KR20210038592A

KR20210038592A - 유전자 인코딩된 이환형 펩타이드 라이브러리

Info

Publication number: KR20210038592A
Application number: KR1020217005287A
Authority: KR
Inventors: 라트미르 데르다; 라자 무케르지; 비비안 트리아나
Original assignee: 더 거버너스 오브 더 유니버시티 오브 알버타
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2021-04-07
Also published as: SG11202100721SA; EP3827116A4; AU2019310359A1; JP2021531295A; CA3106722A1; EP3827116A1; WO2020019072A1; US20210340525A1

Abstract

본 발명은 펩타이드 작제물을 포함하는 이환형 펩타이드 복합체에 관한 것이고, 상기 작제물은 (i) 유리 말단 (N 또는 C)을 갖는 폴리펩타이드; (ii) 선택적으로, 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산; (iii) 상기 폴리펩타이드에 부착된 2배 대칭 링커 (TSL) 화합물을 포함하되, 상기 링커는 공유결합을 통해 폴리펩타이드의 말단 및 펩타이드의 적어도 2개의 별개의 측쇄에 부착된다. 본 발명은 또한 라이브러리, 및 복합체의 제조 방법 및 그를 사용하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

유전자 인코딩된 이환형 펩타이드 라이브러리

본원은 수용체-리간드 상호작용 및 분자 인식의 분야에 속한다. 더 상세하게는, 본원은 이환형 펩타이드 라이브러리, 이환형 펩타이드의 라이브러리를 생성하는 방법, 및 다양한 검정에서 그와 같은 라이브러리의 용도에 관한 것이다.

소분자의 라이브러리의 생성 및 관심 표적에 독특하게 결합하는 이들 분자의 선택은 약물 발견에 중요하다. 각각의 라이브러리 구성원이 정보 주형, 예컨대 DNA 또는 RNA에 연결된 유전자 인코딩된 라이브러리의 생산은 개별 라이브러리 구성원을 개별 용액 및 반응 용기로 분리하지 않고 큰 화학적 라이브러리를 처리할 수 있게 한다. 유전자 인코딩된 분자의 혼합물로부터 표적 분자를 선택하고, 그의 정보 주형을 사용하여 선택된 관심 분자를 확인 또는 증폭시킬 수 있다.

분자내 공유 결합을 함유하고 이환형 토폴로지를 나타내는 펩타이드는 단환형 또는 선형 펩타이드보다 단백질분해 및 다른 형태의 분해에 더 안정한 것으로 알려져 있다. 이들은 또한 단백질 표적과의 더 강한 결합 상호작용을 나타내는 것으로 알려져 있으며; 상호작용의 증가는 선형 또는 환형 시스템에 비해 한정된 이환형 시스템의 감소된 형태 페널티로 인한 것으로 가정된다.

파아지 디스플레이(phage display)는 펩타이드 및 단백질의 유전자 인코딩된 라이브러리의 분석, 디스플레이 및 생산에 사용되는 잘 알려진 기술의 한 예이다(Scott 등, 1990). 파아지 디스플레이는 파아지가 그 표면 상에 인간 항체와 같은 상이한 펩타이드 또는 단백질을 노출 또는 "디스플레이"하도록 만들어지는 과정이다. 유전공학을 통해, 관심 펩타이드 또는 단백질은 파아지 세포 표면 단백질 분자 (보통 유전자 III 단백질 또는 g3p)에 개별적으로 부착된다. 이러한 파아지 집단(파아지 라이브러리)에서, 각각의 파아지는 g3p의 상이한 융합 펩타이드 또는 단백질에 대한 유전자를 운반하고, 이를 그의 표면 상에 노출시킨다. 다양한 선택 절차를 통해, 관심 특정 표적 분자에 결합제를 "디스플레이"하는 파아지를 확인하고 단리할 수 있다. 이들 결합제는 단백질의 새로운 기능 또는 기능의 기전을 결정하기 위한 단백질의 상호작용 파트너, 항원을 인식하고 이에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 진단 및 치료 표적화에 사용하기 위한), 및 단백질-DNA 상호작용과 관련된 단백질 (예컨대, 신규한 전사 인자)을 포함할 수 있다.

파아지 디스플레이는 약제학적 및/또는 진단 폴리펩타이드의 발견 및 개발에 매우 유용할 수 있다. 파아지 디스플레이에서, 전체 파아지는 고정화된 표적 분자에 결합하여 이로부터 용출될 수 있다. 파아지는 감염성으로 남아있기 때문에, DNA를 박테리아 세포에 주입할 수 있고 증폭된다. 파아지 디스플레이 방법은 보통 직접적인 DNA-RNA-단백질 정보 전달에 의해 인코딩될 수 있는 라이브러리의 생산에 제한된다. 이들 방법은 전형적으로 이황화물 결합을 통해 가교된 단지 20개의 천연 아미노산 또는 환형 펩타이드로 만들어진 펩타이드의 선형 서열로 제한된다.

RNA 및 리보솜 디스플레이는 정보 주형 상에 천연-제조 펩타이드의 디스플레이를 허용하는 당업계에 공지된 다른 기술이다. RNA에 부착된 펩타이드의 라이브러리의 증폭은 라이브러리를 생성 또는 재증폭하기 위해 시험관내 번역 시스템을 필요로 한다. Suga 등 (US20100168380 A1)은 RNA 서열에서 비천연 아미노산을 인코딩함으로써 N-메틸 아미노산 및 다른 특수 (비표준) 아미노산을 포함하는 환형 펩타이드의 제조를 교시한다. RNA에서 이환형 펩타이드의 직접 인코딩 및 단독으로 번역에 의한 이환형 라이브러리의 생산의 예는 없다.

화학적 번역후 변형 (cPTM)을 통해 펩타이드로부터 유래된 분자의 인코딩된 디스플레이의 변형에 의해 파아지, DNA 또는 RNA 상에 이환형 펩타이드의 라이브러리를 생성하거나 이환형 펩타이드를 디스플레이하는 것이 공지되어 있다. 전형적으로, 이들 방법은 펩타이드에 대한 유기 합성을 사용하여 펩타이드 유도체를 제조한다. 전체 펩타이드 라이브러리는 균일한 화학적 변형에 의해 변형될 수 있는 것으로 알려져 있다. 변형된 라이브러리로부터의 선택 및 DNA의 서열분석은, 변형된 펩타이드 유도체가 제조될 수 있는 펩타이드 서열을 산출한다. 펩타이드의 라이브러리, 파아지-디스플레이된 폴리펩타이드의 라이브러리 및 RNA-디스플레이된 폴리펩타이드의 라이브러리를 펩타이드 유도체의 라이브러리로 전환시키는 것을 포함하는 몇몇 방법이 존재한다.

Suga 등은 시스테인(Cys) 및 펩타이드 사슬에 동시에 포함된 3개의 상이한 비-단백질원성 아미노산, Cab, Aha, 및 Pgl를 사용하여 RNA 상에 표시된 이환식 펩타이드를 합성하기 위한 방법을 기재한다. 제1 고리화는 Cab의 클로로아세틸기와 Cys 내의 설프하이드릴 기 사이에서 번역 인시투(in situ)에서 발생하였고, Aha-Pgl의 측쇄 상의 제2 고리화를 Cu(I)-촉매화 아자이드-알킨 고리화부가를 통해 수행하였다. (J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (23), pp 7232-7234). Hartman 및 동료는 2개의 Cys, 및 비단백질성 아미노산, 아지도호모알라닌(AzHA) 및 p-에티닐 페닐알라닌(F-yne)을 조합하는 상이한 접근법을 사용하였다(ACS Chem. Biol. 2017, 12, 795-804). 시스테인을 디브로모-m-자일렌으로 가교시킴으로써 발생되는 제1 고리화 및 AzHA-F-yne의 측쇄 상의 제2 고리화를 Cu(I)-촉매화 아지드-알킨 고리화부가를 통해 수행하였다. Aha, Pgl, F-yne과 같은 비천연 아미노산(UAA)의 발현은 특화된 비천연 번역 시스템을 필요로 하며; 파아지 디스플레이와 같은 디스플레이 시스템에서 다수의 비천연 측쇄의 발현은 UAA의 혼입 효율을 저하시키는 것이 어렵다. 따라서, 천연 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드를 사용하는 방법을 개발하는 것이 관심 대상이다.

미국 특허 공개 WO2004/077062에서, 환형 및 이환형 펩타이드의 라이브러리를 생성하기 위해 대칭 링커에 의해 물 중의 천연 아미노산 잔기로 제조된 복수의 비보호된 펩타이드를 변형시키는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 3개의 티올 반응성 기를 갖는 다른 3중 대칭 링커로 확장될 수 있지만, 이러한 높은 대칭성을 갖는 이러한 링커의 수는 제한된다. 종래 기술의 예(WO2009098450A2, WO2004077062, WO2011018227A2) 및 피어 검토 문헌(Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 502-507; Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 1602-1606)에는 황 함유 측쇄 및 3개의 동일한 반응성 기를 갖는 3배 대칭 연결기 화합물, 예컨대 트리스-(브로모메틸) 벤젠 (TBMB)으로 제한된 바이사이클의 합성이 기재되어 있다. 보다 낮은 대칭성(2배)의 링커에 의한 이환형 펩타이드의 제조는 이러한 선행 기술로부터 명백하지 않다. 천연 아미노산으로 만들어진 복수의 비보호 펩타이드를 변형시키기 위해 2-배 대칭 링커를 사용하는 선행 기술의 예는 단환형 펩타이드의 생산에 제한된다 (ACS Chem. Biol. 2016, 11, 1422-1427; J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 5880-5883; Bioconj. Chem. 2016, 27, 509-514; Chem. Sci. 2016, 7, 3785-3790; Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 5539-5545).

넓은 화학적 다양성 공간에 접근하고 목적하는 화학적 또는 생물학적 특성을 갖는 바이사이클을 발견할 가능성을 최대화하기 위해 보다 낮은 대칭 링커, 예컨대 2-배 대칭 링커를 사용하는 라이브러리를 생성하는 것이 관심 대상이다. 비보호된 펩타이드에 저-대칭 변형을 적용하는 것이 보고되었지만, 당해 분야의 모든 실시예는 비보호 펩타이드의 변형에 적용될 때 저 대칭의 링커가 이환형 펩타이드의 복합 혼합물을 생성한다는 것을 입증한다. Heinis 및 동료 (Nature Chemistry 2018, 10, 715)는 구체적으로 아미노산 측쇄와 반응하는 2-배 대칭 링커의 사용이 다중 이환형 구조의 복합 혼합물을 생성한다는 것을 입증한다. 이러한 혼합물은 크로마토그래피 기술 또는 다른 기술에 의해 분리될 수 없다. Liu, Heinis 등은 측쇄의 변형에 적용된 2배 대칭 링커가 생성물의 복잡한 혼합물을 생성한다는 것을 입증한다(Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 4458) 및 비천연 측쇄를 갖는 특화된 아미노산은 이러한 이질성 혼합물의 생성을 피하기 위해 사용되어야 한다. 이들 및 다른 실시예는 일반적으로 2배 이하의 대칭성의 개질제가 펩타이드에서 3개 이상의 유사한 반응성 기를 개질하는데 사용될 때, 이러한 반응이 생성물의 제어되지 않은 복합 혼합물을 생성한다는 것이 잘 이해된다는 것을 강조한다.

바이사이클 펩타이드를 합성하기 위한 특화된 방법은 하기 인자 중 하나 이상의 사용을 요구하는 방법에 의해 공지되어 있다: (i) 천연 아미노산에서 발견되지 않는 특화된 반응성 기를 함유하는 아미노산, (ii) 아미노산에 대한 보호기, (iii) 유기 합성을 위한 고형 지지체, (iv) 유기 용매 및 (v) 생체분자, 예컨대 DNA, RNA 및 생체분자 복합체, 예컨대 파아지와 상용성이 아닌 반응 조건. 보호기가 없고 천연 아미노산으로 만들어진 펩타이드의 변형을 포함하는 이환형 펩타이드의 합성을 위한 저-대칭 링커의 사용의 예는 나타나지 않는다. 이러한 방법은 매우 다양한 유전자 인코딩된 이환형 구조의 합성에 대한 방해되지 않은 경로를 제공할 수 있기 때문에 관심 대상이다.

미국 특허 공보 WO2009098450 A3에서, 3배 대칭 링커를 갖는 파아지 상에 디스플레이된 유전자 인코딩된 펩타이드 라이브러리의 변형을 위한 방법이 기재된다. 상기 방법은 유리 아미노 말단을 갖는 이환형 펩타이드의 라이브러리를 생성하고, 티올 반응성 기를 갖는 3배 대칭 링커의 사용을 요구한다. 홀수(여기서는 3개)의 시스테인을 갖는 파아지 라이브러리를 생성하는 어려움은 당업계에 공지되어 있다.

선행 기술에 기재된 상기 방법은 각각 유리 아미노 말단을 갖는 이환형 펩타이드의 라이브러리를 생성하는 것으로 여겨진다. 이 말단은 단백질분해 절단에 민감한 것으로 알려져 있다. 유리 N-말단 없이 다환형 펩타이드를 생성하는 방법은 공지되어 있지만, 이러한 방법은 N-클로로아세틸 (ClAc) 기를 함유하는 비-단백유전체 아미노산을 혼입하는 것을 필요로 한다. 천연 아미노산으로부터 차단된 N-말단을 갖는 유전자 인코딩된 이환형 라이브러리를 제조하는 방법은 공지되어 있지 않다.

이러한 배경 정보는 본 발명과 관련될 수 있는 것으로 여겨지는 알려진 정보를 만들기 위해 제공된다. 전술한 정보 중 어느 것도 본 발명에 대한 종래 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것이 반드시 의도되지도 않고 해석해서는 안 된다.

일반적인 용어에서, 본 발명은 펩타이드 또는 다중 펩타이드 (라이브러리)를 링커로 변형시켜서 만들어진, N-말단 잔기를 갖지 않는 이환형 펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 펩타이드 또는 펩타이드 라이브러리는 비보호된 천연 단백유전체 아미노산을 포함하거나 그것으로 구성된 폴리펩타이드를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 유전자 인코딩된 펩타이드 라이브러리를 링커로 변형시켜서 만들어진, N-말단 잔기를 갖지 않는 유전자 인코딩된 이환형 펩타이드 라이브러리를 포함한다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 유전자 인코딩된 펩타이드 작제물을 포함할 수 있다:

(a) 폴리펩타이드;

(b) 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 선택적으로 폴리펩타이드를 유일하게 확인하는 확인 태그 및; 및

(c) 제1 말단 반응성 기 (A) 및 2개의 반응성 기 (B2, B2)를 포함하는 제2 말단을 갖는 링커를 폴리펩타이드에 부착하여 수득한 이환형 구조로서, 제1 말단은 공유결합에 의해 상기 폴리펩타이드의 말단에 결찰되고, 및 상기 링커 제2 말단의 반응성 기 둘 다는 공유결합에 의해 상기 폴리펩타이드의 측쇄 잔기에 부착되는, 이환형 구조.

일부 구현예에서, 링커는 2개의 제2 말단 반응성 기는 동일하다는 점에서 2배 대칭을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 말단은 N-말단이고, 측쇄 잔기 각각은 시스테인, 라이신 또는 티로신이다. 대안적으로, 폴리펩타이드 말단은 C-말단이고, 측쇄 잔기 각각은 시스테인, 라이신 또는 티로신이다. 링커 제1 말단 반응성 기는 이때 산성 pH에서 C-말단, 예컨대 C-말단-선택적 광산화환원탈카복실화 공액 첨가에 고유 반응성을 갖는 기이다 (Org. Lett., 2015, 17, 4830-4833 및 Nature Chemistry 2018, 10, 205-211). 일부 구현예에서, 링커 제1 말단 반응성 기는 알데하이드 반응성 기, 예컨대 옥심, 하이드라진, 2-아미노 벤즈아미독심, 포스포늄 일라이드, 황 일라이드, 질소 일라이드 또는 알데하이드와 반응성이 있고 수성 환경에서 안정한 것으로 알려진 임의의 다른 탄소 친핵체 및 카베노이드 시약을 포함한다.

일부 구현예에서, 링커 제2 말단 반응성 기는 티올, 아민 또는 페놀과 반응하는 친전자성 기이다. 티올-반응성 기의 예는 할로케톤, 할로아세트아미드, 할로벤질, 말레 이미드를 포함하는 공액 C-C 이중 결합을 포함하는 마이클 수용체, 아크릴레이트, 카보닐아크릴 시약, 3-아릴프로피올로니트릴, 알렌아미드 플루오로아렌, 클로로테트라진, 줄리아-코시엔스키-유사 시약, 2-아지도아크릴레이트, 유기금속 팔라듐 시약, 유기 금(I) 시약, 티올의 데하이드로알라닌 (Dha)으로의 전환 후 Dha로의 공액 첨가, 물 중 티올 잔기와 특이적으로 반응하는 임의의 다른 방법이다. 물 중 라이신 아민 잔기와 특이적으로 반응하는 기의 예는 예컨대 N-하이드록시석신이미드 에스테르, 아릴 에스테르, 퍼플루오로아릴 에스테르, 퍼플루오로아렌, 케텐, 오르토-프탈알데하이드 변형-방출 아민 개질제 또는 물 중 라이신 아민 잔기와 특이적으로 반응하는 다른 기이다. 티로신 또는 다른 방향족 측쇄와 반응하는 기의 예는 금(I) 촉매작용, 선택적 루테늄-(II)-촉매된 C-H 활성화, 물 중 아릴 아이오다이드에 의한 팔라듐 (II) 아세테이트 촉매된 C-H 활성화 하에 티로신 또는 다른 방향족 측쇄의 반응하는 기의 예는 알릴팔라듐 (J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 1080-1081), 디아조디카복실레이트 (J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1523-1525), 디아조늄 염, 아닐린-포름알데하이드 헤미아미날, 로듐 카베노이드, 디로듐 메탈로펩타이드 촉매, 망간-촉매된 C-H 알키닐화, 와서(Waser) 시약, 1-[(트리이소프로필실릴)에티닐]-1,2-벤즈아이오독솔-3(1 H)-온 (TIPS-EBX), 및 티로신 잔기의 페놀을 특이적으로 변형시키기 위해 당업계에서 알려진 다른 시약 (Biochemistry 2017, 56, 3863-3873)이다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 2개의 시스테인 잔기 및 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하되, 상기 N-말단 세린 또는 트레오닌은 먼저 링커 제1 말단 반응성 기와의 반응을 위해 선택적 산화에 의해 알데하이드로 전환되고, 링커 제2 말단 반응성 기는 시스테인 잔기에 공유결합된다.

일부 구현예에서, 복합체는 상기 폴리펩타이드를 외부에 보유하고 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 파아지 입자와 같은 담체에 부착될 수 있다. 대안적으로, 복합체는 폴리펩타이드를 보유하고; 그리고 상기 폴리펩타이드를 인코딩하고 폴리펩타이드에 연결된 RNA 서열을 포함하는 RNA 디스플레이 화합물일 수 있다. 대안적으로, 복합체는 DNA 디스플레이 화합물일 수 있고, 상기 DNA 디스플레이는 상기 폴리펩타이드를 보유하고; 그리고 상기 폴리펩타이드를 인코딩하고 상기 폴리펩타이드에 연결된 DNA를 포함한다. 대안적으로, 복합체는 확인 태그 예컨대 또 다른 펩타이드와 함께 중합체 또는 단백질 담체에 연결된 폴리펩타이드일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 파아지 디스플레이 복합체를 제조하는 방법을 포함할 수 있고, 상기 방법은 (i) 말단을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 파아지 입자를 제공하는 단계, (ii) 제1 말단 반응성 기 및 2개의 반응성 기를 포함하는 제2 말단을 갖는 링커를 제공하고, 링커 제1 말단 반응성 기를 폴리펩타이드 말단과 결찰시킴으로서 중간 복합체를 형성하여 공유결합을 형성하는 단계 ("결찰 단계"), 및 (iii) 상기 링커 제2 말단의 반응성 기 둘 다를 상기 폴리펩타이드의 측쇄 잔기에 반응시킴으로써 중간 복합체로부터 이환형 구조를 형성하는 단계 ("이중고리화(bicyclization) 단계")를 포함한다. 결찰 단계 및 이중고리화 단계는 바람직하게는 독립적이고 순차적인 단계이고/거나, 바람직하게는 상이한 pH에서 수행된다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 말단은 N-말단이고 결찰 단계 전에 알데하이드 ("산화 단계")로 산화되고, 그리고 결찰 단계는 산성 pH의 수성 완충액에서 N-말단 알데하이드를 포함하는 폴리펩타이드를 링커와 혼합시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 결찰 단계 후에 생성된 중간 복합체는 산성 pH, 바람직하게는 약 pH 5 미만의 수성 완충액에서 예컨대 크기-배제 정제, 예를 들어 겔 여과 또는 투석에 의해 정제된다.

일부 구현예에서, 정제되었을 수 있는 중간 복합체는 이중고리화 단계 전에 환원제 예컨대 TCEP ("환원 단계")로 환원된다. 그 다음, 환원된 중간 복합체는 알칼리성 pH (> 7)에 노출되어 이중고리화를 유도할 수 있고, 제2 말단 반응성 기 각각은 폴리펩타이드에서 2개의 시스테인 잔기 와 반응하는 티올-반응성 기를 포함한다.

일부 구현예에서, 펩타이드는 변형되어 제1 사이클 및 직교 반응성 디케톤 기를 도입한다. 그 다음, 디케톤 기는 제2 사이클을 생성하는 반응을 수행하기 위해 사용될 수 있다 (이중고리화 반응). 제1 사이클 및 디케톤 기를 함유하는 중간 복합체는 1,3 디케톤일 수 있는 디케톤의 반응성의 악화 없이 정제되고 보관될 수 있다. 그 다음 중간 복합체는 생체적합성 수성 조건에서 1,3-디케톤 및 하이드라진의 고유 반응성을 사용하는 많은 반응에 적용될 수 있다.

일부 구현예에서, 1,3-디케톤 작용기는 중성 수성 조건 (약 pH 7 내지 약 pH 8)에서 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 펩타이드를 1,5-디클로로펜타디온-2,5과 반응시킴으로써 도입되어 1,3-디케톤 작용기를 갖는 단환형 펩타이드를 형성한다.

일부 구현예에서, 제2 환형 구조는 1,3-디케톤 작용기를 함유하는 단환형 펩타이드를 하이드라진 작용기 및 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 대해 독특한 반응성을 갖는 작용기를 함유하는 분자와 조합함으로써 형성된다. 이들 분자 사이의 반응은 1,3-케톤 작용기와 펩타이드의 말단 사이의 연결을 형성하여 펩타이드에서 제2 사이클을 형성한다. 대안적으로, 하이드라진은 1,3-디케톤과 반응하여 새로운 작용기 또는 반응성 기를 제공할 수 있고, 이는 이어서 선형 링커에 의해 펩타이드의 N- 또는 C- 말단에 연결될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 화학 반응 단계 후에 반응의 수율을 측정하는 방법을 포함할 수 있고, 상기 방법은 복합체 또는 폴리펩타이드를 미반응된 폴리펩타이드에 반응하지만 반응된 폴리펩타이드에 반응하지 않는 포획 시약에 노출시키는 단계 및 친화성 시약으로 포획제의 혼입을 측정하는 단계를 포함한다. 포획제는 친화성 시약과 쌍을 이루는 반응성 기 및 친화성 핸들을 포함한다. 친화성 핸들-친화성 시약 쌍은 결합 쌍의 정량화를 허용하도록 충분히 높은 특정 결합을 갖는 것으로 알려진 임의의 친화도 리간드 짝짓기를 포함할 수 있다. 예시적인 쌍은 바이오틴-스트렙타비딘, FLAG 펩타이드-항FLAG 항체, 설폰아미드-탄산탈수효소, 메토트렉세이트-데하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR)를 포함한다. 바람직하게는, 친화성 핸들 또는 친화성 시약은 고형 지지체, 예컨대 아가로스 비드에 고정된다.

일부 구현예에서, 포획제 반응성 기는 알데하이드 반응성 기 예컨대 아미노옥시 기, 또는 티올 반응성 기 예컨대 아이오도아세트아미드이다.

일부 구현예에서, 측정된 반응은 산화 단계이고, 이 단계는 산화 단계 후에 파아지 또는 복합체를 아미노옥시바이오틴 (AOB)에 노출되어 알데하이드로 산화된 N-말단 기와 반응, 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, 반응된 복합체를 보유하기 위한 스트렙타비딘 비드의 첨가, 및 보유되지 않은 파아지의 수와 비교하여 스트렙타비딘 비드 상에 보유된 파아지의 수의 차이 측정하여 산화 단계의 수율 (알데하이드 기를 획득한 파아지 입자의 분획)을 결정한다.

일부 구현예에서, 측정된 반응은 결찰 단계이고, 이 단계는 결찰 단계 전에 및/또는 후에 파아지 또는 복합체를 아미노옥시바이오틴 (AOB)에 노출, 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, 결찰되지 않은 알데하이드 기를 갖는 파아지 또는 복합체를 보유하기 위해 스트렙타비딘 비드의 첨가, 및 보유되지 않은 파아지의 수와 비교하여 비드 상에 보유된 파아지 입자의 수의 차이 측정하여 결찰 단계의 수율 (알데하이드 기를 잃은 파아지 입자의 분획)을 결정한다.

일부 구현예에서, 측정된 반응은 환원 단계이고, 이 단계는 환원 단계 전에 및/또는 후에 파아지 또는 복합체를 바이오틴-아이오도아세트아미드 (BIA)에 노출, 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, 티올 기를 노출시키도록 환원된 파아지 또는 복합체를 보유하도록 스트렙타비딘 비드의 첨가, 및 보유되지 않은 파아지의 수를 비교하여 비드 상에 보유된 파아지 입자의 수의 차이 측정하여 환원 단계의 수율 (환원 단계 동안 티올 기를 획득한 파아지 입자의 분획)을 결정한다.

일부 구현예에서, 측정된 반응은 이중고리화 단계이고, 이 단계는 이중고리화 단계 전에 및/또는 후에 파아지 또는 복합체를 바이오틴-아이오도아세트아미드 (BIA)에 노출, 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, 미반응된 티올 기를 갖는 파아지 또는 복합체를 보유하기 위해 스트렙타비딘 비드의 첨가, 보유되지 않은 파아지의 수와 비교하여 비드 상에 보유된 파아지 입자의 수를 측정하여 이중고리화 단계의 수율 (이중고리화 단계 동안 티올 기를 잃은 파아지 입자의 분획)을 결정한다. 대안적으로, 파아지 또는 복합체는 이중고리화 단계 전후에 벤질클로라이드 (또는 다른 티올 반응성 기)와 반응하는 바이오틴-티올 (BSH)에 노출될 수 있고, (ii) 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, (iii) 스트렙타비딘 비드의 첨가, (iv) 포획 후에 남아 있는 파아지 입자의 수를 측정하여, 스트렙타비딘 비드 상에 보유된 파아지의 수는 이중고리화 단계의 수율 (이중고리화 단계 동안 티올-반응성 기를 잃은 파아지 입자의 분획)을 구성한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 각각이 본 명세서에서 기재된 바와 같은 링커를 갖는 이환형 구조를 형성하는 복수의 상이한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 리간드의 유전자 인코딩된 라이브러리를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 폴리펩타이드 P1 및 P2는 DNA 서열에 의해 별도로 인코딩된다. 복수의 상이한 폴리펩타이드는 동일 또는 상이한 링커로 변형될 수 있다. 각 링커는 고유 확인 태그, 예컨대 침묵 유전자 바코드와 관련될 수 있다.

라이브러리는 본 명세서에 기재된 복합체의 라이브러리를 생성함으로써 생성된 유전자 인코딩된 혼합된 복합체의 라이브러리를 형성하도록 함께 풀링될 수 있다. 혼합된 라이브러리는 각각 적어도 2개의 상이한 링커 (L1, L2)로 별도로 변형되어 적어도 4개의 별개의 복합체 (P1L1, P1L2, P1L2, 및 P2L2)를 형성하는 적어도 2개의 상이한 펩타이드 서열 (P1 및 P2)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 L1은 미리 정의된 핵산 코드 B1과 관련된 2개의 펩타이드와 반응될 수 있고 링커 L2는 미리 정의된 핵산 코드 B2를 함유하는 2개의 펩타이드와 반응된다. 핵산 코드는 침묵 유전자 바코드, 예컨대 WO2016061695-A1에 기재된 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 기재된 복합체를 확인하는 방법을 포함하되, 폴리펩타이드 이환형 구조는 리간드에 결합할 수 있고, 상기 방법은 (i) 상기 복합체의 라이브러리를 상기 리간드와 접촉시키는 단계, 및 (ii) 상기 리간드에 결합하는 복합체를 선택하는 단계, (iii) 폴리펩타이드 및/또는 링커의 구조를 인코딩하는 핵산을 서열분석하여 결합 복합체의 구조를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체의 라이브러리는 상기에 기재된 바와 같이 적어도 4개의 별개의 이환형 구조, P1L1, P1L2, P1L2, P2L2를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 SPCQRGHMFC 또는 SYCKRAHKNC를 포함하는 폴리펩타이드 및 TSL6을 포함하는 링커로부터 형성된 이환형 복합체를 포함하는 노달(Nodal) 길항제 펩타이드를 포함한다.

본 발명, 뿐만 아니라 다른 측면 및 추가로 그의 특징을 더 잘 이해하기 위해, 설명과 함께 본 명세서의 일부를 형성하는 도면을 참조한다
도 1a는 펩타이드, 링커 및 인코딩 독립체 예컨대 DNA 또는 RNA를 갖는 담체의 개략적인 묘사를 도시한다.
도 1b는 다양한 펩타이드의 파아지 라이브러리로부터 시작되는 이중고리화 과정의 개념적 개요를 도시한다.
도 1c는, 담체가 C-말단 (왼쪽)에 그리고 N-말단 (오른쪽)에 위치한 폴리펩타이드를 반응시키는 2개의 반응식를 도시한다. 도 1d는 도 1c의 계속이다.
도 2는 링커 TSL1 및 TSL2에 의한 화학 이중고리화 및 2개의 상이한 침묵 유전자 바코드 TCT 및 AGT를 갖는 상이한 링커의 동시 인코딩의 도식을 도시한다.
도 3은 반응성 기 A 및 B로서 N-말단 세린 및 벤질클로라이드 상에 옥심의 형성을 사용하는 링커의 특정 예를 도시한다.
도 4a는 링커 TSL1 (1), TSL3 (2) 및 TSL6 (3)을 도시한다. 서열 1 내지 6은 이들 링커가 반응하여 이환형 구조를 형성할 수 있는 가변성 펩타이드이다.
도 4b는 링커 TSL1에 대한 합성식을 도시한다.
도 4c는 링커 TSL3 및 TSL6에 대한 합성식을 도시한다.
도 5a는 TSL6에 의한 산화된 펩타이드 SHCVWWDC의 변형을 도시한다. 도 5b는 도 5a의 계속이다.
도 6은 TSL6에 의한 환원된 펩타이드 SVCFDNGC의 변형을 도시한다.
도 7a는 중간 길이 (3개의 탄소 원자)의 링커에 의한 이환 변형을 도시하고, 한편 도 7b는 짧은 링커 (하나의 탄소 원자)에 의한 이환 변형을 도시한다.
도 8a는 TSL-6 (6개의 탄소 원자 링커)에 의한 SFCDWYGC 변형을 도시한다. 도 8b는 TSL-6에 의한 SLCFDNGC 변형을 도시한다. 도 8c는 TSL-6에 의한 SHDCYEC 변형을 도시한다. 도 8d는 TSL-6에 의한 SWDYRECYLEC 변형을 도시한다. 도 8e는 TSL-6에 의한 SWCDYRC 변형을 도시한다. 도 8f는 TSL-1에 의한 SHCVWWDC 변형을 도시한다. 도 8g는 TSL-3에 의한 SHCVWWDC 변형을 도시한다.
도 9a는 바이사이클 SHCVWWDC-TSL6를 도시한다. 도 9b는 한 달 동안 실온에서 pH 4 7 및 8.5의 완충 배지에서 복합체의 안정성을 입증하는 그래프를 도시한다.
도 10a는 37℃에서 우태 혈청 (FBS)에서 인큐베이션에 대한 도 9a에 도시된 바이사이클의 안정성을 도시한다. 혼합물은 이온-선택적 LCMS에 의해 분석되었다. 바이사이클 이온의 강도는 37℃에서 FBS에서 인큐베이션의 3 일 (~70 시간) 후에도 줄어들지 않는 반면, 90% 이황화물 SHCVWWDC 펩타이드는 <5 시간 후 분해된다. 도 10b는 37℃에서 Pronase^TM 프로테아제 혼합물에서 인큐베이션에 대한 바이사이클의 안정성을 도시한다. 선형, 이황화물 및 TSL-1 및 TSL-6 링커로부터 만들어진 2개의 바이사이클 화합물은 지적된 기간 (최대 5 시간) 동안 Pronase^TM와 함께 인큐베이션되었다. 반응은 희석되고 이온 선택적 MS-UPLC에 의해 분석되었다. 숫자는 소화 5 시간 후에 남아 있는 온전한 화합물의 %를 나타낸다.
도 11은 2개의 상이한 분해 조건에서 수많은 이환형 펩타이드 조성물의 안정성을 도시한다.
도 12는 TSL6를 사용하는 펩타이드의 파아지 라이브러리의 변형의 개략적인 묘사를 도시한다.
도 13 및 도 14는 TSL1, TSL3 또는 TSL6 링커를 사용하는 큰 파아지 라이브러리 SxCxxxxxxC의 변형의 도식적 예를 도시하고 임의의 라이브러리 및 임의의 링커 기하학에 대한 이러한 접근법의 일반성을 도시한다.
도 15a 및 15b (15a의 계속)는 펩타이드의 2개의 별개의 위치에서 도입된 링커의 두 절반에 해당하는 분자를 이용하는 이중고리화의 예를 도시한다: 첫 번째 절반은 펩타이드 말단과의 반응에 의해 도입되고 두 번째 절반은 상기 펩타이드의 2개의 측쇄와의 반응에 의해 도입된다. 정제될 수 있었던 중간 복합체는 링커의 두 절반의 반응인 고리화를 거치도록 유도된다.
도 16a는 이환형 펩타이드 라이브러리의 스캐폴드를 도시한다. 도 16b는 펩타이드의 파아지 디스플레이된 라이브러리의 변형 및 이 라이브러리로부터 표적에 결합하는 이환형 펩타이드의 선택에 의한 유전자적으로 인코딩된 이환식 라이브러리의 생산을 나타내는 3개의 패널 A, B 및 C를 도시한다.
도 17은 노달에 의해 유도된 알려진 신호전달 이벤트를 억제하는 이환형 구조 능력을 보여주는 4개의 패널을 도시한다.

일 측면에서, 본 발명은 이환형 펩타이드 라이브러리를 합성하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 2개의 별개의 변형 단계를 포함한다. 제1 단계는 수성 환경에서 결찰 화학을 통해 링커의 제1 말단을 담체 상 디스플레이된 펩타이드의 말달에 결찰시킴으로써 중간 복합체를 생성하는 단계를 포함한다. 펩타이드 말단은 N 또는 C 말단일 수 있다. 선택적인 정제 단계 후, 제2 단계는 중간 복합체를 반응 조건에 노출하여 분자내 이중고리화 반응을 유도하는 것을 포함하고, 링커의 제2 말단에 있는 2개의 반응성 기는 각각 독립적으로 펩타이드 서열에서 아미노산의 측쇄와 반응한다.

일부 구현예에서, 이환형 펩타이드 담체는 파아지, mRNA, DNA, 리보솜, 박테리아, 효모, 합성 중합체 예컨대 PEG 또는 폴리스티렌으로 만들어진 비드 또는 당업계에서 알려진 임의의 다른 유전자 인코딩된 생물학적 디스플레이 기술 또는 합성 인코딩된 펩타이드 라이브러리 기술을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 상이한 화학 조성의 랜덤 펩타이드 라이브러리를 인코딩하는 유전자 서열의 디스플레이 세트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 서열의 디스플레이 세트는 예를 들어 랜덤 돌연변이유발에 의해 생성될 것과 같은 상이한 화학 조성의 펩타이드 서열의 집중적인 하위-세트를 인코딩하는 집중적인 유전적 라이브러리를 포함한다.

유전자 서열의 디스플레이 세트는 특정 링커와 쌍을 이룰 수 있고, 이로써 제2 세트는 링커 분자, 예컨대 상이한 크기 또는 조성의 링커, 또는 입체이성질체, 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체인 링커의 화학 구조와 연결된다.

2개의 단계―결찰 및 이중고리화― 중 하나 또는 둘 다는 펩타이드의 화학적 또는 효소적 변형일 수 있다. 일부 구현예에서, 두 변형은 N-말단 또는 특정 N- 말단 아미노산 및 펩타이드 내의 아미노산의 별개의 세트에 특이적인 화학적 접합 기술이다. 결찰을 위해 사용된 화학적 변형은, 예를 들어, 산화된 N-말단 세린에서 옥심의 형성을 초래할 수 있다. 결찰은 당업계에서 알려진 다른 N-말단 또는 C-말단 특정 화학을 이용할 수 있다.

펩타이드 및 링커를 갖는 담체의 도식 표현은 도 1a에 도시된다. N- 또는 C-말단일 수 있는 펩타이드 말단 Z는 링커 L 제1 말단 A와 반응한다. 펩타이드는 링커의 제2 말단 상에서 2개의 작용기 B1 및 B2와 반응하는 반응성 측쇄 X1 및 X2를 갖는다. 링커 L은 지방족 사슬을 포함할 수 있고, 또한 에스테르, 페닐, 아민 등을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 말단 A는 먼저 펩타이드 말단 Z와 결찰되어 도 1a에서 확인된 선형 중간 복합체를 생성하고, 이어서 이중고리화된다. 결찰 반응은 비티히(Wittig) 반응과 같은 탄소-탄소 결합 형성 공정을 통해 산화된 세린 (옥살로일)을 변형시키는 반응을 포함할 수 있다. 이중고리화 단계의 하나의 바람직한 구현예는 시스테인의 알킬화 또는 특정 위치에서 펩타이드 또는 단백질을 변형시키는 임의의 다른 적합한 방법을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 도 1c 및 1d에 도식적으로 보여진 바와 같이, 제 1 단계는 제 1 고리를 형성하고 동시에 독특한 반응성 기를 도입하는 디케톤과의 반응을 포함한다. 디케톤은 바람직하게는 1,3 디케톤이다. 이 반응에서 형성된 중간체 단환형 펩타이드는 독특하게 안정하고, 반응성 기의 어떠한 열화도 없이 정제 및 저장될 수 있다. 이어서, 디케톤 기를 갖는 중간체 단환형 펩타이드는 1,3-디케톤-반응성 기, 예컨대 한쪽 말단에 알킬 또는 아릴 히드라진, 및 다른 쪽 말단에 펩타이드의 말단과의 화학적 또는 효소-촉매된 결찰을 거쳐 제2 고리의 형성을 유도할 수 있는 다른 기를 포함하는 링커 분자와 반응될 수 있다 ("이중고리화"). 펩타이드 말단에서의 결찰이 먼저 일어나서, 선형 중간체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 디케톤과의 반응이 먼저 일어나서, 분지된 중간체를 생성할 수 있다.

예를 들어, 서열에 2개의 내부 시스테인 잔기를 갖는 디스플레이 펩타이드는 알칼리성 pH, 예를 들어 약 pH 8 또는 9에서 1,5-디클로로펜타디온-2,4와 반응하여 1,3-디케톤 기를 펩타이드에 도입할 수 있다. 1,3-디케톤 기는 이후 알킬 또는 아릴 하이라진을 포함하는 링커와 반응할 수 있고, 이는 펩타이드의 N-말단과의 후속 이중고리화 반응을 완료하는 작용기를 도입한다. 예를 들어, 1,3-디케톤 기를 함유하는 상기 펩타이드는 N-말단에서 변형되어 하이드라진 링커를 도입한 후, N- 말단의 하이드라진과 측쇄에 결찰된 1,3-디 케톤 사이의 분자내 반응을 통해 이중고리화될 수 있다. 대안적으로, N-말단 반응성 기를 함유하는 링커가 산성 pH에서 1,3-디케톤과 반응하는 경우, 반응의 순서가 역전된다. 이어서, 중성 pH에서의 말단의 산화 및 산성 pH 4.5로의 환경의 변화는 N-말단과의 반응을 통해 이중고리화를 촉발한다.

모든 경우에, 2개의 단계―결찰 및 이중고리화―는 서로 독립적인 조건에서 일어나는 것이 바람직하다. 이러한 독립성은 중간 생성물의 정제를 허용하고 부반응을 최소화한다. 일부 구현예는 상이한 pH 값을 필요로 하는 반응의 사용을 포함한다. 예를 들어, 산화된 N-말단 세린에서의 옥심의 형성은 산성 pH, 약 pH 3에서 일어나고, 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)에 의해 촉매될 수 있다. 이들 조건은 파아지-디스플레이된 라이브러리 및 다른 유전자 인코딩된 펩타이드 라이브러리 예컨대 RNA-디스플레이된 라이브러리에 의해 용인된다. 후속적인 이중고리화 반응은 더 높은 pH에서 일어나는 아미노산의 측쇄와의 임의의 분자간 반응일 수 있다. 적합한 반응은 티올과 티올 반응성 기 예컨대 할로벤질, 할로아세트아미드, 친핵성 방향족 치환, 또는 접합된 알켄 및/또는 알렌아미드에 대한 티올의 마이클 첨가 사이의 친핵성 치환을 포함할 수 있다. Lys, Tyr의 측쇄 잔기 또는 다른 아미노산 측쇄 잔기와 함께 알칼리성 pH에서 일어나는 다른 알려진 반응도 사용할 수 있다.

대안적인 구현예에서, 결찰 및 이중고리화 단계는 보호-탈보호 반응의 사용을 통해 분리된다. 예를 들어, 비티히 반응을 통한 산화된 N-말단 세린에서의 C-C 결합의 형성은 약 pH 7 내지 약 pH 8에서 일어난다. 비티히 반응이 티올 잔기를 보호하는 S-S 이황화물를 교란시키지 않는 것으로 알려져 있다. 비티히 반응은 파아지-디스플레이된 라이브러리 및 다른 유전자 인코딩된 펩타이드 라이브러리 예컨대 RNA-디스플레이된 라이브러리에 의해 용인된다. 결찰 및 정제 후, 이중고리화 반응은 이황화물의 환원 및 티올과 티올 반응성 기 사이의 결찰에 의해 촉발되고, 이는 약 pH 7 내지 약 pH 8에서 일어날 수 있다. 비티히 결찰 반응에 사용되는 안정화된 일리드를 친핵성 치환, 친핵성 방향족 치환 또는 마이클(Michael) 첨가 또는 이중고리화 단계를 위한 다른 잘 알려진 반응을 위한 티올 반응성 기와 조합하는 많은 링커가 설계될 수 있다.

일부 구현예에서, 담체는 바람직하게는 가변 핵산 코드 식별자인 식별자를 포함한다. 식별자는 담체 외부에 보유되는 임의의 펩타이드를 인코딩하지 않도록 침묵할 수 있다. 대안적으로, 식별자는 식별자의 모든 변이체가 동일하거나 실질적으로 유사한 펩타이드를 인코딩하도록 할 수 있다. 이러한 후자의 경우, "침묵 바코딩(silent barcoding)" 기술로 지칭되며, 상기 방법은 박테리오파아지 입자 내부에 상이한 조성의 DNA를 함유하는 입자 상에 박테리오파아지 디스플레이 시스템을 생성하고 동일한 조성의 펩타이드를 디스플레이하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 담체는 게놈 내에 축퇴성 DNA 태그를 포함하는 가변 핵산 코드를 함유하는 동일한 외부 화학 조성의 바이러스 또는 박테리오파지 비리온이며, 이들 입자 내부에 포장된다. 바이러스 또는 파아지의 게놈은 비리온 코트 인코딩 영역에서 축퇴 코돈의 사용, 절제된 서열을 인코딩하는 DNA 서열의 변화, 발현된 단백질 서열을 인코딩하지 않는 DNA 서열의 변경 또는 비리온 코트에 혼입되지 않는 성분을 인코딩하는 DNA 서열 변경과 같은 비리온 코트의 화학적 조성의 변경을 생성하지 않는 방식으로 조작된다. 따라서, 다수의 담체 (예컨대 파지 또는 바이러스)를 포함하는 담체 라이브러리가 제공될 수 있으며, 여기서 모든 담체는 (변형, 예를 들어 임의의 리간드의 부착 전에) 외부에서 화학적으로 동일하지만, 그 안에 별개의 핵산 식별자를 함유한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 독특한 식별자, 바람직하게는, 특정 이환형 구조와 관련된 침묵 유전자 바코드를 사용하여 펩타이드 라이브러리의 유전자 인코딩된 변형을 선택하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 담체의 다중 라이브러리가 생성되고, 각각은 독특한 침묵 유전자 바코드를 보유하고, 각각은 폴리펩타이드를 표시한다. 그 다음 각 라이브러리는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 상이한 링커로 변형되어, 사용된 링커에 독특한 이환형 구조를 생성한다. 그 다음 라이브러리는 조합되어 혼합된 라이브러리를 생성하고, 각 링커-특이적 이환형 구조는 바코드에 의해 확인될 수 있다. 이어서, 혼합 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 서열 및 바이사이클 토폴로지를 갖는 펩타이드를 선택할 수 있으며, 이는 이어서 유전자 바코드를 서열분석함으로써 (또는 달리 식별자를 확인함으로써) 확인될 수 있다.

예를 들어, 도 2에 개략적으로 도시된 바와 같이, 제1 담체는 제1 침묵 핵산 코드 (바코드) 및 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열을 보유한다. 제2 담체는 제1 코드와 상이한 제2 침묵 핵산 코드, 및 제1 펩타이드와 동일하거나 상이할 수 있는 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열을 보유한다. 제1 담체 펩타이드는 제1 링커(TSL1)로 변형된 반면, 제2 담체는 상이한 링커(TSL2)로 변형된다. 결찰 및 이중고리화 후, 2개의 생성된 상이한 이환형 구조는 제1 및 제2 핵산 코드에 의해 구별가능하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약물 후보를 확인하는 방법을 포함할 수 있고, 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 유전자 인코딩된 이환형 펩타이드 혼합된 라이브러리를 준비하는 단계 및 추정 수용체 분자로 상기 라이브러리를 스크리닝하여 수용체 분자에 결합하는 이환형 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다. 이어서, 수용체에 결합하는 이환형 펩타이드는 침묵 핵산 코드 및 펩타이드를 인코딩하는 서열을 풍부하게 하고 서열분석함으로써 확인된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자 인코딩된 화학 이환형 펩타이드 라이브러리를 합성하는 방법을 포함할 수 있고, 상기 방법은 유전자 서열이 번역시 동일하거나 밀접하게 관련된 펩타이드 서열 ("링커")을 생성하도록, 펩타이드 링커를 인코딩하는 유전자 서열의 중복 세트를 기질 내의 다수의 독립적인 벡터 내로 삽입하는 단계; 펩타이드 ("라이브러리")의 다양한 세트가 번역시 발현되도록, 유전적으로 다양한 삽입물을 인코딩하는 제2 세트의 유전자 서열을 각각의 벡터 내로 삽입시키는 단계; 번역 생성물이 비-가변 링커를 포함하고 가변 펩타이드 라이브러리가 합성되도록 제1 및 제2 유전자 서열을 발현 및 증폭하는 단계; 및 각각의 펩타이드 라이브러리를 별개의 TSL에 의해 변형시키고 다수의 변형된 라이브러리를 조합하여 화학적 변형이 유전적으로 인코딩되는 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다.

US 특허 공개 2013/050083(Derda 등)의 전체 내용은 허용되는 경우 본원에 참조로 포함되는, 유전자 인코딩된 펩타이드 라이브러리의 화학적 변형의 정량화 방법 및 효과적인 변형을 위한 새로운 전략의 선택을 기재한다. 이들 방법은 반응에서 소비될 반응성 기의 존재 또는 부재에 기초하여, 본원에 기재된 반응성 단계 중 임의의 하나 또는 모두의 수율을 정량화하는데 사용될 수 있다.

파아지-디스플레이된 라이브러리에 대한 화학 번역후 변형의 유전적 인코딩의 기술은 PCT 특허 출원 번호 WO2016061695A1에 기재되어 있고, 그 전체 내용은 허용되는 경우 본 명세서에 참조로 포함된다.

실시예

본 명세서에 기재된 본 발명의 더 나은 이해를 얻기 위해, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시적인 목적임을 이해해야 한다. 따라서, 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다.

실시예 1 . 이중고리화를 위한 링커의 합성. 도 4a에서 나타낸 가교결합제 1 (TSL1), 2 (TSL3) 및 3 (TSL6)은 옥심 형성 및 시스테인 S-알킬화 화학을 기초로 설계되었다. 이들 반응은 생체직교성(bioorthogonality), 세정성(clean) 및 빠른 동역학을 갖는 고수율 반응을 포함한다. 합성 단계는 도 4b 및 4c에서 설명된다. 3개 사이의 차이는 주로 연결 사슬 내의 탄소 원자의 수이다.

실시예 2 . TSL6 링커에 의한 환원된 펩타이드 SHCVWWDC의 변형. 변형의 세부사항은 도 5a 및 5b에서 설명된다. 결찰 단계는 낮은 pH에서 일어난다. 알데하이드 단계에서 또는 결찰 후 정제는 크기 배제 칼럼에 의해 제공될 수 있다. 환원 단계에서 낮은 pH는 이중고리화 반응의 수율을 최대화한다. 환원 후 pH의 증가는 이환형 생성물을 깨끗하게 제공하고 LCMS에 의해 가시적인 미반응 출발 물질 또는 부산물을 제공하지 않는다. LCMS에 의한 특성화는 각 단계에서 모든 중간체의 동일성을 확인하였다.

실시예 3 . TSL6 링커에 의한 환원된 펩타이드 SVCFDNGC의 변형. 변형의 세부사항은 도 5에서 설명된다. 화학의 중요한 세부사항: 결찰 단계에서 낮은 pH. 알데하이드 단계에서 또는 결찰 후 정제는 크기 배제 칼럼에 의해 제공될 수 있다. 환원 단계에서 낮은 pH는 이중고리화 반응의 수율을 최대화한다. 환원 후 pH의 증가는 이환형 생성물을 깨끗하게 제공하고 LCMS에 의해 가시적인 미반응 출발 물질 또는 부산물을 제공하지 않는다. LCMS에 의한 특성화는 각 단계에서 모든 중간체의 동일성을 확인하였다.

실시예 4 . 몇 개의 TSL-링커에 의한 다양한 세트의 펩타이드의 변형. N-말단에 세린 잔기 및 다운스트림 위치에 2개의 시스테인을 갖는 일련의 펩타이드 서열을 선택하였다. 옥심 결찰 기반 화학을 사용하여 N-말단 세린의 과요오드산염 매개 산화로부터 생성된 옥소알데히드를 인식하고, 이후 가교결합 전략에 의해 2개의 시스테인을 포획하여, 결국 실시예 2 또는 3에 기재된 조건을 사용하여 형태적 강성 펩타이드 매크로바이사이클을 형성하였다. 도 8a 내지 8g에 기재된 바와 같이, 다수의 상이한 펩타이드에 대한 반응의 요약은 결찰 및 이중고리화 화학이 다양한 펩타이드 서열에서 효과적으로 일어난다는 것을 확인한다. 감소된 수의 원자를 갖는 TSL 링커에 의한 변형은 제2 고리의 생성된 크기가 단지 하나의 아미노산에 의해 형성된 경우에도 효과적으로 진행되었다(도 7b). 이들 결과는 펩타이드 루프의 크기에 대한 제약이 없어야 하고 TSL의 기하학에 대한 제약은 거의 없다는 것을 보여준다.

실시예 5 . 완충액 및 생물학적 배지에서 바이사이클의 안정성. TSL3 링커에 의한 변형에 의해 서열 SHCVWDC로부터 형성된 이환형 펩타이드를 실온에서 1개월 동안 pH 4, 7 및 8.5의 완충된 배지에서 인큐베이션하였다(도 9). 본 발명자들은 LCMS에서 어떠한 변화도 관찰하지 않았으며, 이는 이들 조건 중 임의의 것에서 바이사이클 생성물의 분해가 없음을 나타낸다. SCVCWDC-TSL3 바이사이클을 37℃에서 우태 혈청 (FBS)에서 인큐베이션하고, 바이사이클의 완전성을 LCMS에 의해 시험하였다. 이온-선택적 LCMS를 사용하여, 바이사이클은 37℃에서 FBS에서 3일의 인큐베이션 후에도 FBS 내에서 변하지 않고 유지된다. 대조적으로, 이온-선택적 LCMS는 환형 펩타이드 이황화물 SHCVWDC의 90%가 300분 후에 FBS에서 분해되었음을 입증하였다(도 10a).

또 다른 엄격한 안정성 테스트에서, 엔도- 및 엑소프로테아제 (프로나제)의 공격성 칵테일을 사용하여 선형 서열 SWDYRECYLEC, 그의 이황화물 유도체 및 TSL1 및 TLS6 링커로 변형된 상기 서열의 2개의 이환형 유도체를 분해하였다(도 10b). 37℃에서 5시간 인큐베이션한 후, 단지 0.4±0.1%의 선형 및 단지 0.9±0.4%의 선형 및 이황화물 펩타이드가 소화되지 않은 채로 남아 있다. 동일한 조건에서, 5시간의 단백질분해 소화 후, 68±14%의 TSL6-SWDYRECYLEC 바이사이클 및 82±13%의 TSL1-SWDyRECyLEC 바이사이클은 온전하게 유지된다(도 10b). 후자의 관찰은 TSL1-SWDYRECYLEC 바이사이클의 반감기 안정성을 ~24시간으로 추정한다.

도 11은 2개의 상이한 분해 조건에서 12개의 다른 이환형 펩타이드 조성물에서 이러한 관찰의 일반성을 입증한다. 도 11a는 변형에 사용되는 시약의 서열 및 단축 명칭을 설명한다 (TSL-1, TSL-3 및 TSL-6은 도 4a의 구조 1, 3 및 6에 상응한다). 글자와 숫자 표시는 제품을 설명하는데 사용된다. 도 11b는 36℃에서 5시간의 안정성의 시간-분해능 측정 및 5시간 후 안정성의 종점 측정의 예를 나타낸다. 도 11c는 2개의 상이한 단백질분해 조건: 프로나제 및 신선한 마우스 혈청에서의 종점 측정(36℃에서 5시간)을 요약한다. 도 11c 및 11d는 이환형 펩타이드의 안정성을 당업계에 공지된 환형 및 이환형 구조와 비교한다. 이러한 비교는 본원에 보고된 TSL-6 개질제에 의해 생산된 화합물 14f 및 TBMB 개질제에 의해 유사한 펩타이드 서열로부터 생산된 16j 공지-기술 화합물의 놀라운 명백하지 않은 이점을 보여준다(J. Med. Chem. 2018, 61 (7), 2823-2836). 이환형 화합물 14f는 16j보다 프로나제 처리에 대해 10배 더 안정하다. 13i와 13e 사이의 또 다른 비교는 또한 WO2014052650A2에 기재된 퍼플루오로 아렌을 통한 공지된 고리화와 비교할 때 TSL-6의 이점을 입증한다.

실시예 6 . 펩타이드의 파아지 디스플레이된 라이브러리의 변형 및 포획제에 의한 변형의 검증에 의한 유전자 인코딩된 바이사이클 라이브러리의 생산.

구조 SxCxxxC (여기서, S는 세린이고, C는 시스테인이고, x는 랜덤 아미노산임)를 갖는 펩타이드의 파아지 디스플레이된 라이브러리를 유전자 인코딩된 바이사이클 라이브러리의 생산을 위한 출발점으로서 사용하였다. 도 12는 TSL6 링커를 사용하는 이러한 파아지 라이브러리로부터의 클론의 변형의 예를 기재한다. 도 13 및 도 14는 TSL1, TSL3 또는 TSL6 링커를 사용하는 큰 파아지 라이브러리 SxCxxxXxC의 변형의 예를 기재하고, 임의의 라이브러리 및 임의의 링커 기하학에 대한 이러한 접근법의 일반성을 보여준다. 본 발명자들은 합성 펩타이드 서열에 대한 결찰에 최적화된 조건을 이용하였다: 구체적으로, 라이브러리를 PBS 중의 과요오드산나트륨의 빙냉 60 마이크로몰 용액에 8분 동안 노출시키고, 반응을 0.5 mM 메티오닌 용액을 첨가함으로써 켄칭시켰다. 산화된 라이브러리를 실온에서 1시간 동안 0.1% 수성 트리플루오로아세트산 중의 TSL6 링커의 1 mM 용액에 노출시켰다. 결찰된 라이브러리는 용리액으로서 pH 4 완충액을 사용하여 Zeba^TM Spin 탈염 칼럼, 7K MWCO와 같은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 정제된 라이브러리를 pH 4에서 TCEP에 노출시켜 이황화물 결합을 감소시켰다. 마지막으로, Tris 완충 매질을 용액에 첨가하여 pH를 8로 상승시키고 이중고리화를 촉진시켰다(도 13a). 반응의 각 단계는 포획 시약의 범위를 사용하여 효과적으로 모니터링될 수 있다(도 13b). 예를 들어, 산화 단계를 정량하기 위해, 본 발명자들은 산화된 라이브러리를 아닐린 아세테이트 완충액에서 아미노옥시바이오틴 (AOB)과 혼합하고, 스트렙타비딘-코팅된 비드에 노출 전 및 후에 파지의 역가를 측정하였다(도 13c, f). AOB 포획은 라이브러리의 73%가 산화됨을 입증하였다. 파아지 집단의 10%만이 TSL6에 노출된 후 AOB-반응성 알데하이드를 함유하였고, 이는 산화된 라이브러리의 87%가 TSL 6과 결찰됨을 나타낸다. 동일한 절차를 사용하여 반응성 기의 완전성을 시험할 수 있다. 예를 들어, AOB에 의한 변형 후 포획은 라이브러리가 TSL 링커 없이 0.1% TFA에서 인큐베이션되었을 때 알데히드가 반응성을 유지하는 것을 입증하였다(도 13f). 유사하게, BIA에 대한 노출 및 스트렙타비딘에 의한 포획("BIA 포획")은 티올의 수를 정량하는데 사용될 수 있고, BSH에의 노출에 이어서 스트렙타비딘에 의한 포획("BSH 포획")은 티올-반응성 벤질 클로라이드 기를 함유하는 라이브러리의 분획을 정량하는 데 사용될 수 있다. 결찰 후 및 이중고리화 후(도 13h), BIA로의 노출(도 13g)은 티올이 결찰 후 라이브러리에 존재하지만 이중고리화된 후 사라짐을 보여준다. 유사하게, BSH에 대한 노출을 사용하여 벤질 클로라이드 기의 존재 및 부재를 점검할 수 있다. BSH에 대한 노출은 또한 벤질 클로라이드 기의 완전성을 점검하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 결찰된 라이브러리의 pH 7로의 연장된 노출 또는 pH 7 완충액에서의 정제는 BSH-포획에 의해 결정된 바와 같이 벤질 클로라이드 기의 가수분해를 초래한다. 이 관찰을 사용하여 TSL6에 결찰된 라이브러리의 정제를 위한 특정 조건을 선택하였다. TSL7-변형된 라이브러리의 정제 및 완전성이 이러한 정량화 없이 어떻게 점검될 수 있는지는 명백하지 않다. 다른 펩타이드 크기 및 링커 크기의 최적화는 동일한 단계(도 11, 도 12)를 따르고, 동일한 관찰을 나타낸다.

실시예 7 : 서열에서 2개의 Cys 잔기를 갖는 합성 펩타이드 또는 파아지 표시된 펩타이드는 pH 8.5에서 1,5-디클로로펜타디온-2,4와 반응하여 1,3-디케톤 기를 펩타이드에 정량적으로 도입할 수 있다. 합성 펩타이드에서, LCMS는 다중 다양한 펩타이드 서열에서 반응의 완료를 확인한다. 파아지 상에 디스플레이된 파아지 라이브러리에서, 1,3-디케톤 변형된 생성물과 하이드라진-바이오틴과의 반응, 그 다음 스트렙타비딘 비드에 의한 포획은 표시된 펩타이드에서 1,3-디케톤의 존재를 확인한다. 이어서, 펩타이드 또는 파아지 표시된 펩타이드 중 1,3-디케톤 기는 제어된 조건 예컨대 암모늄 아세테이트 완충액 pH 4.5에서 알킬 또는 아릴 하이드라진으로 변형될 수 있다(도 15a). 이러한 반응성은 작용기, 예컨대 N-말단과의 반응 및 후속 단계에서의 이중고리화를 완료하는 알데히드-반응성 일라이드를 도입하기 위해 사용될 수 있다(도 15b). 예를 들어, 1,3-디케톤기를 함유하는 상기 펩타이드는 N-말단에서 변형되어 알데하이드를 도입할 수 있고, 환경이 산성 pH로 변하면 N-말단의 하이드라진과 측쇄에 결찰된 1,3-디케톤 사이의 분자내 반응을 통해 이중고리화를 유도할 것이다(도 15b 우측 경로). 또 다른 예에서, N-말단 반응성 기를 함유하는 링커가 산성 pH에서 1,3-디케톤과 반응하는 경우 반응의 순서가 역전될 수 있다. 중성 pH에서 말단의 산화는 N-말단과의 반응을 통해 이중고리화를 유발한다(도 15b 좌측 경로).

실시예 8 : 펩타이드의 파지 디스플레이된 라이브러리의 변형 및 이 라이브러리로부터 표적에 결합하는 이환형 펩타이드의 선택에 의한 유전자 인코딩된 바이사이클 라이브러리의 생산. 대표적인 인간 단백질 노달: 유전자은행: BC104976.1을 사용하여 스크리닝 단계를 수행하였다; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002, 99 (26), 16899-16903에 기재된 전체 서열. 구체적으로, Proteintech에서의 헥사히스티딘-태깅된 노달 (His-노달) 카탈로그 번호 ag21882의 BC104976에 의해 인코딩된 40-338 아미노산 서열 PLAYMLSLY[..]VLLDHHKD을 사용하였다. 선택은 파아지 디스플레이된 라이브러리의 선택을 위해 알려진 기술을 이용하였고, 임의의 다른 표적을 위해 쉽게 수행될 수 있다. TSL-6-변형된 SXCX6C의 스크리닝, 패닝 및 검증의 결과는 도 13에 도시된다.

니트릴로트리아세트산 (NTA)으로 관능화된 아가로스 비드 상에 고정된 표적을 TSL-6 (6-탄소) 링커로 변형된 혼합된 이환형 라이브러리를 사용하여 패닝하였다(도 16b-a). 킹피셔 듀오(KingFisher Duo) 상에서 비드를 세척한 후, 비드를 수중에서 비등시켜 노달을 방출시키고 결합된 리간드/파지를 PCR 및 증폭을 거쳤다. 3 라운드의 선택 후에, 원하는 수렴이 관찰되었다: R1 및 R2 라이브러리와 비교할 때, 라운드 3(R3)에서의 바이사이클 라이브러리는 아가로스 비드 상에 고정된 노달 상에 특이적으로 농축되었다. 블랭크 비드 또는 대조군 His-태깅된 표적을 갖는 비드에서 농축은 관찰되지 않았다. 중요하게는, 노달-변형된 비드 상에 패닝된 비변형된 R3-라이브러리는 농축을 나타내지 않았고, 이는 선택된 펩타이드 서열이 이환형 스캐폴드로 구속될 때에만 노달에 결합하는 것을 확인한다(도 16a). 각 라운드의 선택으로부터의 dsDNA 앰플리콘을 Illumina NextSeq를 사용하여 서열분석하였고, 정보학 분석은 다수의 서열(도 16b) 및 적어도 3개의 계열의 서열 모티프(도 16c)가 노달에 대한 잠재적인 리간드임을 제안하였다. 노달에 결합하는 펩타이드 서열의 목록을 표 1에 나타내었다.

예상된 리간드의 결합 능력을 입증하기 위해, 노달에 의해 유도된 알려진 신호전달 이벤트를 억제하기 위해 바이사이클의 능력을 시험하였다. 구체적으로, 배아 암종 P19 세포에서 효과기 단백질 Smad2의 노달-유도된 인산화를 검출하기 위해 항-포스포 Smad 항체와 함께 웨스턴 블랏을 이용하였다. 도 17a는, 2.5% 우태 혈청 (FBS) + 7.5% 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 1시간 동안 100 ng/mL 노달에 의한 P19 세포의 처리가 pSmad2 강도의 증가를 유도함을 기재하고 있다. P19 세포가 100 ng/mL 노달 및 알려진 키나제 억제제 SB-431542와 함께 인큐베이션될 때 pSmad의 노달-유도된 증가는 폐기된다. 유사하게, 100 ng/mL 노달 및 100 μM의 이환형 펩타이드 2 (SPCKAGTGQC), 3 (SPCKGPSATC), 4 (SPCKGRHHNC), 5 (SPCKKAHGAC), 7 (SPCQRGHMFC) 및 11 (SYCKRAHKNC)에의 공동 처리는 배경 수준 초과로 pSmad2 인산화를 증가시키지 않는다. 이환형 펩타이드는 100 마이크로몰 농도에서 노달의 길항제로서 역할을 한다. 도 17b는, 6개의 이환형 펩타이드로부터 2개만이 10 uM 농도에서 효능을 유지함을 기재하고 있다: 바이사이클 7 (SPCQRGHMFC) 및 11 (SYCKRAHKNC)은 pSmad2 인산화을 억제하는 반면, 바이사이클 2, 3, 4, 및 5는 10 uM 농도에서 pSmad2 인산화를 억제하지 않는다. 도 17c-d는 바이사이클 7 및 11의 용량-반응을 기재하고 노달 신호전달의 길항작용에 대한 절반-억제 농도가 1 내지 3 uM임을 시사한다.

SPCQRGHMFC-TSL6 및 SYCKRAHKNC-TSL6 및 유도체 화합물은 암종 세포에서의 단백질 노달의 신호전달 기능을 길항시키는 능력을 갖는다. SPCQRGHMFC-TSL6 및 SYCKRAHKNC-TSL6의 유도체 화합물은 이들 화합물의 유사한 구조 특징을 보유하고 노달 단백질의 기능을 길항시키는 유사하거나 향상된 능력을 나타내는 것이다. 유일한 알려진 노달 길항제 펩타이드는 항-인간 노달 단클론성 항체 3D1이다 (WO2016057683A2). 노달을 길항시킬 수 있는 소분자 화합물은 SB431542(도 17에서 SB로 나타냄) 및 이의 유도체를 포함한다. 그러나 이들 화합물은 노달과 상호작용하지 않고 노달의 다운스트림에서 작용하는 ALK5, ALK4 및 ALK7 키나제의 억제제이다.

참조문헌

본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자의 기술 수준을 나타내며, 허용되는 경우, 각각의 개별 공보, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.

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Claims

제1 말단 및 2개의 반응성 기를 포함하는 제2 말단을 갖는 링커를 폴리펩타이드에 부착하여 생성된 이환형 구조를 포함하는 펩타이드 작제물로서, 상기 제1 말단은 공유결합에 의해 상기 폴리펩타이드의 말단에 결찰되고, 상기 링커 제2 말단의 반응성 기 둘 모두는 각각 상기 폴리펩타이드의 측쇄 잔기에 반응하는, 펩타이드 작제물.
청구항 1에 있어서, 상기 2개의 제2 말단 반응성 기는 동일한, 작제물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 폴리펩타이드 말단은 N-말단이고, 상기 측쇄 잔기는 시스테인, 라이신 또는 티로신인, 작제물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 반응성 기는 티올, 아민 또는 페놀에 대해 반응성인 친전자성 기인, 작제물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 제1 말단은 알데하이드 반응성 기 예컨대 옥심, 하이드라진, 2-아미노 벤즈아미독심, 포스포늄 일라이드, 황 일라이드, 질소 일라이드 또는 알데하이드와 반응성이 있고 수성 환경에서 안정한 것으로 알려진 임의의 다른 탄소 친핵체 및 카베노이드 시약을 포함하는, 작제물.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 2개의 시스테인 잔기 및 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하되, 상기 N-말단 세린 또는 트레오닌은 먼저 선택적 산화에 의해 알데하이드로 전환되고 상기 제2 말단 반응성 기는 상기 시스테인 잔기에 공유결합되는, 작제물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 외부에 보유하고 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 파아지 입자와 같은 담체에 부착되는, 작제물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, RNA 디스플레이 화합물이되, 상기 RNA 디스플레이는 상기 폴리펩타이드를 보유하고; 그리고 상기 폴리펩타이드를 인코딩하고 상기 폴리펩타이드에 연결된 RNA 서열을 포함하는, 작제물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, DNA 디스플레이 화합물이되, 상기 DNA 디스플레이는 상기 폴리펩타이드를 보유하고; 그리고 상기 폴리펩타이드를 인코딩하고 상기 폴리펩타이드에 연결된 DNA를 포함하는, 작제물.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드 말단은 C-말단이고, 상기 측쇄 잔기는 시스테인 또는 라이신이고, 그리고 상기 링커 제1 말단은 산성 pH에서 C-말단에 대한 반응성을 갖는 반응성 기를 포함하고 상기 링커 제2 말단은 티올 또는 아민 잔기와 특이적으로 반응하는 2개의 친전자성 기를 포함하는, 작제물.
청구항 10에 있어서, 상기 산성 pH에서 C-말단에 대한 반응성을 갖는 반응성 기는 C-말단-선택적 광산화환원탈카복실화 공액 첨가인, 작제물.
청구항 4 또는 10에 있어서, 상기 링커 친전자성 기는 물 중 티올, 예컨대 할로케톤, 할로아세트아미드, 할로벤질, 말레 이미드를 포함하는 공액 C-C 이중 결합을 포함하는 마이클(Michael) 수용체, 아크릴레이트, 카보닐아크릴 시약, 3-아릴프로피올로니트릴, 알렌아미드 플루오로아렌, 클로로테트라진, 줄리아-코시엔스키-유사 시약, 2-아지도아크릴레이트, 유기금속 팔라듐 시약, 유기 금(I) 시약, 티올의 데하이드로알라닌 (Dha)으로의 전환 후 Dha로의 공액 첨가와 반응하는, 작제물.
청구항 4 또는 10에 있어서, 상기 링커 친전자성 기는 물 중 아민, 예컨대 N-하이드록시석신이미드 에스테르, 아릴 에스테르, 퍼플루오로아릴 에스테르, 퍼플루오로아렌, 케텐, 오르토-프탈알데하이드, 또는 변형-방출 아민 개질제와 반응하는, 작제물.
청구항 4 또는 10에 있어서, 상기 링커 친전자성 기는 금(I) 촉매작용, 선택적 루테늄-(II)-촉매된 C-H 활성화, 물 중 아릴 아이오다이드에 의한 팔라듐 (II) 아세테이트 촉매된 C-H 활성화 하에 물 중 페놀, 예컨대 알릴팔라듐, 디아조디카복실레이트, 디아조늄 염, 아닐린-포름알데하이드 헤미아미날, 로듐 카베노이드, 디로듐 메탈로펩타이드 촉매, 망간-촉매된 C-H 알키닐화, 와서(Waser) 시약, 1-[(트리이소프로필실릴)에티닐]-1,2-벤즈아이오독솔-3(1 H)-온 (TIPS-EBX) 와 반응하는, 작제물.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기에 의해 분리된 말단 세린 잔기 및 2개의 시스테인 잔기를 포함하는, 작제물.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 사슬을 포함하는, 작제물.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 천연 단백유전체 아미노산만을 포함하고/거나 유리 N-말단을 포함하지 않는, 작제물.
파아지 디스플레이 복합체를 제조하는 방법으로서, (i) 말단을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 파아지 입자를 제공하는 단계 (ii) 제1 말단 및 2개의 반응성 기를 포함하는 제2 말단을 갖는 링커를 제공하고, 및 공유결합을 형성하기 위해 상기 링커 제1 말단을 상기 폴리펩타이드 말단으로 결찰시킴으로써 중간 복합체를 형성하는 단계, 및 (iii) 상기 링커 제2 말단의 반응성 기 둘 다를 상기 폴리펩타이드의 측쇄 잔기에 반응시킴으로써 중간 복합체로부터 이환형 구조를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 18에 있어서, 단계 (ii) 및 (iii)는 독립적이고 순차적인 것인, 방법.
청구항 18 또는 19에 있어서, 단계 (ii) 및 (iii)는 상이한 pH에서 수행되는, 방법.
청구항 18 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 말단은 N-말단이고 결찰 단계 전에 알데하이드로 산화되고, 그리고 상기 결찰 단계는 산성 pH의 수성 완충액에서 N-말단 알데하이드를 포함하는 폴리펩타이드를 링커와 혼합시키는 것을 포함하는, 방법.
청구항 18 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간 복합체는 산성 pH, 예컨대 약 pH 5 미만의 수성 완충액에서 예컨대 크기-배제 정제에 의해, 예컨대 겔 여과 또는 투석에 의해 정제되는, 방법.
청구항 22에 있어서, 상기 정제된 중간 복합체는 상기 이중고리화 단계 전에 환원제 예컨대 TCEP로 환원("환원 단계")되는, 방법.
청구항 23에 있어서, 상기 환원된 중간 복합체는 7 이상의 pH에 노출되어 이중고리화를 유도하되, 상기 제2 말단 반응성 기 각각은 티올-반응성 기를 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 2개의 시스테인 잔기를 포함하는, 방법.
청구항 18 내지 24 중 어느 한 항에 기재된 적어도 하나의 단계 후에 반응의 수율을 측정하는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드를 미반응된 폴리펩타이드에 반응하지만 반응된 폴리펩타이드에 반응하지 않는 포획 시약에 노출시키는 단계 및 친화성 시약으로 포획제의 혼입을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 25에 있어서, 상기 포획제는 친화성 시약, 예컨대 바이오틴-스트렙타비딘, FLAG 펩타이드-항FLAG 항체, 설폰아미드-탄산탈수효소, 메토트렉세이트-데하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR)와 쌍을 이루는 반응성 기 및 친화성 핸들을 포함하고, 바람직하게는 상기 친화성 핸들 또는 친화성 시약은 고형 지지체, 예컨대 아가로스 비드에 고정되는, 방법.
청구항 26에 있어서, 포획제 반응성 기는 알데하이드 반응성 기 예컨대 아미노옥시 기, 또는 티올 반응성 기 예컨대 아이오도아세트아미드인, 방법.
청구항 25 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단계는 (i) 산화 단계 후에 아미노옥시 바이오틴 (AOB)에 파아지의 노출, (ii) 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, (iii) 스트렙타비딘 비드의 첨가, (iv) 포획 후에 남아 있는 파아지 입자의 수를 측정하여, 스트렙타비딘 비드 상에 보유된 파아지의 수의 차이는 산화 단계의 수율(알데하이드 기를 획득한 파아지 입자의 분획)을 구성함 포함하는 청구항 21의 산화 단계인, 방법.
청구항 25 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단계는 (i) 결찰 단계 전후에 아미노옥시 바이오틴 (AOB)에 파아지의 노출, (ii) 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, (iii) 스트렙타비딘 비드의 첨가, (iv) 포획 후에 남아 있는 파아지 입자의 수를 측정하여, 스트렙타비딘 비드 상에 보유된 파아지의 수의 차이는 결찰 단계의 수율(알데하이드 기를 잃은 파아지 입자의 분획)을 구성함을 포함하는 청구항 21의 결찰 단계인, 방법.
청구항 25 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단계는 (i) 환원 단계 전후에 바이오틴-아이오도아세트아미드 (BIA)에 파아지의 노출, (ii) 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, (iii) 스트렙타비딘 비드의 첨가, (iv) 포획 후에 남아 있는 파아지 입자를 수를 측정하여, 스트렙타비딘 비드 상에 보유된 파아지 수의 차이는 환원 단계의 수율(환원 단계 동안 티올 기를 획득한 파아지 입자의 분획)을 구성함을 포함하는 청구항 23의 환원 단계인, 방법.
청구항 25 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단계는 (i) 이중고리화 단계 전후에 바이오틴-아이오도아세트아미드 (BIA) 또는 바이오틴-티올 (BSH)에 파아지의 노출, (ii) 상기 반응을 적어도 한 자릿수로 희석, (iii) 스트렙타비딘 비드의 첨가, (iv) 포획 후 남아있는 파아지 입자의 수를 측정하여, 상기 스트렙타비딘 비드 상에 보유된 파아지의 수는 이중고리화 단계의 수율(이중고리화 단계 동안 티올 기를 잃은 파아지 입자의 분획)을 구성함을 포함하는 청구항 24의 이중고리화 단계인, 방법.
청구항 1에 기재된 이환형 구조를 형성하는 복수의 상이한 펩타이드 서열을 포함하는 리간드의 유전자 인코딩된 라이브러리.
청구항 32에 있어서, 적어도 2개의 펩타이드 P1 및 P2는 DNA 서열에 의해 별도로 인코딩되는, 라이브러리.
청구항 33에 있어서, 적어도 2개의 상이한 펩타이드 서열 P1 및 P2를 포함하되, 이들 각각은 적어도 2개의 상이한 링커 L1 및 L2로 별도로 변형되어 적어도 4개의 별개의 작제물 P1L1, P1L2, P1L2, 및 P2L2를 형성하는, 라이브러리.
청구항 34에 있어서, 링커 L1은 미리 정의된 핵산 코드 B1과 관련된 2개의 펩타이드와 반응하고 링커 L2은 미리 정의된 핵산 코드 B2와 관련된 2개의 펩타이드와 반응하는, 혼합 라이브러리.
청구항 35에 있어서, 상기 핵산 코드는 침묵 유전자 바코드인, 혼합 라이브러리.
리간드에 결합할 수 있는 청구항 1 내지 36 중 어느 한 항의 복합체를 확인하는 방법으로서, (i) 상기 복합체의 라이브러리를 상기 리간드와 접촉시키는 단계, 및 (ii) 상기 리간드에 결합하는 복합체를 선택하는 단계 (iii) 펩타이드 및/또는 링커의 구조를 인코딩하는 핵산을 서열분석함으로써 결합 복합체의 구조를 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 37에 있어서, 상기 복합체의 라이브러리는 청구항 34에 기재된 적어도 4개의 별개의 작제물 P1L1, P1L2, P1L2, P2L2를 포함하고, 상기 복합체는 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에서 청구되는 것과 같은, 방법.
SPCQRGHMFC 또는 SYCKRAHKNC를 포함하는 폴리펩타이드 및 TSL6을 포함하는 링커로부터 형성된 청구항 1의 복합체를 포함하는 노달(Nodal) 길항제 펩타이드.