CN112566651A - 特异于结合素-4的双环肽配体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与分子支架共价结合的多肽，其使得两个或更多个肽环在支架的连接点之间相对。特别地，本发明描述了作为结合素‑4(Nectin‑4)的高亲和力结合子的肽。本发明还包括药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的所述肽、包含所述肽配体和药物缀合物的药物组合物、以及所述肽配体和药物缀合物在预防、抑制或治疗结合素‑4介导的疾病或病症中的用途。

Description

特异于结合素-4的双环肽配体
技术领域
本发明涉及与分子支架共价结合的多肽，其使得两个或更多个肽环在支架的连接点之间相对(subtend)。特别地，本发明描述了作为结合素-4的高亲和力结合子的肽。本发明还包括药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的所述肽、包含所述肽配体和药物缀合物的药物组合物、以及所述肽配体和药物缀合物在预防、抑制或治疗结合素-4介导的疾病或病症中的用途。
背景技术
环肽能够以高亲和力和靶向特异性结合于蛋白质靶标，因此是对于治疗学的发展有吸引力的分子类型。事实上，临床上已经成功使用了几种环肽，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制剂药物环孢菌素或抗癌药奥曲肽(Driggers等人(2008)，Nat Rev Drug Discov 7(7)，608-24)。良好的结合性质来源于肽和靶标之间形成的相对大的相互作用表面以及环状结构的降低的构象柔性。典型地，大环结合于数百平方埃的表面，例如环肽CXCR4拮抗剂CVX15(
Figure BDA0002942622430000011
Wu等人(2007)，Science330,1066-71)，结合整合蛋白αVb3的具有Arg-Gly-Asp基序的环肽
Figure BDA0002942622430000012
(Xiong等人(2002)，Science 296(5565)，151-5)，或与尿激酶型纤溶酶原激活物结合的环肽抑制剂upain-1(
Figure BDA0002942622430000013
Zhao等人(2007)，J Struct Biol 160(1)，1-10)。
由于其环状构型，肽大环较线性肽柔性小，导致其与靶标结合时熵的损失较小并产生更高的结合亲和力。降低的柔性还导致锁定靶标特异性构象，与线性肽相比增加结合特异性。这种作用已经通过一种有效的、选择性基质金属蛋白酶8(MMP-8)抑制剂来例证，当其环被打开时该抑制剂丧失对其它MMP的选择性(Cherney等人(1998)，J Med Chem 41(11)，1749-51)。通过大环化获得的有利的结合性质在具有多于一个肽环的多环肽中更为显著，例如在万古霉素、乳链菌肽和放线菌素中。
不同的研究团队以前已经将具有半胱氨酸残基的多肽连接到合成分子结构上(Kemp和McNamara(1985),J.Org.Chem；Timmerman等人(2005)，ChemBioChem)。Meloen及其同事已经使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速和定量地环化到合成支架上，用于蛋白质表面的结构模拟(Timmerman等人(2005)，ChemBioChem)。公开了产生候选药物化合物的方法，其中通过将含半胱氨酸的多肽与分子支架例如TATA(1,1’,1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮连接，产生所述化合物，Heinis等人Angew Chem,IntEd.2014；53：1602-1606)。
已经开发了基于噬菌体展示的组合方法以产生并筛选出针对目标靶标的双环肽的大型文库(Heinis等人(2009)，Nat Chem Biol 5(7)，502-7和WO2009/098450)。简言之，在噬菌体上展示含有三个半胱氨酸残基和六个随机氨基酸的两个区域的线性肽(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)的组合文库，并通过将半胱氨酸侧链共价连接至一个小分子支架而环化。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了特异于结合素-4(Nectin-4)的肽配体，其包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个半胱氨酸残基，所述分子支架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，其中所述肽配体包含氨基酸序列：
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(SEQ ID NO：1)，
其中，1Nal代表1-萘基丙氨酸，HArg代表高精氨酸，HyP代表羟基脯氨酸、以及Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基，或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的本文所限定的肽配体。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所限定的肽配体或药物缀合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
根据本发明的另一方面，提供了本文所限定的肽配体或药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗结合素-4介导的疾病或病症。
附图说明
在图中存在时，误差棒代表平均值的标准误(SEM)。
图1和图2：向携带NCI-H292异种移植物的雌性BALB/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图3和图4：向携带HT-1376异种移植物的雌性CB17-SCID小鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图5：向携带Panc2.13异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图6：向携带MDA-MB-468异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图7：向携带NCI-H292异种移植物的雌性BALB/c裸鼠施用BCY8549(以BCY8245作为对照)后的肿瘤体积轨迹。
图8：乳腺中结合素-4的门控策略(gating strategy)(T-47D和MDA-MB-468)。
图9：NCI-H292和NCI-H322中结合素-4的门控策略。
图10和图11：分别在NCI-H526和HT1080中的结合素-4的门控策略。
图12-16：分别在膀胱癌(HT1376；图12)、乳腺癌(MDA-MB-468；图13)、结肠直肠癌(HT-29；图14A和HCT-116；图14B)、肺癌(A549；图15A，NCI-H292；图15B，NCI-H358；图15C和NCI-526；图15D)、和胰腺癌(Panc02.13；图16)中的结合素-4的门控策略。
图17：向携带A549异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图18：向携带HCT116异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图19：向携带HT-1376异种移植物的雌性CB17-SCID小鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图20：向携带MDA-MB-468异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图21：向携带NCI-H292异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图22：向携带NCI-H526异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图23：向携带Panc2.13异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245后的肿瘤体积轨迹。
图24：向携带MDA-MB-468异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY8245或BCY8245与BCY8234的组合后的肿瘤体积轨迹。
图25：向携带MDA-MB-468异种移植物的雌性Balb/c裸鼠单独施用BCY8245或施用BCY8245与BCY8234组合后的肿瘤体积轨迹。
图26至图31：Lu-01-0412、LU-01-0007、CTG-1771、CTG-1171、CTG-1106、和CTG-0896PDX异种移植物中的肿瘤体积轨迹。
图32：BT8009(即BCY8245)疗效与CDX/PDX异种移植物的表达相关。结合素-4的表达少/无表达的异种移植物显示肿瘤生长速率降低。表达结合素-4的异种移植物显示肿瘤消退。此分析包括PDX和CDX模型，从各种报告中整理出值。
图33：MDA-MB-468细胞表达结合素-4，并显示MMAE在肿瘤中的保留延长。
图34：HCS-在MDA-MB-468细胞系上的数据分析。
具体实施方式
在一个实施方案中，CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(SEQ ID NO：1)的肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8234)；
Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8122)；
Ac-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8126)；
(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8116)；
荧光素-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8205)；和
[PYA][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8846)。
在另一个实施方案中，CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(SEQ ID NO：1)的肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8234)；
Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8122)；
Ac-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8126)；
(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8116)；和
荧光素-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8205)。
在又一个实施方案中，CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(SEQ ID NO：1)的肤配体包含选自以下的氨基酸序列：
Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8122)；
Ac-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8126)；和
(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8116)。
数据在本文中显示在表2中，其表明通过SPR结合数据证实，该实施方案的肽配体显示对人结合素-4极好的结合水平。
在又一个实施方案中，CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(SEQ ID NO：1)的肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8122)；和
Ac-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8126)。
数据在本文中显示在表1中，其表明通过竞争结合数据结合数据证实，该实施方案的肽配体显示对人结合素-4极好的结合水平。
在又一个实施方案中，CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(SEQ ID NO：1)的肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8234)。
数据在本文中显示在表3中，其表明通过SPR结合数据证实，当该实施方案的肽配体缀合至细胞毒性剂时，显示对人结合素-4极好的结合水平(＜10nM)。
在一个实施方案中，所述分子支架是1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义，例如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域。对于分子生物学、遗传和生物化学方法使用标准技术(参见Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第三版，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版，John Wiley&Sons，Inc.)，其通过引用并入本文。
命名法
编号
当提及本发明的肽内的氨基酸残基位置时，由于半胱氨酸残基是不变的，因而从编号中省略了半胱氨酸残基(Ci、Cii和Ciii)，因此，本发明的肽内的氨基酸残基的编号参考如下：
Ci-P1-[1Nal]2-[dD]3-Cii-M4-[HArg]5-D6-W7-S8-T9-P10-[HyP]11-W12-Ciii(SEQ IDNO：1)。
为了该描述的目的，假设所有双环肽都用1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)环化，产生三取代的结构。用TATA的环化发生在Ci、Cii和Ciii上。
分子形式
将双环核心序列的N-或C-末端延伸加入到序列的左侧或右侧，并用连字符隔开。例如，N末端(β-Ala)-Sar10-Ala尾将表示为：
βAla-Sar10-A-(SEQ ID NO：X)。
反向肽序列
根据Nair等人(2003)J Immunol 170(3)，1362-1373中公开的，设想本文公开的肽序列也将以其逆反形式使用。例如，顺序是反向的(即，N-末端变成C-末端，反之亦然)，它们的立体化学也被颠倒(即，D-氨基酸变成L-氨基酸，反之亦然)。
肽配体
本文所指的肽配体是指共价结合至分子支架的肽。通常，此类肽包含能够与支架形成共价键的两个或更多个反应性基团(即半胱氨酸残基)、以及在所述反应性基团之间相对的序列(称为环序列)，之所以称为环序列，是因为当肽与支架结合时，其形成环。在本申请的情况下，肽包含至少三个半胱氨酸残基(本文称为Ci、Cii和Ciii)，其在支架上形成至少两个环。
肽配体的优势
本发明的某些双环肽具有许多有利的性质，使它们被认为是适合注射、吸入、鼻、眼、口或局部施用的类药物分子。这些有利的性质包括：
-物种交叉反应性。这是临床前疗效学和药代动力学评估的典型要求；
-蛋白酶稳定性。双环肽配体理想应显示出对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、细胞内蛋白酶等的稳定性。应当在不同物种之间保持蛋白酶的稳定性，以便可以在动物模型中开发双环前导候选物，并可以可靠地对人进行施用；
-理想的溶解度曲线。这是带电荷的亲水残基相对于疏水性残基以及分子内/分子间H键的比例的函数，这对于制剂和吸收目的是重要的；
-循环中最佳的血浆半衰期。取决于临床适应症和治疗方案，可能需要开发在急性疾病管理设置中具有短暴露的双环肽，或开发具有在循环中增强保留的双环肽，并因此优选用于更多慢性疾病状态的管理。驱使所想要的血浆半衰期的其他因素是实现最大治疗效率而需要的持续暴露相对于持续暴露于试剂而伴随的毒理学；以及
-选择性。本发明的某些肽配体对其他结合素表现出好的选择性。
药学上可接受的盐
将理解盐的形式在本发明的范围内，并且提及肽配体则包括所述配体的盐形式。
本发明的盐可以通过常规的化学方法，例如Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use,P.Heinrich Stahl(编辑)，Camille G.Wermuth(编辑)，ISBN：3-90639-026-8,Hardcover,388页,2002年8月中描述的方法，由含有碱或酸部分的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中进行反应来制备。
酸加成盐(单盐或二盐)可以用各种酸(无机和有机酸)形成。酸加成盐的示例包括与选自以下的酸形成的单盐或二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、十二烷基磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如D-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙磺酸、乳酸(如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、丹宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸和阳离子交换树脂。
一组具体的盐包括由以下形成的盐：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸盐)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖醛酸。一种具体的盐是盐酸盐。另一种具体的盐是乙酸盐。
如果化合物是阴离子的或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，则可以用产生适当的阳离子的有机或无机碱形成盐。合适的无机阳离子的示例包括但不限于碱金属离子如Li+、Na+和K+，碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+，以及其它阳离子如Al3+或Zn+。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的取代铵离子的示例为衍生自以下的那些：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的示例是N(CH3)4 +。
当本发明的肽含有胺官能团时，例如根据本领域技术人员熟知的方法通过与烷基化剂反应，它们可以形成季铵盐。这样的季铵化合物在本发明范围内。
修饰的衍生物
应当理解，如本文定义的肽配体的修饰的衍生物在本发明的范围内。这种合适的修饰衍生物的示例包含一个或多个选自以下的修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基(例如用一个或多个等排或等电子氨基酸替换一个或多个极性氨基酸残基；用其它非天然的等排或等电子氨基酸替换一个或多个非极性氨基酸残基)；加入间隔物基团；用一个或多个氧化耐受性氨基酸残基替换一个或多个氧化敏感性氨基酸残基；用丙氨酸替换一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体中一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键(surrogate bond)替换一个或多个肽键；肽骨架长度修饰；用另一个化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，用合适的胺、硫醇、羧酸和酚反应性试剂修饰氨基酸如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和酪氨酸，以功能化所述氨基酸，和引入或替换氨基酸，以引入适合于官能化的正交反应性，例如携带叠氮化物或炔烃基团的氨基酸分别允许用携带炔烃或叠氮化物的部分进行官能化。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端和/或C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，其中所述修饰的衍生物包含使用合适的氨基反应性化学的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应性化学的C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，所述N-末端或C-末端修饰包含加入效应物基团，包括但不限于细胞毒性剂、放射螯合剂(radiochelator)或发色团。
在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端修饰。在一个进一步实施方案中，N-末端修饰包含N-末端乙酰基。在该实施方案中，在肽合成期间，N-末端半胱氨酸基团(该基团在本文称为Ci)被乙酸酐或其它合适的试剂封端，产生N-末端乙酰化的分子。该实施方案提供了除去氨基肽酶的潜在识别位点并避免双环肽降解可能性的优点。
在一个替代实施方案中，N-末端修饰包含加入有助于效应物基团缀合和保持双环肽对其靶标的效力的分子间隔物基团。
在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，C-末端修饰包含酰胺基。在该实施方案中，C-末端半胱氨酸基团(该基团在此称为Ciii)在肽合成期间被合成为酰胺，产生C末端酰胺化的分子。该实施方案提供了除去羧肽酶的潜在识别位点并降低双环肽的蛋白水解降解可能性的优点。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，可以选择非天然氨基酸，其具有不被降解性蛋白酶识别、也不对靶标效力产生任何副作用的等排/等电子侧链。
可替代地，可以使用具有约束的氨基酸侧链的非天然氨基酸，使得在构象和空间上阻碍邻近肽键的蛋白水解。具体而言，这些涉及脯氨酸类似物、大体积侧链、Cα--二取代衍生物(例如，氨基异丁酸，Aib)、和环氨基酸、为氨基-环丙基羧酸的简单衍生物。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含加入间隔物基团。在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含向N-末端半胱氨酸(Ci)和/或C-末端半胱氨酸(C iii)加入间隔物基团。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个氧化耐受性氨基酸残基替换一个或多个氧化敏感性氨基酸残基。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个疏水性氨基酸残基替换一个或多个带电荷的氨基酸残基。在替代实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个带电荷的氨基酸残基替换一个或多个疏水性氨基酸残基。带电荷的氨基酸残基与疏水性氨基酸残基的正确平衡是双环肽配体的重要特征。例如，疏水性氨基酸残基影响血浆蛋白结合的程度，因此影响血浆中可利用的游离级分的浓度，而带电荷的氨基酸残基(具体是精氨酸)可以影响肽与细胞表面上的磷脂膜的相互作用。两者组合可以影响肽药物的半衰期、分布容积和暴露，并可以根据临床终点进行调整。另外，带电荷的氨基酸残基与疏水性氨基酸残基的正确组合和数量可以减少注射部位的刺激(如果肽药物已经皮下施用)。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基。据信该实施方案通过空间位阻和通过D-氨基酸稳定β-转角构象的倾向来增加蛋白水解稳定性(Tugyi等人(2005)PNAS,102(2)，413–418)。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包括除去任何氨基酸残基并用丙氨酸进行取代。该实施方案提供了除去潜在的蛋白水解攻击位点的优势。
应当注意，上述提及的每种修饰用于有意地改善肽的效力或稳定性。基于修饰的进一步的效力改善可以通过以下机制来实现：
-并入展现疏水效应并导致降低的解离速率的疏水部分，从而实现更高的亲和力；
-并入展现大范围离子相互作用的带电荷基团，导致结合速率更快和更高的亲和力(参见例如Schreiber等人，Rapid,electrostatically assisted association ofproteins(1996)，Nature Struct.Biol.3,427-31)；和
-在肽中合并入另外的约束，例如通过正确地约束氨基酸的侧链，从而使靶标结合后的熵损失最小化；约束骨架的扭转角，从而使靶标结合后的熵损失最小化；和出于相同的原因而在分子中引入另外的环化。
(综述参见Gentilucci等人，Curr.Pharmaceutical Design,(2010)，16,3185-203和Nestor等人，Curr.Medicinal Chem(2009)，16,4399-418)。
同位素变异
本发明包括本发明的所有药学上可接受的(放射性)同位素标记的肽配体，其中一个或多个原子被具有相同原子数的原子代替，但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数，和本发明的肽配体，其中连接能够容纳相关的(放射性)同位素的金属螯合基团(称为“效应物”)，和本发明的肽配体中的某些官能团被共价替换为相关的(放射性)同位素或同位素标记的官能团。
适合于包含在本发明肽配体中的同位素的示例包括氢的同位素，如2H(D)和3H(T)，碳的同位素，如11C、13C和14C，氯的同位素，如36Cl，氟的同位素，如18F，碘的同位素，如123I、125I和131I，氮的同位素，如13N和15N，氧的同位素，如15O、17O和18O，磷的同位素，如32P，硫的同位素，如35S，铜的同位素，如64Cu，镓的同位素，如67Ga或68Ga，钇的同位素，如90Y，和镥的同位素，如177Lu，以及铋的同位素，如213Bi。
某些同位素标记的本发明的肽配体，例如并入放射性同位素的那些，可用于药物和/或底物组织分布研究，并临床评估患病组织的结合素-4靶标的存在和/或不存在。本发明的肽配体可以进一步具有有价值的诊断性质，因为它们可用于检测或鉴定标记化合物与其它分子、肽、蛋白质、酶或受体之间的复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用用标记试剂标记的化合物，标记试剂如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、发光蛋白和荧光素酶)等。放射性同位素氚，即3H(T)和碳-14，即14C，鉴于其容易并入和方便的检测手段，而特别用于该目的。
用较重的同位素如氘(即2H(D))的取代可以提供由更大的代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求，因此在一些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素(如11C、18F、15O和13N)取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查靶标占有率。
本发明的肽配体的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例中描述的那些类似的方法来制备，使用适当的同位素标记的试剂代替之前使用的非标记的试剂。
分子支架
在一个实施方案中，分子支架包括非芳族分子支架。本文提及的“非芳族分子支架”是指本文定义的任何分子支架，其不包含芳族(即不饱和)碳环或杂环环体系。
适当的非芳族分子支架的示例描述于Heinis等人(2014)Angewandte Chemie,International Edition 53(6)1602-1606中。
如之前的文件中所述，分子支架可以是小分子，例如有机小分子。
在一个实施方案中，分子支架可以是大分子。在一个实施方案中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。
在一个实施方案中，分子支架包含能够与多肽的官能团反应形成共价键的反应性基团。
分子支架可以包括与肽形成连接的化学基团，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤化物和酰基卤化物。
含有αβ不饱和羰基的化合物的示例是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Angewandte Chemie,International Edition(2014)，53(6)，1602-1606)。
效应物和官能团
根据本发明的进一步方面，本发明提供一种药物缀合物，其包含与一个或多个效应物和/或官能团缀合的如本文定义的肽配体。
效应物和/或官能团可以连接于例如多肽的N和/或C末端、多肽内的氨基酸、或分子支架。
合适的效应物基团包括抗体及其部分或片段。例如，效应物基团可以包括抗体轻链恒定区(CL)、抗体CH1重链结构域、抗体CH2重链结构域、抗体CH3重链结构域、或其任何组合，以及一个或多个恒定区结构域。效应物基团还可以包含抗体的铰链区(通常在IgG分子的CH1和CH2结构域之间发现这种区域)。
在本发明该方面的一个进一步实施方案中，根据本发明的效应物基团是IgG分子的Fc区。有利地，根据本发明的肽配体-效应物基团包含具有一天或更长、两天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、或7天或更长的tβ半衰期的肽配体Fc融合物，或由其组成。最有利地，根据本发明的肽配体包含具有一天或更长的tβ半衰期的肽配体Fc融合物，或由其组成。
官能团通常包括结合基团、药物、用于连接其它实体的反应性基团、有助于将大环肽摄取入细胞中的官能团等。
肽透入细胞的能力将允许肽有效地针对细胞内的靶标。可以被具有透入细胞能力的肽接近的靶标包括转录因子、细胞内信号传导分子如酪氨酸激酶和参与细胞凋亡途径的分子。能够透入细胞的官能团包括已经加入到肽或分子支架的肽或化学基团。肽，如衍生自如VP22、HIV-Tat、果蝇(触角足(Antennapedia))的同源盒蛋白的那些，例如，如Chen和Harrison,Biochemical Society Transactions(2007)第35卷,第4部分,第821页；Gupta等人，Advanced Drug Discovery Reviews(2004)第57卷9637中所描述。已经显示在通过质膜的易位中有效的短肽的示例包括来自果蝇触角足蛋白的16个氨基酸的穿透肽(Derossi等人(1994)J Biol.Chem.第269卷，第10444页)、18个氨基酸的“模型两亲肽”(Oehlke等人(1998)Biochim Biophys Acts第1414卷，第127页)和HIV TAT蛋白的富含精氨酸的区域。非缩氨酸方法包括使用可以容易地连接到生物分子上的小分子模拟物或SMOC(Okuyama等人(2007)Nature Methods第4卷，第153页)。将胍基加入到分子中的其它化学策略也增强细胞穿透(Elson-Scwab等人(2007)J Biol Chem第282卷，第13585页)。可以将小分子量分子(如类固醇)加入到分子支架中以增强细胞摄取。
可以与肽配体连接的一类官能团包括抗体及其结合片段，如Fab、Fv或单结构域片段。具体而言，可以使用与能够增加体内肽配体半衰期的蛋白质结合的抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的肽配体-效应物基团具有选自12小时或更长、24小时或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、7天或更长、8天或更长、9天或更长、10天或更长、11天或更长、12天或更长、13天或更长、14天或更长、15天或更长、或20天或更长的tβ半衰期。有利地，根据本发明的肽配体-效应物基团或组合物将具有12至60小时范围内的tβ半衰期。在一个进一步实施方案中，其将具有一天或更长的tβ半衰期。在一个更进一步实施方案中，其将在12至26小时的范围内。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述官能团选自金属螯合剂，其适合于络合具有药用相关性的金属放射性同位素。
可能的效应物基团还包括酶，例如用于酶/前药治疗的羧肽酶G2，其中肽配体替换ADEPT中的抗体。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述官能团选自药物，例如用于癌症治疗的细胞毒性剂。合适的示例包括：烷化剂如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物，包括长春花生物碱类，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)，最初称为紫杉醇(Taxol)；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和拓扑替康，以及II型抑制剂，包括安丫啶、依托泊苷，磷酸依托泊苷和替尼泊苷。其它试剂可以包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素D(用于肾移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素、刺胞霉素等。
在本发明的一个进一步的具体实施方案中，细胞毒性剂选自美登木素生物碱类(maytansinoids)(例如DM1)或单甲基奥瑞他汀类(monomethyl auristatins)(例如MMAE)。
DM1是一种细胞毒性剂，其是美登木素(maytansine)的含硫醇衍生物，具有以下结构：
Figure BDA0002942622430000121
在本文中数据显示在表3中，其证明缀合至含有DM1的毒素的肽配体的效果。
单甲基奥瑞他汀E(MMAE)是一种合成的抗肿瘤剂，具有以下结构：
Figure BDA0002942622430000122
在本文中数据显示在表3中，其证明缀合至含有MMAE的毒素的肽配体的效果。
在本发明的一个更进一步具体的实施方案中，所述细胞毒性剂选自单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。
在一个实施方案中，所述细胞毒性剂通过可裂解的键(例如，二硫键或蛋白酶敏感的键)连接到双环肽。在一个进一步的实施方案中，与二硫键相邻的基团经过修饰以控制二硫键的阻碍(hindrance)，并由此控制切割的速率和伴随的细胞毒性剂释放。
已发表的工作确定了通过在二硫键的任一侧引入空间位阻来改变二硫键对还原的敏感性的潜力(Kellogg等人(2011)Bioconjugate Chemistry,22,717)。更大程度的空间位阻降低细胞内谷胱甘肽和细胞外(全身的)还原剂的还原速率，从而降低了细胞内外释放毒素的容易程度。因此，可以通过仔细选择二硫键的任一侧的阻碍程度来实现循环中二硫化物稳定性(其使毒素的不良副作用最小化)与细胞内环境中的有效释放(其最大化治疗效果)的最佳选择。
通过在分子构建体的靶向实体(这里是双环肽)或毒素侧上引入一个或多个甲基来调节二硫键的任一侧的阻碍。
在一个实施方案中，细胞毒性剂和接头选自WO 2016/067035中描述的那些细胞毒性剂和接头的任何组合(其细胞毒性剂和接头通过引用并入本文)。
在一个实施方案中，所述细胞毒性剂与所述双环肽之间的接头包含一个或多个氨基酸残基。适合作为合适接头的氨基酸残基的示例包括Ala、Cit、Lys、Trp和Val。
在一个实施方案中，细胞毒性剂选自MMAE，并且所述药物缀合物还包含接头，所述接头选自：-PABC-Cit-Val-戊二酰-或-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-，其中PABC代表对氨基苄基氨基甲酸酯。含有环丁基的接头的全部详细内容可见于Wei等人(2018)J.Med.Chem.61,989-1000。在进一步的实施方案中，所述细胞毒性剂选自MMAE，并且接头是-PABC-Cit-Val-戊二酰-。
在一个可选择的实施方案中，所述细胞毒性剂是DM1，并且所述药物缀合物还包含一个接头，其是-SPDB-(SO3H)-，其中SPDB代表N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。
在一个可选择的实施方案中，所述细胞毒性剂是MMAE，所述双环肽选自如本文所限定的BCY8234，并且所述接头选自-PABC-Cit-Val-戊二酰-。
该BDC如本文所知为BCY8245，示意性地表示为：
Figure BDA0002942622430000131
以及还可以更详细的方式如下所示：
Figure BDA0002942622430000141
如表3所示，本文提供的数据证明在SPR结合测定中，BCY8245与人结合素-4极佳结合。如实施例1所示的在非小细胞肺癌模型中、如实施例2所示的膀胱癌模型、实施例3所示的胰腺癌模型、和实施例4所示的乳腺癌模型中，该BDC也显示出良好的抗肿瘤活性。
在一个可选择的实施方案中，细胞毒性剂是MMAE，双环肽选自如本文定义的BCY8234，以及接头选自-PABC-环丁基-(B-Ala)-。该BDC在本文中称为BCY8549。如表3所示，本文提供的数据证明，在SPR结合测定中BCY8549与人结合素-4的结合极佳。
在另一个实施方案中，双环药物缀合物选自BCY8245或BCY8549。在另一个实施方案中，双环药物缀合物是BCY8245。如本文所述的数据所示，药物缀合物BCY8245表现出卓越的剂量依赖性抗肿瘤活性。
合成
本发明的肽可以通过标准技术合成制备，然后在体外与分子支架反应。当进行此操作时，可以使用标准化学方法。这使得能够快速大规模制备可溶性材料用于进一步的下游实验或验证。这样的方法可以使用例如Timmerman等人(同上)中公开的常规化学方法来实现。
因此，本发明还涉及如本文所述选择的多肽或缀合物的制备，其中制备包括如下说明的任选的进一步步骤。在一个实施方案中，这些步骤在通过化学合成制得的最终产物多肽/缀合物上进行。
当制备缀合物或复合物时，目标多肽中的氨基酸残基任选可以被取代。
肽也可以被延伸，以并入例如另一个环，因此引入多特异性。
为了延伸肽，可以使用标准固相或溶液相化学法，使用正交保护的赖氨酸(和类似物)，简单地在其N-末端或C-末端或在环内化学延伸。可以使用标准(生物)缀合技术来引入活化的或可活化的N-或C-末端。可替代地，可以通过片段缩合或天然化学连接进行加入(例如，如(Dawson等人1994.Synthesis of Proteins by Native ChemicalLigation.Science 266：776-779)中所述)，或通过酶，例如使用如(Chang等人Proc NatlAcad Sci U S A.1994Dec 20；91(26)：12544-8或Hikari等人Bioorganic&MedicinalChemistry Letters Volume 18,Issue 22,15November 2008,页6000-6003)中描述的subtiligase进行加入。
可替代地，可以通过二硫键进一步缀合来延伸或修饰肽。这具有允许第一和第二肽一旦处于细胞还原环境中时彼此分离的另外的优点。在这种情况下，可以在第一肽的化学合成期间加入分子支架(例如，TATA)，以使得与三个半胱氨酸基团反应；然后可以将另外的半胱氨酸或硫醇附加到第一肽的N或C末端，使得该半胱氨酸或硫醇仅与第二肽的游离半胱氨酸或硫醇反应，形成二硫键连接的双环肽-肽缀合物。
类似的技术同样适用于两种双环和双特异性大环的合成/偶联，潜在地产生四特异性分子。
此外，可以以相同的方式，使用适当的化学方法，在N-或C-末端或通过侧链的偶联来完成其它官能团或效应物基团的加入。在一个实施方案中，以不阻断任一实体活性的方式进行偶联。
药物组合物
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文定义的肽配体或药物缀合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
一般地，本发明的肽配体将与药理学上适当的赋形剂或载体一起以纯化的形式使用。通常地，这些赋形剂或载体包括水性或醇/水溶液、乳剂或混悬液，包括生理盐水和/或缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸林格氏试剂。如果需要将多肽复合物保持在混悬液中，合适的生理学上可接受的佐剂可以选自增稠剂如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐。
静脉内载剂包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版)。
本发明的肽配体可以用作单独施用的组合物，或者与其他试剂联合施用。这些可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，例如环孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括与本发明的蛋白配体联合的各种细胞毒素或其它试剂的“鸡尾酒混合物”，或甚至包括具有不同特异性的根据本发明选择的多肽的组合，例如使用不同靶配体选择的多肽，无论是否在施用之前合并。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员通常已知的那些。对于治疗，本发明的肽配体可以根据标准技术施用于任何患者。施用可以通过任何适当的模式，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹腔内、经皮、经肺途径、或者也适当地通过直接导管输注。优选地，通过吸入施用根据本发明的药物组合物。施用的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和状况，其它药物的同时施用，禁忌症和临床医生要考虑的其它参数。
本发明的肽配体可以被冻干储存并在使用前重构在合适的载体中。已经证明这种技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调整水平以进行补偿。
可以施用含有本发明肽配体或其鸡尾酒混合物的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，将实现所选细胞群体的至少部分抑制、阻遏、调节、杀死或某些其它可测量参数的足够量定义为“治疗有效剂量”。实现该剂量所需的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但通常范围为每千克体重0.005至5.0mg所选择的肽配体，更常用0.05至2.0mg/kg/剂量的剂量。对于预防性应用，含有本发明肽配体或其鸡尾酒混合物的组合物也可以以相似或稍低的剂量施用。
包含根据本发明的肽配体的组合物可以用于在预防和治疗环境中帮助改变、灭活、杀死或除去哺乳动物中选择的靶细胞群体。此外，本文所述的肽配体可以选择性地用于在体外(extracorporeally)或体外(in vitro)从细胞的异质集合物中杀死、消耗或以其它方式有效除去靶细胞群体。来自哺乳动物的血液可以与选择的肽配体体外组合，由此从血液中将不期望的细胞杀死或以其它方式除去，并根据标准技术返回哺乳动物。
与一种或多种其他治疗剂的共同施用
取决于待治疗的特定病症、或疾病，通常施用以治疗该病症的其他治疗剂也可以存在于本发明的组合物中。因此，在一个实施方案中，药物组合物另外包含一种或多种治疗剂。如本文所用，通常施用以治疗特定疾病、或病症的其他治疗剂已知“适合于所治疗的疾病或病症”。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗所公开的疾病或病状的方法，该方法包括向需要其的患者施用有效量的本文所公开的化合物、或其药学上可接受的盐，并且同时或顺序共同施用有效量的一种或多种其他治疗剂，例如本文所述的那些。在一些实施方案中，所述方法包括共同施用一种其他治疗剂。在一些实施方案中，该方法包括共同施用两种其他治疗剂。在一些实施方案中，所公开的化合物和其他一种或多种治疗剂的组合发挥协同作用。
本发明的化合物也可以与已知的治疗方法(例如，施用激素或放射)联合使用。在某些实施方案中，提供的化合物用作放射增敏剂(radiosensitizer)，特别是用于治疗对放射疗法敏感性差的肿瘤。
本发明的化合物可以单独施用或与一种或多种其他治疗化合物组合施用，可能的组合疗法采取固定组合的形式、或交错施用或彼此独立施用本发明的化合物与一种或多种其他治疗化合物，或组合施用固定组合与一种或多种其他治疗化合物。本发明的化合物还可另外地或额外地与化学疗法、放射疗法、免疫疗法、光疗、手术干预、或其组合组合施用，特别是用于肿瘤治疗。如上所述，在其他治疗策略的背景下，长期疗法与辅助疗法具有同等可能性。其他可能的治疗是在肿瘤消退后维持患者状态的疗法，甚至化学预防疗法，例如在有风险的患者中。
作为多剂量方案的一部分，可以与本发明的化合物或组合物分开施用一种或多种其他治疗剂。或者，一种或多种其他治疗剂可以是单一剂型的一部分，与本发明化合物一起混合在单一组合物中。如果以多剂量方案施用，则可以同时、顺序或在彼此间隔一段时间内施用一种或多种其他治疗剂和本发明的化合物或组合物，例如在彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24小时内施用。在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂和本发明的化合物或组合物在大于24小时间隔内以多剂量方案施用。
如本文所用，术语“组合(combination)”、“组合的(combined)”和相关术语是指同时或依次施用根据本发明的治疗剂。例如，本发明的化合物可以与一种或多种其他治疗剂同时或依次以分开的单位剂型施用或以单一单位剂型一起施用。因此，本发明提供单一单位剂型，其包括本发明的化合物、一种或多种其他治疗剂、以及药学上可接受的载体、佐剂、或载剂(vehicle)。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的本发明化合物和一种或多种其他治疗剂(在包含如上所述的其他治疗剂的那些组合物中)的量将根据治疗的宿主以及特定的施用方式而变化。优选地，应当配制本发明的组合物，使得可以施用剂量在0.01-100mg/kg体重/天的本发明的化合物。
在包含一种或多种其他治疗剂的那些组合物中，一种或多种其他治疗剂和本发明的化合物可以发挥协同作用。因此，这种组合物中的一种或多种其他治疗剂的量可以少于仅使用该治疗剂的单一疗法所需要的量。在这样的组合物中，可以施用剂量在0.01–1,000g/kg体重/天的一种或多种其他治疗剂。
在本发明的组合物中存在的一种或多种其他治疗剂的量，可以不超过在包含该治疗剂作为唯一活性剂的组合物中通常施用的量。优选地，在本公开的组合物中的一种或多种其他治疗剂的量，将在包含该治疗剂作为唯一治疗性活性剂的组合物中通常存在的量约50％至100％的范围。在一些实施方案中，以该试剂通常施用量的约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％的剂量施用一种或多种其他治疗剂。如本文所用，术语“通常施用”是指根据FDA标签插页提供的用于给药的FDA批准的治疗剂的量。
也可将本发明的化合物、或其药物组合物掺入到用于包被可植入医疗装置，例如假体、人造瓣膜、血管移植物、支架和导管的组合物中。例如，血管支架已被用来克服狭窄(受伤后血管壁的重新狭窄)。但是，使用支架或其他可植入设备的患者具有形成血块或活化血小板的风险。通过用包含激酶抑制剂的药学上可接受的组合物预包被该装置，可以防止或减轻这些不良作用。用本发明的化合物包被的可植入装置是本发明的另一实施方案。
示例性其他治疗剂
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂。在一些实施方案中，PARP抑制剂选自奥拉帕尼(olaparib)(
Figure BDA0002942622430000181
AstraZeneca)；瑞卡帕布(rucaparib)(
Figure BDA0002942622430000182
Clovis Oncology)；尼拉帕利布(niraparib)(
Figure BDA0002942622430000183
Tesaro)；他唑帕尼(talazoparib)(MDV3800/BMN 673/LT00673,Medivation/Pfizer/Biomarin)；维利帕尼(veliparib)(ABT-888,AbbVie)；以及BGB-290(BeiGene,Inc.)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。在一些实施方案中，HDAC抑制剂选自伏立诺他(vorinostat)(
Figure BDA0002942622430000191
Merck)；罗米地辛(romidepsin)(
Figure BDA0002942622430000192
Celgene)；帕比司他(panobinostat)(
Figure BDA0002942622430000193
Novartis)；贝利司他(belinostat)(
Figure BDA0002942622430000194
Spectrum Pharmaceuticals)；恩替司他(entinostat)(SNDX-275,Syndax Pharmaceuticals)(NCT00866333)；和甲酰胺(chidamide)(
Figure BDA0002942622430000195
HBI-8000,Chipscreen Biosciences,中国)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是CDK抑制剂，例如，CDK4/CDK6抑制剂。在一些实施方案中，CDK 4/6抑制剂选自帕博西尼(palbociclib)(
Figure BDA0002942622430000196
Pfizer)；瑞博西林(ribociclib)(
Figure BDA0002942622430000197
Novartis)；阿贝西利(abemaciclib)(Ly2835219,EliLilly)；以及trilacicib(G1T28,G1 Therapeutics)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂。在一些实施方案中，PI3K抑制剂选自艾达拉西布(idelalisib)(
Figure BDA0002942622430000198
Gilead)、阿佩利昔布(alpelisib)(BYL719,Novartis)，他赛昔布(taselisib)(GDC-0032,Genentech/Roche)；哌替昔布(pictilisib)(GDC-0941,Genentech/Roche)；帕尼西布(copanlisib)(BAY806946，Bayer)；杜韦利昔布(duvelisib)(原名IPI-145，InfinityPharmaceuticals)；PQR309(Piqur Therapeutics,Switzerland)；和TGR1202(原名RP5230，TG Therapeutics)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是基于铂的治疗剂，也称为铂(platins)。铂主要在快速繁殖的细胞(例如癌细胞)中引起DNA交联，从而抑制DNA修复和/或DNA合成。在一些实施方案中，基于铂的治疗选自顺铂(cisplatin)(
Figure BDA0002942622430000199
Bristol-Myers Squibb)；卡铂(carboplatin)(
Figure BDA00029426224300001910
Bristol-Myers Squibb；以及Teva；Pfizer)；奥沙利铂(oxaliplatin)(
Figure BDA00029426224300001911
Sanofi-Aventis)；奈达铂(nedaplatin)(
Figure BDA00029426224300001912
Shionogi)，吡铂(picoplatin)(Poniard Pharmaceuticals)；和沙铂(satraplatin)(JM-216，Agennix)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是紫杉烷化合物，其引起微管的破坏，这些微管对于细胞分裂是必不可少的。在一些实施方案中，紫杉烷类化合物选自紫杉醇(paclitaxel)(
Figure BDA00029426224300001913
Bristol-Myers Squibb)，多西他赛(docetaxel)(
Figure BDA00029426224300001914
Sanofi-Aventis；
Figure BDA00029426224300001915
Sun Pharmaceutical)；与白蛋白结合的紫杉醇(
Figure BDA00029426224300001916
Abraxis/Celgene)；卡巴他赛(Cabazitaxel)(
Figure BDA00029426224300001917
Sanofi-Aventis)和SID530(SKChemicals，Co.)(NCT00931008)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是核苷抑制剂，或干扰正常DNA合成、蛋白质合成、细胞复制或将抑制迅速增殖的细胞的治疗剂。
在一些实施方案中，核苷抑制剂选自曲贝替定(trabectedin)(胍烷基化剂，
Figure BDA0002942622430000201
Janssen Oncology)、甲氧乙胺(mechlorethamine)(烷基化剂，
Figure BDA0002942622430000202
Aktelion Pharmaceuticals)、长春新碱(
Figure BDA0002942622430000203
Eli Lilly；
Figure BDA0002942622430000204
TevaPharmaceuticals；
Figure BDA0002942622430000205
Talon Therapeutics)；替莫唑胺(temozolomide)(烷基化剂5-(3-甲基三氮杂-1-基)-咪唑-4-羧酰胺(MTIC)的前药，
Figure BDA0002942622430000206
Merck)；阿糖胞苷(cytarabine)注射液(ara-C，抗代谢胞苷类似物，Pfizer)；洛莫司汀(lomustine)(烷基化剂,
Figure BDA0002942622430000207
Bristol-Myers Squibb；
Figure BDA0002942622430000208
NextSource Biotechnology)；阿扎胞苷(azacitidine)(胞嘧啶的嘧啶核苷类似物，
Figure BDA0002942622430000209
Celgene)；奥马西他滨甲基琥珀酸酯(omacetaxine mepesuccinate)(头孢他辛酯)(蛋白质合成抑制剂，
Figure BDA00029426224300002010
TevaPharmaceuticals)；和菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的天冬酰胺酶(用于去除天冬酰胺的酶，
Figure BDA00029426224300002011
Lundbeck；
Figure BDA00029426224300002012
EUSA Pharma)；甲磺酸艾日布林(eribulin)(微管抑制剂，基于微管蛋白的抗有丝分裂剂，
Figure BDA00029426224300002013
Eisai)；卡巴他赛(cabazitaxel)(微管抑制剂，基于微管蛋白的抗有丝分裂剂，
Figure BDA00029426224300002014
Sanofi-Aventis)；卡培他滨(capacetrine)(胸苷酸合酶抑制剂，
Figure BDA00029426224300002015
Genentech)；苯达莫司汀(bendamustine)(双功能甲乙胺衍生物，据信可形成链间DNA交联，
Figure BDA00029426224300002016
Cephalon/Teva)；依沙比酮(ixabepilone)(埃博霉素B的半合成类似物、微管抑制剂、基于微管蛋白的抗有丝分裂剂，
Figure BDA00029426224300002017
Bristol-Myers Squibb)；奈拉滨(nelarabine)(脱氧鸟苷类似物的前药，核苷代谢抑制剂，
Figure BDA00029426224300002018
Novartis)；氯法拉滨(clorafabine)(核糖核苷酸还原酶抑制剂的前药，脱氧胞苷的竞争性抑制剂，
Figure BDA00029426224300002019
Sanofi-Aventis)；以及三氟吡啶和替普拉西酯(tipiracil)(基于胸苷的核苷类似物和胸苷磷酸化酶抑制剂，
Figure BDA00029426224300002020
TaihoOncology)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是激酶抑制剂或VEGF-R拮抗剂。可用于本发明的批准的VEGF抑制剂和激酶抑制剂包括：贝伐单抗(bevacizumab)(
Figure BDA00029426224300002021
Genentech/Roche)，一种抗VEGF单克隆抗体；雷莫昔单抗(ramucirumab)(
Figure BDA00029426224300002022
EliLilly)，一种抗-VEGFR-2抗体和阿柏西普(ziv-aflibercept)，也被称为VEGF Trap(
Figure BDA00029426224300002023
Regeneron/Sanofi)。VEGFR抑制剂，例如瑞格菲尼(regorafenib)(
Figure BDA00029426224300002024
Bayer)；凡德他尼(vandetanib)(
Figure BDA00029426224300002025
AstraZeneca)；阿昔替尼(axitinib)(
Figure BDA00029426224300002026
Pfizer)；乐伐替尼(lenvatinib)(
Figure BDA00029426224300002027
Eisai)；Raf抑制剂，如索拉非尼(sorafenib)(
Figure BDA00029426224300002028
Bayer AG和Onyx)；达拉非尼(dabrafenib)(
Figure BDA00029426224300002029
Novartis)；和维莫非尼(vemurafenib)(
Figure BDA00029426224300002030
Genentech/Roche)；MEK抑制剂，例如考美他尼(cobimetanib)(
Figure BDA00029426224300002031
Exelexis/Genentech/Roche)；曲美替尼(trametinib)(
Figure BDA00029426224300002032
Novartis)；Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼(imatinib)(
Figure BDA00029426224300002033
Novartis)；尼洛替尼(nilotinib)(
Figure BDA00029426224300002034
Novartis)；达沙替尼(dasatinib)(
Figure BDA00029426224300002035
BristolMyersSquibb)；博舒替尼(bosutinib)(
Figure BDA00029426224300002036
Pfizer)；和帕那替尼(ponatinib)(
Figure BDA00029426224300002037
Ariad Pharmaceuticals)；Her2和EGFR抑制剂，例如吉非替尼(gefitinib)(
Figure BDA0002942622430000211
AstraZeneca)；厄洛替尼(erlotinib)(
Figure BDA0002942622430000212
Genentech/Roche/Astellas)；拉帕替尼(lapatinib)(
Figure BDA0002942622430000213
Novartis)；阿法替尼(afatinib)(
Figure BDA0002942622430000214
BoehringerIngelheim)；奥西替尼(osimertinib)(靶向活化的EGFR，
Figure BDA0002942622430000215
AstraZeneca)；和布加替尼(brigatinib)(
Figure BDA0002942622430000216
Ariad Pharmaceuticals)；c-Met和VEGFR2抑制剂，如卡博替尼(Cabozanitib)(
Figure BDA0002942622430000217
Exelexis)；和多激酶抑制剂，如舒尼替尼(sunitinib)(
Figure BDA0002942622430000218
Pfizer)；帕唑帕尼(pazopanib)(
Figure BDA0002942622430000219
Novartis)；ALK抑制剂，例如克唑替尼(
Figure BDA00029426224300002110
Pfizer)；赛立替尼(ceritinib)(
Figure BDA00029426224300002111
Novartis)；和艾乐替尼(alectinib)(
Figure BDA00029426224300002112
Genentech/Roche)；布鲁顿(Bruton)的酪氨酸激酶抑制剂，例如依鲁替尼(ibrutinib)(
Figure BDA00029426224300002113
Pharmacyclics/Janssen)；和Flt3受体抑制剂，例如米哚妥林(midostaurin)(
Figure BDA00029426224300002114
Novartis)。
正在开发并且可以用于本发明的其他激酶抑制剂和VEGF-R拮抗剂包括：替沃扎尼(tivozanib)(Aveo Pharmaecuticals)；瓦他拉尼(vatalanib)(Bayer/Novartis)；卢西他尼(lucitanib)(Clovis Oncology)；多维替尼(dovitinib)(TKI258,Novartis)；乔阿尼卜(Chiauanib)(Chipscreen Biosciences)；CEP-11981(Cephalon)；利尼法尼(linifanib)(Abbott Laboratories)；奈拉替尼(neratinib)(HKI-272,Puma Biotechnology)；雷多替尼(radotinib)(
Figure BDA00029426224300002115
IY5511,Il-Yang Pharmaceuticals,S.Korea)；鲁索替尼(ruxolitinib)(
Figure BDA00029426224300002116
Incyte Corporation)；PTC299(PTC Therapeutics)；CP-547,632(Pfizer)；福瑞替尼(foretinib)(Exelexis,GlaxoSmithKline)；奎扎替尼(quizartinib)(Daiichi Sankyo)和莫替沙尼(motesanib(Amgen/Takeda)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是mTOR抑制剂，其抑制细胞增殖、血管生成和葡萄糖摄取。在一些实施方案中，mTOR抑制剂是依维莫司(everolimus)(
Figure BDA00029426224300002117
Novartis)；替西罗莫司(temsirolimus)(
Figure BDA00029426224300002118
Pfizer)；和西罗莫司(sirolimus)(
Figure BDA00029426224300002119
Pfizer)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是蛋白酶体抑制剂。可用于本发明的批准的蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米(bortezomib)(
Figure BDA00029426224300002120
Takeda)和卡非佐米(carfilzomib)(
Figure BDA00029426224300002121
Amgen)；和依沙佐米(ixazomib)(
Figure BDA00029426224300002122
Takeda)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是生长因子拮抗剂，例如血小板衍生生长因子(PDGF)的拮抗剂、或表皮生长因子(EGF)的拮抗剂或其受体(EGFR)的拮抗剂。可用于本发明的批准的PDGF拮抗剂包括奥拉单抗(olaratumab)(
Figure BDA00029426224300002123
Eli Lilly)。可用于本发明的批准的EGFR拮抗剂包括：西妥昔单抗(
Figure BDA00029426224300002124
Eli Lilly)；尼珠单抗(necitumumab)(
Figure BDA00029426224300002125
Eli Lilly),帕尼单抗(panitumumab)(
Figure BDA00029426224300002126
Amgen)；和奥西替尼(osimertinib)(靶向活化EGFR,
Figure BDA00029426224300002127
AstraZeneca)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是芳香酶抑制剂。在一些实施方案中，芳香酶抑制剂选自：依西美坦(exemestane)(
Figure BDA0002942622430000221
Pfizer)；阿那唑(anastazole)(
Figure BDA0002942622430000222
AstraZeneca)和来洛唑(letrozole)(
Figure BDA0002942622430000223
Novartis)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是hedgehog途径的拮抗剂。可以用于本发明的批准的hedgehog途径抑制剂包括：索尼德吉(sonidegib)(
Figure BDA0002942622430000224
SunPharmaceuticals)；和维莫德吉(vismodegib)(
Figure BDA0002942622430000225
Genentech)，均用于治疗基底细胞癌。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是叶酸抑制剂。用于本发明的批准的叶酸抑制剂包括培美曲塞(pemetrexed)(
Figure BDA0002942622430000226
Eli Lilly)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是CC趋化因子受体4(CCR4)抑制剂。正在研究的可用于本发明的CCR4抑制剂包括莫加单抗(mogamulizumab)(
Figure BDA0002942622430000227
KyowaHakko Kirin,日本)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是异柠檬酸脱氢酶(IDH)抑制剂。正在研究中的可用于本发明的IDH抑制剂包括：AG120(Celgene；NCT02677922)；AG221(Celgene,NCT02677922；NCT02577406)；BAY1436032(Bayer,NCT02746081)；IDH305(Novartis,NCT02987010)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是精氨酸酶抑制剂。可以在本发明中使用的正在研究的精氨酸酶抑制剂包括：AEB1102(聚乙二醇化重组精氨酸酶，AegleaBiotherapeutics)，正在针对急性髓样白血病和骨髓增生异常综合征(NCT02732184)和实体瘤(NCT02561234)的1期临床试验中进行研究；和CB-1158(Calithera Biosciences)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是谷氨酰胺酶抑制剂。可以在本发明中使用的正在研究的谷氨酰胺酶抑制剂包括CB-839(Calithera Biosciences)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是与肿瘤抗原(即在肿瘤细胞的细胞表面上表达的蛋白质)结合的抗体。可以用于本发明的与肿瘤抗原结合的批准的抗体包括：利妥昔单抗(rituximab)(
Figure BDA0002942622430000228
Genentech/BiogenIdec)；奥法木单抗(ofatumumab)(抗-CD20,
Figure BDA0002942622430000229
GlaxoSmithKline)；奥比妥单抗(obinutuzumab)(抗-CD20,
Figure BDA00029426224300002210
Genentech),替伊莫单抗(ibritumomab)(抗-CD20和钇(Yttrium)-90,
Figure BDA00029426224300002211
SpectrumPharmaceuticals)；达雷木单抗(daratumumab)(抗-CD38,
Figure BDA00029426224300002212
Janssen Biotech),地那昔单抗(dinutuximab)(抗-糖脂GD2,
Figure BDA00029426224300002213
United Therapeutics)；曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗-HER2,
Figure BDA00029426224300002214
Genentech)；曲妥珠单抗美坦欣(ado-trastuzumabemtansine)(抗-HER2,融合至美坦欣,
Figure BDA00029426224300002215
Genentech)；和帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗-HER2,
Figure BDA00029426224300002216
Genentech)；和布伦妥昔单抗(brentuximab vedotin)(抗-CD-30药物缀合物,
Figure BDA00029426224300002217
Seattle Genetics)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。在本发明中有用的批准的拓扑异构酶抑制剂包括：伊立替康(irinotecan)(
Figure BDA0002942622430000231
MerrimackPharmaceuticals)；和拓扑替康(topotecan)(
Figure BDA0002942622430000232
GlaxoSmithKline)。可以在本发明中使用的正在研究的拓扑异构酶抑制剂包括匹克酮(pixantrone)(
Figure BDA0002942622430000233
CTIBiopharma)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是抗凋亡蛋白的抑制剂，例如BCL-2。可用于本发明的批准的抗凋亡剂包括：维奈托克(venetoclax)(
Figure BDA0002942622430000234
AbbVie/Genentech)；和博纳吐单抗(blinatumomab)(
Figure BDA0002942622430000235
Amgen)。已经过临床测试并且可用于本发明的靶向凋亡蛋白的其他治疗剂包括奈维托克(navitoclax)(ABT-263，Abbott)，BCL-2抑制剂(NCT02079740)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是雄激素受体抑制剂。可用于本发明的批准的雄激素受体抑制剂包括恩杂鲁胺(enzalutamide)(
Figure BDA0002942622430000236
Astellas/Medivation)；批准的雄激素合成抑制剂包括阿比特龙(abiraterone)(
Figure BDA0002942622430000237
Centocor/Ortho)；批准的促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂(地加瑞克(degaralix),
Figure BDA0002942622430000238
Ferring Pharmaceuticals)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是选择性雌激素受体调节剂(SERM)，其干扰雌激素的合成或活性。可用于本发明的批准的SERM包括雷洛昔芬(raloxifene)(
Figure BDA0002942622430000239
Eli Lilly)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是骨吸收的抑制剂。抑制骨吸收的批准的治疗剂是地诺单抗(Denosumab)(
Figure BDA00029426224300002310
Amgen)，一种与RANKL结合的抗体，其阻止与破骨细胞、其前体和破骨细胞骨样巨细胞表面上存在的其受体RANK的结合，该结合介导在具有骨转移的实体瘤中的骨病理学。其他批准的抑制骨吸收的治疗剂包括双膦酸盐，例如唑来膦酸(zoledronic acid)(
Figure BDA00029426224300002311
Novartis)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是两种主要的p53抑制蛋白MDMX和MDM2之间相互作用的抑制剂。可用于本发明的正在研究的p53抑制蛋白的抑制剂包括ALRN-6924(Aileron)，一种钉合肽，其等效地结合并破坏MDMX和MDM2与p53的相互作用。目前正在临床试验中评估ALRN-6924，以治疗AML，晚期骨髓增生异常综合征(MDS)和周围T-细胞淋巴瘤(PTCL)(NCT02909972；NCT02264613)。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是转化生长因子-β(TGF-β或TGFβ)的抑制剂。可以在本发明中使用的正在研究的TGF-β蛋白的抑制剂包括NIS793(Novartis)，一种在临床上测试用于治疗各种癌症的抗TGF-β抗体，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌和肾癌(NCT02947165)。在一些实施方案中，TGF-β蛋白的抑制剂是弗雷索莫单抗(fresolimumab)(GC1008；Sanofi-Genzyme)，研究其用于黑素瘤(NCT00923169)；肾细胞癌((NCT00356460)；和非小细胞肺癌(NCT02581787)。另外，在一些实施方案中，另外的治疗剂是TGF-β阱，例如，Connolly等人(2012)Int’l J.BiologicalSciences 8:964-978中所述。目前在临床试验中用于治疗实体瘤的一种治疗化合物是M7824(Merck KgaA-原名MSB0011459X)，它是一种双特异性抗-PD-L1/TGFβ阱化合物(NCT02699515)；和(NCT02517398)。M7824由抗PD-L1的全人IgG1抗体融合至人TGF-β受体II的胞外结构域(作为TGFβ“阱”发挥功能)组成。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂选自格伦巴单抗维多汀-单甲基奥司他汀E(glembatumumab vedotin-monomethyl auristatin E)(MMAE)(Celldex)，一种与细胞毒性MMAE连接的抗糖蛋白NMB(gpNMB)抗体(CR011)。gpNMB是一种与多种癌细胞转移能力有关的多种肿瘤过表达的蛋白质。
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是抗增殖化合物。这样的抗增殖化合物包括但不限于：芳香酶抑制剂；抗雌激素；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性化合物；烷基化化合物；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；诱导细胞分化过程的化合物；环氧合酶抑制剂；MMP抑制剂；mTOR抑制剂；抗肿瘤抗代谢物；铂化合物；靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性的化合物以及其他抗-血管生成化合物；靶向、降低或抑制蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物；促性激素释放素激动剂；抗雄激素；蛋氨酸氨基肽酶抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；双膦酸盐；生物反应调节剂；抗增殖抗体；乙酰肝素酶抑制剂；Ras致癌同工型的抑制剂；端粒酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；用于治疗血液系统恶性肿瘤的化合物；靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；Hsp90抑制剂，例如来自Conforma Therapeutics的17-AAG(17-烯丙基氨基格尔德霉素(allylaminogeldanamycin)，NSC330507)，17-DMAG(17-二甲基氨基乙基氨基(dimethylaminoethylamino)-17-去甲氧基-格尔德霉素，NSC707545)、IPI-504、CNF1010、CNF2024、CNF1010；替莫唑胺(temozolomide)
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驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂，例如GlaxoSmithKline的SB715992或SB743921，或CombinatoRx的戊烷脒(pentamidine)/氯丙嗪；MEK抑制剂，例如Array BioPharma的ARRY142886，AstraZeneca的AZd6244，来自Pfizer的PD181461以及亚叶酸(leucovorin)。
如本文所用，术语“芳香酶抑制剂”涉及抑制雌激素产生的化合物，例如，将底物雄烯二酮和睾丸酮分别转化为雌酮和雌二醇。该术语包括但不限于类固醇，尤其是金刚烷、依西美坦和福尔马斯坦，尤其是非类固醇，特别是氨基谷氨酰胺、罗格列酰亚胺、吡啶谷氨二酰亚胺、三氯斯坦、睾丸内酯、酮康唑、伏洛唑、法德罗唑、阿那曲唑和来曲唑。依西美坦(exemestane)的商品名为AromasinTM。福尔马斯坦(formestane)以商品名LentaronTM销售。法德罗唑(fadrozole)以商品名AfemaTM销售。阿那曲唑(Anastrozole)以商品名ArimidexTM销售。来曲唑(letrozole)以商品名为FemaraTM或FemarTM销售。氨基谷氨酰胺(aminoglutethimide)以商品名OrimetenTM销售。包含作为芳香酶抑制剂的化学治疗剂的本发明的组合特别可用于治疗激素受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。
本文使用的术语“抗雌激素”涉及在雌激素受体水平上拮抗雌激素作用的化合物。该术语包括但不限于他莫昔芬(tamoxifen)、氟维司群(fulvestrant)、雷洛昔芬(raloxifene)和盐酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride)。他莫昔芬以商品名NolvadexTM销售。盐酸雷洛昔芬以商品名EvistaTM销售。氟维司群可以商品名FaslodexTM进行施用。包含为抗雌激素的化学治疗剂的本发明的组合特别可用于治疗雌激素受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。
本文使用的术语“抗-雄激素”涉及能够抑制雄激素的生物学效应的任何物质，包括但不限于比卡鲁胺(bicalutamide)(CasodexTM)。本文所用的术语“促性激素释放激动剂”包括但不限于阿贝瑞克斯(abarelix)、戈舍瑞林(goserelin)和醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)。戈舍瑞林可以商品名ZoladexTM施用。
本文所用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括但不限于拓扑替康(topotecan)、吉美替康(gimatecan)、伊立替康(irinotecan)、喜树碱及其类似物、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱缀合物PNU-166148。依立替康可以，例如以其销售形式施用，例如在CamptosarTM商标下。拓扑替康以商品名HycamptinTM销售。
本文所用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不限于蒽环类药物，例如阿霉素(包括脂质体制剂，例如CaelyxTM)、柔红霉素、表柔比星、伊达比星和新莫比星、蒽醌类米托蒽醌和洛索蒽醌、以及鬼臼毒素(podophillotoxines)依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)。依托泊苷以商品名EtopophosTM销售。替尼泊苷以商品名VM 26-Bristol销售。阿霉素以商品名AcriblastinTM或AdriamycinTM销售。表柔比星以商品名FarmorubicinTM销售。伊达比星以商品名ZavedosTM销售。米托蒽醌以商品名Novantron销售。
术语“微管活性剂”涉及微管稳定、微管去稳定化合物和微管蛋白聚合抑制剂，包括但不限于：紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；长春花生物碱，例如长春碱或硫酸长春碱、长春新碱、或硫酸长春新碱、和长春瑞滨；discodermolides；秋水仙碱和埃博霉素及其衍生物。紫杉醇以商品名TaxolTM销售。多西他赛以商品名TaxotereTM销售。硫酸长春碱以商品名Vinblastin R.PTM销售。硫酸长春新碱以商品名FarmistinTM销售。
本文所用的术语“烷基化剂”包括但不限于环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑或亚硝基脲(BCNU或Gliadel)。环磷酰胺以商品名CyclostinTM销售。异环磷酰胺以商品名为HoloxanTM销售。
术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”或“HDAC抑制剂”涉及抑制组蛋白脱乙酰基酶并具有抗增殖活性的化合物。这包括但不限于辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)。
术语“抗肿瘤抗代谢物”包括但不限于5-氟尿嘧啶或5-FU、卡培他滨、吉西他滨、DNA脱甲基化合物，例如5-氮杂胞苷和地西他滨、甲氨蝶呤和埃达曲沙，以及叶酸拮抗剂，例如培美曲塞。卡培他滨以商品名XelodaTM销售。吉西他滨以商品名GemzarTM销售。
本文所用的术语“铂化合物”包括、但不限于卡铂、顺铂、顺铂和奥沙利铂。卡铂可以以例如，如在商标CarboplatTM下销售的形式施用。奥沙利铂可以以例如，如在商标EloxatinTM下销售的形式施用。
本文所用的术语“靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性；或蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物；或其他抗血管生成化合物”，包括但不限于蛋白质酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或脂质激酶抑制剂，例如：a)靶向、降低或抑制血小板衍生生长因子受体(PDGFR)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制PDGFR活性的化合物，特别是抑制PDGF受体的化合物，例如，N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊马替尼、SU101、SU6668和GFB-111；b)靶向、降低或抑制成纤维细胞生长因子受体(FGFR)活性的化合物；c)靶向、降低或抑制胰岛素样生长因子受体I(IGF-IR)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制IGF-IR活性的化合物，尤其是抑制IGF-I受体激酶活性的化合物，或靶向IGF-1受体胞外域或其生长因子的抗体；d)靶向、降低或抑制Trk受体酪氨酸激酶家族的活性的化合物、或肝配蛋白(ephrin)B4抑制剂；e)靶向、降低或抑制AxI受体酪氨酸激酶家族的活性的化合物；f)靶向、降低或抑制Ret受体酪氨酸激酶活性的化合物；g)靶向、降低或抑制Kit/SCFR受体酪氨酸激酶活性的化合物，例如伊马替尼；h)靶向、降低或抑制C-kit受体酪氨酸激酶活性的化合物，所述C-kit受体酪氨酸激酶是PDGFR家族一部分，例如靶向、降低或抑制c-Kit受体酪氨酸激酶家族活性的化合物，特别是抑制c-Kit受体的化合物，例如伊马替尼；i)靶向、降低或抑制c-Abl家族成员、其基因融合产物(例如，BCR-Abl激酶)、和突变体的活性的化合物，例如，靶向、降低或抑制c-Abl家族成员及其基因融合产物的活性的化合物，例如，N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊马替尼或尼洛替尼(nilotinib)(AMN107)；PD180970；AG957；NSC 680410；来自ParkeDavis的PD173955；或达沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)；j)化合物，其靶向、降低或抑制蛋白激酶C(PKC)和丝氨酸/苏氨酸激酶的Raf家族的成员、MEK、SRC、JAK/pan-JAK、FAK、PDK1、PKB/Akt、Ras/MAPK、PI3K、SYK、TYK2、BTK和TEC家族成员、和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家族(CDK)的成员(包括，星形孢菌素衍生物，如米哚妥林(midostaurin))的活性；其他化合物的示例包括UCN-01、沙芬戈(safingol)、BAY 43-9006、苔藓虫素(Bryostatin)1，哌立福辛(Perifosine)；利福磷(llmofosine)；RO 318220和RO 320432；GO 6976；lsis 3521；LY333531/LY379196；异喹啉化合物；FTI；PD184352或QAN697(P13K抑制剂)或AT7519(CDK抑制剂)；k)靶向、降低或抑制蛋白酪氨酸激酶抑制剂活性的化合物，例如靶向、降低或抑制蛋白-酪氨酸激酶抑制剂活性的化合物，包括甲磺酸伊马替尼(GleevecTM)、或酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)，如Tyrphostin A23/RG-50810；AG 99；Tyrphostin AG 213；TyrphostinAG 1748；Tyrphostin AG 490；Tyrphostin B44；Tyrphostin B44(+)对映体；TyrphostinAG 555；AG 494；Tyrphostin AG 556，AG957和腺苷脱氨酶磷酸化抑制剂(adaphostin)(4-{[(2,5-二羟基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金刚烷基酯；NSC 680410，腺苷脱氨酶磷酸化抑制剂)；l)靶向、降低或抑制受体酪氨酸激酶的表皮生长因子家族(为同二聚体或异二聚体的EGFR1、ErbB2、ErbB3、ErbB4)、或其突变体的活性的化合物，例如靶向、降低或抑制表皮生长因子受体家族的活性的化合物具体地是抑制EGF受体酪氨酸激酶家族成员的化合物、蛋白质或抗体，例如EGF受体、ErbB2、ErbB3和ErbB4或结合至EGF或结合至EGF相关的配体，CP358774，ZD 1839，ZM 105180；曲妥珠单抗(HerceptinTM)、西妥昔单抗(ErbituxTM)、易瑞沙(Iressa)、特罗凯(Tarceva)、OSI-774、Cl-1033,EKB-569,GW-2016,E1.1,E2.4,E2.5,E6.2,E6.4,E2.11,E6.3或E7.6.3,和7H-吡咯-[2,3-d]嘧啶衍生物；m)靶向、降低或抑制c-Met受体活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-Met活性的化合物，尤其是抑制c-Met受体激酶活性的化合物，或靶向c-Met的细胞外结构域的抗体或与HGF结合的抗体，n)靶向、降低或抑制一个或多个JAK家族成员(JAK1/JAK2/JAK3/TYK2和/或pan-JAK)激酶活性的化合物，包括但不限于PRT-062070、SB-1578、巴瑞克替尼(baricitinib)、帕瑞替尼(pacritinib)、莫洛替尼(momelotinib)、VX-509、AZD-1480、TG-101348、托法替尼(tofacitinib)、和鲁索(ruxolitinib)；o)靶向、降低或抑制PI3激酶(PI3K)激酶活性的化合物，包括但不限于ATU-027、SF-1126、DS-7423、PBI-05204、GSK-2126458、ZSTK-474、布泊利西布(buparlisib)、哌替利西布(pictrelisib)、PF-4691502、BYL-719、达索替尼(dactolisib)、XL-147、XL-765和艾达拉西布(idelalisib)；和p)靶向、减少或抑制hedgehog蛋白(Hh)或平滑受体(SMO)途径的信号传导作用的化合物，包括但不限于环巴胺、维斯莫德单抗(vismodegib)、伊曲康唑(itraconazole)、依斯莫德单抗(erismodegib)和IPI-926(沙瑞吉卜(saridegib))。
本文所用的术语“PI3K抑制剂”包括但不限于对磷脂酰肌醇-3-激酶家族中的一种或多种酶具有抑制活性的化合物，包括但不限于PI3Kα、PI3Kγ、PI3Kδ、PI3Kβ、PI3K-C2α、PI3K-C2β、PI3K-C2γ、Vps34、p110-α、p110-β、p110-γ、p110-δ、p85-α、p85-β、p55-γ、p150、p101、和p87。在本发明中有用的PI3K抑制剂的示例包括但不限于ATU-027、SF-1126、DS-7423、PBI-05204、GSK-2126458、ZSTK-474、布巴利昔布(buparlisib)、吡曲昔布(pictrelisib)、PF-4691502、BYL-719、达索替尼(dactolisib)、XL-147、XL-765和艾达利西布。
本文所用的术语“Bcl-2抑制剂”包括但不限于对B细胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)具有抑制活性的化合物，包括但不限于ABT-199、ABT-731、ABT-737、阿朴棉酚(apogossypol)，Ascenta的泛-Bcl-2抑制剂，姜黄素(及其类似物)，双重Bcl-2/Bcl-xL抑制剂(InfinityPharmaceuticals/Novartis Pharmaceuticals)、Genasense(G3139)、HA14-1(及其类似物；请参见WO 2008/118802)，奈维托克(及其类似物，参见US 7,390,799)、NH-1(ShenayngPharmaceutical University)、奥巴克拉(obatoclax)(及其类似物，参见WO 2004/106328)、S-001(Gloria Pharmaceuticals)、TW系列化合物(Univ.of Michigan)和维奈托克。在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂是小分子治疗剂。在一些实施方案中，Bcl-2抑制剂是拟肽。
如本文所用，术语“BTK抑制剂”包括但不限于对布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)具有抑制活性的化合物，包括但不限于AVL-292和依鲁替尼。
如本文所用，术语“SYK抑制剂”包括但不限于对脾酪氨酸激酶(SYK)具有抑制活性的化合物，包括但不限于PRT-062070、R-343、R-333、Excellair、PRT-062607和福他替尼(fostamatinib)。
BTK抑制化合物的进一步示例，以及可通过此类化合物与本发明化合物组合治疗的病症的进一步的示例可见于WO 2008/039218和WO 2011/090760，其全部内容通过引用并入本文。
SYK抑制化合物的进一步示例，以及可通过此类化合物与本发明化合物组合治疗的病症的进一步的示例可见于WO 2003/063794，WO 2005/007623和WO 2006/078846，其全部内容通过引用并入本文。
PI3K抑制化合物的进一步示例，以及可通过此类化合物与本发明化合物组合治疗的病症的进一步的示例可见于WO 2004/019973、WO 2004/089925、WO 2007/016176、US 8,138,347、WO 2002/088112、WO 2007/084786、WO 2007/129161、WO 2006/122806、WO 2005/113554、和WO 2007/044729中，其全部内容通过引用并入本文。
JAK抑制化合物的进一步示例，以及可通过此类化合物与本发明化合物组合治疗的病症的进一步的示例可见于WO 2009/114512、WO 2008/109943、WO 2007/053452、WO2000/142246和WO 2007/070514中，其全部内容通过引用并入本文。
其他的抗血管生成化合物包括对它们的活性具有其他机理的化合物，例如，与蛋白质或脂质激酶抑制无关，如沙利度胺(thalidomide)(ThalomidTM)和TNP-470。
可与本发明化合物组合使用的蛋白酶体抑制剂的示例包括但不限于硼替佐米、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素(epigallocatechin)-3-没食子酸酯(EGCG)、盐孢子酰胺A、卡非佐米(carfilzomib)、ONX-0912、CEP-18770和MLN9708。
靶向、降低或抑制蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物为，例如，磷酸酶1、磷酸酶2A、或CDC25的抑制剂，例如，冈田酸或其衍生物。
诱导细胞分化过程的化合物包括但不限于视黄酸、α-γ-或δ-生育酚或α-γ-或δ-生育三烯酚。
本文所用的术语环氧合酶抑制剂包括、但不限于Cox-2抑制剂、5-烷基取代的2-芳基氨基苯基乙酸及其衍生物、例如塞来昔布(celecoxib)(CelebrexTM)、罗非考昔(rofecoxib)(VioxxTM)、依托考昔(etoricoxib)、伐地昔布(valdecoxib)或5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸，例如，5-甲基-2-(2'-氯-6'-氟苯胺基)苯基乙酸和鲁美昔布(lumiracoxib)。
如本文所用，术语“双膦酸酯”包括但不限于依替膦酸(etridonic)、氯膦酸(clodronic)、替鲁膦酸(tiludronic)、帕米膦酸(pamidronic)、阿仑膦酸(alendronic)、伊班膦酸(ibandronic)、立屈膦酸(risedronic)和唑来膦酸(zoledronic acid)。依替膦酸以商品名为DidronelTM进行销售。氯膦酸以商品名为BonefosTM进行销售。替鲁膦酸以商品名为SkelidTM进行销售。帕米膦酸以商品名为ArediaTM进行销售。阿仑膦酸以商品名为FosamaxTM进行销售。伊班膦酸以商品名为BondranatTM进行销售。立屈膦酸以商品名为ActonelTM进行销售。唑来膦酸以商品名为ZometaTM进行销售。术语“mTOR抑制剂”涉及抑制雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)并具有抗增殖活性的化合物，例如西罗莫司(sirolimus)
Figure BDA0002942622430000291
)、依维莫司(everolimus)(CerticanTM)、CCI-779和ABT578。
本文所用的术语“乙酰肝素酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制硫酸肝素降解的化合物。该术语包括但不限于PI-88。本文所用的术语“生物反应调节剂”是指淋巴因子或干扰素。
本文所用的术语“Ras致癌同工型的抑制剂”，例如H-Ras、K-Ras、或N-Ras，是指靶向，降低或抑制Ras致癌活性的化合物。例如“法呢基(farnesyl)转移酶抑制剂”，例如，L-744832、DK8G557或R115777(ZarnestraTM)。本文所用的术语“端粒酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制端粒酶活性的化合物。靶向、降低或抑制端粒酶活性的化合物具体地是抑制端粒酶受体的化合物，例如端粒他汀(telomestatin)。
本文所用的术语“蛋氨酸氨基肽酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制蛋氨酸氨基肽酶活性的化合物。靶向、降低或抑制蛋氨酸氨肽酶活性的化合物，包括但不限于bengamide或其衍生物。
本文所用的术语“蛋白酶体抑制剂”是指靶向、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物。靶向、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物包括、但不限于硼替佐米(VelcadeTM)和MLN341。
本文所用的术语“基质金属蛋白酶抑制剂”或(“MMP”抑制剂)包括但不限于，胶原蛋白肽模拟和非肽模拟抑制剂、四环素衍生物，例如，异羟肟酸酯肽模拟抑制剂巴马司他(batimastat)、及其口服生物利用类似物马立马司他(marimastat)(BB-2516)、普啉司他(prinomastat)(AG3340)、美他司他(metastat)(NSC 683551)BMS-279251、BAY 12-9566、TAA211、MMI270B或AAJ996。
本文所用的术语“用于治疗血液系统恶性肿瘤的化合物”包括但不限于，FMS样酪氨酸激酶抑制剂，其是靶向、降低或抑制FMS样酪氨酸激酶受体(Flt-3R)活性的化合物；干扰素，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(ara-c)和白消安(bisulfan)；和ALK抑制剂，其是靶向、降低或抑制间变性淋巴瘤激酶的化合物。
靶向、降低或抑制FMS样酪氨酸激酶受体(Flt-3R)活性的化合物具体地是抑制Flt-3R受体激酶家族成员的化合物、蛋白质或抗体，例如PKC412、米哚妥林、星形孢菌素(staurosporine)衍生物、SU11248和MLN518。
本文所用的术语“HSP90抑制剂”包括、但不限于靶向、降低或抑制HSP90的固有ATP酶活性的化合物；通过泛素蛋白体途径降解、靶向、降低或抑制HSP90客户蛋白的化合物。靶向、降低或抑制HSP90的固有ATP酶活性的化合物，特别是抑制HSP90的ATP酶活性的化合物、蛋白质或抗体，例如，17-烯丙胺(allylamino)、17-脱甲氧基格尔德霉素(demethoxygeldanamycin)(17AAG)、格尔德霉素衍生物；其他与格尔德霉素有关的化合物；根赤壳菌素(radicicol)和HDAC抑制剂。
如本文所用术语“抗增殖抗体”包括但不限于曲妥珠单抗(HerceptinTM)、曲妥珠单抗-DM1、西妥昔单抗(erbitux)、贝伐单抗(AvastinTM)、利妥昔单抗(rituximab)
Figure BDA0002942622430000301
PRO64553(抗-CD40)和2C4抗体。抗体是指完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体、和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。
为了治疗急性髓性白血病(AML)，本发明的化合物可以与标准白血病疗法联合使用，尤其是与用于AML治疗的疗法联合使用。具体地，本发明的化合物可以与例如，法呢基转移酶抑制剂和/或其他可用于治疗AML的药物联合施用，所述用于治疗AML的药物，例如，柔红霉素、阿霉素、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌(Mitoxantrone)、伊达比星(Idarubicin)、卡铂和PKC412。
其他抗白血病化合物包括，例如，Ara-C、嘧啶类似物、其是脱氧胞苷的2'-α-羟基核糖(阿拉伯糖苷)衍生物。还包括次黄嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)和磷酸氟达拉滨(fludarabine)的嘌呤类似物。靶向、降低或抑制组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂的活性的化合物，例如丁酸钠和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)，可抑制称为组蛋白脱乙酰基酶的酶的活性。特定的HDAC抑制剂包括MS275、SAHA、FK228(原名FR901228)、曲古抑菌素A和US6,552,065中公开的化合物，包括但不限于，N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺、或其药学上可接受的盐和N-羟基-3-[4-[(2-羟乙基){2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺、或其药学上可接受的盐，特别是乳酸盐。本文所用的生长抑素受体拮抗剂是指靶向、治疗或抑制生长抑素受体的化合物，例如奥曲肽(octreotide)和SOM230。肿瘤细胞破坏方法是指诸如电离辐射的方法。上文和下文中的术语“电离辐射”是指作为电磁射线(例如X射线和伽马射线)或粒子(例如α和β粒子)发生的电离辐射。在(但不限于)放射疗法中提供电离辐射，并且在本领域中是已知的。参见Hellman,Principles of Radiation Therapy,Cancer,in Principles andPractice of Oncology,Devita等人,编,第四版,卷1，248-275页(1993)。
还包括EDG结合剂和核糖核苷酸还原酶抑制剂。如本文所用，术语“EDG结合剂”是指调节淋巴细胞再循环的一类免疫抑制剂，例如FTY720。术语“核糖核苷酸还原酶抑制剂”是指嘧啶或嘌呤核苷类似物，包括但不限于，氟达拉滨和/或胞嘧啶阿拉伯糖苷(ara-C)、6-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、克拉屈滨、6-巯基嘌呤(尤其是与抗ALL的ara-C组合)和/或喷司他丁(pentostatin)。核糖核苷酸还原酶抑制剂尤其是羟基脲或2-羟基-1H-异吲哚-1,3-二酮衍生物。
还包括特别是那些VEGF的化合物、蛋白质或单克隆抗体，例如：1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪、或其药学上可接受的盐，1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪琥珀酸酯；AngiostatinTM；EndostatinTM；邻氨基苯甲酸酰胺；ZD4190；Zd6474；SU5416；SU6668；贝伐单抗；或抗-VEGF抗体或抗-VEGF受体抗体，例如，rhuMAb和RHUFab，或VEGF适体，例如Macugon；FLT-4抑制剂、FLT-3抑制剂、VEGFR-2IgGI抗体，Angiozyme(RPI 4610)和贝伐单抗(AvastinTM)。
如本文所用，光动力疗法是指使用某些已知为光敏化合物的化学物质来治疗或预防癌症的疗法。光动力疗法的示例包括用化合物治疗，所述化合物例如VisudyneTM和卟啉钠。
本文所用的血管抑制类固醇是指阻断或抑制血管生成的化合物，例如，如阿奈可他(anecortave)、曲安奈德、氢化可的松、11-α-表氢化皮质醇、11-脱氧皮甾醇、17α-羟基孕酮、皮质酮、脱氧皮质酮、睾丸激素、雌酮和地塞米松。
含有皮质类固醇的植入物是指化合物，例如氟轻松和地塞米松。
其他化学治疗化合物包括但不限于：植物生物碱、激素化合物和拮抗剂；生物反应调节剂，优选淋巴因子或干扰素；反义寡核苷酸或寡核苷酸衍生物；shRNA或siRNA；或混杂的化合物、或具有其他或未知作用机理的化合物。
由编号、通用名或商品名标识的活性化合物的结构可取自标准汇编“默克索引(The Merck Index)”的实际版本或数据库，例如Patents International(例如，IMS WorldPublications)。
示例的免疫肿瘤药
在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂是免疫-肿瘤剂。如本文所用，术语“免疫-肿瘤剂”是指在受试者中有效增强、刺激、和/或上调免疫反应的试剂。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂与本发明的化合物一起施用在治疗癌症中具有协同作用。
免疫-肿瘤剂可以是，例如小分子药物、抗体、或生物或小分子。生物免疫-肿瘤剂的示例包括但不限于，癌症疫苗、抗体、和细胞因子。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是人源化的或人的。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是(i)刺激性(包括共-刺激性)受体的激动剂、或(ii)T细胞上抑制性(包括共-抑制性)信号的拮抗剂，两者导致放大抗原特异性T细胞反应。
某些刺激性和抑制性分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。与共刺激或共抑制受体结合的膜结合配体的一个重要家族是B7家族，包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)、和B7-H6。与共刺激或共抑制受体结合的膜结合配体的另一个家族是与同源TNF受体家族成员结合的TNF分子家族，包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137(4-1BB)、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、Lymphotoxinα/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、Lymphotoxinα1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY和NGFR。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是抑制T细胞活化的细胞因子(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF和其他免疫抑制细胞因子)、或用于刺激免疫反应的刺激T细胞活化的细胞因子。
在一些实施方案中，本发明的化合物和免疫-肿瘤剂的组合可以刺激T细胞反应。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是：(i)抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂(例如，免疫检查点抑制剂)，例如CTLA-4,PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、Galectin 9、CEACAM-1、BTLA、CD69、Galectin-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、和TIM-4；或(ii)刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是NK细胞上抑制性受体的拮抗剂、或NK细胞上活化性受体的激动剂。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是KIR的拮抗剂，例如利瑞鲁单抗(lirilumab)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是抑制或消耗巨噬细胞或单核细胞的试剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂，例如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO2011/70024，WO2011/107553，WO2011/131407，WO2013/87699，WO2013/119716，WO2013/132044)或FPA-008(WO2011/140249；WO2013/169264；WO2014/036357)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂选自以下：连接阳性共刺激受体的激动剂、通过抑制性受体来减弱信号传导的阻断剂、拮抗剂、和系统性增加抗肿瘤T细胞频率(frequency)的一种或多种试剂、克服肿瘤微环境中不同的免疫抑制途径(例如，阻断抑制性受体参与(例如，PD-L1/PD-1相互作用))、消耗或抑制Treg(例如，使用抗-CD25单克隆抗体(例如，达克珠单抗(daclizumab)、或通过体外抗CD25珠耗尽)的试剂，抑制代谢的酶(例如，IDO)、或逆向/预防T细胞能量或衰竭)的试剂、和触发先天性免疫活化和/或在肿瘤部位炎症的试剂。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是CTLA-4拮抗剂。在一些实施方案中，CTLA-4拮抗剂是拮抗性的CTLA-4抗体。在一些实施方案中，拮抗性CTLA-4抗体是YERVOY(伊匹单抗(ipilimumab))或曲美单抗(tremelimumab)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是PD-1拮抗剂。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂通过输液施用。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是特异性结合程序性死亡-1(PD-1)受体并抑制PD-1活性的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是拮抗性的PD-1抗体。在一些实施方案中，拮抗性的PD-1抗体是OPDIVO(纳武单抗(nivolumab))、KEYTRUDA(派姆单抗(pembrolizumab))、或MEDI-0680(AMP-514；WO2012/145493)。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂可以是匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是融合到IgG1的Fc部分的PD-L2(B7-DC)的细胞外结构域组成的重组蛋白，称为AMP-224。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是PD-L1拮抗剂。在一些实施方案中，PD-L1拮抗剂是拮抗性PD-L1抗体。在一些实施方案中，PD-L1抗体是MPDL3280A(RG7446；WO2010/077634)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)、BMS-936559(WO2007/005874)和MSB0010718C(WO2013/79174)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是LAG-3拮抗剂。在一些实施方案中，LAG-3拮抗剂是拮抗性LAG-3抗体。在一些实施方案中，LAG3抗体是BMS-986016(WO2010/19570、WO2014/08218)或IMP-731或IMP-321(WO2008/132601、WO2009/44273)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是CD137(4-1BB)激动剂。在一些实施方案中，CD137(4-1BB)激动剂是激动性CD137抗体。在一些实施方案中，CD137抗体是乌瑞芦单抗(urelumab)、或PF-05082566(WO2012/32433)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是GITR激动剂。在一些实施方案中，GITR激动剂是激动性GITR抗体。在一些实施方案中，GITR抗体是BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO2006/105021，WO2009/009116)、或MK-4166(WO2011/028683)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是吲哚胺(2，3)-双加氧酶(IDO)拮抗剂。在一些实施方案中，IDO拮抗剂选自：依帕考司他(epacadostat)(INCB024360，Incyte)；或吲哚昔莫(indoximod)(NLG-8189，NewLinkGeneticsCorporation)；卡帕尼替尼(capmanitib)(INC280,Novartis)；GDC-0919(Genentech/Roche)；PF-06840003(Pfizer)；BMS：F001287(Bristol-Myers Squibb)；Phy906/KD108(Phytoceutica)；分解犬尿氨酸的酶(Kynase，KynTherapeutics)；和NLG-919(WO2009/73620，WO2009/1156652，WO2011/56652，WO2012/142237)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是OX40激动剂。在一些实施方案中，OX40激动剂是激动性OX40抗体。在一些实施方案中，OX40抗体是MEDI-6383或MEDI-6469。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是OX40L拮抗剂。在一些实施方案中，OX40L拮抗剂是拮抗性的OX40抗体。在一些实施方案中，OX40L拮抗剂是RG-7888(WO2006/029879)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是CD40激动剂。在一些实施方案中，CD40激动剂是激动性CD40抗体。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是CD40拮抗剂。在一些实施方案中，CD40拮抗剂是拮抗性CD40抗体。在一些实施方案中，CD40抗体是卢卡木单抗(lucatumumab)或达西珠单抗(dacetuzumab)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是CD27激动剂。在一些实施方案中，CD27激动剂是激动性CD27抗体。在一些实施方案中，CD27抗体是瓦利鲁单抗(varlilumab)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是MGA271(针对B7H3)(WO2011/109400)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是阿巴戈马布单抗(abagovomab)、阿德卡单抗(adecatumumab)、阿富妥珠单抗(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿那妥单抗芬太尼(anatumomab mafenatox)、阿波珠单抗(apolizumab)、阿替佐利单抗(atezolimab)、阿伐单抗(avelumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、BMS-936559、卡妥索单抗(catumaxomab)、地鲁单抗(durvaluumab)、依帕多司他(epacadostat)、依帕妥单抗(epratuzumab)、吲哚莫德(indoximod)、依普妥珠单抗(inotuzumab)奥佐米星(ozogamicin)、替鲁单抗(intelumumab)、依匹单抗、伊妥昔单抗(isatuximab)、兰博单抗(lambrolizumab)、MED14736、MPDL3280A、纳武单抗(nivolumab)、奥比单抗(obinutuzumab)、奥卡珠单抗(ocaratuzumab)、奥法西单抗(ofatumumab)、奥拉妥他单抗(olatatumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、替卡单抗(ticilimumab)、沙马珠单抗(samalizumab)或曲美单抗(tremelimumab)。
在一些实施方案中、免疫-肿瘤剂是免疫刺激剂。例如，阻断PD-1和PD-L1抑制轴的抗体可以释放活化的肿瘤反应性T细胞，并且已经在临床试验中显示出可以在越来越多的肿瘤组织学中诱导持久的抗肿瘤反应，包括一些通常不认为对免疫疗法敏感的肿瘤类型。参见，例如，Okazaki，T等人(2013)Nat.Immunol.14,1212–1218；Zou等人.(2016)Sci.Transl.Med.8。抗-PD-1抗体纳武单抗(
Figure BDA0002942622430000341
Bristol-Myers Squibb，也称为ONO-4538、MDX1106和BMS-936558)，在改善患有肾透明细胞癌(RCC)患者的总生存率方面显示出潜力，所述患者在先前的抗血管生成疗法期间或之后经历了疾病进展。
在一些实施方案中，免疫调节治疗剂特异性地诱导肿瘤细胞的凋亡。可以在本发明中使用的批准的免疫调节治疗剂包括：泊马利度胺(
Figure BDA0002942622430000342
Celgene)；来那度胺(lenalidomide)(
Figure BDA0002942622430000351
Celgene)；巨大戟醇甲基丁烯酸酯(Ingenol Mebutate)(
Figure BDA0002942622430000352
LEO Pharma)。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是癌症疫苗。在一些实施方案中，癌症疫苗选自：西普卢塞尔-T(sipuleucel-T)(
Figure BDA0002942622430000353
Dendreon/Valeant Pharmaceuticals)，其已被批准用于治疗无症状的、或最小症状的转移性阉割-抗性(激素难治性)前列腺癌；和talimogene laherparepvec(
Figure BDA0002942622430000354
BioVex/Amgen，原名T-VEC)，一种经遗传修饰的溶瘤病毒疗法，被批准用于治疗黑色素瘤中无法切除的皮肤、皮下和结节损伤。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂选自溶瘤病毒疗法，例如pexastimogene devacirepvec(PexaVec/JX-594，SillaJen/原名Jennerex Biotherapeutics)，胸腺嘧啶激酶-(TK-)缺陷型牛痘病毒，其被工程化以表达GM-CSF，用于肝细胞癌(NCT02562755)和黑色素瘤(NCT00429312)；佩拉列罗普(pelareorep)(
Figure BDA0002942622430000355
Oncolytics Biotech)，是呼吸道肠道孤儿病毒(reovirus)的变体，在多种癌中未被RAS活化的细胞中不能复制，所述多种癌包括结肠直肠癌(NCT01622543)；前列腺癌(NCT01619813)；头颈部鳞状细胞癌(NCT01166542)；胰腺腺癌(NCT00998322)；和非小细胞肺癌(NSCLC)(NCT 00861627)；enadenotucirev(NG-348，PsiOxus，原名ColoAd1)，一种腺病毒，经工程改造可表达全长CD80和对T细胞受体CD3蛋白特异性的抗体片段，在卵巢癌(NCT02028117)；转移性或晚期上皮性肿瘤，例如，结肠直肠癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌和唾液腺癌(NCT02636036)；ONCOS-102(Targovax/原名Oncos)，一种经工程改造表达GM-CSF的腺病毒，在黑色素瘤(NCT03003676)中；和腹膜疾病，结肠直肠癌或卵巢癌(NCT02963831)；在腹膜癌(NCT01443260)、输卵管癌、卵巢癌(NCT02759588)研究了经工程改造分别表达β-半乳糖苷酶(β-gal)/β-葡萄糖醛酸酶或β-gal/人碘化钠共转运蛋白(hNIS)的GL-ONC1(GLV-1h68/GLV-1h153，Genelux GmbH)、牛痘病毒；或CG0070(Cold Genesys)，一种经工程化而表达GM-CSF的腺病毒，在膀胱癌(NCT02365818)中。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂选自：JX-929(SillaJen/原名JennerexBiotherapeutics)，一种TK-和牛痘生长因子-缺陷型牛痘病毒，经工程改造表达胞嘧啶脱氨酶，其能够将前药5-氟胞嘧啶转化为细胞毒性药物5-氟尿嘧啶；TG01和TG02(Targovax/原名Oncos)，基于肽的免疫治疗剂，靶向难于治疗的RAS突变；和一种工程改造的腺病毒TILT-123(TILT Biotherapeutics)，名称为：Ad5/3-E2F-δ24-hTNFα-IRES-hIL20；和VSV-GP(ViraTherapeutics)，一种经工程改造以表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白(GP)的水泡性口炎病毒(VSV)，其可以进一步经工程改造以表达旨在提高抗原特异性CD8+T细胞反应的抗原。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是经工程改造以表达嵌合抗原受体或CAR的T细胞。经工程改造表达这种嵌合抗原受体的T细胞被称为CAR-T细胞。
已经构建了由结合结构域组成的CAR，该结合结构域可以源自以下：天然配体、对细胞表面抗原特异性的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)、融合至作为T细胞受体(TCR)功能末端的细胞内结构域(endodomain)，例如来自TCR的CD3-ζ信号传导结构域，其能够在T淋巴细胞中产生活化信号。经过抗原结合，此类CAR连接至效应细胞中的内源性信号传导途径，并产生类似于TCR复合物引发的活化信号。
例如，在一些实施方案中，CAR-T细胞是美国专利8,906,682(通过引用全文并入本文)中描述的那些之一，该专利公开了CAR-T细胞经工程改造以包含具有抗原结合结构域的细胞外结构域(例如，与CD19结合的结构域)，融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的细胞内信号传导结构域。当在T细胞中表达时，CAR能够基于抗原结合特异性来重定向(redirect)抗原识别。对于CD19，抗原在恶性B细胞上表达。目前，在各种适应症中正在进行多于200个使用CAR-T的临床试验[https://clinicaltrials.gov/ct2/results？term＝chimeric+antigen+receptors&pg＝1]。
在一些实施方案中，免疫刺激剂是视黄酸受体相关的孤儿受体γ(RORγt)的活化剂。RORγt是一种转录因子，在CD4+(Th17)和CD8+(Tc17)T细胞的17型效应子亚组的分化和维持以及NK细胞等表达IL-17的先天免疫细胞亚群的分化中起关键作用。在一些实施方案中，RORγt的活化剂是LYC-55716(Lycera)，目前正在临床试验中评估其用于治疗实体瘤(NCT02929862)。
在一些实施方案中，免疫刺激剂是toll样受体(TLR)的激动剂或活化剂。TLR的合适的活化剂包括TLR9的激动剂或活化剂，例如SD-101(Dynavax)。SD-101是一种免疫刺激性CpG，正在研究其以用于B细胞、滤泡淋巴瘤和其他淋巴瘤(NCT02254772)。可用于本发明的TLR8的激动剂或活化剂包括莫托莫莫德(motolimod)(VTX-2337，VentiRxPharmaceuticals)，其正在研究用于头颈部鳞状细胞癌(NCT02124850)和卵巢癌(NCT02431559)。
可用于本发明的其他免疫-肿瘤剂包括：乌瑞芦单抗(BMS-663513,Bristol-MyersSquibb)，一种抗-CD137单克隆抗体；瓦利鲁单抗(varlilumab)(CDX-1127,CelldexTherapeutics)，一种抗-CD27单克隆抗体；BMS-986178(Bristol-Myers Squibb)，一种抗-OX40单克隆抗体；利瑞鲁单抗(IPH2102/BMS-986015,Innate Pharma,Bristol-MyersSquibb)，一种抗-KIR单克隆抗体；莫那珠单抗(monalizumab)(IPH2201,Innate Pharma,AstraZeneca)，一种抗-NKG2A单克隆抗体；安地卡西单抗(Andecaliximab)(GS-5745，Gilead Sciences)，一种抗-MMP9抗体；以及MK-4166(Merck&Co.)，一种抗-GITR单克隆抗体。
在一些实施方案中，免疫刺激剂选自依洛珠单抗、米法莫肽、toll样受体的激动剂或活化剂、和RORγt的活化剂。
在一些实施方案中，免疫刺激性治疗剂是重组人白介素15(rhIL-15)。已在临床上测试过rhIL-15作为黑色素瘤和肾细胞癌(NCT01021059和NCT01369888)和白血病(NCT02689453)的疗法。在一些实施方案中，免疫刺激剂是重组人白介素12(rhIL-12)。在一些实施方案中，基于IL-15的免疫治疗剂是异二聚体IL-15(hetIL-15，Novartis/Admune)，一种融合复合物，其由内源性IL-15与可溶性IL-15结合蛋白IL-15受体α链(IL15：sIL-15RA)复合的合成形式组成，其已在黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和头颈部鳞状细胞癌(NCT02452268)的1期临床试验中进行测试。在一些实施方案中，重组人白介素12(rhIL-12)是NM-IL-12(Neumedicines，Inc.)、NCT02544724、或NCT02542124。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂选自Jerry L.Adams等人,“Big opportunitiesfor small molecules in immuno-oncology,”Cancer Therapy 2015，卷14，603-622页中描述的那些,其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂选自JerryL.Adams等人在表1中描述的示例。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是靶向选自JerryL.Adams等人在表2中列出的那些免疫-肿瘤靶标的小分子。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是选自Jerry L.Adams等人在表2中列出的那些小分子剂。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂选自在Peter L.Toogood,“Small moleculeimmuno-oncology therapeutic agents,”Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters2018,卷28,319-329页中描写的小分子免疫-肿瘤剂，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是靶向如Peter L.Toogood所述途径的试剂。
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂选自Sandra L.Ross等人，“Bispecific T cellengager
Figure BDA0002942622430000371
antibody constructs can mediate bystander tumor cell killing”,PLoS ONE 12(8):e0183390中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是双特异性T细胞衔接剂(engager)
Figure BDA0002942622430000372
抗体构建体。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接剂
Figure BDA0002942622430000373
抗体构建体是CD19/CD3双特异性抗体构建体。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接剂
Figure BDA0002942622430000374
抗体构建体是EGFR/CD3双特异性抗体构建体。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接剂
Figure BDA0002942622430000375
抗体构建体活化T细胞。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接剂
Figure BDA0002942622430000376
抗体构建体活化T细胞，其释放诱导上调旁邻细胞上(bystander cell)的细胞间粘附分子1(ICAM-1)和FAS的细胞因子。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接剂
Figure BDA0002942622430000377
抗体构建体活化T细胞，其导致诱导的旁邻细胞裂解。在一些实施方案中，旁邻细胞处于实体瘤中。在一些实施方案中，被裂解的旁邻细胞靠近被
Figure BDA0002942622430000378
-活化的T细胞。在一些实施方案中，旁邻细胞包含肿瘤-相关抗原(TAA)阴性癌细胞。在一些实施方案中，旁邻细胞包括EGFR-阴性癌细胞。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是阻断PD-L1/PD1轴和/或CTLA4的抗体。在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是离体扩增的肿瘤-浸润T细胞。在一些实施方案中，免疫-肿瘤试剂是将T细胞与肿瘤-相关表面抗原(TAA)直接连接的双特异性抗体构建体、或嵌合抗原受体(CAR)。
示例性免疫检查点抑制剂
在一些实施方案中，免疫-肿瘤剂是本文所述的免疫检查点抑制剂。
如本文所用，术语“检查点抑制剂”涉及可用于预防癌细胞逃避患者免疫系统的试剂。抗肿瘤免疫颠覆(subversion)的主要机制之一称为“T-细胞衰竭”，它是由于慢性暴露于抗原导致抑制受体上调所致。这些抑制受体用作免疫检查点，以防止不受控制的免疫反应。
PD-1和共抑制受体，例如细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA；CD272)，T细胞免疫球蛋白和粘蛋白(Mucin)结构域-3(Tim-3)、淋巴细胞活化基因-3(Lag-3；CD223)，其他通常称为检查点调节子。它们充当分子“守门人”，以允许细胞外信息来决定细胞周期进程和其他细胞内信号传导过程是否应该进行。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是一种针对PD-1的抗体。PD-1结合程序性细胞死亡1受体(PD-1)，以防止该受体结合抑制性配体PDL-1，从而超越了肿瘤抑制宿主抗肿瘤免疫反应的能力。
一方面，检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。在另一个方面，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、完全人源抗体、融合蛋白或其组合。另一个方面，检查点抑制剂抑制选自以下的检查点蛋白：CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在另一个方面，该检查点抑制剂与选自以下的检查点蛋白的配体相互作用：CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一方面，检查点抑制剂是免疫刺激剂、T细胞生长因子、白介素、抗体、疫苗或其组合。在另一个方面，白介素是IL-7或IL-15。在一个具体方面，白介素是糖基化的IL-7。在另一个方面，疫苗是树突细胞(DC)疫苗。
检查点抑制剂包括以统计学上显着的方式阻断或抑制免疫系统抑制途径的任何试剂。这样的抑制剂可以包括小分子抑制剂、或可包括结合至并阻断或抑制免疫检查点受体的抗体、或其抗原结合片段，或者结合至并阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。可能被靶向以阻断或抑制的示例性检查点分子包括但不限于，CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族，并在所有NK，γδ和记忆性CD8+(αβ)T细胞中表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR、和各种B-7家族配体。B7家族配体包括但不限于，B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。检查点抑制剂包括抗体、或其抗原结合片段、其他结合蛋白、生物治疗剂、或小分子，其结合并阻断或抑制以下的一种或多种的活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-15049。示例性的免疫检查点抑制剂包括曲美单抗(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗-B7-Hl；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、纳武单抗(抗-PD1抗体)、CT-011(抗-PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗-PDL1抗体)、BMS-936559(抗-PDL1抗体)、MPLDL3280A(抗-PDL1抗体)、MSB0010718C(抗-PDL1抗体)、和伊匹单抗(抗-CTLA-4检查点抑制剂)。检查点蛋白配体包括但不限于，PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD28、CD86和TIM-3。
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、和CTLA-4拮抗剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂选自纳武单抗
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伊匹单抗
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和派姆单抗
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在一些实施方案中，检查点抑制剂选自：纳武单抗(抗-PD-1抗体，
Figure BDA0002942622430000394
Bristol-Myers Squibb)；派姆单抗(抗-PD-1抗体，
Figure BDA0002942622430000395
Merck)；伊匹单抗(抗-CTLA-4抗体，
Figure BDA0002942622430000396
Bristol-Myers Squibb)；德瓦鲁单抗(durvalumab)(抗-PD-L1抗体，
Figure BDA0002942622430000397
AstraZeneca)；和阿妥珠单抗(atezolizumab)(抗-PD-L1抗体，
Figure BDA0002942622430000398
Genentech)。
在一些实施方案中，检查点抑制剂选自：兰博利珠单抗(MK-3475)、纳武单抗(BMS-936558)、匹地单抗(CT-011)、AMP-224、MDX-1105、MEDI4736、MPDL3280A、BMS-936559、伊匹单抗、利鲁单抗(lirlumab)、IPH2101、派姆单抗
Figure BDA0002942622430000399
和曲美单抗。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是：REGN2810(Regeneron)，一种抗-PD-1抗体，已在患有基底细胞癌(NCT03132636)；NSCLC(NCT03088540)；皮肤鳞状细胞癌(NCT02760498)；淋巴瘤(NCT02651662)；和黑素瘤(NCT03002376)的患者中进行了测试；匹地利珠单抗(CureTech)，也称为CT-011，一种与PD-1结合的抗体，用于弥散性大B-细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验；阿伐单抗(
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Pfizer/Merck KGaA)，也称为MSB0010718C)，一种全人IgG1抗-PD-L1抗体，在临床试验用于：非小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤、实体瘤、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌、和胃癌；或PDR001(Novartis)，一种结合至PD-1的抑制性抗体，在临床试验中用于：非-小细胞肺癌、黑色素瘤、三阴性乳腺癌、以及晚期或转移性实体瘤。曲美单抗(CP-675,206；Astrazeneca)是针对CTLA-4的全人单克隆抗体，已经在临床试验中针对多种适应症进行了研究，包括：间皮瘤、结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌和非小细胞肺癌、胰腺导管腺癌、胰腺癌、生殖细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肝脏转移癌、肝癌、大B细胞淋巴瘤、卵巢癌、子宫颈癌、转移性变性甲状腺癌、尿路上皮癌、输卵管癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、软组织肉瘤、和黑色素瘤。AGEN-1884(Agenus)是抗-CTLA4抗体，正在针对晚期实体瘤(NCT02694822)进行1期临床试验。
在一些实施方案中，检查点抑制剂是含有蛋白-3的T-细胞免疫球蛋白粘蛋白(TIM-3)的抑制剂。可用于本发明的TIM-3抑制剂包括TSR-022、LY3321367和MBG453。TSR-022(Tesaro)是抗-TIM-3抗体，其正在实体瘤(NCT02817633)中进行研究。LY3321367(EliLilly)是抗-TIM-3抗体，其正在实体瘤(NCT03099109)中进行研究。MBG453(Novartis)是抗-TIM-3抗体，其正在晚期恶性肿瘤(NCT02608268)中进行研究。
在一些实施方案中，检查点抑制剂是具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体、或TIGIT(某些T细胞和NK细胞上的免疫受体)的抑制剂。可用于本发明的TIGIT抑制剂包括BMS-986207(Bristol-Myers Squibb)，抗-TIGIT单克隆抗体(NCT02913313)；OMP-313M32(Oncomed)；和抗-TIGIT单克隆抗体(NCT03119428)。
在一些实施方案中，检查点抑制剂是淋巴细胞活化基因-3(LymphocyteActivation Gene-3)(LAG-3)的抑制剂。可用于本发明的LAG-3抑制剂包括BMS-986016和REGN3767和IMP321。BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)是一种抗-LAG-3抗体，正在胶质母细胞瘤和神经胶质肉瘤(NCT02658981)中进行研究。REGN3767(Regeneron)也是一种抗-LAG-3抗体，其正在恶性肿瘤(NCT03005782)中进行研究。IMP321(Immutep S.A.)是一种LAG-3-Ig融合蛋白，正在以下中进行研究：黑色素瘤(NCT02676869)；腺癌(NCT02614833)；和转移性乳腺癌(NCT00349934)。
可用于本发明的检查点抑制剂包括OX40激动剂。在临床试验中正在研究的OX40激动剂包括：PF-04518600/PF-8600(Pfizer)，一种激动性抗-OX40抗体，用于转移性肾癌(NCT03092856)和晚期癌症和赘生物(NCT02554812；NCT05082566)；GSK3174998(Merck),一种激动性抗-OX40抗体，处于1期癌症试验中(NCT02528357)；MEDI0562(Medimmune/AstraZeneca)，一种激动性抗-OX40抗体，用于晚期实体瘤((NCT02318394和NCT02705482)；MEDI6469，一种激动性抗-OX40抗体(Medimmune/AstraZeneca)，用于结肠直肠癌(NCT02559024)、乳腺癌(NCT01862900)、头颈癌(NCT02274155)和转移性前列腺癌(NCT01303705)的患者中；和BMS-986178(Bristol-Myers Squibb),一种激动性抗-OX40抗体，用于晚期癌症(NCT02737475)。
可用于本发明的检查点抑制剂包括CD137(也称为4-1BB)激动剂。在临床试验中正在研究的CD137激动剂包括：乌托米单抗(utomilumab)(PF-05082566，Pfizer)，一种激动性的抗-CD137抗体，在弥漫性大B细胞淋巴瘤(NCT02951156)以及晚期癌症和赘生物(NCT02554812和NCT05082566)中；乌瑞芦单抗(BMS-663513，Bristol-Myers Squibb)，一种激动性抗-CD137抗体，用于黑色素瘤和皮肤癌(NCT02652455)和胶质母细胞瘤和神经胶质肉瘤(NCT02658981)。
可用于本发明的检查点抑制剂包括CD27激动剂。在临床试验中正在研究的CD27激动剂包括：瓦利鲁单抗(CDX-1127，Celldex Therapeutics)，一种激动性抗CD27抗体，用于头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、和胶质母细胞瘤(NCT02335918)；淋巴瘤(NCT01460134)；以及神经胶质瘤和星形细胞瘤(NCT02924038)。
可用于本发明的检查点抑制剂包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)激动剂。在临床试验中正在研究的GITR激动剂包括：TRX518(Leap Therapeutics)，一种激动性抗-GITR抗体，用于恶性黑色素瘤和其他恶性实体瘤(NCT01239134和NCT02628574)；GWN323(Novartis)，一种激动性抗-GITR抗体，用于实体瘤和淋巴瘤(NCT02740270)；INCAGN01876(Incyte/Agenus)，一种激动性抗-GITR抗体，用于晚期癌症(NCT02697591和NCT03126110)；MK-4166(Merck),一种激动性抗-GITR抗体，用于实体瘤(NCT02132754)，和MEDI1873(Medimmune/AstraZeneca)，一种具有人IgG1 Fc结构域的激动性六聚GITR-配体分子，用于晚期实体瘤(NCT02583165)中。
可用于本发明的检查点抑制剂包括可诱导的T-细胞共刺激剂(ICOS，也称为CD278)激动剂。正在临床试验中研究的ICOS激动剂包括：MEDI-570(Medimmune)，一种激动性抗-ICOS抗体，用于淋巴瘤(NCT02520791)中；GSK3359609(Merck)，一种激动性抗-ICOS抗体，用于1期(NCT02723955)；和JTX-2011(Jounce Therapeutics)，一种激动性抗-ICOS抗体，用于1期(NCT02904226)。
可用于本发明的检查点抑制剂包括杀伤性IgG-样受体(KIR)抑制剂。在临床试验中正在研究的KIR抑制剂包括：利瑞鲁单抗(IPH2102/BMS-986015,Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb)，一种抗-KIR抗体，用于白血病(NCT01687387,NCT02399917,NCT02481297,NCT02599649)、多发性骨髓瘤(NCT02252263)、和淋巴瘤(NCT01592370)中；IPH2101(1-7F9,Innate Pharma)，用于骨髓瘤(NCT01222286和NCT01217203)中；和IPH4102(Innate Pharma)，一种与长细胞质尾巴的三个结构域(KIR3DL2)结合的抗-KIR抗体，用于淋巴瘤(NCT02593045)中。
可用于本发明的检查点抑制剂包括CD47和信号调节蛋白α(SIRPa)之间的相互作用的CD47抑制剂。在临床试验中正在研究的CD47/SIRPa抑制剂包括：ALX-148(AlexoTherapeutics)，一种(SIRPa)的拮抗变体，其与CD47结合并阻止CD47/SIRPa-介导的信号传导，在1期(NCT03013218)；TTI-621(SIRPa-Fc,Trillium Therapeutics)，一种可溶性重组融合蛋白，其通过将SIRPa的N-末端CD47-结合结构域与人IgG1的Fc结构域连接而产生，通过结合人CD47、并阻止其向巨噬细胞递送“不吃”信号来发挥作用，处于1期(NCT02890368和NCT02663518)的临床试验中；CC-90002(Celgene)，一种抗-CD47抗体，在白血病中(NCT02641002)；和Hu5F9-G4(Forty Seven,Inc.)，在结肠直肠肿瘤和实体瘤(NCT02953782)、急性髓细胞性白血病(NCT02678338)和淋巴瘤(NCT02953509)中。
可用于本发明的检查点抑制剂包括CD73抑制剂。临床试验中正在研究的CD73抑制剂包括：MEDI9447(Medimmune)，一种抗-CD73抗体，在实体肿瘤(NCT02503774)中；和BMS-986179(Bristol-Myers Squibb)，一种抗-CD73抗体，在实体肿瘤(NCT02754141)中。
可用于本发明的检查点抑制剂包括干扰素基因蛋白的刺激剂的激动剂(STING，也称为跨膜蛋白173或TMEM173)。正在临床试验中研究的STING激动剂包括：MK-1454(Merck)，一种激动性合成环状二核苷酸，在淋巴瘤(NCT03010176)中；和ADU-S100(MIW815，AduroBiotech/Novartis)，一种激动性合成环二核苷酸，在1期中(NCT02675439和NCT03172936)。
可用于本发明的检查点抑制剂包括CSF1R抑制剂。在临床试验中正在研究的CSF1R抑制剂包括：培西达替尼(pexidartinib)(PLX3397，Plexxikon)，一种CSF1R小分子抑制剂，用于结肠直肠癌、胰腺癌、转移性和晚期癌症(NCT02777710)和黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃肠道间质瘤(GIST)和卵巢癌(NCT02452424)；以及IMC-CS4(LY3022855,Lilly)，一种抗-CSF-1R抗体，用于胰腺癌(NCT03153410)、黑色素瘤(NCT03101254)、和实体瘤(NCT02718911)；和BLZ945(4-[2((1R,2R)-2-羟基环己基氨基)-苯并噻唑-6-基氧基]-吡啶-2-羧酸甲酰胺，Novartis)，一种口服可利用的CSF1R抑制剂，用于晚期实体瘤(NCT02829723)。
可用于本发明的检查点抑制剂包括NKG2A受体抑制剂。临床试验中正在研究的NKG2A受体抑制剂包括莫那珠单抗(IPH2201,Innate Pharma)，一种抗-NKG2A抗体，用于头颈赘生物(NCT02643550)和慢性淋巴细胞性白血病(NCT02557516)。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、阿伐单抗、德瓦鲁单抗、阿妥珠单抗或匹地利珠单抗。
治疗用途
本发明的双环肽作为结合素-4(Nectin-4)结合剂具有特定的用途。
结合素-4是一种表面分子，其属于结合素蛋白家族，包含4个成员。结合素是细胞粘附分子，其在发育和成年期间，在上皮、内皮、免疫和神经元细胞的各种生物学过程(例如极性、增殖、分化和迁移)中起关键作用。它们参与了人类的几种病理过程。它们是脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒和麻疹病毒的主要受体。编码结合素-1(PVRL1)或结合素-4(PVRL4)的基因突变会导致与其他异常相关的外胚层发育不良综合征。结合素-4在胎儿发育过程中表达。在成人组织中，其表达比该家族的其他成员的表达更受限制。结合素-4是一种与肿瘤相关的抗原，分别占乳腺癌、卵巢癌和肺癌的50％、49％和86％，主要在预后不良的肿瘤上。在相应的正常组织中未检测到其表达。在乳腺肿瘤中，结合素-4主要在三阴性和ERBB2+癌中表达。在患有这些癌症的患者的血清中，检测到可溶形式的结合素-4与不良预后有关。血清结合素-4水平在转移过程中升高，在治疗后降低。这些结果表明，结合素-4可能是治疗癌症的可靠靶标。因此，在现有技术中已经描述了几种抗-结合素-4抗体。特别是，EnfortumabVedotin(ASG-22ME)是靶向结合素-4的抗体-药物缀合物(ADC)，目前已在临床上进行了研究以治疗实体瘤患者。
根据本发明的方法选择的多肽配体可用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外测定和试剂应用等。具有选择的特异性水平的配体可应用在涉及需要交叉反应的非人类动物的测试中，或者在与同源物或旁系同源物的交叉反应需要小心控制的诊断应用中。在一些应用中，例如疫苗应用，可以利用对预定范围的抗原引起免疫应答的能力来调整针对特定疾病和病原体的疫苗。
对于哺乳动物施用，优选具有至少90至95％同质性的基本上纯的肽配体，并且对于药物施用(尤其是当哺乳动物是人时)，最优选98至99％或更高的同质性。经过纯化、部分纯化、或至所需的同质性后、所选择的多肽可以用于诊断或治疗(包括身体外)、或用于开发和执行测定程序、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis，(1979和1981年)，ImmunologicalMethods、卷I和II，Academic Press,纽约)。
根据本发明的另一个方面，提供了如本文所限定的肽配体或药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗由结合素-4介导的疾病或病症。
根据本发明的另一个方面，提供了一种预防、抑制或治疗由结合素-4介导的疾病或病症的方法，该方法包括向需要其的患者施用本文所限定的肽配体的效应物基团和药物缀合物。
在一个实施方案中，结合素-4是哺乳动物结合素-4。在另一个实施方案中，哺乳动物结合素-4是人结合素-4。
在一个实施方案中，由结合素-4介导的疾病或病症选自病毒感染、外胚层发育异常综合征和其他异常、乳腺癌、卵巢癌和肺癌、转移性进展和实体瘤。
在另一个实施方案中，由结合素-4介导的疾病或病症选自癌症。
可以治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应物)的示例包括但不限于，上皮起源的肿瘤(各种类型的腺瘤和癌，包括腺癌、鳞状癌、移行细胞癌和其他癌)，例如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食道、胃(胃)、小肠、结肠、直肠和肛门)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、颊腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻旁窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、子宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如，甲状腺滤泡癌)、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤和附属物癌(例如，黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角膜棘皮瘤、增生性痣)；血液系统恶性肿瘤(即，白血病、淋巴瘤)和癌前血液病、以及边缘恶性疾病，包括血液系统恶性肿瘤和淋巴谱系的相关病症(例如，急性淋巴细胞性白血病[ALL]、慢性淋巴细胞性白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤如弥漫性大B-细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤性[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不明的单克隆丙球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后的淋巴增生性疾病)、以及血液系统恶性肿瘤和骨髓谱系的相关病症(例如，急性髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、嗜酸性粒细胞增多综合征、骨髓增生异常病症、例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、和原发性骨髓纤维病、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征、和早幼粒细胞白血病)；间充质起源的肿瘤，例如软组织、骨或软骨的肉瘤、例如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织细胞瘤，和隆起皮肤纤维肉瘤；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如，星形细胞瘤、神经胶质瘤、和成胶质细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如，垂体瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌肿瘤和甲状腺髓样癌)；眼部和附件肿瘤(例如，视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如，畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；以及儿科和胚胎肿瘤(例如，髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、威尔姆斯肿瘤、和原始神经外胚层肿瘤)；或使患者容易患恶性肿瘤的先天性或其他形式的综合征(例如干皮病)。
在另一实施方案中，所述癌症选自造血系统恶性肿瘤，例如选自：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、B慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、B和T急性淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性髓性白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、和慢性粒细胞白血病(CML)。
在又一个实施方案中，所述癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌)、膀胱癌、胰腺癌和乳腺癌。本文的数据显示在实施例1至5中，其表明本发明所选择的双环药物缀合物在这些癌症模型中显示出抗肿瘤活性。
本文提到的术语“预防”涉及在诱发疾病之前施用保护性组合物。“抑制”是指在诱导事件之后、但在疾病的临床出现之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状变得明显之后施用保护性组合物。
可获得用于筛选肽配体在预防或治疗疾病中的有效性的动物模型系统。本发明促进了动物模型系统的使用，其允许开发可以与人和动物靶标交叉反应的多肽配体，从而允许使用动物模型。
此外，本文提供的数据证明来自多种肿瘤类型的结合素-4的拷贝数变化(CNV)与基因表达之间的关联。因此，根据本发明的另一个方面，提供了一种预防、抑制或治疗癌症的方法、其包括向有此需要的患者施用本文定义的肽配体的效应物基团和药物缀合物，其中所述患者被鉴定为具有增加的结合素-4的拷贝数变化(CNV)。
在一个实施方案中，癌症选自本文鉴定为具有增加的结合素-4的CNV的那些癌症。在另一个实施方案中，该癌症选自本文鉴定为具有增加的结合素-4的CNV的那些癌症，即：乳腺癌、子宫癌、膀胱癌、肺腺癌、肺鳞癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、胸腺瘤、肉瘤、肾透明细胞癌(RCC)、前列腺癌和胃癌。
下面参考以下实施例进一步描述本发明。
示例
缩略语
1,2,4-TriAz 3-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸
1Nal 1-萘基丙氨酸
2FuAla 2-呋喃丙氨酸
2MePhe 2-甲基-苯丙氨酸
2Nal 2-萘基丙氨酸
2Pal 2-吡啶基丙氨酸
3,3-DPA 3,3-二苯丙氨酸
3MePhe 3-甲基-苯丙氨酸
3Pal 3-吡啶基丙氨酸
4,4-BPA 4,4-联苯丙氨酸
4,4-DFP 4,4-二氟脯氨酸
4MePhe 4-甲基-苯丙氨酸
4Pal 4-吡啶基丙氨酸
4ThiAz β-(4-噻唑基)-丙氨酸
5FTrp 5-氟-L-色氨酸
Agb 2-氨基-4-胍基丁酸
Aib 氨基异丁酸
AzaTrp 氮杂色氨酸
Aze 氮杂环丁烷
C5A 环戊基甘氨酸
Cha 3-环己基-丙氨酸
Cpa 环丙基丙氨酸
Cya 磺基丙氨酸
DOPA 3,4-二羟基苯丙氨酸
HArg 高精氨酸
HGln 高谷氨酰胺
Hleu 高亮氨酸
Hphe 高苯丙氨酸
Hse(me) 高丝氨酸(Me)
Hser 高丝氨酸
HyP 羟脯氨酸
赖氨酸(Ac) 赖氨酸(乙酰)
Met(O2) 蛋氨酸砜
Nle 正亮氨酸
Oic 八氢吲哚羧酸
Oxa 恶唑烷-4-羧酸
pCoPhe 对-羧基-苯丙氨酸
PheOPhe 4-苯氧基-苯丙氨酸
Phg 苯基甘氨酸
Pip 哌啶酸
Pro(4NH) 4-氨基-脯氨酸
tBuAla 叔丁基-丙氨酸
TetraZ 四唑丙氨酸
Thi 噻嗯丙氨酸
THP(O) 四氢吡喃-4-丙酸
THP(SO2) 二氧-4-四氢硫代吡喃基乙酸
Trp(Me) 甲基色氨酸
材料和方法
肽合成
肽合成基于Fmoc化学、使用Peptide Instruments生产的Symphony肽合成仪和MultiSynTech生产的Syro II合成仪。使用标准的Fmoc-氨基酸(Sigma、Merck)，带有适当的侧链保护基团：在每种情况下使用适用的标准偶联条件，然后使用标准方法进行脱保护。
或者，使用HPLC纯化肽，并在分离后用1,3,5-三丙烯酰基六氢-1,3,5-三嗪(TATA，Sigma)修饰它们。为此，将线性肽用50:50MeCN：H2O稀释至～35mL，加入～500μL的100mMTATA的乙腈溶液，并用5mL的1M NH4HCO3的H2O溶液引发反应。使反应在RT下进行约30–60分钟，并且反应完成就立即冻干(通过MALDI判断)。完成后，将1ml的1M L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(Sigma)在H2O中的溶液加入反应，在室温下持续～60分钟，以淬灭任何过量的TATA。
冻干后，如上纯化修饰肽，同时用Gemini C18柱(Phenomenex)代替Luna C8，并将酸改变为0.1％三氟乙酸。合并含有正确TATA-修饰物质的纯馏分，冻干并保存在-20℃进行储存。
除非另有说明，所有氨基酸均以L-构型使用。
在某些情况下，在使用以下方法与毒素的游离硫醇基偶联之前，先将肽转化为活化的二硫化物；将含干燥DMSO(1.25mol eq)的4-甲基(琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯)(100mM)溶液加入到含干燥DMSO(1mol eq)的肽(20mM)溶液中。将反应充分混合并加入DIPEA(20mol eq)。通过LC/MS监测反应直至完成。
制备双环肽药物缀合物
制备BCY8549
分离条件：A相：H2O中0.075％TFA，B相：MeCN
分离方法：18-48-55分钟，RT＝53.5分钟
分离柱：Luna 200*25mm 10μm，C18，110A和Gemin150*30mm，C18，5μm，110A，连接，50℃
溶解方法：DMF
分离纯度：95％
BCY8234通过固相合成法合成。
Figure BDA0002942622430000471
Figure BDA0002942622430000481
Figure BDA0002942622430000491
制备化合物2
使用标准的Fmoc化学合成该肽。
1)将DCM添加到容器中，所述容器含有CTC树脂(5mmol，4.3g,1.17mmol/g)和Fmoc-Cit–OH(2.0g,5mmol，1.0eq)，并用N2鼓泡。
2)滴加DIEA(4.0eq)，混合2小时。
3)加入MeOH(5mL)并混合30分钟。
4)沥干水分并用DMF洗涤5次。
5)加入20％哌啶/DMF并反应30分钟。
6)沥干水分并用DMF洗涤5次。
7)加入Fmoc-氨基酸溶液并混合30秒，然后加入活化缓冲液，N2鼓泡约1小时。
8)重复上述步骤4至7，以偶联以下氨基酸。
注意：
# 材料 偶联剂
1 Fmoc-Cit-OH(1.0eq) DIEA(4.0eq)
2 1-乙氧基羰基环丁烷羧酸(3.0eq) HATU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
将在DMF中的20％哌啶用于Fmoc脱保护30分钟。通过茚三酮测试监测偶联反应，并且用DMF将树脂洗涤5次。
肽切割和纯化：
1)在室温下将裂解缓冲液(20％TFIP/80％DCM)添加到含有侧链保护肽的烧瓶中，并搅拌1小时两次。
2)过滤并收集滤液。
3)浓缩除去溶剂。
4)将粗制肽冻干，得到最终产物(1.4g，85.0％产率)。
制备化合物3
向化合物2(1.65g，5.01mmol，1.0eq)的DCM(30mL)和MeOH(15mL)溶液中加入EEDQ(2.48g，10.02mmol，2.0eq)和(4-氨基苯基)甲醇(740.37mg,6.01mmol，1.2eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物2完全消耗，检测到一个主峰具有所想要的m/z。TLC表明化合物2完全消耗并且形成许多新斑点。减压浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0002942622430000501
80
Figure BDA0002942622430000502
Silica Flash Column，梯度洗脱0～15DCM/MeOH@60mL/分钟)纯化残余物。获得呈黄色固体的化合物3(1.3g,2.99mmol、产率59.72％)。
制备化合物4
向化合物3(1.3g,2.99mmol,1.0eq)的DMF(10ml)溶液中加入DIEA(2.32g,17.95mmol,3.13mL,6.0eq)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(3.64g,11.97mmol,4.0eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物。获得呈黄色固体的化合物4(1.0g,1.67mmol、产率55.74％)。
制备化合物5
向化合物5(250.53mg,417.84μmol,1.5eq)的DMF(5mL)溶液中加入HOBt(56.46mg,417.84μmol,1.5eq)和DIEA(108.01mg,835.68μmol,145.56μL,3.0eq)、MMAE(0.200g,278.56μmol,1.0eq)。将混合物在35℃下搅拌12小时。LC-MS显示MMAE完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。通过制备型HPLC(中性条件)直接纯化反应。获得呈黄色固体的化合物5(0.180g,152.74μmol,产率54.83％)。
制备化合物6
向化合物5(0.170g,144.26μmol,1.0eq)的THF(5mL)和H2O(5mL)溶液中加入LiOH.H2O(12.11mg,288.51μmol,2.0eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物5完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。通过使用AcOH调节PH＝7，并在减压下去除THF以得到残余物。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物。获得呈黄色固体的化合物6(0.185g，粗品)。
制备BCY8549
向化合物6(0.100g,86.93μmol,1.0eq)的DMA(4mL)溶液中加入HOSu(10.00mg,86.93μmol,1.0eq)和EDCI(16.66mg,86.93μmol,1.0eq)。在NHS酯形成之后，β-Ala-BCY8234(525.98mg,173.85μmol,2.0eq)和DIEA(33.70mg,260.78μmol,45.42μL,3.0eq)。将混合物在15℃下搅拌4小时。LC-MS显示化合物6完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。通过制备型HPLC(TFA条件)直接纯化反应。获得呈白色固体的化合物BCY8549(0.0528g,12.15μmol,产率13.98％，纯度95.70％)。保留时间＝11.48分钟。显示质量＝1386.4(M/3+H)。
制备BCY8245
分离条件：A相：H2O中0.075％TFA，B相：MeCN
分离方法：18-48-55分钟，RT＝53.5分钟
分离柱：Luna 200*25mm 10um,C18,110A和Gemin150*30mm,C18,5um,110A，连接，50℃
溶解方法：DMF
分离纯度：95％
通过固相合成法合成BCY8234。
以下显示BCY8245的反应图解
Figure BDA0002942622430000511
Figure BDA0002942622430000521
制备化合物3
通过固相方法合成化合物3。
制备化合物4
向化合物3(1.3g,3.23mmol，1.0eq)的DCM(10mL)和MeOH(5mL)溶液中加入EEDQ(1.60g,6.46mmol，2.0eq)和(4-氨基苯基)甲醇(517.16mg,4.20mmol，1.3eq)。将混合物在20℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。在减压下除去溶剂。通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0002942622430000531
40g
Figure BDA0002942622430000532
Silica Flash Column,梯度洗脱0～15％DCM/MeOH@40mL/分钟)纯化残余物。获得呈黄色固体的化合物4(0.950g，1.87mmol、产率57.94％)。
制备化合物5
向化合物4(0.950g,1.87mmol,1.0eq)的DMF(5ml)溶液中加入DIEA(1.21g,9.36mmol,1.63mL,5.0eq)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(2.28g,7.49mmol,4.0eq)。将混合物在20℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物4完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。通过制备型HPLC(中性条件)直接纯化反应。获得呈白色固体的化合物5(0.400g，594.64μmol,产率31.77％)。
制备化合物6
向化合物5(0.200g,297.32μmol,1.0eq)的DMF(5mL)溶液中加入HOBt(52.23mg,386.51μmol,1.3eq)和DIEA(115.28mg,891.95μmol,155.36μL,3.0eq)、MMAE(192.12mg,267.59μmol,0.9eq)。将混合物在20℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物5完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。通过制备型HPLC(中性条件)直接纯化反应。获得呈白色固体的化合物6(0.160g,127.84μmol,产率43.00％)。
制备化合物7
向化合物6(0.160g,127.84μmol,1.0eq)的THF(3mL)和H2O(3mL)溶液中加入LiOH.H2O(26.82mg,639.21μmol,5.0eq)。将混合物在20℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物6完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。在减压下除去THF,并通过AcOH调节pH＝7，将混合物冻干。获得呈白色固体的化合物7(0.130g,105.05μmol,产率82.17％)。
制备化合物8
向化合物7(36.27mg,315.15μmol,3.0eq)的DMA(6mL)和DCM(2mL)溶液中加入EDCI(60.41mg,315.15μmol,3.0eq)。将混合物在15℃下搅拌3小时。LC-MS显示化合物7完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z。在减压下除去DCM。通过制备型HPLC(中性条件)直接纯化反应。获得呈白色固体的化合物8(0.095g,71.18μmol,产率67.76％)。
制备BCY8245
向BCY8234(66.41mg,22.48μmol,1.0eq)的DMA(4mL)溶液中添加DIEA(8.72mg,67.44μmol,11.75μL,3.0eq)和化合物8(0.030g,22.48μmol,1.0eq)。将混合物在20℃下搅拌16小时。LC-MS显示BCY8234完全消耗，以及检测到一个主峰具有所想要的m/z或想要的质量。通过制备型HPLC(TFA条件)直接纯化反应。获得呈白色固体的化合物BCY8245(0.0427g,10.16μmol,产率45.19％，纯度99.30％)。保留时间＝11.7分钟。显示质量(Mass found)＝1043.9(M/4+H)。
生物数据
结合素-4直接结合测定
根据WO 2016/067035中公开的方法，使用荧光偏振测定法测定本发明的肽对人结合素-4的亲和力(Ki)。将具有荧光标签的本发明肽(荧光素，SIGMA或Alexa Fluor488TM,Fisher Scientific)在PBS中(含有0.01％吐温20)、或在50mM HEPES(含有100mM NaCl和0.01％吐温pH 7.4)(两者都指测定缓冲液)中稀释至2.5nM。将其与在与该肽相同的测定缓冲液中的滴定蛋白组合，以在黑色壁和底部的低结合量低容量384孔板中，得到25μL总体积的1nM肽，通常为5μL测定缓冲液，10μL蛋白然后是10μL荧光肽。1比2的连续稀释液用于给出12种不同的浓度，最高浓度范围从用于已知高亲和力结合剂的500nM到低亲和力结合剂和选择性测定的10μM。在配备有“FP 485 520 520”光学模块的BMG PHERAstar FS上进行测量，该光学模块在485nm处激发，并在520nm处检测平行和垂直发射。将PHERAstar FS设置在25℃，每孔闪烁200次，定位延迟为0.1秒，每孔以5至10分钟的间隔测量60分钟。在60分钟结束时，在孔中没有蛋白质时，对于每个示踪剂确定用于分析的增益。使用Systat Sigmaplot12.0版分析数据。mP值拟合用户定义的二次方程以生成Kd值：f＝ymin+(ymax-ymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2-sqrt((((x+Lig+Kd)/2)^2)-(Lig*x)))。“Lig”是所用示踪剂浓度的定义值。
结合素-4竞争结合测定
测试无荧光标签的肽与ACPFGCHTDWSWPIWCA-Sar6-K(Fl)(SEQ ID NO:2)的竞争和(Kd＝5nM–使用上述操作规程确定)。如直接结合测定法所述，使用5％DMSO的最大值，然后以1比2进行连续稀释，将肽在测定缓冲液中稀释至适当浓度。将5μL的稀释肽添加到平板中，接着加入10μL人结合素-4，然后添加10μL荧光肽。按照直接结合测定法进行测量，尽管如此在第一次测量之前确定增益。使用Systat Sigmaplot 12.0版分析数据，其中mP值拟合用户定义的三次方程式以生成Ki值：f＝ymin+(ymax-ymin)/Lig＊((Lig＊((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+CompProt＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^05)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)))/((3＊Klig)+((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)))).
“Lig”，“KLig”和“Prot”是分别与以下相关的定义值：荧光肽浓度、荧光肽的Kd和结合素浓度。
结合素-4 Biacore SPR结合测定
进行Biacore实验以确定与人Necin-4蛋白结合的单体肽的ka(M-1s-1)、kd(s-1)、KD(nM)值(从Charles River获得)。
将具有gp67信号序列和C-末端FLAG标签的人结合素-4(残基Gly32-Ser349；NCBI参考序列：NP_112178.2)使用标准Bac-to-BacTM操作方案(Life Technologies)克隆到pFastbac-1和杆状病毒中。用P1病毒原液以MOI为2在27℃感染Excell-420介质(Sigma)中的1x106ml-1的Sf21细胞，并在72小时收获上清液。将上清液与在PBS中洗涤的抗-FLAG M2亲和琼脂糖树脂(Sigma)在4℃下分批结合1小时，然后将树脂转移至柱中并用PBS充分洗涤。用100μg/ml的FLAG肽洗脱蛋白。将洗脱的蛋白质浓缩至2ml，并以1ml/分钟的速度在PBS中上样至S-200Superdex柱(GE Healthcare)。收集2ml级分，并将含有结合素-4蛋白的级分浓缩至16mg/ml。
按照制造商建议的操作方案，使用EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin试剂(Thermo Fisher)在PBS中将蛋白质随机生物素化。使用旋转柱将蛋白质充分脱盐，以将未偶联的生物素移入PBS中。
为了分析肽结合，使用了Biacore 3000仪器，该仪器利用了CM5芯片(GEHealthcare)。使用标准胺偶联化学，在25℃下，以HBS-N(10mM HEPES，0.15M NaCl，pH 7.4)作为运行缓冲液，将链霉亲和素固定在芯片上。简而言之，将1：1比例的0.4M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以10μl/分钟的流速注射7分钟，活化羧甲基葡聚糖表面。为了捕获链霉亲和素，将蛋白质在10mM乙酸钠(pH4.5)中稀释至0.2mg/ml，并通过将120μl的链霉亲和素注射到活化的芯片表面上进行捕获。通过注射1M乙醇胺(pH 8.5)7分钟来封闭残余的活化基团，并将生物素化的结合素-4捕获至1,200-1,800RU的水平。将缓冲液更改为PBS/0.05％Tween 20，并在该缓冲液中制备一系列稀释肽，最终DMSO浓度为0.5％。最高肽浓度为100nM，再以2倍稀释稀释6次。在25℃下以50μl/分钟的流速运行SPR分析，结合时间为60秒，取决于各个肽解离时间为400到1200秒。针对DMSO排除体积效应校正数据。使用标准处理程序对所有数据进行空白注射和参考表面的双参照，并使用2.0c版Scrubber软件(BioLogic软件)进行数据处理和动力学拟合。使用简单的1：1结合模型拟合数据，以便在适当的情况下实现质量传输效应。
在上述结合素-4结合测定中测试了本发明的某些肽配体，结果示于表1中：
表1：本发明选择的肽配体的竞争结合数据
双环号 K<sub>i</sub>(μM) 实验号
BCY8122 0.003 2
BCY8126 0.0027 6
在上述SPR测定中测试了本发明的某些双环肽，结果示于表2：
表2：本发明的选定肽配体的SPR数据
Figure BDA0002942622430000561
n＝平均实验次数
将本发明的某些双环肽缀合至细胞毒性剂并在上述SPR测定中进行测试，结果示于表3：
表3：本发明选择的BDC的SPR数据
Figure BDA0002942622430000562
体内研究
在实施例1至5和9中，每个研究采用以下方法：
测试和阳性对照物
编号 物理描述 分子量 纯度 储存条件
BCY8245 冻干粉 4173.85 99.60％ 储存在-80℃
BCY8549 冻干粉 4157.81 95.70％ 储存在-80℃
实验方法和过程
(i)观察
所有研究中与动物处理、护理和治疗有关的程序均按照WuXi AppTec的动物护理和使用委员会机构(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)批准的指南进行，并遵循实验室动物评估与鉴定协会(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care)(AAALAC)的指导。在常规监测时，每天检查动物的肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响，例如活动性、食物和水的消耗量(仅通过观察)、体重增加/减少、眼睛/毛发光泽以及其他在操作规程中陈述的任何异常影响。以每个子集中的动物数量为基准记录死亡和观察到的临床体征。
(ii)肿瘤测量和终点
主要终点是观察肿瘤生长是否可以延迟或小鼠是否可以治愈。使用卡尺每周三次以二维测量肿瘤体积，并使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a x b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。然后将肿瘤尺寸用于T/C值计算。T/C值(百分比)表示抗肿瘤效果；T和C分别是在指定天的治疗组和对照组的平均体积。
使用以下公式为各组计算TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti是在指定天的治疗组的平均肿瘤体积，T0是治疗开始当天治疗组的平均肿瘤体积，Vi是载剂对照组在与Ti相同天的平均肿瘤体积，V0是治疗开始当天的载剂组的平均肿瘤体积。
(iii)统计分析
提供每个时间点各组肿瘤体积的统计数据总结，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)。
根据最终剂量后最佳治疗时间点获得的数据对各组之间的肿瘤体积差异进行统计学分析。
进行单向ANOVA以比较各组之间的肿瘤体积，当获得显着的F-统计量(治疗差异与误差差异之比)时，使用Games-Howell检验进行各组之间的比较。所有数据均使用GraphPadPrism 5.0进行分析。P＜0.05视为统计学上显著的。
实施例1：BCY8245治疗在BALB/c裸鼠中的NCI-H292异种移植物(非小细胞肺癌(NSCLC)模型)的体内疗效测试。
1.研究目的
该研究的目的是评估BCY8245在治疗BALB/c裸鼠中NCI-H292异种移植模型的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430000581
注意：n：动物编号；给药体积：基于体重调整的给药体积10μL/g。
3.材料
3.1动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠(Mus Musculus)
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：用于BCY8245的18只小鼠加上备用
动物供应商：Shanghai LC Laboratory Animal Co.,LTD.
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独通风笼中，每个笼中3只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
3.2测试和阳性对照物
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
将NCI-H292肿瘤细胞维持在补充有10％热灭活胎牛血清的培养介质中，于37℃、在空气中含5％CO2的气氛中保持。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml PBS中的NCI-H292肿瘤细胞(10×106)，以进行肿瘤生长。当平均肿瘤体积达到约158–406mm3时，将动物随机化并开始处理。以下的实验设计表中显示了每组的试验物施用和动物数量。
4.3测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430000591
Figure BDA0002942622430000592
4.4样本采集
在研究结束时，在最后一次给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟收集血浆。
5.结果
5.1肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图1和2所示。
5.2肿瘤体积轨迹
下表中显示携带有NCI-H292异种移植物的雌性Balb/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积：
表4：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430000601
表5：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430000602
5.3肿瘤生长抑制分析
基于肿瘤体积测量，计算第14天在NCI-H292异种移植模型中BCY8245的肿瘤生长抑制率。
表6：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000603
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
表7：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000611
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估BCY8245在NCI-H292异种移植模型中的治疗疗效。图1和图2以及表4至表7显示，在各个时间点中所有治疗组测量的肿瘤体积。
在第14天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到879mm3。
1mg/kg的BCY8245没有产生显著的抗肿瘤活性，从第7天开始将剂量增加到3mg/kg后，测试物显示出明显的抗肿瘤活性，但是当剂量在第21天增加到5mg/kg时，疗效没有进一步改善。在这项研究中，所有处理动物在给药方案中均显示出持续的体重减轻，这可能由于肿瘤负荷和测试物的毒性所致。
BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝149mm3,TGI＝101.4％,p<0.001),3mg/kg,biw(TV＝65mm3,TGI＝112.2％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝83mm3,TGI＝109.8％,p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。
实施例2：BCY7825，BCY8245，BCY8253，BCY8254和BCY8255在治疗CB17-SCID小鼠HT-1376异种移植物(膀胱癌模型)中的体内疗效测试
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物在治疗CB17-SCID小鼠中HT-1376异种移植物中的体内抗肿瘤功效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430000612
a第一周1mg/kg，接下来2周3mg/kg
3.材料
3.1动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：CB17-SCID
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：21-41只小鼠加备用
动物供应商：Shanghai LC Laboratory Animal Co.,LTD.
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
将HT-1376肿瘤细胞在体外作为单层培养物维持在补充有10％热灭活胎牛血清的EMEM介质中，于37℃、在空气中含5％CO2的气氛中维持。肿瘤细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理进行常规每周传代两次。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml的具有基质胶的PBS(1：1)中的HT-1376肿瘤细胞(5×106)，以进行肿瘤生长。当平均肿瘤体积达到153-164mm3时，将动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430000631
Figure BDA0002942622430000632
4.4样本采集
在研究结束时，在最后一次给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟收集第2组的血浆。在最后一次给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟收集第6组的血浆。在最后一次给药后2小时收集第6组的肿瘤。在最后一次给药后2小时收集第4组和第5组的肿瘤。
5.结果
5.1肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图3和4所示。
5.2肿瘤体积轨迹
表8和表9显示了携带HT-1376异种移植物的雌性CB17-SCID小鼠中平均肿瘤体积随时间的变化。
Figure BDA0002942622430000641
表9：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430000651
5.3肿瘤生长抑制分析
基于处理开始后第21天的肿瘤体积测量，计算HT-1376异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表10：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000652
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
表11：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000653
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
第1组和第2组
在这项研究中，评估了测试物在HT-1376异种移植模型中的治疗疗效。图3以及表8和表10显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在第21天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到884mm3。1mg/kg的BCY8245产生轻微的抗肿瘤活性，并且从第7天起将剂量增加至3mg/kg后，发现更好的疗效。
在这项研究中，用3mg/kg的测试物处理的一些小鼠体重减轻超过10％。
第3-6组
在这项研究中，评估了测试物在HT-1376异种移植模型中的治疗疗效。图4以及表9和表11显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝603mm3,TGI＝50.9％,p<0.01),3mg/kg,biw(TV＝407mm3,TGI＝72.3％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝465mm3,TGI＝66.0％,p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。
在这项研究中，5mg/kg qw的BCY8245在治疗时间段中引起超过10％的动物体重减轻。
实施例3：BCY8245在治疗Balb/c裸鼠中Panc2.13异种移植物(胰腺癌模型)的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物在治疗Balb/c裸鼠的Panc2.13异种移植物中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430000661
3.材料
3.1动物和饲养条件
3.1.1动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：41只小鼠加备用
动物供应商：Shanghai LC Laboratory Animal Co.,LTD.
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
将Panc2.13肿瘤细胞维持在补充有15％热灭活胎牛血清和10单位/ml人重组胰岛素的RMPI1640介质中，于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中保持。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2肿瘤接种
将每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml含有基质胶的PBS(1：1)中的Panc2.13肿瘤细胞(5×106)，以进行肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到149mm3时，将41只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430000671
4.4样本采集
在该研究结束时，在最后一次给药后2h收集所有组的肿瘤。
5.结果
5.1肿瘤生长曲线
在图5中显示肿瘤生长曲线
5.2肿瘤体积轨迹
下表12中显示携带有Panc2.13异种移植物的雌性Balb/c裸鼠平均肿瘤体积随时间的变化。
表12：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430000681
5.3肿瘤生长抑制分析
基于处理开始后第14天的肿瘤体积测量，计算Panc2.13异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表13：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000682
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在Panc2.13异种移植模型中的治疗疗效。图5以及表12和表13显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝271mm3,TGI＝69.2％,p<0.01)，3mg/kg,biw(TV＝231mm3,TGI＝79.1％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝238mm3,TGI＝77.5％,p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。
实施例4：BCY8245在治疗Balb/c裸鼠中MDA-MB-468异种移植物(乳腺癌模型)的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估BCY8245在治疗Balb/c裸鼠的MDA-MB-468异种移植物中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430000691
3.材料
3.1动物和饲养条件
3.1.1动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：41只小鼠加备用
动物供应商：Shanghai LC Laboratory Animal Co.,LTD.
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
将肿瘤细胞维持在补充有10％热灭活胎牛血清的莱博维茨(Leibovitz's)L-15介质中，于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中维持。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种在0.2ml的补充有50％基质胶的PBS中的MDA-MB-468肿瘤细胞(10×106)，以用于肿瘤生长。当平均肿瘤体积达到196mm3时，将41只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430000701
4.4样本采集
在研究的第21天，在最后一次给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟收集第2组的血浆。在最后一次给药后2h收集第1组和第3组的肿瘤。在第4组的动物没有任何给药继续饲养另21天，在第42天收集这些组的肿瘤。
5.结果
5.1肿瘤生长曲线
在图6中显示肿瘤生长曲线
5.2肿瘤体积轨迹
下表14和15中显示携带有MDA-MB-468异种移植物的雌性Balb/c裸鼠平均肿瘤体积随时间的变化。
Figure BDA0002942622430000711
5.3肿瘤生长抑制分析
基于处理开始后第21天的肿瘤体积测量，计算MDA-MB-468异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表16：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000721
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在MDA-MB-468异种移植模型中的治疗疗效。图6以及表14至表16显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝85mm3,TGI＝144.2％,p<0.001),3mg/kg,biw(TV＝22mm3,TGI＝169.8％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝29mm3,TGI＝168.4％,p<0.001)以剂量或剂量-频率依赖的方式产生显著的抗肿瘤抗肿瘤活性。
从第21天开始暂停5mg/kg组的给药，在额外三周监测时间期间，肿瘤未显示任何复发。
实施例5：BCY8549在治疗BALB/c裸鼠中的NCI-H292异种移植物(非小细胞肺癌(NSCLC)模型)的体内疗效测试。
1.研究目的
该研究的目的是评估BCY8549在治疗Balb/c裸鼠的NCI-H292异种移植物中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430000722
3.材料
3.1动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：43只小鼠加备用
动物供应商：Shanghai Lingchang Biotechnology Experimental AnimalCo.Ltd
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独的通风笼中，每个笼中3或4只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
将NCI-H292肿瘤细胞在体外作为单层培养物在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640介质中，于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中维持。肿瘤细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理进行常规每周传代两次。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml PBS中的NCI-H292肿瘤细胞(10X106)，以进行肿瘤生长。当平均肿瘤体积达到168mm3时，将43只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430000731
4.4样本采集
在研究结束时，在最后一次给药后5分钟、15分钟、30分钟、1h和2h收集第2组的血浆。
5.结果
5.1肿瘤生长曲线
在图7中显示肿瘤生长曲线
5.2肿瘤体积轨迹
下表17中显示携带有NCI-H292异种移植物的雌性Balb/c裸鼠平均肿瘤体积随时间的变化。
表17：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430000741
5.3肿瘤生长抑制分析
基于处理开始后第14天的肿瘤体积测量，计算NCI-H292异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表18：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000742
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估BCY等在NCI-H292异种移植模型中的治疗疗效。图7以及表17和表18显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在第14天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到843mm3。3mg/kg的BCY8549显示出显著的抗肿瘤活性。在这项研究中，所有小鼠体重维持很好。
实施例6：调查来自多个肿瘤类型的结合素-4的拷贝数变化(CNV)和基因表达之间的相关性
方法
1.选择在cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)中的所有研究并搜索NECTIN4。
(a)移除临时研究。
(b)取消选择具有重叠样本的研究以防止样本偏差(基于cBioPortal中的警告)-如果可以选择，始终保留PanCancer研究。
(c)选择研究用于分析(表19)。
表19：从cBioPortal和研究单元中分析研究
Figure BDA0002942622430000751
Figure BDA0002942622430000761
Figure BDA0002942622430000771
Figure BDA0002942622430000781
2.从cBioPortal导出CNV和RNA表达数据。
3.检验CNV是否与结合素-4mRNA表达变化在统计学上显著相关(未应用log2)。
(a)在GraphPad Prism(7.04)和R/R工作台(studio)中运行非参数Kruskal-Wallis检验(显著性阈值：p<0.01)。
(i)GraphPad Prism：设置列表，运行不匹配或不配对以及不采用高斯分布的非参数检验。
(ii)R中使用的软件包：
1.XLConnect
2.dplyr
3.Kruskal-Wallis秩和检验：Kruskal检验。
4.在R/R工作台中使用Dunn检验调整多重比较(即使组中n＝1，也包括所有可能的比较)(显著性阈值：p<0.025)。
(a)使用多重比较方法的dunn.test＝“bonferonni”。
结果
结果显示在下表20中。在报告结合素-4的肿瘤CNV和mRNA基因表达数据的41个可公开获得的TCGA数据集中，有许多适应症已经报告具有结合素-4拷贝数增加(2-3拷贝)或扩增(>3拷贝)的病例。此外,已经证明具有浅删除(shallow deletions)(<2拷贝)的单独的病例很少报告含有深度删除(deep deletion)的肿瘤，这与多于1拷贝丢失或双等位基因(biallelic)结合素-4丢失相一致。最常检测到扩增的适应症是乳腺癌(10-22％)、膀胱癌(20％)、肺癌(5-7％)和肝细胞癌(8％)。拷贝数丢失最频繁的迹象是肾嫌色癌(77％)、肾透明细胞癌(RCC)(6.5％)、肉瘤(10％)、结肠癌(10％)、头颈癌(7％)和肺鳞状癌。这些数据表明在肿瘤适应症内和之间存在一定范围的CNV，并且在不同适应症之间存在拷贝数模式的多样性。
除了TCGA数据集内的CNV之外，每个适应症的结合素-4mRNA表达水平的中位数涵盖大约210个范围。因此，给定结合素-4mRNA表达水平的范围和在肿瘤类型之间和之中观察到的CNV，进行统计检验以鉴定各个TCGA数据集/适应症中结合素-4mRNA水平与结合素-4CNV之间的潜在相关性。每个适应症的肿瘤被分为5类中的1类：
a)深度删除；
b)浅删除；
c)二倍体；
d)增加；或
e)扩增。
然后进行Kruskall-Wallis检验，以检测各类之间每类mRNA表达值的分布是否不同(P<0.01)。对于那些P<0.01的TCGA数据集，通过计算Z-统计值并计算调整后的P值(Bonferonni)进行事后检验，以识别哪些类别彼此不同。为了简化解释，对每个适应症进行相对于二倍体的配对比较(尽管计算了所有配对的P值)。18/41TCGA研究在增加相对二倍体和/或扩增相对二倍体比较中达到Kruskall-Wallis P<0.01和Bonferonni P<0.025，表明结合素-4mRNA表达增加与结合素-4拷贝数增加相关。这18项研究代表了14种独立的肿瘤组织学：
乳腺癌、子宫癌、膀胱癌，肺腺癌、肺鳞癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、胸腺瘤、肉瘤、肾透明细胞癌(RCC)和胃癌。
此外，有6项研究具有与拷贝数丢失相关的mRNA表达降低。这六项研究中的四项不仅显示了CNV丢失与表达降低之间相关，而且还报告CNV增加与高表达相关：
胃癌、肺鳞癌、结肠癌和甲状腺癌。
肾脏嫌色癌和前列腺癌这两个适应症仅报道与CNV丢失和低转录本丰度相关。此外，还有单独的前列腺癌研究(转移性前列腺癌，SU2C/PCF Dream Team(Robinson等人，Cell 2015))，显示拷贝数增加与高表达(相对于二倍体)相关。
这些观察到的肿瘤CNV丢失和增加与mRNA表达水平，可代表在观察到这种相关性的那些适应症中结合素-4肿瘤蛋白表达背后的机制。显然，有适应症(例如肝细胞癌)，其中CNV似乎不会以可预测的模式影响mRNA表达水平。已经证明本发明的某些结合素-4双环药物缀合物的体内临床前疗效与通过IHC测量的结合素-4蛋白表达相关。因此，如果肿瘤结合素-4CNV与mRNA水平相关并预测蛋白质表达水平，则形式上可能具有拷贝数增加(增益或扩增)的肿瘤患者更可能对本发明的结合素-4双环药物缀合物有反应。如果可以鉴定出结合素-4中CNV增加的患者，那么该信息可以用于选择用本发明的结合素-4双环药物缀合物治疗的患者。
Figure BDA0002942622430000811
Figure BDA0002942622430000821
Figure BDA0002942622430000831
Figure BDA0002942622430000841
Figure BDA0002942622430000851
Figure BDA0002942622430000861
Figure BDA0002942622430000871
Figure BDA0002942622430000881
Figure BDA0002942622430000891
实施例7：结合素-4在6个细胞系的表达分析
1.研究目的
研究目的是通过流式细胞仪评估结合素-4在6个细胞系中的表达，所述6个细胞系包括2个乳腺癌(T-47D、MDA-MB-468)、3个肺癌(NCI-H292、NCI-H322、NCI-H526)以及一个纤维肉瘤(HT-1080)细胞系。
2.小组设计
用于T-47D、MDA-MB-468、NCI-H292、NCI-H322和HT-1080中FCM的小组
荧光染料 空白 同种型 小组
PE - 同种型对照 结合素-4
NCI-H526的小组
荧光染料 空白 同种型 小组
PE - 同种型对照 结合素-4
BV421 活/死 活/死 活/死
3.材料
1.1.样本
细胞系列表
Figure BDA0002942622430000901
3.2.试剂
用于流式细胞仪分析的抗体和试剂盒
Figure BDA0002942622430000911
DPBS(Corning-21-031-CV)
染色缓冲液(eBioscience-00-4222)
固定缓冲液(BD-554655)
3.3.仪器
Eppendorf Centrifuge 5810R
BD FACS Canto流式细胞仪(BD)
4.实验方法和过程
4.1样本采集
收集在指数生长期的细胞系。通过血球计使用台盼蓝染色计数细胞。在4℃以400×g离心细胞5分钟，使用染色缓冲液洗涤细胞两次，然后在染色缓冲液中重悬细胞至1×107/mL。
4.2抗体染色
1)等分100μL细胞悬浮液至96孔V板的每个孔中。
2)加入同种型对照或抗体至悬浮细胞中，并在黑暗中在4℃孵育30分钟。
3)在4℃以400×g离心5分钟来洗涤细胞2×，并弃掉上清。
4)使用100μL的固定缓冲液来重悬细胞，并在黑暗中在4℃孵育30分钟。
5)在4℃以300×g离心5分钟来洗涤细胞2×，并除去上清。
6)在400μL染色缓冲液中重悬细胞。
7)使用FlowJo V10软件分析FACS数据。
4.3数据分析
使用FlowJo V10软件和Graphpad Prism或Excel软件分析所有FACS数据。
5.结果
5.1小组的门控策略
在图8-11中显示结合素-4的门控策略
5.2数据分析
5.2.1.细胞系的生存力
细胞系的生存力如下。
Figure BDA0002942622430000912
Figure BDA0002942622430000921
5.2.2.在细胞系中结合素-4的阳性表达
在6个细胞系中结合素-4的阳性表达和MFI如列表
Figure BDA0002942622430000922
6.讨论
结合素-4在以下高表达：乳腺癌T-47D(99.0％)、MDA-MB-468(99.0％)和肺癌NCI-H292(97.9％)、NCI-H322(99.1％)。没有发现结合素-4在NCI-H526和HT-1080中表达。
实施例8：通过流式细胞仪进行在9个CDX细胞系的结合素-4表达分析
1.研究目的
该项目的目的是评估在9个细胞系中结合素-4(PVRL-4)的表面表达，所述细胞系包括1个乳腺癌(MDA-MB-468)、4个肺癌(NCI-H292、NCI-H358、NCI-H526、A549)、1胰腺癌(Panc02.13)、2个结肠直肠癌(HCT-116、HT-29)和1个膀胱癌(HT1376)细胞系。
2.小组设计
在9个细胞系中FCM的小组
荧光染料 空白 同种型 小组
PE - 同种型对照IgG2b 结合素-4
BV421 活/死 活/死 活/死
3.材料
3.1样本
细胞系列表
Figure BDA0002942622430000931
3.2.试剂
1)DPBS(Corning,21-031-CV)
2)胰蛋白酶0.25％(Invitrogen-25200072)
3)染色缓冲液(eBioscience,00-4222)
4)固定缓冲液(BD,554655)
5)抗体
荧光 标记物 目录号 供应商 说明
PE 结合素-4 FAB2659P R&D AAAO0217021
PE 小鼠IgG2b IC0041P R&D
BV421 活/死 L34964 Invitrogen -
3.3.仪器
Eppendorf Centrifuge 5810R
BD FACS Canto流式细胞仪(BD)
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
细胞解冻
1)用70％的酒精清洁冷冻的小瓶(vial)，然后在37℃水浴中快速解冻小瓶。
2)以约1000rpm离心细胞悬浮液5分钟，除去上清液，并将预热培养基添加到烧瓶中。
3)在37℃，5％CO2培养箱中孵育烧瓶。
细胞传代
1)在37℃水浴中温育介质和胰蛋白酶。
2)除去培养介质，并用DPBS冲洗细胞层。
3)向烧瓶中加入5mL 0.25％胰蛋白酶溶液，并用5mL介质稀释胰蛋白酶。
4)将细胞悬浮液以1000rpm离心5分钟。
5)加入15mL新鲜介质，并轻轻移液重悬细胞。
6)向新的培养烧瓶中添加适当的细胞悬液。
7)在37℃，5％CO2培养箱中孵育培养烧瓶。
4.2.样本采集
收获在指数生长期生长的细胞系。用台盼蓝染色计数细胞。在4℃以400×g离心细胞5分钟，使用染色缓冲液洗涤细胞两次，然后在染色缓冲液中重悬细胞至5×106/mL。
4.3.抗体染色
等分100μL细胞悬浮液至96孔V板的每个孔中。加入同种型对照或抗体至悬浮细胞中，并在黑暗中在4℃孵育30分钟。在4℃以400×g离心5分钟来洗涤细胞2次，并弃掉上清。在300μL染色缓冲液中重悬细胞。使用Flow Jo V10软件分析FACS数据。
4.4.数据分析
使用FlowJo V10软件和Graphpad Prism或Excel软件分析所有FACS数据。
5.结果
5.1.小组的门控策略
在图12-16中显示结合素-4的门控策略。
5.2.数据分析
在9个细胞系中结合素-4的阳性表达和MFI如列表。
Figure BDA0002942622430000941
Figure BDA0002942622430000951
6.讨论
结合素-4在以下高表达：膀胱癌HT-1376(92.4％)、乳腺癌MDA-MB-468(97.1％)和肺癌NCI-H358(90.1％)。发现结合素-4在以下中表达：HT-29(40.0％)、NCI-H292(71.1％)和Panc02.13(51.9％)。没有发现结合素-4在HCT-116、A549和NCI-526中表达。该数据将用于指导模型选择以用于疗效研究。
实施例9：体内疗效研究
实施例9.1：测试物在治疗Balb/c裸鼠中A549异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物治疗在Balb/c裸鼠中A549异种移植物的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430000952
3.材料
动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：41只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1.细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的F-12K介质中，于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中体外作为单层培养物维持A549肿瘤细胞。肿瘤细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理进行常规每周传代两次。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2.肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml PBS中的A549肿瘤细胞(5×106)，以进行肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到158mm3时，将41只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3.测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430000961
4.4.样本采集
在该研究结束时，在最后一次给药后2h收集所有组的肿瘤。
5.结果
5.1.肿瘤生长曲线
在图17中显示肿瘤生长曲线。
5.2.肿瘤体积轨迹
下表21中显示携带有A549异种移植物的雌性Balb/c裸鼠的平均肿瘤体积随时间的变化。
表21：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430000962
Figure BDA0002942622430000971
5.3.肿瘤生长抑制分析
基于治疗开始后第14天的肿瘤体积测量，计算A549异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表22：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000972
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在A549异种移植模型中的治疗疗效。图17以及表21和表22显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在第14天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到568mm3。BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝356mm3,TGI＝51.4％,p<0.05),3mg/kg,biw(TV＝194mm3,TGI＝90.8％,p<0.01)和5mg/kg,qw(TV＝228mm3,TGI＝82.6％,p<0.001)以剂量或剂量-频率依赖的方式产生显著的抗肿瘤抗肿瘤活性。
在BCY8245组的动物良好地维持了体重。在该细胞系中，显示出结合素-4在FACS研究中的最低表达，肿瘤生长受到BCY8245限制，但肿瘤并未消退，强调用于最佳疗效的靶向驱动需求。
实施例9.2：测试物在治疗Balb/c裸鼠中HCT116异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物在治疗Balb/c裸鼠中HCT116异种移植物中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430000981
3.材料
3.1.动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：41只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的介质中，于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中保持HCT116细胞。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2.肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml的PBS中的HCT116肿瘤细胞(5.0×106)，以进行肿瘤生成。当平均肿瘤体积达到166mm3时，将41只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3.测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430000991
4.4.样本采集
在第14天在研究结束时，从第1组和第2组收集肿瘤用于FFPE。对于第4组，在给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟收集血浆。还收集肿瘤并储存在-80℃。
5.结果
5.1.肿瘤生长曲线
在图18中显示肿瘤生长曲线。
5.2.肿瘤体积轨迹
下表23中显示携带有HCT116异种移植物的雌性Balb/c裸鼠的平均肿瘤体积随时间的变化。
表23：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430000992
5.3.肿瘤生长抑制分析
基于处理开始后第14天的肿瘤体积测量，计算HCT116异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表24：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430000993
Figure BDA0002942622430001001
a.平均值±SEM；b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在HCT116异种移植模型中的治疗疗效。图18以及表23和表24显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在开始处理后第14天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到769mm3。BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝425mm3,TGI＝57.1％,p<0.001),3mg/kg,biw(TV＝197mm3,TGI＝94.9％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝134mm3,TGI＝105.2％,p<0.001)以剂量或剂量-频率依赖的方式产生显著的抗肿瘤抗肿瘤活性。
在该研究中，在所有5mg/kg qw组的动物体重减轻平均多于10％。
在该细胞系中，显示结合素-4在FACS研究中最低表达，肿瘤生长受到BCY8245限制，但肿瘤并未消退，强调用于最佳疗效的靶向驱动需求。
实施例9.3：测试物在治疗CB17-SCID小鼠中HT-1376异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物在CB17-SCID小鼠中HT-1376异种移植物治疗中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430001002
3.材料
3.1动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：CB17-SCID
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：41只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的EMEM介质中，于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中维持HT-1376肿瘤细胞。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml含有基质胶(1：1)的PBS中的HT-1376肿瘤细胞(5×106)，以进行肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到153mm3时，将41只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3.测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430001011
4.4.样本采集
在研究结束时，在最后一次给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟收集第4组的血浆。在最后一次给药后2小时收集第4组的肿瘤。在最后一次给药后2小时收集第1、2和3组的肿瘤。
5.结果
5.1.肿瘤生长曲线
在图19中显示肿瘤生长曲线。
5.2.肿瘤体积轨迹
表25显示携带HT-1376异种移植物的雌性CB17-SCID小鼠中平均肿瘤体积随时间的变化。
表25：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430001021
5.3.肿瘤生长抑制分析
基于处理开始后第14天的肿瘤体积测量，计算HT-1376异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表26：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430001022
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估测试物在HT-1376异种移植模型中的治疗疗效。图19以及表25和表26显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在第14天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到1069mm3。BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝603mm3,TGI＝50.9％,p<0.01)，3mg/kg,biw(TV＝407mm3,TGI＝72.3％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝465mm3,TGI＝66.0％,p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。在这项研究中，5mg/kg qw的BCY8245在治疗时间段中引起多于10％的动物体重减轻。
实施例9.4：测试物在治疗Balb/c裸鼠中MDA-MB-468异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物在治疗Balb/c裸鼠中MDA-MB-468异种移植物中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430001031
3.材料
3.1动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：41只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4实验方法和过程
4.1细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的莱博维茨L-15介质中、于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中，维持肿瘤细胞。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种在0.2ml的补充有50％基质胶的PBS中的MDA-MB-468肿瘤细胞(10×106)，以用于肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到196mm3时，将41只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430001041
4.4样本采集
在研究的第21天，在最后一次给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟收集第2组的血浆。在最后一次给药后2h收集第1组和第3组的肿瘤。将第4组的动物继续饲养另21天，没有任何给药，并在第42天收集这些组的肿瘤。
5结果
5.1肿瘤生长曲线
在图20中显示肿瘤生长曲线。
5.2肿瘤体积轨迹
下表27和28中显示携带有MDA-MB-468异种移植物的雌性Balb/c裸鼠平均肿瘤体积随时间的变化。
5.3肿瘤生长抑制分析
基于治疗开始后第21天的肿瘤体积测量，计算MDA-MB-468异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
Figure BDA0002942622430001051
表28：肿瘤体积随时间变化的轨迹(第23天至第42天)
Figure BDA0002942622430001061
表29：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430001062
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在MDA-MB-468异种移植模型中的治疗疗效。图20以及表27至表29显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在第21天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到447mm3。BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝85mm3,TGI＝144.2％,p<0.001),3mg/kg,biw(TV＝22mm3,TGI＝169.8％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝29mm3,TGI＝168.4％,p<0.001)以剂量或剂量-频率依赖的方式产生显著的抗肿瘤抗肿瘤活性。
从第21天开始暂停5mg/kg组的给药，在额外三周监测时间期间，肿瘤未显示任何复发。在该细胞系中，其显示结合素-4在FACS研究中高表达，BCY8245导致肿瘤消退，这强调最佳疗效的靶向驱动性质。
实施例9.5：测试物在治疗Balb/c裸鼠中NCI-H292异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物在治疗Balb/c裸鼠中NCI-H292异种移植物中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430001071
3.材料
3.1.动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：41只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1.细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640介质中、于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中体外作为单层培养物维持NCI-H292肿瘤细胞。肿瘤细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理进行常规每周传代两次。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2.肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml PBS中的NCI-H292肿瘤细胞(10×106)，以进行肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到162mm3时，将41只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3.测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430001081
4.4.样本采集
在该研究结束时，在最后一次给药后2h收集所有组的肿瘤。
5.结果
5.1肿瘤生长曲线
在图21中显示肿瘤生长曲线。
5.2.肿瘤体积轨迹
下表30中显示携带有NCI-H292异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中的平均肿瘤体积随时间的变化。
表30：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430001082
5.3.肿瘤生长抑制分析
基于治疗开始后第14天的肿瘤体积测量，计算NCI-H292异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表31：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430001083
Figure BDA0002942622430001091
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估测试物在NCI-H292异种移植模型中的治疗疗效。图21以及表30和表31显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在第14天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到948mm3。BCY8245以3mg/kg,qw(TV＝149mm3,TGI＝101.4％,p<0.001),3mg/kg,biw(TV＝65mm3,TGI＝112.2％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝83mm3,TGI＝109.8％,p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。
所有这些测试物在3mg/kg、qw，3mg/kg、biw和5mg/kg、qw时，显示出可比较的抗肿瘤活性，当提高剂量或剂量-频率时，疗效并未有进一步改善。
在该研究中，所有组中的小鼠体重维持得很好。
在该细胞系中，其显示出结合素-4在FACS研究中高表达，BCY8245导致肿瘤消退，强调最佳疗效的靶向驱动性质。
实施例9.6：测试物在治疗B alb/c裸鼠中NCI-H526异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物在治疗Balb/c裸鼠中NCI-H526异种移植物中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430001092
3.材料
3.1.动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：21只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独通风笼中，每个笼中3只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的介质中、于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中保持NCI-H526细胞。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2.肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml的PBS中的NCI-H526肿瘤细胞(5.0×106)，以进行肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到181mm3时，将21只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3.测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430001101
4.4.样本采集
在第14天研究结束时，收集所有肿瘤用于FFPE。
5.结果
5.1.肿瘤生长曲线
在图22中显示肿瘤生长曲线。
5.2.肿瘤体积轨迹
下表32中显示携带有NCI-H526异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中的平均肿瘤体积随时间的变化。
表32：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430001111
5.3.肿瘤生长抑制分析
基于处理开始后第14天的肿瘤体积测量，计算NCI-H526异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表33：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430001112
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估测试物在NCI-H526异种移植模型中的治疗疗效。图22以及表32和表33显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在治疗开始后的第14天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到13653。BCY8245(3mg/kg,qw)(TV＝1205mm3,TGI＝13.4％,p＞0.05)和BCY8245(3mg/kg，biw)(TV＝1109mm3,TGI＝21.6％,p>0.05)显示轻度的抗肿瘤活性，BCY8245(5mg/kg,qw)(TV＝476mm3,TGI＝75.0％,p<0.01)显示显著的抗肿瘤活性。在这项研究中，BCY8245(5mg/kg biw)引起多于10％的动物体重减轻。在该细胞系中，其显示出结合素-4在FACS研究中最低表达，肿瘤生长受到BCY8245限制，但肿瘤并未消退，强调用于最佳疗效的靶向驱动需求。
实施例9.7：测试物在治疗Balb/c裸鼠中Panc2.13异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估测试物在治疗Balb/c裸鼠中Panc2.13异种移植物的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430001121
3.材料
3.1.动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：41只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下单独的通风笼中，每个笼中3或5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1.细胞培养
在补充有15％热灭活胎牛血清和10单位/ml人重组胰岛素的RMPI1640介质中、于37℃、在空气中含有5％CO2的气氛中保持Panc2.13肿瘤细胞。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2.肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种0.2ml含有基质胶的PBS(1:1)中的Panc2.13肿瘤细胞(5×106)，以进行肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到149mm3时，将41只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3.测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430001131
4.4.样本采集
在该研究结束时，在最后一次给药后2h收集所有组的肿瘤。
5.结果
5.1.肿瘤生长曲线
在图23中显示肿瘤生长曲线。
5.2.肿瘤体积轨迹
下表34中显示携带有Panc2.13异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中平均肿瘤体积随时间的变化。
表34：肿瘤体积随时间变化的轨迹
Figure BDA0002942622430001132
5.3.肿瘤生长抑制分析
基于治疗开始后第14天的肿瘤体积测量，计算Panc2.13异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表35：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430001141
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在Panc2.13异种移植模型中的治疗疗效。图23以及表34和表35显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在第14天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到545mm3。BCY8245，3mg/kg,qw，(TV＝271mm3,TGI＝69.2％,p<0.01),3mg/kg,biw(TV＝231mm3,TGI＝79.1％,p<0.001)和5mg/kg,qw(TV＝238mm3,TGI＝77.5％,p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。在该研究中，在5mg/kg qw组的所有动物体重减轻平均超过15％。在该细胞系中，其显示出结合素-4在FACS研究中仅有中度表达，肿瘤生长受到BCY8245限制，但肿瘤并未消退。
实施例9.8：测试物在治疗Balb/c裸鼠中MDA-MB-468异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估BCY8245以及BCY8245与BCY8234的组合在治疗Balb/c裸鼠中MDA-MB-468异种移植物的体内抗肿瘤疗效，以测定靶向结合在最佳疗效中发挥的作用。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430001151
注意：N，每组动物数量
3.材料
3.1.动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：36只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独通风笼中，每个笼中4只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1.细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的莱博维茨L-15介质中、于37℃、在空气中含有0％CO2的气氛中，维持肿瘤细胞。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2.肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种在0.2ml补充有50％基质胶的PBS中的MDA-MB-468肿瘤细胞(10×106)，以用于肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到186mm3时，将36只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3.测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430001161
4.4.样本采集
在研究的第21天，收集第5组和第6组的肿瘤用于FFPE。在研究结束时，收集第3组的肿瘤用于FFPE。
5.结果
5.1.肿瘤生长曲线
在图24中显示肿瘤生长曲线。
5.2.肿瘤体积轨迹
下表36至38中显示携带有MDA-MB-468异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中的平均肿瘤体积随时间的变化。
5.3.肿瘤生长抑制分析
基于治疗开始后第21天的肿瘤体积测量，计算MDA-MB-468异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在MDA-MB-468异种移植模型中的治疗疗效。图24以及表36至表39显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
在第21天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到420mm3。BCY8245以1mg/kg,qw(TV＝204mm3,TGI＝92.1％,p<0.001),3mg/kg,qw(TV＝27mm3,TGI＝164.9％,p<0.001)，以剂量依赖的方式产生显著的抗肿瘤活性。BCY8245，0.3mg/kg qw或biw并未产生任何抗肿瘤活性。
BCY8245,1mg/kg,qw和BCY8245,3mg/kg,qw组合BCY8234(无毒素的同源肽),300mg/kg,qw产生显著的抗肿瘤活性(TV＝242mm3,TGI＝75.4％,p<0.01)，产生显著的抗肿瘤活性。当与单独的BCY8245比较时，3mg/kg的BCY8245的抗肿瘤活性被300mg/kg的BCY8234拮抗(p<0.001)。通过竞争性无毒素肽导致的疗效降低证明靶向结合对于最佳疗效的重要性。在以下监测时间表中，以BCY8245,1mg/kg,qw治疗的小鼠显示出明显的肿瘤复发，而以BCY8245,3mg/kg,qw治疗的小鼠没有显示任何肿瘤复发。
Figure BDA0002942622430001181
表37：肿瘤体积随时间变化的轨迹(第23天至第32天)
Figure BDA0002942622430001191
表38：肿瘤体积随时间变化的轨迹(第35天至第91天)
Figure BDA0002942622430001192
表39：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430001201
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
实施例9.9：测试物在治疗Balb/c裸鼠中MDA-MB-468异种移植物的体内疗效研究
1.研究目的
该研究的目的是评估BCY8245单独或BCY8245与BCY8234组合在治疗Balb/c裸鼠中的MDA-MB-468异种移植物中的体内抗肿瘤疗效。
2.实验设计
Figure BDA0002942622430001202
注意：N，每组动物数量。
3.材料
3.1动物和饲养条件
3.1.1.动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22克
动物数量：20只小鼠加备用
3.1.2.饲养条件
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独通风笼中，每个笼中5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×180mm×150mm。铺垫材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒食物。
饮水：动物可以自由饮用无菌饮用水。
笼识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、种系、接收日期、处理、研究编号、组号和处理开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
4.实验方法和过程
4.1细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的莱博维茨L-15介质中、于37℃、在空气中含有0％CO2的气氛中，维持肿瘤细胞。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。收集在指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。
4.2.肿瘤接种
每只小鼠在右腹皮下接种在0.2ml补充有50％基质胶的PBS中的MDA-MB-468肿瘤细胞(10×106)，以用于肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到464mm3时，将20只动物随机化。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数量。
4.3.测试物制剂制备
Figure BDA0002942622430001211
Figure BDA0002942622430001221
4.4.样本采集
在研究结束时，收集第3组的肿瘤用于FFPE。
5.结果
5.1.肿瘤生长曲线
在图25中显示肿瘤生长曲线。
5.2.肿瘤体积轨迹
在表40至42中显示携带有MDA-MB-468异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中的平均肿瘤体积随时间的变化。
5.3.肿瘤生长抑制分析
基于治疗开始后第28天的肿瘤体积测量，计算MDA-MB-468异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
6.结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在MDA-MB-468异种移植模型中的治疗疗效。图25以及表40至表43中显示在不同时间点测量的所有治疗组的肿瘤体积。
有意使初始肿瘤起始尺寸大于之前使用的尺寸，以测定BCY8245是否在该较大尺寸显示疗效。在第28天，经载剂处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到773mm3。BCY8245(1mg/kg,qw)(TV＝384mm3,TGI＝126.6％,p<0.001)和BCY8245(3mg/kg,qw)(TV＝50mm3,TGI＝234.6％,p<0.001)，在第28天以剂量依赖的方式产生显著的抗肿瘤活性。其中，以BCY8245(3mg/kg qw)治疗的小鼠在停止该治疗后显示一些肿瘤复发，从第76天继续给药没有起到使肿瘤完全消退的作用。
BCY8245(3mg/kg,qw)组合BCY8234(300mg/kg,qw)在第28天产生显著的抗肿瘤活性(TV＝55mm3,TGI＝234.0％,p<0.001)，以及在整个监测时间段内肿瘤并未显示任何复发。
使用10mg/kg结合素-4ADC或5mg/kg BCY8245治疗的载剂组的小鼠，以及在PG-D28使用5mg/kg BCY8245治疗的第2组(BCY8245,1mpk,qw)小鼠，在接下来的3周显示有效的肿瘤消退，之后当停掉药物后接下来的4周中，肿瘤显示重新生长。
BCY8245能够在约450mm3的肿瘤中引发肿瘤消退，但在之前接受载剂的肿瘤起始体积约770mm3的组中施用时也可以引发肿瘤消退。
Figure BDA0002942622430001231
表41：肿瘤体积随时间变化的轨迹(第30天至第75天)
Figure BDA0002942622430001241
表42：肿瘤体积随时间变化的轨迹(第79天至第103天)
Figure BDA0002942622430001242
表43：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002942622430001243
Figure BDA0002942622430001251
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
实施例10：体内PK研究
使用BCY8245(BT8009)以3mg/kg注射MDA-MB-468异种移植动物。在不同时间点，将动物安乐死，取血浆和肿瘤并速冻。分析样本用于MMAE。BT8009(BCY8245)的血浆水平来自历史PK研究。在图33中显示在血浆中的MMAE浓度、在肿瘤中的MMAE浓度、以及在血浆中的BT8009浓度。MMAE在肿瘤中的保留时间比在血浆中更长，这支持以下假说：全身暴露显著少于肿瘤暴露。
实施例11：HCS测定。
在结合素-4BDC结合研究中使用HCS测定。孵育细胞与测试试剂，然后洗涤。通过MMAE的荧光抗体检测。MDA-MB-468细胞显示中度结合素-4表达，其中20000细胞给出最佳图像。在该测定中NCI-H292细胞显示出低表达，即使在20000细胞中MMAE检测是弱的。在图34和表44中显示MDA-MB-468细胞系中的HCS数据。
表44
测试物 最大荧光强度 Kd(nM) 历史Kd(nM)
结合素-4ADC 33.63 0.2 0.28±0.07
BCY8245 13.34 3.52 5.18
MMAE 2.95 >10000 >10000
结合素-4ADC和BCY8245保留在细胞上，并用膜染色共定位。BCY8781和MMAE显示最小保留。所有化合物对MDA-MB-468细胞系的Kd与历史数据相一致。结合素-4ADC显示对MDA-MB-468细胞系可检测的结合亲和力。BCY8425显示出一位数的纳摩尔(nanomolar)亲和力，其Bmax低于结合素-4ADC。该降低的最大荧光强度是因为结合素-4ADC具有MMAE与药物比为4，然而BCY8245具有MMAE与药物比为1。BCY8781对MDA-MB-468细胞系显示仅有非常弱的结合亲和力，而MMAE对MDA-MB-468细胞系显示几乎没有可检测的结合亲和力。
实施例12：BCY8245在肺癌的两个PDX模型中的体内疗效
目的
为了评估BCY8245在鳞状细胞非小细胞癌和腺癌(均为非小细胞癌)的PDX模型中的疗效。
动物
物种：小家鼠
种系：Balb/c裸鼠
周龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22
测试试剂
BCY8245和结合素-4ADC或BCY8781
研究前的动物
每只小鼠在右腹皮下接种LU-01-0007或LU-01-0412肿瘤片段(～30mm3)以进行肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到161mm3(LU-01-0007)或147mm3(LU-01-0412)时，将动物随机化。
生活测量和终点
每天检查动物的肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响，例如活动能力、食物和水消耗(仅通过观察)、体重增加/减少、眼/毛发光泽以及操作规程中陈述的任何其他异常影响。基于每个子集中的动物数量记录死亡和观察到的临床体征。主要终点是观察肿瘤生长是否可以延缓或小鼠是否可以治愈。使用卡尺每周三次以二维测量肿瘤体积，并使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a x b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。然后将肿瘤尺寸用于T/C值的计算。T/C值(百分数)指示抗肿瘤效果；T和C分别是在给定的天数中治疗组和对照组的平均体积。
使用以下公式为各组计算TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti是在给定天数中治疗组的平均肿瘤体积，T0是治疗开始当天治疗组的平均肿瘤体积，Vi是与Ti在同一天的载剂对照组的平均肿瘤体积，以及V0是治疗开始当天的载剂组的平均肿瘤体积。
这些研究的结果如图26和图27所示。
Lu-01-0412(图26):BCY8245在该PDX模型中产生剂量相关的疗效，1mg/kg qw时肿瘤生长速率降低，但3mg/kg qw时，肿瘤明显消退至基线。在停止给药(第21天)后，5/6动物显示出没有肿瘤再生长直至研究开始后105天。显示再生长的一只动物对3mg/kg的BCY8245有反应，并显示恢复消退到基线。BCY8781，非结合BDC，在3mg/kg时产生稳定的疾病，在停止给药后，肿瘤与载剂处理组以相同速率快速生长，强调结合素-4结合可为这些试剂提供增强的疗效。响应单一剂量的BCY8245或BCY8781，大肿瘤(载剂处理组)消退。
LU-01-0007(图27):BCY8245产生剂量相关疗效，1mg/kg qw产生稳定的疾病以及3mg/kg产生完全消退。必须维持给药至第56天，直到完全消退(当停止给药时)。在该组中超过56天后没有肿瘤再生长(后者维持至研究开始后126天)。结合素-4ADC给出类似程度的疗效。1mg/kg稳定疾病组响应给药的增加(3和5mg/kg)，表明低剂量的BCY8245并不导致形成抗性。
实施例13：BCY8245在免疫受损小鼠的人乳腺癌、食道癌和膀胱癌的低代PDX模型中的体内评估。
目的
为评估双环试剂在免疫受损小鼠的人乳腺癌、食道癌、和膀胱癌的低代冠军肿瘤移植模型(Low Passage Champions TumorGraft Models)中的抗肿瘤活性。
测试系统
物种：小鼠
种系：Athymic Nude-Foxn1nu(免疫受损)
来源：Envigo：印第安纳州印第安纳波利斯
性别：雌性
在给药开始时的目标周龄：至少6-8周龄
在给药开始时的目标体重：至少18g
适应期：3天
实验设计
研究前的动物:当足够的储备动物(stock animals)达到1.0–1.5cm3时，收集肿瘤以重新植入研究前的动物中。在研究前的动物左腹单侧植入从储备动物收获的肿瘤碎片。从特定的传代批次植入每只动物并记录。
研究动物：在植入后七至十天开始记录每个实验的研究前肿瘤体积。当肿瘤达到150-300mm3的平均肿瘤体积时，将根据肿瘤体积将动物分为治疗组或对照组，以用于给药，并在第0天开始给药。
测试试剂
BCY8245和结合素-4抗体药物缀合物与载剂对照比较。可包括标准护理剂多西他赛。所有试剂通过静脉途径qw给药，剂量在图中表示。
生活测量
有效肿瘤体积:每周两次测量肿瘤体积。研究到达终点的当天将采集最终的肿瘤体积。如果可能的话，如果发现动物垂死，将采集最终的肿瘤体积。
有效动物重量:每周对动物称重两次。如果可能，在研究达到终点的当天或如果发现动物垂死，将采集最终重量。与第0天相比，显示出体重减轻≥10％的动物将获得任意进食
Figure BDA0002942622430001271
在持续7天的时间内净体重减轻>20％的任何动物，或者与第0天相比显示出净体重减轻超过30％的小鼠，都将被视为垂死并将进行安乐死。
数据分析
试剂毒性：从第0天开始，每日观察动物并且每周用数字秤测量重量两次；数据包括个体和平均克重(平均We±SEM)，对每组记录相对第0天的平均百分比重量改变(％vD0)以及在研究完成时绘制％vD0。每天记录动物死亡，并根据体重减轻和肉眼观察将其指定为与药物有关的(D)、技术有关(T)、与肿瘤有关(B)、或未知的(U)；报告平均％vD0>20％和/或>10％死亡率的单一试剂或联合组将被视为高于评估方案中该治疗的最大耐受剂量(MTD)。研究结束时报告每个治疗组的最大平均％vD0(体重最低点)。
试剂疗效
肿瘤生长抑制:在第0天开始，每周通过电子卡尺测量肿瘤尺寸两次，数据包括对每组记录的个体和平均估计的肿瘤体积(平均TV±SEM)；肿瘤体积用公式(1)计算，公式(1)：TV＝宽度2×长度×0.52。在研究完成后，将进行初始(i)和最终(f)肿瘤测量，使用公式(2)计算并报告每个治疗组(T)与对照组(C)的肿瘤生长抑制百分比(％TGI)值，公式(2)：％TGI＝1-(Tf-Ti)/(Cf-Ci)。连续两次测量的肿瘤体积≤第0天测量结果的30％的个体小鼠将被视为部分反应者(PR)。缺少明显肿瘤(连续两次测量为0.00mm3)的个体小鼠将分类为完全反应者(CR)；一直持续到研究完成的CR将视为无肿瘤幸存者(TFS)。使用公式DT＝(Df–Di)*log2/(logTVf–logTVi)确定载剂处理组的肿瘤倍增时间(DT)，其中D＝天，以及TV＝肿瘤体积。本研究中收集的所有数据均以电子方式进行管理，并存储在冗余服务器系统上。
这些研究的结果如图28至图31所示。
在四个低传代PDX模型中测试BCY8245：该模型代表膀胱癌(CTG-1771)、雌激素和孕激素阴性Her2阳性乳腺癌(CTG-1171)、三阴性乳腺癌(CTG-1106)和食道癌(CTG-0896)。在所有这些模型中，BCY8245显示出出色的疗效，引起肿瘤消退，并且在四个模型中的三个中使肿瘤完全消退至基线。在所有情况下，疗效均与ADC相当，并且优于或等于多西他赛SOC。在所有模型中，BCY8245的耐受性均优于多西他赛。
序列表
<110> 拜斯科技术开发有限公司
<120> 特异于结合素-4的双环肽配体
<130> BIC-C-P2584PCT
<150> GB 1810250.9
<151> 2018-06-22
<150> GB 1815684.4
<151> 2018-09-26
<150> GB 1818499.4
<151> 2018-11-13
<150> GB 1904632.5
<151> 2019-04-02
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> 1-Nal
<220>
<221> Xaa
<222> (4)..(4)
<223> dD
<220>
<221> Xaa
<222> (7)..(7)
<223> HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (13)..(13)
<223> HyP
<400> 1
Cys Pro Xaa Xaa Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> Xaa
<222> (18)..(18)
<223> Sar6-K(Fl)
<400> 2
Ala Cys Pro Phe Gly Cys His Thr Asp Trp Ser Trp Pro Ile Trp Cys
1 5 10 15
Ala Xaa

Claims (19)

1.一种特异于结合素-4的肽配体，其包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个半胱氨酸残基，所述分子支架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，其中所述肽配体包含氨基酸序列：
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(SEQ ID NO：1)；
其中，1Nal代表1-萘基丙氨酸，HArg代表高精氨酸，HyP代表羟基脯氨酸以及Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基，或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的肽配体，其包含选自以下的氨基酸序列：
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8234)；
Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8122)；
Ac-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8126)；
(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8116)；
荧光素-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8205)；和
[PYA][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8846)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的肽配体，其包含选自以下的氨基酸序列：
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8234)；
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8122)；
Ac-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8126)；
(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8116)；和
荧光素-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8205)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽配体，其包含选自以下的氨基酸序列：
Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8122)；
Ac-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8126)；和
(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8116)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽配体，其包含选自以下的氨基酸序列：
Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8122)；和
Ac-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8126)。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的肽配体，其包含选自以下的氨基酸序列：
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO：1)(以下称为BCY8234)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肽配体，其中所述分子支架选自1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽配体，其中药学上可接受的盐选自游离酸或钠、钾、钙、铵盐。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽配体，其中结合素-4是人结合素-4。
10.一种药物缀合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所定义的肽配体，所述肽配体缀合至一个或多个效应物和/或官能团。
11.根据权利要求10所限定的药物缀合物，其缀合至一个或多个细胞毒性剂。
12.根据权利要求11所限定的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自MMAE或DM1，特别是MMAE。
13.根据权利要求12所限定的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE，以及所述缀合物还包括选自以下的接头：-PABC-Cit-Val-戊二酰-或-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-，例如-PABC-Cit-Val-戊二酰-，其中PABC代表p-氨基苄基氨基甲酸酯。
14.根据权利要求13所限定的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是DM1，以及所述缀合物还包括接头，其是-SPDB-(SO3H)-，其中SPDB代表N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。
15.根据权利要求10至14中任一项所限定的药物缀合物，其选自：BCY8245或BCY8549，特别是BCY8245。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的肽配体或根据权利要求10至15中任一项所述的药物缀合物，与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
17.根据权利要求16所限定的药物组合物，其还包括一种或多种治疗剂。
18.根据权利要求10至15中任一项所限定的药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗由结合素-4介导的疾病或病症。
19.一种预防、抑制或治疗癌症的方法，其包括向需要其的患者施用根据权利要求10至15中任一项所限定的药物缀合物，其中所述患者鉴定为具有增加的结合素-4的拷贝数变化(CNV)。
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