze3, Aba4 foram combinados com a estabilidade de protease que intensifica HomoArg 5, 4GuanPhe5 e NMeArg 5 para determinar se este produziria candidatos de peptídeo com alta estabilidade de plasma e potência aumentada.

[00262] As Tabelas 15 e 16 apresentam as afinidades dos vários construtos, junto com as estabilidades de plasma.

[00263] Primeiramente, a determinação quantitativa de meias vidas de plasma de rato (4a coluna, Tabela 15) de análogo de arginina contendo peptídeos revelou que a NM-metilação de Arg 5 foi mais potente na proteção do peptídeo (t1/2 >20 horas), seguido por HomoArg 5 e GuanPhe5. O efeito protetor forte de N-metilação de Arg é talvez não surpreendente a medida que ele impede diretamente a hidrólise da ligação de peptídeo. Após inclusão de Aze3 nestes compostos, a afini-dade destes peptídeos pode ser intensificada em todos os casos, produzindo candidatos atrativos de Ac-(06-34-18) Aze3 HomoArg 5 e Ac- (06-34-18) Aze3 NMeArg 5 para desenvolvimento adicional (Tabela 15, Figura 16).

[00264] O efeito de intensificação de afinidade de Aba4 não pode ser reproduzido no contexto de Aze3 e qualquer dos análogos de argi- nina, visto que os valores de Ki foram mais altos do que aqueles observados sem Aba4. Desse modo, os efeitos de intensificação de potência de Aze3 são independentes da substituição tipo Arginina, enquanto que aqueles de Aba4 provavelmente não são.

[00265] Finalmente, a atividade em direção a calicreína do rato destes peptídeos é reduzida significantemente (Tabela 15). Contudo, estes valores são relativos e não quantitativos neste estágio, visto que a preparação de proteína de calicreína do rato não é trivial, e contém impurezas.

Exemplo 6: Intensificação de estabilidade de plasma do condutor de biciclo de calicreína FPYR livre de Trp e intensificação de afinidade por Aze3

[00266] A partir da saída de seleção nos Exemplos 1 a 4, nós descobrimos várias sequências se assemelhando a Ac-06-34-18(TMB)- NH2 que tem uma alta abundância, mas contêm motivos de WPAR alterados. Estes foram WPSR e FPYR. O último, em particular, é interessante a medida que ele carece de triptofano sensível à oxidação.

[00267] Biciclos contendo WPSR, FPYR, WPYR e FPAR foram sintetizados e comparados contra o peptídeo de origem de WPAR (Tabela 21).

[00268] Conforme esperado, nenhum dos peptídeos revelam uma estabilidade de plasma significantemente diferente. A substituição de Trp2 com Phe2 incorre em uma redução de 40 vezes na Ki, realçando a requisição da cadeia lateral mais volumosa do Trp2. Contudo, esta redução pode ser compensada pela substituição de Ala4 com Tyr4 (dando o motivo de FPYR), de modo que a afinidade aumenta novamente a quase aquela da sequência tipo selvagem de WPAR (Ki = 0,46 nM). Desse modo, existe interação cooperativa entre os resíduos na posição 2 e posição 4 do biciclo de Ac-06-34-18(TMB)-NH2. Dada a afinidade de ligação alvo alta e falta de Trp2 no Ac-06-34-18(TMB)- NH2 Phe2Tyr4, este candidato foi investigado para aumento da meia vida do plasma de rato empregando a abordagem conforme descrita no exemplo acima. Adicionalmente, nós investigamos a interação entre Phe2 e Tyr4 por substituição destes resíduos com análogos de amino- ácido não naturais.

Substituições não naturais de Phe2/Tyr4 em Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4

[00269] Nós realizamos um conjunto não exaustivo de síntese incorporando substituições no Phe2 ou Tyr4 no condutor Ac-06-34- 18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4. Amino ácidos não naturais foram escolhidos a partir do mesmo conjunto como na Figura 12, e dado de afinidade é resumido na Tabela 22.

[00270] Aqui, substituição com quaisquer dos aminoácidos testados é geralmente bem tolerada, indiferente se a cadeia lateral é uma entidade heteroaromática (3Pal, 4Pal), aromática e volumosa (1Nal, 2Nal, 4,4-BPal), ou uma entidade cicloalifática (Cha). 3Pal é bem tolerado na posição 2 (Ki = 0,91), que é interessante a medida que Pal contém um grupo ionizável (que pode ser explorado para formulação). Parece, contudo, que a combinação original de Phe2/Tyr4 permanece mais potente.

Estabilização de Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4 em plasma de rato e efeito de substituição de azetidina ácido carboxílico 3

[00271] Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4 foi preparado com as substituições de homo-arginina, 4-guanidilfenilalanina e N- metilarginina, na ausência e presença de Aze3. HomoArg/4Guanphe são bem tolerados, com valores de Ki quase idênticos ao peptídeo de origem Phe2Tyr2 (Tabela 23,), e estabilidade de plasma de rato foi intensificada por um fator de 13 (t1/2 = 12,2 horas, Tabela 23, Figura 16). Além disso, valores IC50 para calicreína do rato são similares àqueles de origem, indicando este ser um candidato atrativo para estudos in vivo.

[00272] Substituição de Pro3 para Aze3 no contexto de FPYR novamente produziu candidatos de peptídeo afinidade intensificada, considerado que um peptídeo com uma Ki menor do que 1 nM foi gerada que provavelmente teria uma meia vida maior do que 20 horas em rato (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3Tyr4 NMeArg 5).

Exemplo 7: Aperfeiçoamento da estabilidade de plasma do candidato principal de biciclo 06-34-18 através de substituições de aminoácido simples no Ciclo 2 Identificação de His7 como um local de reconhecimento de protease de plasma maior

[00273] A estabilidade do plasma de rato e do plasma humano dos seguintes peptídeos 06-34-18 modificados de ciclo 1 foi determinada quantitativamente usando LC-MS (Método #3, Tabela 2). Fica claro que as modificações químicas (HArg 5, 4GuanPhe5, NMe-Arg 5) que concedem estabilidade às proteases de plasma de rato não são efetivas no contexto proteolítico de plasma humano.

[00274] Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2 Tyr4 (referido como peptídeo tipo selvagem) foi subsequentemente submetido a plasma humano, e analisado para fragmentos para aparecerem com o tempo. Este foi comparado ao perfil de degradação observado em plasma humano usando o derivado de NMe-Arg 5 de 06-34-18 (Figuras 18a e 18b). A fragmentação foi determinada de acordo com o Método #2.

[00275] De acordo com a informação de espectrometria de massa, endo-hidrólise proteolítica ocorre, ou o lado N- e/ou C-terminal de His7 na sequência 06-34-18, subsequentemente excisando Leu6 (através de uma atividade exo-proteolítica), ou His7-Gln8 (através de uma atividade exo-proteolítica), ou todos os três resíduos juntos. A partir da natureza dos fragmentos observados, é provável que o evento de hidrólise endoproteolítica inicial ocorre na ligação de peptídeo entre Leu6 e His7, preferivelmente do que entre His7 e Gln8. Além disso, o mesmo padrão de fragmentação é observado se o ponto de reconhecimento de protease de plasma de rato no Arg 5 é bloqueado com N-metilação (Figura 18b), indicando que a especificidade proteolítica de plasma humano é distinta daquela do rato.

Avaliação sistemática do papel de resíduos de Ciclo 2, e estabilização contra proteases de plasma.

[00276] Subsequentemente, o papel de cada um dos resíduos do ciclo 2 em termos de seus efeitos na estabilidade de plasma humano e potência de calicreína humana, foi avaliado.

[00277] Usando abordagens experimentais parcialmente esboçadas no antecedente à seção da invenção, uma varredura de aminoácido de ciclo total 2 foi realizada por 1) substituição de cada um dos aminoácidos de ciclo 2 com Alanina para remover a cadeia lateral que serve como um ponto de reconhecimento para a(s) protease(s); 2) substituição de cada um dos aminoácidos de ciclo 2 com suas contrapartes enantioméricas de D-aminoácido para opor esteri- camente acesso pela(s) protease(s) degradativa(s); 3) substituição de alguns dos aminoácidos de ciclo 2 com D-alanina, para opor estericamente acesso à ligações de peptídeo pe- la(s) protease(s).

[00278] Os dados de potência para cada variante são sumarizados nas Tabelas 3a, 3b, e 3c, respectivamente.

1) Varredura de Alanina de resíduos de Ciclo 2

[00279] A Tabela 3a mostra que a modificação de His7 com Ala7 parece reduzir a degradação proteolítica no segundo ciclo, a medida que fragmentos -L, -HQ, -LHQ não foram detectáveis. Contudo, a atividade proteolítica no ciclo 1 no Arg 5 (que foi previamente observada somente com plasma de rato) agora torna-se detectável. Desse modo, fica claro que proteases de plasma humano são capazes de atacarem ambos os pontos de reconhecimento proteolíticos (Arg 5 e His7). Mesmo embora Ala7 pareça intensificar a estabilidade comparada a His7 (como no peptídeo tipo selvagem, sua potência é reduzida signifi- cantemente (56 vezes), trazendo a Kd para 23 nM, que não é suficientemente potente para uma molécula terapêutica. As substituições Ala remanescentes todas reduzem as potências a graus variantes, sem aumentar a estabilidade do plasma contudo (conforme julgado pelo aparecimento de Fragmentos de peptídeo degradados pelo Ciclo 2, Tabela 3a quarta coluna). Juntos, estes realçam a descoberta que a cadeia lateral de His7 é o ponto de reconhecimento de protease.

2) Varredura de D-Amino Ácido de resíduos de Ciclo 2

[00280] A Tabela 3b mostra o efeito de substituição de cada dos aminoácidos com suas contrapartes D-enantioméricas. Esta modificação deixa a cadeia lateral intacta, mas se projeta na configuração al- ternada no Cα. Os D-aminoácidos em qualquer posição dentro do ciclo 2 parecem estabilizar o ciclo 2 do peptídeo de degradação proteolítica; contudo, conforme visto com a variante Ala7 acima, a especificidade se altera agora para o local lábil no ciclo 1 (Arg 5). A alteração de hidrólise para Arg 5 torna difícil quantificar o efeito de estabilização induzida por D-aminoácido no ciclo 2, a medida que este processo independente impacta a quantidade de material remanescente de origem (determinada adicionalmente abaixo). O efeito protetor distal de substituição de D-aminoácido foi reconhecido na literatura e funciona provavelmente por redução ou prevenção estericamente à ligação hidrolisá- vel (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418). Contudo, os D- aminoácidos progressivamente adicionalmente distantes do local de reconhecimento de His7 putativo (isto é D-Asp9, D-Leu10) também mostram uma quantidade menor de fragmentos correspondentes a uma Leucina 6 excisada, que é adjacente a His7.

[00281] Notavelmente, muitas das variantes de D-aminoácido revelam potências fortemente reduzidas (entre 130 a 9000 vezes de redução na potência), sublinhando a natureza tridimensional e estérica da interação de peptídeo com a proteína de calicreína. D-Asp9 parece ser a exceção, em que um aumento na estabilidade é observado, enquanto que 4 nM (9 vezes de redução comparada a WT) de potência é mantida. Esta modificação pode potencialmente ser uma substituição de estabilização útil em uma molécula terapêutica candidata.

3) Varredura de D-Alanina de resíduos de Ciclo 2

[00282] A Tabela 3c mostra o efeito de substituição de umas poucas seleção de aminoácidos de ciclo 2 com D-Alaninas. A remoção das cadeias laterais e introdução do bloco estérico em Cα devido ao grupo metil presentemente introduzido tem efeitos fortemente nocivos em potências. Não obstante, em dois casos, baixas afinidades nanomola- res são retidas (Ac-(06-34-18) D-Ala9, e Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 D- Ala9). Como com D-Asp9, estas modificações podem ser potencialmente uma substituição de estabilização útil em uma molécula terapêutica candidata.

Substituição de cadeias laterais de aminoácido em Leu6, His7 e Gln8 com miméticos de aminoácido

[00283] Subsequentemente a campanha de substituição de amino- ácido de Leu6, His7 e Gln8 foi suportada para avaliar as requisições estéricas, de carga, e estruturais destes resíduos, e para avaliar seu efeito na redução de reconhecimento do local de His7 por proteases de plasma (uma estrutura de Ciclo 2 é apresentada na Figura 19a).

[00284] Abordagens gerais que são adequadas foram discutidas previamente na seção introdutória.

• Substituições na posição 6 no Ciclo 2 de 06-34-18

[00285] No resíduo Leu6, foi procurado introduzir massa estérica no Cβ do aminoácido, com o objetivo de reduzir acesso de protease à ligação entre Leu6 e His7. As estruturas testadas são mostradas na Figura 19b. O efeito na potência é resumida na Tabela 24a. Algumas das modificações mostram intensificação de afinidades comparadas ao peptídeo tipo selvagem, particularmente no contexto de Ac-(06-34-18) (menos desse modo no contexto de Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4). Especificamente, estes são os aminoácidos não naturais fenilglicina (Phg) e ciclohexilglicina (Chg). Todas estas modificações parecem reduzir um tanto a clivagem proteolítica no segundo ciclo, mas o estabilizador mais potente se comprovou ser terc-butilglicina (tBuGly). Este peptí- deo, Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 tBuGly6, mostrou somente remoção de Arg 5 no primeiro ciclo quando submetido a plasma humano. Juntos, quaisquer das modificações de Chg, Phg, e tBuGly podem servir para intensificar a estabilidade de plasma do segundo ciclo. Em adição, nós identificamos duas modificações (Chg, Phg) que intensificam a potência em direção a calicreína.

• Substituições na posição 7 no Ciclo 2 de 06-34-18

[00286] No resíduo 7, o efeito na estabilidade e potência do plasma por substituição da cadeia lateral de histidina foi estudado empregando as seguintes imitações: As piridilalaninas 2Pal, 3Pal, 4Pal são imitações heteroaromáticas ionizáveis básicas da cadeia lateral de imidazole. Tienilalanina (Thi), furilalanina (FuAla), ThiAz, 1,2,4 triazolalanina, (1,2,4 Triaz), tiazolilalanina (ThiAz) são imitações não carregadas hete- roaromáticas de 5 membros da cadeia lateral de imidazole. His1Me/His3Me são derivados de N-metil substituídos da cadeia lateral de imidazole. Dap, Agb e Agp representam substituições de carga positiva da cadeia lateral de imidazole, carecendo de uma cadeia lateral aromática contudo (Figura 19c). A Tabela 24b resume os dados de potência. Surpreendentemente, todos os peptídeos revelam uma estabilidade intensificada em direção a proteases de plasma no ciclo 2, degradação visível ocorreu no Ciclo 1 em Arg 5. Claramente, uma carga positiva na posição 7 não é suficiente para proporcionar um ponto de reconhecimento para proteases de plasma (Dap, Agp, Agb). Inversamente, a remoção da carga positiva enquanto que retendo mimetismo próximo a cadeia lateral de imidazole original também remove o local de reconhecimento proteolítico. Apesar do mimetismo próximo de algumas das estruturas ao anel de imidazole original, todos dos derivados de peptídeo revelam uma afinidade significantemente reduzida para calicreína de plasma. Isto indica que a estrutura intacta de His 7 é requerida para ligação a calicreína com potência total. Candidatos interessantes que retêm baixa ligação nanomolar foram tiazolilalanina, fu- rilalanina, e His1Me. Candidatos putativos interessantes podem ser homohistidina, e imidazolilglicina.

• Substituições na posição 8 no Ciclo 2 de 06-34-18

[00287] Resíduo 8 (Gln8) é mais distal ao local de clivagem que reside entre Leu6 e His7. Umas poucas substituições foram testadas (Figura 19d e Tabela 24c). Amino ácidos negativamente carregados foram introduzidos nesta posição de modo a encorajar uma ponte de sal ao His7 vizinho, que pode reduzir reconhecimento de His7 por proteases de plasma. Uma sequência de Ciclo 2 adicional foi testada, que estava presente nas saídas de seleção de fago, que também carecem de uma histidina 7. Esta sequência de ciclo 2 foi LTTEL (referida como Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 Thr7 Thr8 Glu9). Adicionalmente, um beta aminoácido foi testado na posição 8 (bHGln8, Figura 19d). Um amino- ácido de carga positiva foi também testado nesta posição de modo a reconhecimento potencialmente proteolítico de His7, e subsequente degradação. Enquanto que as potências destas moléculas foram frequentemente < 10 nanomolares, o efeito na estabilização de plasma foi menor. Estas moléculas podem garantir estudo quantitativo adicional para determinar seus efeitos precisos na estabilidade do plasma.

Exemplo 8: Aperfeiçoamento da estabilidade de plasma humano do candidato principal de biciclo 06-34-18 através de modificações de suporte de aminoácido no Ciclo 2

[00288] A modificação de suporte de aminoácido apresenta um meio amplamente reconhecido pelo qual o suporte de peptídeo pode ser protegido de hidrólise de protease (para revisões, ver Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, e Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

[00289] Um método bem estabelecido na técnica é N-alquilatar, por exemplo, N-metilar o Nα de aminoácidos. A Tabela 25a mostra o efeito de substituição sistemática de ciclo de dois suportes de amida com suas contrapartes Nα-metilatadas. Em princípio, este é uma modificação protetora de hidrólise muito efetiva, como não somente a própria ligação de peptídeo é protegida de hidrólise proteolítica, mas também como a massa do grupo metil na Nα tem efeitos protetores nas ligações de peptídeo vizinhas. De fato, efeitos fortemente protetores na proteólise de ciclo 2 são observáveis; contudo, as potências invariavelmente diminuem por um fator de 100 ou maior. Como com a substituição de D-aminoácido, a N-alquilatação protege o local em His7 mesmo quando ele está presente em Asp9 ou Leu10.

[00290] Outro meio pelo qual o suporte de peptídeo pode ser modificado é por N-alquilatação do Nα com uma cadeia lateral de aminoá- cido apropriada (denominada peptoide). A cadeia lateral de homohisti- dina foi introduzida no Nα de His7, enquanto que concomitantemente removendo a cadeia lateral no CNα de His7, produzindo uma N-alquil glicina. A estrutura deste derivado é mostrada na Figura 20a (denominada N-His7), dentro do contexto do segundo ciclo total de 06-34-18.

[00291] Em uma tentativa de modificar a estrutura do próprio suporte de peptídeo, uma forma reduzida da ligação de peptídeo foi introduzida entre Leu6 e His7 (Figura 20b). Aqui, Leu6 foi substituído por Ala6, e o carbonil neste resíduo foi reduzido a metileno, produzindo uma ligação que carece da ligação de peptídeo nativa. Este derivado é referido como "amida reduzida" ou "pseudo ligação de peptídeo", e denominado ΦCH2NH. Devido a ausência do carbonil nesta posição, o peptídeo não pode ser hidrolisado nesta posição, e deve inferir características de estabilidade de protease favoráveis ao peptídeo.

[00292] No ensaio de plasma, ambos derivados de peptídeo (Ac- (06-34-18) Phe2 Tyr4 N-His e Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 Ala(^CH2NH)6) revelam estabilidade significantemente intensificada no ciclo 2. Fragmentos observados somente correspondem a degradação no Ciclo 1, no Arg 5. O dado de potência é resumido na Tabela 25b. Conforme esperado, o derivado de N-His mostrou inibição fortemente reduzida. Contudo, a pseudo amida peptídeo Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 Ala(^CH2NH)6) retém uma potência muito boa em uma Kd de 1,5 nM.

Exemplo 9: Geração de condutores de bipeptídeo cíclico de reativida- de cruzada, potentes, de plasma de rato e plasma humana, estáveis, por modificação química seletiva em ambos Ciclo 1 e Ciclo 2

[00293] A partir dos dois exemplos precedentes, várias modificações de ciclo 2 foram identificadas, que intensificam a estabilidade de protease no ciclo 2, enquanto que revela uma boa potência. A retenção de uma potência apropriada em direção a calicreína de plasma de rato é desejável para estabelecimento de PK/PD em modelos de animal. A potência comparativa do rato é sumarizada para candidatos intensificados por estabilidade de ciclo 2 na Tabela 26a. Muitas das moléculas revelam potências < 100 nM em direção a calicreína de plasma de rato.

[00294] Nos Exemplos 1 a 6, métodos foram revelados pelos quais o Ciclo 1 de 06-34-18 pode ser estabilizado contra proteases de plasma. Estas modificações vantajosas são combinadas com as modificações de intensificação de estabilidade de plasma no Ciclo 2 (Exemplos 7, 8). Vários candidatos representativos foram preparados e avaliados para estabilidade de plasma humano/plasma de rato, bem como potência em direção a calicreína de plasma humano/plasma de rato (Tabela 26b).

[00295] Notavelmente, muitos dos peptídeos revelam, quando em combinação com os modificadores de ciclo 1, melhores potências em direção a calicreína humana e do rato do que peptídeos com os modificadores do ciclo 2 sozinhos (Tabela 26a). Muitas das potências estão em uma faixa aceitável de propostas terapêuticas e de PK/PD (ver dados de calicreína humana e do rato, Tabela 26b).

[00296] Devido a introdução de HArg 5 no lugar de Arg 5 no ciclo 1, e devido a introdução de modificações no ciclo que reduzem proteólise no local His 7, os peptídeos mostrados na Tabela 26a e 26b devem revelar estabilidade intensificada em ambos plasma de rato e humano.

[00297] A estabilidade de plasma foi avaliada comparativamente como antes usando o ensaio de MALDI TOF (Métodos #1 e #2), e for mação de fragmentos hidrolisados peptídicos foi observada com o tempo (para estabilidade tipo selvagem, ver figuras 18a, 21a, 21b). Comparados a peptídeo tipo selvagem, os peptídeos multivariantes Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 (estabilidade de plasma humano: Figura 21d, estabilidade do plasma de rato: Figura 21 e) e Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 D-Asp9 (estabilidade de plasma humano: Figura 21c) revelam uma estabilidade marcadamente intensificada em ambos plasma de rato e humano.

[00298] Juntos, isto mostra que modificações adequadas ambas no Ciclo 1 e Ciclo 2 de 06-34-18 podem ser combinadas para produzir plasma e bipeptídeos cíclicos estáveis altamente potentes, reativos cruzados, que revelam um perfil adequado para proposta terapêutica.

Exemplo 10: Propriedades farmacocinéticas vantajosas in vivo de dois peptídeos condutores, Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ΦCH2NH)6 e Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9

[00299] Peptídeos Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 (que contêm modificações de intensificação de afinidade Aze3 e as modificações de intensificação de estabilidade de pro-tease HArg5 e a ligação de amida reduzida de intensificação de estabilidade de protease de plasma entre Ala6 e His 7 no Ciclo 2) e Ac-(0634-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9 (que contém a modificação de intensificação de afinidade Aze3 e as modificações de intensificação de estabilidade de protease de plasma HArg5 e D-Asp9 no Ciclo 2) foram selecionados para avaliação farmacocinética no rato. A estrutura química total de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(^CH2NH)6 é mostrada na Figura 22.

[00300] As taxas de eliminação a partir da circulação do rato para ambos peptídeos foram avaliadas e comparadas a um peptídeo de controle que foi composta da sequência de Ac-(06-34-18)(TMB) cujos aminoácidos foram substituídos por cada dos respectivos D- enantiômeros (a sequência, desse modo, sendo "(Ac-cswparclhqdlc- NH2(TMB)). Este peptídeo de controle tem composição atômica e sequência idênticas, retém propriedades físico-químicas similares, carece de qualquer potência em direção ao alvo de calicreína, e, importantemente, é completamente resistente a atividades proteolíticas. Desse modo, a eliminação a partir da circulação do rato do peptídeo de controle all D Ac-06-34-18 é acionada muito renalmente, a medida que a eliminação acionada proteoliticamente é ausente. Qualquer protease otimizada estabilizada e Biciclo de inibição de calicreína potente que é baseado na sequência de 06-34-18 deve, portanto, se eliminar a partir da circulação do rato a uma taxa similar ao peptídeo de controle All-D 06-34-18.

[00301] Peptídeos foram aplicados como bolo intravenoso em solução tamponada com PBS a 1,02 mg/mL (contendo 2,9% de DMSO) a 5,2 mg/kg a ratos Sprague Dawley, e amostras de sangue em série foram tomadas de cada animal via cânulas de veia de alto porte a 5, 10, 20, 30, 60, 120, e 240 minutos pós-dose, e transferidas para tubos de EDTA para geração de plasma. O dado foi adquirido para peptídeo "all D Ac-06-34-18" de 3 ratos, para "Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6" de dois ratos, e para "Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 D-Asp9" de dois ratos.

[00302] Amostras de plasma foram, em seguida, tratadas com 3 volumes de uma mistura 1:1 de acetonitrila e metanol, proteínas precipitadas foram removidas por centrifugação, e o sobrenadante foi analisado por UPLC-MS/MS.

[00303] Quantificação para teor de peptídeo nas amostras foi por referência a uma linha de calibração preparada no plasma de rato de controle. Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados por análise não compartimental usando o pacote de software de PK Solutions 2.0 de Summit Research Services.

[00304] O peptídeo (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 revelou uma meia vida de eliminação de 48 minutos, enquanto o controle All D 06-34-18 peptídeo eliminado em uma meia vida de 54 minutos. Os volumes de distribuição para os dois peptídeos foram comparáveis (Tabela 27, Figura 23). Desse modo, o peptídeo farmacologicamente ativo (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 é tão estável quanto a protease farmacologicamente estável de proteína de controle All D 06-34-18, indicando que (Ac-(0634-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 tem propriedades favoráveis para desenvolvimento adicional como um terapêutico (Figura 23). O peptídeo Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 D-Asp9 elimina mais rapidamente; contudo, com uma meia vida de eliminação de ~27 minutos.

[00305] Os parâmetros farmacocinéticos intravenosos para os 3 peptídeos são resumidos na Tabela 27.

[00306] Os resultados sublinham a estabilidade proteolítica intensificada de peptídeo Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6 na circulação in vivo do rato. A eliminação a 5,8 mL/min/kg é muito próxima a taxa de filtração renal publicada em rato (~8-9 mL/min/kg), indicando que eliminação acionada por protease de plasma deste Bipeptídeo cíclico é virtualmente ausente [Jobin J, Bon- jour JP, (1985) Am J Physiol.;248(5 Pt 2):F734-8].

[00307] A menos que de outro modo citado, quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos podem ser usados na prática ou teste da presente invenção. Métodos, dispositivos e materiais adequados para tais usos, são descritos acima. Todas publicações aqui citadas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para a proposta de descrever e revelar as metodologias, reagentes, e ferramentas reportados nas publicações que podem ser usadas em conjunto com a invenção.

Tabelas Tabela 1:

[00308] Potências, Estabilidade de plasma de rato e reatividade cruzada de espécies de Ac-06-34-18, conforme reveladas no PCT/EP2012/069898. 1Determinadas de acordo com o Método #1. 2Determinados de acordo com o Método #3. Tabela reproduzida de PCT/EP2012/069898.

Tabela 2:

[00309] Sumário das estabilidades de plasma humano e de derivados de peptídeo diferentes de Ciclo1-modificado 06-34-18, conforme determinado pelo Método #3.

Tabela 3a:

[00310] Varredura de alanina no Ciclo2. As potências resultantes são comparadas a WT, e fragmentos de peptídeo observados após incubação em plasma humano são notados.

Tabela 3b:

[00311] Varredura de D-aminoácido no Ciclo2. Potências resultantes são comparadas a WT, e fragmentos de peptídeo observados após incubação em plasma humana são notados.

Tabela 3c:

[00312] Varredura de D-Alanina no Ciclo2. Potências resultantes são comparadas a WT. Os fragmentos foram similares àqueles vistos com as substituições de D-aminoácido totais (Tabela 3b). Nota-se que ambos Ac-(06-34-18) e Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 foram também avaliados. Tabela 4: 5x5 peptídeos Tabela 5: 06-34 - substituições baseadas na identificação de resíduos não críticos com aminoácidos naturais *: A numeração do resíduo é da esquerda para a direita, onde resíduos 1-5 estão no ciclo 1, e resíduos 6-10 estão no ciclo 2. Tabela 6: 06-34 - substituições baseadas na identificação de resíduos não críticos com aminoácidos N-metilatados Tabela 7 Tabela 8 Tabela 9

[00313] Efeitos comparativos de substituição de D-aminoácido na potência e estabilidade de plasma de rato. Tabela 10

[00314] Efeitos comparativos de N-metilação de resíduos de ciclo 1 e Cys2 em potência e estabilidade de plasma de rato. Tabela 11

[00315] Efeitos comparativos de análogos de arginina em Ac-06-34- 18(TMB)-NH2 na potência e estabilidade. Nota-se que a modificação de Δ Arg não revela qualquer inibição até 100 μM de peptídeo. Tabela 12

[00316] Efeitos de afinidade comparativos de aminoácidos hidrofó- bicos que substituem Trp2 em Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Tabela 13

[00317] Afinidades comparativas obtidas para derivados de prolina com substituintes de gama-carbono, análogos de tamanhos de anel variados, derivados bi/tricíclicos, e aminoácidos restringidos, tais como Aib Tabela 14

[00318] Efeitos comparativos de substituições misturadas de Ser1, Ala4, e Cys2 Tabela 15

[00319] Intensificação comparativa na potência induzida por incorporação de Aze3 nos candidatos estabelecidos pelo plasma. 1 Estabilidades comparativas estimadas de acordo com o método #1. 2 A verdadeira meia vida de estabilidades de peptídeo em plasma de rato foi determinada de acordo com o método #3. 3 Valores de IC50 são relativos, não absolutos. Tabela 16

[00320] Efeito na potência sob inclusão de Aba4 em peptídeos contendo Aze3 e as modificações de estabelecimento de plasma NMe- Arg5, HomoArg5, e 4GuanPhe5. Tabela 17

[00321] 42 ligantes de calicreína únicos foram identificados de sele ções usando um motivo de WPAR randomizado nas posições 2, 3, 4 & 5 dentro da sequência 06-34-03. As sequências foram ranqueadas de acordo com a ligação de Calicreína, e a abundância relativa nas produções de seleção total foi notada.

[00322] Abundância de motivo particular em cada produção. Sequências de produção foram analisadas de acordo com a estringência de seleção. A % de um motivo particular na produção de uma seleção de estringência particular foi calculada. B. Ligação de calicreína de plasma humano de motivos particulares nas posições 2, 3, 4 & 5 (com posições 1, 6, 7, 8, 9 &10 fixadas àquelas de 06-34-03). Tabela 19

[00323] 50 ligantes de calicreína superiores contendo um motivo de WPAR fixo. A sequência de WPAR foi fixada em uma biblioteca de bi- ciclo com posições 1, 6, 7, 8, 9 & 10 randomizadas. As sequências de produção de seleção de calicreína foram isoladas e ensaiadas para Ligação de calicreína. As sequências foram ranqueadas de acordo com a Ligação de calicreína. A sequência de peptídeo 06-34-03 foi isolada de seleção, e é realçada em vermelho. Tendências são visíveis no segundo ciclo de peptídeos de ligação de calicreína contendo WPAR. Tabela 20

[00324] As sequências de produção de seleções de calicreína com WPAR fixos no 1° ciclo, e seus sinais de ensaio de ligação de calicreí- na associados, foram agrupadas de acordo com sua derivação de motivo ‘THxxL’ (A), ou motivo ‘xHxDL’ (B). O sinal de ensaio de ligação médio para todos os membros de um dado grupo foi calculado. Grupos contendo precisamente o dado motivo são realçados em verde; exemplos de grupos com ou uma mais ou uma menos mudança a partir do motivo são também mostrados. Tabela 21

[00325] Afinidades e estabilidades de variantes de motivo WPAR. Tabela 22

[00326] Efeito de substituições em Phe2/Tyr4 com análogos hidro- fóbicos Tabela 23

[00327] Resumo do efeito de substituições Arg 5 e Aze3 em Ac-06- 34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4. 1 Estabilidades comparativas estimadas de acordo com método #1. 2 A verdadeira meia vida de estabilidades de peptídeo em plasma de rato foi determinada de acordo com método #3. 3 Valores de IC50 são relativos, não absolutos. Tabela 24a:

[00328] Efeito de substituições de aminoácido único na posição 6. As modificações foram testadas ambos no contexto de Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 (coluna esquerda) e Ac-(06-34-18) (coluna direita). Tabela 24b:

[00329] Efeito de substituições de aminoácido simples na posição 7. As modificações foram testadas somente no contexto de Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4. Tabela 24c:

[00330] Efeito de substituições de aminoácido simples na posição 8. As modificações foram testadas somente no contexto de Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4. Tabela 25a:

[00331] Varredura de α-N-metil aminoácido no Ciclo2. As potências resultantes são comparadas a WT, e fragmentos de peptídeo observados após incubação em plasma humana são notados. Tabela 25b:

[00332] Modificações de suporte de peptídeo no Ciclo2. Tabela 26a:

[00333] Potências comparativas de estabilidade de protease de plasma de ciclo 2 intensificam candidatos em direção a calicreína de plasma humano e de rato. Tabela 26b:

[00334] Potências comparativas de derivados 06-34-18 modificados de ciclo 1 e ciclo 2. Nota-se a inclusão de Aze3 (intensificação de afinidade) e modificações de HArg5 (intensificação de estabilidade de plasma) no ciclo 1, e modificações de intensificação de estabilidade no ciclo 2. Tabela 27:

[00335] Parâmetros farmacocinéticos de (Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 Ala(^CH2NH)6, Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 D- Asp9, e Ac-(06-34-18) Todo controle D em rato. Devido a concentrações de peptídeo divergentes de Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4 HArg 5 D-Asp9 em dois ratos individuais, taxas de eliminação e volumes de distribuição não podem ser calculados com confidência.

Claims (9)

1. Ligante de peptídeo específico para Calicreína humana, caracterizado pelo fato de que compreende Cys Ser1 Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Cys Ala(^CH2NH)6 His7 Gln8 Asp9 Leu10 Cys.

2. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende:

3. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que é ligado a um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

4. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento do mesmo é selecionado de uma região constante de cadeia leve de anticorpo (CL), um domínio de cadeia pesada de anticorpo CH1, um domínio de cadeia pesada de anticorpo CH2, um domínio de cadeia pesada de anticorpo CH3, ou qualquer combinação destes, em adição a um ou mais domínios de região constante; ou o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende a região de articulação de um anticorpo; ou o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região Fc de uma molécula IgG.

5. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região de articulação compreende a região entre os domínios CH1 e CH2 de uma molécula IgG.

6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o oigante de peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, junto com um transportador farmacologicamente apropriado.

7. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para uso na prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, câncer, infecção bacterial ou viral, distúrbios oftálmicos e distúrbios autoimunes.

8. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção, supressão ou tratamento de distúrbios oftálmicos.

9. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os distúrbios oftálmicos incluem distúrbios oftálmicos exudativos e/ou inflamatórios, distúrbios relacionados a permeabilidade e/ou integridade de vaso retinal prejudicada, distúrbios relacionados a ruptura de microvaso retinal que conduzem a hemorragias focais, apoio das doenças do olho, doenças retinais e parte dianteira das doenças do olho são selecionados de: degeneração macular relacionada à idade (ARMD), degeneração macular exudativa (também conhecida como degeneração macular relacionada à idade "molhada" ou neovascular (AMD-molhada), edema macular, degeneração macular desconforme com a idade, edema macular cistoide, edema palpebral, edema retinal, retinopatia diabética, neuroretinopatia macular aguda, corioretinopatia serosa central, neovascularização coroidal, macolopatia neovascular, glaucoma neovascular, retinopatias obstrutivas arterial e venosa (por exemplo, oclusão venosa retinal ou oclusão arterial retinal), oclusão de veia central retinal, coagulopatia intravascular disseminada, oclusão de veia retinal de ramificação, mudanças de fundo hipertensivo, síndrome isquêmica ocular, micro aneurisma retinal arterial, doença de Coat, telangiectase parafoveal, oclusão de veia hemi-retinal, papilloflebite, oclusão de artéria central retinal, oclusão de artéria retinal de ramificação, doença de artéria carótida (CAD), angite de ramificação congelada, retinopatia de célula de foice e outras hemoglobinopatias, linhas angióides, edema macular que ocorre como um resultado de etiologias tal como doença (por exemplo, edema macular diabético), lesão do olho ou cirurgia do olho; isquemia retinal ou degeneração produzida, por exemplo, por lesão, trauma ou tumores, uveíte, irite, vasculite retinal, endoftalmite, panoftalmites, oftalmia metastática, coroidite, epitelite de pigmento retinal, conjuntivite, ciclite, esclerite, episclerite, neurite ótica, neurite ótica retrobulbar, queratite, blefarite, descolamento retinal exudativo, úlcera corneal, úlcera conjuntival, queratite numular crônica, ceratite thygeson, úlcera de mooren progressiva, uma doença inflamatória ocular causada por infecção bacterial ou viral, e por uma operação oftálmica, uma doença inflamatória ocular causada por uma lesão física ao olho, um sintoma causado por uma doença inflamatória ocular incluindo prurido, edema e úlcera, eritema, eritema exsudativum multiforme, eritema nodosum, eritema annulare, esclerodema, dermatite, edema angioneurótico, edema laringeal, edema glótico, laringite subglótica, bronquite, rinite, faringite, sinusite, laringite ou otite média.