JP2022526939A - 修飾された切断酵素、その使用、および関連キット - Google Patents

修飾された切断酵素、その使用、および関連キット Download PDF

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Abstract

本明細書において提供されるのは、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質からアミノ酸を除去するための修飾された切断酵素である。ポリペプチドを処理するために修飾された切断酵素を使用する方法、およびこの修飾された切断酵素を含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、方法およびキットはまた、巨大分子配列決定および／または分析のための他の成分を含む。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０１９年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８２３，９２７号、２０１９年３月２６日に出願された同第６２／８２４，１５７号、および２０１９年１１月６日に出願された同第６２／９３１，７３７号に対する優先権を主張し、これらの開示および内容は、参照によりそれらの全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
連邦政府資金による研究の記載
本発明は、助成金番号１Ｒ４３ＧＭ１３０１８５－０１の下で米国国立衛生研究所の国立総合医科学研究所によって授与された政府支援を受けてなされた。米国政府は、この助成金に従って、本発明に関して一定の権利を有する。
ＡＳＣＩＩテキストでの配列表
本特許または出願ファイルには、コンピュータで読み取り可能なＡＳＣＩＩテキスト形式で提出された配列表（ファイル名：４６１４－２００１３４０＿２０２００３２３＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年３月２３日、サイズ：１８４，９８０バイト）が含まれる。配列表ファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、修飾されたペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含む、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質からアミノ酸を切断するための修飾された切断酵素に関する。ポリペプチドを処理するために修飾された切断酵素を使用する方法、および修飾された切断酵素を含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、方法およびキットはまた、巨大分子配列決定および／または分析のための他の成分を含む。
ペプチドおよびタンパク質の分解に関与する酵素、例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼなどは、ペプチド結合を加水分解する（Ｓａｎｄｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）２６：７９５－８０７）。さまざまなペプチダーゼが、多くの生物において、およびさまざまな組織から、単離および発見されている。アミノペプチダーゼは、単量体および多量体酵素として天然に存在し、金属またはＡＴＰ依存性である可能性がある。一部の基質特異性ペプチダーゼは、ペプチドのアミノ末端から一度に１つまたは２つのアミノ酸残基を特異的に除去するが、他のペプチダーゼは、タンパク質またはペプチドのカルボキシ末端から除去する。一般に、天然のアミノペプチダーゼは特異性が限られており、アミノ酸を段階的に（ｉｎ ａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ ｍａｎｎｅｒ）脱離させ、次々とアミノ酸を脱離させる。
いくつかの実施形態において、ペプチド分解のための方法は、タンパク質分析および／または配列決定における用途に有用である。例えば、ペプチド配列決定は、一連の化学修飾および下流のＨＰＬＣ分析または質量分析を通じてペプチド上のＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）の段階的分解を実現するためのエドマン分解を含み得る。しかしながら、一般に、エドマン分解によるペプチド配列決定は、制限される可能性があり、例えば、典型的なエドマン分解では、長いインキュベーション時間の間、高温かつ過酷な化学的条件（例えば、強酸、ＴＦＡ無水物）を導入する必要がある。場合によっては、エドマン分解は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を使用する分析方法など、過酷な化学的条件に敏感なタンパク質分析方法のためのプロセスと適合しない可能性がある。
したがって、アミノ酸を分解するための改善された試薬に対する必要性が依然として存在する。例えば、ポリペプチドからアミノ酸を除去する、脱離させる、または切断するための酵素的方法が所望され得る。さらに、所望のアミノ酸に結合し、それらをポリペプチドから除去することができるさらなる基質特異的酵素の利用可能性もまた所望される。場合によっては、アミノ酸を除去するためのそのような改善された試薬は、タンパク質の配列決定および／または分析に有用である。本開示は、これらおよび他の関連する必要性を満たす。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の発明を実施するための形態を参照することで明らかになるであろう。この目的のために、特定の背景情報、手順、化合物、および／または組成物をより詳細に説明するさまざまな参考文献が本明細書に記載されており、各々、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｓａｎｄｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）２６：７９５－８０７
本発明の概要は、特許請求される主題の範囲を制限するために使用されることを意図しない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付の図面および添付の特許請求の範囲に開示された態様を含む、発明を実施するための形態から明らかになるであろう。
本明細書において提供されるのは、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された切断酵素であって、修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成される、修飾された切断酵素である。本明細書において提供されるのは、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された切断酵素であって、修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成される、修飾された切断酵素である。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識末端アミノ酸を除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識ジペプチド（末端および最後から２番目の末端アミノ酸）を除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、野生型または未修飾の切断酵素（例えば、ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素）に由来する。例えば、未修飾の切断酵素は、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である。
本明細書において提供されるのは、ポリペプチドを処理する方法であって、ポリペプチドを、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と接触させることを含み、当該修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去する、方法である。本明細書において提供されるのは、ポリペプチドを処理する方法であって、ポリペプチドを、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と接触させることを含み、当該修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去する、方法である。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素で処理されたポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識末端アミノ酸を除去する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素で処理されたポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識ジペプチド（末端および最後から２番目の末端アミノ酸）を除去する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、野生型または未修飾の切断酵素（例えば、ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素）に由来する。例えば、未修飾の切断酵素は、ＥＣ ３．４．１４、ＥＣ ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である。いくつかの実施形態において、この方法は、ポリペプチドを、ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ポリペプチドを、ポリペプチドの末端アミノ酸に結合することができる結合剤と接触させることをさらに含み、結合剤は、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む。いくつかの実施形態において、この方法はまた、コーディングタグの識別情報をポリペプチドに付着した記録タグに転送し、それによってポリペプチド上に伸長記録タグ（複数可）を生成することをさらに含む。場合によっては、この方法は、結合剤を除去することをさらに含む。いくつかのさらなる実施形態において、この方法は、１つ以上の伸長記録タグを分析することをさらに含む。いくつかのさらなる実施形態において、この方法は、上記ステップのいくつかまたはすべてを１回以上繰り返すことをさらに含む。
また、本明細書において提供されるのは、ポリペプチドを分析するための方法であって、（ａ）ポリペプチドを、ポリペプチドの末端アミノ酸に結合することができる結合剤と接触させるステップであって、結合剤が、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと、（ｂ）コーディングタグの識別情報をポリペプチドと関連付けられた記録タグに転送して、伸長記録タグを生成するステップと、（ｃ）ポリペプチドを試薬と接触させて、ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するステップと、（ｄ）ポリペプチドを、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と接触させるステップと、を含み、修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ステップ（ｃ）において試薬によって標識された単一の末端アミノ酸をポリペプチドから除去するか、または除去するように構成されるか、あるいは、修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ステップ（ｃ）において試薬によって標識された単一の末端アミノ酸または単一の末端ジペプチドをポリペプチドから除去するか、または除去するように構成される、方法である。
本明細書において提供されるのは、ポリペプチドを処理するためのキットであって、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と、ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するための試薬と、を含む、キットである。いくつかの態様において、修飾された切断酵素は、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、もしくまたは除去するように構成されるか、あるいは、修飾された切断酵素は、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成される。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の結合剤をさらに含み、各結合剤は、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む。いくつかの実施形態において、キットは、コーディングタグの識別情報をポリペプチドに付着した記録タグに転送するための試薬をさらに含み、識別情報の記録タグへの転送により、ポリペプチド上に伸長記録タグが生成される。いくつかの実施形態において、キットは、伸長記録タグを増幅するための１つ以上の増幅試薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の基質または支持体をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットはまた、核酸配列決定分析のための試薬を含む。
添付の図面を参照して、本発明の非限定的な実施形態を例として説明する。図面は模式的であり、正確な縮尺は意図されない。例示目的上、すべての構成要素がすべての図面において標識されるとは限らず、また、当業者が本発明を理解することを可能にするために例示が必要とされない場合は、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されるとも限らない。
本明細書において提供される例示的な修飾された切断酵素による単一の修飾アミノ酸の除去を示す概略図である。図１Ａの左側では、ジペプチド切断酵素に由来する例示的な未修飾の切断酵素が、ポリペプチドのＮ末端から２つのアミノ酸を除去し、最後から２番目のアミノ酸（Ｐ２）残基と最後から３番目のアミノ酸（Ｐ３）残基との間の結合を切断する。右側では、ジペプチド切断酵素に由来する例示的な修飾された切断酵素が、ポリペプチドのＮ末端から単一の標識アミノ酸を除去し、標識末端アミノ酸（Ｐ１；ひし形は標識を示す）と最後から２番目のアミノ酸残基（Ｐ２）との間の結合を切断する。図１Ｂの左側では、トリペプチド切断酵素に由来する例示的な未修飾の切断酵素が、ポリペプチドのＮ末端から３つのアミノ酸を除去し、Ｃ末端のＮ末端の最後から３番目のアミノ酸への（Ｐ３とＰ４との間）結合を切断する。図１Ｂの右側では、２つの例示的な修飾された切断酵素は、トリペプチド切断酵素に由来する。上部では、修飾されたトリペプチド切断酵素が、ポリペプチドのＮ末端から単一の標識アミノ酸を除去し、標識末端アミノ酸（Ｐ１；ひし形は標識を示す）と最後から２番目のアミノ酸残基（Ｐ２）との間の結合を切断する。下部では、修飾されたトリペプチド切断酵素が、ポリペプチドのＮ末端から標識ジペプチド（Ｐ１－Ｐ２）を除去し、最後から２番目の末端アミノ酸残基（Ｐ２）と最後から３番目のアミノ酸残基（Ｐ３）との間の結合を切断する。 同上。 修飾された切断酵素および末端アミノ酸標識を使用する末端アミノ酸除去のサイクルを描いた概略図である。図２Ａ～２Ｂでは、標識Ｎ末端アミノ酸残基を有するポリペプチドが、修飾された切断酵素によって末端アミノ酸と最後から２番目のアミノ酸との間の結合で切断され、標識末端アミノ酸が放出される。図２Ｃでは、新たな末端アミノ酸が標識され、修飾された切断酵素は、さらなる切断および放出のために、新たな標識末端アミノ酸を認識することができる。 Ｎ末端アミノ酸を標識するための異なる例示的な試薬を用いるＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）変換効率を示す。２つの異なるペプチドを溶液中で試験した：Ｎ末端Ｇ（ＮＴ－Ｇ）＝ＧＲＦＳＧＩＹ（配列番号４０）；Ｎ末端Ｗ（ＮＴ－Ｗ）＝ＷＴＱＩＦＧＡ（配列番号４１）。ＬＣ－ＭＳを使用して変換効率を定量化した。 ６０％の配列類似性または同一性を有するＤＡＰ ＢＩＩ相同体の配列保存のＷｅｂＬｏｇｏ分析からの結果を示す。各スタックの高さは、その位置での配列保存を示し（ビット単位で測定）、スタック内の記号の高さは、示された位置での対応するアミノ酸の相対頻度を反映する（配列番号２０を参照）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
本明細書において提供されるのは、突然変異（例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上の修飾）を含む修飾された切断酵素、および修飾された切断酵素を選択、操作、および使用する関連方法である。本明細書において提供されるのは、ポリペプチドを（例えば化学試薬で）標識し、標識されたポリペプチドを修飾された切断酵素で処理して、標識末端アミノ酸をポリペプチドから除去するための方法である。修飾された切断酵素を含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素を含むキットは、配列決定および／または分析などのために、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を処理するために使用される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素を使用するタンパク質分析は、分子認識事象のバーコーディングおよび核酸コーディング、ならびに／または検出可能な標識を使用する。いくつかの実施形態において、キットはまた、タグ（例えば、ＤＮＡタグまたはＤＮＡ記録タグ）、固体支持体、ならびにポリペプチドを調製するための他の試薬およびポリペプチド分析のための他の試薬を含む、ポリペプチドを処理するための他の成分を含む。
ペプチド結合を加水分解することによってペプチドおよびタンパク質を分解するさまざまな酵素（例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ）が、多くの生物において、さまざまな組織から単離および発見されてきた。しかしながら、天然のアミノペプチダーゼは特異性が限られている可能性があり、一般的にはＮ末端アミノ酸を段階的に脱離させ、次々とアミノ酸を脱離させる。一部の基質特異的ペプチダーゼは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端から一度に１つまたは２つのアミノ酸残基を特異的に除去する。
いくつかの実施形態において、ペプチド分解のための方法は、タンパク質分析および／または配列決定における用途に有用である。例えば、ペプチド配列決定は、一連の化学修飾および下流のＨＰＬＣ分析または質量分析を通じてペプチド上のＮ末端アミノ酸の段階的分解を実現するためのエドマン分解を含み得る。しかしながら、一般に、エドマン分解によるペプチド配列決定は、制限される可能性があり、例えば、典型的なエドマン分解では、長いインキュベーション時間の間、高温かつ過酷な化学的条件（例えば、強酸、ＴＦＡ無水物）を導入する必要がある。場合によっては、エドマン分解は、核酸（例えば、ＤＮＡなど）を使用する分析方法など、過酷な化学的条件に敏感なタンパク質分析方法のためのプロセスと適合しない可能性がある。
したがって、ポリペプチドからアミノ酸を分解するための改良型試薬および技術に対する必要性が残っている。例えば、ポリペプチドからアミノ酸を除去する、脱離させる、または切断するための酵素的方法が所望され得る。本明細書において提供されるのは、そのような必要性を満たす修飾されたペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、ポリペプチドからアミノ酸を除去するための酵素的方法および試薬である。場合によっては、提供される修飾された酵素（例えば、切断酵素）によるアミノ酸の除去を使用して、ポリペプチドからアミノ酸を段階的に分解する。いくつかの実施形態において、提供される修飾された切断酵素によるアミノ酸の除去は、ポリペプチドからアミノ酸を周期的に除去するのに好適である。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識末端アミノ酸を除去する。例えば、修飾された切断酵素は、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識ジペプチド（末端および最後から２番目の末端アミノ酸）を除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、野生型または未修飾の切断酵素（例えば、ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素）に由来する。例えば、未修飾の切断酵素は、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である。例えば、修飾された切断酵素は、野生型または未修飾の切断酵素（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、またはジペプチジルカルボキシペプチダーゼ）に由来する。
いくつかの実施形態において、ペプチダーゼは、標識で修飾された場合にのみ、特定の末端アミノ酸への特異的結合または触媒活性を有するように操作され得る。例えば、切断酵素は、野生型または未修飾の切断酵素と比較して、化学標識によって標識される場合にのみ末端アミノ酸を除去するように、操作または修飾され得る。この例示的なアプローチを使用して、修飾された切断酵素は、ポリペプチドの末端から標識されたアミノ酸（複数可）のみを脱離させ、所望の方式で分解の制御を可能にする。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識末端アミノ酸を除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識末端ジペプチド（末端および最後から２番目の末端アミノ酸）を除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、標識に対して選択的である一方で、アミノ酸残基の同一性に関して非選択的である（例えば、任意の標識末端アミノ酸を除去する）。いくつかの他の実施形態において、修飾された切断酵素は、特定のアミノ酸残基またはアミノ酸クラス（例えば、ポリペプチドのＰ１および／またはＰ２末端位置）に対していくらかの優先性を示す。場合によっては、特定のアミノ酸（またはアミノ酸クラス）に対して異なる優先性を有する２つ以上の修飾された切断酵素を組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＮ末端に結合し、そこからアミノ酸を除去する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端に結合し、そこからアミノ酸を除去する。
いくつかの実施形態において、既知のペプチダーゼは、結合および／または切断のための特定の特徴を達成するように修飾され得る。酵素的Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）分解の特異性を改変するモデルの例としては、ロイシンアミノペプチダーゼに変換されたメチオニンアミノペプチダーゼが含まれる（Ｂｏｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．（２０１４）２３（３）：３１２－３２０）。別の例では、アミノペプチダーゼ突然変異体を、標識された（ビオチン化された）ＮＴＡＡの個々のまたは小さなグループに結合し、それらを脱離させるように操作された（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０６５３２２号を参照）。本明細書において提供されるのは、ポリペプチド上の化学的に修飾された（例えば、ＰＴＣ／ＤＮＰ／アセチル／Ｃｂｚ修飾された）末端アミノ酸などの標識末端アミノ酸を除去するように選択または修飾される、修飾された切断酵素である。いくつかの実施形態において、野生型の切断酵素は、標識として存在するＰＴＣ／ＤＮＰ／アセチル／Ｃｂｚ基を有するＮ末端アミノ酸のみを切断または除去するように、（例えば、構造機能に基づく設計および／または指向性進化を使用して）操作される。いくつかの例では、除去されるべき末端アミノ酸は、Ｃｂｚ標識された末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、除去された標識末端アミノ酸は、単一のアミノ酸として、またはジペプチドの一部として除去される。
特定の実施形態において、コンパクトな単量体金属酵素アミノペプチダーゼは、イソチオ尿素またはＣｂｚ標識ＮＴＡＡを認識して脱離させるように操作される。場合によっては、修飾されたペプチダーゼは、メタロペプチダーゼであり、活性化のために金属イオンを必要とする。いくつかの実施形態において、単量体メタロアミノペプチダーゼの使用は、２つの重要な利点を有する：１）コンパクトな単量体タンパク質は、ファージディスプレイを使用して提示およびスクリーニングすることがより容易である；２）メタロアミノペプチダーゼは、好適な金属カチオンを追加または除去することにより、その活性を自由にオン／オフすることができるという独自の利点を有する。未修飾の切断酵素は、任意の好適な生物に由来し得る。いくつかの例において、野生型または未修飾の切断酵素は、哺乳類（例えば、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、真菌もしくは酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または細菌（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍｅｘｉｃａｎａもしくはＣａｌｄｉｔｈｒｉｘ ａｂｙｓｓｉ）に由来する。場合によっては、これらの酵素は安定しており、堅牢で、室温およびｐＨ値８．０付近で活性があるため、ペプチド分析に好ましい穏やかな条件に適合する。いくつかの実施形態において、標識された修飾または末端アミノ酸（複数可）を高温で除去してペプチドの二次構造を最小化することができる好熱性切断酵素を有することが好ましい。
別の実施形態において、アミノ酸の周期的脱離または除去は、末端アミノ酸標識の存在下でのみ活性であるようにペプチダーゼ（例えば、切断酵素）を操作することによって達成される。いくつかの実施形態において、標識は、化学標識である。場合によっては、標識は、ブロックアミノ酸もしくは標識アミノ酸であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、標識は、外因性の標識または修飾アミノ酸を含む。さらに、ペプチダーゼは、１つの特定のアミノ酸を別のアミノ酸よりも選択的に認識するのではなく、標識を有する末端の任意のアミノ酸を認識するように、非特異的であるように操作され得る。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上などのアミノ酸に対して選択的である。
いくつかの実施形態において、提供される修飾された切断酵素は、サンプルから得られたポリペプチドを処理するために使用される。場合によっては、サンプルおよび／またはサンプルから得られたポリペプチドを、ポリペプチドを消化するなど、ポリペプチドを処理するための他の試薬で処理する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、サンプルから得られた複数のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、対象から得られる。
本開示の完全な理解を提供するために、以下の説明には多くの具体的な詳細が記載される。これらの詳細は、例示目的で提供されており、特許請求される主題は、これらの特定の詳細の一部または全部がなくても、特許請求の範囲に従って実施することができる。特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用することができ、構造変更を行うことができることを理解されたい。個々の実施形態のうちの１つ以上で説明されるさまざまな特徴および機能は、それらが説明される特定の実施形態へのそれらの適用可能性に関して限定されないことを理解されたい。代わりに、それらは、そのような実施形態が説明されるかどうか、およびそのような特徴が説明される実施形態の一部として提示されるかどうかにかかわらず、単独で、またはある組み合わせで、本開示の他の実施形態の１つ以上に適用することができる。明確にするために、特許請求される主題に関連する技術分野で既知の技術項目（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）は、特許請求される主題が不必要に不明瞭とならない程詳細には説明されない。
本出願で言及される特許文書、科学論文およびデータベースを含むすべての出版物は、個々の出版物が参照により個別に組み込まれるのと同じ程度まで、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。出版物または文書の引用は、これらのいずれかが関連する先行技術であることを承認することを意図しておらず、これらの出版物または文書の内容または日付に関するいかなる承認を構成するものではない。
すべての見出しは、読者の利便性のために提供されるものであり、特に明記しない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきでない。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本章に記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願、および他の出版物に記載される定義に反するか、さもなければそれと矛盾する場合、本章に記載される定義は、参照により本明細書に組み込まれる定義よりも優先される。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別のことを指示する場合を除き、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「ペプチド（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つ以上のペプチド、またはペプチドの混合物を包含する。また、本明細書で使用される場合、具体的に述べられているか、または文脈から明らかである場合を除き、「または（ｏｒ）」という用語は、包括的であると理解され、「または（ｏｒ）」および「および（ａｎｄ）」の両方を包含する。
本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、当業者に容易に知られている各値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を包含（および説明）する。例えば、「約Ｘ」について言及する記載は、「Ｘ」についての記載を包含する。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全抗体を含むポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの一本鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む機能的（抗原結合）抗体断片を含む。この用語は、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロ共役抗体、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体、ダイアボディ、トライアボディ、ならびにテトラボディ、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖなどの遺伝子操作されたおよび／または他の方法で修飾された形態の免疫グロブリンを包含する。特に明記しない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、ＩｇＧおよびそのサブクラスなどの任意のクラスまたはサブクラスの抗体、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤを含む、インタクトまたは完全長の抗体を包含する。
「個体」または「被験体」には哺乳類が含まれる。哺乳類には、家畜類（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。「個体」または「対象」には、ニワトリなどの鳥類、魚類および哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネズミ、イヌ、ブタ、雌牛、雄牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類）などの脊椎動物が含まれる。特定の実施形態において、個体または被験体は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、分析物アッセイが望まれる分析物を含有し得るいかなるものをも指す。本明細書で使用される場合、「サンプル」は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。サンプルは、生物学的流体または生物学的組織などの生物学的サンプルであり得る。生物学的流体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織は、結合組織、上皮組織、筋肉組織、および神経組織など、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、またはウイルスの構造の構造材料のうちの１つを形成するそれらの細胞間物質と共に、通常は特定の種類の細胞の集合体である。生物学的組織の例としては、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈、および個々の細胞（複数可）も挙げられる。
いくつかの実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。本開示の生物学的サンプルは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性サンプル、または非水性サンプルの形態のサンプルを包含する。本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」は、生体もしくはウイルス（もしくはプリオン）供給源または巨大分子および生体分子の他の供給源から得られる任意のサンプルを含み、核酸、タンパク質および／もしくは他の巨大分子を得ることができる対象の任意の細胞型または組織を含む。生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接得られたサンプルまたは処理されたサンプルであり得る。例えば、増幅された単離核酸は、生物学的サンプルを構成する。生物学的サンプルとしては、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液、動植物からの組織および器官のサンプル、ならびにそれらに由来する処理されたサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは、組織もしくは体液、例えば、結合組織、上皮組織、筋肉組織もしくは神経組織；脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺、および内部血管；または、血液、尿、唾液、骨髄、精子、腹腔液、およびそれらの細画分、例えば、血清または血漿からなる群から選択される体液に由来することができる。
「レベル（ｌｅｖｅｌ）」または「レベル（ｌｅｖｅｌｓ）」という用語は、標的、例えば、疾患もしくは障害の病因の一部であり、定性的もしくは定量的に決定することができる物質もしくは生物の存在および／または量を言及するのに使用される。標的のレベルの「定性的」変化とは、通常の対照から得られたサンプルにおいて検出可能でないか、または存在する標的の出現または消失を指す。１つ以上の標的のレベルの「定量的」変化とは、正常な対照と比較した場合の標的のレベルの測定可能な増加または減少を指す。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチドおよびタンパク質を包含し、ペプチド結合によって接合された２つ以上のアミノ酸の鎖を含む分子を指す。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、２～５０個のアミノ酸を含み、例えば、２０～３０個を超えるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、二次、三次、またはより高次の構造を含まない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、３０個以上のアミノ酸を含み、例えば、５０個を超えるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、一次構造に加えて、二次、三次、またはより高次の構造を含む。ポリペプチドのアミノ酸は、最も典型的にはＬ－アミノ酸であるが、Ｄ－アミノ酸、修飾アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ポリペプチドは、天然に存在するか、合成的に産生されるか、または組換え的に発現され得る。ポリペプチドは、合成的に産生されるか、単離されるか、組換え的に発現されるか、または上記のような方法論の組み合わせによって産生され得る。ポリペプチドはまた、アミノ酸鎖を修飾する追加の基、例えば、翻訳後修飾を介して追加される官能基を含み得る。ポリマーは、直鎖状または分岐鎖状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、天然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との共役などの他の操作または修飾である。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、ペプチドの単量体サブユニットとして機能する、アミン基、カルボン酸基、および各アミノ酸に特異的な側鎖を含む有機化合物を指す。アミノ酸としては、２０個の標準的、天然または正準アミノ酸、および非標準的なアミノ酸が挙げられる。標準的な天然アミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、スレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸であり得る。非標準的なアミノ酸は、天然に存在するか、化学的に合成される修飾アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、非標準的タンパク質原性アミノ酸、または非タンパク質原性アミノ酸であり得る。非標準的なアミノ酸の例としては、セレノシステイン、ピロリシン、およびＮ－ホルミルメチオニン、β－アミノ酸、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３－置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環－置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、線状コアアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」という用語は、その翻訳、例えばリボソームによる翻訳が完了した後にペプチド上で生じる修飾を指す。翻訳後修飾は、共有結合による化学修飾または酵素修飾であり得る。翻訳後修飾の例としては、アシル化、アセチル化、アルキル化（メチル化を含む）、ビオチン化、ブチリル化、カルバミル化、カルボニル化、脱アミド化、脱イミノ化（ｄｅｉｍｉｎｉａｔｉｏｎ）、ジフタミド形成、ジスルフィド架橋形成、脱離（ｅｌｉｍｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、フラビン付着、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、グリピエーション、ヘムＣ付着、ヒドロキシル化、ヒプシン形成、ヨウ素化、イソプレニル化、脂質化、リポイル化、マロニル化、メチル化、ミリストリル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌｙｌａｔｉｏｎ）、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスホパンテテイン化、リン酸化、プロピオニル化、レチニリデンシフ塩基形成、Ｓ－グルタチオン付加、Ｓ－ニトロシル化、Ｓ－スルフェニル化、セレン化、スクシニル化、スルフィン化、ユビキチン化、およびＣ末端アミド化が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後修飾としては、ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の修飾が挙げられる。末端アミノ基の修飾としては、デスアミノ、Ｎ－低級アルキル、Ｎ－ジ－低級アルキル、およびＮ－アシル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾としては、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾（例えば、低級アルキルはＣ１～Ｃ４アルキルである）が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後修飾としては、アミノ末端とカルボキシ末端との間にあるアミノ酸の修飾（例えば、上記のものであるが、これらに限定されない）も挙げられる。翻訳後修飾という用語はまた、１つ以上の検出可能な標識を含むペプチド修飾を含み得る。
本明細書で使用される場合、「結合剤」という用語は、結合標的、例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドの成分もしくは機構に結合する、それと会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、それと一体化する、それを認識する、またはそれと組み合わされる（ｃｏｍｂｉｎｅｓ ｗｉｔｈ）核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、または小分子を指す。結合剤は、ポリペプチドまたはポリペプチドの成分もしくは機構と共有結合または非共有結合を形成し得る。結合剤はまた、核酸分子－ペプチドキメラ結合剤または炭水化物－ペプチドキメラ結合剤などの２タイプ以上の分子から構成されるキメラ結合剤であり得る。結合剤は、天然に存在するか、合成的に産生されるか、または組換え的に発現される分子であり得る。結合剤は、ポリペプチドの単一の単量体またはサブユニット（例えば、ポリペプチドの単一アミノ酸）に結合するか、またはポリペプチドの複数の連結されたサブユニット（例えば、より長いペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質分子のジペプチド、トリペプチド、またはより高次のペプチド）に結合し得る。結合剤は、線状分子または三次元構造（立体配座）とも呼ばれる）を有する分子に結合し得る。例えば、抗体結合剤は、線状ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に結合するか、または立体配座ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に結合し得る。結合剤は、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質分子のＮ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または介在ペプチドに結合し得る。結合剤は、ペプチド分子のＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、または介在アミノ酸に結合し得る。結合剤は、好ましくは、標識または修飾されていないアミノ酸よりも、化学的に修飾または標識されたアミノ酸（例えば、本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＩＶ）のいずれか１つの化合物を含む試薬によって標識されたアミノ酸）に結合し得る。例えば、結合剤は、好ましくは、標識または修飾されていないアミノ酸よりも、標識または修飾されたアミノ酸に結合し得る。結合剤は、ペプチド分子の翻訳後修飾に結合し得る。結合剤は、ポリペプチドの成分または機構への選択的結合を示し得る（例えば、結合剤は、２０個の可能な天然アミノ酸残基のうちの１つに選択的に結合し、他の１９個の天然アミノ酸残基には非常に低い親和性で結合するか、または全く結合しない可能性がある）。結合剤は、ポリペプチドの複数の成分または機構に結合することができるか、または結合するように構成される場合、低い選択的結合を示し得る（例えば、結合剤は、２つ以上の異なるアミノ酸残基に同様の親和性で結合する可能性がある）。結合剤は、リンカーによって結合剤に接合され得るコーディングタグを含み得る。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つの分子を接合するために使用されるヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、または非ヌクレオチド化学部分のうちの１つ以上を指す。リンカーを使用して、例えば、結合剤をコーディングタグと接合し、記録タグをポリペプチドと接合し、ポリペプチドを固体支持体と接合し、記録タグを固体支持体と接合する。特定の実施形態において、リンカーは、酵素反応または化学反応により、２つの分子を接合する（例えば、クリック化学）。
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、本明細書に記載の化合物に接続された任意の分子または部分を指す。「リガンド」は、化合物に付着した１つ以上のリガンドを指す場合がある。いくつかの実施形態において、リガンドは、ペンダント基または結合部位（例えば、結合剤が結合する部位）である。
本明細書で使用される場合、「プロテオーム」という用語は、任意の生物の、特定の時間にゲノム、細胞、組織、または生物によって発現されるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（それらの共役体または複合体を含む）の全セットを含み得る。一態様において、プロテオームは、規定された条件下で、所与の時間に、所与のタイプの細胞または生物において発現されるタンパク質のセットである。プロテオミクスは、プロテオームの研究である。例えば、「細胞プロテオーム」は、ホルモン刺激への曝露など、特定の一連の環境条件下で特定の細胞型において見られるタンパク質の集合を含み得る。生物の完全なプロテオームには、さまざまな細胞プロテオームのすべてからのタンパク質の完全なセットが含まれ得る。プロテオームには、特定の細胞レベル下の生体系におけるタンパク質の集合も含まれ得る。例えば、ウイルス内のすべてのタンパク質は、ウイルスプロテオームと呼ばれる可能性がある。本明細書で使用される場合、「プロテオーム」という用語は、キノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；ニュートリプロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質化、および／もしくはニトロシル化）によって規定されるプロテオームサブセット、例えば、ホスホプロテオーム（例えば、ホスホチロシン－プロテオーム、チロシン－キノーム、およびチロシン－ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは器官、発達段階、または生理学的もしくは病理学的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞周期、分化（もしくは脱分化）、細胞死、老化、細胞移動、形質転換、または転移などの細胞プロセスに関連するプロテオームサブセット；あるいはそれらの任意の組み合わせを含むが、これに限定されないプロテオームのサブセットを含む。本明細書で使用される場合、「プロテオミクス」という用語は、細胞、組織、および体液内のプロテオームの定量分析、ならびに細胞内および組織内のプロテオームの対応する空間分布を指す。さらに、プロテオミクス研究には、生物学および規定された生物学的または化学的刺激の関数として経時的に継続変化するプロテオームの動的状態が含まれる。
遊離アミノ基を有するペプチドまたはポリペプチド鎖の一端の末端アミノ酸は、本明細書では「Ｎ末端アミノ酸」（ＮＴＡＡ）と呼ばれる。遊離カルボキシル基を有する鎖のもう一方の末端の末端アミノ酸は、本明細書では「Ｃ末端アミノ酸」（ＣＴＡＡ）と呼ばれる。ペプチドの長さが「ｎ」個のアミノ酸である場合、ペプチドを構成するアミノ酸には、順に番号を付けることができる。本明細書で使用される場合、ＮＴＡＡは、ｎ番目のアミノ酸（本明細書では「ｎＮＴＡＡ」とも呼ばれる）と見なされる。この命名法を使用すると、次のアミノ酸は、ｎ－１個のアミノ酸、次いでｎ－２個のアミノ酸というように、ペプチドのＮ末端からＣ末端までの長さを下っていく。特定の実施形態において、ＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、またはその両方は、部分または化学部分で修飾または標識され得る。
本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、ポリペプチド、結合剤、結合サイクルからの結合剤のセット、サンプルポリペプチド、サンプルのセット、コンパートメント（例えば、液滴、ビーズ、もしく分離された位置）内のポリペプチド、コンパートメントのセット内のポリペプチド、ポリペプチドの画分、ポリペプチド画分のセット、空間領域もしくは空間領域のセット、ポリペプチドのライブラリー、または結合剤のライブラリーについての固有の識別子タグまたは起源情報を提供する、約２～約３０塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基）の核酸分子を指す。バーコードは、人工的な配列または天然に存在する配列であり得る。特定の実施形態において、バーコードの集団内の各バーコードは異なる。他の実施形態において、バーコードの集団におけるバーコードの一部分は異なり、例えば、バーコードの集団におけるバーコードの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％異なる。バーコードの集団は、ランダムに生成されるか、またはランダムではなく生成される可能性がある。特定の実施形態において、バーコードの集団は、エラー訂正バーコードである。バーコードを使用して、多重化された配列決定データを計算によりデコンボリューションし、個々のポリペプチド、サンプル、ライブラリーなどに由来する配列リードを識別することができる。また、バーコードを使用して、マッピングを強化するために小さなコンパートメントに分配されたポリペプチド集合のデコンボリューションすることもできる。例えば、ペプチドをプロテオームにマッピングし直すのではなく、ペプチドを元のタンパク質分子またはタンパク質複合体にマッピングし直す。
本明細書で使用される場合、「コーディングタグ」という用語は、その関連する結合剤に関する識別情報を含む、任意の好適な長さを有するポリヌクレオチド、例えば、２～１００（２および１００を含む）の任意の整数を含む、約２塩基～約１００塩基の核酸分子を指す。「コーディングタグ」は、「配列決定可能なポリマー」から作製することもできる（例えば、Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．５：２８２－２９２；Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：７２３７；Ｌｕｔｚ，２０１５，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ４８：４７５９－４７６７（その各々は参照によりその全体が組み込まれる）を参照）。コーディングタグは、エンコーダー配列を含み得、このエンコーダー配列には、任意選択的に、片側に１つのスペーサーが隣接するか、任意選択的に、両側にスペーサーが隣接する。コーディングタグはまた、任意選択的なＵＭＩおよび／または任意の結合サイクル固有のバーコードで構成され得る。コーディングタグは、一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖コーディングタグは、平滑末端、突出末端、またはその両方を含み得る。コーディングタグは、結合剤に直接付着しているコーディングタグ、結合剤に直接付着しているコーディングタグにハイブリダイズした相補配列（例えば、二本鎖コーディングタグの場合）、または伸長記録タグに存在するコーディングタグ情報を指す場合がある。特定の実施形態において、コーディングタグは、結合サイクル固有のスペーサーまたはバーコード、固有の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、「スペーサー」（Ｓｐ）という用語は、記録タグまたはコーディングタグの末端上に存在する、長さが約１塩基～約２０塩基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０塩基）の核酸分子を指す。特定の実施形態において、スペーサー配列は、一端または両端でコーディングタグのエンコーダー配列に隣接する。結合剤のポリペプチドへの結合に続いて、それらの関連するコーディングタグおよび記録タグ上の相補的スペーサー配列間のアニーリングは、それぞれ、プライマー伸長反応または記録タグ、コーディングタグ、またはジタグ構築物へのライゲーションを介した結合情報の伝達を可能にする。Ｓｐ’は、Ｓｐに相補的なスペーサー配列を指す。好ましくは、結合剤ライブラリー内のスペーサー配列は、同じ数の塩基を有する。共通の（共有または同一の）スペーサーを、結合剤ライブラリーで使用することができる。スペーサー配列は、特定の結合サイクルにおいて使用される結合剤を追跡するために、「サイクル特異的」配列を有し得る。スペーサー配列（Ｓｐ）は、すべての結合サイクルにわたって一定であるか、特定のクラスのポリペプチドに特異的であるか、または結合サイクル数に特異的である可能性がある。ポリペプチドクラス特異的スペーサーにより、完了した結合／伸長サイクルからの伸長記録タグに存在する同種結合剤のコーディングタグ情報が、後続の結合サイクルにおける同じクラスのポリペプチドを認識する別の結合剤のコーディングタグに、クラス特異的スペーサーを介してアニーリングすることができる。正確な同種の対の逐次的な結合によってのみ、相互作用するスペーサー要素および効果的なプライマー伸長がもたらされる。スペーサー配列は、記録タグ内の相補的スペーサー配列にアニーリングしてプライマー伸長（ポリメラーゼ伸長とも呼ばれる）反応を開始させるか、またはライゲーション反応用の「副木」を提供するか、または「粘着末端」ライゲーション反応を媒介するのに十分な数の塩基を含み得る。スペーサー配列は、コーディングタグ内のエンコーダー配列よりも少ない数の塩基を含み得る。
本明細書で使用される場合、「記録タグ」という用語は、コーディングタグの識別情報が転送され得るか、あるいは記録タグと関連付けられた巨大分子に関する識別情報（例えば、ＵＭＩ情報）がコーディングタグに転送され得る、部分、例えば、化学カップリング部分、核酸分子、または配列決定可能なポリマー分子を指す（例えば、Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．５：２８２－２９２；Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：７２３７；Ｌｕｔｚ，２０１５，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ４８：４７５９－４７６７（その各々は参照によりその全体が組み込まれる）を参照）。識別情報は、サンプル、画分、パーティション、空間位置、相互作用する隣接分子（複数可）、サイクル数などに関連する情報など、分子を特徴付ける任意の情報を含むことができる。さらに、ＵＭＩ情報の存在も識別情報として分類することができる。特定の実施形態において、結合剤がポリペプチドに結合した後、結合剤に連結したコーディングタグからの情報を、結合剤がポリペプチドに結合している間に、ポリペプチドと関連付けられた記録タグに転送することができる。他の実施形態において、結合剤がポリペプチドに結合した後、ポリペプチドと関連付けられた記録タグからの情報を、結合剤がポリペプチドに結合している間に、結合剤に連結されたコーディングタグに転送することができる。記録タグは、ポリペプチドに直接連結されるか、多官能性リンカーを介してポリペプチドに連結されるか、または固体支持体上でのその近接性（または共局在化）によってポリペプチドと会合され得る。記録タグは、その連結が、コーディングタグ情報を記録タグに、またはその逆に転送するために使用される方法と適合性がある限り、その５’末端または３’末端を介して、または内部で連結され得る。記録タグは、他の機能的成分、例えば、ユニバーサルプライミング部位、固有の分子識別子、バーコード（例えば、サンプルバーコード、画分バーコード、空間バーコード、コンパートメントタグなど）、コーディングタグのスペーサー配列に相補的であるスペーサー配列、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。記録タグのスペーサー配列は、好ましくは、ポリメラーゼ伸長を使用して、コーディングタグ情報を記録タグに転送する実施形態において、記録タグの３’末端にある。
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ伸長」とも呼ばれる「プライマー伸長」という用語は、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって触媒され、それにより、相補鎖にアニーリングする核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー、スペーサー配列）が、相補鎖を鋳型として使用してポリメラーゼによって伸長される反応を指す。
本明細書で使用される場合、「固有の分子識別子」または「ＵＭＩ」という用語は、ＵＭＩが連結される各巨大分子、ポリペプチド、または結合剤に、固有の識別子タグを提供する、長さが約３～約４０塩基（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０塩基）の核酸分子を指す。ポリペプチドＵＭＩを使用して、複数の伸長記録タグからの配列決定データを計算によりデコンボリューションして、個々のポリペプチドに由来する伸長記録タグを識別できる。ポリペプチドＵＭＩを使用して、ＮＧＳリードを固有のＵＭＩに折り畳むことにより、元のポリペプチド分子を正確に計数することができる。結合剤ＵＭＩを使用して、特定のポリペプチドに結合する個々の分子結合剤を識別することができる。例えば、ＵＭＩを使用して、特定のペプチド分子に対して発生する単一のアミノ酸に特異的な結合剤の個々の結合事象の数を特定することができる。ＵＭＩおよびバーコードを両方とも結合剤またはポリペプチドに関連して参照する場合、バーコードは、個々の結合剤またはポリペプチドに関するＵＭＩ以外の識別情報を指す（例えば、サンプルバーコード、コンパートメントバーコード、結合サイクルバーコード）ことが理解される。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」または「ユニバーサルプライミング配列」という用語は、ライブラリーの増幅および／または配列決定反応に使用され得る核酸分子を指す。ユニバーサルプライミング部位には、ＰＣＲ増幅用のプライミング部位（プライマー配列）、いくつかの次世代シーケンシングプラットフォームにおいてブリッジ増幅を可能にするフローセル表面上の相補的オリゴヌクレオチドにアニーリングするフローセルアダプター配列、シーケンシングプライミング部位、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ユニバーサルプライミング部位は、次世代デジタルシーケンシングと組み合わせて一般的に使用されるものを含む、他のタイプの増幅に使用することができる。例えば、伸長記録タグ分子を環状化し、ユニバーサルプライミング部位をローリングサークル増幅に使用して、配列決定鋳型として使用することができるＤＮＡナノボールを形成することができる（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：７８－８１）。あるいは、記録タグ分子を環状化し、ユニバーサルプライミング部位からのポリメラーゼ伸長によって直接配列決定することができる（Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：１１７６－１１８１）。「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」に関連して使用される場合の「フォワード」という用語は、「５」または「センス」と呼ばれる場合もある。「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」に関連して使用される場合の「リバース」という用語は、「３」または「アンチセンス」と呼ばれる場合もある。
本明細書で使用される場合、「伸長記録タグ」という用語は、結合剤のポリペプチドへの結合に続いて、少なくとも１つの結合剤のコーディングタグ（またはその相補的配列）の情報が転送された記録タグを指す。コーディングタグの情報は、直接的に（例えば、ライゲーション）または間接的に（例えば、プライマー伸長）記録タグに転送され得る。コーディングタグの情報は、酵素的または化学的に記録タグに転送され得る。伸長記録タグは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００以上のコーディングタグの結合剤情報を含み得る。伸長記録タグの塩基配列は、それらのコーディングタグによって識別される結合剤の結合の時間的および連続的な順序を反映し得るか、コーディングタグによって識別される結合剤の結合の一部の連続的順序を反映し得るか、またはコーディングタグによって識別される結合剤の結合のいかなる順序も反映しない可能性がある。特定の実施形態において、伸長記録タグに存在するコーディングタグ情報は、分析されているポリペプチド配列を、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性で表す。伸長記録タグが分析されているポリペプチド配列を１００％の同一性で表さない特定の実施形態において、エラーは、結合剤によるオフターゲットの結合、もしくは結合サイクルの「失敗」（例えば、結合サイクル中に結合剤がポリペプチドに結合できないことが原因で、プライマー伸長反応の失敗が原因で）、またはその両方に起因する可能性がある。
本明細書で使用される場合、「伸長コーディングタグ」という用語は、コーディングタグが接合する結合剤の、記録タグが関連付けられたポリペプチドへの結合後に、少なくとも１つの記録タグ（またはその相補的配列）の情報が転送されているコーディングタグを指す。記録タグの情報は、直接的に（例えば、ライゲーション）または間接的に（例えば、プライマー伸長）コーディングタグに転送され得る。記録タグの情報は、酵素的または化学的に転送され得る。特定の実施形態において、伸長コーディングタグは、１つの結合事象を反映する１つの記録タグの情報を含む。本明細書で使用される場合、「ジタグ」または「ジタグ構築物」または「ジタグ分子」という用語は、コーディングタグが接合する結合剤の、記録タグが関連付けられたポリペプチドへの結合後に、少なくとも１つの記録タグ（またはその相補的配列）および少なくとも１つのコーディングタグ（またはその相補配列）の情報が転送されている核酸分子を指す。記録タグおよびコーディングタグの情報は、間接的に（例えば、プライマー伸長）ジタグに転送され得る。記録タグの情報は、酵素的または化学的に転送され得る。特定の実施形態において、ジタグは、記録タグのＵＭＩ、記録タグのコンパートメントタグ、記録タグのユニバーサルプライミング部位、コーディングタグのＵＭＩ、コーディングタグのエンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコード、コーディングタグのユニバーサルプライミング部位、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書で使用される場合、「固体支持体」、「固体表面」、または「固体基質」、または「配列決定基質」、または「基質」という用語は、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用、またはそれらの任意の組み合わせを含む、当技術分野で既知の任意の手段によって、直接的または間接的にポリペプチドを関連付けることができる、多孔質材料および非多孔質材料を含めた任意の固体材料を指す。固体支持体は、二次元（例えば、平面）または三次元（例えば、ゲルマトリックスまたはビーズ）であり得る。固体支持体は、ビーズ、マイクロビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ＰＴＦＥ膜、ＰＴＦＥ膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、フローセル、信号変換電子機器を含めたバイオチップ、チャネル、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ ｄｉｓｃ）、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ポリマーマトリックス、ナノ粒子、またはミクロスフェアを含むが、これらに限定されない任意の支持体表面であり得る。固体支持体の材料としては、アクリルアミド、アガロース、セルロース、デキストラン、ニトロセルロース、ガラス、金、石英、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、デキストラン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。固体支持体はさらに、薄膜、膜、ボトル、皿、繊維、織繊維、チューブなどの成形ポリマー、粒子、ビーズ、ミクロスフェア、微粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例えば、固体表面がビーズである場合、ビーズは、セラミックビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、ポリアクリレートビーズ、メチルスチレンビーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、デキストランビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、制御多孔質ビーズ、シリカベースのビーズ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。ビーズは、球形であっても不規則な形状であってもよい。ビーズまたは支持体は、多孔質であり得る。ビーズのサイズは、ナノメートル、例えば１００ｎｍ～数ミリメートル、例えば１ｍｍまでの範囲であり得る。特定の実施形態において、ビーズのサイズは、約０．２ミクロン～約２００ミクロン、または約０．５ミクロン～約５ミクロンの範囲である。いくつかの実施形態において、ビーズは、直径約１、１．５、２、２、２．５、２．８、３、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１５、または２０μｍであり得る。特定の実施形態において、「ビーズ」固体支持体は、個々のビーズまたは複数のビーズを指す場合がある。いくつかの実施形態において、固体表面はナノ粒子である。特定の実施形態において、ナノ粒子のサイズは、直径が約１ｎｍ～約５００ｎｍ、例えば、直径が約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、または約２００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、直径が約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、または約５００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、直径が約２００ｎｍ未満である。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、３’－５’ホスホジエステル結合によって連結されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド類似体を指す。核酸分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド類似体は、天然ポリヌクレオチドに見られる標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、および、任意選択的に、リボースまたはデオキシリボース以外の修飾された糖部分（複数可）を有し得る。ポリヌクレオチド類似体は、ワトソンクリック塩基対形成による、標準的なポリヌクレオチド塩基への水素結合が可能な塩基を含み、類似体骨格は、オリゴヌクレオチド類似体分子と標準的なポリヌクレオチドの塩基との間の配列特異的な様式でのそのような水素結合を可能にする方式で塩基を提示する。ポリヌクレオチド類似体の例としては、異種核酸（ＸＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、γＰＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、２’－Ｏ－メチルポリヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキルリボシル置換ポリヌクレオチド、ホスホロチオエートポリヌクレオチド、およびボロノホスフェートポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド類似体は、例えば、７－デアザプリン類似体、８－ハロプリン類似体、５－ハロピリミジン類似体、またはヒポキサンチン、ニトロアゾール、イソカルボスチリル類似体、アゾールカルボキサミド、および芳香族トリアゾール類似体、または親和性結合のためのビオチン部分などの追加の官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を有する塩基類似体を含む任意の塩基と対になることができるユニバーサル塩基類似体を含む、プリンまたはピリミジン類似体を有し得る。いくつかの実施形態において、核酸分子またはオリゴヌクレオチドは、修飾されたオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、核酸分子またはオリゴヌクレオチドは、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、保護された塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、もしくはモルホリノＤＮＡ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、核酸分子またはオリゴヌクレオチドは、骨格修飾、糖修飾、または核酸塩基修飾される。いくつかの実施形態において、核酸分子またはオリゴヌクレオチドは、Ａｌｌｏｃなどの核酸塩基保護基、チランなどの求電子性保護基、アセチル保護基、ニトロベンジル保護基、スルホネート保護基、または従来の塩基不安定性保護基を有する。
本明細書で使用される場合、「核酸シーケンシング」は、核酸分子または核酸分子のサンプル中のヌクレオチドの順序の決定を意味する。
本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング」は、数百万～数十億の分子の並行した配列決定を可能にするハイスループットシーケンシング方法を指す。次世代シーケンシング方法の例としては、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、およびパイロシーケンシングが挙げられる。プライマーを固体基質に付着させ、相補配列を核酸分子に付着させることにより、プライマーを介して核酸分子を固体基質にハイブリダイズさせることができ、次いで、ポリメラーゼを使用して増幅することにより、固体基質上の別個の領域に複数のコピーを生成することができる（これらのグループ分けは、ポリメラーゼコロニーまたはポロニーと呼ばれる場合もある）。その結果、配列決定プロセス中に、特定の位置のヌクレオチドを複数回（例えば、数百回または数千回）配列決定することができる。このカバレッジの深度は「ディープシーケンシング」と呼ばれる。ハイスループット核酸シーケンシング技術の例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＢＧＩ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｈｅが提供するプラットフォーム、例えば、パラレルビーズアレイ、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、キャピラリー電気泳動、電子マイクロチップ、「バイオチップ」、マイクロアレイ、並列マイクロチップ、および単一分子アレイ（例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１１：１５４４－１５４６を参照）などのフォーマットが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「単一分子シーケンシング」または「第３世代シーケンシング」は、単一分子配列決定機器からの読み取りがＤＮＡの単一分子の配列決定によって生成される次世代シーケンシング方法を指す。段階的アプローチでのシーケンシングのために多数のＤＮＡ分子を並行してクローン化するために増幅に依存する次世代シーケンシング方法とは異なり、単一分子シーケンシングはＤＮＡの単一分子にインターロゲートし（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｓ）、増幅や同期を必要としない。単一分子シーケンシングには、各塩基の取り込み後にシーケンシング反応を一時停止する必要がある方法（「ウォッシュアンドスキャン」サイクル）と、読み取りステップ間で停止する必要がない方法が含まれる。単一分子シーケンシング方法の例としては、単一分子リアルタイムシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナノポアベースのシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）、デュープレックスインタラプテッドナノポアシーケンシング、および高度な顕微鏡を使用するＤＮＡの直接イメージングが挙げられる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドを「分析する」とは、ポリペプチドの成分の全部または一部分を識別、検出、定量化、特徴付け、区別、またはそれらの組み合わせを意味する。例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分析には、ペプチドのアミノ酸配列（連続または非連続）の全部または一部分を決定することが含まれる。ポリペプチドの分析には、ポリペプチドの成分の部分的な識別も含まれる。例えば、ポリペプチドタンパク質配列中のアミノ酸の部分的な識別は、可能なアミノ酸のサブセットに属するものとしてタンパク質中のアミノ酸を識別することができる。分析は通常、ｎＮＴＡＡの分析から始まり、ペプチドの次のアミノ酸（つまり、ｎ－１、ｎ－２、ｎ－３など）に進む。これは、ｎＮＴＡＡを脱離させ、それによってペプチドのｎ－１個のアミノ酸をＮ末端アミノ酸（本明細書では「ｎ－１ＮＴＡＡ」と呼ぶ）に変換することによって達成される。ペプチドの分析には、ペプチドの翻訳後修飾の存在および頻度決定も含まれ得る。これには、ペプチドの翻訳後修飾の順序に関する情報が含まれても、含まれなくてもよい。ペプチドの分析には、ペプチド中のエピトープの存在および頻度の決定も含まれ得る。これには、ペプチド内のエピトープの順序または位置に関する情報が含まれても、含まれなくてもよい。ペプチドの分析は、異なるタイプの分析の組み合わせ、例えば、エピトープ情報、アミノ酸配列情報、翻訳後修飾情報、またはそれらの任意の組み合わせの取得を含み得る。
本明細書で使用される場合、「未修飾」（「野生型」または「天然」でもある）という用語は、核酸分子およびタンパク質（例えば、切断酵素）などの生物学的材料に関連して使用され、自然界において見られ、人間の介入によって修飾されていないものを指す。
核酸分子およびタンパク質、例えば、ヒトの介入によって作製された、修飾された切断酵素に関して使用される場合の「修飾された」（または「変異体」または「突然変異体」）という用語。変異体、突然変異体、または修飾された切断酵素は、未修飾または野生型の切断酵素と比較して、アミノ酸配列が改変されたポリペプチドである。変異体または修飾された切断酵素は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせによって、野生型の切断酵素配列とは異なるポリペプチドである。変異体、突然変異体、または修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のアミノ酸の差異（例えば、突然変異）を含み得る。変異体または修飾された切断酵素ポリペプチドは、一般に、対応する野生型または未修飾の切断酵素に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。天然に存在しないアミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸は、許容される置換または付加の範囲に含まれる。変異体、突然変異体、または修飾された切断酵素は、特定の作製方法によって作製または生成された変異体、突然変異体、または修飾された切断酵素に限定されず、例えば、遺伝子選択、タンパク質工学、指向性進化、ｄｅ ｎｏｖｏ組換えＤＮＡ技術、またはそれらの組み合わせを含む。変異体、突然変異体、または修飾された切断酵素ポリペプチドは、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって一次アミノ酸配列が改変される。変異体または修飾された切断酵素との関連における「変異体」という用語は、変異体または修飾された切断酵素が作製される任意の特定の出発組成物または方法に条件を課すものとしては解釈されない。したがって、変異体または修飾された切断酵素は、組成物を示し、必ずしも任意の所与のプロセスによって産生された生成物ではない。遺伝子選択、タンパク質工学、組換え法、化学合成、またはそれらの組み合わせを含むさまざまな技術を使用することができる。
タンパク質、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの位置またはその中の位置に関連する「対応する」という用語、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が、配列表に記載されるような、開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置に「対応する」という記載は、構造配列アラインメントに基づいて、またはＧＡＰアルゴリズムなどの標準アラインメントアルゴリズムを使用して、開示された配列とのアラインメント時に識別されるヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す。例えば、対応する残基は、本明細書に記載の構造的アラインメント法により、配列番号５～８、１０～１６、２０に記載されるような参照配列とのアラインメントによって決定することができる。配列をアラインメントすることにより、当業者は、例えば、保存された同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して、対応する残基を識別することができる。
本明細書で使用される場合、ドメイン（アミノ酸残基の配列など）は、分子の他の部分と構造的および／または機能的に別個の識別可能なタンパク質またはコーディング核酸などの分子の一部分を指す。例えば、ドメインは、１つ以上の構造モチーフから構成されるタンパク質内で独立して折りたたまれた構造を形成することができる、および／または結合活性などの機能的活性によって認識される、ポリペプチド鎖の部分を含む。タンパク質は、１つ以上の別個のドメインを有し得る。例えば、ドメインは、モチーフに対する相同性など、関連するファミリーメンバーに対する一次配列または構造の相同性によって識別、定義、または区別され得る。別の例では、ドメインは、同族の結合相手などの分子と相互作用する能力などのその機能によって区別され得る。ドメインは、独立して生物学的機能または活性を示すことができ、その結果、ドメインは、独立して、または別の分子に融合して、例えば、結合などの活性を実行することができる。ドメインは、アミノ酸の線形配列またはアミノ酸の非線形配列であり得る。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含んでいる。そのようなドメインは既知であり、当業者によって識別され得る。本明細書における例示のために、定義が提供されるが、特定のドメインを名称で認識することは十分に当業者の技術範囲内であることが理解される。必要に応じて、好適なソフトウェアを用いてドメインを識別することができる。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの遺伝子またはタンパク質間の配列同一性を指す。「配列同一性」は、アミノ酸レベルでのタンパク質間の同一性の尺度であり、ヌクレオチドレベルでの核酸間の同一性の尺度である。タンパク質配列の同一性は、配列がアラインメントされたときに各配列の所与の位置にあるアミノ酸配列を比較することによって決定され得る。同様に、核酸配列の同一性は、配列がアラインメントされたときに各配列の所与の位置にあるヌクレオチド配列を比較することによって決定され得る。比較のために配列をアラインメントするための方法は当技術分野で周知であり、そのような方法には、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡが含まれる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、パーセント配列同一性を計算し、２つの配列間の類似性の統計分析を実行する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＷｅｂサイトで公開されている。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、指定された炭素原子の数（すなわち、Ｃ１～Ｃ１０またはＣ１～１０は、１～１０個の炭素を意味する）を有する、飽和した直鎖状または分岐鎖状の一価炭化水素構造およびそれらの組み合わせを指し、それらを含む。特定のアルキル基は、１～２０個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ２０アルキル」）を有するものである。特に指定がない限り、より特定のアルキル基は、１～８の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ８アルキル」）、３～８個の炭素原子（「Ｃ３～Ｃ８アルキル」）、１～６個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ６アルキル」）、１～５個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ５アルキル」）、または１～４個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ４アルキル」）を有するものである。アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチルなどの基、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどの相同体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「アルケニル」は、オレフィン性不飽和の少なくとも１つの部位を有し（すなわち、式Ｃ＝Ｃの少なくとも１つの部分を有し）、指定された炭素原子の数（すなわち、Ｃ２～Ｃ１０は、２～１０個の炭素原子を意味する）を有する、不飽和の直鎖状または分岐鎖状の一価炭化水素鎖またはそれらの組み合わせを指す。アルケニル基は、「シス」または「トランス」配置、あるいは「Ｅ」または「Ｚ」配置であり得る。特定のアルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有する（「Ｃ２～Ｃ２０アルケニル」）、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２～Ｃ８アルケニル」）、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２～Ｃ６アルケニル」）、または２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２～Ｃ４アルケニル」）ものである。アルケニルの例としては、エテニル（またはビニル）、プロプ－１－エニル、プロプ－２－エニル（またはアリル）、２－メチルプロプ－１－エニル、ブト－１－エニル、ブト－２－エニル、ブト－３－エニル、ブタ－１，３－ジエニル、２－メチルブタ－１，３－ジエニル、それらの相同体および異性体などが挙げられるが、これらに限定されない。
「アミノアルキル」という用語は、１つ以上の－ＮＨ２基で置換されたアルキル基を指す。特定の実施形態において、アミノアルキル基は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の－ＮＨ２基で置換される。アミノアルキル基は、任意選択的に、本明細書に記載されるように、１つ以上の追加の置換基で置換されてもよい。
本明細書で使用される場合、「アリール」または「Ａｒ」は、縮合環が芳香族であってもなくてもよい単一環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する不飽和芳香族炭素環基を指す。一変形例では、アリール基は、６～１４個の環状炭素原子を含む。少なくとも１つの環が非芳香族である２つ以上の環を有するアリール基は、芳香環位置または非芳香環位置のいずれかで親構造に結合され得る。一変形例では、少なくとも１つの環が非芳香族である２つ以上の環を有するアリール基が、芳香環位置で親構造に接続される。いくつかの実施形態において、フェニルは、好ましいアリール基である。
本明細書で使用される場合、「アリールアルキル」という用語は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアリール基を指す。アリールアルキルの代表的な例としては、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、２－ナフト－２－イルエチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、完全に飽和、一価または多価不飽和であり得るが、指定された炭素原子の数（例えば、Ｃ１～Ｃ１０は、１～１０個の炭素を意味する）を有する非芳香族である環状の一価炭化水素構造を指し、それらを含む。シクロアルキルは、シクロヘキシルなどの１つの環、またはアダマンティルとしてなどの複数の環で構成することができるが、アリール基は除外される。２つ以上の環を含むシクロアルキルは、融合されるか、スピロまたは架橋されるか、あるいはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、シクロアルキルは、３～１３個の環状炭素原子を有する環状炭化水素である。いくつかの実施形態において、シクロアルキルは、３～８個の環状炭素原子を有する環状炭化水素（「Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル」）である。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチル、ノルボルニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素、またはヨウ素を表す。「ハロ」という用語は、クロロ、フルオロ、ブロモ、またはヨードを表す。
「ハロアルキル」という用語は、上記のようなアルキル基を指し、アルキル基上の１つ以上の水素原子がハロ基で置換される。そのような基の例としては、フルオロエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロエチルなどのフルオロアルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、１～１０個の環状炭素原子と、窒素、酸素および硫黄などのヘテロ原子を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの環状ヘテロ原子と、を有する不飽和芳香族環状基であって、窒素および硫黄原子が任意選択的に酸化され、窒素原子（複数可）が任意選択的に四級化される不飽和芳香族環状基を指し、それらを含む。ヘテロアリール環におけるヘテロ原子の選択および順序は、標準的な原子価要件に適合し、芳香族環特性を提供しなければならず、また、本明細書に記載の反応で使用するのに十分安定な環を提供しなければならないことが理解される。通常、ヘテロアリール環は、５～６個の環原子と、１～４個のヘテロ原子と、を有し、特に指定がない限り、Ｎ、ＯおよびＳから選択される。二環式ヘテロアリール基は、１つの結合を共有し、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子～最大５つのヘテロ原子を含む２つの５～６員環を含む。ヘテロアリール基は、環状炭素または環状ヘテロ原子で分子の残りの部分に付着することができ、その場合、ヘテロ原子は通常、窒素である。ヘテロアリール基は、追加の縮合アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、および／またはヘテロシクリル環を含む、追加の縮合環（例えば、１つ～３つの環）を含み得る。ヘテロアリール基の例としては、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピロリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、チオフェニル、フラニル、チアゾリルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「複素環」、「複素環式」、または「ヘテロシクリル」という用語は、１～１０個の環状炭素原子と、窒素、硫黄もしくは酸素などの１～４個の環状ヘテロ原子と、を有する飽和または不飽和の非芳香族基であって、窒素および硫黄原子が任意選択的に酸化され、窒素原子（複数可）が任意選択的に四級化されている飽和または不飽和の非芳香族基を指す。ヘテロシクリル基は、単一の環または複数の縮合環を有し得るが、ヘテロアリール基は除外される。２つ以上の環を含む複素環は、融合されるか、スピロまたは架橋されるか、あるいはそれらの組み合わせであり得る。縮合環系において、縮合環の１つ以上は、アリールまたはヘテロアリールであり得る。ヘテロシクリル基の例としては、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル、４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「置換」という用語は、特定の基または部分が、非置換基の水素原子の代わりに１つ以上の置換基を有することを意味し、これには、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボニルアルコキシ、アシルアミノ、アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、シアノ、アジド、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、カルボキシル、チオール、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、アラルキル、アミノスルホニル、スルホニルアミノ、スルホニル、オキソ、カルボニルアルキレンアルコキシなどの置換基などが含まれるが、これらに限定されない。「非置換」という用語は、特定の基が置換基を有しないことを意味する。「任意選択的に置換された」という用語は、特定の基が非置換であるか、１つ以上の置換基によって置換されており、したがって、基の置換および非置換バージョンの両方を包含することを意味する。「置換（された）」という用語が構造系を説明するために使用される場合、置換は、系上の任意の原子価許容位置（ｖａｌｅｎｃｙ－ａｌｌｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）で起こることを意味する。
本明細書に記載または描写される構造は、当技術分野でよく理解されるように、複数の互変異性体を形成することができる可能性がある。存在する特定の互変異性体（複数可）は、多くの場合、溶媒、ｐＨ、およびその他の環境要因、ならびに構造自体に依存する。互変異性の例をここに示すが、少なくとも３つの異なる互変異性体が描画されて、１つの化合物を表すことができる：
Figure 2022526939000002
化合物が２つ以上の互変異性体の形態で存在し得る場合、典型的には１つの互変異性体が描写または記載され、その構造は、安定な各互変異性体ならびに互変異性体の混合物を表すと理解される。特に、ヒドロキシル基またはアミン基で置換されたグアニジン基およびヘテロアリール基は、多くの場合、複数の互変異性体に存在することができ、１つの互変異性体の説明または描写は、同じ化合物の他の互変異性体を包含すると理解される。
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、ならびに／または態様および実施形態「から本質的になる」を包含することが理解される。
本開示を通じて、本発明のさまざまな態様が、範囲形式で提示される。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する不動の限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、すべての可能なサブ範囲、およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示すると見なすべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのサブ範囲、およびその範囲内の個々の数（例えば、１、２、３、４、５および６）を具体的に開示すると見なすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
本発明の他の目的、利点および特徴は、添付の図面と結び付けられた以下の明細書から明らかになるであろう。
Ｉ．修飾された切断酵素
本明細書において提供されるのは、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された切断酵素であって、修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成される、修飾された切断酵素である。本明細書において提供されるのは、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された切断酵素であって、修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成される、修飾された切断酵素である。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識末端アミノ酸を除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から単一の標識ジペプチド（末端および最後から２番目の末端アミノ酸）を除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、野生型または未修飾の切断酵素（例えば、ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素）に由来する。場合によっては、末端標識アミノ酸残基は、Ｎ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、末端標識アミノ酸残基は、Ｃ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、除去された標識末端アミノ酸は、単一のアミノ酸として、またはジペプチドの一部として除去される。いくつかの態様において、標識アミノ酸は、化学試薬で処理することによって修飾される末端アミノ酸である。いくつかの特定の例において、除去された単一の標識末端アミノ酸または単一の標識末端ジペプチドは、アミド結合を含む。いくつかの態様において、修飾された切断酵素は、アミド結合（例えば、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のアミド結合）と相互作用する活性部位を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの任意の組み合わせであるか、またはそれらを含む。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、未修飾または野生型の切断酵素の活性とは異なる活性を示す。本明細書で使用される場合、「未修飾の切断酵素」または「野生型の切断酵素」は、ポリペプチドの末端から（例えば、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から）ジペプチドまたはトリペプチドを除去する触媒活性を有する任意の天然または野生型エキソペプチダーゼを指す。未修飾または野生型の切断酵素は、最後から２番目のペプチド結合の切断を触媒してペプチド鎖からジペプチドを放出するか、または最後から３番目のペプチド結合の切断を触媒してペプチド鎖からトリペプチドを放出するエキソペプチダーゼであり得る。未修飾または野生型の切断酵素は、アミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼなどのタンパク質分解酵素であり得る。本明細書に記載される未修飾の切断酵素は、酵素委員会（ＥＣ）によってＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳＳ５３、またはその機能的相同体もしくは断片として分類されるタンパク質を指すために使用され得る。本明細書に記載される未修飾の切断酵素は、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼを指すために使用され得る。
「修飾された切断酵素」または「変異体切断酵素」は、記載されるように、未修飾または野生型の切断酵素から修飾された任意のエキソペプチダーゼを指す。修飾された切断酵素または変異体切断酵素は、未修飾または野生型のジペプチド切断酵素（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ）に、または未修飾または野生型のトリペプチド切断酵素（例えば、セドリジンもしくはトリペプチジルペプチダーゼ）に由来し得る。ジペプチドとしてペプチドからＰ１－Ｐ２末端アミノ酸を一度に除去する未修飾または野生型のジペプチド切断酵素と比較して、ジペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素は、ペプチドから標識されたＰ１末端アミノ酸のみを一度に除去する。トリペプチドとしてペプチドからＰ１－Ｐ２－Ｐ３末端アミノ酸を一度に除去する未修飾または野生型のトリペプチド切断酵素と比較して、トリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素は、ペプチドから標識されたＰ１末端アミノ酸を一度に除去するか、またはペプチドから標識されたＰ１－Ｐ２ジペプチドを一度に除去する。（例えば、図１Ａ～１Ｂを参照。）
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、標識末端アミノ酸、例えば、標識Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を除去する。場合によっては、修飾された切断酵素が、標識Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）を除去する。いくつかの実施形態において、除去された標識末端アミノ酸は、単一のアミノ酸として、またはジペプチドの一部として除去される。いくつかの実施形態において、ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素は、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される。いくつかの実施形態において、トリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素は、ポリペプチドの最後から２番目の末端標識アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される。
さまざまな既知の未修飾または野生型エキソペプチダーゼに関する情報は、ＭＥＲＯＰＳおよび／またはＢＲＥＮＤＡ酵素情報システムなどのデータベースから入手可能である（例えば、Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）２６１：１９４－２０６を参照）。タンパク質は、２つ以上の分類システムを使用して分類することができる。酵素委員会（ＥＣ）は、ＥＣ（酵素委員会）番号が付与される特徴付けされた酵素の各タイプを説明するために、国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会からの推奨事項を使用して、特異性に基づき酵素を分類するための番号付けシステムを示している（例えば、Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３０４－３０５を参照）。いくつかの態様において、未修飾または野生型の切断酵素は、ＥＣ ３．４．１４、ＥＣ ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその相同体に分類されるタンパク質である。いくつかの態様において、未修飾または野生型の切断酵素は、表１、２、３、４、５、６、７、および８Ａ～８Ｂに規定されるタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、（表１、２、３、４、５、６、７、および８Ａ～８Ｂに規定されるような）ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、またはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３に分類されるタンパク質、またはその機能的相同体もしくは断片に由来する。
Figure 2022526939000003
Figure 2022526939000004
Figure 2022526939000005
Figure 2022526939000006
Figure 2022526939000007
Figure 2022526939000008
Figure 2022526939000009
Figure 2022526939000010
Figure 2022526939000011
オリゴペプチドの非置換Ｎ末端からジペプチドまたはトリペプチドを連続的に切断するさまざまなペプチダーゼ（例えば、切断酵素）が識別されている。一部のペプチダーゼは、ジペプチドをさまざまなトリペプチドからデカペプチドに切断する。本明細書に記載の切断酵素は、ヒドロラーゼの酵素（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ：ＥＣ）クラス３に分類される酵素を指す。ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ（それぞれ、酵素番号３．４．１４からのＤＰＰおよびＴＰＰ；表１）は、ペプチドのＮ末端からジペプチド（２つのアミノ酸残基Ｐ１－Ｐ２）またはトリペプチド（３つのアミノ酸残基Ｐ１－Ｐ２－Ｐ３）を、典型的には段階的に消化するクラスのエキソペプチダーゼである。ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１５；表２）としても知られるペプチジルジペプチダーゼは、Ｃ末端から作用してジペプチドを段階的に除去する。いくつかの実施形態において、未修飾または野生型の切断酵素は、エキソアミノペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼである。いくつかの態様において、未修飾または野生型の切断酵素は、メタロペプチダーゼ、例えば、亜鉛依存性メタロペプチダーゼまたは亜鉛依存性ヒドロラーゼである。いくつかの態様において、未修飾または野生型の切断酵素は、セリンエキソペプチダーゼまたはセリンプロテアーゼである。ＤＰＰは通常、Ｎ末端のアルファアミンを認識し、ポリペプチド（Ｐ２－Ｐ３）の最後から２番目アミノ酸残基と最後から３番目のアミノ酸残基との間のペプチド結合を切断する。例えば、Ｓａｎｄｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）２６：７９５－８０７）およびＢａｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００８）２８３（３２）：２２３１６－２２３２４を参照。ポリペプチド（例えば、ＴＰＰ）の末端からトリペプチドを除去するさまざまなペプチダーゼも識別されている。例えば、トリペプチジルペプチダーゼＡ、Ｂ、およびＣは、ＭＥＲＯＰＳファミリーＳ３３（ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３．００２、Ｓ３３．００６、Ｓ３３．００７）に分類される。セリン－カルボキシルペプチダーゼとしても知られるセドリシンは、タンパク質分解酵素ＭＥＲＯＰＳファミリーのペプチダーゼＳ５３である（例えば、Ｗｌｏｄａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ．２００３；５０（１）：８１－１０２を参照）。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドまたはタンパク質からの（例えば、Ｎ末端またはＣ末端からの）末端アミノ酸の除去を含む活性を示す。末端アミノ酸は、単一のアミノ酸として、またはジペプチドの一部として、ポリペプチドから除去され得る。一般的な方式では、ペプチダーゼ活性は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の末端からアミノ酸Ｘａａ１および／またはＸａａ２を除去することができ、Ｘａａは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される任意のアミノ酸残基を表し得る。本開示の修飾された切断酵素は、切断されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に関して非特異的であり得ることが理解される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、部分的に特異的または選択的である。いくつかの態様において、修飾された切断酵素は、ペプチドのＰ１またはＰ２位置にあるいくつかのアミノ酸を他のものよりも優先的に切断または除去する。場合によっては、修飾された切断酵素は、あるクラスのアミノ酸を他のクラスよりも優先的に切断または除去し、例えば、他のクラスのアミノ酸よりも疎水性アミノ酸を優先的に除去する。いくつかの態様において、修飾された切断酵素はまた、末端アミノ酸からの第２、第３、第４、第５などの位置にある１つ以上のアミノ酸を優先し得る。場合によっては、修飾された切断酵素は、アミノ酸のサブセットに特異性を示し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５以上の特定の末端アミノ酸を他のものよりも優先的に除去する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、未修飾または野生型の切断酵素と比較して、アミノ酸配列が改変されたポリペプチドである。場合によっては、修飾された切断酵素は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせによって、野生型の切断酵素配列とは異なるポリペプチドである。変異体または修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上の修飾または突然変異、例えばアミノ酸の差異を含むことができる。
いくつかの実施形態において、変異体または修飾された切断酵素ポリペプチドは、一般に、対応する野生型または未修飾の切断酵素に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。いくつかの実施形態において、野生型または未修飾の切断酵素は、配列番号５～８、１０～１６、２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、その成熟配列、または活性部位を含むその一部分を含む。いくつかの実施形態において、変異体または修飾された切断酵素ポリペプチドは、一般に、配列番号５～８、１０～１６、２０に記載の野生型もしくは未修飾の切断酵素またはその相同体に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。
参照配列とのアラインメントなどによって、その一部分を含む、切断酵素ポリペプチドにおける突然変異または修飾、例えばアミノ酸置換の対応する位置を特定することは、当業者の水準の範囲内である。いくつかの実施形態において、未修飾のまたは参照切断酵素ポリペプチドは、一般に、配列番号５～８および１０～１６、２０に記載の配列のうちのいずれかに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。例えば、対応する残基は、既知のアラインメント法を使用して、本明細書に規定される配列（例えば、配列番号５～８、１０～１６、２０に記載される配列、またはその機能的相同体もしくは断片）と参照配列をアラインメントすることによって決定することができる。配列をアラインメントすることにより、当業者は、例えば、保存された同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して、対応する残基を識別することができる。場合によっては、本明細書において提供される残基の番号付けは、参照配列とは異なる可能性があるが、アラインメント法を使用することにより、対応する残基の決定が可能になる。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、未修飾の切断酵素は、ジペプチジルペプチダーゼ３である。ジペプチジルペプチダーゼ３（ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルアリールアミダーゼＩＩＩ、エンケファリナーゼＢ、赤血球アンギオテンシナーゼ、ＤＰＰ３、またはＤＰＰＩＩＩとしても知られる）は、短いペプチドのＮ末端からジペプチド（２つのアミノ酸残基）を順次除去するメタロプロテイナーゼ（亜鉛依存性）である。野生型または未修飾のＤＰＰ３は、Ｍ４９ファミリーに分類される（ＭＥＲＯＰＳデータベース識別子Ｍ４９．００１）。場合によっては、未修飾のジペプチジルペプチダーゼ３は、配列番号５に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＹ３３、配列番号６に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０８２２５、配列番号７に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ８Ａ６Ｎ１、配列番号８に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｈ１ＸＷ４８、または配列番号１５に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ５５０９６に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。例えば、Ｐｒａｊａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２０１１；２７８（１８）：３２５６－２７６；Ｆｕｋａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９９８ Ｊａｎ １５；３２９（Ｐｔ ２）：２７５－２８２；Ｆｕｋａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．２０１１；２０１１：５７４８１６）を参照。ＤＰＰ３は、３～１０アミノ酸の長さのペプチドを優先的に消化する。ＤＰＰ３は、固有のＨＥＸＸＧＨ触媒モチーフ（配列番号１）を有する。このモチーフの両方のヒスチジンは、２番目に保存されたＥＥＸＲＡＥ／Ｄモチーフのグルタメート残基と共に、亜鉛配位に関与する（配列番号２）。場合によっては、Ｃ末端ペプチド修飾はＤＰＰ３酵素の活性に影響を与えない。Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１６）６：２３７８７を参照のこと。Ｎ末端チロシンを有するペプチドとの複合体を含む、ＤＰＰ３のいくつかの基質結合構造が解明されている。Ｎ末端チロシンは、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、またはこれらの修飾因子のフェニルイソシアネートバージョンと構造的に類似しており、これらの基質結合構造は、標的活性部位設計アプローチに有用である可能性がある。いくつかの実施形態において、提供されるのは、標識末端アミノ酸残基、例えば、標識Ｎ末端アミノ酸残基を切断するジペプチジルペプチダーゼ３に由来する修飾された切断酵素である。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、未修飾の切断酵素における突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾を含み、未修飾の切断酵素は、ジペプチジルペプチダーゼ５である。ジペプチジルペプチダーゼ５は、アレルゲンＴｒｉ ｍ ４（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、アレルゲンＴｒｉ ｒ ４（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、アレルゲンＴｒｉ ｔ ４（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、ジペプチジル－ペプチダーゼＶ（ＤＰＰ Ｖ）、および分泌型アラニルジペプチジルペプチダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）としても知られている。野生型または未修飾のジペプチジルペプチダーゼ５は、ペプチダーゼファミリーＳ９に分類される（ＭＥＲＯＰＳデータベース識別子Ｓ０９．０１２）。野生型または未修飾のジペプチジルペプチダーゼ５は、最適な中性ｐＨでＸ－Ａｌａ、Ｈｉｓ－Ｓｅｒ、およびＳｅｒ－Ｔｙｒジペプチドの加水分解を触媒することが観察されている（例えば、Ｂｅａｕｖａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２（１０）：６２３８－４４を参照）。野生型または未修飾のジペプチジルペプチダーゼ５は、非古典的セリンプロテアーゼの触媒部位のコンセンサス配列を含む分泌型ジペプチジルペプチダーゼとして説明される。場合によっては、未修飾の切断酵素は、配列番号１０に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０Ｃ９５９または配列番号１６に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｂ２ＲＩＴ０に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素における突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加）は、配列番号１０または１６の番号付けに関して記載されたアミノ酸配列に関する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、未修飾の切断酵素は、ジペプチジルペプチダーゼ７（ＤＰＰ７）である。野生型または未修飾のＤＰＰ７は、Ｓ４６プロテアーゼファミリーに分類される（ＭＥＲＯＰＳデータベース識別子Ｓ４６．００１）。野生型または未修飾のＤＰＰ７は、オリゴペプチドのＮ末端からのジペプチドの除去を触媒することが観察されており、Ｐ１位置の脂肪族残基と芳香族残基の両方に対する幅広い特異性を含み、グリシンまたはプロリンはこの位置では受け入れられない（例えば、Ｂａｎｂｕｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：６２９９－６３０５を参照）。ＤＰＰ７は、合成基質Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－メチルクマリル（ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ）－７－アミド（Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－ＭＣＡ）、Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＭＣＡ、およびＬｙｓ－Ａｌａ－ＭＣＡを切断する活性を示すことが示されている（Ｒｏｕｆ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ．２０１３；３：１７７－８３）。場合によっては、未修飾の切断酵素は、配列番号１１に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｂ２ＲＫＶ３に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素における突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加）は、配列番号１１の番号付けに関して記載されたアミノ酸配列に関する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、未修飾の切断酵素は、ジペプチジルペプチダーゼ１１である。ジペプチジルペプチダーゼ１１は、Ａｓｐ／Ｇｌｕ特異的ジペプチジルペプチダーゼまたはＤＰＰ１１としても知られている。野生型または未修飾のジペプチジルペプチダーゼ１１は、Ｓ４６プロテアーゼファミリーに分類され（ＭＥＲＯＰＳデータベース識別子Ｓ４６．００２）、ジペプチジルペプチダーゼ７と３８．７％の配列同一性を共有する。野生型または未修飾のジペプチジルペプチダーゼ１１は、オリゴペプチドのＮ末端からのジペプチドの除去、例えば、最後から２番目のＮ末端のＡｓｐおよびＧｌｕを有するオリゴペプチドからのジペプチドの除去、を触媒することが観察されており、疎水性残基よりもＰ２位置が優先される（例えば、Ｏｈａｒａ－Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（４４）：３８１１５－２７を参照）。場合によっては、未修飾の切断酵素は、配列番号１２および１４それぞれに記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｂ２ＲＩＤ１またはＦ８ＷＱＫ８に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素における突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加）は、配列番号１２の番号付けに関して記載されたアミノ酸配列に関する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素における突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加）は、配列番号１４の番号付けに関して記載されたアミノ酸配列に関する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、未修飾の切断酵素は、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ（ＤＡＰ ＢＩＩまたはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩ）である。野生型または未修飾のＤＡＰ ＢＩＩは、ペプチドのアミノ末端からのジペプチドの除去を触媒する（例えば、Ｏｇａｓａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６，１７８：６２８８－６２９５）；Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，４：４９７７を参照）。ＤＡＰ ＢＩＩは、セリンペプチダーゼファミリーＳ４６に属するセリンプロテアーゼである（ＭＥＲＯＰＳデータベース識別子Ｓ４６．００３）。ＤＡＰ ＢＩＩの触媒ユニットのアミノ酸配列は、ＰＡエンドペプチダーゼ族（ｃｌａｎ）に分類されるものと有意な類似性を示す。場合によっては、未修飾の切断酵素は、配列番号１３に記載のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｖ５ＹＭ１４に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩの触媒ドメインにおいて１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、配列番号１３の残基１～２５２および残基５５０～６９８）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素における突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加）は、配列番号１３の番号付けに関して記載されたアミノ酸配列に関する。未修飾または野生型ＤＡＰ ＢＩＩは、オリゴペプチドおよび小タンパク質のＮ末端からペプチドを加水分解し、２番目の（Ｐ１）残基がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、またはＨｉｓである（Ｐｒｏではない）場合にジペプチドユニット（ＮＨ２－Ｐ２－Ｐ１－）を切断することが示されている（例えば、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，４：４９７７を参照）。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ＤＡＰ ＢＩＩに由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６６５、および／または６９２のうちのいずれか１つ以上に対応する、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩ切断酵素またはその断片における１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および／または２０２のうちのいずれか１つ以上に対応する、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩ切断酵素またはその断片における１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、３０２、および／または３１０のうちのいずれか１つ以上に対応する、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩ切断酵素またはその断片における１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置１９１、１９２、１９６、３０６、および／または６５０のうちのいずれか１つ以上に対応する、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩ切断酵素またはその断片における１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置３２３～５４４のうちのいずれか１つ以上に対応する、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩ切断酵素またはその断片における１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置３１０、６５１、６５５、および／または６５６のうちのいずれか１つ以上に対応する、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩ切断酵素またはその断片における１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置６２７、６２８、６３０、６４８、６５１、６５５、および／または６６９のうちのいずれか１つ以上に対応する、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩ切断酵素またはその断片における１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を有する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ＤＡＰ ＢＩＩに由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６２７、６２８、６３０、６４８、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５、６６９、および／または６９２のうちのいずれか１つ以上に対応する、未修飾のＤＡＰ ＢＩＩ切断酵素またはその断片における１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を有する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、Ａ１２６Ｔ、Ｄ１８８Ｖ、Ｉ１８９Ａ、Ｄ１９０Ｓ、Ｎ１９１Ｃ、Ｎ１９１Ｆ、Ｎ１９１Ｌ、Ｎ１９１Ｍ、Ｎ１９１Ｒ、Ｎ１９１Ｓ、Ｎ１９１Ｔ、Ｎ１９１Ｖ、Ｗ１９２Ｆ、Ｗ１９２Ｇ、Ｗ１９２Ｌ、Ｒ１９６Ｈ、Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１９６Ｓ、Ｒ１９６Ｔ、Ｒ１９６Ｖ、Ｇ２３８Ｖ、Ａ３０２Ｗ、Ｎ３０６Ａ、Ｎ３０６Ｇ、Ｎ３０６Ｒ、Ｎ３０６Ｓ、Ｔ３０７Ｋ、Ｎ３１０Ｄ、Ｎ３１０Ｇ、Ｎ３１０Ｋ、Ｎ３１０Ｌ、Ｎ５２５Ｋ、Ａ５２８Ｖ、Ｆ５４６Ｌ、Ａ６０４Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｇ、Ｄ６５０Ｓ、Ｇ６５１Ｈ、Ｇ６５１Ｔ、Ｇ６５１Ｖ、Ｇ６５１Ｙ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｔ、Ｖ６５６Ｅ、Ｖ６５６Ｇ、Ｖ６５６Ｓ、Ｋ６６５Ｉ、およびＫ６９２Ｎ、またはその保存的アミノ酸置換からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾は、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｄ１８８Ｖ／Ｉ１８９Ａ／Ｄ１９０Ｓ／Ｎ１９１Ｌ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｓ／Ａ３０２Ｗ／Ｎ３１０Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｔ３０７Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ５２５Ｋ／Ａ５２８Ｖ／Ａ６０４Ｖ／Ｄ６５０Ａ／Ｋ６９２Ｎ、Ａ１２６Ｔ／Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｇ２３８Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｆ５４６Ｌ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ／Ｋ６６５Ｉ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｒ１９６Ｋ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｆ／Ｗ１９２Ｆ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｇ／Ｇ６５１Ｈ／Ｖ６５６Ｅ、Ｎ１９１Ｒ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｓ／Ｎ３１０Ｌ／Ｇ６５１Ｔ／Ｓ６５５Ｔ／Ｖ６５６Ｓ、Ｎ１９１Ｓ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｔ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｍ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｖ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｓ、またはＮ１９１Ｓ／Ｎ３０６Ｇ／Ｄ６５０Ｓである。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、もしくは少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、またはその特異的結合断片を有する。いくつかの実施形態において、特異的結合断片は、約１０個のアミノ酸～約４００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約３００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約２００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸、または約１０個のアミノ酸～約５０個のアミノ酸の範囲の長さを有する。いくつかの例において、修飾された切断酵素は、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９に規定されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの特定の例において、修飾された切断酵素は、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに記載のアミノ酸の配列、もしくは配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列、またはその特異的結合断片を含む。いくつかの態様において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、３０２、３０６、３１０、および／または６５０に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、位置１９１、１９２、１９６、３０６、および／または６５０に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９の配列のうちのいずれか１つの基質特異性を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９の配列のうちのいずれか１つの切断活性を有する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの触媒ドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有する触媒ドメインを含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかのアミン結合部位と、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミン結合部位を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかのループドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するループドメインを有する。
いくつかの特定の例において、所望の修飾された切断酵素は、ポリペプチドのＰ１またはＰ２位置の特定のアミノ酸に対して減少したバイアスを示し得る。いくつかの実施形態において、そのような修飾された切断酵素は、遺伝子選択において野生型または未修飾の酵素のＰ１またはＰ１ポケットを標的とすることによって得られ得る。場合によっては、配列番号１３の番号付けに関して、残基Ｎ３１０、Ｇ６５１、Ｓ６５５、および／またはＶ６５６が、バイアスを低減するために標的とされ得る。場合によっては、配列番号１３の番号付けに関して、残基Ｎ２１５、Ｗ２１６、Ｒ２２０、Ｎ３３０、および／またはＤ６７４が、バイアスを低減するために標的とされ得る。
表９はまた、例示的な修飾された切断酵素について、配列番号を参照して例示的な配列を提供する。いくつかの例において、修飾された切断酵素は、表９に規定されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。
Figure 2022526939000012
いくつかの実施形態において、除去されたアミノ酸は、化学試薬または酵素試薬によって標識または修飾される。例えば、標識されたアミノ酸は、単一の末端アミノ酸として、またはジペプチドの一部として除去される。いくつかの実施形態において、標識は、末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端アミノ酸）のサイズ／形状を「模倣する」修飾因子または標識であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、除去されたアミノ酸は、アミノ酸（例えば、外因性アミノ酸）、修飾アミノ酸、アミノ酸の一部分、ブロックまたは保護されたアミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせで標識される。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸に付着した標識は、Ｎ末端ブロック（アルファアミンを欠いた）アミノ酸である。いくつかの実施形態において、ジペプチド切断酵素に由来する好適に操作または修飾された切断酵素を用いた好適な標識の選択は、単一の標識末端アミノ酸残基の除去を可能にする。いくつかの実施形態において、トリペプチド切断酵素に由来する好適に操作または修飾された切断酵素を用いた好適な標識の選択は、標識末端ジペプチドの切断を可能にする。いくつかの実施形態において、未修飾の切断酵素の活性部位および／またはアミノ酸結合部位（複数可）は、修飾される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、その基質結合部位内、基質結合部位の境界、触媒ドメイン、Ｐ１もしくはＰ２ポケット、キモトリプシンフォールド、アミン結合部位、ループドメイン、またはそれらの組み合わせに、修飾または突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、活性部位内で、標識－Ｐ１が、ペプチドの天然のＰ１－Ｐ２残基に取って代わり、その結果、修飾された切断酵素における切断は、Ｐ２とＰ３との間（天然のジペプチド切断酵素）ではなく、Ｐ１とＰ２との間（ジペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素）で起こる（例えば、図１Ａを参照）。いくつかの実施形態において、活性部位内で、標識－Ｐ１が、ペプチドまたはその一部分の天然のＰ１－Ｐ２－Ｐ３残基に取って代わり、その結果、修飾された切断酵素における切断は、Ｐ３とＰ４との間（天然のトリペプチド切断酵素）ではなく、Ｐ１とＰ２との間（トリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素）で起こる（例えば、図１Ｂを参照）。いくつかの実施形態において、活性部位内で、標識－Ｐ１－Ｐ２が、ペプチドまたはその一部分の天然のＰ１－Ｐ２－Ｐ３残基に取って代わり、その結果、修飾された切断酵素における切断は、Ｐ３とＰ４との間（天然のトリペプチド切断酵素）ではなく、Ｐ２とＰ３との間（トリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素）で起こる（例えば、図１Ｂを参照）。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ジペプチド切断酵素（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、またはジペプチジルカルボキシペプチダーゼ）に由来し、除去のためにジペプチドの１つの残基に適合する未修飾の切断酵素の空間のうちの１つは、代わりに標識（例えば、化学標識または化学修飾）に適合するように、修飾された切断酵素内に構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、トリペプチド切断酵素（例えば、セドリジンまたはトリペプチジルペプチダーゼ）に由来し、除去のためにトリペプチドの１つまたは２つの残基に適合する未修飾の切断酵素の空間のうちの１つまたは２つは、代わりに標識（例えば、化学標識または化学修飾）に適合するように、修飾された切断酵素内に構成される。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、切断酵素のキモトリプシンフォールドに、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、アミノ酸突然変異（例えば、修飾、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、アミン結合部位に、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、アミノ酸突然変異（例えば、修飾、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ループドメインに、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、アミノ酸突然変異（例えば、修飾、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの態様において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素の活性部位へのアクセス可能性を改善するために、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、アミノ酸突然変異（例えば、修飾、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を含む。場合によっては、修飾された切断酵素が示す活性部位への基質（例えば、ポリペプチド）のアクセス可能性は、未修飾の切断酵素と比べて大きい。例えば、修飾された切断は、より大きな基質が活性部位にアクセスすることを可能にし得る。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、切断酵素の活性部位もしくは触媒ドメイン、または切断酵素の結合ポケットに、アミノ酸突然変異（例えば、修飾、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、切断酵素のヒンジ領域にアミノ酸突然変異（例えば、修飾、置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、切断酵素の結合溝にアミノ酸突然変異を含む。場合によっては、修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、切断酵素の葉間溝（ｉｎｔｅｒ－ｌｏｂｅ ｃｌｅｆｔ）にアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、切断酵素のアルファアミン結合領域にアミノ酸突然変異を含む。例えば、修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、アルファアミン結合が減少している。例えば、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１６）６：２３７８７を参照のこと。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、未修飾の切断酵素と比較して、活性、基質結合能力、または切断特性が改変される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、未修飾の切断酵素の触媒モチーフまたは触媒ドメイン（例えば、配列番号１に記載のＨＥＸＸＧＨ触媒モチーフ）が修飾される。いくつかの実施形態において、突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加）は、配列番号５の番号付けに関して、位置３１６、３９１、または３９４に対応する。いくつかの実施形態において、突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、付加）は、配列番号５の番号付けに関して、アミノ酸残基の位置４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、またはそれらの組み合わせに対応する。
いくつかの実施形態において、未修飾の切断酵素は、メタロペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、メタロペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、亜鉛依存性メタロペプチダーゼまたは亜鉛依存性ヒドロラーゼであるか、またはそれに由来する。いくつかの既知のメタロペプチダーゼは、従来の触媒シグネチャーモチーフＨＥＸＸＨの存在を特徴とする。いくつかの態様において、ＨＥＸＸＨモチーフの２つのＨｉｓ残基は、二価金属イオン（例えば、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋）の配位に寄与する。例えば、修飾された切断は、活性化のために特定の金属イオン（例えば、亜鉛イオン、塩化物イオン）の存在またはそれらとの接触を必要とする。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素の機能は、金属イオンの存在もしくは不在によって、または金属キレート剤と接触することによって調節または制御することができる。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、未修飾の切断酵素と比較して、特定の基質に対する結合親和性および／または特異性が改変される。例えば、修飾された切断酵素は、未修飾の切断酵素と比較して、標識末端アミノ酸に対する結合親和性および／または特異性の増加を示す。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、未修飾の切断酵素と比較して、基質に対する結合親和性および／または特異性の低下を示す。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、結合速度、加水分解速度、放出速度などの１つ以上の所望の特徴を示す。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、所望の速度でポリペプチドから除去または放出され得る。
そのような実施形態のいくつかにおいて、修飾された切断酵素との反応は、修飾された切断酵素を標識末端アミノ酸に動員することによって増強することができる。例えば、１つ以上の修飾された切断酵素は、相補的なユニバーサルプライミング配列、修飾された切断酵素に関連するＤＮＡタグまたは配列、および修飾された切断酵素で処理されるポリペプチドに関連するＤＮＡタグまたは配列のハイブリダイゼーションによって、ポリペプチドの標識末端アミノ酸に動員され得る。このハイブリダイゼーションステップは、標識末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡ）に対する、修飾された切断酵素の有効な親和性を改善し得る。場合によっては、標識末端アミノ酸は、除去された後、拡散する場合があり、ハイブリダイズしたＤＮＡタグを剥がすことにより、関連する修飾された切断酵素を除去することができる。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、アンカー配列に付着する。場合によっては、修飾された切断は、直接的または間接的にアンカー配列に結合する。場合によっては、アンカー配列は、ポリペプチドに付着した配列に相補的である。いくつかの実施形態において、アンカー配列は、ユニバーサル配列またはユニバーサルＤＮＡタグである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはまた、普遍的な配列に付着する。いくつかの例では、修飾された切断酵素上のアンカー配列は、酵素をポリペプチドに近接させる。いくつかの実施形態において、アンカー配列は、酵素を近接させるか、または修飾された切断酵素をポリペプチドに共局在化させる。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素およびポリペプチドのこの共局在化は、前述のポリペプチドからの単一の標識アミノ酸もしくはジペプチドの結合および／または除去を助ける。
本明細書に規定される実施形態のいずれかにおいて、ポリペプチドの末端アミノ酸への１つ以上の修飾された切断酵素の動員は、キメラ修飾切断酵素およびキメラ末端アミノ酸修飾因子を介して増強され得る。キメラ修飾切断酵素およびキメラ末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡ）修飾因子は各々、互いに結合反応することができる部分（例えば、ビオチン－ストレプトアビジン）を含む。例えば、修飾された切断酵素は、低親和性酵素（＞μＭ Ｋｄ）であり得、ストレプトアビジン－キメラ修飾切断酵素を使用して、ビオチンに関連する標識ＮＴＡＡに動員される。場合によっては、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用の結果として有効な局所濃度が増加するため、修飾された切断酵素が標識末端アミノ酸（複数可）を除去する効率が改善され得る。場合によっては、このアプローチにより、親和性ＫＤがμＭからサブピコモルへと効果的に増加する。他の多くのバイオ共役募集戦略も採用することができる。アジド修飾ＰＩＴＣは市販されており（４－アジドフェニルイソチオシアネート、Ｓｉｇｍａ）、アルキン－ビオチンとのクリック化学反応を介して、アジド－ＰＩＴＣの、ビオチン－ＰＩＴＣなどの他のＰＩＴＣのバイオ共役体への、多数の単純な変換を許容する。いくつかの態様において、標識末端アミノ酸は、除去された後、ポリペプチドからの関連する修飾された切断酵素と共に拡散する場合がある。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、単一のポリペプチド鎖、または少なくとも２つのポリペプチド鎖の多量体（二量体またはより高次の多量体）であり得る。したがって、単量体、二量体、およびより高次の多量体修飾切断酵素ポリペプチドは、定義された用語の範囲内にある。多量体ポリペプチドは、（同一のポリペプチド鎖の）ホモ多量体または（同一でないポリペプチド鎖の）ヘテロ多量体であり得る。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、単量体酵素である。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、融合分子またはキメラ分子である。例えば、修飾された切断酵素は、リンカーを介して直接的または間接的にオリゴヌクレオチドに付着または会合され得る。いくつかの特定の場合において、修飾された切断酵素は、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒなどの部分に接合され得る。
Ａ．標識末端アミノ酸
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素によって除去されたペプチドの末端アミノ酸は、標識または修飾される。標識は、任意の好適な材料または部分を含むことができる。タンパク質、アミノ酸、核酸、炭水化物、化学部分、および小分子を含む、任意の好適な分子または材料を、この目的のために用いることができる。いくつかの実施形態において、好適な標識は、修飾された切断酵素の結合ポケットに適合することができる。いくつかの態様において、末端アミノ酸の標識は、核酸適合性である方式で実行される（例えば、標識は、核酸に損傷を与えない方式で実行される）。いくつかの実施形態において、好適な標識は、修飾された切断酵素が、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸残基またはジペプチドを除去することを可能にする。ポリペプチドの末端アミノ酸は、任意の好適な方法によって標識することができる。いくつかの例では、末端アミノ酸は、化学的または酵素的に標識される。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸は、化学薬品、酵素、および／または生物学的薬剤であるか、またはそれらを含む試薬によって標識される。場合によっては、末端アミノ酸は、化学標識または部分で標識される。いくつかの例では、末端アミノ酸は、ブロックアミノ酸または修飾アミノ酸で標識される。
いくつかの実施形態において、前駆体ポリペプチド（例えば、未標識ポリペプチド）は、前駆体ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するための試薬と接触し、修飾された切断酵素での処理のために調製されたポリペプチドを提供する。場合によっては、前駆体ポリペプチドと末端アミノ酸を標識するための試薬との接触は、ポリペプチドを、修飾された切断酵素と接触させる前に行われる。いくつかの態様において、修飾された切断酵素を、標識または修飾されたポリペプチドと接触させる。場合によっては、前駆体ポリペプチドと末端アミノ酸を標識するための試薬との接触、およびポリペプチドと修飾された切断酵素との接触は、同時にまたは実質的に同時に実行される。
１．化学標識
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去されるアミノ酸は、化学標識で標識される。いくつかの例では、修飾された切断酵素によって除去されるアミノ酸は、化学試薬で標識される。いくつかの態様において、化学試薬で処理することによる末端アミノ酸の標識は、核酸適合性である方式で実行される（例えば、標識は、核酸に損傷を与えない条件下で実行される）。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチド上の化学的に修飾または標識された（例えば、ＰＴＣ／ＤＮＰ／アセチル／Ｃｂｚ修飾または標識された）アミノ酸などの、標識アミノ酸を除去する。場合によっては、除去されたアミノ酸は、単一の標識末端アミノ酸である。場合によっては、除去されたアミノ酸は、末端ジペプチドの一部である。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素（例えば、ジペプチド切断酵素）は、標識として存在するＰＴＣ／ＤＮＰ／アセチル／Ｃｂｚ基を有するＮ末端アミノ酸を除去する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素によって除去されるアミノ酸は、単一の末端アミノ酸、または切断酵素によって除去されるジペプチドの末端アミノ酸であり得、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、フェニルイソチオシア（ＰＩＣ）、ニトロ－ＰＩＣ、スルホ－ＰＩＣ、ベンジルオキシカルボニルクロリドもしくはカルボベンゾキシクロリド（Ｃｂｚ－Ｃｌ）、Ｎ－（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｃｂｚ－ＯＳｕもしくはＣｂｚ－Ｏ－ＮＨＳ）、カルボキシル活性化アミノブロックアミノ酸（例えば、Ｃｂｚ－アミノ酸－ＯＳｕ）、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ－Ｃｌ、もしくは１－ジメチルアミノナフタレン－５－スルホニルクロリド）、４－スルホニル－２－ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、無水物、２－ピリジンカルボキサルデヒド、２－ホルミルフェニルボロン酸、２－アセチルフェニルボロン酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ペンタフルオロフェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、３－（カルボン酸）－フェニルイソチオシアネート、３－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、１－ナフチルイソチオシアネート、Ｎ－ニトロイミダゾール－１－カルボキシミダミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（ピバロイル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビス（ベンジルオキシカルボニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミド、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、チオベンジル化試薬、二複素環メタニミン試薬、またはそれらの誘導体からなる群から選択される試薬で標識される。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素によって除去される末端アミノ酸は、切断酵素によって除去されるジペプチドの末端アミンであり得、その無水物または誘導体で標識される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素により除去されるアミノ酸を標識するための試薬は、Ｓ－アセチルメルカプトコハク酸無水物、シス－アコニチン酸無水物、４－アミノ－１，８－ナフタリン酸無水物、エンド－ビシクロ［２．２．２］オクト－５－エン－２，３－ジカルボン酸無水物、５－ブロモイサト酸無水物、ブロモマレイン酸無水物、４－ブロモ－１，８－ナフタル酸無水物、シトラコン無水物、クロトン酸無水物、トランス－１，２－シクロヘキサンジカルボン酸無水物、１－シクロペンテン－１，２－ジカルボン酸無水物、２，３－ジクロロマレイン酸無水物、３，６－ジクロロフタル酸無水物、３，６－ジフルオロフタル酸無水物、ジグリコール酸無水物、２，２－ジメチルグルタル酸無水物、３，３－ジメチルグルタル酸無水物、２，３－ジメチルマレイン酸無水物、２，２－ジメチルコハク酸無水物、（２－ドデセン－１－イル）コハク酸無水物、ドデセニルコハク酸無水物、グルタル酸無水物、ヘキサフルオログルタル酸無水物、ヘキサヒドロ－４－メチルフタル酸無水物、ホモフタル酸無水物、３－ヒドロキシフタル酸無水物、イタコン酸無水物、マレイン酸無水物、３－メチルグルタル酸無水物、Ｎ－メチルイサト酸無水物、メチルコハク酸無水物、１，８－ナフタル酸無水物、３－ニトロ－１，８－ナフタル酸無水物、４－ニトロ－１，８－ナフタル酸無水物、３－ニトロフタル酸無水物、４－ニトロフタル酸無水物、２－オクテン－１－イルコハク酸無水物、２，５－オキサゾリジンジオン、２－フェニルグルタル酸無水物、フェニルマレイン酸無水物、フェニルコハク酸無水物、Ｎ－フタロイル－ＤＬ－グルタミン酸無水物、２，３－ピラジンジカルボン酸無水物、３，４－ピリジンジカルボン酸無水物、コハク酸無水物、４－スルホ－１，８－ナフタル酸無水物、テトラブロモフタル酸無水物、テトラクロロフタル酸無水物、テトラフルオロフタル酸無水物、３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物、３，３－テトラメチレングルタル酸無水物、トリメリット酸無水物クロリド、および２－（トリフェニルホスホラニリデン）コハク酸無水物からなる群から選択される。例えば、Ｓｔａｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９５９，２４，９，１２１４－１２１９；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１９，８４，４，２０２２－２０３１；米国特許第９，８６７，８８３号を参照のこと。
いくつかの例では、本発明の修飾された切断酵素での処理のための調製において、ポリペプチドは、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物、アザイサト酸無水物、コハク酸無水物、またはこれらのうちの１つの誘導体を含む化学試薬で処理され、ポリペプチドの末端アミノ酸は、化学試薬によって修飾または標識される。本発明の修飾された切断酵素で処理されるポリペプチドの末端アミノ酸の標識の特定の例としては、以下が挙げられる：
Figure 2022526939000013
 式中、
Ｇ１～Ｇ４は、ＣＨ、ＣＸ、およびＮからそれぞれ独立して選択され、
各出現におけるＸは、独立してＣ１～Ｃ２アルキル、ＮＯ２、Ｃ１～Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルコキシ、ハロ、－ＯＲ２、－Ｎ（Ｒ２）２、－ＳＲ２、ＳＯ２Ｒ３、ＳＯ３Ｒ２、－Ｂ（ＯＲ２）２、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、ＣＮ、ＣＯＮ（Ｒ２）２、－ＣＯＯＲ２、－Ｃ（－Ｏ）Ａｒ、およびテトラゾールから選択され、
Ｒは、アミノ酸の側鎖、例えば、２０個の一般的なアミノ酸の側鎖のうちの１つを表し、
Ｒ１は、Ｈ、Ｒ３、Ｃ（－Ｏ）Ｒ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２、－Ｃ（＝Ｏ）Ａｒ、および－ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）２から選択され、
Ｒ２は、各出現において独立して、ＨおよびＣ１～Ｃ２アルキルから選択され、
Ｒ３は、各出現において独立して、Ｃ１～Ｃ２アルキルから選択され、
Ａｒは、各出現で独立して、フェニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、およびピラジニルから選択され、これらはそれぞれ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルコキシ、および－ＯＲ２から選択される１つまたは２つの基によって置換されてもよく、
ＰＰは、ポリペプチドの一部分、特に、Ｎ末端アミノ酸を除く本発明の修飾された切断酵素での処理のために調製されているポリペプチドの部分を表す。したがって、式（Ｃ）の化合物は、典型的には、本発明の方法で使用するためのポリペプチドであり、Ｒは、ポリペプチドの末端アミノ酸の側鎖を表す。
好ましい実施形態において、式（Ｃ）に示される末端アミノ酸は、ＲがＨではない場合、Ｌ配置にある。
式（Ｂ）の化合物は、本明細書に記載の修飾された切断酵素反応で使用するために調製されているポリペプチド（標識ポリペプチドと呼ばれる場合もある）である。
いくつかの態様において、修飾された切断酵素による除去のためのアミノ酸は、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物またはアザイサト酸無水物、特に本明細書に記載の式（Ａ）の化合物に由来する例示的な試薬で標識される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去のためのアミノ酸は、Ｎ－メチル－イサト酸無水物、Ｎ－アセチル－イサト酸無水物、４－カルボン酸イサト酸無水物、５－メトキシ－イサト酸無水物、５－ニトロ－イサト酸無水物、４－クロロ－イサト酸無水物、４－フルオロ－イサト酸無水物、６－フルオロ－イサト酸無水物、Ｎ－ベンジル－イサト酸無水物、４－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、５－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、４－ニトロ－イサト酸無水物、４－メトキシ－イサト酸無水物、および５－アミノ－２－フルオロ－イソニコチン無水物（６－フルオロ－１Ｈ－ピリド［３，４－ｄ］［１，３］オキサジン－２，４－ジオン）、またはそれらの誘導体からなるリストから選択される例示的な試薬で標識される。いくつかの例において、本発明の修飾された切断酵素の作用によって除去される標識アミノ酸またはジペプチドは、置換されてもよいベンズアミド、典型的には、本明細書に記載された式（Ｂ）の化合物を含む、本明細書に開示された置換されてもよいイサト酸無水物のうちのいずれかに由来するものを含む。
本発明の他の好ましい実施形態では、本発明の修飾された切断酵素での処理のための調製において、ポリペプチドは、コハク酸無水物、フタル酸無水物、ピラジンジカルボン酸無水物、またはこれらのうちの１つの誘導体を含む化学試薬で処理され、末端アミノ酸は、化学試薬によって修飾または標識される。
本発明の修飾された切断酵素で処理されるポリペプチドの末端アミノ酸を標識するための反応の追加の特定の例としては、以下が挙げられる：
Figure 2022526939000014
 式中、
ｎは、０または１であり、
環Ｃｙは、存在しなくても、存在してもよい５員もしくは６員の環、または８～１０員の二環式環を表し、存在する場合、環Ｃｙは、飽和、不飽和、または芳香族であってもよく、破線の結合は、単結合、二重結合、または芳香族結合であってもよく、
Ｃｙが存在する場合、Ｃｙは、炭素環であっても、環員としてＮ、Ｏ、およびＳから選択される１つまたは２つのヘテロ原子を含有してもよく、
環Ｃｙが存在する場合、環Ｃｙは、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルコキシ、および－ＯＲ４から選択される１～６個の基（またはＣｙが芳香族の場合は１～４個の基）で置換されてもよく、
環Ｃｙが存在しない場合、破線の結合は、単結合または二重結合であってもよく、破線の結合は、ハロ、ＣＮ、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルコキシ、ＣＯ２Ｒ４、および－ＯＲ４から選択される１つまたは２つの基で置換されてもよく、
Ｒは、アミノ酸の側鎖、例えば、２０個の一般的なアミノ酸の側鎖のうちの１つを表し、
Ｒ４は、独立して、各出現において、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２アルキル、およびＣ１～Ｃ２ハロアルキルから選択され、
Ｒ５は、独立して、各出現において、Ｈ、ハロ、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２アルコキシ、およびＣ１～Ｃ２ハロアルコキシから選択され、
ＰＰは、ポリペプチドの一部分、特に、Ｎ末端アミノ酸を除く本発明の修飾された切断酵素での処理のために調製されているポリペプチドの部分を表す。したがって、式（Ｃ）の化合物は、典型的には、本発明の方法で使用するためのポリペプチドであり、Ｒは、ポリペプチドの末端アミノ酸の側鎖を表す。
式（Ｄ）のこれらの試薬の好ましい実施形態において、ｎが１である場合、環Ｃｙは存在しない。式（Ｄ）の化学試薬の追加の好ましい実施形態において、環Ｃｙが存在し、フェニル環または２，３－ピラジン環であり、これらは各々、上記のように置換されてもよく、ｎは０である。
好ましい実施形態において、式（Ｃ）に示される末端アミノ酸は、ＲがＨではない場合、Ｌ配置にある。
式（Ｅ）の化合物は、本明細書に記載の修飾された切断酵素反応で使用するために調製されているポリペプチド（標識ポリペプチドと呼ばれる場合もある）である。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去のためのアミノ酸は、コハク酸無水物に由来する例示的な試薬、または、環Ｃｙが存在せず、破線の結合が単結合を表す式（Ｄ）の化合物で標識される。いくつかの実施形態において、試薬は、３，６，ジフルオロフタル酸無水物、２，３ピラジンジカルボン酸無水物、またはコハク酸無水物である。いくつかの例では、除去された標識アミノ酸またはジペプチドは、４－カルボキシブチルアミドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明の修飾された切断酵素による処理のための調製において、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端のα－アミンとアミド結合を形成することができる任意の好適な化学試薬で処理される。多数の化学試薬がポリペプチドの末端アミンと反応して、ポリペプチドを修飾に連結するアミド結合を有する修飾ポリペプチドを形成する。このＮ末端修飾ポリペプチドは、修飾された切断酵素の基質となり得る。アミンと反応してアミド結合を形成する化学試薬は、ペプチドカップリングの分野から知られており、ハロゲン化アシル（塩化物、フッ化物、臭化物）、アシルイミダゾール、Ｏ－アシルイソ尿素、活性化エステル［Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳまたはＨＯＳｕ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）ｐ－ニトロフェニル（ＰＮＰ）、ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）、４－スルホ－２，３，５，６，－テトラフルオロフェニル、２，４，５－トリクロロフェノール、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド（ＨＯＮＢ）、３－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、１－ヒドロキシ－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－カルボキシレート（ＨＯＣｔ）］、エチル（２Ｚ）－２－シアノ－２－ヒドロキシイミノアセテート（Ｏｘｙｍａ）］、アルキルエステル、カルボジイミドなど（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｎｔａｌｂｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６１：１０８２７－１０８５２；Ｍｏｎｔａｌｂｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：１－１７．ｄｅ Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １１６（１９）：１２０２９－１２１２２（その各々は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））を含むが、これらに限定されない。Ｎ末端修飾は、酵素的方法を介してポリペプチドに連結するアミド結合を用いて導入することもできる（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０（１５）：３４２６－３４３１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。ポリペプチドをＰＮＰエステルで標識する例は、以下の条件下でポリペプチドを標識するために使用され得る４－ニトロフェニルアントラニレートを備える：４－ニトロフェノールアントラニレート（ＰＮＰＡ）を１００ｍＭでＤＭＳＯに溶解し、１ＸＰＢＳ（ｐＨ８．５）中１ｍＭのペプチドまたは１０％ＤＭＳＯ中１００ｍＭのＮａＨＣＯ３炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）と共に、ＰＮＰＡを１０ｍＭで、３７℃にて１時間使用する。生成された結果のペプチド産物は、イサト酸無水物でペプチドを標識するのと同等であり、表１１に示すように、修飾された切断酵素（例えば、ＤＡＰ ＢＩＩに由来）の基質として好適な２－アミノベンズアミドで修飾されたペプチドを生成する。
いくつかの例では、本発明の修飾された切断酵素での処理のための調製において、ポリペプチドは、アミン保護された活性化エステルを含む化学試薬で処理されてアミド結合を形成し、ポリペプチドの末端アミノ酸は、化学試薬によって修飾または標識される。次に、この修飾ポリペプチドをさらに適切に処理して、指定された保護基を除去し、修飾された切断酵素で処理するための修飾ポリペプチドを得ることができる。
本発明の修飾された切断酵素で処理されるポリペプチドの末端アミノ酸の標識の特定の例としては、以下が挙げられる：
Figure 2022526939000015
 式中、
Ｇ１～Ｇ４は、ＣＨ、ＣＸ、およびＮから各々独立して選択され、
各出現におけるＸは、独立してＣ１～Ｃ２アルキル、ＮＯ２、Ｃ１～Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルコキシ、ハロ、－ＯＲ２、－Ｎ（Ｒ２）２、－ＳＲ２、ＳＯ２Ｒ３、ＳＯ３Ｒ２、－Ｂ（ＯＲ２）２、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、ＣＮ、ＣＯＮ（Ｒ２）２、－ＣＯＯＲ２、－Ｃ（－Ｏ）Ａｒ、およびテトラゾールから選択され、
Ｒは、アミノ酸の側鎖、例えば、２０個の一般的なアミノ酸の側鎖のうちの１つを表し、
Ｒ１は、Ｈ、Ｒ３、Ｃ（－Ｏ）Ｒ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２、－Ｃ（＝Ｏ）Ａｒ、および－ＳＯ２Ｎ（Ｒ３）２から選択され、
Ｒ２は、各出現において独立して、ＨおよびＣ１～Ｃ２アルキルから選択され、
Ｒ３は、各出現において独立して、Ｃ１～Ｃ２アルキルから選択され、
Ａｒは、各出現で独立して、フェニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、およびピラジニルから選択され、これらは各々、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２ハロアルコキシ、および－ＯＲ２から選択される１つまたは２つの基によって置換されてもよく、
Ｌは、ハロ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール、スルホＮ－ヒドロキシスクシンイミド（スルホＮＨＳ）、２，３，４，５，６－ペンタフルオロフェノール（ｐＦＰ）、４－スルホ－２，３，５，６－テトラフルオロフェノール、クロロ、４－ニトロフェノール、および－Ｏ（Ｃ＝）－Ｏ－（Ｃ１～６アルキル）から選択される脱離基であり、
任意選択的に、－ＮＲ１－ＰＧは、－Ｎ３で置き換えることができ、
ＰＧは、Ｈまたは窒素保護基であり、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、カルボキシルベンジル（Ｃｂｚ）、パラ－ニトロカルボキシルベンジル（ｐ－ＮＯ２Ｃｂｚ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、パラ－アジドカルボキシルベンジル（ｐ－Ｎ３Ｃｂｚ）、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－イルオキシカルボニル（Ｔｅｍｐｏｃ）、およびその他のＮ保護基から選択され得る。
いくつかの例では、本発明の修飾された切断酵素での処理のための調製において、ポリペプチドは、４－ニトロフェニルアントラニレートで処理される。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去のためにアミノ酸を修飾または標識するための化学試薬は、本明細書に記載の式（Ａ）もしくは（Ｄ）の化合物のうちのいずれか１つ以上、またはその塩もしくは共役体である。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去のためにアミノ酸を修飾または標識するための化学試薬は、本明細書に記載の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）もしくは（ＡＢ）の化合物のうちのいずれか１つ以上、またはその塩もしくは共役体である。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去のためにアミノ酸を修飾または標識するための試薬は、式（Ｉ）：
Figure 2022526939000016
 の化合物からなる群から選択される化合物、またはその塩もしくは共役体を含み、
式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、シクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒａ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または－Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり、
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、およびヘテロアリールは、各々非置換であるか、または置換されており、
Ｒ３は、ヘテロアリール、－ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または－ＳＲｆであり、ヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており、
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１～６アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ３が
Figure 2022526939000017
 である場合、Ｒ１およびＲ２は、いずれもＨではない。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、いずれもＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１もＲ２も、Ｈではない。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の一方は、Ｃ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の一方は、Ｈであり、他方は、Ｃ１～６アルキル、シクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒａ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または－Ｓ（Ｏ）２Ｒｃである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の一方または両方は、Ｃ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の一方または両方は、シクロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の一方または両方は、－Ｃ（Ｏ）Ｒａである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の一方または両方は、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｂである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の一方または両方は、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｃである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の一方または両方は、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり、Ｒｃは、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022526939000018
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022526939000019
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、いずれも
Figure 2022526939000020
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ１またはＲ２は、
Figure 2022526939000021
 である。
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ３は、単環式ヘテロアリール基である。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ３は、５員または６員の単環式ヘテロアリール基である。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ３は、１つ以上のＮを含む５員または６員の単環式ヘテロアリール基である。好ましくは、Ｒ３は、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾールおよびテトラゾールから選択され、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾールまたはテトラゾール環の窒素原子を介して式（Ｉ）のアミジンに連結され、Ｒ３は、ハロ、Ｃ１～３アルキル、Ｃ１～３ハロアルキルおよびニトロから選択される基で置換されてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、
Figure 2022526939000022
 であり、式中、Ｇ１は、Ｎ、ＣＨまたはＣＸであり、Ｘは、ハロ、Ｃ１～３アルキル、Ｃ１～３ハロアルキルまたはニトロである。いくつかの実施形態において、Ｘが、Ｍｅ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３またはＮＯ２である場合、Ｒ３は、
Figure 2022526939000023
 であるか、または。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、
Figure 2022526939000024
 であり、式中、Ｇ１は、ＮまたはＣＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、
Figure 2022526939000025
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、二環式ヘテロアリール基である。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、９員または１０員の二環式ヘテロアリール基である。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、
Figure 2022526939000026
 である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2022526939000027
 である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2022526939000028
 である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2022526939000029
 からなる群から選択され、任意選択的に、
Figure 2022526939000030
 （Ｎ－Ｂｏｃ、Ｎ’－トリフルオロアセチル－ピラゾールカルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビスアセチル－ピラゾールカルボキサミジン、Ｎ－メチル－ピラゾールカルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビスアセチル－Ｎ－メチル－ピラゾールカルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビスアセチル－Ｎ－メチル－４－ニトロ－ピラゾールカルボキサミジン、およびＮ，Ｎ’－ビスアセチル－Ｎ－メチル－４－トリフルオロメチル－ピラゾールカルボキサミジン）、またはこれらのうちのいずれかの塩もしくは共役体を含む。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、向山試薬（２－クロロ－１－メチルピリジニウムヨージド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、試薬は、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物および向山試薬を含む。
いくつかの実施形態では、シアナミド誘導体を含む化学試薬を使用して、ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸を標識する。（例えば、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１４，１６，６０４８－６０５１（その全体が参照により組み込まれる）を参照）。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（ＩＩ）：
Figure 2022526939000031
 の化合物からなる群から選択される化合物、またはその塩もしくは共役体を含み、
式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、シクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）ＲＧ、または－Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり、
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ１～６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ１～６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々非置換であるか、または置換される。
いくつかの実施形態では、イソチオシアネート誘導体を含む試薬を使用して、ポリペプチドの末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡ）を標識する。（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ．２００６，３４，１７８７－１８０１（その全体が参照により組み込まれる）を参照）。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（ＩＩＩ）：
Ｒ５・Ｎ＝Ｃ＝Ｓ （ＩＩＩ）
の化合物、またはその塩もしくは共役体からなる群から選択される化合物を含み、
式中、
Ｒ５は、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールは、各々非置換であるか、またはハロ、－ＮＲｈＲｉ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、またはヘテロシクリルからなる群から選択される１つ以上の基で置換されており、
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、およびヘテロアリールは、各々非置換であるか、または置換される。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態においてＲ５は、置換フェニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、ハロ、－ＮＲｈＲｉ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、またはヘテロシクリルから選択される１つ以上の基で置換された置換フェニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、非置換Ｃ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、置換Ｃ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、ハロ、－ＮＲｈＲｉ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｊまたはヘテロシクリルから選択される１つ以上の基で置換された、置換Ｃ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、非置換Ｃ２～６アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、Ｃ２～６アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、ハロ、－ＮＲｈＲｉ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｊまたはヘテロシクリルから選択される１つ以上の基で置換された、置換Ｃ２～６アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、非置換アリールである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、置換アリールである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、ハロ、－ＮＲｈＲｉ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｊまたはヘテロシクリルから選択される１つ以上の基で置換されたアリールである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、非置換シクロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、置換シクロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、ハロ、－ＮＲｈＲｉ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｊまたはヘテロシクリルから選択される１つ以上の基で置換されたシクロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、非置換ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、置換ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、ハロ、－ＮＲｈＲｉ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｊまたはヘテロシクリルから選択される１つ以上の基で置換されたヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、非置換ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、置換ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は、ハロ、－ＮＲｈＲｉ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒｊまたはヘテロシクリルから選択される１つ以上の基で置換されたヘテロアリールである。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳＩＴＣ）またはペンタフルオロフェニルイソチオシアネート（ＰＦＰＩＴＣ）である。
いくつかの実施形態において、化合物は、トリフルオロメチルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、ジメチルアミノアゾベンゼンイソチオシアネート、４－スルホフェニルイソチオシアネート、３－ピリジルイソチオシアネート、２－ピペリジノエチルイソチオシアネート、３－（４－モルホリノ）プロピルイソチオシアネート、または３－（ジエチルアミノ）プロピルイソチオシアネートではない。
いくつかの実施形態において、試薬は、アルキルアミンであるか、またはアルキルアミンを含む。いくつかの実施形態において、試薬は、ＤＩＰＥＡ、トリメチルアミン、ピリジン、および／またはＮ－メチルピペリジンをさらに含む。いくつかの実施形態において、試薬は、アセトニトリル中のピリジンおよびトリエチルアミンをさらに含む。いくつかの実施形態において、試薬は、水および／またはメタノール中のＮ－メチルピペリジンをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドを、カルボジイミド化合物とも接触させる。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、カルボジイミド誘導体を含む（例えば、Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１５，２１，１０３６９－１０３７８（それらの全体が参照により組み込まれる）を参照）。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドのＮＴＡＡは、アシル化を介して標識される。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２），Ｉ，５８２－５８９（それらの全体が参照により組み込まれる）を参照）。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（ＩＶ）：
Figure 2022526939000032
 の化合物、またはその塩もしくは共役体からなる群から選択される化合物を含み、
式中、
Ｒ８は、ハロまたは－ＯＲｍであり、
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１～６アルキルまたはヘテロシクリルであり、
Ｒ９は、水素、ハロまたはＣ１～６ハロアルキルである。
式（ＩＶ）のいくつかの実施形態においてＲ８は、ハロである。いくつかの実施形態において、Ｒ８は、クロロである。いくつかの実施形態において、Ｒ８は、
Figure 2022526939000033
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ９は、水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ９は、ブロモなどのハロである。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）の化合物は、塩化アセチル、無水酢酸およびアセチル－ＮＨＳから選択される。いくつかの実施形態において、化合物は、アセチル無水物またはアセチル－ＮＨＳではない。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドはまた、ペプチドカップリング試薬と接触している。いくつかの実施形態において、ペプチドカップリング試薬は、カルボジイミド化合物である。いくつかの実施形態において、カルボジイミド化合物は、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である。いくつかの実施形態において、この方法は、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物およびＤＩＣまたはＥＤＣなどのカルボジイミド化合物との接触を含む。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、金属錯体を含む。（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７３（１３５），５０７－５１１；Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７６（１５３），１３７－１３８；Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１３９，９８１９－９８２２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６，１３８（４４），１４５５４－１４５５７（それらの全体が参照により組み込まれる）を参照）。いくつかの実施形態において、金属錯体は、金属配向／キレート基である。いくつかの実施形態において、金属錯体は、金属中心にキレートされた１つ以上のリガンドを含む。いくつかの実施形態において、リガンドは、単座リガンドである。いくつかの実施形態において、リガンドは、二座または多座リガンドである。いくつかの実施形態において、金属錯体は、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、ＺｎおよびＮｉからなる群から選択される金属を含む。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）の共役体を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの末端アミノ酸を修飾するために使用される試薬は、リガンドに共役された式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（Ｉ）－Ｑ、式（ＩＩ）－Ｑ、式（ＩＩＩ）－Ｑまたは式（ＩＶ）－Ｑの共役体を含み、式（Ｉ）～（ＩＶ）は、上で定義した通りであり、Ｑは、リガンドである。
いくつかの実施形態において、リガンドＱは、ペンダント基または結合部位（例えば、結合剤が結合する部位）である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、結合剤に共有結合する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、結合剤に共有結合することができるリガンド基を含む末端アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、式（Ｉ）－Ｑ、式（ＩＩ）－Ｑ、式（ＩＩＩ）－Ｑまたは式（ＩＶ）－Ｑの化合物で標識されたＮＴＡＡを含み、Ｑは、結合剤に共有結合する。いくつかの実施形態において、カップリング反応を実施して、ポリペプチドと結合剤との間に共有結合（例えば、リガンドＱと結合剤上の官能基との間に共有結合）を作り出す。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（Ｉ）－Ｑ：
Figure 2022526939000034
 （式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義された通りであり、Ｑは、リガンドである）の共役体を含む。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（ＩＩ）－Ｑ：
Figure 2022526939000035
 （式中、Ｒ４は、上記で定義された通りであり、Ｑは、リガンドである）の共役体を含む。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（ＩＩＩ）－Ｑ：
Figure 2022526939000036
 （式中、Ｒ５は、上記で定義された通りであり、Ｑは、リガンドである）の共役体を含む。
いくつかの実施形態において、化学試薬は、式（ＩＶ）－Ｑ：
Figure 2022526939000037
 （式中、Ｒ８およびＲ９は、上記で定義された通りであり、Ｑは、リガンドである）の共役体を含む。
いくつかの実施形態において、Ｑは、－Ｃ１～６アルキル、－Ｃ２～６アルケニル、－Ｃ２～６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｎ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ、－ＳＲｐまたは－Ｓ（Ｏ）２Ｒｑからなる群から選択され、－Ｃ１～６アルキル、－Ｃ２～６アルケニル、－Ｃ２～６アルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルは、各々非置換であるか、または置換されており、Ｒｎ、Ｒｏ、ＲｐおよびＲｑは、各々独立して、－Ｃ１～６アルキル、－Ｃ１～６ハロアルキル、－Ｃ２～６アルケニル、－Ｃ２～６アルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｑは、
Figure 2022526939000038
 からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｑは、フルオロフォアである。いくつかの実施形態において、Ｑは、ランタニド、ユーロピウム、テルビウム、ＸＬ６６５、ｄ２、量子ドット、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、フルオレセイン、ローダミン、エオシン、テキサスレッド、シアニン、インドカルボシアニン、オカカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、ピリジルオキサドール、ベンゾオキサジアゾール、カスケードブルー、ナイルレッド、オキサジン１７０、アクリジンオレンジ、プロフラビン、オーラミン、マラカイトグリーンクリスタルバイオレット、ポルフィンフタロシアニン、およびビリルビンから選択される。
他の態様において提供されるのは、２つ以上の標識を有する修飾された切断酵素による除去のために末端アミノ酸またはアミノ酸を標識する際に使用される試薬である。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去のために末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡ）またはアミノ酸を標識することは、第１の試薬および第２の試薬を使用することを含む。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸は、第１の試薬および第２の試薬で同時にまたは連続して標識される。いくつかの実施形態において、第１の試薬は、本明細書に記載されるように、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物からなる群から選択される化合物、またはその塩もしくは共役体を含む。
いくつかの実施形態において、第２の試薬は、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）：
Figure 2022526939000039
 の化合物、またはその塩もしくは共役体を含み、

Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、Ｃ１～６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクリルは、それぞれ非置換であるか、または置換されているか、あるいは
Ｒ１３－Ｘ （Ｖｂ）

Ｒ１３は、Ｃ１～６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、その各々が非置換であるか、または置換されており、
Ｘは、ハロゲンである。
式（Ｖａ）のいくつかの実施形態においてＲ１３は、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、メチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、セクブチル、ペンチルまたはヘキシルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、アリールで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、－ＣＨ２ＣＨ２Ｐｈ、－ＣＨ２Ｐｈ、－ＣＨ（ＣＨ３）Ｐｈ、または－ＣＨ（ＣＨ３）Ｐｈである。
式（Ｖｂ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１３は、メチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、セクブチル、ペンチルまたはヘキシルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、アリールで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、－ＣＨ２ＣＨ２Ｐｈ、－ＣＨ２Ｐｈ、－ＣＨ（ＣＨ３）Ｐｈ、または－ＣＨ（ＣＨ３）Ｐｈである。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去のための末端アミノ酸またはアミノ酸を修飾または標識するための試薬は、ホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸を修飾または標識するための試薬は、ヨウ化メチルを含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドを、還元剤とも接触させる。いくつかの実施形態において、還元剤は、ＮａＢＨ４、ＫＢＨ４、ＺｎＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮまたはＬｉＢｕ３ＢＨなどの水素化ホウ素を含む。いくつかの実施形態において、還元剤は、ＬｉＡｌＨ４またはＳｎＣｌなどのアルミニウムまたはスズ化合物を含む。いくつかの実施形態において、還元剤は、Ｂ２Ｈ６およびジメチルアミンボランなどのボラン錯体を含む。いくつかの実施形態において、試薬は、ＮａＢＨ３ＣＮをさらに含む。
いくつかの実施形態で、末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡ）を標識するために使用され得る試薬には、４－スルホフェニルイソチオシアネート（スルホ－ＰＩＴＣ）、４－ニトロフェニルイソチオシアネート（ニトロ－ＰＩＴＣ）、３－ピリジルイソチオシアネート（ＰＹＩＴＣ）、フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）、ニトロ－ＰＩＣ、スルホ－ＰＩＣ、カルボキシル活性化アミノブロックアミノ酸、無水物（例えば、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物、アザイサト酸無水物、コハク酸無水物）、２－ピペリジノエチルイソチオシアネート（ＰＥＩＴＣ）、３－（４－モルホリノ）プロピルイソチオシアネート（ＭＰＩＴＣ）、３－（ジエチルアミノ）プロピルイソチオシアネート（ＤＥＰＴＩＣ）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８１：１８９３－１９００）、（１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ－Ｃｌ、または１－ジメチルアミノナフタレン－５－スルホニルクロリド）、４－スルホニル－２－ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、アセチル化試薬、アミド化（グアニジニル化）試薬（ＰＣＡおよびＰＣＡ誘導体を含む）、２－カルボキシ－４，６－ジニトロクロロベンゼン、７－メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、ならびに／またはチオベンジル化試薬が含まれる。これらの試薬の多くは、ＰＩＴＣ、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、ＰＹＩＴＣ、およびグアニジニル化試薬（例えば、ＰＣＡ化合物）を含むＤＮＡと非反応性であるか、または最小限の反応性を示す。アミノ酸が、標識に対してブロックされる場合、アシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）でＮ－アセチルブロックを除去するなど、末端のブロックを解除するためのいくつかのアプローチがある（Ｆａｒｒｉｅｓ，Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６：６７９－６８５）。ペプチドのＮ末端のブロックを解除する方法は、当技術分野で既知である（例えば、Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：４５－５０；Ｌｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １１：Ｕｎｉｔ１１．７；Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １１：Ｕｎｉｔ １１．７（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
ダンシルクロリドは、ペプチドの遊離アミン基と反応して、ＮＴＡＡのダンシル誘導体を生成する。ＤＮＦＢおよびＳＮＦＢは、ペプチドのα－アミン基を反応させて、それぞれＤＮＰ－ＮＴＡＡおよびＳＮＰ－ＮＴＡＡを生成する。さらに、ＤＮＦＢおよびＳＮＦＢは、いずれもリジン残基のε－アミンとも反応する。ＤＮＦＢは、チロシンおよびヒスチジンのアミノ酸残基とも反応する。いくつかの実施形態において、ＳＮＦＢは、ＤＮＦＢよりもアミン基に対してより良好な選択性を有する（Ｃａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９６８）２４３（２０）：５２４４－５２５３）。特定の実施形態において、リシンε－アミンは、ポリペプチドのペプチドへのプロテアーゼ消化の前に、有機無水物で事前にブロックされる。
イオン性液体の存在下で、イソチオシアネートは、第一級アミンに対する反応性が向上していることが示されている。イオン性液体は、有機化学反応における優れた溶媒であり（かつ、触媒として機能する）、イソチオシアネートとアミンとの反応を促進してチオ尿素を形成することができる。さらに、イオン性液体は、マイクロ波放射の吸収剤として作用して、反応性をさらに高めることができる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｐａｌｏｕ，Ｊ．Ｍｅｘ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２００７）５１（４）：２５２－２６４）。一例は、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）による芳香族および脂肪族アミンの迅速かつ効率的な官能化のためのイオン性液体１－ブチル－３－メチル－イミダゾリウムテトラフルオロボレート［Ｂｍｉｍ］［ＢＦ４］の使用である（Ｌｅ，Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、以下のスキームに示されるように、式（ＡＢ）の化合物を含む化学試薬で処理することによって標識され得る。
Figure 2022526939000040
いくつかの実施形態において、ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を修飾するために化学試薬で処理されたペプチドは、二複素環メタニミン試薬で処理される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素による除去のための末端アミノ酸またはアミノ酸を修飾または標識するための試薬は、式（ＡＢ）：
Figure 2022526939000041
 式中、
Ｒ２は、Ｈ、Ｒ４、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、または－ＮＨＲ４であり、
Ｒ４は、ハロ、Ｃ１～３アルキル、Ｃ１～３アルコキシ、Ｃ１～３ハロアルキル、フェニル、５員ヘテロアリール、および６員ヘテロアリールから選択される１つまたは２つのメンバーで置換されたＣ１～６アルキルであり、各フェニル、５員ヘテロアリールおよび６員ヘテロアリールが、ハロ、－ＯＨ、Ｃ１～３アルキル、Ｃ１～３アルコキシ、Ｃ１～３ハロアルキル、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＲ”、およびＣＯＮ（Ｒ”）２から選択される１つまたは２つのメンバーで置換されてもよく、
各Ｒ”は、独立して、ＨまたはＣ１～３アルキルであり、
環Ａおよび環Ｂは、各々独立して、環員として最大３つのＮ原子を含む５員ヘテロアリール環であり、各々は、任意選択的に、追加のフェニルまたは５～６員ヘテロアリール環に融合され、５員ヘテロアリール環および任意の縮合フェニルまたは５～６員ヘテロアリール環は各々、Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～４アルコキシ、－ＯＨ、ハロ、Ｃ１～４ハロアルキル、ＮＯ２、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、－ＳＯ２Ｒ＊、－ＮＲ２、フェニル、および５～６員ヘテロアリールから選択される１つまたは２つの基で置換されてもよく、
各Ｒは、独立して、Ｈ、およびＯＨ、ＯＲ＊、－ＮＨ２、－ＮＨＲ＊または－ＮＲ＊２で置換されてもよいＣ１～３アルキルから選択され、
各Ｒ＊は、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～２アルコキシまたはＣＮで置換されてもよいＣ１～３アルキルであり、
ここで、同じＮ上の２つのＲ、または２つのＲ”、または２つのＲ＊は、任意選択的に、一緒にされて４～７員の複素環を形成することができ、任意選択的に、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される追加のヘテロ原子を含有し、および任意選択的に、ハロ、Ｃ１～２アルキル、ＯＨ、オキソ、Ｃ１～２アルコキシ、もしくはＣＮから選択される１つまたは２つの基で置換されてもよい、化合物、
またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、環Ａおよび環Ｂは、いずれも非置換イミダゾールではなく、環Ａおよび環Ｂは、いずれも非置換ベンゾトリアゾールではない。
この実施形態の例では、Ｒ２は、ＨまたはＲ４である。これらの実施形態において、これらの実施形態において、５員ヘテロアリール基は、存在する場合、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される１～３個のヘテロ原子を含む５員環であり得、６員ヘテロアリール基は、存在する場合、環員として１～３個の窒素原子を含む６員環であり得る。これらの実施形態のいくつかでは、環Ａも環Ｂも、非置換イミダゾールまたは非置換ベンゾトリアゾールではない。いくつかの実施形態において、Ｒ２はＨである。これらの実施形態のいくつかでは、環Ａも環Ｂも、非置換イミダゾールまたは非置換ベンゾトリアゾールではない。
いくつかの実施形態において、環Ａおよび環Ｂは、異なる。いくつかの実施形態において、環Ａおよび環Ｂは、同じである。この実施形態の特定の化合物には、以下が含まれる。
Figure 2022526939000042
いくつかの態様において、各５～６員ヘテロアリール環は、独立して選択され、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される１つまたは２つのヘテロ原子を含む。これらの実施形態において、存在する各５員ヘテロアリール基は、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される１つまたは２つのヘテロ原子を含む５員環であり得、６員ヘテロアリール基は、環員として１つまたは２つの窒素原子を含む６員環であり得る。
いくつかの特定の実施形態において、環Ａおよび環Ｂは、
Figure 2022526939000043
 式中、
各Ｒｘ、ＲｙおよびＲｚは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１～２アルキル、Ｃ１～２ハロアルキル、ＮＯ２、ＳＯ２（Ｃ１～２アルキル）、ＣＯＯＲ＃、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＃）２、ならびにハロ、Ｃ１～２アルキル、Ｃ１～２ハロアルキル、ＮＯ２、ＳＯ２（Ｃ１～２アルキル）、ＣＯＯＲ＃、およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＃）２から選択される１つまたは２つの基で置換されてもよいフェニルから選択され、
環の隣接する原子上の２つのＲｘ、ＲｙまたはＲｚは、任意選択的に、一緒にされて、環に縮合したフェニル基、５員ヘテロアリール基または６員ヘテロアリール基を形成し、縮合したフェニル、５員ヘテロアリールまたは６員ヘテロアリール基は、ハロ、Ｃ１～２アルキル、Ｃ１～２ハロアルキル、ＮＯ２、ＳＯ２（Ｃ１～２アルキル）、ＣＯＯＲ＃、およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＃）２から選択される１つまたは２つの基で置換されてもよく、
各Ｒ＃は、独立して、ＨまたはＣ１～２アルキルであり、同じ窒素上の２つのＲ＃は、任意選択的に、一緒にされて、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される追加のヘテロ原子を任意選択的に含む４～７員の複素環を形成することができ、４～７員の複素環は、ハロ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＭＥ、オキソ、ＮＨ２、ＮＨＭｅおよびＮＭＥ２から選択される１つまたは２つの基で置換されてもよい
またはそれらの塩から選択される。
これらの実施形態において、存在する各５員ヘテロアリール基は、環員としてＮ、ＯおよびＳから選択される１～３個のヘテロ原子を含む５員環であり得、６員ヘテロアリール基は、環員として１～３個の窒素原子を含む６員環であり得る。
いくつかの実施形態において、環Ａおよび環Ｂは、同じであり、以下から選択される。
Figure 2022526939000044
 。
以下から選択される、実施形態３０の化合物。
Figure 2022526939000045
２．その他の標識
いくつかの実施形態において、標識は、修飾された切断酵素によって認識または結合されることができる任意の標識である。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸標識は、末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端アミノ酸）のサイズ／形状を「模倣する」標識であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、標識は、修飾アミノ酸、アミノ酸の一部分、保護されたアミノ酸、ブロックアミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸に付着した標識は、Ｎ末端ブロック（アルファアミンを欠いた）アミノ酸である。
いくつかの実施形態において、標識は、天然に存在するか、または合成された任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、標識は、合成されたブロックアミノ酸である。一般に、アミノ酸ブロック基を導入する任意の好適な方法を使用することができる。いくつかの実施形態において、ブロック基は、アミノ酸を試薬と反応させてブロック基を導入することによって導入される。任意の好適な活性化されたブロックアミノ酸を使用して、末端アミノ酸を標識することができる。例えば、Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）５０（１５）：２７９２－２７９４を参照のこと。例えば、１つ以上の外因性アミノ酸（例えば、－Ｘａａ－標識または－Ｘａａ－Ｘａａ－標識）を含む合成標識を標識として使用し、修飾された切断酵素で処理するためにポリペプチドに付着させることができる。
いくつかの実施形態において、アミノ酸ブロック基は、一価または二価の好適な基であり得、これには、アシル基、例えば、アセチルなどの低級アルカノイル、置換された低級アルカノイル、例えば、クロロアセチルなどの低級ハロアルカノイル、フェニルアセチルなどのアリール－低級アルカノイル、およびベンゾイルまたはフタロイルなどのアロイル；エトキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニルまたはｔ－ブチルオキシカルボニルなどの低級アルコキシカルボニル基、および置換された低級アルコキシカルボニル基、例えば、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニルなどの低級ハロアルコキシカルボニル；ベンジルオキシカルボニルなどのアリール－低級アルコキシカルボニル基；スルホニル基、例えばメタンスルホニルなどの低級アルキルスルホニル、およびベンゼンスルホニルまたはｐ－トルエンスルホニルなどのアリールスルホニル；シッフ塩基を形成するアルデヒドおよびケトンとの反応によって形成されるイリデン基、例えばベンズアルデヒド、サリックアルデヒド（ｓａｌｉｃａｌｄｅｈｙｄｅ）またはアセト酢酸エステル；窒素原子がジヒドロピリジン環の一部を形成するような二価基（そのような保護基は、例えば、ホルムアルデヒドおよびβ－ケトエステル、例えば、アセト酢酸エステルとの反応によって得られる）が含まれる。
そのような実施形態のいくつかにおいて、除去のためのペプチドの標識（例えば、ＮＴＡＡの標識）は、アミノ酸を含む標識を、標識と共に付着させることを含む。例えば、Ｃｂｚ－アミノ酸（例えば、Ｎ－ＣＢＺ－ＤＬ－セリン、Ｎ－ＣＢＺ－Ｌ－アスパラギン酸）またはＮ－保護アミノ酸などの標識アミノ酸が市販されている。いくつかの実施形態において、除去のための末端アミノ酸の標識は、除去のための末端アミノ酸への標識としてのＣｂｚ－アミノ酸を付着させることを含む。いくつかの特定の実施形態において、標識は、２つのアミノ酸を含む標識を、標識と共に付着させることを含む。例えば、－Ｘａａ－Ｘａａ－標識（例えば、Ｚ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｏｓｕ）を含む合成標識を標識として使用し、修飾された切断酵素で処理するためにペプチドに付着させることができる。
いくつかの実施形態において、標識は、Ａｃで保護されたアミンを有するアミノ酸を含む。いくつかの例では、標識は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、またはＣｂｚで保護されたアミノ酸を含む。他の例では、標識アミノ酸は、ジアルキルであるアミンを有するアミノ酸を含む。他の例では、標識のアミノ酸のカルボン酸は遊離しており、アミノ酸は、ＨＡＴＵ＋ＤＩＥＡまたはＥＤＣ＋ＤＩＥＡ＋ＨＯＢｔなどの標準的なペプチドカップリング試薬を使用してカップリングされる。他の例では、標識は、ＤまたはＬキラリティーであり得るアミノ酸を含む。
１つ以上の外因性アミノ酸を含む合成標識（例えば、－Ｘａａ－標識）が標識として使用され、ポリペプチドに付着したいくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドの１つのアミノ酸と、標識の一部として追加された１つの外因性アミノ酸と、を含むポリペプチドからジペプチドを除去し得る。場合によっては、外因性アミノ酸Ｘａａは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される任意のアミノ酸残基を表し得る。例えば、Ｎ末端のポリペプチドが－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１を有する場合、Ｘａａ－標識を含む標識が、末端のポリペプチドに付加されて、－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｘａａ－標識を形成する。次に、例示的な修飾された切断酵素を、標識ポリペプチドと接触させて、ポリペプチドから－Ｐ１－Ｘａａ－標識を含むジペプチドを切断し、それにより、ポリペプチドのＮ末端からＰ１アミノ酸を除去する。いくつかの特定の実施形態において、未修飾または野生型トリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素は、ポリペプチドからＰ２－Ｐ１－Ｘａａ標識を含むトリペプチドを除去し、それにより、ポリペプチドのＮ末端からＰ１およびＰ２アミノ酸を除去し得る。
２つの外因性アミノ酸を含む合成標識（例えば、－Ｘａａ－Ｘａａ－標識）が標識として使用され、ポリペプチドに付着したいくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドの１つのアミノ酸と、標識の一部として追加された２つの外因性アミノ酸と、を含むポリペプチドからトリペプチドを除去し得る。例えば、Ｎ末端のポリペプチドが－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１を有する場合、Ｘａａ－Ｘａａ－標識を含む標識が、末端のポリペプチドに付加されて、－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｘａａ－Ｘａａ－標識を形成する。次に、例示的な修飾された切断酵素を、標識ポリペプチドと接触させて、ポリペプチドから－Ｐ１－Ｘａａ－Ｘａａ－標識を含むトリペプチドを切断し、それにより、ポリペプチドのＮ末端からＰ１アミノ酸を除去する。
Ｂ．操作および遺伝子選択
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される修飾された切断酵素は、任意の好適な方法を使用して、作製、単離、操作、または選択することができる。場合によっては、変異体または修飾された切断酵素ポリペプチドは、アミノ酸残基の１つ以上の置換、付加、または欠失を導入することによって、野生型または未修飾の切断酵素と比較して、一次アミノ酸配列が改変される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、操作および遺伝子選択を介して、野生型または未修飾の切断酵素（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、トリペプチジルペプチダーゼ、またはＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３に分類されるタンパク質、またはその機能的相同体もしくは断片）から誘導される。遺伝子選択、タンパク質工学、組換え法、化学合成、またはそれらの組み合わせを含むさまざまな技術を使用することができる。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、選択活性、基質結合能力、または他の切断特性のための合理的な設計アプローチを使用して操作される。いくつかの実施形態において、合理的な設計アプローチは、未修飾の切断酵素の結晶構造に基づく。いくつかの例では、合理的な設計アプローチは、修飾の対象となるアミノ酸残基を特定するための基質を含む未修飾の切断酵素の結晶構造に基づく。場合によっては、修飾は、未修飾の切断酵素の特定のドメインの残基を標的とする場合がある（例えば、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，４：４９７７を参照）。いくつかの実施形態において、合理的な設計を使用して、未修飾の切断酵素の基質結合ドメインに修飾アミノ酸を有する修飾された切断酵素を操作する。いくつかの実施形態において、突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、欠失）は、配列番号５またはヒトジペプチジルペプチダーゼ３（ＤＰＰ３）もしくはその相同体の配列の番号付けに関して、位置３１６、３９１、３９４、またはそれらの組み合わせに対応する。いくつかの実施形態において、合理的な設計を使用して、未修飾の切断酵素と比較して長さが増加したポリペプチドを結合または切断することができる修飾された切断酵素を操作する。いくつかの実施形態において、突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、欠失）は、配列番号５の番号付けに関して、アミノ酸残基の位置４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、またはそれらの組み合わせに対応する。いくつかの実施形態において、合理的な設計を使用して、未修飾の切断酵素のヒンジ領域に修飾アミノ酸を有する修飾された切断酵素を操作する。
いくつかの実施形態において、遺伝子選択または他の操作方法は、標識されたポリペプチド（例えば、化学的に標識されたポリペプチド）に対して活性である修飾された切断酵素を識別するように設計される。いくつかの実施形態において、遺伝子選択または他の操作方法は、標識されたＮ末端アミノ酸を有する修飾または標識されたポリペプチドに対して活性である修飾された切断酵素を識別するように設計される。場合によっては、標識されたポリペプチド上の部分または標識のサイズまたは他の特徴が、所望の修飾された切断酵素を得るための遺伝子選択または他の操作方法の設計において考慮される。
野生型または修飾された切断酵素のドメイン構成を説明するために使用される配列番号として示される特定の配列を含めたアミノ酸への言及は、例示のためのものであり、提供される実施形態の範囲を限定することを意味するものではないことが理解される。ポリペプチドおよびそのドメインの説明は、相同性分析および類似の分子とのアラインメントに基づいて理論的に導出されることが理解される。したがって、正確な遺伝子座は異なる可能性があり、各タンパク質で必ずしも同じであるとは限らない。したがって、特定の結合ドメイン、ループドメイン、または他の機能ドメイン）などの特定のドメインは、既知の分析およびアラインメント方法を使用して、別の種に由来する相同体または酵素において識別され得る。
いくつかの例では、野生型ジペプチド切断酵素（例えば、野生型ＤＡＰ ＢＩＩ）およびその基質の結晶構造の分析を使用して、野生型ジペプチド切断酵素における修飾のためのアミノ酸を選択して、タンパク質相互作用界面における接触残基および他の残基を識別することができる。この分析は、例えば、巨大分子モデリング用のＲｏｓｅｔｔａソフトウェアスイートを使用して実行され得る（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００８）７７：３６３－３８２）。いくつかの実施形態において、修飾のために選択された標的残基を使用して、他の生物の野生型切断酵素配列のアラインメントを使用して、保存された残基を識別することができる（Ｃｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ（２００４）１４（６）：１１８８－１１９０）。この分析に基づいて、保存された標的残基または相同体の対応する残基を修飾することができる。いくつかの実施形態では、識別された接触残基または他の目的の残基を修飾して、新たな機能を導入する。図４Ａ～４Ｃに示されるように、６０％の配列類似性または同一性を有するＤＡＰ ＢＩＩ相同体のＷｅｂＬｏｇｏ分析は、さまざまな残基にわたる配列保存を示した。例えば、配列保存は、配列番号２０に記載の野生型ＤＡＰ ＢＩＩ配列に関して、位置Ｎ２１５、Ｗ２１６、Ｒ２２０、Ｎ３３０、およびＤ６７４を含むＤＡＰ ＢＩＩのアミン結合部位の残基について観察された。別の例では、配列保存は、配列番号２０に記載の野生型ＤＡＰ ＢＩＩ配列に関して、位置Ｇ２０７、Ｋ２０８、Ｆ２０９、Ｇ２１０、Ｇ２１１、Ｄ２１２、Ｉ２１３、Ｄ２１４、Ｎ２１５、Ｗ２１６、Ｍ２１７、Ｗ２１８、Ｐ２１９、Ｒ２２０、Ｈ２２１、Ｔ２２２、Ｇ２２３、Ａ２２４、Ｆ２２５、Ａ２２６、Ａ３２６、および／またはＮ３３４を含むＤＡＰ ＢＩＩのアミン結合部位の残基について観察された。
いくつかの態様において、ＤＡＰ ＢＩＩを操作するための合理的な設計アプローチを使用して、ドメインまたは残基を標的とすることができ、結果として、生じた修飾切断酵素は、基質と複合体を形成するＤＡＰ ＢＩＩの結晶構造を使用して、標識Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を除去するか、または除去するように構成される（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，４：４９７７）。例えば、残基Ｎ１９１、Ｗ１９２、Ｒ１９６、Ｎ３０６、およびＤ６５０（配列番号１３に記載のタンパク質の配列に基づく；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｖ５ＹＭ１４）でペプチド基質と複合体を形成するＤＡＰ ＢＩＩ構造は、ペプチドのＮ末端アミン基と相互作用する。さらに、約２０残基（配列番号１３に関して、残基１８３～２０２）のループは、結合したペプチド基質のＮ末端残基および最後から２番目の残基と接触する。これらのアミン結合残基、ならびにＮＴＡＡおよび最後から２番目のＮＴＡＡ結合残基が、個別にまたは組み合わせて、修飾の対象となり得る。
いくつかの態様において、未修飾または野生型の切断酵素の特異性を改変することが望ましい場合がある（例えば、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，４：４９７７を参照）。いくつかの例では、ＤＡＰ ＢＩＩのＳ１サブサイトまたはポケット内の残基を標的にして、好ましい特異性（例えば、修飾された切断酵素で処理されたポリペプチドのＰ１位置の特定のアミノ酸残基に対する低い特異性）を有する修飾された切断酵素を操作することができる。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、配列番号１３の番号付けに関して、突然変異、例えば、位置Ｄ６２７、Ｉ６２８、Ｇ６３０、Ａ６４８、Ｇ６５１、Ｓ６５５、Ｍ６６９、またはそれらの組み合わせに対応する１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、欠失）を含む。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素変異体は、遺伝子スクリーニングを使用して識別され得る。場合によっては、遺伝子スクリーニングは、細胞ベースのシステムを使用する。いくつかの実施形態において、遺伝子スクリーニングは、Ｅ．ｃｏｌｉ変異体または突然変異体を含むＥ．ｃｏｌｉ株などの原核細胞を使用する。いくつかの実施形態において、遺伝子スクリーニングは、酵母ツーハイブリッドシステムなどの真核細胞を使用する。いくつかの実施形態において、遺伝子選択は、基質の結合、切断、および／または標識末端アミノ酸の除去のための所望の特徴を有する修飾された切断酵素を選択するように設計される。
いくつかの実施形態において、遺伝子選択スクリーニングを実施することは、発現のためにさまざまな切断酵素遺伝子（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼ）を調製することを含む。突然変異体もしくは修飾された切断酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドまたはコスミドは、当技術分野で周知の標準的な技術を使用して容易に構築される。いくつかの実施形態において、切断酵素のうちのいずれか（例えば、配列番号５～８、１０～１６、２０のうちのいずれか）の発現は、シグナル配列をさらに含み得る。場合によっては、シグナル配列の使用が、精製のために役立つ場合がある。例えば、ＰｅｌＢなどのペリプラズム標的配列を発現構築物に含めることができる。組換えベクターは、当技術分野で既知の組換え技術のうちのいずれかを使用して生成することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、原核生物の複製起点および／またはその発現により原核生物系における増殖および／または選択のための検出可能または選択可能なマーカーが得られる遺伝子を含み得る。構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列を発現のために調製すると、ＤＮＡ構築物を好適な宿主に導入することができる。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａなどの細菌を含む原核生物宿主を使用することができる。原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーションまたは他の従来の技術などのさまざまな技術を使用してもよい。融合後、細胞を培地で増殖させ、好適な活性についてスクリーニングする。
いくつかの例では、変異体切断酵素遺伝子のライブラリーは、エラープローンＰＣＲ、もしくは切断酵素の結晶構造をガイドとして使用する合理的な突然変異誘発、またはそれらの組み合わせによって生成することができる。また、突然変異を生成するか、またはライブラリーを生成するための他の好適な方法を使用してもよい。その後、変異体切断酵素遺伝子のライブラリーは、ベクターにクローン化され、Ｅ．ｃｏｌｉ栄養要求性株に形質転換される（エール大学のＣＳＳＣ Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子ストックセンター（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）から入手可能－ｈｔｔｐｓ：／／ｃｇｓｃ２．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／）。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、選択培地上で増殖するコロニーを単離し、プラスミドＤＮＡを抽出および分析して、ポリペプチドから標識末端アミノ酸または標識末端ジペプチドを除去する修飾された切断酵素ポリペプチドを識別することを含む。いくつかの実施形態において、標識アミノ酸（例えば、ＰＩＴＣ標識ＮＴＡＡまたはＣｂｚ標識ＮＴＡＡ）を有するポリペプチドを切断するか、または切断するように構成される修飾された切断酵素を識別および単離するために、スクリーニングを実行することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子スクリーニングは、特定のアミノ酸ではなく、標識の結合を選択することを目的とする。したがって、スクリーニングは、さまざまな標識末端アミノ酸を有するポリペプチドを使用する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素の選択は、修飾された切断酵素の活性の精製、特徴付け、評価および／または最適化をさらに含む。修飾された切断酵素は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの従来の方法に従って単離および精製することができる。
いくつかの実施形態において、遺伝学スクリーニングまたは他の選択方法を使用して、活性部位または結合ポケットが改変されている修飾された切断酵素を選択および取得することもできる。いくつかの実施形態において、遺伝学的スクリーニングまたは選択方法を使用して、ヒンジ領域が改変された修飾された切断酵素を選択および取得することもできる。いくつかの実施形態において、遺伝子スクリーニングまたは選択方法を使用して、結合溝が改変された修飾された切断酵素を選択および取得することもできる。場合によっては、遺伝子スクリーニングまたは選択方法を使用して、葉間溝が改変された修飾された切断酵素を選択および取得することもできる。いくつかの実施形態において、遺伝子スクリーニングまたは選択方法を使用して、アルファアミン結合領域が改変された修飾された切断酵素を選択および取得することもできる。例えば、修飾された切断酵素は、野生型の切断酵素ポリペプチドと比較して、アルファアミン結合が減少している。
いくつかの実施形態において、遺伝子スクリーニングまたは他の選択方法を使用して、さまざまな長さのポリペプチドから標識末端アミノ酸を除去するように構成される修飾された切断酵素を選択および取得することもできる。場合によっては、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜のポリンサイズによって、取り込み可能なペプチドの長さが制限される。いくつかの実施形態において、この長さの制限は、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡまたはＥ．ｃｏｌｉ外膜を透過性にする小分子ＭＡＣ１３２４３でＥ．ｃｏｌｉを簡潔に処理することにより解消され（例えば、Ｌｅｉｖｅ，Ｌ．（１９７４）．Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２３５（０）：１０９－１２９；Ｍｕｈｅｉｍ，Ｃ．（２０１７）．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７（１）：１７６２９）、ペリプラズム空間へのペプチドの取り込みを可能にする。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、長さが５個のアミノ酸を超える、長さが６個のアミノ酸を超える、長さが７個のアミノ酸を超える、長さが８個のアミノ酸を超える、長さが９個のアミノ酸を超える、長さが１０個のアミノ酸を超える、長さが１１個のアミノ酸を超える、長さが１２個のアミノ酸を超える、長さが１３個のアミノ酸を超える、長さが１４個のアミノ酸を超える、長さが１５個のアミノ酸を超える、長さが２０個のアミノ酸を超える、長さが２５個のアミノ酸を超える、もしくは長さが３０個のアミノ酸を超えるポリペプチドからアミノ酸を切断することができるか、または除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾されたジペプチジルペプチダーゼは、長さが３０個未満のアミノ酸、長さが４０個未満のアミノ酸、長さが５０個未満のアミノ酸、長さが７５個未満のアミノ酸、長さが１００個未満のアミノ酸、長さが２００個未満のアミノ酸、長さが３００個未満のアミノ酸、長さが４００個未満のアミノ酸、長さが５００個未満のアミノ酸、長さが６００個未満のアミノ酸、長さが７００個未満のアミノ酸、長さが８００個未満のアミノ酸、長さが９００個未満のアミノ酸、もしくは長さが１０００個未満のアミノ酸であるポリペプチドからアミノ酸を切断することができるか、または除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、長さが１０個～１００個のアミノ酸、長さが２０個～１００個のアミノ酸、長さが３０個～１００個のアミノ酸、長さ５個～５０個のアミノ酸、長さが１０個～５０個のアミノ酸、長さが２０個～５０個のアミノ酸、長さが３０個～５０個のアミノ酸、長さが５個～３０個のアミノ酸長さ、長さが１０個～３０個のアミノ酸、長さが２０個～３０個のアミノ酸、長さが１０個～２０個のアミノ酸であるポリペプチドからアミノ酸を切断することができるか、または除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、長さが５０個～１０００個のアミノ酸、長さが１００個～１０００個のアミノ酸、長さが３００個～１０００個のアミノ酸、長さが５００個～１０００個のアミノ酸、長さが１０個～５００個のアミノ酸、長さが５０個～５００個のアミノ酸、長さが１００個～５００個のアミノ酸、もしくは長さが２００個～５００個のアミノ酸であるポリペプチドからアミノ酸を切断することができるか、または除去するように構成される。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、部分的なまたは消化されたタンパク質およびポリペプチド（例えば、タンパク質またはポリペプチド断片）からアミノ酸を除去することができるか、または除去するように構成される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、全体のまたは未消化のタンパク質およびポリペプチドからアミノ酸を除去することができるか、または除去するように構成される。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドを、５分間未満、１０分間未満、２０分間未満、３０分間未満、４０分間未満、５０分間未満、６０分間未満、２時間未満、５時間未満、８時間未満、もしくは１０時間未満、修飾された切断酵素と接触させることによって、単一の末端アミノ酸または末端ジペプチドを除去する。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素で、約１５分間未満、ポリペプチドを処理することにより、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％以上の、末端アミノ酸が除去されたポリペプチドの収率を達成する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素で、約３０分間未満、ポリペプチドを処理することにより、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％以上の、末端アミノ酸が除去されたポリペプチドの収率を達成する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素で、約４５分間未満、ポリペプチドを処理することにより、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％以上の、末端アミノ酸が除去されたポリペプチドの収率を達成する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素で、約１時間未満、ポリペプチドを処理することにより、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％以上の、末端アミノ酸が除去されたポリペプチドの収率を達成する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素で、約２時間未満、ポリペプチドを処理することにより、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％以上の、末端アミノ酸が除去されたポリペプチドの収率を達成する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、修飾された切断酵素で、約５時間未満、ポリペプチドを処理することにより、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％以上の、末端アミノ酸が除去されたポリペプチドの収率を達成する。
いくつかの実施形態において、修飾されたジペプチドまたはトリペプチド切断酵素は、約１０℃より高い、約２０℃より高い、約３０℃より高い、または約４０℃より高い温度で、末端アミノ酸を切断することができるか、または機能する。いくつかの実施形態において、修飾されたジペプチドまたはトリペプチド切断酵素は、約１０℃～２０℃、約１０℃～３０℃、約１０℃～４０℃、約１０℃～５０℃、約１０℃～６０℃、約１０℃～７０℃、約１０℃～８０℃、約１０℃～９０℃、または約１０℃～１００℃；約２０℃～３０℃、約２０℃～４０℃、約２０℃～５０℃、約２０℃～６０℃、約２０℃～７０℃、約２０℃～８０℃、約２０℃～９０℃、または約２０℃～１００℃；約３０℃～４０℃、約３０℃～５０℃、約３０℃～６０℃；約５０℃～７０℃、約５０℃～８０℃、約５０℃～９０℃、または約５０℃～１００℃の温度で末端アミノ酸を切断することができるか、または機能する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、ポリペプチドの二次構造が破壊される温度で末端アミノ酸を切断することができる。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、約２０～２５℃で機能する。いくつかの実施形態において、この方法は、加熱を適用しながら、修飾された切断酵素をポリペプチドと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、加熱は、マイクロ波エネルギーを印加することによって達成される。本明細書において提供される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、末端アミノ酸を除去するための、修飾された切断酵素のポリペプチドとの接触は、マイクロ波エネルギーの存在下で実行される。
本明細書において提供されるのは、セクションＩに記載されるような、修飾された切断酵素のうちのいずれかをコードする単離されたＤＮＡ分子である。また、セクションＩに記載されるような、修飾された切断酵素のうちのいずれかをコードするＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターも提供される。場合によっては、ＤＮＡ分子および組換え発現ベクターは、記載される遺伝子操作および選択方法から単離される。場合によっては、ＤＮＡ分子を含む宿主細胞も提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つによる核酸分子、または本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つによるベクターを、細胞内でタンパク質を発現させる条件下で、宿主細胞内に導入することを含む、修飾されたまたは変異体切断酵素を産生する方法である。また、本明細書において提供されるのは、修飾された切断酵素の発現に好適な条件下で形質転換された宿主細胞を培養することと、修飾された切断酵素を発現する突然変異体生物を分離、精製および／または回収することと、を含む、本明細書において提供される修飾された切断酵素のうちのいずれかを産生するための方法である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、修飾された切断酵素をコードするＤＮＡ分子を含む宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、修飾された切断酵素を発現するための組換え発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞から変異体もしくは修飾された切断酵素を単離または精製することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つによる変異体もしくは修飾された切断酵素ポリペプチド、または本明細書に記載の変異体もしくは修飾された切断酵素をコードする核酸分子、または本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つによるベクターを発現する、操作された細胞である。いくつかの実施形態において、変異体または修飾された切断酵素ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。
ＩＩ．ポリペプチド
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書において提供される修飾された切断酵素のうちのいずれかによるポリペプチドの処理に関する。いくつかの実施形態において、標識末端アミノ酸は、ポリペプチド（部分的なポリペプチドまたは断片化されたポリペプチドを含む）から除去される。
いくつかの実施形態において、末端アミノ酸は、長さが４個超のアミノ酸、５個超のアミノ酸、６個超のアミノ酸、７個超のアミノ酸、８個超のアミノ酸、９個超のアミノ酸、１０個超のアミノ酸、１１個超のアミノ酸、１２個超のアミノ酸、１３アミノ酸超、１４個超のアミノ酸、１５個超のアミノ酸、２０個超のアミノ酸、２５個超のアミノ酸、または３０個超のアミノ酸であるポリペプチドから除去される。場合によっては、ポリペプチドの長さは、１０個のアミノ酸を超える。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸は、長さが３０個未満のアミノ酸、４０個未満のアミノ酸、５０個未満のアミノ酸、７５個未満のアミノ酸、１００個未満のアミノ酸、２００個未満のアミノ酸、３００個未満のアミノ酸、４００個未満のアミノ酸、５００個未満のアミノ酸、６００個未満のアミノ酸、７００個未満のアミノ酸、８００個未満のアミノ酸、９００個未満のアミノ酸、または１０００個未満のアミノ酸であるポリペプチドから除去される。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸は、長さが５個～１００個のアミノ酸、１０個～１００個のアミノ酸、２０個～１００個のアミノ酸、長さが３０個～１００個のアミノ酸、５個～５０個のアミノ酸、１０個～５０個のアミノ酸、２０個～５０個のアミノ酸、３０個～５０個のアミノ酸、長さが５個～３０個のアミノ酸、１０個～３０個のアミノ酸、２０個～３０個のアミノ酸、１０個～２０個のアミノ酸であるポリペプチドから除去される。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸は、長さが５０個～１０００個のアミノ酸、１００個～１０００個のアミノ酸、３００個～１０００個のアミノ酸、５００個～１０００個のアミノ酸、１０個～５００個のアミノ酸、５０個～５００個のアミノ酸、１００個～５００個のアミノ酸、または２００個～５００個のアミノ酸であるポリペプチドから除去される。
いくつかの実施形態において、末端アミノ酸は、部分的なまたは消化されたタンパク質およびポリペプチド（例えば、ポリペプチド断片）から除去される。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸は、全体のまたは未消化のタンパク質およびポリペプチドから除去される。
本明細書で提供され、本明細書で開示される方法に従って修飾された切断酵素で処理されたポリペプチドは、細胞（初代細胞および培養細胞株の両方）、細胞溶解物もしくは抽出物、細胞小器官もしくは小胞（エキソソーム、組織および組織抽出物を含む）などの生物学的サンプル；生検；糞便物質；体液（血液、全血、血清、血漿、尿、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、水性もしくは硝子体液、コロストラム、痰、羊水、唾液、肛門および膣の分泌物、発汗および精液、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍もしくは他の感染もしくは炎症部位から得られた流体）もしくは事実上すべての生物（ミクロビオーム含有サンプルを含む哺乳動物由来のサンプルが好ましく、ミクロビオーム含有サンプルを含むヒト由来のサンプルが特に好ましい）の関節（正常な関節、または関節リウマチ、変形性関節症、痛風もしくは敗血症性関節炎などの疾患に冒された関節）から得られた流体など；環境サンプル（空気、農業、水、土壌サンプルなど）；微生物バイオフィルムおよび／もしくは群集に由来するサンプル、ならびに微生物胞子を含む微生物サンプル；細胞外液、細胞培養からの細胞外上清、細菌における封入体、ミトコンドリアコンパートメントを含む細胞コンパートメント、および細胞ペリプラズムを含む研究サンプルを含むがこれらに限定されない好適な供給源またはサンプルから得ることができる。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質またはタンパク質複合体である。ポリペプチドのアミノ酸配列情報および翻訳後修飾は、次世代シーケンシング方法によって分析することができる核酸コーディングライブラリーに変換される。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはその両方を含み得る。ポリペプチドは、標準的な天然に存在するアミノ酸、修飾アミノ酸（例えば、翻訳後修飾）、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然に存在するか、合成的に産生されるか、または組換え的に発現される。前述の実施形態のうちのいずれかにおいて、ポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含み得る。
標準的な天然アミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、スレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。非標準的なアミノ酸の例としては、セレノシステイン、ピロリシン、およびＮ－ホルミルメチオニン、β－アミノ酸、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３－置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環－置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、線状コアアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸が挙げられる。
ポリペプチドの翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、共有結合修飾または酵素修飾であり得る。翻訳後修飾の例としては、アシル化、アセチル化、アルキル化（メチル化を含む）、ビオチン化、ブチリル化、カルバミル化、カルボニル化、脱アミド化、脱イミノ化、ジフタミド形成、ジスルフィド架橋形成、脱離（ｅｌｉｍｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、フラビン付着、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化（例えば、Ｎ－連結型、Ｏ－連結型、Ｃ－連結型ホスホグリコシル化）、グリピエーション、ヘムＣ付着、ヒドロキシル化、ヒプシン形成、ヨウ素化、イソプレニル化、脂質化、リポイル化、マロニル化、メチル化、ミリストリル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌｙｌａｔｉｏｎ）、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスホパンテテイン化、リン酸化、プロピオニル化、レチニリデンシフ塩基形成、Ｓ－グルタチオン付加（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）、Ｓ－ニトロシル化、Ｓ－スルフェニル化、セレン化、スクシニル化、スルフィン化、ユビキチン化、およびＣ末端アミド化が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後修飾としては、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の修飾が挙げられる。末端アミノ基の修飾としては、デスアミノ、Ｎ－低級アルキル、Ｎ－ジ－低級アルキル、およびＮ－アシル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾としては、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾（例えば、低級アルキルはＣ１～Ｃ４アルキルである）が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後修飾としては、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端との間にあるアミノ酸の修飾（例えば、上記のものであるが、これらに限定されない）も挙げられる。翻訳後修飾は、細胞内のタンパク質の「生物学」、例えば、その活性、構造、安定性、または局在化を調節することができる。リン酸化は最も一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質の調節、特に細胞シグナル伝達において重要な役割を果たす（Ｐｒａｂａｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ４：５６５－５８３）。グリコシル化などのタンパク質への糖の付加は、タンパク質の折り畳みを促進し、安定性を改善し、調節機能を変更することが示されている。脂質がタンパク質に付着することにより、細胞膜を標的とすることができる。翻訳後修飾はまた、１つ以上の検出可能な標識を含むための修飾を含み得る。
特定の実施形態において、ポリペプチドを断片化することができる。例えば、断片化されたポリペプチドは、生物学的サンプルなどのサンプルからポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体を断片化することによって得ることができる。ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、プロテアーゼまたはエンドペプチダーゼによる断片化を含む、当技術分野で既知の任意の手段によって断片化することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体の断片化は、特定のプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼの使用によって標的とされる。特定のプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼは、特定のコンセンサス配列（例えば、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓコンセンサス配列に特異的なＴＥＶプロテアーゼ）に結合して切断する。他の実施形態において、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の断片化は、非特異的プロテアーゼまたはエンドペプチダーゼの使用による標的とされないか、またはランダムである。非特異的プロテアーゼは、コンセンサス配列ではなく、特定のアミノ酸残基に結合して切断する場合がある（例えば、プロテイナーゼＫは、非特異的セリンプロテアーゼである）。プロテイナーゼおよびエンドペプチダーゼは当技術分野で周知であり、タンパク質またはポリペプチドをより小さなペプチド断片に切断するために使用され得るそのような例としては、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、トロンビン、第Ｘａ因子、フリン、エンドペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、サブチリシン、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（商標）Ｉ、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣ、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣなどが挙げられる（Ｇｒａｎｖｏｇｌ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ ３８９：９９１－１００２）。特定の実施形態において、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、プロテイナーゼＫ、または任意選択的に、プロテイナーゼＫの熱不安定性バージョンによって断片化されて、迅速な不活性化を可能にする。プロテイナーゼＫは、尿素およびＳＤＳなどの変性試薬で非常に安定しており、完全に変性したタンパク質の消化を可能にする。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドを、修飾された切断酵素に加えて１つ以上の酵素と接触させて、ＮＴＡＡを脱離させる（例えば、存在する場合、Ｎ末端プロリンを除去するためのプロリンアミノペプチダーゼ）。いくつかの実施形態において、追加の酵素は、プロリンであるポリペプチドからＮＴＡＡを脱離させる。いくつかの特定の例では、酵素は、プロリンアミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ（ＰＩＰ）、またはピログルタメートアミノペプチダーゼ（ｐＧＡＰ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾された切断酵素を他の酵素と組み合わせて使用して、ポリペプチドを処理する。いくつかの実施形態では、存在する場合、Ｎ末端プロリンを除去するのに好適な条件下で、最初にポリペプチドをプロリンアミノペプチダーゼと接触させる。
化学試薬を使用して、タンパク質をペプチド断片に消化することもできる。化学試薬は、特定のアミノ酸残基で切断する可能性がある（例えば、臭化シアンは、メチオニン残基のＣ末端のペプチド結合を加水分解する）。ポリペプチドまたはタンパク質をより小さなペプチドに断片化するための化学試薬としては、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ギ酸、ＢＮＰＳ－スカトール［２－（２－ニトロフェニルスルフェニル）－３－メチルインドール］、ヨードソ安息香酸、・ＮＴＣＢ＋Ｎｉ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）などが挙げられる。
特定の実施形態において、いくつかのポリペプチドは、酵素的または化学的脱離のための試薬で処理することができる。特定の実施形態において、酵素的または化学的脱離に続いて、得られるポリペプチド断片は、ほぼ同じ所望の長さ、例えば、約１０個のアミノ酸～約７０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約５０個のアミノ酸、約１０個～約４０個のアミノ酸、約１０個～約３０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約７０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約５０個のアミノ酸、約２０個～約４０個のアミノ酸、約２０個～約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸～約７０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸～約６０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸～約５０個のアミノ酸、または約３０個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸である。脱離反応は、タンパク質またはポリペプチドサンプルに、プロテイナーゼまたはエンドペプチダーゼ脱離部位を含むペプチド配列を含む短い試験ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）ポリペプチドをスパイクすることによって、好ましくはリアルタイムで監視することができる。無傷のＦＲＥＴペプチドでは、脱離部位を含むペプチド配列の両端に蛍光基および消光基が付着しており、消光剤とフルオロフォアとの間の蛍光共鳴エネルギー移動により、蛍光が低くなる。プロテアーゼまたはエンドペプチダーゼによって試験ペプチドが排除されると、消光剤およびフルオロフォアが分離され、蛍光が大幅に増加する。特定の蛍光強度が達成されたときに脱離反応を停止することができ、再現性のある脱離終点を達成することができる。
Ａ．溶液中で支持体に接合された（Ｊｏｉｎｅｄ ｔｏ ａ Ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｒ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）ポリペプチドの提供
いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、固体支持体の表面（「基質表面」とも呼ばれる）に接合される。場合によっては、ポリペプチドは、修飾された切断酵素と接触する前に、固体支持体に接合される。場合によっては、修飾された切断酵素は、固体支持体に（直接的または間接的に）接合しているポリペプチドから標識末端アミノ酸を除去する。いくつかの実施形態において、標識末端アミノ酸は、単一のアミノ酸として、またはジペプチドの一部として除去される。
固体支持体は、ビーズ、マイクロビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ＰＴＦＥ膜、ＰＴＦＥ膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フローセル、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含めたバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ ｄｉｓｃ）、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナノ粒子、またはミクロスフェアを含むが、これらに限定されない任意の多孔質または非多孔質の支持体表面であり得る。固体支持体の材料としては、アクリルアミド、アガロース、セルロース、デキストラン、ニトロセルロース、ガラス、金、石英、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。固体支持体はさらに、薄膜、膜、ボトル、皿、繊維、織繊維、チューブなどの成形ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例えば、固体表面がビーズである場合、ビーズは、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、ポリアクリレートビーズ、メチルスチレンビーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、デキストランビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、制御多孔質ビーズ、シリカベースのビーズ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、固体支持体はビーズであり、個々のビーズまたは複数のビーズを指す場合がある。いくつかの実施形態において、ビーズは、下流分析に使用される選択された次世代シーケンシングプラットフォーム（例えば、ＳＯＬｉＤまたは４５４）と適合性がある。いくつかの実施形態において、固体支持体は、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、ガラスビーズ、または制御された多孔質ビーズである。さらなる実施形態において、ビーズは、ポリペプチドへの結合を容易にするために、結合官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）（例えば、アミン基、ビオチン標識ポリペプチドに結合するためのストレプトアビジンなどの親和性リガンド、抗体）でコーティングされ得る。
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用、またはそれらの任意の組み合わせを含む、当技術分野で既知の任意の手段によって、直接的または間接的に固体支持体に接合することができる（例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２：ｅ１１６４；Ｃａｚａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１５：１００５－１００９；Ｓｏｅｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７９０－１１７９１；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１７－５２－５７；Ｄｅｃｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７２：２７９４－２８０２；Ｃａｍａｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１４７３０－１４７３１；Ｇｉｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５：２４４７－２４５１；Ｋａｌｉａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１８：１０６４－１０６９；Ｗａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４５：１４０８－１４１２；Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１８：４６９－４７６；ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）（各々は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。例えば、ペプチドは、ライゲーション反応によって固体支持体に接合され得る。あるいは、固体支持体は、ペプチドを固体支持体に直接的または間接的に結合することを容易にするための薬剤またはコーティングを含むことができる。タンパク質、核酸、炭水化物、および小分子を含む、任意の好適な分子または材料を、この目的のために使用することができる。例えば、一実施形態において、薬剤は親和性分子である。別の例では、薬剤はアジド基であり、この基は、別の分子のアルキニル基と反応して、固体支持体と他の分子との会合または結合を容易にすることができる。
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、「クリック化学」と呼ばれる方法を使用して固体支持体に接合することができる。この目的のために、迅速かつ実質的に不可逆的な任意の反応を使用して、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを固体支持体に付着させることができる。例示的な反応としては、アジドとアルキンの銅触媒反応によるトリアゾールの形成（ヒュスゲン１，３－双極環化付加）、歪み促進型アジドアルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）、ジエンおよびジエノフィルの反応（ディールス－アルダー）、歪み促進型アルキン－ニトロン付加環化、歪みアルケンとアジド、テトラジンまたはテトラゾールとの反応、アルケンおよびアジド［３＋２］環化付加、アルケンおよびテトラジン逆電子要求ディールス－アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応（例えば、ｍ－テトラジン（ｍＴｅｔ）もしくはフェニルテトラジン（ｐＴｅｔ）およびトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）；またはｐＴｅｔおよびアルケン）、アルケンおよびテトラゾール光反応、アジドおよびホスフィンのシュタウディンガーライゲーション、ならびに求電子性原子上の求核攻撃による脱離基の置換などのさまざまな置換反応が挙げられる（Ｈｏｒｉｓａｗａ，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２０１４）．５：４５７；Ｋｎａｌｌ，Ｈｏｌｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（２０１４）５５（３４）：４７６３－４７６６）。例示的な置換反応には、アミンと、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アルデヒド、エポキシドなどとの反応が含まれる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドおよび固体支持体は、２つの相補的反応性基の反応によって形成することができる官能基、例えば、前述の「クリック」反応のうちの１つの生成物である官能基によって接合される。さまざまな実施形態において、官能基は、アルデヒド、オキシム、ヒドラジド、アルキン、アミン、アジド、アシルアジド、アシルハライド、ニトリル、ニトロン、スルフヒドリル、ジスルフィド、スルホニルハライド、イソチオシアネート、イミドエステル、活性化エステル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンチン酸ＳＴＰエステル）、ケトン、α，β－不飽和カルボニル、アルケン、マレイミド、α－ハロイミド、エポキシド、アジリジン、テトラジン、テトラゾール、ホスフィン、ビオチン、またはチイラン官能基と、相補的反応性基との反応によって形成され得る。例示的な反応は、アミン（例えば、一級アミン）とＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはイソチオシアネートとの反応である。
いくつかの実施形態において、官能基は、アルケン、エステル、アミド、チオエステル、ジスルフィド、炭素環式、複素環式またはヘテロアリール基を含む。さらなる実施形態において、官能基は、アルケン、エステル、アミド、チオエステル、チオ尿素、ジスルフィド、炭素環式、複素環式またはヘテロアリール基を含む。他の実施形態において、官能基は、アミドまたはチオ尿素を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、官能基は、トリアゾリル官能基、アミド、またはチオ尿素官能基である。
いくつかの実施形態において、ｉＥＤＤＡクリック化学は、迅速であり、かつ、低入力濃度で高収率を実現するという理由で、ポリペプチドを固体支持体に固定化するために使用される。別の実施形態において、ｍ－テトラジンは結合安定性が改善されているので、テトラジンではなくｍ－テトラジンがｉＥＤＤＡクリック化学反応において使用される。別の実施形態において、フェニルテトラジン（ｐＴｅｔ）は、ｉＥＤＤＡクリック化学反応において使用される。
いくつかの実施形態において、基質表面をＴＣＯで官能化し、記録タグ標識タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを、付着したｍ－テトラジン部分を介して、ＴＣＯでコーティングされた基質表面に固定化する。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドを、例えば、アミン、カルボキシルまたはスルフィドリル基を介して、そのＣ末端、Ｎ末端または内部アミノ酸によって固体支持体の表面に固定化する。アミン基へのカップリングに使用される標準的な活性化支持体には、ＣＮＢｒ活性化、ＮＨＳ活性化、アルデヒド活性化、アズラクトン活性化およびＣＤＩ活性化支持体が含まれる。カルボキシルカップリングで使用される標準的な活性化支持体には、アミン支持体にカップリングするカルボジイミド活性化カルボキシル部分が含まれる。システインカップリングは、マレイミド、イドアセチルおよびピリジルジスルフィド活性化支持体を使用することができる。ペプチドカルボキシ末端固定化の代替様式は、トリプシンの触媒的に不活性な誘導体であるアンヒドロトリプシンを使用し、Ｃ末端にリジンまたはアルギニン残基を含むペプチドを切断せずに結合する。
特定の実施形態では、ポリペプチドを、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのリジン基への固体表面結合リンカーの共有結合を介して、固体支持体に固定化する。
特定の実施形態において、最初に、ポリペプチドをＤＮＡタグで標識し、キメラＤＮＡ－ポリペプチド分子を、核酸ハイブリダイゼーションおよび固体支持体に付着したＤＮＡ配列へのライゲーションを介して、固体支持体に固定化する。いくつかの実施形態において、ペプチドへのタンパク質およびポリペプチドの断片化は、ＤＮＡタグまたはＤＮＡ記録タグを付着させる前または後に実行することができる。
Ｂ．ポリペプチドの任意選択的な処理
ポリペプチドのサンプルは、固体支持体に付着する前にタンパク質分画法を受けることができ、タンパク質またはペプチドは、細胞位置、分子量、疎水性もしくは等電点などの１つ以上の特性、またはタンパク質濃縮法によって分離される。あるいは、またはさらに、タンパク質濃縮法を使用して、特定のタンパク質またはペプチドを選択することができる（例えば、Ｗｈｉｔｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６２：４４－５４）か、または特定の翻訳後修飾を選択することができる（例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ １３７２：１－１７）。あるいは、免疫グロブリンなどの１つ以上の特定クラスのタンパク質、またはＩｇＧなどの免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプを、分析のためにアフィニティー濃縮または選択することができる。免疫グロブリン分子の場合、親和性結合に関与する超可変配列の配列および存在量または頻度の分析は、特にそれらが疾患の進行に応答して変化するか、または健康、免疫、および／もしくは疾患の表現型と相関するので、特に興味深い。標準的な免疫親和性法を使用して、過剰に豊富なタンパク質をサンプルから減算することもできる。豊富なタンパク質の除去は、タンパク質成分の８０％超がアルブミンおよび免疫グロブリンである血漿サンプルに役立つ可能性がある。ＰＲＯＴＩＡおよびＰＲＯＴ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）などの、過剰に豊富なタンパク質の血漿サンプルを除去する（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）ためのいくつかの市販製品が入手可能である。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、正準化されたポリペプチドに対して実行することができる。いくつかの実施形態において、サンプルからの特定のタンパク質種（例えば、非常に豊富なタンパク質）の減算が実行される。これは、例えば、ＳｉｇｍａのＰＲＯＴ２０免疫除去キットなどの市販のタンパク質除去試薬を使用して達成することができる。これは、上位２０個の血漿タンパク質を除去する。さらに、ダイナミックレンジを、さらに管理可能な３～４オーダーにまで大幅に縮小したアプローチがあると便利である。特定の実施形態において、タンパク質サンプルのダイナミックレンジは、電気泳動および液体クロマトグラフィーを含む標準的な分画法を使用してタンパク質サンプルを分画する（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ（２０１２）８４（２）：７２０－７３４）か、または限られた容量のタンパク質結合ビーズ／樹脂（例えば、ヒドロキシル化シリカ粒子）が充填されたコンパートメント（例えば、液滴）に画分を分割し（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８９）１８１（１）：６６－７４）、結合タンパク質を溶出することよって調節することができる。区画化された各画分の過剰なタンパク質は、洗い流される。
電気泳動法の例としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＴＰ）、フリーフロー電気泳動、ゲル溶出液体画分捕捉電気泳動（ＧＥＬＦｒＥＥ）が挙げられる。液体クロマトグラフィータンパク質分離法の例としては、逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥ）、サイズ排除（ＳＥ）、親水性相互作用などが挙げられる。コンパートメントパーティションの例としては、エマルジョン、液滴、マイクロウェル、平坦な基質上の物理的に分離された領域などが挙げられる。例示的なタンパク質結合ビーズ／樹脂には、フェノール基または親水性基で誘導体化されたシリカナノ粒子が挙げられる（例えば、ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ Ｒｅｓｉｎ ｆｒｏｍ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＲａｐｉｄＣｌｅａｎ ｆｒｏｍ ＬａｂＴｅｃｈなど）。ビーズ／樹脂の結合能力を制限することにより、所与の画分に溶出する非常に豊富なタンパク質が、ビーズに部分的にのみ結合し、過剰なタンパク質が除去される。
ＩＩＩ．修飾された切断および関連方法の例示的な使用
本明細書において提供されるのは、ポリペプチドを、修飾された切断酵素と接触させることを含む、１つ以上のポリペプチドを処理する方法である。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、修飾された切断酵素は、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去する。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素は、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去する。いくつかの実施形態において、セクションＩに記載されるように、ポリペプチドを、修飾された切断酵素のうちのいずれか１つ以上と接触させる。いくつかの実施形態において、この方法は、末端アミノ酸を標識するための試薬とポリペプチドを接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸を標識するための試薬との接触は、セクションＩＡに記載される試薬のうちのいずれか１つ以上との接触である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドを、修飾された切断酵素と接触させ、試薬と接触させて末端アミノ酸を標識する１つ以上のサイクルが、図２Ａ～２Ｃに示されるような周期的な方式で行われる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、支持体に結合する。いくつかの実施形態において、この方法は、ポリペプチドを固体支持体に（例えば、直接的または間接的に）接合することを含む。いくつかの実施形態において、提供される修飾された切断酵素を使用するペプチドからのＮＴＡＡの除去は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／０８９８４６号に記載されるような、ペプチドからＮＴＡＡを除去するための化学的方法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、除去された標識末端アミノ酸は、単一のアミノ酸として、またはジペプチドの一部として除去される。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される修飾された切断酵素を使用して、分析および／または配列決定されるポリペプチドを処理することができる。いくつかの実施形態において、方法は、ポリペプチドの少なくとも一部分の配列を決定するためのものである。いくつかの実施形態において、提供される方法は、分解によるポリペプチド配列決定アッセイとの関連で使用することができる。場合によっては、この方法は、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１９２６３３号に記載される方法のうちのいずれかを実行することを含み得る。場合によっては、ポリペプチドの配列は、伸長記録タグなどのポリペプチド配列を表す伸長記録タグ（例えば、ＤＮＡ配列）の構築によって分析される。場合によっては、本明細書において提供される方法は、ＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅアッセイに適用されるか、またはＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅアッセイと組み合わせて使用することができる。環状分解によるポリペプチド分析法を採用するいくつかの実施形態において、提供される修飾された切断酵素は、特定の利点を付与する。例えば、標識アミノ酸の認識および除去は、アッセイの他のステップを実行し得る（例えば、結合剤によりＮＴＡＡを結合すること、およびＮＴＡＡの情報を記録タグへ記録すること）前に、ポリペプチドからアミノ酸を連続して除去し得る未標識のアミノ酸を除去する酵素と比較して、アミノ酸除去を中断させる場合がある。したがって、場合によっては、標識アミノ酸を認識して除去することにより、修飾された切断酵素は、標識ステップが行われた後にのみＮＴＡＡを除去する。それにより、修飾された切断酵素は、未標識のアミノ酸を除去する未修飾の切断酵素と比較して、アミノ酸除去に対する制御を行う。
いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素を含む方法は、核酸（例えば、記録タグなどのＤＮＡ）を分解する条件の不在下で実施される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素を含む方法は、核酸を分解する化学的条件の不在下で実施される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素を含む方法は、分解によるポリペプチド配列決定アッセイ（例えば、国際特許公開第ＷＯ２００７／１９２６３３号に記載される方法）と適合性のある条件下で実施される。場合によっては、修飾された切断酵素を含む方法は、核酸と適合性のある条件の存在下で実施される。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素を含む方法は、強酸または強塩基の不在下で実施される。いくつかの態様において、強酸は強酸無水物である。いくつかの例では、修飾された切断酵素を含む方法は、ＴＦＡ無水物の不在下で行われる。
いくつかの実施形態において、この方法は、ポリペプチドを、２つ以上の修飾された切断酵素と接触させることを含む。場合によっては、さまざまな修飾された切断酵素は、異なる特徴、例えば、ポリペプチドに対する優先的な結合および／またはアミノ酸切断の差異を示し得る。いくつかの実施形態において、さまざまな修飾された切断酵素は、酵素の混合物として、または各々別々に、記載された方法のうちのいずれかにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、さまざまな修飾された切断酵素を、同時にまたは連続してポリペプチドと接触させる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、ＮＴＡＡを脱離させるために１つ以上の追加の酵素（例えば、存在する場合、Ｎ末端プロリンを除去するためのプロリンアミノペプチダーゼ）と接触させる。本発明の方法は、任意選択的に、ＮＴＡＡを標識するために提供される化学試薬のうちのいずれかで処理する前、処理中、または処理後に、１つ以上のＮＴＡＡを除去するための酵素（例えば、プロリンアミノペプチダーゼ）でポリペプチドを処理することを含み得る。本発明の方法は、任意選択的に、提供される修飾された切断酵素のうちのいずれかでの処理前、処理中、または処理後に、１つ以上のＮＴＡＡを除去するための酵素（例えば、プロリンアミノペプチダーゼ）でポリペプチドを処理することを含み得る。いくつかの実施形態において、酵素は、プロリンであるポリペプチドからＮＴＡＡを脱離させる。いくつかの特定の例では、酵素は、プロリンアミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ（ＰＩＰ）、またはピログルタメートアミノペプチダーゼ（ｐＧＡＰ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾された切断酵素を他の酵素と組み合わせて使用して、ポリペプチドを処理する。いくつかの特定の場合において、修飾された切断酵素および／または他の酵素は、カクテルとして提供される。
いくつかの実施形態において、この方法は、ポリペプチドを、ポリペプチドの末端アミノ酸に結合することができる１つ以上の結合剤と接触させることをさらに含み、各結合剤は、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む。場合によっては、結合剤は、ポリペプチドの標識末端アミノ酸に結合し得る。いくつかのさらなる実施形態において、この方法は、コーディングタグの識別情報をポリペプチドに付着した記録タグに転送し、それによってポリペプチド上に伸長記録タグを生成することをさらに含む。いくつかの特定の実施形態において、この方法は、ポリペプチドから、１つ以上の結合剤を除去または放出することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドをさまざまな試薬と接触させる１つ以上のステップは、例えば、修飾された切断酵素と、末端アミノ酸を標識するための試薬と、かつ／または結合試薬と接触することを含み、周期的に繰り返される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、ポリペプチドを分析するための方法であって、（ａ）ポリペプチドを、ポリペプチドの末端アミノ酸に結合することができる結合剤と接触させるステップであって、各結合剤が、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと、（ｂ）コーディングタグの識別情報をポリペプチドと関連付けられた記録タグに転送して、伸長記録タグを生成するステップと、（ｃ）ポリペプチドを試薬と接触させて、ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するステップと、（ｄ）ポリペプチドを、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と接触させるステップと、を含み、修飾された切断酵素が、ステップ（ｃ）において試薬によって標識された単一の末端アミノ酸をポリペプチドから除去する、方法である。除去された末端アミノ酸は、単一のアミノ酸残基として、またはジペプチドの一部として除去され得る。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）～（ｄ）は、「ｎ」回の結合サイクルについて繰り返され、ポリペプチドに結合する各結合剤の各コーディングタグの情報は、前の結合サイクルから生成された伸長記録タグに転送されて、ｎ次伸長記録タグを生成する。いくつかの特定の実施形態において、この方法は、（ｂ１）複数のポリペプチドから、１つ以上の結合剤を除去または放出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、複数のポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、複数の結合剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、２つ以上の結合剤と接触させる。
いくつかの例では、ステップ（ａ）はステップ（ｂ）の前に実行され、ステップ（ａ）はステップ（ｃ）の前に実行され、ステップ（ａ）はステップ（ｄ）の前に実行され、ステップ（ｂ）はステップ（ｃ）の前に実行され、ステップ（ｂ）はステップ（ｄ）の前に実行され、ステップ（ｃ）はステップ（ａ）の前に実行され、ステップ（ｃ）はステップ（ｂ）の前に実行され、および／またはステップ（ｃ）はステップ（ｄ）の前に実行される。いくつかの特定の実施形態において、ステップは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の順序で実行される。いくつかの特定の実施形態において、ステップは、（ｃ）、（ａ）、（ｂ）および（ｄ）の順序で実行される。いくつかの実施形態において、この方法は、（ｅ）ｎ次伸長記録タグを分析することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、１つ以上の結合剤を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ１）はステップ（ａ）の後に実行され、ステップ（ｂ１）はステップ（ｂ）の後に実行され、ステップ（ｂ１）はステップ（ｃ）の後に実行され、および／またはステップ（ｂ１）はステップ（ｄ）の後に実行される。
例示的なワークフローでは、ポリペプチドの処理および分析は以下の通りである：タンパク質分解消化物からのポリペプチドの大規模な集合（例えば、５０００万～１０億個またはそれ以上）を、単一の分子配列決定基質（例えば、ビーズ）上に好適な分子内間隔でランダムに固定化する。場合によっては、ポリペプチドを記録タグに付着させる。周期的に、各ペプチドの末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端アミノ酸）を標識する（例えば、ＰＴＣ、修飾ＰＴＣ、Ｃｂｚ、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル、グアニジニル、アミノグアニジニル、複素環式メタニミン）。場合によっては、末端アミノ酸の標識を後のステップとして実行することができる。各固定化されたペプチドの標識されたＮ末端アミノ酸（例えば、ＰＩＴＣ－ＮＴＡＡ、Ｃｂｚ－ＮＴＡＡ、ＤＮＰ－ＮＴＡＡ、ＳＮＰ－ＮＴＡＡ、アセチル－ＮＴＡＡ、グアニジニル化－ＮＴＡＡ、複素環式メタニミン－ＮＴＡＡ）を、コーディングタグに付着した同族のＮＴＡＡ結合剤によって結合し、結合したＮＴＡＡ結合剤と関連付けられたコーディングタグからの情報を、固定化したペプチドと関連付けられた記録タグに転送し、それによって伸長記録タグを生成する。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合剤は、ポリペプチドから除去または放出される。標識されたＮＴＡＡは、標識された単一のアミノ酸をポリペプチドから除去することができる修飾された切断酵素と接触することによって除去される。標識、結合剤との接触、識別情報の転送、および単一アミノ酸の除去の１つ以上のサイクルを実行することができる。
いくつかの例では、下流の増幅および／またはＤＮＡ配列決定を容易にするために、最終的な伸長記録タグには、任意選択的に、ユニバーサルプライミング部位が隣接する。フォワードユニバーサルプライミング部位（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰ５－Ｓ１配列）は、元の記録タグ設計の一部であり得、リバースユニバーサルプライミング部位（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰ７－Ｓ２’配列）は、記録タグの伸長における最終ステップとして追加することができる。いくつかの実施形態において、フォワードおよびリバースプライミング部位の追加は、結合剤とは独立して行うことができる。
いくつかの実施形態において、分解によるペプチドまたはポリペプチド配列決定アッセイのプロセスにおけるステップの順序は、逆にするか、またはさまざまな順序で実行することができる。例えば、いくつかの実施形態において、末端アミノ酸標識は、ポリペプチドを結合剤に結合する前および／または後に実施することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合剤との接触は、ポリペプチドを、末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させる前である。場合によっては、１つ以上の結合剤との接触は、ポリペプチドを、修飾された切断酵素と接触させて、標識末端アミノ酸を除去する前である。
いくつかの実施形態において、末端アミノ酸標識は、ポリペプチドを支持体に結合する前または後に実施することができる。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸除去は、ポリペプチドを結合剤に結合する前および／または後に実施することができる。いくつかの実施形態において、末端アミノ酸を標識するための試薬とのポリペプチドの接触は、結合剤との接触の前であり、１つ以上の結合剤との接触は、修飾された切断酵素とポリペプチドとの接触の前である。いくつかの実施形態において、識別情報の伝達は、ポリペプチドを１つ以上の結合剤と接触させた後、およびポリペプチドを修飾された切断酵素と接触させる前に実行される。
任意のそのような実施形態のうちのいくつかにおいて、１つ以上の結合剤を除去することは、識別情報を、コーディングタグから、各ポリペプチドと関連付けられた記録タグに転送して、伸長記録タグを生成した後である。任意のそのような実施形態のうちのいくつかにおいて、１つ以上の結合剤を除去することは、ポリペプチドを試薬と接触させて、ポリペプチドの末端アミノ酸を標識する前である。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合剤を除去することは、ポリペプチドを修飾された切断酵素と接触させる前である。
いくつかの実施形態において、タンパク質またはポリペプチドを処理するために提供される方法のステップのうちのいずれかの順序は、逆にするか、またはさまざまな順序で実行することができる。
Ａ．ポリペプチドへの記録タグの付着
いくつかの実施形態において、提供される方法は、ポリペプチドを、修飾された切断酵素および任意選択的にポリペプチド分析のための他の試薬と接触させることを含む。一実施形態において、タンパク質またはポリペプチドを、標準的なアミンカップリング化学により、ＤＮＡ記録タグで標識する。（例えば、リジン残基の）ε－アミノ基およびＮ末端アミノ基は、反応のｐＨに応じて、アミン反応性カップリング剤による標識に特に影響されやすい（Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ（２００９）２８（５）：７８５－８１５）。特定の実施形態において、記録タグは、反応性部分（例えば、固体表面への共役、多官能性リンカー、またはポリペプチド）、リンカー、ユニバーサルプライミング配列、バーコード（例えば、コンパートメントタグ、パーティションバーコード、サンプルバーコード、画分バーコード、またはそれらの任意の組み合わせ）、任意選択的なＵＭＩ、およびコーディングタグへの／からの情報転送を容易にするためのスペーサー（Ｓｐ）配列から構成される。ライゲーションが使用される場合、Ｓｐ配列は、１～８塩基のオーバーハングとして機能する場合がある。場合によっては、記録タグにはスペーサーが含まれない。別の実施形態では、最初にタンパク質をユニバーサルＤＮＡタグで標識することができ、後でバーコードＳｐ配列（サンプル、コンパートメント、スライド上の物理的位置などを表す）を、酵素的または酵素的または化学的カップリングステップを通じてタンパク質に付着させる。ユニバーサルＤＮＡタグは、ポリペプチドを標識するために使用され、バーコード（例えば、コンパートメントタグ、記録タグなど）用の付着点として使用することができるヌクレオチドの短い配列を含む。例えば、記録タグは、その末端に、ユニバーサルＤＮＡタグに相補的な配列を含み得る。特定の実施形態において、ユニバーサルＤＮＡタグは、ユニバーサルプライミング配列である。標識タンパク質上のユニバーサルＤＮＡタグを記録タグ内の相補配列（例えば、ビーズに結合）にハイブリダイゼーションすると、アニーリングされたユニバーサルＤＮＡタグが、プライマー伸長を介して伸長され、記録タグ情報をＤＮＡタグ付きタンパク質に転送し得る。特定の実施形態では、タンパク質を、ペプチドへのプロテイナーゼ消化の前に、ユニバーサルＤＮＡタグで標識する。次に、消化物からの標識ペプチド上のユニバーサルＤＮＡタグを、有益で効果的な記録タグに変換することができる。いくつかの実施形態において、ペプチドへのタンパク質およびポリペプチドの断片化は、ＤＮＡタグまたはＤＮＡ記録タグを付着させる前または後に実行することができる。
少なくとも１つの記録タグを、ポリペプチドと直接的または間接的に関連付けまたは共局在化させ、固体支持体に接合する。記録タグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくははＰＮＡ、ｇＰＮＡ、ＧＮＡ、ＨＮＡ、ＢＮＡ、ＸＮＡ、ＴＮＡを含むポリヌクレオチド類似体、またはそれらの組み合わせを含み得る。記録タグは一本鎖、または部分的または完全に二本鎖であり得る。記録タグは、平滑末端または突出末端を有する場合がある。特定の実施形態では、結合剤がポリペプチドに結合すると、結合剤のコーディングタグの識別情報が記録タグに転送されて、伸長記録タグが生成される。伸長記録タグへのさらなる伸長は、後続の結合サイクルで行うことができる。
記録タグは、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用、またはそれらの任意の組み合わせを含む、当技術分野で既知である任意の手段によって、直接的または間接的に（例えば、リンカーを介して）固体支持体に接合することができる。例えば、記録タグは、ライゲーション反応によって固体支持体に接合され得る。あるいは、固体支持体は、記録タグの固体支持体への直接的または間接的接合を容易にするための薬剤またはコーティングを含むことができる。核酸分子を固体支持体（例えば、ビーズ）に固定化するための戦略は、米国特許第５，９００，４８１号；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ７３：５９７－６０５；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８６１－１０８８０）に記載されている。
特定の実施形態において、ポリペプチドおよび関連付けられた記録タグの共局在化は、ポリペプチドおよび記録タグを、固体支持体表面に直接付着した二官能性リンカーに共役することによって達成される（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ７３：５９７－６０５）。さらなる実施形態において、三官能性部分を使用して、固体支持体（例えば、ビーズ）を誘導体化し、得られる二官能性部分を、ポリペプチドおよび記録タグの両方にカップリングする。他の実施形態において、ポリペプチドおよび関連付けられた記録タグの共局在化は、関連付けられたＤＮＡ記録タグにポリペプチドをカップリングし、ＤＮＡ装飾された固体支持体表面にキメラをライゲーションすることによって達成される。
ポリペプチドと固体支持体との付着に関して記載されたものなどの方法および試薬（例えば、クリック化学試薬および光親和性標識試薬）も、記録タグの付着に使用することができる。
特定の実施形態において、単一の記録タグは、好ましくは、ブロック解除されたＮ末端またはＣ末端アミノ酸への付着を介して、ポリペプチドに付着される。別の実施形態において、複数の記録タグは、ポリペプチド、好ましくはリジン残基またはペプチド骨格に付着する。いくつかの実施形態において、複数の記録タグで標識されたポリペプチドは、より小さなペプチドに断片化または消化され、各ペプチドは、平均して１つの記録タグで標識される。
特定の実施形態において、最初に、ポリペプチドをＤＮＡ記録タグで標識し、キメラＤＮＡ－ポリペプチド分子を、核酸ハイブリダイゼーションおよび固体支持体に付着したＤＮＡ配列へのライゲーションを介して、固体支持体に固定化する。
特定の実施形態において、記録タグは、固有分子識別子（ＵＭＩ）が関連付けられた各ポリペプチドに固有の識別子タグを提供する、任意選択的なＵＭＩを含む。ＵＭＩは、約３～約４０の塩基、またはその部分範囲、例えば、約３個～約３０個の塩基、約３個～約２０個の塩基、もしくは約３個～約１０個の塩基、もしくは約３個～約８個の塩基であり得る。いくつかの実施形態において、ＵＭＩは、約３の塩基、４個の塩基、５個の塩基、６個の塩基、７個の塩基、８個の塩基、９個の塩基、１０個の塩基、１１個の塩基、１２個の塩基、１３個の塩基、１４個の塩基、１５個の塩基、１６個の塩基、１７個の塩基、１８個の塩基、１９個の塩基、２０個の塩基、２５個の塩基、３０個の塩基、３５個の塩基、または４０個の塩基の長さである。ＵＭＩを使用して、複数の伸長記録タグからの配列決定データをデコンボリューションして、個々のポリペプチドからの配列リードを識別することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのライブラリー内で、各ポリペプチドは、単一の記録タグと関連付けられ、各記録タグは、固有のＵＭＩを含む。他の実施形態において、記録タグの複数のコピーは、単一のポリペプチドと関連付けられ、記録タグの各コピーは、同じＵＭＩを含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩは、配列分析中にこれらの成分を区別することを容易にするために、結合剤のコーディングタグ内のスペーサーまたはエンコーダー配列とは異なる塩基配列を有する。
特定の実施形態において、記録タグは、例えば、存在する場合、ＵＭＩ以外のバーコードを含む。バーコードは、長さが約３個～約３０個の塩基、またはその部分範囲、例えば、約３個～約２５個の塩基、約３個～約２０個の塩基、約３個～約１０個の塩基、約３個～約１０個の塩基、約３個～約８個の塩基の核酸分子である。いくつかの実施形態において、バーコードは、約３個の塩基、４個の塩基、５個の塩基、６個の塩基、７個の塩基、８個の塩基、９個の塩基、１０個の塩基、１１個の塩基、１２個の塩基、１３個の塩基、１４個の塩基、１５個の塩基、２０個の塩基、２５個の塩基、または３０個の塩基の長さである。一実施形態において、バーコードは、複数のサンプルまたはライブラリーの多重配列決定を可能にする。バーコードは、ポリペプチドが由来するパーティション、画分、コンパートメント、サンプル、空間的位置、またはライブラリーを識別するために使用され得る。バーコードを使用して、多重化された配列データをデコンボリューションし、個々のサンプルまたはライブラリーからの配列リードを識別することができる。例えば、バーコード付きビーズは、例えばプロテオームを分割する目的で、エマルジョンおよびサンプルの分配を含む方法に有用である。
バーコードは、液滴、マイクロウェル、固体支持体上の物理的領域などのコンパートメントに固有のバーコードが割り当てられるコンパートメントタグであり得る。コンパートメントと特定のバーコードとの関連付けは、コンパートメントに単一のバーコード付きビーズを封入することによって（例えば、バーコード付き液滴をコンパートメントに直接併合または追加することによって、バーコード試薬をコンパートメントに直接印刷または注入することによって）など、あらゆる方式で達成することができる。コンパートメント内のバーコード試薬は、コンパートメント内のポリペプチドまたはその断片にコンパートメント固有のバーコードを追加するために使用される。コンパートメントへのタンパク質の分割に適用されるバーコードは、分析されたペプチドをコンパートメント内の元のタンパク質分子にマッピングし直すために使用することができる。これにより、タンパク質の識別が大幅に容易になる。コンパートメントバーコードは、タンパク質複合体を識別するためにも使用することができる。
他の実施形態において、コンパートメントの集団のサブセットを表す複数のコンパートメントに、サブセットを表す固有のバーコードを割り当てることができる。
あるいは、バーコードは、サンプル識別バーコードであり得る。サンプルバーコードは、単一の反応容器内のサンプルのセットの多重分析に有用であるか、または単一の固体基質もしくは固体基質の集合（例えば、平面スライド、単一のチューブもしくは容器に含まれるビーズの集団など）に固定化される。多くの異なるサンプルからのポリペプチドを、サンプル固有のバーコードが付いた記録タグで標識し、次いで、すべてのサンプルを共にプールした後、固体支持体への固定化、周期的結合、および記録タグ分析を実行することができる。あるいは、ＤＮＡコードライブラリーの作製後までサンプルを分離しておき、サンプルバーコードをＤＮＡコードライブラリーのＰＣＲ増幅中に付着させ、次いで、共に混合した後、配列決定を行うこともできる。このアプローチは、異なる豊度クラス（ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｌａｓｓｅｓ）の分析物（例えば、タンパク質）をアッセイする際に役立ち得る。例えば、サンプルを分割してバーコードを付け、結合剤を使用して一部分を処理し低豊度分析物にし、結合剤を使用して他の部分を処理してより高い豊度の分析物にすることができる。特定の実施形態において、このアプローチは、特定のタンパク質分析物アッセイのダイナミックレンジを調整して、タンパク質分析物の標準的な発現レベルの「スイートスポット」内にあるようにするのに役立つ。
特定の実施形態において、複数の異なるサンプルからのポリペプチドは、サンプル固有のバーコードを含む記録タグで標識される。マルチサンプルのバーコード付きポリペプチドは、周期的な結合反応（ｃｙｃｌｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）前に、共に混合することができる。このようにして、デジタル逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）の高度に多重化された代替物が効果的に作製される（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉ（２０１２）１０（１）：５６；Ａｓｓａｄｉ，Ｌａｍｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２０１３）１２（９）：２６１５－２６２２；Ａｋｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２０１４）１３（７）：１６２５－１６４３；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ（２０１５）９：３５１９－３５２７）。デジタルＲＰＰＡのようなアッセイの作製は、トランスレーショナルリサーチ、バイオマーカーの検証、創薬、臨床、および精密医療において多くの用途がある。
特定の実施形態において、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位、例えば、フォワードまたは５’ユニバーサルプライミング部位を含む。ユニバーサルプライミング部位は、ライブラリー増幅反応のプライミングおよび／または配列決定に使用することができる核酸配列である。ユニバーサルプライミング部位には、ＰＣＲ増幅用のプライミング部位、フローセル表面上の相補的オリゴヌクレオチドにアニーリングするフローセルアダプター配列（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代シーケンシング）、シーケンシングプライミング部位、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ユニバーサルプライミング部位は、約１０塩基～約６０塩基であり得る。いくつかの実施形態において、ユニバーサルプライミング部位は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰ５プライマー（５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’－配列番号３）またはＩｌｌｕｍｉｎａのＰ７プライマー（５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ－３’－配列番号４）を含む。
特定の実施形態において、記録タグは、その末端、例えば３’末端にスペーサーを含む。本明細書で使用される場合、記録タグとの関連におけるスペーサー配列への言及は、その同族結合剤と関連付けられたスペーサー配列と同一のスペーサー配列、またはその同族結合剤と関連付けられたスペーサー配列に相補的なスペーサー配列を含む。記録タグ上の末端、例えば３’スペーサーは、（例えば、プライマー伸長または粘着末端ライゲーションのための相補的スペーサー配列のアニーリングにより）最初の結合サイクル中に同族結合剤の識別情報をそのコーディングタグから記録タグに転送することを可能にする。
一実施形態において、スペーサー配列は、長さが約１つ～２０個の塩基またはその部分範囲、例えば、長さが約２つ～１２個の塩基、もしくは長さが５～１０個の塩基である。スペーサーの長さは、コーディングタグ情報を記録タグに転送するためのプライマー伸長反応の温度および反応条件などの要因に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、記録タグには、スペーサーが含まれない。
好ましい実施形態において、記録中のスペーサー配列は、記録タグ内の他の領域に対して最小限の相補性を有するように設計される。同様に、コーディングタグ内のスペーサー配列は、コーディングタグ内の他の領域に対して最小限の相補性を有する必要がある。言い換えれば、記録タグおよびコーディングタグのスペーサー配列は、記録タグまたはコーディングタグに存在する、固有分子識別子、バーコード（例えば、コンパートメント、パーティション、サンプル、空間位置）、ユニバーサルプライマー配列、エンコーダー配列、サイクル特異的配列などのコンポーネントに対して最小限の配列相補性を有する必要がある。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドのライブラリーと関連付けられた記録タグは、共通のスペーサー配列を共有する。他の実施形態において、ポリペプチドのライブラリーと関連付けられた記録タグは、それらの同族結合剤の結合サイクル特異的スペーサー配列に相補的な結合サイクル特異的スペーサー配列を有し、これは、連結されていない伸長記録タグを使用する場合に有用であり得る。
場合によっては、伸長記録タグの集合は、連結可能である。例えば、結合サイクルが完了した後、ビーズ固体支持体、１個あたり平均して１つまたは１つ未満のポリペプチドを含む各ビーズ、ポリペプチドの部位に共局在化される伸長記録タグの集合を有する各ポリペプチドをエマルジョンに入れる。エマルジョンは、各液滴が平均して最大１つのビーズで占められるように形成される。任意選択的なアセンブリＰＣＲ反応をエマルジョン内で実行して、ビーズ上のポリペプチドと共局在化される伸長記録タグを増幅し、別々の伸長記録タグ上の異なるサイクル特異的配列間でプライミングすることにより、それらを同一直線上の順序で（ｉｎ ｃｏ－ｌｉｎｅａｒ ｏｒｄｅｒ）組み立てる（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（２００８）３２（３）：５２２－５４０）。その後、エマルジョンが破壊され、アセンブルされた伸長記録タグの配列が決定される。
別の実施形態において、ＤＮＡ記録タグは、ユニバーサルプライミング配列（Ｕ１）、１つ以上のバーコード配列（ＢＣ）、および第１の結合サイクルに特異的なスペーサー配列（Ｓｐ１）から構成される。最初の結合サイクルでは、結合剤は、Ｓｐ１相補スペーサー、エンコーダーバーコード、任意選択的なサイクルバーコード、および２番目のスペーサー要素（Ｓｐ２）で構成されるＤＮＡコーディングタグを使用する。少なくとも２つの異なるスペーサー要素を使用することの有用性は、最初の結合サイクルが潜在的にいくつかのＤＮＡ記録タグの１つを選択し、単一のＤＮＡ記録タグが伸長され、その結果、伸長されたＤＮＡ記録タグの最後に新たなＳｐ２スペーサー要素が生じることである。２回目以降の結合サイクルでは、結合剤にはＳｐ１’ではなくＳｐ２’スペーサーのみが含まれる。このようにして、最初のサイクルからの単一の伸長記録タグのみが後続のサイクルで伸長される。別の実施形態において、２回目以降のサイクルは、結合剤特異的スペーサーを使用することができる。
いくつかの実施形態において、記録タグは、５’から３’方向、すなわち、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、ＵＭＩ、およびスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、記録タグは、５’から３’方向、すなわち、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、任意選択的なＵＭＩ、バーコード（例えば、サンプルバーコード、パーティションバーコード、コンパートメントバーコード、空間バーコード、または任意のそれらの組み合わせ）、およびスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、記録タグは、５’から３’方向、すなわち、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、バーコード（例えば、サンプルバーコード、パーティションバーコード、コンパートメントバーコード、空間バーコード、または任意のそれらの組み合わせ）、任意選択的なＵＭＩ、およびスペーサー配列を含む。
コンビナトリアルアプローチを使用して、修飾されたＤＮＡおよびＰＮＡからＵＭＩを生成することができる。一例では、ＵＭＩは、互いに直交するように設計された短いワード配列（４～１５ｍｅｒ）のセットを一緒に「化学的に連結」することによって構築され得る（Ｓｐｉｒｏｐｕｌｏｓ ａｎｄ Ｈｅｅｍｓｔｒａ ２０１２）。ＤＮＡ鋳型は、「ワード」ポリマーの化学ライゲーションを指示するために使用される。ＤＮＡ鋳型は、サブコンポーネントを溶液中で混合するだけで、コンビナトリアル鋳型構造を組み立てられるハイブリダイジングアームを用いて構成される。特定の実施形態において、この設計には「スペーサー」配列はない。ワードスペースのサイズは、数十ワード～１０，０００ワード以上、またはその部分範囲までさまざまであり得る。特定の実施形態において、ワードは、それらが互いに交雑しないように互いに異なり、それでも比較的均一なハイブリダイゼーション条件を有するように選択される。一実施形態において、ワードの長さは１０個の塩基のオーダーであり、サブセットには約１０００のワードが存在する（これは、合計１０ｍｅｒのワード空間のわずか０．１％～４１０＝１００万ワードである）。これらのワード（サブセットでは１，０００）のセットを一緒に連結して、複雑さ＝１０００ｎ乗（ｐｏｗｅｒ）を有する最終コンビナトリアルＵＭＩを生成することができる。一緒に４つのワードを連結した場合、これは、１０１２の異なる要素のＵＭＩ多様性を生成する。これらのＵＭＩ配列は、単一分子レベルでポリペプチドに付加される。一実施形態において、ＵＭＩの多様性は、ＵＭＩが付着するポリペプチドの分子の個数を超える。このようにして、ＵＭＩは目的のポリペプチドを一意に識別する。コンビナトリアルワードＵＭＩを使用すると、長さが複数の塩基であるワードを読み取るのに単一の塩基分解能が不要となるため、エラー率が高いシーケンサー（例えば、ナノポアシーケンサー、ナノギャップトンネリングシーケンシングなど）での読み出しが容易になる。コンビナトリアルワードアプローチを使用して、コンパートメントタグ、パーティションバーコード、空間バーコード、サンプルバーコード、エンコーダー配列、サイクル特異的配列、およびバーコードなど、記録タグまたはコーディングタグの他のＩＤ情報コンポーネントを生成することもできる。エラー耐性のあるワード（コード）を含むＤＮＡコード情報およびナノポアシーケンシングに関連する方法は、当技術分野で既知である（例えば、Ｋｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ（ＩＳＩＴ）；Ｇａｂｒｙｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｌｅｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ－ｂａｓｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ．ＩＥＥＥ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ（ＩＳＩＴ）；Ｌａｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃｏｄｉｎｇ ｉｎ ２Ｄ：Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｔｅｎｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｃｏｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂａｒｃｏｄｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１６０５２７９；Ｙａｚｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉ－Ｓｃａｌｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １：２３０－２４８；ａｎｄ Ｙａｚｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１４１３８（その各々は参照によりその全体が組み込まれる）を参照）。したがって、特定の実施形態において、本明細書に記載される実施形態のいずれかにおける伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグ構築物は、エラー訂正コードである識別コンポーネント（例えば、ＵＭＩ、エンコーダー配列、バーコード、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列など）から構成される。いくつかの実施形態において、エラー訂正コードは、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ－Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ－Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される。ナノポアシーケンシングの場合、電流またはイオンフラックスプロファイルおよび非対称ベースコーリングエラーは、使用するナノポアおよび生化学のタイプに固有であり、この情報を使用して、前述のエラー訂正アプローチを用いて、より堅牢なＤＮＡコードを設計することができる。堅牢なＤＮＡナノポアシーケンシングバーコードを使用する代わりに、バーコード配列の電流またはイオンフラックスシグネチャを直接使用して（米国特許第７，０６０，５０７号（その全体が、参照により組み込まれる））、ＤＮＡベースコーリングを完全に回避し、Ｌａｓｚｌｏら（２０１４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：８２９－８３３（その全体が参照により組み込まれる））によって記載されるように、予測された電流／フラックスシグネチャにマッピングし直すことにより、バーコード配列を即座に識別することができる。例えば、Ｌａｓｚｌｏらは、異なるワード文字列をナノポアに通すときに生物学的ナノポアＭｓｐＡによって生成される電流シグネチャ、および、結果として生じる電流シグネチャを、配列の領域（ａ ｕｎｉｖｅｒｓｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）からの可能な電流シグネチャのインシリコ予測にマッピングし直すことによって、ＤＮＡ鎖をマッピングして識別する能力について説明している（Ｌａｓｚｌｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：８２９－８３３）。同様の概念は、ＤＮＡコードおよびナノギャップトンネリング電流ベースのＤＮＡシーケンシングによって生成される電気信号に適用することができる（Ｏｈｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２：５０１）。
したがって、特定の実施形態において、コーディングタグ、記録タグ、またはその両方の識別コンポーネントは、固有の電流もしくはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを生成することができ、本明細書において提供される方法のうちのいずれかの分析ステップは、固有の電流もしくはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを検出して、識別コンポーネントを識別することを含む。いくつかの実施形態において、識別コンポーネントは、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
特定の実施形態では、サンプル内のポリペプチドのすべてのまたは実質的な量（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）は、記録タグで標識される。ポリペプチドへの記録タグの付着は、ポリペプチドを固体支持体に固定化する前または後に行うことができる。
他の実施形態において、サンプル内のポリペプチドのサブセットは、記録タグで標識される。特定の実施形態において、サンプルからのポリペプチドのサブセットは、記録タグによる標的化された（分析物特異的）標識を受ける。タンパク質の標的化された記録タグ標識は、記録タグ内で相補的な標的特異的ｂａｉｔ配列（例えば、分析物特異的バーコード）にアニーリングする短い標的特異的ＤＮＡ捕捉プローブ（例えば分析物特異的バーコード）に連結された標的タンパク質特異的結合剤（例えば、抗体、アプタマーなど）を使用して達成される。記録タグは、標的タンパク質上に存在する同族の反応性部分に対する反応性部分を含む（例えば、クリック化学標識、光親和性標識）。例えば、記録タグは、アルキン誘導体化タンパク質と相互作用するためのアジド部分を含み得るか、または記録タグは、天然タンパク質などと相互作用するためのベンゾフェノンを含み得る。標的タンパク質特異的結合剤による標的タンパク質の結合時に、記録タグおよび標的タンパク質は、それらの対応する反応性を介してカップリングされる。標的タンパク質を記録タグで標識した後、標的タンパク質特異的結合剤を、標的タンパク質特異的結合剤に連結されたＤＮＡ捕捉プローブの消化によって除去してもよい。例えば、ＤＮＡ捕捉プローブは、ウラシル塩基を含むように設計され得、次に、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））による消化の標的とされる。標的タンパク質特異的結合剤は、標的タンパク質から解離され得る。
一例では、標的タンパク質のセットに特異的な抗体を、相補的なｂａｉｔ配列で設計された記録タグとハイブリダイズするＤＮＡ捕捉プローブで標識することができる。タンパク質のサンプル特異的標識は、サンプル特異的バーコードで構成される記録タグ上で相補的なｂａｉｔ配列とハイブリダイズするＤＮＡ捕捉プローブ標識抗体を使用することで達成することができる。
別の例では、標的タンパク質特異的アプタマーは、サンプル内のタンパク質のサブセットの標的記録タグ標識に使用される。標的特異的アプタマーは、記録タグ内の相補的なｂａｉｔ配列でアニーリングするＤＮＡ捕捉プローブにリンクされる。記録タグは、対応する反応性部分を有する標的タンパク質にカップリングするための反応性化学または光反応性化学プローブ（例えば、ベンゾフェノン（ＢＰ））を含む。アプタマーはその標的タンパク質分子に結合し、記録タグを標的タンパク質に近接させ、その結果、記録タグが標的タンパク質にカップリングされる。
小分子タンパク質親和性リガンドに付着した光反応性化学プローブを使用する光親和性（ＰＡ）タンパク質標識は、以前に記載されている（Ｐａｒｋ，Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．２０１６）。典型的な光反応性化学プローブには、ベンゾフェノン（反応性ジラジカル、３６５ｎｍ）、フェニルジアジリン（反応性炭素、３６５ｎｍ）、およびフェニルアジド（反応性ニトレンフリーラジカル、２６０ｎｍ）に基づくプローブが含まれ、以前に記載されたように照射波長で活性化される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．（２０１５）７（２）：１５９－１８３）。好ましい実施形態において、タンパク質サンプル内の標的タンパク質は、Ｌｉらによって開示された方法を使用して、サンプルバーコードを含む記録タグで標識され、ベンゾフェノン標識記録タグにおけるｂａｉｔ配列は、同族結合剤に付着したＤＮＡ捕捉プローブにハイブリダイズされる（例えば、核酸アプタマー（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ（２０１３）５２（３６）：９５４４－９５４９）。光親和性標識タンパク質標的の場合、光親和性部分が標的タンパク質ではなく抗体を自己標識することができるので、標的タンパク質特異的結合剤としてのＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーの使用が抗体よりも好ましい。対照的に、光親和性標識は、タンパク質よりも核酸の効率が低く、アプタマーを、ＤＮＡ指向性化学標識または光標識のためのより良い媒体にする。光親和性標識と同様に、Ｒｏｓｅｎらによって記載されるのと同様の方式で、アプタマー結合部位に近接する反応性リジン（または他の部分）のＤＮＡ指向性化学標識を使用することもできる。（Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌｕｍｅ（２０１４）６：８０４－８０９；Ｋｏｄａｌ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２０１６）１７：１３３８－１３４２）。
前述の実施形態において、ハイブリダイゼーション以外の他のタイプの連結を使用して、標的特異的結合剤と記録タグを連結することができる。例えば、捕捉された標的タンパク質（または他のポリペプチド）が記録タグに共有結合されると、切断されて結合剤を放出するように設計されたリンカーを使用して、２つの部分を共有結合させることができる。好適なリンカーは、３’末端などの記録タグのさまざまな位置に、または記録タグの５’末端に付着したリンカー内に付着させることができる。
記録タグは、固体支持体への固定化の前または後に、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに付着させることができる。例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを、最初に記録タグで標識し、次に、２つの官能性部分を含む記録タグを介して固体表面に固定化して、カップリングすることができる。記録タグの一方の官能性部分は、タンパク質に結合し、もう一方の官能性部分は、記録タグで標識されたタンパク質を固体支持体に固定化する。
他の実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを記録タグで標識する前に、固体支持体に固定化される。例えば、最初に、タンパク質をクリック化学部分などの反応性基で誘導体化することができる。次に、活性化されたタンパク質分子を好適な固体支持体に付着させ、次に相補的なクリック化学部分を使用して記録タグで標識することができる。一例として、アルキンおよびｍＴｅｔ部分で誘導体化されたタンパク質を、アジドおよびＴＣＯで誘導体化されたビーズに固定化し、アジドおよびＴＣＯで標識された記録タグに付着してもよい。
特定の実施形態において、固体支持体の表面は、結合剤への非特異的吸収を最小限にするために不動態化（ブロック）される。「不動態化された」表面とは、結合剤の非特異的結合を最小限に抑えるために材料の外層で処理された表面を指す。表面を不動態化する方法には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｐｈｙｓ．Ｂｉｏｌ．１２：０４５００６）、ポリシロキサン（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７）、スターポリマー（例えば、スターＰＥＧ）（Ｇｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７２：１－１８）、疎水性ジクロロジメチルシラン（ＤＤＳ）＋自己組織化Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１１：１２３３－１２３６）、ダイヤモンド様炭素（ＤＬＣ）、ＤＬＣ＋ＰＥＧ（Ｓｔａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：９８３－９８８）、および両性イオン部分（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０１８３８６３号）が含まれる。共有表面修飾に加えて、Ｔｗｅｅｎ－２０のような界面活性剤、溶液中のポリシロキサン（Ｐｌｕｒｏｎｉｃシリーズ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＢＳＡおよびカゼインのようなタンパク質を含む多くの不動態化剤を使用することもできる。あるいは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの密度は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを固体基質に固定化するときに競合物質または「ダミー」反応性分子をスパイクすることによって、固体基質の表面上またはその体積内で滴定することができる。
複数のポリペプチドが同じ固体支持体上に固定化される特定の実施形態において、ポリペプチド同士の間隔を適切に設けることにより、例えば、結合剤が第１のポリペプチドに結合し、そのコーディングタグ情報が、最初のポリペプチドと関連付けられた記録タグではなく、隣接するポリペプチドと関連付けられた記録タグに転送される場合など、交差結合または分子間事象の発生を低減または防止することができる。固体支持体上のポリペプチド間隔を制御するために、官能性カップリング基（例えば、ＴＣＯ）の密度を基質表面上で滴定することができる。いくつかの実施形態において、複数のポリペプチドは、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの距離、またはその部分範囲、例えば、約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、もしくは約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、もしくは約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、もしくは約５０ｎｍ～約１００ｎｍの距離で、固体支持体の表面上または体積内（例えば、多孔質支持体）に間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態において、複数のポリペプチドは、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、または少なくとも５００ｎｍの平均距離で、固体支持体の表面上に間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態において、複数のポリペプチドは、少なくとも５０ｎｍの平均距離で、固体支持体の表面上に間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、経験的に、分子間から分子内事象の相対頻度が＜１：１０、＜１：１００、＜１：１，０００、または＜１：１０，０００であるように、固体支持体の表面上または体積内に間隔を置いて配置される。好適な間隔頻度は、機能的アッセイを使用して経験的に決定することができ（国際特許公開第ＷＯ２０１７／１９２６３３号の実施例３１を参照）、希釈することにより、および／または基質表面の付着部位をめぐって競合する「ダミー」スペーサー分子をスパイクすることにより達成することができる。
例えば、ＰＥＧ－５０００（分子量：約５０００）は、基質表面（例えば、ビーズ表面）上のペプチド間の隙間をブロックするために使用される。さらに、ペプチドは、ＰＥＧ－５０００分子にも付着した官能性部分にカップリングする。いくつかの実施形態において、これは、ＮＨＳ－ＰＥＧ－５０００－ＴＣＯ＋ＮＨＳ－ＰＥＧ－５０００－メチルの混合物をアミン誘導体化ビーズにカップリングすることによって達成される。２つのＰＥＧ間の化学量論比（ＴＣＯ対メチル）を滴定して、基質表面に好適な密度の機能的カップリング部分（ＴＣＯ基）を生成する。メチルＰＥＧはカップリングに対して不活性である。ＴＣＯ基間の有効な間隔は、表面のＴＣＯ基の密度を測定することで計算することができる。特定の実施形態において、固体表面上のカップリング部分（例えば、ＴＣＯ）間の平均間隔は、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、または少なくとも５００ｎｍである。ビーズのＰＥＧ５０００－ＴＣＯ／メチル誘導体化後、表面の過剰なＮＨ２基を反応性無水物（コハク酸無水物またはコハク酸無水物など）でクエンチする。他のＭＷＰＥＧも、分子量が約３００Ｄａ～５０ｋＤａを超える不動態化に使用することができる。
いくつかの実施形態において、間隔は、基質表面上の利用可能な付着分子の比率を滴定することによって達成される。いくつかの例では、基質表面（例えば、ビーズ表面）は、活性化剤（例えば、活性化剤はＥＤＣおよびスルホ－ＮＨＳである）で処理されるカルボキシル基（ＣＯＯＨ）で官能化される。いくつかの例では、基質表面（例えば、ビーズ表面）は、ＮＨＳ部分を含む。いくつかの実施形態において、ｍＰＥＧｎ－ＮＨ２およびＮＨ２－ＰＥＧｎ－ｍＴｅｔの混合物が、活性化されたビーズに添加される（式中、ｎは、１～１００などの任意の数値である）。ｍＰＥＧ３－ＮＨ２（カップリングには利用不可）とＮＨ２－ＰＥＧ２４－ｍＴｅｔ（カップリングに利用可能）の比率を滴定して、分析物を基質表面に付着させるために利用可能な官能性部分の好適な密度を生成する。特定の実施形態において、固体表面上のカップリング部分（例えば、ＮＨ２－ＰＥＧ４－ｍＴｅｔ）間の平均間隔は、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、または少なくとも５００ｎｍである。いくつかの特定の実施形態において、ＮＨ２－ＰＥＧｎ－ｍＴｅｔ対ｍＰＥＧ３－ＮＨ２の比は、約１：１０００以上、約１：１０，０００以上、約１：１００，０００以上、または約１：１，０００，０００以上である。いくつかのさらなる実施形態において、捕捉核酸は、ＮＨ２－ＰＥＧｎ－ｍＴｅｔに付着する。
特定の実施形態において、ポリペプチド（複数可）および／または記録タグ（複数可）は、（ｉ）第１のポリペプチドに結合したコーディング剤（特に、その結合したコーディング剤のコーディングタグ）と（ｉｉ）第２のポリペプチドおよび／またはその記録タグとの間の相互作用が、低減、最小化、または完全に排除されるような密度で基質または支持体上に固定化される。したがって、「分子間」エンゲージメントに起因する偽陽性アッセイシグナルを低減、最小化、または排除することができる。
特定の実施形態において、基質上のポリペプチドおよび／または記録タグの密度は、各タイプのポリペプチドについて決定される。例えば、変性ポリペプチド鎖が長いほど、「分子間」相互作用を低減、最小化、または防止するために密度を低くする必要がある。特定の態様において、ポリペプチド分子および／または記録タグ間の間隔を増加させること（すなわち、密度を低下させること）は、現在開示されるアッセイのシグナル対バックグラウンド比を増加させる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチド分子および／または記録タグは、任意の好適な平均密度で、例えば、約０．０００１個の分子／μｍ２、０．００１個の分子／μｍ２、０．０１個の分子／μｍ２、０．１個の分子／μｍ２、１個の分子／μｍ２、約２個の分子／μｍ２、約３個の分子／μｍ２、約４個の分子／μｍ２、約５個の分子／μｍ２、約６個の分子／μｍ２、約７個の分子／μｍ２、約８個の分子／μｍ２、約９個の分子／μｍ２、または約１０個の分子／μｍ２の平均密度で、基質上に堆積または固定化される。他の実施形態において、ポリペプチド（複数可）および／または記録タグ（複数可）は、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１０５個、約１１０個、約１１５個、約１２０個、約１２５個、約１３０個、約１３５個、約１４０個、約１４５個、約１５０個、約１５５個、約１６０個、約１６５個、約１７０個、約１７５個、約１８０個、約１８５個、約１９０個、約１９５個、約２００個、または約２００個の分子／μｍ２の平均密度で、基質上に堆積または固定化される。他の実施形態において、ポリペプチド（複数可）および／または記録タグ（複数可）は、約１個の分子／ｍｍ２、約１０個の分子／ｍｍ２、約５０個の分子／ｍｍ２、約１００個の分子／ｍｍ２、約１５０個の分子／ｍｍ２、約２００個の分子／ｍｍ２、約２５０個の分子／ｍｍ２、約３００個の分子／ｍｍ２、約３５０個の分子／ｍｍ２、４００個の分子／ｍｍ２、約４５０個の分子／ｍｍ２、約５００個の分子／ｍｍ２、約５５０個の分子／ｍｍ２、約６００個の分子／ｍｍ２、約６５０個の分子／ｍｍ２、約７００個の分子／ｍｍ２、約７５０個の分子／ｍｍ２、約８００個の分子／ｍｍ２、約８５０個の分子／ｍｍ２、約９００個の分子／ｍｍ２、約９５０個の分子／ｍｍ２、または約１０００個の分子／ｍｍ２の平均密度で、基質上に堆積または固定化される。さらに他の実施形態において、ポリペプチド（複数可）および／または記録タグ（複数可）は、約１×１０３～約０．５×１０４個の分子／ｍｍ２、約０．５×１０４～約１×１０４個の分子／ｍｍ２、約１×１０４～約０．５×１０５個の分子／ｍｍ２、約０．５×１０５～約１×１０５個の分子／ｍｍ２、約１×１０５～約０．５×１０６個の分子／ｍｍ２、または約０．５×１０６～約１×１０６個の分子／ｍｍ２の平均密度で、基質上に堆積または固定化される。他の実施形態において、基質上に堆積または固定化されるポリペプチド（複数可）および／または記録タグ（複数可）は、例えば、約１個の分子／ｃｍ２～約５個の分子／ｃｍ２、約５～約１０個の分子／ｃｍ２、約１０～約５０個の分子／ｃｍ２、約５０～約１００個の分子／ｃｍ２、約１００～約０．５×１０３個の分子／ｃｍ２、約０．５×１０３～約１×１０３個の分子／ｃｍ２、１×１０３～約０．５×１０４個の分子／ｃｍ２、約０．５×１０４～約１×１０４個の分子／ｃｍ２、約１×１０４～約０．５×１０５個の分子／ｃｍ２、約０．５×１０５～約１×１０５個の分子／ｃｍ２、約１×１０５～約０．５×１０６個の分子／ｃｍ２、または約０．５×１０６～約１×１０６個の分子／ｃｍ２である。
Ｂ．コーディングタグ情報の記録タグへの周期的な転送
本明細書に記載の方法では、結合剤がポリペプチドに結合すると、その連結されたコーディングタグの識別情報が、ポリペプチドと関連付けられた記録タグに転送され、それによって「伸長記録タグ」が生成される。伸長記録タグは、実行された各結合サイクルを表す結合剤のコーディングタグからの情報を含み得る。しかしながら、伸長記録タグはまた、例えば、結合剤がポリペプチドに結合することができないために、コーディングタグが欠落しているか、損傷しているか、または欠陥があるために、プライマー伸長反応が失敗したために、「欠落した」結合サイクルを経験する場合がある。結合事象が発生した場合でも、コーディングタグから記録タグへの情報の転送が不完全であるか、１００％未満の精度である可能性がある。例えば、これは、コーディングタグが損傷しているか、欠陥があるため、プライマー伸長反応においてエラーが発生したためである。したがって、伸長記録タグは、その関連付けられたポリペプチドで発生した結合事象の１００％、または最大９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、６５％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、もしくはその部分範囲を表し得る。さらに、伸長記録タグに存在するコーディングタグ情報は、対応するコーディングタグに対して少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有し得る。
特定の実施形態において、結合剤は、ＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、介在アミノ酸、ジペプチド（２つのアミノ酸の配列）、トリペプチド（３つのアミノ酸の配列）、またはペプチド分子のより高次のペプチドに結合し得る。いくつかの実施形態において、結合剤のライブラリー中の各結合剤は、特定のアミノ酸、例えば、２０個の標準的な天然に存在するアミノ酸のうちの１つに選択的に結合する。標準的な天然アミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、スレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、結合剤は、未修飾または天然のアミノ酸に結合する。いくつかの例では、結合剤は、未修飾または天然のジペプチド（２つのアミノ酸の配列）、トリペプチド（３つのアミノ酸の配列）、またはペプチド分子のより高次のペプチドに結合する。結合剤は、天然または未修飾のＮＴＡＡに対する高い親和性、天然または未修飾のＮＴＡＡに対する高い特異性、あるいはその両方のために設計され得る。いくつかの実施形態において、結合剤は、ファージディスプレイを使用する有望な親和性足場の指向性進化を通じて開発することができる。
結合剤は、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質分子のＮ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または介在ペプチドに結合し得る。結合剤は、ペプチド分子のＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、または介在アミノ酸に結合し得る。結合剤は、Ｎ末端またはＣ末端のジアミノ酸部分に結合し得る。結合剤は、好ましくは、化学的に修飾または標識されたアミノ酸に結合し得る。例えば、結合剤は、好ましくは、前述の部分を持たないアミノ酸上で、アセチル部分、Ｃｂｚ部分、グアニル部分、ダンシル部分、ＰＴＣ部分、ＤＮＰ部分、ＳＮＰ部分、複素環メタニミン部分などで官能化されたアミノ酸に結合し得る。
特定の実施形態において、伸長記録タグは、複数の連続する結合事象を表す複数のコーディングタグからの情報を含み得る。これらの実施形態において、単一の連結された伸長記録タグは、単一のポリペプチドを表すことができる。本明細書で言及されるように、記録タグへのコーディングタグ情報の転送はまた、複数の連続する結合事象を含む方法において起こるような、伸長記録タグへの転送を含む。
特定の実施形態において、結合事象情報は、周期的にコーディングタグから記録タグに転送される。交差反応性結合事象は、２つ以上の独立した結合事象を識別する少なくとも２つの異なるコーディングタグが同じクラスの結合剤（特定のタンパク質と同族）にマッピングされることを要求することにより、配列決定後に情報から（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｌｌｙ）除外することができる。任意選択的なサンプルまたはコンパートメントバーコードは、任意選択的なＵＭＩ配列と同様に記録タグに含めることができる。コーディングタグには、エンコーダーおよびスペーサー配列と共に任意選択的なＵＭＩ配列を含めることもできる。ユニバーサルプライミング配列は、増幅およびＮＧＳシーケンシング用の伸長記録タグに含めることもできる。
特定の結合剤に関連するコーディングタグ情報は、さまざまな方法を使用して記録タグに転送され得る。特定の実施形態において、コーディングタグの情報は、プライマー伸長を介して記録タグに転送される（Ｃｈａｎ，ＭｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１５）。記録タグの３’末端のスペーサー配列または伸長記録タグは、コーディングタグの３’末端の相補的スペーサー配列とアニーリングし、ポリメラーゼ（例えば、鎖置換ポリメラーゼ）は、鋳型としてのアニーリングされたコーディングタグを使用して、記録タグ配列を伸長する。いくつかの実施形態において、コーディングタグエンコーダー配列および５’スペーサーに相補的なオリゴヌクレオチドをコーディングタグに事前にアニーリングして、伸長記録タグに存在する内部エンコーダーおよびスペーサー配列へのコーディングタグのハイブリダイゼーションを防ぐことができる。依然として一本鎖の状態であるコーディングタグ上の３’末端スペーサーは、好ましくは、記録タグ上の末端３’スペーサーに結合する。他の実施形態において、発生期の記録タグを一本鎖結合タンパク質でコーティングして、内部部位へのコーディングタグのアニーリングを防ぐことができる。あるいは、発生期の記録タグをＲｅｃＡ（またはｕｖｓＸなどの関連する相同体）でコーティングして、完全に二本鎖のコーディングタグへの３’末端の侵入を促進することもできる（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ ４９１：２７４－２７８）。この構成は、二本鎖コーディングタグが内部記録タグ要素と相互作用するのを防ぐが、伸長記録タグのＲｅｃＡコーティングされた３’テールによる鎖侵入の影響を受けやすくなる（Ｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｅｌｉｆｅ ４：ｅ０８６４６）。一本鎖結合タンパク質の存在は、鎖置換反応を促進する可能性がある。
いくつかの実施形態において、プライマー伸長のために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、３’－５エキソヌクレアーゼ活性が制限されたるか、または欠如する。このようなポリメラーゼの多くの例のいくつかには、クレノウエキソ－（ＤＮＡ Ｐｏｌ １のクレノウ断片）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼエキソ－、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼエキソ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０）、Ｐｆｕエキソ－、Ｖｅｎｔエキソ－、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔエキソ－、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラーゼ断片エキソ－、Ｂｃａ Ｐｏｌ、９°Ｎ Ｐｏｌ、およびＰｈｉ２９ Ｐｏｌエキソ－が含まれる。好ましい実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、室温および４５℃までで活性である。別の実施形態において、好熱性ポリメラーゼの「ウォームスタート」バージョンは、ポリメラーゼが活性化され、約４０℃～５０℃で使用されるように採用される。例示的なウォームスタートポリメラーゼは、Ｂｓｔ ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）である。
鎖置換複製に有用な添加剤には、Ｅ．ｃｏｌｉのＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２産物、ファージＴ７遺伝子２．５タンパク質、ファージＰｆ３ ＳＳＢ、複製タンパク質ＡＲＰＡ３２およびＲＰＡ１４サブユニット（Ｗｏｌｄ，１９９７）などの、細菌、ウイルス、または真核生物由来の多数の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢタンパク質）のうちのいずれか；アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純ヘルペスタンパク質ＩＣＰ８、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、ヘルペスウイルスＵＬ２９ＳＳＢ様タンパク質などの、他のＤＮＡ結合タンパク質；ファージＴ７ヘリカーゼ／プリマーゼ、ファージＴ４遺伝子４１ヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｅｐヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＢＣＤヘリカーゼ、ｒｅｃＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ、真核生物トポイソメラーゼ（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）７０：３６９－４１３）などの、ＤＮＡ複製に関与することが知られている多くの複製複合体タンパク質のうちのいずれかが含まれる。
再コーディング（ｒｅｃｏｄｉｎｇ）タグの末端スペーサー配列が伸長自己伸長をプライミングする場合などのミスプライミングまたは自己プライミング事象は、一本鎖結合タンパク質（Ｔ４遺伝子３２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＳＢなど）、ＤＭＳＯ（１～１０％）、ホルムアミド（１～１０％）、ＢＳＡ（１０～１００ｕｇ／ｍｌ）、ＴＭＡＣ１（１～５ｍＭ）、硫酸アンモニウム（１０～５０ｍＭ）、ベタイン（１～３Ｍ）、グリセロール（５～４０％）、またはエチレングリコール（５～４０％）をプライマー伸長反応に含めることによって最小限に抑えることができる。
クレノウエキソ－、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼエキソ－（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０）などのほとんどのタイプＡポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性（内因性または操作による除去）を欠いており、Ｔａｑポリメラーゼは、ヌクレオチド、好ましくはアデノシン塩基（配列との関連に応じて、程度は低いがＧ塩基）の、二重増幅産物の３’平滑末端への非鋳型的付加を触媒する。Ｔａｑポリメラーゼの場合、３’ピリミジン（Ｃ＞Ｔ）は非鋳型的アデノシン付加を最小限に抑えるが、３’プリンヌクレオチド（Ｇ＞Ａ）は鋳型化されていないアデノシンの付加を優先する。いくつかの実施形態において、プライマー伸長のためにＴａｑポリメラーゼを使用して、結合剤から遠位のスペーサー配列と、隣接するバーコード配列（例えば、エンコーダー配列またはサイクル特異的配列）との間のコーディングタグにおけるチミジン塩基の配置は、記録タグのスペーサー配列の３’末端に鋳型化されていないアデノシンヌクレオチドが散発的に含まれることに対応する。このようにして、伸長記録タグ（鋳型化されていないアデノシン塩基の有無にかかわらず）は、コーディングタグにアニーリングし、プライマー伸長を受けることができる。
あるいは、鋳型化されていない塩基の添加は、特にＯ－ヘリックス領域において、鋳型化されていない末端トランスフェラーゼ活性が１つ以上の点突然変異によって大幅に減少した突然変異体ポリメラーゼ（中温性または好熱性）を使用することによって減らすことができる（米国特許第７，５０１，２３７号を参照）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００２）３０（１９）：４３１４－４３２０）。３’エキソヌクレアーゼ欠損であり、鎖置換能を有するＰｆｕエキソ－も、鋳型化されていない末端トランスフェラーゼ活性を持たない。
別の実施形態において、ポリメラーゼ伸長緩衝液は、ｐＨ値６～９のＴｒｉｓ－アセテート、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳなどの４０～１２０ｍＭの緩衝剤から構成される。
伸長記録タグの末端スペーサー配列と伸長記録タグの内部領域との自己アニーリングによって開始される自己プライミング／ミスプライミング事象は、記録／伸長記録タグに疑似相補的塩基を含めることによって最小限に抑えることができる（Ｌａｈｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００８）３６：３４０９－３４１９）、（Ｈｏｓｈｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ（２０１０）４９（３２）：５５５４－５５５７）。疑似相補的塩基は、化学修飾の存在により、互いに二重鎖を形成するためのハイブリダイゼーション親和性が大幅に低下することを示す。しかしながら、多くの疑似相補的修飾塩基は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と強い塩基対を形成する可能性がある。特定の実施形態において、コーディングタグスペーサー配列は、複数のＡおよびＴ塩基から構成され、市販の疑似相補的塩基である２－アミノアデニンおよび２－チオチミンは、ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成を利用して記録タグに組み込まれる。追加の疑似相補的塩基は、疑似相補的ヌクレオチドを反応に加えることにより、プライマー伸長中に伸長記録タグに組み込むことができる（Ｇａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（２００６）４５（２２）：６９７８－８６）。
いくつかの実施形態において、溶液中のコーディングタグ標識結合剤と固定化タンパク質の記録タグとの非特異的相互作用を最小化するために、記録タグスペーサー配列に相補的な競合（ブロッキングとも呼ばれる）オリゴヌクレオチドを結合反応に加えて、非特異的な相互作用最小化することができる。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは比較的短い。過剰な競合オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長の前に結合反応から洗い流される。これにより、特にわずかに高い温度（３０～５０℃）にさらされた場合に、アニーリングされた競合オリゴヌクレオチドが記録タグから効果的に解離される。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長を防ぐために、その３’末端にターミネーターヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態において、コーディングタグは、ヘアピンを含み得る。特定の実施形態において、ヘアピンは、相互に相補的な核酸領域を含み、核酸鎖を介して接続される。いくつかの実施形態において、核酸ヘアピンはまた、二本鎖ステムセグメントから延びる３’および／または５’一本鎖領域（複数可）をさらに含み得る。いくつかの例では、ヘアピンは、一本鎖の核酸を含む。
特定の実施形態において、記録タグ上のスペーサー配列の、コーディングタグ上の相補的スペーサー配列へのアニーリングは、プライマー伸長反応条件下で準安定である（すなわち、アニーリングＴｍは、反応温度に類似する）。これにより、コーディングタグのスペーサー配列は、記録タグのスペーサー配列にアニーリングされたブロッキングオリゴヌクレオチドを置換することができる。
特定の結合剤に関連するコーディングタグ情報は、ライゲーションを介して記録タグに転送することもできる。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーションである可能性がある。ライゲーションは、酵素的ライゲーション反応である可能性がある。リガーゼの例としては、ＣＶ ＤＮＡリガーゼ（米国特許公開第ＵＳ２０１４／０３７８３１５号を参照）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏｌｉｇａｓｅ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、ライゲーションは、化学ライゲーション反応であり得る。この例証では、スペーサーのないライゲーションは、「記録ヘルパー」配列とコーディングタグ上のアームとのハイブリダイゼーションを使用することによって達成される。アニーリングされた補体配列は、標準的な化学ライゲーションまたは「クリック化学」を使用して化学的にライゲーションされる（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ（１９９８）８（１１）：１１４２－１１５３；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ（２０１０）（２２）：４１９４－４１９７；Ｅｌ－Ｓａｇｈｅｅｒｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（２０１１）１０８（２８）：１１３３８－１１３４３；Ｅｌ－Ｓａｇｈｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ（２０１１）９（１）：２３２－２３５；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ （２０１２）８４（１４）：６１０４－６１０９；Ｒｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２０１３）２１（１２）：３４５８－３４６４；Ｌｉｔｏｖｃｈｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｉｆ ＤＮＡ ＰＮＡ ＸＮＡ（２０１４）５（１）：ｅ２７８９６；Ｒｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１４）１０５０：１３１－１４１）。
別の実施形態において、ＰＮＡの転送は、公開された技術を使用する化学ライゲーションで達成することができる。ＰＮＡの構造は、５’Ｎ末端アミン基および非反応性３’Ｃ末端アミドを有するようなものである。ＰＮＡの化学ライゲーションでは、化学的に活性になるように末端を修飾する必要がある。これは通常、５’Ｎ末端をシステイニル部分で誘導体化し、３’Ｃ末端をチオエステル部分で誘導体化することによって行われる。このような修飾されたＰＮＡは、標準の天然化学ライゲーション条件を使用して簡単にカップリングする（Ｒｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２１：３４５８－３４６４）。
いくつかの実施形態において、コーディングタグ情報は、トポイソメラーゼを使用して転送することができる。トポイソメラーゼを使用して、記録タグ上のトポ荷電３’リン酸をコーディングタグ上の５’末端またはその補体にライゲーションすることができる（Ｓｈｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２６７８－３２６８４）。
本明細書に記載されるように、結合剤は、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合し得る。したがって、特定の実施形態において、伸長記録タグは、ポリペプチドのアミノ酸配列および翻訳後修飾に関連するコーディングタグ情報を含む。いくつかの実施形態において、内部の翻訳後修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、グリコシル化、スクシニル化、ユビキチン化、Ｓ－ニトロシル化、メチル化、Ｎ－アセチル化、脂質化など）の検出は、末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡまたはＣＴＡＡ）の検出および脱離の前に達成される。一例では、ペプチドは、ＰＴＭ修飾のために結合剤と接触され、関連するコーディングタグ情報は、記録タグに転送される。アミノ酸修飾に関連するコーディングタグ情報の検出および転送が完了すると、Ｎ末端またはＣ末端分解法を使用して一次アミノ酸配列のコーディングタグ情報を検出および転送する前に、ＰＴＭ修飾基を除去することができる。したがって、結果として得られる伸長記録タグは、一次アミノ酸配列情報と共に、ペプチド配列における翻訳後修飾の存在を示すが、連続した順序ではない。
いくつかの実施形態において、内部の翻訳後修飾アミノ酸の検出は、一次アミノ酸配列の検出と同時に行われ得る。一例では、ＮＴＡＡ（またはＣＴＡＡ）を、単独で、または結合剤のライブラリー（例えば、２０個の標準アミノ酸および選択された翻訳後修飾アミノ酸のための結合剤から構成されるライブラリー）の一部として、翻訳後修飾アミノ酸に特異的な結合剤と接触させる。末端アミノ酸の脱離および結合剤（または結合剤のライブラリー）との接触の連続サイクルが続く。したがって、結果として得られる伸長記録タグは、一次アミノ酸配列との関連では、翻訳後修飾の存在および順序を示す。
特定の実施形態において、記録タグのアンサンブルをポリペプチドごとに使用して、コーディングタグ情報転送の全体的な堅牢性および効率を改善することができる。単一の記録タグではなく、所与のポリペプチドと関連付けられた記録タグのアンサンブルを使用すると、コーディングタグと記録タグのカップリング率が高くなり、ライブラリーの全体的な収率が高くなる可能性があるため、ライブラリー構築の効率が向上する。単一の連結された伸長記録タグの収率は、連結の段階的な収率に直接依存するが、コーディングタグ情報を受け入れることができる複数の記録タグを使用すると、連結の指数関数的な損失を被らない。
変性タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの分析を含む実施形態において、結合した結合剤およびアニーリングされたコーディングタグは、高度に変性する条件（例えば、０．１～０．２Ｎ ＮａＯＨ、６Ｍ尿素、２．４Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、９５％ホルムアミドなど）を使用することにより、プライマー伸長後に除去することができる。
Ｃ．アミノ酸認識、記録タグ伸長、およびアミノ酸除去の循環ラウンドによるポリペプチドの特徴付け
特定の実施形態において、本開示で提供されるポリペプチドを分析するための方法は、ポリペプチドを複数の結合剤と接触させ、結合剤の連続的な結合により、核酸ベースのコーディングタグの形態における履歴的な結合情報を、ポリペプチドに関連付けられた少なくとも１つの記録タグに転送する複数の結合サイクルを含む。このようにして、複数の結合事象に関する情報を含むこれまでの記録が核酸形式で生成される。
特定の実施形態において、溶液中の結合剤の濃度は、アッセイのバックグラウンドおよび／または偽陽性の結果を低減するように制御される。
いくつかの実施形態において、結合剤の濃度は、任意の好適な濃度、例えば、約０．０００１ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１０００ｎＭであり得る。他の実施形態において、アッセイで使用される可溶性共役体の濃度は、約０．０００１ｎＭ～約０．００１ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約０．０１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、約２０ｎＭ～約５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１００ｎＭ～約２００ｎＭ、約２００ｎＭ～約５００ｎＭ、約５００ｎＭ～約１０００ｎＭ、または約１０００ｎＭを超える。
いくつかの実施形態において、可溶性結合剤分子と固定化ポリペプチドおよび／または記録タグとの比率は、任意の好適な範囲、例えば、約０．００００１：１、約０．０００１：１、約０．００１：１、約０．０１：１、約０．１：１、約１：１、約２：１、約５：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約５５：１、約６０：１、約６５：１、約７０：１、約７５：１、約８０：１、約８５：１、約９０：１、約９５：１、約１００：１、約１０４：１、約１０５：１、約１０６：１、もしくはそれ以上、または上記の比率の間の任意の比率であり得る。可溶性結合剤分子と固定化ポリペプチド（複数可）および／または記録タグ（複数可）とのより高い比率を使用して、結合および／またはコーディングタグ／記録タグ情報の転送を完了させることができる。これは、サンプル中の少量のポリペプチドを検出および／または分析するのに特に有用である可能性がある。
Ｎ末端分解によるアプローチを使用してペプチドまたはポリペプチドを分析する方法に関する実施形態では、第１の結合剤をｎ個のアミノ酸のペプチドのｎＮＴＡＡに接触させて結合し、第１の結合剤のコーディングタグ情報をペプチドと関連付けられた記録タグに転送し、それによって一次伸長記録タグを生成する。ｎＮＴＡＡは、本明細書に記載されるように脱離させる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド分析アッセイにおける修飾された切断酵素の使用は、標識されたＮＴＡＡを除去するためである。いくつかの態様において、セクションＩに記載される修飾された切断酵素のうちのいずれか２つ以上を組み合わせて使用して、標識されたＮＴＡＡを除去することができる。例えば、サンプルを、修飾された切断酵素の混合物で処理して、サンプル中のペプチド中のさまざまなＮＴＡＡの除去を達成することができる。修飾された切断酵素と接触させることによるｎ個の標識ＮＴＡＡの除去は、ペプチドのｎ－１個のアミノ酸をＮ末端アミノ酸に変換し、これは本明細書ではｎ－１ＮＴＡＡと呼ばれる。第２の結合剤をペプチドと接触させ、ｎ－１ＮＴＡＡに結合し、二次結合剤のコーディングタグ情報を一次伸長記録タグに転送し、それにより二次伸長記録タグを生成する（例えば、ペプチドを表す連結されたｎ次伸長記録タグを生成するため）か、または別の記録タグ（例えば、ペプチドを集合的に表す複数の伸長記録タグを生成するため）に転送する。修飾された切断酵素によるｎ標識ＮＴＡＡの脱離は、ペプチドのｎ－２個のアミノ酸をＮ末端アミノ酸に変換し、これは本明細書ではｎ－２ＮＴＡＡと呼ばれる。追加の結合、転送、標識および除去は、上記のように最大ｎ個のアミノ酸で起こり、ｎ次伸長記録タグまたは集合的にペプチドを表すｎ個の別個の伸長記録タグを生成する。本明細書で使用される場合、結合剤、コーディングタグ、または伸長記録タグに関して使用される場合のｎ「次（ｏｒｄｅｒ）」は、結合剤およびその関連付けられたコーディングタグが使用されるｎ回目の結合サイクル、または伸長記録タグが作製されるｎ回目の結合サイクルを指す。いくつかの実施形態において、記載された例示的なアプローチにおけるＮＴＡＡを含むステップは、代わりに、ＣＴＡＡを用いて実行され得る。
いくつかの実施形態において、第１の結合剤および第２の結合剤のポリペプチドへの接触および任意選択的に、任意のさらなる結合剤（例えば、第３の結合剤、第４の結合剤、第５の結合剤など）の接触が同時に行われる。例えば、第１の結合剤および第２の結合剤、および任意選択的に、任意のさらに高次の結合剤を一緒にプールして、例えば、結合剤のライブラリーを形成することができる。別の例では、第１の結合剤および第２の結合剤、ならびに任意選択的に、任意のさらに高次の結合剤が、一緒にプールされるのではなく、ポリペプチドに同時に添加される。一実施形態において、結合剤のライブラリーは、２０個の標準的な天然に存在するアミノ酸に選択的に結合する少なくとも２０個の結合剤を含む。
他の実施形態において、第１の結合剤および第２の結合剤、および任意選択的に、任意のさらに高次の結合剤を、各々、別個の結合サイクルでポリペプチドと接触させ、連続した順序で加える。特定の実施形態において、複数の結合剤は、同時に並行して使用される。この並行アプローチは、時間を節約し、（結合剤が競合しているために）同族結合剤によって結合される部位に、同族ではない結合剤が非特異的に結合するのを減らす。
本明細書に記載の方法によって生成される最終的な伸長記録タグの長さは、コーディングタグの長さ（例えば、エンコーダー配列およびスペーサー）、記録タグの長さ（例えば、固有分子識別子、スペーサー、ユニバーサルプライミング部位、バーコード）、実行された結合サイクルの数、ならびに各結合サイクルからのコーディングタグが同じ伸長記録タグに転送されるか、複数の伸長記録タグに転送されるか、を含む複数の要因に依存する。いくつかの例では、コーディングタグの両側に５個の塩基のスペーサーが隣接する、５個の塩基のエンコーダー配列がある場合、ペプチドの結合剤の履歴を表す最終的な伸長記録タグのコーディングタグ情報は１０個の塩基×劣化サイクルの数である。
最終結合サイクルおよび最終結合剤のコーディングタグ情報の伸長記録タグへの転送後、ライゲーション、プライマー伸長、または当技術分野で既知の他の方法を介してユニバーサルリバースプライミング部位を追加することにより、タグをキャップすることができる。いくつかの実施形態において、記録タグ内のユニバーサルフォワードプライミング部位は、最終的な伸長記録タグに付加されるユニバーサルリバースプライミング部位と適合性がある。いくつかの実施形態において、ユニバーサルリバースプライミング部位は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰ７プライマー（５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ－３’－配列番号４）またはＩｌｌｕｍｉｎａのＰ５プライマー（５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’－配列番号３）である。記録タグの鎖センスに応じて、センスまたはアンチセンスＰ７を付加することができる。伸長記録タグライブラリーは、固体支持体（例えば、ビーズ）から直接切断または増幅することができ、従来の次世代シーケンシングアッセイおよびプロトコルで使用することができる。
いくつかの実施形態において、プライマー伸長反応は、一本鎖伸長記録タグのライブラリー上で実行され、その相補鎖をコピーする。いくつかの実施形態において、ペプチド配列決定アッセイ（例えば、ＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅアッセイ）は、周期的進行におけるいくつかの化学的および酵素的ステップを含む。場合によっては、単一分子アッセイの１つの利点は、さまざまな周期的な化学的／酵素的ステップにおける非効率性に対する堅牢性である。いくつかの実施形態において、コーディングタグ配列に存在するサイクル特異的バーコードの使用は、アッセイに利点を与える。
Ｄ．タグの処理および分析
伸長記録タグおよび目的のポリペプチド（複数可）を表すその他のタグは、さまざまな核酸配列決定法を使用して処理および分析することができる。配列決定方法の例としては、チェーンターミネーションシーケンシング（サンガーシーケンシング）；合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシングなどの次世代シーケンシング方法；単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアベースのシーケンシング、デュプレックスインタラプテッドシーケンシング、高度な顕微鏡を使用したＤＮＡの直接イメージングなどの第３世代シーケンシング方法が含まれるが、これらに限定されない。
本発明で使用するのに好適な配列決定方法には、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、合成技術（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）およびＳｏｌｅｘａ（商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によるシーケンシング、ＳＭＲＴ（商標）（単一分子リアルタイム）技術（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、真の単一分子シーケンシング（例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、大規模並列次世代シーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳｏｌｅｘａおよびＨｉＳｅｑ（商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、大規模並列半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）、およびパイロシーケンシングテクノロジー（例えば、ＧＳＦＬＸおよびＧＳＪｕｎｉｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ／４５４）、ならびにナノポアシーケンシング（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、さまざまな方式で増幅することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、例えばＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲにより、指数関数的に増幅される可能性がある。エマルジョンＰＣＲは、より均一な増幅をもたらすことが知られている（Ｈｏｒｉ，Ｆｕｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（２００７）３５２（２）：３２３－３２８）。あるいは、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する鋳型ＤＮＡのインビトロ転写を介して、線形増幅を受けることができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、そこに含まれるユニバーサルフォワードプライミング部位およびユニバーサルリバースプライミング部位と適合性のあるプライマーを使用して増幅することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、テールプライマーを使用して増幅し、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの５’末端もしくは３’末端、または両末端に配列を追加することもできる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの終端に追加することができる配列には、ライブラリーに固有のインデックス配列が含まれ、１回の配列決定の実行で複数のライブラリー、アダプター配列、リードプライマー配列、またはその他の配列を多重化して、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーをシーケンシングプラットフォームと適合性のあるものにすることができる。次世代シーケンシングの調製におけるライブラリー増幅の例は次の通りである：約１ｍｇのビーズ（約１０ｎｇ）、２００μＭのｄＮＴＰ、１μＭの各フォワードおよびリバース増幅プライマー、０．５μｌ（１Ｕ）のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から溶出された伸長記録タグライブラリーを使用して２０μｌのＰＣＲ反応容量を設定し、サイクル条件：９８°Ｃで３０秒間、続いて９８°Ｃで１０秒間、６０°Ｃで３０秒間、７２°Ｃで３０秒間、７２°Ｃで７分間を２０サイクルにさらし、その後４°Ｃで保持する。
特定の実施形態において、増幅前、増幅中、または増幅後のいずれかで、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、標的濃縮を受けることができる。いくつかの実施形態において、標的濃縮を使用して、配列決定の前に、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーから目的のポリペプチドを表す伸長記録タグを選択的に捕捉または増幅することができる。いくつかの態様において、標的タンパク質に対して高度に特異的な結合剤を産生する際の費用が高く、かつ困難であるために、タンパク質配列決定のための標的濃縮は難解である。場合によっては、抗体は非特異的であり、何千ものタンパク質にまたがって生産を拡大することが難しいことで有名である。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、タンパク質コードを核酸コードに変換することによってこの問題を回避し、核酸コードは、次に、ＤＮＡライブラリーに利用可能な広範囲の標的ＤＮＡ濃縮戦略を利用することができる。場合によっては、対応する伸長記録タグを濃縮することにより、目的のペプチドをサンプルで濃縮することができる。標的濃縮の方法は当技術分野で既知であり、ハイブリッド捕捉アッセイ、ＴｒｕＳｅｑカスタムＡｍｐｌｉｃｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）などのＰＣＲベースのアッセイ、パドロックプローブ（分子反転プローブとも呼ばれる）などが含まれる（Ｍａｍａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：１１１－１１８；Ｂｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈ．（２０１３）２４：７３－８６；Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ３５７－３７２；Ｍｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：３７４－３８６；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０８５－８（その各々は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。
一実施形態において、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、ハイブリッド捕捉ベースのアッセイにより濃縮される。ハイブリッド捕捉ベースのアッセイでは、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーが、アフィニティータグ（ビオチンなど）で標識された標的特異的オリゴヌクレオチドまたは「ｂａｉｔオリゴヌクレオチド」にハイブリダイズする。ターゲット特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを、親和性リガンド（ストレプトアビジンコーティングビーズなど）を使用して、親和性タグを介して「プルダウン」し、バックグラウンド（非特異的）伸長記録タグを洗い流す。次に、濃縮された伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグが、正の濃縮（例えば、ビーズから溶出される）のために得られる。
アレイベースの「源位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）」オリゴヌクレオチド合成およびそれに続くオリゴヌクレオチドプールの増幅によって合成されたｂａｉｔオリゴヌクレオチドの場合、所与のオリゴヌクレオチドアレイ内でユニバーサルプライマーのいくつかのセットを使用することにより、競合するｂａｉｔをプールに組み込むことができる。ユニバーサルプライマーのタイプごとに、ビオチン化プライマーと非ビオチン化プライマーの比率が濃縮比を制御する。いくつかのプライマータイプを使用することで、いくつかの濃縮比を最終的なオリゴヌクレオチドｂａｉｔのプールにおいて設計することができる。
ｂａｉｔオリゴヌクレオチドは、目的のポリペプチドを表す伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグに相補的であるように設計することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのスペーサー配列に対するｂａｉｔオリゴヌクレオチドの相補性の程度は、０％～１００％、およびその間の任意の整数であり得る。このパラメータは、いくつかの濃縮実験によって簡単に最適化することができる。いくつかの実施形態において、エンコーダー配列に対するスペーサーの長さは、コーディングタグ設計において最小化されるか、またはスペーサーは、それらがｂａｉｔ配列へのハイブリダイゼーションに利用不可であるように設計される。１つのアプローチは、補因子の存在下で二次構造を形成するスペーサーを使用することである。このような二次構造の例は、Ｇ－四重鎖であり、これは、２つ以上のグアニンカルテットが互いに積み重ねられて形成された構造である（Ｂｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ（２０１２）１３（１１）：７７０－７８０）。グアニンカルテットは、フーグスティーン水素結合を介して結合する４つのグアニン塩基によって形成される正方形の平面構造である。Ｇ－四重鎖構造は、カチオン、例えばＫ＋イオンとＬｉ＋イオンの存在下で安定化される。
使用するｂａｉｔオリゴヌクレオチドの個数を最小限に抑えるために、各タンパク質からの比較的固有のペプチドのセットを生物情報学的に識別することができ、目的のペプチドの対応する伸長記録タグライブラリー表現に相補的なｂａｉｔオリゴヌクレオチドのみがハイブリッド捕捉アッセイで使用される。いくつかの実施形態において、同じまたは異なるｂａｉｔセットを用いて、連続的なラウンドまたは濃縮を実施することもできる。
その断片（ペプチドなど）を表す伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリー内のポリペプチドの全長を濃縮するために、タンパク質の核酸表現全体にわたって「タイル状」のｂａｉｔオリゴヌクレオチドを設計することができる。
別の実施形態において、プライマー伸長およびライゲーションベースの媒介増幅濃縮（ＡｍｐｌｉＳｅｑ、ＰＣＲ、ＴｒｕＳｅｑ ＴＳＣＡなど）を使用して、ポリペプチドのサブセットを表すライブラリー要素の濃縮画分を選択およびモジュール化することができる。競合するオリゴヌクレオチドを使用して、プライマーの伸長、ライゲーション、または増幅の程度を調整することもできる。最も単純な実施において、これは、ユニバーサルプライマーテールを含む標的特異的プライマーと５’ユニバーサルプライマーテールを欠く競合プライマーとの混合物を有することによって達成することができる。最初のプライマー伸長後、５’ユニバーサルプライマー配列を持つプライマーのみを増幅することができる。ユニバーサルプライマー配列がある場合とない場合のプライマーの比率は、増幅される標的の割合を制御する。他の実施形態において、ハイブリダイズするが非伸長性であるプライマーを含めることを使用して、プライマー伸長、ライゲーション、または増幅を受けるライブラリー要素の割合を調節することができる。
ターゲットエンリッチメント法を負の選択モードで使用して、配列決定の前にライブラリーから伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを選択的に削除することもできる。したがって、ビオチン化ｂａｉｔオリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジンコーティングビーズを使用する上記の例では、ビーズに結合したｂａｉｔオリゴヌクレオチド：伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグハイブリッドが分析されていない間、上清を配列決定のために保持する。除去することができる望ましくない伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの例は、例えば、タンパク質、アルブミン、免疫グロブリンなどのために、過剰に豊富なポリペプチド種を表すものである。
標的にハイブリダイズするがビオチン部分を欠く競合オリゴヌクレオチドｂａｉｔをハイブリッド捕捉ステップで使用して、濃縮された特定の遺伝子座の画分を調節することもできる。競合オリゴヌクレオチドｂａｉｔは、濃縮中にプルダウンされたターゲットの割合を効果的に調節する標準的なビオチン化ｂａｉｔと、ターゲットへのハイブリダイゼーションをめぐって競合する。タンパク質発現の１０桁のダイナミックレンジは、特にアルブミンなどの過剰に豊富な種の場合、この競合抑制アプローチを使用して数桁圧縮することができる。したがって、標準的なハイブリッド捕捉と比較して、特定の遺伝子座に対して捕捉されたライブラリー要素の割合は、１００％～０％の濃縮に下方調整することができる。
さらに、ライブラリーの正準化手法を使用して、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグライブラリーから過剰に豊富な種を削除することができる。このアプローチは、トリプシン、ＬｙｓＣ、ＧｌｕＣなどの部位特異的プロテアーゼ消化によって生成されたペプチドに由来する定義された長さのライブラリーに最適である。一例では、正準化は、二本鎖ライブラリーを変性させ、ライブラリー要素を再アニーリングさせることによって達成することができる。二分子ハイブリダイゼーション速度論の二次速度定数により、豊富なライブラリー要素は、豊富でない要素よりも迅速に再アニーリングする（Ｂｏｃｈｍａｎ，Ｐａｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．２０１２）。ｓｓＤＮＡライブラリー要素は、ヒドロキシアパタイトカラムでのクロマトグラフィー（ＶａｎｄｅｒＮｏｏｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５３：３７３－３８０）、またはｄｓＤＮＡライブラリー要素を破壊するタラバガニ（Ｓｈａｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１９３５－４２）からの二重特異性ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）によるライブラリーの処理などの当技術分野で既知の方法を使用して、豊富なｄｓＤＮＡライブラリー要素から分離することができる。
固体支持体に付着する前のポリペプチドおよび／または結果として得られる伸長記録タグライブラリーの分画、濃縮、および減算法の任意の組み合わせにより、シーケンシングリードを節約し、低豊度種の測定を改善することができる。
いくつかの実施形態において、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、ライゲーションまたは末端相補的ＰＣＲによって連結されて、複数の異なる伸長レコーダー（ｒｅｃｏｒｄｅｒ）タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを含む長いＤＮＡ分子を作製する（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，（２００３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３５：６６－７２；Ｍｕｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １６：８３７－８４１；米国特許第５，８３４，２５２号（その各々は参照によりその全体が組み込まれる））。この実施形態は、ＤＮＡの長い鎖がナノポアシーケンシングデバイスによって分析されるナノポアシーケンシングにとって好ましい。
いくつかの実施形態において、直接単一分子分析は、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグで実行される（例えば、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１０６－１０９を参照）。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグは、フローセルまたはフローセル表面へのロードに適合性のあるビーズ（任意選択的に、マイクロセルパターン化）などの固体支持体上で直接分析することができる。フローセルまたはビーズは、単一分子シーケンサーまたは単一分子デコード機器と統合され得る。単一分子のデコーディングの場合、デコーディングオリゴヌクレオチドのプールされた蛍光標識された数ラウンドのハイブリダイゼーション（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：９７０－７）を使用して、伸長記録タグ内のコーディングタグの同一性および順序の両方を確認することができる。いくつかの実施形態において、結合剤は、上記のようにサイクル特異的コーディングタグで標識することができる（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：９７０－７も参照）。サイクル固有のコーディングタグは、単一のポリペプチドを表す単一の連結された伸長記録タグ、または単一のポリペプチドを表す伸長記録タグの集合の両方に対して機能する。
伸長レポータータグ、伸長コーディングタグまたはジタグライブラリーの配列に続いて、結果として得られる配列は、ＵＭＩによって折りたたまれ、対応するポリペプチドと関連付けられ、プロテオーム全体にアラインメントされる。結果として生じる配列はまた、それらのコンパートメントタグによって折り畳まれ、それらの対応するコンパートメントプロテオームと関連付けられることができ、これは、特定の実施形態において、単一または非常に限られた数のタンパク質分子のみを含む。タンパク質の識別および定量化はいずれも、このデジタルペプチド情報から簡単に導き出すことができる。
いくつかの実施形態において、コーディングタグ配列は、特定の配列決定分析プラットフォームのために最適化することができる。特定の実施形態において、シーケンシングプラットフォームはナノポアシーケンシングである。いくつかの実施形態において、シーケンシングプラットフォームは、＞１％、＞５％、＞１０％、＞１５％、＞２０％、＞２５％、または＞３０％の１塩基あたりのエラー率を有する。例えば、ナノポアシーケンシング機器を使用して伸長記録タグを分析する場合、バーコード配列（例えば、エンコーダー配列）は、ナノポアを通過する際に最適に電気的に区別可能に設計することができる。ナノポアシーケンシングの単一塩基精度はまだかなり低い（７５％～８５％）ことを考えると、本明細書に記載の方法によるペプチドシーケンシングはナノポアシーケンシングに適している可能性があるが、「エンコーダー配列」の決定ははるかに正確であるはずである（＞９９％）。さらに、デュープレックスインタラプテッドナノポアシーケンシング（ＤＩ）と呼ばれる手法を、分子モーターを必要とせずにナノポアストランドシーケンシングで用いることができるため、システム設計が大幅に簡素化される（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ （２０１０）１０７（３７）：１６０６０－１６０６５）。ＤＩナノポアシーケンシングによる伸長記録タグの読み出しには、連結された伸長記録タグライブラリーのスペーサー要素を相補的なオリゴヌクレオチドでアニーリングする必要がある。本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドは、得られる二本鎖の有効Ｔｍを増加させるために、ＬＮＡ、または他の修飾された核酸または類似体を含み得る。これらの二本鎖スペーサー領域で装飾された一本鎖伸長記録タグが細孔を通過すると、二本鎖領域は狭窄ゾーンで一時的に失速し、二本鎖領域に隣接する約３つの塩基の電流読み出しを可能にする。ＤＩナノポアシーケンシングの特定の実施形態において、エンコーダー配列は、スペーサー要素に隣接する３つの塩基が最大限に電気的に識別可能なナノポアシグナルを生成するように設計される（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ （２０１０）１０７（３７）：１６０６０－１６０６５）。モーターフリーＤＩ配列の代わりに、スペーサー要素は、Ｇ－カルテットなどの二次構造を採用するように設計することができ、この構造は、隣接するエンコーダー配列の読み出しを可能にするナノポアを通過するときに、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを一時的に失速させる（Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００９）３７（３）：９７２－９８２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１６）８，５２４－５３５）。ストールを通過した後、次のスペーサーは、再び一時的なストールを作製し、次のエンコーダー配列の読み出しなどを可能にする。
本明細書に開示される方法は、複数のポリペプチドの同時（多重化）の検出、定量化および／または配列決定を含む分析に使用することができる。本明細書で使用される多重化は、同じアッセイにおける複数のポリペプチドの分析を指す。複数のポリペプチドは、同じサンプルまたは異なるサンプルに由来し得る。複数のポリペプチドは、同じ対象または異なる対象に由来し得る。分析される複数のポリペプチドは、異なるポリペプチド、または異なるサンプルに由来する同じポリペプチドであり得る。複数のポリペプチドには、２つ以上のポリペプチド、５個以上のポリペプチド、１０個以上のポリペプチド、５０個以上のポリペプチド、１００個以上のポリペプチド、５００個以上のポリペプチド、１０００個以上のポリペプチド、５，０００個以上のポリペプチド、１０，０００個以上のポリペプチド、５０，０００個以上のポリペプチド、１００，０００個以上のポリペプチド、５００，０００個以上のポリペプチド、または１，０００，０００個以上のポリペプチドが含まれる。
サンプルの多重化は、タグで標識されたポリペプチドサンプルを記録する事前のバーコーディングによって実現することができる。各バーコードは異なるサンプルを表し、周期的結合アッセイまたは配列分析の前にサンプルをプールすることができる。このようにして、多くのバーコード標識サンプルを単一のチューブで同時に処理することができる。このアプローチは、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）で実施されるイムノアッセイを大幅に改良したものである（Ａｋｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２０１４）１３（７）：１６２５－１６４３；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ（２０１５）９：３５１９－３５２７；Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ（２０１６）３１（１）：３５－４５）。このように、本開示は、本質的に、単純なワークフローで、ＲＰＰＡアッセイに代わる高度にデジタル化されたサンプルおよび分析物の多重化された代替物を提供する。
ＩＶ．キットおよび関連製品
本明細書において提供されるのは、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む１つ以上の修飾された切断酵素と、ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するための試薬と、を含む、キットである。いくつかの態様において、修飾された切断酵素は、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または、修飾された切断酵素は、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去する。いくつかの実施形態において、キットはまた、分析および／または配列決定のためにポリペプチドを処理するための試薬を使用するための説明書を含む。いくつかの実施形態において、（例えば、セクションＩに記載されるような）１つ以上の修飾された切断酵素を含むキットは、配列決定および／または分析のためのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を処理する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、タンパク質分析は、分子認識事象のバーコーディングおよび核酸コーディング、ならびに／または検出可能な標識を使用する。いくつかの実施形態において、キットはまた、タグ（例えば、ＤＮＡタグまたはＤＮＡ記録タグ）、固体支持体、ならびにポリペプチドを調製するための他の試薬およびポリペプチド分析のための他の試薬を含む、ポリペプチドを処理して分析するための他の成分を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、２つ以上の修飾された切断酵素を含む。場合によっては、さまざまな修飾された切断酵素は、異なる特徴、例えば、ポリペプチドの結合および／またはアミノ酸の切断に対する選好を示し得る。いくつかの実施形態において、２つ以上の修飾された切断酵素を、酵素の混合物として、または容器内の各修飾された切断酵素と別々に、キットに含めてもよい。いくつかの実施形態では、さまざまな修飾された切断酵素を、同時にまたは連続してポリペプチドと接触させる。
いくつかの実施形態において、キットはまた、ＮＴＡＡを脱離させるための１つ以上の追加の酵素（例えば、プロリンアミノペプチダーゼ）を含む。いくつかの特定の例では、追加の酵素は、プロリンアミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ（ＰＩＰ）、またはピログルタメートアミノペプチダーゼ（ｐＧＡＰ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾された切断酵素は、他の酵素と組み合わせてキットに含まれる。場合によっては、修飾された切断酵素および他の酵素は、カクテルとしてキットに含まれる。
いくつかの実施形態において、キットはまた、所望の反応が起こるのに必要な基質、イオン、および因子を含む１つ以上の緩衝液または反応流体を含む。洗浄緩衝液、反応緩衝液、および結合緩衝液、溶出緩衝液などを含む緩衝液は、当業者に知られている。いくつかの実施形態において、修飾された切断酵素はメタロペプチダーゼであり、キットは、修飾された切断酵素の活性化に必要な金属イオンを含む緩衝液を含む。いくつかの例では、キットは、修飾された切断酵素の活性化に必要な金属イオン、例えば、亜鉛イオンまたは塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態において、キットは、修飾された切断酵素を不活性化するための金属キレート剤または他の試薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の他の試薬に付随する緩衝液および他の成分をさらに含む。試薬、緩衝液、および他の成分は、バイアル（密封されたバイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラー（Ｍｙｌａｒ）またはビニール袋）などで提供され得る。キットの構成要素はいずれも滅菌および／または密封することができる。
いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の結合剤をさらに含み、各結合剤は、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む。場合によっては、キットは、２つ以上の結合剤を含む。いくつかの例では、キットは、結合剤のライブラリーを含む。いくつかの実施形態において、２つ以上の結合剤は、個々の容器に入れて、または容器内の混合物として、提供され得る。いくつかの実施形態において、キットは、コーディングタグの識別情報をポリペプチドに付着した記録タグに転送するための試薬をさらに含み、識別情報の記録タグへの転送により、ポリペプチド上に伸長記録タグが生成される。場合によっては、識別情報を転送するための試薬は、化学ライゲーション試薬または生物学的ライゲーション試薬である可能性がある。
いくつかの実施形態において、キットは、伸長記録タグを増幅するための増幅試薬をさらに含む。
いくつかの実施形態において、キットは、ビーズ、多孔質ビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、回転干渉測定ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁性ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、ミクロスフェア、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される固体支持体をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、複数の基質を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、核酸配列決定分析のための１つ以上の試薬を含む。いくつかの例では、配列分析用の試薬は、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアベースのシーケンシング、または高度な顕微鏡を使用するＤＮＡのダイレクトイメージング、またはそれらの任意の組み合わせにおいて使用されるためのものである。
いくつかの実施形態において、キットまたは製造品は、本明細書に記載の方法および使用に関する説明書（複数可）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、説明書は、本明細書において提供される修飾された切断酵素を含む、ポリペプチドを調製および処理する方法に向けられている。本明細書に記載のキットはまた、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射器、および本明細書に記載の任意の方法を実行するための説明書を伴う添付文書を含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含み得る。
上記のキット構成要素のうちのいずれか、および任意の分子、分子複合体もしくは共役体、試薬（例えば、修飾された切断酵素を含む化学的または生物学的試薬）、薬剤、構造（例えば、支持体、表面、粒子、もしくはビーズ）、反応中間体、反応生成物、結合複合体、または例示的なキットおよび方法で開示および／または使用される任意の他の製品は、キットを形成するために別個にまたは任意の好適な組み合わせで提供され得る。キットは、任意選択的に、修飾された切断酵素を使用するための説明書を含み得る。
Ｖ．例示的な実施形態
提供される実施形態の中には、以下のものがある。
１．突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された切断酵素であって、
修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成されるか、あるいは
修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成される、修飾された切断酵素。
２．ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素が、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される、実施形態１の修飾された切断酵素。
３．トリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素が、ポリペプチドの最後から２番目の末端標識アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される、実施形態１の修飾された切断酵素。
４．修飾された切断酵素が、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のアミド結合と相互作用する活性部位を含む、実施形態１～３のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
５．未修飾の切断酵素が、メタロペプチダーゼ、亜鉛依存性メタロペプチダーゼ、または亜鉛依存性ヒドロラーゼからなる群から選択される、実施形態１～４のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
６．未修飾の切断酵素が、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である、実施形態１～５のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
７．未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼである、実施形態１～６のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
８．未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ３、ジペプチジルペプチダーゼ５、ジペプチジルペプチダーゼ７、ジペプチジルペプチダーゼ１１、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ、またはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩである、実施形態１～７のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
９．標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を含む、実施形態１～８のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
１０．標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）を含む、実施形態１～８のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
１１．末端アミノ酸が、化学もしくは酵素試薬または部分で標識されている、実施形態１～１０のうちのいずれかの修飾された切断酵素。
１２．標識が、ブロックアミノ酸を含む、実施形態１～１１のうちのいずれかの修飾された切断酵素。
１３．標識が、外因性アミノ酸を含む、実施形態１～１２のうちのいずれかの修飾された切断酵素。
１４．標識が、化学標識を含む、実施形態１～１３のうちのいずれかの修飾された切断酵素。
１５．化学試薬が、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）、ニトロ－ＰＩＣ、スルホ－ＰＩＣ、Ｃｂｚ－Ｃｌ（クロロギ酸ベンジル）またはＣｂｚ－ＯＳｕ（ベンジルオキシカルボニルＮ－スクシンイミド）、カルボキシル活性化アミノブロックアミノ酸、無水物、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ－Ｃｌ、または１－ジメチルアミノナフタレン－５－スルホニルクロリド）、４－スルホニル－２－ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、２－ピリジンカルボキシアルデヒド、２－ホルミルフェニルボロン酸、２－アセチルフェニルボロン酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ペンタフルオロフェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、３－（カルボン酸）－フェニルイソチオシアネート、３－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、１－ナフチルイソチオシアネート、Ｎ－ニトロイミダゾール－１－カルボキシミダミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（ピバロイル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビス（ベンジルオキシカルボニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、チオベンジル化試薬、および二複素環メタニミン試薬、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１１の修飾された切断酵素。
１６．化学試薬が、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物、アザイサト酸無水物、コハク酸無水物、またはそれらの誘導体である、実施形態１１の修飾された切断酵素。
１７．化学試薬がからなる群から選択され、化学試薬が、４－ニトロフェニルアントラニレート、Ｎ－メチル－イサト酸無水物、Ｎ－アセチル－イサト酸無水物、４－カルボン酸イサト酸無水物、５－メトキシ－イサト酸無水物、５－ニトロ－イサト酸無水物、４－クロロ－イサト酸無水物、４－フルオロ－イサト酸無水物、６－フルオロ－イサト酸無水物、Ｎ－ベンジル－イサト酸無水物、４－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、５－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、４－ニトロ－イサト酸無水物、４－メトキシ－イサト酸無水物、５－アミノ－２－フルオロ－イソニコチン無水物（６－フルオロ－１Ｈ－ピリド［３，４－ｄ］［１，３］オキサジン－２，４－ジオン）、３，６，ジフルオロフタル酸無水物、および２，３ピラジンジカルボン酸無水物、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１６の修飾された切断酵素。
１８．修飾された切断酵素が、未修飾の切断酵素と少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、実施形態１～１７のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
１９．突然変異が、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～１８のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２０．ポリペプチドの長さが、４個のアミノ酸を超える、５個のアミノ酸を超える、６個のアミノ酸を超える、７個のアミノ酸を超える、８個のアミノ酸を超える、９個のアミノ酸を超える、１０個のアミノ酸を超える、１１個のアミノ酸を超える、１２個のアミノ酸を超える、１３個のアミノ酸を超える、１４個のアミノ酸を超える、１５個のアミノ酸を超える、２０個のアミノ酸を超える、２５個のアミノ酸を超える、または３０個のアミノ酸を超える、実施形態１～１９のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２１．ポリペプチドの長さが、１０個のアミノ酸を超える、実施形態１～２０のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２２．修飾された切断酵素が、その基質結合部位内に修飾を含む、実施形態１～２１のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２３．修飾された切断酵素が、その触媒ドメイン内に修飾を含む、実施形態１～２２のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２４．修飾された切断酵素が、そのキモトリプシンフォールド内に修飾を含む、実施形態１～２３のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２５．修飾された切断酵素が、アミン結合部位に修飾を含む、実施形態１～２４のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２６．修飾された切断酵素が、そのループドメインに修飾を含む、実施形態１～２５のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２７．修飾された切断酵素が、修飾された切断酵素の前記活性部位へのアクセス可能性を改善するための修飾を含む、実施形態１～２６のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２８．修飾された切断酵素が、配列番号１３または２０に規定されるようなジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩまたはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩに由来する、実施形態１～２７のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
２９．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、もしくは少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列、またはその特異的結合断片を含む、実施形態１～２８のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３０．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８のうちのいずれかに記載のアミノ酸の配列、もしくは配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列、またはその特異的結合断片を含む、実施形態１～２９のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３１．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１～３０のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３２．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、実施形態１～３１のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３３．１つ以上のアミノ酸置換が、Ａ１２６Ｔ、Ｄ１８８Ｖ、Ｉ１８９Ａ、Ｄ１９０Ｓ、Ｎ１９１Ｃ、Ｎ１９１Ｆ、Ｎ１９１Ｌ、Ｎ１９１Ｍ、Ｎ１９１Ｒ、Ｎ１９１Ｓ、Ｎ１９１Ｔ、Ｎ１９１Ｖ、Ｗ１９２Ｆ、Ｗ１９２Ｇ、Ｗ１９２Ｌ、Ｒ１９６Ｈ、Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１９６Ｓ、Ｒ１９６Ｔ、Ｒ１９６Ｖ、Ｇ２３８Ｖ、Ａ３０２Ｗ、Ｎ３０６Ａ、Ｎ３０６Ｇ、Ｎ３０６Ｒ、Ｎ３０６Ｓ、Ｔ３０７Ｋ、Ｎ３１０Ｄ、Ｎ３１０Ｇ、Ｎ３１０Ｋ、Ｎ３１０Ｌ、Ｎ５２５Ｋ、Ａ５２８Ｖ、Ｆ５４６Ｌ、Ａ６０４Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｇ、Ｄ６５０Ｓ、Ｇ６５１Ｈ、Ｇ６５１Ｔ、Ｇ６５１Ｖ、Ｇ６５１Ｙ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｔ、Ｖ６５６Ｅ、Ｖ６５６Ｇ、Ｖ６５６Ｓ、Ｋ６６５Ｉ、Ｋ６９２Ｎ、および／またはそれらの保存的アミノ酸置換である、実施形態１～３２のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３４．１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｄ１８８Ｖ／Ｉ１８９Ａ／Ｄ１９０Ｓ／Ｎ１９１Ｌ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｓ／Ａ３０２Ｗ／Ｎ３１０Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｔ３０７Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ５２５Ｋ／Ａ５２８Ｖ／Ａ６０４Ｖ／Ｄ６５０Ａ／Ｋ６９２Ｎ、Ａ１２６Ｔ／Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｇ２３８Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｆ５４６Ｌ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ／Ｋ６６５Ｉ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｒ１９６Ｋ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｆ／Ｗ１９２Ｆ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｇ／Ｇ６５１Ｈ／Ｖ６５６Ｅ、Ｎ１９１Ｒ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｓ／Ｎ３１０Ｌ／Ｇ６５１Ｔ／Ｓ６５５Ｔ／Ｖ６５６Ｓ、Ｎ１９１Ｓ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｔ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｍ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｖ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｓ、またはＮ１９１Ｓ／Ｎ３０６Ｇ／Ｄ６５０Ｓである、実施形態１～３３のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３５．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９の配列のうちのいずれかの基質特異性を示す、実施形態１～３４のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３６．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの触媒ドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有する触媒ドメインを含むアミノ酸配列を含む、実施形態１～３５のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３７．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかのアミン結合部位と、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミン結合部位を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１～３６のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３８．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかのループドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するループドメインと、を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１～３７のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
３９．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および／または２０２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１～３８のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
４０．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、３０２、および／または３１０に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１～３８のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
４１．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１９１、１９２、１９６、３０６、３１０、６２７、６２８、６３０、６４８、６５０、６５１、６５５、６５６、および／または６６９に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１～３８のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
４２．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置３２３～５４４のうちのいずれかに対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１～３８のうちのいずれか１つの修飾された切断酵素。
４３．ポリペプチドを処理する方法であって、ポリペプチドを、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と接触させることを含み、
修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成されるか、あるいは
修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成される、方法。
４４．ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素が、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される、実施形態４３の方法。
４５．修飾された切断酵素が、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のアミド結合と相互作用する活性部位を含む、実施形態４３または実施形態４４の方法。
４６．単一の標識末端アミノ酸または単一の標識末端ジペプチドの除去が、ポリペプチドの新たな末端アミノ酸を露出させる、実施形態４３～４５のうちのいずれか１つの方法。
４７．未修飾の切断酵素が、メタロペプチダーゼ、亜鉛依存性メタロペプチダーゼ、または亜鉛依存性ヒドロラーゼからなる群から選択される、実施形態４３～４６のうちのいずれか１つの方法。
４８．未修飾の切断酵素が、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である、実施形態４３～４７のうちのいずれか１つの方法。
４９．未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼである、実施形態４３～４８のうちのいずれか１つの方法。
５０．未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ３、ジペプチジルペプチダーゼ５、ジペプチジルペプチダーゼ７、ジペプチジルペプチダーゼ１１、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ、またはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩである、実施形態４３～４９のうちのいずれか１つの方法。
５１．標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を含む、実施形態４３～５０のうちのいずれか１つの方法。
５２．標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）を含む、実施形態４３～５０のうちのいずれか１つの方法。
５３．修飾された切断酵素が、未修飾の切断酵素と少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、実施形態４３～５２のうちのいずれか１つの方法。
５４．突然変異が、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態４３～５３のうちのいずれか１つの方法。
５５．ポリペプチドの長さが、４個のアミノ酸を超える、５個のアミノ酸を超える、６個のアミノ酸を超える、７個のアミノ酸を超える、８個のアミノ酸を超える、９個のアミノ酸を超える、１０個のアミノ酸を超える、１１個のアミノ酸を超える、１２個のアミノ酸を超える、１３個のアミノ酸を超える、１４個のアミノ酸を超える、１５個のアミノ酸を超える、２０個のアミノ酸を超える、２５個のアミノ酸を超える、または３０個のアミノ酸を超える、実施形態４３～５４のうちのいずれか１つの方法。
５６．ポリペプチドの長さが、１０個のアミノ酸を超える、実施形態４３～５５のうちのいずれか１つの方法。
５７．修飾された切断酵素が、その基質結合部位内に修飾を含む、実施形態４３～５６のうちのいずれか１つの方法。
５８．修飾された切断酵素が、その触媒ドメイン内に修飾を含む、実施形態４３～５７のうちのいずれか１つの方法。
５９．修飾された切断酵素が、そのキモトリプシンフォールド内に修飾を含む、実施形態４３～５８のうちのいずれか１つの方法。
６０．修飾された切断酵素が、アミン結合部位に修飾を含む、実施形態４３～５９のうちのいずれか１つの方法。
６１．修飾された切断酵素が、そのループドメインに修飾を含む、実施形態４３～６０のうちのいずれか１つの方法。
６２．修飾された切断酵素が、修飾された切断酵素の活性部位へのアクセス可能性を改善するための修飾を含む、実施形態４３～６１のうちのいずれか１つの方法。
６３．修飾された切断酵素が、配列番号１３または２０に規定されるようなジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩまたはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩに由来する、実施形態４３～６２のうちのいずれか１つの方法。
６４．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、もしくは少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列、またはその特異的結合断片を含む、実施形態４３～６３のうちのいずれか１つの方法。
６５．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに記載のアミノ酸の配列、もしくは配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列、またはその特異的結合断片を含む、実施形態４３～６４のうちのいずれか１つの方法。
６６．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態４３～６５のうちのいずれか１つの方法。
６７．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、実施形態４３～６６のうちのいずれか１つの方法。
６８．１つ以上のアミノ酸置換が、Ａ１２６Ｔ、Ｄ１８８Ｖ、Ｉ１８９Ａ、Ｄ１９０Ｓ、Ｎ１９１Ｃ、Ｎ１９１Ｆ、Ｎ１９１Ｌ、Ｎ１９１Ｍ、Ｎ１９１Ｒ、Ｎ１９１Ｓ、Ｎ１９１Ｔ、Ｎ１９１Ｖ、Ｗ１９２Ｆ、Ｗ１９２Ｇ、Ｗ１９２Ｌ、Ｒ１９６Ｈ、Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１９６Ｓ、Ｒ１９６Ｔ、Ｒ１９６Ｖ、Ｇ２３８Ｖ、Ａ３０２Ｗ、Ｎ３０６Ａ、Ｎ３０６Ｇ、Ｎ３０６Ｒ、Ｎ３０６Ｓ、Ｔ３０７Ｋ、Ｎ３１０Ｄ、Ｎ３１０Ｇ、Ｎ３１０Ｋ、Ｎ３１０Ｌ、Ｎ５２５Ｋ、Ａ５２８Ｖ、Ｆ５４６Ｌ、Ａ６０４Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｇ、Ｄ６５０Ｓ、Ｇ６５１Ｈ、Ｇ６５１Ｔ、Ｇ６５１Ｖ、Ｇ６５１Ｙ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｔ、Ｖ６５６Ｅ、Ｖ６５６Ｇ、Ｖ６５６Ｓ、Ｋ６６５Ｉ、Ｋ６９２Ｎ、および／またはそれらの保存的アミノ酸置換である、実施形態４３～６７のうちのいずれか１つの方法。
６９．１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｄ１８８Ｖ／Ｉ１８９Ａ／Ｄ１９０Ｓ／Ｎ１９１Ｌ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｓ／Ａ３０２Ｗ／Ｎ３１０Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｔ３０７Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ５２５Ｋ／Ａ５２８Ｖ／Ａ６０４Ｖ／Ｄ６５０Ａ／Ｋ６９２Ｎ、Ａ１２６Ｔ／Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｇ２３８Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｆ５４６Ｌ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ／Ｋ６６５Ｉ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｒ１９６Ｋ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｆ／Ｗ１９２Ｆ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｇ／Ｇ６５１Ｈ／Ｖ６５６Ｅ、Ｎ１９１Ｒ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｓ／Ｎ３１０Ｌ／Ｇ６５１Ｔ／Ｓ６５５Ｔ／Ｖ６５６Ｓ、Ｎ１９１Ｓ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｔ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｍ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｖ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｓ、またはＮ１９１Ｓ／Ｎ３０６Ｇ／Ｄ６５０Ｓである、実施形態４３～６８のうちのいずれか１つの方法。
７０．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９の配列のうちのいずれかの配列の基質特異性を示す、実施形態４３～６９のうちのいずれか１つの方法。
７１．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの触媒ドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有する触媒ドメインを含むアミノ酸配列を含む、実施形態４３～７０のうちのいずれか１つの方法。
７２．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかのアミン結合部位と、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミン結合部位を含むアミノ酸配列を含む、実施形態４３～７１のうちのいずれか１つの方法。
７３．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかのループドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するループドメインと、を含むアミノ酸配列を含む、実施形態４３～７２のうちのいずれか１つの方法。
７４．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および／または２０２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態４３～７３のうちのいずれか１つの方法。
７５．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、３０２、および／または３１０に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態４３～７３のうちのいずれか１つの方法。
７６．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１９１、１９２、１９６、３０６、３１０、６２７、６２８、６３０、６４８、６５０、６５１、６５５、６５６、および／または６６９に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態４３～７３のうちのいずれか１つの方法。
７７．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置３２３～５４４のうちのいずれかに対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態４３～７３のうちのいずれか１つの方法。
７８．前駆体ポリペプチドを、前駆体ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させて、修飾された切断酵素で処理するために調製されたポリペプチドを提供することをさらに含む、実施形態４３～７８のうちのいずれか１つの方法。
７９．末端アミノ酸を標識するための試薬が、化学試薬または酵素試薬である、実施形態７８の方法。
８０．標識が、ブロックアミノ酸を含む、実施形態４３～７９のうちのいずれか１つの方法。
８１．標識が、外因性標識アミノ酸を含む、実施形態４３～８０のうちのいずれか１つの方法。
８２．標識が、化学標識を含む、実施形態４３～８１のうちのいずれか１つの方法。
８３．末端アミノ酸を標識するための試薬との接触および修飾された切断酵素との接触が、連続した順序で行われる、実施形態７８～８２のうちのいずれか１つの方法。
８４．末端アミノ酸を標識するための試薬との接触および修飾された切断酵素との接触が、１回以上繰り返される、実施形態７８～８３のうちのいずれか１つの方法。
８５．化学試薬が、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）、ニトロ－ＰＩＣ、スルホ－ＰＩＣ、Ｃｂｚ－Ｃｌ（クロロギ酸ベンジル）またはＣｂｚ－ＯＳｕ（ベンジルオキシカルボニルＮ－スクシンイミド）、カルボキシル活性化アミノブロックアミノ酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ－Ｃｌ、または１－ジメチルアミノナフタレン－５－スルホニルクロリド）、４－スルホニル－２－ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、無水物、２－ピリジンカルボキシアルデヒド、２－ホルミルフェニルボロン酸、２－アセチルフェニルボロン酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ペンタフルオロフェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、３－（カルボン酸）－フェニルイソチオシアネート、３－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、１－ナフチルイソチオシアネート、Ｎ－ニトロイミダゾール－１－カルボキシミダミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（ピバロイル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビス（ベンジルオキシカルボニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、チオベンジル化試薬、および二複素環メタニミン試薬、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態７９～８４のうちのいずれか１つの方法。
８６．化学試薬が、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物、アザイサト酸無水物、コハク酸無水物、またはそれらの誘導体である、実施形態７９～８５のうちのいずれか１つの方法。
８７．化学試薬が、４－ニトロフェニルアントラニレート、Ｎ－メチル－イサト酸無水物、Ｎ－アセチル－イサト酸無水物、４－カルボン酸イサト酸無水物、５－メトキシ－イサト酸無水物、５－ニトロ－イサト酸無水物、４－クロロ－イサト酸無水物、４－フルオロ－イサト酸無水物、６－フルオロ－イサト酸無水物、Ｎ－ベンジル－イサト酸無水物、４－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、５－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、４－ニトロ－イサト酸無水物、４－メトキシ－イサト酸無水物、５－アミノ－２－フルオロ－イソニコチン無水物（６－フルオロ－１Ｈ－ピリド［３，４－ｄ］［１，３］オキサジン－２，４－ジオン）、３，６，ジフルオロフタル酸無水物、および２，３ピラジンジカルボン酸無水物、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態８６の方法。
８８．ポリペプチドを、ポリペプチドの末端アミノ酸に結合することができる結合剤と接触させることをさらに含み、結合剤が、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、実施形態４３～８７のうちのいずれか１つの方法。
８９．結合剤が、２つ以上の結合剤を含む、実施形態８８の方法。
９０．結合剤が、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合する、実施形態８８または実施形態８９の方法。
９１．結合剤が、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）に結合する、実施形態８８または実施形態８９の方法。
９２．結合剤が、標識または未標識末端アミノ酸に結合することができる、実施形態８８～９１のうちのいずれか１つの方法。
９３．結合剤との接触が、
ポリペプチドを、末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させる前、および／または
ポリペプチドを、修飾された切断酵素と接触させる前である、実施形態８８～９２のうちのいずれか１つの方法。
９４．結合剤との接触が、ポリペプチドを、末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させた後である、実施形態８８～９３のうちのいずれか１つの方法。
９５．
末端アミノ酸を標識するための試薬との接触が、結合剤との接触の前であり、
結合剤との接触が、ポリペプチドと修飾された切断酵素との接触の前である、実施形態８８～９２のうちのいずれか１つの方法。
９６．ポリペプチドと結合剤、末端アミノ酸を標識するための試薬、および修飾された切断酵素との接触が、１回以上繰り返される、実施形態８８～９５のうちのいずれか１つの方法。
９７．コーディングタグの別情報をポリペプチドに付着した記録タグに転送し、それによってポリペプチド上に伸長記録タグを生成することをさらに含む、実施形態８８～９６のうちのいずれか１つの方法。
９８．識別情報の転送が、
ポリペプチドと結合剤との結合の後、および
ポリペプチドと修飾された切断酵素との接触の前に実行される、実施形態９７の方法。
９９．
（ａ）ポリペプチドを結合剤と接触させるステップ、
（ｂ）識別情報を記録タグに転送するステップ、
（ｃ）ポリペプチドを、末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させるステップ、および
（ｄ）ポリペプチドを修飾された切断酵素と接触させるステップが、
順番に繰り返されて、１つ以上の追加の伸長記録タグを生成する、実施形態９７または実施形態９８の方法。
１００．ステップ（ｂ）の後およびステップ（ｃ）の前に、結合剤を除去することをさらに含む、実施形態９９の方法。
１０１．
（ａ）ポリペプチドを末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させるステップ、
（ｂ）ポリペプチドを、標識末端アミノ酸に結合することができる結合剤と接触させるステップ、
（ｃ）識別情報を記録タグに転送するステップ、および
（ｄ）ポリペプチドを修飾された切断酵素と接触させるステップが、
順番に繰り返されて、１つ以上の追加の伸長記録タグを生成する、実施形態９７または実施形態９８の方法。
１０２．ステップ（ｃ）の後およびステップ（ｄ）の前に結合剤を除去することをさらに含む、実施形態１０１の方法。
１０３．１つ以上の伸長記録タグを分析することをさらに含む、実施形態９７～１０２のうちのいずれか１つの方法。
１０４．ポリペプチドを分析するための方法であって、
（ａ）ポリペプチドを、ポリペプチドの末端アミノ酸に結合することができる結合剤と接触させるステップであって、結合剤が、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと、
（ｂ）コーディングタグの識別情報をポリペプチドと関連付けられた記録タグに転送して、伸長記録タグを生成するステップと、
（ｃ）ポリペプチドを試薬と接触させて、ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するステップと、
（ｄ）ポリペプチドを、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と接触させるステップと、を含み、
修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ステップ（ｃ）において試薬によって標識された単一の末端アミノ酸をポリペプチドから除去するか、または除去するように構成されるか、あるいは、
修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ステップ（ｃ）において試薬によって標識された単一の末端アミノ酸または単一の末端ジペプチドをポリペプチドから除去するか、または除去するように構成される、方法。
１０５．ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素が、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される、実施形態１０４の方法。
１０６．トリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素が、ポリペプチドの最後から２番目の末端標識アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される、実施形態１０４の方法。
１０７．未修飾の切断酵素が、メタロペプチダーゼ、亜鉛依存性メタロペプチダーゼ、または亜鉛依存性ヒドロラーゼからなる群から選択される、実施形態１０４～１０６のうちのいずれか１つの方法。
１０８．未修飾の切断酵素が、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である、実施形態１０４～１０７のうちのいずれか１つの方法。
１０９．未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼである、実施形態１０４～１０８のうちのいずれか１つの方法。
１１０．未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ３、ジペプチジルペプチダーゼ５、ジペプチジルペプチダーゼ７、ジペプチジルペプチダーゼ１１、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ、またはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩである、実施形態１０４～１０９のうちのいずれか１つの方法。
１１１．結合剤が、２つ以上の結合剤を含む、実施形態１０４～１１０のうちのいずれか１つの方法。
１１２．ポリペプチドが、２つ以上のポリペプチドを含む、実施形態１０４～１１１のうちのいずれか１つの方法。
１１３．ステップ（ａ）～（ｄ）が「ｎ」回の結合サイクルについて繰り返され、ポリペプチドに結合する各結合剤の各コーディングタグの識別情報が、前の結合サイクルから生成された伸長記録タグに転送されて、ｎ次伸長記録タグを生成する、実施形態１０４～１１２のうちのいずれか１つの方法。
１１４．
（ｂ１）結合剤を除去することをさらに含む、実施形態１０４～１１３のうちのいずれか１つの方法。
１１５．
（ｅ）ｎ次伸長記録タグを分析することをさらに含む、実施形態１１３または実施形態１１４の方法。
１１６．
ステップ（ａ）が、ステップ（ｂ）の前に実行され、
ステップ（ａ）が、ステップ（ｃ）の前に実行され、
ステップ（ａ）が、ステップ（ｄ）の前に実行され、
ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前に実行され、
ステップ（ｂ）が、ステップ（ｄ）の前に実行され、
ステップ（ｂ１）が、ステップ（ａ）の後に実行され、
ステップ（ｂ１）が、ステップ（ｂ）の後に実行され、
ステップ（ｂ１）が、ステップ（ｃ）の前に実行され、
ステップ（ｂ１）が、ステップ（ｄ）の前に実行され、
ステップ（ｃ）が、ステップ（ａ）の前に実行され、
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）の前に実行され、かつ／または、
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｄ）の前に実行される、実施形態１０４～１１５のうちのいずれか１つの方法。
１１７．末端アミノ酸が、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）である、実施形態１０４～１１６のうちのいずれか１つの方法。
１１８．末端アミノ酸が、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）である、実施形態１０４～１１６のうちのいずれか１つの方法。
１１９．記録タグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ、分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはそれらの組み合わせである、実施形態９７～１１８のうちのいずれか１つの方法。
１２０．記録タグが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態９７～１１９のうちのいずれか１つの方法。
１２１．記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、実施形態９７～１２０のうちのいずれか１つの方法。
１２２．結合剤およびコーディングタグが、リンカーによって接合される、実施形態８８～１２１のうちのいずれか１つの方法。
１２３．記録タグの識別情報をコーディングタグに転送することが、プライマー伸長によって行われる、実施形態９７～１２２のうちのいずれか１つの方法。
１２４．記録タグの識別情報をコーディングタグに転送することが、ライゲーションによって行われる、実施形態９７～１２２のうちのいずれか１つの方法。
１２５．コーディングタグが、ＵＭＩを含む、実施形態８８～１２４のうちのいずれか１つの方法。
１２６．コーディングタグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、実施形態８８～１２５のうちのいずれか１つの方法。
１２７．ポリペプチドが固体支持体に直接的または間接的に接合されている、実施形態４３～１２６のうちのいずれか１つの方法。
１２８．固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、回転干渉計ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナノ粒子、またはミクロスフェアである、実施形態１２７の方法。
１２９．固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリアクリレートビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、デキストランビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、制御された多孔質ビーズ、シリカベースのビーズ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１２８の方法。
１３０．結合剤が、ポリペプチドまたはタンパク質である、実施形態８８～１２９のうちのいずれか１つの方法。
１３１．結合剤が、アミノペプチダーゼ、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリン、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳ、ＣｌｐＳ２、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；または、１つ以上のアミノ酸に結合する修飾された小分子、すなわちバンコマイシン、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾分子；または、抗体もしくはその結合断片；あるいは、それらの任意の組み合わせである、実施形態１３０の方法。
１３２．結合剤が、ポリペプチドの単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、または翻訳後修飾に結合する、実施形態８８～１３１のうちのいずれか１つの方法。
１３３．結合剤が、Ｎ末端アミノ酸残基に結合する、実施形態１０４～１３３の方法。
１３４．結合剤が、Ｃ末端アミノ酸残基に結合する、実施形態１０４～１３３の方法。
１３５．１つ以上の伸長記録タグが、分析の前に増幅される、実施形態１０３～１３４のうちのいずれか１つの方法。
１３６．１つ以上の伸長記録タグを分析することが、核酸配列決定法を含む、実施形態１０３～１３５のうちのいずれか１つの方法。
１３７．核酸配列決定法が、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、実施形態１３６の方法。
１３８．核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアベースのシーケンシング、または高度な顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、実施形態１３６または実施形態１３７の方法。
１３９．ポリペプチドを修飾された切断酵素と接触させて単一の末端アミノ酸を除去することが、５分間未満、１０分間未満、２０分間未満、３０分間未満、４０分間未満、５０分間未満、６０分間未満、２時間未満、５時間未満、８時間未満、または１０時間未満で行われる、実施形態４３～１３８のうちのいずれか１つの方法。
１４０．核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの混合物もしくは組み合わせを分解する条件の不在下で実施される、実施形態４３～１３９のうちのいずれか１つの方法。
１４１．核酸を分解する条件が、化学的条件である、実施形態１４０の方法。
１４２．核酸と適合性のある条件の存在下で実施される、実施形態４３～１４１のうちのいずれか１つの方法。
１４３．強酸または強塩基の不在下で実施される、実施形態１４０～１４２のうちのいずれか１つの方法。
１４４．強酸無水物の不在下で実施される、実施形態１４３の方法。
１４５．強酸無水物（ｓｔｒｏｎｇ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）が、ＴＦＡ無水物である、実施形態１４４の方法。
１４６．ポリペプチドを処理するためのキットであって、
突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素であって、
修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成されるか、あるいは
修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成される、修飾された切断酵素と、
ポリペプチドの末端アミノ酸を標識するための試薬と、を含む、キット。
１４７．ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素が、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される、実施形態１４６のキット。
１４８．トリペプチド切断酵素に由来する修飾された切断酵素が、ポリペプチドの最後から２番目の末端標識アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成される、実施形態１４６のキット。
１４９．修飾された切断酵素が、ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のアミド結合と相互作用する活性部位を含む、実施形態１４６～１４８のうちのいずれか１つのキット。
１５０．未修飾の切断酵素が、メタロペプチダーゼ、亜鉛依存性メタロペプチダーゼ、または亜鉛依存性ヒドロラーゼからなる群から選択される、実施形態１４６～１４９のうちのいずれか１つのキット。
１５１．未修飾の切断酵素が、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその相同体に分類されるタンパク質である、実施形態１４６～１５０のうちのいずれか１つのキット。
１５２．未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼである、実施形態１４６～１５１のうちのいずれか１つのキット。
１５３．未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ３、ジペプチジルペプチダーゼ５、ジペプチジルペプチダーゼ７、ジペプチジルペプチダーゼ１１、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ、またはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩである、実施形態１４６～１５２のうちのいずれか１つのキット。
１５４．標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を含む、実施形態１４６～１５３のうちのいずれか１つのキット。
１５５．標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）を含む、実施形態１４６～１５３のうちのいずれか１つのキット。
１５６．修飾された切断酵素が、ポリペプチドの最後から２番目の末端アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断しない、実施形態１４６～１５５のうちのいずれか１つのキット。
１５７．修飾された切断酵素が、未修飾の切断酵素と少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、実施形態１４６～１５６のうちのいずれか１つのキット。
１５８．突然変異が、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１４６～１５７のうちのいずれか１つのキット。
１５９．ポリペプチドの長さが、４個のアミノ酸を超える、５個のアミノ酸を超える、６個のアミノ酸を超える、７個のアミノ酸を超える、８個のアミノ酸を超える、９個のアミノ酸を超える、１０個のアミノ酸を超える、１１個のアミノ酸を超える、１２個のアミノ酸を超える、１３個のアミノ酸を超える、１４個のアミノ酸を超える、１５個のアミノ酸を超える、２０個のアミノ酸を超える、２５個のアミノ酸を超える、または３０個のアミノ酸を超える、実施形態１４６～１５８のうちのいずれか１つのキット。
１６０．ポリペプチドの長さが、１０個のアミノ酸を超える、実施形態１４６～１５９のうちのいずれか１つのキット。
１６１．修飾された切断酵素が、その基質結合部位内に修飾を含む、実施形態１４６～１６０のうちのいずれか１つのキット。
１６２．修飾された切断酵素が、その触媒ドメイン内に修飾を含む、実施形態１４６～１６１のうちのいずれか１つのキット。
１６３．修飾された切断酵素が、そのキモトリプシンフォールド内に修飾を含む、実施形態１４６～１６２のうちのいずれか１つのキット。
１６４．修飾された切断酵素が、アミン結合部位に修飾を含む、実施形態１４６～１６３のうちのいずれか１つのキット。
１６５．修飾された切断酵素が、そのループドメインに修飾を含む、実施形態１４６～１６４のうちのいずれか１つのキット。
１６６．修飾された切断酵素が、修飾された切断酵素の活性部位へのアクセス可能性を改善するための修飾を含む、実施形態１４６～１６５のうちのいずれか１つのキット。
１６７．修飾された切断酵素が、配列番号１３または２０に規定されるようなジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩまたはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩに由来する、実施形態１４６～１６６のうちのいずれか１つのキット。
１６８．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列、またはその特異的結合断片を含む、実施形態１４６～１６７のうちのいずれか１つのキット。
１６９．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８のうちのいずれかに記載のアミノ酸の配列、もしくは配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列、またはその特異的結合断片を含む、実施形態１４６～１６８のうちのいずれか１つのキット。
１７０．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１４６～１６９のうちのいずれか１つのキット。
１７１．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、実施形態１４６～１７０のうちのいずれか１つのキット。
１７２．１つ以上のアミノ酸置換が、Ａ１２６Ｔ、Ｄ１８８Ｖ、Ｉ１８９Ａ、Ｄ１９０Ｓ、Ｎ１９１Ｃ、Ｎ１９１Ｆ、Ｎ１９１Ｌ、Ｎ１９１Ｍ、Ｎ１９１Ｒ、Ｎ１９１Ｓ、Ｎ１９１Ｔ、Ｎ１９１Ｖ、Ｗ１９２Ｆ、Ｗ１９２Ｇ、Ｗ１９２Ｌ、Ｒ１９６Ｈ、Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１９６Ｓ、Ｒ１９６Ｔ、Ｒ１９６Ｖ、Ｇ２３８Ｖ、Ａ３０２Ｗ、Ｎ３０６Ａ、Ｎ３０６Ｇ、Ｎ３０６Ｒ、Ｎ３０６Ｓ、Ｔ３０７Ｋ、Ｎ３１０Ｄ、Ｎ３１０Ｇ、Ｎ３１０Ｋ、Ｎ３１０Ｌ、Ｎ５２５Ｋ、Ａ５２８Ｖ、Ｆ５４６Ｌ、Ａ６０４Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｇ、Ｄ６５０Ｓ、Ｇ６５１Ｈ、Ｇ６５１Ｔ、Ｇ６５１Ｖ、Ｇ６５１Ｙ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｔ、Ｖ６５６Ｅ、Ｖ６５６Ｇ、Ｖ６５６Ｓ、Ｋ６６５Ｉ、Ｋ６９２Ｎ、および／またはそれらの保存的アミノ酸置換である、実施形態１４６～１７１のうちのいずれか１つのキット。
１７３．１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｄ１８８Ｖ／Ｉ１８９Ａ／Ｄ１９０Ｓ／Ｎ１９１Ｌ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｓ／Ａ３０２Ｗ／Ｎ３１０Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｔ３０７Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ５２５Ｋ／Ａ５２８Ｖ／Ａ６０４Ｖ／Ｄ６５０Ａ／Ｋ６９２Ｎ、Ａ１２６Ｔ／Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｇ２３８Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｆ５４６Ｌ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ／Ｋ６６５Ｉ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｒ１９６Ｋ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｆ／Ｗ１９２Ｆ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｇ／Ｇ６５１Ｈ／Ｖ６５６Ｅ、Ｎ１９１Ｒ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｓ／Ｎ３１０Ｌ／Ｇ６５１Ｔ／Ｓ６５５Ｔ／Ｖ６５６Ｓ、Ｎ１９１Ｓ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｔ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｍ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｖ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｓ、またはＮ１９１Ｓ／Ｎ３０６Ｇ／Ｄ６５０Ｓである、実施形態１４６～１７２のうちのいずれか１つのキット。
１７４．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９の配列のうちのいずれかの基質特異性を示す、実施形態１４６～１７３のうちのいずれか１つのキット。
１７５．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの触媒ドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有する触媒ドメインを含むアミノ酸配列を含む、実施形態１４６～１７４のうちのいずれか１つのキット。
１７６．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかのアミン結合部位と、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミン結合部位を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１４６～１７５のうちのいずれか１つのキット。
１７７．修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかのループドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するループドメインと、を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１４６～１７６のうちのいずれか１つのキット。
１７８．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および／または２０２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１４６～１７７のうちのいずれか１つのキット。
１７９．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、３０２、および／または３１０に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１４６～１７７のうちのいずれか１つのキット。
１８０．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１９１、１９２、１９６、３０６、３１０、６２７、６２８、６３０、６４８、６５０、６５１、６５５、６５６、および／または６６９に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１４６～１７７のうちのいずれか１つのキット。
１８１．修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置３２３～５４４のうちのいずれかに対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、実施形態１４６～１７７のうちのいずれか１つのキット。
１８２．末端アミノ酸が、化学もしくは酵素試薬または部分で標識されている、実施形態１４６～１８１のうちのいずれかのキット。
１８３．標識が、ブロックアミノ酸を含む、実施形態１４６～１８２のうちのいずれかのキット。
１８４．標識が、外因性標識アミノ酸を含む、実施形態１４６～１８３のうちのいずれかのキット。
１８５．標識が、化学標識を含む、実施形態１４６～１８４のうちのいずれかのキット。
１８６．化学試薬が、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）、ニトロ－ＰＩＣ、スルホ－ＰＩＣ、Ｃｂｚ－Ｃｌ（クロロギ酸ベンジル）またはＣｂｚ－ＯＳｕ（ベンジルオキシカルボニルＮ－スクシンイミド）、カルボキシル活性化アミノブロックアミノ酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ－Ｃｌ、または１－ジメチルアミノナフタレン－５－スルホニルクロリド）、４－スルホニル－２－ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、無水物、２－ピリジンカルボキシアルデヒド、２－ホルミルフェニルボロン酸、２－アセチルフェニルボロン酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ペンタフルオロフェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、３－（カルボン酸）－フェニルイソチオシアネート、３－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、１－ナフチルイソチオシアネート、Ｎ－ニトロイミダゾール－１－カルボキシミダミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（ピバロイル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビス（ベンジルオキシカルボニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、チオベンジル化試薬、および二複素環メタニミン試薬、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１８２のキット。
１８７．化学試薬が、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物、アザイサト酸無水物、コハク酸無水物、またはそれらの誘導体である、実施形態１８２のキット。
１８８．化学試薬が、４－ニトロフェニルアントラニレート、Ｎ－メチル－イサト酸無水物、Ｎ－アセチル－イサト酸無水物、４－カルボン酸イサト酸無水物、５－メトキシ－イサト酸無水物、５－ニトロ－イサト酸無水物、４－クロロ－イサト酸無水物、４－フルオロ－イサト酸無水物、６－フルオロ－イサト酸無水物、Ｎ－ベンジル－イサト酸無水物、４－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、５－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、４－ニトロ－イサト酸無水物、４－メトキシ－イサト酸無水物、５－アミノ－２－フルオロ－イソニコチン無水物（６－フルオロ－１Ｈ－ピリド［３，４－ｄ］［１，３］オキサジン－２，４－ジオン）、３，６，ジフルオロフタル酸無水物、および２，３ピラジンジカルボン酸無水物、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１８７のキット。
１８９．結合剤をさらに含み、結合剤が、結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、実施形態１４６～１８８のうちのいずれか１つのキット。
１９０．キットが、２つ以上の結合剤を含む、実施形態１８９のキット。
１９１．結合剤が、未標識末端アミノ酸に結合するように構成される、実施形態１８９または実施形態１９０のキット。
１９２．結合剤が、標識末端アミノ酸に結合するように構成される、実施形態１８９または実施形態１９０のキット。
１９３．結合剤が、ポリペプチドの単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、または翻訳後修飾に結合する、実施形態１８９～１９２のうちのいずれか１つのキット。
１９４．結合剤が、Ｎ末端アミノ酸残基に結合する、実施形態１９３のキット。
１９５．結合剤が、Ｃ末端アミノ酸残基に結合する、実施形態１９３のキット。
１９６．結合剤が、ポリペプチドまたはタンパク質である、実施形態１８９～１９５のうちのいずれか１つのキット。
１９７．結合剤が、アミノペプチダーゼ、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリン、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳ（ＣｌｐＳ２など）、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；または、１つ以上のアミノ酸に結合する修飾された小分子、すなわちバンコマイシン、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾分子；または、抗体もしくはその結合断片；あるいは、それらの任意の組み合わせである、実施形態１８９～１９６のうちのいずれか１つのキット。
１９８．コーディングタグの識別情報を前記ポリペプチドに付着した記録タグに転送するための試薬をさらに含み、前記識別情報の前記記録タグへの前記転送により、前記ポリペプチド上に伸長記録タグが生成される、実施形態１４６～１９７のうちのいずれか１つのキット。
１９９．識別情報を伝達するための試薬が、化学ライゲーション試薬または生物学的ライゲーション試薬である、実施形態１９８のキット。
２００．識別情報を伝達するための試薬が、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長のための試薬である、実施形態１９８のキット。
２０１．伸長記録タグを増幅するための増幅試薬をさらに含む、実施形態１９８～２００のうちのいずれか１つのキット。
２０２．ビーズ、多孔質ビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、回転干渉測定ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁性ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、ミクロスフェア、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される固体支持体をさらに含む、実施形態１４６～２０１のうちのいずれかのキット。
２０３．固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリアクリレートビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、デキストランビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、制御された多孔質ビーズ、シリカベースのビーズ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２０２のキット。
２０４．核酸配列決定分析のための試薬をさらに含む、実施形態１４６～２０３のうちのいずれか１つのキット。
２０５．核酸配列決定分析が、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアベースのシーケンシング、または高度な顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージング、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２０４のキット。
以下の実施例は、本明細書において提供される方法、組成物、および使用を説明するために提供されるが、これらを限定するものではない。
実施例１：修飾された切断酵素の選択、設計、および単離
本実施例では、修飾された切断酵素の選択および単離、ならびに合理的設計による選択された活性のためのジペプチジルペプチダーゼ３（ＤＰＰ３）、ジペプチジルペプチダーゼ５（ＤＰＰ５）およびジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ（ＤＡＰ ＢＩＩ）タンパク質の操作について説明する。
Ａ．修飾されたＮＴＡＡペプチドに対して活性なＤＰＰ３、ＤＰＰ５およびＤＡＰ ＢＩＩ変異体の遺伝子選択
ＤＰＰ３、ＤＰＰ５およびＤＡＰ ＢＩＩ変異体などの最適な操作された修飾切断酵素を識別するために、アミノ酸特異的な栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株（エール大学のＣＳＳＣ Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子ストックセンターから入手可能－ｈｔｔｐｓ：／／ｃｇｓｃ２．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／）を使用して遺伝子選択を実施する。この株は、栄養要求性アミノ酸または栄養要求性アミノ酸を含む短いペプチドが供給された場合にのみ、最小培地プレートで生存する。例えば、Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）２５（１０）：１１４５－１１４７）を参照のこと。この細胞ベースのアッセイシステムを使用して、次のように標識ポリペプチドで機能する変異体を選択する。切断酵素遺伝子（ＤＰＰ３、ＤＰＰ５およびＤＡＰ ＢＩＩなど）を、Ｃｂｚ標識テトラペプチド（Ｃｂｚ－ＡＡＡＲ、Ｃｂａ－ＶＳＡＲ）を添加した栄養要求性株において個別に発現させる。ここでは、Ｃ末端のジアミノ酸が、細胞質ゾルでの天然のジペプチドの取り込みおよび切断の際に栄養要求性サプリメントとして機能する。短いオリゴペプチド基質は、外膜ポリンチャネルを介してペリプラズムに浸透するが、Ｅ．ｃｏｌｉの３つの主要なオリゴペプチド／ジペプチド取り込み系であるＯｐｐ、ＴｐｐおよびＤｐｐを介した細胞質への能動輸送を必要とする（Ａｂｏｕｈａｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５（５）：１０３５－１０４７）。細胞質に取り込まれた後、短いペプチドは、細胞質ゾル内の内因性エンドペプチダーゼによって消化される。これらの３つの系によるオリゴペプチドまたはジペプチドの輸送は、Ｎ末端修飾（例えば、Ｃｂｚ）オリゴペプチド／ジペプチドによって阻害される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５（Ｐｔ １０）：２８９１－９０１；Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２０００）３８４（１）：９－２３；Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０００ Ｍａｙ；１８２（９）：２５３０－２５３５）。Ｃｂｚ標識原料での栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉの増殖は抑制されるであろう。遺伝子選択は、適切なシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢ）を使用して、ペリプラズムにおける機能性タンパク質の発現および分泌によってこの阻害を緩和することにより達成される（Ｓｐｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．（２０１１）２４（６）：４７３－４８４；Ｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）２５（１）：４９－５４）。ペリプラズムに入ると、機能性タンパク質は、Ｃｂｚ－オリゴペプチドを遊離の栄養要求性ジペプチドに変換し、細胞質に取り込まれる。
アミノ酸に対して栄養要求性のＥ．ｃｏｌｉ株（アルギニン、グルタミン、またはトリプトファンなど）が、遺伝子選択に採用される。他の好適な菌株も選択に使用することができる。遺伝子選択のための増殖培地は、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、グルコース、および寒天を添加したＭ９最小培地塩である。溶液をプレートに注いで固化させる前に、適切なＣｂｚ標識ペプチドも増殖培地に添加する。
切断酵素遺伝子のファミリー（例えば、ＤＰＰ３、ＤＰＰ５およびＤＡＰ ＢＩＩ）を試験するための一般的なアプローチは、それらのコードされたタンパク質の相同性に基づいて、ＮＣＢＩデータベースクラスター内のファミリーを選択することである。各クラスターからの代表を含む遺伝子のプールを選択する。選択したタンパク質の遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化されたコドンを使用して合成する。さまざまな生物からのタンパク質をコードする遺伝子をプールし、突然変異遺伝子のライブラリーを、既知の構造を持つタンパク質の結晶構造を使用したエラープローンＰＣＲまたは合理的な突然変異誘発によって生成する。さらに、エラープローンＰＣＲおよび合理的な突然変異誘発の組み合わせを使用して、追加の突然変異ライブラリーを生成する。続いて、変異遺伝子のプールを、Ｔ５またはアラビノースプロモーターなどの栄養要求性株における遺伝子発現と適合性のあるプロモーターを有するベクターにクローン化する。変異遺伝子のライブラリーを、コードされたタンパク質のＮ末端にペリプラズムターゲティングシグナル（例えば、ｐｅｌＢ）を追加するベクターにクローン化する。次に、クローン化されたライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ栄養要求性株に形質転換する。リッチな培地（例えば、ＳＯＣ）で形質転換細胞を回収した後、細胞をＭ９最小液体培地で洗浄して、栄養要求株が偽陽性として提示することにより遺伝子選択を覆すことができるタンパク質の痕跡をすべて除去する。次に、細胞を、Ｃｂｚ標識ペプチドを含む選択培地上に広げる。コロニーが観察されるまで、プレートを摂氏２５～３７度の範囲の温度でインキュベートする。選択培地で増殖しているコロニーを分離し、プラスミドＤＮＡを抽出する。次に、切断酵素遺伝子の配列を決定して、Ｃｂｚ標識ペプチドを除去することができるタンパク質配列を特定する。
さまざまな長さおよび配列を有するＣｂｚ標識ペプチドを遺伝子選択に使用して、ポリペプチド合成に使用される２０個の修飾天然アミノ酸すべてを除去することができる特異性を持つ酵素を生成することができる。
Ｂ．修飾されたＮＴＡＡペプチドに対する活性についての、ＤＰＰ３、ＤＰＰ５およびＤＡＰ ＢＩＩの合理的設計
標識されたＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を除去するためにＤＰＰ３を操作するための合理的な設計アプローチは、基質と複合体を形成したＤＰＰ３の結晶構造を使用して導かれる。基質と複合体を形成したヒトＤＰＰ３の構造では、残基Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３９１、およびＡｓｎ３９４（配列番号５に記載のタンパク質の配列に基づく；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＹ３３）は、ペプチドのＮ末端アミン基と水素結合相互作用を行う。これらの残基は、個別にまたは組み合わせて、標識されたＮＴＡＡに対応する修飾ジペプチジルペプチダーゼを選択するように改変される。
基質を含むＤＰＰ５の結晶構造がないため、Ｒｏｓｅｔｔａ巨大分子モデリングスイートなどの比較モデリングツールを使用して、ＤＰＰ５のホモロジーモデルを生成する。モデルおよび配列分析に基づいて、Ｔｈｒ１２７～Ｔｈｒ１８０（ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０１２４５７７５５．１に基づく；配列番号１６）のループは、天然Ｎ末端アミノ酸に結合するための仮想領域および故に修飾アミノ酸を認識するための操作領域であると特定された。この領域のＮ末端アミンに結合することができる複数の酸性残基は、Ａｓｐ１４２、Ａｓｐ１５３およびＡｓｐ１６０など、高度に保存される。エラープローンＰＣＲ、部位飽和突然変異誘発、およびＢｌａｓｔ検索からの相同ループへの置換など、複数のアプローチを使用してこのループ領域を探索することができる。これらのさまざまな多様化戦略は、ＰＣＲまたは商業的に合成されたオリゴによってインビトロで生成されたオリゴを使用するキュンケルベースのアプローチを介してライブラリーに組み込まれる。ループ領域の小さな変化を試験することに加えて、インビトロ組換えを使用して、大きな配列変化、および／または完全長のエラープローンＰＣＲを組み合わせて、ループの外側の領域を探索することもできる。突然変異スキャンおよびランダムエラープローンベースのアプローチにより、ライブラリー作製およびスクリーニングの次のラウンドのホットスポット領域を特定することができる。
標識されたＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を除去するためにＤＡＰ ＢＩＩを操作するための合理的な設計アプローチは、基質と複合体を形成したＤＡＰ ＢＩＩの結晶構造を使用して導かれる（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，４：４９７７）。ペプチド基質と複合体を形成するＤＡＰ ＢＩＩ構造において、残基Ｎ１９１、Ｗ１９２、Ｒ１９６、Ｎ３０６、およびＤ６５０（配列番号１３に記載のタンパク質の配列に基づく；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｖ５ＹＭ１４）は、ペプチドのＮ末端アミン基と水素結合相互作用を行う。さらに、天然ＤＡＰ ＢＩＩ結晶構造では、約２０残基（残基１８３～２０２）のループが、結合したペプチド基質のＮ末端残基および最後から２番目の残基と接触する。これらのアミン結合残基ならびにＮＴＡＡおよび最後から２番目のＮＴＡＡ結合残基を、個別にまたは組み合わせて、最小限のバイアスで標識されたＮＴＡＡ残基の後に切断する修飾された切断酵素を選択するように改変する。キュンケルおよび関連する方法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ（１９８５）．ＰＮＡＳ ８２（２）：４８８－４９２）によるこれらの残基のコンビナトリアル変異体ライブラリーを作製し、遺伝子選択ライブラリーを使用して、修飾されたＮ末端アミノ酸に対する活性が改変された変異体をスクリーニングする。エラープローンベースのライブラリーは、ライブラリーの作製およびスクリーニングの次のラウンドの最初のスクリーニングからのヒットに基づいて構築される。
Ｃ．より長いペプチドに対して活性なＤＰＰ３の操作された変異体
場合によっては、ＤＰＰ３酵素の最大ペプチド基質長が制限される場合がある。例えば、ヒト酵素のペプチド基質長は、８個～１０個のアミノ酸に制限される。遺伝子選択は、未修飾のジペプチジルペプチダーゼと比較して増加したペプチドのサイズまたは長さを切断することができる、修飾されたジペプチジルペプチダーゼ酵素を識別するために実施される。Ｅ．ｃｏｌｉ外膜のポリンサイズは、５個または６個のアミノ酸に取り込まれることができるペプチドの長さを制限する。このサイズ制限を覆すために、ビオチントランスポーターを介してＥ．ｃｏｌｉに取り込まれ得る長さ３１個のアミノ酸までのビオチン化ペプチドが、ＤＰＰ３酵素のインビボ基質として使用される。
ＤＰＰ３によって切断され得るペプチドの長さを長くするための合理的な設計アプローチは、基質と複合体を形成したＤＰＰ３の結晶構造を使用して実施される。８個のアミノ酸ペプチドであるＤＲＶＹＩＨＰＦ（配列番号９）と複合体を形成したヒトＤＰＰ３の構造において、ペプチドの長さを制約するＤＰＰ３の領域が推定される。例えば、アミノ酸残基４１９～４２６（配列番号５に記載のヒトＤＰＰ３に従って番号付けされる）が、ＤＰＰ３がより長いペプチドで活性であることを可能にするための突然変異誘発または除去の標的とされる。
Ｄ．精製および特徴付け条件
選択された切断酵素（例えば、ＤＰＰ３、ＤＰＰ５、ＤＡＰ ＢＩＩ）は、６ヒスチジンタグなどの精製タグを伴って生成され、タグを使用して精製される。蛍光または比色基質は、分子に共役したＣｂｚ修飾用アミノ酸（Ｃｂｚ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）によって生成され、Ｃｂｚ修飾アミノ酸（Ｃｂｚ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）の切断時にシグナルを生成する。使用されるアミノ酸結合基質には、アミノ酸－ニトロアニリド、アミノ酸－β－ナフチルアミド、およびアミノ酸－アミドメチルクマリンが含まれる。これらの基質を使用して、選択された修飾酵素の活性を迅速にアッセイおよび最適化する。
実施例２：「アミノ酸」様プロファイルを模倣する化合物によるペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）の標識
本実施例では、ポリペプチドをさまざまな化学試薬で処理することによるＮ末端アミノ酸の標識について説明する。ペプチドのＮ末端へのベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、またはＰＩＴＣ誘導体の付加は、ＤＰＰ３、ＤＰＰ５またはＤＡＰ ＢＩＩなどのジペプチジルペプチダーゼのための天然基質であるＮ末端アミノ酸へのチロシンまたはフェニルアラニンの付加に似ている。主な際立った特徴は、Ｎ末端アミン基がないことである。Ｎ末端アミノ酸を標識するためのいくつかの試薬を、Ｎ末端を効率的に標識する能力について試験した。アミノ酸を標識するための化学試薬も、天然ＤＮＡの修飾に対する効果について試験した。例えば、４つの異なるＮ末端修飾試薬を示す。
Figure 2022526939000046
ペプチドを標識するための修飾試薬には、３つのイソチオシアネート（ピリジル－ＩＴＣ、ニトロ－ＰＩＴＣ、およびスルホ－ＩＴＣ）が含まれる。場合によっては、イソチオシアネートの代わりにイソシアネートを使用して、最終的な修飾ＮＴＡＡに、チオ尿素（硫黄）ではなく尿素（酸素）を生成することができる。示される４番目の試薬は、独自のグアニジニル化誘導体である。ピリジル－ＩＴＣは、イソチオシアネートに基づく既知のエドマン修飾試薬のクラスに由来し、酸性条件下で自己脱離するＮ末端を生成する。ニトロ－ＰＩＴＣおよびスルホ－ＰＩＴＣは、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）のより活性なエドマン誘導体である。すべてのイソチオシアネート試薬を、水性条件下で、２つの例示的なペプチド（Ｎ末端Ｇ（ＮＴ－Ｇ）＝ＧＲＦＳＧＩＹ（配列番号４０）を有するペプチド；Ｎ末端Ｗ（ＮＴ－Ｗ）＝ＷＴＱＩＦＧＡ（配列番号４１）を有するペプチド）のペプチドＮＴＡＡ修飾について試験した。ＰＩＴＣに関連する誘導体化を、２５ｍＭの示された試薬を使用して、１×ＰＢＳ緩衝液中で６０℃にて１５分間実行した。グアニジニル化（ｇｕａｎｄｉｎｙｌａｔｉｏｎ）誘導体化を、１５ｍＭのグアニジニル化試薬を使用して、１０％ＤＭＳＯを含む１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ値７．４）中で６０℃にて１時間実行した。合計５０当量の試薬を溶液アッセイに使用した。ＬＣ－ＭＳを使用して、さまざまな修飾試薬によるペプチドの変換効率を定量化した。
すべての場合において、示されたペプチドを標識するための修飾試薬について、定量的修飾がＤＮＡ修飾なしで観察された。ＰＩＴＣも対照として使用されたが、試験された条件下では完全な修飾は生成されなかった。図３に示すように、ピリジル－ＩＴＣ、ニトロ－ＰＩＴＣおよびスルホ－ＩＴＣによるペプチドの高収率での標識および高収率でのグアニジニル化が、いずれのペプチドでも観察された。
実施例３：Ｎ末端の「保護された」アミノ酸によるペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）の標識
本実施例では、Ｎ末端アミノ酸の標識にブロックアミノ酸または保護されたアミノ酸を使用する方法について説明する。
Figure 2022526939000047
Ｎ末端遊離ペプチドの混合物（合計０．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル／ＴＥＡＡ（１ｍＬ、５０ｍＭ ＴＥＡＡ、１：１（ｖ／ｖ）、ｐＨ値＝８．５）に溶解し、Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｐｆｐ（１ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を、室温で１時間撹拌する。アセトニトリルを減圧下で蒸発させ、ペプチド混合物をＣ１８カラムで濾過して、Ａｃ－Ｐｈｅ末端ペプチドを生成する。
別の例では、Ｎ末端遊離ペプチドの混合物（合計０．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル／ＴＥＡＡ（１ｍＬ、５０ｍＭ ＴＥＡＡ、１：１（ｖ／ｖ）、ｐＨ値＝８．５）に溶解し、Ｃｂｚ（Ｚ）－Ａｌａ－ＯＳｕ（１ｍｍｏｌ、Ｂａｃｈｅｍ）を添加する。混合物を、室温で３０分間撹拌する。アセトニトリルを減圧下で蒸発させ、ペプチド混合物をＣ１８カラムで濾過して、Ｃｂｚ（Ｚ）－Ａｌａ末端ペプチドを生成する。
場合によっては、ＰｆＰは、ＮＨＳまたはスルホ－ＮＨＳに置き換えることができる。他の例では、アミノ酸のＡｃ保護アミンを、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、またはＣｂｚ保護することができる。他の例では、アミノ酸のアミンは、ジアルキルである。他の例では、アミノ酸のカルボン酸は遊離しており、アミノ酸は、ＨＡＴＵ＋ＤＩＥＡまたはＥＤＣ＋ＤＩＥＡ＋ＨＯＢｔなどの標準的なペプチドカップリング試薬を使用してカップリングされる。他の例では、アミノ酸は、ＤまたはＬキラリティーであり得る。アミノ酸は、天然または合成の任意のアミノ酸であり得る。
実施例４：ＤＡＰ ＢＩＩ由来の修飾された切断酵素の選択、単離および評価
本実施例では、変異体ＤＡＰ ＢＩＩ遺伝子のライブラリーの生成と、遺伝子選択からの活性な修飾切断酵素の識別について説明する。
ＤＡＰ ＢＩＩライブラリーは、実質的に実施例１に記載されるように生成され、位置１９１、１９２、１９６、３０６、３１０、６５０、６５１、６５５、および６５６（配列番号１３に記載のタンパク質の配列に基づく）から選択される残基のさまざまな組み合わせを標的とした。変異体ＤＡＰ ＢＩＩライブラリーを、ａｒｇＡ遺伝子に欠失があるＥ．ｃｏｌｉのアルギニン栄養要求性株（ＪＷ２７８６－１株）に形質転換した。切断酵素遺伝子を、ペリプラズム標的配列であるＰｅｌＢシグナル配列で発現させた。アルギニンＮ末端修飾ペプチドを添加したＭ９最小培地寒天プレートを使用して、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ上で遺伝子選択を行った。コロニーが出現するまで、プレートを３５℃でインキュベートした。選択時には、Ｎ末端修飾アルギニンペプチド（ＡＡＡＲ（配列番号２１）またはＡＲＡＡ（配列番号２９））に対して活性である修飾（例えば、ＤＡＰ ＢＩＩ）切断酵素を有する細胞は、ペプチドを切断し、アルギニンを放出する。このアルギニンの放出により、細胞は生存することができる。イサト酸無水物、５－ニトロイサト酸無水物、およびコハク酸無水物を含む、さまざまな例示的な化学試薬を使用して、アルギニン含有ペプチドのＮ末端を標識した。コロニーが出現するまで、プレートを３５℃でインキュベートした。続いて、生存している細胞からプラスミドＤＮＡを単離および配列決定して、標識アミノ酸を認識する活性な修飾切断酵素を生成する突然変異を識別した。
記載された遺伝子選択アプローチを使用して、ＤＡＰ ＢＩＩの突然変異を、野生型ＤＡＰ ＢＩＩ遺伝子に由来する例示的な活性修飾切断酵素で識別した。遺伝子選択で識別した候補を、溶液中アッセイに供した酵素変異体の精製によって確認した。切断酵素遺伝子は、タンパク質のＣ末端に融合したヘキサヒスチジンタグをコードする。これにより、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィーによって切断酵素を精製することができる。精製された修飾切断酵素の候補を、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、切断酵素（１００ｎＭ～１μＭ）、および配列番号２２に記載されるような配列ＡＡＧＶＡＭＰＧＡＥＤＤＶＶＧＳＧＳＫ（Ｎ３）のＮ末端標識ペプチド（１００μＭ）から構成される反応混合物においてアッセイした。反応物を、２５℃～３７℃の間で３０分間～３時間インキュベートした。次に、反応混合物を、生成物の識別のためにＬＣ－ＭＳによって分析した。
単一の標識末端アミノ酸を除去した例示的な切断酵素が識別され、表１０に示されるのと同様の切断活性を示すことが明らかにされた。確認した活性な修飾ジペプチド切断酵素は、表１１に記載の突然変異を含み、例示的なアミノ酸置換は、配列番号１３に記載されるそれぞれの参照未修飾ＤＡＰ ＢＩＩ配列に対応するアミノ酸位置番号で表される。アミノ酸の位置は中央に示され、対応する未修飾（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前に列挙され、識別した変異型アミノ酸置換が番号の後に列挙される。示されるように、ＬＣ－ＭＳデータは、標識末端アミノ酸（Ａ）の切断および除去後、Ｃ末端産物であるＡＧＶＡＭＰＧＡＥＤＤＶＶＧＳＧＳＫ（Ｎ３）の予想質量と一致する８３６．４の観測質量を有する生成物を識別した。これらのデータは、記載されたプロセスが、野生型ジペプチド切断酵素であるＤＡＰ ＢＩＩを修飾し、これが未標識ジペプチドを自然に除去して、単一の標識末端アミノ酸を除去することを実証する。
Figure 2022526939000048
Figure 2022526939000049
実施例５：外因性の活性化されたブロックアミノ酸によるペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）の標識
本実施例では、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を標識するための試薬の合成、および遺伝子選択から単離された修飾切断酵素による標識ポリペプチドの処理について説明する。ポリペプチドのＮＴＡＡを修飾するために使用された標識には、化学的に標識されたアラニン残基（２－アジドベンズアミド－Ａｌａ－ｐＦＰ）が含まれていた。
Ａ．２－アジドベンズアミド－Ａｌａ－ｐＦＰ（Ｎ－（２－アジドベンゾイル）－Ｌ－アラニン－ペンタフルオロフェノールエステル）の合成
Figure 2022526939000050
 イサト酸無水物を含有する丸底フラスコをジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、撹拌した。これに、ＤＣＭに溶解したＬ－アラニン－ｔｅｒｔ－ブチルエステル塩酸塩およびトリエチルアミンの溶液を撹拌溶液に滴下した。混合物を、２５℃で１８時間反応させた。完了したら（ＬＣＭＳで監視）、溶液を真空で凝縮し、１００ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）に再溶解した。有機層を水で、次にブラインで洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、凝縮した。得られた油を少量のＤＣＭに溶解し、シリカゲル（ＳｉＯ２）に乾燥充填し、フラッシュクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン中０～８０％のＥｔＯＡｃ）を使用して所望の化合物Ｎ－（２－アミノベンゾイル－）Ｌ－アラニン－ｔｅｒｔ－ブチルエステル［１ａ］を分離した。所望の生成物を含む画分をプールし、凝縮して、８７％の収率を得た。
Figure 2022526939000051
１ａを含む丸底フラスコに撹拌棒を加え、次に１０％ＨＣｌ（水溶液）に溶解し、氷浴中で撹拌した。別のバイアルで、１．１モル当量の亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）を水に溶解し、１ａの冷却撹拌溶液にゆっくりと加えた。３０分間撹拌した後、１．５モル当量のアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）の水溶液を、１ａおよびＮａＮＯ２の溶液に滴下し、室温までゆっくりと上昇させながら、さらに３０分～１時間撹拌した。結果としてオフホワイトの沈殿物が形成され、溶液を濾過し、追加の水およびｎ－ヘプタンで洗浄して、わずかに黄色の固体を得た（収率９０％；Ｎ－（２－アジドベンゾイル－）Ｌ－アラニン－ｔｅｒｔ－ブチルエステル［１ｂ］）。
Figure 2022526939000052
固体１ｂを、撹拌棒を備える丸底フラスコに入れ、３０ｍＬの１：９トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ＤＣＭに溶解した。溶液を室温で３．５時間撹拌し、その時点で、ＴＬＣはｔｅｒｔ－ブチルエステルのカルボン酸への完全な変換を示した。溶液を真空で凝縮してＴＦＡを除去し、油をＤＣＭに溶解し、ＳｉＯ２に充填して、カラム精製を行った（ｎ－ヘプタン中０～１００％のＥｔＯＡｃ）。所望の生成物であるＮ－（２－アミノベンゾイル－）Ｌ－アラニン［１ｃ］を含む画分をプールし、凝縮した（９９％の収率）。
Figure 2022526939000053
オフホワイトの固体［１ｃ］を、撹拌棒を備える丸底フラスコに入れ、アルゴン雰囲気下に置いた。乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）をフラスコに供給して、固体を溶解させた。続いて、１．１当量のペンタフルオロフェノール（ｐＦＰ）をＴＨＦに溶解し、［１ｃ］を含むフラスコに加え、２５℃で５分間撹拌した。次に、１．１当量のジシクロヘキサンカルボジイミドをＴＨＦに溶解し、撹拌溶液にゆっくりと加えた。白色沈殿物が形成されるまで、反応物を１８時間撹拌し続けた。反応が完了したら、固体を濾過し、ＴＨＦで洗浄した。濾液を凝縮し、少量のＴＨＦに再懸濁した。溶液を再度濾過して、固形物を除去した。ＴＨＦ溶液を再び凝縮し、最小量のＤＣＭに溶解した。溶液をＳｉＯ２上に乾燥充填して、カラムクロマトグラフィーを行った（ｎ－ヘプタン中０～６０％のＥｔＯＡｃ）。表題化合物を含む画分をプールし、凝縮して、白色固体（７２％の収率）を得た［１ｄ］。
Ｂ． ＤＡＰ ＢＩＩ由来の修飾された切断酵素の選択および単離
ライブラリーの生成およびＤＡＰ ＢＩＩ遺伝子の選択を、実施例４に実質的に記載されるように実行した。ＤＡＰ ＢＩＩライブラリーは、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、３０２、３０６、３１０、および６５０（配列番号１３に記載のタンパク質の配列に基づく）から選択される残基のさまざまな組み合わせを標的とした。この実験では、選択に使用されるＮ末端修飾アルギニンペプチド（２－アミノベンズアミド－ＡＡＡＲ、配列番号２１）を、化学試薬であるイサト酸無水物で処理して調製した。続いて、生存している細胞からプラスミドＤＮＡを単離および配列決定して、標識アミノ酸を認識する活性な修飾切断酵素を生成する突然変異を識別した。記載された遺伝子選択アプローチを使用して、ＤＡＰ ＢＩＩの突然変異を、野生型ＤＡＰ ＢＩＩ遺伝子に由来する例示的な活性修飾切断酵素で識別した。遺伝子選択で識別した切断酵素の候補を、溶液中アッセイに供した酵素変異体の精製によって確認した。切断酵素遺伝子は、タンパク質のＣ末端に融合したヘキサヒスチジンタグをコードする。これにより、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィーによって切断酵素を精製することができる。精製した修飾切断酵素の候補を、反応混合物中でアッセイした。
配列番号１７、１８および１９に記載されるような配列を含む３つの例示的なジペプチド切断酵素が識別され、２－アミノベンズアミド標識ペプチドに対して活性を示すことが示された。確認した活性な修飾ジペプチド切断酵素は、突然変異Ｄ１８８Ｖ／Ｉ１８９Ａ／Ｄ１９０Ｓ／Ｎ１９１Ｌ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｓ／Ａ３０２Ｗ／Ｎ３１０Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、またはＮ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａを含み、例示的なアミノ酸置換は、配列番号１３に記載されるそれぞれの参照未修飾ＤＡＰ ＢＩＩ配列に対応するアミノ酸位置番号で表される。アミノ酸の位置は中央に示され、対応する未修飾（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前に列挙され、識別した変異型アミノ酸置換が番号の後に列挙される。
Ｃ．修飾された切断酵素の認識および活性についての、修飾としての２－アジドベンズアミド－Ａｌａ－ｐＦＰの評価
突然変異Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａを有する、配列番号１８に記載されるようなアミノ酸配列を含む、セクションＢに記載されるような遺伝子選択から識別された例示的な修飾切断酵素の１つを、上記のセクションＡで説明したように合成された外因性アラニンで標識されたペプチドに対する認識および活性について評価した。選択的切断のために修飾アラニンを導入する表題化合物の能力の実行可能性を示すために、合成ペプチド（Ｈ－ＩＨＡＧＹＡＷ－ＯＨ；配列番号３０）を［１ｄ］で官能化した。［１ｄ］の溶液（５００ｍＭジメチルアセトアミド；ＤＭＡｃ）を新たに調製した。ペプチドもＤＭＡｃに溶解して、１００ｍＭの濃度にした。次に、１．５ｍＬチューブに、５０μＬの０．４Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．６）および２５μＬのアセトニトリルを加えた。これに、１００ｍＭペプチド溶液１０μＬを加えて混合した。最後に、１５μＬの５００ｍＭ ［１ｄ］を添加し、チューブ内の溶液を５０℃のサーモミキサーに３０分間入れた。インキュベーション中に、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中の修飾切断酵素（配列番号１８）の８０μＬ、１．２５ｕＭ溶液を作製することによって、別の１．５ｍＬチューブ内の溶液を調製した。
ＩＨＡＧＹＡＷペプチドを３０分間インキュベートした後、２０μＬのアリコートを取り出し、修飾された切断酵素を含む溶液に加えた。次に、修飾された切断酵素および標識ペプチドの溶液を、３７℃で１～１８時間インキュベートした。反応のアリコートを取り、ＬＣＭＳに注入することにより、切断事象の進行を監視した。
Figure 2022526939000054
表１２に示すように、ペプチドを［１ｄ］で処理すると、予想分子量の生成物が得られた。ここで標識されたペプチド（２－アミノベンズアミド－ＡＩＨＡＧＹＡＷ）の切断を、１８時間後に完了するまで観察した。２－アミノベンズアミド－ＡＩの喪失は、ＬＣＭＳで観察された唯一の切断事象であった。１８時間のインキュベーション後、残っている２－アミノベンズアミド－ＡＩＨＡＧＹＡＷは観察されなかった。これらのデータは、遺伝子選択からの試験された単離修飾切断酵素が、ジペプチド（２－アミノベンズアミド－ＡＩ）の一部として外因性の添加された化学標識アラニンを含む、処理されたポリペプチドから予想される標識ジペプチドを除去したことを示す。この例示的なアプローチを使用して、野生型ジペプチド切断酵素（ＤＡＰ ＢＩＩ）に由来する試験された修飾切断酵素を修飾して、ポリペプチドから単一の標識アミノ酸（外因性Ｎ末端ブロックアミノ酸、２－アミノベンズアミド－Ａで標識）を除去した。
Ｄ．エラープローンライブラリーからの修飾切断酵素の生成および選択
配列番号１８に記載される、識別されたジペプチド切断酵素から始めて、キュンケル突然変異誘発と組み合わせたエラープローンＰＣＲをさらに使用して、所望の突然変異頻度範囲にわたって正確に制御して、複雑さが約１０９であるライブラリーを生成した（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２０１３）３９４（１－２）：５５－６１）。発現および選択を、実質的に遺伝子選択について上記したように実施した。識別および精製された修飾切断酵素の候補を、実質的に上記のように溶液中アッセイを使用して評価し、２－アミノベンズアミド－ＡＡＧＶＡＭＰＧＡＥＤＤＶＶＧＳＧＳＫ（Ｎ３）ペプチドの切断を試験し、ＬＣ－ＭＳを実行して生成物を識別した。表１３に示される確認された修飾ジペプチド切断酵素は、予想通りに、観察された切断生成物で切断活性を示すことが観察され、試験された２－アミノベンズアミド標識ペプチドから標識ジペプチドが除去された。表では、例示的なアミノ酸置換が、配列番号１３に記載されるそれぞれの参照未修飾ＤＡＰ ＢＩＩ配列に対応するアミノ酸位置番号で表される。アミノ酸の位置は中央に示され、対応する未修飾（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前に列挙され、識別した変異型アミノ酸置換が番号の後に列挙される。場合によっては、記載された方法を使用して識別した修飾切断酵素を使用して、外因性アミノ酸を含むペプチドから標識ジペプチドを除去し、結果として、元のペプチドから単一アミノ酸（Ｐ１）を正味除去することができる。
Figure 2022526939000055
本開示は、例えば、本発明のさまざまな態様を説明するために提供される特定の開示された実施形態に範囲を限定することを意図するものではない。記載される組成物および方法に対するさまざまな変更が、本明細書の説明および教示から明らかになるであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内であることが意図される。これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を持つ均等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
Figure 2022526939000056
Figure 2022526939000057
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Claims (205)

  1. 突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された切断酵素であって、
    前記修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成されているか、あるいは
    前記修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成されている、修飾された切断酵素。
  2. 前記ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成されている、請求項１に記載の修飾された切断酵素。
  3. 前記トリペプチド切断酵素に由来する前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの最後から２番目の末端標識アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間の前記ペプチド結合を切断するように構成されている、請求項１に記載の修飾された切断酵素。
  4. 前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの前記末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のアミド結合と相互作用する活性部位を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  5. 前記未修飾の切断酵素が、メタロペプチダーゼ、亜鉛依存性メタロペプチダーゼ、または亜鉛依存性ヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  6. 前記未修飾の切断酵素が、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  7. 前記未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼである、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  8. 前記未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ３、ジペプチジルペプチダーゼ５、ジペプチジルペプチダーゼ７、ジペプチジルペプチダーゼ１１、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ、またはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩである、請求項１～７のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  9. 前記標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  10. 前記標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  11. 前記末端アミノ酸が、化学もしくは酵素試薬または部分で標識されている、請求項１～１０のいずれかに記載の修飾された切断酵素。
  12. 前記標識が、ブロックアミノ酸を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の修飾された切断酵素。
  13. 前記標識が、外因性アミノ酸を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の修飾された切断酵素。
  14. 前記標識が、化学標識を含む、請求項１～１３のいずれかに記載の修飾された切断酵素。
  15. 前記化学試薬が、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）、ニトロ－ＰＩＣ、スルホ－ＰＩＣ、Ｃｂｚ－Ｃｌ（クロロギ酸ベンジル）またはＣｂｚ－ＯＳｕ（ベンジルオキシカルボニルＮ－スクシンイミド）、カルボキシル活性化アミノブロックアミノ酸、無水物、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ－Ｃｌ、または１－ジメチルアミノナフタレン－５－スルホニルクロリド）、４－スルホニル－２－ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、２－ピリジンカルボキシアルデヒド、２－ホルミルフェニルボロン酸、２－アセチルフェニルボロン酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ペンタフルオロフェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、３－（カルボン酸）－フェニルイソチオシアネート、３－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、１－ナフチルイソチオシアネート、Ｎ－ニトロイミダゾール－１－カルボキシミダミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（ピバロイル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビス（ベンジルオキシカルボニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、チオベンジル化試薬、および二複素環メタニミン試薬、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の修飾された切断酵素。
  16. 前記化学試薬が、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物、アザイサト酸無水物、コハク酸無水物、またはそれらの誘導体である、請求項１１に記載の修飾された切断酵素。
  17. 前記化学試薬がからなる群から選択され、前記化学試薬が、４－ニトロフェニルアントラニレート、Ｎ－メチル－イサト酸無水物、Ｎ－アセチル－イサト酸無水物、４－カルボン酸イサト酸無水物、５－メトキシ－イサト酸無水物、５－ニトロ－イサト酸無水物、４－クロロ－イサト酸無水物、４－フルオロ－イサト酸無水物、６－フルオロ－イサト酸無水物、Ｎ－ベンジル－イサト酸無水物、４－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、５－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、４－ニトロ－イサト酸無水物、４－メトキシ－イサト酸無水物、５－アミノ－２－フルオロ－イソニコチン無水物（６－フルオロ－１Ｈ－ピリド［３，４－ｄ］［１，３］オキサジン－２，４－ジオン）、３，６，ジフルオロフタル酸無水物、および２，３ピラジンジカルボン酸無水物、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１６に記載の修飾された切断酵素。
  18. 前記修飾された切断酵素が、前記未修飾の切断酵素と少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  19. 前記突然変異が、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  20. 前記ポリペプチドの長さが、４個のアミノ酸を超える、５個のアミノ酸を超える、６個のアミノ酸を超える、７個のアミノ酸を超える、８個のアミノ酸を超える、９個のアミノ酸を超える、１０個のアミノ酸を超える、１１個のアミノ酸を超える、１２個のアミノ酸を超える、１３個のアミノ酸を超える、１４個のアミノ酸を超える、１５個のアミノ酸を超える、２０個のアミノ酸を超える、２５個のアミノ酸を超える、または３０個のアミノ酸を超える、請求項１～１９のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  21. 前記ポリペプチドの前記長さが、１０個のアミノ酸を超える、請求項１～２０のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  22. 前記修飾された切断酵素が、その基質結合部位内に修飾を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  23. 前記修飾された切断酵素が、その触媒ドメイン内に修飾を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  24. 前記修飾された切断酵素が、そのキモトリプシンフォールド内に修飾を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  25. 前記修飾された切断酵素が、アミン結合部位に修飾を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  26. 前記修飾された切断酵素が、そのループドメインに修飾を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  27. 前記修飾された切断酵素が、前記修飾された切断酵素の前記活性部位へのアクセス可能性を改善するための修飾を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  28. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３または２０に規定されるようなジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩまたはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩに由来する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  29. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、もしくは少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列、またはその特異的結合断片を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  30. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８のうちのいずれかに記載のアミノ酸の配列、もしくは配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列、またはその特異的結合断片を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  31. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  32. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  33. 前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ａ１２６Ｔ、Ｄ１８８Ｖ、Ｉ１８９Ａ、Ｄ１９０Ｓ、Ｎ１９１Ｃ、Ｎ１９１Ｆ、Ｎ１９１Ｌ、Ｎ１９１Ｍ、Ｎ１９１Ｒ、Ｎ１９１Ｓ、Ｎ１９１Ｔ、Ｎ１９１Ｖ、Ｗ１９２Ｆ、Ｗ１９２Ｇ、Ｗ１９２Ｌ、Ｒ１９６Ｈ、Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１９６Ｓ、Ｒ１９６Ｔ、Ｒ１９６Ｖ、Ｇ２３８Ｖ、Ａ３０２Ｗ、Ｎ３０６Ａ、Ｎ３０６Ｇ、Ｎ３０６Ｒ、Ｎ３０６Ｓ、Ｔ３０７Ｋ、Ｎ３１０Ｄ、Ｎ３１０Ｇ、Ｎ３１０Ｋ、Ｎ３１０Ｌ、Ｎ５２５Ｋ、Ａ５２８Ｖ、Ｆ５４６Ｌ、Ａ６０４Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｇ、Ｄ６５０Ｓ、Ｇ６５１Ｈ、Ｇ６５１Ｔ、Ｇ６５１Ｖ、Ｇ６５１Ｙ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｔ、Ｖ６５６Ｅ、Ｖ６５６Ｇ、Ｖ６５６Ｓ、Ｋ６６５Ｉ、Ｋ６９２Ｎ、および／またはそれらの保存的アミノ酸置換である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  34. 前記１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｄ１８８Ｖ／Ｉ１８９Ａ／Ｄ１９０Ｓ／Ｎ１９１Ｌ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｓ／Ａ３０２Ｗ／Ｎ３１０Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｔ３０７Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ５２５Ｋ／Ａ５２８Ｖ／Ａ６０４Ｖ／Ｄ６５０Ａ／Ｋ６９２Ｎ、Ａ１２６Ｔ／Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｇ２３８Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｆ５４６Ｌ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ／Ｋ６６５Ｉ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｒ１９６Ｋ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｆ／Ｗ１９２Ｆ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｇ／Ｇ６５１Ｈ／Ｖ６５６Ｅ、Ｎ１９１Ｒ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｓ／Ｎ３１０Ｌ／Ｇ６５１Ｔ／Ｓ６５５Ｔ／Ｖ６５６Ｓ、Ｎ１９１Ｓ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｔ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｍ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｖ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｓ、またはＮ１９１Ｓ／Ｎ３０６Ｇ／Ｄ６５０Ｓである、請求項１～３３のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  35. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９の配列のうちのいずれかの基質特異性を示す、請求項１～３４のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  36. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記触媒ドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有する触媒ドメインを含むアミノ酸配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  37. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記アミン結合部位と、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミン結合部位を含むアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  38. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記ループドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するループドメインと、を含むアミノ酸配列を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  39. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および／または２０２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  40. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、３０２、および／または３１０に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  41. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１９１、１９２、１９６、３０６、３１０、６２７、６２８、６３０、６４８、６５０、６５１、６５５、６５６、および／または６６９に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  42. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置３２３～５４４のうちのいずれかに対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の修飾された切断酵素。
  43. ポリペプチドを処理する方法であって、前記ポリペプチドを、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と接触させることを含み、
    前記修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成されているか、あるいは
    前記修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成されている、方法。
  44. 前記ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間の前記ペプチド結合を切断するように構成されている、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの前記末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間の前記アミド結合と相互作用する活性部位を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 前記単一の標識末端アミノ酸または単一の標識末端ジペプチドの前記除去が、前記ポリペプチドの新たな末端アミノ酸を露出させる、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記未修飾の切断酵素が、メタロペプチダーゼ、亜鉛依存性メタロペプチダーゼ、または亜鉛依存性ヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記未修飾の切断酵素が、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼである、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ３、ジペプチジルペプチダーゼ５、ジペプチジルペプチダーゼ７、ジペプチジルペプチダーゼ１１、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ、またはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩである、請求項４３～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を含む、請求項４３～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）を含む、請求項４３～５０のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記修飾された切断酵素が、前記未修飾の切断酵素と少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項４３～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記突然変異が、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記ポリペプチドの前記長さが、４個のアミノ酸を超える、５個のアミノ酸を超える、６個のアミノ酸を超える、７個のアミノ酸を超える、８個のアミノ酸を超える、９個のアミノ酸を超える、１０個のアミノ酸を超える、１１個のアミノ酸を超える、１２個のアミノ酸を超える、１３個のアミノ酸を超える、１４個のアミノ酸を超える、１５個のアミノ酸を超える、２０個のアミノ酸を超える、２５個のアミノ酸を超える、または３０個のアミノ酸を超える、請求項４３～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ポリペプチドの前記長さが、１０個のアミノ酸を超える、請求項４３～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記修飾された切断酵素が、その基質結合部位内に修飾を含む、請求項４３～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記修飾された切断酵素が、その触媒ドメイン内に修飾を含む、請求項４３～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記修飾された切断酵素が、そのキモトリプシンフォールド内に修飾を含む、請求項４３～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記修飾された切断酵素が、アミン結合部位に修飾を含む、請求項４３～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記修飾された切断酵素が、そのループドメインに修飾を含む、請求項４３～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記修飾された切断酵素が、前記修飾された切断酵素の前記活性部位へのアクセス可能性を改善するための修飾を含む、請求項４３～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３または２０に規定されるようなジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩまたはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩに由来する、請求項４３～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、もしくは少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列、またはその特異的結合断片を含む、請求項４３～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに記載のアミノ酸の配列、もしくは配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列、またはその特異的結合断片を含む、請求項４３～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項４３～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項４３～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ａ１２６Ｔ、Ｄ１８８Ｖ、Ｉ１８９Ａ、Ｄ１９０Ｓ、Ｎ１９１Ｃ、Ｎ１９１Ｆ、Ｎ１９１Ｌ、Ｎ１９１Ｍ、Ｎ１９１Ｒ、Ｎ１９１Ｓ、Ｎ１９１Ｔ、Ｎ１９１Ｖ、Ｗ１９２Ｆ、Ｗ１９２Ｇ、Ｗ１９２Ｌ、Ｒ１９６Ｈ、Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１９６Ｓ、Ｒ１９６Ｔ、Ｒ１９６Ｖ、Ｇ２３８Ｖ、Ａ３０２Ｗ、Ｎ３０６Ａ、Ｎ３０６Ｇ、Ｎ３０６Ｒ、Ｎ３０６Ｓ、Ｔ３０７Ｋ、Ｎ３１０Ｄ、Ｎ３１０Ｇ、Ｎ３１０Ｋ、Ｎ３１０Ｌ、Ｎ５２５Ｋ、Ａ５２８Ｖ、Ｆ５４６Ｌ、Ａ６０４Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｇ、Ｄ６５０Ｓ、Ｇ６５１Ｈ、Ｇ６５１Ｔ、Ｇ６５１Ｖ、Ｇ６５１Ｙ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｔ、Ｖ６５６Ｅ、Ｖ６５６Ｇ、Ｖ６５６Ｓ、Ｋ６６５Ｉ、Ｋ６９２Ｎ、および／またはそれらの保存的アミノ酸置換である、請求項４３～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｄ１８８Ｖ／Ｉ１８９Ａ／Ｄ１９０Ｓ／Ｎ１９１Ｌ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｓ／Ａ３０２Ｗ／Ｎ３１０Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｔ３０７Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ５２５Ｋ／Ａ５２８Ｖ／Ａ６０４Ｖ／Ｄ６５０Ａ／Ｋ６９２Ｎ、Ａ１２６Ｔ／Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｇ２３８Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｆ５４６Ｌ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ／Ｋ６６５Ｉ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｒ１９６Ｋ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｆ／Ｗ１９２Ｆ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｇ／Ｇ６５１Ｈ／Ｖ６５６Ｅ、Ｎ１９１Ｒ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｓ／Ｎ３１０Ｌ／Ｇ６５１Ｔ／Ｓ６５５Ｔ／Ｖ６５６Ｓ、Ｎ１９１Ｓ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｔ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｍ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｖ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｓ、またはＮ１９１Ｓ／Ｎ３０６Ｇ／Ｄ６５０Ｓである、請求項４３～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９の配列のうちのいずれかの配列の前記基質特異性を示す、請求項４３～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記触媒ドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有する触媒ドメインを含むアミノ酸配列を含む、請求項４３～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記アミン結合部位と、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミン結合部位を含むアミノ酸配列を含む、請求項４３～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記ループドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するループドメインと、を含むアミノ酸配列を含む、請求項４３～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および／または２０２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項４３～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、３０２、および／または３１０に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項４３～７３のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１９１、１９２、１９６、３０６、３１０、６２７、６２８、６３０、６４８、６５０、６５１、６５５、６５６、および／または６６９に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項４３～７３のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置３２３～５４４のうちのいずれかに対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項４３～７３のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前駆体ポリペプチドを、前記前駆体ポリペプチドの前記末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させて、前記修飾された切断酵素で処理するために調製されたポリペプチドを提供することをさらに含む、請求項４３～７８のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記末端アミノ酸を標識するための前記試薬が、化学試薬または酵素試薬である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記標識が、ブロックアミノ酸を含む、請求項４３～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記標識が、外因性標識アミノ酸を含む、請求項４３～８０のいずれかに記載の方法。
  82. 前記標識が、化学標識を含む、請求項４３～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記末端アミノ酸を標識するための前記試薬との前記接触および前記修飾された切断酵素との接触が、連続した順序で行われる、請求項７８～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記末端アミノ酸を標識するための前記試薬との前記接触および前記修飾された切断酵素との接触が、１回以上繰り返される、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記化学試薬が、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）、ニトロ－ＰＩＣ、スルホ－ＰＩＣ、Ｃｂｚ－Ｃｌ（クロロギ酸ベンジル）またはＣｂｚ－ＯＳｕ（ベンジルオキシカルボニルＮ－スクシンイミド）、カルボキシル活性化アミノブロックアミノ酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ－Ｃｌ、または１－ジメチルアミノナフタレン－５－スルホニルクロリド）、４－スルホニル－２－ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、無水物、２－ピリジンカルボキシアルデヒド、２－ホルミルフェニルボロン酸、２－アセチルフェニルボロン酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ペンタフルオロフェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、３－（カルボン酸）－フェニルイソチオシアネート、３－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、１－ナフチルイソチオシアネート、Ｎ－ニトロイミダゾール－１－カルボキシミダミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（ピバロイル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビス（ベンジルオキシカルボニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、チオベンジル化試薬、および二複素環メタニミン試薬、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記化学試薬が、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物、アザイサト酸無水物、コハク酸無水物、またはそれらの誘導体である、請求項７９～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記化学試薬が、４－ニトロフェニルアントラニレート、Ｎ－メチル－イサト酸無水物、Ｎ－アセチル－イサト酸無水物、４－カルボン酸イサト酸無水物、５－メトキシ－イサト酸無水物、５－ニトロ－イサト酸無水物、４－クロロ－イサト酸無水物、４－フルオロ－イサト酸無水物、６－フルオロ－イサト酸無水物、Ｎ－ベンジル－イサト酸無水物、４－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、５－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、４－ニトロ－イサト酸無水物、４－メトキシ－イサト酸無水物、５－アミノ－２－フルオロ－イソニコチン無水物（６－フルオロ－１Ｈ－ピリド［３，４－ｄ］［１，３］オキサジン－２，４－ジオン）、３，６，ジフルオロフタル酸無水物、および２，３ピラジンジカルボン酸無水物、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ポリペプチドを、前記ポリペプチドの前記末端アミノ酸に結合することができる結合剤と接触させることをさらに含み、前記結合剤が、前記結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、請求項４３～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記結合剤が、２つ以上の結合剤を含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記結合剤が、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合する、請求項８８または請求項８９に記載の方法。
  91. 前記結合剤が、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）に結合する、請求項８８または請求項８９に記載の方法。
  92. 前記結合剤が、標識または未標識末端アミノ酸に結合することができる、請求項８８～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記結合剤との前記接触が、
    前記ポリペプチドを、前記末端アミノ酸を標識するための前記試薬と接触させる前、および／または
    前記ポリペプチドを、前記修飾された切断酵素と接触させる前である、請求項８８～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記結合剤との前記接触が、前記ポリペプチドを、前記末端アミノ酸を標識するための前記試薬と接触させた後である、請求項８８～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記末端アミノ酸を標識するための前記試薬との前記接触が、前記結合剤との前記接触の前であり、
    前記結合剤との前記接触が、前記ポリペプチドと前記修飾された切断酵素との前記接触の前である、請求項８８～９２のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記ポリペプチドと前記結合剤、前記末端アミノ酸を標識するための前記試薬、および前記修飾された切断酵素との前記接触が、１回以上繰り返される、請求項８８～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記コーディングタグの前記識別情報を前記ポリペプチドに付着した記録タグに転送し、それによって前記ポリペプチド上に伸長記録タグを生成することをさらに含む、請求項８８～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記識別情報の転送が、
    前記ポリペプチドと前記結合剤との前記結合の後、および
    前記ポリペプチドと前記修飾された切断酵素との前記接触の前に実行される、請求項９７に記載の方法。
  99. （ａ）前記ポリペプチドを前記結合剤と接触させるステップ、
    （ｂ）識別情報を前記記録タグに転送するステップ、
    （ｃ）前記ポリペプチドを、前記末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させるステップ、および
    （ｄ）前記ポリペプチドを修飾された切断酵素と接触させるステップが、
    順番に繰り返されて、１つ以上の追加の伸長記録タグを生成する、請求項９７または請求項９８に記載の方法。
  100. ステップ（ｂ）の後およびステップ（ｃ）の前に、前記結合剤を除去することをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
  101. （ａ）前記ポリペプチドを、前記末端アミノ酸を標識するための試薬と接触させるステップ、
    （ｂ）前記ポリペプチドを、前記標識末端アミノ酸に結合することができる前記結合剤と接触させるステップ、
    （ｃ）識別情報を前記記録タグに転送するステップ、および
    （ｄ）前記ポリペプチドを修飾された切断酵素と接触させるステップが、
    順番に繰り返されて、１つ以上の追加の伸長記録タグを生成する、請求項９７または請求項９８に記載の方法。
  102. ステップ（ｃ）の後およびステップ（ｄ）の前に前記結合剤を除去することをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記１つ以上の伸長記録タグを分析することをさらに含む、請求項９７～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. ポリペプチドを分析するための方法であって、
    （ａ）ポリペプチドを、前記ポリペプチドの末端アミノ酸に結合することができる結合剤と接触させるステップであって、前記結合剤が、前記結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと、
    （ｂ）前記コーディングタグの前記識別情報を前記ポリペプチドと関連付けられた記録タグに転送して、伸長記録タグを生成するステップと、
    （ｃ）前記ポリペプチドを試薬と接触させて、前記ポリペプチドの前記末端アミノ酸を標識するステップと、
    （ｄ）前記ポリペプチドを、突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素と接触させるステップと、を含み、
    前記修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ステップ（ｃ）において前記試薬によって標識された単一の末端アミノ酸を前記ポリペプチドから除去するか、または除去するように構成されているか、あるいは、
    前記修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ステップ（ｃ）において前記試薬によって標識された単一の末端アミノ酸または単一の末端ジペプチドを前記ポリペプチドから除去するか、または除去するように構成されている、方法。
  105. 前記ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間の前記ペプチド結合を切断するように構成されている、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記トリペプチド切断酵素に由来する前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの最後から２番目の末端標識アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間の前記ペプチド結合を切断するように構成されている、請求項１０４に記載の方法。
  107. 前記未修飾の切断酵素が、メタロペプチダーゼ、亜鉛依存性メタロペプチダーゼ、または亜鉛依存性ヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記未修飾の切断酵素が、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその機能的相同体もしくは断片に分類されるタンパク質である、請求項１０４～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼである、請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ３、ジペプチジルペプチダーゼ５、ジペプチジルペプチダーゼ７、ジペプチジルペプチダーゼ１１、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ、またはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩである、請求項１０４～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記結合剤が、２つ以上の結合剤を含む、請求項１０４～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記ポリペプチドが、２つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０４～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. ステップ（ａ）～（ｄ）が「ｎ」回の結合サイクルについて繰り返され、前記ポリペプチドに結合する各結合剤の各コーディングタグの前記識別情報が、前の結合サイクルから生成された前記伸長記録タグに転送されて、ｎ次伸長記録タグを生成する、請求項１０４～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. （ｂ１）前記結合剤を除去することをさらに含む、請求項１０４～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. （ｅ）前記ｎ次伸長記録タグを分析することをさらに含む、請求項１１３または請求項１１４に記載の方法。
  116. ステップ（ａ）が、ステップ（ｂ）の前に実行され、
    ステップ（ａ）が、ステップ（ｃ）の前に実行され、
    ステップ（ａ）が、ステップ（ｄ）の前に実行され、
    ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前に実行され、
    ステップ（ｂ）が、ステップ（ｄ）の前に実行され、
    ステップ（ｂ１）が、ステップ（ａ）の後に実行され、
    ステップ（ｂ１）が、ステップ（ｂ）の後に実行され、
    ステップ（ｂ１）が、ステップ（ｃ）の前に実行され、
    ステップ（ｂ１）が、ステップ（ｄ）の前に実行され、
    ステップ（ｃ）が、ステップ（ａ）の前に実行され、
    ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）の前に実行され、かつ／または、
    ステップ（ｃ）が、ステップ（ｄ）の前に実行される、請求項１０４～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記末端アミノ酸が、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）である、請求項１０４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記末端アミノ酸が、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）である、請求項１０４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記記録タグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ、分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはそれらの組み合わせである、請求項９７～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記記録タグが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項９７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、請求項９７～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記結合剤および前記コーディングタグが、リンカーによって接合される、請求項８８～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記記録タグの前記識別情報を前記コーディングタグに転送することが、プライマー伸長によって行われる、請求項９７～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記記録タグの前記識別情報を前記コーディングタグに転送することが、ライゲーションによって行われる、請求項９７～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記コーディングタグが、ＵＭＩを含む、請求項８８～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記コーディングタグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、請求項８８～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記ポリペプチドが、固体支持体に直接的または間接的に接合される、請求項４３～１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、回転干渉計ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナノ粒子、またはミクロスフェアである、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリアクリレートビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、デキストランビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、制御された多孔質ビーズ、シリカベースのビーズ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記結合剤が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項８８～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記結合剤が、アミノペプチダーゼ、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリン、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳ、ＣｌｐＳ２、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；または、１つ以上のアミノ酸に結合する修飾された小分子、すなわちバンコマイシン、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾分子；または、抗体もしくはその結合断片；あるいは、それらの任意の組み合わせである、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記結合剤が、前記ポリペプチドの単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、または翻訳後修飾に結合する、請求項８８～１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記結合剤が、Ｎ末端アミノ酸残基に結合する、請求項１０４～１３２に記載の方法。
  134. 前記結合剤が、Ｃ末端アミノ酸残基に結合する、請求項１０４～１３３に記載の方法。
  135. 前記１つ以上の伸長記録タグが、分析の前に増幅される、請求項１０３～１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記１つ以上の伸長記録タグを分析することが、核酸配列決定法を含む、請求項１０３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記核酸配列決定法が、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアベースのシーケンシング、または高度な顕微鏡を使用するＤＮＡのダイレクトイメージングである、請求項１３６または請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記ポリペプチドを前記修飾された切断酵素と前記接触させて前記単一の末端アミノ酸を除去することが、５分間未満、１０分間未満、２０分間未満、３０分間未満、４０分間未満、５０分間未満、６０分間未満、２時間未満、５時間未満、８時間未満、または１０時間未満で行われる、請求項４３～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの混合物もしくは組み合わせを分解する条件の不在下で実施される、請求項４３～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 核酸を分解する前記条件が、化学的条件である、請求項１４０に記載の方法。
  142. 核酸と適合性のある条件の存在下で実施される、請求項４３～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 強酸または強塩基の不在下で実施される、請求項１４０～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 強酸無水物（ｓｔｒｏｎｇ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）の不在下で実施される、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記強酸無水物が、ＴＦＡ無水物である、請求項１４４に記載の方法。
  146. ポリペプチドを処理するためのキットであって、
    突然変異、例えば、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾された切断酵素であって、
    前記修飾された切断酵素が、ジペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を除去するか、または除去するように構成されているか、あるいは
    前記修飾された切断酵素が、トリペプチド切断酵素に由来し、ポリペプチドから単一の標識末端アミノ酸を、もしくはポリペプチドから単一の標識末端ジペプチドを除去するか、または除去するように構成されている、修飾された切断酵素と、
    前記ポリペプチドの前記末端アミノ酸を標識するための試薬と、を含む、キット。
  147. 前記ジペプチド切断酵素またはトリペプチド切断酵素に由来する前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成されている、請求項１４６に記載のキット。
  148. 前記トリペプチド切断酵素に由来する前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの最後から２番目の末端標識アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断するように構成されている、請求項１４６に記載のキット。
  149. 前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの前記末端標識アミノ酸残基と最後から２番目の末端アミノ酸残基との間の前記アミド結合と相互作用する活性部位を含む、請求項１４６～１４８のいずれか一項に記載のキット。
  150. 前記未修飾の切断酵素が、メタロペプチダーゼ、亜鉛依存性メタロペプチダーゼ、または亜鉛依存性ヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項１４６～１４９のいずれか一項に記載のキット。
  151. 前記未修飾の切断酵素が、ＥＣ３．４．１４、ＥＣ３．４．１５、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ８、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ９、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ３３、ＭＥＲＯＰＳ Ｓ４６、ＭＥＲＯＰＳ Ｍ４９、もしくはＭＥＲＯＰＳ Ｓ５３、またはその相同体に分類されるタンパク質である、請求項１４６～１５０のいずれか一項に記載のキット。
  152. 前記未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ペプチジル－ジペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、セドリジン、またはトリペプチジルペプチダーゼである、請求項１４６～１５１のいずれか一項に記載のキット。
  153. 前記未修飾の切断酵素が、ジペプチジルペプチダーゼ３、ジペプチジルペプチダーゼ５、ジペプチジルペプチダーゼ７、ジペプチジルペプチダーゼ１１、ジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩ、またはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩである、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のキット。
  154. 前記標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を含む、請求項１４６～１５３のいずれか一項に記載のキット。
  155. 前記標識末端アミノ酸またはジペプチドが、Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）を含む、請求項１４６～１５３のいずれか一項に記載のキット。
  156. 前記修飾された切断酵素が、前記ポリペプチドの最後から２番目の末端アミノ酸残基と最後から３番目の末端アミノ酸残基との間の前記ペプチド結合を切断しない、請求項１４６～１５５のいずれか一項に記載のキット。
  157. 前記修飾された切断酵素が、前記未修飾の切断酵素と少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項１４６～１５６のいずれか一項に記載のキット。
  158. 前記突然変異が、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１４６～１５７のいずれか一項に記載のキット。
  159. 前記ポリペプチドの前記長さが、４個のアミノ酸を超える、５個のアミノ酸を超える、６個のアミノ酸を超える、７個のアミノ酸を超える、８個のアミノ酸を超える、９個のアミノ酸を超える、１０個のアミノ酸を超える、１１個のアミノ酸を超える、１２個のアミノ酸を超える、１３個のアミノ酸を超える、１４個のアミノ酸を超える、１５個のアミノ酸を超える、２０個のアミノ酸を超える、２５個のアミノ酸を超える、または３０個のアミノ酸を超える、請求項１４６～１５８のいずれか一項に記載のキット。
  160. 前記ポリペプチドの前記長さが、１０個のアミノ酸を超える、請求項１４６～１５９のいずれか一項に記載のキット。
  161. 前記修飾された切断酵素が、その基質結合部位内に修飾を含む、請求項１４６～１６０のいずれか一項に記載のキット。
  162. 前記修飾された切断酵素が、その触媒ドメイン内に修飾を含む、請求項１４６～１６１のいずれか一項に記載のキット。
  163. 前記修飾された切断酵素が、そのキモトリプシンフォールド内に修飾を含む、請求項１４６～１６２のいずれか一項に記載のキット。
  164. 前記修飾された切断酵素が、アミン結合部位に修飾を含む、請求項１４６～１６３のいずれか一項に記載のキット。
  165. 前記修飾された切断酵素が、そのループドメインに修飾を含む、請求項１４６～１６４のいずれか一項に記載のキット。
  166. 前記修飾された切断酵素が、前記修飾された切断酵素の前記活性部位へのアクセス可能性を改善するための修飾を含む、請求項１４６～１６５のいずれか一項に記載のキット。
  167. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３または２０に規定されるようなジペプチジルアミノペプチダーゼＢＩＩまたはジペプチジルペプチダーゼＢＩＩに由来する、請求項１４６～１６６のいずれか一項に記載のキット。
  168. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列、またはその特異的結合断片を含む、請求項１４６～１６７のいずれか一項に記載のキット。
  169. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８のうちのいずれかに記載のアミノ酸の配列、もしくは配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列、またはその特異的結合断片を含む、請求項１４６～１６８のいずれか一項に記載のキット。
  170. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１４６～１６９のいずれか一項に記載のキット。
  171. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１２６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９６、２３８、３０２、３０６、３０７、３１０、５２５、５２８、５４６、６０４、６５０、６５１、６５５、６５６、６６５および／または６９２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含み、配列番号１７～１９、２３～２８、３１～３９のうちのいずれかに対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項１４６～１７０のいずれか一項に記載のキット。
  172. 前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ａ１２６Ｔ、Ｄ１８８Ｖ、Ｉ１８９Ａ、Ｄ１９０Ｓ、Ｎ１９１Ｃ、Ｎ１９１Ｆ、Ｎ１９１Ｌ、Ｎ１９１Ｍ、Ｎ１９１Ｒ、Ｎ１９１Ｓ、Ｎ１９１Ｔ、Ｎ１９１Ｖ、Ｗ１９２Ｆ、Ｗ１９２Ｇ、Ｗ１９２Ｌ、Ｒ１９６Ｈ、Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１９６Ｓ、Ｒ１９６Ｔ、Ｒ１９６Ｖ、Ｇ２３８Ｖ、Ａ３０２Ｗ、Ｎ３０６Ａ、Ｎ３０６Ｇ、Ｎ３０６Ｒ、Ｎ３０６Ｓ、Ｔ３０７Ｋ、Ｎ３１０Ｄ、Ｎ３１０Ｇ、Ｎ３１０Ｋ、Ｎ３１０Ｌ、Ｎ５２５Ｋ、Ａ５２８Ｖ、Ｆ５４６Ｌ、Ａ６０４Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｇ、Ｄ６５０Ｓ、Ｇ６５１Ｈ、Ｇ６５１Ｔ、Ｇ６５１Ｖ、Ｇ６５１Ｙ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｔ、Ｖ６５６Ｅ、Ｖ６５６Ｇ、Ｖ６５６Ｓ、Ｋ６６５Ｉ、Ｋ６９２Ｎ、および／またはそれらの保存的アミノ酸置換である、請求項１４６～１７１のいずれか一項に記載のキット。
  173. 前記１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｄ１８８Ｖ／Ｉ１８９Ａ／Ｄ１９０Ｓ／Ｎ１９１Ｌ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｓ／Ａ３０２Ｗ／Ｎ３１０Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｔ３０７Ｋ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ５２５Ｋ／Ａ５２８Ｖ／Ａ６０４Ｖ／Ｄ６５０Ａ／Ｋ６９２Ｎ、Ａ１２６Ｔ／Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｇ２３８Ｖ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｆ５４６Ｌ／Ｄ６５０Ａ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ／Ｋ６６５Ｉ、Ｎ１９１Ｍ／Ｗ１９２Ｇ／Ｒ１９６Ｔ／Ｎ３０６Ｒ／Ｄ６５０Ａ／Ｇ６５１Ｖ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｒ１９６Ｋ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｃ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｄ／Ｇ６５１Ｙ／Ｓ６５５Ｇ／Ｖ６５６Ｇ、Ｎ１９１Ｆ／Ｗ１９２Ｆ／Ｎ３０６Ｒ／Ｎ３１０Ｇ／Ｇ６５１Ｈ／Ｖ６５６Ｅ、Ｎ１９１Ｒ／Ｗ１９２Ｌ／Ｎ３０６Ｓ／Ｎ３１０Ｌ／Ｇ６５１Ｔ／Ｓ６５５Ｔ／Ｖ６５６Ｓ、Ｎ１９１Ｓ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｔ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｍ／Ｒ１９６Ｈ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｇ、Ｎ１９１Ｖ／Ｎ３０６Ａ／Ｄ６５０Ｓ、またはＮ１９１Ｓ／Ｎ３０６Ｇ／Ｄ６５０Ｓである、請求項１４６～１７２のいずれか一項に記載のキット。
  174. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、または３１～３９の配列のうちのいずれかの前記基質特異性を示す、請求項１４６～１７３のいずれか一項に記載のキット。
  175. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記触媒ドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有する触媒ドメインを含むアミノ酸配列を含む、請求項１４６～１７４のいずれか一項に記載のキット。
  176. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記アミン結合部位と、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するアミン結合部位を含むアミノ酸配列を含む、請求項１４６～１７５のいずれか一項に記載のキット。
  177. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１７～１９、２３～２８、もしくは３１～３９のうちのいずれかの前記ループドメインと、少なくとも２０％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも１２８％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％以上の同一性を有するループドメインと、を含むアミノ酸配列を含む、請求項１４６～１７６のいずれか一項に記載のキット。
  178. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および／または２０２に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１４６～１７７のいずれか一項に記載のキット。
  179. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、３０２、および／または３１０に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１４６～１７７のいずれか一項に記載のキット。
  180. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置１９１、１９２、１９６、３０６、３１０、６２７、６２８、６３０、６４８、６５０、６５１、６５５、６５６、および／または６６９に対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１４６～１７７のいずれか一項に記載のキット。
  181. 前記修飾された切断酵素が、配列番号１３の番号付けに関して、位置３２３～５４４のうちのいずれかに対応する、未修飾の切断酵素における１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１４６～１７７のいずれか一項に記載のキット。
  182. 前記末端アミノ酸が、化学もしくは酵素試薬または部分で標識されている、請求項１４６～１８１のいずれかに記載のキット。
  183. 前記標識が、ブロックアミノ酸を含む、請求項１４６～１８２のいずれかに記載のキット。
  184. 前記標識が、外因性標識アミノ酸を含む、請求項１４６～１８３のいずれかに記載のキット。
  185. 前記標識が、化学標識を含む、請求項１４６～１８４のいずれかに記載のキット。
  186. 前記化学試薬が、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ニトロ－ＰＩＴＣ、スルホ－ＰＩＴＣ、フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）、ニトロ－ＰＩＣ、スルホ－ＰＩＣ、Ｃｂｚ－Ｃｌ（クロロギ酸ベンジル）またはＣｂｚ－ＯＳｕ（ベンジルオキシカルボニルＮ－スクシンイミド）、カルボキシル活性化アミノブロックアミノ酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ－Ｃｌ、または１－ジメチルアミノナフタレン－５－スルホニルクロリド）、４－スルホニル－２－ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、無水物、２－ピリジンカルボキシアルデヒド、２－ホルミルフェニルボロン酸、２－アセチルフェニルボロン酸、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ペンタフルオロフェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルイソチオシアネート、４－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、３－（カルボン酸）－フェニルイソチオシアネート、３－（トリフルオロメチル）－フェニルイソチオシアネート、１－ナフチルイソチオシアネート、Ｎ－ニトロイミダゾール－１－カルボキシミダミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（ピバロイル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’－ビス（ベンジルオキシカルボニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、チオベンジル化試薬、および二複素環メタニミン試薬、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１８２に記載のキット。
  187. 前記化学試薬が、イサト酸無水物、イソニコチン酸無水物、アザイサト酸無水物、コハク酸無水物、またはそれらの誘導体である、請求項１８２に記載のキット。
  188. 前記化学試薬が、４－ニトロフェニルアントラニレート、Ｎ－メチル－イサト酸無水物、Ｎ－アセチル－イサト酸無水物、４－カルボン酸イサト酸無水物、５－メトキシ－イサト酸無水物、５－ニトロ－イサト酸無水物、４－クロロ－イサト酸無水物、４－フルオロ－イサト酸無水物、６－フルオロ－イサト酸無水物、Ｎ－ベンジル－イサト酸無水物、４－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、５－トリフルオロメチル－イサト酸無水物、４－ニトロ－イサト酸無水物、４－メトキシ－イサト酸無水物、５－アミノ－２－フルオロ－イソニコチン無水物（６－フルオロ－１Ｈ－ピリド［３，４－ｄ］［１，３］オキサジン－２，４－ジオン）、３，６，ジフルオロフタル酸無水物、および２，３ピラジンジカルボン酸無水物、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１８７に記載のキット。
  189. 結合剤をさらに含み、前記結合剤が、前記結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、請求項１４６～１８８のいずれか一項に記載のキット。
  190. 前記キットが、２つ以上の結合剤を含む、請求項１８９に記載のキット。
  191. 前記結合剤が、未標識末端アミノ酸に結合するように構成されている、請求項１８９または請求項１９０に記載のキット。
  192. 前記結合剤が、標識末端アミノ酸に結合するように構成されている、請求項１８９または請求項１９０に記載のキット。
  193. 前記結合剤が、前記ポリペプチドの単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、または翻訳後修飾に結合する、請求項１８９～１９２のいずれか一項に記載のキット。
  194. 前記結合剤が、Ｎ末端アミノ酸残基に結合する、請求項１９３に記載のキット。
  195. 前記結合剤が、Ｃ末端アミノ酸残基に結合する、請求項１９３に記載のキット。
  196. 前記結合剤が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項１８９～１９５のいずれか一項に記載のキット。
  197. 前記結合剤が、アミノペプチダーゼ、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリン、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳ（ＣｌｐＳ２など）、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾タンパク質；または、１つ以上のアミノ酸に結合する修飾された小分子、すなわちバンコマイシン、またはその変異体、突然変異体もしくは修飾分子；または、抗体もしくはその結合断片；あるいは、それらの任意の組み合わせである、請求項１８９～１９６のいずれか一項に記載のキット。
  198. 前記コーディングタグの前記識別情報を前記ポリペプチドに付着した記録タグに転送するための試薬をさらに含み、前記識別情報の前記記録タグへの前記転送により、前記ポリペプチド上に伸長記録タグが生成される、請求項１４６～１９７のいずれか一項に記載のキット。
  199. 前記識別情報を伝達するための前記試薬が、化学ライゲーション試薬または生物学的ライゲーション試薬である、請求項１９８に記載のキット。
  200. 前記識別情報を伝達するための前記試薬が、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長のための試薬である、請求項１９８に記載のキット。
  201. 前記伸長記録タグを増幅するための増幅試薬をさらに含む、請求項１９８～２００のいずれか一項に記載のキット。
  202. ビーズ、多孔質ビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、回転干渉測定ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁性ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、ミクロスフェア、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される固体支持体をさらに含む、請求項１４６～２０１のいずれかに記載のキット。
  203. 前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリアクリレートビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、デキストランビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、制御された多孔質ビーズ、シリカベースのビーズ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２０２に記載のキット。
  204. 核酸配列決定分析のための試薬をさらに含む、請求項１４６～２０３のいずれか一項に記載のキット。
  205. 前記核酸配列決定分析が、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアベースのシーケンシング、または高度な顕微鏡を使用するＤＮＡのダイレクトイメージング、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２０４に記載のキット。
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