BR112020025985A2 - ligantes peptídicos bicíclicos específicos para nectina-4 - Google Patents

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Abstract

''LIGANTES PEPTÍDICOS BICÍCLICOS ESPECÍFICOS PARA NECTINA-4''. A presente invenção refere-se a polipeptídeos que são covalentemente ligados a arcabouços moleculares tal dois ou mais loops de peptídeo são subtendidos entre pontos de ligação ao arcabouço. Em particular, a invenção descreve peptídeos que são aglutinantes de alta afinidade de Nectina-4. A invenção também inclui conjugados de fármacos compreendendo os referidos peptídeos, conjugados a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais, a composições farmacêuticas compreendendo os referidos ligantes peptídicos e conjugados de fármacos e ao uso dos referidos ligantes peptídicos e conjugados de fármacos na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por Nectina-4.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LIGANTES PEPTÍDICOS BICÍCLICOS ESPECÍFICOS PARA NECTINA-4".
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos que são covalentemente ligados a estruturas moleculares de modo que dois ou mais loops de peptídeo sejam subtendidos entre os pontos de ligação ao arcabouço. Em particular, a invenção descreve peptídeos que são ligantes de Nectina-4 de elevada afinidade. A invenção também inclui conjugados de fármacos compreendendo os referidos peptídeos, conjugados a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais, a composições farmacêuticas compreendendo os referidos ligantes peptídicos e conjugados de fármacos e ao uso dos referidos ligantes peptídicos e conjugados de fármacos na prevenção, supressão ou tratamento doença ou distúrbio mediado por Nectina-4.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Peptídeos cíclicos são capazes de se ligar com alta afinidade e especificidade a alvos proteicos e, portanto, são uma classe de molécula atraente para o desenvolvimento de terapêuticas. Na verdade, vários peptídeos cíclicos já são usados com sucesso na clínica, como por exemplo o peptídeo antibacteriano vancomicina,o fármaco imunossupressor ciclosporina ouo fármaco anticâncer octreotida (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). Boas propriedades de ligação resultam de uma superfície de interação relativamente grande formada entre o peptídeo e o alvo, bem como a flexibilidade — conformacional reduzida das estruturas cíclicas. Normalmente, os macrociclos se ligam a superfícies de várias centenas de angstrom quadrados, como por exemplo o peptídeo cíclico CXCR4 antagonista CVX15 (400 À?; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), a cyclic peptide com the Arg-Gly-Asp motif binding to integrin aVb3 (355
À?) (Kiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5) ou o inibidor de peptídeo cíclico upain-1 ligante ao ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (603 À?; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).
[003] Devido à sua configuração cíclica, os macrociclos peptídicos são menos flexíveis do que os peptídeos lineares, levando a uma menor perda de entropia após a ligação aos alvos e resultando em uma maior afinidade de ligação. A flexibilidade reduzida também leva ao bloqueio de conformações específicas de alvo, aumentando a especificidade de ligação em comparação com os peptídeos lineares. Este efeito foi exemplificado por um inibidor potente e seletivro da matriz metaloproteinase 8 (MMP-8), que perdeu sua seletividade sobre outras MMPs quando seu anel foi aberto (Cherney et a/. (1998), ] Med Chem 41 (11), 1749-51). As propriedades de ligação favoráveis alcançadas através da macrociclização são ainda mais pronunciadas em peptídeos multicíclicos com mais do que um anel de peptídeo como por exemplo na vancomiíicina, nisina e actinomicina.
[004] Diferentes equipes de pesquisa amarraram polipeptídeos previamente com resíduos de cisteína a um arcabouço molecular sintética (Kemp e McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), — ChemBioChem). Meloen e cooperadores usaram tris(bromometil)Denzeno e moléculas relacionadas para a ciclização rápida e quantitativa de vários loops de peptídeos em estruturas sintéticas para mimetismo estrutural de superfícies de proteínas (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Métodos para a geração de compostos de fármacos candidatos em que os referidos compostos são gerados ligante polipeptídeos contendo cisteína a um arcabouço molecular como, por exemplo, TATA (1,1',1”-(1,3,5-triazinano-1,3,5-tri- iNtriprop-2-en-1-ona, Heinis et al. Angew Chem, Int Ed. 2014; 53: 1602 1606).
[005] Abordagens combinatórias baseadas em exibição de fago foram desenvolvidas para gerar e rastrear grandes bibliotecas de peptídeos bicíclicos para alvos de interesse (Heinis et a/. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 e WO 2009/098450). Resumidamente, bibliotecas combinatórias de peptídeos lineares contendo três resíduos de cisteína e duas regiões de seis aminoácidos aleatórios (Cys-(Xaa) 6- Cys-(Xaa) 6-Cys) foram exibidas no fago e ciclizadas por ligação covalente das cadeias laterais de cisteína a uma pequena estrutura de molécula.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um ligante peptídico específico para Nectina-4 compreendendo um polipeptídeo compreendendo pelo menos três resíduos de cisteína, separados por pelo menos duas sequências de loop, e um arcabouço molecular que forma ligações covalentes com os resíduos de cisteína do polipeptídeo de modo que pelo menos dois loops polipeptídicos sejam formados no arcabouço molecular.
[007] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um conjugado de fármaco que compreende um ligante peptídico, conforme definido neste documento, conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
[008] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um ligante peptídico ou um conjugado de fármaco como aqui definido em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[009] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um ligante peptídico ou conjugado de fármaco como aqui definido para uso na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por Nectina-4.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[010] Onde presentes nas figuras, as barras de erro representam o erro padrão da média (SEM).
[011] Figuras 1 a 7: Traços do volume tumoral após administração de BCY7683, BCY7825, BCY7826, BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus BALB/c fêmeas com xenoenxerto NCI-H292.
[012] Figuras 8 a 10: Traços do volume tumoral após administração de BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto NCI-H292.
[013] Figuras 11 a 15: Traços do volume tumoral após administração de BCY7825, BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255, respectivamente, a camundongos CB17-SCID fêmeas com xenoenxerto HT-1376.
[014] Figuras 16 a 18: Traços do volume tumoral após administração de BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos CB17-SCID fêmeas portando xenoenxerto HT-1376.
[015] Figuras 19 a 21: Traços do volume tumoral após administração de BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto Panc2.13.
[016] Figuras 22 a 24: Traços do volume tumoral após administração de BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto MDA-MB-468.
[017] Figuras 25 a 28: Traços de volume tumoral após administração de BCY8549, BCY8550, BCY8783 e BCY8784, respectivamente (com BCY8245 como controle), a camundongos nus BALB/c fêmeas portando xenoenxerto NCI-H292.
[018] Figura 29: Estratégia de passagem para Nectina-4 na mama (T-47D e MDA-MB-468).
[019] Figura 30: Estratégia de passagem para Nectina-4 em NCI- H292 e NCI-H322.
[020] Figuras 31 e 32: Estratégia de passagem para Nectina-4 em
NCI-H526 e HT1080, respectivamente.
[021] Figuras 33-37: Estratégia de passage para Nectina-4 em Câncer de bexiga (HT1376; Figura 33), Câncer de mama (MDA-MB- 468; Figura 34), câncer colorretal (HT-29; Figura 35A e HCT-116; Figura 35B), Câncer de pulmão (A549; Figura 36A, NCI-H292; Figura 36B, NCI-H358; Figura 36C e NCI-526; Figura 36D) e Câncer de pâncreas (Panc02.13; Figura 37), respectivamente.
[022] Figuras 38-41: Traços do volume tumoral após administração de BCY8242, BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto AS49.
[023] Figuras 42-45: Traços do volume tumoral após administração de BCY8242, BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto de HCT116.
[024] Figuras 46-49: Traços do volume tumoral após administração de BCY8242, BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos CB17-SCID fêmeas portando xenoenxerto HT-1376.
[025] Figuras 50-53: Traços do volume tumoral após administração de BCY8242, BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto MDA-MB-468.
[026] Figuras 54-57: Traços do volume tumoral após administração de BCY8242, BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto NCI-H292.
[027] Figuras 58-59: Traços do volume tumoral após administração de BCY8245 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto NCI-H526.
[028] Figuras 60-63: Traços do volume tumoral após administração de BCY8242, BCY8245, BCY8253 e BCY8255, respectivamente, a camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto Panc2.13.
[029] Figura 64: Traços do volume tumoral após administração de BCY8245, BCY8781 ou BCY8245 em combinação com BCY8234 a camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto MDA-MB-468.
[030] Figura 65: Traços do volume tumoral após administração de BCY8245 sozinho ou BCY8245 em combinação com BCY8234 a camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto MDA-MB-468.
[031] Figuras 66-71: Traços de volume tumoral em xenoenxertos Lu-01-0412, LU-01-0007, CTG-1771, CTG-1171, CTG-1106 e CTG- 0896 PDX.
[032] Figura 72: Eficácia de BT8009 (isto é, BCY8245) se correlaciona com a expressão de xenoenxertos CDX/PDX. Os xenoenxertos com pouca/nenhuma expressão de Nectina-4 mostram uma taxa de crescimento tumoral reduzida. Os xenoenxertos que expressam Nectina-4 mostram regressões do tumor. Os modelos PDX e CDX estão incluídos nesta análise, os valores são agrupados a partir de vários relatórios.
[033] Figura 73: Células MDA-MB-468 expressam Nectina-4 e mostram retenção prolongada de MMAE no tumor.
[034] Figura 74: HCS - Análise de dados na linhagem celular MDA-MB-468.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[035] Em uma modalidade, as referidas sequências de loop compreendem 3, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos. Em uma outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem 3, 6, 7 ou 9 aminoácidos. Em ainda outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem 3 ou 9 aminoácidos.
[036] Em uma outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, uma das quais consiste em 3 aminoácidos e a outra consiste em 9 aminoácidos.
[037] Em uma outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, uma das quais consiste em 3 aminoácidos e a outra consiste em 8 aminoácidos.
[038] Em uma outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, uma das quais consiste em 7 aminoácidos e a outra consiste em 3 aminoácidos.
[039] Em uma outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos.
[040] Em uma modalidade, o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-P/A/Hyp-F/Y-G/A-Ci--X1-X2-X3-W/1-Nal/2-Nal-S/A-X4-P-1/D/A-W/1- Nal/2-Nal-Ci:(SEQ ID NO: 38); Ci-W/A-P-L-D/S-S/D-Y-W-Cii-X5-R-I-Cii (SEQ ID NO: 39); Ci-V-T-T-S-Y-D-Ci-F/W-L/V-H/R/T-L-L/G-G/Q/H-Ci; (SEQ ID NO: 40); Ci-Xe-X7-Xg-Cii-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) é Ci-W/A/Y-P/A-L-D/S/A-S/D/P/A-Y-W/1-Nal-Ci-X5-R/HArg/A-|-Cii; — (SEQ ID NO: 42); em que:
[041] X1-Xs representam qualquer resíduo de aminoácido, incluindo aminoácidos modificados e não naturais;
[042] Xe representa: Gly; Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de azetidina (Aze), hidroxiprolina (HyP), 4-amino- prolina (Pro(4NH)), ácido oxazolidina-4-carboxílico (Oxa), ácido octa-
hidroindolocarboxílico (Oic) ou 4,4-difluoroprolina (4,4-DFP); Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de ácido aminoisobutírico (Aib); ou Sarcosina (Sar);
[043] X7 representa: Phe ou um derivado não natural de Phe selecionado a partir de 3-metil-fenilalanina (3MePhe), 4-metil- fenilalanina (4MePhe), homofenilalanina (HPhe), 4,4-bifenilalanina (4,4- BPA) ou 3,4-di-hidroxifenilalanina (DOPA); Tyr; ou Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 1-naftilalanina (1-Nal), 2- naftilalanina (2-Nal) ou 2-piridilalanina (2Pal);
[044] Xzg representa: Gly; Ala; Asp; Lys ou um derivado não natural de Lys selecionado a partir de acetil-lisina (KAc ou Lys (Ac)); Phe; Glu; Gln; Leu; Ser; Arg; ou ácido cisteico (Cya);
[045] Xo está ausente ou representa: Met ou um derivado não natural de Met selecionado a partir de metionina sulfona (Met(O02)); GIn ou um derivado não natural de Glh selecionado a partir de homoglutamina (HGlh); Leu ou um derivado não natural de Leu selecionado a partir de homoleucina (HLeu) ou norleucina (Nle); Lys; Ile; t-butil-alanina (tBuAla); ou homoserina-metila (HSe(Me));
[046] X1o representa: Pro; Lys ou um derivado não natural de Lys selecionado a partir de acetil-lisina (KAc ou Lys (Ac)); Arg ou um derivado não natural de Arg selecionado a partir de ácido 2-amino-4- guanidinobutírico (Agb), homoarginina (HArg) ou N-metil-homoarginina; Glu; Ser; Asp; Gln; Ala; hidroxiprolina (HyP); ou ácido cisteico (Cya);
[047] X1n representa: Asn ou um derivado não natural de Asn selecionado a partir de N-metil-asparagina; Thr; Asp; Gly; Ser; Seu; Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de tienil-alanina (Thi), 2-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina/ (1,2,4-TriAz) ou Beta-(4-tiazolil)- alanina (4ThiAz); Lys; ou ácido cisteico (Cya);
[048] X12 representa: Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp), 5-fluoro-L-triptofano
(SFTrp) ou metil-triptofano (TrpMe); ou Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 1-naftil alanina (1-Nal) ou 2-naftil alanina (2-Nal);
[049] Xi3 representa: Ser ou um derivado não natural de Ser selecionado a partir de homoserina (HSer); Ala; Asp; ou Thr;
[050] X1a representa: Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp); Ser; Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 2-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina (1,2,4-TriAz), 1-naftil alanina (1-Nal) ou 2-naftil alanina (2-Nal); Asp; Phe ou um derivado não natural de Phe selecionado a partir de 3,4-di- hidróxi-fenilalanina (DOPA); Tyr; Thr ou um derivado não natural de Thr selecionado a partir de N-metil-treonina; ácido tetra-hidropiran-4- propanoico (THP(O)); ou ácido dioxo-4-tetra-hidrotiopiranilacético (THP(SO2));
[051] X15 representa Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de azetidina (Aze), ácido pipecólico (Pip) ou ácido oxazolidina-4-carboxílico (Oxa);
[052] X16 representa: lle ou um derivado não natural de lle selecionado a partir de N-metil-isoleucina (NMelle); Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 3-ciclo-hexil-alanina (Cha) ou ciclopropil-alanina (Cpa); Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de hidroxiprolina (HyP); Asp; Lys; ciclopentil-glicina (C5A); ácido tetra-hidropiran-4-propanoico (THP(O)); ou ácido dioxo-4- tetra-hidrotiopiranilacético (THP(SO2));
[053] X17 representa: Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp) ou 5-fluoro-L-triptofano (SFTrp); Phe; Tyr; 1-naftil alanina (1-Nal); ou 2-naftil alanina (2-Nal);
[054] Hyp representa hidroxiprolina, 1-Nal representa 1-naftil alanina, 2-Nal representa 2-naftl alaninayqa HArg representa homoarginina e C;, Ci e Ci; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[055] Em uma modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-Xe-X7-Xg-Cii-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41); em que Xs a X17 são conforme definidos aqui.
[056] Em uma modalidade, Xs representa: Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de azetidina (Aze), hidroxiprolina (HyP), 4-amino-prolina (Pro(4NH)), ácido oxazolidina-4-carboxílico (Oxa), ácido octa-hidroindolecarboxílico (Oic) ou 4,4-difluoroprolina (4,4-DFP). Em uma outra modalidade, X:« representa Pro.
[057] Em uma modalidade, X; representa: Phe ou um derivado não natural de Phe selecionado a partir de 3-metil-fenilalanina (3$MePhe), 4- metil-fenilalanina (AMePhe), homofenilalanina (HPhe), 4,4-bifenilalanina (4,4-BPA) ou 3,4-di-hidróxi-fenilalanina (DOPA); Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 1-naftilalanina (1-Nal), 2- naftilalanina (2-Nal) ou 2-piridilalanina (2Pal. Em uma outra modalidade, X; representa Phe ou 1-naftilalanina (1-Nal). Em ainda outra modalidade, X; representa 1-naftilalanina (1-Nal).
[058] Em uma modalidade, Xsg representa Asp, Arg, Lys ou ácido cisteico (Cya). Em uma outra modalidade, Xg representa D-Asp, D-Arg, D-Lys ou D-Cya. Em ainda outra modalidade, Xg representa D-Asp.
[059] Em uma modalidade, Xº representa: Met ou um derivado não natural de Met selecionado a partir de metionina sulfona (Met(O2)); ou Leu ou um derivado não natural de Leu selecionado a partir de homoleucina (HLeu) ou norleucina (Nle). Em uma outra modalidade, Xo representa Met ou Leu. Em ainda outra modalidade, X, representa Met.
[060] Em uma modalidade, X1o representa Arg ou um derivado não natural de Arg selecionado a partir de ácido 2-amino-4-guanidinobutírico (Agb), homoarginina (HArg) ou N-metil-homoarginina; ou ácido cisteico (Cya). Em uma outra modalidade, X1o representa homoarginina (HArg) ou ácido cisteico (Cya) (tal como D-Cya). Em ainda outra modalidade, X1o representa homoarginina (HArg). Em uma modalidade alternativa, X1o representa lisina.
[061] Em uma modalidade, X:; representa: Asn ou um derivado não natural de Asn selecionado a partir de N-metil-asparagina; Asp; ou His; ou ácido cisteico (Cya). Em uma outra modalidade, X1, representa Asn, Asp, His ou ácido cisteico (Cya) (tal como D-Cya). Em uma outra modalidade, X1; representa Asp.
[062] Em uma modalidade, X:2 representa: Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp), 5- fluoro-L-triptofano (SFTrp) ou metil-triptofano (TrpMe). Em uma outra modalidade, X12 representa Trp.
[063] Em uma modalidade, X13 representa Ser ou um derivado não natural de Ser selecionado a partir de homoserina (HSer). Em uma outra modalidade, X:3 representa Ser.
[064] Em uma modalidade, X14 representa Thr ou um derivado não natural de Thr selecionado a partir de N-metil-treonina. Em outra modalidade, X14 representa Thr.
[065] Em uma modalidade, X:5 representa Pro.
[066] Em uma modalidade, X16 representa: Ile ou um derivado não natural de Ile selecionado a partir de N-metil-isoleucina (NMelle); ou Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de hidroxiprolina (HyP). Em uma outra modalidade, X:s representa: Ile; ou Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de hidroxiprolina (HyP). Em ainda outra modalidade, X:s representa lle, Pro ou hidroxiprolina (HyP). Em ainda outra modalidade, X1s representa hidroxiprolina (HyP).
[067] Em uma modalidade, X1:; representa Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp) ou 5-fluoro- L-triptofano (SFTrp). Em uma outra modalidade, X17 representa Trp.
[068] Em uma outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-P-X7-Xg-Ci-X9-HArg/Lys-X11-W-S-T-P-X16-W-Cii (SEQ ID NO: 213); em que X7, Xs, X9, X11 e X16 são conforme definidos aqui.
[069] Em uma outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-P-X7-Xg-Cir-X9-HArg-X11-W-S-T-P-X16-W-Cii (SEQ ID NO: 204); em que X7, Xs, X9, X11 e X16 são conforme definidos aqui.
[070] Em ainda outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: C;-P-F/1-Nal-dD/dR-C;;-M/L-HArg/Lys-N/H/D-W-S-T-P-I/P/HyP-W-Cii (SEQ ID NO: 214).
[071] Em ainda outra modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-P-F/1-Nal-dD/dR-Ci;-M/L-HArg-N/H/D-W-S-T-P-I/P/HyP-W-Cii (SEQ
ID NO: 205).
[072] Em uma modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda consiste em 8 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-Xe-X7-Xg-Cii-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 206) em que X; a Xg e Xw1 a Xi7 são como definidos neste documento.
[073] Em uma modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda de que consiste em 8 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-P-1-Nal-D/Cya-Ci-M-HArg/Cya-D/Cya-W-S-T-P-HyP-W-Cii (SEQ ID NO: 207).
[074] Em uma modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-P/A/Hyp-F/Y-G/A-Ci--X1-X2-X3-W/1-Nal/2-Nal-S/A-X4-P-1/D/A-W/1- Nal/2-Nal-Ci; (SEQ ID NO: 38) em que X1-Xa representa qualquer resíduo de aminoácido, incluindo aminoácidos modificados e não naturais, Hyp representa hidroxiprolina, 1-Nal representa 1-naftil alanina, 2-Nal representa 2-naftil alanina, e C;, C; e Ci; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[075] Em uma modalidade, X: é selecionado a partir de M, Npg,
HLeu, |, Q e Nle; em que Npg é neopentil glicina, HLeu é homoleucina e Nle é norleucina.
[076] Em uma modalidade, X> é selecionado a partir de KR, S, D, HArg, K(Ac) e A; em que HArg é homoarginina, K(Ac) é N-acetilisina e A está presente como a isoforma L- ou D- da alanina.
[077] Em uma modalidade, X3 é selecionado a partir de N, D, He A; em que A está presente como a isoforma L- ou D- de alanina.
[078] Em uma modalidade, X, é selecionado a partir de W, D, Te A.
[079] Em uma modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 7 aminoácidos e a segunda consiste em 3 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-W/A/Y-P/A-L-D/S/A-S/D/P/A-Y-W/1-Nal-Ci-X5-R/HArg/A-|-Cii; — (SEQ ID NO: 42) em que X5 representa qualquer resíduo de aminoácido, 1- Nal representa 1-naftil alanina, HArg representa homoarginina e C;, Ci e Ci; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[080] Em uma modalidade, Xs é selecionado a partir de A, dA, G, dD, N,EeP.
[081] Em uma modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, a primeira das quais consiste em 7 aminoácidos e a segunda consiste em 3 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-W/A-P-L-D/S-S/D-Y-W-Cii-X5-R-I-Cii (SEQ ID NO: 39) em que Xs representa qualquer resíduo de aminoácido, e C;, Ci e Ci; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína,
respectivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[082] Em uma modalidade, X; é selecionado a partir de A, G, De N.
[083] Em uma modalidade, as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, ambas consistindo em 6 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-V-T-T-S-Y-D-Ci-F/W-L/V-H/R/T-L-L/G-G/Q/H-Ci; (SEQ ID NO: 40); em que C;, Ci e C;; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[084] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de C;- P/A/Hyp-F/Y-G/A-Ci-X1-X2-X3-W/1-Nal/2-Nal-S/A-X4-P-1/D/A-W/1- Nal/2-Nal-Ci; (SEQ ID NO: 38) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualque uma de SEQ ID NOS: 1-30: CiPFGC;MKNWSWPIWC;i (SEQ ID NO: 1); CiPFGC;MRNWSWPIWC;; (SEQ ID NO: 2); CiPFGC;(Npg)JKNWSWPIWC;i (SEQ ID NO: 3); CiPFGCi(HLeu)KNWSWPIWC;i (SEQ ID NO: 4); CPFGCiIKNWSWPIWCii (SEQ ID NO: 5); CiPFACiMKNWSWPIWC;; (SEQ ID NO: 6); CiPFGC;QKNWSWPIWC;i (SEQ ID NO: 7); CiPFGC;MKNWSDPIWC;i (SEQ ID NO: 8); CiPFGC;MKNWSWPI(1-Nal)Ci; (SEQ ID NO: 9); Ci(Hyp)FGC;iMKNWSWPIWC;; (SEQ ID NO: 10); CiPYGCi;iMKNWSWPIWC;; (SEQ ID NO: 11); CiPFGC;MSNWSWPIWC;i (SEQ ID NO: 12); CiPFGC;MDNWSWPIWC;; (SEQ ID NO: 13); CiPFGC;M(HArg)NWSWPIWC;i (SEQ ID NO: 14);
CPFGCiMKDWSWPIWCii (SEQ ID NO: 15); CPFGCiMKHWSWPIWCii (SEQ ID NO: 16); CiPFGC;MKN(1-Nal)SWPIWC;; (SEQ ID NO: 17); CiPFGC;MKN(2-Nal)SWPIWC;; (SEQ ID NO: 18); CPFGCiMKNWSTPIWC:i (SEQ ID NO: 19); CPFGCiMKNWSWPDWC:i (SEQ ID NO: 20); CiPFGC;MKNWSWPI(2-Nal)Ci; (SEQ ID NO: 21); CiPFGC;M(HArg)NWSWPIWC;i (SEQ ID NO: 22); CiPFGC;M(K(Ac))NWSWPIWC;; (SEQ ID NO: 23); CiPFGC;MKNWSAPIWC;i (SEQ ID NO: 24); CPFGCiMKNWSWPAWC:i (SEQ ID NO: 25); CIAFGCiMKNWSWPIWCii (SEQ ID NO: 26); CPFGCiMANWSWPIWCii (SEQ ID NO: 27); CiPFGC;MKAWSWPIWC;i (SEQ ID NO: 28); CPFGCi(Nle)KNWSWPIWCii (SEQ ID NO: 29); e CPFGCiMKNWAWPIWCii (SEQ ID NO: 30); em que C;, Ci e C;; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[085] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Cr P/A/Hyp-F/Y-G/A-Cii-X1-X2-X3-W/1-Nal/2-Nal-S/A-Xa-P-1/D/A-W/1- Nal/2-Nal-Ci; (SEQ ID NO: 38) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09- 02-N002 ou BCY428); FI-A-(SQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80- 09-02-N006); Ac-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como 80-09- 02-N008 ou BCY7390); Ac-[dD]-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como
BCY7606);
A-(SEQ ID NO: 2)-A (neste documento referido como 80-09- 02-N003 ou BCY429);
(1-Nal)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N009 ou BCY7420);
(2-Nal)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N010 ou BCY7421);
(33DPA)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N011 ou BCY7422);
(44BPA)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N012 ou BCY7521);
Ac-(SEQ ID NO: 3) (neste documento referido como 80-09- 02-N017);
Ac-(SEQ ID NO: 4) (neste documento referido como 80-09- 02-N018);
Ac-(SQ ID NO: 5) (neste documento referido como 80-09-02- NO19 ou BCY7537);
Ac-(SEQ ID NO: 6) (neste documento referido como 80-09- 02-N020);
Ac-(SEQ ID NO: 7) (neste documento referido como 80-09- 02-N021 ou BCY7539);
Ac-(SEQ ID NO: 8) (neste documento referido como 80-09- 02-N022 ou BCY7540);
Ac-(SEQ ID NO: 9) (neste documento referido como 80-09- 02-N023);
Ac-(pCoF)-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como 80-09-02-N044);
Ac-(SEQ ID NO: 10) (neste documento referido como 80-09- 02-N045);
Ac-(SEQ ID NO: 11) (neste documento referido como 80-09-
02-N046 ou BCY7657);
Ac-(SEQ ID NO: 12) (neste documento referido como 80-09- 02-N047 ou BCY7658);
Ac-(SEQ ID NO: 13) (neste documento referido como 80-09- 02-N048 ou BCY7659);
Ac-(SEQ ID NO: 14) (neste documento referido como 80-09- 02-N049);
Ac-(SEQ ID NO: 15) (neste documento referido como 80-09- 02-N050 ou BCY7661);
SDN-(SEQ ID NO: 15)-A (neste documento referido como BCY3387);
Ac-(SEQ ID NO: 16) (neste documento referido como 80-09- 02-N051 ou BCY7662);
Ac-(SEQ ID NO: 17) (neste documento referido como 80-09- 02-N052);
Ac-(SEQ ID NO: 18) (neste documento referido como 80-09- 02-N053);
Ac-(SEQ ID NO: 19) (neste documento referido como 80-09- 02-N054 ou BCY7665);
Ac-(SEQ ID NO: 20) (neste documento referido como 80-09- 02-N055 ou BCY7666);
Ac-(SEQ ID NO: 21) (neste documento referido como 80-09- 02-N056);
A-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N0O01 ou BCY3385);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN(HArg) (neste documento referido como 80-09-02-T01-N003 ou BCY7281);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN(D-K) (neste documento referido como 80-09-02-T01-N004 ou BCY7282);
A-(SEQ ID NO: 22)-TNK (neste documento referido como 80-
09-02-T01-N005);
A-(SEQ ID NO: 23)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N006);
Ac-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N011 ou BCY7391);
A-(SEQ ID NO: 24)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N012 ou BCY7342);
A-(SEQ ID NO: 25)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N014 ou BCY7344);
A-(SEQ ID NO: 1)-ANK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N016 ou BCY7346);
A-(SEQ ID NO: 1)-[dA]NK (neste documento referido como BCY7367);
A-(SEQ ID NO: 1)-TAK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N017 ou BCY7347);
A-(SEQ ID NO: 1)-T[dA]JK (neste documento referido como BCY7368);
A-(SEQ ID NO: 1)-TNA (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N018 ou BCY7348);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN[dA] (neste documento referido como BCY7369);
Ac-[pCoPhe]-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como BCY7656);
A-(SEQ ID NO: 6)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N020 ou BCY7354);
A-(SEQ ID NO: 26)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N022 ou BCY7352);
A-(SEQ ID NO: 27)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N026 ou BCY7356);
A-(SEQ ID NO: 28)-TNK (neste documento referido como 80-
09-02-TO01-N027 ou BCY7357); A-(SEQ ID NO: 29)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N041 ou BCY7372); e A-(SEQ ID NO: 30)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N042 ou BCY7424).
[086] Ainda, em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-P/A/Hyp-F/Y-G/A-Cii-X1-X2-X3-W/1-Nal/2-Nal-S/A-X4-P-I/D/A-W/1- Nal/2-Nal-Ci; (SEQ ID NO: 38) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: A-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N0O01 ou BCY3385); Ac-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como 80-09- 02-N008 ou BCY7390); e Ac-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N011 ou BCY7391).
[087] Dados estão presentes neste documento na Tabela 3 os quais demonstram que os ligantes peptídicos desta modalidade exibiram bons níveis ( < 100 nM) de ligação a Nectina-4 humana como evidenciado pelos dados de ligação SPR.
[088] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de C;-W/A- P-L-D/S-S/D-Y-W-Ci-X5s-R-|-Ci; (SEQ ID NO: 39) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualque uma de SEQ ID NOS: 31-34: CMWPLDSYWCiARIC;i (SEQ ID NO: 31); CiAPLDDYWCiGRIC;i (SEQ ID NO: 32); CIAPLDDYWCiDRIC;ii (SEQ ID NO: 33); e CIAPLSDYWCIiNRIC:i (SEQ ID NO: 34); em que C;, Ci e C;; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[089] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de C;-W/A- P-L-D/S-S/D-Y-W-Ci-X5s-R-|-Ci; (SEQ ID NO: 39) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de:
A-(SEQ ID NO: 31)-A (neste documento referido como 80- 10-00 ou BCY488);
A-(SEQ ID NO: 32)-A (neste documento referido como BCY432);
DDW-(SEQ ID NO: 32)-A (neste documento referido como 80-10-11-T01 ou BCY433);
VDW-(SEQ ID NO: 33)-A (neste documento referido como 80-10-12-T01 ou BCY462);
QKW-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como 80-10-13-T01 ou BCY3400);
Q[HArg]W-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7278);
QIK(Ac)]JW-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7280);
[AC]JQKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7392);
Q[dK]W-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7426);
Ac-AKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7622);
Ac-QAW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCYT7623);
Ac-QKA-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7624);
Ac-[dAJKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7634);
Ac-Q[dAJW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7635); Ac-QK[dA]-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7636); Ac-Q[dD]W-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7993); Ac-QK[1Nal]l-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7996); Ac-QK[2Nal]-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7997); e Ac-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY8044).
[090] Ainda, em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-W/A-P-L-D/S-S/D-Y-W-Cii-X5-R-1|-Ci; (SEQ ID NO: 39) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: [AC] QKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7392).
[091] Dados estão presentes neste documento na Tabela 3 os quais demonstram que o ligante peptídico desta modalidade exibiram bons níveis ( < 100 nM) de ligação a Nectina-4 humana como evidenciado pelos dados de ligação SPR.
[092] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Cr W/A/Y-P/A-L-D/S/A-S/D/P/A-Y-W/1-Nal-Ci-X5-R/HArg/A-I-C;i; (SEQ ID NO: 42) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: CWPLDPYWCGRIC (SEQ ID NO: 43); CYPLSPYWCERIC (SEQ ID NO: 44); CWPLDDYWCPRIC (SEQ ID NO: 58); CAPLSDYWCN[HArg]lC (SEQ ID NO: 65); CAALSDYWCNRIC (SEQ ID NO: 103); CAPLADYWCNRIC (SEQ ID NO: 104);
CAPLSAYWECNRIC (SEQ ID NO: 105); CAPLSDYWCARIC (SEQ ID NO: 106); CAPLSDYWCNAIC (SEQ ID NO: 107); CAPLIdAJDYWCNRIC (SEQ ID NO: 108); CAPLS[dA]YWCNRIC (SEQ ID NO: 109); CAPLSDYWOCI[dAJRIC (SEQ ID NO: 110); CAPLSDYT[INalJCNRIC (SEQ ID NO: 153); e CAPLSDYWCI[dD]JRIC (SEQ ID NO: 154).
[093] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Cr W/A/Y-P/A-L-D/S/A-S/D/P/A-Y-W/1-Nal-Ci--X5-R/HArg/A-1|-Cii (SEQ ID NO: 42) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: A-(SEQ ID NO: 43)-A (doravante referido como BCY430); A-(SEQ ID NO: 44)-A (doravante referido como BCY431); A(SEQ ID NO: 58)-PQA (doravante referido como BCY3401); QKW-SEQ ID NO: 65)-A (doravante referido como BCY7279); Ac-QKW-(SEQ ID NO: 103) (doravante referido como BCY7625); Ac-QKW-(SEQ ID NO: 104) (doravante referido como BCYT7627); Ac-QKW-(SEQ ID NO: 105) (doravante referido como BCY7628); Ac-QKW-(SEQ ID NO: 106) (doravante referido como BCY7631); Ac-QKW-(SEQ ID NO: 107) (doravante referido como BCY7632); Ac-QKW-(SEQ ID NO: 108) (doravante referido como BCY7639);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 109) (doravante referido como BCY7640); Ac-QKW-(SEQ ID NO: 110) (doravante referido como BCY7643); Ac-QKW-(SEQ ID NO: 153) (doravante referido como BCY7998); e Ac-QKW-(SEQ ID NO: 154) (doravante referido como BCY8000).
[094] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de C;-V-T- T-S-Y-D-C;i-F/W-L/V-H/R/T-L-L/G-G/Q/H-Ci; '(SEQ ID NO: 40) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualque uma de SEQ ID NOS: 35-37: CVTTSYDCiFLHLLGC;: (SEQ ID NO: 35); CIVTTSYDCiWVRLGQC:i (SEQ ID NO: 36); e CIVTTSYDC;WVTLGHC;; (SEQ ID NO: 37); em que C,;, Ci; e C;; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[095] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de C;-V-T- T-S-Y-D-C;i-F/W-L/V-H/R/T-L-L/G-G/Q/H-Ci; '(SEQ ID NO: 40) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: A-(SEQ ID NO: 35)-A (neste documento referido como 80- 11-00 ou BOY471); A-(SEQ ID NO: 36)-A (neste documento referido como 80- 11-01 ou BOY472); e A-(SEQ ID NO: 37)-SRF (neste documento referido como 80- 11-08-T01 ou BCY3406).
[096] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de C;-V-T- T-S-Y-D-C;i-F/W-L/V-H/R/T-L-L/G-G/Q/H-Ci; '(SEQ ID NO: 40) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de:
Ac-(SEQ ID NO: 37)-SRF (neste documento referido como BCY7393).
[097] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-Xe- X7-Xg-Ci-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: CPFGCMETWSWPIWC (SEQ ID NO: 45); CPFGCMRGWSWPIWCOC (SEQ ID NO: 46); CPFGCMSGWSWPIWC (SEQ ID NO: 47); CPFGCMEGWSWPIWOC (SEQ ID NO: 48); CPFGCMEDWSWPIWC (SEQ ID NO: 49); CPFGCMPGWSWPIWC (SEQ ID NO: 50); CPFGCMKSWSWPIWC (SEQ ID NO: 51); CPFGCMKTWSWPIWC (SEQ ID NO: 52); CPFGCMKGWSWPIWC (SEQ ID NO: 53); CPFGCQEHWSWPIWC (SEQ ID NO: 54); CPFGCIKSWSWPIWC (SEQ ID NO: 55); CPFGCQEDWSWPIWC (SEQ ID NO: 56); CPFGCMSDWSWPIWC (SEQ ID NO: 57); CPFGCM[HArg]|NWSWPIWC (SEQ ID NO: 59); CPFGCM[K(Ac)]]NWSWPIWC (SEQ ID NO: 60); CPFGCMIK(Ac)]|SWSWPIWC (SEQ ID NO: 61); CPFGCINIeJkKSWSWPIWC (SEQ ID NO: 62); CPFGCM[HArg]|SWSWPIWC (SEQ ID NO: 63); CPFGCM[AKISWSWPIWC (SEQ ID NO: 64); CP[gAJGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 66); CPF[dgAJCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 67); CPFGCM[dAAJNWSWPIWC (SEQ ID NO: 68); CPFGCMK[dAJWSWPIWC (SEQ ID NO: 69); CPFGCMKN[dAJSWPIWC (SEQ ID NO: 70); CPFGCMKNWSWPI[dAJWC (SEQ ID NO: 71);
CIdAJFGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 72); CPFGCItBuAlalkKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 73); CPFGC[HLeu]KNWSWPIWC (SEQ ID NO: 74); CPFGCMKNWSWPI[1Nal]C (SEQ ID NO: 75); CPF[dDJCM[HArglNWSWPIWC (SEQ ID NO: 76); CPFIdAJCMIHArg]lNWSWPIWOC (SEQ ID NO: 77); CP[3MePhe]GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 78); CP[4MePhe] GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 79); CP[HPhe]GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 80); CPF[dDJCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 81); CPFGC[Hse(Me)]JKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 82); CPFGCMKN[AzaTrp]SWPIWC (SEQ ID NO: 83); CPFGCMKNWSFPIWC (SEQ ID NO: 84); CPFGCMKNWSYPIWC (SEQ ID NO: 85); CPFGCMKNWS[1Nal]PIWC (SEQ ID NO: 86); CPFGCMKNWS[2Nal]PIWC (SEQ ID NO: 87); CPFGCMKNWS[AzaTrp]PIWC (SEQ ID NO: 88); CPFGCMKNWSWIAZe]IWC (SEQ ID NO: 89); CPFGCMKNWSWIPip]IWC (SEQ ID NO: 90); CPFGCMKNWSWPIFC (SEQ ID NO: 91); CPFGCMKNWSWPIYC (SEQ ID NO: 92); CPFGCMKNWSWPI[AzaTrp]C (SEQ ID NO: 93); CGFGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 94); CIAze]JFGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 95); CPFIK(Ac]]|CMKNWSWPIWOC (SEQ ID NO: 96); CPFGCLKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 97); CPFGC[MetO2JKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 98); CPFGCMPNWSWPIWOC (SEQ ID NO: 99); CPFGCMQNWSWPIWC (SEQ ID NO: 100); CPFGCMKNWSWPPWOC (SEQ ID NO: 101);
CP[2Pal|GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 102); CPFGCMKN[1Nal|SWPIWC (SEQ ID NO: 111); CPFGCMKN[2Nal|SWPIWC (SEQ ID NO: 112); CPFGCMKNWSWPI[2Nal]C (SEQ ID NO: 113); CIHyPJFEGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 114); CPF[dD]JCM[HArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 115); CPF[dD]JCM[HArg][dK|WSTPIWOC (SEQ ID NO: 116); CPFIdDJCM[HArglNWSTPKWOC (SEQ ID NO: 117); CIPro(4NH)IFIdDJCMIHArg lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 118); CPF[IdDJCMKNWSTPIWC (SEQ ID NO: 119); CPFIdKJCMIHArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 120); CPF[dD]JCK[HArg]lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 121); CPFIdD]JCM[HArg]KWSTPIWC (SEQ ID NO: 122); CIOxalFIdDJCM[HArg]INWSTPIWC (SEQ ID NO: 123); CPF[dD]JCM[HArg][ThilWSTPIWC (SEQ ID NO: 124); CPF[dD]JCM[HArg][4ThiAZ]WSTPIWOC (SEQ ID NO: 125); CPF[dD]JCM[HArg][1 24TriAZ|WSTPIWOC (SEQ ID NO: 126); CPF[dD]JCM[HArg]NWS[124TriAzZ]PIWC (SEQ ID NO: 127); CPFIdD]JCM[HArg]|NWST[Oxa]lWC (SEQ ID NO: 128); CPI[DOPA][dD]CM[HArg]lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 129); CPFIdD]JCM[HArg]lNWS[DOPA]PIWC (SEQ ID NO: 130); CPFIdD]JCM[HArg]NWS[THP(SO2)]PIWC (SEQ ID NO: 131); CPFIdDJICM[HArglNWSTP[THP(SO2)]WC (SEQ ID NO: 132); CPF[dD]JCM[HArg]N[5FTrp]|STPIWC (SEQ ID NO: 133); CPF[dD]JCM[HArg]|NWSTPI[5FTrp]C (SEQ ID NO: 134); CPF[dD]JCM[HArg]lNWS[THP(O)]JPIWC (SEQ ID NO: 135); CPFIdDJCM[HArglNWSTP[THP(O)]WC (SEQ ID NO: 136); CI44DFP]FIdDJCMIHArg lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 137); CIOic]FIdDICM[HArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 138);
CPFIdFICM[HArg]lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 139); CPFIdEJCMIHArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 140); CPFIdQ]CM[HArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 141); CPFIdL]ICMIHArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 142); CPFIdS]CMIHArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 143); CPFIdD]JCM[HArg]NW[HSer]TPIWC (SEQ ID NO: 144); CPF[dD]JCM[HArglNWSTP[C5AJWC (SEQ ID NO: 145); CPFIdDJCM[HArglNWSTP[Cpa]lWC (SEQ ID NO: 146); CPFIdD]JCM[HArglNWSTP[Cha]WC (SEQ ID NO: 147); CPF[dD]C[HGIN][HArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 148); CPFIdD]C[C5A][HArg|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 149); CPF[dD]JCM[HArg]N[Trp(Me)|STPIWC (SEQ ID NO: 150); CPF[IdDIINMeCys]M[HArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 151); CPF[dD]C[HArg]|NWS[NMeThr]PIWC (SEQ ID NO: 152); CP[1Nall|[dDJCM[HArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 155); CP[2Nal]|[dDJCM[HArg]lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 156); CP[44BPA][dD]CM[HArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 157); CPFIdDJCM[HArglNWSTPPWOC (SEQ ID NO: 158); CPFIdD]JICM[HArglNWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 159); CPF[IdD]CLIHArglNWSTPPWC (SEQ ID NO: 160); CPF[dD]JCLIHArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 161); CPY[dD]JCM[HArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 162); CIAib]FIdDJCMI[HArg |NWSTPIWC (SEQ ID NO: 163); CISar|FIdDJCM[HArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 164); CPFIdRICM[HArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 165); CPFIdDJCM[HArglNWSTPKWOC (SEQ ID NO: 166); CP[1Nall|[dDJCM[HArg lNWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 167); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]HWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 168): CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 169); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWSTPIWC (SEQ ID NO: 170);
CP[INal|[dRICM[HArg lNWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 171); CP[INal|[dRICM[HArg]HWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 172); CPFIdDJCMINMeHArg|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 173); CPF[dD]JCM[HArg][NMeAsn]JWSTPIWC (SEQ ID NO: 174); CPF[dD]JCM[HArg]|NWS[NMeThr]PIWC (SEQ ID NO: 175); CPFIdD]JCM[HArglNWSTP[NMelle]JWC (SEQ ID NO: 176); CP[1Nall[dDJCM[HArg][CyalWSTP[HyPJWC (SEQ ID NO: 177); CP[1Nall[dDJCM[Cya]DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 178); CP[INall[DCya]CM[HArg]lDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 179); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWDTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 180); CP[2Nal]|[dDJCM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 181); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWTTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 182); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWI[HSer]TP[HyPJWC (SEQ ID NO: 183); CP[1Nall[dDJCM[HArg]DWIdS]ITP[HyPJWC (SEQ ID NO: 184); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWSSP[HyP]WC (SEQ ID NO: 185); CP[1Nall|[dDJCM[Agb]DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 186); CP[INall[ldDJCMPDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 187); CP[1Nall|[dDJCM[HyPIDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 188); CP[INall|[dRICM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 189); CP[INal|[dRICM[HArg]DWDTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 190); CP[2Nal]|[dRICM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 191); CP[INal|[dRICM[HArg]DWTTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 192); CP[1Nall|[dRICM[HArg]DWI[HSer]TP[HyPJWC (SEQ ID NO: 193); CP[INall|[dRICM[HArg]DWIdS]ITP[HyPJWC (SEQ ID NO: 194);
CP[INal]|[dRJCM[HArg]DWSSP[HyP]WC (SEQ ID NO: 195); CP[INal]|[dRJCM[Agb]|DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 196); CP[INal][dRJCMPDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 197); CP[INal]|[dR]|CM[HyP]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 198); CP[1Nal][dD]JCL[HArg]|DWSTPIWC (SEQ ID NO: 199); CP[1Nal][dDJCL[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 200); CP[INal][dR]ICL[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 201); CP[INal][dR]ICL[HArglHWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 202); CP[INal]|[dRJCM[HArg]DWSTPIWC (SEQ ID NO: 203); CP[INal][DCya]CM[Cya]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 208); CP[INal][DCya]CM[HArg][Cya]WSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 209); CP[INal][dDJCM[Cya][CyalWSTP[HyPJWC (SEQ ID NO: 210); CP[INal][dK]|CM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 211); CP[1Nal]l[dDJCMKDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 212); CP[1Nal][dDJCM[HArg]D[dW]ISTP[HyP][dW]C (SEQ ID NO: 215) e CPFGCM[HArg]|DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 216).
[098] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-Xe- X7-Xg-Ci-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: CP[INal]ldD]CM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 169).
[099] Em uma modalidade, o ligante peptídico da invenção é um ligante peptídico que é outro diferente da sequência de aminoácido CP[INal]ldD]CM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 169).
[100] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-Xe- X7-Xg-Ci-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de:
DDA-(SEQ ID NO: 45)A (doravante referido como BCY3386); DTA-(SEQ ID NO: 46)A (doravante referido como BCY3388); DSE-(SEQ ID NO: 47)A (doravante referido como BCY3389); HDA-(SEQ ID NO: 48)-A (doravante referido como BCY3390); MDT-(SEQ ID NO: 49) A (doravante referido como BCY3391); DPG-(SEQ ID NO: 50)A (doravante referido como BCY3392); HDS-(SEQ ID NO: 51)-A (doravante referido como BCY3393); (D-H)DS-(SEQ ID NO: 51)-A (doravante referido como BCY7272); A(SEQ ID NO: 52) TDK (doravante referido como BCY3394); A(SEQ ID NO: 53)LKD (doravante referido como BCY3395); A(SEQ ID NO: 54)TTA (doravante referido como BCY3396); A(SEQ ID NO: 55)-QME (doravante referido como BCY3397); A(SEQ ID NO: 56)LSE (doravante referido como BCY3398); A(SEQ ID NO: 57)-STD (doravante referido como BCY3399); A(SEQ ID NO: 59) TNK (doravante referido como BCY7265);
Ac-(SEQ ID NO: 59) (doravante referido como BCY7660); A(SEQ ID NO: 60) TNK (doravante referido como BCY7266); Ac-(SEQ ID NO: 60) (doravante referido como BCY7616); HDS-(SEQ ID NO: 61)A (doravante referido como BCY7273); HDS-(SEQ ID NO: 62)A (doravante referido como BCY7274); HDS-(SEQ ID NO: 63)-A (doravante referido como BCY7275); HDS-(SEQ ID NO: 64)-A (doravante referido como BCY7276); A(SEQ ID NO: 66) TNK (doravante referido como BCY7349); A(SEQ ID NO: 67) TNK (doravante referido como BCY7350); Ac-(SEQ ID NO: 67) (doravante referido como BCY7538); A(SEQ ID NO: 68) TNK (doravante referido como BCY7359); A(SEQ ID NO: 69) TNK (doravante referido como BCY7360); A(SEQ ID NO: 70) TNK (doravante referido como BCY7361); A(SEQ ID NO: 71) TNK (doravante referido como BCY7365); A(SEQ ID NO: 72) TNK (doravante referido como BCY7370); Ac-(SEQ ID NO: 73) (doravante referido como BCY7535); Ac-(SEQ ID NO: 74) (doravante referido como BCY7536); Ac-(SEQ ID NO: 75) (doravante referido como BCY7541);
[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 76) (doravante referido como BCY7556); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 76) (doravante referido como BCY7558); [B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 77) (doravante referido como BCY7557); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 77) (doravante referido como BCY7559); Ac-(SEQ ID NO: 78) (doravante referido como BCY7580); Ac-(SEQ ID NO: 79) (doravante referido como BCY7581); Ac-(SEQ ID NO: 80) (doravante referido como BCY7582); Ac-(SEQ ID NO: 81) (doravante referido como BCY7584); Ac-(SEQ ID NO: 82) (doravante referido como BCY7585); Ac-(SEQ ID NO: 83) (doravante referido como BCY7588); Ac-(SEQ ID NO: 84) (doravante referido como BCY7589); Ac-(SEQ ID NO: 85) (doravante referido como BCY7590); Ac-(SEQ ID NO: 86) (doravante referido como BCY7591); Ac-(SEQ ID NO: 87) (doravante referido como BCY7592); Ac-(SEQ ID NO: 88) (doravante referido como BCY7593); Ac-(SEQ ID NO: 89) (doravante referido como BCY7594); Ac-(SEQ ID NO: 90) (doravante referido como BCY7595); Ac-(SEQ ID NO: 91) (doravante referido como BCY7596); Ac-(SEQ ID NO: 92) (doravante referido como BCY7597); Ac-(SEQ ID NO: 93) (doravante referido como BCY7598); Ac-(SEQ ID NO: 94) (doravante referido como BCY7607); Ac-(SEQ ID NO: 95) (doravante referido como BCY7608); Ac-(SEQ ID NO: 96) (doravante referido como BCY7611); Ac-(SEQ ID NO: 97) (doravante referido como BCY7612); Ac-(SEQ ID NO: 98) (doravante referido como BCY7613); Ac-(SEQ ID NO: 99) (doravante referido como BCY7614);
Ac-(SEQ ID NO: 100) (doravante referido como BCY7615);
Ac-(SEQ ID NO: 101) (doravante referido como BCY7618);
Ac-(SEQ ID NO: 102) (doravante referido como BCY7620);
Ac-(SEQ ID NO: 111) (doravante referido como BCY7663);
Ac-(SEQ ID NO: 112) (doravante referido como BCY7664);
Ac-(SEQ ID NO: 113) (doravante referido como BCY7667);
Ac-(SEQ ID NO: 114) (doravante referido como BCY7668);
Ac-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7765);
(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7793);
(MeO-dPEG12)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8087);
(Carboxifluorosceína)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8208);
(PEG3)(PEG3)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7815);
(MeO-dPEG12)(PEG3)(PEG3)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8094);
Ac-DDD-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8028);
Ac-[dD][dD][dD]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8029);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7814);
Ac-(SEQ ID NO: 116) (doravante referido como BCY7816);
Ac-(SEQ ID NO: 116) (MeO-dPEG12) ligado a D-Lys6 (doravante referido como BCY8084);
Ac-(SEQ ID NO: 117) (doravante referido como BCY7817);
Ac-(SEQ ID NO: 118) (doravante referido como BCY7818;
Ac-(SEQ ID NO: 118) (MeO-dPEG12) ligado a Pro(ANH)1 (doravante referido como BCY8086);
Ac-(SEQ ID NO: 119) (doravante referido como BCY7819; Ac-(SEQ ID NO: 119) (MeO-dPEG12) ligado a Lys5 (doravante referido como BCY8088); Ac-(SEQ ID NO: 120) (doravante referido como BCY7820; Ac-(SEQ ID NO: 120) (MeO-dPEG12) ligado a D-Lys3 (doravante referido como BCY8089); Ac-(SEQ ID NO: 121) (doravante referido como BCY7821); Ac-(SEQ ID NO: 121) (MeO-dPEG12) ligado a Lys4 (doravante referido como BCY8090); Ac-(SEQ ID NO: 122) (doravante referido como BCY7822); Ac-(SEQ ID NO: 122) (MeO-dPEG12) ligado a Lys6 (doravante referido como BCY8091); Ac-(SEQ ID NO: 123) (doravante referido como BCY7876); Ac-(SEQ ID NO: 124) (doravante referido como BCY7877); Ac-(SEQ ID NO: 125) (doravante referido como BCY7879); Ac-(SEQ ID NO: 126) (doravante referido como BCY7881); Ac-(SEQ ID NO: 127) (doravante referido como BCY7883); Ac-(SEQ ID NO: 128) (doravante referido como BCY7884); Ac-(SEQ ID NO: 129) (doravante referido como BCY7886); Ac-(SEQ ID NO: 130) (doravante referido como BCY7887); Ac-(SEQ ID NO: 131) (doravante referido como BCY7889); Ac-(SEQ ID NO: 132) (doravante referido como BCY7890); Ac-(SEQ ID NO: 133) (doravante referido como BCY7891); Ac-(SEQ ID NO: 134) (doravante referido como BCY7892); Ac-(SEQ ID NO: 135) (doravante referido como BCY7894); Ac-(SEQ ID NO: 136) (doravante referido como BCY7895); Ac-(SEQ ID NO: 137) (doravante referido como BCY7896); Ac-(SEQ ID NO: 138) (doravante referido como BCY7897); Ac-(SEQ ID NO: 139) (doravante referido como BCY7902); Ac-(SEQ ID NO: 140) (doravante referido como BCY7903);
Ac-(SEQ ID NO: 141) (doravante referido como BCY7904); Ac-(SEQ ID NO: 142) (doravante referido como BCY7906); Ac-(SEQ ID NO: 143) (doravante referido como BCY7907); Ac-(SEQ ID NO: 144) (doravante referido como BCY7908); Ac-(SEQ ID NO: 145) (doravante referido como BCY7911); Ac-(SEQ ID NO: 146) (doravante referido como BCY7912); Ac-(SEQ ID NO: 147) (doravante referido como BCY7913); Ac-(SEQ ID NO: 148) (doravante referido como BCY7914); Ac-(SEQ ID NO: 149) (doravante referido como BCY7915); Ac-(SEQ ID NO: 150) (doravante referido como BCY7916); Ac-(SEQ ID NO: 151) (doravante referido como BCY7973); Ac-(SEQ ID NO: 152) (doravante referido como BCY7979); Ac-(SEQ ID NO: 155) (doravante referido como BCY8030); Ac-(SEQ ID NO: 156) (doravante referido como BCY8031); Ac-(SEQ ID NO: 157) (doravante referido como BCY8032); Ac-(SEQ ID NO: 158) (doravante referido como BCY8036); Ac-(SEQ ID NO: 159) (doravante referido como BCY8037); Ac-(SEQ ID NO: 160) (doravante referido como BCY8038); Ac-(SEQ ID NO: 161) (doravante referido como BCY8039); Ac-(SEQ ID NO: 162) (doravante referido como BCY8040); Ac-(SEQ ID NO: 163) (doravante referido como BCY8041); Ac-(SEQ ID NO: 164) (doravante referido como BCY8042); Ac-(SEQ ID NO: 165) (doravante referido como BCY8042); Ac-(SEQ ID NO: 166) (doravante referido como BCY8085); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8120); Ac-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8124); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8121); Ac-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8125);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8122);
Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126);
(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8116);
Fluoresceína-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8205);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234);
[PY A][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8846);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8123);
Ac-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8127);
(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8206);
Ac-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8128);
(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8207);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8232);
Ac-(SEQ ID NO: 172) (doravante referido como BCY8129);
Ac-(SEQ ID NO: 173) (doravante referido como BCY8153);
Ac-(SEQ ID NO: 174) (doravante referido como BCY8154);
Ac-(SEQ ID NO: 175) (doravante referido como BCY8157);
Ac-(SEQ ID NO: 176) (doravante referido como BCY8158);
Ac-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8161);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8278);
Ac-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8162);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8277);
Ac-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8163);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8276); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8269); Ac-(SEQ ID NO: 180) (doravante referido como BCY8174); Ac-(SEQ ID NO: 181) (doravante referido como BCY8175); Ac-(SEQ ID NO: 182) (doravante referido como BCY8176); Ac-(SEQ ID NO: 183) (doravante referido como BCY8177); Ac-(SEQ ID NO: 184) (doravante referido como BCY8178); Ac-(SEQ ID NO: 185) (doravante referido como BCY8180); Ac-(SEQ ID NO: 186) (doravante referido como BCY8181); Ac-(SEQ ID NO: 187) (doravante referido como BCY8182); Ac-(SEQ ID NO: 188) (doravante referido como BCY8183); Ac-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8184); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8235); Ac-(SEQ ID NO: 190) (doravante referido como BCY8185); Ac-(SEQ ID NO: 191) (doravante referido como BCY8186); Ac-(SEQ ID NO: 192) (doravante referido como BCY8187); Ac-(SEQ ID NO: 193) (doravante referido como BCY8188); Ac-(SEQ ID NO: 194) (doravante referido como BCY8189); Ac-(SEQ ID NO: 195) (doravante referido como BCY8191); Ac-(SEQ ID NO: 196) (doravante referido como BCY8192); Ac-(SEQ ID NO: 197) (doravante referido como BCY8193); Ac-(SEQ ID NO: 198) (doravante referido como BCY8194); Ac-(SEQ ID NO: 199) (doravante referido como BCY8211); Ac-(SEQ ID NO: 200) (doravante referido como BCY8212); Ac-(SEQ ID NO: 201) (doravante referido como BCY8213); Ac-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8214); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como
BCY8231); Ac-(SEQ ID NO: 203) (doravante referido como BCY8215); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 208) (doravante referido como BCY8279); Ac-[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8280); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8273); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 210) (doravante referido como BCY8281); Ac-(SEQ ID NO: 211) (doravante referido como BCY8831); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 212) (doravante referido como BCY8238); (SEQ ID NO: 215) (doravante referido como BCY 11415); [PY A][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 215) (doravante referido como BCY11942); e (SEQ ID NO: 216) (doravante referido como BCY 11414).
[101] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-Xe- X7-Xg-Ci-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126); (SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8116); Fluoresceína-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8205); e [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234).
[102] Em uma modalidade, o ligante peptídico da invenção é um ligante peptídico que é outro diferente da sequência de aminoácido:
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8234); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8126); (SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8116); Fluoresceína-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8205); e [PYA][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8846).
[103] Ainda, em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-Xe-X7-Xg-Cii-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234).
[104] Ainda, em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-Xe-X7-Xg-Cii-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 77) (doravante referido como BCY7559); Ac-(SEQ ID NO: 101) (doravante referido como BCY7618); Ac-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7765); (SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7793); Ac-(SEQ ID NO: 155) (doravante referido como BCY8030); Ac-(SEQ ID NO: 160) (doravante referido como BCY8038); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8120); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8121); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como
BCY8122); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8123); Ac-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8124); Ac-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8125); Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126); Ac-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8127); Ac-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8128); Ac-(SEQ ID NO: 172) (doravante referido como BCY8129); Ac-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8161); Ac-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8162); Ac-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8163); Ac-(SEQ ID NO: 187) (doravante referido como BCY8182); Ac-(SEQ ID NO: 188) (doravante referido como BCY8183); Ac-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8184); Ac-(SEQ ID NO: 196) (doravante referido como BCY8192); Ac-(SEQ ID NO: 197) (doravante referido como BCY8193); Ac-(SEQ ID NO: 198) (doravante referido como BCY8194); Ac-(SEQ ID NO: 199) (doravante referido como BCY8211); Ac-(SEQ ID NO: 200) (doravante referido como BCY8212); Ac-(SEQ ID NO: 201) (doravante referido como BCY8213); Ac-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8214); Ac-(SEQ ID NO: 203) (doravante referido como BCY8215); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8276); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8277); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8278); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 208) (doravante referido como BCY8279); Ac-[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8280); e Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 210) (doravante referido como BCY8281).
[105] Dados estão presentes neste documento na Tabela 3 os quais demonstram que os ligantes peptídicos desta modalidade exibiram bons níveis ( < 100 nM) de ligação a Nectina-4 humana como evidenciado pelos dados de ligação SPR.
[106] Ainda, em uma modalidade adicional, o ligante peptídico de Ci-Xe-X7-Xg-Cii-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: Ac-(SEQ ID NO: 155) (doravante referido como BCY8030); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8120); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8121); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8122); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8123); Ac-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8124); Ac-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8125); Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126); Ac-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8127); Ac-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8128); Ac-(SEQ ID NO: 172) (doravante referido como BCY8129); Ac-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8161); Ac-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8162); Ac-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8163);
Ac-(SEQ ID NO: 187) (doravante referido como BCY8182); Ac-(SEQ ID NO: 188) (doravante referido como BCY8183); Ac-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8184); Ac-(SEQ ID NO: 196) (doravante referido como BCY8192); Ac-(SEQ ID NO: 197) (doravante referido como BCY8193); Ac-(SEQ ID NO: 198) (doravante referido como BCY8194); Ac-(SEQ ID NO: 199) (doravante referido como BCY8211); Ac-(SEQ ID NO: 200) (doravante referido como BCY8212); Ac-(SEQ ID NO: 201) (doravante referido como BCY8213); Ac-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8214); Ac-(SEQ ID NO: 203) (doravante referido como BCY8215); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8276); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8277); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8278); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 208) (doravante referido como BCY8279); Ac-[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8280); e Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 210) (doravante referido como BCY8281).
[107] Dados estão presentes neste documento na Tabela 3 os quais demonstram que os ligantes peptídicos desta modalidade exibiram excelentes níveis ( < 10 nM) de ligação a Nectina-4 humana como evidenciado pelos dados de ligação SPR.
[108] Em uma modalidade, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-
02-N002 ou BCY428);
FI-A-(SQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80- 09-02-N006);
Ac-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como 80-09- 02-N008 ou BCY7390);
Ac-[dD]-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como BCY7606);
A-(SEQ ID NO: 2)-A (neste documento referido como 80-09- 02-N003 ou BCY429);
(1-Nal)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N009 ou BCY7420);
(2-Nal)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N010 ou BCY7421);
(33DPA)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N011 ou BCY7422);
(44BPA)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N012 ou BCY7521);
Ac-(SEQ ID NO: 3) (neste documento referido como 80-09- 02-N017);
Ac-(SEQ ID NO: 4) (neste documento referido como 80-09- 02-N018);
Ac-(SQ ID NO: 5) (neste documento referido como 80-09-02- NO19 ou BCY7537);
Ac-(SEQ ID NO: 6) (neste documento referido como 80-09- 02-N020);
Ac-(SEQ ID NO: 7) (neste documento referido como 80-09- 02-N021 ou BCY7539);
Ac-(SEQ ID NO: 8) (neste documento referido como 80-09- 02-N022 ou BCY7540);
Ac-(SEQ ID NO: 9) (neste documento referido como 80-09-
02-N023);
Ac-(pCoF)-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como 80-09-02-N044);
Ac-(SEQ ID NO: 10) (neste documento referido como 80-09- 02-N045);
Ac-(SEQ ID NO: 11) (neste documento referido como 80-09- 02-N046 ou BCY7657);
Ac-(SEQ ID NO: 12) (neste documento referido como 80-09- 02-N047 ou BCY7658);
Ac-(SEQ ID NO: 13) (neste documento referido como 80-09- 02-N048 ou BCY7659);
Ac-(SEQ ID NO: 14) (neste documento referido como 80-09- 02-N049);
Ac-(SEQ ID NO: 15) (neste documento referido como 80-09- 02-N050 ou BCY7661);
SDN-(SEQ ID NO: 15)-A (neste documento referido como BCY3387);
Ac-(SEQ ID NO: 16) (neste documento referido como 80-09- 02-N051 ou BCY7662);
Ac-(SEQ ID NO: 17) (neste documento referido como 80-09- 02-N052);
Ac-(SEQ ID NO: 18) (neste documento referido como 80-09- 02-N053);
Ac-(SEQ ID NO: 19) (neste documento referido como 80-09- 02-N054 ou BCY7665);
Ac-(SEQ ID NO: 20) (neste documento referido como 80-09- 02-N055 ou BCY7666);
Ac-(SEQ ID NO: 21) (neste documento referido como 80-09- 02-N056);
A-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80-
09-02-TO01-N0O01 ou BCY3385);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN(HArg) (neste documento referido como 80-09-02-T01-N003 ou BCY7281);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN(D-K) (neste documento referido como 80-09-02-T01-N004 ou BCY7282);
A-(SEQ ID NO: 22)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N005);
A-(SEQ ID NO: 23)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N006);
Ac-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N011 ou BCY7391);
A-(SEQ ID NO: 24)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N012 ou BCY7342);
A-(SEQ ID NO: 25)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N014 ou BCY7344);
A-(SEQ ID NO: 1)-ANK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N016 ou BCY7346);
A-(SEQ ID NO: 1)-[dA]NK (neste documento referido como BCY7367);
A-(SEQ ID NO: 1)-TAK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N017 ou BCY7347);
A-(SEQ ID NO: 1)-T[dA]JK (neste documento referido como BCY7368);
A-(SEQ ID NO: 1)-TNA (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N018 ou BCY7348);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN[dA] (neste documento referido como BCY7369);
Ac-[pCoPhe]-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como BCY7656);
A-(SEQ ID NO: 6)-TNK (neste documento referido como 80-
09-02-T01-N020 ou BCY7354);
A-(SEQ ID NO: 26)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N022 ou BCY7352);
A-(SEQ ID NO: 27)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N026 ou BCY7356);
A-(SEQ ID NO: 28)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N027 ou BCY7357);
A-(SEQ ID NO: 29)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N041 ou BCY7372);
A-(SEQ ID NO: 30)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N042 ou BCY7424);
A-(SEQ ID NO: 31)-A (neste documento referido como 80- 10-00 ou BCY488);
A-(SEQ ID NO: 32)-A (neste documento referido como BCY432); DDW-(SEQ ID NO: 32)-A (neste documento referido como 80-10-11-T01 ou BCY433);
VDW-(SEQ ID NO: 33)-A (neste documento referido como 80-10-12-T01 ou BCY462);
QKW-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como 80-10-13-T01 ou BCY3400);
Q[HArg]W-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7278);
QIK(Ac)]JW-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7280);
[AC]JQKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7392);
Q[dK]W-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7426);
Ac-AKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7622);
Ac-QAW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7623);
Ac-QKA-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7624);
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(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7793);
(MeO-dPEG12)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8087);
(Carboxifluorosceína)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8208);
(PEG3)(PEG3)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7815);
(MeO-dPEG12)(PEG3)(PEG3)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8094);
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Ac-[dD][dD][dD]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8029);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7814);
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Ac-(SEQ ID NO: 116) (MeO-dPEG12) ligado a D-Lys6 (doravante referido como BCY8084);
Ac-(SEQ ID NO: 117) (doravante referido como BCY7817);
Ac-(SEQ ID NO: 118) (doravante referido como BCY7818;
Ac-(SEQ ID NO: 118) (MeO-dPEG12) ligado a Pro(ANH)1 (doravante referido como BCY8086);
Ac-(SEQ ID NO: 119) (doravante referido como BCY7819;
Ac-(SEQ ID NO: 119) (MeO-dPEG12) ligado a Lys5 (doravante referido como BCY8088);
Ac-(SEQ ID NO: 120) (doravante referido como BCY7820;
Ac-(SEQ ID NO: 120) (MeO-dPEG12) ligado a D-Lys3 (doravante referido como BCY8089);
Ac-(SEQ ID NO: 121) (doravante referido como BCY7821);
Ac-(SEQ ID NO: 121) (MeO-dPEG12) ligado a Lys4
(doravante referido como BCY8090); Ac-(SEQ ID NO: 122) (doravante referido como BCY7822); Ac-(SEQ ID NO: 122) (MeO-dPEG12) ligado a Lys6 (doravante referido como BCY8091); Ac-(SEQ ID NO: 123) (doravante referido como BCY7876); Ac-(SEQ ID NO: 124) (doravante referido como BCY7877); Ac-(SEQ ID NO: 125) (doravante referido como BCY7879); Ac-(SEQ ID NO: 126) (doravante referido como BCY7881); Ac-(SEQ ID NO: 127) (doravante referido como BCY7883); Ac-(SEQ ID NO: 128) (doravante referido como BCY7884); Ac-(SEQ ID NO: 129) (doravante referido como BCY7886); Ac-(SEQ ID NO: 130) (doravante referido como BCY7887); Ac-(SEQ ID NO: 131) (doravante referido como BCY7889); Ac-(SEQ ID NO: 132) (doravante referido como BCY7890); Ac-(SEQ ID NO: 133) (doravante referido como BCY7891); Ac-(SEQ ID NO: 134) (doravante referido como BCY7892); Ac-(SEQ ID NO: 135) (doravante referido como BCY7894); Ac-(SEQ ID NO: 136) (doravante referido como BCY7895); Ac-(SEQ ID NO: 137) (doravante referido como BCY7896); Ac-(SEQ ID NO: 138) (doravante referido como BCY7897); Ac-(SEQ ID NO: 139) (doravante referido como BCY7902); Ac-(SEQ ID NO: 140) (doravante referido como BCY7903); Ac-(SEQ ID NO: 141) (doravante referido como BCY7904); Ac-(SEQ ID NO: 142) (doravante referido como BCY7906); Ac-(SEQ ID NO: 143) (doravante referido como BCY7907); Ac-(SEQ ID NO: 144) (doravante referido como BCY7908); Ac-(SEQ ID NO: 145) (doravante referido como BCY7911); Ac-(SEQ ID NO: 146) (doravante referido como BCY7912); Ac-(SEQ ID NO: 147) (doravante referido como BCY7913); Ac-(SEQ ID NO: 148) (doravante referido como BCY7914);
Ac-(SEQ ID NO: 149) (doravante referido como BCY7915); Ac-(SEQ ID NO: 150) (doravante referido como BCY7916); Ac-(SEQ ID NO: 151) (doravante referido como BCY7973); Ac-(SEQ ID NO: 152) (doravante referido como BCY7979); Ac-(SEQ ID NO: 155) (doravante referido como BCY8030); Ac-(SEQ ID NO: 156) (doravante referido como BCY8031); Ac-(SEQ ID NO: 157) (doravante referido como BCY8032); Ac-(SEQ ID NO: 158) (doravante referido como BCY8036); Ac-(SEQ ID NO: 159) (doravante referido como BCY8037); Ac-(SEQ ID NO: 160) (doravante referido como BCY8038); Ac-(SEQ ID NO: 161) (doravante referido como BCY8039); Ac-(SEQ ID NO: 162) (doravante referido como BCY8040); Ac-(SEQ ID NO: 163) (doravante referido como BCY8041); Ac-(SEQ ID NO: 164) (doravante referido como BCY8042); Ac-(SEQ ID NO: 165) (doravante referido como BCY8042); Ac-(SEQ ID NO: 166) (doravante referido como BCY8085); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8120); Ac-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8124); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8121); Ac-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8125); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126); (SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8116); Fluoresceína-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8205); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234);
[PY A][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8846);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8123);
Ac-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8127);
(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8206);
Ac-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8128);
(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8207);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8232);
Ac-(SEQ ID NO: 172) (doravante referido como BCY8129);
Ac-(SEQ ID NO: 173) (doravante referido como BCY8153);
Ac-(SEQ ID NO: 174) (doravante referido como BCY8154);
Ac-(SEQ ID NO: 175) (doravante referido como BCY8157);
Ac-(SEQ ID NO: 176) (doravante referido como BCY8158);
Ac-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8161);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8278);
Ac-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8162);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8277);
Ac-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8163);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8276);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8269);
Ac-(SEQ ID NO: 180) (doravante referido como BCY8174);
Ac-(SEQ ID NO: 181) (doravante referido como BCY8175);
Ac-(SEQ ID NO: 182) (doravante referido como BCY8176);
Ac-(SEQ ID NO: 183) (doravante referido como BCY8177);
Ac-(SEQ ID NO: 184) (doravante referido como BCY8178); Ac-(SEQ ID NO: 185) (doravante referido como BCY8180); Ac-(SEQ ID NO: 186) (doravante referido como BCY8181); Ac-(SEQ ID NO: 187) (doravante referido como BCY8182); Ac-(SEQ ID NO: 188) (doravante referido como BCY8183); Ac-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8184); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8235); Ac-(SEQ ID NO: 190) (doravante referido como BCY8185); Ac-(SEQ ID NO: 191) (doravante referido como BCY8186); Ac-(SEQ ID NO: 192) (doravante referido como BCY8187); Ac-(SEQ ID NO: 193) (doravante referido como BCY8188); Ac-(SEQ ID NO: 194) (doravante referido como BCY8189); Ac-(SEQ ID NO: 195) (doravante referido como BCY8191); Ac-(SEQ ID NO: 196) (doravante referido como BCY8192); Ac-(SEQ ID NO: 197) (doravante referido como BCY8193); Ac-(SEQ ID NO: 198) (doravante referido como BCY8194); Ac-(SEQ ID NO: 199) (doravante referido como BCY8211); Ac-(SEQ ID NO: 200) (doravante referido como BCY8212); Ac-(SEQ ID NO: 201) (doravante referido como BCY8213); Ac-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8214); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8231); Ac-(SEQ ID NO: 203) (doravante referido como BCY8215); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 208) (doravante referido como BCY8279); Ac-[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8280); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8273);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 210) (doravante referido como BCY8281); Ac-(SEQ ID NO: 211) (doravante referido como BCY8831); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 212) (doravante referido como BCY8238); (SEQ ID NO: 215) (doravante referido como BCY 11415); [PY A][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 215) (doravante referido como BCY11942); e (SEQ ID NO: 216) (doravante referido como BCY 11414).
[109] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: A-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N0O01 ou BCY3385); Ac-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como 80-09- 02-N008 ou BCY7390); Ac-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N011 ou BCY7391); [AC]JQKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7392); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 77) (doravante referido como BCY7559); Ac-(SEQ ID NO: 101) (doravante referido como BCY7618); Ac-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7765); (SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7793); Ac-(SEQ ID NO: 155) (doravante referido como BCY8030); Ac-(SEQ ID NO: 160) (doravante referido como BCY8038); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8120); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8121);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8122); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8123); Ac-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8124); Ac-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8125); Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126); Ac-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8127); Ac-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8128); Ac-(SEQ ID NO: 172) (doravante referido como BCY8129); Ac-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8161); Ac-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8162); Ac-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8163); Ac-(SEQ ID NO: 187) (doravante referido como BCY8182); Ac-(SEQ ID NO: 188) (doravante referido como BCY8183); Ac-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8184); Ac-(SEQ ID NO: 196) (doravante referido como BCY8192); Ac-(SEQ ID NO: 197) (doravante referido como BCY8193); Ac-(SEQ ID NO: 198) (doravante referido como BCY8194); Ac-(SEQ ID NO: 199) (doravante referido como BCY8211); Ac-(SEQ ID NO: 200) (doravante referido como BCY8212); Ac-(SEQ ID NO: 201) (doravante referido como BCY8213); Ac-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8214); Ac-(SEQ ID NO: 203) (doravante referido como BCY8215); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8276); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8277); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8278);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 208) (doravante referido como BCY8279); Ac-[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8280); e Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 210) (doravante referido como BCY8281).
[110] Dados estão presentes neste documento na Tabela 3 os quais demonstram que os ligantes peptídicos desta modalidade exibiram bons níveis ( < 100 nM) de ligação a Nectina-4 humana como evidenciado pelos dados de ligação SPR.
[111] Ainda, em uma modalidade adicional, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: Ac-(SEQ ID NO: 155) (doravante referido como BCY8030); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8120); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8121); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8122); Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8123); Ac-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8124); Ac-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8125); Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126); Ac-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8127); Ac-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8128); Ac-(SEQ ID NO: 172) (doravante referido como BCY8129); Ac-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8161); Ac-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8162); Ac-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8163);
Ac-(SEQ ID NO: 187) (doravante referido como BCY8182); Ac-(SEQ ID NO: 188) (doravante referido como BCY8183); Ac-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8184); Ac-(SEQ ID NO: 196) (doravante referido como BCY8192); Ac-(SEQ ID NO: 197) (doravante referido como BCY8193); Ac-(SEQ ID NO: 198) (doravante referido como BCY8194); Ac-(SEQ ID NO: 199) (doravante referido como BCY8211); Ac-(SEQ ID NO: 200) (doravante referido como BCY8212); Ac-(SEQ ID NO: 201) (doravante referido como BCY8213); Ac-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8214); Ac-(SEQ ID NO: 203) (doravante referido como BCY8215); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8276); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8277); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8278); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 208) (doravante referido como BCY8279); Ac-[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8280); e Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 210) (doravante referido como BCY8281).
[112] Dados estão presentes neste documento na Tabela 3 os quais demonstram que os ligantes peptídicos desta modalidade exibiram excelentes níveis ( < 10 nM) de ligação a Nectina-4 humana como evidenciado pelos dados de ligação SPR.
[113] Em uma modalidade alternativa, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: [B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 76) (doravante referido como
BCY7556); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7814); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8231); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8232); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8235); Ac-(SEQ ID NO: 211) (doravante referido como BCY8831); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8269); e [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8273).
[114] Os dados são apresentados aqui na Tabela 4, os quais demonstram que os ligantes peptídicos desta modalidade, quando conjugados a um agente citotóxico, exibiram bons níveis ( < 100 nM) de ligação a Nectina-4 humana, conforme evidenciado pelos dados de ligação a SPR.
[115] Em uma outra modalidade, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: [B-Ala] [Sar10] -(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234); [B-Ala] [Sar10] -(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8231); [B-Ala] [Sar10] -(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8232); [B-Ala] [Sar10] -(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como
BCY8235); Ac-(SEQ ID NO: 211) (doravante referido como BCY8831); [B-Ala] [Sar10] -(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8269); e [B-Ala] [Sar10] -(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8273).
[116] Os são apresentados aqui na Tabela 4, os quais demonstram que os ligantes peptídicos desta modalidade, quando conjugados a um agente citotóxico, exibiram excelentes níveis ( < 10 nM) de ligação a Nectina-4 humana, conforme evidenciado pelos dados de ligação a SPR.
[117] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica, como nas áreas da química de peptídeos, cultura de células e exibição de fagos, química de ácidos nucleicos e bioquímica. Técnicas padrão são usadas para biologia molecular, métodos genéticos e bioquímicos (vide Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3º ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols em Molecular Biology (1999) 4º ed., John Wiley & Sons, Inc.), que são aqui incorporados por referência. Nomenclatura Numeração
[118] Quando se referem às posições de resíduos de aminoácidos dentro dos peptídeos da invenção, os resíduos de cisteína (Ci, Ci e Cii) são omitidos da numeração, pois são invariantes, portanto, a numeração de resíduos de aminoácidos dentro dos peptídeos da invenção é referida como abaixo: Ci-P1-F2-G3-Cii-Ma-Ks5-Ne-W7-Sg-Wa-P10-111-W12-Cii (SEQ ID NO: 1).
[119] Para o propósito desta descrição, todos os peptídeos bicíclicos são considerados ciclizados com 1,1',1"”-(1,3,5-triazinano- 1,3,5-triil) triprop-2-an-1-ona (TATA) e produzindo uma estrutura tri- substituída. A ciclização com TATA ocorre em C;, Ci e Cii. Formato Molecular
[120] As extensões dos C ou N-terminais à sequência núcleo bicíclica são adicionadas ao lado esquerdo ou direito da sequência, separadas por um hífen. Por exemplo, uma cauda BAla-Sar10-Ala N- terminal seria denotada como: BAla-Sar10-A-(SEQ ID NO: X). Sequências de Peptídeos Inversas
[121] À luz da divulgação em Nair et a/ (2003) J Immunol 170 (3), 1362-1373, prevê-se que as sequências de peptídeos aqui divulgadas também encontrariam utilidade na sua forma retro-inversa. Por exemplo, a sequência é invertida (i.e. N-terminal torna-se C-terminal e vice-versa) e sua estereoquímica também é invertida (ie. D- aminoácidos tornam-se L-aminoácidos e vice-versa). Ligantes Peptídicos
[122] Um ligante peptídico, como referido aqui, refere-se a um peptídeo — covalentemente ligado a um arcabouço molecular. Normalmente, esses peptídeos compreendem dois ou mais grupos reativos (ou seja, resíduos de cisteína) que são capazes de formar ligações covalentes ao arcabouço, e uma sequência subtendida entre os referidos grupos reativos que é referida como a sequência de loop, uma vez que forma um loop quando o peptídeo está ligado ao arcabouço. No presente caso, os peptídeos compreendem pelo menos três resíduos de cisteína (aqui referidos como C;, C;; e Ci) e formam pelo menos dois loops no arcabouço. Vantagens dos Ligantes Peptídicos
[123] Certos peptídeos bicíclicos da presente invenção têm uma série de propriedades vantajosas que permite que sejam considerados como moléculas semelhanteso fármacos adequados para injecção, inalação, administração nasal, ocular, oral ou tópica. Essas propriedades vantajosas incluem: - Reatividade cruzada de espécies. Este é um requisito típico para avaliação farmacodinâmica e farmacocinética pré-clínica; - Estabilidade de protease. Os ligantes peptídicos bicíclicos devem, idealmente, demonstrar estabilidade às proteases plasmáticas, proteases epiteliais ("ancoradas à membrana"), proteases gástricas e intestinais, proteases de superfície pulmonar, proteases intracelulares e semelhantes. A estabilidade da protease deve ser mantida entre espécies diferentes de modo que um candidato dianteiro bicíclico possa ser desenvolvido em modelos animais, bem como administrado com confiança em humanos; - Perfil de solubilidade desejável. Esta é uma função da proporção de resíduos carregados e hidrofílicos versus hidrofóbicos e ligação H intra/intermolecular, que é importante para fins de formulação e absorção; - Uma meia-vida plasmática ideal na circulação. Dependendo da indicação clínica e do regime de tratamento, pode ser necessário desenvolver um peptídeo bicíclico para exposição curta em um ambiente de tratamento de doença aguda ou desenvolver um peptídeo bicíclico com retenção aumentada na circulação e, portanto, é ideal para o gerenciamento de mais estados de doenças crônicas. Outros fatores que determinam a meia-vida plasmática desejável são os requisitos de exposição sustentada para eficiência terapêutica máxima versus a toxicologia que a acompanha devido à exposição sustentada do agente; e - Seletividade. Certos ligantes peptídicos da invenção demonstram boa seletividade sobre outras nectinas.
Sais Farmaceuticamente Aceitáveis
[124] Será apreciado que as formas de sal estão dentro do escopo desta invenção, e as referências a ligantes peptídicos incluem as formas de sal dos referidos ligantes.
[125] Os sais da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto original que contém uma porção básica ou ácida por métodos químicos convencionais, tais como métodos descritos em Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 páginas, agosto de 2002. Geralmente, tais sais podem ser preparados reagindo as formas de ácido ou base livres desses compostos com a base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois.
[126] Os sais de adição de ácido (mono- ou di-sais) podem ser formados com uma ampla variedade de ácidos, tanto inorgânicos quanto orgânicos. Exemplos de sais de adição de ácido incluem mono- ou di-sais formados com um ácido selecionado a partir do grupo que consiste em acético, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico, ascórbico (por exemplo, L-ascórbico), L-aspártico, benzenossulfônico, benzoico, 4- acetamidobenzoico, butanoico, (+) canfórico, canforossulfônico, (+)- (18)-camfor-10-sulfônico, cáprico, caproico, caprílico, cinâmico, cítrico, ciclâmico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-dissulfônico, etanossulfônico, 2- hidroxietanossulfônico, fórmico, fumárico, galactárico, gentísico, glucoheptônico, D-glucônico, glucurônico (por exemplo, D-glucurônico), glutâmico (por exemplo, L-glutâmico), a-oxoglutárico, glicólico, hipúrico, ácido hidroálico (por exemplo, ácido bromídrico, clorídrico, hidriódico), isethiônico, láctico (por exemplo (+)- L-láctico, (+)-DL-láctico), lactobiônico, maleico, málico, (-)-L-málico, malônico, (+)-DL-mandélico, metanossulfônico, naftaleno-2-sulfônico, naftaleno-1,5-dissulfônico, 1- hidróxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiônico, pirúvico, L-piroglutâmico, ácidos salicílico, 4-amino-salicílico, sebácico, esteárico, succínico, sulfúrico, tânico, (+)-L-tartárico, tiociânico, p-toluenossulfônico, undecilênico e valérico, bem como aminoácidos acilados e resinas de troca catiônica.
[127] Um grupo particular de sais consiste em sais formados a partir dos ácidos acético, clorídrico, iodídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, cítrico, láctico, succínico, maleico, málico, isetionico, fumárico, benzenossulfônico, toluenossulfônico, sulfúrico, metanossulfônico (mesilato), etanossulfônico, naftalenossulfônico, valérico, propanoico, butanoico, malônico, glucurônico e lactobiônicos. Um sal em particular é o sal cloridrato. Outro sal particular é o sal acetato.
[128] Se o composto for aniônico ou tiver um grupo funcional que pode ser aniônico (por exemplo, COOH pode ser COO'), então um sal pode ser formado com uma base orgânica ou inorgânica, gerando um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, íons de metal alcalino, como Li+, Na+ e K+, cátions de metal alcalino-terroso, como Ca2+ e Mg2+, e outros cátions, como Al3+ ou Zn+. Exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, íon amônio (isto é, NHa+) e íons de amônio substituídos (por exemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Exemplos de alguns íons de amônio substituídos adequados são aqueles derivados de: metilamina, etilamina, dietilamina, propilamina, diciclo- hexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina e trometamina, bem como aminoácidos, como lisina e arginina. Um exemplo de íon de amônio quaternário comum é o N(CH3)4+t.
[129] Quando os peptídeos da invenção contêm uma função amina, estes podem formar sais de amônio quaternário, por exemplo, por reação com um agente alquilante de acordo com métodos bem conhecidos do especialista. Esses compostos de amônio quaternário estão dentro do escopo da invenção. Derivados Modificados
[130] Será apreciado que os derivados modificados dos ligantes peptídicos como aqui definidos estão dentro do âmbito da presente invenção. Exemplos de tais derivados modificados adequados incluem uma ou mais modificações selecionadas a partir de: modificações N- terminal e/ou C-terminal; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais (como a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos polares por um ou mais aminoácidos isostéricos ou isoeletrônicos; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos não polares por outros aminoácidos isostéricos ou isoeletrônicos não naturais); adição de um grupo espaçador; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxidação por um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxidação; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por uma alanina, substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácido por um ou mais resíduos de D-aminoácido; N-alquilação de uma ou mais ligações amida dentro do ligante peptídico bicíclico; substituição de uma ou mais ligações peptídicas por uma ligação substituta; modificação do comprimento da estrutura principal do peptídeo; substituição do hidrogênio no carbono alfa de um ou mais resíduos de aminoácidos por outro grupo químico, modificação de aminoácidos, como cisteína, lisina, glutamato/aspartato e tirosina por amina, tiol, ácido carboxílico e reagentes reativos com fenol adequados, quanto a funcionalizar os referidos aminoácidos e a introdução ou substituição de aminoácidos que introduzem reatividades ortogonais que são adequadas para funcionalização, por exemplo, azida ou aminoácidos contendo grupo alquino que permitem funcionalização com grupos alquino ou contendo azida, respectivamente.
[131] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação N-terminal e/ou C-terminal. Em uma outra modalidade, em que o derivado modificado compreende uma modificação N-terminal usando química amino-reativa adequada e/ou modificação C-terminal usando química carbóxi-reativa adequada. Em uma outra modalidade, a referida modificação N-terminal ou C-terminal compreende a adição de um grupo efetor, incluindo, mas não se limitando a, um agente citotóxico, um radiocelador ou um cromóforo.
[132] Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação do N-terminal. Em uma outra modalidade, a modificação N-terminal compreende um grupo acetil N- terminal. Nesta modalidade, o grupo cisteína N-terminal (o grupo aqui referido como Ci) é tampado com anidrido acético ou outros reagentes apropriados durante a síntese de peptídeo levando a uma molécula que é N-terminalmente acetilada. Esta modalidade fornece a vantagem de remover um ponto de reconhecimento potencial para aminopeptidases e evita o potencial de degradação do peptídeo bicíclico.
[133] Em uma modalidade alternativa, a modificação N-terminal compreende a adição de um grupo espaçador molecular que facilita a conjugação de grupos efetores e a retenção da potência do peptídeo bicíclico em seu alvo.
[134] Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação C-terminal. Em uma outra modalidade, a modificação —C-terminal! compreende um grupo amida. Nesta modalidade, o grupo de cisteína C-terminal (o grupo aqui referido como Cii) é sintetizado como uma amida durante a síntese de peptídeo levando a uma molécula que é C-terminalmente amidada. Esta modalidade fornece a vantagem de remover um ponto de reconhecimento potencial para carboxipeptidase e reduz o potencial de degradação proteolítica do peptídeo bicíclico.
[135] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais. Nesta modalidade, os aminoácidos não naturais podem ser selecionados tendo cadeias laterais isostéricas/isoeletrônicas que não são reconhecidas por proteases degradativas nem têm qualquer efeito adverso sobre a potência alvo.
[136] Alternativamente, aminoácidos não naturais podem ser usados tendo cadeias laterais de aminoácidos restritas, de modo que a hidrólise — proteolítica “da ligação peptídica próxima seja conformacionalmente e estericamente impedida. Em particular, estes dizem respeito a análogos de prolina, cadeias laterais volumosas, derivados Ca-dissubstituídos (por exemplo, ácido aminoisobutírico, Aib) e cicloaminoácidos, um derivado simples sendo o ácido amino- ciclopropilcarboxílico.
[137] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador. Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador à cisteína N- terminal (Ci) e/ou à cisteína C-terminal (Cii).
[138] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxidação por um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxidação.
[139] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos carregados por um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Em uma modalidade alternativa, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos por um ou mais resíduos de aminoácidos carregados. O equilíbrio correto de resíduos de aminoácidos carregados versus hidrofóbicos é uma característica importante dos ligantes peptídicos bicíclicos. Por exemplo, resíduos de aminoácidos hidrofóbicos influenciam o grau de ligação às proteínas plasmáticas e, portanto, a concentração da fração livre disponível no plasma, enquanto os resíduos de aminoácidos carregados (em particular arginina) podem influenciar a interação do peptídeo com as membranas fosfolipídicas nas superfícies celulares. Os dois em combinação podem influenciar a meia-vida, o volume de distribuição e a exposição do fármaco peptídica e podem ser ajustados de acordo com o desfecho clínico. Além disso, a combinação correta e o número de resíduos de aminoácidos carregados versus hidrofóbicos podem reduzir a irritação no sítio da injeção (seo fármaco peptídico foi administrado subcutaneamente).
[140] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácido por um ou mais resíduos de D-aminoácido. Acredita-se que esta modalidade aumenta a estabilidade proteolítica por impedimento estérico e por uma propensão de D-aminoácidos para estabilizar conformações de B-voltas (Tugyi et al (2005) PNAS, 102 (2), 413-418).
[141] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a remoção de quaisquer resíduos de aminoácidos e a substituição por alaninas. Esta modalidade fornece a vantagem de remover o (s) sítio (s) de ataque proteolítico potencial.
[142] Deve-se notar que cada uma das modificações acima mencionadas serve para melhorar deliberadamente a potência ou estabilidade do peptídeo. Outras melhorias de potência com base em modificações podem ser alcançadas através dos seguintes mecanismos: - "Incorporação de porções hidrofóbicas que exploram o efeito hidrofóbico e levam a taxas de desativação mais baixas, de modo que afinidades mais altas sejam alcançadas; - “Incorporação de grupos carregados que exploram interações iônicas de longo alcance, levando a taxas mais rápidas e a afinidades mais altas (vide, por exemplo, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of protein (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31) e - “Incorporação de restrição adicional no peptídeo, por exemplo, restringir as cadeias laterais de aminoácidos corretamente de modo que a perda de entropia seja mínima após a ligação ao alvo, restringir os ângulos de torção da estrutura principal de modo que a perda de entropia seja mínima após a ligação ao alvo e introduzir ciclizações adicionais na molécula por razões idênticas. (para revisões, vide Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, e Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418). Variações Isotópicas
[143] A presente invenção inclui todos os ligantes peptídicos marcados com isótopos farmaceuticamente aceitáveis da invenção, em que um ou mais átomos são substituídos por átomos com o mesmo número atômico, mas uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa geralmente encontrados na natureza, e ligantes peptídicos da invenção, em que grupos quelantes de metal são anexados (denominados "efetores") que são capazes de conter (rádio) isótopos relevantes e ligantes peptídicos da invenção, em que certos grupos funcionais são covalentemente substituídos por (radio) isótopos ou grupos funcionais marcados isotopicamente.
[144] Exemplos de isótopos adequados para inclusão nos ligantes peptídicos da invenção compreendem isótopos de hidrogênio, como 2H (D) e ?H (T), carbono, tais como *'C, “ºC e *C, cloro, como Cl, flúor, como *F, iodo, tal como 1281, 1291 e 13, nitrogênio, tal como *?N e *SN, oxigênio, tal como 15O, 17O e 18O, fósforo, tal como ?º?P, enxofre, tal como
?5S, cobre, tal como Cu, gálio, como Ga ou Ga, ítrio, como ºY e lutécio, como *”7Lu, e bismuto, como 2!3Bi.
[145] Certos ligantes peptídicos marcados isotopicamente da invenção, por exemplo, aqueles que incorporam um isótopo radioativo, são úteis em estudos de distribuição de fármacos e/ou substrato em tecidos e para avaliar clinicamente a presença e/ou ausência do alvo de Nectina-4 em tecidos doentes. Os ligantes peptídicos da invenção podem ainda ter propriedades de diagnóstico valiosas, uma vez que podem ser usados para detectar ou identificar a formação de um complexo entre um composto marcado e outras moléculas, peptídeos, proteínas, enzimas ou receptores. Os métodos de detecção ou identificação podem usar compostos que são marcados com agentes de marcação, como radioisótopos, enzimas, substâncias fluorescentes, substâncias luminosas (por exemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, aequorina e luciferase), etc. Os isótopos radioativos trítio isto é, ?H (T), e carbono-14, isto é, 1ºC, são particularmente úteis para este propósito em vista de sua facilidade de incorporação e meios de detecção rápidos.
[146] A substituição por isótopos mais pesados, como deutério, ou seja, 2H (D), pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou requisitos de dosagem reduzidos e, portanto, pode ser preferida em algumas circunstâncias.
[147] A substituição por isótopos emissores de pósitrons, como 11C,18F, SO e **N, pode ser útil em estudos de Topografia de Emissão de Pósitrons (PET) para examinar a ocupação do alvo.
[148] Os compostos isotopicamente marcados de ligantes peptídicos da invenção podem geralmente ser preparados por técnicas convencionais conhecidas pelos versados na técnica ou por processos análogos aos descritos nos Exemplos acompanhantes usando um reagente isotopicamente marcado apropriado no lugar do reagente não marcado anteriormente empregado.
Arcabouço Molecular
[149] Em uma modalidade, o arcabouço molecular compreende um arcabouço molecular não aromático. As referências aqui a "arcabouço molecular não aromático" referem-se a qualquer arcabouço molecular, conforme definido neste documento, que não contenha um sistema de anel carbocíclico ou heterocíclico aromático (isto é, insaturado).
[150] Exemplos adequados de arcabouços não-aromáticos são descritos em Heinis et al (2014) Angewandte Chemie, International Edition 53 (6) 1602-1606.
[151] Conforme observado nos documentos anteriores, O arcabouço molecular pode ser uma molécula pequena, como uma pequena molécula orgânica.
[152] Em uma modalidade, o arcabouço molecular pode ser uma macromolécula. Em uma modalidade, o arcabouço molecular é uma macromolécula — composta de aminoácidos, nucleotídeos ou carboidratos.
[153] Em uma modalidade, o arcabouço molecular compreende grupos reativos que são capazes de reagir com grupo (s) funcional (s) do polipeptídeo para formar ligações covalentes.
[154] O arcabouço molecular pode compreender grupos químicos que formam a ligação com um peptídeo, tais como aminas, tióis, álcoois, cetonas, aldeídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, azidas, anidridos, succinimidas, maleimidas, halogenetos de alquila e halogenetos de acila.
[155] Um exemplo de um composto contendo carbonila insaturado ap é 1,1'1”-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona — (TATA) (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53 (6), 1602-1606).
Grupos Efetores e Funcionais
[156] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um conjugado de fármaco que compreende um ligante peptídico, conforme definido neste documento, conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
[157] Os grupos efetores e/ou funcionais podem ser ligados, por exemplo, aos N e/ou C-terminais do polipeptídeo, a um aminoácido dentro do polipeptídeo ou ao arcabouço molecular.
[158] Grupos efetores apropriados incluem anticorpos e partes ou fragmentos dos mesmos. Por exemplo, um grupo efetor pode incluir uma região constante de cadeia leve (CL) de anticorpo, um domínio de cadeia pesada CH1 do anticorpo, um domínio de cadeia pesada CH2 do anticorpo, um domínio de cadeia pesada CH3 do anticorpo ou qualquer combinação dos mesmos, além de um ou mais domínios de região constante. Um grupo efetor também pode compreender uma região de dobradiça de um anticorpo (tal região normalmente encontrada entre os domínios CH1 e CH2 de uma molécula de IgG).
[159] Em uma outra modalidade deste aspecto da invenção, um grupo efetor de acordo com a presente invenção é uma região Fc de uma molécula de IgG. Vantajosamente, um grupo ligante-efetor de peptídeo de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma fusão Fc de ligante peptídico tendo uma meia-vida de um dia ou mais, dois dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais ou 7 dias ou mais. Mais vantajosamente, o ligante peptídico de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma fusão Fc de ligante peptídico tendo uma meia-vida tB de um dia ou mais.
[160] Os grupos funcionais incluem, em geral, grupos de ligação, fármacos, grupos reativos para a ligação de outras entidades, grupos funcionais que auxiliam na absorção dos peptídeos macrocíclicos nas células e semelhantes.
[161] A capacidade dos peptídeos de penetrar nas células permitirá que os peptídeos contra alvos intracelulares sejam eficazes. Os alvos que podem ser acessados por peptídeos com a capacidade de penetrar nas células incluem fatores de transcrição, moléculas de sinalização intracelular, como tirosina quinases e moléculas envolvidas na via apoptótica. Os grupos funcionais que permitem a penetração nas células incluem peptídeos ou grupos químicos que foram adicionados ao peptídeo ou ao arcabouço molecular. Peptídeos, tais como aqueles derivados de tais como VP22, HIV-Tat, uma proteína homeobox de Drosophila (Antennapedia), por exemplo, como descrito em Chen e Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, parte 4, p821; Gupta et al. em Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637. Exemplos de peptídeos curtos que se mostraram eficientes na translocação através das membranas plasmáticas incluem o peptídeo penetratina de 16 aminoácidos da proteína Drosophila Antennapedia (Derossi et a/ (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444), o 'peptídeo anfipático modelo' de 18 aminoácidos (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127) e regiões ricas em arginina da proteína HIV TAT. Abordagens não peptídicas incluem o uso de mimetizadores de moléculas pequenas ou SMOCs que podem ser facilmente anexados a biomoléculas (Okuyama et al (2007) Nature Methods Volume 4 p153). Outras estratégias químicas para adicionar grupos de guanidínio às moléculas também aumentam a penetração celular (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585). Moléculas de baixo peso molecular, como esteroides, podem ser adicionadas ao arcabouço molecular para aumentar a absorção nas células.
[162] Uma classe de grupos funcionais que podem ser ligados a ligantes peptídicos inclui anticorpos e fragmentos de ligação dos mesmos, tais como Fab, Fv ou fragmentos de domínio único. Em particular, podem ser utilizados anticorpos que se ligam a proteínas capazes de aumentar a meia-vida do ligante peptídico in vivo.
[163] Em uma modalidade, um grupo efetor de ligante peptídico de acordo com a invenção tem uma meia-vida selecionada a partir do grupo que consiste em: 12 horas ou mais, 24 horas ou mais, 2 dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais, 7 dias ou mais, 8 dias ou mais, 9 dias ou mais, 10 dias ou mais, 11 dias ou mais, 12 dias ou mais, 13 dias ou mais, 14 dias ou mais, 15 dias ou mais ou dias ou mais. Vantajosamente, um grupo ou composição de ligante peptídico - efetor de acordo com a invenção terá uma meia-vida tê na faixa de 12 a 60 horas. Em outra modalidade, terá uma meia-vida tB de um dia ou mais. Em uma outra modalidade ainda, estará na faixa de 12 a 26 horas.
[164] Em uma modalidade particular da invenção, o grupo funcional é selecionado a partir de um quelante de metal, que é adequado para complexar radioisótopos de metal de relevância medicinal.
[165] Grupos efetores possíveis também incluem enzimas, por exemplo, tais como carboxipeptidase G2 para uso em terapia enzimática/profármaco, onde o ligante peptídico substitui anticorpos em ADEPT.
[166] Em uma modalidade particular da invenção, o grupo funcional é selecionado a partir de um fármaco, como um agente citotóxico para terapia de câncer. Os exemplos adequados incluem: agentes alquilantes, tais como cisplatina e carboplatina, bem como oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, ifosfamida; antimetabolitos incluindo análogos de purina azatioprina e mercaptopurina ou análogos de pirimidina; alcaloides e terpenoides vegetais, incluindo alcaloides de vinca, tais como Vincristina,
Vinblastina, Vinorelbina e Vindesina; Podofilotoxina e seus derivados etoposídeo e teniposídeo; Taxanos, incluindo paclitaxel, originalmente conhecido como Taxol; inibidores da topoisomerase incluindo camptotecinas: irinotecano e topotecano, e inibidores do tipo Il incluindo amsacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo e teniposídeo. Outros agentes podem incluir antibióticos antitumorais que incluem o imunossupressor dactinomicina (que é usado em transplantes renais), doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina, caliqueamicinas e outros.
[167] Em uma outra modalidade particular da invenção, o agente citotóxico é selecionado a partir de maitansinoides (como DM1) ou monormetil auristatinas (como MMAE).
[168] DM1 é um agente citotóxico que é um derivado da maitansina contendo tiol e tem a seguinte estrutura: o indo oe
OH H = à > CÃO o |
N SH
DAN cl º 2º
[169] Dados são apresentados aqui na Tabela 4, os quais demonstram os efeitos de um ligante peptídico conjugado a uma toxina contendo DM1.
[170] Monormetil auristatina E (MMAE) é um agente antineoplásico sintético e tem a seguinte estrutura:
+ mN (
PP ERTN E
[171] São apresentados aqui na Tabela 4, os quais demonstram os efeitos dos ligantes peptídicos conjugados a uma toxina contendo MMAE.
[172] Em ainda outra modalidade particular da invenção, o agente citotóxico é selecionado a partir de monometil auristatina E (MMAE).
[173] Em uma modalidade, o agente citotóxico é ligado ao peptídeo bicíclico por uma ligação clivável, tal como uma ligação dissulfeto ou uma ligação sensível à protease. Em uma outra modalidade, os grupos adjacentes à ligação dissulfeto são modificados para controlar o impedimento da ligação dissulfeto e, por isso, a taxa de clivagem e liberação concomitante do agente citotóxico.
[174] Trabalhos publicados estabeleceram o potencial para modificar a susceptibilidade da ligação dissulfeto à redução introduzindo impedimento estérico nos lados da ligação dissulfeto (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717) Um maior grau de impedimento estérico reduz a taxa de redução pela glutationa intracelular e também por agentes redutores extracelulares (sistêmicos), consequentemente reduzindo a facilidade com que a toxina é liberada, tanto dentro quanto fora da célula. Assim, a seleção do ideal em estabilidade de dissulfeto na circulação (que minimiza os efeitos colaterais indesejáveis da toxina) versus a liberação eficiente no meio intracelular (que maximiza o efeito terapêutico) pode ser alcançada por meio da seleção cuidadosa do grau de impedimento em ambos os lados da ligação dissulfeto.
[175] O impedimento em qualquer lado da ligação dissulfeto é modulado através da introdução de um ou mais grupos metila na entidade de direcionamento (aqui, o peptídeo bicíclico) ou no lado da toxina do construto molecular.
[176] Em uma modalidade, o agente citotóxico e o ligante são selecionados a partir de quaisquer combinações daqueles descritos em WO 2016/067035 (os agentes citotóxicos e ligantes dos mesmos são aqui incorporados por referência).
[177] Em uma modalidade, o ligante entre o referido agente citotóxico e o referido peptídeo bicíclico compreende um ou mais resíduos de aminoácidos. Exemplos de resíduos de aminoácidos adequados como ligantes adequados incluem Ala, Cit, Lys, Trp e Val.
[178] Em uma modalidade, o agente citotóxico é selecionado a partir de MMAE e o referido conjugado de fármaco compreende adicionalmente um ligante selecionado a partir de: -PABC-CIit-Val- Glutaril- ou -PABC-ciclobutil-Ala-Cit-BAla-, em que PABC representa p- aminobenzilcarbamato. Detalhes completos do ligante contendo ciclobutila podem ser encontrados em Wei et al (2018) J. Med. Chem. 61, 989-1000. Em uma outra modalidade, o agente citotóxico é selecionado a partir de MMAE e o ligante é -PABC-CIit-Val-Glutaril-.
[179] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é DM1 e o referido conjugado de fármaco compreende adicionalmente um ligante que é -SPDB-(SO3H)-, em que SPDB representa N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato.
[180] Em uma modalidade, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BOCY7556 como definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val- Glutaril-- Este BDC é conhecido aqui como BCY7683. Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação à Nectina-4 humana para BCY7683 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também demonstrou boa atividade antitumoral no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 1.
[181] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY7814 conforme definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val-Glutaril-. Este BDC é aqui conhecido como BCY7825. Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação a Nectina-4 humana para BCY7825 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também demonstrou boa atividade antitumoral no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 1 e o modelo de câncer de bexiga conforme mostrado no Exemplo 2.
[182] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é DM1, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY7814 conforme definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de -SPDB- (SO3H)-. Este BDC é conhecido aqui como BCY7826. Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação à Nectina-4 humana para BCY7826 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também demonstrou boa atividade antitumoral no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 1.
[183] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8234 conforme definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val-Glutaril-. Este BDC é conhecido aqui como BCY8245 e é representado esquematicamente como: LEE Nº DANO oHYOo o | DU de ds é Tó Me A Fe nun 10 (SEQID) HN*o NWNO:168,
BCY8245 e também pode ser representado de forma mais detalhada como: GC) :
SE Go) o É 3. Os 3 (OD < do co
SOMO Q É É GQ
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G o ( DN + | ) eb
SN ã S + $ o > t Ds ox = [e FE Y &
O BCY8245
[184] Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação à Nectina-4 humana para BCY8245 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também demonstrou boa atividade antitumoral no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 1, o modelo de câncer de bexiga conforme mostrado no Exemplo 2, o modelo de câncer pancreático conforme mostrado no Exemplo 3 e o modelo de câncer de mama conforme mostrado no Exemplo 4.
[185] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8231 conforme definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val-Glutaril-. Este BDC é conhecido aqui como BCY8253. Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação a Nectina-4 humana para BCY8253 no ensaio de ligação a SPR, conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também demonstrou boa atividade antitumoral no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 1, o modelo de câncer de bexiga conforme mostrado no Exemplo 2, o modelo de câncer pancreático conforme mostrado no Exemplo 3 e o modelo de câncer de mama conforme mostrado no Exemplo 4.
[186] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8232 como definido aqui e o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val-Glutaril- . Este BDC é conhecido aqui como BCY8254. Dados são apresentados aqui que demonstram excelente ligação a Nectina-4 humana para BCY8254 no ensaio de ligação SPR conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também demonstrou boa atividade antitumoral no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 1 e o modelo de câncer de bexiga conforme mostrado no Exemplo 2.
[187] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é
MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8235 como aqui definido e o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val-Glutaril- . Este BDC é conhecido aqui como BCY8255. Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação a Nectina-4 humana para BCY8255 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também demonstrou boa atividade antitumoral no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 1, o modelo de câncer de bexiga conforme mostrado no Exemplo 2, o modelo de câncer pancreático conforme mostrado no Exemplo 3 e o modelo de câncer de mama conforme mostrado no Exemplo 4.
[188] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8234 conforme definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de -PABC-ciclobutil-(B-Ala)-. Este BDC é conhecido aqui como BCY8549. Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação a Nectina-4 humana para BCY8549 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4.
[189] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8831 como aqui definido, o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val-Glutaril- e o agente ligante-citotóxico está ligado ao peptídeo bicíclico no Posição Lys3. Este BDC é conhecido aqui como BCY8550. Dados são apresentados aqui, os quais demonstram excelente ligação à Nectina-4 humana para BCY8550 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4.
[190] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8269 conforme definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val-Glutaril-. Este BDC é conhecido aqui como BCY878 3.
Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação a Nectina-4 humana para BCY8783 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também regrediu tumores potentemente no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 5.
[191] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8273 conforme definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de -PABC-CIit-Val-Glutaril-. Este BDC é conhecido aqui como BCY8784. Dados são apresentados neste documento os quais demonstram excelente ligação a Nectina-4 humana para BCY8784 no ensaio de ligação a SPR conforme mostrado na Tabela 4. Este BDC também regrediu tumores potentemente no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas, conforme mostrado no Exemplo 5.
[192] Em uma outra modalidade, o conjugado de fármaco bicíclico é selecionado a partir de qualquer um de: BCY7683, BCY7825, BCY7826, BCY8245, BCY8253, BCY8254, BCY8255, BCYB8549, BCY8550, BCY8783 e BCY8784. Em uma outra modalidade, o conjugado de fármaco bicíclico é selecionado a partir de qualquer um de: BCY7683, BCY7825, BCY7826, BCY8245, BCY8253, BCY8254, BCY8255, BCY8783 e BCY8784. Em ainda outra modalidade, o conjugado de fármaco bicíclico é BCY8245. O conjugado de fármaco BCY8245 demonstrou atividade antitumoral dependente da dose superior, conforme demonstrado nos dados aqui descritos.
[193] Em uma modalidade, o conjugado de fármaco é diferente de BCY8245 e/ou BCY8549. Síntese
[194] Os peptídeos da presente invenção podem ser fabricados sinteticamente por técnicas padrão seguidas por reação com um arcabouço molecular in vitro. Quando isso é realizado, a química padrão pode ser usada. Isso permite a preparação rápida em grande escala de material solúvel para outros experimentos ou validação posteriores. Tais métodos podem ser realizados usando química convencional, como a divulgada em Timmerman et al (supra).
[195] Assim, a invenção também se refere à fabricação de polipeptídeos ou conjugados selecionados conforme estabelecido neste documento, em que a fabricação compreende outras etapas opcionais conforme explicado abaixo. Em uma modalidade, essas etapas são realizadas no produto final polipeptídeo/conjugado feito por síntese química.
[196] Opcionalmente, os resíduos de aminoácidos no polipeptídeo de interesse podem ser substituídos na fabricação de um conjugado ou complexo.
[197] Os peptídeos também podem ser estendidos, para incorporar, por exemplo, outro loop e, portanto, introduzir especificidades múltiplas.
[198] Para estender o peptídeo, ele pode simplesmente ser estendido quimicamente em seu N-terminal ou C-terminal ou dentro dos loops usando lisinas protegidas ortogonalmente (e análogos) usando fase sólida padrão ou química de fase de solução. Técnicas de (bio)conjugação padrão podem ser usadas para introduzir um N ou C- terminal ativado ou ativável. Alternativamente, as adições podem ser feitas por condensação de fragmentos ou ligação química nativa, por exemplo, como descrito em (Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266: 776-779), ou por enzimas, por exemplo usando subtiligase como descrito em (Chang et al. Proc Natl Acad Sci USA. 20 de dezembro de 1994; 91 (26): 12544-8 ou em Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Questão 22, 15 de novembro de 2008, Páginas 6000-6003).
[199] Alternativamente, os peptídeos podem ser estendidos ou modificados por conjugação adicional através de ligações dissulfeto. Isto tem a vantagem adicional de permitir que o primeiro e o segundo peptídeos se dissociem um do outro uma vez dentro do ambiente redutor da célula. Neste caso, o arcabouço molecular (por exemplo, TATA) poderia ser adicionado durante a síntese química do primeiro peptídeo de modo a reagir com os três grupos de cisteína; uma cisteína ou tiol adicional poderia então ser anexado ao N ou C-terminal do primeiro peptídeo, de modo que esta cisteína ou tiol apenas reagisse com uma cisteína ou tiol livre do segundo peptídeo, formando um peptídeo-peptídeo bicíclico ligado por dissulfeto conjugado.
[200] Técnicas — semelhantes se aplicam igualmente à síntese/acoplamento de dois macrociclos bicíclicos e biespecíficos, potencialmente criando uma molécula tetrasspeciífica.
[201] Além disso, a adição de outros grupos funcionais ou grupos efetores pode ser realizada da mesma maneira, usando química apropriada, acoplamento nos N ou C-terminais ou via cadeias laterais. Em uma modalidade, o acoplamento é conduzido de tal maneira que não bloqueia a atividade de qualquer entidade. Composições Farmacêuticas
[202] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um ligante peptídico ou um conjugado de fármaco como aqui definido em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[203] Geralmente, os presentes ligantes peptídicos serão utilizados na forma purificada juntamente com excipientes ou veículos farmacologicamente apropriados. Normalmente, estes excipientes ou veículos incluem soluções, emulsões ou suspensões aquosas ou alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e/ou meio tamponado. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e Ringer com lactato. Adjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessários para manter um complexo polipeptídico em suspensão, podem ser escolhidos entre espessantes, tais como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos.
[204] Os veículos intravenosos incluem reforçadores de fluidos e nutrientes e reforçadores de eletrólitos, como aqueles baseados na dextrose de Ringer. Conservantes e outros aditivos, tais como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes, também podem estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16º Edição).
[205] Os ligantes peptídicos da presente invenção podem ser usados como composições administradas separadamente ou em conjunto com outros agentes. Estes podem incluir anticorpos, fragmentos de anticorpos e vários fármacos imunoterapêuticos, tais como ciclosporinay metotrexato, adriamicina ou cisplatina e imunotoxinas. As composições farmacêuticas podem incluir "coquetéis" de vários agentes citotóxicos ou outros em conjunto com os ligantes de proteína da presente invenção, ou mesmo combinações de polipeptídeos selecionados de acordo com a presente invenção com diferentes especificidades, tais como polipeptídeos selecionados usando diferentes ligantes alvo, sejam ou não agrupados antes da administração.
[206] A via de administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser qualquer uma das comumente conhecidas pelos versados na técnica. Para terapia, os ligantes peptídicos da invenção podem ser administrados a qualquer paciente de acordo com técnicas padrão. A administração pode ser por qualquer modo apropriado, incluindo parenteral, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, transdérmico, por via pulmonar, ou também, apropriadamente, por infusão direta com um cateter. Preferivelmente,
as composições farmacêuticas de acordo com a invenção serão administradas por inalação. A dosagem e frequência de administração dependerão da idade, sexo e condição do paciente, administração concomitante de outros fármacos, contraindicações e outros parâmetros a serem levados em consideração pelo médico.
[207] Os ligantes peptídicos desta invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes do uso. Esta técnica demonstrou ser eficaz e técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na area podem ser empregues. Será apreciado por aqueles versados na técnica que a liofiização e reconstituição podem levar a vários graus de perda de atividade e que os níveis podem ter que ser ajustados para cima para compensar.
[208] As composições contendo os presentes ligantes peptídicos ou um coquetel destes podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em certas aplicações terapêuticas, uma quantidade adequada para realizar pelo menos a inibição parcial, supressão, modulação, morte ou algum outro parâmetro mensurável de uma população de células selecionadas é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades necessárias para atingir esta dosagem dependerão da gravidade da doença e do estado geral do próprio sistema imunológico do paciente, mas geralmente variam de 0,005 a 5,0 mg de ligante peptídico selecionado por quilograma de peso corporal, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais comumente usado. Para aplicações profiláticas, composições contendo os presentes ligantes peptídicos ou seus coquetéis também podem ser administradas em dosagens semelhantes ou ligeiramente inferiores.
[209] Uma composição contendo um ligante peptídico de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em configurações profiláticas e terapêuticas para auxiliar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de células alvo selecionada em um mamífero. Além disso, os ligantes peptídicos aqui descritos podem ser usados extracorporealmente ou in vitro seletivamente para matar, esgotar ou de outra forma remover efetivamente uma população de células alvo de uma coleção heterogênea de células. O sangue de um mamífero pode ser combinado extracorporealmente com os ligantes peptídicos selecionados, pelo que as células indesejadas são mortas ou removidas do sangue para retornar ao mamífero de acordo com técnicas padrão. Coadministração com Um ou Mais Outros Agentes Terapêuticos
[210] Dependendo da condição particular, ou doença, a ser tratada, agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar essa condição, podem também estar presentes nas composições desta invenção. Assim, em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um ou mais agentes terapêuticos. Tal como aqui utilizado, os agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar uma doença ou condição específica, são conhecidos como "apropriados para a doença ou condição a ser tratada".
[211] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratar uma doença ou condição divulgada compreendendo a administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um composto divulgado neste documento ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e coadministrar simultânea ou sequencialmente uma quantidade eficaz de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como aqueles aqui descritos. Em algumas modalidades, o método inclui a coadministração de um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o método inclui a coadministração de dois agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, a combinação do composto divulgado e o agente ou agentes terapêuticos adicionais atua sinergicamente.
[212] Um composto da presente invenção também pode ser usado em combinação com processos terapêuticos conhecidos, por exemplo, a administração de hormônios ou radiação. Em certas modalidades, um composto fornecido é usado como um radiossensibilizador, especialmente para o tratamento de tumores que apresentam baixa sensibilidade à radioterapia.
[213] Um composto da presente invenção pode ser administrado sozinho ou em combinação com um ou mais outros compostos terapêuticos, possível terapia de combinação tomando a forma de combinações fixas ou a administração de um composto da invenção e um ou mais outros compostos terapêuticos sendo escalonados ou dados independentemente um do outro, ou a administração combinada de combinações fixas e um ou mais outros compostos terapêuticos. Um composto da presente invenção pode, além ou adicionalmente, ser administrado especialmente para terapia de tumor em combinação com quimioterapia, radioterapia, imunoterapia, fototerapia, intervenção cirúrgica ou uma combinação destes. A terapia de longo prazo é igualmente possível, assim como a terapia adjuvante no contexto de outras estratégias de tratamento, conforme descrito acima. Outros tratamentos possíveis são a terapia para manter o estado do paciente após a regressão do tumor, ou mesmo a terapia quimiopreventiva, por exemplo em pacientes de risco.
[214] Um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser administrados separadamente de um composto ou composição da invenção, como parte de um regime de dosagem múltipla. Alternativamente, um ou mais outros agentes terapêuticos podem fazer parte de uma forma de dosagem única, misturados com um composto desta invenção em uma única composição. Se administrados como um regime de dosagem múltipla, um ou mais outros agentes terapêuticos e um composto ou composição da invenção podem ser administrados simultânea, sequencialmente ou dentro de um período de tempo um do outro, por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas um do outro. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos e um composto ou composição da invenção são administrados como um regime de dosagem múltipla com mais de 24 horas de intervalo.
[215] Tal como aqui utilizado, o termo "combinação", "combinado" e termos relacionados referem-se à administração simultânea ou sequencial de agentes terapêuticos de acordo com esta invenção. Por exemplo, um composto da presente invenção pode ser administrado com um ou mais outros agentes terapêuticos simultânea ou sequencialmente em formas de dosagem unitária separadas ou juntos em uma forma de dosagem unitária única. Consequentemente, a presente invenção fornece uma única forma de dosagem unitária compreendendo um composto da presente invenção, um ou mais outros agentes terapêuticos e um transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[216] A quantidade de um composto da invenção e um ou mais outros agentes terapêuticos (nas composições que compreendem um agente terapêutico adicional como descrito acima) que podem ser combinados com os materiais transportadores para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro tratado e o modo particular de administração. Preferivelmente, uma composição da invenção deve ser formulada de modo que uma dosagem entre 0,01 - 100 mg/kg de peso corporal/dia de um composto da invenção possa ser administrada.
[217] Nas composições que compreendem um ou mais outros agentes terapêuticos, o um ou mais outros agentes terapêuticos e um composto da invenção podem atuar sinergicamente. Portanto, a quantidade de um ou mais outros agentes terapêuticos em tais composições pode ser menor do que a necessária em uma monoterapia utilizando apenas aquele agente terapêutico. Em tais composições, pode ser administrada uma dosagem entre 0,01 - 1.000 em peso/kg de peso corporal/dia de um ou mais outros agentes terapêuticos.
[218] A quantidade de um ou mais outros agentes terapêuticos presentes nas composições desta invenção pode ser não mais do que a quantidade que seria normalmente administrada em uma composição compreendendo aquele agente terapêutico como o único agente ativo. Preferivelmente, a quantidade de um ou mais outros agentes terapêuticos nas composições presentemente divulgadas variará de cerca de 50% a 100% da quantidade normalmente presente em uma composição que compreende esse agente como o único agente terapeuticamente ativo. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são administrados em uma dosagem de cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90 %, ou cerca de 95% da quantidade normalmente administrada para esse agente. Tal como aqui utilizado, a frase "normalmente administrado" significa a quantidade de um agente terapêutico aprovado pela FDA fornecido para dosagem de acordo com a instrução da FDA.
[219] Os compostos desta invenção, ou composições farmacêuticas dos mesmos, também podem ser incorporados em composições para revestir um dispositivo médico implantável, como próteses, válvulas artificiais, enxertos vasculares, stents e cateteres. Stents vasculares, por exemplo, têm sido usados para superar a reestenose (estreitamento da parede do vaso após a lesão). No entanto, pacientes que usam stents ou outros dispositivos implantáveis correm o risco de formação de coágulos ou ativação de plaquetas. Estes efeitos indesejados podem ser evitados ou mitigados por pré-revestimento do dispositivo com uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um inibidor de quinase. Dispositivos implantáveis revestidos com um composto desta invenção são outra modalidade da presente invenção. Outros Agentes Terapêuticos Exemplares
[220] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor de poli ADP ribose polimerase (PARP). Em algumas modalidades, um inibidor de PARP é selecionado a partir de olaparib (LynparzaG, Astrazeneca); rucaparib (RubracaO, Clovis Oncology); niraparib (Zejula&, Tesaro); talazoparib (MDV3800/BMN 673/LTOO0673, —Medivation/Pfizer/Biomarin); veliparib (ABT-888, AbbvVie); e BGB-290 (BeiGene, Inc.).
[221] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um inibidor de histona desacetilase (HDAC). Em algumas modalidades, um inibidor de HDAC é selecionado a partir de vorinostat (ZolinzaO, Merck); romidepsina (IstodaxO, Celgene); panobinostat (FarydakO, Novartis); belinostat (BeleodagO, Spectrum Pharmaceuticals); entinostat (SNDX-275, Syndax Pharmaceuticals) (NCTOO0866333); e chidamida (Epidaza&, HBI-BOOO, Chipscreen Biosciences, China).
[222] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor de CDK, como um inibidor de CDK4/CDKG6. Em algumas modalidades, um inibidor de CDK 4/6 é selecionado a partir de palbociclib (IbranceG, Pfizer); ribociclib (Kisgalio, Novartis); abemaciclib (Ly2835219, Eli Lily; e trilacicib (G1T28, G1 Therapeutics).
[223] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um inibidor da fosfatidilinositol 3 quinase (PISK). Em algumas modalidades, um inibidor de PI3K é selecionado a partir de idelalisib (Zydeligê, Gilead), alpelisib (BYL719, Novartis), taselisib (GDC-0032, Genentech/Roche); pictilisib (GDC-0941,
Genentech/Roche); copanlisib" (BAY806946, Bayer); duvelisib (anteriormente 1IPI-145, Infinity Pharmaceuticals); PQR309 (Piqur Therapeutics, Suíça); e TGR1202 (anteriormente RP5230, TG Therapeutics).
[224] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um agente terapêutico à base de platina, também conhecido como platinas. As platinas causam ligações cruzadas de DNA, de modo que inibem o reparo e/ou síntese de DNA, principalmente em células de reprodução rápida, como as células cancerosas. Em algumas modalidades, um terapêutico à base de platina é selecionado a partir de cisplatina (PlatinolO, Bristol-Myers Squibb); carboplatina (ParaplatinO, Bristol-Myers Squibb; também, Teva; Pfizer); oxaliplatina (Eloxitin& Sanofi-Aventis); nedaplatina (Aqupla&, Shionogi), picoplatina (Poniard Pharmaceuticals); e satraplatina (JM-216, Agennix).
[225] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um composto de taxano, que causa a ruptura dos microtúbulos, que são essenciais para a divisão celular. Em algumas modalidades, um composto de taxano é selecionado a partir de paclitaxel (TaxolGO, Bristol-Myers Squibb), docetaxel (TaxotereG, Sanofi- Aventis; DocefrezO&O, Sun Pharmaceutical), paclitaxel ligado à albumina (Abraxane6; Abraxis/Celgene), cabazitaxel (JevtanaO, Sanofi-Aventis) e SID530 (SK Chemicals, Co.) (NCTO0931008).
[226] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor de nucleosídeos ou um agente terapêutico que interfere na síntese normal de DNA, síntese de proteínas, replicação celular ou, de outra forma, inibirá células em proliferação rápida.
[227] Em algumas modalidades, um inibidor de nucleosídeo é selecionado a partir de trabectedina (agente alquilante de guanidina, Yondelis&, Janssen Oncology), mecloretamina (agente alquilante,
ValchlorO&, Aktelion Pharmaceuticals); vincristina (OncovinO, Eli Lilly; VincasarO, Teva Pharmaceuticals; Margibo6, Talon Therapeutics); temozolomida (profármaco para agente alquilante 5-(3-metiltriazen-1-il)- imidazol-4-carboxamida (MTIC) Temodar&, Merck); injeção de citarabina (ara-C, análogo antimetabólico de citidina, Pfizer); lomustina (agente alquilante, CeeNUGO, Bristol-Myers Squibb; Gleostine€O, NextSource Biotechnology); azacitidina (análogo de nucleosídeo pirimidina de citidinay VidazaO, Celgene) mepesuccinato de omacetaxina (éster de cefalotaxina) (inibidor da síntese de proteínas, SynriboO6; Teva Pharmaceuticals); asparaginase Erwinia chrysanthemi (enzima para depleção de asparagina, ElsparO, Lundbeck; ErwinazeO, EUSA Pharma); mesilato de eribulina (inibidor de microtúbulos, antimitótico à base de tubulina, HalavenO, Eisai); cabazitaxel (inibidor de microtúbulos, antimitótico à base de tubulina, Jevtana€O, Sanofi- Aventis); capacetrina (inibidor de timidilato sintase, XelodaO, Genentech); bendamustina (derivado bifuncional de mecloretamina, que acredita-se formar ligações cruzadas entre cadeias de DNA, Treanda€&, Cephalon/Teva); ixabepilona (análogo semissintético de epotilona B, inibidor de microtúbulos, antimitótico à base de tubulina, IXempraO, Bristol-Myers Squibb); nelarabina (profármaco do análogo de desoxiguanosina, inibidor metabólico de nucleosídeo, Arranon€O, Novartis); clorafabina (profármaco do inibidor da ribonucleotídeo redutase, inibidor competitivo da desoxicitidina, Clolar&, Sanofi- Aventis); e trifluridina e tipiracil (análogo de nucleosídeo baseado em timidina e inibidor de timidina fosforilase, LonsurfO&, Taiho Oncology).
[228] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor da quinase ou antagonista de VEGF-R. Inibidores de VEGF e inibidores de quinase aprovados úteis na presente invenção incluem: bevacizumab (AvastinO, Genentech/Roche) um anticorpo monoclonal anti-VEGF; ramucirumab (Cyramza&, Eli Lilly),
um anticorpo anti-VEGFR-2 e ziv-aflibercept, também conhecido como VEGF Trap (Zaltrap&; Regeneron/Sanofi). Inibidores de VEGFR, tais como Fregorafenib (Stivarga0, Bayer); vandetanib (Caprelsa€O, AstraZeneca); axitinib (Inlyta&, Pfizer); e lenvatinib (LenvimaG, Eisai); Inibidores de Raf, como sorafenib (NexavarO, Bayer AG e Onyx); dabrafenib — (TafinlarO, Novartis; e vemurafenib (ZelborafO, Genentech/Roche); Inibidores de MEK, como cobimetanib (CotellicO, Exelexis/Genentech/Roche); trametinib (Mekinist&, Novartis); Inibidores da tirosina quinase Bcr-Abl, tais como imatinib (GleevecO, Novartis); nilotinib (TasignaO, Novartis); dasatinib (SprycelO, BristolMyersSquibb); bosutinib — (Bosulifo, Pfizer; e ponatinib (Inclusig&, Ariad Pharmaceuticals); Inibidores Her2 e EGFR, como gefitinib (Iressa&, Astrazeneca); erlotinib (Tarceeva6, Genentech/Roche/Astellas); lapatinib (TykerbO, Novartis); afatinib (GilotrifO, Boehringer Ingelheim); osimertinib (visando EGFR ativado, Tagrisso0, Astrazeneca); e brigatinib (Alunbrig&, Ariad Pharmaceuticals); inibidores de c-Met e VEGFR?2, tal como cabozanitib (CometrigO&, Exelexis); e inibidores de multiquinase, como sunitinib (Sutent&, Pfizer); pazopanib (VotrientO, Novartis); Inibidores de ALK, como crizotinib (XalkoriO&, Pfizer); ceritinib (ZykadiaO, Novartis); e alectinib (Alecenza6, Genentech/Roche); Inibidores da tirosina quinase de Bruton, tais como ibrutinib (Imbruvica&, Pharmacyclics/Janssen); e inibidores do receptor FIt3i, como midostaurina (RydaptO, Novartis).
[229] Outros inibidores de quinase e antagonistas de VEGF-R que estão em desenvolvimento e podem ser usados na presente invenção incluem: tivozanib (Aveo Pharmaecuticals); vatalanib (Bayer/Novartis); lucitanib (Clovis Oncology); dovitinib (TKI258, Novartis); Chiauanib (Chipscreen Biosciences); CEP-11981 (Cephalon); linifanib (Abbott Laboratories); neratinib (HKlI-272, Puma Biotechnology); radotinib (Supect&, IY5511, Il-Yang Pharmaceuticals, S. Coreia); ruxolitinib
(JakafiO, Incyte Corporation); PTC299 (PTC Therapeutics); CP-547.632 (Pfizer); foretinib (Exelexis, GlaxoSmithKline); quizartinib (Daiichi Sankyo) e motesanib (Amgen/Takeda).
[230] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor de MTOR, que inibe a proliferação celular, angiogênese e absorção de glicose. Em algumas modalidades, um inibidor de mMTOR é everolimus (Afinitor&, Novartis); temsirolimus (ToriselG, Pfizer); e sirolimus (RapamuneG, Pfizer).
[231] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um inibidor de proteassoma. Os inibidores de proteassoma aprovados úteis na presente invenção incluem bortezomib (Velcade&, Takeda); carfilzomib (KyprolisS, Amgen); e ixazomib (NinlaroO, Takeda).
[232] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um antagonista do fator de crescimento, como um antagonista do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) ou fator de crescimento epidérmico (EGF) ou seu receptor (EGFR). Antagonistas de PDGF aprovados que podem ser usados na presente invenção incluem olaratumab (Lartruvo&; Eli Lilly). Antagonistas de EGFR aprovados que podem ser usados na presente invenção incluem: cetuximab (ErbituxO, Eli Lilly); necitumumab (Portrazza€, Eli Lilly), panitumumab (Vectibix&, Amgen); e osimertinib (visando EGFR ativado, TagrissoO, AstraZeneca).
[233] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor de aromatase. Em algumas modalidades, um inibidor de aromatase é selecionado a partir de: exemestano (AromasinO, Pfizer); anastazol (ArimidexO, AstraZeneca) e letrozol (FemaraO, Novartis).
[234] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um antagonista da via hedgehog. Os inibidores da via de hedgehog aprovados que podem ser usados na presente invenção incluem: sonidegib (OdomzoG, Sun Pharmaceuticals); e vismodegib (Erivedge&, Genentech), ambos para tratamento do carcinoma basocelular.
[235] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um inibidor de ácido fólico. Inibidores de ácido fólico aprovados úteis na presente invenção incluem pemetrexed (Alimta&, Eli Lilly).
[236] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um inibidor do receptor 4 de quimiocina CC (CCR4). Os inibidores de CCR4 em estudo que podem ser úteis na presente invenção incluem mogamulizumab (PoteligeoO, Kyowa Hakko Kirin, Japan).
[237] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor da isocitrato desidrogenase (IDH). Os inibidores de IDH em estudo que podem ser usados na presente invenção incluem: AG120 (Celgene; NOCT02677922); AG221 (Celgene, NCTO02677922; NCTO2577406); BAY 1436032 (Bayer, NOTO2746081); IDH305 (Novartis, NCTO02987010).
[238] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor da arginase. Os inibidores de arginase sendo estudados que podem ser usados na presente invenção incluem: AEB1102 (arginase recombinante peguilada, Aeglea Biotherapeutics), que está sendo estudado em ensaios clínicos de Fase 1 para leucemia mieloide aguda e síndrome mielodisplásica (NCT02732184) e tumores sólidos (NCT02561234); e CB-1158 (Calithera Biosciences).
[239] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos é um inibidor da glutaminase. Os inibidores da glutaminase em estudo que podem ser usados na presente invenção incluem CB- 839 (Calithera Biosciences).
[240] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um anticorpo que se liga a antígenos tumorais, ou seja, proteínas expressas na superfície celular de células tumorais. Os anticorpos aprovados que se ligam a antígenos tumorais que podem ser usados na presente invenção incluem: rituximab (RituxanO, Genentech/Biogenldec); ofatumumab (anti-CD20, Arzerra€O, GlaxoSmithKline); obinutuzumab (anti-CD20, Gazyva€6, Genentech), ibritumomab —(anticCD20 e Yttrium-90, Zevalino, Spectrum Pharmaceuticals); daratumumab (anti-CD38, Darzalex6, Janssen Biotech), dinutuximab (anti-glicolíbpido GD2, Unituxino, United Therapeutics); trastuzumab (anti-HER2, Herceptin&, Genentech); ado- trastuzumab emtansina (anti-HER2, fundido com emtansina, Kadcyla&, Genentech); e pertuzumab (anti-HER2, Perjeta&, Genentech); e brentuximab vedotina (conjugado anti-CD30-fármaco, AdcetrisO, Seattle Genetics).
[241] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor da topoisomerase. Os inibidores da topoisomerase aprovados úteis na presente invenção incluem: irinotecano (OnivydeG, Merrimack Pharmaceuticals); topotecano (HycamtinO, GlaxoSmithKline). Os inibidores da topoisomerase em estudo que podem ser usados na presente invenção incluem pixantrona (Pixuvri&, CTI Biopharma).
[242] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um inibidor de proteínas antiapoptóticas, tal como BCL-2. Os antiapoptóticos aprovados que podem ser utilizados na presente invenção incluem: venetoclax (Venclexta&, AbbVie/Genentech); e blinatumomab (Blincyto€, Amgen). Outros agentes terapêuticos direcionados a proteínas apoptóticas que foram submetidas a testes clínicos e podem ser usados na presente invenção incluem navitoclax (ABT-263, Abbott), um inibidor de BCL-2 (NCT02079740).
[243] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente terapêutico é um inibidor do receptor de andrógeno. Os inibidores do receptor de andrógeno aprovados úteis na presente invenção incluem: enzalutamida (XtandiO, Astellas/Medivation); inibidores aprovados da síntese de andrógenos incluem abiraterona (Zytiga&, Centocor/Ortho); antagonista aprovado do receptor do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) (degaralix, FirmagonO, Ferring Pharmaceuticals).
[244] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um modulador seletivo do receptor de estrogênio (SERM), que interfere na síntese ou atividade dos estrogênios. SERMs aprovados úteis na presente invenção incluem raloxifeno (EvistaG, Eli Lilly).
[245] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor da reabsorção óssea. Um terapêutico aprovado que inibe a reabsorção óssea é o Denosumab (XgevaO, Amgen), um anticorpo que se liga ao RANKL, evita a ligação ao seu receptor RANK, encontrado na superfície dos osteoclastos, seus precursores e células gigantes semelhantes a osteoclastos, que medeiam a patologia óssea em tumores sólidos com metástases ósseas. Outras terapêuticas aprovadas que inibem a reabsorção óssea incluem bifosfonatos, como ácido zoledrônico (Zometa&O, Novartis).
[246] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor da interação entre as duas proteínas supressoras primárias p53, MDMX e MDM?. Os inibidores das proteínas supressoras p53 em estudo e que podem ser usados na presente invenção incluem ALRN-6924 (Aileron), um peptídeo grampeado que se liga equipotentemente e interrompe a interação de MDMX e MDM2 com p53. ALRN-6924 está sendo avaliado em ensaios clínicos para o tratamento de LMA, síndrome mielodisplásica avançada (SMD) e linfoma de células T periférico (PTCL) (NCT02909972; NCT02264613).
[247] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um inibidor do fator de crescimento de transformação beta (TGF-beta ou TGFB). Os inibidores das proteínas TGF-beta sendo estudados e que podem ser usados na presente invenção incluem NIS793 (Novartis) um anticorpo anti-TGF-beta sendo testado clinicamente para o tratamento de vários cânceres, incluindo câncer de mama, pulmão, hepatocelular, colorretal, pancreático, de próstata e renal (NCT 02947165). Em algumas modalidades, o inibidor de proteínas TGF-beta é fresolimumab (GC 1008; Sanofi-Genzyme), que está sendo estudado para melanoma (NCTO0923169); carcinoma de células renais (NOCTOO356460); e câncer de pulmão de células não pequenas (NCTO02581787). Além disso, em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é uma armadilha de TGF-beta, como descrito em Connolly et a/. (2012) Int'| J. Biological Sciences 8: 964-978. Um composto terapêutico atualmente em ensaios clínicos para o tratamento de tumores sólidos é M7824 (Merck KgaA - anteriormente MSBO0011459X), que é um composto armadilha de anti-PD-L1/TGFB biespecífico (NCT02699515); e (NCT02517398). M7824 é composto por um anticorpo IgG1 totalmente humano contra PD-L1 fundido ao domínio extracelular do receptor Il de TGF-beta humano, que funciona como uma "armadilha" de TGFB.
[248] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados a partir de glembatumumab vedotin- monometil —auristatihna E (MMAE) (Celldex) um anticorpo antiglicoproteína NMB (goNMB) (CRO011) ligado a MMAE citotóxico. gpNMB é uma proteína superexpressada por vários tipos de tumor associados à capacidade de metástase das células cancerosas.
[249] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um composto antiproliferativo. Esses compostos antiproliferativos incluem, mas não estão limitados a: inibidores da aromatase; antiestrogênios; inibidores da topoisomerase |; inibidores da topoisomerase ||; compostos ativos de microtúbulos; compostos alquilantes; inibidores da histona desacetilase; compostos que induzem processos de diferenciação celular; inibidores da ciclo-oxigenase; inibidores de MMP; inibidores de mTOR; antimetabólitos antineoplásicos; compostos de platina; compostos que têm como alvo/diminuem a atividade de uma proteína ou lipídio quinase e outros compostos antiangiogênicos; compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de uma proteína ou fosfatase lipídica; agonistas de gonadorelina; antiandrógenos; inibidores da metionina aminopeptidase; inibidores da matriz metaloproteinase; bisfosfonatos; modificadores da resposta biológica; anticorpos antiproliferativos; inibidores da heparanase; inibidores de isoformas oncogênicas Ras; inibidores da telomerase; inibidores de proteassoma; compostos usados no tratamento de doenças malignas hematológicas; compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de FIlt-3; Inibidores de Hsp90, tais como 17-AAG (17-alilaminogeldanamicina, NSC330507), 17-DMAG (17-dimetilaminoetilamino-17-desmetóxi-geldanamicina, NSC707545), IPI-504, CNF1010, CNF2024, CNF1010 da Conforma Therapeutics; temozolomida (TemodalO); inibidores da proteína do fuso da cinesina, tais como SB715992 ou SB743921 da GlaxoSmithKline, ou pentamidina/clorpromazina da CombinatoRx; inibidores de MEK, tais como ARRY142886 da Array BioPharma, AZd6244 da AstraZeneca, PD181461 da Pfizer e leucovorin.
[250] O termo "inibidor de aromatase", tal como aqui utilizado, refere-se a um composto que inibe a produção de estrogênio, por exemplo, a conversão dos substratos androstenediona e testosterona em estrona e estradiol, respectivamente. O termo inclui, mas não está limitado a esteroides, especialmente atamestano, exemestano e formestano e, em particular, não esteroides, especialmente aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano, testolactona, cetoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol e letrozol. O exemestano é comercializado com o nome comercial Aromasin'“. O Formestano é comercializado com o nome comercial Lentaron'“. O Fadrozol é comercializado com o nome comercial Afema'"“. O anastrozol é comercializado com o nome comercial Arimidex"". O letrozol é comercializado sob os nomes comerciais Femara"Y ou Femar"". À aminoglutetimida é comercializada sob o nome comercial Orimeten'TY. Uma combinação da invenção compreendendo um agente quimioterapêutico que é um inibidor da aromatase é particularmente útil para o tratamento de tumores positivos para receptores hormonais, tais como tumores da mama.
[251] O termo "antiestrogênio", conforme usado neste documento, refere-se a um composto que antagoniza o efeito dos estrogênios ao nível do receptor de estrogênio. O termo inclui, mas não está limitado a tamoxifeno, fulvestrant, raloxifeno e cloridrato de raloxifeno. O tamoxifeno é comercializado sob o nome comercial Nolvadex'". O cloridrato de raloxifeno é comercializado com o nome comercial Evista'"Y. Fulvestrant pode ser administrado com o nome comercial Faslodex'“. Uma combinação da invenção compreendendo um agente quimioterapêutico que é um antiestrogênio é particularmente útil para o tratamento de tumores positivos para receptor de estrogênio, tais como tumores de mama.
[252] O termo "antiandrógeno", conforme usado neste documento, refere-se a qualquer substância que é capaz de inibir os efeitos biológicos dos hormônios androgênicos e inclui, mas não está limitado a, bicalutamida (Casodex'“). O termo "agonista de gonadorelina" conforme usado neste documento inclui, mas não está limitado a abarelix, goserelina e acetato de goserelina. A goserelina pode ser administrada com o nome comercial Zoladex“.
[253] O termo "inibidor da topoisomerase |", conforme usado neste documento, inclui, mas não está limitado a topotecano, gimatecano, irinotecano, camptoteciano e seus análogos, 9-nitrocamptotecina e o conjugado — macromolecular de camptotecina PNU-166148. O irinotecano pode ser administrado, por exemplo, na forma como é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial Camptosar"Y. O topotecano é comercializado com o nome comercial HycamptinTY.
[254] O termo "inibidor da topoisomerase 1I", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado às antraciclinas, tais como doxorrubicina (incluindo formulação lipossomal, tal como Caelyx""Y), daunorrubicina, —epirrubicina, idarrubicina e nemorrubicina, as antraquinonas mitoxantrona e iosoxantrona, e as podofilotoxinas etoposídeo e teniposídeo. O etoposídeo é comercializado com o nome comercial Etopophos'Y. O teniposídeo é comercializado com o nome comercial VM 26-Bristol. A doxorrubicina é comercializada sob o nome comercial — Acriblastin'" ou Adriamycin'"”. A epirrubicina é comercializada com o nome comercial FarmorubicinTY. A idarrubicina é comercializada. sob o nome comercial Zavedos'Y. A mitoxantrona é comercializada sob o nome comercial Novantron.
[255] O termo "agente ativo de microtúbulos" refere-se a compostos de estabilização de microtúbulos, desestabilização de microtúbulos e inibidores de polimerização de microtublos incluindo, mas não se limitando a: taxanos, tais como paclitaxel e docetaxel; alcaloides de vinca, tais como vinblastina ou sulfato de vinblastina, vincristina ou sulfato de vincristina e vinorelbina; discodermolidas; cochicina e epotilonas e seus derivados. Paclitaxel é comercializado com o nome comercial Taxol'Y. O Docetaxel é comercializado com o nome comercial Taxotere'". O sulfato de vinblastina é comercializado sob o nome comercial Vinblastin RP'Y. O sulfato de vincristina é comercializado sob o nome comercial Farmistin'Y.
[256] O termo "agente alquilante" conforme usado neste documento inclui, mas não está limitado a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano ou nitrosoureia (BCNU ou Gliadel). A ciclofosfamida é comercializada com o nome comercial Ciclostin'Y. A ifosfamida é comercializada com o nome comercial Holoxan'Y.
[257] O termo "inibidores de histona desacetilase" ou "inibidores de HDAC" refere-se a compostos que inibem a histona desacetilase e que possuem atividade antiproliferativa. Isso inclui, mas não está limitado a, ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA).
[258] O termo "antimetabólito antineoplásico" inclui, mas não está limitado a, 5-fluorouracil ou 5-FU, capecitabina, gemcitabina, compostos desmetilantes de DNA, tais como B5-azacitidina e decitabina, metotrexato e edatrexato, e antagonistas do ácido fólico, como pemetrexed. Capecitabina é comercializada com o nome comercial Xeloda'Y". A gencitabina é comercializada com o nome comercial Gemzar'"“,
[259] O termo "composto de platina" conforme neste documento usado inclui, mas não está limitado a, carboplatina, cis-platina, cisplatina e oxaliplatina. A carboplatina pode ser administrada, por exemplo, na forma como é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial Carboplat'Y. A oxaliplatina pode ser administrada, por exemplo, na forma como é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial EloxatinTY.
[260] O termo "compostos direcionando/diminuindo a atividade de uma proteína ou lipídio quinase; ou uma atividade de proteína ou lipídio fosfatase; ou outros compostos antiangiogênicos", como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a, proteína tirosina quinase e/ou serina e/ou inibidores de treonina quinase ou inibidores de lipídio quinase, tais como: a) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade dos receptores de fator de crescimento derivados de plaquetas (PDGFR), tais como compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de PDGFR, especialmente compostos que inibem o receptor PDGF, tal como um derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, tal como imatinib, SU101, SU6668 e GFB-111; b) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade dos receptores do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR); c) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade do receptor | do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-IR), tais como compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de IGF-IR, especialmente compostos que inibem a atividade quinase do Receptor de IGF-l, ou anticorpos que direcionam o domínio extracelular do receptor IGF-| ou seus fatores de crescimento; d) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da família da tirosina quinase do receptor Trk ou inibidores da efrina B4; e) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da família da tirosina quinase do receptor Axl; f) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade do receptor tirosina quinase Ret; g) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da tirosina quinase do receptor Kit/SCFR, tal como imatinib; h) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade das tirosina quinases do receptor C-kit, que fazem parte da família PDGFR, tais como compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da família da tirosina quinase do receptor c-Kit, especialmente compostos que inibem o receptor c-Kit, como imatinib; i) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de membros da família c-Abl, seus produtos de fusão de genes (por exemplo, quinase BCR-Abl) e mutantes, tais como compostos que diminuem ou inibem a atividade de membros da família c-Abl e seus produtos de fusão gênica, como um derivado de N-fenil-2- pirimidina-amina, como imatinib ou nilotinib (AMN107); PD180970; AG957; NSC 680410; PD1 73955 de ParkeDavis; ou dasatinib (BMS-
354825); j) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de membros da família da proteína quinase C (PKC) e Raf das serina/treonina quinases, membros da família MEK, SRC, JAK/pan- JAK, FAK, PDK1, PKB/Akt, Ras/MAPK, PI3K, SYK, TYK2, BTKe TEC, e/ou membros da família quinase dependente de ciclina (CDK) incluindo derivados de estaurosporina, tais como midostaurina; exemplos de outros compostos incluem UCN-01, safingol, BAY 43-9006, Briostatina 1, Perifosina; Ilmofosina; RO 318220 e RO 320432; GO 6976; Isis 3521; LY333531/LY379196; compostos de isoquinolina; FTIs; PD184352 ou QAN697 (um inibidor de P13K) ou AT7519 (inibidor de CDK); k) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de inibidores de proteína-tirosina quinase, tais como compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de inibidores de proteína- tirosina quinase incluem mesilato de imatinib (GleevecTY) ou tirfostina, como Tirfostina A23/RG-50810; AG 99; Tirfostina AG 213; Tirfostina AG 1748; Tirfostina AG 490; Tirfostina B44; Enantiômero Tirfostina B44 (+); Tirfostina AG 555; AG 494; Tirfostina AG 556, AG957 e adafostina (adamantil éster de ácido 4-f[(2,5-di-hidroxifenil)metilJamino)-benzoico; NSC 680410, adafostina); |) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da família do fator de crescimento epidérmico das tirosina quinases receptoras (EGFR ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo- ou heterodímeros) e seus mutantes, tais como compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da família de receptor de fator de crescimento epidérmico são especialmente compostos, proteínas ou anticorpos que inibem membros da família de tirosina quinase de receptor de EGF, como receptor de EGF, ErbB2, ErbB3 e ErbB4 ou se ligam a EGF ou ligantes relacionados a EGF, CP 358774, ZD 1839, ZM 105180; trastuzumab (Herceptin'"), cetuximab (ErbituxTY), Iressa, Tarceva, OSI-774, CI-1033, EKB-569, GVW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E2.3 ou E7.6.3 e derivados de 7H-
pirrolo-[2,3-d]pirimidina; m) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade do receptor c-Met, tais como compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de c-Met, especialmente compostos que inibem a atividade quinase do receptor c-Met, ou anticorpos que direcionam o domínio extracelular de c-Met ou liga-se a HGF, n) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da quinase de um ou mais membros da família JAK (JAKI/JAK2/JAK3/TYK2 e/ou pan-JAK), incluindo, mas não limitado a PRT-062070, SB-1578, baricitinib, pacritinib, momelotinib, VX-509, AZD-1480, TG-101348, tofacitinib e ruxolitinib; 0) compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade quinase de PI3 quinase (PISK) incluindo, mas não se limitando a ATU-027, SF-1126, DS-7423, PBI-05204, GSK-2126458, ZSTK-474, buparlisib, pictrelisib, PF- 4691502, BYL-719, dactolisib, XL-147, XL-765 e idelalisib; e; e p) compostos que direcionam, diminuem ou inibem os efeitos de sinalização das vias da proteína hedgehog (Hh) ou do receptor suavizado (SMO), incluindo, mas não se limitando a ciclopamina, vismodegib, itraconazol, erismodegib e IPI-926 (saridegib).
[261] O termo "inibidor de PI3K", conforme usado neste documento, inclui, mas não está limitado a compostos com atividade inibidora contra uma ou mais enzimas da família da fosfatidilinositol-3- quinase, incluindo, mas não se limitando a PI3Ka, PI3Ky, PI3Kô, PISKB, PISK-C2a, PISK-C26, PISK-C2y, Vps34, p110-a, p110-B, p110-y, p110- õ, p85-a, p85-B, p55-y, p150, p101 e p87. Exemplos de inibidores de PI3K úteis nesta invenção incluem, mas não estão limitados a ATU-027, SF-1126, DS-7423, PBI-05204, GSK-2126458, ZSTK-474, buparlisib, pictrelisib, PF-4691502, BYL-719, dactolisib,y XL-147, XL-765 e idelalisib.
[262] O termo "inibidor de Becl-2", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a compostos com atividade inibidora contra a proteína do linfoma 2 de células B (Bcl-2), incluindo, mas não se limitando a ABT-199, ABT-731, ABT- 737, apogossipol, inibidores de pan-Bcl-2 da Ascenta, curcumina (e seus análogos), inibidores duplos Bcl-2/Bcl-xL (Infinity Pharmaceuticals/Novartis Pharmaceuticals), Genasense (G3139), HA14-1 (e seus análogos; vide WO 2008/118802), navitoclax (e seus análogos, vide US 7.390.799), NH-1 (Shenayng Pharmaceutical University), obatoclax (e seus análogos, vide WO 2004/106328), S-001 (Gloria Pharmaceuticals), compostos da série TW (Univ. De Michigan) e venetoclax. Em algumas modalidades, o inibidor de Bcl-2 é uma pequena molécula terapêutica. Em algumas modalidades, o inibidor de Bcl-2 é um peptídeomimético.
[263] O termo "inibidor de BTK", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a compostos com atividade inibidora contra a tirosina quinase de Bruton (BTK), incluindo, mas não se limitando a AVL-292 e ibrutinib.
[264] O termo "inibidor de SYK", conforme usado neste documento, inclui, mas não está limitado a compostos com atividade inibidora contra tirosina quinase do baço (SYK), incluindo, mas não se limitando a PRT-062070, R-343, R-333, Excellair, PRT-062607 e fostamatinib.
[265] Exemplos adicionais de compostos inibidores de BTK, e condições tratáveis por tais compostos em combinação com compostos desta invenção podem ser encontrados em WO 2008/039218 e WO 2011/090760, a totalidade dos quais são incorporados aqui por referência.
[266] Exemplos adicionais de compostos inibidores de SYK e condições tratáveis por tais compostos em combinação com compostos desta invenção podem ser encontrados em WO 2003/063794, WO 2005/007623 e WO 2006/078846, a totalidade dos quais é aqui incorporada por referência.
[267] Exemplos adicionais de compostos inibidores de PISK e condições tratáveis por tais compostos em combinação com compostos desta invenção podem ser encontrados em WO 2004/019973, WO 2004/089925, WO 2007/016176, US 8.138.347, WO 2002/088112, WO 2007/084786, WO 2007/129161, WO 2006/122806, WO 2005/113554 e WO 2007/044729, cuja totalidade dos quais é aqui incorporada por referência.
[268] Exemplos adicionais de compostos inibidores de JAK e condições tratáveis por tais compostos em combinação com compostos desta invenção podem ser encontrados em WO 2009/114512, WO 2008/109943, WO 2007/053452, WO 2000/142246 e WO 2007/070514, cuja totalidade é incorporada aqui por referência.
[269] Compostos antiangiogênicos adicionais incluem compostos com outro mecanismo para a sua atividade, por exemplo, não relacionado com a inibição da proteína ou da quinase lipídica, por exemplo, talidomida (ThalomidTY) e TNP-470.
[270] Exemplos de inibidores de proteassoma úteis para uso em combinação com compostos da invenção incluem, mas não estão limitados a bortezomib, dissulfiram, epigalocatequina-3-galato (EGCG), salinosporamida A, carfilzomib, ONX-0912, CEP-18770 e MLN9708.
[271] Compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de uma proteína ou fosfatase lipídica são, por exemplo, inibidores de fosfatase 1, fosfatase 2A ou CDC25, tais como ácido ocadaico ou um seu derivado.
[272] Compostos que induzem processos de diferenciação celular incluem, mas não estão limitados a, ácido retinoico, a- y- ou 5- tocoferol Ou a- y- ou ó-tocotrienol.
[273] O termo inibidor de ciclo-oxigenase, tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a, inibidores de Cox-2, ácido 2- arilaminofenilacético substituído por 5-alquila e derivados, tais como celecoxib (Celebrex'"Y), rofecoxib (VioxxTY), etoricoxib, valdecoxib ou um Ácido 5-alquil-2-arilaminofenilacético, tal como ácido 5-metil-2-(2"- cloro-6'-fluoroanilino) fenilacético e lumiracoxib.
[274] O termo "bisfosfonatos", conforme usado neste documento, inclui, mas não está limitado a, ácido etridônico, clodrônico, tiludrônico, pamidrônico, alendrônico, ibandrônico, risedrônico e zoledrônico. O ácido etridônico é comercializado sob o nome comercial Didronel"Y. O ácido clodrônico é comercializado com o nome comercial Bonefos"Y. O ácido tiludrônico é comercializado sob o nome comercial Skelid'Y. O ácido pamidrônico é comercializado sob o nome comercial Aredia"Y. O ácido alendrônico é comercializado com o nome comercial Fosamax'“Y. O ácido ibandrônico é comercializado sob o nome comercial Bondranat'“. O ácido risedrônico é comercializado com o nome comercial ActonelvY. O ácido zoledrônico é comercializado sob o nome comercial Zometa"". O termo "inibidores de mMTOR" refere-se a compostos que inibem o alvo mamífero da rapamicina (MTOR) e que possuem atividade antiproliferativa como sirolimus (RapamuneO), everolimus (CerticanTY), CCI-779 e ABT578.
[275] O termo "inibidor da heparanase", conforme usado neste documento, refere-se a compostos que direcionam, diminuem ou inibem a degradação do sulfato de heparina. O termo inclui, mas não está limitado a, PI-88. O termo "modificador de resposta biológica", conforme usado neste documento, refere-se a uma linfocina ou interferons.
[276] O termo "inibidor de isoformas oncogênicas de Ras", como H-Ras, K-Ras ou N-Ras, conforme neste documento usado, refere-se a compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade oncogênica de Ras; por exemplo, um "inibidor da farnesil transferase", como L- 744832, DK8G557 ou R115777 (Zarnestra""). O termo "inibidor da telomerase", conforme usado neste documento, refere-se a compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da telomerase. Os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da telomerase são especialmente compostos que inibem o receptor da telomerase, como a telomestatina.
[277] O termo "inibidor da metionina aminopeptidase", conforme usado neste documento, refere-se a compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da metionina aminopeptidase. Os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da metionina aminopeptidase incluem, mas não estão limitados a, bengamida ou um seu derivado.
[278] O termo "inibidor de proteassoma", conforme usado neste documento, refere-se a compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade do proteassoma. Os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade do proteassoma incluem, mas não estão limitados a, Bortezomib (Velcade"Y) e MLN 341.
[279] O termo "inibidor de matriz metaloproteinase" ou (inibidor de "MMP") como aqui utilizado inclui, mas não está limitado a, inibidores peptidomiméticos e não peptidomiméticos de colágeno, derivados de tetraciclina, por exemplo, inibidor de hidroxamato peptidomimético batimastat e seu análogo biodisponível oralmente marimastat (BB- 2516), prinomastat (AG3340), metastat (NSC 683551) BMS-279251, BAY 12 -9566, TAA211, MMI270B ou AAJ996.
[280] O termo "compostos usados no tratamento de doenças hematológicas", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a, inibidores de tirosina quinase tipo FMS, que são compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de receptores de tirosina quinase tipo FMS (FIt-3R); interferon, 1-B-D-arabinofuransilcitosina (ara- c) e bissulfano; e inibidores de ALK, que são compostos que direcionam, diminuem ou inibem a cinase de linfoma anaplásico.
[281] Compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de receptores de tirosina quinase tipo FMS (FIt-3R) são especialmente compostos, proteínas ou anticorpos que inibem membros da família de quinase receptor de FIt-3R, como PKC412, midostaurina, um derivado de estaurosporina, SU11248 e MLN518.
[282] O termo "inibidores de HSP90", como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a, compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade intrínseca de ATPase de HSP90; degradar, direcionar, diminuir ou inibir as proteínas cliente HSP90 através da via do proteossoma da ubiquitina. Os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade ATPase intrínseca de HSP90 são especialmente compostos, proteínas ou anticorpos que inibem a atividade ATPase de HSP90, tais como 17-alilamino, 17-desmetoxigeldanamicina (17AAG), um derivado de geldanamicina; outros compostos relacionados com a geldanamicina; inibidores de radicicol e HDAC.
[283] O termo "anticorpos antiproliferativos", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a, trastuzumab (Herceptin'Y), trastuzumab-DM1, erbitux, bevacizumab (Avastin'"), rituximab (Rituxan&O), PRO64553 (anti-CD40) e anticorpo 2C4. Por anticorpos entende-se anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos formados a partir de pelo menos 2 anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos desde que exibam a atividade biológica desejada.
[284] Para o tratamento de leucemia mieloide aguda (AML), os compostos da presente invenção podem ser usados em combinação com terapias padrão de leucemia, especialmente em combinação com terapias usadas para o tratamento de AML. Em particular, os compostos da presente invenção podem ser administrados em combinação com, por exemplo, inibidores de farnesil transferase e/ou outras fármacos úteis para o tratamento de AML, tais como Daunorrubicina, Adriamicina, Ara-C, VP-16, Teniposídeo, Mitoxantrona, Idarrubicina, Carboplatina e PKC412.
[285] Outros compostos antileucêmicos incluem, por exemplo, Ara-C, um análogo da pirimidina, que é o derivado 2'-alfa-hidroxirribose (arabinosídeo) da desoxicitidina. Também está incluído o análogo de purina de hipoxantina, 6-mercaptopurina (6-MP) e fosfato de fludarabina. Os compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade dos inibidores da histona desacetilase (HDAC), como o butirato de sódio e o ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA), inibem a atividade das enzimas conhecidas como histona desacetilases. Inibidores de HDAC específicos incluem MS275, SAHA, FK228 (anteriormente FR901228), Tricostatina A e compostos divulgados em US 6.552.065 incluindo, mas não se limitando a, N-hidróxi-3-[4-[[[[2-(2- metil-1H-indol-3-il)-etil]--amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, ou um sal farmaceuticamente — aceitável! do mesmo e N-hidróxi-3-[4-[(2- hidroxietil)(2-(1H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]|-2E-2-propenamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, especialmente o sal de lactato. Os antagonistas do receptor da somatostatina, como aqui utilizados, referem-se a compostos que têm como alvo, tratam ou inibem o receptor da somatostatina, tal como octreotido e SOM230. As abordagens que danificam as células tumorais referem-se a abordagens como a radiação ionizante. O termo "radiação ionizante" referido acima e daqui em diante significa radiação ionizante que ocorre como raios eletromagnéticos (como raios X e raios gama) ou partículas (como partículas alfa e beta). A radiação ionizante é fornecida, mas não se limita a, terapia de radiação e é conhecida na técnica. Vide Hellman, Principles of Radiation Therapy, Cancer, em Principles and Practice of Oncology, Devita et a/l., Eds., 4º Edição, Vol. 1, pp. 248-275 (1993).
[286] Também incluídos estão os aglutinantes de EDG e os inibidores da ribonucleotídeo redutase. O termo "aglutinantes de EDG", tal como aqui utilizado, refere-se a uma classe de imunossupressores que modula a recirculação de linfócitos, como FTY720. O termo
"inibidores de ribonucleotídeo redutase" refere-se a pirimidina ou análogos de nucleosídeo de purina incluindo, mas não se limitando a, fludarabina e/ou citosina arabinosídeo (ara-C), 6-tioguanina, 5- fluorouracil, — cladribina, — 6-mercaptopurina — (especialmente — em combinação com ara-C contra ALL) e/ou pentostatina. Os inibidores da ribonucleotídeo redutase são especialmente derivados de hidroxiureia ou 2-hidróxi-1H-isoindol-1,3-diona.
[287] Também estão incluídos, em particular, aqueles compostos, proteínas ou anticorpos monoclonais de VEGF, tais como: 1-(4- cloroanilino)-4-(4-piridilmetil) ftalazina ou um sal farmaceuticamente aceitávelAÀ do — mesmo, succinato de 1-(4-cloroanilino)-4-(4- piridilmetil)ftalazina; Angiostatin'v; Endostatin'Y; amidas de ácido antranílico; ZD4190; Zds474; SU5416; SU6668; bevacizumab; ou anticorpos anti-VEGF ou anticorpos receptores de anti-VEGF, como rhuMAb e RHUFab, aptâmero de VEGF, como Macugon; inibidores de FLT-A, inibidores de FLT-3, anticorpo VEGFR-2 IgGlI, Angiozima (RPI 4610) e Bevacizumab (AvastinTY).
[288] A terapia fotodinâmica, conforme usada neste documento, refere-se à terapia que usa certos produtos químicos conhecidos como compostos fotossensibilizadores para tratar ou prevenir cânceres. Exemplos de terapia fotodinâmica incluem o tratamento com compostos, como Visudyne'"Y e porfímero de sódio.
[289] Os esteroides angiostáticos, como aqui utilizados, referem- se a compostos que bloqueiam ou inibem a angiogênese, tais como, por exemplo, anecortave, triancinolona, hidrocortisona, 11-a- epihidrocotisol, cortexolona, 17a-hidroxiprogesterona, corticosterona, desoxicorticosterona, testosterona, estrona e dexametasterona.
[290] Implantes — contendo corticosteroides referem-se a compostos, como fluocinolona e dexametasona.
[291] Outros compostos quimioterapêuticos incluem, mas não estão limitados a: alcaloides vegetais, compostos hormonais e antagonistas; modificadores da resposta biológica, preferivelmente linfocinas ou interferons; oligonucleotídeos antissentido ou derivados de oligonucleotídeos; ShnRNA ou siRNA; ou compostos diversos ou compostos com outro mecanismo de ação ou desconhecido.
[292] A estrutura dos compostos ativos identificados por números de código, nomes genéricos ou comerciais pode ser obtida da edição real do compêndio padrão "The Merck Index" ou de bancos de dados, por exemplo, Patents International (por exemplo, IMS World Publications). Agentes de Imuno-oncologia Exemplares
[293] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são um agente imuno-oncológico. Conforme usado neste documento, o termo "um agente imuno-oncológico" se refere a um agente que é eficaz para aumentar, estimular e/ou regular as respostas imunes em um objeto. Em algumas modalidades, a administração de um agente imuno-oncológico com um composto da invenção tem um efeito sinérgico no tratamento de um câncer.
[294] Um agente imuno-oncológico pode ser, por exemplo, um fármaco de molécula pequena, um anticorpo ou uma molécula biológica ou pequena. Exemplos de agentes biológicos imuno-oncológicos incluem, mas não estão limitados a, vacinas contra o câncer, anticorpos e citocinas. Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal é humanizado ou humano.
[295] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é (i) um agonista de um receptor estimulador (incluindo um coestimulador) ou (ii) um antagonista de um sinal inibitório (incluindo um co-inibitório) nas células T, ambos os quais resultam na amplificação de respostas de células T específicas de antígeno.
[296] Algumas das moléculas estimuladoras e inibidoras são membros da superfamília das imunoglobulinas (I9SF). Uma família importante de ligantes ligados à membrana que se ligam a receptores coestimuladores ou coinibidores é a família B7, que inclui B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) e B7-H6. Outra família de ligantes ligados à membrana que se ligam a receptores coestimuladores ou coinibidores é a família de moléculas TNF que se ligam a membros da família de receptores cognatos TNF, que inclui CD40 e CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137 (4-1BB), TRAIL/Apo2-L, TRAILR1I/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTBR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TLIA, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Linfotoxina a/TNFB, TNFR?2, TNFa, LTBR, Linfotoxina a1, FASL, RELT, DR6, TROY e NGFR.
[297] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é uma citocina que inibe a ativação de células T (por exemplo, IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF e outras citocinas imunossupressoras) ou uma citocina que estimula a ativação de células T, para estimular uma resposta imune.
[298] Em algumas modalidades, uma combinação de um composto da invenção e um agente imuno-oncológico pode estimular respostas de células T. Em algumas modalidades, um agente imuno- oncológico é: (i) um antagonista de uma proteína que inibe a ativação de células T (por exemplo, inibidores de ponto de verificação imunológico), como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPRS56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 e TIM-4; ou (ii) um agonista de uma proteína que estimula a ativação de células T, como B7-1, B7-2, CD28,4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40,
OXA40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 e CD28H.
[299] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista de receptores inibitórios em células NK ou um agonista de receptores ativadores em células NK. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista de KIR, como lirilumab.
[300] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um agente que inibe ou esgota macrófagos ou monócitos, incluindo, mas não se limitando a antagonistas de CSF-1R, como anticorpos antagonistas de CSF-1R, incluindo RG7155 (WO 2011/70024, WO 2011/107553, WO 2011/131407, WO 2013/87699, WO 2013/119716, WO 2013/132044) ou FPA-008 (WO 2011/140249; WO 2013/169264; WO 2014/036357).
[301] Em algumas modalidades, um imuno-oncolo o agente gy é selecionado a partir de agentes agonísticos que ligam receptores coestimuladores positivos, agentes de bloqueio que atenuam a sinalização através de receptores inibitórios, antagonistas e um ou mais agentes que aumentam sistemicamente a frequência de células T antitumorais, agentes que superam vias imunossupressoras distintas dentro do microambiente tumoral (por exemplo, bloquear o envolvimento do receptor inibitório (por exemplo, interações PD-L1/PD- 1), esgotar ou inibir Tregs (por exemplo, usando um anticorpo monoclonal anti-CD25 (por exemplo, daclizumab) ou por depleção de grânulos anti-CD25 ex vivo), inibem enzimas metabólicas, como IDO, ou reverter/prevenir a energia ou exaustão das células T) e agentes que desencadeiam a ativação imune inata e/ou inflamação em locais de tumor.
[302] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista de CTLA-4. Em algumas modalidades, um antagonista de CTLA-4 é um anticorpo antagonista de CTLA-4. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista CTLA-4 é YERVOY
(ipilimumab) ou tremelimumab.
[303] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista de PD-1. Em algumas modalidades, um antagonista PD- 1 é administrado por infusão. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a um receptor de morte programada-1 (PD-1) e inibe a atividade de PD-1. Em algumas modalidades, um antagonista de PD-1 é um anticorpo PD-1 antagonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo PD-1 antagonístico é OPDIVO (nivolumab), KEYTRUDA (pembrolizumab) ou MEDI-0680 (AMP-514; WO 2012/145493). Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico pode ser pidilizumab (CT-011). Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é uma proteína recombinante composta do domínio extracelular de PD-L2 (B7-DC) fundido à porção Fc de IgG1, chamada AMP-224.
[304] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista de PD-L1. Em algumas modalidades, um antagonista de PD-L1 é um anticorpo PD-L1 antagonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo PD-L1 é MPDL3280A (RG7446; WO 2010/077634), — durvalumab — (MEDI4736) BMS-936559 (WO 2007/005874) e MSBO010718C (WO 2013/79174).
[305] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista de LAG-3. Em algumas modalidades, um antagonista de LAG-3 é um anticorpo LAG-3 antagonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo LAG3 é BMS-986016 (WO 2010/19570, WO 2014/08218), ou IMP-731 ou IMP-321 (WO 2008/132601, WO 2009/44273).
[306] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um agonista de CD137 (4-1BB). Em algumas modalidades, um agonista CD137 (4-1BB) é um anticorpo CD137 agonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo CD137 é urelumab ou PF-05082566 (WO 2012/32433).
[307] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um agonista de GITR. Em algumas modalidades, um agonista de GITR é um anticorpo GITR agonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo GITR é BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO 2006/105021, WO 2009/009116) ou MK-4166 (WO 2011/028683).
[308] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista de indolamina (2,3)-dioxigenase (IDO). Em algumas modalidades, um antagonista de IDO é selecionado a partir de: epacadostat (INCB024360, Incyte); indoximod (NLG-8189, NewLink Genetics Corporation); capmanitib (INC280, Novartis); GDC-0919 (Genentech/Roche); PF-O6840003 (Pfizer); BMS:FO01287 (Bristol- Myers Squibb); Phy906/KD108 (Phytoceutica); uma enzima que quebra a quinurenina (Kynase, Kyn Therapeutics); e NLG-919 (WO 2009/73620, WO 2009/1156652, WO 2011/56652, WO 2012/142237).
[309] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um agonista OX40. Em algumas modalidades, um agonista OX40 é um anticorpo OX40 agonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo OX40 é MEDI-6383 ou MEDI-6469.
[310] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista OX40L. Em algumas modalidades, um antagonista de OXA40L é um anticorpo OX40 antagonístico. Em algumas modalidades, um antagonista de OX40L é RG-7888 (WO 2006/029879).
[8311] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um agonista de CD40. Em algumas modalidades, um agonista de CD40 é um anticorpo CD40 agonístico. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um antagonista de CD40. Em algumas modalidades, um antagonista de CD40 é um anticorpo CD40 antagonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo CD40 é lucatumumab ou dacetuzumab.
[312] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um agonista de CD27. Em algumas modalidades, um agonista de CD27 é um anticorpo CD27 agonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo CD27 é varlilumab.
[313] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é MGAZ271 (para B7H3) (WO 2011/109400).
[314] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, anatumomab .mafenatox, apolizumab, atezolimab, avelumab, blinatumomab, BMS-936559, catumaxomab, durvalumab, epacadostat, epratuzumab, indoximod, inotuzumab ozogamicin, intelumumab, ipilimumab, isatuximab, lambrolizumab, MED14736, MPDL3280A, nivolumab, obinutuzumab, ocaratuzumab, ofatumumab, olatatumab, pembrolizumab, pidilizumab, rituximab, ticiimumab, samalizumab, or tremelimumab.
[315] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um imunossupressor agente imunoestimulatório. Por exemplo, os anticorpos que bloqueiam o eixo inibitório de PD-1 e PD-L1 podem desencadear células T reativas ao tumor ativadas e foram mostrados em ensaios clínicos para induzir respostas antitumorais duráveis em um número crescente de histologias tumorais, incluindo alguns tipos de tumor que convencionalmente não foram considerados sensíveis à imunoterapia. Vide, por exemplo, Okazaki, T. et al. (2013) Nat. Immunol. 14, 1212-1218; Zou et al. (2016) Sci. Transl. Med. 8. O anticorpo anti- PD-1 nivolumab (Opdivo&, Bristol-Myers Squibb, também conhecido como ONO-4538, MDX1106 e BMS-936558) demonstrou potencial para melhorar a sobrevida geral em pacientes com carcinoma renal de células claras (RCC) que experimentaram progressão da doença durante ou após a terapia antiangiogênica anterior.
[316] Em algumas modalidades, a terapêutica imunomoduladora induz especificamente a apoptose de células tumorais. As terapêuticas imunomoduladoras aprovadas que podem ser utilizadas na presente invenção incluem: pomalidomida (Pomalyst&, Celgene); lenalidomida (RevlimidO, Celgene); mebutato de ingenol (Picato&, LEO Pharma).
[317] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é uma vacina contra o câncer. Em algumas modalidades, a vacina contra o câncer é selecionada a partir de: sipuleucel-T (Provenge&O, Dendreon/Valeant Pharmaceuticals), que foi aprovado para o tratamento de câncer de próstata assintomático ou resistente à castração — metastático — minimamente * sintomático (refratário a hormônios); e talimogene laherparepvec (Imlygic&, BioVex/Amgen, anteriormente conhecido como T-VEC), uma terapia viral oncolítica geneticamente modificada aprovada para o tratamento de lesões cutâneas, subcutâneas e nodais irressecáveis em melanoma. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é selecionado a partir de uma terapia viral oncolítica, como pexastimogene devacirepvec (PexaVec/JX-594, SillaJen/anteriormente Jennerex Biotherapeutics), um vírus vaccinia deficiente em timidina quinase-(TK-), desenvolvido para “expressar GM-CSF, para carcinoma hepatocelular (NCTO02562755) e melanoma (NCTO00429312); pelareorep (ReolysinO, Oncolytics Biotech), uma variante do vírus entérico órfão respiratório (reovírus) que não se replica em células que não são ativadas por RAS, em vários cânceres, incluindo câncer colorretal (NCT01622543); câncer de próstata (NCT01619813); câncer de células escamosas de cabeça e pescoço (NCTO01166542); adenocarcinoma pancreático (NCTO00998322); e câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) (NCT 00861627); enadenotucirev (NG-348, PsiOxus, anteriormente conhecido como ColoAd1), um adenovírus construído geneticamente para expressar um CD80 de comprimento completo e um fragmento de anticorpo específico para a proteína CD3 do receptor de células T, no câncer de ovário (NCT02028117); tumores metastáticos ou epiteliais avançados, tais como em câncer colorretal, câncer de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e câncer de glândula salivar (NCT02636036); ONCOS-102 (Targovax/anteriormente Oncos), um adenovírus construído geneticamente para expressar GM- CSF, em melanoma (NCTO3003676); e doença peritoneal, câncer colorretal ou câncer de ovário (NCT02963831); GL-ONC1 (GLV- 1h68/GLV-1h153, Genelux GmbH), vírus vaccinia construído geneticamente para expressar beta-galactosidase (beta-gal)/beta- glucoronidase ou beta-gal/simportador de iodeto de sódio humano (ANIS), respectivamente, foram estudados na carcinomatose peritoneal (NCTO01443260); câncer das trompas de Falópio, câncer do ovário (NCT 02759588); ou CG0070 (Cold Genesys), um adenovírus construído geneticamente para expressar GM-CSF, no câncer de bexiga (NCT02365818).
[318] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é selecionado a partir de: JX-929 (SillaJen/anteriormente Jennerex Biotherapeutics), um vírus vaccinia deficiente em fator de crescimento de vaccinia e TK construído geneticamente para expressar citosina desaminase, que é capaz de converter o profármaco 5-fluorocitosina na fármaco citotóxica 5-fluorouracil; TGO01 e TGO02 (Targovax/anteriormente Oncos), agentes de imunoterapia à base de peptídeos direcionados para mutações RAS de difícil tratamento; e TILT-123 (TILT Biotherapeutics), um adenovírus construído geneticamente designado: Ad5/3-E2F-delta24-hTNFa-IRES-hlIL20; e VSV-GP (ViraTherapeutics) um vírus de estomatite vesicular (VSV) construído geneticamente para expressar a glicoproteína (GP) do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), que pode ser adicionalmente construído geneticamente para expressar antígenos construído projetados para aumentar uma resposta de células T CD8+ específicas de antígeno.
[319] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é uma célula T projetada para expressar um receptor de antígeno quimérico, ou CAR. As células T projetadas para expressar tal receptor de antígeno quimérico são referidas como células CAR-T.
[320] CARs foram construídos os quais consistem em domínios de ligação, que podem ser derivados de ligantes naturais, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) derivados de anticorpos monoclonais específicos para antígenos de superfície celular, fundidos a endodomínios que são a extremidade funcional do receptor de células T (TOR), como o domínio de sinalização CD3-zeta dos TCRs, que é capaz de gerar um sinal de ativação em linfócitos T. Após a ligação a antígeno, tais CARs se ligam às vias de sinalização endógena na célula efetora e geram sinais de ativação semelhantes aos iniciados pelo complexo TCR.
[321] Por exemplo, em algumas modalidades, a célula CAR-T é uma das descritas na Patente US 8.906.682 (incorporada neste documento por referência em sua totalidade), que divulga células CAR- T construídas geneticamente para compreender um domínio extracelular com um domínio de ligação a antígeno (como um domínio que se liga a CD19), fundido a um domínio de sinalização intracelular da cadeia zeta do complexo receptor de antígeno de células T (como CD3 zeta). Quando expresso na célula T, o CAR é capaz de redirecionar o reconhecimento do antígeno com base na especificidade de ligação a antígeno. No caso de CD19, o antígeno é expresso nas células B malignas. Mais de 200 ensaios clínicos estão em andamento empregando CAR-T em uma ampla gama de indicações. [https://clinicaltrials.gov/ct2/resultados?term=chimeric+antigen+recepto rs&pg=1]
[322] Em algumas modalidades, um agente imunoestimulador é um ativador do receptor órfão relacionado ao receptor de ácido retinoico y (RORyt). RORYt é um fator de transcrição com papéis chave na diferenciação e manutenção de subconjuntos efetores Tipo 17 de células T CD4+ (Th17) e CD8+ (Tc17), bem como na diferenciação de IL-17 que expressa subpopulações de células imunes inatas, como células NK. Em algumas modalidades, um ativador de RORyt é LYC- 55716 (Lycera), que atualmente está sendo avaliado em ensaios clínicos para o tratamento de tumores sólidos (NCT02929862).
[323] Em algumas modalidades, um agente imunoestimulador é um agonista ou ativador de um receptor tipo toll (TLR). Ativadores adequados de TLRs incluem um agonista ou ativador de TLR9, como SD-101 (Dynavax). SD-101 é um CpG imunoestimulador que está sendo estudado para linfomas de células B, foliculares e outros (NCT02254772). Agonistas ou ativadores de TLR8 que podem ser usados na presente invenção incluem motolimod (VTX-2337, VentiRx Pharmaceuticals) que está sendo estudado para câncer de células escamosas de cabeça e pescoço (NCT02124850) e câncer de ovário (NCTO02431559).
[324] Outros agentes imuno-oncológicos que podem ser usados na presente invenção incluem: urelumab (BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), um anticorpo monoclonal anti-CD137; varlilumab (CDX-1127, Celldex Therapeutics), um anticorpo monoclonal anti-CD27; BMS- 986178 (Bristol-Myers Squibb), um anticorpo monocional anti-OX40; lirlumab (IPH2102/BMS-986015, Innate Pharma, Bristol-Myers Squibb), um anticorpo monocional anti-KIR; monalizumab (IPH2201, Innate Pharma, AstraZzeneca) um anticorpo monoclonal anti-NKG2A; andecaliximab (GS-5745, Gilead Sciences), um anticorpo anti-MMP9; e MK-4166 (Merck & Co.), um anticorpo monoclonal anti-GITR.
[325] Em algumas modalidades, um agente imunoestimulador é selecionado a partir de elotuzumab, mifamurtida, um agonista ou ativador de um receptor do tipo toll e um ativador de RORyt.
[326] Em algumas modalidades, uma terapêutica imunoestimulatória é interleucina 15 humana recombinante (rhlL-15). rhlL-15 foi testada clinicamente como uma terapia para melanoma e carcinoma de células renais (NCTO01021059 e NCTO01369888) e leucemias (NCT02689453). Em algumas modalidades, um agente imunoestimulador é a interleucina 12 humana recombinante (rhlL-12). Em algumas modalidades, um imunoterapêutico à base de I|L-15 é IL- heterodimérico (hetlL-15, Novartis/Admune), um complexo de fusão composto por uma forma sintética de IL-15 endógena complexada com a proteína de ligação IL-15 solúvel IL-15 cadeia alfa do receptor (IL15: SIL-15RA), que foi testado em ensaios clínicos de Fase 1 para melanoma, carcinoma de células renais, câncer de pulmão de células não pequenas e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (NCTO02452268). Em algumas modalidades, uma interleucina humana recombinante 12 (rhil-12) é NM-IL-12 (Neumedicines, lnc.), NCTO02544724 ou NOCTO02542124.
[327] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é selecionado daqueles descritos em Jerry L. Adams et al., "Big opportunities for small molecules em immuno-oncology," Cancer Therapy 2015, Vol. 14, páginas 603-622, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é selecionado a partir dos exemplos descritos na Tabela 1 de Jerry L. Adams et al. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é uma pequena molécula direcionada a um alvo de imuno-oncologia selecionado a paritr daqueles listados na Tabela 2 de Jerry L. Adams et al. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um agente de molécula pequena selecionado a partir daqueles listados na Tabela 2 de Jerry L. Adams et al.
[328] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é selecionado a partir dos agentes imuno-oncológicos de molécula pequena descritos em Peter L. Toogood, "Small molecule immuno- oncologyapeutic agents", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2018, Vol. 28, páginas 319-329, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um agente direcionado às vias conforme descrito em Peter L. Toogood.
[329] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é selecionado daqueles descritos em Sandra L. Ross et al., "Bispecific T cell engager (BITEG) antibody constructs can mediate bystander tumor cell killing”, PLoOS ONE 12(8): e0183390), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um construto de anticorpo engajador de células T biespecíficas (BITEG) Em algumas modalidades, um construto de anticorpo biespecífico engajador de células T (BITEG) é um construto de anticorpo biespecífico CD19/CD3. Em algumas modalidades, um construto de anticorpo biespecífico de células T (BITEG) é um construto de anticorpo biespecífico EGFR/CD3. Em algumas modalidades, um construto de anticorpo engajador de células T biespecíficas (BITEG) ativa as células T. Em algumas modalidades, um construto de anticorpo engajador de células T biespecíficas (BITEG) ativa células T, que liberam citocinas que induzem a regulação positiva da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e FAS em células espectadoras. Em algumas modalidades, um construto de anticorpo engajador de células T biespecíficas (BITEG) ativa células T que resultam em lise de células espectadoras induzidas. Em algumas modalidades, as células espectadoras estão em tumores sólidos. Em algumas modalidades, as células espectadoras sendo lisadas estão na proximidade das células T ativadas por BITEGO. Em algumas modalidades, as células espectadoras compreendem células cancerosas negativas para antígeno associado a tumor (TAA). Em algumas modalidades, as células espectadoras compreendem células cancerosas negativas para EGFR. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um anticorpo que bloqueia o eixo PD- L1/PD1 e/ou CTLA4. Em algumas modalidades, um agente imuno- oncológico é uma célula T infiltrante de tumor expandida ex vivo. Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um construto de anticorpo biespecífico ou receptores de antígenos quiméricos (CARs) que conectam diretamente as células T com antígenos de superfície associados a tumor (TAAs). Inibidores de Ponto de Verificação Imunológico Exemplares
[330] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um inibidor de ponto de verificação imune, conforme descrito neste documento.
[331] O termo "inibidor de ponto de verificação", tal como aqui utilizado, refere-se a agentes úteis na prevenção de células cancerosas de evitar o sistema imunológico do paciente. Um dos principais mecanismos de subversão da imunidade antitumoral é conhecido como "exaustão de células T", que resulta da exposição crônica a antígenos que levou à regulação positiva dos receptores inibitórios. Esses receptores inibitórios servem como pontos de controle imunológico para prevenir reações imunológicas descontroladas.
[332] PD-1 e receptores coinibitórios, como o antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA-4, B e Atenuador de Linfócitos T (BTLA; CD272), imunoglobulina de células T e domínio de mucina 3 (Tim-3), gene de ativação de linfócitos 3 (Lag-3; CD223), e outros são frequentemente referidos como reguladores de ponto de verificação. Eles agem como "porteiros" moleculares que permitem que a informação extracelular dite se a progressão do ciclo celular e outros processos de sinalização intracelular devem prosseguir.
[333] Em algumas modalidades, um inibidor do ponto de verificação imunológico é um anticorpo para PD-1. PD-1 se liga ao receptor de morte celular programada 1 (PD-1) para evitar que o receptor se ligue ao ligante inibitório PDL-1, substituindo assim a capacidade dos tumores de suprimir a resposta imune antitumoral do hospedeiro.
[334] Em um aspecto, o inibidor de ponto de verificação é um terapêutico biológico ou uma molécula pequena. Em outro aspecto, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo monoclional, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano, uma proteína de fusão ou uma combinação dos mesmos. Em um outro aspecto, o inibidor de ponto de verificação inibe uma proteína de ponto de verificação selecionada a partir de CTLA-4, PDLI, PDL2, PDI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, ligantes da família B-7 ou uma combinação dos mesmos. Em um aspecto adicional, o inibidor de ponto de verificação interage com um ligante de uma proteína de ponto de verificação selecionada a partir de CTLA-4, PDL1, PDL2, PDI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, ligantes da família B-7 ou uma combinação dos mesmos. Em um aspecto, o inibidor de ponto de verificação é um agente imunoestimulador, um fator de crescimento de células T, uma interleucina, um anticorpo, uma vacina ou uma combinação dos mesmos. Em um outro aspecto, a interleucina é IL-7 ou IL-15. Em um aspecto específico, a interleucina é IL-7 glicosilada. Em um aspecto adicional, a vacina é uma vacina de células dendríticas (DC).
[335] Os inibidores de ponto de verificação incluem qualquer agente que bloqueia ou inibe, de maneira estatisticamente significativa,
as vias inibitórias do sistema imunológico. Tais inibidores podem incluir inibidores de moléculas pequenas ou podem incluir anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígeno, que se ligam a e bloqueiam ou inibem os receptores de ponto de verificação imunológico ou anticorpos que se ligam a e bloqueiam ou inibem ligantes do receptor de ponto de verificação imunológico. Moléculas de ponto de verificação ilustrativas que podem ser direcionadas para bloqueio ou inibição incluem, mas não estão limitadas a, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, LAG3, TIM3, VISTA, KIR, 2B4 (pertence à família de moléculas CD2 e é expresso em todas as células NK, yô e células T CD8+ (aB) de memória), CD160 (também referido como BY55), CGEN- 15049, CHK 1 e CHK2 quinases, A2aR, e vários ligantes da família B-
7. Os ligantes da família B7 incluem, mas não estão limitados a, B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 e B7-H7. Os inibidores de ponto de verificação incluem anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, outras proteínas de ligação, terapêutica biológica ou pequenas moléculas, que se ligam a e bloqueiam ou inibem a atividade de um ou mais de CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD 160 e CGEN-15049. Os inibidores de ponto de verificação imune ilustrativos incluem Tremelimumab (anticorpo bloqueador de CTLA-4), anti-OX40, anticorpo monoclonal PD-L1 (Anti-B7-HI; MEDI4736), MK-3475 (bloqueador de PD-1), Nivolumab (anticorpo anti-PDI), CT-011 (anticorpo anti-PDL), anticorpo monoclonal BY55, AMP224 (anticorpo anti-PDLI), BMS- 936559 (anticorpo anti-PDLI), MPLDL3280A (anticorpo anti-PDLI), MSBO0010718C (anticorpo anti-PDLI), e ipilimumab (inibidor do ponto de verificação anti-CTLA-4). Os ligantes de proteína de ponto de verificação incluem, mas não estão limitados a PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CD28, CD86 e TIM-3.
[336] Em certas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imunológico é selecionado a partir de um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1 e um antagonista de CTLA-4. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é selecionado a partir do grupo que consiste em nivolumab (OpdivoO), ipilimumab (YervoyO) e pembrolizumab (Keytruda&). Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é selecionado a partir de: nivolumab (anticorpo anti- PD-1, OpdivoG&, Bristol-Myers Squibb); pembrolizumab (anticorpo anti- PD-1, Keytruda&, Merck); ipilimumab (anticorpo anti-CTLA-4, YervoyO, Bristol-Myers Squibb); durvalumab (anticorpo anti-PD-L1, ImfinziO, AstraZeneca); e atezolizumab (anticorpo anti-PD-L1, TecentrigO, Genentech).
[337] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é selecionado a partir do grupo que consiste em lambrolizumab (MK- 3475), nivolumab (BMS-936558), pidilizumab (CT-011), AMP-224, MDX-1105, MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559, ipilimumab, lirtumab, IPH2101, pembrolizumab (KeytrudaO) e tremelimumab.
[338] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico é: REGN2810 (Regeneron), um anticorpo anti- PD-1 testado em pacientes com carcinoma basocelular (NCTO03132636),; NSCLC (NCTO3088540); carcinoma de células escamosas cutâneo (NCTO02760498); linfoma (NCTO02651662); e melanoma “(NCTO3002376); pidilizumab (CureTech), também conhecido como CT-011, um anticorpo que se liga a PD-1, em ensaios clínicos para linfoma difuso de grandes células B e mieloma múltiplo; avelumab (BavencioGO, Pfizer/Merck KGaA), também conhecido como MSBO0010718C), um anticorpo IgG1 anti-PD-L1 totalmente humano, em ensaios clínicos para câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células Merkel, mesotelioma, tumores sólidos, câncer renal, câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço e câncer gástrico; ou PDROO01 (Novartis), um anticorpo inibitório que se liga a PD-1, em ensaios clínicos para câncer de pulmão de células não pequenas, melanoma, câncer de mama triplo negativo e tumores sólidos avançados ou metastáticos. Tremelimumab (CP-675.206; Astrazeneca) é um anticorpo monoclional totalmente humano contra CTLA-4 que foi estudado em ensaios clínicos para várias indicações, incluindo: mesotelioma, câncer colorretal, câncer renal, câncer de mama, câncer de pulmão e câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma ductal pancreático, câncer pancreático, câncer de células germinativas, câncer de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, câncer endometrial, câncer metastático no fígado, câncer de fígado, linfoma de grandes células B, câncer de ovário, câncer cervical, câncer metastático de tireoide anaplásico, câncer urotelial, câncer das trompas de Falópio, mieloma múltiplo, câncer de bexiga, sarcoma de tecidos moles e melanoma. AGEN-1884 (Agenus) é um anticorpo anti-CTLA4 que está sendo estudado em ensaios clínicos de Fase 1 para tumores sólidos avançados (NCT02694822).
[339] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação é um inibidor de mucina de imunoglobulina de células T contendo proteína-3 (TIM-3). Os inibidores de TIM-3 que podem ser usados na presente invenção incluem TSR-022, LY3321367 e MBG453. TSR-022 (Tesaro) é um anticorpo anti-TIM-3 que está sendo estudado em tumores sólidos (NCT02817633). LY3321367 (Eli Lilly) é um anticorpo anti-TIM-3 que está sendo estudado em tumores sólidos (NCTO03099109). MBG453 (Novartis) é um anticorpo anti-TIM-3 que está sendo estudado em doenças malignas avançadas (NCT02608268).
[340] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação é um inibidor do imunorreceptor de células T com domínios Ig e ITIM, ou TIGIT, um receptor imune em certas células T e células NK. Os inibidores TIGIT que podem ser usados na presente invenção incluem BMS-986207 (Bristol-Myers Squibb), um anticorpo monoclional anti-TIGIT (NCT02913313); OMP-313M32 (Oncomed); e anticorpo monoclonal anti-TIGIT (NCT03119428).
[341] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação é um inibidor do Gene de Ativação de Linfócitos-3 (LAG-3). Os inibidores de LAG-3 que podem ser usados na presente invenção incluem BMS-986016 e REGN3767 e IMP321. O BMS-986016 (Bristol- Myers Squibb), um anticorpo anti-LAG-3, está sendo estudado em glioblastoma e gliossarcoma (NCT02658981). REGN3767 (Regeneron), também é um anticorpo anti-LAG-3 e está sendo estudado em doenças malignas (NCTO03005782). IMP321 (Immutep S.A.) é uma proteína de fusão LAG-3-lg, sendo estudada em: melanoma (NCTO02676869); adenocarcinoma (NCTO02614833); e câncer de mama metastático (NCTO0349934).
[342] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas OX40. Os agonistas de OX40 que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: PF- 04518600/PF-8600 (Pfizer), um anticorpo anti-OX40 agonístico, em câncer renal metastático (NOCTO03092856) e cânceres avançados e neoplasias (NCT02554812; NCTOS5082566); GSK3174998 (Merck), um anticorpo anti-OX40 agonístico, em ensaios de câncer de Fase 1 (NCT02528357); MEDIO562 (Medimmune/AstraZeneca), um anticorpo anti-OX40 agonístico, em tumores sólidos avançados (NCT02318394 e NCTO2705482); MEDI6469, um anticorpo agonístico anti-OX40 (Medimmune/AstraZeneca), em pacientes com câncer colorretal (NCT02559024), câncer de mama (NCT01862900), câncer de cabeça e pescoço (NCTO02274155) e câncer de próstata metastático (NCTO01303705); e BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb), um anticorpo anti-OX40 agonístico, em cânceres avançados (NCT02737475).
[343] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas de CD137 (também chamados de 4-1BB). Os agonistas de CD137 que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: utomilumab (PF-05082566, Pfizer) um anticorpo anti-CD137 agonístico, no linfoma difuso de grandes células B (NCTO2951156) e em cânceres e neoplasias avançados (NCTO02554812 e NCTO5082566); urelumab (BMS-663513, Bristol- Myers Squibb), um anticorpo anti-CD137 agonístico, no melanoma e câncer de pele (NCTO02652455) e glioblastoma e gliossarcoma (NCT02658981).
[344] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas de CD27. Os agonistas de CD27 que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: varlilumab (CDX-1127, Celldex Therapeutics) um anticorpo anti-CD27 agonístico, em câncer de cabeça e pescoço de células escamosas, carcinoma de ovário, câncer colorretal, câncer de células renais e glioblastoma (NCTO02335918); linfomas (NCTO1460134); e glioma e astrocitoma (NCT02924038).
[345] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas do receptor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticoides (GITR). Os agonistas de GITR que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: TRX518 (Leap Therapeutics), um anticorpo anti-GITR agonístico, em melanoma maligno e outros tumores sólidos malignos (NCTO01239134 e NCTO02628574); GWN323 (Novartis) um anticorpo anti-GITR agonístico, em tumores sólidos e linfoma (NCTO02740270); INCAGNO01876 (Incyte/Agenus), um anticorpo anti-GITR agonístico, em cânceres avançados (NCTO02697591 e NCTO3126110); MK-4166 (Merck), um anticorpo agonístico anti-GITR, em tumores sólidos (NCT02132754) e MEDII873 (Medimmune/AstraZzeneca)) uma molécula de ligante-GITR hexamérica agonística com um domínio Fc de
I9gG1 humano, em tumores sólidos avançados (NCT02583165).
[346] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas coestimuladores de células T induzíveis (ICOS, também conhecido como CD278). Os agonistas de ICOS que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: MEDI- 570 (Medimmune), um anticorpo anti-|COS agonístico, em linfomas (NCT02520791); GSK3359609 (Merck), um anticorpo anti-|/COS agonístico, na Fase 1 (NCT02723955); e JTX-2011 (Jounce Therapeutics), um anticorpo anti-|-COS agonístico, na Fase 1 (NCT02904226).
[347] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores do receptor do tipo IgG assassino (KIR). Os inibidores de KIR que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: lirlumab (IPH2102/BMS-986015, Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb), um anticorpo anti-KIR, em leucemias (NCTO0168738/7, NCTO02399917, NCTO02481297, NCTO2599649), mieloma múltiplo (NCT02252263), e linfoma (NCT01592370); IPH2101 (1-7F9, Innate Pharma) em mieloma (NCT01222286 e NCT01217203); e IPH4102 (Innate Pharma), um anticorpo anti-KIR que se liga a três domínios da cauda citoplasmática longa (KIR3DL2), no linfoma (NCT02593045).
[348] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores de CD47 da interação entre CDA47 e proteína reguladora de sinal alfa (SIRPa). Os inibidores de CD47/SIRPa que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: ALX-148 (Alexo Therapeutics), uma variante antagonista de (SIRPa) que se liga a CD47 e impede a sinalização mediada por CD47/SIRPa, na fase 1 (NCT03013218); TTI-621 (SIRPa-Fc, Trillium Therapeutics), uma proteína de fusão recombinante solúvel criada pela ligação do domínio de ligação de CD47 N-terminal de SIRPa com o domínio Fc de
I9gG1 humano, atua ligante CD47 humano e impedindo-o de entregar seu Sinal de "não coma" para macrófagos, está em ensaios clínicos na Fase 1 (NCT02890368 e NCTO02663518); CC-90002 (Celgene), um anticorpo anti-CD47, em leucemias (NCT02641002); e Hu5F9-G4 (Forty Seven, Inc), em neoplasias colorretals e tumores sólidos (NCT02953782), leucemia mieloide aguda (NCT02678338) e linfoma (NCT02953509).
[349] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores de CD73. Os inibidores de CD73 que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: MEDI9447 (Medimmune), um anticorpo anti-CD73, em tumores sólidos (NCT02503774); e BMS-986179 (Bristol-Myers Squibb), um anticorpo anti-CD73, em tumores sólidos (NCT02754141).
[350] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas do estimulador da proteína dos genes do interferon (STING, também conhecida como proteína transmembrana 173 ou TMEM173). Os agonistas de STING que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: MK-1454 (Merck), um dinucleotídeo cíclico sintético agonístico, no linfoma (NCTO03010176); e ADU-S100 (MIW815, Aduro Biotech/Novartis), um dinucleotídeo cíclico sintético agonístico, na Fase 1 (NOT02675439 e NCTO03172936).
[351] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores de CSFIR. Os inibidores de CSF1IR que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: pexidartinib (PLX3397, Plexxikon), um inibidor de pequena molécula CSF1R, em câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer metastático e avançado (NCT02777710) e melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas câncer de cabeça e pescoço, tumor estromal gastrointestinal (GIST) e câncer de ovário (NCT02452424); e IMC-CS4 (LY3022855, Lilly), um anticorpo anti-CSF-1R, em câncer pancreático
(NCTO3153410), melanoma (NCTO3101254) e tumores sólidos (NCT02718911); e BLZ945 (metilamida de ácido 4-[2((1R,2R)-2- hidroxiciclo-hexilamino)-benzotiazol-6-iloxil]-piridina-2-carboxílico, Novartis), um inibidor oral disponível de CSFIR, em tumores sólidos avançados (NCT02829723)
[352] Os inibidores de ponto de verificação que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores do receptor NKG2A. Os inibidores do receptor NKG2A que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem monalizumab (IPH2201, Innate Pharma), um anticorpo anti-NKG2A, em neoplasias de cabeça e pescoço (NCT02643550) e leucemia linfocítica crônica (NOT02557516).
[353] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imunológico é selecionado a partir de nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, avelumab, durvalumab, atezolizumab ou pidilizumab. Usos Terapêuticos
[354] Os peptídeos bicíclicos da invenção têm utilidade específica como agentes de ligação à Nectina-4.
[355] Nectina-4 é uma molécula de superfície que pertence à família de proteínas da nectina, que compreende 4 membros. As nectinas são moléculas de adesão celular que desempenham um papel fundamental em vários processos biológicos, como polaridade, proliferação, diferenciação e migração, para células epiteliais, endoteliais, imunológicas e neuronais, durante o desenvolvimento e a vida adulta. Elas estão envolvidas em vários processos patológicos em humanos. Elas são os principais receptores do poliovírus, vírus do herpes simplex e vírus do sarampo. Mutações nos genes que codificam Nectina-1 (PVRL1) ou Nectina-4 (PVRL4) causam síndromes de displasia ectodérmica associadas a outras anormalidades. A nectina-4 é expressa durante o desenvolvimento fetal. Nos tecidos adultos, sua expressão é mais restrita do que a de outros membros da família. A nectina-4 é um antígeno associado ao tumor em 50%, 49% e 86% dos carcinomas de mama, ovário e pulmão, respectivamente, principalmente em tumores de mau prognóstico. Sua expressão não é detectada nos tecidos normais correspondentes. Em tumores de mama, a Nectina-4 é expressa principalmente em carcinomas triplo-negativos e ERBB2+. No soro de pacientes com esses cânceres, a detecção de formas solúveis de Nectina-4 está associada a um mau prognóstico. Os níveis de Nectina-4 sérica aumentam durante a progressão metastática e diminuem após o tratamento. Esses resultados sugerem que a Nectina-4 pode ser um alvo confiável para o tratamento do câncer. Consequentemente, vários anticorpos anti-Nectina-4 foram descritos na técnica anterior. Em particular, Enfortumab Vedotin (ASG-22ME) é um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) que visa à Nectina4 e é atualmente investigado clinicamente para o tratamento de pacientes que sofrem de tumores sólidos.
[356] Os ligantes polipeptídicos selecionados de acordo com o método da presente invenção podem ser utilizados em aplicações terapêuticas e profiláticas in vivo, aplicações de diagnóstico in vitro e in vivo, ensaios in vitro e aplicações de reagentes e semelhantes. Os ligantes com níveis selecionados de especificidade são úteis em aplicações que envolvem testes em animais não humanos, onde a reatividade cruzada é desejável, ou em aplicações de diagnóstico, onde a reatividade cruzada com homólogos ou parálogos precisa ser controlada cuidadosamente. Em algumas aplicações, tais como aplicações de vacinas, a capacidade de induzir uma resposta imune a intervalos predeterminados de antígenos pode ser explorada para adaptar uma vacina para doenças e patógenos específicos.
[357] Ligantes peptídicos substancialmente puros com pelo menos 90 a 95% de homogeneidade são preferidos para administração a um mamífero, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade é o mais preferido para usos farmacêuticos, especialmente quando o mamífero é um humano. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogeneidade conforme desejado, os polipeptídeos selecionados podem ser usados diagnóstica ou terapeuticamente (incluindo extracorporalmente) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaio, colorações imunofluorescentes e semelhantes (Lefkovite e Pernis, (1979 e 1981) Immunological Methods, Volumes | e Il, Academic Press, NY).
[358] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um ligante peptídico ou um conjugado de fármaco como aqui definido, para uso na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por Nectina-4.
[359] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método para prevenir, suprimir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por Nectina-4, que compreende a administração a um paciente em necessidade do mesmo de um grupo efetor e conjugado de fármaco do ligante peptídico como aqui definido.
[360] Em uma modalidade, a Nectina-4 é a Nectina-4 de mamífero. Em uma outra modalidade, a Nectina-4 de mamífero é a Nectina-4 humana.
[361] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio mediado por Nectina-4 é selecionado a partir de infecções virais, síndromes de displasia ectodérmica e outras anormalidades, carcinomas de mama, ovário e pulmão, progressão metastática e tumores sólidos.
[362] Em uma outra modalidade, a doença ou distúrbio mediado por Nectina-4 é selecionado a partir de câncer.
[363] Exemplos de cânceres (e suas contrapartes benignas) que podem ser tratados (ou inibidos) incluem, mas não estão limitados a tumores de origem epitelial (adenomas e carcinomas de vários tipos, incluindo adenocarcinomas, carcinomas escamosos, carcinomas de células transicionais e outros carcinomas), tais como carcinomas da bexiga e do trato urinário, mama, trato gastrointestinal (incluindo esôfago, estômago (gástrico), intestino delgado, cólon, reto e ânus), fígado (carcinoma hepatocelular), vesícula biliar e sistema biliar, pâncreas exócrino, rim, pulmão (por exemplo, adenocarcinomas, carcinomas pulmonares de células pequenas, carcinomas pulmonares de células não pequenas, carcinomas bronquioalveolares e mesoteliomas), cabeça e pescoço (por exemplo, cânceres de língua, cavidade bucal, laringe, faringe, nasofaringe, amígdala, glândulas salivares, cavidade nasal e seios paranasais), ovário, trompas de falópio, peritônio, vagina, vulva, pênis, colo do útero, miométrio, endométrio, tireoide (por exemplo, carcinoma folicular da tireoide), adrenal, próstata, pele e anexos (por exemplo melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas, ceratoacantoma, nevo displásico); malignidades hematológicas (ou seja, leucemias, linfomas) e distúrbios hematológicos pré-malignos e distúrbios de malignidade limítrofe, incluindo malignidades hematológicas e condições relacionadas de linhagem linfoide (por exemplo, leucemia linfocítica aguda [LLA], leucemia linfocítica crônica [CLL], linfomas de células B, como linfoma difuso de grandes células B [DLBCL], linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células do manto, linfomas de células T e leucemias, linfomas de células naturais assassinas [NK], linfomas de Hodgkin, leucemia de células pilosas, gamopatia monoclonal de significado incerto, plasmocitoma, mieloma múltiplo e distúrbios linfoproliferativos pós-transplante), e malignidades hematológicas e condições relacionadas de linhagem mieloide (por exemplo, leucemia mielogênica aguda [LMA], leucemia mieloide crônica [CML], leucemia mielomonocítica crônica [CMML], síndrome hipereosinofílica, distúrbios mieloproliferativos, policitemia vera, trombocitemia essencial e mielofibrose — primária, — síndrome — mieloproliferativa, — síndrome mielodisplásica e leucemia promielócítica); tumores de origem mesenquimal, por exemplo sarcomas de tecido mole, osso ou cartilagem, tais como osteossarcomas, fibrossarcomas, condrossarcomas, rabdomiossarcomas, leiomiossarcomas, lipossarcomas, angiossarcomas, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, carcoma sinuvial, sarcomas epitelioides, sarcomas estromais gastrointestinais, histiocitomas benigno e malign,n e sarcoma dermatofibroso protuberante; tumores do sistema nervoso central ou periférico (por exemplo astrocitomas, gliomas e glioblastomas, meningiomas, ependimomas, tumores pineais e schwannomas); tumores endócrinos (por exemplo, tumores pituitários, tumores adrenais, tumores de células das ilhotas, tumores da paratireoide, tumores carcinoides e carcinoma medular da tireoide); tumores oculares e anexiais (por exemplo retinoblastoma); células germinativas e tumores trofoblásticos (por exemplo teratomas, seminomas, disgerminomas, manchas hidatiformes e coriocarcinomas); e tumores pediátricos e embrionários (por exemplo meduloblastoma, neuroblastoma, tumor de Wilms e tumores neuroectodérmicos primitivos); ou síndromes, congênitas ou não, que deixam o paciente suscetível à malignidade (por exemplo, Xeroderma Pigmentosum).
[364] Em uma outra modalidade, o câncer é selecionado a partir de uma malignidade hematopoiética, tal como selecionado a partir de: linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma de Burkitt (BL), mieloma múltiplo (MM), leucemia linfocítica crônica B (B-CLL), Leucemia linfocítica aguda B e T (LLA), linfoma de células T (TCL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia de células pilosas (HCL), Linfoma de Hodgkin (HL) e leucemia mieloide crônica (CML).
[365] Em ainda outra modalidade, o câncer é selecionado a partir de câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de bexiga, câncer de pâncreas e câncer de mama. Dados são apresentados neste documento nos Exemplos 1 a 5 que demonstram que os conjugados de fármaco bicíclicos selecionados da invenção exibiram atividade antitumoral nestes modelos de câncer.
[366] As referências aqui feitas ao termo "prevenção" envolvem a administração da composição protetora antes da indução da doença. "Supressão" refere-se à administração da composição após um evento indutivo, mas antes do aparecimento clínico da doença. "Tratamento" envolve a administração da composição protetora após os sintomas da doença se manifestarem.
[367] Estão disponíveis sistemas de modelo animal que podem ser usados para rastrear a eficácia dos ligantes peptídicos na protecção ou tratamento da doença. O uso de sistemas de modelos animais é facilitado pela presente invenção, que permite o desenvolvimento de ligantes polipeptídicos que podem reagir de forma cruzada com alvos humanos e animais, para permitir a utilização de modelos animais.
[368] Além disso, são apresentados dados aqui que demonstram uma associação entre a variação do número de cópias (CNV) e a expressão do gene para Nectina-4 de vários tipos de tumor. Assim, de acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método de prevenção, supressão ou tratamento do câncer, que compreende a administração a um paciente em necessidade de um grupo efetor e conjugado de fármaco do ligante peptídico conforme definido neste documento, em que o referido paciente é identificado como tendo uma variação aumentada do número de cópias (CNV) de Nectina-4.
[369] Em uma modalidade, o câncer é selecionado daqueles identificados aqui como tendo CNV aumentado de Nectina-4. Em uma outra modalidade, o câncer é selecionado daqueles identificados aqui como tendo CNV aumentada de Nectina-4, a saber: mama, uterino, bexiga, adenocarcinoma de pulmão, pulmão escamoso, cervical, cabeça e pescoço, pancreático, tireoide, colorretal, timoma, sarcoma, carcinoma renal de células claras (RCC), próstata e estômago.
[370] A invenção é ainda descrita abaixo com referência aos seguintes exemplos.
Exemplos Abreviações 1,2,4-TriAz 3-(1,2,4-Triazol-1-il)-alanina 1Nal 1-Naftilalanina 2FuAla 2-Furilalanina 2MePhe 2-Metil-Fenilalanina 2Nal 2-Naftilalanina 2Pal 2-Piridilalanina 3,3-DPA 3,3-difenilalanina 3MePhe 3-Metil-Fenilalanina 3Pal 3-piridilalanina 4,4-BPA 4 4-Bifenilalanina 4,4-DFP 4 4-difluoroprolina 4MePhe 4-Metil-Fenilalanina 4Pal 4-piridilalanina 4ThiAz Beta-(4-Tiazolil)-Alanina 5FTrp 5-Fluoro-L-triptofano Agb Ácido 2-amino-4-guanidinobutírico Aib Ácido Aminoisobutírico AzaTrp Azatriptofano Aze Azetidina C5A Ciclopentilglicina Cha 3-ciclo-hexil-alanina Cpa Ciclopropilalanina Cya Ácido cisteico DOPA 3,4-Di-hidróxi-fenilalanina HArg HomoArginina HGInh HomoGlutamina
Hleu HomeLeucina Hphe HomorFenilalanina HSe(Me) Homosserina (Me) HSer HomoSerina HyP Hidroxiprolina Lys (Ac) lisina (acetil) Met(O02) Metionina sulfona Nle Norleucina Oic Ácido octa-hidroindolocarboxílico Oxa Ácido oxazolidina-4-carboxílico pCoPhe para-Carbóxi-Fenilalanina PheOPhe 4-Fenoxifenilalanina Phg Fenilglicina Pip Ácido pipecólico Pro(4NH) 4-Amino-Prolina tBuAla t-Butil-Alanina Tetraz tetrazol alanina Thi Tienil-alanina THP(O) Ácido tetra-hidropiran-4-propanoico THP(SO2) Ácido dioxo-4-tetra-hidrotiopiranilacético Trp (Me) Metil Trptofano Materiais e Métodos Síntese de Peptídeo
[871] A síntese de peptídeos foi baseada na química Fmoc, usando um sintetizador de peptídeos Symphony fabricado pela Peptide Instruments e um sintetizador Syro || pela MultiSynTech. Fmoc- aminoácidos padrão (Sigma, Merck) foram empregados, com grupos de proteção de cadeia lateral apropriados: onde aplicáveis, condições de acoplamento padrão foram usadas em cada caso, seguido por desprotecção usando metodologia padrão.
[372] Alternativamente, os peptídeos foram purificados usando HPLC e após o isolamento foram modificados com 1,3,5- Triacriloilhexahidro-1,3,5-triazina (TATA, Sigma). Para isso, o peptídeo linear foi diluído com 50:50 MeCN: H2O até — 35 mL, — 500 ul de 100 mM de TATA em acetonitrila foi adicionado e a reação foi iniciada com mL de NH4HCO;3 a 1 M em H2O. A reação foi deixada prosseguir durante — 30 - 60 min à TA e liofiizada uma vez que a reação foi concluída (avaliada por MALDI). Uma vez concluído, 1ml de cloridrato de L-cisteína mono-hidratado a 1M (Sigma) em H2O foi adicionado à reação por — 60 min à temperatura ambiente para extinguir qualquer excesso de TATA. Após a liofilização, o peptídeo modificado foi purificado como acima, substituindo o Luna C8 por uma coluna Gemini C18 (Phenomenex), e alterando o ácido para 0,1% de ácido trifluoroacético. As frações puras contendo o material modificado com TATA correto foram reunidas, liofiizadas e mantidas a -20ºC para armazenamento.
[373] Todos os aminoácidos, salvo indicação em contrário, foram usados nas configurações L-.
[374] Em alguns casos, os peptídeos são convertidos em dissulfetos ativados antes do acoplamento com o grupo tiol livre de uma toxina usando o seguinte método; uma solução de 4-metil(succinimidil 4-(2-piridiltio )pentanoato) (100 mM) em DMSO seco (1,25 equiv molar) foi adicionada a uma solução de peptídeo (20 mM) em DMSO seco (1 equiv molar). A reação foi bem misturada e DIPEA (20 equiv molar) foi adicionado. A reação foi monitorada por LC/MS até a conclusão. Preparação de Conjugados de Fármacos de Peptídeo Bicíclico Preparação de BCY 7826 Condição de separação: Fase A: 0,075% TFA em H2O, fase B: MeCN Método de separação: 18-48-55min, RT = 53,5min
Coluna de separação: Luna 200 * 25mMm 10um, C18, 110A e Gemin150 * 30mm, C18, 5um, 110A, conexão ºC, 50ºC Método de dissolução: DMF Pureza de separação: 95%
Q o d ex. , . O N Síntese de fase sólida ox À, " : : 7 7 3 (À T é Ad A A AA A AAA L A Ro 2 FESTAS A EITA q í T
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[375] O peptídeo foi sintetizado por síntese de fase sólida. Foram usados 1,11 g de Resina Rink Amide MBHA (sub: 0,45 mmol/g). A uma mistura contendo Rink Amide MBHA (0,5 mmol, 1,11 g, 0,45 mmol/g) e Fmoc-Cys (Trt)-OH (0,87 g, 1,5 mmol, 3,0 eq) foi adicionado DMF (20 mL), depois DIC (3,0 eq) e HOAt (3,0 eq) foram adicionados e misturados por 1 h. 20% de piperidina em DMF foi usada para desbloqueio. E outros aminoácidos foram acoplados com 3,0 eq usando reagentes ativadores, DIC (3,0 eq) e HOAt (3,0 eq) em DMF (20 mL). A reação foi monitorada por reação de cor de ninidrina ou reação de cor de tetracloro. Após a conclusão da síntese, a resina peptídica foi lavada com DMF X 3, MeOH X 3 e, em seguida, seca sob borbulhamento de N> durante a noite. Depois disso, a resina do peptídeo foi tratada com
92,5% de TFA/2,5% de TIS/2,5% de EDT/2,5% de H2O durante 3 h.
O peptídeo foi precipitado com éter isopropílico frio (200 mL) e centrifugado (3 min a 3000 rpm). Lavagem de éter isopropílico mais duas vezes (200 mL). Secar o peptídeo bruto sob vácuo por 2h.
O peptídeo bruto é usado (ou seja, após a clivagem do peptídeo e precipitação com éter isopropílico, o precipitado é liofiizado para remover éter isopropílico residual e TFA), Dissolverr o pó liofilizado (0,5 mmol) em 500 ml de ACN/H2O (50:50) e adicionar 5 mL de 100 mM de TATA.
Adicionar 10 mL de bicarbonato de amônio em H2O (1 M) e misturar por 1 h.
Assim que a ciclização estiver completa, a reação deve ser extinta com 10,0 eq de cisteína sobre TATA.
Adicionar pelo menos mL de Cisteína a 1 M à solução, misturar e deixar repousar por uma hora.
A solução foi liofilizada para obter o produto em bruto.
O peptídeo bruto foi purificado por HPLC prep e liofilizado para dar o produto BCYT814 (144,1 mg, 97,1% de pureza; 9,6% de rendimento) como um sólido branco. (Condição de análise HPLC) Instrumento - Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) Gemini-NX C18 5um 110A 150*4.6mm A: H2O (0.1% TFA) Fase Móvel B: CH3CN taxa de Fluxo 1 mL/Min Comprimento de onda 220/254 nm
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AS N Ss > | SS ? OD CC P CISO3H é, — csomH iso NA, HAc, EtOH, 40 ºC ZD gro DIEA, 1,2-DCE 1 2 DM1, DMF 28 ——<«—«««u«ucltonso» eo —>t - -: As or DM1-SO3H-SPDB SO3H 3 o Oo o nÁ (E) (RS) a
E R Ss SPT HOSu Pao) o N Oo EDCI d Vo 9 Q Oo VA | SO3H DM1-SO3H-SPDB o o o n ER) A E) Do Pra BCY00007814 TO = z o. Y o o o 9 À o Sl so | Sso;H o DM1-SO3H-SPDB-NHS o Do o n EEN L, e sssR Tn o à) WO o SO3H q N Ass AN BcvonoTata | o BCY00007826
[376] A uma solução de BCY7814 (61,80 mg, 21,29 umol, 1,1 eq) em DMA (4 mL) foi adicionado DIEA (7,50 mg, 58,05 umol, 10,11 uL, 3,0 eq) e DM1-SO3H-SPDB-NHS. A mistura foi agitada a 25ºC durante 16 horas. LC-MS mostrou que DM1-SO3H-SPDB-NHS foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. À reação foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição TFA). Composto BCY7826 (0,0242 g, 6,31 umol, 32,63% de rendimento, 99,7% de pureza) foi obtido como um sólido branco. Tempo de retenção = 13,99 min, Massa encontrada = 1254,1 (M/3+1) Preparação de BCY8549 Condição de Separação: fase A: 0.075% de TFA em H2O, Fase B: MeCN Método de Separação: 18-48-55min, RT=53.5min Coluna de Separação: Luna 200*25mm 10um, C18, 110A e Gemin150*30mm, C18, 5um, 110A, conexão, 50ºC Método de dissolvição: DMF Pureza de separação: 95% BCY8234 foi sintetizado por síntese de fase sólida. Fase sótia TC” ie TI us AO Q- i - EsDO DCM/MEOH 1 2
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NH 7 o mm o NS o à R N N B-Ala-BCY8234 o O O
HN A nt, BCY00008549 Preparação de composto 2
[877] O peptídeo foi sintetizado usando química de Fmoc padrão.
1) Adicionar DCM ao frasco contendo Resina CTC (5 mmol,
4.3 g, 1.17 mmol/g) e Fmoc-Cit -OH (2.0 g, 5 mmol, 1.0 eq) com borbulamento de N..
2) Adicionar DIEA (4.0 eq) gota a gota e misturar por 2 horas.
3) Adicionar MeOH (5 mL) e misturar por 30 min.
4) Drenar e lavar com DMF 5 vezes.
5) Adicionar 20% piperidina/DMF e reagir por 30 min.
6) Drenar e lavar com DMF 5 vezes.
7) Adicionar solução de aminoácido-Fmoc e misturar 30 segundos, em seguida adicionar tampão de ativação, borbulhamento de N2 borbulhar por cerca de 1 hora.
8) Repetir etapas 4 a 7 acima para o acoplamento dos seguintes aminoácidos.
Nota: FO seis Resgentos de Acoplamento | carboxílico (3.0 eq) 20% de piperidina em DMF foi usada para desprotecção de Fmoc durante 30 min. A reação de acoplamento foi monitorada pelo teste da ninidrina e a resina foi lavada com DMF 5 vezes. Clivagem e Purificação de Peptídeos:
1) — Adicionar tampão de clivagem (20% TFIP/80% DCM) ao frasco contendo o peptídeo protegido da cadeia lateral à temperatura ambiente e agitar por 1 hora duas vezes. 2) Filtrar e coletar o filtrado. 3) Concentrar para remover o solvente. 4) O peptídeo bruto foi liofiizado para dar o produto final (1,4 9, 85,0% de rendimento). Preparação do composto 3
[378] A uma solução do composto 2 (1,65 g, 5,01 mmol, 1,0 eq) em DCM (30 mL) e MeOH (15 mL) foi adicionado EEDQ (2,48 g, 10,02 mmol, 2,0 eq) e (4-aminofenil) metanol (740,37 mg, 6,01 mmol, 1,2 eq). A mistura foi agitada a 15ºC durante 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 2 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. TLC indicou que o composto 2 foi consumido completamente e muitos novos pontos formados. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente para dar um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel (ISCOG; 80 SepaFlash6 Silica Flash Column, eluente de gradiente de 0 — 15 DOCM/MeOH (Q 60 mL/min). O composto 3 (1,3 g, 2,99 mmol, 59,72% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação do composto 4
[379] A uma solução do composto 3 (1,3 g, 2,99 mmol, 1,0 eq) em DMF (10 mL) foi adicionado DIEA (2,32 g, 17,95 mmol, 3,13 mL, 6,0 eq) e bis(4-nitrofenil) carbonato (3,64 g, 11,97 mmol, 4,0 eq). A mistura foi agitada a 15ºC durante 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 3 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 4 (1,0 g, 1,67 mmol, 55,74% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação do composto 5
[380] A uma solução do composto 5 (250,53 mg, 417,84 umol, 1,5 eq) em DMF (5 mL) foi adicionado HOBt (56,46 mg, 417,84 umol, 1,5 eq) e DIEA (108,01 mg, 835,68 umol, 145,56 uL, 3,0 eq), MMAE (0,200 g, 278,56 umol, 1,0 eq). A mistura foi agitada a 35 ºC durante 12 h. LC- MS mostrou que MMAE foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. A reação foi purificada diretamente por HPLC prep (condição neutra). O Composto 5 (0,180 9, 152,74 umol, 54,83% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação do composto 6
[381] A uma solução do composto 5 (0,170 g, 144,26 umol, 1,0 eq) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) foi adicionado LiOH.H20O (12,11 mg, 288,51 umol, 2,0 eq). A mistura foi agitada a 15 ºC durante 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 5 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. PH ajustado = 7 usado por AcCOH e THF foi removido sob pressão reduzida para dar um resíduo. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 6 (0,185 g, em bruto) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação de BCY8549
[382] A uma solução do composto 6 (0,100 g, 86,93 umol, 1,0 eq) em DMA (4 mL) foi adicionado HOSu (10,00 mg, 86,93 umol, 1,0 eq) e EDCI (16,66 mg, 86,93 umol, 1,0 eq). Após a formação do éster NHS, B-Ala-BCY8234 (525,98 mg, 173,85 umol, 2,0 eq) e DIEA (33,70 mg, 260,78 umol, 45,42 uL, 3,0 eq). A mistura foi agitada a 15 ºC durante 4 horas. LC-MS mostrou que o composto 6 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. A reação foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição TFA). O composto BCY8549 (0,0528 g, 12,15 umol, 13,98% de rendimento, 95,70% de pureza) foi obtido como um sólido branco. Tempo de retenção = 11,48 min. Massa encontrada = 1386,4 (M/3+ H) Preparação de BCY8245
Condição de Separação: fase A: 0.075% de TFA em H2O, Fase B: MeCN Método de Separação: 18-48-55min, RT=53.5min Coluna de Separação: Luna 200*25mm 10um, C18, 110A e Gemin150*30mm, C18, 5um, 110A, conexão, 50ºC Método de dissolvição: DMF Pureza de separação: 95%
[383] O BCY8234 foi sintetizado por síntese de fase sólida. Esquema de reação de BCY8245 é conhecido abaixo: Fest KA À o e & ”) Fase sóida ' V AA, -o » S >» " 1 ar; . , o 6 " À Ant LO um PAM, q SN ——— ó RN > ão ã . 2 ” do [o 9 o 9 * N2o NO? oH nl R do o IS FONDO : TA ORI A >
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NH BCY00008245 Neo Preparação do composto 3 O composto 3 foi sintetizado pelo método de fase sólida. Preparação do composto 4
[384] A uma solução do composto 3 (1,3 g, 3,23 mmol, 1,0 eq) em DCM (10 mL) e MeOH (5 mL) foi adicionado EEDQ (1,60 g, 6,46 mmol, 2,0 eq) e (4-aminofenil) metanol (517,16 mg, 4,20 mmol, 1,3 eq). À mistura foi agitada a 20ºC durante 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 3 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel (ISCOG; 40 g Cçoluna de Sílica Gel SepaFlashO, Eluente de gradiente de O — 15% DCM/MeOH (Q 40 mL/min). O Composto 4 (0,950 g, 1,87 mmol, 57,94% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação do composto 5
[385] A uma solução do composto 4 (0,950 g, 1,87 mmol, 1,0 eq) em DMF (5 mL) foi adicionado DIEA (1,21 g, 9,36 mmol, 1,63 mL, 5,0 eq) e bis(4-nitrofenil) carbonato (2,28 g, 7,49 mmol, 4,0 eq). A mistura foi agitada a 20 ºC durante 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 4 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. A reação foi purificada diretamente por HPLC prep (condição neutra). O Composto 5 (0,400 g, 594,64 umol, 31,77% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Preparação do composto 6
[386] A uma solução do composto 5 (0,200 g, 297,32 umol, 1,0 eq) em DMF (5 mL) foi adicionado HOBt (52,23 mg, 386,51 umol, 1,3 eq) e
DIEA (115,28 mg, 891,95 umol, 155,36 uL, 3,0 eq), MMAE (192,12 mg, 267,59 umol, 0,9 eq). A mistura foi agitada a 20 ºC durante 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 5 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. A reação foi purificada diretamente por HPLC prep (condição neutra). O Composto 6 (0,160 9, 127,84 umol, 43,00% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Preparação do composto 7
[387] A uma solução do composto 6 (0,160 g, 127,84 umol, 1,0 eq) em THF (3 mL) e H2O (3 mL) foi adicionado LiOH.H20O (26,82 mg, 639,21 umol, 5,0 eq). A mistura foi agitada a 20 ºC durante 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 6 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. O THF foi removido sob pressão reduzida e o pH ajustado = 7 por ACOH, a mistura foi liofilizada. O Composto 7 (0,130 g, 105,05 umol, 82,17% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Preparação do composto 8
[388] A uma solução do composto 7 (36,27 mg, 315,15 umol, 3,0 eq) em DMA (6 mL) e DCM (2 mL) foi adicionado EDCI (60,41 mg, 315,15 umol, 3,0 eq). A mistura foi agitada a 15 ºC por 3 horas. LC-MS mostrou que o composto 7 foi consumido completamente e um pico principal com o m/z desejado foi detectado. DCM foi removido sob pressão reduzida. A reação foi purificada diretamente por HPLC prep (condição neutra). O composto 8 (0,095 g, 71,18 umol, rendimento de 67,76%) foi obtido como um sólido branco. Preparação de BCY8245
[389] A uma solução de BCY8234 (66,41 mg, 22,48 umol, 1,0 eq) em DMA (4 mL) foi adicionado DIEA (8,72 mg, 67,44 umol, 11,75 uL, 3,0 eq) e composto 8 (0,030 g, 22,48 umol, 1,0 eq). A mistura foi agitada a 20 ºC durante 16 horas. LC-MS mostrou que BCY8234 foi consumido completamente e um pico principal com m/z ou massa desejada foi detectado. A reação foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição TFA). O composto BCY8245 (0,0427 g, 10,16 umol, 45,19% de rendimento, 99,30% de pureza) foi obtido como um sólido branco. Tempo de retenção = 11, 0,7 min. Massa encontrada = 1043,9 (M/4+ H)
[390] Os seguintes conjugados de fármacos bicíclicos foram feitos de maneira análoga a BCY8245:
LCMS Amt Escala MMAE- (amt de Ren- Ren- PABC-vc- Pureza peptí- dimen- | dimen- Glutarato- (%) Massa RT deo to (mg) | to (%) NHS encontrada (min) usado) d | No.de usado (actual mass)
BCY
1285.1 = M/3+H | 14,52 BCY7683 ESPNFNFA 28,39 | e9s | (3852.58) |
1374.9 = M/3+H | 12,78 BCY7825 84 35 34,1 | 31,22 (4122.85)
1406.7 = M/3+H | 10,34 BCY8253 [eme os ds [se 317 | ses | (4219.95) [ E]
1405.6 = M/3+H | 10,35 BCY8254 76 34 36,4 | 33,70 | 994 (4214.94)
1405.7 = M/3+H | 10,54 BCY8255 123 50 425 | 2594 | 964 (4215.93)
1058.0 = M/4+H | 12,08 BCY8550 50,1 | 52,28 | 99,2 (4227.1) 1404,1 = M/3+H | 12,76 BCY8783 61 30 471 | 4818 | 96,8 (4209,89) 1415,3 = M/3+H | 13,50 BCY8784 34 20 23,1 | 34,74 | 95,7 (4245,94)
DADOS BIOLÓGICOS Ensaio de Ligação Direta de Nectina-4
[391] A afinidade dos peptídeos da invenção para Nectina-4 (Ki) humana foi determinada usando um ensaio de polarização de fluorescência, de acordo com os métodos divulgados em WO 2016/067035. Os peptídeos da invenção com uma etiqueta fluorescente (ou fluoresceína, SIGMA ou Alexa Fluor4887Y, Fisher Scientific) foram diluídos a 2,5 nM em PBS com 0,01% de tween 20 ou 50 mM de HEPES com 100 mM de NaCl e 0,01% de pH 7,4 (ambos referidos como tampão de ensaio). Isto foi combinado com uma titulação de proteína no mesmo tampão de ensaio que o peptídeo para dar 1 nM de peptídeo em um volume total de 25 uL em placas de 384 poços de baixo volume de fundo de baixa ligação e de parede preta, tipicamente 5 ul. de tampão de ensaio, 10 uL de proteína e 10 ul de peptídeo fluorescente. Uma em duas diluições em série foi usada para dar 12 concentrações diferentes com concentrações superiores variando de 500 nM para ligantes de alta afinidade conhecidos a 10 uM para aglutinantes de baixa afinidade e ensaios de seletividade. As medições foram realizadas em um BMG PHERAstar FS equipado com um módulo óptico "FP 485 520 520" que excita a 485 nm e detecta emissões paralelas e perpendiculares a 520 nm. O PHERAstar FS foi ajustado a 25 ºC com 200 flashes por poço e um retardo de posicionamento de 0,1 segundo, com cada poço medido em intervalos de 5 a 10 minutos por 60 minutos. O ganho utilizado para a análise foi determinado para cada marcador ao final dos 60 minutos em que não havia proteína no poço. Os dados foram analisados usando Systat Sigmaplot versão 12.0. Os valores de mP foram ajustados a uma equação quadrática definida pelo usuário para gerar um valor Kd: f = ymin+ (ymax-ymin)/Lig * ((x+ Lig+ Kd)/2-sqrt ((((x+ Lig+ Kd)/2) * 2)-(Lig *x))). "Lig" foi um valor definido da concentração do traçador usado. Ensaio de Ligação de Competição de Nectina-4
[392] Os peptídeos sem uma etiqueta fluorescente foram testados em competição com ACPFGCHTDWSWPIWCA-Sar6-K (FI) (SEQ ID NO: 217) e (Kd = 5 nM - determinado usando o protocolo acima). Os peptídeos foram diluídos para uma concentração apropriada em tampão de ensaio, conforme descrito no ensaio de ligação direta com um máximo de 5% de DMSO, depois diluídos em série 1 em 2. Cinco uL de peptídeo diluído foram adicionados à placa seguidos por 10 ul de Nectina-4 humana, em seguida, 10 ul de peptídeo fluorescente foram adicionados. As medições foram realizadas como para o ensaio de ligação direta, no entanto, o ganho foi determinado antes da primeira medição. A análise de dados foi feita no Systat Sigmaplot versão 12.0, onde os valores de mP foram ajustados a uma equação cúbica definida pelo usuário para gerar um valor Ki: f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((Lig*((2*((KligrKcomp+Lig+Comp-Prot*c)'2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig"Kcomp))"0.5*COS(ARCCOS((- 2*(KligrKcomp+Lig+Comp-Prot*c)"3+9*(KligrKcomp+Lig+Comp- Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)-+Klig*Kcomp)-27*(- 1*KligrKcomp*Prot*c))/(2*((((KligrKcomp+Lig+Comp-Prot*c)'2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig"Kcomp))"3)"0.5)))/3))- (KligrKcomp+Lig+Comp- Prot*c)))/((3*Klig)'+((2*((KligrKcomp+Lig+Comp-Prot*c)'2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig"Kcomp))"0.5*COS(ARCCOS((- 2*(KligrKcomp+Lig+Comp-Prot*c)"3+9*(KligrKcomp+Lig+Comp- Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)-+Klig*Kcomp)-27*(- 1*KligrKcomp*Prot*c))/(2*((((KligrKcomp+Lig+Comp-Prot*c)'2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig"Kcomp))"3)"0.5)))/3))- (KligrKcomp+Lig+Comp-Prot*c)))).
[393] "Lig", "KLig" e "Prot" foram todos valores definidos em relação a: concentração de peptídeo fluorescente, o Kd do peptídeo fluorescente e concentração de nectina, respectivamente. Ensaio de Ligação SPR de Nectina-4 Biacore
[394] Experimentos Biacore foram realizados para determinar os valores ka (Ms), kd (s!), Ko (nM) de peptídeos monoméricos que se ligam à proteína Necin-4 humana (obtida de Charles River).
[395] Nectina-4 humana (resíduos Gly32-Ser349; NCBI RefSeaq: NP 112178.2) com uma sequência de sinal gp67 e tag FLAG C-terminal foi clonada em pFastbac-1 e baculovírus feito usando protocolos Bac- to-Bac'“Y padrão (Life Technologies). As células Sf21 a 1 x 10ºml* em meio Excell-420 (Sigma) a 27 ºC foram infectadas em um MOI de 2 com um estoque de vírus P1 e o sobrenadante colhido em 72 horas. O sobrenadante foi ligado em batelada durante 1 hora a 4 ºC com resina de agarose de afinidade Anti-FLAG M2 (Sigma) lavada em PBS e a resina subsequentemente transferida para uma coluna e lavada extensivamente com PBS. A proteína foi eluída com 100 ug/ml de peptídeo FLAG. A proteína eluída foi concentrada para 2 mL e carregada em uma coluna S-200 Superdex (GE Healthcare) em PBS a 1 mL/min. Frações de 2 ml foram recolhidas e as frações contendo a proteína Nectina-4 concentradas para 16 mg/ml.
[396] A proteína foi biotinilada aleatoriamente em PBS usando o reagente EZ-Link"yY Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina (Thermo Fisher) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. A proteína foi extensivamente dessalinizada para remover a biotina desacoplada usando colunas de rotação em PBS.
[397] Para a análise da ligação do peptídeo, um instrumento Biacore 3000 foi usado utilizando um chip CM5 (GE Healthcare). À estreptavidina foi imobilizada no chip usando química de acoplamento de amina padrão a 25 ºC com HBS-N (HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, pH
7. 4) como tampão de funcionamento. Resumidamente, a superfície de carboximetil dextrano foi ativada com uma injeção de 7 minutos de uma proporção de 1:1 de 04 M de cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/0,1 M N-hidróxi succinimida (NHS) em um taxa de fluxo de 10 ulímin. Para a captura da estreptavidina, a proteína foi diluída para 0,2 mg/ml em 10 mM de acetato de sódio (pH 4,5) e capturada por injeção de 120 ul de estreptavidina na superfície do chip ativado. Grupos ativados residuais foram bloqueados com uma injeção de 7 minutos de etanolamina a 1 M (pH 8,5) e Nectina-4 biotinilada capturada a um nível de 1.200-1.800 RU. O tampão foi alterado para PBS/Tween 20 a 0,05% e uma série de diluições dos peptídeos foi preparada neste tampão com uma concentração final de DMSO de 0,5%. A concentração de peptídeo superior foi de 100 nM com mais 6 diluições de 2 vezes. A análise SPR foi executada a 25 ºC a uma taxa de fluxo de 50 ul/min com 60 segundos de associação e dissociação entre 400 e 1.200 segundos, dependendo do peptídeo individual. Os dados foram corrigidos para efeitos de volume excluídos do DMSO. Todos os dados foram duplamente referenciados para injeções em branco e superfície de referência usando procedimentos de processamento padrão e processamento de dados e ajuste cinético foram realizados usando o software Scrubber, versão 2.0c (Software BioLogic). Os dados foram ajustados usando modelo de ligação 1:1 simples, permitindo efeitos de transporte de massa quando apropriado.
[398] Certos ligantes peptídicos da invenção foram testados nos ensaios de ligação de Nectina-4 mencionados acima e os resultados são mostrados nas Tabelas 1 e 2: Tabela 1: Dados de Ligação Direta para Ligantes Peptídicos Selecionados da Invenção Molecular (nM)
(Carboxifluorosceína)(SEQ TATA [ser a a es em que "A" representa L-Alanina e "a" representa L-Alanina e * refere-se a uma média de 2 experimentos Tabela 2: Dados de Ligação de Competição para Ligantes Peptídicos Selecionados da Invenção resmas | am | ET | No. do Biclico K; (HUM) Experimentos
| BOSS | oo | 6 |
[BEST
[O BoY&1I%s — | omwr [6 |
BCY8184 0,0032 BCY8185 0,0261 BCYB186 0,006 BCY8187 0,005 BCY8188 BCYB189 0,1658 BCY8191 0,0045 BCY8192 0,005 BCYB193 0,003 BCY8194 0,0035 BCYB211 0,0045 BCY8212 0,003 BCY8213 0,0035 BCYB214 0,0063 BCY8215 0,003
[399] Certos peptídeos bicíclicos da invenção foram testados no ensaio de SPR acia mencionado e os resultados são mostrados na Tabela 3: Tabela 3: Dados de SPR para Ligantes Peptídicos Selecionados da Invenção No. do Bicíclo | Kd de SPR Humano (nM) | mn | BCY428 333,52 BCY3385 87,37 BCY7390 40,31 BCY7393 1383,33 BCY7765 24,94 BCY8038 44,53 e a ee a
BCY8116 0,372 n = número médio de experimentos
[400] Certos peptídeos bicíclicos da invenção foram conjugados a agentes citotóxicos e testados no ensaio SPR mencionado acima e os resultados são mostrados na Tabela 4: Tabela 4: Dados SPR para BDCs selecionados da invenção Conjugado Peptídeo Kd de SPR bicíclico da humano (nM) fármaco (BDC) No. BCY7683 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-BCY7556 27,10(n=1) BCY7825 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-BCY7814 11,60 (n=1) BCY7826 DM1-SPDB(SO3H)-BCY7814 12,10(n=1) BCY8245 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-BCY8234 5,12(n=4) BCY8253 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-BCY8231 6,22 (n=4) BCY8254 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-BCY8232 4,11(n=1) BCY8255 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-BCY8235 8,58 (n=4) BCY8549 MMAE-PABC-ciclobutyl-(B-Ala)-BCY8234 |1,44(n=1) BCY8550 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-(Lys3)- 0,27 (n=1) BCY8831 BCY8783 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-BCY8269 0,804 (n=1) BCY8784 MMAE-PABC-CIit-Val-Glutaril-BCY8273 0,662 (n=1) Estudos in vivo
[401] Em cada um dos exemplos 1 a 5 e 9 a seguinte metodologia foi adotada para cada estudo : Teste e Artigos de Controle Positivo Número Descrição Física | Peso Pureza Condição de Molecular armazenamento
Métodos Experimentais e Procedimentos (1) Observações
[402] Todos os procedimentos relacionados ao manejo, cuidado e tratamento dos animais no estudo foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais (IACUC) do WUuXi AppTec, seguindo as orientações da Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidados de Animais de Laboratório (ARALAC). No momento do monitoramento de rotina, os animais foram verificados diariamente quanto a quaisquer efeitos do crescimento do tumor e tratamentos sobre o comportamento normal, como mobilidade, consumo de comida e água (apenas olhando), ganho/perda de peso corporal, emaranhado de olhos/cabelo e qualquer outro efeito anormal, conforme estabelecido no protocolo. A morte e os sinais clínicos observados foram registrados com base no número de animais em cada subconjunto.
(ii) Medições de tumor e os pontos finais
[403] O principal ponto final era ver se o crescimento do tumor poderia ser atrasado ou os camundongos poderiam ser curados. O volume tumoral foi medido três vezes por semana em duas dimensões usando um paquímetro, e o volume foi expresso em mm? usando a fórmula: V = 0,5 a x b? onde a e b são os diâmetros longo e curto do tumor, respectivamente. O tamanho do tumor foi então usado para cálculos do valor T/C. O valor T/C (em porcentagem) é uma indicação da eficácia antitumoral; T e C são os volumes médios dos grupos tratado e controle, respectivamente, em um determinado dia.
[404] TGI foi calculado para cada grupo usando a fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-To)/(Vi-Vo)] x 100; T; é o volume médio do tumor de um grupo de tratamento em um determinado dia, To é o volume médio do tumor do grupo de tratamento no dia do início do tratamento, Vi; é o volume médio do tumor do grupo de controle do veículo no mesmo dia com Ti, e Vo é o volume médio do tumor do grupo do veículo no dia do início do tratamento. (iii) Análise Estatística
[405] As estatísticas resumidas, incluindo a média e o erro padrão da média (SEM), são fornecidas para o volume tumoral de cada grupo em cada ponto de tempo.
[406] A análise estatística da diferença no volume tumoral entre os grupos foi realizada com base nos dados obtidos no melhor ponto de tempo terapêutico após a dose final.
[407] Um ANOVA de uma via foi realizado para comparar o volume tumoral entre os grupos, e quando uma estatística F significativa (uma razão da variância do tratamento para a variância do erro) foi obtida, as comparações entre os grupos foram realizadas com o teste Games- Howell. Todos os dados foram analisados usando GraphPad Prism 5.0. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Exemplo 1: Teste de eficácia in vivo de BCY7683, BCY7825, BCY7826, BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255 no tratamento de NCI-H292 (modelo de Câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC)) em camundongos nus BALB/c
1. Objetivo do Estudo
[408] O objetivo da pesquisa foi avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY7683, BOY 7825, BOY 7826, BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255 no tratamento do modelo de xenoenxerto NCI-H292 em camundongos nus BALB/c.
2. Projeto Experimental Volume de Dose Rota de Tratamento Dosagem Programa (mg/kg) Dosagem (uia) Eos RR mA Nota: n: número do animal; Volume de dosagem: ajustar volume de dosagem com base no peso corporal de 10 ul/g. * A dosagem de BCY7683 foi diminuída para 3 mg/kg a partir do dia 7. ** O esquema de tratamento foi ajustado com base no peso corporal no dia da dosagem.
3. Materiais
3.1 Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus
Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 12 camundongos para o teste BCY7683, 21 camundongos para BCY7825 e BCY7826, 18 camundongos para BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255 mais sobressalentes Fornecedor de animais: Shanghai LC Laboratory Animal Co., LTD.
3.1.2. Condição de habitação
[409] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 animais em cada gaiola.
e Temperatura: 20 — 26 ºC. * Umidade 40-70%.
[410] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[411] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[412] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[413] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[414] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
3.2 Artigos de Teste e Controle Positivo
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[415] As células tumorais NCI-H292 serão mantidas em meio suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em atmosfera de 5% de CO, em ar. As células tumorais serão rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial serão colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação do Tumor
[416] Cada camundongo será inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais NCI-H292 (10 x 106) em 0,2 ml de PBS para o desenvolvimento do tumor. Os animais serão randomizados e o tratamento será iniciado quando o volume tumoral médio atingir aproximadamente 158-406 mm?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na seguinte tabela de projeto experimental.
4.3 Preparação de Formulação de Artigo de Teste a a A 7 Dissolver 2,25 mg de BCY7683 com 112 ul de BCY7683 estoque cpm 90 ul de Kolliphor, 454! de BCY7683 1ImMM de Hepes e 742,5 de água . Diluir 0,5 mg/ml de solução de dosage com 0,-3 tampão de 2.5% de DMSO, 10% Kolliphor, e 50 po dee | [veias — = Ts mude Histana, 10% de sacarose pite7 | tampão de formulação
Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY7825 em 630 ul 0,,3 : A de tampão de formulação 0,1 Diluir 90 ul 1 mg/ml de BOCY7825 em 810 ul ” de tampão de formulação mM de Histidina, 10% de sacarose pH=7 tampão 1 Dissolver 3,,2 mg de BCY7826 em 3,,2 ml! de tampão de formulação BCY7826 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY7826 em 630 ul 0,,3 : A de tampão de formulação 01 Diluir 90 ul 1 mg/ml de BOCY7826 em 810 ul ” de tampão de formulação Artigo de = Son mai) [veículo — [2] 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose 1 Dissolver 1,61 mg de BCY8245 com 1,604 ml de tampão (veículo) 01 Diluir 90 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com ' 810 ul de tampão (veículo) BCY8245 0,3 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque ' com 630 ul de tampão (veículo)
0.5 Diluir 450 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque ' com 450 ul de tampão (veículo) 1 Dissolver 1,15 mg de BCY8253 com 1,116 ml de tampão (veículo) 01 Diluir 90 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com ' 810 ul de tampão (veículo) BCY8253 0,3 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque ' com 630 ul de tampão (veículo) 05 Diluir 450 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque ' com 450 ul de tampão (veículo) 1 Dissolver 1,80 mg de BCY8254 com 1,789 ml de tampão (veículo) 01 Diluir 90 ul 1 mg/ml de BCY8254 estoque com ' 810 ul de tampão (veículo) BCY8254 Diluir 270 pl 1 mg/ml de BCY8254 estoque 0,3 = , com 630 ul de tampão (veículo) Diluir 450 ul 1 mg/ml de BCY8254 estoque 0,5 com 450 ul de tampão (veículo)
Dissolver 1,30 mg de BCY8255 com 1,192 ml 1 de 50 mM de acetato/ácido acético pH5 10% de sacarose Diluir 90 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 0,1 810 ul de 50 mM de acetato/ácido acético pH5 10% de sacarose BCY8255 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque 0,3 com 630 ul de 50 mM de acetato/ácido acético PH5 10% de sacarose Diluir 450 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque 0,5 com 450 ul de 50 mM de acetato/ácido acético PH5 10% de sacarose Artigo de = Con. (maim) |veícuo — |. | 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose BCY8245 1 Dissolver 10,56 mg de BCY8245 em 10,518 ml de tampão de Histidina Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque BOY8245 0.5 com 400 ul de tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque BOY8245 0.3 com 560 ul de tampão de Histidina BCY8253 1 Dissolver 11,35 mg de BCY8253 em 11,010 ml de tampão de Histidina Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque B0Y8253 0.5 com 400 ul de tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque B0Y8253 0.3 com 560 ul de tampão de Histidina BCY8255 1 Dissolver 10,78 mg de BCY8255 em 10,715 ml Tampão de acetato Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque BOY8255 0.5 com 400 ul de tampão de acetato Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque BOY8255 0.3 com 560 ul de tampão de acetato
1. Tampão de histidina: 25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose
2.. Tampão de acetato: 50 mM de acetato/ácido acético pH 5 10% de sacarose
3. BCY8245(1mg/mL), BCY8253(1mg/mL) e BCY8255(1mg/mL) estoques foram separados em tubos individuais e armazenados a -80ºC
4.4 Coleta de Amostra
[417] No final do estudo, o plasma foi coletado a 5 min, 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após última dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento Tumoral
[418] Curvas de Crescimento Tumoral são mostradas nas figuras 1to 10.
5.2 Traço de Volume Tumoral
[419] Volume tumoral médio através do tempo em camundongos Balb/c fêmeas nus portando xenoenxertos NCI-H292 é mostrado nas tabelas abaixo: Tabela 5: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo TE Sss:A:I)Rllias após o início do tratamento Tratamento o o 2 4 7 9 nn 14 16 Veículo, piw — 179E 32TH2 407+5 53883 620x2 71286 87OsB 4 8 1 5 7 o 8 Bcy7zesa, ger qe o AO O O 5/3 mpk, biw/qw " 8 97+16 88+17 72+14 58H16 4/+9 - Tabela 6: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo ãÔÓc >O AA ias após o inicio dotratamento =|| Tratamento o o 2 5 7 9 12 14 Veículo, biw — 15811 227+7 302+25 398+47 452+47 558H+46 718+79 BOYTBA5, 1 mpk, 15611 214+20 332+31 444+46 505+62 GO5+52 —754+66 biw BOYTBA5, 3 mpk, 159+28 195+29 119+30 102+35 103+35 —65+21 73+24 biw BOYTBA5, 3 mpk, 157417 179+22 162+18 179+20 146+23 109+8 —116+25 qw
BCYTB26, 1 mpk, 15715 22343 297+13 350+10 449+69 530+71 625111 biw IBOYTB26, 3 mpk, 158+27 17132 121+25 110+29 990+22 8716 9119 biw IBOYTB26, 3 mpk, 157+10 183+14 215+32 284+35 319+33 247+14 29816 qw Tabela 7: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo | O eóXÔCÔcOccÔÔQg e ÕZ C0“Aiag5 após o inicio do tratamento = Tratamento o 16 19 21 Veículo, biw 895+160 — 1026+175 1107+210 BCYTB25, O 1 mpk, 890+126 982+133 1063+139 biw BCYTB25, O 3 mpk, 87+26 81+28 80+29 biw BCYTB25, O 3 mpk, 130+30 133+28 177434 qw BCY78B26, O 1 mpk, 671+109 731+144 774+151 biw BCYTBA6, O 3 mpk, 88+19 75+23 93+33 biw BCYTBA6, O 3 mpk, 33313 378+19 425+25 qw
Tabela 8: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo Tratamento — O 2 4 7 9 MM 14 16. “Veículo, qv 410X/77 516:69 62/%61 931141 11188225 1208 149583 17438. +257 É — 65 419 “BCY8245, 40465 39142 542H14 721136 762+115 607% 61489 62693 1/3/5 mpk, 95 qw “BCY8253 40115 420H34 536:26 789H/1 713:290 593% 63713 70840 1/3/ mpk, 65 qw “BCY8254 408H:65 442H48 601471 73/2/6 74/28/38 565% 54353 599026. 1/3/5 mpk, 47 qw “BCY8255, 408:62 482:50 582+39 750111 771%906 698 6/0%83 76159 1/3/5 mpk, 58 qw Tratamento — 18 — 21 23 25 28 30 32 35 “Veículo,qw 1950E5 —2T49E6 ||| 51 39 “BCY8245, G611:93 65415 732+139 755132 713114 762: 96829 11192 1/3/5 mpk, 2 165 o 16 qw “BCY8253 G58:95 69/14 685110 73/:81 930+100 965% 1029H1 12932 1/3/5 mpk, o 163 85 6 qw “BCY8254 G623H:43 684:907 740:682 771158 840:55 856: 88389 10041. 1/3/5 mpk, 129 TI qw “BCY8255, 838HX12 85616 1003170 105821 1103233 1182 1259%2 13202 1/3/5 mpk, 7 3 1 +258 — 26 67 qw Tabela 9: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo o Diasapósoiniciodotratamento Tratamento a o 2 4 7 9 1 14 Veículo, qu 161+2 270+14 357+14 448H17 570+16 720+36 948+61 BCY8245,ÀÀUUUUUU A AAA AS ADIA An AdAR 160+5 220+11 266+15 218+23 167+10 16136 149+43 3 mpk, qu
BCY8245, 162+13 243+19 21112 101+11 100+8 877 65+3 3 mpk, biw BCY8245, 160+9 176+7 191+3 105+8 82+3 9114 83+8 mpk, qu BCY8253, 162+7 187+9 176+20 159+15 147+8 114+13 — 98+3 3 mpk, qu BCY8253, 162+14 174+9 149+7 70+2 68+6 58+2 49+5 3 mpk, biw BCY8253, 16110 —161+9 121+9 97+3 79+6 82+8 68+9 5 mpk, qu BCY8255, 162+8 19514 160+5 123+1 108+5 104+3 — 100+9 3 mpk, qu BCY8255, 162+15 204+16 148+11 132+16 102+20 /106+38 96+35 3 mpk, biw BCY8255, 164+8 171+8 103+9 101+5 89+11 87+32 — 97+44 5 mpk, qu
5.3 Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[420] Taxa de inibição de crescimento tumoral para BCY7683, BCY7825, BCY7826, BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255 no modelo de xenoenxertos de NCI-H292 no dia 14 foi calculada com base nas medicos de volume tumoral. Tabela 10: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Valor P Volume do Tumor TIC? TGI Tratamento comparado (mm?) (%) (%) , com veículo Veículo, biw 879+88 -—- -— - BCY7683, 47+9 5.3 118.4 p<0.001 5 mpk, biw/qw a. Média + SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
Tabela 11: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Volume do Tratamento Tumor TIC” (%) TGI (%) Valor P (mm?) Veículo, biw 1107+210 -— -- -- BCY7825,1 1063+139 96,0 4,3 p>0,05 mpk,biw BCY7825, 80+29 7,3 108,3 p<0,001 3 mpk, biw BCY7825, 177+34 16,0 97,9 p<0,001 3 mpk, qv BCY7826, . 774+151 70,0 34,9 p>0,05 1 mpk, biw BCY7826, . 93+33 84 106,9 p<0,001 3 mpk, biw BCY7826, 425+25 38,4 71,7 p<0,01 3 mpk, qv Tabela 12: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Valor P Tumor Tratamento TICP(% TGI(%) comparado Volume (mm?)º com veículo Veículo, qu 2149+639 - -— -- BCY8245, 654+152 30,4 85,7 p<0,05 1/3/5 mpk, qwv BCY8253 697+140 32,4 83,0 p<0,05 1/3/5 mpk, qwv BCY8254 684+97 31,8 84,1 p<0,05 1/3/5 mpk, qwv BCY8255, 856+163 39,8 74,2 p<0,05 1/3/5 mpk, qwv b.
Média + SEM. c.
A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C)
Tabela 13: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Valor P Tumor Tratamento TIC (% TGI(%) comparado Volume (mm?)º com veículo Veículo, qu 948+61 -- -- -- BCY8245, 149+43 15,8 101,4 p<0,001 3 mpk, qv BCY8245, 65+3 6,9 112,2 p<0,001 3 mpk, biw BCY8245, 83+8 8,8 109,8 p<0,001 mpk, qv BCY8253, 98+3 10,4 108,1 p<0,001 3 mpk, qv BCY8253, . 49+5 5,2 114,3 p<0,001 3 mpk, biw BCY8253, 68+9 7,2 111,9 p<0,001 5 mpk, qv BCY8255, 100+9 10,6 107,9 p<0,001 3 mpk, qv BCY8255, 96+35 10,1 108,5 p<0,001 3 mpk, biw BCY8255, 97+44 10,2 108,5 p<0,001 5 mpk, qv a. Média + SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[421] Neste estudo, a eficácia terapêutica de BCY7683, BCY7825, BCY7826, BCY8245, BCY8253, BOCY8254 e BCY8255 no modelo de xenoenxerto NCI-H292 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 1 a 10 e Tabelas 5 a 13.
[422] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 879 mm? no dia 14. BCY7683 a 5 mg/kg mostrou rápida regressão do tumor após o tratamento, mas o tratamento induziu perda severa de peso corporal, então a dosagem foi suspensa no dia 3 e ajustada para 3 mg/kg no dia 7. Finalmente, BCY7683 (TV = 47 mmº, TGI = 118,4%, p < 0,001) produziu eficácia antitumoral óbvia e todos os camundongos sobreviveram até o ponto final.
[423] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 1107 mm? no dia 21. BOY7825 a 1 mg/kg (TV = 1063 mm?, TGI = 4,3%, p > 0,05) não produziu qualquer atividade antitumoral, BCY7825 a 3 mg/kg biw (TV = 80 mm?, TGI = 108,3%, p < 0,001) e 3 mg/kg qw (TV = 177 mmº?, TGI = 97,9%, p < 0,001) regrediram o tumor rapidamente e mostraram atividade antitumoral potente.
[424] BCY7826 a 1 mg/kg (TV = 774 mm?, TGI = 34,9%, p > 0,05) não produziu atividade antitumoral óbvia, BOY7826 a 3 mg/kg biw (TV = 93 mm?, TGI = 106,9%, p < 0,001) e 3 mg/kg (TV = 425 mmº?, TGI = 71,7%, p < 0,01) qwv produziram atividade antitumoral dependente da frequência de dosagem. Entre eles, BOY7826 a 3 mg/kg biw induziu regressão tumoral óbvia.
[425] BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255 a 1 mg/kg não produziram atividade antitumoral significativa, todos os quatro artigos de teste mostraram atividade antitumoral óbvia após aumentar a dosagem para 3 mg/kg a partir do dia 7, mas a eficácia não foi melhorada após aumentar a dosagem para 5 mg/kg no dia 21. Neste estudo, todos os animais de tratamento mostraram perda de peso corporal contínua durante o esquema de dosagem, isto pode ser devido à carga tumoral e à toxicidade dos artigos de teste.
[426] BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 149 mm?, TGI = 101,4%, p < 0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 65 mmº?, TGI = 112,2%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 83 mm3?, TGI = 109,8%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[427] BCY8253 a 3 mg/kg, qw (TV = 98 mm3, TGI = 108,1%, p < 0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 49 mm?, TGI = 114,3%, p < 0,001) e a 5 mg/kg, qw (TV = 68 mm?, TGI = 111,9%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[428] BCY8255 a 3 mg/kg, qw (TV = 100 mm?, TGI = 107,9%, p < 0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 96 mm?, TGI = 108,5%, p < 0,001) e a 5 mg/kg, qwv (TV = 97 mm?, TGI = 108,5%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[429] Todos os artigos de teste a 3 mg/kg, qw, 3 mg/kg, biw e 5 mg/kg, qwv mostraram atividade antitumoral comparável, a eficácia não melhorou ainda mais quando se aumentou a dosagem ou frequência de dose.
[430] Neste estudo, os animais tratados com BCY8253 a 5 mg/kg mostraram uma perda média de 15% do peso corporal no dia 9, os camundongos em outros grupos mantiveram bem o peso corporal. Exemplo 2: Teste de eficácia in vivo de BCY7825, BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255 no tratamento de xenoenxerto HT- 1376 (modelo de câncer de bexiga) em camundongos CB17-SCID
1. Objetivo do Estudo
[431] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento do xenoenxerto HT-1376 em camundongos CB17-SCID.
2. Projeto Experimental Tratamento Dose Volume de | Rotade | Progra- (mg/kg) Dosagem Dosa- ma Tri Le Re a
[o sos a fume] o ar e = a es [re 6 a a 1mg/kg for the first week e 3 mg/kg for the following 2 semanas
3. Materiais
3.1 Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: CB17-SCID Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 21-41 camundongos mais sobressalentes Fornecedor de animais: Shanghai LC Laboratory Animal Co., LTD.
3.1.2. Condição de habitação
[432] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola. e Temperatura: 20 — 26ºC. * Umidade 40-70%.
[433] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[434] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[435] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[436] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[437] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[438] As células tumorais HT-1376 foram mantidas in vitro como cultura em monocamada em meio EMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor a 37ºC em atmosfera de 5% de CO>z em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana por tratamento com tripsina-EDTA. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação do Tumor
[439] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais HT-1376 (5 x 106º) em 0,2 ml de PBS com matrigel (1:1) para o desenvolvimento do tumor. Os animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 153-164 mm?º. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3 Preparação de Formulação de Artigo de Teste (mg/ml)
BCY7825 0,1 Diluir 90 ul 1 mg/ml de BCY7825 estoque com 810 ul 10 % Kolliphor, 50 mM de Hepes pH 7 BCY7825 0,3 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BOY7825 estoque com 630 ul 10 % Kolliphor, 50 mM de Hepes pH 7 BCY8245 0,1 Diluir 90 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 810 ul de tampão (veículo) BCY8245 0,3 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 630 ul de tampão (veículo) BCY8253 0,1 Diluir 90 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 810 ul de tampão (veículo) BCY8253 0,3 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 630 ul de tampão (veículo) BCY8254 0,3 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY8254 estoque com 630 ul de tampão (veículo) BCY8255 0,1 Diluir 900 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 810 ul de tampão (veículo) BCY8255 0,3 Diluir 270 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 630 ul de tampão (veículo) Artigo de | Con, Formulação teste (mg/ml) | Veículo — = | 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 400 ul BCY8245 0,5 de tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 560 ul BCY8245 0,3 de tampão de Histidina Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 400 ul BCY8253 0,5 de tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 560 ul BCY8253 0,3 de tampão de Histidina Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul BCY8255 0,5 de tampão de acetato Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul BCY8255 0,3 de tampão de acetato Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose Tampão de acetato: 50 mM de acetato/ácido acético pH 5 10% de sacarose
4.4 Coleta de Amostra
[440] No final do estudo, o plasma do grupo 3, 4, 5, 6 e grupo 7 foi coletado em 5 min, 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após a última dosagem. O plasma do grupo 11, 14 e 17 foi coletado em 5 min, 15 min, min, 60 min e 120 min após a última dosagem. O tumor dos grupos 11,14 e grupo 17 foram coletados 2 h após a última dosagem. O tumor dos grupos 8, 9, 10, 12, 13, 15 e 16 foram coletados 2 h após a última dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento do Tumor
[441] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 11 a 18.
5.2 Traços do Volume Tumoral
[442] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos CB17-SCID fêmeas com xenoenxerto HT-1376 é mostrado nas Tabelas 14 e 15.
Tabela 14: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo mo Tratamento 1 Dias após início do tratamento É OSÊbétÕÔ5??]2)y” -!” "o :,“ “” ” o 2 4 7 9 1 14 16 18 21
1 Veículo, qv 168+37 —220+47 274+56 391+73 442+75 503+82 576+84 G49+81 801+84 B8B4+81
12 Bew7eas, O .AúP0 a 6 dA [é 12 tmwm)bdnalr"M/ A rH«osn0“diaac=- )::) 1 mpk, qv 165+26 222+42 280+36 385+31 431+21 478+31 546+17 636+37 GO3+94 — 772+101
O BOYW85, . 1 ÔóÔÉ. ke: ij(/m1950>aÓ a" º=ÉA
? 3 mpk, qv 165+23 —195+26 209+12 307+24 365+21 358+15 412+13 423+19 467+14 54549 a BSYS A ggeKgeg”cat6n ãaÔóÔZeannaÔsÔ a ocçõÕ cz>>»>Só >>micriçiçaççça:seaaoecC>ZO a 1U3mpk qu — 164+16 184+12 206+14 265+21 291+10 281+28 335+16 354+11 309+19 347+14 S
1 Beysass o ll/]"i ae sam r rp)T mi - -“psSAAM "eg uH5N.ST“-"-]"0"aAgvyçsanNueraaaPPºélimins arsnsrsiseees = 13mpk,qv — 163+37 201+47 240+42 333+49 35819 305+28 370+33 386+41 348H+15 448+19 o Beyvsasa NS. o-A5AS“SJ ?ÃÃ5E rd np --I4<mu" ;.O HA NM A) A "7 5PÉZACZDA 13mpk,qv — 162+17 156+18 200+22 305+28 338+55 326+33 419+36 4290+42 453+34 539+75
1 Mú mBevsass oi r-ÓA:|i: 5 2 $l=- pn a )o-!)ia-e "1 7 2 " 04057 -.Ú1“9“3 l lr gn pa CA 13mpk,qv — 162+28 198H+40 257+43 352+49 375+81 332+22 385+45 440+12 514+144 549+149
Tabela 15: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo Dias após o início do tratamento Gr. Tratamento RC o 2 5 7 9 12 14 8 Veículoqw 153+16 266+30 398+41 529+56 721+76 908+91 1069+90 BCY8245, 9 153+26 254+53 298+69 398+61 468+73 502+67 603+76 3 mpk, qv BCY8245, 10 154+30 248+58 203+15 273+45 356+50 391+53 407+53 3 mpk, biw BCY8245, n 153+15 237+41 228+36 317+31 394+20 438+31 465+33 mpk, qv BCY8253, 12 153+12 209+9 269+8 343+29 447+33 466+25 533+29 3 mpk, qv BCY8253, 13 153+13 214+33 246+18 286+23 364+41 400+33 442+45 3 mpk, biw BCY8253, 14 153+15 217+49 231+49 308+36 360+44 401+/0 442+62 5 mpk, qv BCY8255, 153+22 233+3 284+6 358+27 476+40 486+65 538+59 3 mpk, qv BCY8255, 16 . 15321 233+33 218+23 298+45 336+42 365+31 390+40 3 mpk, biw BCY8255, 17 152+17 233+30 290+4 338+10 406+26 459+68 516+64 5 mpk, qv
5.3 Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[443] A taxa de inibição do crescimento do tumor para o Artigo de teste no modelo de xenoenxerto HT-1376 foi calculada com base nas medições do volume do tumor no dia 21 após o início de tratamento. Tabela 16:Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Valor P Tumor TGI Gr Tratamento TICº (%) comparado Volume (mm?)º (%) com veículo 1 Veículo, qv 884+81 -- -- -—-
T Bcyr8285 UI ÓT IA "9 2 772+101 87,3 15,2 p>0,05 1 mpk, qv To Boyz, ST? ?!;/4J É A ÉAAÃS st =P 3 545+9 61,6 46,9 p<0,05 3 mpk, qv To Boyaags, o PeOA0C55 =P": Pa ai 4 347+14 39,2 74,5 p<0,001 3 mpk, qv O BCY8253, o 5 pó" > Tt" jPUa CTT 275 448+19 50,6 60,2 p<0,01 3 mpk, qv ML Bcysasa, -SP58""PP "5 y“rP=e<7757752"""“- 6 539+75 60,9 47,4 p<0,05 3 mpk, qv Boyaass, O IEBÉE Ab PÔ aa TO 27 7 549+149 62,1 45,9 p<0,05 3 mpk, qv a.
Média + SEM. b.
A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C) Tabela 17:Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Valor P Tumor TGI Gr Tratamento TIC” (%) comparado Volume (mm?)º (%) com veículo 8 Veículo, qu 1069+90 -- -— -- BCY8245, 9 603+76 56,4 50,9 p<0,01 3 mpk, qv — Bcygaass — t0mÕs" J 6:45 o]Õ" TP 10 . 407+53 38,1 72,3 p<0,001 3 mpk, biw To Boysags, o =" -I)“"A 7 7 ô-ÊAA AA A CÔCScSSÉS n 465+33 43,5 66,0 p<0,001 5 mpk, qv BCY8253, 12 533+29 49,8 58,5 p<0,01 3 mpk, qv O BCysA53ã o NA/AP A a PAGA AAA AS 133 442+45 41,3 68,4 p<0,001 3 mpk, biw ML, BoYaasa, OS õU3 ÚÕO 0 = a AA 14 442+62 41,4 68,5 p<0,001 5 mpk, qv
15 BEY8255, 538+59 50,3 58,0 p<0,01 3 mpk, qv 16 BEY8255, 390+40 36,5 74,1 p<0,001 3 mpk, biw 117 BEY8255, 516+64 48,3 60,3 p<0,01 mpk, qv b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados Grupos 1-7
[444] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto HT-1376 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 11 a 15 e Tabelas 14 e 15.
[445] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 884 mm? no dia 21. BCY7825 a 1 mg/kg (TV = 772 mmº, TGI = 15,2%, p > 0,05) não produziu atividade antitumoral significativa, BCY7825 a 3 mg/kg (TV = 545 mmº?, TGI = 46,9%, p < 0,05) produziu atividade antitumoral significativa.
[446] BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255 a 1 mg/kg produziram atividade antitumoral leve e melhor eficácia foi encontrada após aumentar a dosagem para 3 mg/kg a partir do dia 7.
[447] Neste estudo, alguns camundongos tratados com artigos de teste a 3 mg/kg mostraram mais de 10% de perda de peso corporal, um camundongo tratado com BCY8255 a 3 mg/kg foi encontrado morto no dia 16, os camundongos no veículo e os grupos BCY7825 1 mg/kg mantiveram o peso corporal também. Grupos 8-17
[448] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto HT-1376 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 16 a 18 e nas Tabelas 16 e 17.
[449] BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 603 mm?, TGI = 50,9%, p < 0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 407 mmº?, TGI = 72,3%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 465 mmº?, TGI = 66,0%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[450] BCY8253 a 3 mg/kg, qw (TV = 533 mmº?, TGI = 58,5%, p < 0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 442 mmº, TGI = 68,4%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 442 mmº?, TGI = 68,5%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[451] BCY8255 a 3 mg/kg, qw (TV = 538 mm?, TGI = 58,0%, p < 0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 390 mmº, TGI = 74,1%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 516 mmº?, TGI = 60,3%, p < 0,01) produziu atividade antitumoral significativa.
[452] Neste estudo, BCY8245 e BCY8253 a 5 mg/kg qw causaram mais de 10% de perda de peso corporal do animal durante o esquema de tratamento. Exemplo 3: Estudo de eficácia in vivo de BCY8245, BCY8253 e BCY8255 no tratamento de xenoenxerto Panc2.13 (modelo de câncer pancreático) em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[453] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento do xenoenxerto Panc2.13 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental Tratamento Dose Dosagem | Dosagem | Progra- (mg/kg) Volume Rota ma
LE E Loss 5
[o soe | [er o eo [E soe | [er o [9 soe | Ter o eo
3. Materiais
3.1 Animais e Condições de Habitação
3.1.1 Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes Fornecedor de animais: Shanghai LC Laboratory Animal Co., LTD.
3.1.2. Condição de habitação
[454] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola. * Temperatura: 20 — 26 ºC. * Umidade 40-70%.
[455] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[456] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[457] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[458] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[459] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[460] As células tumorais Panc2.13 serão mantidas em meio RMPI1640 suplementado com 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 10 unidades/ml de insulina humana recombinante a 37ºC em atmosfera de 5% CO,» em ar. As células tumorais serão rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial serão colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação do Tumor
[461] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais Panc2.13 (5 x 106) com Matrigel (1:1) em 0,2 ml de PBS para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 149 mmº?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3 Preparação de Formulação de Artigo de Teste este (mg/ml) [Vecmo = [26mMdersianapH TON desammse
BCY8253 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 560 ul de tampão de Histidina BCY8255 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul de tampão de acetato BCY8255 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul de tampão de acetato Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose Tampão de acetato: 50 mM de acetato/ácido acético pH 5 10% de sacarose
4.4 Coleta de Amostra
[462] No final do estudo, o tumor de todos os grupos foi coletado 2 h após a última dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento do Tumor
[463] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 19 a 21.
5.2 Traços do Volume Tumoral
[464] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto Panc2.13 é mostrado na Tabela 18. Tabela 18: Traços do volume tumoral ao longo do tempo Dias após o início do tratamento Gr. Tratamento o o 2 4 7 9 n 14 1 Veículo, qu — 149+12 202+12 240+9 321+17 410+27 479+32 54517 BCY8245, 2 149+34 160+33 191+39 21553 242+62 259+59 271+54 3 mpk, qu BCY8245, 3 148H+46 170+38 204+57 216+56 236+59 241+60 231+57 3 mpk, biw BCY8245, 4 149+18 180+11 231+33 242+34 248+40 231+37 238+40 mpk, qu BCY8253, 5 149+19 176+20 230+25 253+20 274+27 303+18 324+21 3 mpk, qu BCY8253, 6 . 149+42 175+39 217+61 216+59 222+64 213+64 219+68 3 mpk, biw
BCY8253, 7 14847 —159+8 1955 190+5 173+11 16812 170+23 mpk, qu BCY8255, 8 150+35 184+39 234+52 267+52 277+54 297+55 310+58 3 mpk, qu BCY8255, 9 149+41 186+43 233+52 247+53 256+54 244+44 251+44 3 mpk, biw BCY8255, 150+27 180+27 223+37 239+39 224+31 200+18 209+19 5 mpk, qu
5.3 Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[465] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto Panc2.13 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 19: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Tumor Valor P Gr Tratamento 3 TIC (% TGI(%) comparado Volume (mm?)? ; com veículo 1 Veículo, qu 545417 -- -— -- 2 BCY8245, 271+54 49,6 69,2 p<0,01 3 mpk, qv BCY8245, 3 3 mpk, biw 231+57 42,3 79,1 p<0,001 4 BCY8245, 238+40 43,6 77,5 p<0,001 5 mpk, qwv 5 BCY8253, 324+21 59,3 55,9 p<0,01 3 mpk, qv BCY8253, 6 3 mpk, biw 219+68 40,2 82,2 p<0,001 7 BCY8253, 170+23 31,1 94,5 p<0,001 5 mpk, qwv 8 BCY8255, 310+58 56,8 59,5 p<0,01 3 mpk, qv BCY8255, 9 3 mpk, biw 251+44 46,0 74,3 p<0,001 10 BCY8255, 209+19 38,2 85,1 p<0,001 5 mpk, qwv a. Média + SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[466] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto Panc2.13 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 19 a 21 e nas Tabelas 18 e 19.
[467] BCY8245 a 3 mg/kg, qwv (TV = 271 mm?, TGI = 69,2%, p < 0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 231 mmº?, TGI = 79,1%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 238 mmº?, TGI = 77,5%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[468] BCY8253 a 3 mg/kg, qw (TV = 324 mm?, TGI = 59,8%, p < 0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 219 mmº?, TGI = 82,2%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 170 mmº?, TGI = 94,5%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou maneira dependente da frequência da dose.
[469] BCY8255 a 3 mg/kg, qw (TV = 310 mm?, TGI = 59,5%, p < 0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 251 mmº, TGI = 74,3%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 209 mmº?, TGI = 85,1%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[470] Neste estudo, os animais em todos os grupos de 5 mg/kg qwv perderam em média 15% do peso corporal, especialmente aqueles nos grupos de 5 mg/kg BCY8253 e BCY8255, que perderam mais de 20% do peso corporal durante o esquema de tratamento. Exemplo 4: Estudo de eficácia in vivo de BCY8245, BCY8253 e BCY8255 no tratamento de xenoenxerto MDA-MB-468 (modelo de câncer de mama) em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[471] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY8245, BCY8253 e BCY8255 no tratamento do xenoenxerto MDA-MB-468 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental
Tratamento Dose Dosagem Dosagem | Program (mg/kg) Volume Rota a (ul'g) e e [E ses 5 ore] e o [E ses [5 oe] em vw E es 1 Ge] o o e
3. — Materiais
3.1 Animais e Condições de Habitação
3.1.1 Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes Fornecedor de animais: Shanghai LC Laboratory Animal Co., LTD.
3.1.2. Condição de habitação
[472] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola. * Temperatura: 20 — 26 ºC. * Umidade 40-70%.
[473] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[474] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[475] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[476] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[477] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[478] As células tumorais foram mantidas em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em atmosfera de 5% CO, em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação do Tumor
[479] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais MDA-MB-468 (10 x 10º) em 0,2 ml! de PBS suplementado com matrigel 50% para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 196 mm?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3 Preparação de Formulação de Artigo de Teste teste (mg/ml) [eco | - [smvcemstame pr 7IMdesTe o
BCY8245 0,5 Diluir 400 pl mam! de BCY8245 estoque com 400 ul de tampão de Histidina BCY8245 0,3 Diluir 240 pl mam! de BCY8245 estoque com 560 ul de tampão de Histidina BCY8253 1 Dissolver 11.35 mg de BCY8253 em 11.010 ml de tampão de Histidina BCY8253 0,5 Diluir 400 pl mam! de BCY8253 estoque com 400 ul de tampão de Histidina BCY8253 0,3 Diluir 240 pl mam! de BCY8253 estoque com 560 ul de tampão de Histidina BCY8255 Dissolver 10.78 mg de BCY8255 em 10.715 ml Tampão de acetato BCY8255 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul de tampão de acetato BCY8255 0,3 Dir ao ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul de tampão de acetato
1. Tampão de histidina: 25 mM de histidina pH7 10% de sacarose
2. Tampão de acetato: Acetato 50 mM/ácido acético pH 5 sacarose a 10%
3. Os estoques BCY8245 (1mg/mL), BCY8253 (1mg/mL) e BOCY8255 (1mg/mL) foram separados em tubos individuais e armazenados a -800C
4.4 Coleta de Amostras
[480] No dia 21 do estudo, o plasma do grupo 2, 5 e 8 foi coletado em 5 min, 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após a última dosagem. Os tumores dos grupos 1, 3, 6 e 9 foram coletados 2 h após a última dosagem. Os animais dos grupos 4, 7 e 10 foram mantidos correndo por mais 21 dias sem qualquer dosagem, e os tumores desses grupos foram coletados no dia 42.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento do Tumor
[481] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 22 a 24.
5.2 Traços do Volume Tumoral
[482] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto MDA-MB-468 é mostrado nas Tabelas 20 e 21.
Tabela 20:Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 0 ao dia 21) Dias após o início do tratamento Gr Tratamento á LO ODO OO SCSFPOOLà» O» ,»I—FOOOà»,»OICSCSOO O SDSSSCSDSSDILCSISCCDD»DSDLU,»FPPUt— o 2 4 7 9 n 14 16 18 21
1 Veículo, qv 199+6 217+9 23515 274+14 291+14 31420 348+24 37433 398+39 447+39 BCY8245,
2 194+12 192+26 184+20 131+20 113+17 10413 —94+25 81+23 — 8723 85+31 3 mpk, qv BCY8245,
3 . 195+33 193+27 154+20 103+20 83+16 67+14 — 4911 45+14 32+12 22+4 3 mpk, biw BCY8245,
4 199+28 193+11 1354 98+5 58+5 49+5 47+2 37+4 35+3 29+3 N mpk, qwv o BCY8253, dg
5 195+17 190+24 162+21 160+28 13833 139+32 136+25 106+24 104+18 109+19 Õ 3 mpk, qv o BCY8253,
6 . 199+34 198+13 150+21 119411 102+14 69+13 70+5 46+5 33+5 29+7 3 mpk, biw BCY8253,
7 198+28 188+32 142+32 150+20 95+13 69+13 67+13 47+8 42+5 40+8 5 mpk, qwv BCY8255,
8 198+18 191+15 172+24 148+18 139+13 11422 140+13 128+22 141+18 136431 3 mpk, qv BCY8255,
9 . 197+36 190+28 154+18 10911 90+13 67+3 64+7 51+8 41+5 311 3 mpk, biw BCY8255,
194+29 156+25 12119 109+14 7514 55+8 66+5 43+5 37+1 42+2 5 mpk, qwv
Tabela 21:Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 23 ao dia 42) TOS . Q bóbõbzzxzWBXbMkHãcage"ecereiessisAMNag após o inicio dotratamento ||| Gr. Tratamento o 23 25 28 32 35 39 42 BCY8245, 4 35+5 48+5 377 28+6 24+4 28+6 26+6 mpk, qwv “— Bcygasa, — ,ô .. Cj mp2 =. /—0 “= 0" 0 7" olJ" "7" 7 45+7 56+8 60+19 45+2 41+10 48+15 50+20 5 mpk, qwv BCY8255, 41+4 577 48+8 39+9 39+6 38+9 34+8 5 mpk, qwv
NM o Ss > o
O fo)
5.3 Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[483] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 21 após o início do tratamento. Tabela 22: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Gr Tratamento Tumor “tic Te ValorP Volume com 1 Veículo, qu 447+39 -- -- -- 2 BCY8245, 85431 18,9 1442 — p<0,001 3 mpk, qwv 3 BCY8245, 22+4 4,9 169,8 — p<0,001 3 mpk, biw 4 BCY8245, 2933 6,6 1684 — p<0,001 mpk, qwv 5 BCY8253, 109+19 24,4 134,7 — p<0,001 3 mpk, qwv 6 BCY8253, 2937 6,6 168,3 — p<0,001 3 mpk, biw 7 BCY8253, 40+8 8,9 1639 — p<0,001 5 mpk, qwv 8 BCY8255, 136+31 30,4 125,1 p<0,001 3 mpk, qwv 9 BCY8255, 3141 6,9 1668 — p<0,001 3 mpk, biw BCY8255, 42+2 9,5 161,8 — p<0,001 5 mpk, qwv a. Média + SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[484] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 22 a 24 e Tabelas 20 a 22.
[485] BCY8245 a 3 mg/kg, qwv (TV = 85 mm3, TGI = 144,2%, p < 0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 22 mmº?, TGI = 169,8%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 29 mm?, TGI = 168,4%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral antitumoral significativa em dose ou maneira dependente da frequência da dose.
[486] BCY8253 a 3 mg/kg, qw (TV = 109 mm?, TGI = 134,7%, p < 0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 29 mmº?, TGI = 168,3%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 40 mm3, TGI = 163,9%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral antitumoral significativa em dose ou maneira dependente da frequência da dose.
[487] BCY8255 a 3 mg/kg, qw (TV = 136 mm?, TGI = 125,1%, p < 0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 31 mm?, TGI = 166,8%, p < 0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 42 mm?, TGI = 161,3%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral antitumoral significativa em dose ou maneira dependente da frequência da dose.
[488] Os grupos de dosagem de 5 mg/kg foram suspensos a partir do dia 21, os tumores não mostraram qualquer recidiva durante o programa de monitoramento extra de 3 semanas.
[489] Neste estudo, BCY8253 e BCY8255 5 mg/kg causaram severa perda de peso corporal do animal, entre eles, o camundongo 10- 1 no grupo BCY8253 5 mg/kg foi encontrado morto no dia 20. Exemplo 5: Teste de eficácia in vivo de BCY8549, BCY8550, BCY8783 e BCY8784 no tratamento de xenoenxerto NCI-H292 (modelo de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC)) em camundongos nus BALB/c
1. Objetivo do Estudo
[490] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY8549, BCY8550, BCY8783 e BCY8784 no tratamento do xenoenxerto NCI-H292 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental
Tratamento Dose Dosagem | Dosagem | Programa (mg/kg) Volume Rota Cs EO e =
3. Materiais
3.1 Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 43 camundongos mais sobressalentes Fornecedor de animais: Shanghai Lingchang Biotechnology Experimental Animal Co. Ltd
3.1.2. Condição de habitação
[491] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 4 animais em cada gaiola.
[492] Temperatura: 20 — 26 ºC.
[493] Umidade 40-70%.
[494] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[495] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[496] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[497] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[498] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[499] As células tumorais NCI-H292 foram mantidas in vitro como cultura em monocamada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% CO» em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana por tratamento com tripsina-EDTA. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação do Tumor
[500] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais NCI-H292 (10 x 106º) em 0,2 ml! de PBS para o desenvolvimento do tumor. 43 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 168 mm?º. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
Preparação de Formulação de Artigo de Teste | Veículo | —- | 25mMdeHistidnmapH710%desacarose =— |
BCY8783 Dissolvido 1 mg BCY8783 in 968 ul de tampão de veículor BCY8783 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml BCY8783 estoque com 560 ul de tampão de veículor BCY8784 Dissolvido 1,2 mg BCY8784 in 1148 ul de tampão de veículor BCY8784 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml BCY8784 estoque com 560 ul de tampão de veículor
4.4 Coleta de Amostra
[501] No final do estudo, o plasma dos grupos 2 e 3 camundogons foi coletado em 5 min, 15 min, 30 min, 1 he 2 h após a última dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento do Tumor
[502] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 25 a 28.
5.2 Traços do Volume Tumoral
[503] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto NCI-H292 é mostrado na Tabela 23. Tabela 23: Traços do volume tumoral ao longo do tempo Dias após o início do tratamento Gr. Tratamento Rr o 2 4 7 9 1 14 1 Veículo,qw 168+16 297+48 362+58 460+62 548+69 697+102 843+152 BCY8549, 2 168+30 187+36 164+31 205+50 234+57 240+98 251+66 3 mpk, qv BCY8550, 3 167+18 208+21 237+16 324+35 421+35 489+44 545477 3 mpk, qv BCY8783, 4 167+28 182+27 16140 137+19 135+22 97+20 9719 3 mpk, qv BCY8784, 167+36 165+28 111+19 121+12 123+8 —99+10 9447 3 mpk, qv
5.3 Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[504] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto NCI-H292 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 24: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Volume tumoral T/CP TGI Gr Tratamento Valor P (mm?)? (%) (% 1 Veículo, qv 843+152 -—- -—- -—- BCY8549, 2 251+66 29,8 87,7 p<0,05 3 mpk, qv ML Beyasso, — ;P !É““UúA a AÔÔ AO 3 545+77 64,7 439 p>0,05 3 mpk, qv BCY8783, 4 97+19 11,55 110,3 p<0,01 3 mpk, qv BCY8784, 94+7 111 1108 p<0,01 3 mpk, qv b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[505] Neste estudo, foi avaliada a eficácia terapêutica dos BOCYs no modelo de xenoenxerto NCI-H292. O volume de tumor medido de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 25 a 28 e Tabelas 23 e 24.
[506] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 843 mmº no dia 14. BOCY8550 a 3 mg/kg não mostrou atividade antitumoral óbvia, os outros compostos a 3 mg/kg mostraram atividade antitumoral significativa. Entre eles, BOCY8783 e BCY8784 mostraram efeito inibidor de tumor comparável com BCY8245 e regrediram os tumores potentemente.
[507] Neste estudo, todos os camundongos mantiveram bem o peso corporal. Exemplo 6: Investigação da associação entre a variação do número de cópias (CNV) e a expressão gênica para Nectina-4 de vários tipos de tumor Métodos
1. Selecionar todos os estudos em cBioPortal (http://www .cbioportal.org/) e pesquisar NECTINA.
(a) Remover estudos provisórios.
(b) Desmarcar estudos com amostras sobrepostas para evitar o viés da amostra (com base no aviso no cBioPortal)- sempre mantenha o estudo PanCancer se for uma opção.
(c) Estudos selecionados para análise (Tabela 25).
Tabela 25: Estudos analisados do cBioPortal e unidades em estudo “om ” o Câncer de Mama (METABRIC, Expressão de mRNA (micromatriz) Nature 2012 & Nat Commun 2016) Carcinoma Invasivo de Mama Batelada de Expressão de MRNA (TCGA, PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Endometrial de Corpo Batelada de Expressão de MRNA Uterino (TCGA, PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Urotelial da Bexiga RSEM (Batelada normalizada de Ilumina (TCGA, PanCancer Atlas) HiSeq RNASeqV2) Adenocarcinoma de Pulmão (TCGA, | Expressão de mMRNA, RSEM (Batelada PanCancer Atlas) normalizada de Illumina HiSeq RNASeqV2) Carcinoma Cervical de Células RSEM (Batelada normalizada de Ilumina Escamosas (TCGA, PanCancer HiSeq RNASeqV2) Atlas)
Carcinoma de Pulmão de Células Batelada de Expressão de MRNA Escamosas (TCGA, PanCancer Normalizada/Fundida de Illumina Atlas) HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de Cabeça e Pescoço de | Expressão de mRNA, RSEM (Batelada Células Escamosas (TCGA, normalizada de Illumina PanCancer Atlas) HiSeq RNASeqV2) Adenocarcinoma Pancreático (TCGA, | Batelada de Expressão de MRNA PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de tireoide (TCGA, Batelada de Expressão de MRNA PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma de cólon (TCGA, RSEM (Batelada normalizada de Ilumina PanCancer Atlas) HiSeq RNASeqV2) Timoma (TCGA, PanCancer Atlas) Batelada de Expressão de MRNA Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Sarcoma (TCGA, PanCancer Atlas) Batelada de Expressão de MRNA Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma de estômago Batelada de Expressão de MRNA (TCGA, PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma da próstata (TCGA, | Expressão de mMRNA, RSEM (Batelada PanCancer Atlas) normalizada de Illumina HiSeq RNASeqV2) Cromófobo renal (TCGA, PanCancer | Expressão de mRNA, RSEM (Batelada Atlas) normalizada de Illumina HiSeq RNASeqV2)
Adenocarcinoma do reto (TCGA, Batelada de Expressão de MRNA PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina
HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Câncer de Próstata Metastático, Expressão de mRNA/captura (Seq de SU2C/PCF Dream Team (Robinson RNA RPKM) et al., Cell 2015) Feocromocitoma e Paraganglioma Batelada de Expressão de MRNA (TCGA, PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina
HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de células claras renal Expressão de mRNA, RSEM (Batelada (TCGA, PanCancer Atlas) normalizada de Illumina
HiSeq RNASeqV2) Adenocarcinoma da próstata (Fred Expressão de MRNA Hutchinson CRC, Nat Med 2016) Adenocarcinoma Colorretal (TCGA, Seq de RNA RPKM Nature 2012) Cistadenocarcinoma Seroso Batelada de Expressão de MRNA Ovariano (TCGA, PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina
HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de Células Pilosas Renal | Expressão de mRNA, RSEM (Batelada (TCGA, PanCancer Atlas) normalizada de Illumina
HiSeq RNASeqV2) Glioma Cerebral de Baixo Grau RSEM (Batelada normalizada de Illumina (TCGA, PanCancer Atlas) HiSeq RNASeqV2) Adenocarcinoma Esofágico (TCGA, RSEM (Batelada normalizada de Ilumina PanCancer Atlas) HiSeq RNASeqV2) Carcinoma adrenocorticoide (TCGA, | RSEM (Batelada normalizada de Illumina PanCancer Atlas) HiSeq RNASeqV2)
Glioblastoma Multiforme (TCGA, Expressão de mRNA, RSEM (Batelada PanCancer Atlas) normalizada de Illumina HiSeq RNASeqV2) Adenocarcinoma da próstata Expressão de MRNA (MSKCC, Cancer Cell 2010) Carcinossarcoma uterino (TCGA, Batelada de Expressão de MRNA PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Leucemia Mieloide Aguda (TCGA, Expressão de mRNA, RSEM (Batelada PanCancer Atlas) normalizada de Illumina HiSeq RNASeqV2) Melanoma Cutâneo de Pele (TCGA, | Batelada de Expressão de MRNA PanCancer Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Mesotelioma (TCGA, PanCancer Batelada de Expressão de MRNA Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Colangiocarcinoma (TCGA, RSEM (Batelada normalizada de Ilumina PanCancer Atlas) HiSeq RNASeqV2) Leucemia Linfoide Aguda Pediátrica - | NECTIN4: Expressão de mRNA (RNA- Fase Il (TARGET, 2018) Seq RPKM) Linfoma Difuso de Grandes Células B | Expressão de mMRNA, RSEM (Batelada (TCGA, PanCancer Atlas) normalizada de Illumina HiSeq RNASeqV2) Enciclopédia de Linhagem Celular de | Expressão de mRNA (micromatriz) Câncer (Novartis/Broad, Nature 2012) Melanoma Uveal (TCGA, PanCancer | Batelada de Expressão de MRNA Atlas) Normalizada/Fundida de Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369
Tumor Pediátrico de Wilms NECTINA4: Expressão de MRNA (RNA- Tumores de Células Germinais Batelada de Expressão de MRNA Atlas) HiSeq RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Hepatocelular de Fígado — | NECTINA4: Expressão de MRNA, RSEM (TCGA, PanCancer Atlas) (Batelada normalizada de Illumina Fm ea
2. Exportar dados de expressão de CNV e RNA do cBioPortal.
3. Testar se CNVs estão estatística e significativamente associadas a alterações na expressão de mRNA para Nectina-4 (log2 não aplicado).
(a) Executar o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis no GraphPad Prism (7,04) e R/R studio (limite de significância: p < 0,01).
(i) GraphPad Prism: configurar a tabela de colunas, executar o teste não paramétrico sem correspondência ou emparelhamento e não assumir a distribuição Gaussiana.
(ii) Pacotes usados em R:
1. XLConnect
2. dply
3. Teste de soma de postos de Kruskal-Wallis: teste de Kruskal.
4. Ajustar para comparações múltiplas (incluir todas as comparações possíveis, mesmo se n = 1 dentro de um grupo) em R/Rstudio usando o teste de Dunn (limite de significância: p < 0,025).
(a) dunn.test com método de comparação múltipla = "bonferonni".
Resultados
[508] Os resultados são mostrados na Tabela 26 abaixo. Em 41 conjuntos de dados TCGA disponíveis publicamente que relatam dados de expressão gênica de CNV e mRNA de tumor para Nectina-4, há muitas indicações em que casos foram relatados com ganhos de número de cópias de Nectina-4 (2-3 cópias) ou amplificações (> 3 cópias) Além disso, casos separados demonstraram ter deleções superficiais (< 2 cópias) com relatos raros de tumores contendo deleções profundas consistentes com perda superior a 1 cópia ou perda de Nectina-4 bialélica. As indicações onde as amplificações foram detectadas com mais frequência foram câncer de mama (10-22%), câncer de bexiga (20%), câncer de pulmão (5-7%) e carcinoma hepatocelular (8%). As indicações com perdas de número de cópias mais frequentes foram cromófobo renal (77%), carcinoma renal de células claras (RCC) (6,5%), sarcoma (10%), câncer de cólon (10%), câncer de cabeça e pescoço (7%) e câncer escamoso de pulmão. Esses dados indicam que há uma faixa de CNV dentro e entre as indicações de tumor e uma diversidade de padrões de número de cópias em diferentes indicações.
[509] Além de CNVs no conjunto de dados TCGA, o nível de expressão de mMRNA de Nectina-4 mediano por indicação cobre aproximadamente 2º faixa. Portanto, dada a faixa de níveis de expressão de mMRNA de Nectina-4 e CNVs observadas em todos os tipos de tumor, o teste estatístico foi realizado para identificar possíveis associações entre os níveis de MRNA de Nectina-4 e CNVs de Nectina- 4 em conjuntos de dados/indicações individuais de TOGA. Tumores por indicação foram alocados em 1 de 5 classes: a) Exclusão profunda; b) Exclusão superficial; c) Diploidee; d) Ganho; ou e) Amplificação.
[510] O teste de Kruskall-Wallis foi então realizado para detectar se as distribuições dos valores de expressão de mRNA por classes diferiam entre as classes (P < 0,01). Para os conjuntos de dados TOGA com P < 0,01 e para identificar quais classes eram diferentes umas das outras, o teste post hoc foi realizado pelo cálculo da estatística Z com valores P ajustados calculados (Bonferonni). Para simplicidade de interpretação, as comparações de pares vs. diploide por indicação foram revisadas (embora todos os valores P de pares tenham sido calculados). 18/41 Estudos TCGA encontraram Kruskall-Wallis P < 0,01 e Bonferonni P < 0,025 para comparações de ganho vs. diploide e/ou amplificação vs. diploide, indicando uma associação de expressão aumentada de MRNA de Nectina-4 com número de cópias de Nectina-4 aumentado. Estes 18 estudos representaram 14 histologias tumorais independentes: Mama, uterino, bexiga, adenocarcinoma pulmonar, pulmão escamoso, cervical, cabeça e pescoço, pancreático, tireoide, colorretal, timoma, sarcoma, carcinoma renal de células claras (RCC) e estômago.
[511] Além disso, 6 estudos diminuíram a expressão de mMRNA associada à perda do número de cópias. Quatro desses seis estudos não apenas mostraram uma associação entre a perda de CNV e a expressão reduzida, mas também relataram ganhos de CNV associados à alta expressão: estômago, pulmão escamoso, cólon e tireoide.
[512] Ao passo que duas indicações, cromófobo renal e câncer de próstata relataram apenas associações com perda de CNV e baixa abundância de transcritos. Além disso, houve um estudo separado do câncer de próstata (Metastatic Prostate Cancer, SU2C/PCF Dream Team (Robinson et a/., Cell 2015)) que mostrou ganhos no número de cópias associados à alta expressão (em relação ao diploide).
[513] Estas observações de perda e ganho de CNV tumoral com níveis de expressão de mMRNA podem representar o mecanismo por trás da expressão da proteína tumoral Nectina-4 nas indicações em que tais associações foram observadas.
Claramente, há indicações em que CNVs não parecem impactar os níveis de expressão de MRNA em um padrão previsível, como o carcinoma hepatocelular.
A eficácia pré- clínica in vivo com certos conjugados de fármacos bicíclicos Nectina-4 da invenção demonstrou estar correlacionada com a expressão da proteína Nectina-4 medida por IHC.
Portanto, se as CNVs de Nectina-4 tumorais se associarem aos níveis de mMRNA e preverem os níveis de expressão de proteínas, é formalmente possível que os pacientes com tumores contendo aumentos no número de cópias (ganho ou amplificação) possam ser mais propensos a responder aos conjugados de drogafármacos bicíclicos de Nectina-4 da invenção.
Se os pacientes pudessem ser identificados com CNV aumentada em Nectina-4, então esta informação poderia ser usada para selecionar pacientes para tratamento com conjugados de drogafármacos bicíclicos de Nectina-4 da invenção.
Tabela 26:Resultados da investigação da associação entre variação do número de cópias (CNV) e expressão gênica para Nectina-4 o | Mmendomeas neo Mal | Tee CusoriiaS | Comperaedo em Pre manada San RSS | Bonferonni Nome do Unidades Dele- Dele- Di- Ampli- | Estatis- Valor P Deleção Diploide — Diploide- Amplifi- Estudo ção ção ploi- fica- tica de profun-da Deleção Ganho cação - pro- super- de ção Kruskal- - Diploi-de | superfici- Diploide funda fícial Wallis al Câncer de Expressão de nn 745 706 404 380,4 <2,20€-16 N/A 0,568782 -11,89096 18,85085 Mama mMRNA (1,0000) (0,0000)* (0,0000)* (METABRIC, | (micromar-triz) Nature 2012 & Nat Commun 2016 NS Carcinoma Batelada de EK) 244 97 219,5 <2,20€-16 N/A 1,186089 -12,30176 12,07432 2 Invasivo de | Expressão de (0,7068) (0,0000)* (0,0000)* o Mama MRNA Ss (TCGA, Normaliza- PanCancer | da/Fundida de Atlas) Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369 Carcinoma Batelada de 5 274 210 18 76,392 <2,20€-16 N/A 1,130854 -7,274308 5,601260 Endometrial | Expressão de (0,7743) (0,0000)* (0,0000)* de Corpo MRNA Uterino Normalizada/F (TCGA, undida de PanCancer Ilumina Atlas) HiSeg RNASe qv2 syn4976369 Carcinoma RSEM 16 171 145 70 67,078 1,80E-14 N/A 0,060907 -3,323839 8,054269 Urotelial da (Batelada (1,0000) (0,0027)* (0,0000)* Bexiga normalizada (TCGA, de Illumina PanCancer | HiSeq RNASe Atlas) qv2)
Adenocarcin | Expressão de 129 332 33 59,578 7,24E-13 N/A 0,237200 -6,244156 6,247228 oma de MRNA, RSEM (1,0000) (0,0000)* (0,0000)* Pulmão (Batelada (TCGA, normalizada
PanCancer de Illumina Atlas) HiSeq RNASe qV2) Carcinoma RSEM 7 115 147 51,372 4,08E-11 N/A 1,093749 -6,170067 3,815296 Cervical de (Batelada (0,8222) (0,0000)* (0,0004)* Células normalizada
Escamosas de Illumina
(TCGA, HiSegq RNASe PanCancer qv2)
Atlas) Carcinoma Batelada de 22 199 222 23 42,128 3,77E-09 N/A 2,819759 -3,034709 4,860629 de Pulmão Expressão de (0,0144)* (0,0072)* (0,0000)* de Células MRNA
Escamosas | Normalizada/F NM (TCGA, undida de Mm
PanCancer Ilumina o Atlas) HiSeg RNASe Ss qv2 syn4976369 Carcinoma Expressão de 32 330 122 37,81 3,10E-08 N/A 1,736867 -4,848550 3.033083 de Cabeça e | mRNA, RSEM (0,2472) (0.0000)* (0.0073)*
Pescoço de (Batelada Células normalizada
Escamosas de Illumina (TCGA, HiSegq RNASe
PanCancer qv2) Atlas
Adenocarcin Batelada de 7 105 50 36,863 4,92E-08 N/A 1,333193 -4.388701 4.166401 oma Expressão de (0,5474) (0.0000)* (0.0001)*
Pancreático MRNA
(TCGA, Normalizada/F PanCancer undida de Atlas) Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369
Carcinoma Batelada de 3 451 26 31,882 1,19E-07 N/A 2,486724 -5.021279 N/A de tireoide Expressão de (0,0193)*) (0.0000)* (TCGA, mMRNA PanCancer | Normalizada/F Atlas) undida de Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369 Adenocarcin RSEM 40 266 2 31,309 7,32E-07 N/A 3,811621 -2.987223 1.759508 oma de (Batelada (0,0004)* (0.0084)* (0.2355) cólon normalizada (TCGA, de Illumina PanCancer | HiSeq RNASe Atlas) qv2) Timoma Batelada de 95 22 2 26,213 2,03E-06 N/A N/A -4.962115 1.567541 (TCGA, Expressão de (0.0000)* (0.1755) NM PanCancer MRNA N Atlas) Normalizada/F & undida de o Ilumina Ss HiSeg RNASe qv2 syn4976369 Sarcoma Batelada de 22 120 74 14 26,831 6,39E-06 N/A -0,410850 -4,582047 3.106262 (TCGA, Expressão de (1,0000) (0.0000)* (0.0057)* PanCancer MRNA Atlas) Normalizada/F undida de Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369 Adenocarcin Batelada de nn 253 134 19,096 0,0002611 N/A 2,835658 -2.921683 -0.265333 oma de Expressão de (0,0137)* (0.0104)* (1.0000) estômago MRNA (TCGA, Normalizada/F PanCancer undida de Atlas) Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369
Adenocarcin | Expressão de 3 15 437 29 3 19,125 0,0007426 | -2,532734 3,202764 -1.351661 0.509151 oma da MRNA, RSEM (0,0566) | (0,0068)* (0.8824) (1.0000) próstata (Batelada (TCGA, normalizada PanCancer de Illumina Atlas) HiSeq RNASe qV2) Cromófobo Expressão de 50 14 1 13,851 0,0009823 N/A 3,609735 -0.058395 N/A renal (TCGA, | mRNA, RSEM (0,0005)* (1.0000) PanCancer (Batelada Atlas) normalizada de Illumina HiSeq RNASe qV2) Adenocarcin Batelada de nn 91 33 1 14,056 0,00283 N/A 1,050760 -2.951363 1.809506 oma do reto | Expressão de (0,8801) (0.0095)* (0.2111) (TCGA, mMRNA PanCancer | Normalizada/F N Atlas) undida de PD Ilumina o HiSeg RNASe Ss qv2 syn4976369 Câncer de Expressão de 3 75 37 2 12,336 0,006317 N/A 0,040058 -3.420479 -0.362109 Próstata MRNA/captura (1,0000) (0.0019)* (1.0000) Metastático, (Seg de RNA SU2C/PCF RPKM) Dream Team (Robinson et al., Cell
2015. Feocromocit Batelada de 14 123 19 5 11,573 0,008998 N/A -1,271308 -2.597791 2.201970 omae Expressão de (0,6109) (0.0281) (0.0830) Paraganglio MRNA ma (TCGA, | Normalizada/F PanCancer undida de Atlas) Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369
Carcinoma Expressão de 22 297 32 1 11,314 0,01014 N/A -0,748380 -2.996852 1.502464 de células | mRNA, RSEM (1,0000) (0.0082)* (0.3989) claras renal (Batelada (TCGA, normalizada PanCancer de Illumina Atlas) HiSeq RNASe qV2)
Adenocarcin | Expressão de 1 59 7 9,8842 0,01958 N/A 0,677737 -0.409530 3.028793 oma da mMRNA (1,0000) (1.0000) (0.0074)* próstata
(Fred Hutchinson CRC, Nat Med 2016) Adenocarcin Seq de RNA 153 34 2 9,4054 0,02 N/A 0,062894 -1.860678 2.514653 oma RPKM (1,0000) (0.1884) (0.0357) Colorretal o) (TCGA, D
Nature 2012) Ss
Cistadenocar Batelada de 7 75 117 2 9,3101 0,02544 N/A 1,589035 -2.168253 0.062706 o cinoma Expressão de (0,3362) (0.0904) (1.0000) Seroso MRNA Ovariano Normalizada/F (TCGA, undida de
PanCancer Ilumina Atlas) HiSeg RNASe qv2 syn4976369 Carcinoma Expressão de 1 19 239 15 9,1134 0,02782 1,607764 -0,569938 -2.552083 N/A de Células | mRNA, RSEM (0,3237) (1,0000) (0.0321) Pilosas (Batelada Renal normalizada (TCGA, de Illumina PanCancer | HiSeq RNASe Atlas: qv2 Glioma RSEM nn 462 32 2 4,769 0,1895 N/A 0,462462 -1.718955 1.261960 Cerebral de (Batelada (1,0000) (0.2569) (0.6209) Baixo Grau normalizada (TCGA, de Illumina PanCancer | HiSegq RNASe
Adenocarcin RSEM 78 4,267 0,234 N/A 0,747441 -0.768855 1.756911 oma (Batelada (1,0000) (1.0000) (0.2368) Esofágico normalizada (TCGA, de Illumina PanCancer | HiSeq RNASe Atlas) qv2) Carcinoma RSEM 54 nn 2 4,0298 0,2583 N/A 0,157281 -0.131234 1.984800 adrenocortic (Batelada (1,0000) (1.0000) (0.1415) oide (TCGA, normalizada PanCancer de Illumina Atlas) HiSeq RNASe qV2) Glioblastoma | Expressão de 3 115 27 2,6252 0,2691 N/A 0,180194 -1.593755 N/A o) Multiforme | mRNA, RSEM (1,0000) (0.1665) Ss (TCGA, (Batelada o PanCancer normalizada o Atlas) de Ilumina o HiSeq RNASe qV2) Adenocarcin | Expressão de 3 78 2,181 0,3361 N/A 1,423206 0.454433 N/A oma da mMRNA (0,2320) (0.9743) próstata (MSKCC, Cancer Cell 2010) Carcinossarc Batelada de 14 37 1 3,308 0,3465 N/A 0,104285 -0.539065 1.764353 oma uterino | Expressão de (1,0000) (1.0000) (0.2330) (TCGA, mMRNA PanCancer | Normalizada/F Atlas) undida de Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369
Leucemia Expressão de 163 2 0,82638 0,3633 N/A N/A 0.909052 N/A Mieloide MRNA, RSEM (0.1817) Aguda (Batelada (TCGA, normalizada PanCancer de Illumina Atlas) HiSeq RNASe qV2) Melanoma Batelada de 1 19 146 189 3,6483 0,4557 -0,898187 -1,116994 -1.235317 0.900287 Cutâneo de | Expressão de (1,0000) (1,0000) (1.0000) (1.0000) Pele (TCGA, MRNA PanCancer | Normalizada/F Atlas) undida de Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369 Mesotelioma Batelada de 2 56 23 1 2,3747 0,4984 N/A —-1,426445 0.418206 0.143440 (TCGA, Expressão de (0,4612) (1.0000) (1.0000) 8 PanCancer MRNA ND Atlas) Normalizada/F o undida de Ss Ilumina HiSeg RNASe qv2 syn4976369 Colangiocarc RSEM EK) 18 5 1,3058 0,5205 N/A N/A -0.653051 1.121055 inoma (Batelada (0.7706) (0.3934) (TCGA, normalizada PanCancer de Illumina Atlas) HiSeg RNASe qv2 Leucemia NECTINA4: 10 1 2,2337 0,5253 N/A 0,133399 -0.504875 -1.375728 Linfoide Expressão de (1,0000) (1.0000) (0.5067) Aguda MRNA (RNA- Pediátrica - Seq RPKM) Fase || (TARGET, 2018:
Linfoma Expressão de 2 25 1 1,4939 0,6837 N/A 0,374642 1.170326 -0.405844 Difuso de =| mRNA, RSEM (1,0000) (0.7256) (1.0000) Grandes (Batelada Células B normalizada (TCGA, de Illumina PanCancer | HiSeq RNASe Atlas) qv2) Enciclopédia | Expressão de 1 112 396 319 1,9013 0,7539 -0,398204 0,562427 -0.847920 -0.379251 de Linhagem mMRNA (1,0000) (1,0000) (1.0000) (1.0000) Celular de (micromatriz) Câncer (Novartis/Bro ad, Nature 2012) Melanoma Batelada de 72 0,067914 0,7944 N/A N/A -0.260603 N/A Uveal Expressão de (0.3972) (TCGA, mMRNA PanCancer | Normalizada/F N Atlas) undida de oo Ilumina o HiSeg RNASe Ss qv2 syn4976369 Tumor NECTINA4: 1 50 46 0,78538 0,853 N/A 0,165021 -0.815915 -0.090701 Pediátrico de | Expressão de (1,0000) (1.0000) (1.0000) Wilms MRNA (RNA- (TARGET, Seq RPKM) 2018) Tumores de Batelada de 1 76 67 0,14279 0,9311 N/A -0,366969 0.061216 N/A Células Expressão de (1,0000) (1.0000) Germinais MRNA Testiculares | Normalizada/F (TCGA, undida de PanCancer Ilumina Atlas) HiSeg RNASe qv2 syn4976369
Carcinoma NECTINA4: 1 224 34 0,2908 0,9618 N/A 0,082418 0.188961 0.363341 Hepatocelula | Expressão de (1,0000) (1.0000) (1.0000) r de Fígado | mMRNA, RSEM (TCGA, (Batelada PanCancer normalizada Atlas) de Illumina HiSeg RNASe qv2 o)
NM o = o
O o
Exemplo 7: Análise de Expressão de Nectina-4 em 6 linhagens celulares
1. Objetivo do Estudo
[514] Objetivo do Estudo foi avaliar a expressão de Nectina-4 em 6 linhagens celulares por citometria de fluxo, incluindo 2 câncer de mama (T-47D, MDA-MB-468), 3 câncer de pulmão (NCI-H292, NCI- H322, NCI-H526) e 1 linhagem celular de fibrossarcoma (HT-1080)).
2. Projeto do Painel Painel para FCOM em T-47D, MDA-MB-468, NCI-H292, NCI-H322 e HT- 1080 [Próramamo TEmbrano | Bétpo | Peer Ctrl de PE . Nectina-4 Isótipo Painel para NCI-H526 Ctrl de PE . Nectina-4 Isótipo BV421 Vivo/Morto | Vivo/Morto Vivo/Morto
3. Material
3.1 Amostra Lista de Linhagens celulares Proprieda Linhagens Tipo de Forneced des de | Meios de Cultura celulares Câncer or Cultura RPMI-1640+0.2 Câncer de ATCC- Unidades/ml 1 T-47D aderente Mama HTB-133 bovine insulin+10%FBS MDA-MB- Câncer de ATCC- Leibovitz's L- 2 aderente [ro SO [eso | es [eme | soe |
RPMI- 3 NCI-H292 Pulmão 91091815 | aderente RPMI-1640+2mM 4 NCI-H322 Pulmão 95111734 | aderente Glutamina+10%
FBS agrupame ntos redondos RPMI- NCI-H526 Pulmão CRL-5811 em 1640+10%FBS suspensã o EMEM+2mM Glutamina+1% Fibrossarco | ECACC- Non Essential HT1080 aderente ma 85111505 Aminoácidos (NEAA)+10%
FBS
3.2. Reagentes Anticorpos e kit para análise de citometria de fluxo I9gG2b de De BICY- PE controle de | ICO041P R&D a 20161117A Isótipo DPBS (Corning-21-031-CV) Tampão de coloração (eBioscience-00-4222) Tampão de fixação (BD-554655)
3.3. Instrumentos Centrífuga Eppendorf 5810R Citômetro de fluxo BD FACS Canto (BD)
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1. Coleta de Amostra
[515] Colher as linhagens celulares que crescem em uma fase de crescimento exponencial. Contar células por hemocitômetro com coloração com azul Trypan. Centrifugar as células a 400Xg por 5 min a 4ºC, lavar as células por duas vezes com tampão de coloração e suspender as células em tampão de coloração a 1 x 10º/mL.
4.2. Coloração de Anticorpo 1) 100 uL aliquotados de suspensão de células para cada poço de uma placa em V de 96 poços. 2) Controle de isótipo ou anticorpos adicionados em células em suspensão e incubadas por 30 min a 4 ºC no escuro. 3) Célulaslavadas 2X por centrifugação a 400 X g por mina 4ºCe sobrenadante descartado. 4) Células ressuspensas com 100 ul de tampão de fixação e incubadas por 30 min a 4 ºC no escuro. 5) Célulaslavadas 2 X por centrifugação a 300 X g por Bmina4ºCe o sobrenadante removido 6) Célulasressuspensas em 400 uL de tampão de coloração. 7) OsdadosFACS analisados usando o software FlowJo V10.
4.3. Análise de dados
[516] Todos os dados FACS foram analisados pelo software Flowjo V10 e Graphpad Prism ou software Excel.
5. Resultados
5.1 Estratégia de Passagem para Painel
[517] A estratégia de passagem para Nectina-4 é mostrada nas Figuras 29-32.
4.2. Análise de Dados
5.2.1. Viabilidade de linhagens celulares A viabilidade das linhagens celulares foi como abaixo.
Linhagem Células viáveis e [ES pe a PES] dese em ss | ss
[E ess | me | ss | ss o [are reesem| so ] ur
5.2.2. A expressão positiva de Nectina-4 em linhagens celulares Expressão positiva e MFI de Nectina-4 em 6 linhagens celulares estavam em lista.
Linhagem o au Meme Lima ires de [ass | | so |
6. Discussão
[518] Houve uma alta expressão de Nectina-4 no câncer de mama T-47D (99,0%), MDA-MB-468 (99,0%) e câncer de pulmão NCI-H292 (97,9%), NCI-H322 (99,1%). Em NCI-H526 e HT-1080, nenhuma expressão de Nectina-4 foi encontrada. Exemplo 8: Análise de expressão de nectina-4 em 9 linhagens celulares CDX por citometria de fluxo
1. Objetivo do Estudo
[519] O objetivo deste projeto é avaliar a expressão de superfície de Nectina-4 (PVRL-4) em 9 linhagens celulares, incluindo 1 câncer de mama (MDA-MB-468), 4 câncer de pulmão (NCI-H292, NCI-H358, NCI -H526, A5S49), 1 linhagem celular de câncer de pâncreas (Panc02.13), 2 de câncer colorretal (HCT-116, HT-29) e 1 de câncer de bexiga (HT1376).
2. Projeto do Painel Painel para FCM em 9 linhagens celulares [Pesnamo | Embranso | tsótro — T pena IgG2b de controle PE Nectina-4 de Isótipo BV421 Vivo/Morto Vivo/Morto Vivo/Morto
3. Materiais
3.1 Amostras Lista de linhagens celulares Proprieda Linhagem | Tipo de Fornecedor des de Meios de Cultura Celular Câncer Cultura ATCC-CRL- 1 HT1376 Bexiga aderente EMEM+ 10% FBS 1472 MDA-MB- Leibovitz's L- 2 Mama |ATCC-HTB-132 | aderente 468 15+10%FBS Colorreta RPM! 1640+ 10% 3 HCT-116 ATCC-CCL-247 | aderente | FBS Colorreta McCoy's 5a+ 10% 4 HT-29 ATCC-HTB-38 | aderente | FBS ECACC- RPMI 1640+ 10% NCI-H292 Pulmão suspensão 91091815 FBS . ECACC- RPMI 1640+ 10% 7 | NCI-H358 | Pulmão aderente 95111733 FBS . ATCC-CRL- RPMI 1640+ 10% NCI-526 Pulmão aderente 5811 FBS RPMI-1640+15% ATCC-CRL- Panc02.13 | Pancreas 2554 aderente FBS+5ug/ml de insulina humana
3.2. Reagentes 1) DPBS (Corning, 21-031-CV) 2) Tripsina 0.25% (Invitrogen- 25200072) 3) Tampão de coloração (eBioscience, 00-4222) 4) Tampão de fixação (BD, 554655) 5) Anticorpo
ESCORRE camundongo [rar vam | tese | msn |
3.3. — Instrumentos Centrífuga Eppendorf 5810R Citômetro de fluxo BD FACS Canto (BD)
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular Descongelamento de células 1) Limpar os frascos congelados com álcool 70% e descongele rapidamente em banho-maria a 37ºC. 2) Suspensão de células centrifugadas a aproximadamente 1000 rpm por 5 minutos, removido o sobrenadante e adicionado o meio de pré-aquecimento aos frascos. 3) Frascos de cultura incubados a 37ºC, incubadora de CO»? a 5%. Passagem da Célula 1) Meio aquecido e tripsina em banho-maria a 37ºC. 2) Retirado o meio de cultura e enxaguou a camada de células com DPBS. 3) — Adicionados 5 mL de solução de tripsina a 0,25% ao frasco e tripsina diluída com 5 mL de meio. 4) Suspensão de células centrifugadas a 1000 rpm por 5 min.
5) Adicionados 15 mL de meio fresco e as células ressuspensas pipetando suavemente. 6) Adicionada a suspensão de células apropriada a novos frascos de cultura. 7) Frascos de cultura incubados a 37ºC, incubadora com 5% de CO;>.
4.2. Coleta de Amostras
[520] A linhagens celulares colhidas crescendo em uma fase de crescimento exponencial. Células contadas com coloração com azul tripano. Células centrifugadas a 400 x g por 5 min a 4ºC, as células lavadas com tampão de coloração por duas vezes e as células suspensas em tampão de coloração a 5 x 106/mL.
4.3. Coloração de Anticorpo
[521] 100 uL de suspensão de células aliquotados para cada poço de uma placa em V de 96 poços. Adicionado controle de isótipo ou anticorpos em células em suspensão e incubados por 30 min a 4ºC no escuro. Células lavadas 2 vezes por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4ºC e sobrenadante descartado. Células ressuspensas em 300 uL de tampão de coloração. Os dados FACS analisados usando o software Flow Jo V10.
4.4. Análise de dados
[522] Todos os dados FACS foram analisados pelo software Flow Jo V10 e GraphPad Prism ou software Excel.
5. Resultados
5.1. Estratégia de portão para painel
[523] A estratégia de passagem para Nectina-4 é mostrada nas Figuras 34-37.
5.2 Análise de dados
[524] Expressão positiva e MFI de Nectina-4 em 9 linhagens celulares foram conforme lista.
[o [Eras cuiar | tcina | ueissótio | irisana | [Ee | 7x | as ss roses es | ss | e [E reais | en | e | as
6. Discussão
[525] Houve uma alta expressão de Nectina-4 em câncer de bexiga HT-1376 (92,4%), câncer de mama MDA-MB-468 (97,1%) e câncer de pulmão NCI-H358 (90,1%). Uma expressão média de Nectina-4 foi encontrada em HT-29 (40,0%), NCI-H292 (71,1%) e Panc02,13 (51,9%). Em HCT-116, A549 e NCI-526, nenhuma expressão de Nectina-4 foi encontrada. Esses dados serão usados para orientar a seleção de modelos para estudos de eficácia. Exemplo 9: Estudos de Eficácia in vivo Exemplo 9.1: Estudo de Eficácia in vivo de Artigo de testes em tratamento de xenoenxertos A549 em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[526] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento do xenoenxerto A549 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental ml ao me fins MO (mg/kg) Dosagem Dosage (ul/g) m [1 | veeão | 5 | —- | 1 | 64 | qv |)
BoYEZAz Smola [6 | Bevezas mol [o | Bevezas mol BCYB256 S mala
3. Materiais Animais e Condições de Alojamento
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[527] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola. * Temperatura: 20 — 26ºC. * Umidade 40-70%.
[528] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[529] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[530] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[531] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[532] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1. Cultura de células
[533] As células tumorais A549 foram mantidas in vitro como uma cultura em monocamada em meio F-12K suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% CO» em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana por tratamento com tripsina-EDTA. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação do Tumor
[534] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais A549 (5 x 106º) em 0,2 ml! de PBS para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 158 mmº?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste este (mg/ml) [vecmo | — jzmuceremna pr 7ioMdesaçarse
BCY8245 0,5 Diluir 400 ul mg/ml de BCY8245 estoque com 400 ul de tampão de Histidina BCY8245 0,3 Diluir 240 ul mg/ml de BCY8245 estoque com 560 ul de tampão de Histidina BCY8253 0,5 Diluir 400 ul mg/ml de BCY8253 estoque com 400 ul de tampão de Histidina BCY8253 0,3 Diluir 240 ul mg/ml de BCY8253 estoque com 560 ul de tampão de Histidina BCY8255 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul de tampão de acetato BCY8255 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul de tampão de acetato
1. Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose
2. Tampão de acetato: 50 mM de acetato/ácido acético pH 5 10% de sacarose
4.4. Coleta de Amostra
[535] No final do estudo, o tumor de todos os grupos, exceto o grupo 2, 3, 4 foi coletado 2 h após a última dosagem. O tumor do grupo 2, 3, 4 foi coletado sem qualquer dosagem.
5. Resultados
5.1. Curvas de Crescimento do Tumor
[536] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 38-41.
5.2 Traço do Volume Tumoral
[537] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto A549 é mostrado na Tabela 27. Tabela 27: Traços do volume tumoral ao longo do tempo Dias após o início do tratamento Gr. Tratamento o 2 5 7 9 12 14 1 Veículo, qv 158+13 235+24 278+26 346+39 387+35 471+45 568+49 BCY8242, 2 157+13 215+19 221+12 257+28 262+32 3290+6 356+26 3 mpk, qwv BCY8242, 3 ' 158+10 224+29 189+38 205+44 232+55 —239+41 261+41 3 mpk, biw
BCY8242, 4 15716 189+23 16917 182+30 191+39 162+33 191+29 mpk, qw To :77 CT 5 157+10 20815 197+25 257+40 293+41 341+54 356+53 3 mpk, qwv BCY8245, 6 157+14 183+27 15816 184+6 182+8 190+15 194+27 3 mpk, biw BCY8245, 7 15714 179+22 147+10 172+23 173+24 204+36 228+33 5 mpk, qw BCY8253, 8 158+10 1979 1774 225+4 246+5 —268+11 323+30 3 mpk, qwv OOUBCYB258, A A ANA Anda MS AA Rn Do 9 158+12 207+9 16849 210+15 219+17 234+10 247+11 3 mpk, biw O BOYB258, A AS ANSA AA AS A RR 15847 —203+18 149+7 199+20 187+15 17815 203+6 5 mpk, qw O BOYB255, A A ASA AA MAS A nao n 15849 —199+15 18110 243+1 261+8 293+4 337415 3 mpk, qwv O BOYB255, o A A A ANN ASR, 12 158+14 180+17 15519 193+36 179+28 199+27 227+34 3 mpk, biw O BOYB255, A A AN MAS AS AA RDNS 13 15814 17716 153+19 206+25 201+42 183+44 205+32 5 mpk, qw
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[538] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto A549 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 28: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Volume do Valor P Gr Tratamento Tumor TIC (% TGI(%) comparado (mmº?)? com veículo 1 Veículo, qv 568+49 -— -- -— 2 BCY8242, 356+26 62,7 51,6 p<0.05 3 mpk, qwv BCY8242 ? +: 3 3 mpk, biw 261+41 46,0 74,9 p<0.01 4 BCY8242, 191+29 33,6 291,7 p<0.001 5 mpk, qwv 5 — BCY8245, 356453 62,8 51,4 p<0.05 3 mpk, qwv
6 So bia 194+27 34,2 90,8 p<0.001 7 So as 228+33 40,2 82,6 p < 0.001 8 Soa 323+30 56,8 59,8 p<0.01 9 FADE 247+11 43,4 78,3 p<0.001 Soa 203+6 35,7 89,2 p < 0.001 "E So as 337415 59,4 56,4 p<0.01 12 EAD 227+34 39,9 83,4 p<0.001 13 Sos 205+32 36,1 88,5 p<0.001 a. Média + SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Resumo e Discussão de Resultados
[539] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto A549 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 38-41 e Tabelas 27 e 28.
[540] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 568 mm? no dia 14. BCY8242 a 3 mg/kg, qw (TV=356 mmº?, TGI=51.6%, p < 0.05), BCY8242 a 3 mg/kg biw (TV=261 mm, TGI=74.9%, p < 0.01) e 5 mg/kg, qv (TV=191 mm?, TGI=91.7%, p <
0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[541] BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV=356 mm?º, TGI=51.4%, p <
0.05), 3 mg/kg, biw (TV=194 mm?º, TGI=90.8%, p < 0.01) e 5 mg/kg, qwv (TV=228 mmº?, TGI=82.6%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[542] BCY8253 a 3 mg/kg, qw (TV=323 mm?º, TGI=59.8%, p <
0.01), 3 mg/kg, biw (TV=247 mm3, TGI=78.3%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qu (TV=203 mmº?, TGI=89.2%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[543] BCY8255 a 3 mg/kg, qv (TV=337 mmº?, TGI=56.4%, p <
0.01), 3 mg/kg, biw (TV=227 mmº?, TGI=83.4%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qwv (TV=205 mm?, TGI=88.5%, p < 0.001) produced significativa atividade antitumoral antitumoral de maneira dependente da dose ou da frequência da dose.
[544] Neste estudo, os animais em BCY8242 a 3 mg/kg qw e 5 mg/kg qw, BCY8253 e BCY8255 a 5 mg/kg qw perderam mais de 10% do peso corporal médio durante o esquema de tratamento, os animais nos grupos BCY8245 mantiveram bem o peso corporal. Nesta linhagem celular, que mostra expressão mínima de Nectina-4 em estudos FACS, o crescimento do tumor é restringido por BOY8245, mas o tumor não sofre regressão, enfatizando o requisito direcionado ao alvo para eficácia ideal. Exemplo 9.2: Estudo de eficácia in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto HCT116 em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[545] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento do xenoenxerto HCT116 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental o ço Eme Sm TO (mg/kg) Dosagem Dosagem (ulg) [ve E E RO
BCYs2as [| 9 | Bscve253 BCY8255
3. Materiais
3.1. Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[546] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola. * Temperatura: 20 — 26ºC. * Umidade 40-70%.
[547] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[548] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[549] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[550] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo,
linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[551] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[552] As células HCT116 foram mantidas em meio suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em atmosfera de 5% CO; em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação do Tumor
[553] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais HCT116 (5,0 x 106º) em 0,2 ml de PBS para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 166 mm?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste Artigo de Con. Formulação se fa o ess [espe rsIan pA TIO AESA BCY8242 0,5 Diluir 510 ul 20 mg/ml de BCY8242 estoque com O Mesma | BCY8242 0,3 Diluir 480 ul 0.5 mg/ml de BCY8242 estoque com 320 O semana o BCY8245 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 400 ul mma BCY8245 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 560 ul OI Jean |
BCY8253 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 400 ul o Taamdai BCY8253 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 560 ul A o A BCY8255 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul O mta BCY8255 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul md | Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose
4.4. Coleta de Amostras
[554] No final do estudo no dia 14, os tumores dos grupos 1,2,5, 8 e 11 foram coletados para FFPE. Para os grupos 4, 7, 10e 13, o plasma foi coletado aos 5 min, 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após a dosagem. Os tumores também foram coletados e armazenados a - 800C.
5. Resultados
5.1. Curvas de Crescimento do Tumor
[555] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 42-45.
5.2 Traço do Volume Tumoral
[556] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto HCT116 é mostrado na Tabela 29. Tabela 29: Traços do volume tumoral ao longo do tempo “Grupo: Tratamento -2/2$ 2PÓS o início do tratamento o 2 4 7 9 12 14 1 ao 16612 219+21 323+29 397+28 488+36 G30:+49 76971 2 aaa 166+3 —201+16 219+29 280+14 319+17 375+23 492+19 3 Aro 16616 212+17 213+17 208+30 202+33 195+25 201+28
4 BCY8242, 16724 203+16 168+10 186+9 211+5 201+8 206+7 mpk, qw 5 BCY8245, 16711 209+13 227+17 269+33 324+39 348+27 425+28 3 mpk, qw 6 BCY8245, 166+18 229+40 215+42 213+49 213+48 206+55 197+50 3 mpk, biw 7 BCY8245, 166+35 201+42 176+15 183+17 170+16 125+18 134+12 5 mpk, qw 8 BCY8253, 16610 210+11 254+31 288+8 305+3 316+13 354+6 3 mpk, qw 9 BCY8253, 16715 200+3 175+11 186+8 195+8 197+17 199+9 3 mpk, biw BCY8253, 166+37 179+37 143+31 150+41 115+28 90+30 92+29 5 mpk, qw "1 BCY8255, 166+18 221+12 209+14 294+26 354+37 437+51 498+52 3 mpk, qw 12 BCY8255, 16732 220+52 182+42 191+44 217+46 221+53 178+40 3 mpk, biw 13 BCY8255, 166+35 183+51 128+27 141+27 142+24 132+10 137+5 5 mpk, qw
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[557] A taxa de inibição do crescimento do tumor para o Artigo de teste no modelo de xenoenxerto HCT116 foi calculada com base nas medições do volume do tumor no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 30: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Volume do Grupo — Tratamento Tumor TIC” (%) TGI (%) Valor P (mmº). Veículo, 1 769+71 - - - qw BCY8242, 2 492+19 64.0 45.9 P<0.001 3 mpk, qw BCY8242, 3 . 201+28 26.2 94.1 P<0.001 3 mpk, biw BCY8242, 4 206+7 26.7 93.5 P<0.001 5 mpk, qw
BCY8245, 425+28 55.2 57.1 P<0.001 3 mpk, qw BCY8245, 6 197+50 25.6 94.9 pP<0.001 3 mpk, biw BCY8245, 7 134+12 17.4 105.2 P<0.001 5 mpk, qw BCY8253, 8 354+6 46.0 68.8 P<0.001 3 mpk, qw BCY8253, 9 199+9 25.9 94.7 P<0.001 3 mpk, biw BCY8253, 92+29 12.0 112.2 P<0.001 5 mpk, qw BCY8255, E 498+52 64.7 44.9 P<0.001 3 mpk, qw BCY8255, 12 178+40 23.1 98.3 P<0.001 3 mpk, biw BCY8255, 13 137+5 17.8 104.9 pP<0.001 5 mpk, qw a. Média + SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Resumo e Discussão de Resultados
[558] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto HCT116 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 42-45 e Tabelas 29 e 30.
[559] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 769 mm? no dia 14 após o início do tratamento. BCY8242 a 3 mg/kg, qv (TV=492 mmº?, TGI=45.9%, p<0.001), 3 mg/kg, biw (TV=201 mmº?, TGI=94.1%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qv (TV=206 mm, TGI=93.5%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[560] BCY8245 a 3 mg/kg, qv (TV=425mMm?, TGI=57.1%, p<
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=197 mm?, TGI=94.9%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=134 mm?, TGI=105.2%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[561] BCY8253 a 3 mg/kg, qwv (TV=354 mmº?, TGI=68.8%, p<
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=199 mm?, TGI=94.7%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=92 mm3, TGI=112.2%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[562] BCY8255 a 3 mg/kg, qv (TV=498 mmº?, TGI=44.9%, p<
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=178 mm?, TGI=98.3%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=137 mm?, TGI=104.9%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[563] Neste estudo, animais em todos os grupos qw de 5 mg/kg perderam mais de 10% de peso corporal, especialmente aqueles nos grupos BCY8253 e BCY8255 5 mg/kg, os quais perderam mais de 10% de peso corporal; BCY8253 e BCY8255 3mg/kg biw tambem causaram 15% de perda de peso corporal durante o programa de tratamento.
[564] Nesta linhagem celular, que mostra expressão mínima de Nectina-4 em estudos FACS, o crescimento do tumor é restringido por BCY8245, mas o tumor não sofre regressão, enfatizando o requisito direcionado ao alvo para eficácia ideal. Exemplo 9.3: Estudo de eficácia in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto HT-1376 em camundongos CB17-SCID
1. Objetivo do Estudo
[565] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento do xenoenxerto HT-1376 em camundongos CB17-SCID.
2. Projeto Experimental Volume de Rota de Dose Tratamento Dosagem | Dosagem | Programa (mg/kg) (ul'g) LT Meteo a qw BCYS2AZ mao BCYEZAS mola | 6 | Bevszas Tm9lo BCY8245 Smato [E | sevazs maio [| 9 | Bsevazss mol BCY8253 Smato BCY8255 Tmolo BCY8255 Tmoto BCYEZSS maio
3. Materiais
3.1 Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: CB17-SCID Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[566] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
* Temperatura: 20 — 26 ºC. * Umidade 40-70%.
[567] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[568] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[569] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[570] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[571] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[572] As células tumorais HT-1376 serão mantidas em meio EMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em atmosfera de 5% CO, em ar. As células tumorais serão rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial serão colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação do Tumor
[573] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais HT-1376 (5 x 106) com Matrigel (1:1) em 0,2 ml de PBS para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 153 mmº?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste este (mg/ml) Meno | [smesenmmepaTIÇN
BCY8242 0,5 Diluir 510 nl 20 mg/ml de BCY8242 estoque com 19.886 ml de tampão de Histidina BCY8242 0,3 Diluir 480 ul 0.5 mg/ml de BCY8242 estoque com 320 ul de tampão de Histidina BCY8245 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 400 ul de tampão de Histidina BCY8245 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 560 ul de tampão de Histidina BCY8253 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 400 ul de tampão de Histidina BCY8253 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 560 ul de tampão de Histidina BCY8255 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul de tampão de acetato BCY8255 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul de tampão de acetato Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose Tampão de acetato: 50 mM de acetato/ácido acético pH 5 10% de sacarose
4.4. Coleta de Amostra
[574] No final do estudo, o plasma do grupo 7, 10 e grupo 13 foi coletado em 5 min, 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após a última dosagem. O tumor dos grupos 7, 10 e grupo 13 foi coletado 2 h após a última dosagem. O tumor do grupo 1, 5, 6, 8, 9, 11 e 12 foi coletado 2 h após a última dosagem. O tumor do grupo 2, 3 e grupo 4 foram coletados sem qualquer dosagem.
5. Resultados
5.1. Curvas de Crescimento do Tumor
[575] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 46-49,
5.2 Traço do Volume Tumoral
[576] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos CB17-SCID fêmeas com xenoenxerto HT-1376 é mostrado na Tabela 31.
Tabela 31: Traços do volume tumoral ao longo do tempo
Dias após o início do tratamento Gr. Tratamento Ro o 2 5 7 9 12 14 1 Veículoqw 153+16 266+30 398+41 529+56 721+76 908+91 1069+90 BCY8242, 2 15317 23141 27121 376431 473+70 530+81 570+92 3 mpk, qu BCY8242, 3 153+15 220+8 245+37 354+35 378+38 39152 428+66 3 mpk, biw BCY8242, 4 152+13 202+14 249+22 361+54 372+37 389+40 459+34 mpk, qu BCY8245, 5 153+26 254+53 298+69 398+61 468+73 502+67 603+76 3 mpk, qu BCY8245, 6 154+30 248+58 203+15 273+45 356+50 39153 407+53 3 mpk, biw BCY8245, 7 15315 237+41 228+36 317+31 394+20 43831 465+33 5 mpk, qu BCY8253, 8 153+12 209+9 2690+8 343+29 447+33 46625 533+29 3 mpk, qu BCY8253, 9 15313 21433 246+18 286+23 364+41 40033 442+45 3 mpk, biw BCY8253, 15315 217+49 231+49 308+36 360+44 401+70 442+62 5 mpk, qu BCY8255, u 153+22 233+3 284+6 358+27 476+40 486+65 538+59 3 mpk, qu BCY8255, 12 15321 233+33 218+23 298+45 336+42 36531 390+40 3 mpk, biw BCY8255, 13 152+17 233+30 290+4 338+10 406+26 459+68 516+64 5 mpk, qu
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[577] Taxa de inibição de crescimento tumoral para artigos de teste no modelo de xenoenxertos HT-1376 foi calculada com base nas medicos de volume tumoral no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 32: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Volume do Valor P Gr Tratamento Tumor TIC (% TGI(%) comparado (mm?) com veículo 1 Veículo, qv 1069+90 -- -- -—-
2 BCY8242, 570+92 53,3 54,5 p<0,01 3 mpk, qv BCY8242, 3 3 mpk, biw 428+66 40,1 70,0 p<0,001 4 BCY8242, 459+34 43,0 66,4 p<0,001 mpk, qv 5 BCY8245, 603+76 56,4 50,9 p<0,01 3 mpk, qv BCY8245, 6 3 mpk, biw 407+53 38,1 72,3 p<0,001 7 BCY8245, 465+33 43,5 66,0 p<0,001 5 mpk, qv 8 BCY8253, 533+29 49,8 58,5 p<0,01 3 mpk, qv BCY8253, 9 3 mpk, biw 442+45 41,3 68,4 p<0,001 BCY8253, 442+62 41,4 68,5 p<0,001 5 mpk, qv 1 BCY8255, 538+59 50,3 58,0 p<0,01 3 mpk, qv BCY8255, 12 3 mpk, biw 390+40 36,5 74,1 p<0,001 13 BCY8255, 516+64 48,3 60,3 p<0,01 5 mpk, qv a. Média + SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[578] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto HT-1376 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 46-49 e Tabelas 31 e 32.
[579] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 1.069 mmº no dia 14. BCY8242 a 3 mg/kg, qw (TV=570 mm?, TGI=54.5%, p < 0.01), 3 mg/kg, biw (TV=428 mm3, TGI=70.0%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=459 mmº?, TGI=66.4%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[580] BCY8245 a 3 mg/kg, qv (TV=603 mm?, TGI=50.9%, p <
0.01), 3 mg/kg, biw (TV=407 mm3, TGI=72.3%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qu (TV=465 mmº?, TGI=66.0%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[581] BCY8253 a 3 mg/kg, qv (TV=533 mmº?, TGI=58.5%, p <
0.01), 3 mg/kg, biw (TV=442 mm3, TGI=68.4%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qu (TV=442 mmº?, TGI=68.5%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[582] BCY8255 a 3 mg/kg, qw (TV=538 mm?º, TGI=58.0%, p <
0.01), 3 mg/kg, biw (TV=390 mm3, TGI=74.1%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qu (TV=516 mmº?, TGI=60.3%, p < 0.01) produziu atividade antitumoral significativa.
[583] Neste estudo, BCY8242 a 3 mg/kg qw e 5 mg/kg qw causou mais de 10% e 20% de perda de peso corporal do animal, respectivamente, BCY8245 e BCY8253 a 5 mg/kg qw causou mais de 10% de perda de peso corporal do animal durante o esquema de tratamento.
Exemplo 9.4: Estudo de eficácia in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto MDA-MB-468 em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[584] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto MDA-MB-468 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental Tratamento Dose Volume de | Rotade | Progra- (mg/kg) Dosagem Dosa- ma
EE Logs = rs
[o sos | [er o o [E [soe | [er o vw [E es ss es | e | | 6)
3. Materiais
3.1. Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[585] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola. * Temperatura: 20 — 26 ºC. * Umidade 40-70%.
[586] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[587] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[588] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[589] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[590] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1. Cultura de células
[591] As células tumorais foram mantidas em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em atmosfera de 5% CO, em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação do Tumor
[592] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais MDA-MB-468 (10 x 106º) em 0,2 ml de PBS suplementado com matrigel 50% para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 196 mm?º?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste Artigo de Con. ves o [sm HIrapA TI dessa
19.886 ml de tampão de Histidina ul de tampão de Histidina
Dissolver 10.56 mg de BCY8245 em 10.518 ml de BCY8245 1 tampão de Histidina Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 400 ul BCY8245 0,5 de tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 560 ul BCY8245 0,3 de tampão de Histidina Dissolver 11.35 mg de BCY8253 em 11.010 ml de BCY8253 1 tampão de Histidina Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 400 ul BCY8253 0,5 de tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 560 ul BCY8253 0,3 de tampão de Histidina Dissolver 10.78 mg de BCY8255 em 10.715 ml BCY8255 1 Tampão de acetato Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul BCY8255 0,5 de tampão de acetato Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul BCY8255 0,3 de tampão de acetato
1. Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose
2. Tampão de acetato: 50 mM de acetato/ácido acético pH 5 10% de sacarose
3. BCY8242(0.5mg/mL), BCY8245(1mg/mL), BCY8253(1mg/mL) e BCY8255(1mg/mL) estoques foram separados em tubos individuais e armazenados a -80ºC 4,4 Coleta de Amostra
[593] No dia 21 do estudo, o plasma do grupo 5, 8 e do grupo 11 foi coletado em 5 min, 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após a última dosagem. Os tumores dos grupos 1, 6, 9 e grupo 12 foram coletados 2 h após a última dosagem. Os tumores do grupo 3 foram coletados sem qualquer dosagem. Os camundongos do grupo 2 foram sacrificados. Os animais dos grupos 4, 7, 10 e 13 foram mantidos correndo por mais 21 dias sem qualquer dosagem, e os tumores desses grupos foram coletados no dia 42.
5. Resultados
5.1. Curvas de Crescimento do Tumor
[594] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 50-53.
5.2. Traço do Volume Tumoral
[595] volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto MDA-MB-468 é mostrado nas Tabelas 33 e 34.
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[596] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 21 após o início do tratamento.
Tabela 33: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 0 ao dia 21) e Diasapósoiniciodotratamento À Gr. Tratamento o o 2 4 7 9 nn 14 16 18 21 1 Veículoqv —199:6 — 217:9 23515 27414 291+14 314:20 34824 37433 398+39 447439 BCY8242, 2 192+11 188+17 —178+10 190+11 166+13 144+16 133+10 12111 114+13 /122+10 3 mpk, qu BA, Ia a tm) a=ao Oii rriCGPA 3 194+29 192+20 179+23 137+12 94+7 59+5 47+7 37+6 28+3 16+3 3 mpk, biw BEBA ss CO “OOOO N 4 193+24 186+30 —133+20 112+13 80+14 66+16 6117 45+11 42+6 40+5 o mpk, qv Ss BCY8245, o 5 194+12 192+26 184+20 131+20 113+17 104+13 94+25 81+23 87+23 85+31 3 mpk, qu BEBA ss O 6 195+33 193+27 —154+20 103+20 83+16 67+14 49+11 45+14 32+12 22+4 3 mpk, biw
BRA O 7 199+28 193+11 1354 98+5 58+5 49+5 47+2 37+4 35+3 29+3 5 mpk, qv BEBA, ss 8 19517 190+24 162+21 160+28 138+33 139+32 136+25 106+24 104+18 109+19 3 mpk, qu BEBA EEFÁ A cmC6"""""Ó 9 199+34 198+13 150+21 119+11 102+14 69+13 70+5 46+5 33+5 29+7 3 mpk, biw BCY8253, 198+28 188+32 142+32 150+20 95+13 69+13 67+13 47+8 42+5 40+8 mpk, qv
BAR n 198+18 191+15 172+24 148+18 139+13 11422 140+13 128+22 141+18 136431 3 mpk, qu BCY8255, 12 197+36 190+28 154+18 109+11 90+13 67+3 64+7 51+8 41+5 311 3 mpk, biw BEBA =" 133 194+29 156+25 121+19 109+14 75414 55+8 66+5 43+5 37+1 42+2 5 mpk, qv
NM 2 s
O o
Tabela 34: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 23 ao dia 42) Dias após o início do tratamento Gr.
Tratamento 23 25 28 32 35 39 42 BCY8242, 4 43+4 68H10 5747 5243 55+2 58+2 55+5 mpk, qv BCY8245, 7 35+5 48H45 37+7 2846 24+4 28H+6 26+6 5 mpk, qv BCY8253, 45+7 56+8 6019 45+2 41+10 48+15 50+20 5 mpk, qv BCY8255, 13 41+4 57+X7 48H68 —39+9 39+6 38+9 34+8 5 mpk, qv Tabela 35: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Valor P Volume do TIC di Gr Tratamento TGI (%) comparado tumor (mm?)? (%) com veículo 1 Veículo, qv 447+39 -- -— -- 2 BCY8242, 122+10 27,2 1282 p<0,001 3 mpk, qv BCY8242, 3 3 mpk, biw 16+3 3,6 171,8 p<0,001 4 BCY8242, 40+5 9,0 161,5 p<0,001 5 mpk, qv 5 BCYS245, 8531 189 144,2 p<0,001 3 mpk, qv BCY8245, 6 3 mpk, biw 22+4 4,9 169,8 p<0,001 7 BCY8245, 29+3 6,6 168,4 p<0,001 5 mpk, qv 8 BCY8253, 109+19 244 1347 p<0,001 3 mpk, qv BCY8253, 9 3 mMpk, biw 29+7 6,6 168,3 p<0,001
10 BCY8253, 40+8 8,9 163,9 p<0,001 mpk, qv nn a mph as 136+31 30,4 125,1 p<0,001 12 E mk bbw 311 6,9 166,8 p<0,001 13 Soh as 42+2 9,5 161,3 p<0,001 a. Média F SEM. — — — PTj A |0" 7 ]ÀÔ4H b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[597] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 50-53 e Tabelas 33 a 35.
[598] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 447 mm? no dia 21. BCY8242 a 3 mg/kg, qw (TV=122 mmº, TGI=128.2%, p < 0.001), 3 mg/kg, biw (TV=16 mm?, TGI=171.8%, Pp<0.001) e 5 mg/kg, qwv (TV=40 mm3?, TGI=161.5%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[599] BCY8245 a 3 mg/kg, qv (TV=85 mm?, TGI=144.2%, p <
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=22 mm?, TGI=169.8%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=29 mm3, TGI=168.4%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[600] BCY8253 a 3 mg/kg, qv (TV=109 mmº?, TGI=134.7%, p <
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=29 mm?, TGI=168.3%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=40 mm?, TGI=163.9%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[601] BCY8255 a 3 mg/kg, qw (TV=136 mm3, TGI=125.1%, p <
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=31 mm?, TGI=166.8%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=42 mm?, TGI=161.3%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[602] A dosagem de grupos de 5 mg/kg foi suspense do dia 21, os tumors não mostraram qualquer recaída durante o programa de monitoramento de 3 semana extra.
[603] Neste estudo, BCY8242, BCY8253 e BCY8255 5 mg/kg causaram severa perda de peso corporal do animal, entre eles, o camundongo 10-1 no grupo BCY8253 5 mg/kg foi encontrado morto no dia 20.
[604] Nesta linhagem celular, que mostra alta expressão de Nectina-4 em estudos FACS, BCY8245 causa a regressão do tumor enfatizando a natureza direcionada ao alvo de eficácia ideal. Exemplo 9.5: Estudo de eficácia in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto NCI-H292 em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[605] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto NCI-H292 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental Tratamento Dose Volume de | Rotade | Programa (mg/kg) Dosagem | Dosagem
CO e e [Goes Te] | 6 e)
[E soe [5 [eme | o a [E oe 1 es | o | 6 | 66
3. Materiais
3.1. Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[606] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
* Temperatura: 20 — 26ºC. * Umidade 40-70%.
[607] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[608] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[609] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[610] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo,
linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[811] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1. Cultura de Células
[612] As células tumorais NCI-H292 foram mantidas in vitro como cultura em monocamada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% CO» em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana por tratamento com tripsina-EDTA. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação do Tumor
[8613] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais NCI-H292 (10 x 106º) em 0,2 ml de PBS para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 162 mmº?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste Artigo de Con.
[jar
19.886 ml de tampão de Histidina ul de tampão de Histidina tampão de Histidina
Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 400 ul BCY8245 0,5 de tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 560 ul BCY8245 0,3 de tampão de Histidina Dissolver 11.35 mg de BCY8253 em 11.010 ml de BCY8253 1 tampão de Histidina Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 400 ul BCY8253 0,5 de tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 560 ul BCY8253 0,3 de tampão de Histidina Dissolver 10.78 mg de BCY8255 em 10.715 ml BCY8255 1 Tampão de acetato Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul BCY8255 0,5 de tampão de acetato Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul BCY8255 0,3 de tampão de acetato 1, Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose 2, Tampão de acetato: 50 mM de acetato/ácido acético pH 5 10% de sacarose 3, BCY8242(0,5mg/mL), BCY8245(1mg/mL), BCY8253(1mg/mL) e BCY8255(1mg/mL) estoques foram separados em tubos individuais e armazenados a -80ºC
4.4. Coleta de Amostra
[614] No final do estudo, o tumor de todos os grupos, exceto o grupo 2, 3, 4 foi coletado 2 h após a última dosagem. O tumor do grupo 2, 3, 4 foi coletado sem qualquer dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento do Tumor
[615] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 54-57.
5.2 Traço do Volume Tumoral
[616] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto NCI-H292 é mostrado na Tabela 36.
Tabela 36: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo Dias após o início do tratamento Gr. Tratamento RE o 2 4 7 9 1 14 1 Veículoqw 161%2 270+14 357+14 44817 570+16 720+36 948+61 BEBA ns SO 2 1601 21413 197+15 159+2 175+X7 —119+8 9210 3 mpk, qwv BCY8242, 3 162+12 221+9 17617 146+36 131+49 79:25 7328 3 mpk, biw BCY8242, 4 163+8 18518 133+4 145+18 131+12 91+5 8145 mpk, qwv BCY8245, 5 1605 220+11 266+15 21823 167+10 161+36 149+43 3 mpk, qwv BCY8245, 6 162+13 243+19 21112 10111 100+6 —87X7 6543 3 mpk, biw BCY8245, 7 160+9 —176:7 191+3 105+8 8243 91X14 8348 5 mpk, qwv BCY8253, 8 1627 1879 17620 159+15 147+68 11413 9843 3 mpk, qwv BCY8253, 9 162+14 174:9 14947 70+2 6846 58+2 — 4945 3 mpk, biw BCY8253, 161+10 1619 121+9 97+3 — 7946 82+8 689 5 mpk, qwv BCY8255, n 162+8 195+14 16045 123+1 108H5 —104+3 100+9 3 mpk, qwv BCY8255, 12 162+15 20416 14811 132+16 102+20 106+38 96+35 3 mpk, biw O BOYB255, A AA AS no 13 164:8 171+8 103+9 101+5 89+11 8732 9744 5 mpk, qwv
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[6817] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto NCI-H292 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 37: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
FT Volume do Mn amiG=iSAgrp
TIC TG Gr Tratamento Tumor comparado (%) (% ; (mmº)? com veículo 1 Veículo, qu 948+61 -—- - -—- BCY8242, 2 92+10 9,7 1086 p<0,001 3 mpk, qv BCY8242, 3 . 73+28 7,7 1114 p<0,001 3 mpk, biw aa CACOS 4 81+5 86 1104 p<0,001 mpk, qwv BEBA si A TP" OCS 5 149+43 158 1014 p<0,001 3 mpk, qv Mr Bora MB [PACO ATA ACCS O 6 . 65+3 69 1122 p<0,001 3 mpk, biw Mr BOYBAB o FaI:I:EE" rir OO 7 83+8 88 1098 p<0,001 5 mpk, qwv BCY8253, 8 98+3 104 1081 p<0,001 3 mpk, qv Mr Bcocysa53, SS“ 2" >=: 2" 0 9 49+5 5,2 1143 p<0,001 3 mpk, biw Mo Boysasa, o aIiIM.H 0 — AU" 68+9 7,2 111,9 p<0,001 5 mpk, qwv “A Bcyga555 — > PbSjíI ia 50 n 100+9 106 107,9 p<0,001 3 mpk, qv “o Bcygas5s 3" a a“ 9A 12 . 96+35 101 1085 p<0,001 3 mpk, biw Be a AB THA AO 13 97+44 102 1085 p<0,001 5 mpk, qwv a. Média + SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[618] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto NCI-H292 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 54-57 e Tabelas 36 e 37.
[8619] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 948 mm? no dia 14. BCY8242 a 3 mg/kg, qw (TV=92 mm?, TGI=108.6%, p < 0.001), 3 mg/kg, biw (TV=73 mm?, TGI=111.4%, p<0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=81 mm?, TGI=110.4%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[620] BCY8245 a 3 mg/kg, qv (TV=149 mmº?, TGI=101.4%, p <
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=65 mm?, TGI=112.2%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=83 mm3, TGI=109.8%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[621] BCY8253 a 3 mg/kg, qwv (TV=98 mm?, TGI=108.1%, p <
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=49 mm?, TGI=114.3%, p < 0.001) e at 5 mg/kg, qw (TV=68 mm3, TGI=111.9%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[622] BCY8255 a 3 mg/kg, qv (TV=100 mmº?, TGI=107.9%, p <
0.001), 3 mg/kg, biw (TV=96 mm?, TGI=108.5%, p < 0.001) e at 5 mg/kg, qw (TV=97 mm3, TGI=108.5%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[623] Todos os artigos de teste a 3 mg/kg, qw, 3 mg/kg, biw e 5 mg/kg, qwv mostraram atividade antitumoral comparável, a eficácia não melhorou ainda mais quando se aumentou a dosagem ou frequência de dose.
[624] Neste estudo, os animais tratados com BCY8253 a 5 mg/kg mostraram uma perda média de 15% do peso corporal no dia 9, os camundongos em outros grupos mantiveram bem o peso corporal.
[625] Nesta linhagem celular, que mostra alta expressão de Nectina-4 em estudos FACS, BCY8245 causa a regressão do tumor enfatizando a natureza direcionada ao alvo de eficácia ideal.
Exemplo 9.6: Estudo de eficácia in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto NCI-H526 em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[626] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto NCI-H526 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental Tratamento Dose Volume de Rota de Programa (mg/kg) Dosagem Dosagem
A E O ee RT a) E ee ss e A
3. Materiais
3.1. Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 21 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[627] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 animais em cada gaiola. * Temperatura: 20 — 26 ºC.
* Umidade 40-70%.
[628] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[629] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[630] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[631] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[632] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[633] As células NCI-H526 foram mantidas em meio suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em atmosfera de 5% de CO> em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação do Tumor
[634] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais NCI-H526 (5,0 x 106º) em 0,2 ml! de PBS para o desenvolvimento do tumor. 21 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 181 mm?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste
Artigo de | Con. Formulação teste (mg/ml) [Veículo —[- | 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 400 ul de BCY8245 |0,5 tampão de Histidina Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 560 ul de BCY8245 |0,3 tampão de Histidina Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 ul de BCY8255 |0,5 tampão de acetato Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 ul de BCY8255 |0,3 tampão de acetato
7. Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose
8. Tampão de acetato: 50 mM de acetato/ácido acético pH 5 10% de sacarose
4.4. Coleta de Amostra
[635] No final do estudo no dia 14, todos os tumores foram coletados para FFPE.
5. Resultados
5.1. Curvas de Crescimento do Tumor
[636] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 58 e 59.
5.2 Traço do Volume Tumoral
[637] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto NCI-H526 é mostrado na Tabela 38. Tabela 38: Traços do volume tumoral ao longo do tempo Grup Tratament Dias após o iníciodo tratamento o o o 2 4 7 9 12 14 1 Veículo, 181X3 — 26256 431+90 563X/2 729115 107615 1365208 qw 2 5 2 BCY8245, 180+3 25651 403+/72 545+68 657x83 101915 120579 3mpk,qwv 2 5 3 BCY8245, 182+4 232+49 308+/79 440112 530121 810197 1109250 3 mpk,biw 3
4 BCY8245, 180+5 209+66 236+72 383+119 375115 365479 476103 5mpk,qwv 2 BCY8255, 182+3 264+63 364:88 53/:97 610:80 842103 1146125 3mpk,qw O 6 BCY8255, 181%2 26446 313+56 393+62 440:67 520:7/6 715163 3mpk,biw 9 7 BCY8255, 182+3 227+57 256+63 381+90 3954/76 474100 704101 Smpk,/qwv 5
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[638] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto NCI-H526 foi calculada com base nas ocorrências do volume tumoral no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 39: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Volume do Grupo Tratamento Tumor TIC (%) TGI (%) Valor P (mm?) 1 Veículo, qv 1365+208 -- -- -- 2 BCY8245, 1205+79 88,3 134 p>0,05 3 mpk, qv BCY8245, 3 3 mpk, biw 1109+250 81,3 21,6 p>0,05 a BCYS2S, 476+103 34,9 750 — p<ooi 5 mpk, qwv 5 BCY8255, 1146+125 84,0 18,5 p>0,05 3 mpk, qv BCY8255, 6 : 715+163 52,4 54,9 p>0,05 3 mpk, biw BCY8255, 7 704+101 51,5 55,9 p<0,05 5 mpk, qwv a. Média + SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[639] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto NCI-H526 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 58 e 59 e nas Tabelas 38 e 39.
[640] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 13653 no dia 14 após o início do tratamento. BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 1205 mm3, TGI = 13,4%, p > 0,05) e 3 mg/kg, biw (TV = 1109 mm?, TGI = 21,6%, p > 0,05) mostrou ligeira atividade antitumoral, BCY8245 a 5 mg/kg, qw (TV = 476 mm?, TGI = 75,0%, p < 0,01) mostrou atividade antitumoral significativa.
[641] BCY8255 a 3 mg/kg, qw (TV = 1146 mm?, TGI = 18,5%, p > 0,05) mostrou ligeira atividade antitumoral. BCY8255 a 3 mg/kg, biw (TV = 715 mm?, TGI = 54,9%, p > 0,05) produziu atividade antitumoral moderada, mas sem significância estatística. BCY8255 a 5 mg/kg, qwv (TV = 704 mm3?, TGI = 55,9%, p < 0,05) mostrou atividade antitumoral significativa.
[642] Neste estudo, BCY8245 a 5 mg/kg biw causou mais de 10% de perda de peso corporal do animal, BCY8255 3 mg/kg biw e 5 mg/kg qw perdidos causaram mais de 15% de perda de peso corporal do animal durante o esquema de tratamento.
[643] Nesta linhagem celular, que mostra expressão mínima de Nectina-4 em estudos FACS, o crescimento do tumor é restringido por BCY8245, mas o tumor não sofre regressão, enfatizando o requisito direcionado ao alvo para eficácia ideal. Exemplo 9.7: Estudo de eficácia in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto Panc2.13 em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[644] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento do xenoenxerto Panc2.13 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental Tratamento Dose Volume de Rota de Programa (mg/kg) Dosagem Dosagem (ulg) e e a) ee Tr ee e | 6 6 [E ses [5 es | o o a o ses [5 [eme | o
3. Materiais
3.1. Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[645] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola. * Temperatura: 20 — 26 ºC. * Umidade 40-70%.
[646] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[647] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[648] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[649] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[650] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1. Cultura de células
[651] As células tumorais Panc2.13 serão mantidas em meio RMPI1640 suplementado com 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 10 unidades/ml de insulina humana recombinante a 37ºC em atmosfera de 5% CO,» em ar. As células tumorais serão rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial serão colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação do Tumor
[652] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais Panc2.13 (5 x 106) com Matrigel (1:1) em 0,2 ml de PBS para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 149 mmº?. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste
Artigo de Con. Formulação fee em O [E Jara) BCY8242 0,5 Diluir 510 ul 20 mg/ml de BCY8242 estoque com ço SOME | BCY8242 0,3 Diluir 480 ul 0.5 mg/ml de BCY8242 estoque com o [seua o BCY8245 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 400 o [aeee BCY8245 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8245 estoque com 560 o [aeee BCY8253 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 400 o [aeee BCY8253 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8253 estoque com 560 o [aee BCY8255 0,5 Diluir 400 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 400 [neem BCY8255 0,3 Diluir 240 ul 1 mg/ml de BCY8255 estoque com 560 a dnetmánda |
9. Tampão de histidina:25 mM de Histidina pH7 10% de sacarose 4,4. Coleta de Amostra
[653] No final do estudo, o tumor de todos os grupos, exceto o grupo 2, 3, 4 foi coletado 2 h após a última dosagem. O tumor do grupo 2, 3, 4 foi coletado sem qualquer dosagem.
5. Resultados
5.1. Curvas de Crescimento do Tumor
[654] As Curvas de Crescimento do Tumor são mostradas nas Figuras 60-63.
5.2 Traço do Volume Tumoral
[655] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto Panc2.13 é mostrado na Tabela 40.
Tabela 40: Traços do volume tumoral ao longo do tempo Dias após o início do tratamento Gr. Tratamento RE o 2 4 7 9 1 14 1 Veículo, qu —149+12 202+12 240+9 321+17 410+27 479+32 545+17 Boa annbes ss SO 2 149+31 172433 20146 240+40 275+49 293+48 334+49 3 mpk, qwv Ti Berg A "A" 3 148+10 169+6 192+1 22613 245+14 223+11 227+22 3 mpk, biw BCY8242, 4 149+37 172+32 19038 211437 21437 199+31 218+41 mpk, qwv BCY8245, 5 149+34 160+33 19139 21553 242+62 259+59 271+54 3 mpk, qwv BCY8245, 6 148H+46 170+38 204+57 216+56 236+59 241+60 231+57 3 mpk, biw BCY8245, 7 149+18 180+11 23133 242+34 248H+40 231+37 238+40 5 mpk, qwv BCY8253, 8 149+19 176+20 230+25 253+20 274+27 303+18 324+21 3 mpk, qwv BCY8253, 9 149+42 175+39 217+61 216+59 222+64 213+64 219+68 3 mpk, biw BCY8253, 148X7 —159+8 19545 190+5 173X11 168412 170+23 5 mpk, qwv BCY8255, u 150+35 184+39 234+52 267+52 277+54 297+55 310+58 3 mpk, qwv BCY8255, 12 149+41 18643 233+52 247+53 256+54 244+44 251+44 3 mpk, biw BOBA ss SO 13 150+27 180+27 223+37 239+39 224+31 200+18 209+19 5 mpk, qwv
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[656] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto Panc2.13 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 41: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
Volume Valor P TIC? TGI Gr Tratamento do Tumor comparado %&) (% ' (mm3)a com veículo 1 Veículo, qv B545+17 -- -- -- o Boraaga o 65 oÍCettAvlPs)A CA POA 2 334+49 61,2 53,2 p<0,01 3 mpk, qv BCY8242, 3 227+22 41,6 80,0 p<0,001 3 mpk, biw BCY8242, 4 218+41 40,0 82,4 p<0,001 mpk, qv Bag Ai] A" "000 MR 5 271+54 49,6 69,2 p<0,01 3 mpk, qv O BCOYBM5 6 231+57 42,3 79,1 p<0,001 3 mpk, biw BCY8245, 7 238+40 43,6 77,5 p<0,001 5 mpk, qv BCY8253, 8 324+21 59,3 55,9 p<0,01 3 mpk, qv BB, "O 9 219+68 40,2 82,2 p<0,001 3 mpk, biw BCY8253, 170+23 31,1 94,5 p<0,001 5 mpk, qv BCY8255, 1 310+58 56,8 59,5 p<0,01 3 mpk, qv BCY8255, 12 251+44 46,0 74,3 p<0,001 3 mpk, biw BAR" NA TAÕOÚCOO 13 209+19 38,2 85,1 p<0,001 5 mpk, qv a.
Média + SEM. b.
A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e Discussão de Resultados
[657] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto Panc2.13 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 60-63 e Tabelas 40 e 41.
[658] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 545 mm? no dia 14. BCY8242 a 3 mg/kg, qw (TV=334 mm?, TGI=53.2%, p < 0.01), 3 mg/kg, biw (TV=227 mm?, TGI=80.0%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qw (TV=218 mmº?, TGI=82.4%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[659] BCY8245 a 3 mg/kg, qwv (TV=271 mmº, TGI=69.2%, p <
0.01), 3 mg/kg, biw (TV=231 mm3, TGI=79.1%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qu (TV=238 mmº?, TGI=77.5%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[660] BCY8253 a 3 mg/kg, qwv (TV=324 mmº?, TGI=59.8%, p <
0.01), 3 mg/kg, biw (TV=219 mm3, TGI=82.2%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qu (TV=170 mmº?, TGI=94.5%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa em dose ou de uma maneira dependente de frequência de dose.
[661] BCY8255 a 3 mg/kg, qw (TV=310 mmº, TGI=59.5%, p <
0.01), 3 mg/kg, biw (TV=251 mmº?, TGI=74.3%, p < 0.001) e 5 mg/kg, qwv (TV=209 mmº?, TGI=85.1%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa.
[662] Neste estudo, os animais em todos os grupos de 5 mg/kg qw perderam em média 15% do peso corporal, especialmente aqueles nos grupos de 5 mg/kg BCY8253 e BCY8255, que perderam mais de 20% do peso corporal durante o esquema de tratamento.
[663] Nesta linhagem celular, que mostra apenas expressão moderada de Nectina-4 em estudos de FACS, o crescimento do tumor é restringido por BOY8245, mas o tumor não sofre regressão. Exemplo 9.8: Estudo de eficácia in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto MDA-MB-468 em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[664] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY8245, BCY8781 e BOCY8245 em combinação com BCY8234 no tratamento de xenoenxerto MDA-MB-468 em camundongos nus Balb/c para determinar o papel que a ligação ao alvo tem que desempenhar em eficácia ideal.
2. Projeto Experimental es] oe [| [ES] ee] (mg/kg) Dosagem Eos e E e esse] E E E E E esse] E ssa] mm | | e [ocre] [2 mona] sm | | Tones] Nota: N, o número de animais em cada grupo.
3. Materiais
3.1. Animais e Condições de Alojamento
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g
Número de animais: 36 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[665] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 4 animais em cada gaiola. * Temperatura: 20 — 26ºC. * Umidade 40-70%.
[666] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[667] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[668] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[669] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[670] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1. Cultura de células
[671] As células tumorais foram mantidas em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em uma atmosfera de 0% CO» em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação do Tumor
[672] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais MDA-MB-468 (10 x 106º) em 0,2 ml de PBS suplementado com matrigel 50% para o desenvolvimento do tumor. 36 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 186 mmº. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste Artigo Conc. [core [Pro fina remeet [PER LS ame TI ESSES tampão de Histidina' 1164 ul de tampão de Histidina BCY8245 | 99,4% 1080 ul de tampão de Histidina 840 ul de tampão de Histidina diluir com 2.426 ml de tampão de Histidina 1164 ul de tampão de Histidina BCY8781 | 99,0% 1080 ul de tampão de Histidina 840 ul de tampão de Histidina tampão de Histidina
4.4. Coleta de Amostra
[673] No dia 21 do estudo, os tumores dos grupos 5, 6,7,8e9 foram coletados para FFPE. No final do estudo, os tumores do grupo 3 foram coletados para FFPE.
5. Resultados
5.1. Curva de Crescimento Tumoral
[674] A curva de crescimento do tumor é mostrada na Figura 64.
5.2 Traço do Volume Tumoral
[675] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto MDA-MB-468 é mostrado nas Tabelas 42 a 44.
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[676] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 21 após o início do tratamento.
6. Sumário e Discussãode Resultados
[677] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 64 e nas Tabelas 42 a 45.
[678] O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 420 mm? no dia 21. BCY8245 at 1 mg/kg, qw (TV=204 mm?, TGI=92.1%, p < 0.001), 3 mg/kg, qwv (TV=27 mm?, TGI=164.9%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa de uma maneira dependente de dose. BCY8245 a 0,3 mg/kg qw ou biw não mostrou qualquer atividade antitumoral.
[679] BCY8781 a 0,3 mg/kg, qw (ou biw) (TV=283 mm?3, TGI=58.3%, p < 0.05), 1 mg/kg, qv (TV=232 mm?, TGI=80.1%, p <
0.01), 3 mg/kg, qw (TV=91 mm?, TGI=139.4%, p < 0.001) produziu atividade antitumoral significativa de uma maneira dependente de dose.
[680] BCY8245 a 1 mg/kg, qwv e 3 mg/kg, qw em combinação com BCY8234 (o peptídeo cognato livre de toxina) 300 mg/kg, qwv produziu atividade antitumoral significativa (TV = 242 mm?, TGI = 75,4%, p <0,01)
produziu atividade antitumoral significativa. Quando comparado com BCY8245 sozinho, a atividade antitumoral de BCY8245 a 3 mg/kg foi antagonizada por BCY8234 a 300 mg/kg (p < 0,001). Esta redução na eficácia pelo peptídeo livre de toxina competidor demonstra a importância da ligação ao alvo para a eficácia ideal. A resposta de eficácia observada com o BTC de não ligação, BCY8781, foi comparável à observada com BCY8245 na presença de excesso de peptídeo de ligação livre de toxina. Isso novamente enfatiza as vantagens da ligação dirigida ao alvo para eficácia ideal.
[681] O grupo de veículo foi dividido em dois grupos no dia 32 e recebeu uma dose de 5 mg/kg BCY8781 ou 5 mg/kg BCY8245, respectivamente, os tumores mostraram regressão tumoral óbvia após a dose única.
[682] Durante o seguinte programa de monitoramento, os camundongos tratados com BCY8245 1 mg/kg qw apresentaram recidiva tumoral óbvia, enquanto os camundongos tratados com BCY8245 3 mg/kg qw não mostraram nenhuma recidiva tumoral.
Tabela 42: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 0 ao dia 21) FO ÔÂM"edeaâÂaa"iagapósoiniciodo tratamento ||| Gr. Tratamento o o 2 4 7 9 1 14 16 18 21 1 Veículo, qu 182+15 196+18 217+18 260+15 283+19 302+26 /335+27 362+28 386+31 420+37 BCY8245 2 188+21 189+19 — 211+21 235+28 252+25 253+33 275+26 277+X27 295+26 —300+27
0.3 mpk, qv BCY8245 3 185+21 187+22 183+22 190+28 —205+29 195+27 — 201+25 197+22 21824 — 204+19 1 mpk, qwv BCY8245 4 181+14 17117 163+10 141+21 113+16 — 92+5 66+4 58+2 41+2 27+1 3 mpk, q NM RR oo BCY8781 N 184+14 187+12 — 204+9 245+17 262+24 272+21 277+24 290+29 297+41 283+23 o
0.3 mpk, qu Ss BCY8781 6 184+12 175+16 188+21 206+25 — 223+26 213+29 202+31 200+24 21134 232+32 1 mpk, qwv BCY8781 7 184+15 179+17 180+20 177+27 170+21 142+21 124+13 108+12 107+8 917 3 mpk, qwv BCY8245+BCY8234 8 184+15 189+22 194+28 21230 221+34 221+39 223+36 211+38 221+51 242+67 1+300 mpk, qwv BEBA BEBA ss O 9 184+16 178+57 193+36 197+46 179+44 138+41 137+32 114+24 110+24 — 99+18 3+300 mpk, qwv
Tabela 43: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 23 ao dia 32) “O . Diasapósoiniciodotratamento Gr. Tratamento 23 25 28 30 32 1 Veículo, qu 434+35 —460+38 504+32 535+46 548+51 BCY8245 2 284+14 268+10 25415 240+21 241+32
0.3 mpk, qw BCY8245 3 200+16 199+13 210+6 221+14 239+16 1 mpk, qv BA AMA PP" 2 4 22+3 19+3 20+3 15+2 15+1 3 mpk, qv Tabela 44: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 35 ao dia 91) Grupo 1, Grupo 1, Veículo,qv Veículo,qw, Grupo 2, doseado doseado Grupo 3 Grupo 4, BCY8245, Dias com com BCY8245, BCY8245,
0.3 mpk, BCY87815 BCY82455 Impk,vqv 3mpk, qw w mpk em mpk em 9 PG-D32 PG-D32 389+19 455+81 237+33 255+15 19+2 37 326+26 373+92 246+40 292+19 16+2 39 248+18 247+48 248+37 304+36 141 42 149+14 134+18 245+48 314+42 14+2 44 135+20 108+3 251+48 327+42 18+4 46 129+8 79+3 248+61 342+55 19+4 49 120+1 63+8 250+65 356+59 20+4 51 134+6 62+5 264+68 374+71 18+5 53 144+2 53+12 268+81 381+87 22+4 56 161+1 52+13 271+87 416+104 21+4 58 166+7 58+0 267+95 433+113 20+5 60 169+10 61+7 270+108 464+119 18+6 64 176+10 71+23 276+132 532+154 23+6
67 191+5 66+14 269+137 550+162 23+5 71 194+18 73+5 280+155 565+170 24+7 74 186+1 82+4 295+167 594+173 27+8 78 203+11 90+8 313+194 612+195 23+6 81 212+20 104+17 291+192 639+206 27+8 84 224+51 110+1 301+194 695+234 34+7 88 230+60 106+7 277+194 743+236 32+7 1 242+75 110+3 293+209 771+240 26+6 Tabela 45: Análise de Inibição de Crescimento Tumoral Gr Tratamento TC TG VaorP Combo Volume — (%) (%) comparado comparado do Tumor (mm?)? com com veículo BCY8245 1 Veículo, qw — 420837 oo mo mo 2 BCY8M5 — 30027 714 527 p>005
0.3 mpk, qwv 3 — BCY8245 — 20419 486 921 p<000T 1 mpk, qv 4 BCY8SM5 — 27X1 65 1649 p<000T 3 mpk, qv BCY8781 — 283:23 6/4 583 p<005
0.3 mpk, qwv 6 BCY8781 — 232:32 552 801 p<0MT 1 mpk, qv 7 BCY8I81 917 216 13894 p<000T 3 mpk, qv 8 BCY8245+BCY8234 242+67 5/8 754 p<001 p>005 1+300 mpk, qwv 9 BCYS245+BCY8234 99:18 235 1359 p<0,001 P<0001 3+300 mpk, qwv a MÉdia Fr SEM.
b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
Exemplo 9.9: Estudo de eficácia in vivo de artigos de teste no tratamento de xenoenxerto MDA-MB-468 em camundongos nus Balb/c
1. Objetivo do Estudo
[683] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY8245 sozinho ou em combinação com BCY8234 no tratamento do xenoenxerto MDA-MB-468 em camundongos nus Balb/c.
2. Projeto Experimental mo EEE | (mg/kg) Dosagem For e E Tas =300 semanas Nota: N, o número de animais em cada grupo.
3. Materiais
3.1 Animais e Condições de Habitação
3.1.1. Animais Espécie: Mus Musculus Cepa: Balb/c nus Idade: 6-8 semanas Sexo: fêmea Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 20 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de habitação
[684] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 5 animais em cada gaiola.
* Temperatura: 20 — 26ºC. * Umidade 40-70%.
[685] Gaiolas: Fabricadas em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[686] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[687] Água: os animais tiveram livre acesso à água potável esterilizada.
[688] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[689] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e Procedimentos Experimentais
4.1 Cultura Celular
[690] As células tumorais foram mantidas em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em uma atmosfera de 0% CO» em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação do Tumor
[691] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais MDA-MB-468 (10 x 106º) em 0,2 ml de PBS suplementado com matrigel 50% para o desenvolvimento do tumor. 20 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 464 mmº. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo de Teste Artigo Conc.
[dotes Poms [qnga [Pi as | [e ATA Tess tampão de histidina* ul de tampão de histidina ul de tampão de histidina tampão de histidina
4.4. Coleta de Amostras
[692] No final do estudo, os tumores do grupo 3 foram coletados para FFPE.
5. Resultados
5.1. Curva de Crescimento Tumoral
[693] A curva de crescimento do tumor é mostrada na Figura 65.
5.2 Traço do Volume Tumoral
[694] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto MDA-MB-468 é mostrado nas Tabelas 46 a 48.
5.3. Análise de Inibição de Crescimento Tumoral
[695] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi calculada com base nas medições do volume tumoral no dia 28 após o início do tratamento.
6. Sumário e Discussãode Resultados
[696] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi avaliada. Os volumes tumorais medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 65 e nas Tabelas 46 a 49.
[697] O tamanho de partida do tumor inicial foi intencionalmente maior do que o anteriormente usado para determinar se BCY8245 mostrou eficácia neste tamanho maior. O tamanho médio do tumor de camundongos tratados com veículo atingiu 773 mm? no dia 28. BCY8245 a 1 mg/kg, qw (TV = 384 mm3, TGI = 126,6%, p < 0,001) e 3 mg/kg, qwv (TV = 50 mm?, TGI = 234,6%, p < 0,001) produziu atividade antitumoral significativa de maneira dependente da dose no dia 28. Entre eles, os camundongos tratados com BCY8245, 3 mg/kg qw mostraram alguma recidiva do tumor após cessar o tratamento, a dosagem adicional a partir do dia 76 não funcionou na regressão completa do tumor.
[698] BCY8245 a 3 mg/kg, qw em combinação com BCY8234 300 mg/kg, qw produziu atividade antitumoral significativa (TV = 55 mm3, TG! = 234,0%, p < 0,001) no dia 28, e os tumores não mostraram qualquer recaída durante todo o programa de monitoramento.
[699] Os camundongos do grupo de veículo tratado com 10 mg/kg de Nectina-4 ADC ou 5 mg/kg BCY8245 e os camundongos do grupo 2 (BCY8245, 1 mpk, qw) tratados com 5 mg/kg de BCY8245 em PG-D28 mostraram regressão tumoral eficaz nas 3 semanas seguintes, depois disso, os tumores voltaram a crescer nas 4 semanas seguintes quando retirados do medicamento.
[700] BCY8245 foi capaz de causar regressão tumoral nos tumores de aproximadamente 450 mm?, mas também quando administrado ao grupo que recebeu anteriormente v veículo, em tumores com um volume inicial de aproximadamente 770 mmº.
Tabela 46: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 0 ao dia 28) FO cmÔuzeaeaZeCeíiasapósoiniciodotratamento ||| Gr. Tratamento a o 2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 26 28 5290 548 574 602 632 659 68 706 741 769 773 1 Veículo, qu 466+89 — 494+94 106 +109 +117 +130 +133 +129 +133 +145 +148 +157 +155 Ba mm AS 474 446 461 460 433 412 430 421 382 384 2 466+22 — 480+24 Impk, qwv +29 +25 +31 +34 +28 +37 +32 +32 +34 +37 +41 BCY8245 388 333 281 168 129 093 83 71 60 49 50 3 464+28 —451+24 3 mpk, qu +25 +30 +26 +24 +20 +23 +17 +19 +17 +17 +17 BCY8245+BCY8234 401 389 309 205 150 125 NM 4 467+45 —457+46 95+3 90+5 78H5 664 5545 o (3+300) mpk, qwv +47 +42 +25 +9 +9 +5 =D o o
O fo)
Tabela 47: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 30 ao dia 75) Grupo 1, Grupo p P Grupo 2, Veículo, 1,Veículo, BCY8245, doseado —“doseado Dias após Impk, Grupo 3, Grupo 4, com com o início do mudança BCY8245, BCY8245+BCY8234 trat: It Smpk Smpk 5mpk 3mpk, ratamento em 5m mpk, qu + ; BCY8781 BCY8245 p PK qw — 3+300 mpi, qu em PG- em PG- em PG- D28 D28 D28 700+57 625+27 351+42 44+18 49+8 33 537+88 477431 213+29 43+20 33+10 443+70 405+65 151+18 44+20 3110 37 297+71 237+36 98+16 50+24 3110 40 203+64 148+33 89+17 55+29 36+14 42 161+47 142+33 95+16 66+32 40+13 44 139+50 132+69 103+20 71+33 3511 48 103+35 — 146+100 106+21 80+36 43+14 51 114445 171+122 103+21 91+43 45+18 55 108+44 — 227+166 104+20 108+53 42+13 56 119+50 — 264+182 120+23 125+58 43+12 62 118450 — 288+206 145+29 146+70 40+12 65 129+55 — 316+212 163+31 147+74 41+14 68 124+51 — 347+215 173+32 155+81 46+13 72 142+62 — 368+242 180+36 170+89 45+20 75 146+50 — 385+245 196+40 — 223+115 43+19 Tabela 48: Traço de Volume Tumoral ao longo do Tempo (Dia 79 ao dia 103) Gr.
Tratamen- Dias após o início do tratamento to 79 82 86 89 93 96 100 103 3 BCY8245 221+1 198+1 185+1 180+1 155+ 166 221+1 250+1 3mpk,qw 18 o7 os 02 91 95 19 25

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Ligante peptídico específico para Nectina-4, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo compreendendo pelo menos três resíduos de cisteína, separados por pelo menos duas sequências de loop, e um arcabouço molecular que forma ligações covalentes com os resíduos de cisteína do polipeptídeo de modo que pelo menos dois loops de polipeptídeo são formados no arcabouço molecular.
2. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas sequências de loop compreendem 3, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos, tais como 3, 6, 7 ou 9 aminoácidos, em particular 3 ou 9 aminoácidos.
3. Ligante peptídico, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequências de loop, uma das quais consiste em 3 aminoácidos e a outra consiste em 9 aminoácidos.
4. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: Ci-P/A/Hyp-F/Y-G/A-Ci-X1-X2-X3-W/1-Nal/2-Nal-S/A-X4-P- VD/A-W/1-Nal/2-Nal-Ci; (SEQ ID NO: 38); Ci-W/A-P-L-D/S-S/D-Y-W-Cii-X5-R-1I-Cii (SEQ ID NO: 39); Cr-V-T-T-S-Y-D-Ci-F/W-L/V-H/R/T-L-L/G-G/Q/H-Ci; (SEQ ID NO: 40); Ci-Xe-X7-Xg-Cii-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii: — (SEQ ID NO: 41); e Ci-W/A/Y-P/A-L-D/S/A-S/D/P/A-Y-W/1-Nal-Ci-X5-R/HArg/A- |-Cii (SEQ ID NO: 42);
em que:
X1-Xs representam qualquer resíduo de aminoácido, incluindo aminoácidos modificados e não naturais;
Xs representa: Gly; Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de azetidina (Aze), hidroxiprolina (HyP), 4-amino- prolina (Pro(4NH)), ácido oxazolidina-4-carboxílico (Oxa), ácido octa- hidroindolocarboxílico (Oic) ou 4,4-difluoroprolina (4,4-DFP); Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de ácido aminoisobutírico (Aib); ou Sarcosina (Sar);
X7 representa: Phe ou um derivado não natural de Phe selecionado a partir de 3-metil-fenilalanina (3MePhe), 4-metil- fenilalanina (4MePhe), homofenilalanina (HPhe), 4,4-bifenilalanina (4,4- BPA) ou 3,4-di-hidroxifenilalanina (DOPA); Tyr; ou Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 1-naftilalanina (1-Nal), 2- naftilalanina (2-Nal) ou 2-piridilalanina (2Pal);
Xzg representa: Gly; Ala; Asp; Lys ou um derivado não natural de Lys selecionado a partir de acetil-lisina (KAc ou Lys (Ac)); Phe; Glu; Gln; Leu; Ser; Arg; ou ácido cisteico (Cya);
Xa está ausente ou representa: Met ou um derivado não natural de Met selecionado a partir de metionina sulfona (Met(O2)); GIn ou um derivado não natural de Gln selecionado a partir de homoglutamina (HGlh); Leu ou um derivado não natural de Leu selecionado a partir de homoleucina (HLeu) ou norleucina (Nle); Lys; Ile; t-butil-alanina (tBuAla); ou homoserina-metila (HSe(Me));
X1o representa: Pro; Lys ou um derivado não natural de Lys selecionado a partir de acetil-lisina (KAc ou Lys (Ac)); Arg ou um derivado não natural de Arg selecionado a partir de ácido 2-amino-4- guanidinobutírico (Agb), homoarginina (HArg) ou N-metil-homoarginina; Glu; Ser; Asp; Gln; Ala; hidroxiprolina (HyP); ou ácido cisteico (Cya);
X1 representa: Asn ou um derivado não natural de Asn selecionado a partir de N-metil-asparagina; Thr; Asp; Gly; Ser; Seu; Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de tienil-alanina (Thi), 2-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina / (1,2,4-TriAz) ou Beta-(4-tiazolil)- alanina (A4ThiAz); Lys; ou ácido cisteico (Cya);
X12 representa: Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp), 5-fluoro-L-triptofano (SFTrp) ou metil-triptofano (TrpMe); ou Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 1-naftil alanina (1-Nal) ou 2-naftil alanina (2-Nal);
Xi3 representa: Ser ou um derivado não natural de Ser selecionado a partir de homoserina (HSer); Ala; Asp; ou Thr;
X1a representa: Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp); Ser; Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 2-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina (1,2,4-TriAz), 1-naftil alanina (1-Nal) ou 2-naftil alanina (2-Nal); Asp; Phe ou um derivado não natural de Phe selecionado a partir de 3,4-di-hidróxi- fenilalanina (DOPA); Tyr; Thr ou um derivado não natural de Thr selecionado a partir de N-metil-treonina; ácido tetra-hidropiran-4- propanoico (THP(O)); ou ácido dioxo-4-tetra-hidrotiopiranilacético (THP(SO2));
X15 representa Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de azetidina (Aze), ácido pipecólico (Pip) ou ácido oxazolidina-4-carboxílico (Oxa);
Xe representa: lle ou um derivado não natural de lle selecionado a partir de N-metil-isoleucina (NMelle); Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 3-ciclo-hexil-alanina (Cha) ou ciclopropil-alanina (Cpa); Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de hidroxiprolina (HyP); Asp; Lys; ciclopentil-glicina (C5A); ácido tetra-hidropiran-4-propanoico (THP(O)); ou ácido dioxo-4- tetra-hidrotiopiranilacético (THP(SO2));
X17 representa: Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp) ou 5-fluoro-L-triptofano (SFTrp); Phe; Tyr; 1-naftil alanina (1-Nal); ou 2-naftil alanina (2-Nal); Hyp representa hidroxiprolina, 1-Nal representa 1-naftil alanina, 2-Nal representa 2-naftl alaninayqà HArg representa homoarginina e C;, Ci e Ci; representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequência de loop a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda das quais consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: Ci-Xe-X7-Xg-Cii-Xo-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii: — (SEQ ID NO: 41); em que Xs a X1:7 são como definidos na reivindicação 4.
6. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que: Xs representa: Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de azetidina (Aze), hidroxiprolina (HyP), 4-amino- prolina (Pro(4NH)), ácido oxazolidina-4-carboxílico (Oxa), ácido octa- hidroindolecarboxílico (Oic) ou 4,4-difluoroprolina (4,4-DFP), tal como Pro; e/ou X7 representa: Phe ou um derivado não natural de Phe selecionado a partir de 3-metil-fenilalanina (3MePhe), 4-metil- fenilalanina (4MePhe), homofenilalanina (HPhe), 4,4-bifenilalanina (4,4- BPA) ou 3,4-di-hidróxi-fenilalanina (DOPA); Ala ou um derivado não natural de Ala selecionado a partir de 1-naftilalanina (1-Nal), 2- naftilalanina (2-Nal) ou 2-piridilalanina (2Pal), tal como Phe ou 1-
naftilalanina (1-Nal), em particular 1-naftilalanina; e/ou
Xg representa Asp, Arg, Lys ou ácido cisteico (Cya). Em uma outra modalidade, Xg representa D-Asp, D-Arg, D-Lys ou D-Cya, em particular D-Asp; e/ou
X,o representa: Met ou um derivado não natural de Met selecionado a partir de metionina sulfona (Met(O2)); ou Leu ou um derivado não natural de Leu selecionado a partir de homoleucina (HLeu) ou norleucina (Nle); tal como Met ou Leu, em particular Met; e/ou
X1w representa Arg ou um derivado não natural de Arg selecionado a partir de ácido 2-amino-4-guanidinobutírico (Agb), homoarginina (HArg) ou N-metil-homoarginina; ou ácido cisteico (Cya), tal como homoarginina (HArg) ou ácido cisteico (Cya) (tal como D-Cya), em particular homoarginina (HArg); e/ou
X1 representa: Asn ou um derivado não natural de Asn selecionado a partir de N-metil-asparagina; Asp; ou His; ou ácido cisteico (Cya). Em uma outra modalidade, X1: representa Asn, Asp, His ou ácido cisteico (Cya) (tal como D-Cya), em particular Asp; e/ou
X12 representa: Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp), 5-fluoro-L-triptofano (SFTrp) ou metil-triptofano (TrpMe), tal como Trp; e/ou
Xi3 representa Ser ou um derivado não natural de Ser selecionado a partir de homoserina (HSer), tal como Ser; e/ou
X1a representa Thr ou um derivado não natural de Thr selecionado a partir de N-metil-treonina, tal como Thr; e/ou
X15 representa Pro; e/ou
Xe representa: lle ou um derivado não natural de lle selecionado a partir de N-metil-isoleucina (NMelle); ou Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de hidroxiprolina (HyP), tal como lle; ou Pro ou um derivado não natural de Pro selecionado a partir de hidroxiprolina (HyP),em particular Ile, Pro ou hidroxiprolina
(HyP), mais particularmente hidroxiprolina (HyP); e/ou X17 representa Trp ou um derivado não natural de Trp selecionado a partir de azatriptofano (AzaTrp) ou 5-fluoro-L-triptofano (5SFTrp), tal como Trp.
7. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequência de loop a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda das quais consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: Ci-P-X7-Xg-Cir-X9-HArg-X11-W-S-T-P-X16-W-Cii (SEQ ID NO: 204); em que X7, X8, X9, X11 e X' são como definidos na reivindicação 4 ou reivindicação 6.
8. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que as referidas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína separados por duas sequência de loop a primeira das quais consiste em 3 aminoácidos e a segunda das quais consiste em 9 aminoácidos, e o referido ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: C;-P-F/1-Nal-dD/dR-C;;-M/L-HArg-N/H/D-W-S-T-P-1/P/HyP- W-Cii (SEQ ID NO: 205).
9. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico de Ci-X6-X7-Xg-Cii-Xo- X1o-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Cii (SEQ ID NO: 41) compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: CPFGCMETWSWPIWC (SEQ ID NO: 45); CPFGCMRGWSWPIWCOC (SEQ ID NO: 46);
CPFGCMSGWSWPIWC (SEQ ID NO: 47); CPFGCMEGWSWPIWC (SEQ ID NO: 48); CPFGCMEDWSWPIWC (SEQ ID NO: 49); CPFGCMPGWSWPIWC (SEQ ID NO: 50); CPFGCMKSWSWPIWC (SEQ ID NO: 51); CPFGCMKTWSWPIWC (SEQ ID NO: 52); CPFGCMKGWSWPIWC (SEQ ID NO: 53); CPFGCQEHWSWPIWC (SEQ ID NO: 54); CPFGCIKSWSWPIWC (SEQ ID NO: 55); CPFGCQEDWSWPIWC (SEQ ID NO: 56); CPFGCMSDWSWPIWC (SEQ ID NO: 57); CPFGCMI[HArg]lNWSWPIWC (SEQ ID NO: 59); CPFGCMIK(Ac)]!NWSWPIWC (SEQ ID NO: 60); CPFGCMIK(Ac)]|SWSWPIWC (SEQ ID NO: 61); CPFGCINIEeJKSWSWPIWC (SEQ ID NO: 62); CPFGCMI[HArg]|SWSWPIWC (SEQ ID NO: 63); CPFGCM[dK]ISWSWPIWC (SEQ ID NO: 64); CP[dA]GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 66); CPF[dAJCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 67); CPFGCM[dAIJNWSWPIWC (SEQ ID NO: 68); CPFGCMK[dAJWSWPIWC (SEQ ID NO: 69); CPFGCMKN[dAISWPIWOC (SEQ ID NO: 70); CPFGCMKNWSWP[dAJWC (SEQ ID NO: 71); CIdAJFGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 72); CPFGCItBuAla-lKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 73); CPFGC[HLeu]lKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 74); CPFGCMKNWSWPI[1Nal]C (SEQ ID NO: 75); CPF[dDJCM[HArg]lNWSWPIWC (SEQ ID NO: 76); CPF[dA]CMIHArg]|NWSWPIWC (SEQ ID NO: 77); CP[3MePhe] GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 78);
CP[4MePhe] GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 79); CP[HPhe]GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 80); CPF[dDJCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 81); CPFGC[Hse(Me)]JKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 82); CPFGCMKN[AzaTrp]SWPIWC (SEQ ID NO: 83); CPFGCMKNWSFPIWC (SEQ ID NO: 84); CPFGCMKNWSYPIWC (SEQ ID NO: 85); CPFGCMKNWS[1Nal]PIWC (SEQ ID NO: 86); CPFGCMKNWS[2Nal]PIWC (SEQ ID NO: 87); CPFGCMKNWS[AzaTrp]PIWC (SEQ ID NO: 88); CPFGCMKNWSWIAZe]IWC (SEQ ID NO: 89); CPFGCMKNWSWIPip]IWC (SEQ ID NO: 90); CPFGCMKNWSWPIFC (SEQ ID NO: 91); CPFGCMKNWSWPIYC (SEQ ID NO: 92); CPFGCMKNWSWPI[AzaTrp]C (SEQ ID NO: 93); CGFGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 94); CIAze]JFGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 95); CPFIK(Ac]]|CMKNWSWPIWOC (SEQ ID NO: 96); CPFGCLKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 97); CPFGC[MetO2JKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 98); CPFGCMPNWSWPIWOC (SEQ ID NO: 99); CPFGCMONWSWPIWC (SEQ ID NO: 100); CPFGCMKNWSWPPWOC (SEQ ID NO: 101); CP[2Pal|GCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 102); CPFGCMKN[1Nal|SWPIWC (SEQ ID NO: 111); CPFGCMKN[2Nal|SWPIWC (SEQ ID NO: 112); CPFGCMKNWSWPI[2Nal]C (SEQ ID NO: 113); CIHyPJFEGCMKNWSWPIWC (SEQ ID NO: 114); CPF[dD]JCM[HArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 115); CPF[dD]JCM[HArg][dK|WSTPIWOC (SEQ ID NO: 116);
CPFIdDJCM[HArglNWSTPKWOC (SEQ ID NO: 117); CIPro(4NH)IFIdDJCMIHArg lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 118); CPF[IdDJCMKNWSTPIWC (SEQ ID NO: 119); CPFIdKJCMIHArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 120); CPF[dD]JCK[HArg]lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 121); CPFIdD]JCM[HArg]KWSTPIWC (SEQ ID NO: 122); CIOxalFIdDJCM[HArg]INWSTPIWC (SEQ ID NO: 123); CPF[dD]JCM[HArg][ThilWSTPIWC (SEQ ID NO: 124); CPF[dD]JCM[HArg][4ThiAZ]WSTPIWOC (SEQ ID NO: 125); CPF[dD]JCM[HArg][1 24TriAZ|WSTPIWOC (SEQ ID NO: 126); CPF[dD]JCM[HArg]NWS[124TriAzZ]PIWC (SEQ ID NO: 127); CPFIdD]JCM[HArg]|NWST[Oxa]lWC (SEQ ID NO: 128); CPI[DOPA][dD]CM[HArg]lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 129); CPFIdD]JCM[HArg]lNWS[DOPA]PIWC (SEQ ID NO: 130); CPFIdD]JCM[HArg]NWS[THP(SO2)]PIWC (SEQ ID NO: 131); CPFIdDJICM[HArglNWSTP[THP(SO2)]WC (SEQ ID NO:
132); CPF[dD]JCM[HArg]N[5FTrp]|STPIWC (SEQ ID NO: 133); CPF[dD]JCM[HArg]|NWSTPI[5FTrp]C (SEQ ID NO: 134); CPF[dD]JCM[HArg]lNWS[THP(O)]JPIWC (SEQ ID NO: 135); CPFIdDJCM[HArglNWSTP[THP(O)]WC (SEQ ID NO: 136); CI44DFP]FIdDJCMIHArg lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 137); CIOic]FIdDICM[HArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 138); CPFIdFICM[HArg]lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 139); CPFIdEJCMIHArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 140); CPFIdQ]CM[HArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 141); CPFIdL]ICMIHArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 142); CPFIdS]CMIHArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 143); CPFIdD]JCM[HArg]NW[HSer]TPIWC (SEQ ID NO: 144); CPF[dD]JCM[HArglNWSTP[C5AJWC (SEQ ID NO: 145);
CPFIdDJCM[HArglNWSTP[Cpa]lWC (SEQ ID NO: 146); CPFIdD]JCM[HArglNWSTP[Cha]WC (SEQ ID NO: 147); CPF[dD]C[HGIN][HArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 148); CPFIdD]C[C5A][HArg|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 149); CPF[dD]JCM[HArg]N[Trp(Me)|STPIWC (SEQ ID NO: 150); CPF[IdDIINMeCys]M[HArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 151); CPF[dD]C[HArg]|NWS[NMeThr]PIWC (SEQ ID NO: 152); CP[1Nall|[dDJCM[HArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 155); CP[2Nal]|[dDJCM[HArg]lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 156); CP[44BPA][dD]CM[HArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 157); CPFIdDJCM[HArglNWSTPPWOC (SEQ ID NO: 158); CPFIdD]JICM[HArglNWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 159); CPF[IdD]CLIHArglNWSTPPWC (SEQ ID NO: 160); CPF[dD]JCLIHArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 161); CPY[dD]JCM[HArg|lNWSTPIWC (SEQ ID NO: 162); CIAib]FIdDJCMI[HArg |NWSTPIWC (SEQ ID NO: 163); CISar|FIdDJCM[HArg]|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 164); CPFIdRICM[HArglNWSTPIWC (SEQ ID NO: 165); CPFIdDJCM[HArglNWSTPKWOC (SEQ ID NO: 166); CP[1Nall|[dDJCM[HArg lNWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 167); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]HWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 168): CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 169); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWSTPIWC (SEQ ID NO: 170); CP[INal|[dRICM[HArg lNWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 171); CP[INal|[dRICM[HArg]HWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 172); CPFIdDJCMINMeHArg|NWSTPIWC (SEQ ID NO: 173); CPF[dD]JCM[HArg][NMeAsn]JWSTPIWC (SEQ ID NO: 174); CPF[dD]JCM[HArg]|NWS[NMeThr]PIWC (SEQ ID NO: 175); CPFIdD]JCM[HArglNWSTP[NMelle]JWC (SEQ ID NO: 176); CP[1Nall[dDJCM[HArg][CyalWSTP[HyPJWC (SEQ ID NO:
177); CP[1Nall[dDJCM[Cya]DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 178); CP[INall[DCya]CM[HArg]lDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 179); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWDTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 180); CP[2Nal]|[dDJCM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 181); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWTTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 182); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWI[HSer]TP[HyPJWC (SEQ ID NO: 183); CP[1Nall[dDJCM[HArg]DWIdS]ITP[HyPJWC (SEQ ID NO: 184); CP[1Nall|[dDJCM[HArg]DWSSP[HyP]WC (SEQ ID NO: 185); CP[1Nall|[dDJCM[Agb]DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 186); CP[INall[ldDJCMPDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 187); CP[1Nall|[dDJCM[HyPIDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 188); CP[INall|[dRICM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 189); CP[INal|[dRICM[HArg]DWDTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 190); CP[2Nal]|[dRICM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 191); CP[INal|[dRICM[HArg]DWTTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 192); CP[1Nall|[dRICM[HArg]DWI[HSer]TP[HyPJWC (SEQ ID NO: 193); CP[INall|[dRICM[HArg]DWIdS]ITP[HyPJWC (SEQ ID NO: 194); CP[INal|[dRICM[HArg]DWSSP[HyP]WC (SEQ ID NO: 195); CP[INal|[dRICM[Agb]DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 196); CP[INallldRICMPDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 197); CP[INall|[dRICM[HyPIDWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 198); CP[1Nall|[dD]CL[HArg]DWSTPIWC (SEQ ID NO: 199); CP[1Nall[dD]CL[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 200); CP[1Nall|[dRICL[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 201);
CP[1INal]|[dR]CL[HArg]HWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 202); CP[INal|[dR]|CM[HArg]DWSTPIWC (SEQ ID NO: 203); CP[INall[DCya]CM[Cya]DWSTP[HyPJWC (SEQ ID NO: 208);
CP[INal]|[DCya]CM[HArg][CyalWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 209);
CP[INall[dD]CM[Cyal[CyalWSTP[HyPJWC (SEQ ID NO: 210);
CP[1INal|[dK]|CM[HArg]DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 211);
CP[INal|[dDJCMKDWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 212);
CP[1INall[dDJCM[HArg]D[dW]STP[HyP][dW]C (SEQ ID NO: 215) e
CPFGCM[HArg]|DWSTP[HyP]WC (SEQ ID NO: 216);
tal como:
CP[1Nal|[dDJCM[HArg]DWSTP[HyP]JWC (SEQ ID NO: 169);
em particular:
DDA-(SEQ ID NO: 45)A (doravante referido como BCY3386);
DTA-(SEQ ID NO: 46)A (doravante referido como BCY3388);
DSE-(SEQ ID NO: 47)A (doravante referido como BCY3389);
HDA-(SEQ ID NO: 48)-A (doravante referido como BCY3390);
MDT-(SEQ ID NO: 49) A (doravante referido como BCY3391);
DPG-(SEQ ID NO: 50)A (doravante referido como BCY3392);
HDS-(SEQ ID NO: 51)-A (doravante referido como BCY3393);
(D-H)DS-(SEQ ID NO: 51)-A (doravante referido como BCY7272); A(SEQ ID NO: 52) TDK (doravante referido como BCY3394); A(SEQ ID NO: 53)LKD (doravante referido como BCY3395); A(SEQ ID NO: 54)TTA (doravante referido como BCY3396); A(SEQ ID NO: 55)-QME (doravante referido como BCY3397); A(SEQ ID NO: 56)LSE (doravante referido como BCY3398); A(SEQ ID NO: 57)-STD (doravante referido como BCY3399); A(SEQ ID NO: 59) TNK (doravante referido como BCY7265); Ac-(SEQ ID NO: 59) (doravante referido como BCY7660); A(SEQ ID NO: 60) TNK (doravante referido como BCY7266); Ac-(SEQ ID NO: 60) (doravante referido como BCY7616); HDS-(SEQ ID NO: 61)A (doravante referido como BCY7273); HDS-(SEQ ID NO: 62)A (doravante referido como BCY7274); HDS-(SEQ ID NO: 63)-A (doravante referido como BCY7275); HDS-(SEQ ID NO: 64)-A (doravante referido como BCY7276); A(SEQ ID NO: 66) TNK (doravante referido como BCY7349);
A(SEQ ID NO: 67) TNK (doravante referido como BCY7350);
Ac-(SEQ ID NO: 67) (doravante referido como BCY7538);
A(SEQ ID NO: 68) TNK (doravante referido como BCY7359);
A(SEQ ID NO: 69) TNK (doravante referido como BCY7360);
A(SEQ ID NO: 70) TNK (doravante referido como BCY7361);
A(SEQ ID NO: 71) TNK (doravante referido como BCY7365);
A(SEQ ID NO: 72) TNK (doravante referido como BCY7370);
Ac-(SEQ ID NO: 73) (doravante referido como BCY7535);
Ac-(SEQ ID NO: 74) (doravante referido como BCY7536);
Ac-(SEQ ID NO: 75) (doravante referido como BCY7541);
[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 76) (doravante referido como BCY7556);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 76) (doravante referido como BCY7558);
[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 77) (doravante referido como BCY7557);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 77) (doravante referido como BCY7559);
Ac-(SEQ ID NO: 78) (doravante referido como BCY7580);
Ac-(SEQ ID NO: 79) (doravante referido como BCY7581);
Ac-(SEQ ID NO: 80) (doravante referido como BCY7582);
Ac-(SEQ ID NO: 81) (doravante referido como BCY7584);
Ac-(SEQ ID NO: 82) (doravante referido como BCY7585);
Ac-(SEQ ID NO: 83) (doravante referido como BCY7588);
Ac-(SEQ ID NO: 84) (doravante referido como BCY7589); Ac-(SEQ ID NO: 85) (doravante referido como BCY7590); Ac-(SEQ ID NO: 86) (doravante referido como BCY7591); Ac-(SEQ ID NO: 87) (doravante referido como BCY7592); Ac-(SEQ ID NO: 88) (doravante referido como BCY7593); Ac-(SEQ ID NO: 89) (doravante referido como BCY7594); Ac-(SEQ ID NO: 90) (doravante referido como BCY7595); Ac-(SEQ ID NO: 91) (doravante referido como BCY7596); Ac-(SEQ ID NO: 92) (doravante referido como BCY7597); Ac-(SEQ ID NO: 93) (doravante referido como BCY7598); Ac-(SEQ ID NO: 94) (doravante referido como BCY7607); Ac-(SEQ ID NO: 95) (doravante referido como BCY7608); Ac-(SEQ ID NO: 96) (doravante referido como BCY7611); Ac-(SEQ ID NO: 97) (doravante referido como BCY7612); Ac-(SEQ ID NO: 98) (doravante referido como BCY7613); Ac-(SEQ ID NO: 99) (doravante referido como BCY7614); Ac-(SEQ ID NO: 100) (doravante referido como BCY7615); Ac-(SEQ ID NO: 101) (doravante referido como BCY7618); Ac-(SEQ ID NO: 102) (doravante referido como BCY7620); Ac-(SEQ ID NO: 111) (doravante referido como BCY7663); Ac-(SEQ ID NO: 112) (doravante referido como BCY7664); Ac-(SEQ ID NO: 113) (doravante referido como BCY7667); Ac-(SEQ ID NO: 114) (doravante referido como BCY7668); Ac-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7765); (SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7793); (MeO-dPEG12)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8087); (Carboxifluorosceína)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8208); (PEG3)(PEG3)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como
BCY7815);
(MeO-dPEG12)(PEG3)(PEG3)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8094);
Ac-DDD-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8028);
Ac-[dD][dD][dD]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8029);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7814);
Ac-(SEQ ID NO: 116) (doravante referido como BCY7816);
Ac-(SEQ ID NO: 116) (MeO-dPEG12) ligado a D-Lys6 (doravante referido como BCY8084);
Ac-(SEQ ID NO: 117) (doravante referido como BCY7817);
Ac-(SEQ ID NO: 118) (doravante referido como BCY7818;
Ac-(SEQ ID NO: 118) (MeO-dPEG12) ligado a Pro(ANH)1 (doravante referido como BCY8086);
Ac-(SEQ ID NO: 119) (doravante referido como BCY7819;
Ac-(SEQ ID NO: 119) (MeO-dPEG12) ligado a Lys5 (doravante referido como BCY8088);
Ac-(SEQ ID NO: 120) (doravante referido como BCY7820;
Ac-(SEQ ID NO: 120) (MeO-dPEG12) ligado a D-Lys3 (doravante referido como BCY8089);
Ac-(SEQ ID NO: 121) (doravante referido como BCY7821);
Ac-(SEQ ID NO: 121) (MeO-dPEG12) ligado a Lys4 (doravante referido como BCY8090);
Ac-(SEQ ID NO: 122) (doravante referido como BCY7822);
Ac-(SEQ ID NO: 122) (MeO-dPEG12) ligado a Lys6 (doravante referido como BCY8091);
Ac-(SEQ ID NO: 123) (doravante referido como BCY7876);
Ac-(SEQ ID NO: 124) (doravante referido como BCY7877);
Ac-(SEQ ID NO: 125) (doravante referido como BCY7879); Ac-(SEQ ID NO: 126) (doravante referido como BCY7881); Ac-(SEQ ID NO: 127) (doravante referido como BCY7883); Ac-(SEQ ID NO: 128) (doravante referido como BCY7884); Ac-(SEQ ID NO: 129) (doravante referido como BCY7886); Ac-(SEQ ID NO: 130) (doravante referido como BCY7887); Ac-(SEQ ID NO: 131) (doravante referido como BCY7889); Ac-(SEQ ID NO: 132) (doravante referido como BCY7890); Ac-(SEQ ID NO: 133) (doravante referido como BCY7891); Ac-(SEQ ID NO: 134) (doravante referido como BCY7892); Ac-(SEQ ID NO: 135) (doravante referido como BCY7894); Ac-(SEQ ID NO: 136) (doravante referido como BCY7895); Ac-(SEQ ID NO: 137) (doravante referido como BCY7896); Ac-(SEQ ID NO: 138) (doravante referido como BCY7897); Ac-(SEQ ID NO: 139) (doravante referido como BCY7902); Ac-(SEQ ID NO: 140) (doravante referido como BCY7903); Ac-(SEQ ID NO: 141) (doravante referido como BCY7904); Ac-(SEQ ID NO: 142) (doravante referido como BCY7906); Ac-(SEQ ID NO: 143) (doravante referido como BCY7907); Ac-(SEQ ID NO: 144) (doravante referido como BCY7908); Ac-(SEQ ID NO: 145) (doravante referido como BCY7911); Ac-(SEQ ID NO: 146) (doravante referido como BCY7912); Ac-(SEQ ID NO: 147) (doravante referido como BCY7913); Ac-(SEQ ID NO: 148) (doravante referido como BCY7914); Ac-(SEQ ID NO: 149) (doravante referido como BCY7915); Ac-(SEQ ID NO: 150) (doravante referido como BCY7916); Ac-(SEQ ID NO: 151) (doravante referido como BCY7973); Ac-(SEQ ID NO: 152) (doravante referido como BCY7979); Ac-(SEQ ID NO: 155) (doravante referido como BCY8030); Ac-(SEQ ID NO: 156) (doravante referido como BCY8031);
Ac-(SEQ ID NO: 157) (doravante referido como BCY8032);
Ac-(SEQ ID NO: 158) (doravante referido como BCY8036);
Ac-(SEQ ID NO: 159) (doravante referido como BCY8037);
Ac-(SEQ ID NO: 160) (doravante referido como BCY8038);
Ac-(SEQ ID NO: 161) (doravante referido como BCY8039);
Ac-(SEQ ID NO: 162) (doravante referido como BCY8040);
Ac-(SEQ ID NO: 163) (doravante referido como BCY8041);
Ac-(SEQ ID NO: 164) (doravante referido como BCY8042);
Ac-(SEQ ID NO: 165) (doravante referido como BCY8042);
Ac-(SEQ ID NO: 166) (doravante referido como BCY8085);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8120);
Ac-(SEQ ID NO: 167) (doravante referido como BCY8124);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8121);
Ac-(SEQ ID NO: 168) (doravante referido como BCY8125);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8122);
Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126);
(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8116);
Fluoresceína-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8205);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234);
[PY A][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8846);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8123);
Ac-(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8127);
(SEQ ID NO: 170) (doravante referido como BCY8206);
Ac-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8128); (SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8207); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 171) (doravante referido como BCY8232); Ac-(SEQ ID NO: 172) (doravante referido como BCY8129); Ac-(SEQ ID NO: 173) (doravante referido como BCY8153); Ac-(SEQ ID NO: 174) (doravante referido como BCY8154); Ac-(SEQ ID NO: 175) (doravante referido como BCY8157); Ac-(SEQ ID NO: 176) (doravante referido como BCY8158); Ac-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8161); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 177) (doravante referido como BCY8278); Ac-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8162); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 178) (doravante referido como BCY8277); Ac-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8163); Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8276); [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 179) (doravante referido como BCY8269); Ac-(SEQ ID NO: 180) (doravante referido como BCY8174); Ac-(SEQ ID NO: 181) (doravante referido como BCY8175); Ac-(SEQ ID NO: 182) (doravante referido como BCY8176); Ac-(SEQ ID NO: 183) (doravante referido como BCY8177); Ac-(SEQ ID NO: 184) (doravante referido como BCY8178); Ac-(SEQ ID NO: 185) (doravante referido como BCY8180); Ac-(SEQ ID NO: 186) (doravante referido como BCY8181); Ac-(SEQ ID NO: 187) (doravante referido como BCY8182); Ac-(SEQ ID NO: 188) (doravante referido como BCY8183); Ac-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8184);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 189) (doravante referido como BCY8235);
Ac-(SEQ ID NO: 190) (doravante referido como BCY8185);
Ac-(SEQ ID NO: 191) (doravante referido como BCY8186);
Ac-(SEQ ID NO: 192) (doravante referido como BCY8187);
Ac-(SEQ ID NO: 193) (doravante referido como BCY8188);
Ac-(SEQ ID NO: 194) (doravante referido como BCY8189);
Ac-(SEQ ID NO: 195) (doravante referido como BCY8191);
Ac-(SEQ ID NO: 196) (doravante referido como BCY8192);
Ac-(SEQ ID NO: 197) (doravante referido como BCY8193);
Ac-(SEQ ID NO: 198) (doravante referido como BCY8194);
Ac-(SEQ ID NO: 199) (doravante referido como BCY8211);
Ac-(SEQ ID NO: 200) (doravante referido como BCY8212);
Ac-(SEQ ID NO: 201) (doravante referido como BCY8213);
Ac-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8214);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 202) (doravante referido como BCY8231);
Ac-(SEQ ID NO: 203) (doravante referido como BCY8215);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 208) (doravante referido como BCY8279);
Ac-[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8280);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 209) (doravante referido como BCY8273);
Ac-[B-Ala][Sar10])-(SEQ ID NO: 210) (doravante referido como BCY8281);
Ac-(SEQ ID NO: 211) (doravante referido como BCY8831);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 212) (doravante referido como BCY8238);
(SEQ ID NO: 215) (doravante referido como BCY 11415);
[PY A][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 215) (doravante referido como BCY11942); e (SEQ ID NO: 216) (doravante referido como BCY 11414); more particularly: Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8126); (SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8116); Fluoresceína-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8205); e [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234); especialmente: [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 169) (doravante referido como BCY8234).
10. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de: A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09- 02-N002 ou BCY428); FI-A-(SQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80- 09-02-N006); Ac-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como 80-09- 02-N008 ou BCY7390); Ac-[dD]-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como BCY7606); A-(SEQ ID NO: 2)-A (neste documento referido como 80-09- 02-N003 ou BCY429); (1-Nal)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N009 ou BCY7420);
(2-Nal)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N010 ou BCY7421);
(33DPA)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N011 ou BCY7422);
(44BPA)A-(SEQ ID NO: 1)-A (neste documento referido como 80-09-02-N012 ou BCY7521);
Ac-(SEQ ID NO: 3) (neste documento referido como 80-09- 02-N017);
Ac-(SEQ ID NO: 4) (neste documento referido como 80-09- 02-N018);
Ac-(SQ ID NO: 5) (neste documento referido como 80-09-02- NO19 ou BCY7537);
Ac-(SEQ ID NO: 6) (neste documento referido como 80-09- 02-N020);
Ac-(SEQ ID NO: 7) (neste documento referido como 80-09- 02-N021 ou BCY7539);
Ac-(SEQ ID NO: 8) (neste documento referido como 80-09- 02-N022 ou BCY7540);
Ac-(SEQ ID NO: 9) (neste documento referido como 80-09- 02-N023);
Ac-(pCoF)-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como 80-09-02-N044);
Ac-(SEQ ID NO: 10) (neste documento referido como 80-09- 02-N045);
Ac-(SEQ ID NO: 11) (neste documento referido como 80-09- 02-N046 ou BCY7657);
Ac-(SEQ ID NO: 12) (neste documento referido como 80-09- 02-N047 ou BCY7658);
Ac-(SEQ ID NO: 13) (neste documento referido como 80-09- 02-N048 ou BCY7659);
Ac-(SEQ ID NO: 14) (neste documento referido como 80-09- 02-N049);
Ac-(SEQ ID NO: 15) (neste documento referido como 80-09- 02-N050 ou BCY7661);
SDN-(SEQ ID NO: 15)-A (neste documento referido como BCY3387);
Ac-(SEQ ID NO: 16) (neste documento referido como 80-09- 02-N051 ou BCY7662);
Ac-(SEQ ID NO: 17) (neste documento referido como 80-09- 02-N052);
Ac-(SEQ ID NO: 18) (neste documento referido como 80-09- 02-N053);
Ac-(SEQ ID NO: 19) (neste documento referido como 80-09- 02-N054 ou BCY7665);
Ac-(SEQ ID NO: 20) (neste documento referido como 80-09- 02-N055 ou BCY7666);
Ac-(SEQ ID NO: 21) (neste documento referido como 80-09- 02-N056);
A-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N0O01 ou BCY3385);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN(HArg) (neste documento referido como 80-09-02-T01-N003 ou BCY7281);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN(D-K) (neste documento referido como 80-09-02-T01-N004 ou BCY7282);
A-(SEQ ID NO: 22)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N005);
A-(SEQ ID NO: 23)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N006);
Ac-(SEQ ID NO: 1)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N011 ou BCY7391);
A-(SEQ ID NO: 24)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N012 ou BCY7342);
A-(SEQ ID NO: 25)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N014 ou BCY7344);
A-(SEQ ID NO: 1)-ANK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N016 ou BCY7346);
A-(SEQ ID NO: 1)-[dA]NK (neste documento referido como BCY7367);
A-(SEQ ID NO: 1)-TAK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N017 ou BCY7347);
A-(SEQ ID NO: 1)-T[dA]JK (neste documento referido como BCY7368);
A-(SEQ ID NO: 1)-TNA (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N018 ou BCY7348);
A-(SEQ ID NO: 1)-TN[dA] (neste documento referido como BCY7369);
Ac-[pCoPhe]-(SEQ ID NO: 1) (neste documento referido como BCY7656);
A-(SEQ ID NO: 6)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N020 ou BCY7354);
A-(SEQ ID NO: 26)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N022 ou BCY7352);
A-(SEQ ID NO: 27)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-T01-N026 ou BCY7356);
A-(SEQ ID NO: 28)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N027 ou BCY7357);
A-(SEQ ID NO: 29)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO1-N041 ou BCY7372);
A-(SEQ ID NO: 30)-TNK (neste documento referido como 80- 09-02-TO01-N042 ou BCY7424);
A-(SEQ ID NO: 31)-A (neste documento referido como 80- 10-00 ou BCY488);
A-(SEQ ID NO: 32)-A (neste documento referido como BCY432);
DDW-(SEQ ID NO: 32)-A (neste documento referido como 80-10-11-T01 ou BCY433);
VDW-(SEQ ID NO: 33)-A (neste documento referido como 80-10-12-T01 ou BCY462);
QKW-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como 80-10-13-T01 ou BCY3400);
Q[HArg]W-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7278);
QIK(Ac)]JW-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7280);
[AC]JQKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7392);
Q[dK]W-(SEQ ID NO: 34)-A (neste documento referido como BCY7426);
Ac-AKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7622);
Ac-QAW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7623);
Ac-QKA-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7624);
Ac-[dAJKW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7634);
Ac-Q[dAJW-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7635);
Ac-QK[dA]-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7636);
Ac-Q[dD]W-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7993);
Ac-QK[1Nal]l-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7996);
Ac-QK[2Nal]-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY7997);
Ac-(SEQ ID NO: 34) (neste documento referido como BCY8044);
A-(SEQ ID NO: 43)-A (doravante referido como BCY430);
A-(SEQ ID NO: 44)-A (doravante referido como BCY431);
A(SEQ ID NO: 58)-PQA (doravante referido como BCY3401);
QKW-SEQ ID NO: 65)-A (doravante referido como BCY7279);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 103) (doravante referido como BCY7625);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 104) (doravante referido como BCY7627);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 105) (doravante referido como BCY7628);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 106) (doravante referido como BCY7631);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 107) (doravante referido como BCY7632);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 108) (doravante referido como BCY7639);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 109) (doravante referido como BCY7640);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 110) (doravante referido como BCY7643);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 153) (doravante referido como BCY7998);
Ac-QKW-(SEQ ID NO: 154) (doravante referido como BCY8000);
A-(SEQ ID NO: 35)-A (neste documento referido como 80- 11-00 ou BCY471);
A-(SEQ ID NO: 36)-A (neste documento referido como 80- 11-01 ou BOY472);
A-(SEQ ID NO: 37)-SRF (neste documento referido como 80- 11-08-T01 ou BCY3406);
Ac-(SEQ ID NO: 37)-SRF (neste documento referido como BCY7393);
DDA-(SEQ ID NO: 45)A (doravante referido como BCY3386);
DTA-(SEQ ID NO: 46)A (doravante referido como BCY3388);
DSE-(SEQ ID NO: 47)A (doravante referido como BCY3389);
HDA-(SEQ ID NO: 48)-A (doravante referido como BCY3390);
MDT-(SEQ ID NO: 49) A (doravante referido como BCY3391);
DPG-(SEQ ID NO: 50)A (doravante referido como BCY3392);
HDS-(SEQ ID NO: 51)-A (doravante referido como BCY3393);
(D-H)DS-(SEQ ID NO: 51)-A (doravante referido como BCY7272);
A(SEQ ID NO: 52) TDK (doravante referido como BCY3394);
A(SEQ ID NO: 53)LKD (doravante referido como BCY3395); A(SEQ ID NO: 54)TTA (doravante referido como BCY3396); A(SEQ ID NO: 55)-QME (doravante referido como BCY3397); A(SEQ ID NO: 56)LSE (doravante referido como BCY3398); A(SEQ ID NO: 57)-STD (doravante referido como BCY3399); A(SEQ ID NO: 59) TNK (doravante referido como BCY7265); Ac-(SEQ ID NO: 59) (doravante referido como BCY7660); A(SEQ ID NO: 60) TNK (doravante referido como BCY7266); Ac-(SEQ ID NO: 60) (doravante referido como BCY7616); HDS-(SEQ ID NO: 61)A (doravante referido como BCY7273); HDS-(SEQ ID NO: 62)A (doravante referido como BCY7274); HDS-(SEQ ID NO: 63)-A (doravante referido como BCY7275); HDS-(SEQ ID NO: 64)-A (doravante referido como BCY7276); A(SEQ ID NO: 66) TNK (doravante referido como BCY7349); A(SEQ ID NO: 67) TNK (doravante referido como BCY7350); Ac-(SEQ ID NO: 67) (doravante referido como BCY7538); A(SEQ ID NO: 68) TNK (doravante referido como
BCY7359);
A(SEQ ID NO: 69) TNK (doravante referido como BCY7360);
A(SEQ ID NO: 70) TNK (doravante referido como BCY7361);
A(SEQ ID NO: 71) TNK (doravante referido como BCY7365);
A(SEQ ID NO: 72) TNK (doravante referido como BCY7370);
Ac-(SEQ ID NO: 73) (doravante referido como BCY7535);
Ac-(SEQ ID NO: 74) (doravante referido como BCY7536);
Ac-(SEQ ID NO: 75) (doravante referido como BCY7541);
[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 76) (doravante referido como BCY7556);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 76) (doravante referido como BCY7558);
[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 77) (doravante referido como BCY7557);
Ac-[B-Ala][Sars]-(SEQ ID NO: 77) (doravante referido como BCY7559);
Ac-(SEQ ID NO: 78) (doravante referido como BCY7580);
Ac-(SEQ ID NO: 79) (doravante referido como BCY7581);
Ac-(SEQ ID NO: 80) (doravante referido como BCY7582);
Ac-(SEQ ID NO: 81) (doravante referido como BCY7584);
Ac-(SEQ ID NO: 82) (doravante referido como BCY7585);
Ac-(SEQ ID NO: 83) (doravante referido como BCY7588);
Ac-(SEQ ID NO: 84) (doravante referido como BCY7589);
Ac-(SEQ ID NO: 85) (doravante referido como BCY7590);
Ac-(SEQ ID NO: 86) (doravante referido como BCY7591);
Ac-(SEQ ID NO: 87) (doravante referido como BCY7592);
Ac-(SEQ ID NO: 88) (doravante referido como BCY7593); Ac-(SEQ ID NO: 89) (doravante referido como BCY7594); Ac-(SEQ ID NO: 90) (doravante referido como BCY7595); Ac-(SEQ ID NO: 91) (doravante referido como BCY7596); Ac-(SEQ ID NO: 92) (doravante referido como BCY7597); Ac-(SEQ ID NO: 93) (doravante referido como BCY7598); Ac-(SEQ ID NO: 94) (doravante referido como BCY7607); Ac-(SEQ ID NO: 95) (doravante referido como BCY7608); Ac-(SEQ ID NO: 96) (doravante referido como BCY7611); Ac-(SEQ ID NO: 97) (doravante referido como BCY7612); Ac-(SEQ ID NO: 98) (doravante referido como BCY7613); Ac-(SEQ ID NO: 99) (doravante referido como BCY7614); Ac-(SEQ ID NO: 100) (doravante referido como BCY7615); Ac-(SEQ ID NO: 101) (doravante referido como BCY7618); Ac-(SEQ ID NO: 102) (doravante referido como BCY7620); Ac-(SEQ ID NO: 111) (doravante referido como BCY7663); Ac-(SEQ ID NO: 112) (doravante referido como BCY7664); Ac-(SEQ ID NO: 113) (doravante referido como BCY7667); Ac-(SEQ ID NO: 114) (doravante referido como BCY7668); Ac-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7765); (SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7793); (MeO-dPEG12)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8087); (Carboxifluorosceína)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8208); (PEG3)(PEG3)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7815); (MeO-dPEG12)(PEG3)(PEG3)(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8094); Ac-DDD-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como
BCY8028);
Ac-[dD][dD][dD]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY8029);
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 115) (doravante referido como BCY7814);
Ac-(SEQ ID NO: 116) (doravante referido como BCY7816);
Ac-(SEQ ID NO: 116) (MeO-dPEG12) ligado a D-Lys6 (doravante referido como BCY8084);
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11. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o arcabouço molecular é selecionado a partir de 1,1',1"-(1,3,5-triazinana-1,3,5-tri- ill)triprop-2-en-1-ona (TATA).
12. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do ácido livre ou ou sais de sódio, potássio, cálcio, amônio.
13. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a Nectina-4 é Nectina-4 humana.
14. Conjugado de fármaco compreendendo um ligante peptídico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
15. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é conjugado a um ou mais agentes citotóxicos.
16. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido agente citotóxico é selecionado de MMAE ou DM1, em particular MMAE.
17. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido agente citotóxico é MMAE e o referido conjugado adicionalmente compreende um ligante selecionado a partir de: -PABC-CIit-Val-Glutaril- ou -PABC-ciclobutil-Ala-Cit-BAla-, tal como -PABC-CIit-Val-Glutaril; em que PABC representa p- aminobenzilcarbamato.
18. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido agente citotóxico é DM1 e o referido conjugado adicionalmente compreende um ligante que é - SPDB-(SO3H)-, em que SPDB representa N-succinimidil 3-(2-
piridilditio)propionato.
19. Conjugado de fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir de qualquer um de: BCY7683, BCY7825, BCY7826, BCY8245, BCY8253, BCY8254, BCY8255, BCY8549, BCY8550, BCY8783 e BCY8784, tal como: BCY7683, BCY7825, BCY7826, BCY8245, BCY8253, BCY8254, BCY8255, BCY8783 e BCY8784, em particular BCY8245.
20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o ligante peptídico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou conjugado de fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19, em combinação com uma ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende um ou mais agentes terapêuticos.
22. Conjugado de fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por Nectina-4.
23. Método de prevenir, suprimir ou tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo, um conjugado de fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19, em que o referido paciente é identificado como tendo uma variação do número de cópia aumentada (CNV) de Nectina-4.
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