JP2021531295A - 遺伝的にコードされた二環式ペプチドライブラリー - Google Patents

Abstract

本発明は、ペプチド構築物を含む二環式ペプチド複合体であって、前記構築物が、（ｉ）遊離末端（ＮまたはＣ）を有するポリペプチド；（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドをコードする核酸；（ｉｉｉ）リンカーが、共有結合を介してポリペプチドの末端およびペプチドの少なくとも２つの別個の側鎖に結合している、前記ポリペプチドに結合した２回対称リンカー（ＴＳＬ）化合物を含む、二環式ペプチド複合体に関する。本発明はまた、ライブラリー、および複合体を作製するための方法に関し、ならびにそれを使用してスクリーニングする方法に関する。

Description

本出願は、受容体−リガンド相互作用および分子認識の分野に関係する。より詳細には、本出願は、二環式ペプチドライブラリー、二環式ペプチドのライブラリーを産生するための方法、および様々なアッセイにおけるそのようなライブラリーの使用に関する。

小分子のライブラリーの生成および目的の標的に一意に結合するそれらの分子の選択は、創薬にとって重要である。各ライブラリーメンバーがＤＮＡまたはＲＮＡなどの情報テンプレートに連結されている遺伝的にコードされたライブラリーの産生により、個々のライブラリーメンバーを個々の溶液または反応容器に分離することなく、大きな化学ライブラリーを処理することが可能になる。遺伝的にコードされた分子の混合物から標的分子を選択し、その情報テンプレートを使用して、選択された目的の分子を識別または増幅することができる。

分子内共有結合を含有し、かつ二環式トポロジーを示すペプチドは、単環式または線状ペプチドよりもタンパク質分解および他の形態の分解に対してより安定であることが知られている。それらは、タンパク質標的とのより強い結合相互作用を示すことも知られており；相互作用の増加は、線状または環式システムと比較して、制約付き二環式システムのコンフォメーションペナルティが減少したためであると仮定される。

ファージディスプレイは、ペプチドおよびタンパク質の遺伝的にコードされたライブラリーの分析、ディスプレイ、および産生に使用されるよく知られた技術の一例である（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，１９９０）。ファージディスプレイは、その間にファージがその表面上にヒト抗体などの異なるペプチドまたはタンパク質を露出または「ディスプレイする」ように作製されるプロセスである。遺伝子工学により、目的のペプチドまたはタンパク質は、ファージ細胞表面タンパク質分子（通常は遺伝子ＩＩＩタンパク質またはｇ３ｐ）に個別に結合する。そのようなファージ集団（ファージライブラリー）では、各ファージは、ｇ３ｐの異なる融合ペプチドまたはタンパク質の遺伝子を運び、その表面上に露出している。種々の選択手順を通じて、目的の特異的な標的分子へのバインダーを「ディスプレイ」するファージを識別および単離することができる。これらのバインダーには、タンパク質の新しい機能または機能メカニズムを決定するためのタンパク質の相互作用パートナー、抗原を認識して結合するペプチド（例えば、診断および治療標的に使用するため）、ならびにタンパク質−ＤＮＡ相互作用に関与するタンパク質（例えば、新規の転写因子）が含まれ得る。

ファージディスプレイは、医薬品および／または診断用ポリペプチドの発見および開発に非常に有用であり得る。ファージディスプレイでは、ファージ全体が結合し、固定化された標的分子から溶出することができる。ファージは、感染性を維持しているため、そのＤＮＡを細菌細胞に注入して増幅することができる。ファージディスプレイ法は、通常、直接ＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質情報転送によってコードすることができるライブラリーの産生に制限されている。これらの方法は、典型的には、ジスルフィド結合を通して架橋された２０個の天然アミノ酸または環状ペプチドのみで作製されたペプチドの線状配列に限定される。

ＲＮＡおよびリボソームディスプレイは、情報テンプレート上に天然に作製されたペプチドのディスプレイを可能にする当技術分野で知られている他の技術である。ＲＮＡに結合したペプチドのライブラリーの増幅には、ライブラリーを生成または再増幅するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムが必要である。Ｓｕｇａ ｅｔ ａｌ（ＵＳ２０１００１６８３８０ Ａ１）は、ＲＮＡ配列に非天然アミノ酸をコードすることによる、Ｎ−メチルアミノ酸および他の特殊な（非標準）アミノ酸を含む環状ペプチドの産生を教示している。ＲＮＡにおける二環式ペプチドの直接コード化および翻訳のみによる二環式ライブラリーの産生の例はない。

化学的翻訳後修飾（ｃＰＴＭ）を介してペプチドに由来する分子のコードされたディスプレイを修飾することにより、ファージ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ上に二環式ペプチドのライブラリーまたは二環式ペプチドのディスプレイを産生することが知られている。典型的には、これらの方法は、ペプチドの有機合成を使用してペプチド誘導体を作製する。ペプチドライブラリー全体は、均一な化学修飾によって修飾することができることが知られている。修飾されたライブラリーからの選択およびＤＮＡの配列決定により、修飾されたペプチド誘導体を作製することができるペプチド配列が得られる。ペプチドのライブラリー、ファージディスプレイされたポリペプチドのライブラリー、およびＲＮＡディスプレイされたポリペプチドのライブラリーのペプチド誘導体のライブラリーへの変換を伴ういくつかの方法が存在する。

Ｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．は、システイン（Ｃｙｓ）ならびにペプチド鎖に同時に組み込まれた３つの異なる非タンパク新生アミノ酸、Ｃａｂ、Ａｈａ、およびＰｇｌを使用することにより、ＲＮＡ上にディスプレイされた二環式ペプチドを合成するための方法論を記載している。第１の環化は、翻訳のｉｎ ｓｉｔｕでＣａｂのクロロアセチル基とＣｙｓ中のスルフヒドリル基との間で起こり、Ａｈａ−Ｐｇｌの側鎖での第２の環化は、Ｃｕ（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環状付加を介して実行した。（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０（２３），ｐｐ ７２３２−７２３４）。Ｈａｒｔｍａｎおよび共同研究者らは、２つのＣｙｓと非タンパク新生アミノ酸、アジドホモアラニン（ＡｚＨＡ）、およびｐ−エチニルフェニルアラニン（Ｆ−ｙｎｅ）とを組み合わせた異なるアプローチを使用した（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１７，１２，７９５−８０４）。第１の環化は、システインをジブロモ−ｍ−キシレンで架橋することによって起こり、ＡｚＨＡ−Ｆ−インの側鎖での第２の環化は、Ｃｕ（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環状付加を介して実行した。Ａｈａ、Ｐｇｌ、Ｆ−ｙｎｅなどの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を発現させるには、特殊な非天然翻訳システムが必要であり；複数の非天然側鎖の発現は、ファージディスプレイなどのディスプレイシステムでは困難であり、ＵＡＡの取り込み効率が低くなる。したがって、天然アミノ酸残基から構成されたペプチドを使用する方法を開発することは興味深い。

米国特許公開ＷＯ２００４／０７７０６２では、環状および二環式ペプチドのライブラリーを産生するために、対称リンカーによって水中の天然アミノ酸残基からなる複数の保護されていないペプチドを修飾するための方法が記載されている。この方法は、３つのチオール反応性基を有する他の３回対称リンカーに拡張することができるが、そのような高い対称性を有するリンカーの数は、限定される。先行技術の例（ＷＯ２００９０９８４５０Ａ２、ＷＯ２００４０７７０６２、ＷＯ２０１１０１８２２７Ａ２）および査読済み文献（（Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９、５、５０２−５０７；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４，５３，１６０２−１６０６）は、硫黄含有側鎖およびトリス−（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）などの３つの同一の反応性基を有する３回対称コネクタ化合物に限定された二環性の合成について記載している。より低い対称性（２回）のリンカーによる二環式ペプチドの産生は、そのような先行技術からは明らかではない。天然アミノ酸からなる複数の保護されていないペプチドを修飾するために２回対称リンカーを使用する先行技術の例は、単環式ペプチドの産生に制限されている（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１６，１１，１４２２−１４２７；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，５８８０−５８８３；Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１６，２７，５０９−５１４；Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１６，７，３７８５−３７９０；Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１６，１４，５５３９−５５４５）。

広い化学多様性空間にアクセスし、所望の化学的または生物学的特性を備えた二環性を見つける可能性を最大化するために、２回対称リンカーなどの対称性の低いリンカーを使用するライブラリーを生成することは興味深い。保護されていないペプチドに対称性の低い修飾を適用することが報告されているが、当技術分野のすべての例は、保護されていないペプチドの修飾に適用した場合の対称性の低いリンカーが、二環式ペプチドの複雑な混合物を産生することを実証している。Ｈｅｉｎｉｓおよび共同研究者ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８，１０，７１５）は、アミノ酸側鎖と反応する２回対称リンカーを使用すると、複数の二環式構造の複雑な混合物が産生されることを具体的に実証している。そのような混合物は、クロマトグラフィー技術または他の技術では分離できない場合がある。Ｌｉｕ、Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌは、側鎖の修飾に適用された２回対称リンカーが、生成物の複雑な混合物を産生し（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７，５６，４４５８）、そのような不均一な混合物の産生を避けるために、非天然側鎖を有する特殊なアミノ酸を使用する必要があることを実証している。これらおよび他の例で概して強調されているのは、２回以下の対称性の修飾因子を使用して、ペプチド中の３つ以上の同様の反応性基を修飾すると、そのような反応が制御されない複雑な生成物の混合物を産生することがよく理解されることである。

二環性ペプチドを合成するための特殊な方法は、以下の要因のうちの１つまたは複数の使用を義務付ける方法によって知られている：（ｉ）天然アミノ酸には見られない特殊な反応基を含有するアミノ酸、（ｉｉ）アミノ酸のための保護基、（ｉｉｉ）有機合成のための固体支持体、（ｉｖ）有機溶媒、ならびに（ｖ）ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子およびファージなどの生体分子複合体と互換性のない反応条件。保護基を欠き、天然アミノ酸からなるペプチドの修飾を含む二環式ペプチドの合成のための対称性の低いリンカーの使用例はないようである。そのような方法は、多種多様の遺伝的にコードされた二環式構造の合成への邪魔されない経路を提供し得るため、興味深い。

米国特許公開第ＷＯ２００９０９８４５０ Ａ３では、３回対称リンカーを用いてファージ上にディスプレイされた遺伝的にコードされたペプチドライブラリーを修飾するための方法が記載されている。この方法は、遊離アミノ末端を有する二環式ペプチドのライブラリーを産生し、チオール反応性基を有する３回対称リンカーの使用が義務付けられている。奇数のシステイン（ここでは３つ）を有するファージライブラリーを生成することの難しさは、当技術分野で知られている。

先行技術に記載されている上記の方法は、それぞれが遊離アミノ末端を有する二環式ペプチドのライブラリーを産生すると考えられている。この末端は、タンパク質分解による切断を受けやすいことが知られている。遊離Ｎ末端のない多環式ペプチドを産生する方法論は、知られているが、そのような方法では、Ｎ−クロロアセチル（ＣｌＡｃ）基を含有する非タンパク新生アミノ酸を組み込む必要がある。天然アミノ酸からＮ末端がブロックされた遺伝的にコードされた二環式ライブラリーを産生する方法は、知られていない。

この背景情報は、本発明に関連する可能性があると考えられる知られた情報を作製する目的で提供される。前述の情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを必ずしも意図するものではなく、またそのように解釈されるべきでもない。

一般論では、本発明は、リンカーでペプチドまたは複数のペプチド（ライブラリー）を修飾することによって作製された、Ｎ末端残基を有さない二環式ペプチドを含む。好ましくは、ペプチドまたはペプチドライブラリーは、保護されていない天然のタンパク新生アミノ酸を含むか、またはそれからなるポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーで遺伝的にコードされたペプチドライブラリーを修飾することによって作製された、Ｎ末端残基を有さない、遺伝的にコードされた二環式ペプチドライブラリーを含む。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、
（ａ）ポリペプチド；
（ｂ）ポリペプチドをコードする核酸、および任意選択で、ポリペプチドを一意に識別する識別タグ；ならびに
（ｃ）第１の末端反応性基（Ａ）および２つの反応性基（Ｂ２、Ｂ２）を含む第２の末端を有するリンカーをポリペプチドに結合することから生じる二環式構造であって、第１の末端が、共有結合によってポリペプチドの末端にライゲートされ、リンカーの第２の末端の両方の反応性基が、共有結合によってポリペプチドの側鎖残基に結合する、二環式構造
を含む遺伝的にコードされたペプチド構築物を含み得る。

いくつかの実施形態では、リンカーは、２つの第２の末端反応性基が同一であるという点で２回対称性（two-fold symmetry）を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド末端は、Ｎ末端であり、側鎖残基は、それぞれシステイン、リジン、またはチロシンである。あるいは、ポリペプチド末端は、Ｃ末端であり、側鎖残基は、それぞれシステイン、リジン、またはチロシンである。次いで、リンカーの第１の末端反応性基は、酸性ｐＨでのＣ末端選択的光レドックス脱炭酸コンジュゲート付加などのＣ末端に対する独自の反応性を有する基である（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２０１５，１７，４８３０−４８３３およびＮａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８，１０，２０５−２１１）。いくつかの実施形態では、リンカーの第１の末端反応性基は、オキシム、ヒドラジン、２−アミノベンザミドキシム、ホスホニウムイリド、硫黄イリド、窒素イリド、またはアルデヒドと反応性であり、水性環境で安定であることが知られている任意の他の炭素求核試薬およびカルベノイド試薬などのアルデヒド反応性基である。

いくつかの実施形態では、リンカーの第２の末端反応性基は、チオール、アミン、またはフェノールと反応性の求電子性基である。チオール反応性基の例は、ハロケトン、ハロアセトアミド、ハロベンジル、マレイミド、アクチラート、カルボニルアクリル試薬、３−アリールプロピオロニトリル、アレナミドフルオロアレーン、クロロテトラジン、ジュリア−コシエンスキ様試薬、２−アジドアクリラート、有機金属パラジウム試薬、有機金（Ｉ）試薬を含む共役Ｃ−Ｃ二重結合を含むマイケルアクセプター、チオールのデヒドロアラニン（Ｄｈａ）への変換、それに続くＤｈａへの共役付加、水中のチオール残基と特異的に反応する任意の他の方法などである。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アリールエステル、パーフルオロアリールエステル、パーフルオロアレーン、ケテン、オルト−フタルアルデヒドひずみ放出アミン修飾剤、または水中のリジンアミン残基と特異的に反応する他の基など、水中のリジンアミン残基と特異的に反応する基の例。チロシンまたは他の芳香族側鎖と反応する基の例は、アリルパラジウム（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１０８０−１０８１）、ジアゾジカルボキシラート（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，１５２３−１５２５）、ジアゾニウム塩、アニリン−ホルムアルデヒドヘミアミナール、ロジウムカルベノイド、ジロジウムメタロペプチド触媒、マンガン触媒Ｃ−Ｈアルキニル化、ワザー試薬、１−［（トリイソプロピルシリル）エチニル］−１，２−ベンゾヨードキソール−３（１Ｈ）−オン（ＴＩＰＳ−ＥＢＸ）、金（Ｉ）触媒下、選択的ルテニウム−（ＩＩ）触媒Ｃ−Ｈ活性化、水中のヨウ化アリールによる酢酸パラジウム（ＩＩ）触媒Ｃ−Ｈ活性化、およびチロシン残基のフェノールを特異的に修飾するための当技術分野で知られている他の試薬（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１７，５６，３８６３−３８７３）である。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、２つのシステイン残基およびＮ末端セリンまたはスレオニン残基を含み、Ｎ末端セリンまたはスレオニンは、リンカーの第１の末端反応性基との反応のための選択的酸化によって最初にアルデヒドに変換され、リンカーの第２の末端反応基は、システイン残基に共有結合している。

いくつかの実施形態では、複合体は、ポリペプチドを外部に保有し、ポリペプチドをコードする核酸を含むファージ粒子などの担体に結合され得る。あるいは、複合体は、ポリペプチドを保有し、ポリペプチドをコードし、ポリペプチドに連結されたＲＮＡ配列を含むＲＮＡディスプレイ化合物であり得る。あるいは、複合体は、ＤＮＡディスプレイ化合物であり得、前記ＤＮＡディスプレイは、ポリペプチドを保有し、かつポリペプチドに連結された、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。あるいは、複合体は、別のペプチドなどの識別タグとともに、ポリマーまたはタンパク質担体に連結されたポリペプチドであり得る。

別の態様では、本発明は、ファージディスプレイ複合体を作製するための方法であって、（ｉ）末端を有するポリペプチドを含むファージ粒子を提供すること、（ｉｉ）第１の末端反応性基および２つの反応性基を含む第２の末端を有するリンカーを提供し、リンカーの第１の末端反応性基をポリペプチド末端とライゲートして、共有結合を形成することにより中間複合体を形成すること（「ライゲーションステップ」）、ならびに（ｉｉｉ）リンカーの第２の末端の両方の反応性基をポリペプチドの側鎖残基に反応させることにより、中間複合体から二環式構造を形成すること（「二環化ステップ」）を含む、方法を含み得る。ライゲーションステップおよび二環化ステップは、好ましくは独立した連続したステップであり、かつ／または好ましくは異なるｐＨで実行される。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドの末端は、Ｎ末端であり、ライゲーションステップの前にアルデヒドに酸化され（「酸化ステップ」）、ライゲーションステップは、酸性ｐＨの水性緩衝液中でＮ末端アルデヒドを含むポリペプチドをリンカーと混合することを含む。好ましくは、ライゲーションステップ後に産生される中間複合体は、サイズ排除精製、例えば、酸性ｐＨ、好ましくは約ｐＨ５未満の水性緩衝液中でのゲル濾過または透析によって精製される。

いくつかの実施形態では、精製され得る中間複合体は、二環化ステップの前に、ＴＣＥＰなどの還元剤で還元される（「還元ステップ」）。次いで、還元された中間複合体をアルカリ性ｐＨ（＞７）に曝露して二環化を誘導してもよく、第２の末端反応性基は、それぞれ、ポリペプチド中の２つのシステイン残基と反応するチオール反応性基を含む。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、第１のサイクルおよび直交的に反応性のジケトン基を導入するように修飾される。次いで、ジケトン基を使用して、第２のサイクルを作成する反応（二環化反応）を実施することができる。第１のサイクルおよびジケトン基を含有する中間複合体は、１，３ジケトンであり得るジケトンの反応性を劣化させることなく精製かつ貯蔵され得る。次いで、中間複合体は、生体適合性の水性条件で、１，３−ジケトンとヒドラジンとの独自の反応性を使用する多くの反応に供され得る。

いくつかの実施形態では、１，３−ジケトン官能基は、中性水性条件（約ｐＨ７〜約ｐＨ８）において２つのシステイン残基を含有するペプチドと、１，５−ジクロロペンタジオン−２，５との反応によって導入され、１，３−ジケトン官能基を有する単環式ペプチドを形成する。

いくつかの実施形態では、第２の環状構造は、１，３−ジケトン官能基を含有する単環ペプチドと、ヒドラジン官能基およびペプチドのＮ末端またはＣ末端に対して独自の反応性を有する官能基を含有する分子とを組み合わせることによって形成される。これらの分子間の反応により、１，３−ケトン官能基とペプチドの末端との間に接続が形成され、ペプチドに第２のサイクルが形成される。あるいは、ヒドラジンを１，３ジケトンと反応させて、新しい官能基または反応性基を提示し得、次いでこれを線状リンカーによってペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結させ得る。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの化学反応ステップ後の反応の収率を測定するための方法であって、未反応のポリペプチドに反応性であるが、反応済みのポリペプチドに反応性ではない捕捉試薬に複合体またはポリペプチドを曝露するステップ、および親和性試薬による捕捉剤の取り込みを測定するステップを含む、方法を含み得る。捕捉剤は、反応性基および親和性試薬と対になった親和性ハンドルを含む。親和性ハンドル−親和性試薬対は、結合対の定量化を可能にするのに十分に高い特異的結合を有することが知られた任意の親和性リガンド対を含み得る。例示的な対には、ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＬＡＧペプチド−抗ＦＬＡＧ抗体、スルホンアミド−炭酸脱水酵素、メトトレキサート−デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）が含まれる。好ましくは、親和性ハンドルまたは親和性試薬は、アガロースビーズなどの固体支持体上に固定化される。

いくつかの実施形態では、捕捉剤反応性基は、アミノオキシ基などのアルデヒド反応性基、またはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基である。

いくつかの実施形態では、測定された反応は、酸化ステップであり、ファージまたは複合体は、酸化ステップの後にアミノオキシビオチン（ＡＯＢ）に曝露され、これは、アルデヒドに酸化されたＮ末端基と反応し、反応物を少なくとも１桁希釈し、ストレプトアビジンビーズを追加して、反応済みの複合体を保持し、ストレプトアビジンビーズ上に保持されたファージの数を保持されていないファージの数と比較した差を測定して、酸化ステップの収率（アルデヒド基を獲得したファージ粒子の割合）を決定する。

いくつかの実施形態では、測定された反応は、ライゲーションステップであり、ファージまたは複合体は、ライゲーションステップの前および／または後にアミノオキシビオチン（ＡＯＢ）に曝露され、反応物を少なくとも１桁希釈し、ストレプトアビジンビーズを追加して、ライゲートされていないアルデヒド基を有するファージまたは複合体を保持し、ビーズ上に保持されたファージ粒子の数を保持されていないファージの数と比較した差を測定して、ライゲーションステップの収率（アルデヒド基を失ったファージ粒子の割合）を決定する。

いくつかの実施形態では、測定された反応は、還元ステップであり、ファージまたは複合体は、還元ステップの前および／または後に、ビオチン−ヨードアセタミド（ＢＩＡ）に曝露され、反応物を少なくとも１桁希釈し、ストレプトアビジンビーズを追加して、チオール基を露出させるために還元されたファージまたは複合体を保持し、ビーズ上に保持されたファージ粒子の数を保持されていないファージの数と比較した差を測定して、還元ステップの収率（還元ステップ中にチオール基を獲得したファージ粒子の割合）を決定する。

いくつかの実施形態では、測定された反応は、二環化ステップであり、ファージまたは複合体は、二環化ステップの前および／または後に、ビオチン−ヨードアセタミド（ＢＩＡ）に曝露され、反応物を少なくとも１桁希釈し、ストレプトアビジンビーズを追加して、未反応のチオール基とのファージまたは複合体を保持し、ビーズ上に保持されたファージ粒子の数を保持されていないファージの数と比較した差を測定して、二環化ステップの収率（二環化ステップ中にチオール基を失ったファージ粒子の割合）を決定する。あるいは、ファージまたは複合体は、二環化ステップの前後に塩化ベンジル（または他のチオール反応性基）と反応するビオチン−チオール（ＢＳＨ）に曝露されてもよく、（ｉ）反応物を少なくとも１桁希釈し、（ｉｉ）ストレプトアビジンビーズを追加し、（ｉｉｉ）捕捉後に残っているファージ粒子の数を測定し、これにより、ストレプトアビジンビーズ上に保持されたファージの数が、二環化ステップの収率（二環化ステップ中にチオール反応性基を失ったファージ粒子の割合）を構成する。

別の態様では、本発明は、複数の異なるポリペプチド配列を含む遺伝的にコードされたリガンドのライブラリーを含み得、それぞれが本明細書に記載されるようにリンカーと二環式構造を形成する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのポリペプチドＰ１およびＰ２は、ＤＮＡ配列によって別々にコードされる。複数の異なるポリペプチドは、同じまたは異なるリンカーで修飾され得る。各リンカーは、サイレント遺伝子バーコードなどの独自の識別タグに関連付けられ得る。

ライブラリーを一緒にプールして、本明細書に記載の複合体のライブラリーを産生することによって産生された、遺伝的にコードされた複合体の混合ライブラリーを形成し得る。混合ライブラリーは、少なくとも２つの異なるペプチド配列（Ｐ１およびＰ２）を含み得、それぞれが少なくとも２つの異なるリンカー（Ｌ１、Ｌ２）で別々に修飾され、少なくとも４つの別個の複合体（Ｐ１Ｌ１、Ｐ１Ｌ２、Ｐ１Ｌ２、およびＰ２Ｌ２）を形成する。いくつかの実施形態では、リンカーＬ１は、事前定義された核酸コードＢ１に関連する２つのペプチドと反応し得、リンカーＬ２は、事前定義された核酸コードＢ２を含有する２つのペプチドと反応する。核酸コードは、ＷＯ２０１６０６１６９５−Ａ１に記載されているようなサイレント遺伝子バーコードを含み得る。

別の態様では、本発明は、ポリペプチド二環式構造がリガンドに結合することができる、本明細書に記載の複合体を識別するための方法であって、（ｉ）複合体のライブラリーをリガンドと接触させ、（ｉｉ）リガンドに結合するそれらの複合体を選択し、（ｉｉｉ）ポリペプチドおよび／またはリンカーの構造をコードする核酸を配列決定することによって、結合複合体の構造を同定することを含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、複合体のライブラリーは、上記のように、少なくとも４つの別個の二環式構造、Ｐ１Ｌ１、Ｐ１Ｌ２、Ｐ１Ｌ２、Ｐ２Ｌ２を含み得る。

別の態様では、本発明は、ＳＰＣＱＲＧＨＭＦＣまたはＳＹＣＫＲＡＨＫＮＣを含むポリペプチドおよびＴＳＬ６を含むリンカーから形成された二環式複合体を含むＮｏｄａｌアンタゴニストペプチドを含む。

本発明、ならびに他の態様およびそのさらなる特徴をよりよく理解するために、本明細書の一部を形成する図面を説明とともに参照する。

ペプチド、リンカー、およびＤＮＡまたはＲＮＡなどのコード化エンティティを有する担体の概略図を示す図である。

様々なペプチドのファージライブラリーから始まる二環化プロセスの概念的な概要を示す図である。

担体がＣ末端（左）およびＮ末端（右）にあるポリペプチドを反応させる２つのスキームを示す図である。 図１Ｃの続きを示す図である。

リンカーＴＳＬ１およびＴＳＬ２による化学的二環化のスキームならびに２つの異なるサイレント遺伝子バーコードＴＣＴおよびＡＧＴを用いた異なるリンカーの同時コード化を示す図である。

反応性基ＡおよびＢとしてＮ末端セリンおよび塩化ベンジル上でのオキシムの形成を使用するリンカーの具体例を示す図である。

リンカーＴＳＬ１（１）、ＴＳＬ３（２）、およびＴＳＬ６（３）を示す図である。配列１〜６は、これらのリンカーが反応して二環式構造を形成し得る可変ペプチドである。

リンカーＴＳＬ１の合成スキームを示す図である。

リンカーＴＳＬ３およびＴＳＬ６の合成スキームを示す図である。

ＴＳＬ６による酸化ペプチドＳＨＣＶＷＷＤＣの修飾を示す図である。 図５Ａの続きを示す図である。

ＴＳＬ６による還元ペプチドＳＶＣＦＤＮＧＣの修飾を示す図である。

中程度の長さ（３つの炭素原子）のリンカーによる二環式修飾を示す図である。 短いリンカー（１つの炭素原子）による二環式修飾を示す図である。

ＴＳＬ−６（６つの炭素原子リンカー）によるＳＦＣＤＷＹＧＣ修飾を示す図である。 ＴＳＬ−６によるＳＬＣＦＤＮＧＣ修飾を示す図である。 ＴＳＬ−６によるＳＨＤＣＹＥＣ修飾を示す図である。 ＴＳＬ−６によるＳＷＤＹＲＥＣＹＬＥＣ修飾を示す図である。 ＴＳＬ−６によるＳＷＣＤＹＲＣ修飾を示す図である。 ＴＳＬ−１によるＳＨＣＶＷＷＤＣ修飾を示す図である。 ＴＳＬ−３によるＳＨＣＶＷＷＤＣ修飾を示す図である。

二環性ＳＨＣＶＷＷＤＣ−ＴＳＬ６を示す図である。 室温で１か月間のｐＨ４、７、および８．５の緩衝培地中での複合体の安定性を実証するグラフを示す図である。

３７℃でのウシ胎児血清（ＦＢＳ）でのインキュベーションに対する図９Ａに示した二環性の安定性を示す図である。混合物をイオン選択性ＬＣＭＳで分析した。二環性イオンの強度は、３７℃のＦＢＳで３日間（約７０時間）インキュベートした後でも低下しないのに対して、９０％ジスルフィドＳＨＣＶＷＷＤＣペプチドは、５時間未満で分解される。 ３７℃でのＰｒｏｎａｓｅ（商標）プロテアーゼ混合物中でのインキュベーションに対する二環性の安定性を示す図である。ＴＳＬ−１およびＴＳＬ−６リンカーから作製された線状のジスルフィドおよび２つの二環性化合物を、指定された時間（最大５時間）、Ｐｒｏｎａｓｅ（商標）とインキュベートした。反応物を希釈し、イオン選択性ＭＳ−ＵＰＬＣで分析した。数字は、５時間の消化後に残っている無傷の化合物の％を示している。

２つの異なる分解条件におけるいくつかの二環式ペプチド組成物の安定性を示す図である。

ＴＳＬ６を使用したペプチドのファージライブラリーの修飾の概略図を示す図である。

ＴＳＬ１、ＴＳＬ３、またはＴＳＬ６リンカーを使用した大規模なファージライブラリーＳｘＣｘｘｘｘｘｘＣの修飾の概略例を示し、任意のライブラリーおよび任意のリンカージオメトリに対するこのアプローチの一般性を示す図である。 ＴＳＬ１、ＴＳＬ３、またはＴＳＬ６リンカーを使用した大規模なファージライブラリーＳｘＣｘｘｘｘｘｘＣの修飾の概略例を示し、任意のライブラリーおよび任意のリンカージオメトリに対するこのアプローチの一般性を示す図である。

ペプチド中の２つの別個の場所に導入されたリンカーの２つの半分：ペプチド末端との反応による第１の半分およびペプチドの２つの側鎖との反応により導入された第２の半分に対応する分子を用いる二環化の例を示す図である。 （１５Ａの続き）ペプチド中の２つの別個の場所に導入されたリンカーの２つの半分：ペプチド末端との反応による第１の半分およびペプチドの２つの側鎖との反応により導入された第２の半分に対応する分子を用いる二環化の例を示す図である。精製され得る中間複合体は、リンカーの２つの半分が反応して環化を受けるように誘導される。

二環式ペプチドライブラリーの足場を示す図である。 ３つのパネルＡ、Ｂ、およびＣを示しており、ファージディスプレイされたペプチドのライブラリーの修飾およびこのライブラリーからの標的に結合する二環式ペプチドの選択による、遺伝的にコードされた二環性ライブラリーの産生を示す図である。

Ｎｏｄａｌによって誘導される知られたシグナル伝達イベントを阻害する二環式構造の能力を示す４つのパネルを示す図である。

一態様では、本発明は、２つの別個の修飾ステップを含む二環式ペプチドライブラリーを合成する方法を含む。第１のステップは、水性環境でのライゲーション化学作用によって、リンカーの第１の末端を担体上にディスプレイされたペプチドの末端にライゲートすることによって中間複合体を作成することを含む。ペプチド末端は、Ｎ末端またはＣ末端であり得る。任意選択の精製ステップ後、第２のステップは、中間複合体を反応条件に曝露して、分子内二環化反応を誘導することを含み、リンカーの第２の末端での２つの反応基は、それぞれ独立してペプチド配列におけるアミノ酸の側鎖と反応する。

いくつかの実施形態では、二環式担体は、ファージ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、リボソーム、細菌、酵母、ＰＥＧもしくはポリスチレンなどの合成ポリマーからなるビーズ、または任意の他の遺伝的にコードされた生物学的ディスプレイ技術もしくは当技術分野で知られている合成コードされたペプチドライブラリー技術を含み得る。いくつかの実施形態では、担体は、異なる化学組成のランダムペプチドライブラリーをコードする遺伝子配列のディスプレイセットを含む。別の実施形態では、遺伝子配列のディスプレイセットは、例えば、ランダム突然変異誘発によって生成されたものなどの異なる化学組成のペプチド配列の焦点を合わせたサブセットをコードする焦点を合わせた遺伝子ライブラリーを含む。

遺伝子配列のディスプレイセットは、第２のセットが、異なるサイズもしくは組成のリンカー、または立体異性体、ジアステレオマー、もしくはエナンチオマーであるリンカーなどのリンカー分子の化学構造と連結されるように、特異的なリンカーと対になり得る。

ライゲーションおよび二環化の２つのステップのいずれかまたは両方は、ペプチドの化学的または酵素的修飾であり得る。いくつかの実施形態では、両方の修飾は、Ｎ末端または特異的なＮ末端アミノ酸およびペプチド中のアミノ酸の別個のセットに特異的な化学的コンジュゲーション技術である。例えば、ライゲーションに使用される化学修飾により、酸化されたＮ末端セリンでオキシムを形成することができる。ライゲーションは、当技術分野で知られている他のＮ末端またはＣ末端の特異的な化学作用を用いることができる。

ペプチドおよびリンカーを有する担体の概略図を図１Ａに示す。Ｎ末端またはＣ末端のいずれかであり得るペプチド末端Ｚは、リンカーＬの第１の末端Ａと反応する。ペプチドは、リンカーの第２の末端上の２つの官能基Ｂ１およびＢ２と反応する反応性側鎖Ｘ１およびＸ２を有する。リンカーＬは、脂肪族鎖を含み得、またエステル、フェニル、アミンなども含み得る。

いくつかの実施形態では、第１の末端Ａは、最初にペプチド末端Ｚとライゲートされ、図１Ａで識別される線状中間複合体をもたらし、次いで、二環化が続く。ライゲーション反応には、ウィッティヒ反応などの炭素−炭素結合形成プロセスを通じて酸化セリン（オキサロイル）を修飾する反応が含まれ得る。二環化ステップの１つの好ましい実施形態は、システインのアルキル化、または特定の場所でペプチドまたはタンパク質を修飾するための他の任意の好適な方法を含む。

図１Ｃおよび１Ｄに概略的に示される代替の実施形態では、第１のステップは、第１の環を形成し、同時に独自の反応性基を導入するジケトンとの反応を含む。ジケトンは、好ましくは、１，３ジケトンである。この反応で形成される中間単環式ペプチドは、独自の安定性があり、反応基を劣化させることなく精製および貯蔵され得る。次いで、ジケトン基を保有する中間単環式ペプチドは、一端がアルキルまたはアリールヒドラジンなどの１，３−ジケトン反応性基、および他端がペプチドの末端との化学的または酵素触媒によるライゲーションを受けて、第２の環（「二環化」）の形成を誘導することができる別の基を含むリンカー分子と反応し得る。ペプチド末端でのライゲーションが最初に起こり、線状中間体をもたらし得る。あるいは、ジケトンとの反応が最初に起こり、分岐した中間体をもたらし得る。

例えば、配列中に２つの内部システイン残基を有するディスプレイペプチドを、アルカリ性ｐＨ、例えば約ｐＨ８または９で１，５−ジクロロペンタジオン−２，４と反応させて、１，３−ジケトン基をペプチドに導入することができる。次いで、１，３，−ジケトン基を、アルキルまたはアリールヒドラジンを含むリンカーと反応させることができ、これにより、ペプチドのＮ末端との後続の二環化反応を完了する官能基が導入される。例えば、１，３−ジケトン基を含有する前記ペプチドは、Ｎ末端で修飾されてヒドラジンリンカーを導入し、次いで、Ｎ末端のヒドラジンと側鎖にライゲートされた１，３−ジケトンとの間の分子内反応を介して二環化することができる。あるいは、反応の順序が逆になり、Ｎ末端反応基を含有するリンカーが、酸性ｐＨで１，３−ジケトンと反応する。次いで、中性ｐＨでの末端の酸化および酸性ｐＨ４．５への環境の変化により、Ｎ末端との反応を介して二環化が引き起こされる。

すべての場合において、ライゲーションおよび二環化の２つのステップは、互いに独立した条件で起こることが好ましい。そのような独立性により、中間生成物の精製が可能になり、副反応が最小限に抑えられる。いくつかの実施形態は、異なるｐＨ値を必要とする反応の使用を伴う。例えば、酸化されたＮ末端セリンでのオキシムの形成は、酸性ｐＨの約ｐＨ３で起こり、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって触媒することができる。これらの条件は、ファージディスプレイされたライブラリーおよびＲＮＡディスプレイされたライブラリーなどの他の遺伝的にコードされたペプチドライブラリーによって許容される。後続の二環化反応は、より高いｐＨで起こるアミノ酸の側鎖との任意の分子間反応であり得る。好適な反応には、チオールとチオール反応性基との間の求核置換、例えばハロベンジル、ハロアセトアミド、求核芳香族置換、または共役アルケンおよび／もしくはアレンアミドへのチオールのマイケル付加が含まれ得る。Ｌｙｓ、Ｔｙｒの側鎖残基または他のアミノ酸側鎖残基とアルカリ性ｐＨで起こる他の知られた反応を使用することも可能である。

代替の実施形態では、ライゲーションおよび二環化のステップは、保護−脱保護反応の使用によって分離される。例えば、ウィッティヒ反応を介して酸化されたＮ末端セリンでのＣ−Ｃ結合の形成は、約ｐＨ７〜約ｐＨ８で起こる。ウィッティヒ反応は、チオール残基を保護するＳ−Ｓジスルフィドを乱さないことが知られている。ウィッティヒ反応は、ファージディスプレイされたライブラリーおよびＲＮＡディスプレイされたライブラリーなどの他の遺伝的にコードされたペプチドライブラリーによって許容される。ライゲーションおよび精製後、二硫化物の還元およびチオールとチオール反応性基との間のライゲーションによって二環化反応が引き起こされ、これは約ｐＨ７〜約ｐＨ８で起こり得る。ウィッティヒライゲーション反応で使用される安定化イリドを、求核置換、求核芳香族置換、もしくはマイケル付加、または二環化ステップの他のよく知られた反応のためのチオール反応性基と組み合わせる多くのリンカーが設計され得る。

いくつかの実施形態では、担体は、好ましくは可変核酸コード識別子である識別子を含む。識別子は、担体外部上に保有するいかなるペプチドもコードしないようにサイレントであり得る。あるいは、識別子は、識別子のすべての変異体が同一または実質的に同様のペプチドをコードするようなものであり得る。この後者の場合、「サイレントバーコード」技術と呼ばれ、この方法は、バクテリオファージ粒子内部に異なる組成のＤＮＡを含有し、同一組成のペプチドをディスプレイする粒子上にバクテリオファージディスプレイシステムを産生することを伴う。いくつかの実施形態では、担体は、これらの粒子内部にパッケージされた、ゲノム内の縮重ＤＮＡタグを含む可変核酸コードを含有する同一の外部化学組成のウイルスまたはバクテリオファージビリオンである。ウイルスまたはファージのゲノムは、ビリオンコートコード化領域での縮重コドンの使用などのビリオンコートの化学組成の変化、切除された配列をコードするＤＮＡ配列の変化、発現されたタンパク質配列をコードしないＤＮＡ配列の変化、またはビリオンコートに組み込まれていない成分をコードするＤＮＡ配列の変化を生じさせない方法で操作される。したがって、複数の担体（ファージまたはウイルスなど）を含む担体ライブラリーが提供され得、すべての担体は、外部的に化学的同一である（例えば、任意のリガンドの結合の修飾前）が、その中に別個の核酸識別子を含有する。

別の態様では、本発明は、特異的な二環式構造に関連する独自の識別子、好ましくはサイレント遺伝子バーコードを使用することによって、ペプチドライブラリーの遺伝的にコードされた修飾を選択する方法を含み得る。いくつかの実施形態では、複数の担体のライブラリーが産生され、それぞれが独自のサイレント遺伝子バーコードを有し、それぞれがポリペプチドをディスプレイする。次いで、各ライブラリーは、本明細書に記載されるように、異なるリンカーで修飾されて、使用されるリンカーに対して独自の二環式構造を産生する。次いで、ライブラリーを組み合わせて混合ライブラリーを産生し、各リンカー固有の二環式構造は、バーコードで識別され得る。次いで、混合ライブラリーをスクリーニングして、所望の配列および二環性トポロジーを有するペプチドを選択し得、これは、次いで、遺伝子バーコードを配列決定することによって（またはそうでなければ識別子を識別することによって）識別され得る。

例えば、図２に概略的に示されているように、第１の担体は、第１のサイレント核酸コード（バーコード）およびペプチドをコードするＤＮＡ配列を運ぶ。第２の担体は、第１のコードとは異なる第２のサイレント核酸コード、および第１のペプチドと同じであっても異なっていてもよいペプチドをコードするＤＮＡ配列を運ぶ。第１の担体ペプチドは、第１のリンカー（ＴＳＬ１）で修飾され、第２の担体は、異なるリンカー（ＴＳＬ２）で修飾される。ライゲーションおよび二環化後、結果として生じる２つの異なる二環式構造は、第１および第２の核酸コードによって区別可能である。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるように遺伝子にコードされた二環式ペプチド混合ライブラリーを調製すること、および受容体分子に結合するそれらの二環式ペプチドを識別するために推定受容体分子でライブラリーをスクリーニングすることを含む薬物候補を識別する方法を含み得る。次いで、受容体に結合する二環式ペプチドは、サイレント核酸コードおよびペプチドをコードする配列を濃縮および配列決定することによって識別される。

別の態様では、本発明は、遺伝子配列が翻訳時に同一または密接に関連するペプチド配列（「リンカー」）を産生するように、基質中の複数の独立したベクターに、ペプチドリンカーをコードする遺伝子配列の冗長なセットを挿入すること；ペプチドの多様なセット（「ライブラリー」）が翻訳時に発現されるように、各ベクターに、遺伝的に多様な挿入物をコードする遺伝子配列の第２のセットを挿入すること；翻訳産物が非可変リンカーを含み、可変ペプチドライブラリーが合成されるように、第１および第２の遺伝子配列を発現かつ増幅すること；ならびに別個のＴＳＬによって各ペプチドライブラリーを修飾し、複数の修飾されたライブラリーを組み合わせて、化学修飾が遺伝的にコードされたライブラリーを産生することを含む遺伝的にコードされた化学二環式ペプチドライブラリーを合成する方法を含み得る。

Ｄｅｒｄａ ｅｔ ａｌ．への米国特許公開２０１３／０５００８３号は、その内容全体が、許可されている場合に参照により本明細書に組み込まれ、遺伝的にコードされたペプチドライブラリーの化学修飾の定量化および効果的な修飾のための新しい戦略の選択について記載している。これらの方法は、反応で消費される反応性基の存在または不在に基づいて、本明細書に記載の反応性ステップのいずれか１つまたはすべての収率を定量化するために使用され得る。

ファージディスプレイされたライブラリーの化学的翻訳後修飾の遺伝子コード化の技術は、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１６０６１６９５Ａ１に記載されており、その内容全体が、許可されている場合に参照により本明細書に組み込まれる。

例
本明細書に記載の本発明をよりよく理解するために、以下の例を説明する。これらの例は、例示のみを目的としていることを理解すべきである。したがって、それらは、いかなる方法でも本発明の範囲を制限するべきではない。

例１．二環化のためのリンカーの合成。図４Ａに示すように、架橋剤１（ＴＳＬ１）、２（ＴＳＬ３）、および３（ＴＳＬ６）は、オキシム形成およびシステインＳ−アルキル化化学に基づいて設計した。これらの反応は、生体直交性のクリーンかつ高収率の反応を高速で伴う。合成ステップを図４Ｂおよび４Ｃに概説する。３つの違いは、主に連結鎖における炭素原子の数である。

例２．ＴＳＬ６リンカーによる還元ペプチドＳＨＣＶＷＷＤＣの修飾。修飾の詳細を図５Ａおよび５Ｂに概説する。ライゲーションステップは、低ｐＨで起こる。サイズ排除カラムにより、アルデヒドステップまたはライゲーション後の精製が可能である。還元ステップでの低ｐＨは、二環化反応の収率を最大化する。還元後のｐＨの上昇により、二環式生成物がクリーンに得られ、ＬＣＭＳによる目に見える未反応の出発物質または副産生物はなかった。ＬＣＭＳによる特性評価により、各ステップですべての中間体の同一性が確認された。

例３．ＴＳＬ６リンカーによる還元ペプチドＳＶＣＦＤＮＧＣの修飾。修飾の詳細を図５に概説する。化学作用の重要な詳細：ライゲーションステップでの低ｐＨ。サイズ排除カラムにより、アルデヒドステップまたはライゲーション後の精製が可能である。還元ステップでの低ｐＨは、二環化反応の収率を最大化する。還元後のｐＨの上昇により、二環式生成物がクリーンに得られ、ＬＣＭＳによる目に見える未反応の出発物質または副産生物はなかった。ＬＣＭＳによる特性評価により、各ステップですべての中間体の同一性が確認された。

例４．いくつかのＴＳＬリンカーによるペプチドの多様なセットの修飾。Ｎ末端にセリン残基を有し、かつ下流の位置に２つのシステインを有する一連のペプチド配列を選択した。オキシムライゲーションベースの化学作用を使用して、Ｎ末端セリンの過ヨウ素酸塩媒介酸化から生成されたオキソアルデヒドを認識し、その後、架橋戦略によって２つのシステインを捕捉し、例２または３に記載の条件を使用して最終的に立体配座的に剛直なペプチド大二環性を形成した。図８Ａ〜８Ｇに記載されているように、複数の異なるペプチドでの反応の要約は、ライゲーションおよび二環化化学が種々のペプチド配列で効果的に起きることを確認する。原子数が減少しているＴＳＬリンカーによる修飾は、結果として生じる第２の環のサイズが１つのアミノ酸のみで形成されている場合でも効果的に進行した（図７Ｂ）。これらの結果は、ペプチドループのサイズに制約がなく、ＴＳＬのジオメトリにほとんど制約がないことを示している。

例５．緩衝液および生物学的媒体における二環性の安定性。ＴＳＬ３リンカーで修飾することにより配列ＳＨＣＶＷＷＤＣから形成された二環式ペプチドを、ｐＨ４、７、および８．５の緩衝培地中で室温で１か月間インキュベートした（図９）。本発明者らは、これらの条件のいずれにおいても二環性生成物の分解がないことを示すＬＣＭＳの変化がないことを観察した。ＳＨＣＶＷＷＤＣ−ＴＳＬ３二環性を、３７℃でのウシ胎児血清（ＦＢＳ）でインキュベートし、二環性の完全性をＬＣＭＳによって試験した。イオン選択性ＬＣＭＳを使用すると、二環性は、３７℃でのＦＢＳにおいて３日間インキュベーションした後でも、ＦＢＳで変化しなかった。対照的に、イオン選択性ＬＣＭＳは、環状ペプチドジスルフィドＳＨＣＶＷＷＤＣの９０％が３００分後にＦＢＳで分解されることを実証した（図１０Ａ）。

別の厳密な安定性試験では、エンドプロテアーゼおよびエキソプロテアーゼのアグレッシブカクテル（Ｐｒｏｎａｓｅ）を使用して、線状配列ＳＷＤＹＲＥＣＹＬＥＣ、そのジスルフィド誘導体、ならびにＴＳＬ１およびＴＳＬ６リンカーで修飾されたこの配列の２つの二環式誘導体を消化した（図１０Ｂ）。３７℃で５時間のインキュベーション後、０．４±０．１％の線状ペプチドならびに０．９±０．４％の線状およびジスルフィドペプチドのみが未消化のままである。同じ条件で、５時間のタンパク質分解消化後、６８±１４％のＴＳＬ６−ＳＷＤＹＲＥＣＹＬＥＣ二環性および８２±１３％のＴＳＬ１−ＳＷＤＹＲＥＣＹＬＥＣ二環性は、無傷のままである（図１０Ｂ）。後者の観察結果は、ＴＳＬ１−ＳＷＤＹＲＥＣＹＬＥＣ二環性の半減期の安定性を約２４時間と推定している。

図１１は、２つの異なる分解条件での他の１２個の二環式ペプチド組成におけるこの観察結果の一般性を実証している。図１１ａは、修飾に使用された試薬の配列および略称を説明している（ＴＳＬ−１、ＴＳＬ−３、およびＴＳＬ−６は、図４Ａの構造１、３、および６に対応する）。生成物を説明するために英数字の表記を使用する。図１１ｂは、３６℃での５時間の安定性の時間分解測定および５時間後の安定性のエンドポイント測定の例を示している。図１１ｃは、Ｐｒｏｎａｓｅおよび新鮮なマウス血清の２つの異なるタンパク質分解条件でのエンドポイント測定（３６℃で５時間）を要約している。図１１ｃおよび１１ｄは、二環式ペプチドの安定性を、当技術分野で知られている環状および二環式構造の一部と比較している。この比較は、本明細書で報告されるＴＳＬ−６修飾因子によって産生される化合物である１４ｆおよびＴＢＭＢ修飾子による同様のペプチド配列から産生される知られた最先端の化合物である１６ｊ（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１８，６１（７），２８２３−２８３６）の驚くべき非自明の利点を示す。二環式化合物１４ｆは、１６ｊよりもＰｒｏｎａｓｅ処理に対して１０倍安定している。１３ｉと１３ｅとの間の別の比較は、ＷＯ２０１４０５２６５０Ａ２に記載のパーフルオロアレーンを通じた当技術分野で知られている環化と比較した場合のＴＳＬ−６の利点を再び実証している。

例６．ファージディスプレイされたペプチドのライブラリーの修飾および捕捉剤による修飾の検証による、遺伝的にコードされた二環性ライブラリーの産生。

Ｓがセリン、Ｃがシステイン、ｘがランダムアミノ酸である構造ＳｘＣｘｘｘＣのファージディスプレイされたペプチドのライブラリーを、遺伝的にコードされた二環性ライブラリーの産生の開始点として使用した。図１２は、ＴＳＬ６リンカーを使用するそのようなファージライブラリーからのクローンの修飾の例を説明している。図１３および図１４は、ＴＳＬ１、ＴＳＬ３、またはＴＳＬ６リンカーを使用する大規模なファージライブラリーＳｘＣｘｘｘｘｘｘＣの修飾の例を説明し、任意のライブラリーおよび任意のリンカージオメトリに対するこのアプローチの一般性を示している。本発明者らは、合成ペプチド配列のライゲーションに最適化された条件を使用した：具体的には、ライブラリーを氷冷した６０マイクロモルの過ヨウ素酸ナトリウムのＰＢＳ中溶液に８分間曝露し、メチオニンの０．５ｍＭの溶液を添加して反応を停止させた。酸化されたライブラリーを、１ｍＭのＴＳＬ６リンカーの０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液中溶液に、室温で１時間曝露した。ライゲートしたライブラリーは、溶離液としてｐＨ４緩衝液を使用して、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯなどのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。精製したライブラリーをｐＨ４のＴＣＥＰに曝露して、ジスルフィド結合を還元した。最後に、トリス緩衝培地を溶液に添加して、ｐＨを８に上げ、二環化を促進した（図１３Ａ）。反応の各ステップは、様々な捕捉試薬を使用して効果的に監視することができる（図１３Ｂ）。例えば、酸化ステップを定量化するために、本発明者らは、酸化ライブラリーを酢酸アニリン緩衝液中のアミノオキシビオチン（ＡＯＢ）と混合し、ストレプトアビジンコーティングされたビーズへの曝露前後のファージの力価を測定した（図１３Ｃ、Ｆ）。ＡＯＢ捕捉は、ライブラリーの７３％が酸化されていることを実証した。ＴＳＬ６への曝露後にファージ集団の１０％のみがＡＯＢ反応性アルデヒドを含有し、酸化されたライブラリーの８７％がＴＳＬ６とライゲートされていることを示している。同じ手順を使用して、反応性基の完全性を試験することができる。例えば、ＡＯＢによる修飾とそれに続く捕捉により、ライブラリーをＴＳＬリンカーなしで０．１％のＴＦＡでインキュベートした場合にアルデヒドが、反応性を維持することが実証された（図１３Ｆ）。同様に、ＢＩＡへの曝露およびストレプトアビジンによる捕捉（「ＢＩＡ捕捉」）を使用して、チオールの数を定量化することができ、ＢＳＨへの曝露とそれに続くストレプトアビジンによる捕捉（「ＢＳＨ捕捉」）を使用して、チオール反応性塩化ベンジル基を含有するライブラリーの割合を定量化することができる。ライゲーション後および二環化後（図１３Ｈ）のＢＩＡ（図１３Ｇ）への曝露は、チオールがライゲーション後にライブラリーに存在するが、二環化後に消失することを示している。同様に、ＢＳＨへの曝露は、塩化ベンジル基の有無をチェックするために使用することができる。ＢＳＨへの曝露は、塩化ベンジル基の完全性をチェックするためにも使用することができる。例えば、ライゲートされたライブラリーをｐＨ７に長時間曝露したり、ｐＨ７緩衝液で精製したりすると、ＢＳＨ捕捉で決定した場合に、塩化ベンジル基の加水分解につながる。この観察結果を使用して、ＴＳＬ６にライゲートされたライブラリーを精製するための特定の条件を選択した。そのような定量化を行わずに、ＴＳＬ７で修飾されたライブラリーの精製および完全性をどのようにチェックできるかは明らかではない。他のペプチドサイズおよびリンカーサイズの最適化は、同じステップ（図１１、図１２）に従い、同じ観察結果を示す。

例７：配列中に２つのＣｙｓ残基を有する合成ペプチドまたはファージディスプレイされたペプチドを、ｐＨ８．５で１，５−ジクロロペンタジオン−２，４と反応させて、１，３−ジケトン基をペプチドに定量的に導入することができる。合成ペプチドでは、ＬＣＭＳは、複数の多様なペプチド配列での反応の完了を確認する。ファージ上にディスプレイされたファージライブラリーでは、１，３−ジケトン修飾生成物とヒドラジン−ビオチンとの反応とそれに続くストレプトアビジンビーズによる捕捉により、ディスプレイされたペプチド中に１，３−ジケトンが存在することが確認される。次いで、ペプチドまたはファージディスプレイされたペプチド中の１，３−ジケトン基を、酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４．５などの制御された条件でアルキルまたはアリールヒドラジンで修飾することができる 図１５Ａ。この反応性を使用して、後続のステップにおけるＮ末端との反応および二環化を完了するアルデヒド反応性イリドなどの官能基を導入することができる（図１５Ｂ）。例えば、１，３−ジケトン基を含有する前記ペプチドは、アルデヒドを導入するためにＮ末端で修飾することができ、酸性ｐＨに対する環境の変化は、Ｎ末端のヒドラジンと側鎖にライゲートされた１，３−ジケトンとの間の分子内反応を介して二環化を誘導する（図１５Ｂの右経路）。別の例では、反応の順序を逆にすることができ、Ｎ末端反応性基を含有するリンカーを酸性ｐＨで１，３−ジケトンと反応させる。中性ｐＨでの末端の酸化は、Ｎ末端との反応を介して二環化を引き起こす。（図１５Ｂの左経路）。

例８：ファージディスプレイされたペプチドのライブラリーの修飾およびこのライブラリーからの標的に結合する二環式ペプチドの選択による、遺伝的にコードされた二環性ライブラリーの産生。スクリーニングステップは、代表的なヒトタンパク質Ｎｏｄａｌ：ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ１０４９７６．１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００２、９９（２６）、１６８９９−１６９０３に記載されている完全な配列を使用して実行した。具体的には、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈにおけるヘキサヒスチジンタグ付きＮｏｄａｌ（Ｈｉｓ−Ｎｏｄａｌ）カタログ番号ａｇ２１８８２のＢＣ１０４９７６によってコードされる４０−３３８アミノ酸配列ＰＬＡＹＭＬＳＬＹ［．．］ＶＬＬＤＨＨＫＤを使用した。選択は、ファージディスプレイされたライブラリーの選択のために知られた技術を用いて、任意の他の標的に対して容易に実行することができる。ＴＳＬ−６で修飾されたＳＸＣＸ６Ｃのスクリーニング、パニング、および検証の結果を図１３に示す。

ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で官能化されたアガロースビーズ上に固定化された標的は、ＴＳＬ−６（６−炭素）リンカーで修飾された混合二環式ライブラリーを使用してパンした（図１６Ｂ−Ａ）。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｄｕｏでビーズを洗浄した後、ビーズを水中で煮沸してＮｏｄａｌを放出し、結合したリガンド／ファージをＰＣＲおよび増幅に供した。３ラウンドの選択後、所望の収束が観察された：ラウンド３（Ｒ３）での二環性ライブラリーは、Ｒ１およびＲ２ライブラリーと比較した場合、アガロースビーズ上に固定化されたＮｏｄａｌで特異的に濃縮した。対照のＨｉｓタグ付き標的を有するブランクビーズまたはビーズでは濃縮は観察されなかった。重要なことに、Ｎｏｄａｌ修飾ビーズ上でパンされた未修飾Ｒ３ライブラリーは、濃縮を示さず、選択されたペプチド配列が二環式足場に制約された場合にのみＮｏｄａｌに結合することを確認した（図１６Ａ）。選択の各ラウンドからのｄｓＤＮＡアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑを使用してシーケンスし、インフォマティクス分析により、多数のシーケンス（図１６Ｂ）および少なくとも３つのシーケンスモチーフファミリー（図１６Ｃ）がＮｏｄａｌの潜在的なリガンドであることが示唆された。Ｎｏｄａｌに結合するペプチド配列のリストを表１に示す。

予測されたリガンドの結合能力を検証するために、本発明者らは、Ｎｏｄａｌによって誘導された知られたシグナル伝達イベントを阻害する二環性の能力を試験した。具体的には、本発明者らは、抗リン酸化Ｓｍａｄ抗体によるウエスタンブロットを用いて、胚性癌腫Ｐ１９細胞におけるエフェクタータンパク質Ｓｍａｄ２のＮｏｄａｌ誘導リン酸化を検出した。図１７ａは、２．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋７．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）でＰ１９細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｄａｌで１時間処理すると、ｐＳｍａｄ２強度が増加することを記載している。Ｐ１９細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｄａｌおよび知られたキナーゼ阻害剤ＳＢ−４３１５４２とインキュベートすると、ｐＳｍａｄにおけるＮｏｄａｌ誘導の増加が抑制される。同様に、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｄａｌと１００μＭの二環式ペプチド２（ＳＰＣＫＡＧＴＧＱＣ）、３（ＳＰＣＫＧＰＳＡＴＣ）、４（ＳＰＣＫＧＲＨＨＮＣ）、５（ＳＰＣＫＫＡＨＧＡＣ）、７（ＳＰＣＱＲＧＨＭＦＣ）、および１１（ＳＹＣＫＲＡＨＫＮＣ）との同時処理では、バックグラウンドレベルを超えてｐＳｍａｄ２リン酸化は増加しない。二環式ペプチドは、１００マイクロモル濃度でＮｏｄａｌのアンタゴニストとして機能する。図１７ｂは、６つの二環式ペプチドのうち２つのみが、１０μＭ濃度で効力を保持することを説明している：二環性７（ＳＰＣＱＲＧＨＭＦＣ）および１１（ＳＹＣＫＲＡＨＫＮＣ）は、ｐＳｍａｄ２リン酸化を阻害するのに対して、二環性２、３、４、および５は、１０μＭ濃度でｐＳｍａｄ２リン酸化を阻害しない。図１７ｃ−ｄは、二環性７および１１の用量反応を説明し、Ｎｏｄａｌシグナル伝達の拮抗作用の半分の阻害濃度が１〜３μＭであることを示唆している。

ＳＰＣＱＲＧＨＭＦＣ−ＴＳＬ６およびＳＹＣＫＲＡＨＫＮＣ−ＴＳＬ６ならびに誘導体化合物は、癌細胞におけるタンパク質Ｎｏｄａｌのシグナル伝達機能に拮抗する能力を有する。ＳＰＣＱＲＧＨＭＦＣ−ＴＳＬ６およびＳＹＣＫＲＡＨＫＮＣ−ＴＳＬ６の誘導体化合物は、これらの化合物の同様の構造的特徴を保持し、Ｎｏｄａｌタンパク質の機能に拮抗する同様のまたは強化された能力を示す。唯一知られたＮｏｄａｌアンタゴニストペプチドは、抗ヒトＮｏｄａｌモノクローナル抗体３Ｄ１である（ＷＯ２０１６０５７６８３Ａ２）。Ｎｏｄａｌに拮抗することができる小分子化合物は、ＳＢ４３１５４２（図１７でＳＢとして記載されている）およびその誘導体を含む。しかし、これらの化合物は、Ｎｏｄａｌと相互作用せず、Ｎｏｄａｌの下流で作用するＡＬＫ５、ＡＬＫ４、およびＡＬＫ７キナーゼの阻害剤である。
参考文献

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が関係する当業者の技能のレベルを示し、許可される場合、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (39)

1. 第１の末端および２つの反応性基を含む第２の末端を有するリンカーをポリペプチドに結合することから生じる二環式構造を含むペプチド構築物であって、前記第１の末端が、共有結合によって前記ポリペプチドの末端にライゲートされ、前記リンカーの第２の末端の両方の反応性基が、それぞれ前記ポリペプチドの側鎖残基に反応する、ペプチド構築物。
2. 前記２つの第２の末端反応性基が同一である、請求項１に記載の構築物。
3. 前記ポリペプチド末端がＮ末端であり、前記側鎖残基がシステイン、リジン、またはチロシンである、請求項１または２に記載の構築物。
4. 前記リンカー反応性基が、チオール、アミン、またはフェノールに反応性の求電子性基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構築物。
5. 前記リンカーの第１の末端が、オキシム、ヒドラジン、２−アミノベンザミドキシム、ホスホニウムイリド、硫黄イリド、窒素イリド、またはアルデヒドと反応性があり、水性環境で安定であることが知られている任意の他の炭素求核試薬およびカルベノイド試薬などのアルデヒド反応性基を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の構築物。
6. 前記ポリペプチドが、２つのシステイン残基およびＮ末端セリンまたはスレオニン残基を含み、前記Ｎ末端セリンまたはスレオニンが、最初に選択的酸化によってアルデヒドに変換され、前記第２の末端反応性基が、前記システイン残基に共有結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の構築物。
7. 前記ポリペプチドを外部に保有し、かつ前記ポリペプチドをコードする核酸を含むファージ粒子などの担体に結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構築物。
8. ＲＮＡディスプレイ化合物であり、前記ＲＮＡディスプレイが、前記ポリペプチドを保有し、かつ前記ポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドに連結されたＲＮＡ配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構築物。
9. ＤＮＡディスプレイ化合物であり、前記ＤＮＡディスプレイが、ポリペプチド保有し、かつ前記ポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドに連結されたＤＮＡを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構築物。
10. 前記ポリペプチド末端が、Ｃ末端であり、前記側鎖残基が、システインまたはリシンであり、前記リンカーの第１の末端が、酸性ｐＨにおいてＣ末端に対して反応性を有する反応性基を含み、前記リンカーの第２の末端が、チオールまたはアミン残基と特異的に反応する２つの求電子性基を含む、請求項１に記載の構築物。
11. 酸性ｐＨにおいてＣ末端に対して反応性を有する前記反応性基が、Ｃ末端選択的光レドックス脱炭酸コンジュゲート付加である、請求項１０に記載の構築物。
12. 前記リンカー求電子性基が、水中のチオールと反応性であり、ハロケトン、ハロアセトアミド、ハロベンジル、マレイミド、アクチラート、カルボニルアクリル試薬、３−アリールプロピオロニトリル、アレナミドフルオロアレーン、クロロテトラジン、ジュリア−コシエンスキ様試薬、２−アジドアクリラート、有機金属パラジウム試薬、有機金（Ｉ）試薬を含む共役Ｃ−Ｃ二重結合を含むマイケルアクセプター、チオールのデヒドロアラニン（Ｄｈａ）への変換、それに続くＤｈａへの共役付加などである、請求項４または１０に記載の構築物。
13. 前記リンカー求電子性基が、水中のアミンと反応性であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アリールエステル、パーフルオロアリールエステル、パーフルオロアレーン、ケテン、オルトフタルアルデヒド、またはひずみ放出アミン修飾剤などである、請求項４または１０に記載の構築物。
14. 前記リンカー求電子性基が、水中のフェノールと反応性であり、アリルパラジウム、ジアゾジカルボキシラート、ジアゾニウム塩、アニリン−ホルムアルデヒドヘミアミナール、ロジウムカルベノイド、ジロジウムメタロペプチド触媒、マンガン触媒Ｃ−Ｈアルキニル化、ワザー試薬、１−［（トリイソプロピルシリル）エチニル］−１，２−ベンズヨードキソール−３（１Ｈ）−オン（ＴＩＰＳ−ＥＢＸ）、金（Ｉ）触媒下、選択的ルテニウム−（ＩＩ）触媒Ｃ−Ｈ活性化、水中のヨウ化アリールによる酢酸パラジウム（ＩＩ）触媒Ｃ−Ｈ活性化などである、請求項４または１０に記載の構築物。
15. 前記ポリペプチドが、末端セリン残基および少なくとも２、３、４、または５つのアミノ酸残基によって分離された２つのシステイン残基を含む、請求項１に記載の構築物。
16. 前記リンカーが、１〜６つの炭素原子を有するアルキル鎖を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の構築物。
17. 前記ポリペプチドが、天然のタンパク新生アミノ酸のみを含み、かつ／または遊離Ｎ末端を含まない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の構築物。
18. ファージディスプレイ複合体を作製するための方法であって、（ｉ）末端を有するポリペプチドを含むファージ粒子を準備し、（ｉｉ）第１の末端および２つの反応性基を含む第２の末端を有するリンカーを準備し、前記リンカーの第１の末端を前記ポリペプチド末端とライゲートして、共有結合を形成することにより中間複合体を形成し、（ｉｉｉ）前記リンカーの第２の末端の両方の反応性基を前記ポリペプチドの側鎖残基に反応させることにより、前記中間複合体から二環式構造を形成することを含む、方法。
19. ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が独立しており、連続的である、請求項１８に記載の方法。
20. ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が異なるｐＨで実行される、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 前記ポリペプチドの末端が、Ｎ末端であり、前記ライゲーションステップの前にアルデヒドに酸化され、前記ライゲーションステップが、酸性ｐＨの水性緩衝液中でＮ末端アルデヒドを含むポリペプチドをリンカーと混合することを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記中間複合体が、サイズ排除精製などによって、約ｐＨ５未満などの酸性ｐＨの水性緩衝液中でのゲル濾過または透析などによって精製される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記精製された中間複合体が、前記二環化ステップの前に、ＴＣＥＰなどの還元剤で還元される（「還元ステップ」）、請求項２２に記載の方法。
24. 前記還元された中間複合体が、７以上のｐＨに曝露されて二環化を誘導し、前記第２の末端反応性基が、それぞれチオール反応性基を含み、前記ポリペプチドが、２つのシステイン残基を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 請求項１８〜２４のうちの一項に記載の少なくとも１つのステップ後の反応の収率を測定するための方法であって、未反応のポリペプチドに反応性であるが、反応済みのポリペプチドに反応性ではない捕捉試薬に前記ポリペプチドを曝露するステップ、および親和性試薬による捕捉剤の取り込みを測定するステップを含む、方法。
26. 前記捕捉剤が、反応性基およびビオチン−ストレプトアビジン、ＦＬＡＧペプチド−抗ＦＬＡＧ抗体、スルホンアミド−炭酸脱水酵素、メトトレキサート−デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）などの親和性試薬と対になった親和性ハンドルを含み、好ましくは、前記親和性ハンドルまたは前記親和性試薬が、アガロースビーズなどの固体支持体上に固定化される、請求項２５に記載の方法。
27. 捕捉剤反応性基が、アミノオキシ基などのアルデヒド反応性基、またはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基である、請求項２６に記載の方法。
28. 少なくとも１つのステップが、（ｉ）前記酸化ステップ後のアミノオキシビオチン（ＡＯＢ）へファージを曝露し、（ｉｉ）反応物を少なくとも１桁希釈し、（ｉｉｉ）ストレプトアビジンビーズを追加し、（ｉｖ）捕捉後に残っているファージ粒子の数を測定することを含む、請求項２１に記載の酸化ステップであり、これにより、前記ストレプトアビジンビーズ上に保持されたファージの数の差が、酸化ステップの収率（アルデヒド基を獲得したファージ粒子の割合）を構成する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 少なくとも１つのステップが、（ｉ）前記ライゲーションステップの前後のアミノオキシビオチン（ＡＯＢ）へファージの曝露し、（ｉｉ）反応物を少なくとも１桁希釈し、（ｉｉｉ）ストレプトアビジンビーズを追加し、（ｉｖ）捕捉後に残っているファージ粒子の数を測定することを含む、請求項２１に記載のライゲーションステップであり、これにより、前記ストレプトアビジンビーズ上に保持されたファージの数の差が、ライゲーションステップの収率（アルデヒド基を失ったファージ粒子の割合）を構成する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
30. 少なくとも１つのステップが、（ｉ）前記還元ステップの前後のビオチン−ヨードアセトアミド（ＢＩＡ）へファージを曝露し、（ｉｉ）反応物を少なくとも１桁希釈し、（ｉｉｉ）ストレプトアビジンビーズを追加し、（ｉｖ）捕捉後に残っているファージ粒子の数を測定することを含む請求項２３に記載の還元ステップであり、前記ストレプトアビジンビーズ上に保持されたファージの数の差が、還元ステップの収率（還元ステップ中にチオール基を獲得したファージ粒子の割合）を構成する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
31. 少なくとも１つのステップが、（ｉ）前記二環化ステップの前後のビオチン−ヨードアセトアミド（ＢＩＡ）またはビオチン−チオール（ＢＳＨ）へファージを曝露し、（ｉｉ）反応物を少なくとも１桁希釈し、（ｉｉｉ）ストレプトアビジンビーズを追加し、（ｉｖ）捕捉後に残っているファージ粒子の数を測定することを含む請求項２４に記載の二環化ステップであり、これにより、前記ストレプトアビジンビーズ上に保持されたファージの数が、二環化ステップの収率（前記二環化ステップ中にチオール基を失ったファージ粒子の割合）を構成する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
32. 請求項１に記載されるように二環式構造を形成する複数の異なるペプチド配列を含む、遺伝的にコードされたリガンドのライブラリー。
33. 少なくとも２つのペプチドＰ１およびＰ２が、ＤＮＡ配列によって別々にコードされる、請求項３２に記載のライブラリー。
34. 前記少なくとも２つの異なるペプチド配列Ｐ１およびＰ２を含み、それぞれが少なくとも２つの異なるリンカーＬ１およびＬ２で別々に修飾され、少なくとも４つの別個の構築物Ｐ１Ｌ１、Ｐ１Ｌ２、Ｐ１Ｌ２、およびＰ２Ｌ２を形成する、請求項３３に記載のライブラリー。
35. リンカーＬ１が、事前定義された核酸コードＢ１に関連する２つのペプチドと反応し、リンカーＬ２が、事前定義された核酸コードＢ２に関連する２つのペプチドと反応する、請求項３４に記載の混合ライブラリー。
36. 前記核酸コードがサイレント遺伝子バーコードである、請求項３５に記載の混合ライブラリー。
37. リガンドに結合することができる請求項１〜３６のいずれかに記載の複合体を同定するための方法であって、（ｉ）複合体のライブラリーを前記リガンドと接触させ、（ｉｉ）前記リガンドに結合するそれらの複合体を選択し、（ｉｉｉ）ペプチドおよび／またはリンカーの構造をコードする核酸を配列決定することによって、結合複合体の構造を同定することを含む、方法。
38. 前記複合体のライブラリーが、請求項３４に記載されるように少なくとも４つの別個の構築物Ｐ１Ｌ１、Ｐ１Ｌ２、Ｐ１Ｌ２、Ｐ２Ｌ２を含み、前記複合体が、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のとおりである、請求項３７に記載の方法。
39. ＳＰＣＱＲＧＨＭＦＣまたはＳＹＣＫＲＡＨＫＮＣを含むポリペプチド、およびＴＳＬ６を含むリンカーから形成された請求項１の複合体を含む、Ｎｏｄａｌアンタゴニストペプチド。
    

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