JP2017502921A - 新規なポリペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、2つ以上のペプチドループが足場に対する結合点の間に内在するように、分子足場に共有結合しているポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、ヒトおよびラットのプロテアーゼ血漿カリクレインに特異的であり、力価および/またはプロテアーゼ耐性を向上させるように1つまたは2つのペプチドループにおいて修飾されているペプチドを記載する。
Description
本発明は、2個以上のペプチドループが分子足場への結合点の間に内在するように、分子足場に共有結合しているポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、ヒトおよびラットプロテアーゼ血漿カリクレインに特異的であり、力価および/またはプロテアーゼ耐性を向上させるように1つまたは2つのペプチドループにおいて修飾されているペプチドを記載する。
環状ペプチドは、タンパク質標的に高い親和性および標的特異性で結合することができ、したがって治療法の開発のために魅力的な分子クラスである。実際に、例えば、抗菌性ペプチドのバンコマイシン、免疫抑制薬のシクロスポリンまたは抗癌薬のオクトレオチド(octreotide)のように、数種の環状ペプチドが、既に診療所において使用することに成功している(Driggers et al. (2008),Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24)。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成された相対的に大きな相互作用表面と共に、環状構造のコンホメーション上の柔軟性の低下に起因する。通常、大環状分子は、例えば、環状ペプチドCXCR4アンタゴニストCVX15(400Å2;Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71)、インテグリンαVb3に結合するArg−Gly−Aspモチーフを有する環状ペプチド(355Å2)(Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5)またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン(upain)−1(603Å2;Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10)のように、数百平方オングストロームの表面に結合する。
その環状立体配置のため、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドよりも柔軟性が低く、標的への結合によるエントロピー損失がより小さくなり、より高い結合親和性をもたらす。柔軟性の低下は、標的特異的コンホメーションをロックし、直鎖状ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。このような効果は、その環が開環されると他のMMPに及ぶその選択性を失う、マトリックスメタロプロテイナーゼ8(MMP−8)の強力かつ選択的な阻害剤により例証されてきた(Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51)。大環状化により達成される有利な結合特性は、例えばバンコマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシン等、2個以上のペプチド環を有する多環性ペプチドにおいてさらにより明らかである。
様々な研究チームが、以前に、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋いでいる(Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem)。Meloenおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造を模倣するために、合成足場上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス(ブロモメチル)ベンゼンおよび関連分子を使用している(Timmerman et al. (2005), ChemBioChem)。システイン含有ポリペプチドを分子足場、例えばトリス(ブロモメチル)ベンゼンに連結させることによって作製される候補薬物化合物を作製する方法は、WO2004/077062号およびWO2006/078161号に開示されている。
ファージディスプレイベースのコンビナトリアルアプローチが開発され、目的の標的に対する二環性ペプチドの大型のライブラリが生成されてスクリーニングされた(Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7およびWO2009/098450)。要約すると、3個のシステイン残基と、2個のランダムな6アミノ酸領域とを含有する(Cys−(Xaa)6−Cys−(Xaa)6−Cys)(配列番号97)直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリをファージ上に提示させ、システイン側鎖を小分子(トリス−(ブロモメチル)ベンゼン)に共有結合させることにより環化させた。ヒトプロテアーゼカテプシンGおよび血漿カリクレイン(PK)に対する親和性選択で単離した二環性ペプチドは、ナノモルの阻害定数を実証した。WO2013/050615およびWO2013/050616は、ヒト血漿カリクレインに特異的なさらなる二環性ペプチドリガンドを開示している。
本発明の第1の態様によれば、血漿カリクレインに特異的なペプチドリガンドであって、少なくとも2つのループ配列によって隔てられる少なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチド、および上記ポリペプチドの上記システイン残基と共有結合を形成する分子足場を含み、その結果、少なくとも2つのポリペプチドループが上記分子足場上に形成され、上記ペプチドリガンドが、
(a)-Ci-N-X-W-N-P-W-Cii-O/U-X-X-X-O/J-X-Ciii- (配列番号1);
(b)-Ci-B-N-J-W-N-P-Cii-X-L-O-X-X-X-Ciii- (配列番号2);
(c)-Ci-Q-K-F-E-S-R-Cii-X-X-X-X-X-X-Ciii- (配列番号3);
(d)-Ci-P-L-S-D-T-L-Cii-Y-R-R-M-P-P-Ciii- (配列番号4);
(e)-Ci-P-Y-P-F-R-Cii-X-H-X-X-X-Ciii- (配列番号5);および
(f)-Ci-(N)a-U-J-P-J-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (配列番号6);
もしくはその修飾誘導体、または薬学的に許容される塩
のいずれかから選択されるペプチド配列を含み、
ここで、
Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ、第1、第2および第3のシステイン残基を表し、
下付き文字「a」は、0または1から選択される整数を表し、
Xは、任意のアミノ酸残基を表し、
Oは、G、A、I、L、PおよびVから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表し、
Jは、F、WおよびYから選択される非極性の芳香族アミノ酸残基を表し、
Uは、N、C、Q、M、SおよびTから選択される極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、
Bは、R、HおよびKから選択される極性の正に荷電されたアミノ酸残基を表す、
ペプチドリガンドが提供される。
(a)-Ci-N-X-W-N-P-W-Cii-O/U-X-X-X-O/J-X-Ciii- (配列番号1);
(b)-Ci-B-N-J-W-N-P-Cii-X-L-O-X-X-X-Ciii- (配列番号2);
(c)-Ci-Q-K-F-E-S-R-Cii-X-X-X-X-X-X-Ciii- (配列番号3);
(d)-Ci-P-L-S-D-T-L-Cii-Y-R-R-M-P-P-Ciii- (配列番号4);
(e)-Ci-P-Y-P-F-R-Cii-X-H-X-X-X-Ciii- (配列番号5);および
(f)-Ci-(N)a-U-J-P-J-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (配列番号6);
もしくはその修飾誘導体、または薬学的に許容される塩
のいずれかから選択されるペプチド配列を含み、
ここで、
Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ、第1、第2および第3のシステイン残基を表し、
下付き文字「a」は、0または1から選択される整数を表し、
Xは、任意のアミノ酸残基を表し、
Oは、G、A、I、L、PおよびVから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表し、
Jは、F、WおよびYから選択される非極性の芳香族アミノ酸残基を表し、
Uは、N、C、Q、M、SおよびTから選択される極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、
Bは、R、HおよびKから選択される極性の正に荷電されたアミノ酸残基を表す、
ペプチドリガンドが提供される。
本発明の新規なカリクレイン結合性二環性ペプチドリガンドを、本明細書で実施例において記載される生物学的選択に従って特定した。生物学的選択の間のヒトカリクレインとラットカリクレインとの間の標的バイトを切り替えることによって、種間で良好な交差反応性を有するリード配列を特定した。分子に対する可溶性の修飾を導入して、二環性ペプチドリードを形成する能力を向上し、ラットの薬物動態学的分析によって、in vivoで高い代謝安定性を有する配列が明らかになった。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義されるペプチドリガンドを1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、および自己免疫障害の予防、抑制または処置における使用のための、本明細書に定義されるペプチドリガンドが提供される。
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学ならびに生化学の分野などの当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学、遺伝子学および生化学的の方法には、本明細書中に参考として組み込まれている(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.を参照)標準の技法が使用される。
ペプチドリガンド
本明細書中で言及するペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドをいう。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる2つ以上の反応基(すなわちシステイン残基)、および、ペプチドが足場と結合した際にループを形成することからループ配列と呼ばれる、前記反応基間に内在する配列を含む。本事例において、ペプチドは、少なくとも3個のシステイン残基(本明細書中で言及するCi、Cii、およびCiii)を含み、足場上に少なくとも2個のループを形成する。
本明細書中で言及するペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドをいう。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる2つ以上の反応基(すなわちシステイン残基)、および、ペプチドが足場と結合した際にループを形成することからループ配列と呼ばれる、前記反応基間に内在する配列を含む。本事例において、ペプチドは、少なくとも3個のシステイン残基(本明細書中で言及するCi、Cii、およびCiii)を含み、足場上に少なくとも2個のループを形成する。
一実施形態では、上記ペプチドリガンドは、式(a)の配列を含む。式(a)のコンセンサス配列は、最初のリードバイシクルペプチド06−259、ならびに実施例1および表2および4に記載の最初のリードの親和性成熟によって特定された最も見込みのあるペプチド配列の各々の両方由来のモチーフを含む。
さらなる実施形態では、式(a)のペプチドは、−Ci−N−X−W−N−P−W−Cii−O/U−X−X−X−O−X−Ciii−(配列番号7)から選択される配列を含む。
なおさらなる実施形態では、式(a)のペプチドは、−Ci−N−T/H/Y−W−N−P−W−Cii−G/S/P−A/V/W/D/S−D/E/V/T/P−A/G/P/I/R/D−G/P/Y/I−F/I/L/V/R/G/D−Ciii−(配列番号8)から選択される配列を含む。
なおさらなる実施形態では、式(a)のペプチドは、−Ci−N−T/H/Y−W−N−P−W−Cii−G/S/P−A/V/W−D/E/V−A/G/P−G/P−F/I/L/V−Ciii−(配列番号9)から選択される配列を含む。
なおさらなる実施形態では、式(a)のペプチドは、
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-G-W-V-G-G-F-Ciii- (06-259)(配列番号10);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii- (06-259-01)(配列番号11);
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-02)(配列番号12);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-I-Ciii- (06-259-03)(配列番号13);
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-04)(配列番号14);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-R-Ciii- (06-259-F1)(配列番号15);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-P-A-D-I-P-V-Ciii- (06-259-E2)(配列番号16);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-D-D-P-Y-I-Ciii- (06-259-H3)(配列番号17)
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-S-D-P-P-V-Ciii- (06-259-H4)(配列番号18)
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-S-D-T-R-I-G-Ciii- (06-259-A6)(配列番号19);および
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-S-W-P-D-I-D-Ciii- (06-259-F2)(配列番号20)
から選択される配列を含む。
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-G-W-V-G-G-F-Ciii- (06-259)(配列番号10);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii- (06-259-01)(配列番号11);
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-02)(配列番号12);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-I-Ciii- (06-259-03)(配列番号13);
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-04)(配列番号14);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-R-Ciii- (06-259-F1)(配列番号15);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-P-A-D-I-P-V-Ciii- (06-259-E2)(配列番号16);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-D-D-P-Y-I-Ciii- (06-259-H3)(配列番号17)
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-S-D-P-P-V-Ciii- (06-259-H4)(配列番号18)
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-S-D-T-R-I-G-Ciii- (06-259-A6)(配列番号19);および
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-S-W-P-D-I-D-Ciii- (06-259-F2)(配列番号20)
から選択される配列を含む。
なおまださらなる実施形態では、式(a)のペプチドは、
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii- (06-259-01)(配列番号11);
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-02)(配列番号12);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-I-Ciii- (06-259-03)(配列番号13);および
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-04)(配列番号14)
から選択される配列を含む。
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii- (06-259-01)(配列番号11);
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-02)(配列番号12);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-I-Ciii- (06-259-03)(配列番号13);および
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-04)(配列番号14)
から選択される配列を含む。
この実施形態のペプチドは、親和性成熟によって、最も強力な候補の1つであることが特定された(実施例1および表4を参照のこと)。さらに、この実施形態の各々のペプチドは、ラットとヒトカリクレインとの間で、高い力価および良好な交差反応性の両方を実証することが特定された(表5を参照のこと)。
なおまださらなる実施形態では、式(a)のペプチドは、−Ci−N−T−W−N−P−W−Cii−P−W−D−A−P−L−Ciii−(06−259−02)(配列番号12)から選択される配列を含む。この実施形態のペプチドは、式(a)内のペプチドリガンドの最も強力で、交差反応性で安定なメンバーであることが特定された(実施例1および2を参照のこと)。例えば、本明細書に記載される方法番号1を用いる最初のスクリーニングでは、06−259−02は、最大10日までの検出ウインドウで判定した場合、残りのバイシクルリードのほとんどよりも安定であることが示された(データ示さず)。さらに、ex vivoの安定性はまた、in vivoで、特にラットで再現可能であって、ここではペプチドの代謝物は、クリアランスおよび既知の糸球体濾過速度と比較して判定して事実上存在しなかった(実施例4)。
一実施形態では、ペプチドリガンドは、式(b)の配列を含む。式(b)のコンセンサス配列は、最初のリードバイシクルペプチド06−254および06−255の両方由来のモチーフ、ならびに実施例1ならびに表2および3に記載の最初のリード06−254の親和性成熟で特定された最も見込みのあるペプチド配列の各々を含む。
さらなる実施形態では、式(b)のペプチドは、−Ci−K/R−N−Y−W−N−P−Cii−D/T/G−L−I/V/L−E/M/N/P/T/Q/S/Y/G/D/W/R/H/A−D/G/I/T/A/S/P/V−P/S/T/A/K/G/H/F/Q/D/L/I/M/R/Y−Ciii−(配列番号21)から選択される配列を含む。
なおさらなる実施形態では、式(b)のペプチドは、−Ci−K/R−N−Y−W−N−P−Cii−D/T−L−I/V−E/M/N/P/T−D/G/I/T−P/S/T−Ciii−(配列番号22)から選択される配列を含む。
さらなる実施形態では、式(b)のペプチドは、
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-T-I-S-Ciii- (06-254)(配列番号23);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-E-T-T-Ciii- (06-254-01)(配列番号24);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii- (06-254-02)(配列番号25);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-M-D-T-Ciii- (06-254-03)(配列番号26);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-Q-D-A-Ciii- (06-254-F4)(配列番号27);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-S-I-K-Ciii- (06-254-B3)(配列番号28);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-T-G-Ciii- (06-254-G3)(配列番号29);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-Q-I-H-Ciii- (06-254-H4)(配列番号30);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-G-I-T-Ciii- (06-254-G2)(配列番号31);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-D-T-F-Ciii- (06-254-A4)(配列番号32);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-E-A-Q-Ciii- (06-254-G4)(配列番号33);
-Ci-K-N-F-W-N-P-Cii-D-L-I-P-I-S-Ciii- (06-254-D3)(配列番号34);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-W-T-D-Ciii- (06-254-E2)(配列番号35);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-L-Ciii- (06-254-F5)(配列番号36);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-E-S-T-Ciii- (06-254-E5)(配列番号37);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-R-P-P-Ciii- (06-254-D1)(配列番号38);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-G-I-A-Ciii- (06-254-B9)(配列番号39);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-H-D-I-Ciii- (06-254-E3)(配列番号40);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-M-Ciii- (06-254-D6)(配列番号41);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-D-L-Ciii- (06-254-H3)(配列番号42);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-H-V-R-Ciii- (06-254-A7)(配列番号43);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-P-Y-Ciii- (06-254-C1)(配列番号44);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-G-L-V-Y-S-T-Ciii- (06-254-E6)(配列番号45);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-P-D-L-Ciii- (06-254-B1)(配列番号46);および
-Ci-R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-I-T-Ciii- (06-255)(配列番号47)
から選択される配列を含む。
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-T-I-S-Ciii- (06-254)(配列番号23);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-E-T-T-Ciii- (06-254-01)(配列番号24);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii- (06-254-02)(配列番号25);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-M-D-T-Ciii- (06-254-03)(配列番号26);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-Q-D-A-Ciii- (06-254-F4)(配列番号27);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-S-I-K-Ciii- (06-254-B3)(配列番号28);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-T-G-Ciii- (06-254-G3)(配列番号29);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-Q-I-H-Ciii- (06-254-H4)(配列番号30);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-G-I-T-Ciii- (06-254-G2)(配列番号31);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-D-T-F-Ciii- (06-254-A4)(配列番号32);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-E-A-Q-Ciii- (06-254-G4)(配列番号33);
-Ci-K-N-F-W-N-P-Cii-D-L-I-P-I-S-Ciii- (06-254-D3)(配列番号34);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-W-T-D-Ciii- (06-254-E2)(配列番号35);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-L-Ciii- (06-254-F5)(配列番号36);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-E-S-T-Ciii- (06-254-E5)(配列番号37);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-R-P-P-Ciii- (06-254-D1)(配列番号38);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-G-I-A-Ciii- (06-254-B9)(配列番号39);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-H-D-I-Ciii- (06-254-E3)(配列番号40);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-M-Ciii- (06-254-D6)(配列番号41);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-D-L-Ciii- (06-254-H3)(配列番号42);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-H-V-R-Ciii- (06-254-A7)(配列番号43);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-P-Y-Ciii- (06-254-C1)(配列番号44);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-G-L-V-Y-S-T-Ciii- (06-254-E6)(配列番号45);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-P-D-L-Ciii- (06-254-B1)(配列番号46);および
-Ci-R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-I-T-Ciii- (06-255)(配列番号47)
から選択される配列を含む。
なおまださらなる実施形態では、式(b)のペプチドは、
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-E-T-T-Ciii- (06-254-01)(配列番号24);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii- (06-254-02)(配列番号25);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-M-D-T-Ciii- (06-254-03)(配列番号26);および
-Ci-R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-I-T-Ciii- (06-255)(配列番号47)
から選択される配列を含む。
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-E-T-T-Ciii- (06-254-01)(配列番号24);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii- (06-254-02)(配列番号25);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-M-D-T-Ciii- (06-254-03)(配列番号26);および
-Ci-R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-I-T-Ciii- (06-255)(配列番号47)
から選択される配列を含む。
この実施形態のペプチドは、親和性成熟に従って最も強力な候補であることが特定された(実施例1および表3を参照のこと)。さらに、この実施形態の各々のペプチドは、ラットとヒトカリクレインとの間で高い力価および良好な交差反応性の両方を実証することが特定された(表5を参照のこと)。
なおまださらなる実施形態では、式(b)のペプチドは、
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii- (06-254-02)(配列番号25);および
-Ci-R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-I-T-Ciii- (06-255)(配列番号47)
から選択される配列を含む。
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii- (06-254-02)(配列番号25);および
-Ci-R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-I-T-Ciii- (06-255)(配列番号47)
から選択される配列を含む。
この実施形態のペプチドは、式(b)内のペプチドリガンドの各々のファミリーの最も強力なメンバーであることが特定された(実施例2を参照のこと)。
なおまださらなる実施形態では、式(b)のペプチドは、−Ci−R−N−Y−W−N−P−Cii−T−L−I−N−I−T−Ciii−(06−255)(配列番号47)から選択される配列を含む。本明細書に記載される方法番号1を用いる最初のスクリーニングによって、06−255は、最大10日までの検出のウインドウで判定した場合、残りのバイシクルリードのほとんどよりも安定であることが示された(データ示さず)。
一実施形態では、ペプチドリガンドは、式(c)の配列を含む。式(c)のコンセンサス配列は、最初のリードバイシクルペプチド06−256由来のループ1内の固定されたQKFESR(配列番号48)モチーフ、およびそこに含まれる同様の誘導体を、実施例1および表2に記載のとおり含む。
さらなる実施形態では、式(c)のペプチドは、−Ci−Q−K−F−E−S−R−Cii−R−V−D−T−R−Y−Ciii−(06−256)(配列番号49)から選択される配列を含む。ヒトと、ラットと、ウサギとの間の06−256に関する交差反応性データを、表1および5に示す。
一実施形態では、ペプチドリガンドは、式(d)の配列を含む。式(d)のペプチド配列は、実施例1および表1に記載のとおり、最初のリードバイシクルペプチド06−257の配列に相当する。ヒトと、ラットと、ウサギとの間の06−257に関する交差反応性データは、表1および5に示す。
一実施形態では、ペプチドリガンドは、式(e)の配列を含む。式(e)のコンセンサス配列は、ループ1内の保存されたPYPER(配列番号50)モチーフ、およびループ2内の2位のヒスチジン残基を、最初のリードバイシクルペプチド06−258中に含み、ここでこのコンセンサスは、最初の選択の回の間に特定された同様の配列に基づく(実施例1および表2)。
さらなる実施形態では、式(f)のペプチドは、−Ci−(N)a−U−F−P−J−R−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−(配列番号51)から選択される配列を含む。
さらなる実施形態では、式(e)のペプチドは、−Ci−P−Y−P−F−R−Cii−L−H−E−N−L−Ciii−(06−258)(配列番号52)から選択される配列を含む。この実施形態のペプチドは、ラットとヒトカリクレインとの間で高い力価および良好な交差反応性の両方を実証することが特定された(表5を参照のこと)。
一実施形態では、ペプチドリガンドは、式(f)の配列を含む。式(f)のコンセンサス配列は、最初のリードバイシクルペプチド06−261および06−550の両方に由来するモチーフ、ならびに実施例1ならびに表1および2に記載のように最初のスクリーニングから特定される最も見込みのあるペプチド配列の各々を含む。
なおさらなる実施形態では、式(f)のペプチドは、−Ci−(N)a−N/S−F−P−F/Y−R−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−(配列番号53)から選択される配列を含む。
さらなる実施形態では、式(f)のペプチドは、
-Ci-N-N-F-P-F-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (06-261)(配列番号54);または
-Ci-S-F-P-Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (06-550)(配列番号55)
から選択される配列を含む。
-Ci-N-N-F-P-F-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (06-261)(配列番号54);または
-Ci-S-F-P-Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (06-550)(配列番号55)
から選択される配列を含む。
なおまださらなる実施形態では、式(f)のペプチドは、−Ci−N−N−F−P−F−R−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−(06−261)(配列番号54)から選択される配列を含む。この実施形態のペプチドは、選択後に最も強力な候補の1つであることが特定された(実施例1および表1を参照のこと)。さらに、この実施形態のペプチドは、ラットとヒトカリクレインとの間で高い力価および良好な交差反応性の両方を実証することが特定された(表5を参照のこと)。
別の実施形態では、式(f)のペプチドは、−Ci−S−F−P−Y−R−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−(06−550)(配列番号55)から選択される配列を含む。06−550の利点を実証するデータは、実施例3および4に記載しており、ここでは、06−550が強力なキメラバイシクルであることが見出され得る。具体的には、ヒト、ラットおよびウサギカリクレインの間の交差反応性は、表7に見ることができる。
一実施形態では、本発明の特定のペプチドリガンドは、ヒト、ラットおよび/またはウサギの血漿カリクレインに特異的である。さらなる実施形態では、本発明の特定のペプチドリガンドは、ヒトおよび/またはラットの血漿カリクレインに特異的である。なおさらなる実施形態では、本発明の特定のペプチドリガンドは、ヒト血漿カリクレインに特異的である。
ペプチドリガンドの利点
本発明の特定の二環性ペプチドは、多数の有利な特性を有しており、これによって、注射、吸入、経鼻、眼、口腔または局所投与について適切な薬物様の分子とみなすことができる。このような有利な特性としては以下が挙げられる。
− 種交差反応性。これは、前臨床の薬力学および薬物動態学的評価のための典型的な要件である。
− プロテアーゼ安定性。二環性ペプチドリード候補ペプチドリガンドは理想的には、血漿プロテアーゼ、上皮(「膜アンカー型(membrane−anchored)」)プロテアーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対する安定性を実証するべきである。プロテアーゼ安定性は、バイシクルリード候補が動物モデルで開発可能であり、ヒトに信頼性をもって投与可能であるように、異なる種の間で維持されなければならない。
− 望ましい溶解度プロファイル。これは、製剤化および吸収の目的に重要である、荷電および親水性対疎水性残基の割合、ならびに分子内/分子間のH結合の関数である。
− 循環中の最適血漿半減期。臨床指標および処置計画次第で、急性の疾患管理の状況では、短い曝露用の二環性ペプチドを開発する必要がある場合もあるし、または循環中で保持を増強している二環性ペプチドを開発する必要がある場合があり、したがって、より慢性の疾患状態の管理に最適である。
本発明の特定の二環性ペプチドは、多数の有利な特性を有しており、これによって、注射、吸入、経鼻、眼、口腔または局所投与について適切な薬物様の分子とみなすことができる。このような有利な特性としては以下が挙げられる。
− 種交差反応性。これは、前臨床の薬力学および薬物動態学的評価のための典型的な要件である。
− プロテアーゼ安定性。二環性ペプチドリード候補ペプチドリガンドは理想的には、血漿プロテアーゼ、上皮(「膜アンカー型(membrane−anchored)」)プロテアーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対する安定性を実証するべきである。プロテアーゼ安定性は、バイシクルリード候補が動物モデルで開発可能であり、ヒトに信頼性をもって投与可能であるように、異なる種の間で維持されなければならない。
− 望ましい溶解度プロファイル。これは、製剤化および吸収の目的に重要である、荷電および親水性対疎水性残基の割合、ならびに分子内/分子間のH結合の関数である。
− 循環中の最適血漿半減期。臨床指標および処置計画次第で、急性の疾患管理の状況では、短い曝露用の二環性ペプチドを開発する必要がある場合もあるし、または循環中で保持を増強している二環性ペプチドを開発する必要がある場合があり、したがって、より慢性の疾患状態の管理に最適である。
薬学的に許容される塩
塩形態は、本発明の範囲内であることが理解され、式(I)の化合物に対する言及はこのような化合物の塩形態を含む。
塩形態は、本発明の範囲内であることが理解され、式(I)の化合物に対する言及はこのような化合物の塩形態を含む。
本発明の塩は、Pharmaceutical Salts: Properties, Selection,and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002に記載の方法などの従来の化学的方法によって、塩基性または酸性の部分を含む親化合物から合成してもよい。一般には、このような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基形態と、適切な塩基または酸とを水中で、もしくは有機溶媒中で、または2つの混合物中で反応させることによって調製され得る。
酸付加塩(一塩または二塩)は、無機および有機の両方の広範な種々の酸と形成されてもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、2,2−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸(例えば、L−アスコルビン酸)、L−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、4−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、(+)ショウノウ酸、ショウノウ−スルホン酸、(+)−(1S)−ショウノウ−10−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−1,2−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、D−グルコン酸、グルクロン酸(例えば、D−グルクロン酸)、グルタミン酸(例えば、L−グルタミン酸)、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸(例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸)、イセチオン酸、乳酸(例えば、(+)−L−乳酸および(±)−DL−乳酸)、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、(−)−L−リンゴ酸、マロン酸、(±)−DL−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−2−スルホン酸、ナフタレン−1,5−ジスルホン酸、1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、L−ピログルタミン酸、サリチル酸、4−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、(+)−L−酒石酸、チオシアン酸、p−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸、および吉草酸からなる群から選択される酸、ならびにアシル化アミノ酸および陽イオン交換樹脂を用いて形成された一塩または二塩が挙げられる。
塩の具体的な1グループは、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸(メシラート)、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸、およびラクトビオン酸から形成された塩からなる。1つの具体的な塩は、塩酸塩である。別の具体的な塩は、酢酸塩である。
修飾誘導体
本明細書に定義されるペプチドリガンドの修飾誘導体は、本発明の範囲内であることが理解される。このような適切な修飾誘導体の例としては、N末端修飾および/またはC末端修飾、1つまたは複数のアミノ酸残基の1つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換(例えば、1つまたは複数の極性アミノ酸残基の1つまたは複数の等比体積または等電子アミノ酸での置換、1つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の等比体積または等電子アミノ酸での置換)、スペーサー基の付加、1つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の1つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基での置換、1つまたは複数のアミノ酸残基のアラニンでの置換、1つまたは複数のL−アミノ酸残基の1つまたは複数のD−アミノ酸残基での置換、二環性ペプチドリガンド内の1つまたは複数のアミド結合のN−アルキル化、1つまたは複数のペプチド結合の代用結合での置換、ペプチド骨格長改変、1つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の別の化学基での置換、ならびにシステイン、リジン、グルタミン酸塩/アスパラギン酸塩およびチロシンなどのアミノ酸の、適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬での合成後修飾から選択される1つまたは複数の修飾が挙げられる。
本明細書に定義されるペプチドリガンドの修飾誘導体は、本発明の範囲内であることが理解される。このような適切な修飾誘導体の例としては、N末端修飾および/またはC末端修飾、1つまたは複数のアミノ酸残基の1つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換(例えば、1つまたは複数の極性アミノ酸残基の1つまたは複数の等比体積または等電子アミノ酸での置換、1つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の等比体積または等電子アミノ酸での置換)、スペーサー基の付加、1つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の1つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基での置換、1つまたは複数のアミノ酸残基のアラニンでの置換、1つまたは複数のL−アミノ酸残基の1つまたは複数のD−アミノ酸残基での置換、二環性ペプチドリガンド内の1つまたは複数のアミド結合のN−アルキル化、1つまたは複数のペプチド結合の代用結合での置換、ペプチド骨格長改変、1つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の別の化学基での置換、ならびにシステイン、リジン、グルタミン酸塩/アスパラギン酸塩およびチロシンなどのアミノ酸の、適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬での合成後修飾から選択される1つまたは複数の修飾が挙げられる。
一実施形態では、修飾誘導体は、N末端修飾および/またはC末端修飾を含む。
さらなる実施形態では、修飾誘導体は、N末端修飾を含む。さらなる実施形態では、N末端修飾は、N末端アセチル基を含む。この実施形態では、N末端システイン基(本明細書ではCiと呼ばれる基)は、無水酢酸または他の適切な試薬で、ペプチド合成の間にキャップされて、N末端アセチル化されている分子がもたらされる。この実施形態は、アミノペプチダーゼの潜在的認識ポイントを除去するという利点を提供し、二環性ペプチドの分解の可能性を回避する。
さらなる実施形態では、修飾誘導体は、C末端修飾を含む。さらなる実施形態では、C末端修飾は、アミド基を含む。この実施形態では、C末端システイン基(本明細書ではCiiiと呼ばれる基)は、ペプチド合成の間、アミドとして合成されて、C末端アミド化されている分子がもたらされる。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識ポイントを除去するという利点を提供し、二環性ペプチドの分解の可能性を回避する。
一実施形態では、修飾誘導体は、1つまたは複数のアミノ酸残基の1つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換を含む。この実施形態では、分解性のプロテアーゼによってさらに認識もされず、標的力価になんら効果も有さない等比体積/等電子側鎖を有する非天然のアミノ酸が選択され得る。
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質分解による加水分解がコンホメーション的および立体的に妨害されるような、制約されたアミノ酸側鎖を有する非天然のアミノ酸を用いてもよい。具体的には、これらは、プロリンアナログ、巨大な(bulky)側鎖、Cα−二置換誘導体(例えば、アミノイソ酪酸、Aib)、およびシクロアミノ酸、単純な誘導体(アミノ−シクロプロピルカルボン酸である)に関する。
さらなる実施形態では、プロリン残基は、L−アゼチジンカルボン酸残基で置換されてもよく、および/またはアルギニン残基は、N−α−メチルアルギニンまたはL−ホモアルギニン残基で置換されてもよい。本明細書に示されているデータによって、このような非天然のアミノ酸の存在は、タンパク質分解性の安定性を向上し、一方では、二環性ペプチドリガンドの標的親和性を維持するかまたは向上することが実証される。
実施例3は、06−550ペプチドリガンドの選択された非天然の誘導体を実証する。したがって、一実施形態では、本発明は、式(f)の非天然の誘導体であって、
-Ci-S-F-P-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) HArg5)(配列番号56);
-Ci-S-F-[Aze]-Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (配列番号57);
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号58);
-Ci-S-F-P-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) NMeArg5)(配列番号59);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 NMeArg5)(配列番号60);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRはL−ホモアルギニン残基を表し、NMeRがN−α−メチルアルギニン残基を表す非天然の誘導体を提供する。
-Ci-S-F-P-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) HArg5)(配列番号56);
-Ci-S-F-[Aze]-Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (配列番号57);
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号58);
-Ci-S-F-P-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) NMeArg5)(配列番号59);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 NMeArg5)(配列番号60);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRはL−ホモアルギニン残基を表し、NMeRがN−α−メチルアルギニン残基を表す非天然の誘導体を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、式(f)の非天然の誘導体であって、
-Ci-S-F-P-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) HArg5)(配列番号56);
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号58);
-Ci-S-F-P-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) NMeArg5)(配列番号59);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 NMeArg5)(配列番号60);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRがL−ホモアルギニン残基を表し、NMeRがN−α−メチルアルギニン残基を表す、非天然の誘導体を提供する。
-Ci-S-F-P-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) HArg5)(配列番号56);
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号58);
-Ci-S-F-P-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) NMeArg5)(配列番号59);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 NMeArg5)(配列番号60);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRがL−ホモアルギニン残基を表し、NMeRがN−α−メチルアルギニン残基を表す、非天然の誘導体を提供する。
ヒト、ラットおよびウサギカリクレインの間のこれらの修飾されたペプチドの交差反応性は表7に見出され得る。
なおさらなる実施形態では、本発明は、式(f)の修飾誘導体であって、
-Ci-S-F-P-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) HArg5)(配列番号56);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号58);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRはL−ホモアルギニン残基を表す、修飾誘導体を提供する。
-Ci-S-F-P-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) HArg5)(配列番号56);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号58);
から選択される配列を有するペプチドを含み、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRはL−ホモアルギニン残基を表す、修飾誘導体を提供する。
この実施形態のペプチドは、対応するN−メチル修飾誘導体よりも安定であることが実証されている(実施例3を参照のこと)。
なおまださらなる実施形態では、本発明は、式(f)の非天然の誘導体であって、−Ci−S−F−[Aze]−Y−[hR]−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−((06−550)Aze3 HArg5)(配列番号58)(ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRはL−ホモアルギニン残基を表す)から選択される配列を有するペプチドを含む非天然の誘導体を提供する。
この実施形態のペプチドは、ヒトおよびラットの両方の親和性が高いので、十分耐容されることが実証されている(実施例3および表7を参照のこと)。
一実施形態では、修飾誘導体は、スペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、N末端システイン(Ci)および/またはC末端システイン(Ciii)に対するスペーサー基の付加を含む。なおさらなる実施形態では、修飾誘導体は、C末端システイン(Ciii)に対するスペーサー基の付加を含む。なおまださらなる実施形態では、スペーサー基は、2つ以上のD−アルギニン残基(適切には2つのD−アルギニン残基)に連結された1つまたは複数のサルコシン基(適切には3つのサルコシン基)を含む。本明細書に示すデータでは、このようなスペーサーの存在が、二環性ペプチドリガンドの水溶性を向上することが示される。
一実施形態では、本発明は、式(a)の修飾誘導体であって、−Ci−N−T−W−N−P−W−Cii−P−W−D−A−P−L−Ciii−Sar3−(D−Arg)2((06−259−02(Sar3−(D−Arg)2)(配列番号61)(ここでSar3は、3つのサルコシンスペーサーを表し、(D−Arg)2は2つのD−アルギニン残基を表す)から選択される配列を有するペプチドを含む修飾誘導体を提供する。
この実施形態のペプチドによって、実施例4に記載の好適なin vivoの薬物動態学的プロファイルが実証された。具体的には、このペプチドは、そのクリアランスのほとんどが腎濾過によって駆動されるという理由で、ラットの循環中で顕著な安定性を実証した。さらに、この実施形態のペプチドはまた、このようなモデルについてのゴールデンスタンダード(インドメタシン)に匹敵した実施例6に記載のようなカラギーナン誘導性の足の腫脹の高度に有意な阻害も実証した。
一実施形態では、本発明は、式(f)の修飾誘導体であって、
-Ci-S-F-P-Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii-Sar3-(D-Arg)2((06-550)-Sar3-(DArg2))(配列番号62);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii-Sar3-(D-Arg)2((06-550)-Sar3-(DArg2) Aze3 HArg5)(配列番号63);
から選択される配列を有するペプチドを表し、
ここでSar3は、3つのサルコシンスペーサーを表し、(D−Arg)2は2つのD−アルギニン残基を表し、AzeはL−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRはL−ホモアルギニン残基を表す。
-Ci-S-F-P-Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii-Sar3-(D-Arg)2((06-550)-Sar3-(DArg2))(配列番号62);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii-Sar3-(D-Arg)2((06-550)-Sar3-(DArg2) Aze3 HArg5)(配列番号63);
から選択される配列を有するペプチドを表し、
ここでSar3は、3つのサルコシンスペーサーを表し、(D−Arg)2は2つのD−アルギニン残基を表し、AzeはL−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRはL−ホモアルギニン残基を表す。
この実施形態のペプチドは、より好適な水溶性を有することが実証されている(実施例3を参照のこと)。さらに重要なことに、Sar3−(D−Arg)2(配列番号98)基の追加は、十分耐容され、その理由は、この修飾を欠いているペプチドと比較して力価が未変化のままであるからである(実施例3および表7を参照のこと)。
さらなる実施形態では、本発明は、式(f)の修飾誘導体であって、−Ci−S−F−[Aze]−Y−[hR]−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−Sar3−(D−Arg)2((06−550)−Sar3−(DArg2)Aze3 HArg5)(配列番号63)から選択される配列を有しているペプチドを含み、ここでSar3は、3サルコシンスペーサーを表し、(D−Arg)2は2つのD−アルギニン残基を表し、AzeはL−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRはL−ホモアルギニン残基を表す修飾誘導体を提供する。この実施形態のペプチドは、実施例3において、分解生成物はほとんど観察されなかったので、高度な安定性を有することが実証されている。さらに、この実施形態のペプチドはまた、実施例4に記載のような好適なin vivo薬物動態学的プロファイルを実証した。さらに、この実施形態のペプチドは、実施例5に記載されるとおり、ウサギの眼への硝子体内注射後に硝子体液からのクリアランスが遅いことを実証した。それ自体が既に有利であるが、この特性によってさらに、眼への投与のための徐放性の処方物に理想的に適しているという利点が得られる。
一実施形態では、修飾誘導体は、1つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の1つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基での置換を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、トリプトファン残基のフェニルアラニン残基での置換を含む。この実施形態によって、得られた二環性ペプチドリガンドの医薬品安定性プロファイルを改善するという利点が得られる。
一実施形態では、修飾誘導体は、1つまたは複数の荷電アミノ酸残基の1つまたは複数の疎水性アミノ酸残基での置換を含む。別の実施形態では、修飾誘導体は、1つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の1つまたは複数の荷電アミノ酸残基での置換を含む。荷電対疎水性アミノ酸残基の正確な均衡は、二環性ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度に対して、したがって、血漿における遊離した利用できる画分の濃度に影響を与え、一方、荷電アミノ酸残基(特にアルギニン)は、細胞表面におけるリン脂質膜とペプチドとの相互作用に影響を与え得る。組み合わせた両者は、半減期、分布の体積およびペプチド薬物への曝露に影響を与えることができ、臨床エンドポイントに応じて目的に合わせて作製することができる。加えて、荷電対疎水性アミノ酸残基の正確な組合せおよび数は、注射部位における刺激作用を低下させることができる(ペプチド薬物を皮下投与した場合)。
一実施形態では、修飾誘導体は、1つまたは複数のL−アミノ酸残基の1つまたは複数のD−アミノ酸残基での置換を含む。この実施形態は、立体障害によって、およびD−アミノ酸の傾向によって(βターンコンホメーションを安定化させる)タンパク質分解安定性を増加させるためと考えられる(Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418)。
一実施形態では、修飾誘導体は、二環性ペプチドリガンド内の1つまたは複数のアミド結合のN−アルキル化誘導体を含む。この実施形態は、解離しやすいアミド結合の直接的な修飾によりタンパク質分解からの保護を与えることであると考えられる(Fiacco et al, Chembiochem. (2008), 9(14), 2200-3)。N−メチル化は、ペプチド結合のねじれ角に対する強力な効果も有し、細胞浸透&経口利用能を助けると考えられる(Biron et al (2008), Angew. Chem. Int. Ed., 47, 2595 -99)。
一実施形態では、修飾誘導体は、1つまたは複数のN−アルキル化誘導体(例えば、−CO−NR)還元ペプチド結合(例えば、−CH2−NH−)、ペプトイド結合(例えば、−NR−CH2−CO−)、チオアミド結合(例えば、−CS−NH−)、アザペプチド結合(例えば、−CO−NH−NR−)、トランス−アルケン結合(例えば、−RHC=C−)、レトロ−インベルソ結合(例えば、−NH−CO−)および尿素代用結合(例えば、−NH−CO−NHR−)から選択される代用結合による1つまたは複数のペプチド結合の置換を含む。
一実施形態では、修飾誘導体は、任意のアラニンアミノ酸残基の除去を含む。この実施形態は、潜在的なタンパク質分解性攻撃部位を除去するという利点を提供する。
一実施形態では、修飾誘導体は、ペプチド骨格長改変を含む。さらなる実施形態では、ペプチド骨格長改変は、1つまたは複数のβ2/3−アミノ酸残基(例えば、−NH−CR−CH2−COまたは−NH−CH2−CHR−CO−)の使用を含む。
一実施形態では、修飾誘導体は、1つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上に置換を含む。この実施形態は、骨格のコンホメーションを制約するという利点を提供する。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、1つまたは複数のアミノ酸残基の2−アミノイソ酪酸(α−アミノイソ酪酸(AIB)、α−メチルアラニンまたは2−メチルアラニンとしても公知)での置換を含む。
上述の修飾の各々は、標的に対するペプチドの効力の計画的な改善になることを留意されたい。さらに修飾に基づく力価改善は、以下の機序を通じて達成され得る。
− より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活かし、より低いオフレートにつながる疎水性部分を組み込むこと
− 長期にわたるイオン性相互作用を活用する荷電された基を組み込み、より速いオンレートおよびより高い親和性をもたらすこと(例えば、Schreiber et al,Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31を参照のこと、および
− 例えば、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、アミノ酸の側鎖を正確に制約すること、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、骨格の二面角を制約すること、および同一の理由のために分子中に追加の環化を導入すること、
によって、ペプチドに追加的な制約を組み込むこと。
− より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活かし、より低いオフレートにつながる疎水性部分を組み込むこと
− 長期にわたるイオン性相互作用を活用する荷電された基を組み込み、より速いオンレートおよびより高い親和性をもたらすこと(例えば、Schreiber et al,Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31を参照のこと、および
− 例えば、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、アミノ酸の側鎖を正確に制約すること、エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、骨格の二面角を制約すること、および同一の理由のために分子中に追加の環化を導入すること、
によって、ペプチドに追加的な制約を組み込むこと。
(総説のため、Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203およびNestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418を参照)。
結合活性
本明細書の文脈における特異性は、標的と類似の実体を除外したその同族標的と結合する、さもなければこれと相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵素の相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの能力を指すことができる。本明細書に記載されているアプローチを用いて、企図される標的のホモログまたはパラログとリガンドがより相互作用できるようにまたはできなくなるように、特異性が増加または減少するようモジュレートすることができる。特異性は、活性、親和性またはアビディティーと同義であるとは企図されておらず、その標的におけるリガンドの作用の効力(例えば、結合親和性または阻害のレベル等)は、必ずしもその特異性に関係しない。
本明細書の文脈における特異性は、標的と類似の実体を除外したその同族標的と結合する、さもなければこれと相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵素の相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの能力を指すことができる。本明細書に記載されているアプローチを用いて、企図される標的のホモログまたはパラログとリガンドがより相互作用できるようにまたはできなくなるように、特異性が増加または減少するようモジュレートすることができる。特異性は、活性、親和性またはアビディティーと同義であるとは企図されておらず、その標的におけるリガンドの作用の効力(例えば、結合親和性または阻害のレベル等)は、必ずしもその特異性に関係しない。
本明細書における結合活性は、例えば、本明細書に記載されている結合アッセイから得られる定量的結合測定値を指す。したがって、結合活性は、所定の標的濃度で結合しているペプチドリガンドの量を指す。
多重特異性は、2種以上の標的に結合する能力である。通常、結合ペプチドは、そのコンホメーション特性により、抗体の場合はエピトープ等、単一の標的と結合することができる。しかし、2種以上の標的に結合することができるペプチド、例えば、上記のように当技術分野において既知の通り、二重特異的抗体を開発することができる。本発明において、ペプチドリガンドは、2種以上の標的に結合することができ、したがって多重特異的となり得る。好適には、これは、2種の標的に結合し、二重特異的である。結合は、独立的となることができ、これは、ペプチドにおける標的に対する結合部位が、標的の一方または他方の結合により構造的に妨げられないことを意味する。この場合、両方の標的が独立的に結合していてよい。より一般的には、一方の標的の結合が、他方の結合を少なくとも部分的に妨害するであろうと予想される。
二重特異的リガンドと2つの関連の標的を含む特異性を有するリガンドとの間に基本的な相違が存在する。第1の事例では、リガンドは両方の標的について個々に特異的であり、お互いと特異的な方式で相互作用する。例えば、リガンド中の第1のループは、第1の標的に結合し得、第2のループは第2の標的に結合し得る。第2の事例では、リガンドは非特異的である。なぜなら、リガンドは、例えば、両方に共通の標的のエピトープとの相互作用によって、2つの標的の間で違いがあることはないからである。
本発明の状況では、例えば、標的およびオルソログについて活性を有するリガンドは、二重特異性リガンドであり得ることが可能である。しかし、一実施形態では、このリガンドは二重特異性ではなく、有する特異性の正確性が少なく、その結果、このリガンドは、標的と1つまたは複数のオルソログの両方に結合する。一般には、標的とそのオルソログの両方に対して選択されていないリガンドは、二重特異性に向かう選択的圧力がないせいで、二重特異性である可能性が低い。二環性ペプチドのループ長は、関連の少ないホモログに対する高い選択性を維持したままで、良好な標的およびオルソログの交差反応性が得られるように、仕立てられた結合表面を提供するのには決定的であり得る。
このリガンドが真に二重特異性である場合、一実施形態では、リガンドの標的特異性のうちの少なくとも1つは、選択されるリガンドのうちでも一般的であり、その特異性のレベルは、本明細書に開示される方法によってモジュレートされ得る。第2のまたはさらなる特異性は共有される必要はなく、本明細書に示される手順の対象となる必要もない。
標的は、ペプチドリガンドが結合する、さもなければ相互作用する分子またはその一部である。結合は、多くの種類の活性に必須のものと理解され、それ自体が活性となり得るが、他の活性が想定される。よって、本発明は、直接的または間接的な結合の測定を必要としない。
分子足場とは、複数の点でペプチドと接続して、ペプチドに1つまたは複数の構造的特長を与えることができる、任意の分子である。好ましくは、分子足場は、足場反応基と呼ばれる、ペプチドの結合点を少なくとも3つ含む。これらの基は、ペプチド上のシステイン残基(Ci、Cii、およびCiii)と反応して共有結合を形成することができる。それらは、単にジスルフィド結合(分子の還元性の切断および付随する分解に供される)を形成するのではなく、安定な共有チオエーテル連結を形成する。分子足場の好ましい構造を以下に記載する。
分子足場
分子足場は、例えば、WO2009/098450ならびにそこに引用されている参考文献、特に、WO2004/077062およびWO2006/078161において記載されている。
分子足場は、例えば、WO2009/098450ならびにそこに引用されている参考文献、特に、WO2004/077062およびWO2006/078161において記載されている。
前述の文書に記されている通り、分子足場は、有機小分子等、小分子でもよい。
一実施形態では、分子足場は、ヌクレオシド、糖、またはステロイドなどの天然の単量体であり得る、またはそれに基づき得る。例えば、分子足場は、二量体または三量体などの、そのような実体の短いポリマーを含み得る。
一実施形態では、分子足場は、既知の毒性、例えば低い毒性の化合物である。適切な化合物の例には、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはタマゼパム(tamazepam)などの既存の薬物が含まれる。
一実施形態では、分子足場は巨大分子であり得る。一実施形態では、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。
一実施形態では、分子足場は、ポリペプチドの官能基(複数可)と反応して共有結合を形成することができる反応基を含む。
分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、酸無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの化学基を含有し得る。
一実施形態では、分子足場は、トリス(ブロモメチル)ベンゼン、特に1,3,5−トリス(ブロモメチル)ベンゼン(「TBMB」)、またはその誘導体を含み得る、またはそれからなり得る。
一実施形態では、分子足場は2,4,6−トリス(ブロモメチル)メシチレンである。この分子は、1,3,5−トリス(ブロモメチル)ベンゼンに類似であるが、ベンゼン環に結合した3つの追加的なメチル基を含有する。これは、追加的なメチル基が、ポリペプチドとのさらに別の接触を形成し、したがって追加的な構造的制約を加え得るという利点を有する。
本発明の分子足場は、本発明のコードされたライブラリのポリペプチドの官能基が分子足場と共有結合を形成することのできる化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジ化物、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含む広範な官能基から選択される。
システインのチオール基と反応させるために分子足場上で使用することができる足場反応基は、アルキルハロゲン化物、(またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも命名される)。
具体例は、ブロモメチルベンゼン(TBMBにより例証される足場反応基)またはヨードアセトアミドである。化合物をタンパク質中のシステインと選択的にカップリングさせるために使用される他の足場反応基はマレイミドである。本発明において分子足場として使用され得るマレイミドの例には、トリス−(2−マレイミドエチル)アミン、トリス−(2−マレイミドエチル)ベンゼン、トリス−(マレイミド)ベンゼンが含まれる。セレノシステインは、また、システインと類似の反応性を有しており、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。したがって、システインに言及する場合はいつでも、文脈によりそうでないと示唆される場合以外は、セレノシステインを置換することが典型的には許容される。
エフェクターおよび官能基
エフェクターおよび/または官能基を、例えば、ポリペプチドのNもしくはC末端にまたは分子足場に付けることができる。
エフェクターおよび/または官能基を、例えば、ポリペプチドのNもしくはC末端にまたは分子足場に付けることができる。
適切なエフェクター基は、抗体およびその部分または断片を含む。例えば、エフェクター基は、1種または複数種の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域(CL)、抗体CH1重鎖ドメイン、抗体CH2重鎖ドメイン、抗体CH3重鎖ドメインまたはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。エフェクター基は、抗体のヒンジ領域(IgG分子のCH1およびCH2ドメインの間に通常存在する領域等)を含むこともできる。
本発明の本態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基は、IgG分子のFc領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基は、1日間以上、2日間以上、3日間以上、4日間以上、5日間以上、6日間以上または7日間以上のtβ半減期を有するペプチドリガンドFc融合体を含む、あるいはこれからなる。最も有利には、本発明によるペプチドリガンドは、1日間以上のtβ半減期を有するペプチドリガンドFc融合体を含む、あるいはこれからなる。
官能基は、一般に、結合基、薬物、他の実体を付けるための反応基、細胞への大環状ペプチドの取り込みを助ける官能基その他を含む。
細胞へと浸透するペプチドの能力は、細胞内標的に対するペプチドを有効なものとすることができる。細胞へと浸透する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的は、転写因子、チロシンキナーゼ等の細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与する分子を含む。細胞の浸透を可能にする官能基は、ペプチドまたは分子足場のいずれかに付加されたペプチドまたは化学基を含む。VP22、HIV−Tat、ショウジョウバエ(Drosophila)のホメオボックスタンパク質(アンテナペディア)等に由来するペプチド等、ペプチドは、例えば、Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35巻, Part 4, p821;Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637に記載されている。細胞膜を通した転位置において効率的であることが示された短いペプチドの例として、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の16アミノ酸ペネトラチン(penetratin)ペプチド(Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444頁)、18アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」(Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127頁)およびHIV TATタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチは、生体分子に容易に付けることができる小分子模倣物またはSMOCの使用を含む(Okuyama et al (2007) Nature Methods Volume 4 p153)。分子にグアニジウム基を付加する他の化学的戦略も、細胞浸透を増強させる(Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585)。ステロイド等、低分子量の分子を分子足場に付加して、細胞への取り込みを増強させることができる。
ペプチドリガンドに付けることのできる官能基の一クラスは、抗体、およびFab、Fvまたはシングルドメイン断片等、その結合断片を含む。特に、in vivoにおけるペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体を用いることができる。
多くの細胞上に存在するインテグリンに結合するRGDペプチドを組み入れることもできる。
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基は、12時間以上、24時間以上、2日間以上、3日間以上、4日間以上、5日間以上、6日間以上、7日間以上、8日間以上、9日間以上、10日間以上、11日間以上、12日間以上、13日間以上、14日間以上、15日間以上または20日間以上からなる群から選択されるtβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンドエフェクター基または組成物は、12〜60時間の範囲内のtβ半減期を有するであろう。さらに別の実施形態では、これは、1日間以上のtβ半減期を有するであろう。さらにまた別の実施形態では、これは、12〜26時間の範囲内であろう。
官能基は、癌治療のための細胞傷害性薬剤等、薬物を含む。これは、シスプラチンおよびカルボプラチン等のアルキル化剤ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド;プリンアナログ、アザチオプリンおよびメルカプトプリンを含む抗代謝剤またはピリミジンアナログ;ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン等、ビンカアルカロイドを含む植物アルカロイドおよびテルペノイド;ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド;本来タキソールとして知られた、パクリタキセルを含むタキサン;カンプトテシンを含むトポイソメラーゼ阻害剤;イリノテカンおよびトポテカン、ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシドを含むII型阻害剤を含む。さらに別の薬剤は、免疫抑制薬ダクチノマイシン(腎臓移植において用いられる)、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンなどを含む抗腫瘍抗生物質を含むことができる。
可能なエフェクター基は、例えば、ペプチドリガンドが、ADEPTにおいて抗体を置き換える、酵素/プロドラッグ治療法において用いるためのカルボキシペプチダーゼG2等、酵素も含む。
合成
本発明のペプチドは、標準的な技術によって、続いてインビトロでの分子足場での反応によって、合成的に製造されてもよい。これが行われる場合、標準的な化学が用いられてもよい。これによって、さらなる下流の実験またはバリデーションのために可溶性の材料の迅速な大規模調製が可能になる。このような方法は、Timmermanら(上述)に開示されるもののような従来の化学を用いて達成され得る。
本発明のペプチドは、標準的な技術によって、続いてインビトロでの分子足場での反応によって、合成的に製造されてもよい。これが行われる場合、標準的な化学が用いられてもよい。これによって、さらなる下流の実験またはバリデーションのために可溶性の材料の迅速な大規模調製が可能になる。このような方法は、Timmermanら(上述)に開示されるもののような従来の化学を用いて達成され得る。
したがって、本発明はまた、本明細書に示されるように選択されたポリペプチドまたはコンジュゲートの製造であって、下に説明されるような任意選択のさらなるステップを含む製造に関する。一実施形態では、これらのステップは、化学合成によって作製された最終生成物のポリペプチド/コンジュゲートで行われる。
任意選択で、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を製造する場合、置換されてもよい。
ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、それによって複数の特異性を導入するために伸長されてもよい。
ペプチドを伸長するために、これは、標準的な固相または溶液相化学を用い、直交的に保護されたリジン(およびアナログ)を用いて、ループのN末端もしくはC末端で、またはループ内で化学的に、伸長されてもよい。標準的なタンパク質化学を、活性化可能なN末端またはC末端を導入するために用いてもよい。あるいは、追加は、例えば、(Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779)に記載のように断片縮合もしくは天然の化学的ライゲーションによって、または酵素によって、例えば、(Chang et al Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20;91(26):12544-8、またはHikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003)に記載のようにサブチリガーゼを用いて行ってもよい。
あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を通じてさらなるコンジュゲーションによって伸長または修飾されてもよい。これは、第1および第2のペプチドが、細胞の還元性環境内でお互いから一度解離することが可能になるという追加の利点を有する。この場合、分子足場(例えば、TBMB)が、3つのシステイン基と反応するように第1のペプチドの化学合成の間に追加され得る;次いで、さらなるシステインが、このシステインが第2のペプチドの遊離のシステインとのみ反応するように、第1のペプチドのN末端に追加されてもよい。
同様の技術を、2つの二環性および二重特異性の大員環の合成/カップリングに等しく適用して、可能性としては四重特異的な分子を作成する。
さらに、他の官能基またはエフェクター基の追加は、適切な化学を用いて同じ方式で達成され得、N末端もしくはC末端で、または側鎖を介してカップリングする。一実施形態では、このカップリングは、これがいずれの実体の活性もブロックしないような方式で行われる。
医薬組成物
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義されるペプチドリガンドを1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義されるペプチドリガンドを1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。
一般に、本発明のペプチドリガンドは、精製された形態で、薬理学的に適切な賦形剤または担体と共に利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体には、生理食塩水および/または緩衝媒体を含めた、水性またはアルコール/水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液に保つために必要な場合は、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどのシックナーから選択し得る。
静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液および栄養素補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る(Mack (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Edition)。
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与する組成物として、または他の薬剤と併せて使用し得る。これらには、シルコスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれる場合がある。医薬組成物に様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明のタンパク質リガンド、またはさらには標的リガンドを用いて選択されたポリペプチドなどの様々な特異性を有する本発明によって選択されたポリペプチド)の組み合わせとを併せた「カクテル」が含まれる場合があり、これらを投与前にプールするかどうかに拘らない。
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののうちの任意のものであり得る。これに限定されないが免疫療法を含む治療のために、本発明のペプチドリガンドは、標準の技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、また、適切には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含めた、任意の適切な様式であることができる。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、対抗適応症ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。
本発明のペプチドリガンドは、眼科障害の処置のための眼科用組成物として製剤化されるとき、その投与経路は典型的には、局所、結膜下、テノン下、眼内、眼科インプラントなどの眼科経路による投与など、その眼科障害の部位に直接であることが理解される。一実施形態では、投与の経路は、眼内注射による。別の実施形態では、その眼科用組成物は、局所に(例えば、眼球外適用)または全身的(例えば、口腔または他の非経口経路、例えば、皮下投与など)であり、ただし、眼の中または眼に隣接して位置する細胞または組織内の十分な量のペプチドが、眼科状態の部位との接触を達成する条件である。別の実施形態では、眼科用組成物は、非経口的に送達される。投与の正確な経路は、WO2007/104541(その内容は、参照によって本明細書に援用される)に記載の共通の一般的知識および方法論に従って、処置されるべき眼科障害に取り組めば、当業者には直ちに明らかになる。
本発明のペプチドリガンドは、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成することができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾燥および再構成の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および再構成は様々な度合の活性の損失をもたらす場合があり、補償するためにレベルを上方調節する必要があり得ることが理解されよう。
本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および/または治療的な処置のために投与することができる。特定の治療的の応用では、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、変調、死滅、または何らかの他の測定可能なパラメータを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用量を達成するために必要な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般に体重1キログラム当たり0.005〜5.0mgの選択されたペプチドリガンドの範囲であり、0.05〜2.0mg/kg/用量の用量がより一般的に使用される。予防的な応用では、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様または僅かに低い用量で投与してもよい。
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設定で利用し得る。さらに、本明細書中に記載のペプチドリガンドは、不均一な細胞のコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除去するために、体外またはin vitroで選択的に使用し得る。哺乳動物からの血液を体外で選択されたペプチドリガンドと合わせ、これにより所望しない細胞を死滅させるまたは他の様式で血液から除去して、標準の技法に従って哺乳動物に戻し得る。
治療的な使用
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、in vivo治療および予防適用、in vitroおよびin vivo診断適用、in vitroアッセイおよび試薬適用その他において用いることができる。選択されたレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望ましい非ヒト動物における検査に関与する適用において、あるいはホモログまたはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断適用において有用である。ワクチン適用等、一部の適用において、所定の範囲の抗原に対する免疫応答を誘発する能力を活用して、ワクチンを特異的疾患および病原体の目的に合わせることができる。
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、in vivo治療および予防適用、in vitroおよびin vivo診断適用、in vitroアッセイおよび試薬適用その他において用いることができる。選択されたレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望ましい非ヒト動物における検査に関与する適用において、あるいはホモログまたはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断適用において有用である。ワクチン適用等、一部の適用において、所定の範囲の抗原に対する免疫応答を誘発する能力を活用して、ワクチンを特異的疾患および病原体の目的に合わせることができる。
少なくとも90〜95%の均一性の実質的に純粋なペプチドリガンドが哺乳動物への投与に好ましく、98〜99%またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場合に製薬的な使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療(体外が含まれる)において、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの展開および実行において使用し得る(Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY)。
本発明のペプチドリガンドは、典型的には、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、および自己免疫障害(これらに限定されないが、I型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症を含む)の予防、抑制または処置において使用が見つかる。
したがって、本発明のさらなる態様によれば、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、および自己免疫障害を予防、抑制または処置するのにおける使用のための、本明細書において定義されたようなペプチドリガンドが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、眼科障害、および自己免疫障害を予防、抑制または処置する方法であって、本明細書に定義されるペプチドリガンドの必要な患者に対して投与することを含む方法が提供される。
一実施形態では、本発明の眼科障害は、網膜の血管の透過性および/または完全性の損傷に関連する障害である。さらなる実施形態では、本発明の眼科障害は、局所出血を引き起こす網膜微小血管の破裂に関連する障害である。さらなる実施形態では、本発明の眼科障害は、眼後部の疾患、具体的には網膜疾患である。さらなる実施形態では、本発明の眼科障害は、前眼部の疾患である。さらなる実施形態では、本発明の眼科障害は、眼の過剰な血管透過性および/または浮腫に関連する障害である。
適切な「眼科の障害」の例(これには、滲出性および/または炎症性の眼科の障害、網膜の血管の透過性および/または完全性の損傷に関連する障害、局所出血を引き起こす網膜微小血管の破裂に関連する障害、眼後部の疾患、網膜疾患、および前眼部の疾患を含む)は、これらに限定されないが、加齢黄斑変性(ARMD)、滲出性黄斑変性(「ウェット(滲出型)(wet)」または新血管性加齢性黄斑変性症(wet−AMD)としても公知である)、黄斑浮腫、老人性円板状黄斑変性症、嚢胞様黄斑浮腫、眼瞼浮腫、網膜浮腫、糖尿病網膜症、急性黄斑神経網膜症、中心性漿液性網膜脈絡膜症、網脈絡膜炎、脈絡叢新血管新生、血管新生黄斑症、新生血管緑内障、動脈閉塞性および静脈閉塞性網膜症(例えば、網膜静脈閉塞症または網膜動脈閉塞症)、網膜中心静脈閉塞症、播種性血管内凝固症候群、網膜分枝静脈閉塞症、高血圧性眼底変化、眼性虚血発作、網膜動脈小動脈瘤、コーツ病、傍中心窩毛細血管拡張症、半側網膜静脈閉塞症、乳頭血管炎、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、頚動脈疾患(CAD)、霜状分枝血管炎(frosted branch angitis)、鎌状赤血球網膜症および他のヘモグロビン異常症、網膜色素線条症、疾患を病因とする黄斑浮腫(例えば、糖尿病黄斑浮腫)、眼部の損傷もしくは眼部の外科手術;例えば、損傷、外傷もしくは腫瘍により引き起こされる網膜の虚血もしくは網膜変性、ブドウ膜炎、虹彩炎、網膜血管炎、眼内炎、全眼球炎、転移性眼炎、脈絡膜炎、網膜色素上皮炎、結膜炎、毛様体炎、強膜炎、上強膜炎、視神経炎、球後視神経炎、角膜炎、眼瞼炎、滲出性網膜剥離、角膜潰瘍、結膜潰瘍、慢性貨幣状角膜炎、タイゲソン角膜炎、進行性モーレン潰瘍、細菌もしくはウイルス感染によって、および眼部の外科手術によって引き起こされる眼部の炎症性疾患、眼部の物理的な損傷により引き起こされる眼部の炎症性疾患、掻痒、発赤、浮腫および潰瘍を含む眼部の炎症性疾患により引き起こされる症状、紅斑症、多形滲出性紅斑、結節性紅斑、環状紅斑、浮腫性硬化症、皮膚炎、血管神経性浮腫、咽頭水腫、声門水腫、声門下喉頭炎、気管支炎、鼻炎、咽頭炎、副鼻腔炎、喉頭炎または中耳炎を含む。
本明細書で言及される「眼の後部の疾患(back-of-eye diseases)」としては、とりわけ、眼の後部領域における網膜、黄斑、窩に影響する疾患が挙げられる。適切な「眼の後部の疾患」の例は、これらに限定されないが、黄斑浮腫、例えば、臨床上の黄斑浮腫または血管造影の類嚢胞黄斑浮腫(種々の病因論、例えば、糖尿病で生じる)、滲出性黄斑変性症および黄斑浮腫(網膜のレーザー処置から生じる)、加齢性黄斑変性症、未熟児の網膜症(水晶体後部線維増殖症としても公知)、網膜虚血および脈絡膜血管新生、網膜の疾患(糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜浮腫、網膜剥離、網膜下新血管形成による老年性黄斑変性症、近視性網膜症);炎症性疾患;腫瘍に関連するブドウ膜炎、例えば、網膜芽細胞腫または偽網膜膠腫;硝子体切除術後の新血管形成;血管疾患(網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、頸動脈虚血から生じる網膜症);ならびに視神経の新血管形成を含む。
本明細書で言及される「眼の前部の疾患(front-of-eye diseases)」とは、眼の前部の組織、例えば、角膜、光彩、毛様体、結膜などに主に影響する疾患を指す。適切な「眼の前部の疾患」の例は、これらに限定されないが、角膜の新血管形成(炎症、移植、虹彩の発達不全、滲出性または炎症性の要素を有する角膜疾患または混濁化、眼の穿通または眼球の挫傷性傷害に起因する血管新生に起因する);慢性ブドウ膜炎;前ブドウ膜炎;LASIK、LASEK、屈折矯正手術、IOL移植のような手術によってもたらされる炎症性状態;白内障手術の合併症としての不可逆性角膜浮腫;傷害または外傷(物理的、化学的、薬理学的など)の結果としての浮腫;炎症;結膜炎(例えば、持続的アレルギー性、巨大乳頭性、季節周期的アレルギー性、通年性アレルギー性、毒性の結膜炎(細菌、ウイルスまたはクラミジアの感染により引き起こされる));角結膜炎(春季、アトピー性、乾燥);虹彩毛様体炎;虹彩炎;強膜炎;上強膜炎;感染性角膜炎;点状表層角膜炎;円錐角膜;後部多形性角膜ジストロフィー;フックスジストロフィー(角膜および内皮);無水晶体および偽水晶体水疱性角膜症;角膜浮腫;強膜疾患;眼部瘢痕性類天疱瘡;毛様体扁平部炎;ポスナーシュロスマン症候群;ベーチェット病;フォークト・小柳・原田症候群;過敏反応;眼球表面障害;結膜浮腫;トキソプラズマ網脈絡膜炎;眼窩の炎症性偽腫瘍;結膜浮腫;結膜静脈鬱血;眼窩周囲蜂巣炎;急性涙嚢炎;非特異的血管炎;サルコイドーシス;ならびにサイトメガロウイルス感染を含む。
例えば、網膜または硝子体における、適切な「眼の過剰な血管透過性および/または浮腫に関連する障害」の例は、これらに限定されないが、加齢性黄斑変性症(AMD)、網膜浮腫、網膜出血、硝子体出血、黄斑浮腫(ME)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)および非増殖性糖尿病性網膜症(DR)、放射線網膜症、毛細血管拡張症、中心性漿液性網膜症、および網膜静脈閉塞を含む。網膜浮腫は、網膜内空間における液体の蓄積である。DMEは、糖尿病を有する患者で生じる網膜微小血管変化の結果である。血液−網膜障壁のこの妥協によって網膜の周囲への血漿構成要素の漏出がもたらされて、網膜浮腫が生じる。網膜の他の障害としては、網膜静脈閉塞(例えば、血管枝または中心静脈閉塞)、放射線網膜症、鎌状赤血球網膜症、未熟児網膜症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、後部ブドウ膜炎、慢性網膜剥離、アーヴァイン・ガス症候群、イールズ病、網膜炎および/または脈絡膜炎が挙げられる。
本明細書における「予防」という用語の言及には、疾患の誘導前の保護的組成物の投与を含む。「抑制」とは、誘導現象の後であるが、疾患の臨床的所見の前に組成物を投与することをいう。「処置」とは、疾患の症状が顕性となった後に保護的組成物を投与することを含む。
疾患に対する保護、またはその処置におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用できる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、本発明により促進されて、ヒトおよび動物標的と交差反応し得るポリペプチドリガンドの開発を可能にし、動物モデルの使用を可能にする。
感受性マウスにおいて全身性エリテマトーデス(SLE)を試験する方法は当分野で知られている(Knight et al. (1978) J Exp. Med., 147: 1653, Reinersten et al. (1978) New Eng. J : Med., 299: 515)。重症筋無力症(MG)は、SJL/J雌マウスにおいて、別の種からの可溶性AchRタンパク質を用いて疾患を誘導することによって試験する(Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233)。関節炎は、マウスの感受性株においてII型コラーゲンを注射することによって誘導する(Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233)。感受性ラットにおいてマイコバクテリア熱ショックタンパク質を注射することによってアジュバント関節炎を誘導するモデルが記載されている(Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171)。甲状腺炎は、マウスにおいて記載のようにサイログロブリンを投与することによって誘導する(Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115)。インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)は、Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27:113によって記載されているものなどの特定のマウス株において自然に発生するか、または誘導することができる。マウスおよびラットにおけるEAEは、ヒトにおけるMSのモデルとして役割を果たす。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質を投与することによって脱髄性疾患が誘導される(Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478、ならびにSatoh et al. (1987) J ; Immunol., 138: 179を参照)。
次の実施例を参照することにより、次に、本発明をさらに説明する。
材料および方法
ファージライブラリのクローニング
ファージライブラリは、Heinis et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502−7)に従って作成した。
ファージライブラリのクローニング
ファージライブラリは、Heinis et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502−7)に従って作成した。
ファージ選択
ファージライブラリのグリセロールストックを、500mlの2YT/クロラムフェニコール(30mg/ml)培養中でOD600=0.1まで希釈して、ファージを、30℃で一晩(15〜16時間)生成した。ファージを、Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502−7に記載のように精製して、化学的に修飾した。ビオチン化hPK(3mg)(IHPKA、ヒト血漿由来、Innovative Research、Novi、MI、USA)を、50mlの予備洗浄した磁性ストレプトアビジンビーズ(Dynal,M−280(Invitrogen、Paisley、UK))とともにRTで10分間インキュベートした。ビーズを、3回洗浄した後に、1%のBSAおよび0.1%のTween20を含有する0.5mlの洗浄バッファー(10mMのTris−Cl、pH7.4、150mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mMのCaCl2)を用いて30分間RTで回転しながらブロックした。化学的に修飾されたファージ(典型的には、2mlの洗浄バッファー中で1010〜1011t.u.に溶解)を、3%のBSAおよび0.3%のTween20を含有する1mlの洗浄バッファーの添加によって、同時にブロックした。次いで、ブロックしたビーズをブロックした化学的に修飾されたファージと混合して、回転ホイール上で、RTで30分間インキュベートした。ビーズを、0.1%のTween20を含有する洗浄バッファーを用いて8回洗浄し、洗浄バッファーで2回洗浄した後、100mlの50mMグリシン、pH2.2とともに5分間インキュベートした。溶出されたファージを50mlの1MのTris−Cl、pH8に中和のために移して、30mlのTG1細胞とともにOD600=0.4で90分間37℃でインキュベートして、細胞を大きい2YT/クロラムフェニコールプレート上にプレートした。同じ手順を用いて、1回または2回の追加の回のパンニングを行った。2回目の選択では、ニュートラアビジンコーティングの磁性ビーズを用いて、ストレプトアビジン特異的なペプチドの富化を防止した。このニュートラアビジンビーズは、0.8mgのニュートラアビジン(Pierce、Rockford、IL、USA)と0.5mlのトシル−活性化磁性ビーズ(Dynal、M−280、Invitrogen、Paisley、UK)とを、供給業者の指示に従って反応させることによって調製した。
ファージライブラリのグリセロールストックを、500mlの2YT/クロラムフェニコール(30mg/ml)培養中でOD600=0.1まで希釈して、ファージを、30℃で一晩(15〜16時間)生成した。ファージを、Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502−7に記載のように精製して、化学的に修飾した。ビオチン化hPK(3mg)(IHPKA、ヒト血漿由来、Innovative Research、Novi、MI、USA)を、50mlの予備洗浄した磁性ストレプトアビジンビーズ(Dynal,M−280(Invitrogen、Paisley、UK))とともにRTで10分間インキュベートした。ビーズを、3回洗浄した後に、1%のBSAおよび0.1%のTween20を含有する0.5mlの洗浄バッファー(10mMのTris−Cl、pH7.4、150mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mMのCaCl2)を用いて30分間RTで回転しながらブロックした。化学的に修飾されたファージ(典型的には、2mlの洗浄バッファー中で1010〜1011t.u.に溶解)を、3%のBSAおよび0.3%のTween20を含有する1mlの洗浄バッファーの添加によって、同時にブロックした。次いで、ブロックしたビーズをブロックした化学的に修飾されたファージと混合して、回転ホイール上で、RTで30分間インキュベートした。ビーズを、0.1%のTween20を含有する洗浄バッファーを用いて8回洗浄し、洗浄バッファーで2回洗浄した後、100mlの50mMグリシン、pH2.2とともに5分間インキュベートした。溶出されたファージを50mlの1MのTris−Cl、pH8に中和のために移して、30mlのTG1細胞とともにOD600=0.4で90分間37℃でインキュベートして、細胞を大きい2YT/クロラムフェニコールプレート上にプレートした。同じ手順を用いて、1回または2回の追加の回のパンニングを行った。2回目の選択では、ニュートラアビジンコーティングの磁性ビーズを用いて、ストレプトアビジン特異的なペプチドの富化を防止した。このニュートラアビジンビーズは、0.8mgのニュートラアビジン(Pierce、Rockford、IL、USA)と0.5mlのトシル−活性化磁性ビーズ(Dynal、M−280、Invitrogen、Paisley、UK)とを、供給業者の指示に従って反応させることによって調製した。
標準的な選択プロセスを、1回目および2回目に関してはビオチン化ヒトカリクレインの漸減濃度を用い、次いで、3回目および4回目にはヒトまたはラットのいずれかのビオチン化カリクレインの漸減濃度を用いて、5×5および6×6のライブラリで用いた。ヒトカリクレインは組み換えではなく、したがって、重鎖が存在し、ラットカリクレインは組み換えであり、重鎖を欠き、可能性としては、(ヒトタンパク質の活性に基づいて)予想されるよりも低い活性である。活性が低い可能性があるので、ラットの標的の濃度は、ヒトタンパク質のところまでは、低下されなかった。
ヒト、サルおよびラットのPKのクローニングおよび発現
ヒト、サルおよびラットPKの触媒性ドメインを、哺乳動物細胞中で、その触媒性ドメインに対してproTEV切断部位を介してN末端で接続されたプロペプチドを有する不活性前駆体として発現させた。発現ベクターをクローニングして、下記のとおり、タンパク質を発現し、活性化して、精製した。PKシグナル配列、ポリヒスチジンタグ、proTEV切断部位、PKの成熟触媒性ドメインおよび終止コドンをコードする合成遺伝子は、Geneart(Regensburg、Germany)(Supplementary materials)から購入した。ヒト、サル(Macaca mulatta)およびラットのPKの合成遺伝子を含むプラスミドDNAを調製して、遺伝子をpEXPR−IBA42哺乳動物発現ベクター(IBA Biotechnology、Goettingen、Germany)中に、制限酵素対のXholおよびHindIII(Fermentas、Vilnius、Latvia)ならびにT4 DNAリガーゼ(Fermentas)を用いて移動した。連結されたプラスミドを、XL−1ブルーエレクトロコンピテントセル(Stratagene、Santa Clara、USA)に形質転換して、アンピシリン(10μg/ml)を含有する2YT寒天プレート上にプレートした。3つの発現ベクター(命名はmPK、rPKおよびhPK)由来のDNAを生成して、正確な配列を、DNAシーケンシング(Macrogen、Seoul、South Korea)によって確認した。
ヒト、サルおよびラットPKの触媒性ドメインを、哺乳動物細胞中で、その触媒性ドメインに対してproTEV切断部位を介してN末端で接続されたプロペプチドを有する不活性前駆体として発現させた。発現ベクターをクローニングして、下記のとおり、タンパク質を発現し、活性化して、精製した。PKシグナル配列、ポリヒスチジンタグ、proTEV切断部位、PKの成熟触媒性ドメインおよび終止コドンをコードする合成遺伝子は、Geneart(Regensburg、Germany)(Supplementary materials)から購入した。ヒト、サル(Macaca mulatta)およびラットのPKの合成遺伝子を含むプラスミドDNAを調製して、遺伝子をpEXPR−IBA42哺乳動物発現ベクター(IBA Biotechnology、Goettingen、Germany)中に、制限酵素対のXholおよびHindIII(Fermentas、Vilnius、Latvia)ならびにT4 DNAリガーゼ(Fermentas)を用いて移動した。連結されたプラスミドを、XL−1ブルーエレクトロコンピテントセル(Stratagene、Santa Clara、USA)に形質転換して、アンピシリン(10μg/ml)を含有する2YT寒天プレート上にプレートした。3つの発現ベクター(命名はmPK、rPKおよびhPK)由来のDNAを生成して、正確な配列を、DNAシーケンシング(Macrogen、Seoul、South Korea)によって確認した。
3つのオーソロガス(同じ遺伝子座)の血漿カリクレインを、以下のように哺乳動物細胞中で発現した。50mlの懸濁−適合のHEK−293細胞を、4mMのグルタミンおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤バルプロ酸(3.75mM)の存在下で、オービター振盪100mlフラスコ中で、180rpmで、ISF−4−Wインキュベーター(Kuehner AG、Birsfelden、Switzerland)の中で、37℃で、5%CO2の存在中で、無血清のExCell 293培地(SAFC Biosciences、St.Louis、MO)の中で、増殖させた。胚性腎細胞(HEK−293)を高い細胞密度(20×106細胞/ml)で(Backliwal, et al. Biotechnol Bioeng 2008, 99 (3), 721-7)、3つのプラスミド(300mg/ml)を用い、直鎖のポリエチレンイミン(PEI、Polysciences、Eppenheim、Germany)を用いてトランスフェクトした。7日の産生段階の終わりに、細胞を4℃で15分間2500rpmの遠心分離によって回収した。追加の細胞破片を、0.45μmのPES膜(Filter−top 250ml低タンパク質結合TPP)を通した濾過によって培地から除去した。ポリヒスチジン−タグ化タンパク質を、Ni−NTA樹脂、洗浄バッファー(500mMのNaCl、25mMのNa2HPO4、pH7.4)および溶出バッファー(500mMのNaCl、25mMのNa2HPO4、pH7.4、500mMのイミダゾール)を用いて、Ni−アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。タンパク質を、(50単位)のproTEV(Promega、Madison、Wisconsin、USA)を用いて部分的に活性化し、さらにNi−アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過(PD10カラム、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA、50mMのHEPES、pH7)によって精製した。
結合活性の改善されたポリペプチドの開発
個々の位置のランダム化
ライブラリの構築:カリクレイン結合性二環性ペプチド中のアミノ酸をマッピングするために、1セットの小さいライブラリを構築した。5つの残基の2つのループから構成されるバイシクルに関しては、各々がペプチド配列中の特定のコドンでランダム化された10の別個のライブラリを生成した。各々のライブラリについてオリゴヌクレオチドを設計して、部位指向性の突然変異誘発によってファージゲノムDNAを変異させた。目的のコドンの突然変異誘発組み込みランダム化(NNSに変化)、およびテンプレートゲノム配列からの固有のApaL1制限部位の除去。突然変異誘発生成物は、超純水への溶出を用いるQIAgen QIAquick PCR精製キットを用いて精製した。各々のライブラリを用いて、別々に、TG1 E coliを、エレクトロポレーションによって、BioRad Micropulser machine(Ec1 program)および1mmのBioRadのキュベットを用いて形質転換した。1mlのSOC培地中で37℃で1時間回復させた後、ライブラリの形質転換体を、抗生物質を含む25mlの2TYブロス中で一晩増殖させて、ライブラリの形質転換体のみを選択的に増殖させた。細菌を、遠心分離によって回収して、ライブラリのファージDNAを、E.coliから、QIAgen Plasmid Plus Midiキットを用いて精製して、蒸留水中に溶出した。精製されたDNAを、New England Biolabsバッファー4の中で2時間ApaL1を用いて消化して、親物質を除去した。消化後、DNAを、QIAgen PCR精製キット(上記のとおり)を用いて再精製し、これを用いてTG1を形質転換した(エレクトロポレーション;上記のとおり)。SOC中での1時間の回復後、形質転換体を、選択性抗生物質を含有するLB−寒天プレートの上にプレートして、コロニーを37℃で一晩成長させた。
個々の位置のランダム化
ライブラリの構築:カリクレイン結合性二環性ペプチド中のアミノ酸をマッピングするために、1セットの小さいライブラリを構築した。5つの残基の2つのループから構成されるバイシクルに関しては、各々がペプチド配列中の特定のコドンでランダム化された10の別個のライブラリを生成した。各々のライブラリについてオリゴヌクレオチドを設計して、部位指向性の突然変異誘発によってファージゲノムDNAを変異させた。目的のコドンの突然変異誘発組み込みランダム化(NNSに変化)、およびテンプレートゲノム配列からの固有のApaL1制限部位の除去。突然変異誘発生成物は、超純水への溶出を用いるQIAgen QIAquick PCR精製キットを用いて精製した。各々のライブラリを用いて、別々に、TG1 E coliを、エレクトロポレーションによって、BioRad Micropulser machine(Ec1 program)および1mmのBioRadのキュベットを用いて形質転換した。1mlのSOC培地中で37℃で1時間回復させた後、ライブラリの形質転換体を、抗生物質を含む25mlの2TYブロス中で一晩増殖させて、ライブラリの形質転換体のみを選択的に増殖させた。細菌を、遠心分離によって回収して、ライブラリのファージDNAを、E.coliから、QIAgen Plasmid Plus Midiキットを用いて精製して、蒸留水中に溶出した。精製されたDNAを、New England Biolabsバッファー4の中で2時間ApaL1を用いて消化して、親物質を除去した。消化後、DNAを、QIAgen PCR精製キット(上記のとおり)を用いて再精製し、これを用いてTG1を形質転換した(エレクトロポレーション;上記のとおり)。SOC中での1時間の回復後、形質転換体を、選択性抗生物質を含有するLB−寒天プレートの上にプレートして、コロニーを37℃で一晩成長させた。
個々のクローンの結合のアッセイ:ライブラリ形質転換体クローンは、ランダムに採取して、個々の培養物として、選択性の抗生物質を含有する2TYブロス中で増殖させた。採取したコロニーを、QIAgen PyroMark Q96 DNAシーケンサーを用いてDNA配列決定して、各々のクローンに存在するアミノ酸置換を明らかにした。単離された場合、各々の固有の置換のクローンを、以下のようにヒト血漿カリクレイン結合についてアッセイした。ファージを含有している上清を、培養物から回収して、ファージを、Heinis et al (Nature Chemical Biology vol. 5 pp 502-507 (2009))の方法に基づいて、トリスブロモメチルベンゼン(TBMB)で環化した。このプロセスから精製されたファージを、プレートベースのホモジニアス結合アッセイを用いて、ビオチン化ヒト血漿カリクレインに対する結合についてアッセイした;BMG Labtech Pherastar FSプレートリーダーで測定したアッセイ読み出し。三連のアッセイ試料からの定量的結合データを平均し(平均)、シグナル:バックグラウンドとして表現した(ここで、バックグラウンドとは、標的物質なしでアッセイした試料であった)。シグナル:バックグラウンドを、並行な親の試料の%として表現した。エラーバーは、平均の標準偏差を示す。示したアッセイは、少なくとも2つの独立した実験の代表である。このアッセイデータは、ペプチド配列と相互に関連した。灰色で印した置換は、試験しなかった(クローンは、ランダムライブラリサンプリングからは単離しなかった)。非結合(任意)バイシクルの試料を、並行してアッセイして、アッセイベースラインを図示した。
ペプチドドメインのランダム化
ライブラリ構築:小さいファージライブラリを、上記の「ファージライブラリのクローニング」に記載されるようにHeinisらの方法に従って生成した。バイシクルコード部分が、NNSにランダム化された4〜6のコドンのみを有する、親の5×5または6×6バイシクル(5×5:2つの5残基ループ、6×6:2つの6残基ループ)DNA配列に基づくように、sficx3baプライマーを修飾した。ランダム化コドンは、目的のペプチドドメイン/モチーフをコードするものであった。
ライブラリ構築:小さいファージライブラリを、上記の「ファージライブラリのクローニング」に記載されるようにHeinisらの方法に従って生成した。バイシクルコード部分が、NNSにランダム化された4〜6のコドンのみを有する、親の5×5または6×6バイシクル(5×5:2つの5残基ループ、6×6:2つの6残基ループ)DNA配列に基づくように、sficx3baプライマーを修飾した。ランダム化コドンは、目的のペプチドドメイン/モチーフをコードするものであった。
個々のクローンの結合のアッセイ:ライブラリ形質転換体コロニー、または選択アウトプットコロニーを、採取して、個々の培養物として、選択性の抗生物質を含有する2TYブロス中で増殖させた。採取したコロニーを、QIAgen PyroMark Q96 DNAシーケンサーを用いてDNA配列決定して、各々のクローンに存在するアミノ酸置換を明らかにし、以下のとおり、ヒト血漿カリクレイン結合についてアッセイした。ファージを含有している上清を、培養物から回収して、ファージを、Heinis et al (Nature Chemical Biology vol. 5 pp 502-507 (2009))の方法に基づいて、トリスブロモメチルベンゼン(TBMB)で環化した。このプロセスから精製されたファージを、プレートベースのホモジニアス結合アッセイを用いて、ビオチン化ヒト血漿カリクレインに対する結合についてアッセイした;BMG Labtech Pherastar FSプレートリーダーで測定したアッセイ読み出し。二連のアッセイ試料からの定量的結合データを平均し(平均)、シグナル:バックグラウンドとして表現した。示したアッセイデータは、少なくとも2つの独立した実験の代表である。このアッセイデータは、ペプチド配列と相互に関連した。
ペプチド合成
ペプチド合成は、Peptide Instrumentsが製造した、Symphonyペプチドシンセサイザーを用いる、Fmoc化学に基づいた。標準のFmoc−アミノ酸類を使用し(Sigma、Merck)、以下の側鎖保護基を用いた、Arg(Pbf);Asn(Trt);Asp(OtBu);Cys(Trt);GIu(OtBu);Gln(Trt);His(Trt);Lys(Boc);Ser(tBu);Thr(tBu);Trp(Boc)、Tyr(tBu)(Sigma)。カップリング試薬は、HCTU(Pepceuticals)であって、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、Sigma)を、ベースとして使用し、脱保護は、DMF(AGTC)中の20%のピペリジンで達成した。合成は、0.37mmol/gr Fmoc−Rink アミドAM樹脂(AGTC)を用いて100μmole規模で行い、Fmoc−アミノ酸を4倍過剰で利用して、ベースはアミノ酸に関して4倍過剰であった。アミノ酸を、0.2MでDMF中に、HCTU(0.4MでDMF中に)、およびDIPEA(1.6MでN−メチルピロリドン中に)(Alfa Aesar)に溶解した。カップリング時間は一般には30分であって、脱保護時間は2×2.5分間であった。Fmoc−N−メチルグリシン(Fmoc−Sar−OH、Merck)を、1時間カップリングして、以下の残基についての脱保護およびカップリング時間はそれぞれ20分および1時間であった。合成後、樹脂をジクロロメタンで洗浄して、乾燥した。側鎖保護基のおよび支持体からの切断は、10mLの95:2.5:2.5:2.5(v/v/v/w)のTFA/H2O/iPr3SiH/ジチオスレイトールを用いて3時間達成した。切断後、使用済みの樹脂を濾過によって取り除き、濾液を、−80℃で冷却された35mLのジエチルエーテルに添加した。ペプチドペレットを遠心分離して、エーテルの上清を廃棄して、ペプチドペレットを、冷エーテルを用いて2回以上洗浄した。次いで、ペプチドを5〜10mLのアセトニトリル−水中に再溶解して、凍結乾燥した。わずかな試料を、質量分析法(MALDI−TOF、Voyager DE(Applied Biosystems))による粗生成物の純度の分析のために取り出した。凍結乾燥後、ペプチド粉末を10mLの6M塩酸グアニジウム(H2O中に含まれる)中に採取し、0.5mLの1Mのジチオスレイトールを補充し、C8 Luna分取HPLC カラム(Phenomenex)上にロードした。溶媒(H2O、アセトニトリル)を0.1%のヘプタフルオロ酪酸を用いて酸性化した。勾配は、Gilson分取HPLCシステムを用いて、15/20mL/分の流速で、15分で30〜70%のアセトニトリルにわたった。純粋な直鎖のペプチド物質を含有する画分(MALDIによって特定されるとおり)を合わせて、トリスブロモメチルベンゼン(TBMB、Sigma)で修飾した。このために、直鎖のペプチドを、H2Oを用いて最大約35mLまで希釈し、アセトニトリル中に含まれる約500μLの100mMのTBMBを添加して、その反応を、H2Oに含まれる5mLの1MのNH4HCO3で開始した。その反応を、RTで約30〜60分間進行させて、一旦凍結乾燥させ、その反応を終わらせた(MALDIで判定)。凍結乾燥後、修飾されたペプチドを、上記のとおり精製したが、ただしLuna C8はGemini C18カラム(Phenomenex)で置き換え、酸は0.1%トリフルオロ酢酸に変えた。正確なTMB−修飾物質を含有する純粋な画分をプールして、凍結乾燥して、貯蔵のために−20℃で保持した。
ペプチド合成は、Peptide Instrumentsが製造した、Symphonyペプチドシンセサイザーを用いる、Fmoc化学に基づいた。標準のFmoc−アミノ酸類を使用し(Sigma、Merck)、以下の側鎖保護基を用いた、Arg(Pbf);Asn(Trt);Asp(OtBu);Cys(Trt);GIu(OtBu);Gln(Trt);His(Trt);Lys(Boc);Ser(tBu);Thr(tBu);Trp(Boc)、Tyr(tBu)(Sigma)。カップリング試薬は、HCTU(Pepceuticals)であって、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、Sigma)を、ベースとして使用し、脱保護は、DMF(AGTC)中の20%のピペリジンで達成した。合成は、0.37mmol/gr Fmoc−Rink アミドAM樹脂(AGTC)を用いて100μmole規模で行い、Fmoc−アミノ酸を4倍過剰で利用して、ベースはアミノ酸に関して4倍過剰であった。アミノ酸を、0.2MでDMF中に、HCTU(0.4MでDMF中に)、およびDIPEA(1.6MでN−メチルピロリドン中に)(Alfa Aesar)に溶解した。カップリング時間は一般には30分であって、脱保護時間は2×2.5分間であった。Fmoc−N−メチルグリシン(Fmoc−Sar−OH、Merck)を、1時間カップリングして、以下の残基についての脱保護およびカップリング時間はそれぞれ20分および1時間であった。合成後、樹脂をジクロロメタンで洗浄して、乾燥した。側鎖保護基のおよび支持体からの切断は、10mLの95:2.5:2.5:2.5(v/v/v/w)のTFA/H2O/iPr3SiH/ジチオスレイトールを用いて3時間達成した。切断後、使用済みの樹脂を濾過によって取り除き、濾液を、−80℃で冷却された35mLのジエチルエーテルに添加した。ペプチドペレットを遠心分離して、エーテルの上清を廃棄して、ペプチドペレットを、冷エーテルを用いて2回以上洗浄した。次いで、ペプチドを5〜10mLのアセトニトリル−水中に再溶解して、凍結乾燥した。わずかな試料を、質量分析法(MALDI−TOF、Voyager DE(Applied Biosystems))による粗生成物の純度の分析のために取り出した。凍結乾燥後、ペプチド粉末を10mLの6M塩酸グアニジウム(H2O中に含まれる)中に採取し、0.5mLの1Mのジチオスレイトールを補充し、C8 Luna分取HPLC カラム(Phenomenex)上にロードした。溶媒(H2O、アセトニトリル)を0.1%のヘプタフルオロ酪酸を用いて酸性化した。勾配は、Gilson分取HPLCシステムを用いて、15/20mL/分の流速で、15分で30〜70%のアセトニトリルにわたった。純粋な直鎖のペプチド物質を含有する画分(MALDIによって特定されるとおり)を合わせて、トリスブロモメチルベンゼン(TBMB、Sigma)で修飾した。このために、直鎖のペプチドを、H2Oを用いて最大約35mLまで希釈し、アセトニトリル中に含まれる約500μLの100mMのTBMBを添加して、その反応を、H2Oに含まれる5mLの1MのNH4HCO3で開始した。その反応を、RTで約30〜60分間進行させて、一旦凍結乾燥させ、その反応を終わらせた(MALDIで判定)。凍結乾燥後、修飾されたペプチドを、上記のとおり精製したが、ただしLuna C8はGemini C18カラム(Phenomenex)で置き換え、酸は0.1%トリフルオロ酢酸に変えた。正確なTMB−修飾物質を含有する純粋な画分をプールして、凍結乾燥して、貯蔵のために−20℃で保持した。
全てのアミノ酸は、他に注記しない限り、L−コンホメーションで用いた。
二環性ペプチドはN/C末端上の2つの不変のアラニンを通常含んでいるファージ選択から直接特定した。血漿安定性および薬物動態学的研究を追求するためのペプチドに関しては、ペプチドを示したとおり再合成し(末端アラニンを欠いている)、示したとおりN末端アセチル化した。
実施例4の薬物動態学的研究に用いたペプチドは、水に含まれる10mMのHClから3回凍結乾燥して、化合物の塩酸塩を得た。溶液は、1mg/mLで、50mMのHepes(pH7.0)、5%グリセロール、1.9%DMSOの中で、2つの化合物(Ac−(06−550)Aze3 HArg5 Sar3−(D−Arg2))および(06−259−02)−Sar3−(D−Arg2))について、5mg/kgで、Spraguely Dawelyラットに静脈内ボーラスで投与した。連続血液サンプル(約0.2mL)を、EDTAチューブ中に、示した時点で採取し、血漿を遠心分離によって分離して、分析のために−20℃で凍結した。標準的な生体分析技術を使用して、次に、血漿サンプルを、Waters,Xevo TQS LC−MSを用いて親の残りの化合物について分析して定量した。PKパラメータは、Summit Research ServicesのソフトウェアパッケージPK Solutions 2.0を用いて決定した。
実施例5および6の研究に用いたペプチドは、0.5%酢酸の存在下において逆相精製試行で収集した純粋(>95%)画分から得て、ここでは、凍結乾燥後にペプチドの酢酸塩を得た。
酵素アッセイ
機能的な酵素アッセイを、10mMのTris HCl、150mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mMのCaCl2および1mg/mLのBSA(全てSigma UK)(pH7.4)の中で、25℃で、ソリッドブラック(solid black)96または384ウェルプレートの中で行った。要するに、26.5pMヒト血漿カリクレイン(Stratech、UKより購入)または13.25pMラット血漿カリクレイン(社内で発現および精製した)を、漸増濃度の試験ペプチドの存在または不存在のもとで15分間インキュベートし、その後に蛍光発生的な基質Z−PheArg−AMC(Enzo Lifesciences UK)を、100μM(4%のDMSOの中に含有)の最終アッセイ濃度まで添加した。AMCの遊離は、Pherastar FS(BMG Labtech)、励起360nm、発光460nmを用いて測定した。反応の直線段階(典型的には5〜45分)の速度は、MARSデータ解析ソフトウェア(BMG labtech)で算出した。次いで、その速度を用いて、IC50およびKiをPrism(GraphPad)中で算出した。4つのパラメータ阻害非線形回帰式を用いて、IC50を算出した。ワンサイト(One site)−適合Ki式を用いてKiを算出し、これは、Kiを基質についてのKm(ヒト酵素に関しては150μM、ラットオルソログに関しては200μMである)に制約する。全てのKi/IC50値は、少なくとも2つの独立した実験の平均である(1nMより低いKi値を有するペプチドについては少なくとも3つの平均)。ウサギカリクレインに関しては、7〜14pMの間の酵素を使用し、ここで50μMのKmで33μMの基質である。
機能的な酵素アッセイを、10mMのTris HCl、150mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mMのCaCl2および1mg/mLのBSA(全てSigma UK)(pH7.4)の中で、25℃で、ソリッドブラック(solid black)96または384ウェルプレートの中で行った。要するに、26.5pMヒト血漿カリクレイン(Stratech、UKより購入)または13.25pMラット血漿カリクレイン(社内で発現および精製した)を、漸増濃度の試験ペプチドの存在または不存在のもとで15分間インキュベートし、その後に蛍光発生的な基質Z−PheArg−AMC(Enzo Lifesciences UK)を、100μM(4%のDMSOの中に含有)の最終アッセイ濃度まで添加した。AMCの遊離は、Pherastar FS(BMG Labtech)、励起360nm、発光460nmを用いて測定した。反応の直線段階(典型的には5〜45分)の速度は、MARSデータ解析ソフトウェア(BMG labtech)で算出した。次いで、その速度を用いて、IC50およびKiをPrism(GraphPad)中で算出した。4つのパラメータ阻害非線形回帰式を用いて、IC50を算出した。ワンサイト(One site)−適合Ki式を用いてKiを算出し、これは、Kiを基質についてのKm(ヒト酵素に関しては150μM、ラットオルソログに関しては200μMである)に制約する。全てのKi/IC50値は、少なくとも2つの独立した実験の平均である(1nMより低いKi値を有するペプチドについては少なくとも3つの平均)。ウサギカリクレインに関しては、7〜14pMの間の酵素を使用し、ここで50μMのKmで33μMの基質である。
ペプチドは、TFA塩としてそれらの粉末型で溶解し、ストック溶液は通常は水中で調製した。全ての溶液を遠心分離して、濾過した(20μmのシリンジフィルター)後に、280nmで吸収を測定した。吸光係数は、ペプチドのTrp/Tyr含量、およびTMBのもの(TMBコアは、ペプチドに含まれる場合、約300M−1cm−1という吸光係数を有する)に基づいて算出した。
血漿安定性プロファイリング
方法番号1:
迅速血漿安定性プロファイリングアッセイ(rapid plasma stability profiling assay)を開発し、これには親ペプチドの質量がもはや観察不能になる時点まで、親の質量の質量分析検出(MALDI−TOF、Voyager DE、Applied Biosystems)を使用した。具体的には、200μMのペプチドを、35%ラットまたはヒト血漿(Sera labs、抗凝固薬としてクエン酸塩を使用)の存在下で、1×PBS(10×PBS Stock、Sigma由来)を補充して、37℃でインキュベートした。種々の時点(すなわち、t=0、3、24時間、その後は10日まで毎日)、2μLの試料を、アセトニトリル:H2Oの1:1混合物中に含有される、18μLの30mMの重炭酸アンモニウムに添加した。試料は分析の時点まで−80℃で凍結した。ペプチドの適切な検出ウインドウを決定する質量分光分析のために、所定の時点のアセトニトリル:H2O希釈試料を、MALDIプレートの上に直接(0.7μL)スポットした。マトリックス(α−シアノ桂皮酸、Sigma(0.1%トリフルオロ酢酸を含有する1:1のアセトニトリル:水の中の飽和溶液として調製))を、試料上に積層した(1μL)。MALDI TOF上の同様のレーザー強度設定で、次に、親ペプチドがもはや検出不能になるまで時間を決定してもよい。これは、血漿安定性における相対的変化を検出するように機能する定量アッセイであることに留意されたい。
方法番号1:
迅速血漿安定性プロファイリングアッセイ(rapid plasma stability profiling assay)を開発し、これには親ペプチドの質量がもはや観察不能になる時点まで、親の質量の質量分析検出(MALDI−TOF、Voyager DE、Applied Biosystems)を使用した。具体的には、200μMのペプチドを、35%ラットまたはヒト血漿(Sera labs、抗凝固薬としてクエン酸塩を使用)の存在下で、1×PBS(10×PBS Stock、Sigma由来)を補充して、37℃でインキュベートした。種々の時点(すなわち、t=0、3、24時間、その後は10日まで毎日)、2μLの試料を、アセトニトリル:H2Oの1:1混合物中に含有される、18μLの30mMの重炭酸アンモニウムに添加した。試料は分析の時点まで−80℃で凍結した。ペプチドの適切な検出ウインドウを決定する質量分光分析のために、所定の時点のアセトニトリル:H2O希釈試料を、MALDIプレートの上に直接(0.7μL)スポットした。マトリックス(α−シアノ桂皮酸、Sigma(0.1%トリフルオロ酢酸を含有する1:1のアセトニトリル:水の中の飽和溶液として調製))を、試料上に積層した(1μL)。MALDI TOF上の同様のレーザー強度設定で、次に、親ペプチドがもはや検出不能になるまで時間を決定してもよい。これは、血漿安定性における相対的変化を検出するように機能する定量アッセイであることに留意されたい。
方法番号2:
安定性のデータをより迅速に得るために、ペプチドをまた95%血漿中でも評価した。ここでは、PBSを省き、1〜5mMペプチドストック(DMSO中に含まれる)を直接、血漿中に希釈し(すなわち、47.5μL血漿中に2.5μLのストック)、50μMの最終濃度を得た。5μLの試料を適切な時点で採取して、−80℃で凍結した。分析のために、試料を解凍して、25μLの3:3:1のアセトニトリル:メタノール:水と混合し、13kで5分間遠心分離した。5μLのペプチド含有上清を吸引して、アセトニトリル:H2Oの1:1混合物中に含有される30mMの重炭酸アンモニウムと混合した。次いで、この1μLを、MALDIプレート上にスポットして、上記のとおり解析した。上記のとおり、これは、血漿安定性の相対的な変化を検出するように機能する定量的アッセイであることに注目すべきである。
安定性のデータをより迅速に得るために、ペプチドをまた95%血漿中でも評価した。ここでは、PBSを省き、1〜5mMペプチドストック(DMSO中に含まれる)を直接、血漿中に希釈し(すなわち、47.5μL血漿中に2.5μLのストック)、50μMの最終濃度を得た。5μLの試料を適切な時点で採取して、−80℃で凍結した。分析のために、試料を解凍して、25μLの3:3:1のアセトニトリル:メタノール:水と混合し、13kで5分間遠心分離した。5μLのペプチド含有上清を吸引して、アセトニトリル:H2Oの1:1混合物中に含有される30mMの重炭酸アンモニウムと混合した。次いで、この1μLを、MALDIプレート上にスポットして、上記のとおり解析した。上記のとおり、これは、血漿安定性の相対的な変化を検出するように機能する定量的アッセイであることに注目すべきである。
方法番号3:
血漿安定性を定量的に得るために、ペプチドストック溶液(DMSO中に1mM含有)を、Biofocus、UKに送り、ここで分析を行った。ペプチドを、水を用いて100μMに希釈して、血漿中で1:20希釈し(5μMの最終濃度、血漿を95%で使用)、必要に応じてサンプリングして、上記のとおり沈殿させて、Waters Xevo TQ−MSを用いてLC−MSで定量した。
血漿安定性を定量的に得るために、ペプチドストック溶液(DMSO中に1mM含有)を、Biofocus、UKに送り、ここで分析を行った。ペプチドを、水を用いて100μMに希釈して、血漿中で1:20希釈し(5μMの最終濃度、血漿を95%で使用)、必要に応じてサンプリングして、上記のとおり沈殿させて、Waters Xevo TQ−MSを用いてLC−MSで定量した。
都合の良いホモログ選択性および種交差反応性を有するカリクレイン結合性二環性ペプチドの特定
(a)新規の強力なヒトおよびラットの交差反応性のリード配列の特定
任意の所定の治療的二環性ペプチドに関しては、その薬理学的および薬物動態学的特性を、前臨床動物種で評価する必要がある。一般的な前臨床の種としては、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ミニブタ、およびカニクイザルが挙げられる。
(a)新規の強力なヒトおよびラットの交差反応性のリード配列の特定
任意の所定の治療的二環性ペプチドに関しては、その薬理学的および薬物動態学的特性を、前臨床動物種で評価する必要がある。一般的な前臨床の種としては、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ミニブタ、およびカニクイザルが挙げられる。
二環性ペプチドの一般的に高い選択性(部分的には、標的タンパク質に対するそれらの大きい接触面積によって容易になる)に起因して、ヒト標的タンパク質に対する高い親和性の二環性ペプチドは、所定の前臨床種由来の同じ標的タンパク質と交差反応し得ず、このようなリードの前臨床評価が困難になる。ある例としては、ヒトカリクレインに対して約1.2nMのKiを有する強力な二環性ペプチド(6×6ループサイズ)である、PK15(WO2009/098450に開示される)が挙げられる。ラットカリクレインに対する力価は、約500nMのKiで顕著に低下されて、これによって、このリードは、前臨床評価に適切でなくなる。
ラットカリクレインに対してかなりの力価を保持したままで、ヒトカリクレインに対する高い力価を有する5×5および6×6リード二環性ペプチドを特定するために、ファージ選択を行い、ここではラットおよびヒトの両方のカリクレインを、各々の選択の回の間にベイトとして入れ替えた。選択の回の間のベイトの濃度を調節することによって、異なる交差反応性のリード配列を特定してもよい。各々の選択アウトプットのサンプルを、ヒトカリクレインに対する結合についてスクリーニングして、引き続き配列決定した。
具体的には、第1の2回の選択を、ヒトカリクレインで、3〜100nMの間におよぶ標的濃度で行い、続いて、ラットカリクレインを、30nMの標的濃度で用いて2回の選択を行う。
相同スクリーニングアッセイでカリクレイン結合について個々のファージクローンをスクリーニングすることによって、バックグラウンドを超えるシグナルの最大50倍増大をともなう、多数の固有の配列が明らかになった。それらを、ヒト、ラットおよびウサギカリクレインを阻害するために、合成ペプチドとして調製して評価した(表1)。
リードのいくつかは、ラットとヒトカリクレインとの間で良好な交差反応性(06−254、06−255、06−258、および06−261)(表1)を示す。各々のリードファミリーについての配列アウトプットを評価することによって、半保存された残基が特定され得、下線を付される(表1)。
06−254および06−255は、ほとんど同一の第1のループを共有するが、それらの第2のループは異なる。06−258は、ループ1およびループ2の両方で5アミノ酸を含んでいる、特定された唯一の交差反応性のリードである(5x5)。
(b)ラット−ヒトカリクレイン交差反応性の二環性ペプチド配列の親和性成熟
選択二環性ペプチド候補(表1)を、親和性成熟について選択した。コンセンサス残基は、最初の選択のアウトプットから推定した。親和性成熟のために、コンセンサス領域の外側であると考えられる残基を、表2内の情報に従って無作為化した。
選択二環性ペプチド候補(表1)を、親和性成熟について選択した。コンセンサス残基は、最初の選択のアウトプットから推定した。親和性成熟のために、コンセンサス領域の外側であると考えられる残基を、表2内の情報に従って無作為化した。
より多い保存された結合モチーフの外側残基を無作為化した(「X」)。06−261の場合、その06−34−18−様FPFRモチーフ(配列番号100)を無作為化したが、周囲の残基は固定した。
親和性成熟したライブラリの配列アウトプットを、2つの実施例06−254および06−259で示す。
06−254配列アウトプット:
表3は、スクリーニングアッセイで特定された最も強力な06−254バリアントを示す。
表3は、スクリーニングアッセイで特定された最も強力な06−254バリアントを示す。
最も強力な候補(06−254−01、06−254−02および06−254−03)を、ペプチド合成について選択し、ラットおよびヒトカリクレイン阻害について評価した。
06−259配列アウトプット:
表4では、スクリーニングアッセイで特定された最も強力な06−259バリアントを示す。
表4では、スクリーニングアッセイで特定された最も強力な06−259バリアントを示す。
最も強力な候補(06−259−01、06−259−02、06−259−03および06−259−04)を、ペプチド合成、ならびにラットおよびヒトカリクレインに対する親和性測定のために選択した。
合成ペプチドのin vitroの力価および交差反応性を表5にまとめる。
まとめると、06−254−01、06−254−02、06−254−03、06−255、06−258、06−259−01、06−259−02、06−259−03、06−259−04および06−261などの、ラットとヒトカリクレインとの間での高い力価および良好な交差反応性を示すいくつかの候補がある(太字、表5を参照のこと)。
カリクレイン結合性二環性ペプチドの血漿安定性スクリーニングによって、見込みのあるリード候補が明らかになる
実施例1では、いくつかの新規な二環性リード配列が、高いヒトおよびラット力価で特定された。各々のファミリーの最も強力なメンバーを、ラットおよびヒトの血漿安定性の比較のために選択した。これらは、06−254−02、06−255、06−259−02および06−261であった。方法番号1を用いる最初のスクリーニングによって、06−255および06−259−02は、これらの2つのペプチドの検出のより長いウインドウによって判定した場合(最大10日まで、図は示さず)、残っている二環性ペプチドよりも安定であることが示された。残りのペプチドは、2〜3日後にはそれ以上検出できず、これによって、06−34−18の未修飾の配列と同様の低い安定性が示されている。06−255および06−259−02は両方とも、安定性プロファイルが劣っており、したがって、可溶性C末端伸長で再合成された(Sar3−(D−Arg)2(配列番号98))。それによって、サルコシン3(Sar3)は、分子スペーサーとして機能するが、D−アルギニンは、それらが生理学的pHで強力にイオン性の水錯体の性質であることに起因して、より高い水溶性をその分子に対して付与する。
実施例1では、いくつかの新規な二環性リード配列が、高いヒトおよびラット力価で特定された。各々のファミリーの最も強力なメンバーを、ラットおよびヒトの血漿安定性の比較のために選択した。これらは、06−254−02、06−255、06−259−02および06−261であった。方法番号1を用いる最初のスクリーニングによって、06−255および06−259−02は、これらの2つのペプチドの検出のより長いウインドウによって判定した場合(最大10日まで、図は示さず)、残っている二環性ペプチドよりも安定であることが示された。残りのペプチドは、2〜3日後にはそれ以上検出できず、これによって、06−34−18の未修飾の配列と同様の低い安定性が示されている。06−255および06−259−02は両方とも、安定性プロファイルが劣っており、したがって、可溶性C末端伸長で再合成された(Sar3−(D−Arg)2(配列番号98))。それによって、サルコシン3(Sar3)は、分子スペーサーとして機能するが、D−アルギニンは、それらが生理学的pHで強力にイオン性の水錯体の性質であることに起因して、より高い水溶性をその分子に対して付与する。
可溶性伸長は、表6に示されるとおり、酵素阻害定数を有意に妨害しなかった。
ペプチドは、方法番号2に記載の条件下でヒトおよびラットの血漿中でアッセイした。安定性は、06−34−18に対して比較して評価し、これは、ラット血漿では、2.3時間、およびヒト血漿では2時間という定量的t1/2を有する(WO2013/050616)。図1および図2によって、二環性ペプチドリード06−259−02が、特に都合の良い血漿安定性プロファイルを有しており、すなわち、06−255および06−34−18に比較してヒトおよびラット血漿の両方に対して有意にさらに安定であることが示される。
異なる二環性ペプチドリードの間のペプチドループをグラフトすることで、都合のよい特性を有する新規なキメラ構築物が生成される
以前に開示された06−34−18配列の第1のループ(WO2013/050616、配列:
(配列番号86))は、本明細書で特定された06−261ペプチド、(配列:
(配列番号54))と同様のFPFRモチーフ(配列番号100、下線)を共有する。しかし、06−34−18は、血漿プロテアーゼにむかってペプチドを変化しやすくする2つのタンパク質分解性認識部位を含み、したがってカリクレイン阻害性治療として不適切であることが記載されている。これらの部位は、06−34−18の残基Arg5およびHis7
(配列番号86):下線および太字)を含む。現在開示されている06−261配列(実施例1)では、ループ2中に等価なヒスチジンタンパク質分解性認識部位は存在しない。
以前に開示された06−34−18配列の第1のループ(WO2013/050616、配列:
06−261の第2のループ(配列:VYYPDI(配列番号87))中のHis7の欠失に起因して、本発明の研究者らは、ループ2におけるタンパク質分解性の安定性が向上した十分強力なキメラペプチドを生じることを期待して、タンパク質分解を受けやすいヒスチジン含有の06−34−18の第2のループを、06−261の第2のループで置き換えた。具体的には、この配列は、06−34−18の第1のループ(配列:SFPYR(配列番号88))および06−261の第2のループ(配列:VYYPDI(配列番号87))を含み、キメラの全長配列CSFPYRCVYYPDIC(配列番号55)(またはWPAR等価物、すなわちCSWPARCVYYPDIC(配列番号89))を生じる。このキメラペプチドは、06−550と名付けられ、ループ1中に5つの残基、およびループ2中に6つの残基を有する。
06−34−18におけるArg5誘導性のタンパク質分解不安定性は、Arg5をN−α−メチルアルギニン(NMe−Arg)またはホモアルギニン(HArg)で置き換えることによって取り除かれるかまたは減少され得ることが以前に開示された(WO2013/050616)。さらに、L−アゼチジンカルボン酸(Aze)の付随する親和性向上置換が、3位に導入されてもよく、これがもとのプロリン3を置き換える。
キメラの二環ペプチド06−550が06−34−18の第1のループを保持するので、Arg5/Pro3上でのHArg5/Aze3への同一の修飾を行い、このペプチドを06−550 Aze3 HArg5と命名する。
しかし、配列中に溶解性を向上するヒスチジン7がないせいで、06−550(または06−550 Aze3 HArg5)は、06−34−18に比較して有意な水溶性の低下を示した。これらの分子の水溶性を向上するために、サルコシン3−スペーサーに続いて2つのD−アルギニンを含んでいる、C末端伸長を含んだ誘導体を合成した。D−アルギニンを含めることにより、これらのペプチドのさらに好適な水溶性がもたらされた。
これらのペプチドのカリクレイン阻害定数を表7にまとめる。
このデータから、ヒトおよびラットの両方の親和性とも高いという理由で、Aze3−HArg5修飾は十分に耐容されることが明らかである。N−メチル修飾は、それほど適切ではない。同様に、Sar3−(D−Arg2)(配列番号98)溶解性伸長は、この伸長を欠いているペプチドと比較して力価が不変のままであるので、十分に耐容される。
06−550誘導体の比較の血漿安定性プロファイリング
二環性ペプチド「Ac−(06−550)−Sar3−(DArg2)Aze3 HArg5」(表7)の安定性を、ヒトおよびラットの血漿における相対的な安定性について方法番号2によって評価して、不安定な06−34−18(図1および2)と比較した。
二環性ペプチド「Ac−(06−550)−Sar3−(DArg2)Aze3 HArg5」(表7)の安定性を、ヒトおよびラットの血漿における相対的な安定性について方法番号2によって評価して、不安定な06−34−18(図1および2)と比較した。
両方の種由来の血漿中で、分解産物はわずかにしか観察されないので、ペプチドは、高い安定性を示す。比較によって、不安定な06−34−18の親の質量は、同じ時間経過の間に大きく消失した(実施例2に示されるデータ)。したがって、別の親配列(06−261および06−34−18)由来のループを組み合わせるという概念で、新規な、キメラの、強力でかつ、タンパク質分解に対して安定な分子が得られた。
選択カリクレイン阻害性二環性ペプチドのin vivoの薬物動態学的挙動
ペプチドAc−(06−550)−Sar3−(D−Arg)2 Aze3 HArg5(これは、安定性および親和性向上修飾Aze3およびHArg5、ならびに可溶性C末端伸長Sar3−(D−Arg)2)(配列番号98)およびAc−(06−259−02)−Sar3−(D−Arg)2を含む)を、ラットでの薬物動態学的アセスメントのために選択した。ペプチドを、緩衝化溶液中で1mg/mLで、5mg/kgとしてSprague Dawleyラットに静脈内注射し、血液をサンプリングして、ペプチド濃度を注射後、多数の時点で解析した。
ペプチドAc−(06−550)−Sar3−(D−Arg)2 Aze3 HArg5(これは、安定性および親和性向上修飾Aze3およびHArg5、ならびに可溶性C末端伸長Sar3−(D−Arg)2)(配列番号98)およびAc−(06−259−02)−Sar3−(D−Arg)2を含む)を、ラットでの薬物動態学的アセスメントのために選択した。ペプチドを、緩衝化溶液中で1mg/mLで、5mg/kgとしてSprague Dawleyラットに静脈内注射し、血液をサンプリングして、ペプチド濃度を注射後、多数の時点で解析した。
両方のペプチドとも、17ml/分/kg(06−550)〜7ml/分/kg(06−259−02)の間のクリアランスを示し(表8、図4)、これはラットで公表されている腎濾過速度(約8〜9mL/分/kg)に近い[Jobin J, Bonjour JP, (1985) Am J Physiol.;248(5 Pt 2):F734−8]。
これは、Ac−(06−550)−Sar3−(D−Arg)2 Aze3 HArg5(これは、2つの安定性修飾Aze3およびHArg5、ならびに本質的にタンパク質分解性で安定であるループ2中の配列を含む)の向上されたタンパク質分解安定性を強調する。
Ac−(06−259−02)−Sar3−(D−Arg)2の場合は、天然の配列は、ラットでタンパク質分解的に十分安定であり、その結果、そのクリアランスはほとんどが腎排出によって駆動される。
選択カリクレイン阻害性二環性ペプチドの硝子体内注射後のin vivoの薬物動態学的解析
この解析では、ペプチドAc−(06−550)−Sar3−(D−Arg)2 Aze3 HArg5(本研究においてはバイシクル1と呼び、これは、安定性および親和性向上修飾Aze3およびHArg5、ならびに可溶性C末端伸長Sar3−(D−Arg)2(配列番号98)を含む、本明細書における実施例3および4を参照のこと)を、ペプチドAc−(06−34−18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6(本研究においてはバイシクル2と呼び、これはPCT/EP2014/057440の表26bおよび図2に開示される)に対して比較して評価した。ニュージーランドホワイトウサギ(New Zealand White rabbit)(2〜3kg)を麻酔して、両方のペプチドを硝子体内注射(100μg/眼)によって、表9に記載のプロトコールに従って投与した。
この解析では、ペプチドAc−(06−550)−Sar3−(D−Arg)2 Aze3 HArg5(本研究においてはバイシクル1と呼び、これは、安定性および親和性向上修飾Aze3およびHArg5、ならびに可溶性C末端伸長Sar3−(D−Arg)2(配列番号98)を含む、本明細書における実施例3および4を参照のこと)を、ペプチドAc−(06−34−18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6(本研究においてはバイシクル2と呼び、これはPCT/EP2014/057440の表26bおよび図2に開示される)に対して比較して評価した。ニュージーランドホワイトウサギ(New Zealand White rabbit)(2〜3kg)を麻酔して、両方のペプチドを硝子体内注射(100μg/眼)によって、表9に記載のプロトコールに従って投与した。
適切な時間後、ウサギを安楽死させて、硝子体液、眼房水、網膜および血漿のサンプルを採取した。サンプルをLC−MSによって分析して、ペプチドの濃度を決定した。本研究の結果を、図5に示しており、ここでは、両方のペプチドとも硝子体液から緩徐に排出され、この排出半減期は20〜30時間であったことが観察できる。これは、抗生物質シプロフロキサシンなどの小分子のクリアランスよりも有意に遅い(報告された正常なウサギの硝子体での半減期は2.2時間;Pearson et al. 1993, Retina 13:326-330)。
カラギーナン誘導性の足浮腫に対する選択カリクレイン阻害性二環性ペプチドの効果
この解析では、ペプチドAc−(06−259−02)−Sar3−(D−Arg)2(本研究では、バイシクル3と呼ぶ;本明細書の実施例2を参照のこと)を、ペプチドAc−(06−34−18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6(本研究ではバイシクル2と呼び、これはPCT/EP2014/057440の表26bおよび図22に開示されている)に対して比較して評価した。炎症は、雄性Sprague−Dawleyラット(1群あたりn=10)で、右後ろ足の足底下で100μLの1%カラギーナン溶液の注射によって誘導した。動物には、表10に従ってペプチドおよびインドメタシンでの処置を与えた。
この解析では、ペプチドAc−(06−259−02)−Sar3−(D−Arg)2(本研究では、バイシクル3と呼ぶ;本明細書の実施例2を参照のこと)を、ペプチドAc−(06−34−18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6(本研究ではバイシクル2と呼び、これはPCT/EP2014/057440の表26bおよび図22に開示されている)に対して比較して評価した。炎症は、雄性Sprague−Dawleyラット(1群あたりn=10)で、右後ろ足の足底下で100μLの1%カラギーナン溶液の注射によって誘導した。動物には、表10に従ってペプチドおよびインドメタシンでの処置を与えた。
カラギーナン投与の1、2、4および6時間後、足の容積を、水置換法で測定した。統計学的解析を、反復測定(GraphPad Prism)によって2元配置ANOVAを用いて行った。
本研究の結果を、図6に示しており、ここでは、両方のペプチドが全ての時点でカラギーナンによって誘導された足の腫脹を阻害したことが観察され得る。ペプチドまたは陽性コントロールであるインドメタシンのいずれかでの処置によって、足の腫脹における高度に有意な低下が生じた(p<0.001)。重要なことに、阻害の程度は、2つのペプチドとインドメタシンとの間で匹敵する(インドメタシンは、このモデルでのゴールデンスタンダードの治療部分とみなされている)。
Claims (28)
- 血漿カリクレインに特異的なペプチドリガンドであって、少なくとも2つのループ配列によって隔てられる少なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチド、および前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する分子足場を含み、その結果、少なくとも2つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成され、前記ペプチドリガンドが、
(a)-Ci-N-X-W-N-P-W-Cii-O/U-X-X-X-O/J-X-Ciii- (配列番号1);
(b)-Ci-B-N-J-W-N-P-Cii-X-L-O-X-X-X-Ciii- (配列番号2);
(c)-Ci-Q-K-F-E-S-R-Cii-X-X-X-X-X-X-Ciii- (配列番号3);
(d)-Ci-P-L-S-D-T-L-Cii-Y-R-R-M-P-P-Ciii- (配列番号4);
(e)-Ci-P-Y-P-F-R-Cii-X-H-X-X-X-Ciii- (配列番号5);および
(f)-Ci-(N)a-U-J-P-J-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (配列番号6);
もしくはその修飾誘導体、または薬学的に許容される塩
のいずれかから選択されるペプチド配列を含み、
ここで、
Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ、第1、第2および第3のシステイン残基を表し、
下付き文字「a」は、0または1から選択される整数を表し、
Xは、任意のアミノ酸残基を表し、
Oは、G、A、I、L、PおよびVから選択される非極性の脂肪族アミノ酸残基を表し、
Jは、F、WおよびYから選択される非極性の芳香族アミノ酸残基を表し、
Uは、N、C、Q、M、SおよびTから選択される極性の非荷電のアミノ酸残基を表し、
Bは、R、HおよびKから選択される極性の正に荷電されたアミノ酸残基を表す、
ペプチドリガンド。 - 式(a)の配列を含む、請求項1に記載のペプチドリガンド。
- 式(a)のペプチドが、−Ci−N−X−W−N−P−W−Cii−O/U−X−X−X−O−X−Ciii−(配列番号7)、例えば、−Ci−N−T/H/Y−W−N−P−W−Cii−G/S/P−A/V/W/D/S−D/E/V/T/P−A/G/P/I/R/D−G/P/Y/I−F/I/L/V/R/G/D−Ciii−(配列番号8)、具体的には、−Ci−N−T/H/Y−W−N−P−W−Cii−G/S/P−A/V/W−D/E/V−A/G/P−G/P−F/I/L/V−Ciii−(配列番号9)から選択される配列を含む、請求項1または請求項2に記載のペプチドリガンド。
- 式(a)のペプチドが、
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-G-W-V-G-G-F-Ciii- (06-259)(配列番号10);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii- (06-259-01)(配列番号11);
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-02)(配列番号12);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-I-Ciii- (06-259-03)(配列番号13);
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii- (06-259-04)(配列番号14);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-R-Ciii- (06-259-F1)(配列番号15);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-P-A-D-I-P-V-Ciii- (06-259-E2)(配列番号16);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-D-D-P-Y-I-Ciii- (06-259-H3)(配列番号17);
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-S-D-P-P-V-Ciii- (06-259-H4)(配列番号18);
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-S-D-T-R-I-G-Ciii- (06-259-A6)(配列番号19);および
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-S-W-P-D-I-D-Ciii- (06-259-F2)(配列番号20);
例えば、
−Ci−N−H−W−N−P−W−Cii−S−V−E−P−P−V−Ciii−(06−259−01)(配列番号11)、
−Ci−N−T−W−N−P−W−Cii−P−W−D−A−P−L−Ciii−(06−259−02)(配列番号12)、
−Ci−N−H−W−N−P−W−Cii−S−A−D−P−P−I−Ciii−(06−259−03)(配列番号13)、
および
−Ci−N−Y−W−N−P−W−Cii−P−W−D−A−P−L−Ciii−(06−259−04)(配列番号14)、
具体的には−Ci−N−T−W−N−P−W−Cii−P−W−D−A−P−L−Ciii−(06−259−02)(配列番号12)
から選択される配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドリガンド。 - 式(b)の配列を含む、請求項1に記載のペプチドリガンド。
- 式(b)のペプチドが、−Ci−K/R−N−Y−W−N−P−Cii−D/T/G−L−I/V/L−E/M/N/P/T/Q/S/Y/G/D/W/R/H/A−D/G/I/T/A/S/P/V−P/S/T/A/K/G/H/F/Q/D/L/I/M/R/Y−Ciii−(配列番号21)、例えば−Ci−K/R−N−Y−W−N−P−Cii−D/T−L−I/V−E/M/N/P/T−D/G/I/T−P/S/T−Ciii−(配列番号22)から選択される配列を含む、請求項1または請求項5に記載のペプチドリガンド。
- 式(b)のペプチドが、
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-T-I-S-Ciii- (06-254)(配列番号23);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-E-T-T-Ciii- (06-254-01)(配列番号24);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii- (06-254-02)(配列番号25);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-M-D-T-Ciii- (06-254-03)(配列番号26);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-Q-D-A-Ciii- (06-254-F4)(配列番号27);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-S-I-K-Ciii- (06-254-B3)(配列番号28);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-T-G-Ciii- (06-254-G3)(配列番号29);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-Q-I-H-Ciii- (06-254-H4)(配列番号30);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-G-I-T-Ciii- (06-254-G2)(配列番号31);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-D-T-F-Ciii- (06-254-A4)(配列番号32);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-E-A-Q-Ciii- (06-254-G4)(配列番号33);
-Ci-K-N-F-W-N-P-Cii-D-L-I-P-I-S-Ciii- (06-254-D3)(配列番号34);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-W-T-D-Ciii- (06-254-E2)(配列番号35);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-L-Ciii- (06-254-F5)(配列番号36);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-E-S-T-Ciii- (06-254-E5)(配列番号37);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-R-P-P-Ciii- (06-254-D1)(配列番号38);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-G-I-A-Ciii- (06-254-B9)(配列番号39);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-H-D-I-Ciii- (06-254-E3)(配列番号40);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-M-Ciii- (06-254-D6)(配列番号41);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-D-L-Ciii- (06-254-H3)(配列番号42);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-H-V-R-Ciii- (06-254-A7)(配列番号43);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-P-Y-Ciii- (06-254-C1)(配列番号44);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-G-L-V-Y-S-T-Ciii- (06-254-E6)(配列番号45);
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-P-D-L-Ciii- (06-254-B1)(配列番号46);および
-Ci-R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-I-T-Ciii- (06-255)(配列番号47);
例えば、−Ci−K−N−Y−W−N−P−Cii−D−L−I−E−T−T−Ciii−(06−254−01)(配列番号24)、
−Ci−K−N−Y−W−N−P−Cii−D−L−I−P−G−P−Ciii−(06−254−02)(配列番号25)、
−Ci−K−N−Y−W−N−P−Cii−D−L−V−M−D−T−Ciii−(06−254−03)(配列番号26)、および
−Ci−R−N−Y−W−N−P−Cii−T−L−I−N−I−T−Ciii−(06−255)(配列番号47)、
具体的には−Ci−K−N−Y−W−N−P−Cii−D−L−I−P−G−P−Ciii−(06−254−02)(配列番号25)、および
−Ci−R−N−Y−W−N−P−Cii−T−L−I−N−I−T−Ciii−(06−255)(配列番号47)、
さらに具体的には−Ci−R−N−Y−W−N−P−Cii−T−L−I−N−I−T−Ciii−(06−255)(配列番号47)
から選択される配列を含む、請求項5または請求項6に記載のペプチドリガンド。 - 式(c)の配列を含む、請求項1に記載のペプチドリガンド。
- 式(c)のペプチドが、−Ci−Q−K−F−E−S−R−Cii−R−V−D−T−R−Y−Ciii−(06−256)(配列番号49)から選択される配列を含む、請求項8に記載のペプチドリガンド。
- 式(d)の配列を含む、請求項1に記載のペプチドリガンド。
- 式(e)の配列を含む、請求項1に記載のペプチドリガンド。
- 式(e)の前記ペプチドが、−Ci−P−Y−P−F−R−Cii−L−H−E−N−L−Ciii−(06−258)(配列番号52)から選択される配列を含む、請求項11に記載のペプチドリガンド。
- 式(f)の配列を含む、請求項1に記載のペプチドリガンド。
- 式(f)の前記ペプチドが、−Ci−(N)a−N/S−F−P−F/Y−R−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−(配列番号53)から選択される配列を含む、請求項1または請求項13に記載のペプチドリガンド。
- 式(f)の前記ペプチドが、
-Ci-N-N-F-P-F-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (06-261)(配列番号54);または
-Ci-S-F-P-Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- (06-550)(配列番号55)
から選択される配列を含む、請求項13または請求項14に記載のペプチドリガンド。 - 前記修飾誘導体が、N末端修飾および/またはC末端修飾、1つまたは複数のアミノ酸残基の1つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換(例えば、1つまたは複数の極性アミノ酸残基の1つまたは複数の等比体積または等電子アミノ酸での置換、1つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の等比体積または等電子アミノ酸での置換)、スペーサー基の付加、1つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の1つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基での置換、1つまたは複数のアミノ酸残基のアラニンでの置換、1つまたは複数のL−アミノ酸残基の1つまたは複数のD−アミノ酸残基での置換、二環性ペプチドリガンド内の1つまたは複数のアミド結合のN−アルキル化、1つまたは複数のペプチド結合の代用結合での置換、ペプチド骨格長改変、1つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の別の化学基での置換、ならびにシステイン、リジン、グルタミン酸塩およびチロシンなどのアミノ酸の、適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬での合成後生体直交型修飾から選択される1つまたは複数の修飾を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載のペプチドリガンド。
- 前記修飾誘導体が、N末端修飾、例えば、N末端アセチル基を含み、具体的には前記N末端システイン基(Ci)は、無水酢酸でキャップされる、請求項16に記載のペプチドリガンド。
- 前記修飾誘導体が、C末端修飾、例えば、C末端アミド基、具体的にはC末端システイン基(Ciii)のアミド化を含む、請求項16に記載のペプチドリガンド。
- 前記修飾誘導体が、1つまたは複数のアミノ酸残基の1つまたは複数の非天然のアミノ酸残基での置換、例えば、プロリン残基のL−アゼチジンカルボン酸残基による置換、および/またはアルギニン残基のN−α−メチルアルギニンもしくはL−ホモアルギニン残基による置換を含む、請求項16に記載のペプチドリガンド。
- 前記ペプチドリガンドが、
-Ci-S-F-P-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) HArg5)(配列番号56);
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 HArg5)(配列番号58);
-Ci-S-F-P-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) NMeArg5)(配列番号59);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[NMeR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii- ((06-550) Aze3 NMeArg5)(配列番号60;
から選択される配列を有するペプチドを含む、式(f)の非天然の誘導体であり、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRおよびHArgは、L−ホモアルギニン残基を表し、NMeRおよびNMeArgは、N−α−メチルアルギニン残基、
例えば、−Ci−S−F−P−Y−[hR]−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−((06−550)HArg5)(配列番号56)、および
−Ci−S−F−[Aze]−Y−[hR]−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−((06−550)Aze3 HArg5)(配列番号58)であり、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRおよびHArgはL−ホモアルギニン残基を表し、
具体的には、−Ci−S−F−[Aze]−Y−[hR]−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−((06−550)Aze3 HArg5)(配列番号58)を表し、
ここでAzeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRおよびHArgは、L−ホモアルギニン残基を表す、請求項19に記載のペプチドリガンド。 - 前記修飾誘導体が、スペーサー基の付加、例えば、N末端システイン(Ci)および/またはC末端システイン(Ciii)に対するスペーサー基の付加を含む、請求項16に記載のペプチドリガンド。
- 前記スペーサー基が、2つ以上のD−アルギニン残基(適切には2つのD−アルギニン残基)に連結された1つまたは複数のサルコシン基(適切には3つのサルコシン基)を含む、請求項21に記載のペプチドリガンド。
- 前記ペプチドリガンドが、−Ci−N−T−W−N−P−W−Cii−P−W−D−A−P−L−Ciii−Sar3−(D−Arg)2((06−259−02(Sar3−(D−Arg)2)(配列番号61)から選択される配列を有するペプチドを含む、式(a)の修飾誘導体であり、ここでSar3は、3つのサルコシンスペーサーを表し、(D−Arg)2は2つのD−アルギニン残基を表す、請求項21または請求項22に記載のペプチドリガンド。
- 前記ペプチドリガンドが、
-Ci-S-F-P-Y-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii-Sar3-(D-Arg)2((06-550)-Sar3-(DArg2))(配列番号62);および
-Ci-S-F-[Aze]-Y-[hR]-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii-Sar3-(D-Arg)2((06-550)-Sar3-(DArg2) Aze3 HArg5)(配列番号63);
から選択される配列を有するペプチドを含む式(f)の修飾誘導体であり、
ここでSar3は3つのサルコシンスペーサーを表し、(D−Arg)2は2つのD−アルギニン残基を表し、Azeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRおよびHArgは、L−ホモアルギニン残基を表し、
例えば、−Ci−S−F−[Aze]−Y−[hR]−Cii−V−Y−Y−P−D−I−Ciii−Sar3−(D−Arg)2((06−550)−Sar3−(DArg2)Aze3 HArg5)(配列番号63)を表し、
ここでSar3は、3つのサルコシンスペーサーを表し、(D−Arg)2は、2つのD−アルギニン残基を表し、Azeは、L−アゼチジンカルボン酸残基を表し、hRおよびHArgは、L−ホモアルギニン残基を表す、請求項21または請求項22に記載のペプチドリガンド。 - 前記薬学的に許容される塩が、塩酸塩または酢酸塩から選択される、請求項1〜24のいずれか1項に記載のペプチドリガンド。
- ヒト、ラットおよび/またはウサギ血漿カリクレイン、例えば、ヒトおよび/またはラット血漿カリクレイン、具体的にはヒト血漿カリクレインに特異的である、請求項1〜25のいずれか1項に記載のペプチドリガンド。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のペプチドリガンドを1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
- 炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、眼科障害および自己免疫障害の予防、抑制または処置における使用のための、請求項1〜26のいずれか1項に記載のペプチドリガンド。
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