KR20230042153A - Ｍｔ１－ｍｍｐ에 대한 결합용 펩티드 리간드 - Google Patents

Ｍｔ１－ｍｍｐ에 대한 결합용 펩티드 리간드 Download PDF

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KR20230042153A
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Abstract

MT1-MMP에 대한 특이성이 있는 펩티드 리간드로서, 두 개의 디아미노프로피온산 (Dap) 또는 N-아릴디아미노프로피온산 (N-AlkDap) 잔기, 및 시스테인, Dap, 또는 N-AlkDap 에서 선택된 세번째 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 잔기는 적어도 두 개의 루프 서열 및 분자 스캐폴드에 의해 분리되어 있으며, 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드의 Dap 또는 N-AlkDap 잔기와 함께 공유 알킬아미노 연결부에 의해, 그리고 상기 세번째 잔기가 시스테인인 경우에는 시스테인과 함께 공유 티오에테르 연결부에 의해 스캐폴드에 연결되어, 두 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되어 있고, 여기서, 상기 펩티드 리간드는 하기 화학식 II의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 리간드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 II]
Figure pat00065
(서열번호 1)
여기에서, A1, A2, 및 A3는 독립적으로, 시스테인, L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), N-베타-알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-AlkDap), 또는 N-베타-할로알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-HAlkDap)이고, 단, A1, A2, 및 A3 중의 적어도 하나는 Dap, N-AlkDap 또는 N-HAlkDap이고; X 는 아미노산 잔기를 나타내고; U는 N, C, Q, M, S 및 T로부터 선택되는 극성의 비하전된 아미노산 잔기를 나타내고, O 는 G, A, I, L, P 및 V로부터 선택되는 비극성의 지방족 아미노산 잔기를 나타낸다.

Description

ＭＴ１－ＭＭＰ에 대한 결합용 펩티드 리간드{The peptide ligand for the bond about MT1－MMP}
본 발명은 MT1-MMP 에 대한 강한 결합 친화력을 나타내는 펩티드 리간드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 펩티드와 스캐폴드(scaffold) 분자 사이에 둘 이상의 결합을 형성하기 위한 신규한 화학 특성을 갖는 펩티드 리간드에 관한 것이다.
상이한 연구팀들이, 펩티드의 시스테인 잔기와 스캐폴드 분자의 적합한 관능기 사이에 둘 이상의 티오에테르 결합을 형성함으로써 스캐폴드 모이어티(moiety)에 펩티드를 이미 묶어두었다. 예를 들어,트리스(브로모메틸)벤젠으로서 분자 스캐폴드에 시스테인-포함 펩티드를 연결시켜서 약물 화합물 후보를 제조하는 방법이 WO 2004/077062 및 WO 2006/078161에 개시되어 있다.
고리화 잔기를 만들기 위해 시스테인 티올을 이용하여 공유 티오에테르 연결부를 만드는 방법의 장점은 반응성이 선택적이고 생물 직교성(bioorthogonal)이라는 것이다. 티올-포함 직쇄 펩티드는 티올-반응성 스캐폴드 화합물, 예컨대 1,3,5-트리스-브로모메틸벤젠(TBMB)와 함께 고리화되어 바이사이클릭 펩티드를 형성할 수 있는데, 그 반응 생성물은 벤질 위치에 3개의 티오에테르를 포함한다. 티오에테르 연결부가 있는 루프형(looped) 바이사이클릭 펩티드를 형성하기 위한 직쇄 펩티드와 TBMB 의 전체적 반응은 도 1에 도시되어 있다.
티오에테르 모이어티에 대한 적합한 대안을 이용하여 펩티드를 스캐폴드 모이어티에 커플링하여 루프형 펩티드 구조를 형성함으로써 다른 펩티드와의 호환성, 개선된 용해도와 같은 물리화학적 성질의 변화, 생체분포도의 변화 및 기타 이점을달성하고자 하는 대안적 화학 방법에 대한 필요성이 있다.
WO2011/018227 는 제1 펩티드 리간드 또는 펩티드 리간드의 그룹 (여기서 각 펩티드 리간드는 분자 스캐폴드에 공유 연결된 루프 서열에 의해 분리되어 있는 적어도 두 반응성 기를 포함하고 상기 분자 스캐폴드는 상기 반응성 기와 함께 공유 결합을 형성하고 있음)의 배좌를 변경하여 제2 펩티드 리간드 또는 펩티드 리간드의 그룹을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 제1 유도체 또는 유도체의 그룹의 펩티드와 스캐폴드로부터 상기 제2 유도체 또는 유도체의 그룹을 조립하는 단계를 포함하며, 하기 중 하나가 혼입되어 있는 방법을 기재한다: (a) 하나 이상의 반응성 기를 변경하는 단계; 또는 (b) 분자 스캐폴드의 특성을 변경하는 단계; 또는 (c) 하나 이상의 반응성 기 및 분자 스캐폴드 사이의 결합을 변경하는 단계; 또는 (a), (b) 또는 (c)의 임의 조합.
본 출원 전에 공개된 본 출원인의 출원 WO2016/067035 및 계류 중인 출원 GB1607827.1 (2016년 5월 4일 출원)은 MT1-MMP에 대한 결합 친화력이 높은 바이사이클 펩티드 리간드를 기재한다. 또한, 이들 출원은 치료제, 특히 세포독성제와 펩티드 리간드의 콘쥬게이트를 추가로 기재한다. 이들 출원의 전문이 본원에 명백히 혼입된다.
발명의 개요
본 출원인은 MT1-MMP에 대한 친화력이 있는 루프형 펩티드에서 티오에테르 연결부를 알킬아미노 연결부로 대체함으로써 MT1-MMP에 대한 친화력이 모든 티오에테르 연결부로 만들어진 대응 콘쥬게이트(conjugates)와 유사한 루프형 펩티드 콘쥬게이트를 만들 수 있음을 발견하였다. 티오에테르 연결부를 알킬아미노 연결부로 대체함으로써 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 용해성 및/또는 산화 안정성이 개선될 것으로 기대된다.
이에 따라, 제 1 양태에 따르면, 본 발명은 MT1-MMP에 대한 특이성이 있는 펩티드 리간드로서, 시스테인, L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), N-베타-알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-AlkDap) 및 N-베타-할로알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-HAlkDap)에서 선택된 3개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서, 상기 3개 잔기는 적어도 두 개의 루프 서열(loop sequence) 및 분자 스캐폴드에 의해 분리되어 있으며, 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드의 Dap 또는 N-AlkDap 또는 N-HAlkDap 잔기와 함께 공유(covalent) 알킬아미노 연결부에 의해, 그리고 상기 3개 잔기가 시스테인을 포함하는 경우에는 상기 폴리펩티드의 시스테인 잔기와 함께 티오에테르 연결부에 의해 스캐폴드에 연결되어 두 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되고, 상기 펩티드 리간드는 하기 화학식 II의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 리간드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 II]
Figure pat00001
(서열번호 1)
화학식 II에서,
A1, A2, 및 A3는 독립적으로, 시스테인, L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), N-베타-알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-AlkDap), 또는 N-베타-할로알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-HAlkDap)이고, 단, A1, A2, 및 A3 중의 적어도 하나는 Dap, N-AlkDap 또는 N-HAlkDap이고;
X 는 아미노산 잔기를 나타내고;
U는 N, C, Q, M, S 및 T로부터 선택되는 극성의 비하전된(uncharged) 아미노산 잔기를 나타내고,
O 는 G, A, I, L, P 및 V로부터 선택되는 비극성(non-polar)의 지방족 아미노산 잔기를 나타낸다.
본 발명의 유도체는 N-HAlkDap 잔기의 Dap 또는 N-AlkDap에 하나 이상의 알킬아미노 연결부에 의해, 그리고 시스테인에 둘 이하의 티오에테르 연결부에 의해 스캐폴드에 커플링되어 있는 펩티드 루프를 포함한다고 볼 수 있다. 적합하게는, A1, A2, 및 A3는 하나의 시스테인 및 Dap, N-AlkDap 또는 N-HAlkDap에서 선택되는 두 개의 잔기로 이루어진다. N-AlkDap 및 N-HAlkDap 에서 접두어 "알킬"은 탄소 원자수 1 내지 4개의 알킬기, 바람직하게는 메틸을 가리킨다. 접두어 "할로"는 본원에서 일반적 의미에서는 하나 이상, 적합하게는 하나의 플루오로-, 클로로-, 브로모-또는 요오도-치환체를 갖는 알킬기를 지칭하는데 사용된다.
시스테인이 존재할 경우, 티오에테르 연결부는 사이클릭 펩티드의 형성 동안에 앵커(anchor)를 제공하는데, 이에 대해서는 하기에 더 설명한다. 본 구현예에서, 티오에테르 연결부는 적합하게는, 바이사이클릭 펩티드 콘쥬게이트의 중심 연결부인데, 즉, 펩티드 서열에서 펩티드 내의 알킬아미노 연결부를 형성하는 두 개의 잔기가 서로 떨어져서 상기 티오에테르 연결부를 형성하는 시스테인의 양측에 위치한다. 따라서, 루프형 펩티드 구조는 중심에 티오에테르 연결부를 갖고두개의주변알킬아미노 연결부를 갖는바이사이클펩티드콘쥬게이트이다.대안적구현예에따르면, 티오에테르 연결부는 펩티드의 N-말단부 또는 C-말단부,중심연결부,및Dap, N-AlkDap 또는 N-HAlkDap에서 선택되는 기타 말단 연결부에 자리한다.
본 발명의 구현예에서, A1, A2, 및 A3의 셋 모두는 적합하게는 Dap 또는 N-AlkDap또는 N-HAlkDap일 수 있다. 본 구현예에서, 본 발명의 펩티드 리간드는 적합하게는, 중심 알킬아미노 연결부 및 두 개의 주변 알킬아미노 연결부를 갖는 바이사이클 콘쥬게이트이고, 여기서 상기 펩티드는 중심 알킬아미노 연결부를 공유하는 두 개의 루프를 형성한다. 본 구현예에서, A1, A2, 및 A3는 적합하게는 N-AlkDap 또는 N-HAlkDap에서 모두 선택되고, 가장 적합하게는 N-AlkDap인데, 이는 알킬화된 Dap와의 유리한 반응 동역학 때문이다.
적합하게는, X1은 다음의 아미노산 중 임의 하나에서 선택된다: Y, M, F 또는 V, 예컨대 Y, M 또는 F, 특히, Y 또는 M, 보다 특히는 Y.
적합하게는, U/O2는 U, 예컨대 N, 또는 O, 예컨대 G에서 선택된다.
적합하게는, X3는 U 또는 Z에서 선택되고, 여기서 U 는 N, C, Q, M, S 및 T에서 선택되는 극성의 비하전된 아미노산 잔기를 나타내고 Z는 D 또는 E에서 선택되는극성의 음으로 하전된(negatively charged) 아미노산 잔기를 나타내고, 특히, 3 위치의 U는 Q에서 선택되고 3 위치의 Z는 E에서 선택된다.
적합하게는, X4는 J에서 선택되고, 여기서 J는 F, W 및 Y에서 선택되는 비극성의 방향족 아미노산 잔기를 나타낸다.
적합하게는, X10는 Z에서 선택되고, 여기서 Z는 D 또는 E에서 선택되는 극성의 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 D를 나타낸다.
적합하게는, X11는 O에서 선택되고,여기서 O는 G, A, I, L, P 및 V에서 선택되는 비극성의 지방족 아미노산 잔기,예컨대 I를 나타낸다.
적합하게는, 화학식 II의 바이사이클은 하기 화학식 IIa의 화합물, 또는 하기 화학식 IIb의 화합물, 또는 하기 화학식 IIc의 화합물, 또는 하기 화학식 IId의 화합물, 또는 하기 화학식 IIe의 화합물이다:
[화학식 IIa]
-A1-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-A2-E-D-F-Y-Z-O-A3- (서열번호 6)
(화학식 IIa에서, U, O, J 및 Z는 상기 정의한 바와 같다.)
[화학식 IIb]
-A1-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (서열번호 7)
[화학식 IIc]
-A1-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(서열번호 8)
[화학식 IId]
-A1-Y/M-N-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (서열번호 9)
[화학식 IIe]
-A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-07) (서열번호 2)
적합하게는, 화학식 II의 바이사이클은 하기에서 선택되는 서열을 포함한다:
Figure pat00002
예컨대,
Figure pat00003
특히,
Figure pat00004
이고,
가장 특히는
서열번호 16:
Figure pat00005
로 표기되는 17-69-07-N241의 Dap 동족체;
서열번호 17:
Figure pat00006
로 표기되는 17-69-07-N268의 Dap 동족체.
상기 서열 모두에서, A1, A2, 및 A3는 상기 정의한 바와 같다. A1, A2, 및 A3의 적합하고 바람직한 유형 및 위치는 상기 정의한 바와 같다.
구현예에서, 본 발명의 펩티드 리간드는 하기에서 선택되는 하나 이상의 개질을 추가로 포함한다: N-말단 및/또는 C-말단 개질; 하나 이상의 비자연적 아미노산 잔기로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체 (예컨대 하나 이상의 등배전자성(isosteric) 또는 등전자성(isoelectronic) 아미노산으로 하나 이상의 극성 아미노산 잔기를 대체; 기타 비자연적 등배전자성 또는 등전자성 아미노산으로 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 대체); 스페이서 기 (spacer group)의 추가; 하나 이상의 내산화성 아미노산 잔기로 하나 이상의 산화 감수성 아미노산 잔기를 대체; 알라닌으로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체; 하나 이상의 D-아미노산으로 하나 이상의 L-아미노산 잔기를 대체; 바이사이클릭 펩티드 리간드내의 하나 이상의 아미드 결합의 N-알킬화; 대리 결합(surrogate bond)로 하나 이상의 펩티드 결합을 대체; 펩티드 주쇄 길이 개질; 다른 화학기로 하나 이상의 아미노산 잔기의α-탄소상의 수소를 치환; 및 적합한 아민,티올, 카르복실산 및 페놀-반응성 시약으로 시스테인, 라이신, 글루타메이트 및 타이로신과 같은 아미노산을 합성후 생물 직교성 개질.
적합하게는, 본 구현예는 적합한 아미노-반응성 화학을 사용하는 N-말단 개질 및/또는 적합한 카르복시-반응성 화학을 사용하는 C-말단 개질을 포함할 수 있다. 예를 들어, N-말단 개질은 주효 기(effector group)의 콘쥬게이션 및 바이사이클릭 펩티드의 역가 유지를 용이하게 하여 주는 분자 스페이서 기를 표적체에 부가하는 것을 포함할 수 있다. 상기 스페이서 기는 약 5 내지 약 30개의 아미노산을 포함하는 올리고펩티드 기, 예컨대 Ala, G-Sar10-A 기 또는 bAla-Sar10-A 기이다.대안적으로 또는 부가적으로, N-말단 및/또는 C-말단 개질은 세포독성제의 부가를 포함한다.
추가의 가능성있는 펩티드 개질로는 1 위치 및/또는 9 위치의 아미노산에서의 개질을 포함한다.
구현예에서, 펩티드 개질은 하나 이상의 비자연성 아미노산 잔기로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다. 예를 들어, 비자연적 아미노산 잔기가 4 위치에서 치환되고 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌; 3,4-디클로로페닐알라닌; 및 호모페닐알라닌, 예컨대 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌, 및 3,4-디클로로페닐알라닌, 특히 1-나프틸알라닌에서 선택된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비자연적 아미노산 잔기를 9 위치 및/또는 11 위치에서 치환되고, 9 위치에서 4-브로모페닐알라닌 또는 펜타플루오로-페닐알라닌 및/또는 11 위치에서 터트-부틸글라이신에서 선택된다. 본 실시예에서, 상기 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 9 위치에 존재하는 것은 4-브로모페닐알라닌에서 선택될 수 있고 및/또는 상기 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 11 위치에 존재하는 것은 터트-부틸글라이신에서 선택된다.
구현예에서, 1 위치의 아미노산 잔기는 D-아미노산, 예컨대 D-알라닌으로 치환한다. 기타 구현예에서, 5 위치의 아미노산 잔기는 D-아미노산, 예컨대 D-알라닌또는 D-아르기닌으로 치환한다.
적합하게는, 펩티드 리간드는 전술한 개질을 복수 개, 예컨대 하기의 개질 중 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 이상, 예컨대 하기의 5개 개질 모두를 포함할 수 있다: 1 위치에서 D-알라닌 및/또는 5 위치에서 D-알라닌, 4 위치에서 1-나프틸알라닌, 9 위치에서 4-브로모페닐알라닌, 및 11 위치에서 터트-부틸글라이신.
본원에 정의된 펩티드 서열 모두에 있어서, 하나 이상의 타이로신 잔기가 페닐알라닌에 의해 대체될 수 있다. 이는 펩티드를 스캐폴드 분자에 염기-촉매화 커플링시키는 동안에 바이사이클펩티드 생성물의 수율을 개선시키는 것으로 발견되었다.
적합하게는, 본 발명의 펩티드 리간드는 인간, 마우스 및 개 MT1-MMP 헤모펙신 도메인의 높은 친화력 결합제이다. 적합하게는 결합 친화도 ki가 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만 또는약 10 nM 미만이다.
적합하게는, 본 발명의 펩티드 리간드는 MT1-MMP에 대해 선택적이지만, MMP-1, MMP-2, MMP-15 및 MMP-16와 교차반응하지 않는다. 적합하게는 이들 리간드 각각과의 결합 친화력 ki는 약 500 nM 초과 , 약 1000 nM 초과, 또는 약 10000 nM 초과이다.
적합하게는, 상기 스캐폴드는 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지환족 모이어티를 포함한다. 적합하게는, 상기 스캐폴드는 트리스-치환된 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지환족 모이어티, 예를 들어 트리스-메틸렌 치환된 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지환족 모이어티를 포함한다. 상기 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지환족 모이어티는 적합하게는 6원 고리 구조이고, 바람직하게는 트리스-치환되어 스캐폴드가 3-폴드(3-fold) 대칭축을 갖도록 한다. 이에, 일부 바람직한 구현예에서는, 스캐폴드는 1,3,5-트리스-메틸벤젠이다. 다른 바람직한 구현예에서는, 스캐폴드는1,3,5-트리스-(아세트아미도)벤젠기인데, 이것은 펩티드를 1,3,5-트리스-(브로모아세트아미도)벤젠 (TBAB)에 커플링시켜서 유도될 수 있는 것으로, 이에 대해서는 아래에 더 기재되어있다.
제 2 양태에 따르면, 본 발명은, 본 발명의제 1 양태와 관련하여 상기 정의한바와 같은 화학식 II의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다. 적합하게는, 상기 펩티드는 적합한 스캐폴드 분자에 대한 연결부에 의해 본 발명에 따른 펩티드 리간드를 만드는데 적합하며, 이에 대해서는 아래에 기재되어 있다. 적합하게는, 상기 펩티드는 직쇄 펩티드이다.
추가의 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에 따른 펩티드 리간드의 제조 방법으로서, 본 발명의 제 2 양태에 따른 펩티드를 제공하는 단계; 시스테인 및 디아미노프로피온산 또는 β-N-알킬디아미노프로피온산 잔기의 측쇄 아미노기를 갖는 알킬아미노 연결부를 형성하기 위해 적어도 3개의 반응 자리를 갖는 스캐폴드 분자를 제공하는 단계; 및 상기 펩티드와 상기 스캐폴드 분자 사이의 상기 알킬아미노 연결부를 형성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 반응 자리는, 제 3 잔기가 시스테인인 구현예에 있어서, 시스테인의 -SH 기로 티오에테르 연결부를 형성하는데 적합하다. 시스테인의 -SH 기는 매우 친핵성이고, 본 구현예에서, 이는 먼저, 스캐폴드 분자의 친전자성 중심과 반응하여 펩티드를 스캐폴드 분자에 고정시킨 후, 아미노기가 상기 스캐폴드 분자의 나머지 친전자성 중심과 반응하여 루프형 펩티드 리간드를 형성하는 것으로 기대된다.
구현예에서, 펩티드는, 알킬아미노 연결부를 형성하려는 의도로 아미노기 및 -SH기 (존재할 경우) 이외에 친핵성 기상에 보호기를 갖는다.
적합하게는, 본 발명의 방법은, 3개 이상의 이탈기를 갖는 스캐폴드 분자와본원에서 정의한 바와 같은 펩티드를 친핵성 치환 반응으로 반응시키는 단계를 포함한다.
대안적 방법에서, 본 발명의 화합물은, 펩티드의 둘 이상의 측쇄기를 이탈기로 전환시키는 단계, 둘이상의 아미노기를 갖는 스캐폴드 분자와 펩티드를, 친핵성 치환 반응으로 반응시키는 단계로 만들어질 수 있다.
상기 친핵성 치환 반응은 예를 들어, 이탈기가 통상의 음이온성(anionic) 이탈기인 경우, 염기의 존재하에 수행될 수 있다. 본 발명자들은 사이클화된 펩티드 리간드의 수율은 친핵성 치환 반응을 위한 염기 및 용매를 적합하게 선택함으로써 매우 증가할 수 있다는 점 및 바람직한 용매 및 염기는 티오에테르 연결부의 형성에만 관여하는 종래 기술의 용매 및 염기 조합과는 상이하다는 점을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 트리알킬아민 염기, 즉, 화학식 NR1R2R3의 염기 (여기서, R1, R2및 R3는 독립적으로 C1-C5 알킬기, 적합하게는 C2-C4 알킬기, 특히 C2-C3 알킬기이다)를 사용할 경우, 수율이 개선된다는 것을 발견하였다. 특히 적합한 염기는 트리에틸아민 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)이다. 이들 염기는 오직 약한 친핵성만 가지고 있으며, 이러한 성질이 이 염기들을 사용했을때 관찰되는 더 적은 부반응 및 더 높은 수율을 설명한다고 생각된다. 또한, 본 발명자들은, 친핵성 치환 반응을 위한 바람직한 용매가 극성의 프로톤성(protic) 용매, 특히 MeCN/H2O (50:50)이라는 점을 발견하였다.
추가의 양태에서, 본 발명은 세포독성제 또는 금속 킬레이터(chelator)와 같은 주효 기 및/또는 관능기 하나 이상에 콘쥬게이트되어 있는 본 발명에 따른 펩티드 리간드를 포함하는 약물 콘쥬게이트를 제공한다.
적합하게는, 상기 콘쥬게이트는 절단가능한 결합(cleavable bond), 예컨대 디술파이드 결합에 의해 펩티드 리간드에 연결된 세포독성제를 갖는다. 적합하게는 상기 세포독성제는 DM1 또는 MMAE에서 선택된다.
구현예에서, 약물 콘쥬게이트는 하기의 구조를 갖는다:
Figure pat00007
상기식에서 R1, R2, R3및 R4는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 나타내고;
톡신은 임의 적합한 세포독성제를 나타내고;
바이사이클은 루프형 펩티드 구조를 나타내고;
n은 1 내지 10에서 선택되는 정수를 나타내고; 및
m은 0 내지 10에서 선택되는 정수를 나타낸다.
적합하게는, 다음 중 어느 것이다: R1, R2, R3및 R4 모두가 H이거나; 또는 R1, R2, R3 모두가 H이고 R4 = 메틸; 또는 R1, R2 = 메틸이고 R3, R4 = H이거나;또는 R1, R3 = 메틸 및 R2, R4 = H; 또는 R1, R2 = H 및 R3, R4 = C1-C6 알킬이다.
톡신과 바이사이클 펩티드 사이의 연결체는 아지드-관능화된 톡신과 알킨-관능화된 바이사이클 펩티드 구조 사이 (또는 그 반대)의 클릭 반응(click-reaction)에 의해 형성되는 트리아졸 기를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 바이사이클 펩티드는 카르복실레이트-관능화된 톡신과 바이사이클 펩티드의 N-말단 아미노기 사이의 반응에 의해 형성된 아미드 연결부를 포함할 수 있다.
톡신과 바이사이클 펩티드 사이의 연결체는 표적 세포 내에서 톡신의 선택적 방출을 제공하기 위한 카뎁신(cathepsin)-절단가능한 기를 포함할 수 있다. 적합한 카뎁신-절단가능한 기는 발린-시트룰린이다.
톡신과 바이사이클 펩티드 사이의 연결체는 목적하는 관능성, 예를 들어 콘쥬게이트에 결합 친화력 또는 카뎁신 절단성을 제공하기 위해 하나 이상의 스페이서 기를 포함할 수 있다. 적합한 스페이서 기는 발린-시트룰린 기와 톡신 모이어티 중간에 위치할 수 있는 파라-아미노 벤질 카르바메이트(PABC)이다.
따라서, 구현예에서, 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트는 톡신-PABC-cit-val-트리아졸-바이사이클로 구성되는 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure pat00008
추가의 구현예에서, 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트는 톡신-PABC-cit-val-디카르복실레이트-바이사이클로 구성되는 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure pat00009
여기에서, (Alk)는 화학식 CnH2n의 알킬렌기 (여기서 n은 1 내지 10이고, 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다)이고, 적합하게는 (Alk)는 n-프로필렌 또는 n-부틸렌이다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 리간드 또는 콘쥬게이트를 적어도 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
또다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 펩티드 리간드 또는 콘쥬게이트, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 리간드, 콘쥬게이트, 또는 조성물을 사용하여 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 적합하게는, 상기 질병은 종양성 질환, 예컨대 암이다.
추가의 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 리간드 또는 조성물을 사용한 질병의 진단을 포함하는 진단 방법을 제공한다. 따라서, 통상적으로, 펩티드 리간드에의 피분석물 결합을 이용하여 약제를 대체시키고, 이것이 이동 신호의 발생을 이끌어낼 수 있다. 예를 들어, 특히 만약 효소가 그의 활성 자리를 통해 펩티드 리간드에 잡혀져 있다면, 펩티드 리간드에 결합된 효소 (제1 표적)를 피분석물 (제2 표적)의 결합이 대체하여 결합 분석의 기초를 제공할 수 있다.
도 1은 종래 기술에 따른 티오에테르-연결된 바이사이클릭 펩티드 리간드의 제조를 위한 반응식을 도시한다.
도 2는 17-69-07-N241로 표기되는, 종래 기술에 따른 티오에테르-연결된 바이사이클릭 펩티드 리간드를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 첫번째 2급 아미노-연결된 바이사이클릭 펩티드 리간드를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 3급 N-메틸 아미노-연결된 바이사이클릭 펩티드 리간드를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 세번째 2급 아미노-연결된 바이사이클릭 펩티드 리간드를 나타낸다.
도 6은 TBAB 스캐폴드와 함께 고리화된, 본 발명에 따른 네번째 2급 아미노-연결된 바이사이클릭 펩티드 리간드를 나타낸다.
도 7은 도 3의 유도체를 위한, MT1-MMP에 대한 경쟁적 친화력 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 8은 도 4의 유도체를 위한, MT1-MMP에 대한 경쟁적 친화력 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 9는 본 발명에 따른 추가의 유도체를 위한, MT1-MMP에 대한 경쟁적 친화력 결합 분석 데이터를 도시한다.
도 10은 본 발명에 따른 특정의 바이사이클 펩티드-TBMB 유도체의 도식적 구조를 나타낸다.
도 11은 본 발명에 따른 추가의 바이사이클 펩티드-TBMB 유도체의 도식적 구조를 나타낸다.
도 12는 본 발명에 따른 추가의 바이사이클 펩티드-TBMB 유도체의 도식적 구조를 나타낸다.
도 13은 본 발명에 따른 추가의 바이사이클 펩티드-TBMB 유도체의 도식적 구조를 나타낸다.
도 14는 트리아졸 연결부를 형성하기 위한 클릭 반응에 의해 본 발명의 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트를 제조하는 반응식을 나타낸다.
도 15는 아미도 연결부를 가짐으로써 본 발명에 따른 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트를 제조하는 반응식을 나타낸다.
도 16은 HT1020 종양 세포 종양을 가진 Balb/c 누드 마우스를 본 발명에 따른 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트를 사용하여 치료한 이후의 시간에 따른 종양 부피 및 체질량을 도시한다.
도 17은 HT1020 종양 세포 종양을 가진 Balb/c 누드 마우스를 본 발명에 따른 추가 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트를 사용하여 치료한 이후의 시간에 따른 종양 부피 및 체질량을 도시한다.
도 18은 HT1020 종양 세포 종양을 가진 Balb/c 누드 마우스를 본 발명에 따른 추가 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트를 사용하여 치료한 이후의 시간에 따른 종양 부피 및 체질량을 도시한다.
도 19는 HT1020 종양 세포 종양을 가진 Balb/c 누드 마우스를 본 발명에 따른 추가 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트를 사용하여 치료한 이후의 시간에 따른 종양 부피 및 체질량을 도시한다.
도 20은 HT1020 종양 세포 종양을 가진 Balb/c 누드 마우스를 본 발명에 따른 추가 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트를 사용하여 치료한 이후의 시간에 따른 종양 부피 및 체질량을 도시한다.
달리 정의되어 있지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 당업계, 예컨대 펩티드 화학 업계, 세포 배양과 파지 디스플레이, 핵산 화학 업계 및 생화학 업계에서 통상의 기술을 가진 자가 공통적으로 이해하는 의미와 동일하다. 분자 생물학, 유전학 및 생화학적 방법을 위한 표준 기술이 사용되며 (참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.), 이들은 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명은 청구항 제1항에 정의한 바와 같은 루프형 펩티드 구조로서, 분자 스캐폴드 상의 3개 연결부 사이를 대하는 두 펩티드 루프를 포함하고, 중심 연결부가 상기 두 루프에게 공통인 구조를 제공한다. 상기 중심 연결부는 적합하게는 펩티드의 시스테인 잔기에 대해 형성된 티오에테르 연결부이거나, 또는 펩티드의 Dap 또는 N-AlkDap 잔기에 대해 형성된 알킬아미노 연결부이다. 두 개의 외부 연결부는 적합하게는 펩티드의 Dap 또는 N-AlkDap 잔기에 대해 형성된 알킬아미노 연결부이거나, 또는 외부 연결부 중 하나가 펩티드의 시스테인 잔기에 대해 형성된 티오에테르 연결부일 수 있다.
당업자라면, 화학식 II의 1, 3, 4, 10 및 11 위치의 X가, 알라닌 스캔 및 선택 결과에 따라 이들 위치에서 내성이 좋은(well-tolerated) 치환을 허용한다고 결과가 나온 임의 아미노산을 나타낼 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일 구현예에서, 화학식 II에서 1 위치의 X는 하기의 아미노산 중 임의 하나에서 선택된다: Y, M, F 또는 V. 추가의 구현예에서, 화학식 II에서 1 위치의 X는 Y, M 또는 F에서 선택된다. 또다른 추가의 구현예에서, 화학식 II에서 1 위치의 X는 Y 또는 M에서 선택된다. 또다른 추가의 구현예에서, 화학식 II에서 1 위치의 X는 Y에서 선택된다.
일 구현예에서, 화학식 II에서 2 위치의 U/O는 U, 예컨대 N에서 선택된다. 대안적 구현예에서, 화학식 II에서 2 위치의 U/O는 O, 예컨대 G에서 선택된다.
일 구현예에서, 화학식 II에서 3 위치의 X는 U 또는 Z에서 선택되고, 여기서 U는 N, C, Q, M, S 및 T 에서 선택되는 극성의 비하전된 아미노산 잔기를 나타내고 Z는 D 또는 B에서 선택되는 극성의 음으로 하전된 아미노산 잔기를 나타낸다. 추가의 구현예에서 화학식 II에서 3 위치의 U는 Q에서 선택된다. 대안적 구현예에서 화학식 II에서 3 위치의 Z는 E에서 선택된다.
일 구현예에서, 화학식 II에서 4 위치의 X는 J 에서 선택되고, J는 F, W 및 Y 에서 선택되는 비극성의 방향족 아미노산 잔기를 나타낸다. 추가의 구현예에서, 화학식 II에서 4 위치의 J는 F 에서 선택된다. 대안적 구현예에서, 화학식 II에서 4 위치의 J는 Y 에서 선택된다. 대안적 구현예에서, 화학식 II에서 4 위치의 J는 W 에서 선택된다.
일 구현예에서, 화학식 II에서 10 위치의 X는 Z 에서 선택되고, 여기서 Z는 D 또는 E 에서 선택되는 극성의 음으로 하전된 아미노산 잔기를 나타낸다. 일 구현예에서, 화학식 II 에서 10 위치의 Z는 D 에서 선택된다.
일 구현예에서, 화학식 II에서 11 위치의 X는 O 에서 선택되고, 여기서 O 는 G, A, I, L, P 및 V 에서 선택되는 비극성의 지방족 아미노산 잔기를 나타낸다. 일 구현예에서, 화학식 II 에서 11 위치의 O 는 I 에서 선택된다.
일 구현예에 따르면, 화학식 II의 화합물은 하기 화학식 IIa의 화합물이다:
[화학식 IIa]
Figure pat00010
화학식 IIa에서 U, O, J 및 Z는 앞서 정의한 바와 같다.
일 구현예에 따르면, 화학식 II의 화합물은 하기 화학식 IIb의 화합물이다:
[화학식 IIb]
Figure pat00011
일 구현예에 따르면, 화학식 II의 화합물은 하기 화학식 IIc의 화합물이다:
[화학식 IIc]
Figure pat00012
일 구현예에 따르면, 화학식 II의 화합물은 하기 화학식 IId의 화합물이다:
[화학식 IId]
Figure pat00013
일 구현예에 따르면, 화학식 II의 화합물은 하기 화학식 IIe의 화합물이다:
[화학식 IIe]
Figure pat00014
추가의 구현예에 따르면, 화학식 II의 펩티드는 하기에서 선택되는 서열을 포함한다:
Figure pat00015
본 구현예의 펩티드는 MT1-MMP 의 헤모펙신 도메인에 대한 친화력 성숙(affinity maturation)을 수반하는 강력한 후보물인 것으로 동정되었다.
또다른 추가의 구현예에 따르면, 화학식 II의 펩티드는 하기에서 선택되는 서열을 포함한다:
Figure pat00016
본 구현예의 펩티드는 경쟁 실험을 사용한 친화력의 정량적 측정, 코어 바이사이클 서열의 합성, 및 MT1-MMP의 헤모펙신 도메인에 대한 친화력 성숙을 수반하는 친화력이 가장 높은 후보물로 동정되었다.
또다른 추가의 구현예에 따르면, 화학식 II의 펩티드는
Figure pat00017
에서 선택되는 서열을 포함한다. 본 구현예의 펩티드는 화학식 II 범위 내의 펩티드 리간드 패밀리 중에서 가장 강력하고 안정적인 멤버인 것으로 동정되었다.
또다른 추가의 구현예에 따르면, 화학식 II의 펩티드는 각각 하기에서 선택되는 서열을 포함한다:
Figure pat00018
여기서, N 말단은 적합하게는 유리 아미노산으로서 존재하고, C 말단은 적합하게는 아미드화된다.
상기 서열 모두에서, A1, A2, 및 A3는 앞서 정의한 바와 같다. 적합하고 바람직한 A1, A2, 및 A3의 유형 및 위치는 앞서 정의한 바와 같다.
일 구현예에서, 화학식 II의 특정 펩티드는 쥣과 동물(murine), 개, 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 및 인간 MT1-MMP 와 완전히 교차 반응한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 특별히 예시화된 펩티드 리간드는 쥣과 동물, 개, 사이노몰구스 원숭이 및 인간 MT1-MMP 와 완전히 교차 반응한다. 예를 들어, 17-69-07 의 비안정화된 유도체 및 안정화된 유도체 모두 (즉, 17-69-07-N219, 17-69-07-N241 및 17-69-07-N268)가 완전 교차 반응성이다.
또다른 구현예에서, 화학식 II의 펩티드는 MT1-MMP에 대해 선택적이지만, MMP-1, MMP-2, MMP-15 및 MMP-16와 교차반응하지 않는다. 17-69-07 코어 서열, 및 17-69-07-N258 의 안정화된 변이체는 MT-MMP에 대해 특별히 선택적인데, 적합하게는 MT1-MMP 에 대한 결합 친화력 ki 이 약 100 nM 미만, 약 50nM 미만, 약 25nM 미만, 또는 약 10nM 미만이다.. 적합하게는, MMP-1, MMP-2, MMP-15 및 MMP-16 와의 결합 친화력 ki 은 약 500 nM 초과, 약 1000nM 초과, 또는 약 10000nM 초과이다.
본원에 정의한 바와 같은 펩티드 리간드의 개질된 유도체가 본 발명의 범위에 들어간다는 것을 인식할 것이다. 이러한 적합한 개질된 유도체의 예는 하기에서 선택되는 하나 이상의 개질을 포함한다: N-말단 및/또는 C-말단 개질; 하나 이상의 비자연적 아미노산 잔기로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체 (예컨대 하나 이상의 등배전자성 또는 등전자성 아미노산으로 하나 이상의 극성 아미노산 잔기를 대체; 기타 비자연적 등배전자성 또는 등전자성 아미노산으로 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 대체); 스페이서 기 의 추가; 하나 이상의 내산화성 아미노산 잔기로 하나 이상의 산화 감수성 아미노산 잔기를 대체; 알라닌으로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체; 하나 이상의 D-아미노산으로 하나 이상의 L-아미노산 잔기를 대체; 바이사이클릭 펩티드 리간드내의 하나 이상의 아미드 결합의 N-알킬화; 대리 결합으로 하나 이상의 펩티드 결합을 대체; 펩티드 주쇄 길이 개질; 다른 화학기로 하나 이상의 아미노산 잔기의α-탄소상의 수소를 치환; 적합한 아민,티올, 카르복실산 및 페놀-반응성 시약으로 시스테인, 라이신, 글루타메이트/아스파르테이트 및 타이로신과 같은 아미노산을 개질하여 상기 아미노산을 관능화하기, 및 관능화에 적합한 직교적 반응성을 도입하는 아미노산, 예를 들어, 각각 알킨 또는 아지드-포함 모이어티로의 관능화를 허용하는 아지드 또는 알킨-기 포함 아미노산의 도입 또는 대체.
일 구현예에서, 개질된 유도체는 아미노산 1 위치 및/또는 9 위치에서의 개질을 포함한다. 이들 위치, 특히 타이로신이 존재하는 경우의 이들 위치는 단백질 가수분해(proteolytic degradation)에 가장 민감하다.
일 구현예에서, 개질된 유도체는 N-말단 및/또는 C-말단 개질을 포함한다. 추가의 구현예에서, 개질된 유도체가 적합한 아미노-반응성 화학을 이용한 N-말단 개질 및/또는 적합한 카르복시-반응성 화학을 이용한 C-말단 개질을 포함한다. 추가의 구현예에서 N-말단 또는 C-말단 개질은 주효 기 (세포독성제, 방사성 킬레이터 또는 발색단을 포함하나 이것으로 한정되지는 않음)의 부가를 포함한다.
추가의 구현예에서, 개질된 유도체는 N-말단 개질을 포함한다. 추가의 구현예에서, N-말단 개질은 N-말단 아세틸 기를 포함한다. 본 구현예에서, N-말단 시스테인 기 (Ci 로 본원에서 칭해지는 기)는 펩티드 합성 동안에는 아세트산 무수물 또는 기타 적당한 시약으로 캡핑(capping)되어 N-말단 아세틸화된 분자를 이끌어낸다. 본 구현예는 아미노펩티다아제에 대한 잠재적인 인식 포인트를 제거하는 이점을 제공하며 바이사이클릭 펩티드의 분해 잠재성을 피하게 한다.
대안적 구현예에서, N-말단 개질은 주효 기의 콘쥬게이션 및 바이사이클릭 펩티드의 역가 유지를 용이하게 하여 주는 분자 스페이서 기를 표적체에 부가하는 것을 포함할 수 있다. 상기 스페이서 기는 적합하게는 약 5 내지 약 30개의 아미노산을 포함하는 올리고펩티드 기, 예컨대 Ala, G-Sar10-A 기 또는 bAla-Sar10-A 기이다. 일 구현예에서, 스페이서 기는 bAla-Sar10-A (즉, 17-69-07-N241)에서 선택된다. 바이사이클릭 펩티드 17-69-07 로의 상기 스페이서 기의 부가는 표적 단백질에 대한 역가를 변경시키지 않는다.
추가의 구현예에서, 개질화된 유도체는 C-말단 개질을 포함한다. 추가의 구현에에서 C-말단 개질은 아미드 기를 포함한다. 이 구현예에서, C-말단 시스테인 기 (본원에서 Ciii 로도 칭해지는 기)는, C-말단 아미드화된 분자를 만드는 펩티드 합성 동안에 아미드로서 합성된다. 본 구현예는 카르복시펩티다아제에 대한 잠재적 인식 포인트를 제거하는 이점을 제공하며, 바이사이클릭 펩티드의 단백질 가수분해 잠재성을 감소시켜준다.
일 구현예에서, 개질화된 유도체는 하나 이상의 비자연적 아미노산 잔기로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다. 이 구현예에서, 비자연적 아미노산은 분해성 프로테아제에 의해 인식되거나 표적 역가에 어떠한 악영향을 미치지 않는 등배전자/등전자성 측쇄를 갖는 것으로 선택될 수 있다.
대안적으로는, 구속성(contrained) 아미노산 측쇄를 갖는 비자연적 아미노산을 사용하여, 인근의 펩티드 결합의 단백질 가수분해가 형태적으로 및 입체구조적으로 방해되게 한다. 특히, 이는 프롤린 유사체, 벌키한(bulky) 측쇄, C-이치치환된(C-disubstituted) 유도체 (예를 들어, 아미노이소부티르산, Aib), 및 사이클로아미노산, 아미노-사이클로프로필카르복실산인 단순 유도체가 고려된다.
일 구현예에서, 비자연적 아미노산 잔기는 4 위치에서 치환된다. 다수의 비자연적 아미노산 잔기가 이 위치에서 내성이 좋다. 추가의 구현예에서, 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 4 위치에 존재하는 것은 하기로부터 선택된다: 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌; 사이클로헥실글라이신, 페닐글라이신; 터트-부틸글라이신; 3,4-디클로로페닐알라닌; 사이클로헥실알라닌; 및 호모페닐알라닌.
추가의 구현예에서, 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 4 위치에 존재하는 것들은 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌 및 3,4-디클로로페닐알라닌에서 선택된다. 상기 치환은 비개질된 야생형 서열에 비하여 친화력을 증강시킨다.
추가의 구현예에서, 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 4 위치에 존재하는 것은 1-나프틸알라닌에서 선택된다. 상기 치환은 야생형과 비교했을 때 가장 높은 수준의 친화력 증강 (7배 초과)을 제공한다.
일 구현예에서, 비자연적 아미노산 잔기는 9 위치 및/또는 11 위치에 도입된다. 다수의 비자연적 아미노산 잔기가 이 위치에서 내성이 좋다.
추가의 구현예에서, 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 9 위치에 존재하는 것은 4-브로모페닐알라닌, 펜타플루오로-페닐알라닌에서 선택되고, 예컨대 4-브로모페닐알라닌이다.
추가의 구현예에서, 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 11 위치에 존재하는 것은 터트-부틸글라이신에서 선택된다. 활성 증강 및 근접한 아미노산 주쇄를 단백질 가수분해로부터 강하게 보호하는 것이 입체 장애에 의해 달성된다.
일 구현예에서, 개질된 유도체는 전술한 개시을 복수 개, 예컨대 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 이상 포함한다. 추가의 구현예에서, 개질된 유도체는 하기의 개질을 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 이상, 예컨대 하기의 5개 개질 모두를 포함할 수 있다: 1 위치 및 5 위치에서 D-알라닌, 4 위치에서 1-나프틸알라닌, 9 위치에서 4-브로모페닐알라닌, 및 11 위치에서 터트-부틸글라이신. 이러한 다중 치환은 야생형에 비해 뛰어난 역가가 있을 뿐만 아니라 내성이 있다. 추가의 구현예에서, 개질된 유도체는 다음의 개질을 포함한다: 1 위치 및 5 위치에서 D-알라닌, 4 위치에서 1-나프틸알라닌, 및 11 위치에서 터트-부틸글라이신. 이러한 다중 치환은 야생형에 비해 뛰어난 역가가 있을 뿐만 아니라 내성이 있다.
일 구현예에서, 개질된 유도체는 스페이서 기의 부가를 포함한다.
일 구현예에서, 개질된 유도체는 하나 이상의 내산화성 아미노산 잔기로 하나 이상의 산화 감수성 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다. 추가의 구현예에서, 개질된 유도체는 나프틸알라닌 또는 알라닌 잔기로 트립토판 잔기를 대체하는 것을 포함한다. 이 구현예는 생성된 바이사이클릭 펩티드 리간드의 약학적 안정성 프로파일을 개선하는 이점을 제공한다.
일 구현예에서, 개질된 유도체는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기로 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다. 대안적 구현예에서, 개질된 유도체는 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기로 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다. 하전된 아미노산 잔기 대 소수성 아미노산 잔기의 올바른 균형은 바이사이클릭 펩티드 리간드의 중요한 특징이다. 예를 들어, 소수성 아미노산 잔기는 혈장 단백질 결합도, 및 이에 따른 혈장 내의 가용성(available) 유리 절편의 농도에 영향을 미치는 반면, 하전된 아미노산 잔기 (특히, 아르기닌)은 세포 표면 상의 포스포리피드 멤브레인과 펩티드의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 상기 둘의 조합은 펩티드 약물의 반감기, 분포와 노출의 양에 영향을 미칠 수 있고, 임상 종료점에 따라 조정될 수 있다. 또한, 하전된 아미노산 잔기 대 소수성 아미노산 잔기의 올바른 조합 및 수는 주사 자리 (펩티드 약물이 피하 투여될 경우)에서의 자극을 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, 개질된 유도체는 하나 이상의 D-아미노산 잔기로 하나 이상의 L-아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다. 이 구현예는 회전 배열(-turn conformation)을 안정화하려는 D-아미노산의 성향과 입체 장애에 의해 단백질 가수분해 안정성을 증가시키는 것으로 생각된다 (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).
본원에 정의된 펩티드 서열 모두에서, 하나 이상의 타이로신 잔기가 페닐알라닌에 의해 대체될 수 있다. 이는 펩티드를 스캐폴드 분자에 염기-촉매작용된 커플링하는 동안 바이사이클 펩티드 생성물의 수율을 개선시키는 것으로 발견되었다.
추가의 구현예에서, 1 위치의 아미노산 잔기는 D-아미노산, 예컨대 D-알라닌으로 치환된다. 이 치환은 그 결과에 따라 분해가 일어나지 않고도 역가를 유지한다.
추가의 구현예에서, 5 위치의 아미노산 잔기는 D-아미노산, 예컨대 D-알라닌 또는 D-아르기닌으로 치환된다. 이 치환든 그 결과에 따라 분해가 일어나지 않고도 역가를 유지한다.
일 구현예에서, 개질된 유도체는 임의 아미노산 잔기의 제거 및 알라닌으로의 치환을 포함한다. 이 구현예는 잠재적인 단백질 가수분해 공격 자리를 없애버리는 이점을 제공한다.
전술한 개질 각각이 펩티드의 역가 또는 안정성을 의도적으로 개선하는 작용을 한다는 것을 주목해야 한다. 또한, 개질에 기반한 역가의 개선은 다음의 메커니즘을 통해 달성될 수 있다:
- 소수성 효과를 활용하고 떨어지는 비율을 낮춰서 더 높은 친화력을 달성시키는 소수성 모이어티의 혼입;
- 긴 범위의 이온성 상호작용을 활용하여 속도를 더 빠르게 하고 친화력을 더 높이는 하전된 기의 혼입 (예를 들어, 참고: Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); 및
- 펩티드 내로 추가의 구속사항을 혼입시키는 것, 예를 들어, 아미노산의 측쇄를 올바르게 구속하는 것에 의해 표적 결합시 엔트로피 손실을 최소화, 주쇄의 비틀림 각을 구속하는 것에 의해 표적 결합시 엔트로피 손실을 최소화, 및 같은 이유로 분자에 추가의 사이클화를 도입
(검토를 위해 하기를 참고: Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, and Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).
본 발명은 본 발명의 모든 약학적으로 허용 가능한 (방사성)동위원소-라벨링된 화합물, 즉, 하나 이상의 원자가 동일한 원자 번호를 갖되 자연계에서 일반적으로 발견되는 원자 질량 또는 질량수와는 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 화학식 II의 화합물, 및 금속 킬레이팅 기가 관련 (방사성)동위원소를 보유할 수 있는 금속 킬레이팅 기가 부착된 ("주효체(effector)"로 칭해짐) 화학식 Il 의 화합물, 및 특정 관능기가 관련 (방사성)동위원소 또는 동위원소로 라벨링된 관능기로 공유결합적으로 대체된 화학식 l 의 화합물을 포함한다.
본 발명의 화합물에 포함되는데 적합한 동위원소의 예로는 수소의 동위원소, 예컨대 2H (D) 및 3H (T), 탄소의 동위원소, 예컨대 11C, 13C 및 14C, 염소의 동위 원소, 예컨대 36Cl, 불소의 동위원소, 예컨대 18F, 요오드의 동위원소, 예컨대 123I, 125I 및 131I, 질소의 동위원소, 예컨대 13N 및 15N, 산소의 동위원소, 예컨대 15O, 17O 및 18O, 인의 동위원소, 예컨대 32P, 황의 동위원소, 예컨대 35S, 구리의 동위원소, 예컨대 64Cu, 갈륨의 동위원소, 예컨대 67Ga 또는 68Ga, 이트륨의 동위원소, 예컨대 90Y 및 루테튬의 동위원소, 예컨대 177Lu, 및 비스무트의 동위원소, 예컨대 213Bi를 포함한다.
화학식 II의 특정한 동위원소-라벨링된 화합물, 예를 들어, 방사성 동위원소가 혼입된 것은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용하고, 종양과 같이 질환이 있는 조직에 MT1-MMP 표적이 존재하는지 및/또는 부재하는지 및 어디에 있는지를 임상적으로 평가하는데 유용하다. 또한, 화학식 II의 화합물은 라벨링된 화합물과 다른 분자, 펩티드, 단백질, 효소 또는 수용체 간에 복합체가 형성되었는지를 검출하거나 동정하는데 사용될 수 있다는 점에서 가치있는 진단 특성을 가질 수 있다. 검출 또는 진단 방법은 방사성 동위원소, 효소, 형광(fluorescent) 물질, 발광(luminous) 물질 (예를 들어, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 에쿼린, 및 루시페라아제) 등과 같은 라벨링제로 라벨링된 화합물을 사용할 수 있다. 방사성 동위원소, 트리튬, 즉, 3H (T), 및 탄소-14, 즉, 14C 가, 혼입이 용이하고 즉시 이용가능한 검출 수단이라는 측면에서, 상기 목적에 특히 유용하다.
더 무거운 동위원소, 예컨대 듀테륨, 즉, 2H (D)는 더 큰 대사 안정성으로 인해 발생하는 특정한 치료적 이점, 예를 들어, 생체내 반감기 증가 또는 투약 요건 감소를 제공할 수 있으므로, 일부 상황에서는 선호될 수 있다.
동위원소, 예컨대 11C, 18F, 15O 및 13N 가 방출하는 양전자로의 치환은 표적물 점유를 검사하기 위한 양전자 방출 토포그래피 (Position Emission Topography (PET)) 연구에 유용할 수 있다.
64Cu, 67Ga, 68Ga, 및 177Lu 와 같은 동위원소를 금속 킬레이팅 주효 기에 혼입시키는 것은, PET 또는 SPECT 이미징을 이용하여 종양 특이적 항원을 시각화하는데 유용할 수 있다.
90Y, 177Lu, 및 213Bi와 같은, 그러나 이에 한정되지는 않는 동위원소를 금속 킬레이팅 주효 기에 혼입시키는 것은, 표적 방사선 치료법의 옵션을 제공할 수 있으며, 여기서, 금속-킬레이터를 포함하는 화학식 II의 화합물은 표적 단백질과 활성 자리에 대한 치료적 방사성 핵종을 운반한다.
통상적으로, 동위원소로 라벨링된 화학식 II의 화합물은 당업자에게 공지된 통상적 기법으로 또는 이전에 이용했던 라벨링되지 않은 시약을 대신하여 적당히 동위원소로 라벨링된 시약을 이용하는 후속하는 실시예에 기재된 것과 유사한 방법으로 제조할 수 있다.
본원의 문맥에서, 특이성(specificity)이란, 표적과 유사한 실체는 배제하고 그의 동족 표적에 결합하거나 상호작용하기 위한 리간드의 능력을 가리킨다. 예를 들어, 특이성은, 인간 효소의 상호작용을 저해하되, 다른 종에서 유래한 상동성 효소는 저해하지 않는 리간드의 능력을 가리킬 수 있다. 본원에 기재된 접근법을 사용하면, 특이성이 증가 또는 감소되도록 조절하여, 리간드가 의도한 표적의 동족체 또는 파라로그(paraloques)와 보다 더 또는 보다 덜 상호작용하도록 만들 수 있다. 특이성은 활성, 친화력 또는 결합활성(avidity)과 동의어가 아니며, 표적에 대한 리간드의 작용의 역가 (예를 들어, 결합 친화력 또는 저해 수준)가 반드시 그의 특이성과 관련되지는 않는다.
본원에서 사용되는 결합 활성이란, 결합 분석법, 예를 들어 본원에 기재된 분석법에 따른 정량적 결합 측정치를 가리킨다. 따라서, 결합 활성은 소정의 표적 농도에서 결합되는 펩티드 리간드의 양을 가리킨다.
다중특이성은 둘 이상의 표적에 결합하는 능력이다. 통상적으로 결합 펩티드는, 그의 형태적 특성으로 인하여 단일 표적, 예컨대 항체의 경우에는 에피토프에 결합할 수 있다. 그러나, 둘 이상의 표적에 결합할 수 있는 펩티드, 예를 들어 전술한 바와 같이 당업게에 공지된 이중 특이적 항체가 개발될 수 있다. 본 발명에서, 펩티드 리간드는 둘 이상의 표적에 결합할 수 있고, 이에 다중 특이적이다. 적합하게는, 펩티드 리간드는 두 개의 표적에 결합하는, 이중 특이적이다. 결합은 독립적일 수 있는데, 펩티드 상의 표적을 위한 결합 자리가 표적 중 하나 또는 다른 것의 결합에 의해 구조적으로 장해를 받지 않는다는 것을 의미할 것이다. 이 경우, 두 표적은 독립적으로 결합할 수 있다. 보다 통상적으로는, 하나의 표적의 결합이 다른 것의 결합을 적어도 부분적으로 방해할 것으로 기대된다.
이중 특이성 리간드와, 두 개의 관련된 표적을 포함하는 특이성이 있는 리간드 사이에는 기본적인 차이가 있다. 첫번째의 경우, 리간드는 두 표적에 대해 개별적으로 특이성이 있고, 각각의 표적과 함께 특이적 방식으로 상호작용한다. 예를 들어, 리간드 내의 제1 루프는 제1 표적에 결합하고 제2 루프는 제2 표적에 결합할 수 있다. 두번째의 경우, 리간드는 예를 들어 표적의 둘 모두에 공통된 에피토프와 상호작용함으로써, 두 표적 사이를 구별하지 않기 때문에 비-특이적이다.
본 발명의 문맥에서, 예를 들어 표적과 오르토로그(orthologue)에 대해 활성을 갖는 리간드가 이중특이성(bispecific) 리간드일 수 가능성이 있다. 그러나, 일 구현예에서는, 리간드는 이중특이성이 아니고, 다만, 덜 정확한 특이성을 가져서, 표적과 하나 이상의 오르토로그 모두와 결합한다. 통상적으로, 표적과 그의 오르토로그 모두에 대해 선택되지 않은 리간드는 이중특이성에 대한 선택 압력이 없기 때문에, 이중특이성이 될 가능성이 적다. 바이사이클릭 펩티드에서 루프 길이는, 덜 관련성 있는 동족체에 대해서는 높은 선택성을 유지하면서도, 우수한 표적 및 오르토로그 교체-반응성을 수득할 수 있도록 조정된 결합 표면을 제공하는데 결정적일 수 있다.
리간드가 진성으로 이중특이성일 경우, 일 구현예에 따르면, 리간드의 표적 특이성 중 적어도 하나가, 선택된 리간드 사이에서 공통적일 것이며, 그 특이성의 수준은 본원에 개시된 방법에 의해 조절될 수 있다. 제2 또는 추가의 특이성은 공유될 필요가 없으며 본원에 설명한 절차의 주제가 될 필요가 없다.
분자 스캐폴드는 다중 지점에서 펩티드를 연결할 수 있어서 펩티드에 하나 이상의 구조적 특징을 부여할 수 있는 임의 분자이다. 바람직하게는, 분자 스캐폴드는, 스캐폴드 반응성 기라고 칭해지는, 펩티드를 위한 적어도 3개의 부착 지점을 포함한다. 이들 기는 펩티드 상의 Dap 또는 N-AlkDap 또는 시스테인 (존재할 경우) 잔기와 함께 반응하여 안정한 공유(covalent) 알킬아미노 및 티오에테르 연결부를 형성할 수 있다. 분자 스캐폴드를 위한 바람직한 구조는 아래에 기재한다.
본 발명의 화합물은 분자 스캐폴드에 공유 결합된 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다. 본원에서 용어 "스캐폴드" 또는 "분자 스캐폴드"는 본 발명의 화합물에서 알킬아미노 연결부 및 티오에테르 연결부 (3번째 잔기가 시스테인인 경우)에서 펩티드에 결합되는 화학적 모이어티를 가리킨다. 본원에서 용어 "스캐폴드 분자" 또는 "분자성 스캐폴드 분자"는, 알킬아미노 및, 특정 구현예에 있어서는, 또한 티오에테르 결합을 갖는 본 발명의 유도체를 형성하기 위해 펩티드 또는 펩티드 리간드와 함께 반응할 수 있는 분자를 가리킨다. 따라서, 스캐폴드 분자는, 분자의 각 반응성 기 (예컨대 이탈기)가 스캐폴드 모이어티에서 펩티드에 대한 알킬아미노 및 티오에테르 결합으로 대체되었다는 점을 제외하고는, 스캐폴드 모이어티와 동일한 구조를 갖는다.
분자성 스캐폴드 분자는 다중 지점에서 펩티드를 연결할 수 있어서 펩티드에 티오에테르 및 알킬아미노 결합을 형성하는 임의 분자이다. 이는 일반적으로는 2개의 펩티드를 연결하지 않는다는 점에서 교차-연결체는 아니나; 그 대신에, 단일(single) 펩티드를 위한 둘 이상의 부착 지점을 제공한다. 분자성 스캐폴드 분자는, 스캐폴드 반응성 기로 칭해지는, 펩티드를 위한 적어도 3개의 부착 지점을 포함한다. 이들 기는 펩티드 상의 -SH 및 아미노 기와 함께 반응하여 티오에테르 및 알킬아미노 연결부를 형성할 수 있다. 이에, 분자성 스캐폴드는 본 발명의 콘쥬게이트에서 티오에테르 및 알킬아미노 연결부를 포함하지 않는 스캐폴드 모이어티를 나타낸다. 스캐폴드 분자는 스캐폴드 구조를 가졌으나, 본 발명의 콘쥬게이트에서 티오에테르 및 알킬아미노 결합의 위치에 반응성 기를 갖는 것이다.
적합하게는, 스캐폴드는 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지환족 모이어티를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다.
본원에서 사용하는 "(헤테로)아릴"은 방향족 고리, 예를 들어 4 내지 12 원의 방향족 고리, 예컨대 페닐 고리를 포함한다. 이들 방향족 고리는 하나 이상의 헤테로 원자(예를 들어, 하나 이상의 N, O, S, 및 P)를 임의로 포함할 수 있고, 예컨대 티에닐 고리, 피리딜 고리, 및 푸라닐 고리가 있다. 방향족 고리는 임의 치환될 수 있다. "(헤테로)아릴"은 또한, 하나 이상의 다른 아릴 고리 또는 비(非)아릴 고리와 융합된 방향족 고리를 포함한다. 예를 들어, 나프틸 기, 인돌 기, 티에노티에닐 기, 디티에노티에닐, 및 5,6,7,8-테트라히드로-2-나프틸 기 (이들 각각은 임의 치환될 수 있음)는 본 발명의 목적을 위한 아릴 기이다. 앞서 언급한 바와 같이, 아릴 고리는 임의 치환될 수 있다. 적합한 치환체로는 알킬 기 (이는 임의 치환될 수 있음), 다른 아릴 기 (이는 치환될 수 있음), 헤테로사이클릭 고리 (포화 또는 불포화), 알콕시 기 (아릴옥시기를 포함함 (예를 들어, 페녹시기)), 하이드록시기, 알데히드 기, 니트로기, 아민기 (예를 들어, 비치환된, 또는 아릴 또는 알킬기로 일(mono)- 또는 이(di)-치환된 것), 카르복실산 기, 카르복실산 유도체 (예를 들어, 카르복실산 에스테르, 아미드 등), 할로겐 원자 (예를 들어, Cl, Br, 및 I) 등이 포함된다.
본원에서 사용된 "(헤테로)지환족"은 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 포화 고리를 가리킨다. 상기 고리는 치환되지 않을 수 있거나 또는 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다. 치환체는 포화 또는 불포화일 수 있고, 방향족 또는 비방향족일 수 있으며, 적합한 치환체의 예로는 알킬 및 아릴 기 상의 치환체와 관련하여 앞서 언급한 것들이 포함된다. 또한, 둘 이상의 고리 치환체가 결합하여 다른 고리를 형성할 수 있으므고, 본원에서 사용된 "고리"란 융합된 고리계도 포함한다.
적합하게는, 스캐폴드는 트리스-치화된 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지환족 모이어티, 예를 들어 트리스-메틸렌 치환된 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)방향족 모이어티를 포함한다. 상기 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지환족 모이어티는 적합하게는 6원 고리 구조이고, 바람직하게는 트리스 치환되어 스캐폴드가 3-폴드 대칭 축을 갖도록 한다.
구현예에서, 스캐폴드는 트리스-메틸렌(헤테로)아릴 모이어티, 예를 들어, 1,3,5-트리스메틸렌벤젠 모이어티이다. 이 구현예에서, 대응하는 스캐폴드 분자는 적합하게는 메틸렌 탄소에 이탈기를 갖는다. 그리고, 상기 메틸렌 기는 본원에서 정의한 바와 같은 알킬아미노 연결부의 R1 모이어티를 형성한다. 상기 메틸렌-치환된 (헤테로)방향족 화합물에서, 방향족 고리의 전자가 친핵성 치환 동안에 전이 상태를 안정화시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 벤질 할라이드는 (헤테로)방향족 기에 연결되지 않은 알킬 할라이드에 비하여, 친핵성 치환에 대하여 100배 내지는 1000배 더 반응성이 있다.
본 구현예에서, 스캐폴드 및 스캐폴드 분자는 하기의 일반식을 갖는다:
Figure pat00019
상기 식에서 LG는 이탈기를 나타내는데 이는 스캐폴드 분자에 대해 하기에서 더 기재한 바와 같으며, 또는 LG (알킬아미노기의 R1 모이어티를 형성하는 인접 메틸렌기를 포함)는 본 발명의 콘쥬게이트 내의 펩티드에 대한 알킬아미노 연결부를 나타낸다.
구현예에서, 상기 LG 기는 할로겐, 예컨대 브롬 원자일 수 있으나, 이것으로 한정되지는 않으며, 이 경우, 스캐폴드 분자는 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠 (TBMB)이다. 다른 적합한 스캐폴드 분자는 2,4,6-트리스(브로모메틸)메시틸렌이다. 이는 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠과 유사하지만, 벤젠 고리에 3개의 메틸기가 추가로 부착되어 있다. 이 스캐폴드의 경우, 추가의 메틸기는 펩티드와의 추가 접촉부를 형성할 수 있으므로, 추가의 구조적 통제를 부가한다. 이에, 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠을 사용했을 때에 비해서 상이한 다양성 범위가 달성된다.
친핵성 치환에 의한 펩티드와의 반응용 스캐폴드를 형성하는 다른 바람직한 분자는 1,3,5-트리스(브로모아세트아미도)벤젠 (TBAB)이다:
Figure pat00020
다른 구현예에서, 분자 스캐폴드는 4면체 기하학적 구조를 가질 수 있어서, 분자 스캐폴드와 코딩된 펩티드의 4개 관능기의 반응으로 둘 이하의 생성물 이성질체를 생성한다. 기타 기하학적 구조도 가능하고; 실제로 거의 무한한 수의 스캐폴드 기하학적 구조가 가능하므로, 이것이 펩티드 리간드 다양화에 대한 보다 큰 가능성을 이끌어낸다.
본 발명의 리간드를 형성하는데 사용되는 펩티드는, 스캐폴드에 대한 알킬아미노 연결부를 형성하기 위한 Dap 또는 N-AlkDap 또는 N-HAlkDap 잔기를 포함한다. 디아미노프로피온산의 구조가, -NH2으로 시스테인의 말단 -SH 기를 대체한, 종래 기술의 스캐폴드에서 스캐폴드에 대한 티오에테르 결합을 형성하는데 사용되었던 시스테인과 유사하고, 그 시스테인의 등배전자 구조이다:
Figure pat00021
용어 "알킬아미노"는 통상적인 화학적 개념으로 본원에 사용되며, 2개의 탄호 원자에 연결된 N(R3) 또는 NH로 이루어진 연결부로서, 여기서 상기 탄소 원자가 독립적으로 알킬, 알킬렌, 또는 아릴 탄소 원자에서 선택되고 R3 이 알킬기인 연결부를 가리킨다. 적합하게는, 본 발명의 알킬아미노 연결부는 2개의 포화 탄소 원자, 가장 적합하게는 메틸렌 (-CH2-) 탄소 원자에 연결된 NH 모이어티를 포함한다. 본 발명의 알킬아미노 연결부는 하기의 일반식을 갖는다:
S-R1-N(R3)-R2-P
상기 일반식에서,
S는 스캐폴드 코어, 예를 들어 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지환족 고리를 나타내며, 이에 대해서는 하기에 더 설명되어 있고;
R1은 C1 내지 C3의 알킬렌기, 적합하게는 메틸렌 또는 에틸렌기, 가장 적합하게는 메틸렌 (CH2)이고;
R2는 Dap 또는 N-AlkDap 측쇄의 메틸렌기이고;
R3은 분지쇄 알킬 및 사이클로 알킬을 포함하는 C1-4 알킬, 예를 들어 메틸 또는 H 이고;
P는 펩티드 주쇄를 나타내는데, 즉, 상기 연결부의 R2 모이어티가 Dap 또는 N-AlkDap 잔기의 카르복실 탄소에 인접한 펩티드 주쇄 내의 탄소 원자에 연결되어 있다.
화학식 II의 특정 바이사이클릭 펩티드는, 주사 투여, 흡입 투여, 비강 투여, 안 투여, 경구 투여 또는 국소 투여를 위한 적합한 약물형 분자로서 고려될 수 있게 하는 다수의 유리한 특성을 갖는다. 상기 유리한 특성은 다음을 포함한다:
- 종 교체-반응성. 이는 임상전 약력학 및 약동학 평가를 위한 통상의 요건이다.
- 프로테아제 안정성. 바이사이클릭 펩티드 리간드는 혈장 프로테아제, 상피 ("멤브레인-앵커드(anchored)") 프로테아제, 위장관 프로테아제, 폐 표면 프로테아제, 세포내 프로테아제 등에 대한 안정성을 이상적으로 나타내어야 한다. 바이사이클 리드 후보물질이 동물 모델에서 개발될 수 있을 뿐만 아니라 인간에게도 안심하고 투여될 수 있도록, 프로테아제 안정성은 상이한 종 사이에서 유지되어야 한다.
- 바람직한 용해도 프로파일. 이는 하전된 친수성 잔기 대 소수성 잔기의 비율 및 분자내/분자간 H-결합의 함수이고, 이는 제형화 및 흡수 목적에 중요하다.
- 순환에 있어서 최적의 혈장 반감기. 임상적 지시 및 치료 요법에 따라서는, 급성의 질병 관리 상황에서 짧은 노출을 위해 바이사이클릭 펩티드를 개발하거나 또는 순환계에서의 체류가 증가되어 보다 만성적인 질환 상태의 관리에 최적인 바이사이클릭 펩티드를 개발하도록 요구될 수 있다. 바람직한 혈장 반감기를 추진하는 다른 인자는, 최대의 치료 효율을 위한 지속적인 노출 대 약제의 지속 노출로 인해 수반되는 독성에 대한 요건이다.
염 형태가 본 발명의 범위에 들어간다는 것을 인식할 것이며, 화학식 II의 바이사이클릭 펩티드 화합물에 대한 참조는 상기 화합물의 염 형태를 포함한다.
본 발명의 염은 [Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (편집자), Camille G. Wermuth (편집자), ISBN: 3-90639-026-8, 하드커버, 388 페이지, August 2002] 에 기재된 방법과 같은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 포함하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 통상적으로는, 상기 염은 수 중에서 또는 유기 용매 중에서 또는 이들 둘의 혼합물 중에서 적당한 염기 또는 산과 상기 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
산 부가 염 (일(mono)- 또는 이(di)-염)은 무기 산 및 유기 산을 비롯한 폭넓게 다양한 산을 사용하여 형성될 수 있다. 산 부가 염의 예는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 산을 사용하여 형성된 일-또는 이-염을 포함한다: 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산 (예를 들어, L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포어(camphor)-술폰산, (+)-(1S)-캄포어-10-술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 시클람산, 도데실-황산, 에탄-1,2-디술폰산, 에탄술폰산, 2-하이드록시에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 젠티스산, 글루코헵탄산, D-글루콘산, 글루코론산 (예를 들어, D-글루코론산), 글루탐산 (예를 들어, L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글라이콜산, 히푸르산, 할로겐화산 (예를 들어, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산), 이세티온산, 락트산 (예를 들어, (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산, (-)-L-말간, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, 나프탈렌-1,5-디술폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 파모인산, 인산, 프로피온산, 피루브산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 황산, 탄닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔술폰산, 운데실렌산 및 발레르산 뿐만 아니라, 아실화된 아미노산 및 양이온 교환 수지.
염의 일 특정 그룹은, 아세트산, 염산, 요오드화수소산, 인산, 질산, 황산, 시트르산, 락트산, 숙신산, 말레산, 말산, 이세티온산, 푸마르산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 황산, 메탄술폰산 (메실레이트), 에탄술폰산, 나프탈렌술폰산, 발레르산, 프로판산, 부탄산, 말론산, 글루쿠론산 및 락토비온산으로부터 형성되는 염으로 이루어진다. 일 특정 염은 염산염이다. 다른 특정 염은 아세테이트 염이다.
화합물이 음이온성일 경우 또는 음이온성일 수 있는 관능기 (예를 들어, -COOH는 -COO- 일 수 있음)를 가질 경우, 염은, 적합한 양이온을 발생시키는 유기 또는 무기 염기를 사용하여 형성될 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예로는 알칼리 금속 이온, 예컨대 Li+, Na+ 및 K+, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 Ca2+ 및 Mg2+, 및 기타 양이온, 예컨대 Al3+ 또는 Zn+ 이 포함되나, 이것들로 한정되지는 않는다. 적합한 유기 양이온의 예로는 암모늄 이온 (즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온 (예를 들어, NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)이 포함되나, 이것들로 한정되지는 않는다. 몇몇 적합한 치환된 암모늄 이온의 예로는 하기로부터 유래된 것들이 있다: 메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민, 및 트로메타민 뿐만 아니라, 아미노산, 예컨대 라이신 및 아르기닌. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 + 이다.
화학식 II의 화합물이 아민 관능부를 포함할 경우, 이들은 예를 들어 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법에 따라 알킬화제를 사용한 반응에 의하여, 4급 암모늄 염을 형성할 수 있다. 이러한 4급 암모늄 화합물도 화학식 II의 범위 내에 들어간다.
몇몇 콘쥬게이트화된 펩티드는 본 발명에 따른 동일한 분자 내로 함께 혼입될 수 있다. 예를 들어, 동일한 특이성의 두 펩티드 콘쥬게이트를, 분자 스캐폴드를 경유하여 함께 연결시켜서 표적에 대한 유도체의 결합활성을 증가시킬 수 있다. 대안적으로는, 기타 구현에에서, 복수개의 펩티드 콘쥬게이트를 조합하여 다합체를 형성시킨다. 예를 들어, 두 개의 상이한 펩티드 콘쥬게이트를 조합하여 다중 특이성 분자를 만든다. 대안적으로는, 동일하거나 상이할 수 있는 셋 이상의 펩티드 콘쥬게이트를 조합하여 다중 특이성 유도체를 형성할 수 있다. 일 구현예에서, 동일 또는 상이할 수 있는 분자 스캐폴드를 함께 연결시킴으로써 다가 복합체를 구성할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 리간드의 제조 방법으로서, 본 발명에 따른 펩티드 및 스캐폴드 분자를 제공하는 단계; 및 펩티드와 스캐폴드 분자 사이에 티오에테르 (세번째 잔기가 시스테인인 경우) 및 알킬아미노 연결부를 형성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
스캐폴드 분자 및 펩티드에 관한 상세한 사항은 적합하게는 본 발명의 제1 양태와 관련하여 앞서 기재한 바와 같다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 펩티드는 아미노산 출발 물질로부터 통상적인 고체상 합성을 이용하여 제조할 수 있으며, 이는 본원에 기재한 바와 같은 적당한 보호 기를 포함할 수 있다. 펩티드를 제조하기 위한 이러한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
적합하게는, 펩티드는 알킬아미노 연결부를 형성하려는 의도의 아민 기 및 -SH 기에 추가하여 친핵성 기 상의 보호 기를 갖는다. 아미노산 측쇄의 친핵성은 몇몇 연구의 주제였으며 이를 내림 차순으로 열거한다: 시스테인에서 티올레이트, 라이신에서 아민, 히스티딘 및 트립토란에서 2급 아민, 아르기닌에서 구아니디노 아민, 세린/트레오닌에서 하이드록실 및 마지막으로 아스파르테이트 및 글루타메이트에서 카르복실레이트. 이에 따라, 일부 경우에는 이들 기와의 목적하지 않는 부반응을 방지하기 위하여 펩티드 상에서 더 친핵성인 기에 보호 기를 적용하는 것이 필수적일 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 방법은 하기를 포함한다: 알킬아미노 연결부를 형성하려는 의도의 아민 기에 추가하여 친핵성 기 상에 보호기를 갖고 알킬아미노 연결부를 형성하려는 의도의 아민기 상에 제2 보호기를 갖는 펩티드 (여기서, 알킬아미노 연결부를 형성하려는 의도의 아민기 상의 보호 기는 상기 다른 친핵성 기 상의 보호기와는 상이한 조건 하에서 제거될 수 있음)를 합성하고, 그 후, 상기 다른 친핵성 기를 탈보호하지 않고 알킬아미노 연결부를 형성하려는 의도의 아민 기를 탈보호하기 위해 선택된 조건 하에서 펩티드를 처리함. 그 후, 스캐폴드에 대한 커플링 반응을 실시한 후, 잔존하는 보호 기를 제거하여 펩티드 콘쥬게이트를 얻는다.
적합하게는, 본 발명의 방법은, 친핵성 치환 반응에서 반응성 측쇄 -SH 및 아민 기를 갖는 펩티드를 셋 이상의 이탈기를 갖는 스캐폴드 분자와 함께 반응시키는 것을 포함한다.
본원에서 용어 "이탈기"는 통상의 화학적 의미로 사용되어, 아민기에 의해 친핵성 이동을 할 수 있는 모이어티를 의미한다. 이러한 임의 이탈기가 본원에서 사용될 수 있으며, 단, 아민에 의한 친핵성 이동에 의해 쉽게 제거되는 것이다. 적합한 이탈기는 pKa 가 약 5 미만인 산의 콘쥬게이트 염기이다. 본 발명에 유용한 이탈기의 비제한적 예로는 할로, 예컨대 브로모, 클로로, 요오도, O-토실레이트 (OTos), O-메실레이트 (OMes), O-트리플레이트 (OTf) 또는 O-트리메틸실릴 (OTMS)를 포함한다.
친핵성 치환 반응은, 예를 들어 이탈기가 통상의 음이온성 이탈기일 경우, 염기의 존재 하에 수행될 수 있다. 본 발명자들은 사이클화된 펩티드 리간드의 수율이 친핵성 치환 반응을 위한 염기와 용매 (및 pH)의 적합한 선택에 의해 크게 증가될 수 있었다는 점 및 바람직한 용매와 염기는 오직 티오에테르 연결부의 형성에만 관여하는 종래 기술의 용매와 염기 조합과는 상이하다는 점을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 트리알킬아민 염기, 즉, 화학식 NR1R2R3 (여기서 R1, R2 및 R3은 독립적으로 C1-C5 알킬 기, 적합하게는 C2-C4 알킬 기, 특히 C2-C3 알킬기이다)의 염기를 사용할 때 수율이 개선된다는 것을 발견하였다. 특히 적합한 염기는 트리에틸아민 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA)이다. 이들 염기는 오직 약하게만 친핵성인 성질을 가지며, 상기 성질은 더 적은 부반응 및 이들 염기를 사용했을 때 관찰되는 더 높은 수율을 설명하는 것으로 이해된다. 본 발명자들은, 친핵성 치환 반응에 대한 바람직한 용매는 극성 및 프로톤성의 용매, 특히 1:10 내지 10:1, 적합하게는 2:10 내지 10:2, 더욱 적합하게는 3:10 내지 10:3, 특히 4:10 내지 10:4의 부피비로 MeCN 및 H2O를 포함하는 MeCN/H2O 이라는 것을 더 발견하였다.
추가의 결합 활성 또는 관능 활성은 분자 스캐폴드에 공유 연결된 펩티드의 N 또는 C 말단에 부착될 수 있다. 상기 관능기는, 예를 들어 하기로 구성되는 그룹에서 선택된다: 펩티드 리간드의 생체내 반감기를 연장시키는 분자에 결합할 수 있는 기 및 펩티드 리간드의 생체내 반감기를 연장시키는 분자. 상기 분자는 예를 들어, HSA 또는 세포 매트릭스 단백질일 수 있고, 펩티드 리간드의 생체 내 반감기를 연장시키는 분자에 결합할 수 있는 기는 HSA 또는 세포 매트릭스 단백질에 특이성이 있는 항체 또는 항체 절편이다. 또한, 상기 분자는 분자량이 높은 PEG와의 콘쥬게이트일 수도 있다.
일 구현예에서, 관능기는, 분자 스캐폴드에 공유 연결된 펩티드를 포함하는 제2 펩티드 리간드 및 항체 또는 항체 절편으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 결합 분자이다. 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 펩티드 리간드가 함께 할 수 있다. 임의의 둘 이상의 상기 유도체의 특이성은 동일하거나 상이할 수 있고; 만약 동일한 경우에는 다가 결합 구조가 형성되어, 일가 결합 분자에 비하여 표적에 대한 결합 활성이 증가된 것이다. 또한, 분자 스캐폴드는 상이하거나 동일할 수 있으며, 동일 또는 상이한 수의 루프를 대할 수 있다.
또한, 관능기는 주효 기, 예를 들어, 항체 및 Fc 영역일 수 있다.
N 또는 C 말단에 대한 부착은 분자 스캐폴드에 대한 펩티드의 부착 이 전에 또는 이후에 행해질 수 있다. 이에, 펩티드는 N 또는 C 말단 펩티드기를 이미 위치시켜서 제조될 수 있다 (합성적으로 또는 생물학적으로 유도된 발현 시스템에 의해). 그러나, 바람직하게는 N 또는 C 말단에 대한 부가는 펩티드가 분자 주쇄와 함께 조합되어 콘쥬게이트를 형성한 이후에 발생한다. 예를 들어, 플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로라이드를 사용하여 펩티드의 N-말단에서 Fmoc 보호기를 도입시킬 수 있다. Fmoc 는 높은 친화력으로 HSA를 포함한 혈청 알부민에 결합하고, Fmoc-Trp 또는 Fmoc-Lys 는 증가된 친화력으로 결합한다. 펩티드는 Fmoc 보호기가 떠난 채로 합성되고 그 후 알킬아미노를 통해 스캐폴드와 함께 커플링될 수 있다. 대안적인 것은 HSA 를 결합하는 팔미토일 모이어티이고 예를 들어 리라글루타이드(Liraglutide)에 사용되어 이 GLP-1 유사체의 반감기를 늘려왔다.
대안적으로, 스캐폴드와 펩티드의 콘쥬게이트를 제조한 후, 예를 들어 아민- 및 술프히드릴(sulfhydryl)-반응성 연결체 N-e-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드 에스테르 (EMCS)을 사용하여 N-말단을 개질할 수 있다. 상기 연결체를 경유하여 펩티드 콘쥬게이트가 다른 펩티드, 예를 들어 항체 Fc 절편에 연결될 수 있다.
결합 관능은 다합체를 형성하는 분자 스캐폴드에 결합된 다른 펩티드; 항체 또는 항체 절편을 포함하는 다른 결합 단백질; 또는 혈청 알부민 또는 주효 기, 예컨대 항체 Fc 영역을 포함하는 임의 다른 목적하는 물질일 수 있다.
또한, 부가적인 결합 또는 관능적 활성은 분자 스캐폴드에 직접적으로 결합될 수 있다.
구현예에서, 스캐폴드는 추가의 활성이 결합될 수 있는 반응성 기를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기는 분자 스캐폴드 상의 다른 반응성 기에 대하여 직교적임으로써 펩티드와의 상호작용을 피한다. 일 구현예에서, 반응성 기는 보호되고, 추가의 활성을 콘쥬게이트하는 것이 필요할 때 탈보호될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 추가적 양태에서, 하나 이상의 주효 및/또는 관능 기에 콘쥬게이트된 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 리간드를 포함하는 약물 콘쥬게이트가 제공된다.
주효 및/또는 관능 기가 예를 들어, 폴리펩티드의 N 또는 C 말단에 또는 분자 스캐폴드에 부착될 수 있다.
적당한 주효 기로는 항체 및 그의 일부 또는 절편이 포함된다. 예를 들어, 주효 기는, 하나 이상의 불변 영역 도메인에 추가하여, 항체 경쇄 불변 영역 (CL), 항체 CH1 중쇄 도메인, 항체 CH2 중쇄 도메인, 항체 CH3 중쇄 도메인, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 주효 기는 항체의 힌지(hinge) 영역을 포함할 수 있다 (이러한 영역은 통상적으로 IgG 분자의 CH1과 CH2 도메인 사이에서 발견된다).
본 발명의 본 양태의 추가 구현예에서, 본 발명에 따른 주효 기는 IgG 분자의 Fc 영역이다. 유익하게는, 본 발명에 따른 펩티드 리간드-주효 기는 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 또는 7일 이상의 tβ 반감기를 갖는 펩티드 리간드 Fc 융합부를 포함하거나 이루어진다. 가장 유익하게는, 본 발명에 따른 펩티드 리간드는 1일 이상의 tβ 반감기를 갖는 펩티드 리간드 Fc 융합부를 포함하거나 이루어진다.
관능 기로는 통상적으로, 결합 기, 약물, 다른 물질의 부착을 위한 반응성 그룹, 대환식(macrocyclic) 펩티드가 세포 내로 흡수되는 것을 보조하는 관능 기 등이 포함된다.
세포 내로 침투하는 펩티드의 능력은 세포 내 표적에 대해 펩티드가 유효성있게 하여준다. 세포 내 침투 능력을 갖는 펩티드가 접근할 수 있는 표적으로는 전사 인자, 세포내 신호전달 분자, 예컨대 타이로신 키나아제 및 세포사멸 경로에 관련된 분자가 포함된다. 세포 침투가 가능하게 하여주는 관능 기로는 펩티드 또는 분자 스캐폴드 중 어느 쪽에 부가되어 왔던 펩티드 또는 화학적 기가 포함된다. 예컨대 VP22, HIV-Tat, 초파리속(Drosophila)의 호메오박스 단백질 (안테나피디아(Antennapedia))에서 유래된 것과 같은 펩티드는 예를 들어, [Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, 821p]; 및 [Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637]에 기재되어 있는 바와 같다. 혈장 멤브레인을 통한 자리 옮김에 효율적이라고 알려져 있던 짧은 펩티드의 예로는 초파리속 안테나피디아 단백질로부터의 16 아미노산 페네트라틴(penetratin) 펩티드 (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444), 18 아미노산 "모델 양친성 펩티드' (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127) 및 HIV TAT 단백질의 아르기닌 풍부 영역이 포함된다. 비(非)펩티드성 접근법으로는, 생물 분자에 용이하게 부착할 수 있는 SMOC 또는 소분자 모방체(small molecule mimics)의 사용이 포함된다 (Okuyama et al (2007) Nature Methods Volume 4 p153). 분자에 구아니디늄 기를 부가하는 기타의 화학적 전략도 세포 침투를 증강시킨다 (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585). 스테로이드와 같은 작은 분자량의 분자를 분자 스캐폴드에 부가하여 세포로의 흡수를 증강시킬 수도 있다.
펩티드 리간드에 부착될 수 있는 관능기의 일 부류로는 항체 및 이의 결합 절편, 예컨대 Fab, Fv 또는 단일 도메인 절편이 포함된다. 특히, 펩티드 리간드의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있는 단백질에 결합하는 항체가 사용될 수 있다.
많은 세포에 존재하는 인테그린에 결합하는 RGD 펩티드도 또한 혼입될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 펩티드 리간드-주효 기는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 tβ 반감기를 갖는다: 12 시간 이상, 24 시간 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상 또는 20일 이상. 유익하게는 본 발명에 따른 펩티드 리간드-주효 기 또는 조성물은 12 내지 60 시간 범위의 tβ 반감기를 가질 것이다. 추가의 구현예에 따르면, 1일 이상의 tβ 반감기를 가질 것이다. 추가의 구현예에 따르면 12 내지 26 시간 범위일 것이다.
본 발명의 일 특정 구현예에서, 루프형 펩티드에 콘쥬게이트된 관능 기는 금속 킬레이터에서 선택되고, 이는 의약적 관련성이 있는 금속 방사성 동위원소들을 복합체화하는데 적합하다. 상기 방사성 동위원소와 함께 복합체화할 경우, 상기 주효기는 유용한 암 치료제를 제공할 수 있다. 적합한 예로는 DOTA, NOTA, EDTA, DTPA, HEHA, SarAr 및 기타의 것들이 포함된다 (참고: [Targeted Radionuclide therapy, Tod Speer, Wolters/Kluver Lippincott Williams & Wilkins, 2011]).
또한, 가능성있는 주효 기로는, 펩티드 리간드가 ADEPT 에서 항체를 대체하는 경우, 효소, 예를 들어 효소/프로드러그 치료법에 사용하기 위한 카르복시펩티다아제 G2가 포함된다.
본 발명의 본 양태의 일 특정 구현예에서, 관능 기는 약물, 예컨대 암 치료용 세포독성제에서 선택된다. 적합한 예로는 다음이 포함된다: 알킬화제, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴 뿐만 아니라 옥살리플라틴(oxaliplatin), 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 이포스파마이드; 푸린 유사체 아자티오프린 및 메르캅토푸린 또는 피리미딘 유사체를 포함하는 대사길항제; 빈크리스틴, 빈플라스틴, 비노렐빈 및 벤데신과 같은 빈카 알칼로이드를 포함하는 식물 알칼로이드 및 테르페노이드; 포도필로톡신 및 이의 유도체 에토포시드 및 테니포시드; 탁솔로 공지되어 있는 파클리탁셀을 포함하는 탁산; 캄토테신(camptothecin)을 포함하는 토포이소머라아제 억제제; 이리노테칸 및 토포테칸, 및 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 및 테니포시드을 포함하는 II형 억제제. 추가의 약제로는 면역억제성 닥티노마이신 (신장 이식에 사용되는 것), 독소루비신, 에피루비신, 클레오마이신 및 기타를 포함하는 항종양성 항생물질이 포함될 수 있다.
본 양태에 따른 본 발명의 추가의 일 특정 구현예에 따르면, 세포독성제는 DM1 또는 MMAE 에서 선택된다.
DM1은 하기의 구조를 가지는 메이탄산(maytansine)의 티올-포함 유도체인 세포독성제이다:
Figure pat00022
모노메틸 아우리스타틴 E (monomethyl auristatin E)(MMAE)는 하기의 구조를 가지는 합성 항종양제이다:
Figure pat00023
일 구현예에서, 세포독성제는 절단가능한 결합, 예컨대 디술파이드 결합에 의해 바이사이클릭 펩티드에 연결된다. 추가의 구현에에서, 디술파이드 결합에 인접한 기를 개질하여 디술파이드 결합의 장해(hindrance)를 제어하고, 이에 의해 세포독성제의 분열 속도 및 수반되는 방출을 제어한다.
디술파이드 결합의 양 측에 입체 장해를 도입함으로써 환원에 대한 디술파이드 결합의 감수성을 개질하는 잠재성이 공개된 논문에 밝혀졌다 (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). 입체 장해의 정도가 크면 세포내 글루타티온 및 세포외 (전신성) 환원제에 의한 환원 속도를 감소시켜, 결과적으로는 세포 내 및 외에서 톡신이 방출되는 용이성을 감소시킨다. 따라서, 세포내 환경에서의 효율적인 방출 (이는 치료 효과를 최대화함)에 대하여 순환에서 디술파이드 안정성의 최적치를 선택 (이는 톡신의 바람직하지 않은 부작용을 최소화함)은, 디술파이드 결합의 양 측에 있는 장해 정도의 조심스러운 선택에 의해 달성될 수 있다.
디술파이드 결합의 양 측 상의 장해는 표적 물질 (여기서는 바이사이클릭 펩티드) 또는 분자 구조물의 톡신 측에 하나 이상의 메틸기를 도입함으로써 조절된다.
따라서, 일 구현예에서, 세포독성제는 하기 화학식의 화합물로부터 선택된다:
Figure pat00024
상기 식에서, n은 1 내지 10에서 선택되는 정수를 나타내고,
R1 및 R2는 독립적으로, 수소 또는 메틸기를 나타낸다.
상기 화학식의 화합물의 일 구현예에서, n은 1을 나타내고, R1 및 R2는 둘 모두 수소를 나타낸다 (즉, 메이탄신 유도체 DM1).
상기 화학식의 화합물의 대안적 구현예에서, n은 2를 나타내고, R1은 수소를 나타내고, R2는 메틸기를 나타낸다 (즉, 메이탄신 유도체 DM3).
화합물의 일 구현예에서, n은 2를 나타내고, R1 및 R2는 둘 모두 메틸기를 나타낸다 (즉, 메이탄신 유도체 DM4).
세포독성제는 디술파이드 결합을 형성할 수 있고, 바이사이클릭 펩티드와의 콘쥬게이트 구조에서, 티올-톡신과 티올-바이사이클 펩티드 사이의 디술파이드 연결은 몇가지 가능한 합성식을 통해 도입된다.
일 구현예에서, 콘쥬게이트의 바이사이클릭 펩티드 구성성분은 하기의 구조를 갖는다:
Figure pat00025
상기 식에서, m은 0 내지 10에서 선택되는 정수를 나타내고,
바이사이클은 본원에 기재된 바와 같은 임의 적합한 루프형 펩티드 구조를 나타내고,
R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 메틸을 나타낸다.
R3 및 R4가 둘 모두 수소인 상기 화학식의 화합물은 힌더드(hindered)되지 않은 것으로 생각되며, R3 및 R4 중의 하나 또는 모두가 메틸을 나타내는 상기 화학식의 화합물은 힌더드되어 있는 것으로 생각된다.
상기 화학식의 바이사이클릭 펩티드는 디술파이드 결합을 형성할 수 있고, 전술한 세포독성제와의 콘쥬게이트 구조에서, 티올-톡신과 티올-바이사이클 펩티드 사이의 디술파이드 연결은 몇가지 가능한 합성식을 통해 도입된다.
일 구현예에서, 세포독성제는 하기의 연결체에 의해 바이사이클릭 펩티드에 연결된다:
Figure pat00026
상기 식에서 R1, R2, R3 및 R4은 수소 또는 C1-C6 알킬기를 나타내고,
톡신은 본원에 정의된 임의 적합한 세포독성제를 가리키고,
바이사이클은 본원에 기재된 바와 같은 임의 적합한 루프형 펩티드 구조를 나타내고,
n은 1 내지 10에서 선택되는 정수를 나타내고,
m은 0 내지 10에서 선택되는 정수를 나타낸다.
R1, R2, R3 및 R4가 각각 수소일 경우, 디술파이드 결합은 적게 힌더드되고, 환원에 가장 민감하다. R1, R2, R3 및 R4가 각각 알킬일 경우, 디술파이드 결합은 가장 힌더드되고, 환원에 대해 적게 민감하다. 수소와 알킬의 부분적 치환은 환원에 대한 저항성의 점진적 증가 및 수반되는 톡신의 분열과 방출을 산출한다. 바람직한 구현예로는 다음을 포함한다: R1, R2, R3 및 R4가 모두 H; R1, R2, R3 가 모두 H이고 R4 가 메틸; R1, R2 = 메틸이고, R3, R4 = H; R1, R3 = 메틸이고, R2, R4 = H; 및 R1, R2 = H, R3, R4 = C1-C6 알킬.
일 구현예에서, 화합물의 톡신은 메이탄신이고, 콘쥬게이트는 하기 화학식의 화합물을 포함한다:
Figure pat00027
상기 식에서 R1, R2, R3, 및 R4는 상기 정의한 바와 같고;
바이사이클은 본원에 정의된 바와 같은 임의 적합한 루프형 펩티드 구조를 나타내고,
n은 1 내지 10에서 선택되는 정수를 나타내고,
m은 0 내지 10에서 선택되는 정수를 나타낸다.
톡신을 사용하여 바이사이클 펩티드 리간드의 전술한 콘쥬게이트를 제조하는 것에 대한 추가의 상세한 사항 및 방법은 본 출원인의 특허 공개 공보 WO 2016/067035 및 2016년 5월 4일에 출원한 계류 중인 출원 GB1607827.1 에 상세히 기재되어 있다. 상기 출원들의 전문이 본원에 참조로 명백히 혼입되어 있다.
톡신과 바이사이클 펩티드 사이의 연결체는 아지드-관능화된 톡신과 알킨-관능화된 바이사이클 펩티드 구조 사이 (또는 그 반대)의 클릭 반응에 의해 형성되는 트리아졸 기를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 바이사이클 펩티드는 카르복실레이트-관능화된 톡신과 바이사이클 펩티드의 N-말단 아미노기 사이의 반응에 의해 형성된 아미드 연결부를 포함할 수 있다.
톡신과 바이사이클 펩티드 사이의 연결체는 표적 세포 내에서 톡신의 선택적 방출을 제공하기 위한 카뎁신-절단가능한 기를 포함할 수 있다. 적합한 카뎁신-절단가능한 기는 발린-시트룰린이다.
톡신과 바이사이클 펩티드 사이의 연결체는 목적하는 관능성, 예를 들어 콘쥬게이트에 결합 친화력 또는 카뎁신 절단성을 제공하기 위해 하나 이상의 스페이서 기를 포함할 수 있다. 적합한 스페이서 기는 발린-시트룰린 기와 톡신 모이어티 중간에 위치할 수 있는 파라-아미노 벤질 카르바메이트(PABC)이다.
따라서, 구현예에서, 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트는 톡신-PABC-cit-val-트리아졸-바이시클로 구성되는 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure pat00028
추가의 구현예에서, 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트는 톡신-PABC-cit-val-디카르복실레이트-바이사이클로 구성되는 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure pat00029
상기 식에서 (Alk)는 화학식 CnH2n의 알킬렌기 (여기서 n은 1 내지 10이고, 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다)이고, 적합하게는 (Alk)는 n-프로필렌 또는 n-부틸렌이다.
적합하게는 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트는 BT17BDC53, BT17BDC59, BT17BDC61, BT17BDC62, 및 BT17BDC68로 이루어진 군 (이에 대해서는 하기에 정의되어 있음)에서 선택된다.
본 발명에 따른 펩티드 리간드는 생체내 치료 및 예방적 응용에, 시험관내 및 생체내 진단 응용에, 시험관내 분석법 및 시약 응용 등에 이용될 수 있다.
통상적으로, 펩티드 리간드의 사용은 항체의 사용을 대체할 수 있다. 본 발명에 따라 선택된 유도체는 웨스턴 분석법에서 진단학적 용도 및 표준 면역조직화학적 절차에 의한 인시투(in situ) 단백질 검출의 용도를 가지며; 이러한 응용법에서의 사용을 위해, 선택된 레퍼토리의 유도체는 당업게에 공지된 기법에 따라 라벨링될 수 있다. 또한, 이러한 펩티드 리간드는, 레진과 같은 크로마토그래피 지지물에 복합체화될 경우, 친화력 크로마토그래피 절차에 제조용으로 사용될 수 있다. 이러한 모든 기법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 펩티드 리간드는 항체와 유사한 결합 역량을 가지며, 이러한 분석법에서 항체를 대체할 수 있다.
진단학적 용도로는 테스트-스트립 분석법, 실험실 분석법 및 면역진단법적 분석법을 포함하는, 항체가 일반적으로 투입되는 임의 용도가 포함된다.
본 발명에 따라 제조된 펩티드 리간드의 치료 및 예방적 용도는 본 발명에 따라 선택된 유도체를 인간과 같은 포유동물 수령체에 투여하는 것과 연관된다. 적어도 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 펩티드 리간드가 포유동물에의 투여에 선호되며, 특히 상기 포유동물이 인간일 경우에는 98 sow 99% 이상의 균질성이 약학적 용도로 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 목적하는 바에 따른 균일도까지 정제되면, 선택된 펩티드는 진단 또는 치료에 사용하거나 (체외 진단 또는 치료 포함), 또는 분석법 절차, 면역 형광 염색 등을 전개 및 실시하는데 사용될 수 있다 (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
통상적으로, 본 펩티드 리간드는 약리학적으로 적당한 담체와 함께 순수한 형태로 활용될 것이다. 통상적으로, 상기 캐리어는 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함하고, 염수 및/또는 완충된 매질을 포함하는 임의의 것을 포함한다. 비경구용 비히클(vehicle)은 염화나트륨 용액, 링거(Ringer)의 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트화된 링거를 포함한다. 필요한 경우 현탁액 중에 펩티드 복합체를 유지시키기 위해, 적합한 생리학적으로 허용가능한 아쥬반트(adjuvant)를 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 겔라틴 및 알기네이트와 같은 증점제로부터 선택할 수 있다.
정맥용 비히클은 유체 및 영양 보충물 및 전해질 보충물, 예컨대 링거의 덱스트로스에 기초한 것들을 포함한다. 또한, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체와 같은 보존제 및 기타 첨가제도 존재할 수 있다 (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
본 발명의 펩티드 리간드는 개별 투여되는 조성물로서 사용되거나 또는 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 이들로는, 항체, 항체 절편 및 다양한 면역요법적 약물, 예컨대 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티눔 및 면역 독소가 포함된다. 약학적 조성물은, 본 발명의 선택된 항체, 수용체 또는 이의 결합 단백질과 다양한 세포독성제 또는 기타 약제의 "칵테일"을 포함하거나 또는 상이한 특이성을 갖는 본 발명의 선택된 펩티드, 예컨대 상이한 표적 유도체를 사용하여 선택된 펩티드의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있는 임의의 것일 수 있다. 면역 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 요법을 위해, 본 발명의 선택된 항체, 수용체 또는 이의 결합 단백질을 표준 기법에 따라 임의 환자에게 투여할 수 있다. 투여는 임의의 적당한 방식에 따를 수 있고, 비경구적 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피내 투여, 폐 경로를 경유한 투여 또는 적당한 경우 카테터를 사용한 직접 투입이 포함된다. 투약량 및 투여 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 병용, 금기증 및 임상의가 고려할 기타 파라미터에 의존할 것이다.
본 발명의 펩티드 리간드는 보관을 위해 동결 건조될 수 있고, 사용 전에 적합한 담체 중에서 복원될 수 있다. 이러한 기법은 효과적인 것으로 나타났으며 당업계에 공지된 동결 건조 및 복원 기법이 이용될 수 있다. 당업자라면 동결 건조 및 복원이 다양한 정도의 활동 손실을 야기할 수 있다는 점 및 사용 수준은 이를 보상하기 위해 상향 조정되어야 할 수 있다는 점을 인식할 것이다.
본 발명의 펩티드 리간드 또는 이의 칵테일을 포함하는 조성물은 예방 및/또는 치료 요법에 투여될 수 있다. 특정 치료적 응용에 있어서, 선택된 세포군의 적어도 부분적인 저해, 억제, 조절, 사별, 또는 일부 기타 측정가능한 파라미터를 달성하기에 적합한 양은 "치료적 유효 투여량"으로 정의된다. 이러한 투약량을 달성하는데 필요한 양은 질환의 경중 및 환자 본인 면역계의 통상적 상태에 의존할 것이지만, 통상적으로는 체중 1 킬로그램 당 0.005 내지 5.0 mg의 선택된 펩티드 리간드의 범위이고, 0.05 내지 2.0 mg/kg/투여의 투여량이 더 일반적으로 사용된다. 예방적 응용을 위해, 본 발명의 펩티드 리간드 또는 이의 칵테일을 포함하는 조성물은 또한, 유사한 또는 약간 더 낮은 투약량으로 투여될 수도 있다.
본 발명에 따른 펩티드 리간드를 함유하는 조성물은 포유동물에서 선택 표적 세포군의 변경, 불활성화, 사멸 또는 제거를 보조하기 위한 예방적 및 치료적 셋팅에 활용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 펩티드의 선택된 레퍼토리는 세포의 불균질 채집물로부터 표적 세포군을 사멸, 고갈 또는 기타 효과적으로 제거하기 위해 체외 또는 생체 내에서 선택적으로 사용될 수 있다. 표유동물의 혈액을 선택된 펩티드 리간드와 함께 체외에서 조합함으로써, 목적하지 않은 세포는, 표준 기법에 따라 포유동물로 돌려보내기 위한 혈액으로부터 사멸되거나 그렇지 않으면 제거된다.
하기의 실시예를 참조하여 본 발명을 추가로 설명한다.
실시예
재료 및 방법
단백질 발현
MT1-MMP 헤모펙신형 리피트(repeat) (MT1-MMP 헤모펙신 도메인으로도 공지되어 있음), 인간 유전자로부터의 잔기 Cys319-Gly511을, pEXPR-IBA42 (IBA) 발현 벡터를 사용하여, 분비된 N-말단 His6-태그된 가용성 단백질로서 HEK293 세포 내에서 임시 발현시켰다. 발현 후, 상기 단백질을 니켈-NTA 친화성 크로마토그래피로, 그 후에는 겔 여과로 정제하였고, 순도를 SDS-PAGE 로 확인하였다. 배취(batch)와 배취에 따른 변산도(variability)도 헤모펙신 도메인 결합 바이사이클의 존재/부재 하에 형광 열 시프트 실험으로 모니터링하였다.
펩티드 합성
MultiSynTech 사의 Syro II 합성기 및 Peptide Instruments 사에서 제조한 Symphony 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc 화학에 기초하여 펩티드를 합성하였다. 다음의 측쇄 보호기를 갖는 표준 Fmoc-아미노산을 이용하였다 (Sigma, Merck 사 제조): Arg(Pbf); Asn(Trt); Asp(OtBu); Cys(Trt); GIu(OtBu); Gln(Trt); His(Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu); Trp(Boc); 및 Tyr(tBu) (Sigma 사 제조). 커플링 시약은 HCTU (Pepceuticals)였고, 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, Sigma 사 제조)을 염기로 이용하였고 DMF 중의 20% 피페리딘 (AGTC)를 사용하여 탈보호를 시켰다. 0.37 mmol/gr Fmoc-Rink 아미드 AM 레진 (AGTC)을 사용하여 합성을 수행하고, Fmoc-아미노산을 4배 과량으로 이용하였고, 염기는 상기 아미노산에 대해 4배 과량이었다. 아미노산을 DMSO 중에 0.2 M로, HCTU 를 DMF 중 0.4 M로, DIPEA 를 N-메틸피롤리돈 중 1.6 M 로 (Alfa Aesar사 제조) 용해시켰다. 조건은, 커플링 반응물이 DMF 중 20 내지 50% DMSO 에 포함되도록 하는 것이었고, 이렇게 함으로써 고체상 합성 동안에 응집 및 삭제를 감소시키고 수율을 높였다. 커플링 시간은 통상적으로 30분 이었고, 탈보호 시간은 2 × 5 분이었다. Fmoc-N-메틸글라이신 (Fmoc-Sar-OH, Merck 사 제조)을 1 시간 동안 커플링 시켰고, 탈보호 시간 및 후속하는 잔기와의 커플링 시간은 각각 20 분 및 1 시간 이었다. 합성후, 레진을 디클로로메탄으로 세척하고 건조하였다. 지지물로부터 측쇄 보호기의 절단은 95:2.5:2.5:2.5 v/v/v/w TFA/H2O/iPr3SiH/디티오트레이톨 10 mL를 사용하여 3 시간 동안 수행하였다. 절단 후, 사용된 레진은 여과 제거하고, 여과물은 -80℃로 냉각시켜두었던 35 mL의 디에틸에테르에 첨가하였다. 펩티드 펠릿을 원심분리하고, 에테르계 상청액은 폐기하고, 펩티드 펠렛을 냉각된 에테르로 2회 이상 세척하였다. 그 후, 펩티드를 5 내지 10 mL의 아세토니트릴-물 중에 재용해시켜 동결 건조하였다. 조 생성물의 순도를 질량 분광분석법 (Applied Biosystems 사의 Voyager DE, MALDI-TOF)으로 분석하기 위해 작은 시료를 제거하였다. 동결 건조후, 펩티드 분말을 H2O 중 10 mL 6 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 중에 취하고, 1 M 디티오트레이톨 0.5 mL로 보충하고, C8 Luna 분취형(preparative) HPLC 칼럼 (Phenomenex)으로 로딩하였다. 용매 (H2O, 아세토니트릴)을 0.1% 헵타플루오로부티르산으로 산성화하였다. 구배는, Gilson 분취형 HPLC 시스템을 사용하여, 15 내지 20 mL/qnsdml 유속에서, 15 분 내에 30 내지 70% 아세토니트릴의 범위로 하였다. 순수한 직쇄 펩티드 재료를 함유하는 분획 (MALDI로 동정됨)을, 후술하는 바와 같은 스캐폴드 분자로의 커플링에 의해 바이사이클 유도체를 제조하는데 사용하였다.
달리 표시하지 않는한, 모든 아미노산은 L-배치의 것으로 사용되었다. 비자연적 아미노산은 전술한 통상의 방법을 사용하여 펩티드 서열에 혼입되었다. 본원에서 이용한 비자연적 아미노산 전구체의 목록을 하기 표에 요약한다:
Figure pat00030
추가로, 다음의 비자연적 아미노산 전구체가 DAP 및 N-MeDAP 개질된 펩티드를 제조하는데 사용되었다:
Figure pat00031
MT1-MMP에 대한 결합 친화력
형광 편광법 (이방성)을 사용한 경쟁 분석법으로 결합 친화력을 측정하였다.
본원에서 언급된 형광 트레이서(tracer)는 5,6-카르복시플루오레세인을 사용하여 플루오레세인화된 바이사이클릭 펩티드이다. 플루오레세인화는, 사르코신 스페이서 (일반적으로 Sar5)에 의해 바이사이클 코어 서열로부터 분리되는, 펩티드의 N-말단 아미노 기 상에서 수행될 수 있다. N-말단 아미노산이 그 펩티드에 대해 고유한 경우, Fmoc 고체상 합성 동안에 또는 합성후 (TBMB 를 사용한 사이클화 및 정제 후) 플루오레세인화를 수행할 수 있다. 플루오레세인화는 또한, 그 후 사르코신 스페이서 (일반적으로 Sar6)에 의해 바이사이클 코어 서열에 의해 분리되는, C-말단 상에서, 일반적으로는 첫번째 C-말단 잔기로서 도입된 라이신 상에서 수행될 수 있다. 따라서, N-말단 트레이서는 C-말단 플루오레세인화된 구조물을 위해 Fluo-Gly-Sar5-A(바이사이클 코어 서열), 및 (바이사이클 코어 서열)-A-Sar6-K(Fluo) 로 기재되는 분자 포맷을 가질 수 있다. 실시에에서 사용되는 형광 트레이서는 A-(17-69)-A-Sar6-K(Fluo), A-(17-69-07)-A-Sar6-K(Fluo), 및 A-(17-69-12)-A-Sar6-K(Fluo) 이다. 17-69 형광 펩티드의 산성 특성으로 인하여, 이들은 농축 DMSO 스톡으로서 통상 제조되며, 이를 100 mM 트리스 pH 8 완충제에서 희석하였다.
MT1-MMP 헤모펙신 도메인 (PEX)에 대한 높은 친화력으로 인하여, 본원의 플루오레세인화된 유도체는 경쟁 시험용으로 사용될 수 있다 (검출을 위해 FP 사용함). 여기서, 형광 PEX-결합 트레이서와 PEX 의 미리-형성된 복합체를, 유리되고 플루오레세인화되지 않은 바이사이클 펩티드를 사용하여 적정하였다. 모든 17-69-기초 펩티드가 동일한 자리에 결합할 것으로 예상되기 때문에, 적정제가 PEX로부터 형광 트레이서를 대신할 것이다. 복합체의 해리는 정량적으로 측정될 수 있고, 표적 단백질에 대한 경쟁물질 (적정제)의 Kd 를 측정하였다. 경쟁 방법의 이점은 플루오레세인화되지 않은 바이사이클릭 펩티드의 친화력을 정확하고 빠르게 측정할 수 있다는 것이다.
트레이서의 농도는 일반적으로 Kd 또는 그 이하이고 (여기서는 1nM), 결합 단백질 (여기에서는, MT1-MMP의 헤모펙신)은 15배 과량으로 하여 트레이서의 >90% 가 결합되도록 하였다. 후속하여, 무형광 경쟁물질 바이사이클릭 펩티드 (일반적으로 단지 바이사이클 코어 서열)을 적정하여, 표적 단백질로부터 형광 트레이서를 대신하도록 하였다. 트레이서의 이동을 형광 편광법에서의 감소치(drop)로 측정하고 연관시켰다. 형광 편광법에서의 감소치는 무형광 적정제와 결합된 표적 단백질의 분획에 비례하므로, 표적 단백질에 대한 적정제의 친화력 척도이다.
원시 데이터(raw data)는 형광 트레이서, 적정제, 및 결합 단백질 사이의 균형 상태를 기재하는 3차 방정식의 분석적 해답에 맞춰진다. 이러한 맞춤은 표적 단백질에 대한 형광 트레이서의 친화력 값을 필요로 하는데, 이 값은 직접 결합 FP 실험 (앞서 기재된 바를 참조)에 의해 개별적으로 측정될 수 있다. 곡선 맞춤 (curve fitting)은 Sigmaplot 12.0 을 사용하여 수행되었으며 Zhi-Xin Wang 방정식 (FEBS Letters 360 (1995) 111-114)의 개량 버전을 사용하였다.
참조예 1
알킬아미노 스캐폴드 연결부와 티오에테르를 비교하기 위해 선택된 바이사이클릭 펩티드는 17-69-07-N241로 표기하였다. 이는 트리메틸렌 벤젠 스캐폴드를 갖는 티오에테르-형성 펩티드의 바이사이클 콘쥬게이트이다. 상기 바이사이클 유도체의 구조는 도 2에 도식적으로 나타나 있다. 콘쥬게이트 이전의 직쇄 펩티드는 다음의 서열을 갖는다:
H-(β-Ala)-Sar10-Ala-Cys-(D-Ala)-Asn-Glu-(1Nal)-(D-Ala)-Cys-Glu-Asp-Phe-Tyr-Asp-(tBuGly)-Cys-NH2
1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠 (TBMB, Sigma 사 제조)에 대한 콘쥬게이션이 다음과 같이 수행되었다. 직쇄 펩티드를 H2O 로 대략 35 mL 까지 희석시키고, 아세토니트릴 중 대략 500 μL의 100 mM TBMB 를 첨가하고, H2O 중의 5 mL의 1 M NH4HCO3 로 반응을 개시하였다. 반응을 실온에서 대략 30 분 내지 60 분 동안 진행시켰고, 반응이 완료되면 (MALDI로 판정), 동결 건조시켰다. 동결 건조후, 개질된 펩티드를, Luna C8을 Gemini C18 칼럼 (Phenomenex)으로 대체하고 산을 0.1% 트리플루오로아세트산으로 변경한 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 정제하였다. 올바른 TMB-개질된 재료를 포함하는 순수한 분획을 풀(pool)하고, 동결 건조하고, -20℃ 에서 보관하였다.
17-69-07-N241 로 표기된 생성된 바이사이클 유도체는 MT1-MMP에 대해 높은 친화력을 나타내었다. 유도체의 MT1-MMP에 대한 측정된 친화력 (Kd)는 0.23 nM 이었다. 따라서, 유도체는 세포 표면 메탈로프로테이나아제 MT1-MMP를 발현하는 종양 세포를 표적하기 위한 유망한 후보물질로 간주된다.
실시예 1
참고예 1의 펩티드 리간드의 바이사이클 구역에 대응하고, b-Ala -Sar10 테일(tail)이 빠졌고, 첫번째 및 세번째 시스테인 잔기를 TBMB 스캐폴드에 대해 알킬 아미노 연결부를 형성하는 DAP 잔기로 대체한, 17-69-07-N385로 표기되는 바이사이클 펩티드를 제조하였다. 이 유도체의 구조는 도 3에 도식적으로 나타나 있다.
상기 바이사이클을 형성하는데 사용한 직쇄 펩티드는 다음과 같다:
Ac-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap)
직쇄 펩티드 및 바이사이클 펩티드는 다음과 같은 LCMS 특성을 갖는다:
Figure pat00032
사이클화 단계를 위한 다양한 시약은 다음과 같이 시도되었다. 시약은 선택한 용매 중에 하기 표에 표시된 농도로 만들어졌다. 펩티드 용액의 부피에 대해 절반 부피의 TBMB 용액을 첨가하고, 그 혼합물을 잘 교반한 후, 절반 부피의 염기 용액을 첨가하였다. 반응물을 혼합하고 LCMS 분석을 위해 주기적으로 샘플링하였다.
Figure pat00033
실시예; 50 μL 펩티드 용액에 25 μL TBMB 용액을 첨가하였다. 용액을 완전히 혼합시킨 후, 25 μL 염기 용액을 첨가하였다.
사용한 용액이 DMF 일 경우, 모든 시약은 DMF 중에서 만들어진다. 사용한 용매가 DMSO 인 경우, 모든 시약은 DMSO 중에서 만들어진다. 사용한 용매가 MeCN/H2O 인 경우, 펩티드 용액은 50% MeCN/H2O에서 만들어지고, TBMB 용액은 MeCN 에서 만들어지고, 염기 용액은 H2O 에서 만들지며, 다만, 염기가 DIPEA 일 경우에는 염기 용액은 MeCN 에서 만들어진다. 모든 사이클화는 실온에서 수행하였다. 그 결과는 다음과 같다 (스펙트럼 범위는 3.5 내지 5.5 분. 220 nm 에서의 스펙트럼을 적분하고, 주요 피이크의 합을 취했음):
Figure pat00034
사이클화 이후의 순도는 염기의 선택에 매우 의존한다는 것을 알 수 있다. 생성물 순도는 2 내지 66%의 범위이고, 여기서 후자는 DIPEA 존재 하에 아세토니트릴/물의 혼합물과 연관되어 있다. 참조예 1의 사이클화와 달리, 통상적인 NaHCO3 를 염기로 사용하였을 때 수율이 대고 낮다. 트리알킬아민, 즉, 트리에틸아민과 디이소프로필에틸아민 (DIPEA)를 사용했을 때 최고의 수율을 달성한다.
MT1-MMP 에 대한 결합의 비교 데이터는 도 7에 나타나 있다. 측정된 Kd 는 0.45 nM 인데, 이는 해당 실시예에서 알킬아미노 연결부의 변화가, 참조예 1의 티오에테르 연결된 유도체에 비하여 결합 친화력에 현저히 낮은 변화를 가져온다는 것을 보여준다.
실시예 2
실시예 1의 바이사이클펩티드에 대응하되, DAP 잔기를 N-MeDAP 잔기로 대체한, 17-69-07-N426 로 표시되는 바이사이클 펩티드를 제조하였다. 이 유도체의 구조는 도 4 에 도식적으로 나타나 있다. 이 바이사이클을 형성하는데 사용한 직쇄 펩티드는 다음과 같다:
Ac-A(Dap(Me))(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap(Me))
직쇄 펩티드 및 바이사이클 펩티드는 다음과 같은 LCMS 특성을 갖는다:
Figure pat00035
실시예 1에 기재한 바와 같은 사이클화 단계에 대해 다양한 상이한 반응 조건, 용매 및 염기를 사용하였으며, 그 결과는 다음과 같다 (모든 사이클화는 실온에서 수행하였음):
Figure pat00036
사이클화 이후의 순도는 다시, 염기의 특성에 의존한다. 예상한 바와 같이 염기로서 Na2CO3 를 사용했을 때의 순도가 낮았다 (실시예 1 참조). DIPEA 존재 하에 아세토니트릴/물의 최적 조건을 사용하였을 때, 사이클화 이후의 순도는 매우 높았고 (93%), 이는 Dap 의 N-메틸화가 부반응의 수준을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
MT1-MMP 에 대한 결합의 비교 데이터를 도 8에 나타내었다. 측정된 Kd 는 0.36 nM 이고, 이는 참조예 1의 티오에테르 연결된 유도체에서 거의 변하지 않은 것이다. 연결부 상에서의 두 N-메틸화에도 불구하고 역가는 유지되었으며, 이에, 본 실시예의 유도체는 매우 흥미롭다.
실시예 3
Tyr9를 Phe9 로 대체하여 (Tyr 하이드록실의 제거) 실시예 1의 바이사이클 펩티드에 대응하는, 17-69-07-N428 로 표기된 바이사이클 펩티드를 제조하였다. 이 바이사이클을 형성하는데 사용된 직쇄 펩티드는 다음과 같다:
Ac-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFF9D(tBuGly)(Dap)
상기 직쇄 펩티드 및 바이사이클 펩티드는 다음과 같은 LCMS 특성을 갖는다:
Figure pat00037
실시예 1에 기재한 바와 같은 사이클화 단계에 대해 다양한 상이한 반응 조건, 용매 및 염기를 사용하였으며, 그 결과는 다음과 같다 (스펙트럼의 LCMS 범위는 4 내지 6 분. 220 nm 에서의 스펙트럼을 적분하고, 주요 피이크의 합을 취했음):
Figure pat00038
생성물 순도가 2 내지 71%의 범위이고, 후자는 DIPEA 의 존재 하의 아세토니트릴/물의 혼합물과 연관되어 있음을 알 수 있다. Tyr-OH 의 제거 (Tyr → Phe9)는, MeCN/H2O/TMG/실온 또는 MeCN/H20/K2CO3/실온 조건 하에서 타이로신-포함 펩티드를 사용한 동일한 반응에 비하여, 생성물 수율을 현저하게 증가시켰다. 용매로서 DMSO 의 사용은, 쉽게 분석할 수가 업는 다중 피이크가 있는 매우 혼란스러운 크로마토그램을 보여줬다.
MT1-MMP에 대한 상기 17-69-07-N428 유도체의 결합 비교 데이터는 도 9에 나타냈다. 측정된 Kd 는 3.5 nM 였다. 참조예 1의 티오에테르 연결된 유도체에 비하여 결합 친화력이 약간 감소하였고, 이는 Tyr9 을 Phe9 로 대체하였던 것에서 주로 기인한 것으로 여겨진다.
실시예 4
참조예 1과 유사하게 N-말단 Sar10 스페이서를 사용한 실시예 1의 바이사이클 펩티드에 대응하고 PYA 기 (4-펜타이노산(pentynoic acid), 톡신과의 "클릭" 유도체화용)를 콘쥬게이트한, 17-69-07-N434 로 표기되는 바이사이클 펩티드를 만들었다. 이 유도체의 구조는 도 5에 도식적으로 나타나 있다. 이 바이사이클을 형성하는데 사용된 직쇄 펩티드는 다음과 같다:
(PYA)-(B-Ala)-Sar10-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap)
상기 직쇄 펩티드 및 바이사이클 펩티드는 다음과 같은 LCMS 특성을 가졌다.
Figure pat00039
사이클화는 다음과 같이 수행하였다.
Figure pat00040
생성된 유도체 17-69-07-N434 는 주효 기, 즉, 톡신으로의 유도체화를 위해 필요한 N-말단 알킨이 있는 N241 (참조예 1)의 Dap1/3 등가물이다. 이 펩티드는 60% 순도에서 TBMB 로 사이클화될 수 있다. MT1-MMP 에 대한 측정된 Kd 는 1.52 nM 이며, 이는 상기 바이사이클 펩티드가 MT1-MMP 를 표적하는데 고도로 적합하게 한다.
실시예 5
실시예 1 내지 3에서 사용한 TBMB 스캐폴드 분자를 TBAB 로 대체하는 것이 다음과 같이 수행되었다.
실시예 1 내지 3에서 17-69-07-N385, 17-69-07-N426 및 17-69-07-N428을 형성시키는데 사용한 직쇄 펩티드를 TBMB에 사용한 것과 동일한 농도 및 등가량으로 TBAB 를 사용하여 사이클화하였다. N385 펩티드를 사용한 TBAB 유도체의 구조를 도 6에 도식적으로 나타내었다.
실온에서 MeCN/H2O의 용매 혼합물과 함께, DIPEA 를 염기로 선택하였다. 다음과 같은 결과가 얻어졌다.
Figure pat00041
상기 결과는, 생성물% 열에서 알 수 있듯이, TBAB (할로아세틸-) 화학이 TBMB 에 비하여 더 높은 사이클화 속도 및 더 큰 선택도를 제공한다는 것을 보여준다.
실시예 6
Cys6 를 Dap(Me)로 대체한 실시예 1의 바이사이클 펩티드에 대응하는, 17-69-07-N474 로 표기된 바이사이클 펩티드를 제조하였다. 상기 바이사이클을 형성하는데 사용한 직쇄 펩티드는 다음과 같다:
Ac-A(Dap(Me))(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)(Dap(Me))EDFYD(tBuGly)(Dap(Me))
N385 펩티드를 사용한 TBMB 유도체의 구조를 도 10에 도식적으로 나타내었다. 직쇄 펩티드 및 바이사이클 펩티드는 다음과 같은 LCMS 특성을 갖는다:
Figure pat00042
사이클화는 다음의 절차에 따라 수행되었다: MeCN/H2O (1:1) 중에 펩티드의 1 mM 용액 50 μL를 MeCN 중의 25μL 2.6 mM TBMB 와 혼합한 후, MeCN/H2O 중의 25μL 200mM DIPEA (아세트산을 사용하여 pH 를 10까지 조정)를 첨가하고 용액을 혼합하였다(반응에 존재하는 펩티드에 대하여 1.3 당량의 TBMB 및 100 당량의 염기). 하기 표에 나타낸 바와 같이, 반응 진행에 따라 4 시간 후 및 하룻밤 후에 LCMS 시료를 취하였다.
Figure pat00043
MT1-MMP 에 대한 결합은 다른 실시예에서와 동일한 방법으로 평가하였다. 측정된 Kd 는 8.0 nM 이었고, 이는 참조예 1의 티오에테르 연결된 유도체보다 더 적다. 이 화합물은 연결부 상에 3개의 N-메틸Dap 이 있음에도 불구하고 강한 친화력으로 여전히 결합하는 바, 이에, 본 실시예의 유도체는 매우 흥미롭다.
실시예 7
본 발명에 따라 하기와 같이 추가의 바이사이클 펩티드를 제조하고, 전술한 방법을 사용하여 MT1-MMP 로 결합 친화력에 대해 테스트하였다. 상기 바이사이클 펩티드 화합물의 도식적 구조를 도 10 내지 도 13에 나타낸다.
Figure pat00044
Figure pat00045
MT1-MMP에 대한 높은 친화력은 본 발명에 따른 상기 알킬아미노-연결된 바이사이클 화합물로 달성된다는 것을 알 수 있다. 또한, 연구는, 개, 마우스/래트 및 인간 MT1-MMP 와 본 발명의 바이사이클 펩티드의 완전한 교차 반응성을 보여주었다. 또한, 연구는 MMMP1 엑토도메인, MMP2 엑토도메인, MMP15 엑토도메인 (헤모펙신 도메인) 또는 MMP16 헤모펙신 도메인과의 유의한 교차 반응성이 없는, 본 발명에 따른 바이사이클 펩티드의 높은 특이성을 보여주었다. 또한, 본 발명에 따른 바이사이클의 약동력학은 스캐폴드에 3개 티오에테르 연결부를 갖는 대응하는 바이사이클 펩티드와 유사한 것으로 나타났으나, 본 발명의 바이사이클 펩티드의 경우 혈청 중 반감기 측정값이 약간 더 길었다.
실시예 8
본 발명에 따른 바이사이클 펩티드가 트리아졸 사이클화 반응에 의해 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)에 커플링된 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트 (BCD)가 도 14에 도시한 반응식에 따라 제조되었다. 트리아졸 기에 추가하여 콘쥬게이트 내의 연결부 기는 발린-시트룰린 (카뎁신-절단가능한 기) 및 파라-아미노 벤질 카르바메이트 (PABC), 스페이서 기를 포함한다. 반응식의 단계를 다음과 같이 수행하였다.
화합물 3 의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00046
DCM (300 mL) 및 MeOH (150 mL) 중의 화합물 2 (30 g, 80 mmol)의 용액에, 암흑 속에서 4-아미노페닐 메탄올 (11 g, 88 mmol) 및 EEDQ (40 g, 160 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 30℃ 에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC (DCM:MeOH = 10/1, Rf = 0.43)에서 화합물 2 가 모두 소모되고 많은 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. TLC 에 따르면 반응은 깨끗하였다. 생성된 반응 혼합물을 농축하고 잔류물을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피 (ISCO®; 330 g x 3 SepaFlash® 실리카 플래쉬 칼럼, 0~20% MeOH/디클로로메탄의 용리액 @ 100 mL/min)로 정제하였다. 화합물 3 (20 g, 52% 수율)이 백색 고체로서 수득되었다.
화합물 4 의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00047
DMF (40 mL) 중의 화합물 3 (5.0 g, 10.4 mmol)의 용액에 DIEA (5.4 g, 7.26 mL, 41.7 mmol) 및 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (12.7 g, 41.7 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃ 에서 질소 하에 1 시간 동안 교반하였다. TLC (DCM:MeOH = 10/1, Rf = 0.66)에 따르면 화합물 3 이 완전히 소모되고 하나의 새로운 스폿이 형성된 것으로 나타났다. TLC 에 따르면 반응은 깨끗하였고, LCMS (ES8241-10-P1A, 생성물: RT = 1.15 분)은 목적하는 생성물이 형성되었다는 것을 보여줬다. 생성된 반응 혼합물을 중성 조건 하에서 곧바로 prep-HPLC 에 의해 정제하였다. 화합물 4가 백색 고체로 얻어졌다 (12 g, 60% 수율).
화합물 5 의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00048
한 배취(batch)의 반응을 다음과 같이 수행하였다: DMF (10 mL) 중의 화합물 4 (1.2 g, 1.68 mmol)의 용액을 질소 대기 하에서 DIEA (1.22 mL, 6.98 mmol)에 첨가하였다. 용액을 0℃에서 10분 동안 교반한 후, HOBt (226 mg, 1.68 mmol) 및 MMAE (1.00 g, 1.40 mmol)을 그에 첨가하고, 혼합물을 탈기하고 N2 로 3회 퍼어지하고, 이를 35℃ 에서 16 시간 동안 교반하였다. LC-MS (ES8396-1-P1A1, 생성물: RT = 1.19 분)은 화합물 4가 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출된다는 것을 보여주었다. 생성된 반응 혼합물의 5개 배취를 1 L 비이커에 합치고 500 mL 물을 첨가한 후, 침전물이 형성되어 이를 여과 수집하였다. 침전물을 EtOAc로 하룻밤 동안 적정하였다. 화합물 5가 백색 고체로서 얻어졌다 (5 g, 59% 수율).
화합물 6의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00049
화합물 5 (3.3 g, 2.7 mmol)를 TFA (44 mmol, 3.5 mL)의 존재하에 DCM (18 mL)에 용해시킨 후, 용액을 25℃ 에서 3 시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 감압 농축하여 DCM 및 TFA 를 제거하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 THF (20 mL)에 용해시키고 K2CO3 (1.8 g, 13 mmol)로 처리하고, 혼합물을 25℃ 에서 추가의 12 시간 동안 더 교반하였다. LC-MS (ES8396-2-P1B1, 생성물: RT = 1.04 분)는 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 반응 혼합물을 여과 및 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 10 mL 의 DMF 에 용해시키고 prep-HPLC 로 정제하였다 (중성 조건). 화합물 6이 백색 고체로서 얻어졌다 (1.6 g, 53% 수율).
화합물 7-1의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00050
화합물 6 (1.2 g, 1.1 mmol) 및 2-아지도아세트산 (162 mg, 1.6 mmol)을 DMF (10 mL)에 용해시켰다. TEA (450 uL, 3.2 mmol), HOBt (217 mg, 1.6 mmol) 및 EDCI (307 mg, 1.6 mmol)을 질소 하에서 상기 용액에 첨가하고, 혼합물을 0℃ 에서 30분 동안 교반한 후, 혼합물을 25℃ 까지 서서히 가온하고 15.5 시간 동안 더 교반하였다. LC-MS (ES8396-3-P1A, 생성물: RT = 1.04 분)은 화합물 6 이 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 2 mL의 물을 상기 반응 혼합물에 첨가하여 맑은 용액을 얻었다. 그 후, 용액을 중성 조건 하에 prep-HPLC 로 곧바로 정제하였다. 화합물 7-1 이 백색 고체로서 얻어졌다 (0.9 g, 70% 수율).
BT17BDC-53의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00051
DMF (3 mL) 및 H2O (2 mL) 중의 (2-아지도아세트산)-Val-Cit-PABC-MMAE (16 mg, 13.26 umol, 1 eq) 및 바이사이클 알킨 (17-69-07-N434, 30 mg, 11.09 umol, 0.8 eq)의 혼합물에 CuI (1.26 mg, 6.63 umol, 0.5 eq)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 N2 하에 20 시간 동안 교반하였다. LC-MS 는 (2-아지도아세트산)-Val-Cit-PABC-MMAE가 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여주었다. 생성된 반응 혼합물을 prep-HPLC 로 정제하였다 (TFA 조건). 화합물 BT17BDC-53 을 백색 고체로서 얻었다 (23.7 mg, 6.06 umol, 54.64% 수율).
BT17BDC-59의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00052
DMF (3 mL) 중의 (2-아지도아세트산)-Val-Cit-PABC-MMAE (31 mg, 25.69 umol, 1.2 eq) 및 17-69-07-N438 (40 mg, 20.8 umol, 1 eq)의 혼합물에 물 (0.4 mL) 중의 CuSO4 (10.25 mg, 64.24 umol, 3 eq) 용액 및 물 (0.4 mL) 중의 아스코르브산 (37.71 mg, 214.12 umol, 10 eq)의 용액을 질소 하에서 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 25℃ 에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS 는 (2-아지도아세트산)-Val-Cit-PABC-MMAE 가 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 중요한 피이크가 검출되었음을 보여주었다. 생성된 반응 혼합물을 prep-HPLC 에 의해 정제하였다 (TFA 조건). BT17BDC-59을 백색 고체로 얻었다 (26.7 mg, 8.53 umol, 41.02% 수율).
BT17BDC61의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00053
화합물 7-1 (250 mg, 207 umol) 및 BICY-ALKYNE 17-69-07-N450 (515 mg, 188 umol)을 50 mL의 둥근형 플라스크에 넣고, DMF (5 mL)을 첨가하고, 질소 대기 하에서 아스코르브산 수용액 (1 M, 1.88 mL) 및 CuSO4 수용액 (1 M, 570 uL)을 첨가하고, 혼합물을 25℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. LC-MS (ES8396-8-P1A, 생성물: RT = 1.03 분)에 따르면 BICY-ALKYNE 이 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 반응 혼합물을 여과하여 용해되지 않은 물질은 제거하고, 여과액을 곧바로 prep-HPLC 로 여과하였다 (TFA 조건). BT17BDC61 이 백색 고체로서 얻어졌다 (262 mg, 35% 수율).
BT17BDC62 의 제조를 위한 일반적 절차
화합물 7-1 (250 mg, 207 umol) 및 BICY-ALKYNE 17-69-07-N443 (368 mg, 188 umol)을 50 mL의 둥근형 플라스크에 넣고, DMF (5 mL)을 첨가한 후, 아스코르브산 수용액 (1 M, 1.88 mL) 및 CuSO4 수용액 (1 M, 570 uL)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 25℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. LC-MS (ES8396-9-P1A, 생성물: RT = 1.07 분)에 따르면, BICY-ALKYNE 가 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 반응 혼합물을 여과하여 용해되지 않은 물질은 제거하였다. 생성된 여과액을 prep-HPLC 로 곧바로 정제하였다 (TFA 조건). BT17BDC62 가 백색 고체로서 얻어졌다 (253 mg, 42% 수율).
실시예 9
본 발명에 따른 바이사이클 펩티드가 연결체의 말단 글루타릴 기 및 펩티드의 말단 아미노 사이의 아미드 형성에 의해 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)에 커플링된 바이사이클-약물 콘쥬게이트 (BCD)를 도 15에 나타낸 반응식에 따라 제조하였다. 상기 반응식의 단계들을 하기와 같이 수행하였다.
화합물 3의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00054
DCM (80.00 mL) 및 MeOH (40.00 mL) 중의 화합물 2 (7.00 g, 18.70 mmol, 1.00 eq)의 용액에 암흑 속에서 (4-아미노페닐)메탄올 (2.53 g, 20.56 mmol, 1.10 eq) 및 EEDQ (9.25 g, 37.39 mmol, 2.00 eq)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 8 시간 동안 교반하였다. LC-MS 에 따르면 화합물 2 가 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 생성된 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하고 잔류물을 얻었다. 잔류물을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피 (ISCO®; 120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 칼럼, 0~10% MeOH/DCM의 용리액 @ 85 mL/min)로 정제하였다. 화합물 3을 백색 고체로서 수득하였다 (7.00 g, 14.60 mmol, 78.06% 수율).
화합물 4의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00055
THF (20.00 mL) 및 DCM (10.00 mL) 중의 화합물 3 (4.00 g, 8.34 mmol, 1.00 eq) 및 4-니트로페닐카본클로리데이트 (6.72 g, 33.36 mmol, 4.00 eq)의 용액에 피리딘 (2.64 g, 33.36 mmol, 2.69 mL, 4.00 eq)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃ 에서 5 시간 동안 교반하였다. LC-MS에 따르면 화합물 3이 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 잔류물을 얻고, 이것을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피 (ISCO®; 120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 칼럼, 0~20% DM/MeOH의 용리액 @ 85 mL/min)로 정제하였다. 화합물 4가 백색 고체로서 수득되었다 (2.20 g, 3.41 mmol, 40.92% 수율).
화합물 5의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00056
DMF (10.00 mL) 중의 화합물 4 (500.00 mg, 775.59 umol, 1.00 eq) 및 DIEA (1.00 g, 7.76 mmol, 1.35 mL, 10.00 eq)의 혼합물을 0℃ 에서 30분 동안 질소 하에 교반하였다. MMAE (445.49 mg, 620.47 umol, 0.80 eq) 및 HOBt (104.80 mg, 775.59 umol, 1.00 eq)을 상기 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 0℃ 에서 10분 동안 30℃ 에서 추가의 18시간 동안 교반하였다. LC-MS 에 따르면 화합물 4가 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 생성된 반응 혼합물을 플래쉬 C18 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 330 g SepaFlash® C18 플래쉬 칼럼, 0~50% MeCN/H2O의 용리액 @ 85 mL/min)으로 곧바로 정제하였다. 화합물 5가 백색 고체로서 수득되었다 (400.00 mg, 326.92 umol, 42.15% 수율).
화합물 6의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00057
DCM (36.00 mL) 중의 화합물 5 (430.00 mg, 351.44 umol, 1.00 eq)의 용액에 TFA (6.16 g, 54.03 mmol, 4.00 mL, 153.73 eq)을 첨가하고, 혼합물을 25℃ 에서 2 시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 감압 농축하여 잔류물을 얻고 이를 THF (10.00 mL)에 용해시키고, K2CO3 (1.21 g, 8.79 mmol, 25.00 eq)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 25℃ 에서 12 시간 동안 교반하였다. LC-MS 에 따르면 화합물 5가 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 생성된 반응 혼합물을 여과하고 여과액을 감압 농축하여 잔류물을 얻고 이를 플래쉬 C18 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 120 g SepaFlash® C18 플래쉬 칼럼, 0~50% MeCN/H2O의 용리액 @ 85 mL/min)로 정제하였다. 화합물 6가 백색 고체로서 얻어졌다 (290.00 mg, 258.14 umol, 73.45% 수율).
화합물 7의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00058
화합물 6 (400 mg, 356 umol)을 포함하는 바이알을 질소 풍선을 이용하여 퍼어지하였다. 무수 DMA (5 mL)를 교반하며 첨가하고, 용액을 얼음 수조에서 0℃ 까지 냉각시켰다. 그 후, DIEA (130 uL, 712 umol)를 첨가하고 반응물을 0℃에서 10 분 동안 교반하고, 테트라하이드로피란-2,6-디온 (81 mg, 712 umol)을 첨가한 후, 얼음조를 제거하였다. 반응물을 25℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. LC-MS (ES8396-4-P1A, 생성물: RT = 1.08 분)에 따르면 화합물 6이 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 혼합물을 5 mL의 물로 희석한 후, prep-HPLC 로 정제하였다 (중성 조건). 화합물 7-2가 백색 고체로서 얻어졌다 (330 mg, 75% 수율).
화합물 8의 제조를 위한 일반적 절차
Figure pat00059
무수 DMA (4.5 mL) 및 DCM (1.5 mL) 중의 화합물 7-2 (330 mg, 267 umol)에 was added HOSu (92 mg, 800 umol)을 질소 하에 첨가하고 얼음조를 사용하여 0℃ 에서 10 분 동안 교반하였다. 그 후, EDCI (154 mg, 800 umol)을 상기 혼합물에 첨가하고, 25℃ 에서 16 시간 동안 추가로 교반하였다. LC-MS (ES8396-5-P1A, 생성물: RT = 1.15 분)에 따르면 화합물 7-2가 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 생성된 반응 혼합물을 5 mL의 물로 희석한 후, prep-HPLC 로 정제하였다 (중성 조건). 화합물 8이 백색 고체로서 수득되었다 (250 mg, 70% 수율).
BT17BDC68의 제조를 위한 일반적 절차
DMA (4 mL) 중에 BICY-NH2 17-69-07-N451 (80.0 mg, 30 umol)을 포함하는 50 mL의 둥근 바닥 플라스크를, 질소 풍선을 사용하여 퍼어지하였다. 그 후, DIEA (20 uL, 114 umol)을 첨가하고 25℃ 에서 10 분 동안 교반하였다. 그 후, 화합물 8 (40 mg, 30 umol)을 첨가하고, 반응물을 25℃ 에서 18 시간 동안 양의 질소 대기 하에서 교반하였다. LC-MS (ES6635-127-P1A1, 생성물: RT = 1.06 분)에 따르면 화합물 8 이 완전히 소모되고 목적하는 질량을 가진 하나의 주요 피이크가 검출되었음을 보여줬다. 생성된 반응 혼합물을 prep-HPLC 로 정제하였다 (TFA 조건). BT17BDC68 이 백색 고체로서 수득되었다 (33.9 mg, 29% 수율).
실시예 10
본원에서 이미 기재한 바에 따라, 상기 제조된 바이사이클 펩티드-약물 콘쥬게이트의 생체내 결합 친화력을 MT1-MMP에 대해 측정하였다. 결과는 다음과 같다.
Figure pat00060
모든 경우에서, 바이사이클 펩티드의 결합 친화력이 MMAE에 대한 후속 콘쥬게이션에도 유지된다는 것을 알 수 있다.
실시예 11
마우스 및 인간 혈청에서 BT17BDC-53의 혈장 안정성을 연구하였다. 콘쥬게이트는 마우스와 인간 혈청 모두에서 안정한 것으로 나타났다 (4μm 농도에서 50 시간 초과의 T1/2). 상기 안정성은, 펩티드가 3개의 티오에테르 연결부에 의해 스캐폴드에 연결된 대응 콘쥬게이트의 안정성보다 약간 더 큰 것으로 보인다.
실시예 12
상기 제조한 바이사이클 펩티드 약물 콘쥬게이트의, 종양에 대한 생체내 효능을 다음과 같이 평가하였다.
HT1080 종양 세포를, 5% CO2 및 공기의 대기 중 37℃에서 10% 가열 불활성화된 소 태아 혈청으로 보충한 EMEM 매질 중에 단층 배양물로서 생체 내 유지시켰다. 상기 종양 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 일주일에 2회 관례적으로 계대 배양하였다. 급속 생장 상태로 생장하는 세포를, 종양 접종을 위해 채취 및 계수하였다.
종양 발달을 위해 0.2 ml의 PBS 중 HT1080 종양 세포 (% x 106)를, BALB/c 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 134mm2 에 이르렀을 때 39 마리의 동물을 무작위 선출하였다.
25mM 히스티딘 및 10% 수크로스를 함유하는 비히클 완충제 중에 0.03 mg/ml 로 BDC 화합물을 제형화하였다. 상기 제형물을 0.3, 1, 3 및 10 mg/kg으로 1주일에 2회 (biw) 투여하였다. 첫번째 투여일로부터 14일째 되는 날까지 종양 부피 및 체중을 측정하였다. 그 결과를 도 16 내지 20에 도시한다.
테스트된 콘쥬게이트 5개 모두 투여-의존성 종양 억제를 나타낸다는 결과가 나왔다. 3mg/kg 및 10mg/kg 투여량에서, 종양이 완전히 퇴치되는 것으로 보였다. BT17BDC53, 61 및 68 모두가 10mg/kg 까지 내성이 좋았다. BT17BDC62 는 약 5mg/kg 까지 내성이 있었다. BT17BDC59 는 3mg/kg 까지 내성이 있었다. 이는 BT17BDC53, 61 및 68 에 있는 N-말단 Sar10 스페이서의 존재가 콘쥬게이트의 전신 독성을 감소시킨다는 것을 시사한다.
상기 명세서에 언급한 모든 문헌은 본원에 참조로 혼입된다. 본 발명의 상기 기재된 양태 및 구현예의 다양한 개질 및 변이가, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고도 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정의 바람직한 구현예와 관련하여 기재되었지만, 특허청구 발명은 이러한 특정 구현예에 과도하게 한정되지 않아야 함을 이해할 것이다. 실제로, 본 발명을 수행하기 위한 상기 기재된 방식에 대한, 당업자에게 명백한 다양한 개질도 하기 특허청구범위 내에 들어가는 것이고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> BICYCLE THERAPEUTICS LIMITED <120> PEPTIDE LIGANDS FOR BINDING TO MT1-MMP <130> P5685PC00 <140> PCT/EP2017/083954 <141> 2017-12-20 <150> GB 1713560.9 <151> 2017-08-23 <150> GB 1622142.6 <151> 2016-12-23 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Dap" or "N-AlkDap" or "N-HAlkDap" <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Cys" or "Gln" or "Met" or "Ser" or "Thr" or "Gly" or "Ala" or "Ile" or "Leu" or "Pro" or "Val" <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Dap" or "N-AlkDap" or "N-HAlkDap" <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(13) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> /replace="Dap" or "N-AlkDap" or "N-HAlkDap" <220> <221> MISC_FEATURE 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Claims (37)

  1. MT1-MMP에 대한 특이성이 있는 펩티드 리간드로서, 시스테인, L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), N-베타-알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-AlkDap) 및 N-베타-할로알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-HAlkDap)에서 선택된 3개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서, 상기 3개 잔기는 적어도 두 개의 루프 서열(loop sequence) 및 분자 스캐폴드에 의해 분리되어 있으며, 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드의 Dap 또는 N-AlkDap 또는 N-HAlkDap 잔기와 함께 공유(covalent) 알킬아미노 연결부에 의해, 그리고 상기 3개 잔기가 시스테인을 포함하는 경우에는 상기 폴리펩티드의 시스테인 잔기와 함께 티오에테르 연결부에 의해 스캐폴드에 연결되어, 두 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되어 있고, 여기서, 상기 펩티드 리간드는 하기 화학식 II의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 리간드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염
    [화학식 II]
    Figure pat00061
    (서열번호 1)
    화학식 II에서,
    A1, A2, 및 A3는 독립적으로, 시스테인, L-2,3-디아미노프로피온산 (Dap), N-베타-알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-AlkDap), 또는 N-베타-할로알킬-L-2,3-디아미노프로피온산 (N-HAlkDap)이고, 단, A1, A2, 및 A3 중의 적어도 하나는 Dap, N-AlkDap 또는 N-HAlkDap이고;
    X 는 임의 아미노산 잔기를 나타내고;
    U는 N, C, Q, M, S 및 T로부터 선택되는 극성의 비하전된(uncharged) 아미노산 잔기를 나타내고,
    O 는 G, A, I, L, P 및 V로부터 선택되는 비극성(non-polar)의 지방족 아미노산 잔기를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, X1이 하기의 아미노산 중의 하나에서 선택되는 펩티드 리간드: Y, M, F 또는 V, 예컨대 Y, M 또는 F, 특히, Y 또는 M, 더욱 특히는 Y.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, U/O2는 U, 예컨대 N, 또는 O, 예컨대 G에서 선택되는 펩티드 리간드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X3 이 U 또는 Z에서 선택되고, 여기서, U는 N, C, Q, M, S 및 T에서 선택되는 극성의 비하전된 아미노산 잔기를 나타내고, Z는 D 또는 E에서 선택되는 극성의, 음으로 하전된 아미노산 잔기를 나타내고, 특히, 3 위치에 있는 U는 Q에서 선택되거나 또는 3 위치에 있는 Z는 E에서 선택되는 펩티드 리간드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X4는 J에서 선택되고, 여기서 J는 F, W, 및 Y에서 선택되는 비극성의 방향족 아미노산 잔기를 나타내는 펩티드 리간드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X10은 Z에서 선택되고, 여기서 Z는 D, 또는 E, 예컨대 D에서 선택되는 극성의, 음으로 하전된 아미노산 잔기를 나타내는 펩티드 리간드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, X11은 O에서 선택되고, 여기서 O는 G, A, I, L, P 및 V, 예컨대 I에서 선택되는 비극성의 지방족 아미노산 잔기를 나타내는 펩티드 리간드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II의 바이사이클은 하기 화학식 IIa의 화합물, 또는 하기 화학식 IIb의 화합물, 또는 하기 화학식 IIc의 화합물, 또는 하기 화학식 IId의 화합물, 또는 하기 화학식 IIe의 화합물인 펩티드 리간드:
    [화학식 IIa]
    -A1-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-A2-E-D-F-Y-Z-O-A3- (서열번호 6)
    (화학식 IIa에서, U, O, J 및 Z는 상기 정의한 바와 같다.)
    [화학식 IIb]
    -A1-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (서열번호 7)
    [화학식 IIc]
    -A1-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(서열번호 8)
    [화학식 IId]
    -A1-Y/M-N-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (서열번호 9)
    [화학식 IIe]
    -A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-07) (서열번호 2).
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II의 바이사이클은 하기에서 선택되는 서열을 포함하는 펩티드 리간드:
    -A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-07) (서열번호 2);
    -A1-M-N-Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-12) (서열번호 10);
    -A1-F-G-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-02) (서열번호 11);
    -A1-V-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-03) (서열번호 12);
    -A1-F-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-04) (서열번호 13);
    -A1-Y-N-E-Y-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-07-N057) (서열번호 14); 및
    -A1-Y-N-E-W-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-44-N002) (서열번호 15),
    예컨대,
    -A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-07) (서열번호 2); 및
    -A1-M-N-Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-12) (서열번호 10),
    특히,
    -A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3- (17-69-07) (서열번호 2)이고,
    가장 특히는
    서열번호 16: ((bAla)-Sar10-AA1(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)A2EDFYD(tBuGly)A3 로 표기되는 Dap 동족체;
    서열번호 17: AA1(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)A2EDFYD(tBuGly)A3 로 표기되는 Dap 동족체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, A1, A2 및 A3 중 둘은 Dap, N-AlkDap 또는 N-HAlkDap에서 선택되고, A1, A2 및 A3 중 세번째 것은 시스테인이고, 바람직하게는 A2는 시스테인인, 펩티드 리간드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, A1, A2 및 A3 은 각각 N-AlkDap 또는 N-HAlkDap 인, 펩티드 리간드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 타이로신 잔기가 페닐알라닌 잔기에 의해 대체되는, 펩티드 리간드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하기에서 선택되는 하나 이상의 개질을 추가로 포함하는 펩티드 리간드:
    N-말단 및/또는 C-말단 개질; 하나 이상의 비자연적 아미노산 잔기로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체 (예컨대 하나 이상의 등배전자성(isosteric) 또는 등전자성(isoelectronic) 아미노산으로 하나 이상의 극성 아미노산 잔기를 대체; 기타 비자연적 등배전자성 또는 등전자성 아미노산으로 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 대체); 스페이서 기 (spacer group)의 추가; 하나 이상의 내산화성 아미노산 잔기로 하나 이상의 산화 감수성 아미노산 잔기를 대체; 알라닌으로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체; 하나 이상의 D-아미노산으로 하나 이상의 L-아미노산 잔기를 대체; 바이사이클릭 펩티드 리간드 내의 하나 이상의 아미드 결합의 N-알킬화; 대리 결합(surrogate bond)으로 하나 이상의 펩티드 결합을 대체; 펩티드 주쇄 길이의 개질; 다른 화학 기로 하나 이상의 아미노산 잔기의α-탄소 상의 수소를 치환; 및 적합한 아민, 티올, 카르복실산 및 페놀-반응성 시약으로 시스테인, 라이신, 글루타메이트 및 타이로신과 같은 아미노산을 합성후 생물 직교성(bioorthogonal) 개질.
  14. 제13항에 있어서, 적합한 아미노-반응성 화학을 사용하는 N-말단 개질 및/또는 적합한 카르복시-반응성 화학을 사용하는 C-말단 개질을 포함하는, 펩티드 리간드.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, N-말단 개질이, 주효 기(effector group)의 콘쥬게이션 및 바이사이클릭 펩티드의 역가 유지를 용이하게 하여 주는, Ala, G-Sar10-A 기 또는 bAla-Sar10-A 기와 같은 분자 스페이서 기를 표적체에 부가하는 것을 포함하는, 펩티드 리간드.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단 개질이 세포독성제의 부가를 포함하는, 펩티드 리간드.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1 위치 및/또는 9 위치의 아미노산에서의 개질을 포함하는, 펩티드 리간드.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 비자연적 아미노산 잔기로 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함하는, 펩티드 리간드.
  19. 제18항에 있어서, 비자연적 아미노산 잔기가 4 위치에서 치환되고, 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌; 3,4-디클로로페닐알라닌; 및 호모페닐알라닌에서, 예컨대 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌; 및 3,4-디클로로페닐알라닌에서 선택되고, 특히 1-나프틸알라닌인, 펩티드 리간드.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 비자연적 아미노산 잔기가 9 위치 및/또는 11 위치에서 치환되고, 9 위치에서 4-브로모페닐알라닌 또는 펜타플루오로-페닐알라닌 및/또는 11 위치에서 터트-부틸글라이신으로부터 선택되는, 펩티드 리간드.
  21. 제20항에 있어서, 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 9 위치에 존재하는 것이 4-브로모페닐알라닌에서 선택되는, 펩티드 리간드.
  22. 제20항에 있어서, 비자연적 아미노산 잔기, 예컨대 11 위치에 존재하는 것이 터트-부틸글라이신에서 선택되는, 펩티드 리간드.
  23. 제13항에 있어서, 1 위치의 아미노산 잔기가 D-알라닌과 같은 D-아미노산으로 치환하는, 펩티드 리간드.
  24. 제13항에 있어서, 5 위치의 아미노산 잔기가 D-알라닌 또는 D-아르기닌과 같은 D-아미노산으로 치환하는, 펩티드 리간드.
  25. 제18항에 있어서, 전술한 개질을 복수 개, 예컨대 하기의 개질 중 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 이상, 예컨대 하기의 5개 개질 모두를 포함하는 펩티드 리간드: 1 위치에서 D-알라닌 및/또는 5 위치에서 D-알라닌, 4 위치에서 1-나프틸알라닌, 9 위치에서 4-브로모페닐알라닌, 및 11 위치에서 터트-부틸글라이신.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II의 바이사이클은 인간, 마우스 및 개 MT1-MMP 헤모펙신 도메인의 높은 친화력 결합제인 펩티드 리간드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II의 바이사이클은 MT1-MMP에 대해 선택적이지만, MMP-1, MMP-2, MMP-15 및 MMP-16와 교차반응하지 않는, 펩티드 리간드.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 화학식 II의 아미노산 서열을 포함하는 직쇄 펩티드.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 리간드의 제조 방법으로서, 제25항에 기재된 펩티드를 제공하는 단계; 펩티드의 시스테인 및 디아미노프로피온산 또는 β-N-알킬디아미노프로피온산 잔기의 측쇄 -SH 및 아미노기와 함께 티오에테르 및 알킬아미노 연결부를 형성하기 위해 적어도 3개의 반응 자리를 갖는 스캐폴드 분자를 제공하는 단계; 및 상기 펩티드와 상기 스캐폴드 분자 사이의 상기 티오에테르 및 알킬아미노 연결부를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 하나 이상의 주효 기 및/또는 관능 기에 콘쥬게이트된, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 리간드를 포함하는 약물 콘쥬게이트(drug conjugate).
  31. 제30항에 있어서, 주효 기 및/또는 관능 기가 세포독성제 또는 금속 킬레이터를 포함하는 약물 콘쥬게이트.
  32. 제31항에 있어서, 세포독성제가 디술파이드 결합과 같은 절단가능한 결합에 의해 바이사이클릭 펩티드에 연결되어 있는 약물 콘쥬게이트.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 세포독성제가 DM1 또는 MMAE로부터 선택되는 약물 콘쥬게이트.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 콘쥬게이트가 하기의 구조를 갖는 약물 콘쥬게이트:
    Figure pat00062

    상기에서, R1, R2, R3 및 R4는 수소 또는 C1-C6 알킬 기를 나타내고;
    톡신은 본원에 정의된 임의 적합한 세포독성제를 나타내고;
    바이사이클은 본원에 정의된 임의 적합한 바이사이클릭 펩티드를 나타내고;
    n은 1 내지 10에서 선택된 정수를 나타내고;
    m은 0 내지 10에서 선태괸 정수를 나타낸다.
  35. 제34항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4 모두가 H이거나; 또는 R1, R2, R3 모두가 H이고 R4 = 메틸이거나; 또는 R1, R2 = 메틸이고 R3, R4 = H이거나; 또는 R1, R3 = 메틸이고 R2, R4 = H 이거나; 또는 R1, R2 = H이고 R3, R4 = C1-C6 알킬인, 약물 콘쥬게이트.
  36. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 콘쥬게이트가 하기의 구조를 갖는 약물 콘쥬게이트:
    Figure pat00063
  37. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 콘쥬게이트가 하기의 구조를 갖는 약물 콘쥬게이트:
    Figure pat00064

    상기에서, (Alk)는 화학식 CnH2n 의 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이고, 여기서 n은 1 내지 10이다.
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