JP2013518807A - 多重特異性ペプチド - Google Patents

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ウィンター，ポール・グレゴリー
ハイニス，クリスティアン
ベルナール，エリーズ
ロークス，デイヴィッド
タイト，ジョン・ポール
ヴァイスブルド，マリーナ
トイフェル，ダニエル・パウル
リーヒマン，ルッツ
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Abstract

本発明は、（ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップであって、各々のポリペプチドが、分子足場と共有結合する能力のある２以上の反応性基、および２つの反応性基間に内在する２以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも一つのループを含む、ステップと、（ｂ）（ａ）に記載されるポリペプチドの第２のレパートリを準備するステップと、（ｃ）第１のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループを、第２のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループと連結して、２つのループを含む少なくとも一つのポリペプチドを形成するステップ、および（ｄ）複合ポリペプチド（１または複数）を、少なくとも３つのアミノ酸位置で分子足場にコンジュゲートするステップを含む、３以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合し、かつ２以上の別個の標的と結合する能力のあるポリペプチドを含む、多重特異性ペプチドリガンドを提供するための方法に関する。

Description

本発明は、ペプチドに立体構造を付与する、構造骨格を提供する化合物に結合することによりその構造が制約されるペプチドに関する。特に、本発明は、同じであっても異なっていてもよい、２以上の分子標的に対する結合親和性を有するペプチドに関する。
二重特異性を有するポリペプチドは、当分野で公知である。特に、２種類の異なる抗原と、または同じ抗原分子上の２つのエピトープと同時に結合する能力のある抗体分子が設計されている。
ＶＨ領域およびＶＬ領域の相補的な対を含む二重特異性抗体は、当分野で公知である。これらの二重特異性抗体は、２対のＶＨおよびＶＬを含み、各々のＶＨＶＬ対は、単一の抗原またはエピトープに結合している。そのような二重特異性抗体としては、ハイブリッドハイブリドーマ（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ＆ Ｃｕｅｌｌｏ ＡＣ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−４０）、ミニボディ（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：３０５５−３０６１；）、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，６４４４−６４４８；ＷＯ９４／１３８０４号）、キレート組換え抗体（ＣＲＡｂｓ；（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６，３６７−３７３）、ビスｃＦｖ（例えばＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２）、「ノブ・イン・ホール」安定化抗体（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６，７８１−７８８）が挙げられる。いずれの場合にも、各々の抗体種は２つの抗原結合部位を含み、各々はＶＨおよびＶＬドメインの相補的な対により形成される。それにより各々の抗体は、２種類の異なる抗原またはエピトープに同時に結合することが可能であり、各々の抗原またはエピトープへの結合は、ＶＨとその相補的ＶＬドメインにより媒介される。
２つの異なる抗体結合特異性を、同じ結合部位にさらに組み込むことができる。ほとんどの場合、構造上関連のある抗原またはエピトープに対応するか、または広く交差反応性である抗体に対応する２以上の特異性を標的にすることができる。例えば、交差反応性抗体は、通常、２つの抗原が配列および構造に関連がある場合に記載されている、例えば、ニワトリ卵白リゾチームとシチメンチョウリゾチーム（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７号）、あるいは、遊離ハプテンに対して、および担体とコンジュゲートしたハプテンに対して記載されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ １９９４ １３：１４ ３２４５−６０）。さらなる例では、ＷＯ０２／０２７７３号（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）には、「二重特異性」をもつ抗体分子が記載されている。言及される抗体分子は、それらの特異性が単一の抗原よりも広く及ぶように、複数の抗原に対して産生されたかまたは選択された抗体である。ＷＯ０２／０２７７３号の抗体において各々の相補的なＶＨ／ＶＬ対は、２以上の構造上関連のある抗原に対して単一の結合特異性を特定する；そのような相補的な対のＶＨおよびＶＬドメインは、各々別個の特異性を有さない。従って、抗体は、構造上関連のある２つの抗原を包含する広い単一の特異性を有する。
さらに、多反応性であり（Ｃａｓａｌｉ ＆ Ｎｏｔｋｉｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，５１５−５３１）、構造上関連していない、少なくとも２つの（通常はそれ以上の）異なる抗原またはエピトープと反応する天然の自己抗体が記載されている。また、モノクローナル抗体にファージディスプレイ技術を用いるランダムペプチドレパートリを選択することにより、抗原結合部位に適合する一連のペプチド配列を同定することも示されている。これらの配列の一部は、高度に関連があり、コンセンサス配列に一致するのに対して、その他の配列は非常に異なり、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）と名付けられている（Ｌａｎｅ ＆ Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，５，２６８−２７１）。従って、会合した相補的なＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体の結合部位が、既知抗原の広い万物由来の多くの異なる抗原と結合する可能性を有することは明白である。
ＷＯ０３／００２６０９号（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）には、各々のＶＨ／ＶＬ対が二重特異性を有する、すなわち同じまたは異なる抗原上の２つのエピトープと結合することが可能である二重特異性抗体の生成が記載されている。立体構造は、開放型であっても閉鎖型であってもよい；開放型の立体構造では、２つのエピトープは同時に結合することができるが、閉鎖型の立体構造では、第１のエピトープとの結合により、第２のエピトープとの結合は妨げられるかまたは阻止される。
複数の結合特異性をもつ非免疫グロブリンタンパク質は、事実上知られている。例えば、多数の転写因子がＤＮＡとその他のタンパク質分子の両方に結合する。しかし、先行技術において結合ペプチドを選択するための方法は、二重または多重特異性ではなく単一特異性をもつペプチドだけを選択する。
様々な研究チームが、これまでにポリペプチドをシステイン残基によって合成分子構造に繋ぎ止めている（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＮａｍａｒａ，Ｐ．Ｅ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，１９８５；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００５）。Ｍｅｌｏｅｎと共同研究者らは、タンパク質表面を構造的に模倣するために、合成足場の上での複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化にトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００５）。前記化合物を、例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼンのように、システイン含有ポリペプチドと分子足場を連結させることにより生成する、候補薬物化合物の生成のための方法は、ＷＯ２００４／０７７０６２号およびＷＯ２００６／０７８１６１号に開示されている。
ＷＯ２００４／０７７０６２号には、候補薬物化合物を選択する方法が開示されている。特に、この文書は、第１および第２の反応性基を含み、足場をさらなる分子に接触させて、カップリング反応において足場とさらなる分子との間に少なくとも２つの結合を形成する、様々な足場分子を開示している。
ＷＯ２００６／０７８１６１号には、結合化合物、免疫原化合物およびペプチド模倣薬が開示されている。この文書には、既存のタンパク質から採取したペプチドの様々なコレクションの人為的合成が開示されている。次に、これらのペプチドを、コンビナトリアルライブラリを作成するために導入された、いくつかのアミノ酸変化を有する一定の合成ペプチドと組み合わせる。様々なアミノ酸変化を特色とする別個のペプチドとの化学結合によってこの多様性を導入することにより、所望の結合活性を見出す機会が増加する。この文書の図７には、様々なループペプチド構築物の合成の模式図が示される。しかし、作成されたペプチドは、単一の特異性を有する。複数のペプチドループが提供される場合、ループは協力して単一の標的に結合する。
本発明者らの同時係属未公開の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００３０１号において、本発明者らは、合成分子構造に繋ぎ止められたペプチドを選択するための生物学的選択技術、例えばファージディスプレイなどの使用を開示している。
本発明者らは、少なくとも２つのペプチドループを形成するために分子足場に繋ぎ止めたポリペプチドに基づく多重特異性結合ポリペプチドを開発した。多重特異性は、３つの方法のうちの一つで実現することができる。
本発明の第１の立体配置では、ポリペプチドと分子足場の相互作用により形成されたポリペプチドループは、１より多くの標的に結合することが可能である。この立体配置内で、一実施形態では、所望の標的との結合のためにループを個々に選択し、次いで結合させてよい。もう一つの実施形態では、ループは、様々な所望の標的との結合のために、単一の構造の一部として一緒に選択される。
第２の立体配置では、官能基をポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはそれらの両方に結合させることができる。官能基は、標的と結合することが可能な結合基、例えば、抗体ドメイン、Ｆｃドメインまたは上記のようなさらに構造化されたペプチドを含むポリペプチドの形態をとってよい。それはさらに、標的と化学結合することが可能な反応性基の形をとってよい。さらに、官能基は、大型の血漿タンパク質、例えば血清アルブミンなど、および細胞透過性ペプチドを含むエフェクター基であってよい。
第３の立体配置では、官能基は分子足場自体に結合していてよい。官能基の例は、先行する立体配置のものと同様である。
第１の立体配置
本発明の第１の立体配置の第１の態様によれば、
（ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップであって、各々のポリペプチドが、分子足場と共有結合する能力のある２以上の反応性基、および２つの前記反応性基間に内在する２以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも一つのループを含むステップと、
（ｂ）（ａ）に記載されるポリペプチドの第２のレパートリを準備するステップと、
（ｃ）第１のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループを、第２のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループと連結して、２つのループを含む少なくとも一つのポリペプチドを形成するステップと、
（ｄ）複合ポリペプチド（１または複数）を、少なくとも３つのアミノ酸位置で分子足場にコンジュゲートするステップと
を含む、３以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合し、かつ２以上の別個の標的と結合する能力のあるポリペプチドを含む、多重特異性ペプチドリガンドを提供するための方法が提供される。
本発明は、従って、異なる標的との結合を担う異なる分子の部分を連結することによる多重特異性分子の調製を提供する。これらは、分子足場との結合点間に内在するループであり、反応性基により規定される。好ましくは、組み合わせて第３のレパートリを形成する前に、前記第１および第２のレパートリを前記第１および第２の標的との結合についてスクリーニングする。
第１および第２の標的に対するスクリーニングは、いくつかの形式で行われてよい。例えば、第１または第２のレパートリは、スクリーニングのために分子足場にコンジュゲートされてよい。あるいは、特に単一ループレパートリの場合には、反応性基を対にすることにより、例としてジスルフィド結合によって、メンバーを内部架橋してよい。
明らかなように、いくつかの入れ替えが可能である。第１および第２のレパートリは、１、２またはそれ以上のペプチドループを含んでよい。１より多くのループが存在する場合、第１または第２の標的に対する結合についての選択は、２以上のループが関与する協同的結合と単一ループによる個々の結合を区別できないことになる。従って、第１または第２のレパートリ中の分子からのループの単離は、単離されたループが標的結合に十分であったこと、または、何らかのそのような結合能が標的分子に移動することになることを保証しない。第１および第２のレパートリが単一ループを含む場合、このループが標的結合に十分であり、この能力がハイブリッド分子に移動することになる可能性が高い。
従って、一実施形態では、前記第１および／または第２のレパートリのメンバーは、分子足場にコンジュゲートされて単一のポリペプチドループを形成する。単一ループを使用すると、ループを別のレパートリからのループと連結することにより多重特異性ポリペプチドが生成する場合に、結合活性が移される可能性が増加する。
しかし、第１および／または第２のレパートリが、２以上のループを含むポリペプチドである場合、そのようなループをポリペプチドから単離し、別のレパートリのポリペプチドからの単一ループと結合させることができる。そのような例では、前記ポリペプチドループの単一ループに対応するポリペプチドメンバーの一部が、第２のレパートリのポリペプチドの少なくとも一つのループと連結される。特定の例では、ポリペプチド全体を、下に詳細に記載されるように、別のレパートリからの別のポリペプチドと連結してよい。
一実施形態では、第１および第２のレパートリを合わせて第３のレパートリを形成し、それを第１および第２の標的に対する結合についてスクリーニングする。第１および第２のレパートリは、個々に前記標的に対して事前にスクリーニングされていてもよいし、未処理であってもよい。好ましくは、レパートリの一方を事前にスクリーニングする。もう一方は未処理であってよい。
一実施形態では、
（ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを、２以上のアミノ酸残基でポリペプチドに結合する分子足場にコンジュゲートして、ポリペプチド抱合体の第１のレパートリを形成するステップと、
（ｃ）前記第１のレパートリを第１の標的に対する結合についてスクリーニングし、第１の標的に結合する第１のレパートリのメンバーを選択するステップと、
（ｄ）ポリペプチドの第２のレパートリを用いてステップ（ａ）〜（ｃ）を反復し、第２の標的に結合するポリペプチド抱合体の第２のレパートリを得るステップと、
（ｅ）前記第１および前記第２のレパートリのメンバーからループを単離し、それらを合わせてポリペプチド抱合体の第３のレパートリを形成し（この際、ポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸で分子足場に結合している）、かつ、第１のおよび第２の標的の両方と結合する能力のある分子を選択するステップと
を含む、３以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合し、かつ２以上の別個の標的と結合する能力のあるポリペプチドを含む、多重特異性ペプチドリガンドを提供するための方法が提供される。
２つのループを含有する分子からそれらのループのたった一つを含有するハイブリッド分子への結合能の移動は、非効率的であり得る。従って、その他の実施形態も同様に効率的なスクリーニング能力が非常に望ましい。スクリーニングは、個々の分子の分析によって実施してよい。そのような方法は、ＷＯ２００４／０７７０６２号およびＷＯ２００６／０７８１６１号に記載されている。個々の化合物、または化合物の小さなセットのスクリーニングは面倒であり、多数の化合物を分析するとなると費用がかかり得る。スクリーニングアッセイでアッセイすることのできる化合物の数は、一般に数千を超えない。
好ましい実施形態では、ポリペプチドのレパートリは、核酸ライブラリの形態で提供され、遺伝子ディスプレイ系の一部として組み込まれる。適用可能な系としては、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームまたはポリソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイおよび人工マイクロカプセルでのインビトロ発現が挙げられる。好ましい技法は、糸状バクテリオファージを用いるファージディスプレイである。
好ましくは、本発明のポリペプチド抱合体は、二重特異性であり、ただ２つのループを含む。いくつかのそのようなポリペプチド抱合体を同じタンパク質に一緒に組み込んでよい。例えば同じ特異性の２つのそのようなポリペプチド抱合体を、例としてＮ末端をＣ末端に連結し、リガンドのその標的に対する結合活性を増大させることができる。あるいは、もう一つの実施形態では、複数の二重特異性ポリペプチド抱合体を合して多量体を形成する。例えば、２つの異なる二重特異性ポリペプチド抱合体を合して四重特異性分子を作成する。あるいは、同じであっても異なっていてもよい、３以上のポリペプチド抱合体を合して多特異的リガンドを形成してもよい。
一実施形態では、分子足場を連結させることにより多価複合体を構築することができる。これは、下記でさらに考察される。
第１の標的と第２の標的は異なる。それらは、天然に存在していても合成であってもよい、ポリペプチド、タンパク質または核酸であるかまたはその一部であってよい。標的は、エピトープであってよく、そのようなエピトープは、同じ分子上にあっても異なる分子上にあってもよい。
当業者は、標的分子の選択が大規模で多様であることを理解する。それらは、例として、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素の酵素補因子またはＤＮＡ結合タンパク質であり得る。適したサイトカインおよび増殖因子としては、限定されるものではないが、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エクソダス−２、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−Ｉ、インスリン、ＩＦＮｙ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−ｌａ、ＩＬ−１（３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１７ｃ、ＩＬ−１７ｄ、ＩＬ−１７ｅ、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト増殖因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ミュラー管抑制因子、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＭＩＰ−３ａ、ＭＩＰ３、ＭＩＰ−４、骨髄系前駆細胞抑制因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン、神経成長因子、Ｐ−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦｌａ、ＳＤＦｌｐ、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１，１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が挙げられる。サイトカイン受容体には、前述のサイトカインの受容体が含まれる。ケモカイン標的には、ＣＣケモカインリガンドＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１／ＨＣＣ−３、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１αイソ型ＬＤ７８β、ＣＣＬ２３／Ｃｋβ８−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１δ、ＣＣＬ２６類（ＣＣＬ−ｌｉｋｅ）／エオタキシン−３類（エオタキシン−３−ｌｉｋｅ）、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１γ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＣＣＬ１４ａ／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１／Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ＴＡＦＡ１／ＦＡＭ１９Ａ１、ＭＣＫ−２、ＴＡＦＡ５／ＦＡＭ１９Ａ５、ＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１、ＴＡＦＡ３／ＦＡＭ１９Ａ３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＴＡＦＡ４／ＦＡＭ１９Ａ４、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４およびＣＣＬ２５／ＴＥＣＫが含まれる。ケモカイン受容体には、ＣＣＲ１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ８、ＣＣＲ３、ＣＣＲ９、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ５、ＣＣＲＬ２／ＬＣＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／ＢおよびＣＣＲ６が挙げられる。ＣＸＣケモカインリガンドとしては、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０／ＣＲＧ−２、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＬＩＸ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１５／ルングキン（Ｌｕｎｇｋｉｎｅ）、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ１／２／３／ＧＲＯ、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα／ＫＣ／ＣＩＮＣ−１、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ／ＭＩＰ−２／ＣＩＮＣ−３、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１β、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯγ／ＣＩＮＣ−２／ＤＣＩＰ−１、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ７／胸腺ケモカイン−１およびＣＸＣＬ８／ＩＬ−８が含まれる。ＣＸＣケモカイン受容体には、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ７／ＲＤＣ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ１／ＩＬ−８ＲＡ、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ＲＢおよびＣＸＣＲ６が含まれる。ＴＮＦスーパーファミリーリガンドには、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、リンホトキシン、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡ（ｐａｎ）、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２およびＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８が含まれる。ＴＮＦスーパーファミリー受容体には、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、オステオプロテジェリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＨ３／ＴＮＦＲＳＦ２６、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６／ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＷＥＡＫ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、リンホトキシンβ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ３およびＸＥＤＡＲが含まれる。ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９を含むトル様（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ）受容体；カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ウロキナーゼ、カリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ９、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５を含む）を含む、酵素；補体系の成分；細胞内シグナル分子および転写因子；ｐ５３；およびＭＤＭ２。
また、下に示すように、標的は大型の血漿タンパク質、例えば血清アルブミンなどであってもよい。
このリストが決して網羅的でないことは当然理解される。
また、下に示すように、標的は大型の血漿タンパク質、例えば血清アルブミンなどであってもよい。
このリストが決して網羅的でないことは当然理解される。ポリペプチド抱合体が（同じまたは異なる標的上の）２つのエピトープに結合する場合、標的分子は、このリストから選択することができる。
これらの標的は、それらが両方とも同時に結合できないように、ポリペプチド抱合体と結合するために競合する可能性がある。あるいは、ポリペプチド抱合体が標的を架橋するように、それらは両方とも同時に結合する可能性がある。そのような実施形態では、第３のレパートリを、第１および第２の標的の両方に対して同時にスクリーニングしてよい。
第２の態様において、本発明は、分子足場に共有結合したペプチドリガンドを含む多重特異性ポリペプチド抱合体を提供する。本発明に従う抱合体は、少なくとも２つの標的と結合する。有利には、抱合体は、上に示す方法によって得られる。
有利には、二重特異性ポリペプチド抱合体は、標的分子を結合する能力のある第２の結合機能、および、インビボで抱合体の半減期を延長する分子または基を結合する能力のある第２の結合機能を含み得る。例えば、分子または基は、嵩高の物質、例えばＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質などであってよい。一実施形態では、二重特異性複合体は、半減期増強分子または基の置換でのみ標的分子に結合可能であり得る。従って、例えば、二重特異性抱合体は、ＨＳＡなどの嵩高の分子により被験体の血流中で循環して維持される。標的分子に出会うと、二重特異性抱合体の結合機能間の競合の結果、ＨＳＡの置換および標的の結合がもたらされる。
第３の態様では、本発明の第１の立体配置は、本明細書に定義される少なくとも二重特異性抱合体をコードする１以上の核酸分子を提供する。
核酸は、発現後にポリペプチドを宿主細胞から運び出すためのシグナル配列をさらにコードすることができ、かつ、発現後に糸状バクテリオファージ粒子の表面成分（または遺伝子ディスプレイ系のその他の成分）と融合することができる。
さらなる態様において、本発明は、本発明に従う核酸を含むベクターを提供する。
なおさらなる態様では、本発明は、本発明に従うベクターをトランスフェクトした宿主細胞を提供する。ＤＮＡベクターは、ファージゲノムであってよい。だが、下に示すように、本発明者らは、関与する化学プロセシングがファージの感染性に影響を及ぼし得るという、分子足場にコンジュゲートしたペプチドのファージディスプレイに固有の問題を解決した。従って、感染性が損なわれた場合、ファージＤＮＡを細胞にトランスフェクトすることが好ましい可能性がある。
そのようなベクターからの発現は、例えばバクテリオファージ粒子の表面上に、選択のための可変ドメインを生成するように設定されてよい。これにより、本発明の方法を用いて、ディスプレイされた可変領域の選択、および従って二重特異性抱合体の選択が可能になる。
第２の立体配置
本発明の第２の立体配置に従って、さらなる結合活性または機能活性を、分子足場に共有結合したペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合することができる。そのため、本発明は、１以上の官能基とコンジュゲートした、分子足場と共有結合したポリペプチドを含むペプチドリガンドを提供する。
官能基は、例えば、インビボでペプチドリガンドの半減期を延長する分子と結合する能力のある基、およびインビボでペプチドリガンドの半減期を延長する分子からなる群から選択される。そのような分子は、例として、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質であってよく、インビボでペプチドリガンドの半減期を延長する分子と結合する能力のある基は、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質に特異的な抗体または抗体フラグメントである。
一実施形態では、官能基は、結合性分子であり、分子足場と共有結合したポリペプチドを含む第２のペプチドリガンド、および抗体または抗体フラグメントからなる群から選択される。分子足場と共有結合したポリペプチドを含むペプチドリガンドを連結することは、所望の特異性を有するペプチドリガンドを（好ましくはＮ末端をＣ末端に）連結して多重特異性分子を形成する、二重特異性分子を作成する代替手段を提供する。２、３、４、５またはそれ以上のペプチドリガンドはこのような方法で連結することができる。任意の２以上のこれらのリガンドの特異性は同じであっても異なっていてもよい。それらが同じである場合、多価結合構造が形成され、それは一価の結合性分子と比較して標的に対する結合活性が増加している。分子足場は、さらに、Ｎ末端が同じであっても異なっていてもよく、かつ、同じまたは異なる数のループに内在してよい。
官能基は、さらに、エフェクター基、例えば抗体Ｆｃ領域であってよい。
Ｎ末端またはＣ末端との結合は、ペプチドの分子足場との結合よりも前に、または後で行ってよい。従って、ＮまたはＣ末端ポリペプチド基が既に配置されているペプチドを（合成によって、または核酸の発現によって）生成することができる。しかし、好ましくは、Ｎ末端またはＣ末端への添加は、ペプチドが分子骨格と結合して抱合体を形成した後に行われる。有利には、そのため、後の官能基自体の結合を許容するために所望の官能基と結合する能力のある基がペプチドに結合する。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニルクロライドを用いてＦｍｏｃ保護基をポリペプチドのＮ末端に導入することができる。Ｆｍｏｃは、ＨＳＡを含む血清アルブミンと高い親和性で結合し、Ｆｍｏｃ−ＴｒｐまたはＦＭＯＣ−Ｌｙｓは増大した親和性で結合する。例として実施例３に示されるように、ペプチドは、残されたＦｍｏｃ保護基と合成することができ、次に、システインを通じて足場と結合させることができる。Ｆｍｏｃ基は、ヒト血清アルブミン結合機能を二環式ペプチドに付与する。あるいは、実施例６に記載されるように、ペプチドと足場の抱合体を作成し、次にＮ末端で例えばアミン反応性およびスルフヒドリル反応性リンカーＮ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）によって修飾してよい。このリンカーを介して、ペプチド抱合体をその他のポリペプチド、例えば抗体Ｆｃフラグメントと連結することができる。
結合機能は、多量体を作成する、分子足場と結合した別のペプチド；抗体または抗体フラグメントを含む別の結合タンパク質；あるいは、血清アルブミンまたはエフェクター基を含む、任意のその他の所望の実体、例えば抗体Ｆｃ領域などであってよい。
第３の立体配置
第３の立体配置では、さらなる結合または機能活性は、分子足場に直接結合される。
有利には、分子足場は、さらなる活性を結び付けることのできる反応性基を含む。好ましくは、この基は、ペプチドとの相互作用を回避するために分子足場上のその他の反応性基に対して直交している。一実施形態では、さらなる活性をコンジュゲートするために必要な場合には、反応性基を保護し、そして脱保護してよい。
従って、本発明は、
（ａ）ポリペプチドを生成するステップと、
（ｂ）それを分子足場とコンジュゲートするステップと、
（ｃ）前記１以上の官能基を分子足場に結合させるステップと
を含む、１以上の結合または官能基とコンジュゲートした、分子足場と共有結合したポリペプチドを含むペプチドリガンドを調製するための方法を提供する。
共通の態様
本発明の特定の態様は、そのあらゆる立体配置に適用可能である。例えば、本発明はさらに、本発明に従う少なくとも二重特異性のペプチドリガンドを含むキットを提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法により得られる二重特異性ペプチドリガンド、および製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。
さらに、本発明は、本発明に従う二重特異性ペプチドリガンドまたは組成物を用いる疾患の治療のための方法を提供する。
本発明の一実施形態では、疾患は癌である。例として架橋二重特異性ペプチドリガンドを用いて、細胞傷害性Ｔ細胞を癌マーカーに補充するか、または癌細胞の表面上の２つの異なる標的と結合させて、それにより細胞表面との結合の親和性または特異性を増大させる。あるいは、一つの標的の結合がもう一方を置換するのであれば、そのような抗体を用いて癌細胞表面マーカーの結合時に薬物を放出させてもよい。
さらなる態様において、本発明は、本発明に従う二重特異性ペプチドリガンドまたは組成物を用いる疾患の診断を含む、診断のための方法を提供する。従って、一般に、分析物の二重特異性ペプチドリガンドへの結合をうまく利用して、薬剤を置換し、それにより置換時にシグナルの生成をもたらすことができる。例えば、特に酵素がその活性部位を通じてペプチドリガンドに保持される場合に、分析物（第２の標的）の結合は、結合実験の基礎をもたらす、ペプチドリガンドと結合した酵素（第１の標的）を置換することができる。
本発明のポリペプチド抱合体の特定の利点は、先行技術の多重特異性バインダーよりも小さいことである。一般に、そのようなリガンドの分子量は５０００ダルトン未満；好ましくは４０００ダルトン未満；好ましくは３０００ダルトン未満である。本発明の第２の立体配置に記載される「デイジーチェーン（ｄａｉｓｙ−ｃｈａｉｎｉｎｇ）」ペプチドリガンドにより構築される多重特異性リガンドが、より高い分子量を有することになることは当然理解される。さらに、ＨＳＡなどの分子に結合したペプチドリガンドは、非常により高い分子量を有することになる。
リガンドが小型であるのは、一般に質量５００ダルトンの小型の分子足場の使用に起因する。ペプチド自体は、好ましくは、それを分子足場に結合するＮ末端とＣ末端の結合点の間で測定して、２７アミノ酸未満の長さである。当然、さらなるペプチドが、結合点の外側に存在または結合していてよく、ペプチド構造を長くしている。ポリペプチドの各々のループは、好ましくは、隣接する結合点間で測定して０〜９アミノ酸の間の長さである。有利には、任意のペプチドリガンド中のループは、独立に、３、４、５、６、７、８または９アミノ酸の長さである。
ＤＴＴによる前処理無し、およびＤＴＴによる前処理あり、ならびにＤＴＴの後にキモトリプシンによる前処理ありの、環状抱合体または非コンジュゲートペプチドとしてのファージクローン１０および４８（実施例１）とＭＤＭ２の結合を示す図である。 ＭＤＭ２に対する親和性を示す、ペプチドＰＥＰ１０およびＰＥＰ４８についての蛍光異方性のプロットを示す図である。実施例１を参照されたい。 ＰＥＰ４８およびＰＫ１５からのループを含む二重特異性ペプチドについての蛍光異方性のプロットを示す図である（実施例２）。 ＢＳＡによるＦｍｏｃ誘導体の結合についての蛍光異方性のプロットを示す図である。 ＨＳＡによるＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨの結合についての蛍光異方性のプロットを示す図である。 ＢＳＡによるペンタペプチドＦｍｏｃ誘導体についての蛍光異方性のプロットを示す図である。 図７Ａおよび７Ｂは、合成したペプチド、Ｆｍｏｃ−ＷＧＧＧＡＣＶＲＦＧＷＴＣＳＤＲＦＲＮＣＧ−ＮＨ２の質量スペクトルおよびＨＰＬＣ分析を示す図である。 図７Ｃおよび７Ｄは、ＴＢＭＢとのコンジュゲーションの前後の前記ポリペプチドの質量スペクトルを示す図である。図７Ｅは、この抱合体のＨＰＬＣ分析を示す図である。実施例３を参照されたい。 Ｆｍｏｃ基を介したＢＳＡとコンジュゲートペプチドの結合を示す図である。 コンジュゲート二重特異性ペプチドとＭＤＭ２の結合を示す図である。
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、例えばペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学／生物化学の分野などの当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。標準的な技法が分子生物学、遺伝学および生化学的方法に使用され（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）、それらは引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
本明細書において言及される、ペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドをさす。一般に、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成する能力のある２以上の反応性基、および、ペプチドが足場と結合する場合にそれがループを形成するのでループ配列と呼ばれる前記反応性基間に内在する配列を含む。
反応性基は、分子足場と共有結合を形成する能力のある基である。一般に、反応性基はペプチド上のアミノ酸側鎖に存在する。好ましいものは、システイン、リジンおよびセレノシステインなどのアミノ含有基である。
多重特異性は、２以上の標的と結合する能力である。一般に、結合ペプチドは、それらの立体構造的特性によって、単一の標的、例えば抗体の場合のエピトープなどと結合する能力がある。しかし、２以上の標的と結合することのできるペプチド；例えば、上述のように当分野で公知の二重特異性抗体を開発することができる。本発明において、ペプチドリガンドは、２以上の標的と結合する能力があり、そのため多重特異性である。好ましくは、リガンドは２つの標的と結合し、二重特異性である。結合は独立していてよく、それはペプチド上の標的の結合部位が、その標的の一方または他方の結合によって構造的に妨害されないことを意味し得る。この場合、両方の標的は独立に結合してよい。より一般には、一つの標的の結合は、他方の結合を少なくとも一部分妨げることになると予測されている。
多重特異性ペプチドは、個々の標的に結合しているペプチドリガンドの個々のループを連結することにより形成することができる。連結されるループは、隣接するループ（ｌｏｐｓ）であってもよいし、第３のループにより隔てられていてもよいし、さらに、さらなるループであってもよい。多重特異性ペプチドにおいてループが直接隣接して配置されている場合、該ループの一本を規定する反応性基の一つを取り除くことが、ある一つの位置での反応性基の効率的な複製（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を回避するために好ましい。
標的は、ペプチドリガンドが結合する分子またはその部分である。一般に、標的は、エピトープに類似し、従って同じ分子上の異なるエピトープ、または異なる分子上の異なるエピトープの形をとり得る。標的が同じ分子上にある場合、二重特異性リガンドを使用することは、分子に対するリガンドの結合活性を増大させることとなり、分子を架橋することまたは分子の規定された機能部分を占有することによってその他の特性を付与することができる。
分子足場は、複数の点でペプチドを結び付けて１以上の構造的特徴をペプチドに付与する能力のある分子である。分子足場は、それがただ単にジスルフィド結合を置換しないという点において、架橋剤ではない。その代わりに、分子足場は２以上のペプチドの結合点を提供する。好ましくは、分子足場は、足場反応性基と呼ばれる、少なくとも３つのペプチドの結合点を含む。これらの基は、ペプチド上の反応性基と反応して共有結合を形成する能力がある。分子足場に好ましい構造は、以下に記載される。
レパートリは、その配列が異なる変異体、この場合はポリペプチド変異体のコレクションである。一般に、反応性基の位置および性質は変化しないが、反応性基間にループを形成する配列はランダム化することができる。
結合活性（または任意のその他の所望の活性）についてのスクリーニングは、当分野で周知の方法に従って、例としてファージディスプレイ技術から実施される。例えば、固相に固定化された標的を用いてレパートリの結合メンバーを同定および単離することができる。スクリーニングは、所望の特性に応じたレパートリのメンバーの選択を可能にする。
ライブラリとは、異種ポリペプチドまたは核酸の混合物をさす。ライブラリはメンバーで構成され、その各々は単一のポリペプチドまたは核酸配列を有する。この点で、ライブラリはレパートリと同義である。ライブラリメンバー間の配列の違いが、ライブラリ中に存在する多様性の原因である。ライブラリは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形をとってもよいし、核酸のライブラリで形質転換された、生物または細胞、例えば細菌、ウイルス、動物もしくは植物細胞などの形であってもよい。好ましくは、各々の個々の生物または細胞は、ただ一つまたは限定された数のライブラリメンバーを含む。
有利には、核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、核酸は発現ベクターに組み込まれる。従って、好ましい態様では、ライブラリは、宿主生物の集団の形をとってよく、各々の生物は、発現させてその対応するポリペプチドメンバーを生成することのできるライブラリの単一のメンバーを核酸形態で含有する発現ベクターの１以上のコピーを含有する。よって、宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリをコードする可能性を有する。
好ましくは、核酸のライブラリは、ポリペプチドのレパートリをコードする。ライブラリの各々の核酸メンバーは、好ましくは１以上のその他のライブラリのメンバーに関連する配列を有する。関連配列は、ライブラリの少なくとも一つのその他のメンバーに対して少なくとも５０％の同一性、好適には少なくとも６０％の同一性、好適には少なくとも７０％の同一性、好適には少なくとも８０％の同一性、好適には少なくとも９０％の同一性、好適には少なくとも９５％の同一性、好適には少なくとも９８％の同一性、好適には少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。同一性は、参照配列の少なくとも３つのアミノ酸の連続するセグメントにわたって、好適には少なくとも４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸、好適には最小１２のアミノ酸、好適には最小１４のアミノ酸、好適には最小１６のアミノ酸、好適には最小１７のアミノ酸または全長の連続するセグメントにわたって好適に判断される。
ペプチドリガンドに結合する官能基は、例えば、さらなる結合活性を媒介するか、またはエフェクター基の結合を可能にする基である。よって、官能基には、抗体およびその結合断片、本明細書に記載されるさらなるペプチドリガンド、化学反応性基、ならびに同類のものが含まれる。
エフェクター基は、特異的活性を有するペプチドリガンドに結合する基である。例として、ペプチドリガンドの半減期を増加させるタンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などであり得る。また、エフェクター基には、薬物、例えば細胞傷害性薬物、免疫エフェクター（ｉｍｍｕｎｏｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）、例えば抗体のＦｃ領域など、および次のパラメータ：５以下の水素結合供与体（窒素または酸素原子と１以上の水素原子）；１０以下の水素結合アクセプター（窒素原子または酸素原子）；５００ダルトン未満の分子量；ならびに、５未満のオクタノール−水分配係数ｌｏｇＰ、に従う化合物が含まれる。
多重特異性ペプチドリガンド
本発明に従うペプチドリガンドは、先行技術で公知であるか、または本明細書に記載される技法により調製することができる。リガンドの成分、特に分子足場およびポリペプチド成分は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ６：８２１−８２４、ならびにＷＯ２００４／０７７０６２号、ＷＯ２００６／０７８１６１号およびＷＯ２００８／０１３４５４号から公知である。分子足場と複合体化するポリペプチドを選択するためにファージディスプレイを使用することは、Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，５０２−５０７、ならびに本発明者らの同時係属未公開国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ０９／０００３０１号に記載されている。これらの文書の各々は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明に従う多重特異性分子を構築するために好ましい方法、およびファージディスプレイの使用は、下により詳細に記載されている。
一般に、本発明に従う多重特異性分子は、（ａ）２つの個別の単一特異的ペプチドリガンドから生じる２つのループを融合するステップと、（ｂ）２つの単一特異的ペプチドリガンド全体を融合するステップと、（ｃ）結合基をペプチドリガンドに、Ｎ末端またはＣ末端で結合するか、もしくは分子足場に結合するステップ、または（ｄ）官能基またはエフェクター基を直接ペプチドリガンドに、好ましくは分子足場上に化学的に結合するステップにより構築することができる。
（Ａ）ペプチドリガンドの構築
（ｉ）分子足場
分子足場は、「分子コア」または「連結化合物」と呼ばれることもある。好適には、分子足場は、分子対称性を有する。好適には、分子足場は３つの足場反応性基を有し、３回対称性を有する。これには、単一の反応生成物のみを生成するという利点がある。分子足場が対称分子でない場合には、複数の反応生成物が生成される可能性がある。これは、複雑な状態を引き起こし得るか、または、所望の異性体をその他の反応生成物から分離することを必要とし得る。
ペプチドを分子足場にコンジュゲートするために好ましい反応性基は、システインである。しかし、３以上の反応性基が分子足場との少なくとも３つの別個の共有結合のために存在する場合、前記反応性基は各々がシステインである必要はない。例えば、これらの３つの反応性基は、一つのシステインと２つのさらなる適した反応性基からなってよく、それは例えばリジン、セレノシステインまたはその他のものからなってよい。好適には３つ全ての反応性基がシステインである。
公知の技法では、せいぜい架橋剤が、遺伝的にコードされたポリペプチドなどのポリペプチドに導入されるかまたは結合されてきた。一方、本発明は、同じポリペプチドの異なる部分の複数の多重配位のための分子足場を提供する。
好適には、分子足場は小分子であってよい。好適には、分子足場は有機小分子である。
好適には、分子足場は、天然モノマー、例えばヌクレオシド、糖、またはステロイドなどであってもよいし、またはそれらに基づいていてもよい。好適には、分子足場は、そのような物質の短いポリマー、例えば二量体または三量体を含んでよい。
好適には、分子足場は、既知毒性の、好適には低い毒性の化合物である。適した化合物の例としては、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはタマゼパム（ｔａｍａｚｅｐａｍ）などの既存の薬物が挙げられる。
好適には、分子足場は、高分子であってよい。好適には、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物で構成される高分子である。
好適には、分子足場は、ポリペプチドの官能基（１または複数）と反応して共有結合を形成する能力のある反応性基を含む。
分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルのような化学基を含むことができる。
好適には、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、またはその誘導体を含んでもよいし、それからなってもよい。
好適には、分子足場は、ポリペプチドの３つの官能基と分子足場との反応が単一の生成物異性体を生じるような、３回回転対称を有する。
一部の実施形態では、分子足場は、コードされたポリペプチドの４つの官能基と分子足場との反応が最大２つの生成物異性体を生じるような、４面体の形状を有し得る。
適した分子足場は、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。それは１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似するが、ベンゼン環に結合した３つのメチル基をさらに含む。これは、さらなるメチル基が、ポリペプチドとのさらなる接触点を形成することができ、そのためにさらなる構造的制約を加える点で有利である。
本発明の分子足場は、小分子かまたは巨大分子構造のいずれかから選択される。前記分子足場は、有機、無機または有機および無機成分からなる。
好ましい実施形態では、分子足場は、例えば直鎖アルカンのような有機小分子である。より好適には、分子足場は、分枝アルカン、環状アルカン、多環式アルカン、芳香族（ａｒｏｍａｔｅ）、複素環式アルカンまたは複素環式芳香族であり、これらは柔軟性が低い（すなわち、より硬質である）という利点をもたらす。最も好適には、分子足場は、ベンジル基を含む。
もう一つの実施形態では、分子足場は、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは多糖のような巨大分子構造から選択される。
本発明の分子足場は、本発明のコードされたライブラリのポリペプチドの官能基に分子足場との共有結合を形成することを許容する化学基を含む。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含む広い範囲の官能基から選択される。
（ｉｉ）ポリペプチド
コードされたポリペプチドの反応性基は、好適には天然もしくは非天然アミノ酸の側鎖により提供される。コードされたポリペプチドの反応性基は、好適にはチオール基、アミノ基、カルボキシル基、グアニジウム基、フェノール基またはヒドロキシル基から選択される。コードされたポリペプチドの反応性基は、好適にはアジド基、ケト−カルボニル基、アルキン基、ビニル基、またはハロゲン化アリール基から選択されてよい。分子足場に連結するためのコードされたポリペプチドの反応性基は、好適にはポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
一部の実施形態では、分子足場に連結するためのポリペプチドの反応性基の各々は、同じ種類のものである。例えば、各々の反応性基は、システイン残基であってよい。
一部の実施形態では、分子足場と連結するための反応性基は、２以上の異なる種類を含んでよい、または、３以上の異なる種類を含んでよい。例えば、反応性基は、２個のシステイン残基と１個のリジン残基を含んでよい、または、１個のシステイン残基、１個のリジン残基および１個のＮ末端アミンを含んでよい。
システインは、その反応性が、その他の全てのアミノ酸とは非常に異なっているという利点を有するため、最も適したアミノ酸である。システインのチオール基と反応させるために分子足場で使用することができ得る足場反応性基は、ハロゲン化アルキル（またはハロゲノアルカンまたはハロアルカンとも命名される）である。例は、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢに例示される足場反応性基）またはヨードアセトアミドである。タンパク質中で化合物をシステインと選択的に結合させるためのその他の使用される足場反応性基は、マレイミドである。本発明において分子足場として使用することのできるマレイミドの例としては、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンが挙げられる。セレノシステインも、システインに似た反応性を有する天然アミノ酸であり、同じ反応に用いることができる。従って、システインが言及される場合はいつも、前後関係から別のものが示唆される場合を除いて、一般にセレノシステインを代用することが容認される。システインが使用されることが最も適している。
リジン（およびペプチドのＮ末端の第一級アミン）も、分子足場に連結することによりファージ上でペプチドを修飾するための反応性基として適している。しかし、それらはファージタンパク質中でシステインよりも豊富であり、ファージ粒子が架橋されかねないか、またはそれらがその感染性を失いかねないというリスクが高まる。それにもかかわらず、分子足場との第２のまたは連続的な連結を形成するために、リジンが分子内反応において特に有用である（例えば、分子足場が既にファージペプチドに連結されている場合）ことが見出された。この場合、分子足場は、提示されたペプチドのリジン（特にすぐ近くにあるリジン）と優先的に反応する。第一級アミンと選択的に反応する足場反応性基は、スクシンイミド、アルデヒドまたはハロゲン化アルキルである。いくつかの添付される実施例で用いられるブロモメチル基において、ベンゼン環の電子は、カチオン遷移状態を安定化することができる。この特定のハロゲン化アリールは、そのためハロゲン化アルキルよりも１００〜１０００倍反応性が高い。分子足場として使用するためのスクシンイミドの例としては、トリス−（スクシンイミジルアミノトリアセテート）、１，３，５−ベンゼントリ酢酸が挙げられる。分子足場として使用するためのアルデヒドの例としては、トリホルミルメタンが挙げられる。分子足場として使用するためのハロゲン化アルキルの例としては、１，３，５−トリス（ブロモメチル）−２，４，６−トリメチルベンゼン、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン、１，３，５−トリス（ブロモメチル）−２，４，６−トリエチルベンゼンが挙げられる。
一部の実施形態では、分子リンカーまたは分子修飾体を、分子足場の結合の前にコードされたポリペプチドの反応性基に添加する（または反応性基を生成する）ことができる（この際、前記リンカーまたは修飾は該分子足場と反応する能力がある）。
分子足場と連結するための反応性基を含むアミノ酸は、コードされたポリペプチド内の任意の適した位置に位置してよい。生成される特定の構造またはループに影響を及ぼすためには、反応性基を有するアミノ酸の位置は、熟練した操作者によって、例えば製造したポリペプチドを変異させるためにポリペプチドをコードする核酸の操作によって、様々であり得る。
コードされたポリペプチドの各々のアミノ酸は、熟練作業者または本発明が適用される目的の必要性に従う変異誘発（例えば、変動の制限された変異誘発）の標的であり得る。明らかに、分子足場と結合するために少なくとも３つの反応性基が目的のポリペプチド上に必要である。分子足場との結合に必要とされるもの以外のアミノ酸は、操作者の必要性に従って自由に変動してよく、「可変性アミノ酸」と称される。前記コードされたポリペプチド（例えば、ポリペプチドライブラリメンバー（１または複数））の可変性アミノ酸は、ランダム化されていてもよく、部分的にランダム化されていてもよく、または定常的であってもよい。
ポリペプチドは、分子足場結合セグメントを含む。これは、分子足場が結合する領域である。好適には、ポリペプチド上の反応性基に関する解説は、この結合セグメントに適用される。好適には、ポリペプチドの分子足場結合セグメントは、１〜２７個のアミノ酸残基、好適には５〜２０個のアミノ酸残基を含む。好適には、ポリペプチドの分子足場結合セグメントは、１０個より少ないアミノ酸を含む。これは、それが分子足場に結合すると、さらなる立体構造的制約をポリペプチドセグメントに課すという利点を有する。
ポリペプチドは、好適には配列ＡＣ（Ｘ）６Ｃ（Ｘ）６ＣＧを含み、この際、Ｘはランダム天然アミノ酸を表し、Ａはアラニンを表し、Ｃはシステインを表し、Ｇはグリシンを表す。
ポリペプチドは、好適には配列（Ｘ）ＩＹ（Ｘ）ｍＹ（Ｘ）ｎＹ（Ｘ）ｏを含み、この際、Ｙは反応性基をもつアミノ酸を表し、Ｘはランダムアミノ酸を表し、ｍおよびｎは介在するポリペプチドセグメントの長さを規定する１〜２０の間の数字であり、かつＩおよびｏは隣接するポリペプチドセグメントの長さを規定する０〜２０の間の数字である。
一部の実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、配列ＡＣ（Ｘ）６Ｃ（Ｘ）６ＣＧをもつポリペプチドを含み得る。一実施形態では、本発明のライブラリメンバーまたはペプチドリガンドは、メシチレン分子足場および配列ＡＣ（Ｘ）６Ｃ（Ｘ）６ＣＧをもつポリペプチドを含んでよく、この際、ポリペプチドは、ポリペプチドのシステイン残基を介して分子足場のエキソ環状メチル基に繋ぎ止められ、それとともに３つのチオエーテル結合を形成し、かつ、この際、Ｘはアミノ酸、（好適には天然アミノ酸）を表し、Ａはアラニンを表し、Ｃはシステインを表し、Ｇはグリシンを表す。メシチレン足場の使用は、ペプチドリガンドの構造にある程度の柔軟性を導入する。
（ｉｉｉ）ポリペプチドの反応性基
本発明の分子足場は、ポリペプチド上の官能基また反応性基を介してポリペプチドに結合させることができる。これらは、一般にポリペプチドポリマー中に見出される特定のアミノ酸の側鎖から形成される。そのような反応性基は、システイン側鎖、リジン側鎖、あるいはＮ末端アミン基または任意のその他の適した反応性基であってよい。
好適には、少なくとも一つの反応性基は、システイン基である。リジンまたはＮ末端アミンなどの基は、一般に便宜な時間枠内で独力で分子足場と結合するほど十分に反応性ではない。しかし、ひとたび分子足場が少なくとも一つのシステインに引き付けられるかまたは結合すれば、通常の反応速度論は、リジン結合またはアミン結合はそれ以降迅速かつ安定して形成され得ることが意味する。この理由から、好適には少なくとも一つの反応性基はシステイン基である。
ポリペプチド上にシステイン／リジン／アミン基以外の反応性基を所望する場合、ポリペプチド上の最適な特定の官能性反応性基と対とするために、異なる分子足場を選んでよい。
好適には、システイン、リジンまたはアミン基を、目的のポリペプチド上の官能性または反応性基として使用する。
好適には、少なくとも３つの共有結合が分子足場と目的のポリペプチドとの間に形成される。
一部の実施形態では、４つの結合またはそれより多くの結合が分子足場と目的のポリペプチドとの間に形成され得る。しかし、４より多くの結合を用いる場合、一般に形成される生成混合物は、次第に複雑になり、その後の使用または用途を妨げる可能性がある。この理由から、分子足場と目的のポリペプチドとの間には３つの結合または４つの結合が好ましい。いずれの実施形態でも、分子足場の分子対称性が好ましい。最も好ましいのは、３つの官能基または反応性基を有する分子足場である。最も好ましいのは、３回対称性を有する分子足場である。
本発明の遺伝的にコードされたポリペプチドの反応性基は、分子足場／分子コアと共有結合を形成する能力がある。反応性基は、天然アミノ酸か非天然アミノ酸のいずれかの中の原子の特定の基である。優先的に、独特の化学反応性をもつ反応性基を用いてポリペプチドを分子足場に連結して、本発明の複合体を形成する。前記独特の反応性基の使用により、分子足場／分子コアの結合は、複合体のポリペプチド、核酸またはその他の成分のいずれかの多様性要素のその他の化学基とではなく、ポリペプチドの指定された反応性基とだけ可能となる。
天然アミノ酸の適した反応性基は、システインのチオール基、リジンのアミノ基、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基、アルギニンのグアニジウム基、チロシンのフェノール基あるいはセリンのヒドロキシル基である。非天然アミノ酸は、アジド、ケト−カルボニル、アルキン、ビニル、またはハロゲン化アリール基を含む、広い範囲の反応性基を提供することができる。ポリペプチドの末端のアミノおよびカルボキシル基も、分子足場／分子コアと共有結合を形成するための反応性基としての役割を果たし得る。
本発明のコードされたポリペプチドは、好適には少なくとも３つの反応性基を含む。前記ポリペプチドは、４以上の反応性基を含むこともできる。より多くの反応性基を使用するほど、より多くの多様性セグメントが分子足場／分子コアに繋ぎ止められ得る。しかし、過剰な数の反応性基と分子足場／分子コアの結合は、管理しにくい数の生成物異性体をもたらし得るので、推奨されない。好適には３つ、４つまたは５つの分子足場に対する共有結合、最も好適には３つまたは４つの共有結合、最も好適には３つの共有結合が使用される。
好ましい実施形態では、３つの反応性基をもつコードされたポリペプチドが生成される。前記ポリペプチドと、３回回転対称を有する分子足場／分子コアの反応は、単一の生成物異性体を生成する。単一の生成物異性体の生成は、いくつかの理由で好ましい。化合物ライブラリの核酸は、ポリペプチドの一次配列だけをコードするが、コードされたポリペプチドと分子コアの反応によって形成される分子の異性状態をコードしない。ただ一つの生成物異性体だけを形成することができれば、生成物異性体に対する核酸の割り当ては明確に規定される。複数の生成物異性体が形成される場合、核酸は、スクリーニングまたは選択プロセスで単離された生成物異性体の性質についての情報を与えることができない。単一の生成物異性体の形成はまた、本発明のライブラリの特定のメンバーを合成する場合にも有利である。この場合、ポリペプチドと分子足場の化学反応は、異性体の混合物よりもむしろ単一の生成物異性体を生じる。
本発明もう一つの実施形態では、４つの反応性基をもつコードされたポリペプチドが生成される。前記ポリペプチドと、４面体対称を有する分子足場／分子コアの反応は、２つの生成物異性体を生成する。たとえ２つの異なる生成物異性体が一つの同じ核酸（「遺伝コード」）でコードされていても、単離された異性体の異性体としての性質は、両方の異性体を化学的に合成し、２つの異性体を分離し、両方の異性体を標的リガンドとの結合について試験することにより決定することができる。
本発明の一実施形態では、ポリペプチドの反応性基の少なくとも一つ、残りの反応性基に対して直交する。直交反応性基を使用することにより、前記直交反応性基を分子コアの特定の部位に向けることが可能となる。直交反応性基を伴う連結戦略を用いて、形成される生成物異性体の数を制限することができる。言い換えれば、少なくとも３つの結合の残りに選択される反応性基とは別個または異なる反応性基を少なくとも３つの結合の１以上に選択することにより、ポリペプチドの特定の反応性基の分子足場上の特定の位置に対する、特定の順序の結合または配向を、有用に達成することができる。
もう一つの実施形態では、本発明コードされたポリペプチドの反応性基を、分子リンカーと反応させる。この際、前記リンカーは、最終の結合状態でリンカーが分子足場とポリペプチドの間に介在するように、分子足場と反応する能力がある。
遺伝的にコードされたコンビナトリアル化学ライブラリのメンバーの適したアミノ酸は、任意の天然もしくは非天然アミノ酸で置換することができる。これらの交換可能なアミノ酸から除外されるものは、ポリペプチドを分子コアに架橋するための官能基を有するものである。変動し得る隣接アミノ酸の群は、ポリペプチドセグメントと定義される。単一のポリペプチドセグメントのサイズは、好適には１〜２０アミノ酸の範囲である。ポリペプチドセグメントは、ランダム配列か、定常配列か、またはランダムアミノ酸と定常アミノ酸を含む配列のいずれかを有する。反応性基をもつアミノ酸は、本発明のコードされたポリペプチド内の規定された位置かまたはランダム位置のいずれかに配置される。
一実施形態では、分子足場／分子コアと結合するための反応性基を有する２つのアミノ酸により境界されるポリペプチドセグメントは、１０またはそれよりも少ないアミノ酸からなる短いアミノ酸配列である。前記コードされたポリペプチド配列と分子コアとの反応は、高い立体構造的制約をもつライブラリメンバーを生じる。立体構造的に制約されたリガンドは、一般に特異性がより高く、より高い結合親和性を有する。立体構造的制約はまた、例えば体液中でのタンパク質分解からリガンドを保護することができる。
一実施形態では、３つの反応性基をもつコードされたポリペプチドは、配列（Ｘ）ＩＹ（Ｘ）ｍＹ（Ｘ）ｎＹ（Ｘ）ｏを有し、この際、Ｙは反応性基をもつアミノ酸を表し、Ｘはランダムアミノ酸を表し、ｍおよびｎは介在するポリペプチドセグメントの長さを規定する１〜２０の間の数字であり、かつＩおよびｏは隣接するポリペプチドセグメントの長さを規定する０〜２０の間の数字である。
好ましい実施形態では、本発明のコードされたポリペプチドライブラリは、配列ＡＣ（Ｘ）６Ｃ（Ｘ）６ＣＧを含み、この際、Ａはアラニンを表し、Ｃはシステインを表し、Ｘはランダム天然アミノ酸を表し、Ｇはグリシンを表す。
チオール媒介コンジュゲーションの代替法を用いて、共有相互作用を介して分子足場をペプチドに結合させることができる。あるいはこれらの技法は、さらなる部分（例えば分子足場とは異なる目的の小分子など）を本発明に従って選択するかまたは単離した後に、ポリペプチドとの修飾または結合に使用してもよい。この実施形態において、その時、明らかに該結合は共有結合である必要はなく、非共有結合を包含してよい。これらの方法は、相補的な反応性基を有する小分子と組み合わせて、必要な化学反応性基をもつ非天然アミノ酸を有するタンパク質およびペプチドを提示するファージを産生することによるか、あるいは、選択／単離ステップの後に分子を作製する場合には非天然アミノ酸を化学合成または組換え合成ポリペプチドの中に組み込むことにより、チオール介在方法の代わりに（またはそれと組み合わせて）使用することができる。
ファージ上のペプチドおよびタンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸には、１）ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびそれらの誘導体と特異的に反応することのできるケトン反応性基（パラもしくはメタアセチル−フェニルアラニンに見出されるもの）（Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｔｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｂｒｏｃｋ Ａ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３ Ｊａｎ ７；１００（１）：５６−６１；Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００６ Ｏｃｔ １５；１６（２０）：５３５６−９．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｋｅｔｏｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｚｅｎｇ Ｈ，Ｘｉｅ Ｊ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ）、２）銅触媒「クリック化学」または歪みにより促進される（ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｄ）（３＋２）環化付加（ｃｙｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ）を介してアルキンと反応し、対応するトリアゾールを形成することのできるアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニンに見出されるもの）（Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐ−ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｃｈｉｎ ＪＷ，Ｓａｎｔｏｒｏ ＳＷ，Ｍａｒｔｉｎ ＡＢ，Ｋｉｎｇ ＤＳ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００２ Ａｕｇ ７；１２４（３１）：９０２６−７；Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｄｅｉｔｅｒｓ Ａ，Ｃｒｏｐｐ ＴＡ，Ｍｕｋｈｅｒｊｉ Ｍ，Ｃｈｉｎ ＪＷ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＣ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００３ Ｏｃｔ １；１２５（３９）：１１７８２−３）、または、シュタウディンガー・ライゲーション（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐ−ａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ．Ｔｓａｏ ＭＬ，Ｔｉａｎ Ｆ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００５ Ｄｅｃ；６（１２）：２１４７−９）を介してアリールホスフィンと反応して、対応するアミドを形成することのできるアジド、４）アジドと反応して対応するトリアゾールを形成することのできるアルキン（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｋｙｎｅ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｄｅｉｔｅｒｓ Ａ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００５ Ｍａｒ １；１５（５）：１５２１−４）、５）１より多くの適切に間隔を空けたヒドロキシル基を含有する化合物と特異的に反応することができるか、あるいはパラジウムに媒介されるハロゲン化化合物との結合を受けることのできるボロン酸（ボロネート）（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ｌｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００８；４７（４３）：８２２０−３．Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｏｒｏｎａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．，Ｂｒｕｓｔａｄ Ｅ，Ｂｕｓｈｅｙ ＭＬ，Ｌｅｅ ＪＷ，Ｇｒｏｆｆ Ｄ，Ｌｉｕ Ｗ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ）、６）金属イオンを特異的に配位させることのできる、ビピリジルを有するものを含む、金属キレート化アミノ酸（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ｌｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００７；４６（４８）：９２３９−４２．Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｉｄｅｎｔａｔｅ，ｍｅｔａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．Ｘｉｅ Ｊ，Ｌｉｕ Ｗ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ）が含まれてよい。
非天然アミノ酸は、１）コドンに応答して非天然アミノ酸の組込みを指示する、直交アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡ、２）非天然アミノ酸組込みの部位で選択されたコドンを含むように変更されたファージＤＮＡまたはファージミドプラスミド、を有するプラスミドまたはプラスミドの組合せで大腸菌を形質転換することにより、ファージ上に提示されるペプチドおよびタンパク質に組み込まれてよい（（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００８ Ｎｏｖ １８；１０５（４６）：１７６８８−９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．Ｌｉｕ ＣＣ，Ｍａｃｋ ＡＶ，Ｔｓａｏ ＭＬ，Ｍｉｌｌｓ ＪＨ，Ｌｅｅ ＨＳ，Ｃｈｏｅ Ｈ，Ｆａｒｚａｎ Ｍ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ，Ｓｍｉｄｅｒ Ｗ；Ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｔｉａｎ Ｆ，Ｔｓａｏ ＭＬ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００４ Ｄｅｃ １５；１２６（４９）：１５９６２−３）。直交アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡは、メタノコッカス・ヤナシイ・チロシル対またはシンセターゼ（Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．Ｃｈｉｎ ＪＷ，Ｍａｒｔｉｎ ＡＢ，Ｋｉｎｇ ＤＳ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００２ Ａｕｇ ２０；９９（１７）：１１０２０−４）およびピロリジンを自然に組み込むｔＲＮＡ対（Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅ Ｎ（ｅｐｓｉｌｏｎ）−（ｏ− ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｔ，ｌｓｈｉｉ Ｒ，Ｆｕｋｕｎａｇａ Ｒ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ１ Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ，Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｓ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｎｏｖ ２４；１５（１１）：１１８７−９７；Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎ（ｅｐｓｉｌｏｎ）−ａｃｅｔｙｌｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｅｕｍａｎｎ Ｈ，Ｐｅａｋ−Ｃｈｅｗ ＳＹ，Ｃｈｉｎ ＪＷ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００８ Ａｐｒ；４（４）：２３２− ４．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｆｅｂ １７）から誘導されてよい。組込みのためのコドンは、アンバーコドン（ＵＡＧ）であっても別の停止コドン（ＵＧＡ１またはＵＡＡ）であってもよく、あるいはそれは４塩基コドンであってもよい。アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡは、既存のベクターから作出してよく、それには、ｐＢＫ系列のベクター、ｐＳＵＰ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｒｙｕ Ｙ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６ Ａｐｒ；３（４）：２６３−５）ベクターおよびｐＤＵＬＥベクター（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５ Ｍａｙ；２（５）：３７７−８４．Ｐｈｏｔｏ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ ＩＳ１ Ｔｏｒｏｎｅｙ Ｒ１ Ｈａｚｅｎ ＪＬ１ Ｍｅｈｌ ＲＡ，Ｃｈｉｎ ＪＷ）が含まれる。用いる大腸菌株は、（一般にｔｒａオペロンを介して）Ｆ線毛を発現する。アンバー抑制を用いる場合、大腸菌株自体は、活性なアンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含有しない。このアミノ酸は成長培地に、好ましくは１ｍＭまたはそれ以上の終濃度で添加されることになる。アミノ酸組込みの効率は、直交リボソーム結合部位を含む発現構築物を使用し、リボ−Ｘを含む遺伝子を翻訳することにより高めることができる（Ｅｖｏｌｖｅｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｗａｎｇ Ｋ，Ｎｅｕｍａｎｎ Ｈ，Ｐｅａｋ−Ｃｈｅｗ ＳＹ，Ｃｈｉｎ ＪＷ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｊｕｌ；２５（７）：７７０−７）。これにより、リガンドとの複数の結合部位をもたらす非天然アミノ酸の効率的な多重部位組込みを可能にすることができる。
（ｉｖ）多重特異性分子を形成するためのループの組合せ
ペプチドリガンド、またはペプチドリガンドのレパートリからのループは、有利には、配列決定および合わせたループを組み込むポリペプチドのデノボ合成により結合される。あるいは、そのようなポリペプチドをコードする核酸を合成してもよい。
レパートリ、特に単一ループレパートリを合わせる場合、該レパートリをコードする核酸は、有利に消化され、再連結されて、構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ）レパートリからのループの異なる組合せを有する新規なレパートリを形成する。ファージベクターには、制限酵素のためのポリリンカーおよびその他の部位を含むことができ、それはベクターを切断およびライゲーション（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）するための独自の点を提供し、所望の多重特異性ペプチドリガンドを作成することができる。ファージライブラリを操作するための方法は、抗体については周知であり、本事例でも同様に適用することができる。
（ｖ）結合後修飾
一部の実施形態では、ポリペプチド−分子足場複合体は、結合後の時点で修飾することができる。
プロテアーゼ切断
一部の実施形態では、本発明のポリペプチド要素は、分子足場／分子コアに繋ぎ止められるとすぐにタンパク質分解によって切断される。この切断により、分子足場／分子コアに繋ぎ止められた別個のペプチド断片を有するリガンドが生成される。このアプローチにより、個々のペプチドリガンドからのループの組合せを促進し、本発明に従う多重特異性ペプチドリガンドを形成することができる。
例えば、ポリペプチドの１以上のアミド結合は、ポリペプチドを分子コアに繋ぎ止めた後に、タンパク質分解によって切断されてよい。これには、各々が少なくとも一つの共有結合により分子足場に結合されているが、親ポリペプチドをコードする核酸を含む複合体中に保持される異なる分子構造を提示する、短いポリペプチドを作成するという利点がある。ポリペプチド切断は、好適には、当分野で公知の任意の適した手段、例えば制御された加水分解またはより好適には適したプロテアーゼによる酵素切断などにより触媒される。プロテアーゼは、任意の適したプロテアーゼであってよいが、好ましくは特定のポリペプチド認識配列またはモチーフを含むプロテアーゼである。これにより、より規定された、かつ／またはより予測可能なポリペプチド切断産物の産生が有利にもたらされる。実際に、この実施形態では、プロテアーゼ認識配列は、例えばポリペプチドをコードする核酸（１または複数）を操作することにより、ポリペプチドに体系的に付加されるかまたはそれから除去され得る。これにより、有利には、本発明に従って提示される分子において、より高度な制御がもたらされ、かつ、より高度な多様性が生成されることが許容される。最も好適には、ポリペプチドは、少なくとも一つのプロテアーゼ認識部位を含む。好適には、各々の前記切断部位は、分子足場と共有結合するために用いられるポリペプチド上の反応性基間のアミノ酸配列（１または複数）の中に含まれる。好適には、各々の前記切断部位は、分子足場と共有結合するために用いられるポリペプチド上の反応性基間のアミノ酸配列（１または複数）の中に含まれる。
ペプチドループは、好適には、特定のアミノ酸位置でポリペプチドを認識し保有するプロテアーゼ、例えばトリプシン（Ｐ１位置のアルギニンまたはリジン）またはサーモリシン（Ｐ１位置の脂肪族側鎖）で切断される。酵素は、提示された分子のペプチドループの効率的なプロセシングを可能にするがファージ粒子を残す濃度で使用される。最適な条件は、ポリペプチドループの長さ、および用いるプロテアーゼによって変動し得る。例えばトリプシンは、一般に１０℃にて１０分間、ＴＢＳ−Ｃａバッファー（２５ｍＭ トリスＨＣｌ／１３７ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中２００ｎＭで用いられる。提示されるポリペプチドを修飾するがファージを残すために適したあらゆる種類のプロテアーゼが、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ；Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ．１９９８；３（５）：３２１−８）に記載されている。ファージ上のペプチドの酵素プロセシングは、限定された数のファージコートタンパク質が切断されることを排除することができないために、「部分的タンパク質分解」であり得る。よって、条件の最適化では、標的の切断を最大化することとファージ粒子を最大限残すこととの間の最良のバランスが好適に選択される。
好適には、ポリペプチドは、少なくとも一つのそのようなタンパク質分解切断部位を含む。好適には、ポリペプチドは、少なくとも２つのそのようなタンパク質分解切断部位を含む。
好適には、ポリペプチドは、少なくとも３つのそのようなタンパク質分解切断部位を含む。
各々のそのようなタンパク質分解の実施形態において、好適には、前記プロテアーゼ部位（１または複数）は、分子足場により範囲が定められるポリペプチドループ内に位置する。これは、分子足場が複合体上に保持される点で有利である。そうでなければポリペプチド−分子足場複合体はポリペプチドをコードする核酸から分離される可能性があり、それは大部分の本発明の用途に望ましくないためである。
短いループ（例えば６アミノ酸残基以下の短さ）の使用は、一部のプロテアーゼのループ内で切断する能力を損なう可能性がある。一部の例では、プロテアーゼに接近する可能性のより高い、より長いループを選択することが望ましい場合がある。さらに、エンドプロテアーゼによるループの切断後に、その他のエンドプロテアーゼで、あるいは実際にはエキソプロテアーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼなどによって、さらにループを短くすることが望ましい場合がある。
ポリペプチドが１より多くのそのようなプロテアーゼ部位を含む場合、好適には、それらの部位の各々は、ポリペプチドと分子足場との間に作成される２つの共有結合間に存在する。必要であれば、複数の切断部位が結合間に存在してもよい。
プロテアーゼ耐性
もう一つの実施形態では、ポリペプチドは、プロテアーゼ切断に対して耐性であり得る。一般に、プロテアーゼは、ポリペプチドを切断するためにそれに物理的に接近することができないので、しっかりと折りたたまれたポリペプチド構造は、プロテアーゼに対する耐性がより高い。そのため、ペプチドリガンド中の足場および足場結合の操作によって、ポリペプチドループの折りたたみに影響を及ぼすことにより、プロテアーゼ感受性を調節することができる。
前節に示されるように、プロテアーゼステップは、化学足場に結合したループ内の接近可能な部位を切断するために導入することができる。ペプチド抱合体のレパートリがファージ上に提示されると、各々が少なくとも一つの共有結合により化学足場に結合しているが、親ポリペプチドをコードする核酸を含む抱合体に保持されているペプチドがもたらされる。抗原による選択の前に化学修飾されたファージをプロテアーゼで処理することにより、切断されたループ（１または複数）を含むペプチド抱合体を有するファージ、および、切断部位の欠如に起因して切断されていないか、そうでなければ切断に耐性であるループ（１または複数）を含むペプチド抱合体を有するファージも生じることが見込まれる。一方が抗原に結合し、他方が結合しない場合、選択されたファージクローンと標的抗原の結合をプロテアーゼ処理の前および後に比較することによりこれらの種を識別することは可能である。よって、切断されたループをもつ種は、プロテアーゼ処理の前ではなく後に結合すると予測される；一方、プロテアーゼ耐性の種は、処理の前および後の両方に結合すると予測される。抱合体が切断されたループと切断されていないループの両方と結合する場合は（カリクレイン切断後にＰＫ１５のように；Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ，２００９参照）、プロテアーゼ耐性と不正確に認定される可能性があることに留意する。これは、切断を確かめるための直接的方法（例えばペプチド抱合体を化学的に合成することによる）を使用すること、および切断を確かめること（例えば質量分析による）の重要性を示す。
切断されたループ抱合体がプロテアーゼ耐性抱合体に好ましい場合、１回目の選択の前に化学的に修飾されたファージレパートリをプロテアーゼで処理し、後続の回で、同じプロテアーゼか、または共通の切断部位をもつプロテアーゼを使用し続けることが有利となる。しかし、その代わりにプロテアーゼ耐性抱合体が望ましいことがある。そのようなペプチドは、腸プロテアーゼを生き残る経口投与か、またあるいは血液、組織または細胞においてタンパク質分解作用にさらされる投与に有用であり得る。この場合、プロテアーゼを用いない１回目の選択は、その後にプロテアーゼを用いる後続の回の選択が続く、耐性のある種の選択を好むはずである。
プロテアーゼの使用は、選択プロセス中にさらなる有用性がある。例えば、（ａ）ヌクレオチドの合成でのエラーにより必要なシステイン残基をコードできなかった、または（ｂ）必要なシステイン残基が溶液中の遊離システインとジスルフィド結合を形成した（恐らく不適切な還元または再酸化に起因）、あるいは、不可逆的な方法で反応した（例えば、酸化されてシステイン酸になる、または、必要なシステインの一つが足場の異なる分子と反応して他のものになる）という理由から、一部の形成されていないループ（配列の直線状のセグメント）が、ライブラリ中に存在する可能性がある。配列の直線状のセグメントは、ループよりもプロテアーゼの作用に感受性が高いので、切断部位が存在する条件では、プロテアーゼを使用してそのようなバインダーを避けることが可能であり得る。
プロテアーゼステップ（還元剤の存在下）はまた、化学足場によるよりも、必要なシステイン間のジスルフィドを介して形成されたループを除去するのに有利である。これは、ファージ上にシステインの不十分な還元（または後続の再酸化）がある場合に予期され得る。この理由から、本発明者らは、化学架橋ステップの間に脱気したバッファーを使用した；また、本発明者らはＴＢＭＢとの反応の間に還元剤（ＴＣＥＰ）を低レベルに保って還元環境を維持した。それにもかかわらず、１回目の選択の後、本発明者らは４つのシステイン残基（ループ中に３つの必要なシステイン残基、およびさらなるシステイン残基）が含まれた多くの配列、例えば、ＰＥＰ２１（ＣＦＮＳＥＷＳＣＬＱＳＣＳＮＣ）を見出した。合成ヌクレオチドライブラリにはランダムコドンが含まれるので（ＮＮＫ多様性：ここでＮはアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドの各々の２５％混合物を表し、Ｋはチミンおよびグアニンヌクレオチドの各々の５０％混合物を表す）、そのような余分のシステインはペプチドレパートリ中に存在すると予期される。一部の条件下で、例えば不十分な還元、または必要なシステインと化学足場の不完全な反応（恐らくアミノ基または水による足場に対する競合反応に起因する）がある場合、余分のシステインが、酸化条件下で、３つの必要なシステインの一つとジスルフィドループを形成することが予測され得る。あるいは、余分のシステインが足場と反応し、必要な２つのシステインにジスルフィドで閉じられたループを形成させる可能性がある。
それらの生成の背後にある正確な機構が何であろうと、そのようなジスルフィドで閉じられたループは、足場で閉じられたループと競合し、優勢となる可能性がある。モノマーでなくトリプレットから構築した合成ヌクレオチドライブラリを使用し、そうしてループ中のシステインコドンを回避することによって、余分のシステインの発生頻度を低下させること；および／または、ジスルフィドで閉じられたループを開くために還元剤の存在下で選択を行うことが可能であるはずである。より便宜には、本発明者らは、ループを開いてその次に切断するために、還元剤（例えばジチオスレイトールまたはＴＣＥＰなど）の存在下で化学的に修飾されたファージレパートリをプロテアーゼで処理することが、そのような種の寄与を最小限にするのに役立つことを見出した。
そのため、一実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、実質的にプロテアーゼ耐性である。標的に対する選択の後にペプチドリガンドを切断させることは、プロテアーゼ切断に耐性である結合ペプチドリガンドの同定を促す。特定のペプチドリガンドが、切断後も標的に結合する能力を保持している可能性を完全に除外することはできない。しかし、そのようなリガンドの発生率は低いことになる。そのため、本発明は、
（ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを、２以上のアミノ酸残基でポリペプチドに結合する分子足場にコンジュゲートして、ポリペプチド抱合体のレパートリを形成するステップと、
（ｃ）前記レパートリを標的に対する結合についてスクリーニングするステップ、および、標的に結合する第１のレパートリのメンバーを選択するステップと、
（ｄ）所望により、選択したレパートリを還元剤で処理するステップと、
（ｅ）レパートリをプロテアーゼで処理するステップと、
（ｆ）前記レパートリを標的との結合についてさらにスクリーニングするステップと
を含む、増大したプロテアーゼ耐性を有するペプチドリガンドを選択するための方法を提供する。
もう一つの実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、プロテアーゼにより実質的に切断される。プロテアーゼステップは、レパートリのスクリーニングの前に含められ、切断された形態で標的に結合するペプチドリガンドの同定を促す。そのため、本発明は、
（ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを、２以上のアミノ酸残基でポリペプチドに結合する分子足場にコンジュゲートして、ポリペプチド抱合体のレパートリを形成するステップと、
（ｃ）所望により、レパートリを還元剤で処理するステップと、
（ｄ）レパートリをプロテアーゼで処理するステップと、
（ｅ）前記レパートリを標的に対する結合についてスクリーニングし、プロテアーゼでの処理の後に標的に結合する、第１レパートリのメンバーを選択するステップと
を含む、プロテアーゼにより切断されたペプチドリガンドを選択するための方法を提供する。
プロテアーゼ耐性についてのスクリーニングは、簡単に、結合がプロテアーゼに感受性であるかまたはプロテアーゼの作用を必要とするレパートリメンバーを同定するための、プロテアーゼによる制限消化の形をとってよい。最も望ましいのは、二環式ペプチドが使用されることになる条件下、例えば血清の存在下で活性であるプロテアーゼを使用することになる。
（ｖｉ）エフェクター基および官能基の結合
上記のように、エフェクター基および／または官能基は、ポリペプチドのＮまたはＣ末端に、あるいは分子足場に結合することができる。
適したエフェクター基には、抗体およびその部分または断片が含まれる。例として、エフェクター基には、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、および抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメイン、またはそれらの任意の組合せが、１以上の定常領域ドメインに加えて含まれ得る。エフェクター基はまた、抗体のヒンジ領域（そのような領域は、通常ＩｇＧ分子のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に見出される）を含むことができる。
本発明のこの態様のさらに好ましい実施形態では、本発明に従うエフェクター基は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明に従うペプチドリガンド−エフェクター基は、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上または７日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含むか、またはそれからなる。最も有利には、本発明に従うペプチドリガンドは、１日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含むか、またはそれからなる。
官能基には、一般に、結合基、薬物、その他の物質の結合のための反応性基、大環状ペプチドの細胞内への取り込みを助ける官能基、および同類のものが含まれる。
ペプチドが細胞を透過する能力により、ペプチドは細胞内標的に対して効果的となることができる。細胞を透過する能力をもつペプチドによって接近することのできる標的としては、転写因子、チロシンキナーゼなどの細胞内シグナル分子、およびアポトーシス経路に関与する分子が挙げられる。細胞の透過を可能にする官能基としては、ペプチドかまたは分子足場のいずれかに付加されたペプチドまたは化学基が挙げられる。ペプチドは、例えばＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）由来ペプチド、例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００７）Ｖｏｌｕｍｅ ３５，ｐａｒｔ ４，ｐ８２１「Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｅｎａｂｌｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ」および「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」ｂｙ Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００４）Ｖｏｌｕｍｅ ５７ ９６３７に記載される通りである。血漿膜を貫通する転位で効率的であることが示された短いペプチドの例としては、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の１６アミノ酸ペネトラチンペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌｕｍｅ ２６９ ｐ１０４４４「Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｈｅｌｉｘ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」）、１８アミノ酸「両親媒性ペプチドモデル」（Ｏｅｈｌｋｅ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔｓ Ｖｏｌｕｍｅ １４１４ ｐ１２７「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｎ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｍｏｄｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｄｅｌｉｖｅｒ ｐｏｌａｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｎｏｎ−ｅｎｄｏｃｙｔｉｃａｌｌｙ」）およびＨＩＶ ＴＡＴタンパク質のアルギニン富化領域が挙げられる。ペプチド以外のアプローチとしては、生体分子に容易に結合することのできる小分子模倣物またはＳＭＯＣの使用が挙げられる（Ｏｋｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌｕｍｅ ４ ｐ１５３’Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｉｍｉｃｓ ｏｆ ａｎ ａ−ｈｅｌｉｘ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ’）。分子にグアニジウム基を付加するその他の化学戦略も、細胞の透過を強化する（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｖｏｌｕｍｅ ２８２ ｐ１３５８５「Ｇｕａｎｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ Ｎｅｏｍｃｙｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｓ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｇｏ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｕｌｐｈａｔｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ」）。ステロイドなどの低分子量分子を、分子足場に付加して細胞内への取り込みを強化することができる。
ペプチドリガンドと結合することのできる官能基の一つの種類には、抗体およびその結合断片、例えばＦａｂ、Ｆｖまたは単一のドメイン断片などが含まれる。特に、インビボでペプチドリガンドの半減期を増大する能力のあるタンパク質と結合する抗体を使用することができる。
多くの細胞上に存在するインテグリンと結合するＲＧＤペプチドも組み込むことができる。
一実施形態では、本発明に従うペプチドリガンド−エフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上または２０日以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明に従うペプチドリガンド−エフェクター基または組成物は、１２〜６０時間の範囲内のｔβ半減期を有する。さらなる実施形態では、それは１日以上のｔ半減期を有する。さらなる実施形態ではなお、それは１２〜２６時間の範囲内である。
官能基には、薬物、例えば癌治療のための細胞傷害性薬剤が含まれる。これらには、アルキル化剤、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン、ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イフォスファミドなど；プリン類似体アザチオプリンおよびメルカプトプリン））またはピリミジン類似体を含む代謝拮抗薬；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンなどのビンカアルカロイドを含む、植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド；本来タキソールとして公知のパクリタキセルを含む、タキサン；カンプトテシン類、つまりイリノテカンおよびトポテカンを含む、トポイソメラーゼ阻害剤、ならびに、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドを含む、タイプＩＩ阻害剤が含まれる。さらなる薬剤には、免疫抑制剤ダクチノマイシン（腎臓移植で使用される）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンなどを含む抗腫瘍性抗生物質が含まれ得る。
また、可能性のあるエフェクター基には、酵素、例として酵素／プロドラッグ療法で使用するためのカルボキシペプチダーゼＧ２などが含まれ、ここで、ペプチドリガンドがＡＤＥＰＴにおける抗体に代わる。
（ｖｉｉ）合成
注目すべきは、ひとたび目的のポリペプチドが本発明に従って単離または同定されると、それに続くその合成は、可能な限り簡略化することができることである。例えば、目的のポリペプチド配列を決定することができ、それは標準的な技法により合成によって製造した後、インビトロで分子足場と反応させることができる。これを実施する場合、遺伝的にコードされた担体粒子の官能価または完全性を保存する必要はもはやないので、標準的な化学を使用することができる。これにより、さらなる下流の実験または検証のための可溶性材料の迅速な大規模調製が可能となる。この点において、本発明の方法により同定された候補化合物またはリード化合物の大規模調製は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌに開示されるような従来の化学を用いて達成することができ得る。
従って、本発明はまた、本明細書に記載されるように選択されるポリペプチドまたは抱合体の製造にも関し、この際、製造は、下に説明されるように任意選択のさらなるステップを含む。最も好適にはこれらのステップは、ファージではなく、化学合成により製造された最終生成物ポリペプチド／抱合体で実行される。
所望により、抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を例えば、初期の単離／同定ステップの後に製造する場合に、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換してもよい。
また、ペプチドを伸長して、例えば別のループを組み込み、その結果多重特異性を導入することができる。
ペプチドを伸長するために、標準的な固相または液相化学を用いてそのＮ末端またはＣ末端でペプチドを化学的に簡単に伸長することができる。標準的なタンパク質化学を用いて活性化可能なＮまたはＣ末端を導入すればよい。あるいは、断片縮合またはネイティブ・ケミカル・ライゲーションにより、例えば（Ｄａｗｓｏｎ ＰＥ，Ｍｕｉｒ ＴＷ，Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ，Ｋｅｎｔ，ＳＢＨ．１９９４．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）に記載されるように、または酵素により、例えば（Ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ：ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｈａｎｇ ＴＫ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＤＹ，Ｂｕｒｎｉｅｒ ＪＰ，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４ Ｄｅｃ ２０；９１（２６）：１２５４４−８またはＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｔａｇｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ ｗｉｔｈ ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅ １８，Ｉｓｓｕｅ ２２，１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８，Ｐａｇｅｓ ６０００−６００３ Ｔａｇｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ ｗｉｔｈ ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；Ｈｉｋａｒｉ Ａ．Ｉ．Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｓａｍｉ Ｍａｈｒｕｓ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｗｅｌｌｓ）に記載されるようにサブチリガーゼを用いて、付加を作製してもよい。
あるいは、ジスルフィド結合によるさらなるコンジュゲーションにより、ペプチドを伸長または修飾してよい。これは、第１および第２のペプチドを細胞の還元環境内で一度お互いから解離させるというさらなる利点を有する。この場合、分子足場（例えばＴＢＭＢ）を、３つのシステイン基と反応するように第１のペプチドの化学合成の間に付加することができた；次に、さらなるシステインを第１のペプチドのＮ末端に付加して、このシステインが第２のペプチドの遊離システインとだけ反応するようにすることができた。
同様の技法は、２つの二環式かつ二重特異性大環状分子の合成／カップリングに等しく適用し、四重特異性分子を作成する可能性がある。
さらに、その他の官能基またはエフェクター基の付加を、同じ方法で、適切な化学を用いて、ＮもしくはＣ末端でのカップリングにより、または側鎖を介して達成してよい。好適には、カップリングは、いずれの物質の活性も遮断しないような方法で行われる。
（Ｂ）ペプチドリガンドのレパートリ
（ｉ）ライブラリの構築
選択を目的とするライブラリは、当分野で公知の技法、例えばＷＯ２００４／０７７０６２号に記載されるような技法、または、本明細書に記載されるファージベクター系を含む生物系を用いて構築することができる。その他のベクター系は、当分野で公知であり、それにはその他のファージ（例として、ファージλ）、細菌プラスミド発現ベクター、真核細胞系発現ベクター（酵母ベクターを含む）、および同類のものが挙げられる。
非生物系、例えば、ＷＯ２００４／０７７０６２号に記載されるようなものなどは、従来の化学スクリーニングアプローチに基づいている。それらは単純であるが、ペプチドリガンドの大きなライブラリをスクリーニングすることは不可能であるか、または少なくとも実行不可能なほどに面倒であるので、生物系の能力に欠く。しかし、それらは、例として、ごく少数のペプチドリガンドをスクリーニングする必要がある場合に有用である。しかし、そのような個別のアッセイによるスクリーニングは、時間がかかる可能性があり、特定の標的との結合について試験することのできる独自分子の数は、一般に１０６の化学物質を超えない。
その一方、生物学的スクリーニング法または選択法は、一般に、それより非常に大きな数の異なる分子のサンプリングが可能である。従って、本明細書の適用において、生物学的方法がより好適に使用される。生物学的手順において、分子は単一の反応容器中でアッセイされ、好ましい特性（すなわち結合）をもつものは、不活性分子から物理的に分離される。１０１３より多くの個々の化合物を同時に生成しアッセイすることを可能にする選択戦略が利用できる。強力な親和性選択技法のための例は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはＲＮＡ／ＤＮＡアプタマー法である。これらの生物学的なインビトロでの選択法は、リガンドレパートリがＤＮＡまたはＲＮＡによりコードされることを共通して有する。それらは、配列決定により選択されたリガンドの増殖および同定を可能にする。ファージディスプレイ技術は、例えば、事実上いかなる標的に対しても非常に高い結合親和性をもつ抗体の単離に使用されている。
生物系を使用する場合、ひとたびベクター系を選択し、目的のポリペプチドをコードする１以上の核酸配列をライブラリベクターにクローニングすると、発現よりも前に変異誘発を行うことによりクローン分子の中に多様性を生成することができる。あるいは、変異誘発および追加の回の選択の前に、コードされたタンパク質を発現させ、選択することが好ましい。
そのようなアプローチは、本明細書に記載されるペプチドリガンドの親和性成熟に特に適応される。例えば、第１および第２の標的に結合するペプチドリガンドの第１および第２のレパートリを合わせ、得られる第３のレパートリを、該レパートリをコードする核酸ライブラリメンバーの変異誘発による親和性成熟に供する。
構造上最適化されたポリペプチドをコードする核酸配列の変異誘発は、標準的な分子法により実行される。特に有用なものは、ポリメラーゼ連鎖反応、またはＰＣＲ、（Ｍｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）である。ＰＣＲは、目的の標的配列を増幅するために熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ複製の複数のサイクルを使用し、当分野で周知である。様々な抗体ライブラリの構築は、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２，４３３−５５、およびそこに引用される参照文献において考察されている。
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ、り有用には、１〜１０００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。各々の配列はプールの分子のほんの小さな部分により表され、後の増幅サイクルで量が制限されるようになるので、プライマープールが極めて異種である場合には、より多くの量のプライマーを使用することが有利であり得る。典型的な反応混合物には、２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液１（米国カリフォルニア州フォスターシティ、パーキンエルマー社製）、０．４μｌの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、０．１５μｌ（または２．５単位）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州フォスターシティ、パーキンエルマー社製）および脱イオン水が、全容積が２５μｌとなるように含まれる。１．鉱油を重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲサイクルの各々のステップの長さおよび温度、ならびにサイクルの数を、事実上ストリンジェンシー要件に従って調節する。アニーリング温度およびタイミングは、両方ともプライマーが鋳型にアニールされると予測される効率および許容されるはずであるミスマッチの程度により決定される。明らかに、核酸分子が同時に増幅および変異誘発される場合、少なくとも第１回の合成において、ミスマッチが必要とされる。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、十分に当業者の知識の範囲内である。３０℃〜７２℃の間のアニーリング温度を使用する。鋳型分子の初期変性は、通常９２℃〜９９℃の間で４分間起こり、それに続いて変性（９４〜９９℃、１５秒〜１分間）、アニーリング（上述のように決定した温度で、１〜２分）、および伸長（７２℃、１〜５分間、増幅産物の長さによって決まる）からなるサイクルを２０〜４０回行う。最終伸長は一般に７２℃で４分間であり、その後に４℃の不定（０〜２４時間）ステップが続いてよい。
あるいは、本発明に従う短い鎖長のポリペプチドが与えられれば、変異体を好ましくはデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成し、適した発現ベクターに挿入する。ペプチド合成は、上記のように、当分野で公知の標準的技法により実行することができる。自動ペプチド合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ４３３（米国カリフォルニア州フォスターシティ、アプライドバイオシステムズ社）などが、広く利用可能である。
（ｉｉ）遺伝的にコードされた多様性
目的のポリペプチドは、好適には遺伝的にコードされる。これにより、取扱いの容易さとともに多様性の増加という利点がもたらされる。遺伝的にコードされたポリペプチドライブラリの一例は、ｍＲＮＡディスプレイライブラリである。別の例は、ファージディスプレイライブラリなどの複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）ライブラリである。好適には、目的のポリペプチドは、ファージディスプレイライブラリとして遺伝的にコードされる。
従って、好適には本発明の複合体は、ファージ粒子などの複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）を含む。これらの実施形態では、好適には核酸は、ファージゲノムに含まれる。これらの実施形態では、好適にはポリペプチドはファージコートに含まれる。
一部の実施形態では、本発明を用いて、いくつかの核酸を対応するポリペプチドに翻訳し、前記分子足場の分子を前記ポリペプチドに連結することにより生成されるポリペプチドの、遺伝的にコードされたコンビナトリアルライブラリを作製することができる。
遺伝的にコードされた、ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイにより作製することができる。
好適には、遺伝的にコードされた、ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリは、ファージディスプレイにより作製される。ファージディスプレイ実施形態では、好適にはポリペプチドは、下に記載されるものなどの確立された技法に従ってファージに提示される。最も好適には、そのようなディスプレイは、目的のポリペプチドと、目的のポリペプチドの、外部ディスプレイを可能にする操作された遺伝子との融合により達成される；好適には前記操作された遺伝子は、ファージの操作された遺伝子９（ｐ９または遺伝子ＩＸ）、遺伝子８（遺伝子ＶＩＩＩ）、遺伝子７（ｐ７または遺伝子ＶＩＩ）、遺伝子６（ｐ６または遺伝子ＶＩ）または遺伝子３（ｐ３または遺伝子ＩＩＩ）を含む。これらのタンパク質は、ＴＢＭＢなどの分子足場と反応し、副生成物を生じることができるシステインをわずかしか、または全く含まないという利点をもたらす。ｐ６に関して、システイン８４をセリンに変異させることが有利である。ｐ７およびｐ９のシステインは、埋没する可能性が最も高く、そのためにそれらは必ずしも変異させて除去する必要はない。ｐ８は、それがシステイン残基を含まないという利点をもたらす。従って、より好適には、前記操作された遺伝子は、ファージの操作された遺伝子８（遺伝子ＶＩＩＩ）、遺伝子６（遺伝子ＶＩ）または遺伝子３（遺伝子ＩＩＩ）を含む。
最も好適には、そのようなディスプレイは、目的のポリペプチドの、ドメイン１および２のシステイン残基を欠く操作された遺伝子３タンパク質との融合により達成される。この融合は、当分野で公知の任意の適した技法、例えば、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードする核酸を操作して、システインをコードするコドンをその他のアミノ酸（１または複数）をコードするコドン（１または複数）に変えることにより、かつ、ポリペプチドをファージ粒子の外部で遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質として提示されるように、ポリペプチドをコードする核酸配列をインフレームの遺伝子ＩＩＩコード配列に挿入することにより達成することができる。
本発明の利益は、得られる操作された遺伝子（１または複数）が、ファージを感染性にする、すなわち感染および増殖を可能にすることである。たとえ操作された遺伝子が遺伝子３以外の遺伝子であっても、（例えば遺伝子６または遺伝子８）、１以上のシステイン残基（例えば全てのシステイン残基）を除去するように遺伝子３を操作することがなお望ましいと思われる。
好ましい実施形態では、本発明の遺伝的にコードされたポリペプチドは、核酸を翻訳し、生成されたポリペプチドを前記コードに関連付けることにより生成される。表現型と遺伝子型が連携することにより、コードされたリガンドレパートリを増殖または解読することが可能となる。ポリペプチドをそのポリヌクレオチドコードに関連付けるための様々な技法が利用できる。これらの技法としては、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母ディスプレイおよび細菌ディスプレイなどが挙げられる。１０１３までの個別メンバーを含む、コードされたポリペプチドレパートリが前記方法で作製されている。本発明に従って生成することのできる個別リガンドの数は、従来のスクリーニングで一般にアッセイされる個別分子の数を明らかに凌いでいる。
好ましい実施形態では、ファージディスプレイ技術を用いて本発明のポリペプチドを遺伝的にコードする。ファージディスプレイは、ポリペプチドの遺伝子をファージコートタンパク質の遺伝子と融合させる方法である。ファージを細菌細胞で産生させる場合、ポリペプチドはコートタンパク質の融合体として発現させる。ファージ粒子を集合させると、ポリペプチドはファージの表面上に提示される。ファージレパートリを固定化した抗原に接触させることにより、一部のファージは抗原に結合したまま残るが、その他のファージは洗浄により除去される。ファージを溶離して増殖させることができる。選択されたファージのポリペプチドをコードするＤＮＡを配列決定することができる。ファージディスプレイを用いて１０１０より多くの個別ポリペプチドをコードしてよい。ファージディスプレイの好ましい態様は、一本鎖ＤＮＡである遺伝コードをコートの中に詰め込むことである。コートはＤＮＡを分子コアとの反応から保護することができる。
もう一つの好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドライブラリは、遺伝子３タンパク質融合体としてファージ上に提示される。各々のファージ粒子は、前記ファージコートタンパク質約３〜５コピーを有する。修飾したポリペプチドの複数のコピーをディスプレイする結果として、マイクロモルの親和性をもつリガンド（弱いバインダー）も、ファージ選択で単離され得る。あるいは、ファージミドを用いてファージあたりのポリペプチドの数を減らして結合活性効果を回避し、親和性のより高いリガンドを選択する。
もう一つの好ましい実施形態では、修飾したコートタンパク質を含むファージを、本発明のポリペプチドライブラリをコードするために使用する。特に、コートタンパク質において特定の種類のアミノ酸を欠くかまたは特定の種類のアミノ酸の減少したファージを使用する。前記コートタンパク質を使用することは、分子コアが前記特定の種類のアミノ酸に対して反応性である場合に有利であり得る。これは、明らかに、分子コアを架橋するための提示されたポリペプチドの反応性基が天然アミノ酸であり、同じ種類の天然アミノ酸がファージコートの表面露出領域に存在する場合の事例である。前記ファージを修飾したコートタンパク質とともに使用することにより、複数のファージのアミノ酸と、同じ分子コアとの反応によってファージ粒子の架橋を防ぐことができる。その上、前記ファージを使用することにより、ポリペプチドの反応性基のアミノ酸側鎖と、ファージコートタンパク質のアミノ酸側鎖の両方と、同じ分子コアとの架橋を減らすことができる。
さらにもう一つの好ましい実施形態では、ドメイン１および２においてジスルフィド架橋Ｃ７−Ｃ３６、Ｃ４６−Ｃ５３、Ｃ１８８−Ｃ２０１のシステイン残基を欠く遺伝子３タンパク質を含むファージを用いて、本発明のポリペプチドライブラリを提示する。前記位置（Ｃ７Ｃ、Ｃ３６Ｉ、Ｃ４６Ｉ、Ｃ５３Ｖ、Ｃ１８８Ｖ、Ｃ２０１Ａ）における突然変異、および熱安定性の低下を補うための遺伝子３タンパク質中の１４個のさらなる突然変異（Ｔ１３Ｉ、Ｎ１５Ｇ、Ｒ２９Ｗ、Ｎ３９Ｋ、Ｇ５５Ａ、Ｔ５６Ｉ、Ｉ６０Ｖ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、Ｎ１３８Ｇ、Ｌ１９８Ｐ、Ｆ１９９Ｌ、Ｓ２０７Ｌ、Ｄ２０９Ｙ）を含むファージが、Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｆ．Ｘ．および共同研究者ら（Ｋａｔｈｅｒ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００５）により作成された。前記マイナーコートタンパク質中のチオール基を含まないファージは、ポリペプチドを分子コアに架橋するための１以上の官能性アミノ酸がシステイン残基である場合に適している。ファージコートタンパク質中のシステイン残基を除去することは、ポリペプチドと分子足場との間の前記結合反応へのシステイン残基の干渉を防ぐ。
本発明で適用するためのこの例となるファージをこれからより詳細に説明する。
ＦＸ Ｓｃｈｍｉｄのジスルフィドを含まないファージ（ドメインＤ１−Ｄ２）は、ベクターｆＣＫＣＢＳに由来するｆｄファージを含む（Ｋｒｅｂｂｅｒ，Ｃ，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）。ベクターｆＣＫＣＢＳは、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：１５６６９−Ｂ２）に由来するｆｄファージベクターに基づく。
野生型ｆｄファージのｐ３のドメイン１および２のアミノ酸配列は、公に、例えばＰｕｂＭｅｄデータベースにおいて入手可能である。参照が容易なように、例となる配列は、
ＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＲＹＡＮＹＥＧＣＬＷＮＡＴＧＶＶＶＣＴＧＤＥＴＱＣＹＧＴＷＶＰＩＧＬＡ
ＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＴＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳ
ＱＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＣＡＦ
ＨＳＧＦＮＥＤＰＦＶＣＥＹＱＧＱＳＳＤＬＰＱＰＰＶＮＡＰＳＧ
である。
ＦＸ Ｓｃｈｍｉｄおよび共同研究者らは、４個のアミノ酸を変異させることにより、このファージのｐ３を進化的に安定化させた（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ，ＦＸ．，２００３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）。継続的な研究においてＦＸ Ｓｃｈｍｉｄおよび共同研究者らは、６個のシステインを変異させて３個のジスルフィド架橋を除去し、さらなる突然変異を挿入して安定性の喪失を補った（Ｋａｔｈｅｒ，Ｉ．ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ ＦＸ．，２００５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）。複数の進化サイクルにおいて、彼らは、熱安定性を変えた、全てがジスルフィドを含まないｐ３を有するクローン１９、２０、２１、および２３を生成した。
変異株２１（「クローン２１」）は、記載される通りに作成してもよいし、または簡単にＦＸ Ｓｃｈｍｉｄおよび共同研究者らより入手してもよい。ＦＸ Ｓｃｈｍｉｄの出版物によれば、このクローンは、ドメイン１および２に次の変異を含む：Ｃ７Ｓ、Ｔ１３Ｉ、Ｎ１５Ｇ、Ｒ２９Ｗ、Ｃ３６Ｉ、Ｎ３９Ｋ、Ｃ４６Ｉ、Ｃ５３Ｖ、Ｇ５５Ａ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、Ｃ１８８Ｖ、Ｆ１９９Ｌ、Ｃ２０１Ａ、Ｄ２０９Ｙ。その上、本発明者らは、クローンを配列決定してそれを野生型ｆｄファージと比較した時に、次の変異をドメイン１および２に見出した：Ｐ１１ＳおよびＰ１９８Ｌ。理論に縛られることを望むものではないが、これらの変異はベクターｆＣＫＣＢＳのファージに既に存在していたと考えられる。
クローン２１のドメインＤ１およびＤ２は、次のアミノ酸配列：
ＡＥＴＶＥＳＳＬＡＫＳＨＩＥＧＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＷＹＡＮＹＥＧＩＬＷＫＡＴＧＶＶＶＩＴＧＤＥＴＱＶＹＡＴＷＶＰＩＧＬＡ
ＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＩＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳ
ＨＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＶＡＦ
ＨＳＧＦＮＥＤＬＬＶＡＥＹＱＧＱＳＳＹＬＰＱＰＰＶＮＡＰＳＧ
を有する。
一実施形態では、スクリーニングは、本発明のライブラリを標的に接触させ、前記標的に結合する１以上のライブラリメンバーを単離することにより実施されてよい。
もう一つの実施形態では、前記ライブラリの個々のメンバーを、スクリーニングにおいて標的と接触させ、前記標的に結合する前記ライブラリのメンバーを同定する。
もう一つの実施形態では、前記ライブラリのメンバーを、同時に標的に接触させ、前記標的に結合する前記ライブラリのメンバーを選択する。
標的（１または複数）は、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。
標的は、受容体、受容体リガンド、酵素、ホルモンまたはサイトカインであってよい。
標的リガンドは、原核生物タンパク質、真核生物タンパク質、または古細菌タンパク質であってよい。より具体的には、標的リガンドは、哺乳動物タンパク質または昆虫タンパク質または細菌タンパク質または真菌タンパク質またはウイルスタンパク質であってよい。
標的リガンドは、酵素、例えばプロテアーゼであってよい。
注目すべきは、本発明が、本発明に従うスクリーニングから単離されたライブラリメンバー（１または複数）も包含することである。好適には、本発明のスクリーニング法（１または複数）は、前記標的に結合する能力があるとして単離された一定量の本発明の複合体を製造するステップをさらに含む。
本発明はまた、本発明に従うスクリーニングにより単離されているか、または単離されることのできるライブラリメンバーにも関し、前記メンバーは、その後に本発明の複合体の一部である時に前記ポリペプチドをコードする核酸をさらに用いることなく、生成／製造される。例えば、適した本発明の方法は、分子足場をポリペプチドに結合させることによる、本発明の方法により単離または同定された一定量のポリペプチドを製造する追加のステップをさらに含み、前記ポリペプチドは組換えによって発現されるかまたは化学的に合成される。例えば、この実施形態でポリペプチドが組換えによって合成される場合、本来本発明の複合体の一部としてポリペプチドをコードする核酸は、もはや直接的に存在しないが、中間ステップ、例えば複合体の元の核酸のＰＣＲ増幅またはクローニングステップでは存在していた可能性があり、この追加のステップでポリペプチドを合成することのできる鋳型核酸の製造がもたらされる。
本発明はまた、２本よりも多くのループを有するペプチドリガンドに関する。例えば、分子足場に連結された三環式ポリペプチドは、本発明に従う分子足場に連結された二環式ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端を連結することにより作成することができる。このように、連結されたＮ末端およびＣ末端は第３のループを作成し、三環系ポリペプチドを作製する。この実施形態は、好適にはファージ上で実行されず、好適には本発明のポリペプチド−分子足場抱合体上で実行される。Ｎ末端およびＣ末端を連結することは、日常的なペプチド化学のことである。何らかの指針が必要な場合は、Ｃ末端を活性化させ、かつ／またはＮ末端およびＣ末端を伸長させて、例えばシステインを各々の末端に付加した後、ジスルフィド結合によりそれらを連結すればよい。あるいは、Ｎ／Ｃ末端に組み込んだリンカー領域を用いることにより連結を達成してもよい。あるいは、Ｎ末端およびＣ末端を従来のペプチド結合により連結してもよい。あるいはＮ末端およびＣ末端を連結するための任意のその他の適した手段を用いてよい、例えばＮ−Ｃ−環化を、例えば、Ｌｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９０，６７１−６８２（２００８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ− ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎ− ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」に、またはＨｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１ ，１０２６− １０３４（２００８）「ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｒａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｄｒｕｇ ｌｅａｄ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｂｅｓｉｔｙ」に開示されるような、標準的な技法によって行うこともでき得る。そのような三環式分子の一つの利点は、特にエキソプロテアーゼ作用による、遊離末端のタンパク質分解の回避である。この性質の三環系ポリペプチドのもう一つの利点は、第３のループを、一般に適用可能な機能、例えばＢＳＡ結合、細胞侵入もしくは輸送作用、タギングまたは任意のその他のそのような使用などに利用することができることである。この第３のループは、一般に選択に利用可能でない（それはファージ上でなくポリペプチド−分子足場抱合体上でのみ生成されるため）、そのためその他のそのような生物学的機能にそれを使用することで、さらに有利にはループ１と２の両方が特異性の選択／創造のために残されることが注目される。従って、本発明はまた、そのような三環式ポリペプチドならびにその製造および使用に関する。
本発明は、遺伝的にコードされた化合物ライブラリを標的リガンドと接触させるための方法、および前記標的リガンドと結合するリガンドを同定するためのさらなる方法を提供する。遺伝的にコードされた化合物ライブラリは、スクリーニングかまたは選択手順のいずれかによりアッセイされる。
スクリーニング手順では、ライブラリの個々のメンバーがアッセイされる。ライブラリの個々のメンバーの複数のコピーは、例えば標的リガンドとともにインキュベートされる。ライブラリのメンバーを接触させる前または後に標的リガンドを固定化し、結合しなかったメンバーを洗浄により除去する。結合リガンドは、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で検出する。標的リガンドに結合したライブラリのメンバーのアミノ酸配列を、遺伝コードの配列決定により決定する。
選択手順では、コードされた化合物ライブラリの複数のメンバーを１以上の標的と接触させる。ライブラリのメンバーを接触させる前または後に標的を固定化し、結合しなかったメンバーを洗浄により除去する。結合リガンドの遺伝暗号を配列決定する。あるいは、選択されたリガンドを増殖させてさらなる選択回を実施する。
本発明の一実施形態では、化合物ライブラリは、ファージディスプレイによりコードされ、選択は、ファージパニングにより実施される。
（ｉｉｉ）ファージ精製
ファージの精製のためのどんな適した手段を使用してもよい。本発明では標準的技法が適用され得る。例えば、ファージは、濾過またはＰＥＧ沈殿などの沈殿により精製することができる；ファージ粒子は、既に記載したようにポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）沈殿により製造および精製することができる。
さらなる指針が必要な場合は、Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２００４ １７（１０）：７０９−７１３．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｒｏｍ ｃｈｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．）に言及する。好適には、ファージは該文献中で教示される通り精製され得る。この出版物の内容は、ファージ精製の方法について参照により本明細書に具体的に援用される；特にＪｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌの７０９頁の右欄の部分から始まる材料および方法の節を参照する。
さらに、ファージは、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ｖｏｌ ２２２ ｐｐ５８１−５９７により公開される通り精製されてよく、該文献は、どのようにファージ製造／精製を実施するかの詳細な説明を参照することにより本明細書に具体的に援用される。
何らかの指針が必要な場合は、ファージを以下のように還元し、精製すればよい。約５×１０１２ファージ粒子を１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）と室温にて３０分間反応させ、次いでＰＥＧ沈殿させる。水ですすいだ後、ペレットを１ｍｌの反応バッファー（１０ｍＭリン酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）に再懸濁する。次に、ファージを所望により５０μｌの１．６ｍＭのＮ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤＩＡ）（分子プローブ）と室温にて２時間反応させるか、またはより好適には、本明細書に記載される分子足場と反応させる。反応は、ファージ粒子のＰＥＧ沈殿で終了する。
ファージを製造／精製することのできるなお一層さらなる方法は、Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓｅ（Ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍ１３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １２９（１）：１６９−７２，１９７９）に教示される通りである。この出版物は、一本鎖ＤＮＡを鋳型として必要とする、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）の鎖終結ＤＮＡ塩基配列決定法を扱っている。Ｍ１３ファージＤＮＡは、一本鎖として存在するため、Ｍ１３にクローニングされるあらゆるＤＮＡ配列は、この形態で容易に得ることができる。ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅは、Ｍ１３一本鎖ＤＮＡが、配列決定の鋳型として使用するのに十分純粋であり、ファージ粒子の簡単な遠心分離およびフェノールでの抽出により調製することができることを示す。ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅの出版物は、ファージの生成の方法について参照することにより本明細書に具体的に援用される。疑いを避けるために、フェノール抽出は核酸精製を目的とするため、本発明に従う複合体を作成するためにはフェノール抽出は実施しない。従って、ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅのフェノールステップは、好適には除外される。ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅの方法には、精製されたファージ粒子の時点までしか従わない。
従って、ファージの精製のための当分野で周知の無数の技法が存在する。本発明の状況において、そのような精製は、分子足場との結合のために、特にそのような結合がシステイン残基を解する場合に、目的のポリペプチド中の反応性基を還元するために使用した還元剤を除去するために使用される。
所望により、下の反応化学の節で考察される、ファージ精製に特に有利な技法を採用してもよい。これらの技法は本発明に不可欠と見なされるものではないが、特に役立つ方法に相当するか、または本発明のファージ粒子を作製する最善の様式でさえあり得ることを明確に注意するべきである。しかし、分子足場の結合の前の還元剤の除去の段階で、ファージ上の還元した官能基／反応性基の再酸化を回避することに注意が払われているならば、原則としてどんな技法を用いてこれを達成してもよい。記載される濾過技法は、効果的であるが、標準的な技法よりも複雑になってもいるので、操作者が、彼らの本発明の特定の作業に最も適している技法を選ぶことになる。
（ｉｖ）反応化学
先行技術のポリペプチドの修飾のための技術は、厳しい化学および独立したポリペプチド修飾反応を伴ってきた。一方、本発明は、有利には生成物の遺伝的にコードされたエレメントの機能および完全性を保持するポリペプチドの修飾のための化学条件を利用する。具体的には、遺伝的にコードされたエレメントが、それをコードするファージの表面に提示されたポリペプチドである場合、その化学は有利にはファージの生物学的完全性を損なわない。これらの化学反応を増強または促進することのできる限られた枠の条件が存在することが本明細書に開示されている。特に、下により詳細に説明されるが、使用する溶媒および温度が効率的な反応に重要である。さらに、使用する試薬の濃度も、正確な結合を促進するのに役立ち、さらに修飾されているポリペプチド部分の架橋または損傷を回復または除去するのに役立つ。
特に、ポリペプチド中のシステインの還元が、最も効率的な反応に必要とされることが開示されている。明らかに、それらのシステインを化学的に還元するために使用した還元剤は、所望の結合を実施するために除去されねばならない。一つの公知の技法は、沈殿反応においてファージ粒子などの粒子を沈殿させるために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）をシステインの還元のために使用すること、および還元剤の除去のために使用することである。そのような沈殿反応は、一般に２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、ファージ粒子の沈殿を導く２．５モルのＮａＣｌとともに含む。しかし、重要なことは再酸化を回避することである。下により詳細に開示されるように、脱気した緩衝液の使用、反応混合物中でのキレート剤の使用、および粒子を抽出するための濾過の使用、またはＴＢＭＢの存在下で低濃度のＴＣＥＰの使用を含む、一連の戦略に解決法が見出される。
例えば分子足場とポリペプチドの結合のための反応条件は、注意深く選択するべきである。条件の選択は、本発明が適用される用途に応じて非常に変動する可能性がある。ポリペプチドがファージ粒子に含まれる場合には特別な注意が必要である。本明細書および実施例の節全体にわたって指針が提供されている。
反応温度、分子足場濃度、溶媒および／またはｐＨのような反応条件は、ポリペプチドの反応性基と分子足場との効率的な反応を可能にするが、単離分子を（例えば、配列に対して）解読することを可能にする、および／あるいは単離分子を（例えば、ＰＣＲによるか、またはファージ増殖によるか、または任意のその他の適した技法で）増殖させる条件で、ポリペプチドをコードする核酸を残すように選択するべきである。さらに、反応条件は、ファージコートタンパク質を、それがファージを増殖させる条件で残すべきである。
ファージにコードされるポリペプチドのチオール基は、分子足場結合の前に還元剤で還元されてよい。そのような実施形態では、特にファージディスプレイ実施形態では、または特に還元剤がＴＣＥＰである場合には、過剰な還元剤は、濾過、例えば、ファージの濾過により除去することが好適である。
本発明において、一方では、コードされたポリペプチドを分子足場に効率的に連結させ、他方では、付加した核酸（およびファージコートタンパク質）を増殖または解読を可能にする条件に残す、反応条件が適用される。前記反応条件は、例えば反応温度、分子足場濃度、溶媒組成物またはｐＨである。
本発明の一実施形態では、システイン残基のチオール基を、ポリペプチドを分子コアと連結させる反応性基として使用する。一部の化学反応には、ポリペプチドのチオール基を還元する必要がある。ファージ提示されたポリペプチドのチオール基は、例えばトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のような還元剤の添加により効率的に還元される。過剰な還元剤は結合反応に干渉し得るため、それは主としてファージの濾過により、またはＰＥＧ沈殿により除去されるが、結合反応の間に還元条件を維持するために低濃度（１０マイクロモル以下）が望ましいことがある。
チオール基の再酸化は、ペプチドと分子足場との反応にＴＣＥＰを含めることにより防ぐことができる。
チオール基の再酸化は、反応バッファーを脱気することにより好適に防止される。
また、チオール基の再酸化は、キレート化、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）によるキレート化による金属イオンの複合体形成により好適に防止される。
最も好適には、チオール基の再酸化は、ＴＣＥＰを分子足場の反応に含めることにより、キレート化により、かつ、脱気した緩衝液の使用により防止または阻害される。
本発明の一実施形態では、ポリペプチドと分子足場との結合は、ファージにコードされるポリペプチドのチオール基などのポリペプチドの反応性基を分子足場と１時間反応させることにより達成される。
好適には、それらは３０℃で反応させる。
好適には、それらは分子足場（例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼンなど）と１０μＭ〜４０μＭの濃度で反応させる。
好適には反応は、水性緩衝液中で行う。
好適には反応はｐＨ８で行う。
好適には反応バッファーは、アセトニトリルを含む。好適には反応バッファーは、２０％アセトニトリルを含む。
最も好適には、反応は、２以上の前記条件を特徴とする。好適には、反応は、３以上の前記条件を特徴とする。好適には、反応は、４以上の前記条件を特徴とする。好適には、反応は、５以上の前記条件を特徴とする。好適には、反応は、６以上の前記条件を特徴とする。好適には、反応は、前記条件の各々を特徴とする。
これらの反応条件を最適化してポリペプチドのチオール基とトリス（ブロモメチル）ベンゼンの反応性基とを定量的に反応させる。同じ反応条件下で、約２０％のファージ粒子は、増殖および解読のために遺伝暗号を細菌細胞に導くために感染性のままである。
一実施形態では、分子足場、例えばＴＢＭＢは、ポリペプチド、例えばファージにコードされるポリペプチドなどに、２０％のアセトニトリルを含有するｐＨ８の水性緩衝液中１０μＭ ＴＣＥＰの存在下、１０μＭのＴＢＭＢ（すなわち、トリス（ブロモメチル）ベンゼン）で３０℃にて１時間、ポリペプチドのチオール基を反応（インキュベーション）させることにより結合させることができる。もう一つの実施形態では、この反応は、同じ緩衝液中３０μＭ ＴＣＥＰの存在下、４０μＭのＴＢＭＢを用いて実行することができる。
本発明者らはまた、ファージ感染性への反応物中の分子足場の濃度の効果を開示する。特に、本発明は、好適には反応で用いられる分子足場の濃度を最小化する。言い換えれば、常に十分な分子足場がファージポリペプチドに連結されるならば、ファージのポリペプチドとの反応の時点で用いられる分子足場の濃度は低いほど、よい。このようにして存在する分子足場を最小化することの利点は、分子足場のカップリングの後のファージ感染性の保存に優れていることである。例えば、分子足場がＴＢＭＢである場合、分子足場の濃度が１００μＭより大きいと感染性を損ない得る。従って、好適には分子足場がＴＢＭＢである場合、好適には、ポリペプチドとの結合の時点で存在するＴＢＭＢの濃度は、１００μＭ未満である。
（Ｃ）本発明に従う二重特異性リガンドの使用
本発明の方法に従って選択された多重特異性ペプチドリガンドは、インビボでの治療および予防用途、インビトロおよびインビボでの診断用途、インビトロでのアッセイおよび試薬用途などで用いることができる。
上記に示唆されるように、本発明に従って選択された分子は、診断、予防および治療手技で有用である。一般に、二重特異性ペプチドリガンドの使用は、二重特異性抗体の使用に置換することができる。本発明に従って選択された二重特異性抗体は、ウエスタン解析および標準的な免疫組織化学法による原位置でのタンパク質検出において診断上有用である；これらの用途で使用するために、選択されたレパートリの抗体を当分野で公知の技法に従って標識してよい。その上、そのような抗体ポリペプチドは、クロマトグラフ保持体、例えば樹脂などと複合体化した場合には、アフィニティークロマトグラフィー法で準備として使用することができる。そのような技法は全て当業者に周知である。本発明に従うペプチドリガンドは、抗体の結合能に似た結合能を有し、そのようなアッセイにおいて抗体に置換することができる。
本発明に従う二重特異性リガンドの診断使用には、２つの標的が同時に結合できないように、２つの標的に競合して結合する（閉鎖型立体構造）二重特異性ペプチドリガンドの能力、またあるいは２つの標的に同時に結合する（開放型立体構造）能力、を利用する分析物のための均一アッセイが含まれる。
真のイムノアッセイ形式が、創薬開発で使用される診断アッセイ系および研究アッセイ系の製造業者らにより熱心に探究されている。主な診断マーケットとしては、病院、医院および診療所、商業的な基準検査室、血液バンク、および家庭でのヒト検査、非ヒト診断（例えば、食物検査、水質検査、環境検査、生体防御（ｂｉｏｄｅｆｅｎｃｅ）、および獣医学検査）、ならびに、最後に研究（創薬；基礎研究および学術研究を含む）が挙げられる。
現在、これらのマーケットは全て、化学発光、ＥＬＩＳＡ、蛍光または希少な例ではラジオイムノアッセイ技術を中心に構築されたイムノアッセイ系を利用している。各々のこれらのアッセイ形式は、分離ステップ（結合した試薬を非結合試薬から分離すること）を必要とする。一部の例では、数個の分離ステップが必要である。これらの追加ステップを加えることにより、試薬および自動化が加えられ、時間がかかり、アッセイの最終結果に影響が及ぶ。ヒト診断では、分離ステップは自動化することができ、この問題を遮蔽するが、除去はしない。ロボット工学、追加の試薬、追加のインキュベーション時間などは、相当なコストおよび複雑さを付加する。創薬、例えば、文字通り何百万のサンプルを同時に非常に低レベルの被検分子を用いて試験するハイスループットスクリーニングなどにおいて、追加の分離ステップを加えることは、スクリーニングを実施する能力を排除し得る。しかし、分離を回避することにより、読み出しにおいて過剰なノイズが生成される。従って、現行のアッセイ形式から得ることのできる範囲で感受性をもたらす真の均一形式が必要である。有利には、アッセイは、高感受性の完全定量的読み出しおよび大きなダイナミックレンジを有する。感受性は、必要なサンプル量を減らすことができるので重要な要件である。これらの両方の特徴は、均一系がもたらす特徴である。これは、ケア検査の点で、かつサンプルが貴重な創薬において非常に重要である。現在当分野で利用可能な不均一系は、大量のサンプルおよび高価な試薬を必要とする。
均一アッセイの用途には、癌検査が含まれ、癌検査で最大のアッセイは、前立腺癌について男性をスクリーニングする際に使用される前立腺特異的抗原のアッセイである。その他の用途としては不妊検査が挙げられ、これは妊娠に関するβ−ｈｃｇを含む、妊娠を試みる女性に一連の試験を提供する。肝炎、ＨＩＶ、風疹、ならびにその他のウイルスおよび微生物および性的に伝染する疾患を含む感染症。試験は、特にＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａ非Ｂ肝炎の試験が、血液バンクにより使用される。治療薬のモニタリング試験には、患者において処方薬のレベルを有効性についてモニタリングすること、ならびに、毒性を避けるためにモニタリングすることが含まれる（例えば不整脈に対してジゴキシン、精神病の場合にはフェノバルビタールレベル；喘息に対してテオフィリン）。
診断検査は、乱用薬物試験、例えばコカイン、マリファナなどについての試験においてさらに有用である。代謝検査は、甲状腺機能、貧血およびその他の生理学的障害および機能を測定するために用いられる。
均一な結合アッセイ形式は、標準的な臨床化学アッセイの製造においてさらに有用である。イムノアッセイおよび化学アッセイを同じ装置に封入することは、診断検査において非常に有利である。適した化学アッセイとしては、グルコース、コレステロール、カリウムなどの検査が挙げられる。
均一な結合アッセイのさらに主要な用途は、創薬開発である：ハイスループットスクリーニングには、超高容量でコンビナトリアル化学ライブラリを標的に対して試験することが含まれる。シグナルを検出し、次に陽性群をより小さな群に分け、最終的に細胞で、次いで動物で試験する。均一アッセイは、これらの全ての種類の試験で使用することができる。創薬では、特に動物実験および臨床試験においてイムノアッセイの頻繁な使用が行われる。均一アッセイは、これらの手順を大いに加速し、簡略化する。その他の用途としては、食品および飲料検査：大腸菌、サルモネラ菌などに対する食肉およびその他の食品の検査；水質検査（大腸菌を含む全種類の汚染物質についての水性植物での試験を含む）；ならびに獣医学検査が含まれる。
広範な実施形態では、本発明は、本発明に従う二重特異性ペプチドリガンドに結合した検出可能な薬剤を含む結合アッセイを提供し、その検出可能な特性は、分析物と前記二重特異性ペプチドリガンドとの結合により変更される。
そのようなアッセイは、各々が二重特異性ペプチドリガンドの上記特性を利用する、いくつかの異なる方法で企図されてよい。
二重特異性リガンドが閉鎖型の立体構造にある場合、アッセイは、分析物による薬剤の直接または間接的な置換の結果、薬剤の検出可能な特性の変化がもたらされることに依存する。例えば、薬剤が、検出可能なエンドポイントを有する反応を触媒する能力のある酵素である場合、前記酵素は、ペプチドリガンドによってその活性部位を妨げ、それにより酵素を不活化させるように結合され得る。これも二重特異性リガンドにより結合されている分析物は、酵素を置換し、活性部位を自由にすることにより酵素を活性化させる。次に、酵素は基質と反応する能力があり、検出可能な事象を生じさせる。代替実施形態では、ペプチドリガンドは、活性部位の外側の酵素に結合し、酵素の立体構造に影響を及ぼし、よってその活性を変更し得る。例えば、活性部位の構造は、リガンドの結合により制約され得る、または活性に必要な補因子の結合が妨げられ得る。
アッセイの物理的実施は、当分野で公知のどの形態をとってもよい。例えば、二重特異性ペプチドリガンド／酵素複合体を、試験ストリップの上に準備し；基質を該試験ストリップの異なる領域に準備し、分析物を含有する溶媒にリガンド／酵素複合体を通じて移動させ、酵素を置換し、それを基質領域に運んでシグナルを生成することができる。あるいは、リガンド／酵素複合体を試験スティックの上またはその他の固相に準備し、分析物／基質溶液に浸漬し、分析物の存在に応答して酵素を溶液中に放出させることができる。
分析物の各々の分子は一つの酵素分子を放出する可能性があるので、アッセイは定量的であり、所与時間内に生じたシグナルの強度は、溶液中の分析物の濃度に依存する。
閉鎖型の立体構造において分析物を用いるさらなる立体配置も可能である。例えば、二重特異性リガンドは、酵素のアロステリック部位に結合し、それにより酵素を活性化することが企図され得る。そのような実施形態では、酵素は分析物の不在下で活性である。分析物の添加により酵素は置換されてアロステリック活性化が失われ、従って酵素を不活化させる。
酵素活性を分析物濃度の尺度として用いる上記の実施形態の状況において、酵素の活性化または不活性化とは、酵素がシグナル生成反応を触媒する能力として測定される、酵素の活性の増加または低下をさす。例えば、酵素は、検出不能な基質のその検出可能な形態への変換を触媒し得る。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、商業的に入手可能な発色基質または化学発光基質とともに当分野で広く使用されている。酵素の活性の増加または低下のレベルは、１０％〜１００％の間、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％であってよい；活性の増加の場合には、増加は１００％より大きい、すなわち２００％、３００％、５００％またはそれ以上であってよく、あるいは、阻害酵素のベースライン活性が検出不能である場合には百分率として測定できなくてもよい。
さらなる立体配置では、二重特異性リガンドは、酵素よりも酵素／基質対の基質に結合し得る。そのため、分析物の結合を通じて二重特異性リガンドから基質が放出されるまで酵素には基質は利用できない。
この立体配置の実施は、酵素に結合する立体配置に関するものである。
さらに、蛍光がリガンドとの結合で消光されるような立体構造において、蛍光分子、例えばフルオレセインまたは別のフルオロフォアなどに結合するアッセイが企図され得る。この場合、分析物とリガンドとの結合は、蛍光分子を置換し、従ってシグナルを生じる。本発明において有用な、蛍光分子に対する代替物には、発光剤、例えばルシフェリン／ルシフェラーゼなど、および、ＨＲＰなどのイムノアッセイにおいて慣用される薬剤を含む発色剤が含まれる。
さらに、「開放型」立体構造で二重特異性リガンドを使用するアッセイが企図され得る。この立体構造では、二重特異性リガンドは、同時に２つの標的に結合する能力がある。例えば、第１の実施形態において、二重特異性リガンドが酵素および基質に結合するようなアッセイが企図されてよく、ここで酵素は基質に対して低い親和性を有し；かつ、酵素または基質のいずれかが分析物である。
基質と酵素の両方が二重特異性リガンドにより一緒にされる場合、この両者間の相互作用は増強され、シグナルの強化につながる。
あるいは、二重特異性リガンドは、上記のように蛍光分子に結合してよく、蛍光分子は分析物の結合により消光される。そのため、この実施形態では、蛍光は分析物の不在下で検出可能であるが、その存在下で消光される。
このようなアッセイの基本的実施は、上記に閉鎖型の立体構造アッセイについて記載される通りである。
本発明に従って調製される二重特異性リガンドの治療的使用および予防的使用は、本発明に従って選択されたリガンドのレシピエント哺乳動物、例えばヒトへの投与を伴う。二重特異性は、ペプチドリガンドを大きい結合活性で多量体抗原に結合させることができる。二重特異性ペプチドリガンドは、例えば腫瘍細胞株の死滅を媒介するための細胞傷害性Ｔ細胞の補充において、２つの抗原の架橋を可能にすることができる。
二重特異性はまた、一部の例では医学的状態の治療において有利である、２以上の標的の生物活性に拮抗することのできるペプチドリガンドの生成を可能にする。二重特異性はまた、一部の例では医学的状態の治療において有利である、２以上の標的でアゴニストとして作用することのできるペプチドリガンドの生成を可能にする。
均一性が少なくとも９０〜９５％の実質的に純粋なペプチドリガンドが、哺乳動物への投与に好ましく、製薬学的用途には、特に哺乳動物がヒトである場合に、均一性が９８〜９９％またはそれ以上であるのが最も好ましい。要望どおり部分的にまたは均質に、いったん精製されると、選択されたポリペプチドは、診断的または処理的に（体外を含む）またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの開発および実施において使用することができる（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ ａｎｄ Ｐｅｒｎｉｓ，（１９７９ ａｎｄ １９８１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。
本発明のペプチドリガンドは、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌もしくはウイルス感染、および自己免疫障害（それには、限定されるものではないが、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、クローン病および重症筋無力症が含まれる）を予防、抑制または治療する際の使用が見出される。
本出願において、用語「予防」は、疾患の誘発よりも前に保護用組成物を投与することを伴う。「抑制」とは、誘導性の事象の後であるが、疾患の臨床所見よりも前の組成物の投与をさす。「治療」は、疾患症状が明白となった後の保護用組成物の投与を伴う。
疾患に対する保護または疾患の治療におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために用いることのできる動物モデル系が利用可能である。
感受性の高いマウスにおける全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の試験のための方法は、当分野で公知である（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７：１６５３；Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ ：Ｍｅｄ．，２９９：５１５）。重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて別の種由来の可溶性ＡｃｈＲタンパク質で疾患を誘発することにより試験される（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｎｚｎ７ｕｎｏｌ．，４２：２３３）。関節炎は、感受性の高いマウス系統において２型コラーゲンの注射により誘発される（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：２３３）。感受性の高いラットにおいてマイコバクテリアの熱ショックタンパク質の注射によりアジュバント関節炎を誘発するモデルが記載されている（Ｖａｎ Ｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３１：１７１）。甲状腺炎は、記載されるようにサイログロブリンの投与によりマウスにおいて誘発される（Ｍａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５２：１１１５）。インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、天然に起こるか、またはＫａｎａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２７：１１３に記載されるものなどのマウスの系統において誘発させることができる。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳのモデルとして役立つ。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄性疾患が誘発される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９８６）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７９−２１３；ＭｃＦａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７９：４７８：およびＳａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ；Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：１７９参照）。
一般に、本ペプチドリガンドは、精製された形態で薬理学的に適切な担体とともに利用される。一般に、これらの担体としては、水性またはアルコール性／水溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられ、いずれも生理食塩水および／または緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウムおよび乳酸リンゲル液が挙げられる。適した生理学的に許容されるアジュバントは、ポリペプチド複合体を懸濁液中に保持するために必要な場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択されてよい。
静脈内ビヒクルには、流動体ならびに栄養補充剤および電解質補充剤、例えばリンゲルデキストロースに基づくものなどが含まれる。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスも存在してよい（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物として、またはその他の薬剤とともに使用されてよい。これらには、抗体、抗体フラグメントおよび様々な免疫療法薬、例えばシクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチナム、および免疫毒素などが挙げられる。医薬組成物には、それらが投与前に貯蔵されていようといまいと、様々な細胞毒性剤またはその他の薬剤の「カクテル」が、本発明の選択された抗体、受容体またはその結合タンパク質とともに、またさらには異なる特異性を有する本発明に従う選択されたポリペプチドの組合せ、例えば異なる標的リガンドを用いて選択されたポリペプチドなどとともに含まれてよい。
本発明に従う医薬組成物の投与経路は、一般に当業者に公知の経路のいずれであってもよい。治療（免疫療法を含むがこれに限定されるものではない）には、本発明の選択された抗体、受容体またはその結合タンパク質を、いずれの患者にも標準的な技法に従って投与することができる。投与は、任意の適切な様式によるものであってよく、それには非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺経路を介して、または、適切にカテーテルでの直接注入も挙げられる。投薬量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、その他の薬物の同時投与、対抗兆候（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）ならびに臨床医が考慮に入れるべきその他のパラメータによって決まることになる。
本発明のペプチドリガンドは、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適した担体で再構成することができる。この技法は、これまでに有効であることが示され、当分野で公知の凍結乾燥および再構成技法を用いることができる。当然ながら、凍結乾燥および再構成が、様々な程度の活性消失をもたらし得ること、ならびにそれを補うために使用レベルを上方に調節する必要があり得ることは、当業者に理解される。
本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防および／または治療上の処置のために投与することができる。特定の治療用途において、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅、またはその他のいくつかの測定可能なパラメータを達成するために適切な量は、「治療上有効量」と定義される。この投薬量を実現するために必要な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態によって決まることになるが、一般に体重１キログラム当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択されたペプチドリガンドの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用されている。予防用途には、本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、同様かまたはわずかに少ない投薬量で同じく投与されてよい。
本発明に従うペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択標的細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去に役立つ予防設定および治療設定に利用することができる。その上、本明細書に記載されるポリペプチドの選択されたレパートリを、体外でまたはインビトロで選択的に用いて、細胞の不均一コレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇またあるいは効果的に除去することができる。哺乳動物から得た血液を体外で選択されたペプチドリガンドと組み合わせて、それにより不要な細胞を死滅させるか、またあるいは標準的な技法に従って哺乳動物に戻すために血液から除去することができる。
実施例１．ＭＤＭ２に対するプロテアーゼ耐性三環系ペプチド
ＭＤＭ２は、腫瘍抑制因子であるｐ５３のトランス活性化ドメインを認識する酵素（Ｅ３ユビキチンリガーゼ）であり、プロテオソームによるＰ５３のユビキチン化および分解を導く。ｐ５３−ＭＤＭ２相互作用のヌトリン阻害剤は、ｐ５３経路のインビボ活性化を導くことができ、そのような薬剤が抗癌剤としての可能性を有し得ることが示唆されてきた。本発明者らは標的「抗原」であるＭＤＭ２に対する２種類の二環式ペプチド（ＰＥＰ１０およびＰＥＰ４８）の選択をここに記載する。各々の合成ペプチドの親和性はマイクロモル以下で、２５０〜７５０ｎＭの範囲内であった。競合ＥＬＩＳＡにより、これらのペプチドの少なくとも一つが、ｐ５３−ＭＤＭ２相互作用を阻止することが既に示されている線状ペプチドと同じ部位に結合することが示された。
プロトコールは、特に断りのない限り、一般に以前にＨｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，５０２−５０７に記載されるものに従った。Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．の研究ではカリクレインとカテプシンＧという標的の両方がプロテアーゼであった。カリクレイン阻害剤はカリクレインによるタンパク質分解に相当に耐性であるが、それにはカリクレイン切断部位が含まれる。ＭＤＭ２はプロテアーゼではない。そのため、選択されたペプチドもプロテアーゼに耐性であるかどうかは明白ではなかった。このために、およびその他の理由のために（詳細については下記参照）、本発明者らは、１以上のプロテアーゼ（キモトリプシン）ステップをファージペプチドレパートリとＴＢＭＢとの（酸化または還元条件下での）反応の後、かつＭＤＭ２に対するレパートリの選択の前に含めた。これらの２種類の選択されたファージペプチドＰＥＰ１０およびＰＥＰ４８は、ファージＥＬＩＳＡで示されるように、タンパク質分解に耐性であると思われる。
ファージ産生および精製
少なくとも４×１０９クローンの多様性をもつファージペプチドライブラリを調製し、ＴＢＭＢを以前に記載されるように、少しの変更とともにコンジュゲートした。
１．以前に記載したファージのｃｘ６ライブラリ（ＴＧ１細胞から調製）を用いて非サプレッサー株ＨＢ２１５１（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ．１９８５．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４３）を感染させ、感染細胞を播種した。約８ｍｌ ２ｘＴＹ培地中、３０ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）の中に細菌をプレートからこすり落とした。
２．約０．８ｍｌの原液を、３０ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む８００ｍｌ ２ｘＴＹ培地に添加して、６００ｎｍで約０．１のＯＤを得た。培養物を３０℃にてインキュベートし、２リットルのフラスコ中で２００ｒｐｍにて１６時間振盪した。
３．細胞培養を、４，０００ｒｐｍ（ヘレウス社製Ｍｅｇａｆｕｇｅ ２Ｒ）で４℃にて３０分間遠心した。上清を２００ｍｌ冷２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣＬに移した。この混合物を氷上に１時間放置した。
４．沈殿した上清／ファージ混合物を、４℃にて３０分間遠心沈殿し、上清を捨てた。
５．ファージを、３５ｍｌ ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、それに続いて４０００ｒｐｍ（ヘレウス社製Ｍｅｇａｆｕｇｅ ２Ｒ）で１５分間回転させて細胞残屑を除去した。上清を新しい５０ｍｌファルコンチューブに移した。
ＴＢＭＢによるファージの修飾
１．５ｍｌの８ｍＭ ＴＣＥＰ（Ｈ２Ｏ中）を、ファージに添加して、終濃度１ｍＭのＴＣＥＰを得た。チューブを数回反転させて混合し、４２℃の水浴中で１時間インキュベートした。
２．ＴＣＥＰを、２回目のＰＥＧ沈殿により除去した。１０ｍｌの２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣＬ（脱気溶液）を添加し、混合し、氷上で４５分間インキュベートして、４℃、４０００ｒｐｍで３０分間回転させた。
３．上清を注意深く取り出し、１２ｍｌ ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｕＭ ＴＣＥＰ（脱気緩衝液）にペレットを再懸濁した。
４．３ｍｌの、アセトニトリル中５０ｕＭ ＴＢＭＢを、１２ｍｌの還元したファージに添加して、１０ｕＭのＴＢＭＢ終濃度を得た。チューブを数回反転させ、水浴中３０℃にて１時間放置した。ファージを氷上で冷却し、１／５量の２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣＬで３０分間沈殿させた。４０００ｒｐｍ（ヘレウス社製Ｍｅｇａｆｕｇｅ ２Ｒ）にて２０分間回転させることによりファージを回収した。上清を取り出し、ファージを４ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。ファージを２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１３０００ｒｐｍ（エッペンドルフ社製卓上遠心機）で１０分間回転させた。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ファージの感染性を測定した。
ファージ選択：一般的なプロトコール
１回目の選択
１．上記のように精製し化学的にコンジュゲートさせたファージを、ストレプトアビジンでコートしたダイナビーズ（ダイナル・バイオテク社）の表面上に固定化されたビオチン化ＭＤＭ２（ｂｉｏ−ＭＤＭ２）ペプチド（ｒｅｓ２−１２５）に対して選択した。８０ｕｌのビーズをまず洗浄し、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のマーベル社製粉乳（ＰＢＳＭ）で４０分間ブロッキングし、それに続いて総量１ｍｌで１００ｎＭ ｂｉｏ−ＭＤＭ２とともに２０分間インキュベートした。
２．化学的に修飾したファージ（１０１０〜１０１１ＴＵ）を、ＰＢＳＭとともに４０分間インキュベートした。
３．ステップ１のブロックされたＡｇコートビーズを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で過剰なＡｇから洗浄し、総量１ｍｌでブロックされたファージとともに３０分間インキュベートした。
４．非結合ファージを、ＰＢＳＴで１０回、その後ＰＢＳで２回洗浄した。各々の３度目の洗浄ステップの後、ファージコートビーズを新しいエッペンドルフチューブに移した。
５．回転ホイール上で、５００ｕｌの５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２とともに１０分間インキュベートすることにより、ファージを溶離した。溶離したファージを、２５０ｕｌの１Ｍトリス、ｐＨ７．５で中和した。
６．３７５ｕｌのファージを、１０ｍｌのＨＢ２１５１細胞とともに、振盪せずに、３７℃にて９０分間インキュベートした。
７．次に、感染細胞を３７℃にて３０分間振盪した後、クロラムフェニコールプレート（２０×２０ｃｍ）に播種した。
８．上記のように、コロニーをプレートから２ｘＴＹ、クロラムフェニコール、１０％グリセロールの中にこすり落とし、グリセロール原液として−８０℃にて貯蔵した。細胞の一部分を用いて２回目の選択のためのファージを調製した。
２回目の選択
２回目の選択は、少しの変更を除いて１回目の選択に類似した。
１．ニュートラアビジンでコートした磁性ビーズを、ストレプトアビジンでコートしたものの代わりに使用した。
２．選択で使用した抗原の量は２０ｎＭであった。
３．化学的に修飾されたファージ（１０１０−５×１０１０ＴＵ）を最初に５０ｕｇ／ｍｌのキモトリプシンで２分間処理した後、ＰＢＳＭで４０分間ブロッキングした。
４．非結合ファージを、ＰＢＳＴで１５回、その後ＰＢＳで２回、そのほかの点では上記の通り洗浄した。
ファージ選択：変異プロトコール
上記のような一般的なプロトコールを用いてクローン４８を選択し、一方クローン１０を、導入されている修飾プロトコールの結果として開発した。これらの修飾は、以下である：
１．１回目では、化学的に修飾されたファージを５０ｕｇ／ｍｌのキモトリプシンで２分間前処理した後、ＰＢＳＭで４０分間ブロッキングした。
２．２回目では、化学的に修飾されたファージを最初に５ｍＭ ＤＴＴで２０分間還元した後、５０ｕｇ／ｍｌのキモトリプシンで２分間インキュベートし、ＰＢＳＭで４０分間ブロッキングした。
ペプチド合成
ファージクローン４８およびファージクローン１０由来のコードペプチドを、遊離Ｎ末端およびＣ末端を用いて合成した。ＰＥＰ１０：Ｈ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ；ＰＥＰ４８：Ｈ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ。
これらの合成は、ＤＭＦ中ＰｙＢｏｐおよびＮＭＰ中ＤＩＰＥＡ（それぞれ１当量および２当量）で活性化した５倍過剰のＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて、０．１ミリモルＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ ＰＳ樹脂でＣＥＭ社製Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置でのＦｍｏｃ−ペプチド合成により実施された。側鎖保護基は、次の通りであった：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ（ｔＢｕ）；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）。Ｆｍｏｃ−脱保護は、０．１Ｍ ＨＯＢｔを含有する２０％ ｖ／ｖ ピペリジン／ＤＭＦを用いて実施された。Ｈ−ペプチジル−樹脂を、ＤＭＦで、次いでプロパン−２−オールで洗浄し、真空乾燥させた。側鎖保護基および支持体からの切断は、９４：２．５：２．５：１ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ ＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ｉＰｒ３ＳｉＨを２時間用いて達成した。ペプチド／ＴＦＡ混合物を濾過して支持体を除去し、ペプチド／ＴＦＡ混合物を水で希釈し、Ｅｔ２０（５回）で洗浄し、水層を凍結乾燥させた。
逆相ＨＰＬＣを、フェノメネックス社製ジュピター５μ Ｃ１８ ３００Å ２５０×４．６ｍｍカラムで実施した。バッファーＡ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；バッファーＢ：１０％バッファーＡを含有するＣＨ３ＣＮ。カラムを１０％バッファーＢと均一濃度で２分間溶離し、次いで１０〜９０％の直線勾配で２５分にわたって溶離した。検出は２１５／２３０ｎｍで；流速は１．５ｍｌ／分であった。
ペプチドを凍結乾燥し、質量分析によって確認した。ＰＥＰ１０ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ（Ｍ＋Ｈ）：２０９９．９Ｄａ（理論値：２０９８．４Ｄａ）。ＰＥＰ４８ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｍａｓｓ（Ｍ＋Ｈ）：２０４３．８Ｄａ（理論値：２０４２．８Ｄａ）。次に、ペプチドをＴＢＭＢでコンジュゲートした。実施例２に記載される通り、ペプチドをＴＢＭＢでコンジュゲートした。
結合アッセイ
ファージＥＬＩＳＡアッセイ
０．６μｇ／ｍＬのビオチン化ＭＤＭ２ペプチド（ｒｅｓ２〜１２５）を、ストレプトアビジンコートプレート（ロシュ社）上に固定化した。プレートをＰＢＳＭ（但し粉乳中４％）でブロッキングし、直鎖状またはＴＢＭＢコンジュゲートファージ（５ｍＭ ＤＴＴの存在下または不在下、ＰＢＳＭ中１０７ＴＵ／ウェル）を、プレート上で室温にて５０分間インキュベートした。同様に、ファージを最初に５ｍＭ ＤＴＴ中で２０分間還元し、キモトリプシン（ＰＢＳ中５０ｕｇ／ｍｌ）で２分間処理し、ＰＢＳＭ（終濃度）と混合し、プレート上で５０分間室温にてインキュベートした。抗−Ｍ１３−ＨＲＰモノクローナル抗体（１：５０００、アマシャム社）を用いてファージを検出した。
結果（図１）は、ファージクローン１０とクローン４８の両方が環状抱合体としてＭＤＭ２に結合するが、非コンジュゲートペプチド（ＤＴＴでの前処理の有無に関わらず）としては結合しないことを定性的に示した。さらに、コンジュゲートペプチドの結合は、タンパク質分解に耐性である。ＤＴＴが、キモトリプシンのジスルフィド結合を還元し、プロテアーゼとしてその不活性化を導くことができることに留意されたい。キモトリプシンがアッセイ条件下で活性であったことを裏付けるため、本発明者らは、上記のようにＤＴＴでの前処理の後にＭＤＭ２に結合する線状ペプチドを有する対照ファージをインキュベートした。本発明者らの実験条件下で、対照ファージの結合活性は、タンパク質分解で失われた。その他の実験では、本発明者らは、ＰＢＳ中室温にて２分間、キモトリプシン（０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）の存在下、０．２ｍＭ〜５ｍＭまでのＴＣＥＰを使用した。これらの条件も、本発明者らがファージ上の線状ペプチドと環状ペプチドを区別することを許容した。
蛍光異方性測定
滴定実験は、実験室のソフトウェアにより制御されたハミルトン社製Ｍｉｃｒｏｌａｂ滴定装置を備えたホリバ・ジョバンイボン社製蛍光光度計で実施した。用いたλｅｘおよびλｅｍは、それぞれ２９５ｎｍおよび３５０ｎｍであった。励起および発光のスリット幅は、５ｎｍおよび１５ｎｍであり、１０秒の積分時間を各々の測定に用いた。ペプチド１０、４８中のトリプトファンの内部蛍光を用いて、ＭＤＭ２（ｒｅｓ２〜１２５）に対するそれらの結合親和性を測定した。実験は２３℃にてＰＢＳ中、５ｍＭ ＤＴＴで実施した。通常は２５０ｕｌのＭＤＭ２（１５０ｕＭ）を、１．２ｍｌのペプチド（１ｕＭ）に滴定した。滴定データを、平衡Ｋｄ＝［Ａ］［Ｂ］／［ＡＢ］に対する二次方程式の解（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて標準的な１：１結合モデルで分析した。Ｋｄは、解離速度であり、［Ａ］および［Ｂ］は、それぞれ、滴定剤（ＭＤＭ２）および蛍光ペプチド１０および４８の濃度をさす。フィッティング方程式には、線形ドリフト（ｌｉｎｅａｒ ｄｒｉｆｔ）を説明するために余分の項目を含めた。
これらの結果（図２および下記）は、各々のペプチドの親和性がマイクロモル以下であり、２５０〜７５０ｎＭの範囲内であることを示す。ＰＥＰ４８の測定を繰り返した。
ＰＥＰ１０＋ＭＤＭ２、測定値λｅｘ＝２９５ｎｍ、Ｋｄ＝２６７ｎＭ；
ＰＥＰ４８＋ＭＤＭ２、測定値λｅｘ＝２８０ｎｍ、Ｋｄ＝７６０ｎＭ；
ＰＥＰ４８＋ＭＤＭ２、測定値λｅｘ＝２９５ｎｍ、Ｋｄ＝５６７ｎＭ
競合アッセイ
ＰＥＰ４８ファージとＭＤＭ２の結合は、ＭＤＭ２にｐ５３部位でＫｄ＝３．３ｎＭで結合するペプチドｐＭＩ（ＴＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ）に競合された（Ｐａｚｇｉｅｒ ｅｔ．ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ，１０６，４６６５−４６７０）。０．６μｇ／ｍｌのビオチン化ＭＤＭ２ペプチド（ｒｅｓ２〜１２５）を、ストレプトアビジンコートプレート（ロシュ社）上に固定化した。プレートをＰＢＳＭでブロッキングした。ＴＢＭＢ−コンジュゲートファージ（１％ＰＢＳＭ中１０７ＴＵ／ウェル）を、一連の濃度のｐＤＩ（６．９４ｎＭ〜１ｕＭ）と前もって混合し、プレート上で７５分間室温にてインキュベートした。抗Ｍ１３−ＨＲＰモノクローナル抗体（１：５０００、アマシャム社）を用いてファージを検出した。ＰＥＰ４８ファージとＭＤＭ２の結合は、ｐＭＩペプチドの添加により抑制され、ＩＣ５０＝１２５ｎＭと推定された。
実施例２．２以上の標的と結合する環状ペプチド
Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）の研究は、カリクレイン（ＰＫ１５）に対する二環式ペプチド（ＰＫ１５）の単離を実証する。ＰＫ１５は、二段階法により作製された。第１の二環式レパートリを両方のループの多様性を含めて作成した。カリクレインでの反復選択の後、ＰＫ２がその代表である、一連のコンセンサス配列が第１のループに出現した。次に、第１のループにＰＫ２配列を保持しながら第２のレパートリを作製し、第２のループを多様化させた。カリクレインでの反復選択の後、一連のコンセンサス配列が第２のループに出現した。この二段階法は、結合親和性の向上をもたらした。
ＰＫ２の第１のループにおけるコンセンサス配列の出現は、このループが結合に重要な貢献をしていることを示唆する。第２のループもＰＫ２において結合に重要な貢献をしている可能性は排除されない。実際にＰＫ１５における第２のループのコンセンサス配列の出現は、第２のループが本当にＰＫ１５において重要な貢献をしていることを示唆する。
それでもやはり、本発明者らは、異なる特異性の二環式ペプチドからの個々のループを合わせることにより、２つの標的に対する結合特異性をもつ二環式ペプチドを構築することが可能であるかどうか疑問に思った。本発明者らは、各々の標的に対する結合親和性の重大な喪失を見ることを予測したが、本発明者らは、さらなる変異誘発が改良された結合親和性をもつ変異体をもたらすはずであると考えた。
従って、本発明者らはまず、ＴＢＭＢコア上のＰＫ１５の第１のループのいくつかの変異体を、Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）により以前に記載された方法で、または、本発明者らがＴＢＭＢとファージのコンジュゲーションに用いる反応条件を模倣しようと試みた、下に記載される方法により、合成した。三環系には、二環式ペプチドのＮおよびＣ末端を連結するためのさらなる化学ステップを必要とした。二環式ペプチドを、ＨＰＬＣにより精製し、質量分析により確認し、凍結乾燥により乾燥させた。各々の変異ペプチドのカリクレイン活性の阻害に関するＩＣ５０を表に要約する。
ＰＫ１５の第１のループは、各々の変異体において下線が引かれ、カテプシンＧに対して向けられるＣＧ４ペプチドの第１のループ（二重線の下線）か（Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９０）、またはＭＤＭ２に対して向けられるＰＥＰ４８の第１のループ（破線の下線）と組み合わされた（ＷＯ２００９／０９８４５０号参照）。
Figure 2013518807
これらの結果から、ＰＫ１５の第１のループは、第２の標的に対して向けられる二環式（または三環式）ペプチドからのループと合わせると、カリクレイン活性を阻害することが可能であることが示される。しかし阻害活性はその同族のループと組み合わせた場合よりもはるかに低く、非同族ループの配列および／または順序に従って変動する。
また、本発明者らは、ＰＫ１５と合わせた、ＰＥＰ４８の第１のループの結合についての結果を得た（図３）。従って、ＰＫ１５Ｌ１−ＰＥＰ４８Ｌ１二環式ペプチドは、全ＰＥＰ４８Ｌ１−ＰＥＰ４８Ｌ２二環式ペプチドの親和性（実施例１、Ｋｄ＝５００〜８００ｎＭ）よりもたったの２倍または３倍低い、ＭＤＭ２に対する結合親和性（Ｋｄ＝１．５５ｕＭ）を有する。さらに、後に実施例３で示されるように、ＦｍｏｃＰＥＰ４８Ｌ１−ＰＫ１５Ｌ１ペプチドは、１ｕＭより小さい結合親和性を有すると推定される。これは、異なる標的特異性の２種類の二環式ペプチドからのループを結合することが可能であり、それにより２つの標的特異性をもつ二環式ペプチドを作成することが可能であることを実証する。
これらの二環式ペプチドの結合親和性を改善することは、例えば（ａ）ペプチドをコードする変異ＤＮＡカセットを「スパイクされた」オリゴヌクレオチドと合成すること、（ｂ）前記変異ペプチドレパートリをファージ上に提示すること、および（ｃ）前記ファージレパートリを徐々にストリンジェントになる条件下で（例えば、より低い濃度の抗原、または標的に結合したファージのより広範囲の洗浄を用いる）選択回に付すことにより、可能である。さらに、レパートリを各々の標的に対して順番に選択することにより（ファージの収量によって、細菌増殖の回を間に入れても入れなくてもよい）、淘汰圧を確実に両方の標的で維持することが可能であるはずである。二重特異性ファージを作製するためのその他の戦略のさらなる考察は、実施例４に記載される。
ＴＢＭＢ−ペプチド抱合体の合成
最初の反応を実施して、ファージ選択の間に用いた条件を模倣した。一般に、５ｍｇの精製ペプチドを水１ｍｌに溶解させ、０．８ｍｌ ５０ｍＭ ＮＨ３ＨＣＯ３を添加し、それに続いて４０μｌのＴＣＥＰを添加した。ＭｅＣＮに溶解したＴＢＭＢ（ペプチドの重量に基づいて３当量）を、この反応に加えた。反応を１．５時間放置した後、ＨＰＬＣでモニターした。完了すると、反応物をＨＰＬＣにより精製した。一般に、０．５〜１．５ｍｇの最終生成物が得られた。この方法は、多くの副生成物を生じ、主な生成物は所望の質量＋２５０ａｍｕである。これは、ＴＣＥＰの目的生成物への添加に相当し、この生成物の収量は反応時間とともに増加する。加えて、２回目のＴＢＭＢの添加に相当する、その他の質量のより高い生成物が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で観察されたが、単離されなかった。
ＴＣＥＰ付加物の形成に基づいて、好ましい方法が開発された。ペプチドを樹脂から切断した後、ペプチドをＨＰＬＣにより直接精製するか、またはＨＰＬＣ精製の前にＴＣＥＰで１５分間前処理した。ＨＰＬＣ溶出バッファー（一般に６ｍｌ）中の、ＨＰＬＣ反応からの生成物を、５０ｍＭ ＮＨ３ＨＣＯ３（４ｍｌ）で中和し、上記のようにＭｅＣＮ中のＴＢＭＢを添加する。１０％ＴＨＦを添加した結果、透明な溶液が得られ、その結果反応が促進される。反応は質量分析によりモニターされるが、一般に１〜２時間で完了する。この反応からの副生成物は（生成物＋１６の存在が質量分析により観察されるが）最小限である。この反応は、ＨＰＬＣ精製の前に有機溶媒を除去するための濃度を必要とし、そうでなければ生成物は溶媒先端とともに溶離する傾向がある。この方法から得られる生成物の収量は、一般に、３ｍｇのペプチドから０．５〜１．５ｍｇであるが、これは最適化されていない。
三環系ペプチドの合成
三環系ペプチドＣＧ４Ｌ１−ＰＫ１５Ｌ１−ＰＫ１５−Ｌ２を、次のように合成した：約１ｍｇの二環式Ｘ−ＣＧ４Ｌ１−ＰＫ１５Ｌ１−Ｙ（ここで、ＸおよびＹは、ＰＫ１５Ｌ２の部分を表す）を、２ｍｌの２０ｍＭ ＮＨ３ＨＣＯ３に溶解し、ＥＤＣ（水１００μｌ中０．８ｍｇ、１０当量）で処理し、マイクロ波合成装置において５０Ｗにて０℃から始めて３７℃まで加熱した。反応の進行を１５分および３０分にモニターした、その時は環化した生成物が主な生成物であったが、もう一つの水分損失も観察された。反応物をＨＰＬＣ（セミ分取）により精製して三環系抱合体を単一ピークとして得た、収量０．５ｍｇ。
カリクレインアッセイ
酵素はシグマ・アルドリッチ社より、基質はバッケムＡＧ社より購入した。アッセイ緩衝液は、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０１％トリトンＸ１００および５％ＤＭＳＯからなる。基質の添加の前に、酵素を阻害剤とともに室温にて３０分間インキュベートする。全ての実験は３０℃で９０分間記録した。
アッセイは、ｅｘｃ／ｅｍ ３５０／４５０ｎｍの波長でＢＭＧ Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーで実施した。カリクレインを、１０８０μｇ／ｍＬの溶液として購入し、希釈してアッセイ緩衝液中０．３ｎＭの作業濃度とした。基質Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ａｍｃをＤＭＳＯ中１０ｍＭの原液濃度で可溶化し、アッセイ緩衝液で３００μＭの作業濃度に希釈した。阻害剤をアッセイ緩衝液中で６０μＭの原液濃度に対して可溶化した。ウェルあたり１５０μＬの最終容積のために、各々の試薬５０μＬをウェルに導入する。アッセイでのカリクレインの終濃度は０．１ｎＭであり、基質は１００μＭである。
阻害剤の終濃度は：０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、８０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、８００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、８μＭ、１０μＭおよび２０μＭであった。反応の初期速度は、蛍光＝ｆ（時間）データをプロットし、各々の濃度の阻害剤に直線的な趨勢線を当てはめることにより得られる。阻害曲線は、初期速度＝ｆ（［ｌ］）をプロットすることにより得られ、ＩＣ５０値を求めることができる。
実施例３．同じペプチド内に３つの官能基を与えるための二環式ペプチドへの血清アルブミン結合機能の付加
本発明のリガンドには、１以上の官能基との抱合体が含まれ得る。官能基は、直接ペプチドに、または足場に連結されてよい。官能基は、天然ペプチド、または化学基または両方を含み得る。本発明者らはここに、血清アルブミンに結合をもたらし、それによりリガンドの血清中半減期を延長するために、本発明のリガンドに連結することのできる官能基を記載する。
血清アルブミンのＸ線結晶構造は、ワルファリンとの複合体において解析された（Ｐｅｔｉｔｐａｓ ｅｔ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２２８０４−２２８０９）。ワルファリンは、構造の深部の疎水性ポケットに位置する。本発明者らは、同様の構造のその他の化学物質はペプチドとの結合をもたらすのかどうか疑問に思った。本発明者らは、ペプチド合成の間にアミノ基を保護するために使用されるフルオレニルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）が適しているのではないかと注目し；同様にペプチドを蛍光標識するために使用されるメトキシ−クマリン（Ｍｃａ）が適しているのではないかと注目した。
従って本発明者らは、リジンおよびＦｍｏｃおよび／またはＭｃａを含む単純なペプチド抱合体を作成し、血清アルブミンとの結合においてこれらを試験した。下の実験は、Ｆｍｏｃは血清アルブミンと結合するが、Ｍｃａは結合しないこと；さらに、Ｆｍｏｃ−ＴｒｐまたはＦｍｏｃ−Ｐｈｅが結合親和性の増大をもたらすことを示す。本発明者らは、フルオレン環を含むその他の抱合体も血清アルブミンに結合すると予想する（例えば、加水分解に対してより安定していると予想されるフルオレン酢酸）。
本発明者らはまた、モデル二環式ペプチドとのＦｍｏｃ−Ｔｒｐの使用を示す。従ってＮ末端Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐおよびグリシンスペーサーが、二環式ペプチドに付加された（ＰＥＰ４８Ｌ１−ＰＫ１５Ｌ１）。この二環式ペプチドは、２つの異なる特異性の二環式ペプチドからのループを含む。第１のループは、実施例１に記載されるように、ＭＤＭ２に結合する二環式ペプチドであるＰＥＰ４８からの第１のループ（Ｌ１）であった。第２のループは、以前に記載されているように（Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）、カリクレインを阻害する二環式ペプチドであるＰＫ１５からの第１のループ（Ｌ１）であった。蛍光滴定は、二環式ペプチドが、約６０ｎＭの親和性で血清アルブミンと結合する能力があり、血清中の半減期延長に適した範囲内に十分あることを示す（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＥＤＳ１９，２９１−２９７）。
この二環式ペプチドの結合親和性を、ＭＤＭ２に対しても測定した。予備データは、このペプチドが１ｕＭより小さい親和性でＭＤＭ２に結合する能力があることを示した。さらなる予備実験（実施例２に記載）により、このペプチドによるカリクレインの抑制に関するＩＣ５０が約１７マイクロモルであることが明らかとなった。従って、この二環式ペプチドは３つの機能；Ｆｍｏｃペプチドにより与えられる血清アルブミンとの結合、第１のペプチドループを介するＭＤＭ２との結合、および第２のペプチドループによるカリクレインとの結合、を有する。
この実施例において結合機能は、治療薬においてそれぞれ何らかの有用性を有するかもしれないが、発明者らは、同じ薬剤中のこれらの３つの機能を一緒に合わせることが特に有利であり得ると伝えることを意図するものではない。しかし、血流内（例えばカリクレインの抑制のため）、または細胞内（例えばｐ５３−ＭＤＭ２相互作用を阻止するため）で標的に送達される薬物に関して、血清中の半減期が延長されているのは有利であり得る。
Ｆｍｏｃ−アミノ酸とウシ血清アルブミンの結合
フルオロフォアの標的タンパク質に対する親和性定数（Ｋｄ）を決定するために、本発明者らは、蛍光異方性滴定を選択する。ここで、漸増量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を蛍光ペプチドに滴定し、結合が起こると、ＢＳＡにより次第に複合体化したペプチドの典型的な飽和曲線（異方性の変化の関数として記録される（ｒ））が観察される。結合平衡Ｋｄ＝Ａ＊Ｂ／［ＡＢ］に対する二次方程式の解（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて、Ｋｄを決定することができる（Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ，（２００７）ＰＮＡＳ １０４，７００９−７０１４）。
・Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍｃａ
Ａ３２４にて１２９００／Ｍ／ｃｍの吸光係数を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍｃａ（ノバ・バイオケム社より入手）でのフルオロフォアメトキシ−クマリン（またはＭｃａ、Ｌｙｓの□−ＮＨ２に連結される）の濃度を推定することができ得る。Ａ２８０は、ＢＳＡに対して０．６６７ＡＵ／ｍｇ／ｍＬである。ホリバ・ジョバンイボン社製蛍光光度計（フランス、ロンジュモー市）を用いて、１．２ｍｌのＰＢＳ（２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中５００ｎＭのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍｃａを、合計２５０μｌの１５μＭ ＢＳＡ（ＰＢＳ中）の４０の漸増アリコートで滴定し、ｒの変化を漸増濃度のＢＳＡの関数として記録した。励起はクマリンに特異的であり（３２８ｎｍ）、発光は３９３ｎｍであった。積分時間は、通常少なくとも１０秒に設定し、励起／発光スリット幅を、濃度およびフルオロフォアの量子収量に応じて調節した：ここではスリット幅は励起について２ｎｍ、発光について１０ｎｍであった。データを適合させた後、実験は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＭｃａがＢＳＡを３４０＋／−４０ｎＭのＫｄで堅く結合することを示した（図４）。
・Ｌｙｓ−Ｍｃａ
ＭｃａまたはＦｍｏｃがＢＳＡを結合する役割を果たすかどうか決定するために、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中２０％ピペリジンによって取り出した。この方法で処理したＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍｃａを１０倍量のエーテルに添加し、Ｌｙｓ−Ｍｃａを沈殿させた。沈殿物を凍結乾燥し、再溶解し、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／０．１％ ＴＦＡを溶媒として用いる分析Ｃ１８逆カラムで精製した。純粋なＬｙｓ−Ｍｃａであることは、Ａ２９９でのＦｍｏｃの特性吸収ピークの不在、および質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ、アプライドバイオシステムズ社を使用）でのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍｃａの質量の不在によって明白であった。上記と同じ蛍光光度計の設定を用いて、結合（すなわち、異方性の変化）をＬｙｓ−Ｍｃａについて観察することができなかった、これによりＦｍｏｃ部分が結合事象を担っていることが示唆される（図４）。
・Ｍｃａ−ＯＨ
Ｍｃａ−ＯＨ（ノバ・バイオケム社）を試験して上記の知見を検証した。ＢＳＡによる滴定の間の異方性変化の欠如により証明されるように、Ｌｙｓ−Ｍｃａとして、Ｍｃａ−ＯＨはＢＳＡを結合しなかった（図４）。
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ
Ｆｍｏｃの隣接基（ここではＧｌｙ）がＢＳＡとの結合に影響を及ぼすかどうかを決定するため、同様の実験をＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ノバ・バイオケム社）を用いて実行した。Ｆｍｏｃの固有の蛍光特性を異方性実験に使用した。Ｆｍｏｃは、２つの異なる吸収ピークを２８８ｎｍと２９９ｎｍで示した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの吸光係数（規定量のＤＭＦ中の規定量を秤量し、これをＰＢＳ中１０００倍に希釈し、その吸収を２８８ｎｍと２９９ｎｍの両方で記録することにより決定される）は、Ａ２８８およびＡ２９９でそれぞれ４８００および５３００／Ｍ／ｃｍである。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの最大蛍光は３１５ｎｍであったので、蛍光異方性滴定実験を励起波長２８８および発光波長３１５で、スリット幅はそれぞれ５および７ｎｍで実行した。キュベット中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの濃度は依然０．５μＭ（１．２ｍｌ中）であり、合計２５０μｌの６２．７μＭ ＢＳＡをその中に滴定した。Ｋｄは、４２０＋／−４０ｎＭであり、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍｃａとほぼ同じであった。
・Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ
隣接する疎水性の嵩高な基が、ＢＳＡ結合に増強効果または有害作用を有するかどうかを決定するため、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを上記のように試験した。ここで決定された吸光係数はＡ２８８で４２４０／Ｍ／ｃｍであった。結合がより強固であるので、フルオロフォア（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ）の濃度は、Ｋｄのより正確な測定のために１００ｎＭまで下げなければならず、それは２５０μｌの１５．７μＭ ＢＳＡで滴定された。Ｋｄは、約１００ｎＭであったので、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨよりも有意に強固であり、隣接する疎水基（フェニル環）がＦｍｏｃとＢＳＡの結合にプラスの効果を有することが示された（図４）。
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨは高い親和性でウシ血清アルブミンと結合するので、本発明者らは、ヒト相同体ＨＳＡについて同じことを観察することができるかどうか試験した。１２．６μＭの２５０μｌＨＳＡ（３６６００／Ｍ／ｃｍの吸光係数を使用、Ｍｏｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ）を、２００ｎＭのＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨに滴定した。親和性は、ＢＳＡ（Ｋｄは約１００ｎＭ）よりも有意に高く（Ｋｄは約１０ｎＭ）、結合はわずかに協同的であった（従ってヒルの方程式をデータフィッティングに使用した）（図５）。Ｋｄを正確に測定することはできないが、フルオロフォア濃度はわずかにＫｄを上回るため、より正確なＫｄ測定には、Ｆｍｏｃを化学修飾することによるか、またはより良好なフルオロフォアＣ末端をフェニルアラニンに付加する（同時にそれはＨＳＡ結合に干渉するべきでない）ことによる、より大きい量子収量をもつフルオロフォアが必要となる。
Ｆｍｏｃ−ペンタペプチドとウシ血清アルブミンの結合
Ｆｍｏｃ−５−ｍｅｒ誘導体の合成および精製：
ペプチドＦｍｏｃ−ＧＧＳＧＤ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−ＦＧＧＧＤ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−ＦＧＳＧＤ−ＮＨ２およびＦｍｏｃ−ＷＧＳＧＤ−ＮＨ２を、ＣＥＭ マイクロ波ペプチド合成装置（ＮＣ、ＵＳＡ）で０．１ミリモルのスケールで、製造業者により提供される標準的なプロトコールを用いて合成した。用いた固相樹脂は、アプライドバイオシステムズ社製のＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳであった。合成後の保護基の除去および樹脂切断を、樹脂を９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％トリイソプロピルシラン、および２．５％ Ｈ２Ｏとともに３時間振盪することで達成した。全てのペプチドを、Ｎ末端のＦｍｏｃ、およびＣ末端のアミド（ＮＨ２）でキャップした。切断後、ペプチドを凍結乾燥し、５ｍＬのＤＭＦ中で可溶化した。１００μｌのこのペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣを用いる分析Ｃ１８カラムに装入し、メタノールおよび水（両方とも０．１％ＴＦＡの存在下）を溶媒として用いた。Ｆｍｏｃペプチドは、８０％を上回るメタノールで溶離し、不純物は含んでいなかった。
・Ｆｍｏｃ−ＧＧＳＧＤ−ＮＨ２
ペプチド濃度を、Ｆｍｏｃに対するＡ２９９での５３００／Ｍ／ｃｍの吸光係数により推定した（上記参照）。キュベット中のペプチド濃度は２００ｎＭであった。これを、励起波長および発光波長にそれぞれ２９９ｎｍおよび３１５ｎｍを用い、１３．１μＭの２５０μｌＢＳＡで滴定した。ＢＳＡに対するこのペプチドの親和性は、１３００＋／−３８０ｎＭであった、これは個別のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨよりも弱い。これにより、追加のアミノ酸ＧＳＧＤは、ＢＳＡを結合する際にマイナスの効果を有することが示される（図６）。
・Ｆｍｏｃ−ＦＧＳＧＤ−ＮＨ２
本発明者らは、ＢＳＡを結合する際のＦｍｏｃに隣接するフェニルアラニンの増強効果もペンタ−ペプチドＦｍｏｃ−ＦＧＳＧＤ−ＮＨ２において観察できるかどうか決定した。Ｆｍｏｃ−ＧＧＳＧＤ−ＮＨ２に関する濃度および設定で、Ｋｄは、１６０＋／−２０ｎＭであった、従ってグリシン変異体よりも８倍強固であった。これは、Ｐｈｅ（Ｆｍｏｃに隣接）が、より長いペプチド配列という状況でも結合を増強することを裏付ける（図６）。
・Ｆｍｏｃ−ＦＧＧＧＤ−ＮＨ２
中央がセリンでなくてグリシンの（比較のためにＦｍｏｃ−ＧＧＳＧＤ−ＮＨ２を参照）このペプチドは、余分なセリン側鎖の欠如がＢＳＡ結合に有意な効果を有するかどうかを確認するために作製した。滴定実験により、わずかに低い親和性（Ｋｄ＝２００＋／−４０ｎＭ）が明らかとなり、アミノ酸３（Ｆｍｏｃ基から数える）の異なる側鎖がＢＳＡを結合する際に効果を有し得ることが示された（図６）。
・Ｆｍｏｃ−ＷＧＳＧＤ−ＮＨ２
この実験を行って、Ｆｍｏｃに対するＴｒｐ（ＰｈｅまたはＧｌｙよりも）Ｃ末端がＦｍｏｃのＢＳＡとの結合にさらなる増強効果を有するかどうか確認した。ここで、０．４μＭのペプチドを、１３．１μＭの２５０μＬ ＢＳＡ（上記）とともに使用した。励起は２９９ｎｍ（Ｔｒｐ吸収を最小化するため）で、発光は３２０ｎｍであった。スリット幅は、それぞれ５ｎｍおよび１２ｎｍであった。親和性（Ｋｄ約６０＋／−８ｎＭ）は、Ｆｍｏｃ−ＦＧＳＧＤ−ＮＨ２よりも３倍強く、より大きな疎水基がＢＳＡを結合するために有益であることが示された。従って、調査した全ての配列から、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＧＳＧＤがＢＳＡを結合するのに最適である（図６）。
ＦＭＯＣ二環式ペプチドの血清アルブミンおよびその他の２つの標的との結合
ペプチド合成および精製
ペプチドを、前述同様にＣＥＭマイクロ波合成装置を用いて合成した。配列は、Ｆｍｏｃ−ＷＧＧＧＡＣＶＲＦＧＷＴＣＳＤＲＦＲＮＣＧ−ＮＨ２であった。全てのＣｙｓおよびＡｒｇを室温にて３０分間カップリングし、最後の５残基（ＷＧＧＧＡ）をカップリングステップの後にキャップした。凍結乾燥後、ペプチドを８０／２０のＤＭＦ／Ｈ２Ｏに溶解し、遠心した。５ｍＬの上清を、同じＷａｔｅｒｓシステムのＣ１８分取カラムに装入した。溶媒は、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡであり、９０％を上回る純粋なペプチドの溶出は約５０％アセトニトリルで起こった。収量は３６ｍｌの約３００μＭペプチドであった（図７Ａ、Ｂ）。
ＴＢＭＢによる誘導体化
上記で得たＨＰＬＣ画分に含まれるペプチドを直接ＴＢＭＢと反応させた。まず、Ｆｍｏｃを発色団（３００μＭ）として用いてＡ２９９で濃度を推定した。これの１０ｍｌに対して、０．４ｍｌのＨ２Ｏ中１Ｍ重炭酸アンモニウムを添加して４０ｍＭの終濃度を得た。これは溶液中に存在するＴＦＡを中和するのに十分であり、ＴＢＭＢとペプチドとの間の反応の結果として生じる新生ＨＢｒのスカベンジャーとして作用するために十分に過剰（３２ｍＭ）である。これに、４０μｌのアセトニトリル中１００ｍＭ ＴＢＭＢを添加して４００μＭのＴＢＭＢという終濃度を得た。この反応の後に質量分析が続き、それは３分後に完了し、残っている出発物質はなく、主な副生成物も生じなかった（図７Ｄ）。次にＴＢＭＢ結合ペプチドを、上記のようにＨＰＬＣにより精製し、その際、反応混合物を直接Ｃ１８分取カラムに装入した（図７Ｅ）。収量：１３ｍｌの９２μＭの二環式Ｆｍｏｃ−ＷＧＧＧＡ−ＰＥＰ４８Ｌ１−ＰＫ１５−Ｌ１。
二環式Ｆｍｏｃ−ＷＧＧＧＡ−ＰＥＰ４８Ｌ１−ＰＫ１５Ｌ１のＢＳＡに対する活性
二環式ペプチドはあまり水に可溶性でなかったので、それをまずＤＭＦに可溶化し、次にＰＢＳに希釈した。実験には、合計２５０μＬの１３．５μＭ ＢＳＡを漸増アリコートで１．２ｍＬの５００ｎＭペプチドに滴定した。ペプチド濃度は、４７００／Ｍ／ｃｍの吸光係数を用いて２９９ｎｍでの吸光度により推定した。励起は２９９ｎｍであり、発光は３２０ｎｍに設定し、それぞれ５ｎｍおよび１２ｎｍのスリット幅であった。データは、標準的なリガンド結合方程式の一つに適合することができ（ｒ＝Ｆ＊［ｃ］／（Ｋｄ＋［ｃ］）＋ｏｆｆｓｅｔ、式中、ｒは異方性の観察値であり、Ｆは倍率であり、［ｃ］は、滴定剤（ここではＢＳＡ）の濃度である）、解離定数Ｋｄは、６２＋／−１４ｎＭであった。従って、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＧＧＧ部分は、二環式ペプチドＰＥＰ４８Ｌ１−ＰＫ１５−Ｌ１と連結された場合に、ＢＳＡを結合する際に完全に機能性である（図８）。
二環式Ｆｍｏｃ−ＷＧＧＧＡ−ＰＥＰ４８Ｌ１−ＰＫ１５Ｌ１のＭｄｍ２に対する活性
Ｍｄｍ２は、完全なＰＥＰ４８ペプチドを良好な親和性で結合する。本発明者らは、Ｍｄｍ２結合がＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−リンカー−二環式誘導体の中でなお機能性であるかどうかをここに決定した。２５０μＬの１８．８μＭ Ｍｄｍ２（Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ２００７に記載されるように発現および精製されたもの）を、１．２ｍｌの５００ｎＭペプチドに滴定した。強い結合事象が生じた（Ｋｄ＜１μＭ）が、Ｋｄがこの実験で用いたペプチドの濃度よりもはるかに低すぎたため、データを適合することができなかった（図９）。より低い濃度のペプチドは、技術的な限界のために使用することができなかった。Ｍｄｍ２に対するこのペプチドの解離定数の正確な決定は、Ｆｍｏｃよりも優れたフルオロフォア（上記参照）、または等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）などの異なる方法論を必要とする。
実施例４．レパートリのシャッフリングによる二重特異性二環式ペプチドの作製
実施例２では、２つの異なる標的に対して向けられる個々の二環式ペプチドからのループの組合せが、二重特異性をもつ二環式ペプチドを導くことができることが示される。しかし、予測できない結合親和性の損失がある。一般的な代替法は、個々のループではなくループのレパートリを合わせることであり、これを実行することのできる方法は多数ある。
第１のアプローチは、ペプチドの３つのシステインと３つの共有結合を形成することのできるトリスブロモメチルベンゼンなどの足場を用いて、（両方のループに多様性をもつ）二環式ペプチドのレパートリを作製することである。次に、このレパートリを、少なくとも１回、または選択されたクローンの配列決定により第１の（または第２の）ループにおけるコンセンサス配列の痕跡が明らかとなるまで、標的Ａに対して選択することができる。次に、第１の（または第２の）ループレパートリを、同様の未処理の第２の（または第１の）ループレパートリと必要に応じて共通のシステインで結合させることができ、結合した三価の足場上の２つのループのレパートリは、少なくとも１回、標的Ｂに対して選択することができる。合わせたレパートリのその後の選択を２つの標的間で交互に行うことにより、二重特異性をもつ二環式ペプチドを導くことが可能である。
第２のアプローチは、上記のように二環式ペプチドのレパートリを作製し、次いでそれを標的Ａに対して選択し、同様のレパートリを別々に標的Ｂに対して選択する（いずれの場合も少なくとも１回）ことである。標的Ａの第１の（または第２の）ループレパートリは、次に標的Ｂの第２の（または第１の）ループレパートリと必要に応じて共通のシステインで結合させて、三価の足場上の２つのループの合わせたレパートリを得る。合わせたレパートリの選択を２つの標的で交互に行うことにより、二重特異性をもつ二環式ペプチドを導くことが可能である。
第３のアプローチは、ペプチドの２つのシステインと２つの共有結合を形成することのできるビスブロモメチルベンゼンなどの足場を用いて、（ループに多様性を有する）単環式ペプチドのレパートリを作製し、次に、それを標的Ａに対して、そして同様のライブラリを別々に標的Ｂに対して、いずれの場合も少なくとも１回、選択することである。次に、標的Ａのループレパートリを標的Ｂのループレパートリとシステインで結合させて、次にトリスブロモメチルベンゼンなどの三価の足場にコンジュゲートすることができる。合わせた２つのループレパートリの選択を２つの標的間で交互に行うことにより、同様に二重特異性をもつ二環式ペプチドを導くことが可能である。この戦略の変形は、ループの基部でシステイン間の対形成を可能にすることにより、単環式ペプチドレパートリを作製することである。（この場合、ファージは単に培養から回収され、ジスルフィドは空気酸化により自然に形成される）。
３つの全ての可能性において、二環式ペプチドの結合親和性は、各々の標的に対して最適とならない可能性がある。これらは、スパイクされたオリゴヌクレオチドでペプチドをコードするＤＮＡを合成することにより改良することができ、それにより三価の足場との反応後にファージで変異二環式ペプチドのレパートリを作製することができる。レパートリは、よりストリンジェントな条件下（例えば、長い洗浄時間、またはより低い濃度の標的）を除いて、上記の両方の標的で選択することができる。
接続して外すことのできるループを含むペプチドレパートリを作製する能力は、適したベクターの設計を必要とする。これらは、制限部位に構築されてもよいし、または合成ＤＮＡプライマーによるＰＣＲ増幅に適したループに隣接するヌクレオチドのストレッチを保存してもよい。説明の目的で本発明者らは下に制限部位の使用を記載するが、本質的なモジュールの特徴はＰＣＲ戦略に類似する。
第１ライブラリ−単一ループ（標的Ａ用）。単一ループを含む第１のペプチドライブラリは、一般式Ｎｔｅｒｍ−Ｃ−Ｘ１−Ｃ−Ｒ１−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２に従って、ベクター内の発現カセットのために設計されてよい。カセット内で、Ｎｔｅｒｍは、単一ループライブラリのＮ末端隣接配列を意味し、Ｃは、システイン残基を意味し、Ｘ１は、ランダム化アミノ酸残基の第１の配列を意味し、Ｒ１は、第２のシステイン残基に対する１以上のアミノ酸Ｃ末端を意味し、第１の制限部位を形成するＤＮＡ配列によりコードされ、Ｆｕｓｉｏｎは、ペプチドに融合したポリペプチドの少なくとも一部を意味し、最後にＲ２は、第２の制限部位を形成するＤＮＡにコードされるアミノ酸を意味する。第２のシステイン残基は、Ｒ１とともに第１の制限部位を形成することができる。
第１ライブラリ−２ループ（標的Ａ用）。２つのループを含む第１のペプチドライブラリは、一般式Ｎｔｅｒｍ−Ｃ−Ｘ１−Ｃ−Ｒ１−Ｘ２−Ｃ−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２に従って、ベクター内の発現カセットのために設計されてよい。カセット内の表記は上記の通りであるが、さらにＸ２は、ランダム化アミノ酸の第２の配列を意味する。
第２ライブラリ−単一ループ（標的Ｂ用）。単一ループを含む第２のペプチドライブラリは、一般式Ｎｔｅｒｍ−Ｃ−Ｒ１−Ｙ１−Ｃ−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２に従って、ベクター内の発現カセットのために設計されてよい。カセット内の表記は上記の通りであるが、さらにＹ１は、ランダム化アミノ酸残基の第３の配列を意味する。
第２ライブラリ−２ループ（標的Ｂ用）。２つのループを含む第２のペプチドライブラリは、一般式Ｎｔｅｒｍ−Ｃ−Ｒ１−Ｙ１−Ｃ−Ｒ３−Ｙ２−Ｃ−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２に従って、ベクター内の発現カセットのために設計されてよく、この際、Ｙ２は、ランダム化残基の第４の配列を意味する（その他の表記は上記の通り）。
これらの設計において、第１および第２の単一ループライブラリは、対応する２つのループライブラリから容易に導くことができることに留意されたい。例えば、２ループライブラリで、標的選択後に第２のループを、部位Ｒ１およびＲ２に特異的な制限酵素による消化により（カセットＮｔｅｒｍ−Ｃ−Ｘ１−Ｃ−Ｒ１−Ｘ２−Ｃ−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２に関して）、または部位Ｒ３およびＲ２に特異的な制限酵素による消化後に（カセットＮｔｅｒｍ−Ｃ−Ｒ１−Ｙ１−Ｃ−Ｒ３−Ｙ２−Ｃ−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２に関して）除去することができる。消化の後に、部分的カセットＲ１−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２またはＲ３−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ１（適したプライマーを用いてＰＣＲにより調製することができる）のＤＮＡの連結による挿入が続き、設計Ｎｔｅｒｍ−Ｃ−Ｘ１−Ｃ−Ｒ１−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２またはＮｔｅｒｍ−Ｃ−Ｒ１−Ｙ１−Ｃ−Ｒ３−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２の単一ループライブラリが得られる。
これらのライブラリはまた、３つの制限部位での適した切り出しおよび貼り付けにより容易に再結合させることができる。第１のライブラリから選択された標的特異的（ファージ特異的）クローンのプールのためのベクターＤＮＡを、ファージのプールを発現している細菌から調製する。少なくとも第２のライブラリの発現カセットを含むＤＮＡも、例えば選択されたファージのプールからのＤＮＡのＰＣＲ増幅により、調製する。第１のライブラリ由来のベクターＤＮＡおよび少なくとも第２のライブラリの発現カセットを含むＤＮＡを、Ｒ１およびＲ２をコードするＤＮＡに特異的な制限酵素で消化させ、その後に連結し、発現のために細菌に形質転換する。これにより、第１の（標的Ａで選択した）ライブラリのＸ１−ｌｏｏｐに続いて第２の（標的Ｂで選択した）ライブラリのＹ１−ｌｏｏｐを含むコンビナトリアルライブラリが得られる。得られるライブラリ中のクローンは、得られる発現カセットＮｔｅｒｍ−Ｃ−Ｘ１−Ｃ−Ｒ１−Ｙ２−Ｃ−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２またはＮｔｅｒｍ−Ｃ−Ｘ１−Ｃ−Ｒ１−Ｙ２−Ｃ−Ｒ３−Ｆｕｓｉｏｎ−Ｒ２（表記は上記の通り）を有することになる。
実施例５．二環式ペプチドのプロテアーゼ耐性
Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９の二環式ペプチドＰＫ１５およびＣＧ４を、それぞれプロテアーゼであるカリクレインおよびカテプシンＧに対して選択した。二環式ペプチドがこれらのプロテアーゼによる消化に耐性であれば、それは驚くべきことではない、特に足場の制約された性質は、タンパク質分解作用に対する保護に役立つはずである。
本発明者らは、直鎖状ＰＫ１５（ヨードアセトアミドで処理したシステイン）と、ＴＢＭＢ足場にコンジュゲートしたＰＫ１５、カリクレインと、その他のプロテアーゼとを比較した、下の表を参照されたい（スケールの範囲は、＋＋＋（実質的に無傷である）から−（完全に切断された）までである）。予測したようにＴＢＭＢを含むＰＫ１５抱合体は、カリクレインによる攻撃に対して直鎖状よりも耐性が高かった。異なる濃度の酵素を比較することによって示されるように、係数は約１００倍であった。
その他のプロテアーゼに関して、係数は、プロテアーゼによって、１０〜１００倍の間の範囲であった。また、本発明者らは、二環式ＣＧ４Ｌ１−ＰＫ１５Ｌ１（実施例２）のタンパク質分解に対する耐性を比較した。この場合、係数は、プロテアーゼに応じて１〜１００倍以上の範囲であった。従って、抱合体は、選択プロセスの間に曝露されたプロテアーゼ（カリクレイン）以外のプロテアーゼに対して増大した耐性を有する。
プロテアーゼによる耐性の変化は、実施例１において既に記載されるように、タンパク質分解ステップを選択またはスクリーニングプロセスに含めることが望ましいことを示唆する。最も望ましいのは、二環式ペプチドを使用する条件下で、例えば血清の存在下で活性であるプロテアーゼを使用することである。興味から本発明者らはＰＫ１５の血清に対する耐性を調べた。これにより、直鎖状ＰＫ１５が、約２時間以内に３７℃の血清中でプロテアーゼにより消化されることが示された。しかし、ＰＫ１５抱合体は、少なくとも４８時間タンパク質分解に抵抗する；それ以降の時間はまだ試験していない。
Figure 2013518807
Figure 2013518807
方法
直鎖状ペプチド（ＰＫ１５およびＣＧ４Ｌ１−ＰＫ１５Ｌ１）を、まず消化試験の前にヨードアセトアミドで処理した。これらのペプチド（約３〜４ｍｇ）を、ＨＰＬＣ（一般的な方法に記載されるようにセミ分取プロテオカラムカラム）により精製し、ＨＰＬＣ画分（約３ｍｌ）を等容積の５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで中和した。アセトニトリル（１ｍｌ）中のヨードアセトアミド（３ｍｇ、約９当量）を添加し、質量分析により反応の完了が示されるまで（一般に２〜３時間）反応物を室温で放置した。反応混合物を濃縮し（ロータリーエバポレーター）、上記のようにＨＰＬＣにより再精製した。
ペプチド（直鎖状および抱合体）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解し、約０．５ｍＭ原液の有効濃度を得た。２μｌのペプチド抱合体（実際の分子量に応じて反応物中約３０μＭ）を、反応バッファー（下記参照）に溶解して総反応容積を３０μｌとし、その後にプロテアーゼが続き、サンプルを３７℃にて１時間インキュベートした。１０μｌアリコートを２０μｌのＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）中１０％ジクロロ酢酸の中でクエンチし、−２０℃にて３０分貯蔵し、４℃（１３０００ｒｐｍ）にて５分間遠心した後、分析のためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計プレートにスポットした。
全ての反応は３７℃で行った。カテプシンＧおよびカリクレイン（ｋａｌｉｋｒｅｉｎ）の反応は、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０１％トリトンＸ１００および５％ＤＭＳＯ中で実施した。キモトリプシン反応は、１００ｍＭトリスｐＨ７．４、１０ｍＭ ＣａＣｌ２中で実施した。プロナーゼおよびプロテイナーゼＫの反応は、１００ｍＭトリスｐＨ７．４、０．５％ＳＤＳ中で実施した。スブチリシンの反応は、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．５中で実施した。トリプシンの反応は、６７ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．６中で実施した。血清を含む反応条件は、ペプチドを１×ＰＢＳ（総容積２４μｌ）に溶解することおよび６μｌのヒト血清をこの反応に添加することを伴う。
実施例６：二環式ペプチド−Ｆｃ断片抱合体
二環式ペプチドを抗体のＦｃフラグメントに化学的にコンジュゲートして、その循環半減期を延長させた。抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ再循環を媒介する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する、そのためにタンパク質およびその抱合体を長期間（一般に数日）循環中に保持する。ＦｃＲｎとの結合はまた、内皮および上皮性関門を横断する経細胞輸送を媒介し、ＩｇＧおよびＦｃおよびそれらの抱合体のエアゾール送達を許容する。
マレイミド官能化二環式ペプチドＰＫ１５の調製
二環式ペプチドＰＫ１５（ＴＢＭＢとコンジュゲートしたＮＨ２−ＡＣＳＤＲＦＲＮＣＰＡＤＥＡＬＣＧ−ＮＨ２）のＮ末端を、アミン反応性およびスルフヒドリル反応性リンカー（Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル）（ＥＭＣＳ）で修飾した。ＤＭＳＯに溶解させた５０ｍＬのリンカー（２ｍＭ）を、５０ｍＭトリスｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ中９５０ｍＬのＰＫ１５（５０ｍＭ）に添加し、混合し、２５℃にて１時間インキュベートした。反応生成物をクロマトグラフによって精製した。
Ｆｃフラグメントの調製
Ｆｃγ１断片を、ヒト正常ＩｇＧ１からタンパク質をパパインで消化し、鎖間ジスルフィド架橋を選択的還元することによるか（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ＧＴ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９７）、または哺乳動物細胞におけるＦｃフラグメントの組換え発現から調製した。後者の場合は、セレノシステインを組み込んで二環式ペプチドを化学反応において選択的に結合することのできるハンドルを得た（Ｈｏｆｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００８）。
Ｆｃフラグメントの酵素による調製のため、２０ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧを、０．５ｍＭ ２−メルカプトエタノールの存在下、パパイン（０．５ｍｇ／ｍｌ）とともに３７℃およびｐＨ６．７にて２０分間インキュベートした。これらの条件下で、大部分のＩｇＧが切断され、分子内ジスルフィド結合の還元は検出されなかった。ＦｃフラグメントをＦａｂおよび未消化のＩｇＧから分離した。この断片の２つの鎖間結合（ヒンジ部）を、１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ；２ｍＭ）にｐＨ８および２５℃にて１５分間曝露することにより還元した。ＤＴＴを除去し、緩衝液を０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５に交換した。還元したシステインのうちの一つを、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）と、０．７５当量のＮＥＭの添加および３７℃で２時間のインキュベーションにより反応させた。次に、ジスルフィド架橋のうちの一つを再構成し、残っているシステイン残基をマレイミド活性化二環式ペプチドＰＫ１５と反応させ、固定化ヒト血漿カリクレインおよびゲル濾過を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
Ｃ末端セレノシステイン残基を用いるＦｃフラグメントの組換え発現のために、ヒトＩｇＧ由来Ｆｃフラグメントをコードする遺伝子、ＴＧＡコドン、ヘキサヒスチジンタグおよびヒトセレン含有タンパク質チオレドキシンレダクターゼ１の遺伝子の３’ＵＴＲを、哺乳動物発現ベクターに挿入した。このタンパク質を、セレノシステイン源（Ｎａ２ＳｅＯ３；１ｍＭ）を含有する血清フリー培地を含む懸濁液中のＨＥＫ２９３細胞で発現させ、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したＦｃ−セレノシステインタンパク質のマレイミド官能化二環式ペプチドＰＫ１５との、０．１ｍＭ ＤＴＴの存在下、ｐＨ５．２の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中２５℃にて１時間のインキュベーションにより、ペプチドとＦｃフラグメントの部位選択的結合がもたらされた。このＦｃフラグメント−環式ペプチド抱合体を、固定化ヒト血漿カリクレインを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、かつゲル濾過により順次精製した。
実施例７：細胞を透過する二環式ペプチド抱合体
それらのＣ末端に様々な細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列または制御配列を含有する、いくつかのＰｅｐ４８誘導体のフルオレセインまたはメトキシ−クマリン修飾型を調製した。フルオロフォアは常にＮ末端に結合した。配列は次の通りである。
Figure 2013518807
ＣＰＰ配列は、通常数個の連続するアルギニンを含有し（Ｐｅｐ４８−Ｒ３、Ｐｅｐ４８Ｔ−１および−３を参照）、これらのポリアルギニンは、アルギニンをそのＤ型で用いる（Ｐｅｐ４８Ｔ−２）ことによりさらに安定化され得る（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００９，ＰＭＩＤ：１９９２５７９１）。Ｐｅｐ４８Ｔ−４およびＰｅｐ４８Ｔ−５は、それぞれＣＰＰ配列ＨＩＶ−ｔａｔおよびペネトラチンを含有する。両方のＣＰＰは、標的分子の細胞取り込みの促進において十分に確立されている（Ｗａｄｉａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４ １０（３）：３１０−５，およびＤｏｍ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３，３１（２）：５５６−６１）。
Ｐｅｐ４８配列は、実施例１に記載されるように約１．２μＭのＫｄでＭｄｍ２と結合する能力のある（ＴＢＭＢ抱合体として）配列に相当する。Ｐｅｐ４８Ｔ配列は、後に１００ｎＭの推定Ｋｄで選択される、より堅く結合親和性成熟したＰｅｐ４８誘導体に相当する。第１ループの配列は、いずれの場合にも同一である。
２つの細胞株、ＨｅＬａおよびＨＣＴ１１６を、これらの実験に使用した。ＨｅＬａは、ヒトネグロイド子宮頸部類上皮細胞癌腫であり、ＨＣＴ１１６は、ヒト結腸癌腫である。両方の細胞種は広く入手可能である；例として、ＨｅＬａ細胞は、ＵＫ ＨＰＡからカタログ番号９３０２１０１３で入手可能である。ＨＣＴ１１６細胞は、ＵＫ ＨＰＡからカタログ番号９１０９１００５で入手可能である。
細胞を、Ｌａｂ−Ｔｅｋホウケイ酸カバーガラスチャンバー（Ｎｕｎｃ社製）に播種した。４８時間培養した後（細胞は４０〜６０％培養密度に達した）、培地を取り除き、１０μＭのペプチドを添加した新鮮な培地を細胞に加えた。細胞をさらに３．５時間または２４時間培養した。インキュベーション時間の終わりに細胞を３回ＤＭＥＭで洗浄し、最後に１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加したＤＭＥＭ完全培地再懸濁した。生細胞イメージングをレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ ７１０、ツァイス社製）で行って、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）および蛍光画像を得た。
フルオレセインＰｅｐ４８−Ｒ３およびＰｅｐ４８−Ｄ３ ＴＢＭＢ抱合体ペプチドをＨＣＴ１１６細胞とともにインキュベートすることにより、「Ｒ３」ペプチドによる細胞内の蛍光染色が示されたが、「Ｄ３」ペプチドでは示されなかった。これは、二環式ペプチドが細胞を透過することができることを示し、上に引用される、いくつかのアルギニン残基がこれを促進する可能性があるとの文献に一致する。
ＨｅＬａ細胞での、ＴＢＭＢを含むその他のフルオレセインペプチド抱合体（Ｐｅｐ４８Ｔ１−５）を用いるその後の実験により、それらは全て細胞を透過することが示された。一般に染色は点状であったので、ペプチドがエンドソームに蓄積した可能性が示唆される。
ＴＢＭＢを含むクマリンペプチド抱合体はまた、細胞に選択的に侵入すると思われた（対応する「Ｒ３」および「Ｄ３」抱合体によって示される通りであるが、蛍光発光シグナルは弱かったので、画像の解釈はより困難となった）。
方法
Ｐｅｐ４８Ｔ−１〜Ｐｅｐ４８Ｔ−５を実施例３に記載されるように、０．２５ミリモルのスケールで上記のように合成し、各々のカップリングステップの後に最後の１０残基をキャップした。次に、５種類の細胞透過性ペプチドの各々の樹脂を等しい部分に分割し、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで脱保護し、５，６カルボキシフルオレセインスクシンイミド（５，６−ＦＡＭ）（ビオチウム社）またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−メトキシクマリン（Ｌｙｓ−Ｍｃａ）（ノバ・バイオケム社）と反応させた。前者には、３００ｍｇの５，６−ＦＡＭを、５．１ｍＬのＤＭＦに溶解し、１．０２ｍＬのアクチベーター・ベース（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｂａｓｅ）（３４．５ｍＬジイソプロピルエチルアミンおよび６５．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリドンの原液由来）を添加した。１．２２ｍＬのこの混合物を、脱保護したＤＭＦ洗浄ペプチド樹脂と反応させ、室温にて１６時間振盪した。次に、樹脂を排水し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、前述同様にＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏで切断した。Ｌｙｓ−Ｍｃａをペプチド合成装置で室温にて１時間、標準的なカップリングプロトコールを用いてＮ末端に結合させた。蛍光標識されたＰｅｐ４８−Ｒ３およびＰｅｐ４８−Ｄ３を、０．１ミリモルのスケールを除いて上記のように調製した。
次に、これらのペプチドを、実施例３に記載されるように、次の通りＴＢＭＢにコンジュゲートした。１）切断し凍結乾燥したペプチドの、６Ｍグアニジウム塩酸塩＋ＤＴＴ（０．２ｇ／５ｍＬ）への溶解、２）Ｈ２Ｏ／アセトニトリル／０．１％ヘプタフルオロ酪酸勾配を用いるＨＰＬＣ、３）正確な画分を同定するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、４）４０ｍＭ重炭酸アンモニウムの存在下、ＴＢＭＢとのカップリング、５）凍結乾燥、６）６Ｍグアニジウム塩酸塩への溶解、６）２）と同様のＨＰＬＣ、７）３）と同様のＭＳ、８）最終凍結乾燥。蛍光標識されたペプチドの濃度を、フルオレセインに関して４９２ｎｍで６６，０００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いることにより推定した。同様に、クマリン標識ペプチド濃度を、３２４ｎｍでＥ＝１２，０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて決定した。
細胞は、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて、「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社）で培養し、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＤＭＥＭ完全培地）を添加した。
上記明細書において言及される全ての刊行物は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明の記載される態様および実施形態の様々な変更および変形は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことは当然理解される。実際に、当業者には明らかな、本発明を実行するための記載される形態の様々な変更は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (38)

  1. ３以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合し、かつ２以上の別個の標的と結合する能力のあるポリペプチドを含む、多重特異性ペプチドリガンドを提供するための方法であって、
    （ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップであって、各々のポリペプチドが、分子足場と共有結合する能力のある２以上の反応性基、および２つの前記反応性基間に内在する２以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも一つのループを含む、ステップと、
    （ｂ）（ａ）に記載されるポリペプチドの第２のレパートリを準備するステップと、
    （ｃ）前記第１のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループを、前記第２のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループと連結して、２つのループを含む少なくとも一つのポリペプチドを形成するステップと、
    （ｄ）前記複合ポリペプチド（１または複数）を、少なくとも３つのアミノ酸位置で分子足場にコンジュゲートするステップと
    を含む、方法。
  2. 前記第１および第２のレパートリを、第１および第２の標的との結合についてスクリーニングして、ステップ（ｃ）で用いた前記１以上のメンバーを単離する、請求項１に記載の方法。
  3. （ｉ）前記第１または第２のレパートリの前記メンバーを分子足場にコンジュゲートし、前記第１または第２の標的に対する結合についてスクリーニングするステップ、または
    （ｉｉ）前記第１または第２のレパートリの前記メンバーを、前記反応性基によって架橋するステップと、
    前記第１または第２の標的に対する結合についてスクリーニングするステップと
    により、前記第１および第２のレパートリが、結合についてスクリーニングされる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１および／または第２のレパートリの前記メンバーが、分子足場にコンジュゲートされて単一ループを形成する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記第１のレパートリの前記メンバーが、分子足場にコンジュゲートされて２以上のループを形成し、かつ、その単一ループが、前記第２のレパートリの前記メンバーの少なくとも一つのループに連結されている、請求項３に記載の方法。
  6. ステップ（ｃ）により、ペプチドリガンドの第３のレパートリの形成がもたらされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第１および第２のレパートリのうち一つが未処理である、請求項６に記載の方法。
  8. ３以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合し、かつ２以上の別個の標的と結合する能力のあるポリペプチドを含む、多重特異性ペプチドリガンドを提供するための方法であって、
    （ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップと、
    （ｂ）前記ポリペプチドを、少なくとも一つのループを形成する２以上のアミノ酸残基で前記ポリペプチドに結合する分子足場にコンジュゲートして、ポリペプチド抱合体の第１のレパートリを形成するステップと、
    （ｃ）前記第１のレパートリを第１の標的に対する結合についてスクリーニングし、前記第１の標的に結合する前記第１のレパートリのメンバーを選択するステップと、
    （ｄ）ポリペプチドの第２のレパートリを用いてステップ（ａ）〜（ｃ）を反復するステップであって、第２の標的に結合するポリペプチド抱合体の第２のレパートリを得るステップと、
    （ｅ）前記第１および前記第２のレパートリのメンバーからループを単離し、それらを合わせて前記ポリペプチドが前記分子足場と少なくとも３つのアミノ酸で結合しているポリペプチド抱合体の第３のレパートリを形成し、前記第１と前記第２の標的の両方と結合する能力のある分子を選択するステップと
    を含む、方法。
  9. １以上のレパートリのポリペプチド抱合体を、プロテアーゼで処理する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. １以上のレパートリの前記ポリペプチド抱合体が、還元剤およびプロテアーゼで処理される、請求項９に記載の方法。
  11. ポリペプチドの１以上の前記レパートリが、核酸分子の１以上のライブラリによりコードされる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記レパートリの前記スクリーニングが、遺伝子ディスプレイ系を用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記遺伝子ディスプレイ系が、ファージディスプレイである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記多重特異性ペプチドリガンドが、二重特異性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第３のレパートリのメンバーによる前記第１および第２の標的との結合が、同時に起こり得る、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第３のレパートリのメンバーによる前記第１および第２の標的との結合が、同時に起こり得ない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第３のレパートリのメンバーを、前記第１の標的に対してスクリーニングし、次に結合するものを前記第２の標的に対してスクリーニングする、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記第１の標的との結合についての前記第１のスクリーニングの後に、前記第３のレパートリを増幅し、次に前記第２の標的に対してスクリーニングする、請求項１７に記載の方法。
  19. ２以上の標的と結合することが可能である、少なくとも３つのアミノ酸位置で分子足場と共有結合したポリペプチドを含む多重特異性ペプチドリガンド。
  20. ２以上の標的と同時に結合することが可能である、請求項１９に記載の多重特異性リガンド
  21. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により得られる、請求項１９または請求項２０に記載の多重特異性ペプチドリガンド。
  22. １以上の官能基にコンジュゲートした、分子足場と共有結合したポリペプチドを含むペプチドリガンド。
  23. １以上の官能基にコンジュゲートした、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
  24. 前記ポリペプチドのＮ末端、前記ポリペプチドのＣ末端、および前記分子足場から選択される１以上の位置で前記官能基が結合している、請求項２２または請求項２３に記載のペプチドリガンド。
  25. 前記官能基が、インビボで前記ペプチドリガンドの半減期を延長する分子に結合するリガンドである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
  26. インビボで前記ペプチドリガンドの半減期を延長する前記分子が、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質である、請求項２５に記載のペプチドリガンド。
  27. インビボで前記ペプチドリガンドの半減期を延長する分子に結合する前記リガンドが、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質に特異的な抗体または抗体フラグメントである、請求項２６に記載のペプチドリガンド。
  28. 前記官能基が、分子足場と共有結合したポリペプチド、１０００ダルトン未満の化学基、および抗体または抗体フラグメントからなる群から選択されるリガンドである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
  29. 前記官能基が、エフェクター基である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
  30. 前記エフェクター基が、抗体Ｆｃ領域である、請求項２９に記載のペプチドリガンド。
  31. 前記エフェクター基が、細胞透過性ペプチドである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
  32. 前記細胞透過性ペプチドが、ポリアルギニン、ＶＰ−２２、アンテナペディア、ＨＩＶ−ｔａｔおよびペネトラチンからなる群から選択される、請求項３１に記載のペプチドリガンド。
  33. 請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンドを調製するための方法であって、
    （ａ）前記ポリペプチドを製造するステップと、
    （ｂ）それを前記分子足場にコンジュゲートするステップと、
    （ｃ）前記１以上の官能基を前記ポリペプチドの前記Ｎ末端またはＣ末端に結合するステップと
    を含む、方法。
  34. 前記官能基が、ＦＭＯＣである、請求項３３に記載の方法。
  35. 請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンドを調製するための方法であって、
    （ａ）前記ポリペプチドを製造するステップと、
    （ｂ）それを前記分子足場にコンジュゲートするステップと、
    （ｃ）前記１以上の官能基を前記分子足場に結合するステップと
    を含む、方法。
  36. 分子量が３０００ダルトン未満である、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
  37. 分子量が５０００ダルトン未満である、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
  38. 前記ポリペプチドと前記分子足場の任意の２つの隣接する結合点間に内在する前記ポリペプチドループの長さが、０〜９アミノ酸の間であり、前記結合点の最初と最後の間の前記ポリペプチド配列の長さが２７アミノ酸より短い、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
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