JP6942147B2 - Ｍｔ１−ｍｍｐに対して特異的な二環式ペプチド−毒素コンジュゲート - Google Patents

Description

本発明は、標的化がん療法において有用性を有する１個もしくは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートしたＭＴ１−ＭＭＰに対して特異的な二環式ペプチドを含む薬物コンジュゲートに関する。

環式ペプチドは、タンパク質の標的に対して高親和性および標的特異性を伴って結合することができ、したがって、療法の開発のための魅力的な分子クラスである。実際、いくつかの環式ペプチドは、例えば、抗菌ペプチドであるバンコマイシン、免疫抑制剤であるシクロスポリンまたは抗がん薬であるオクトレオチドとして、既に臨床において首尾よく使用されている（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ７（７），６０８−２４）。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成された相対的に大きな相互作用表面と共に、環状構造のコンホメーション上の柔軟性の低下に起因する。典型的には、大環状分子は、例えば、環式ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å^２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０，１０６６−７１）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環式ペプチド（３５５Å^２）（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６（５５６５），１５１−５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターに結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン−１（ｕｐａｉｎ−１）（６０３Å^２；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １６０（１），１−１０）のように、数百平方オングストロームの表面に結合する。

それらの環状配置によって、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドより柔軟でなく、標的への結合によるエントロピーのより小さな損失に至り、より高い結合親和性をもたらす。低減した柔軟性はまた、直鎖状ペプチドと比較して、標的特異的立体構造の固定、結合特異性の増加をもたらす。このような効果は、その環が開環されると他のＭＭＰに及ぶその選択性を失う、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力かつ選択的な阻害剤により例証されてきた（Ｃｈｅｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４１（１１），１７４９−５１）。大環状化によって達成される好ましい結合特性は、例えば、バンコマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシンにおけるように、１つを超えるペプチド環を有する多環状ペプチド（multicyclic peptide）においてさらにより明白である。

異なる研究チームが、従前からシステイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋いでいる（Ｋｅｍｐ ａｎｄ ＭｃＮａｍａｒａ（１９８５）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者は、タンパク質表面の構造的模倣のための合成足場上への複数のペプチドループの急速および定量的な環化のためのトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用してきた（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。候補薬物化合物の生成のための方法（ここでは、前記化合物がシステイン含有ポリペプチドを分子足場、例えば、トリス（ブロモメチル）ベンゼンに連結することによって生じる）は、国際公開第２００４／０７７０６２号および国際公開第２００６／０７８１６１号に開示されている。

ファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチが開発され、目的の標的に対する二環式ペプチドの大きなライブラリーが生成およびスクリーニングされてきた（Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５（７），５０２−７および国際公開第２００９／０９８４５０号）。手短に言えば、３個のシステイン残基、および６個のランダムアミノ酸の２つの領域（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_６−Ｃｙｓ）を含有する直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを、ファージ上に提示し、システイン側鎖を小分子（トリス−（ブロモメチル）ベンゼン）へと共有結合的に連結することによって環化させた。

本発明の第１の態様によれば、式（Ｉ）の薬物コンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩を提供し、

式中、Ｒ_１およびＲ_２は両方とも、水素を表し、
Ｒ_３およびＲ_４は両方とも、Ｃ_１〜６アルキルを表し、
ｎは、１〜１０から選択される整数を表し、
ｍは、０〜１０から選択される整数を表し、
毒素は、細胞毒性剤を指し、
二環は、少なくとも２個のポリペプチドループが分子足場上に形成されるように、少なくとも２個のループ配列によって隔てられている少なくとも３個のシステイン残基と、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場とを含むポリペプチドを含む、ＭＴ１−ＭＭＰに対して特異的なペプチドリガンドを表し、ペプチドリガンドは、式（ＩＩ）のアミノ酸配列：
−Ｃ_ｉ−Ｘ_１−Ｕ／Ｏ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ_５−Ｃ_ｉｉ−Ｅ_６−Ｄ_７−Ｆ_８−Ｙ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｃ_ｉｉｉ−（配列番号１）
（ＩＩ）
を含み、
式中、
Ｃ_ｉ、Ｃ_ｉｉおよびＣ_ｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し、
Ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される極性非荷電アミノ酸残基を表し、
Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される非極性脂肪族アミノ酸残基を表す。

本発明のさらなる態様によれば、１種もしくは複数の薬学的に許容される添加剤と組み合わせた本明細書に定義されているような薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、がん、特に、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの予防、抑制または処置において使用するための本明細書に定義されているような薬物コンジュゲートを提供する。

ＥＢＣ−１異種移植マウスにおけるＢＴ１７ＢＤＣ−２７についての時間に対する平均腫瘍体積のプロット。用量は０日目、２日目、４日目、７日目、９日目、１１日目および１４日目に投与した。 薬物が関連する毒物学および全体的な動物の健康を示す、ＢＴ１７ＢＤＣ−２７によるＥＢＣ−１異種移植マウスの処置の間の体重。 ＥＢＣ−１異種移植マウスにおけるＢＴ１７ＢＤＣ−２８についての時間に対する平均腫瘍体積のプロット。用量は０日目、２日目、４日目、７日目、９日目、１１日目および１４日目に投与した。 薬物が関連する毒物学および全体的な動物の健康を示す、ＢＴ１７ＢＤＣ−２８によるＥＢＣ−１異種移植マウスの処置の間の体重。

他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、技術分野、例えば、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学の技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学、遺伝学的および生化学的方法について標準的な技術を使用する（参照により本明細書中に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４^ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）。

［薬物コンジュゲート］
本発明の第１の態様によれば、式（Ｉ）の薬物コンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩を提供し、

式中、Ｒ_１およびＲ_２は両方とも、水素を表し、
Ｒ_３およびＲ_４は両方とも、Ｃ_１〜６アルキルを表し、
ｎは、１〜１０から選択される整数を表し、
ｍは、０〜１０から選択される整数を表し、
毒素は、細胞毒性剤を指し、
二環は、少なくとも２個のポリペプチドループが分子足場上で形成されるように、少なくとも２個のループ配列によって隔てられている少なくとも３個のシステイン残基と、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場とを含むポリペプチドを含む、ＭＴ１−ＭＭＰに対して特異的なペプチドリガンドを表し、前記ペプチドリガンドは、式（ＩＩ）のアミノ酸配列：
−Ｃ_ｉ−Ｘ_１−Ｕ／Ｏ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ_５−Ｃ_ｉｉ−Ｅ_６−Ｄ_７−Ｆ_８−Ｙ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｃ_ｉｉｉ−（配列番号１）
（ＩＩ）
を含み、
式中、
Ｃ_ｉ、Ｃ_ｉｉおよびＣ_ｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し、
Ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される極性非荷電アミノ酸残基を表し、
Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される非極性脂肪族アミノ酸残基を表す。

本発明の特定の一実施形態では、細胞毒性剤は、アルキル化剤、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン、ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロランブシル、イホスファミド；プリン類似体であるアザチオプリンおよびメルカプトプリンまたはピリミジン類似体を含めた代謝拮抗剤；ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンを含めた植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体であるエトポシドおよびテニポシド；最初にＴａｘｏｌとして公知である、パクリタキセルを含めたタキサン；カンプトテシン：イリノテカンおよびトポテカンを含めたトポイソメラーゼ阻害剤、ならびにアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドを含めたＩＩ型阻害剤から選択される。さらなる薬剤は、抗腫瘍抗生物質を含むことができ、これらは免疫抑制剤であるダクチノマイシン（腎臓移植において使用される）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、カリケアマイシンなどを含む。

本発明の１つのさらなる特定の実施形態では、細胞毒性剤は、マイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）またはモノメチルアウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ）から選択される。

ＤＭ１は、メイタンシンのチオール含有誘導体である細胞毒性剤であり、下記の構造

を有する。

モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は合成の抗新生物剤であり、下記の構造

を有する。

データは、本明細書の実施例１〜３において提示し、これらはＤＭ１を含有する毒素にコンジュゲートしているペプチドリガンドの効果を示す。

用語Ｃ_１〜６アルキルは、本明細書において使用する場合、それぞれ、１〜６個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の飽和炭化水素基を指す。このような基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルまたはヘキシルなどを含む。

一実施形態では、Ｒ^３およびＲ^４は、両方ともメチルである。

一実施形態では、ｎは、１を表す。

一実施形態では、ｍは、１を表す。

一実施形態では、Ｒ^３およびＲ^４は、両方ともメチルであり、ｎは、１を表し、ｍは、１を表す。

一実施形態では、毒素は、メイタンシンであり、コンジュゲートは、式（ＩＩＩ）の化合物を含み、

式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、ｎ、ｍおよび二環は、本明細書に定義されている通りである。

式（ＩＩＩ）のコンジュゲートのさらなる実施形態では、ｎおよびｍは両方とも、１を表し、Ｒ_１およびＲ_２は両方とも、水素を表し、Ｒ_３およびＲ_４は両方とも、メチルを表す、すなわち、式（ＩＩＩ）^ａの化合物。

またさらなる実施形態では、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ）^ａのコンジュゲートは、ＢＴ１７ＢＤＣ−２７

またはＢＴ１７ＢＤＣ−２８

から選択される。

ＢＴ１７ＢＤＣ−２８は、毒素−ジスルフィド構築物にアミド結合している安定化された二環式ペプチド対応物（１７−６９−０７−Ｎ２４１）を用いる。メイタンシンのこの立体障害のない誘導体（ｎ＝１である）は、ＤＭ１と称される。分子は、二環側で２個の立体障害をもたらすメチル基を含有し、抗体薬物コンジュゲートの状況において、還元剤、例えば、ジチオトレイトールに対するその感受性の１４分の１の低減を生じさせる。還元に対する感受性の低減は、より低い毒素放出速度と相関する。

ＢＴ１７ＢＤＣ−２７は、１７−６９−０７−Ｎ２４１のｂＡｌａ−Ｓａｒ１０分子スペーサーを欠いており、毒素−ジスルフィド構築物にアミド結合している、安定化された二環式ペプチド対応物（１７−６９−０７−Ｎ２６８）を用いる。分子スペーサーが存在しないことは、低減した合成コストで、より高い毒素とＡＰＩの比を伴って、より小さな全体分子を提供する。メイタンシンのこの立体障害のない誘導体（ｎ＝１である）は、ＤＭ１と称される。分子は、二環側で２個の立体障害をもたらすメチル基を含有し、抗体薬物コンジュゲートの状況において、還元剤、例えば、ジチオトレイトールに対するその感受性の１４分の１の低減を生じさせる。還元に対する感受性の低減は、より低い毒素放出速度と相関する。

［命名法］
番号付け
式（ＩＩ）の化合物内のアミノ酸残基の位置に言及するとき、システイン残基（Ｃ_ｉ、Ｃ_ｉｉおよびＣ_ｉｉｉ）は、これらが不変であるため番号付けから除外される。したがって、式（ＩＩ）の化合物内のアミノ酸残基の番号付けは、下記のように言及される。
−Ｃ_ｉ−Ｘ_１−Ｕ／Ｏ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ_５−Ｃ_ｉｉ−Ｅ_６−Ｄ_７−Ｆ_８−Ｙ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｃ_ｉｉｉ−（配列番号１）。

本開示の目的のために、全ての二環式ペプチドは、ＴＢＭＢ（１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン）と環化されていると想定され、三置換１，３，５−トリスメチルベンゼン構造がもたらされる。ＴＢＭＢとの環化は、Ｃ_ｉ、Ｃ_ｉｉ、およびＣ_ｉｉｉ上で起こる。

二環式ペプチドコア配列
本明細書において開示されている各二環式ペプチドは、第１のＮ末端システイン（Ｃ_ｉ）と最後のＣ末端システイン（Ｃ_ｉｉｉ）の間のアミノ酸配列として定義される、独特のコア配列番号を割り当てられている。識別名１７−６９−０７の例において、コア配列は、Ｃ_ｉＹＮＥＦＧＣ_ｉｉＥＤＦＹＤＩＣ_ｉｉｉ（配列番号２）であり、「１７−６９−０７」または「（１７−６９−０７）」と言及される。

ペプチドコード
本明細書において開示されている特定の二環式ペプチドはまた、ペプチドコード、例えば、１７−６９−０７−Ｎ２４１を使用して独特の識別子を割り当てられており、Ｎ２４１は、１７−６９−０７二環コア配列の特定の誘導体を示す。１７−６９−０７の異なる誘導体は、異なるＮ−番号、すなわち、Ｎ００１、Ｎ００２、Ｎｘｘｘを有する。

分子フォーマット
二環コア配列に対するＮ末端またはＣ末端の伸長は、ハイフンによって隔てられてコア配列の左側または右側に加えられる。例えば、Ｎ末端ｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａｌａテールは、
ｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−（１７−６９−０７）
として示され、βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−ＣＹＮＥＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ（配列番号３）の完全配列を有する。

修飾
二環コア配列内の非天然アミノ酸置換は、分子フォーマット記載の後に示される。例えば、１７−６９−０７におけるチロシン１が、Ｄ−アラニンで置換されている場合、記載は、（１７−６９−０７）Ｄ−Ａｌａ１であり、完全配列は、Ｃ（Ｄ−Ａｌａ１）ＮＥＦＧＣＥＤＦＹＤＩＣ（配列番号４）と記載される。

Ｎ末端またはＣ末端テールが、コア配列への修飾をまた含有する二環式ペプチドに付着している場合、一例として１７−６９−０７−Ｎ２４１を使用することによって、分子フォーマット記載は、
ｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−（１７−６９−０７）ＤＡｌａ１ １Ｎａｌ４ ＤＡｌａ５ ｔＢｕＧｌｙ１１
である。

１７−６９−０７−Ｎ２４１の全アミノ酸配列は、したがって、
ｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−Ｃ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃ（配列番号５）
である。

［式（ＩＩ）の二環式ペプチドリガンド］
ペプチドリガンドは、本明細書において言及するように、分子足場に共有結合をしているペプチドを指す。典型的には、このようなペプチドは、足場へと共有結合を形成することができる２個もしくはそれより多い反応性基（すなわち、システイン残基）と、ペプチドが足場に結合しているときループを形成するため、ループ配列と称される前記反応性基の間に内在される配列とを含む。この場合、ペプチドは、少なくとも３個のシステイン残基（本明細書においてＣ_ｉ、Ｃ_ｉｉおよびＣ_ｉｉｉと言及される）を含み、足場上に少なくとも２個のループを形成する。

これらの位置における良好に許容される置換を可能とするアラニンスキャンおよび選択アウトプット（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｕｔｐｕｔｓ）の結果に続いて、式（ＩＩ）の１位、３位、４位、１０位および１１位におけるＸは、任意のアミノ酸を表し得ることを当業者は認識するであろう。

一実施形態では、式（ＩＩ）の１位におけるＸは、Ｙ、Ｍ、ＦまたはＶの任意の１つから選択されるアミノ酸である。さらなる実施形態では、式（ＩＩ）の１位におけるＸは、Ｙ、ＭまたはＦから選択される。またさらなる実施形態では、式（ＩＩ）の１位におけるＸは、ＹまたはＭから選択される。なおまたさらなる実施形態では、式（ＩＩ）の１位におけるＸは、Ｙから選択される。

一実施形態では、式（ＩＩ）の２位におけるＵ／Ｏは、Ｕ、例えば、Ｎから選択される。代替的な実施形態では、式（ＩＩ）の２位におけるＵ／Ｏは、Ｏ、例えば、Ｇから選択される。

一実施形態では、式（ＩＩ）の３位におけるＸは、ＵまたはＺから選択され、Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される極性非荷電アミノ酸残基を表し、Ｚは、ＤまたはＥから選択される極性負荷電アミノ酸残基を表す。さらなる実施形態では、式（ＩＩ）の３位におけるＵは、Ｑから選択される。代替的な実施形態では、式（ＩＩ）の３位におけるＺは、Ｅから選択される。

一実施形態では、式（ＩＩ）の４位におけるＸは、Ｊから選択され、Ｊは、Ｆ、ＷおよびＹから選択される非極性芳香族アミノ酸残基を表す。さらなる実施形態では、式（ＩＩ）の４位におけるＪは、Ｆから選択される。代替的な実施形態では、式（ＩＩ）の４位におけるＪは、Ｙから選択される。代替的な実施形態では、式（ＩＩ）の４位におけるＪは、Ｗから選択される。

一実施形態では、式（ＩＩ）の１０位におけるＸは、Ｚから選択され、Ｚは、ＤまたはＥから選択される極性負荷電アミノ酸残基を表す。一実施形態では、式（ＩＩ）の１０位におけるＺは、Ｄから選択される。

一実施形態では、式（ＩＩ）の１１位におけるＸは、Ｏから選択され、Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される非極性脂肪族アミノ酸残基を表す。一実施形態では、式（ＩＩ）の１１位におけるＯは、Ｉから選択される。

一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩａ）の化合物：
−Ｃ_ｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ／Ｖ−Ｕ／Ｏ−Ｕ／Ｚ−Ｊ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｚ−Ｏ−Ｃ_ｉｉｉ−（配列番号６）
（ＩＩａ）であり、
式中、Ｕ、Ｏ、ＪおよびＺは、本明細書の上に定義されている通りである。

一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩｂ）の化合物：
−Ｃ_ｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ／Ｖ−Ｎ／Ｇ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（配列番号７）
（ＩＩｂ）である。

一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩｃ）の化合物：
−Ｃ_ｉ−Ｙ／Ｍ／Ｆ−Ｎ／Ｇ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（配列番号８）
（ＩＩｃ）である。

一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩｄ）の化合物：
−Ｃ_ｉ−Ｙ／Ｍ−Ｎ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（配列番号９）
（ＩＩｄ）である。

一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩｅ）の化合物：
−Ｃ_ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）
（ＩＩｅ）である。

またさらなる実施形態では、式（ＩＩ）のペプチドは、
−Ｃ_ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）；
−Ｃ_ｉ−Ｍ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−１２）（配列番号１０）；
−Ｃ_ｉ−Ｆ−Ｇ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−０２）（配列番号１１）；
−Ｃ_ｉ−Ｖ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−０３）（配列番号１２）；
−Ｃ_ｉ−Ｆ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−０４）（配列番号１３）；
−Ｃ_ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｙ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−０７−Ｎ０５７）（配列番号１４）；および
−Ｃ_ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−４４−Ｎ００２）（配列番号１５）
から選択される配列を含む。

この実施形態のペプチドは、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメインに対する親和性成熟に続いて、強力な候補であることが同定された。

なおまたさらなる実施形態では、式（ＩＩ）のペプチドは、
−Ｃ_ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）；および
−Ｃ_ｉ−Ｍ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−１２）（配列番号１０）
から選択される配列を含む。

この実施形態のペプチドは、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメインに対する親和性成熟、コア二環配列の合成、および競合実験を使用した親和性の定量的測定に続いて、最も高い親和性候補であることが同定された。

なおまたさらなる実施形態では、式（ＩＩ）のペプチドは、−Ｃ_ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｃ_ｉｉ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｃ_ｉｉｉ−（１７−６９−０７）（配列番号２）から選択される配列を含む。この実施形態のペプチドは、式（ＩＩ）内でペプチドリガンドのファミリーの最も強力および安定的メンバーであることが同定された。

なおまたさらなる実施形態では、式（ＩＩ）のペプチドは、それぞれ、
ｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−（１７−６９−０７）Ｄ−Ａｌａ１ １Ｎａｌ４ Ｄ−Ａｌａ５ ｔＢｕＧｌｙ１１（完全配列（ｂＡｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＣ_ｉ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）Ｃ_ｉｉＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃ_ｉｉｉを有する１７−６９−０７−Ｎ２４１）；または
Ａ−（１７−６９−０７）Ｄ−Ａｌａ１ １Ｎａｌ４ Ｄ−Ａｌａ５ ｔＢｕＧｌｙ１１（完全配列ＡＣ_ｉ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）Ｃ_ｉｉＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃ_ｉｉｉを有する１７−６９−０７−Ｎ２６８）
から選択される配列を含み、Ｎ末端は、遊離アミノ基として存在し、Ｃ末端は、アミド化されている。

データを実施例１〜３において提示し、これらは、これらの二環式ペプチドを含む薬物コンジュゲートの好ましいインビトロおよびインビボでの特性を示す。

一実施形態では、式（ＩＩ）の特定のペプチドは、マウス、イヌ、カニクイザルおよびヒトのＭＴ１−ＭＭＰと完全に交差反応性である。さらなる実施形態では、本発明の特に例示されるペプチドリガンドは、マウス、イヌ、カニクイザルおよびヒトのＭＴ１−ＭＭＰと完全に交差反応性である。例えば、１７−６９−０７の安定化されていないおよび安定化された誘導体の両方（すなわち、１７−６９−０７−Ｎ２１９、１７−６９−０７−Ｎ２４１および１７−６９−０７−Ｎ２６８）は、完全に交差反応性である。

またさらなる実施形態では、式（ＩＩ）のペプチドは、ＭＴ１−ＭＭＰに対して選択的であるが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１５およびＭＭＰ−１６と交差反応しない。１７−６９−０７コア配列、および安定化されたバリアント１７−６９−０７−Ｎ２５８は、ＭＴ１−ＭＭＰに対して独特に選択的である。

［ペプチドリガンドの利点］
式（ＩＩ）の特定の二環式ペプチドは、注射、吸入、経鼻、目、経口または局所投与のための適切な薬物様分子として考慮されることを可能とするいくつかの有利な特性を有する。このような有利な特性は、以下を含む。
−種交差反応性。これは、前臨床薬力学および薬物動態学的査定のための典型的な必要条件である；
−プロテアーゼ安定性。二環式ペプチドリガンドは理想的には、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー」）プロテアーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対して安定性を示すべきである。二環リード候補を動物モデルにおいて開発することができ、かつヒトへと信頼性をもって投与することができるように、プロテアーゼ安定性は、異なる種の間で維持すべきである；
−望ましい溶解性プロファイル。これは、製剤化および吸収の目的のために重要である、荷電および親水性残基に対する疎水性残基、ならびに分子内／分子間の水素結合の比率の関数である；ならびに
−循環中の最適な血漿内半減期。臨床適応症および処置レジメンによって、急性の疾病管理の設定における短い曝露のための二環式ペプチドを開発すること、または循環における増強された保持を伴う二環式ペプチドを開発することが必要とされてもよく、したがって、より慢性の病態の管理のために最適である。望ましい血漿内半減期を推進する他の要因は、薬剤の持続性の曝露による付随する毒物学に対する最大の治療上の効率のための持続性の曝露の必要性である。

［薬学的に許容される塩］
塩の形態は本発明の範囲内であり、式（ＩＩ）の二環式ペプチド化合物への言及は、前記化合物の塩の形態を含むことを認識されたい。

本発明の塩は、通常の化学的方法、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ Ｓｔａｈｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｃａｍｉｌｌｅ Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｅｄｉｔｏｒ），ＩＳＢＮ：３−９０６３９−０２６−８，Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，３８８ ｐａｇｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ ２００２に記載されている方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基形態と、水もしくは有機溶媒、またはその２つの混合物中の適当な塩基または酸とを反応させることによって調製することができる。

酸付加塩（単塩または二塩（ｍｏｎｏ− ｏｒ ｄｉ−ｓａｌｔｓ））は、無機および有機の両方の多種多様の酸と共に形成し得る。酸付加塩の例は、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）ショウノウ酸、ショウノウ−スルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸および吉草酸からなる群から選択される酸、ならびにアシル化アミノ酸およびカチオン交換樹脂と共に形成される単塩または二塩を含む。

塩の１つの特定の群は、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラクトビオン酸から形成される塩からなる。１つの特定の塩は、塩酸塩である。別の特定の塩は、酢酸塩である。

化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性であり得る官能基を有する（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ⁻であり得る）場合、塩は、有機または無機塩基と共に形成され、適切なカチオンを生じさせ得る。適切な無機カチオンの例には、これらに限定されないが、アルカリ金属イオン、例えば、Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋およびＫ^＋、アルカリ土類金属カチオン、例えば、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋、および他のカチオン、例えば、Ａｌ^３＋またはＺｎ^＋が含まれる。適切な有機カチオンの例には、これらに限定されないが、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ_４ ^＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ_３Ｒ^＋、ＮＨ_２Ｒ_２ ^＋、ＮＨＲ_３ ^＋、ＮＲ_４ ^＋）が含まれる。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンに由来するものである。一般の第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ_３）_４ ^＋である。

式（ＩＩ）の化合物が、アミン官能基を含有する場合、これらは、当業者には周知の方法によって、例えば、アルキル化剤との反応によって第四級アンモニウム塩を形成し得る。このような第四級アンモニウム化合物は、式（ＩＩ）の範囲内である。

［修飾された誘導体］
本明細書に定義されているようなペプチドリガンドの修飾された誘導体は本発明の範囲内であることを認識されたい。このような適切な修飾された誘導体の例は、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾；１個もしくは複数の非天然アミノ酸残基による１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換（例えば、１個もしくは複数の等比体積アミノ酸または等電子アミノ酸による１個もしくは複数の極性アミノ酸残基の置換；他の非天然の等比体積アミノ酸または等電子アミノ酸による１個もしくは複数の非極性アミノ酸残基の置換）；スペーサー基の付加；１個もしくは複数の酸化耐性アミノ酸残基による１個もしくは複数の酸化感受性アミノ酸残基の置換；アラニンによる１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、１個もしくは複数のＤ−アミノ酸残基による１個もしくは複数のＬ−アミノ酸残基の置換；二環式ペプチドリガンド内の１個もしくは複数のアミド結合のＮ−アルキル化；代替的結合による１個もしくは複数のペプチド結合の置換；ペプチド骨格長の修飾；別の化学基による１個もしくは複数のアミノ酸残基のアルファ−炭素上の水素の置換、前記アミノ酸を官能化するための、適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬によるアミノ酸、例えば、システイン、リジン、グルタミン酸／アスパラギン酸およびチロシンの修飾、ならびに官能化に適した直交反応性を導入するアミノ酸、例えば、それぞれ、アルキンまたはアジド担持部分による官能化を可能にするアジドまたはアルキン基担持アミノ酸の導入または置換から選択される１つもしくは複数の修飾を含む。

一実施形態では、修飾された誘導体は、アミノ酸の１位および／または９位における修飾を含む。これらの位置は、特に、チロシンが存在する場合、タンパク質分解に対して最も影響されやすい。

一実施形態では、修飾された誘導体は、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、適切なアミノ反応性化学反応を使用するＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学反応を使用するＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、前記Ｎ末端またはＣ末端修飾は、これらに限定されないが、細胞毒性剤、放射性キレート剤（ｒａｄｉｏｃｈｅｌａｔｏｒ）または発色団を含めたエフェクター基の付加を含む。

さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、Ｎ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｎ末端修飾は、Ｎ末端アセチル基を含む。この実施形態では、Ｎ末端システイン基（本明細書においてＣ_ｉと言及される基）は、ペプチド合成の間に無水酢酸または他の適当な試薬でキャップされ、Ｎ末端がアセチル化されている分子をもたらす。この実施形態は、アミノペプチダーゼのための潜在的な認識ポイントを除去する利点を提供し、二環式ペプチドの分解についての可能性を回避する。

代替的な実施形態では、Ｎ末端修飾は、Ａｌａ、Ｇ−Ｓａｒ１０−Ａ基またはｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ基のような、エフェクター基のコンジュゲーションおよび二環性ペプチドのその標的に対する活性の保持を容易にする分子スペーサー基の付加を含む。一実施形態では、スペーサー基は、ｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ（すなわち、１７−６９−０７−Ｎ２４１）から選択される。二環式ペプチド１７−６９−０７へのこれらのスペーサー基の付加は、標的タンパク質への効力を変化させない。

さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、Ｃ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端修飾は、アミド基を含む。この実施形態では、Ｃ末端システイン基（本明細書においてＣ_ｉｉｉと言及される基）は、ペプチド合成の間にアミドとして合成され、Ｃ末端がアミド化されている分子をもたらす。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼについての潜在的な認識ポイントを除去する利点を提供し、二環式ペプチドのタンパク質分解についての可能性を低減させる。

一実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数の非天然アミノ酸残基による１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換を含む。この実施形態では、分解性プロテアーゼによって認識されず、標的効力によって有害効果も有さない、等比体積／等電子側鎖を有する非天然アミノ酸を選択し得る。

あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質分解加水分解が、立体構造的および立体的に妨害されるように、制約されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸を使用し得る。特に、これらは、プロリン類似体、かさ高い側鎖、Ｃα−二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）、およびシクロアミノ酸、単純な誘導体であるアミノ−シクロプロピルカルボン酸が関係する。

一実施形態では、非天然アミノ酸残基は、４位において置換されている。いくつかの非天然アミノ酸残基は、この位置において良好に許容される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸残基、例えば、４位に存在しているものは、１−ナフチルアラニン；２−ナフチルアラニン；シクロヘキシルグリシン、フェニルグリシン；ｔｅｒｔ−ブチルグリシン；３，４−ジクロロフェニルアラニン；シクロヘキシルアラニン；およびホモフェニルアラニンから選択される。

またさらなる実施形態では、非天然アミノ酸残基、例えば、４位に存在しているものは、１−ナフチルアラニン；２−ナフチルアラニン；および３，４−ジクロロフェニルアラニンから選択される。これらの置換は、修飾されていない野生型配列と比較して親和性を増強させる。

またさらなる実施形態では、非天然アミノ酸残基、例えば、４位に存在しているものは、１−ナフチルアラニンから選択される。この置換は、野生型と比較して親和性の最も大きなレベルの増強（７倍超）を提供した。

一実施形態では、非天然アミノ酸残基は、９位および／または１１位において導入される。いくつかの非天然アミノ酸残基は、これらの位置において良好に許容される。

さらなる実施形態では、非天然アミノ酸残基、例えば、９位に存在しているものは、４−ブロモフェニルアラニン、ペンタフルオロ−フェニルアラニン、例えば、４−ブロモフェニルアラニンから選択される。

またさらなる実施形態では、非天然アミノ酸残基、例えば、１１位に存在しているものは、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンから選択される。活性の増強、およびタンパク質分解性加水分解からの近接するアミノ酸骨格の強力な保護は、立体妨害によって達成される。

一実施形態では、修飾された誘導体は、複数の上述の修飾、例えば、２つ、３つ、４つまたは５つまたはそれより多い修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、下記の修飾の２つ、３つ、４つまたは５つまたはそれより多いもの、例えば、１位および５位におけるＤ−アラニン、４位における１−ナフチルアラニン、９位における４−ブロモフェニルアラニン、ならびに１１位におけるｔｅｒｔ−ブチルグリシンの５つの修飾の全てを含む。この多置換は、野生型よりも優れている効力に呼応して許容される。またさらなる実施形態では、修飾された誘導体は、１位および５位におけるＤ−アラニン、４位における１−ナフチルアラニン、ならびに１１位におけるｔｅｒｔ−ブチルグリシンの修飾を含む。この多重置換は、野生型よりも優れている効力に呼応して許容される。

一実施形態では、修飾された誘導体は、スペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、Ｎ末端システイン（Ｃ_ｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃ_ｉｉｉ）へのスペーサー基の付加を含む。

一実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数の酸化耐性アミノ酸残基による１個もしくは複数の酸化感受性アミノ酸残基の置換を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、ナフチルアラニンまたはアラニン残基によるトリプトファン残基の置換を含む。この実施形態は、生成した二環式ペプチドリガンドの医薬安定性プロファイルを改善させる利点を提供する。

一実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数の疎水性アミノ酸残基による１個もしくは複数の荷電アミノ酸残基の置換を含む。代替的な実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数の荷電アミノ酸残基による１個もしくは複数の疎水性アミノ酸残基の置換を含む。荷電アミノ酸残基に対する疎水性アミノ酸残基の正確なバランスは、二環式ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度、およびしたがって、血漿中の利用可能な遊離画分の濃度に影響を与え、一方、荷電アミノ酸残基（特に、アルギニン）は、細胞表面上のリン脂質膜とのペプチドの相互作用に影響を与え得る。組み合わせたこの２つは、ペプチド薬物の半減期、分布容積および曝露に影響を与えてもよく、臨床的エンドポイントによって調整することができる。さらに、荷電アミノ酸残基に対する疎水性アミノ酸残基の正確な組合せおよび数は、注射部位における刺激作用を低減し得る（ペプチド薬物が皮下で投与された場合）。

一実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数のＤ−アミノ酸残基による１個もしくは複数のＬ−アミノ酸残基の置換を含む。この実施形態は、立体障害によって、およびβターンコンホメーションを安定化させるＤ−アミノ酸の傾向によって、タンパク質分解安定性を増加させると考えられる（Ｔｕｇｙｉ ｅｔ ａｌ（２００５）ＰＮＡＳ，１０２（２），４１３−４１８）。

さらなる実施形態では、１位におけるアミノ酸残基は、Ｄ−アミノ酸、例えば、Ｄ−アラニンに置換される。この置換は、結果としての分解を伴わずに効力の保持を達成する。

さらなる実施形態では、５位におけるアミノ酸残基は、Ｄ−アミノ酸、例えば、Ｄ−アラニンまたはＤ−アルギニンに置換される。この置換は、結果としての分解を伴わずに効力の保持を達成する。

一実施形態では、修飾された誘導体は、任意のアミノ酸残基の除去、およびアラニンによる置換を含む。この実施形態は、潜在的なタンパク質分解攻撃部位を除去する利点を提供する。

上述の修飾のそれぞれは、ペプチドの効力または安定性を意図的に改善させる役割を果たすことに留意すべきである。修飾に基づいたさらなる効力の改善は、下記の機序によって達成し得る。
−より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を利用し、より低いオフレート（ｏｆｆ ｒａｔｅ）をもたらす疎水性部分を組み込むこと；
−長距離イオン相互作用（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ｉｏｎｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）を利用し、より速いオンレート（ｏｎ ｒａｔｅ）およびより高い親和性をもたらす荷電基を組み込むこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｒａｐｉｄ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，４２７−３１を参照されたい）；ならびに
−例えば、エントロピーにおける損失が標的結合において最小であるように、アミノ酸の側鎖を正確に制約し、エントロピーにおける損失が標的結合によって最小であるように、骨格のねじれ角を制約し、かつ同一の理由のために分子中にさらなる環化を導入することによって、さらなる制約をペプチドに組み込むこと。（レビューについて、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，（２０１０），１６，３１８５−２０３、およびＮｅｓｔｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ（２００９），１６，４３９９−４１８を参照されたい）。

［同位体のバリエーション］
本発明は、本発明の全ての薬学的に許容される（放射性）同位体標識化合物、すなわち、１個もしくは複数の原子は、同じ原子番号であるが、天然で通常見出される原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている式（ＩＩ）の化合物、および関連性のある（放射性）同位体を保持することができる金属キレート化基が付着している（「エフェクター」と称される）式（ＩＩ）の化合物、および特定の官能基は、関連性のある（放射性）同位体または同位体的に標識されている官能基と共有結合的に置き換えられている式（Ｉ）の化合物を含む。

本発明の化合物中に含まれるのに適した同位体の例は、水素の同位体、例えば、^２Ｈ（Ｄ）および^３Ｈ（Ｔ）、炭素の同位体、例えば、^１１Ｃ、^１３Ｃおよび^１４Ｃ、塩素の同位体、例えば、^３６Ｃｌ、フッ素の同位体、例えば、^１８Ｆ、ヨウ素の同位体、例えば、^１２３Ｉ、^１２５Ｉおよび^１３１Ｉ、窒素の同位体、例えば、^１３Ｎおよび^１５Ｎ、酸素の同位体、例えば、^１５Ｏ、^１７Ｏおよび^１８Ｏ、リンの同位体、例えば、^３２Ｐ、硫黄の同位体、例えば、^３５Ｓ、銅の同位体、例えば、^６４Ｃｕ、ガリウムの同位体、例えば、^６７Ｇａまたは^６８Ｇａ、イットリウムの同位体、例えば、^９０Ｙ、およびルテチウムの同位体、例えば、^１７７Ｌｕ、ならびにビスマスの同位体、例えば、^２１３Ｂｉを含む。

式（ＩＩ）の特定の同位体標識された化合物、例えば、放射性同位体を組み込んでいるものは、薬物および／または基質組織分布研究において、ならびに患部組織、例えば、腫瘍およびその他の場所上のＭＴ１−ＭＭＰ標的の存在および／または非存在を臨床的に評価するのに有用である。式（ＩＩ）の化合物は、標識化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体の間の複合体の形成を検出または同定するために使用することができるという点で貴重な診断上の特性をさらに有することができる。検出または同定方法は標識化剤、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光性物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）などで標識されている化合物を使用することができる。放射性同位体トリチウム、すなわち、^３Ｈ（Ｔ）、および炭素１４、すなわち、^１４Ｃは、組み込みの容易さ、およびすぐ検出できる手段であるという観点で、この目的に特に有用である。

より重い同位体、例えば、重水素、すなわち、^２Ｈ（Ｄ）による置換は、より大きな代謝安定性、例えば、インビボでの半減期の増加または投与必要量の低減によって生じる特定の治療上の利点を提供し得、したがって、いくつかの環境において好ましくあり得る。

ポジトロン放出同位体、例えば、^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１５Ｏおよび^１３Ｎによる置換は、標的占有率を検査するためのポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）研究において有用であり得る。

金属キレート化エフェクター基、例えば、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、および^１７７Ｌｕへの同位体の組込みは、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴイメージングを用いて腫瘍特異的抗原を視覚化するのに有用であり得る。

金属キレート化エフェクター基への、これらに限定されないが^９０Ｙ、^１７７Ｌｕ、および^２１３Ｂｉなどの同位体の組込みは、標的化放射線療法のオプションを提示することができ、それによって、式（ＩＩ）の金属−キレート剤担持化合物は、治療用放射性核種を標的タンパク質および作用部位に向かって輸送する。

式（ＩＩ）の同位体的に標識されている化合物は一般に、当業者には公知の従来の技術によって、または従前に用いられている非標識試薬の代わりに適当な同位体標識された試薬を使用して、添付の実施例において記載されているものと類似したプロセスによって調製することができる。

［結合活性］
特異性は、本明細書の状況において、標的と同様である実体を除外して、その同族の標的に結合するか、または他に相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵素の相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの能力を指すことができる。本明細書に記載されているアプローチを使用して、特異性は、リガンドが、多かれ少なかれ意図する標的の相同体またはパラログと相互作用することができるようになるために、モジュレート、すなわち、増加または減少させることができる。特異性は、活性、親和性または結合活性と同じ意味であることは意図されず、その標的に対するリガンドの作用の効力（例えば、結合親和性、または阻害のレベル）は、必ずしもその特異性に関連しない。

結合活性は、本明細書において使用する場合、例えば、本明細書に記載のような結合アッセイから取った定量的な結合測定値を指す。したがって、結合活性は、所与の標的濃度において結合するペプチドリガンドの量を指す。

多重特異性は、２つもしくはそれより多い標的に結合する能力である。典型的には、結合ペプチドは、それらの立体構造特性によって、単一の標的、例えば、抗体の場合、エピトープに結合することができる。しかし、２種以上の標的に結合することができるペプチド、例えば、上記のように当技術分野において既知の通り、二重特異的抗体を開発することができる。本発明において、ペプチドリガンドは、２つもしくはそれより多い標的に結合することができ、したがって、多重特異性である。適切に、それらは２つの標的に結合し、二重特異性である。結合は、独立的であり得、これはペプチド上の標的についての結合部位が、標的の１つまたは他方の結合によって構造的に立体障害を受けないことを意味する。この場合、両方の標的は、独立に結合することができる。より一般に、１つの標的の結合は、他方の結合を少なくとも部分的に妨げることが予想される。

二重特異性リガンドと、２つの関連する標的を包含する特異性を有するリガンドとの間に根本的な差異が存在する。第１の場合において、リガンドは、両方の標的の個々に対して特異的であり、特異的な様式でそれぞれと相互作用する。例えば、リガンド中の第１のループは、第１の標的に結合し、第２のループは、第２の標的に結合し得る。第２の場合において、リガンドは、例えば、両方に共通している標的のエピトープと相互作用することによって、２つの標的を識別しないため非特異的である。

本発明の状況において、例えば、標的およびオルソログに関して活性を有するリガンドは、二重特異性リガンドであり得ることが可能である。しかし、一実施形態では、リガンドは、標的および１つもしくは複数のオルソログの両方に結合するように、二重特異性ではないが、より厳密でない特異性を有する。一般に、標的およびそのオルソログの両方に対して選択されていないリガンドは、二重特異性への選択圧がないことによって、二重特異性である可能性が低い。より関連しない相同体に対する高い選択性を維持する一方で、良好な標的およびオルソログの交差反応性を得ることができるように、二環式ペプチドにおけるループの長さは、調整された結合表面を実現することにおいて決定的であり得る。

リガンドが真に二重特異性である場合、一実施形態では、リガンドの標的特異性の少なくとも１つは、選択したリガンドの間で共通であり、その特異性のレベルは、本明細書において開示されている方法によってモジュレートされ得る。第２またはさらなる特異性は、共有される必要はなく、本明細書において記載する手順の対象である必要はない。

標的は、ペプチドリガンドが結合するか、または他に相互作用する分子またはその部分である。結合は大部分の種類の活性に対して必須であると見られ、それ自体活性であり得るが、他の活性が予想される。このように、本発明は、直接的または間接的な結合の測定を必要としない。

分子足場は、ペプチドを複数のポイントにおいて接続し、１つもしくは複数の構造的特色をペプチドに与えることができる任意の分子である。好ましくは、分子足場は、足場反応性基と言及されるペプチドのための少なくとも３個の付着ポイントを含む。これらの基は、ペプチド上のシステイン残基（Ｃ_ｉ、Ｃ_ｉｉおよびＣ_ｉｉｉ）と反応して、共有結合を形成することができる。これらは、分子の還元切断および付随する崩壊に供されるジスルフィド結合を単に形成するだけではなく、安定的な共有結合的チオエーテル連結を形成する。分子足場のための好ましい構造を、下記で記載する。

［分子足場］
分子足場は、例えば、国際公開第２００９／０９８４５０号およびその中で引用されている参照文献、特に、国際公開第２００４／０７７０６２号および国際公開第２００６／０７８１６１号に記載されている。

上記の文献において留意されているように、分子足場は、小分子、例えば、小有機分子であり得る。

一実施形態では、分子足場は、天然モノマー、例えば、ヌクレオシド、糖、もしくはステロイドであり得るか、またはこれらに基づき得る。例えば、分子足場は、このような実体の短いポリマー、例えば、二量体または三量体を含み得る。

一実施形態では、分子足場は、既知の毒性、例えば、低毒性の化合物である。適切な化合物の例は、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、または現存する薬物、例えば、タマゼパム（ｔａｍａｚｅｐａｍ）を含む。

一実施形態では、分子足場は、巨大分子であり得る。一実施形態では、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。

一実施形態では、分子足場は、ポリペプチドの官能基と反応して、共有結合を形成することができる反応性基を含む。

分子足場は、ペプチドと連結を形成する化学基、例えば、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含み得る。

一実施形態では、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、もしくはその誘導体を含み得るか、またはこれらからなり得る。

一実施形態では、分子足場は、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。この分子は、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンと同様であるが、ベンゼン環に付着している３個のさらなるメチル基を含有する。これは、さらなるメチル基がポリペプチドとのさらなる接点を形成し、したがって、さらなる構造的制約を加え得るという利点を有する。

本発明の分子足場は、本発明のコードされたライブラリーのポリペプチドの官能基が分子足場と共有結合的連結を形成することを可能とする化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含めた広範囲の官能性から選択される。

分子足場上で使用され、システインのチオール基と反応することができる足場反応性基は、ハロゲン化アルキル（またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも称される）である。

具体例には、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢによって例示される足場反応性基）またはヨードアセトアミドが含まれる。化合物をタンパク質中のシステインに選択的にカップリングするために使用される他の足場反応性基は、マレイミドである。本発明において分子足場として使用し得るマレイミドの例は、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンを含む。セレノシステインはまた、システインと同様の反応性を有し、かつ同じ反応のために使用することができる天然アミノ酸である。このように、システインが記述される場合は必ず、状況が他に示唆しない限り、典型的にはセレノシステインを置換することは許容される。

［合成］
式（ＩＩ）のペプチドは、標準的な固相ペプチド合成技術、それに続くインビトロでの分子足場との反応によって合成的に製造し得る。これが行われるとき、標準的な化学を使用し得る。これは、さらなる下流の実験または検証のための可溶性材料の急速で大規模な調製を可能とする。このような方法は、通常の化学、例えば、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（上記）において開示されているものを使用して達成することができる。

このように、本発明はまた、本明細書に示したように選択されたポリペプチドまたはコンジュゲートの製造に関し、ここで製造は、下記で例示したような任意選択のさらなるステップを含む。一実施形態では、これらのステップは、化学合成によって作製された最終生成物であるポリペプチド／コンジュゲート上で行われる。

任意選択的に、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を製造するとき、置換し得る。

ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、したがって複数の特異性を導入するために、伸長することができる。

ペプチドを伸長させるために、それは、標準的な固相または液相化学を使用して、オルトゴナル保護されたリジン（および類似体）を使用して、そのＮ末端もしくはＣ末端において、またはループもしくは他の場所内で単純に化学的に伸長し得る。標準的な（バイオ）コンジュゲーション技術を使用して、活性化されたまたは活性化可能なＮ末端またはＣ末端を導入し得る。あるいは、付加は、例えば、（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）に記載されているように、フラグメント縮合もしくは天然化学的ライゲーションによって、または例えば、（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４ Ｄｅｃ ２０；９１（２６）：１２５４４−８もしくはＨｉｋａｒｉ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌｕｍｅ １８，Ｉｓｓｕｅ ２２，１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８，Ｐａｇｅｓ ６０００−６００３）に記載されているように、スブチリガーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ）を使用して酵素によって行い得る。

あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を介したさらなるコンジュゲーションによって伸長または修飾し得る。これは、いったん、細胞の還元性環境内にあれば、第１および第２のペプチドが互いから解離することを可能とするさらなる利点を有する。この場合、分子足場（例えば、ＴＢＭＢ）を、３個のシステイン基と反応するように第１のペプチドの化学合成の間に加えることができる。次いで、さらなるシステインまたはチオールを、第１のペプチドのＮまたはＣ末端に添付することができ、その結果、このシステインまたはチオールは、第２のペプチドの遊離システインまたはチオールとのみ反応して、ジスルフィド連結二環式ペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成する。

同様の技術は、潜在的に四重特異性分子を生じさせる、２個の二環式二重特異性大環状分子の合成／カップリングに等しく適用される。

さらに、他の官能基またはエフェクター基の付加は、適当な化学、ＮまたはＣ末端においてカップリングを使用して、または側鎖を介して、同じ様式で達成し得る。一実施形態では、カップリングは、いずれの実体の活性も遮断しない様式で行われる。

本発明のさらなる態様によれば、スキームＩにおいて記載されている合成経路を含む、本明細書に定義されているような薬物コンジュゲートを調製するプロセスを提供する。

［医薬組成物］
本発明のさらなる態様によれば、１種もしくは複数の薬学的に許容される添加剤と組み合わせた本明細書に定義されているような薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。

一般に、薬物コンジュゲートは、薬理学的に適当な添加剤または担体と一緒に精製された形態で利用される。典型的には、これらの添加剤または担体は、食塩水および／または緩衝化した媒体を含む、水溶液またはアルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸リンゲル液を含む。適切な生理学的に許容されるアジュバントは、ポリペプチド複合体を懸濁液中に保持することが必要であれば、増粘剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートから選択し得る。

静脈内ビヒクルは、液体および栄養素補充液および電解質補充液、例えば、リンゲルのデキストロースに基づくものを含む。保存剤および他の添加物、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスがまた存在し得る（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。

本発明の薬物コンジュゲートは、別々に投与される組成物として、または他の薬剤と併せて使用され得る。これらは、抗体、抗体フラグメントおよび様々な免疫治療薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチンおよび免疫毒素を含むことができる。医薬組成物は、これらが投与の前にプールされるかどうかに関わらず、本発明の薬物コンジュゲート、またはそれどころか異なる特異性を有する本発明による薬物コンジュゲートの組合せ、例えば、異なる標的リガンドを使用して選択されるポリペプチドを含むものと併せた、様々な細胞毒性剤または他の薬剤の「カクテル」を含むことができる。

本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者には一般に公知のもののいずれかであり得る。これに限定されないが、免疫療法を含めた治療のために、本発明の薬物コンジュゲートは、標準的な技術によって任意の患者に投与することができる。投与は、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺の経路を介すること、またはまた、適切に、カテーテルによる直接の注入によることを含めて任意の適当なモードによってであってよい。投与量および投与の頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の併行投与、逆の徴候（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）および臨床医が考慮する他のパラメーターによって決まる。

本発明の薬物コンジュゲートを、貯蔵のために凍結乾燥し、使用の前に適切な担体中で再構成することができる。この技術は、有効であることが示されてきており、公知の凍結乾燥および再構成技術を用いることができる。凍結乾燥および再構成は、様々な程度の活性の損失をもたらし得、そのレベルは、補償するために上方に調節しなければならないことがあることを当業者は認識するであろう。

本薬物コンジュゲートまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。特定の治療的用途において、選択した細胞の集団の少なくとも部分阻害、抑制、モデュレーション、死滅、またはいくつかの他の測定可能なパラメーターを達成する適当な量は、「治療有効用量」として定義される。この投与量を達成するのに必要とされる量は、疾患の重症度および患者自身の免疫系の全体的状況によって決まるが、一般に、１キログラムの体重当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択した薬物コンジュゲートの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般に使用される。予防的用途のために、本薬物コンジュゲートまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、同様または僅かにより低い投与量で投与し得る。

本発明による薬物コンジュゲートを含有する組成物は、哺乳動物における選択した標的細胞集団の変化、不活性化、死滅または除去を助けるために予防的および治療的設定において利用し得る。さらに、本明細書に記載されている薬物コンジュゲートは、体外でまたはインビトロで選択的に使用され、細胞の異種性コレクションからの標的細胞集団を死滅させるか、枯渇させるか、またはその他の方法で効果的に除去し得る。哺乳動物からの血液は、選択した薬物コンジュゲートと体外で合わせてもよく、それによって、標準的な技術によって、哺乳動物へと返すために、望ましくない細胞は死滅させるか、または血液から他の方法で除去される。

［治療上の使用］
式（ＩＩ）の二環式ペプチドは、膜型メタロプロテアーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ、また、ＭＭＰ１４として公知である）の高親和性結合剤として特定の有用性を有する。ＭＴ１−ＭＭＰは、直接的に、その成分のいくつかを分解することによって、および間接的にプロ−ＭＭＰ２を活性化することによって、細胞外マトリックスリモデリングにおいて主要な役割を果たす膜貫通メタロプロテアーゼである。ＭＴ１−ＭＭＰは、腫瘍血管形成のために重大であり（Ｓｏｕｎｎｉ ｅｔ ａｌ（２００２）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１６（６），５５５−５６４）、種々の固形腫瘍上に過剰発現しており、したがって、本発明のＭＴ１−ＭＭＰ結合二環ペプチドを含む薬物コンジュゲートは、がん、特に、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの標的化処置において特定の有用性を有する。一実施形態では、式（ＩＩ）の二環式ペプチドは、ヒトＭＴ１−ＭＭＰに対して特異的である。さらなる実施形態では、式（ＩＩ）の二環式ペプチドは、マウスＭＴ１−ＭＭＰに対して特異的である。またさらなる実施形態では、式（ＩＩ）の二環式ペプチドは、ヒトおよびマウスのＭＴ１−ＭＭＰに対して特異的である。またさらなる実施形態では、式（ＩＩ）の二環式ペプチドは、ヒト、マウスおよびイヌのＭＴ１−ＭＭＰに対して特異的である。

式（ＩＩ）のポリペプチドリガンドは、インビボでの治療的および予防的用途、インビトロおよびインビボでの診断用途、インビトロでのアッセイおよび試薬用途などにおいて用いてもよい。選択したレベルの特異性を有するリガンドは、ヒトではない動物における試験が関与する用途（ここでは、交差反応性が望ましい）、または診断用途（ここでは、相同体もしくはパラログとの交差反応性は、注意深く制御する必要がある）において有用である。いくつかの用途、例えば、ワクチン用途において、所定の範囲の抗原に対して免疫応答を引き出す能力を利用して、特定の疾患および病原体に対してワクチンを調整することができる。

少なくとも９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なペプチドリガンドは、哺乳動物への投与のために好ましく、９８〜９９％またはそれ超の均質性は、特に、哺乳動物がヒトであるとき、製薬学的用途のために最も好ましい。所望の通り部分的にまたは均一となるまで精製すると、選択したポリペプチドは、診断的もしくは治療的に（体外を含めた）、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などを開発し、行うことにおいて使用し得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ ａｎｄ Ｐｅｒｎｉｓ，（１９７９ ａｎｄ １９８１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。

本発明のペプチドリガンドのコンジュゲートは典型的には、がん、特に、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの予防、抑制または処置に使用される。

このように、本発明のさらなる態様によれば、がん、特に、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの予防、抑制または処置において使用するための、本明細書に定義されているようなペプチドリガンドの薬物コンジュゲートを提供する。

本発明のさらなる態様によれば、必要とする患者に、本明細書に定義されているようなペプチドリガンドの薬物コンジュゲートを投与することを含む、がん、特に、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんを予防、抑制または処置する方法を提供する。

処置（または阻害）し得るがん（およびそれらの良性の対応物）の例には、これらに限定されないが、上皮由来の腫瘍（腺がん、扁平上皮がん、移行上皮がんおよび他の癌腫を含めた様々なタイプの腺腫および癌腫）、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管（食道、胃（胃の）、小腸、結腸、直腸および肛門を含めた）、肝臓（肝細胞がん）、胆嚢および胆管系、膵外分泌部、腎臓，肺（例えば、腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支肺胞上皮がんおよび中皮腫）、頭頸部（例えば、舌、口腔、喉頭、咽頭、上咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および副鼻腔のがん）、卵巣、輪卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内膜、甲状腺（例えば、甲状腺濾胞腺がん）、副腎、前立腺、皮膚および付属器（例えば、黒色腫、基底細胞がん、扁平上皮細胞がん、角化棘細胞腫、異形成母斑）の癌腫；血液学的悪性腫瘍、およびリンパ球系統の関連する状態（例えば、急性リンパ球性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ球性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、毛様細胞白血病、意義不明な単クローン性ガンマグロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、および移植後のリンパ増殖性障害）、ならびに血液学的悪性腫瘍および骨髄細胞系統の関連する状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増加症候群、骨髄増殖性障害、例えば、真性多血症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、および前骨髄球性白血病）を含めた血液学的悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）、ならびに前悪性血液障害およびボーダーライン悪性腫瘍の障害；間葉起源の腫瘍、例えば、軟部組織、骨または軟骨の肉腫、例えば、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、胃腸間質腫瘍、良性および悪性の組織球腫、ならびに隆起性皮膚線維肉腫；中枢または末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫および神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍およびシュワン細胞腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺の髄様がん）；目および付属器腫瘍（例えば、網膜芽細胞腫）；生殖細胞および絨毛性腫瘍（例えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛がん）；ならびに小児および胎児性腫瘍（例えば、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、および原始神経外胚葉性腫瘍）；または患者を悪性腫瘍に対して影響を受けやすくさせる先天性もしくはその他の症候群（例えば、色素性乾皮症）が含まれる。

本明細書において用語「予防」への言及は、疾患の誘発の前の保護的組成物の投与が関与する。「抑制」は、誘導的事象の後であるが、疾患の臨床的な出現の前の組成物の投与を指す。「処置」は、病徴が明らかとなった後の保護的組成物の投与が関与する。

疾患から保護するか、疾患を処置することにおいて、薬物コンジュゲートの有効性をスクリーニングするために使用することができる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、ヒトおよび動物標的と交差反応することができ、動物モデルの使用を可能にするポリペプチドリガンドの開発を可能にする本発明によって促進される。

本発明を、下記の実施例を参照して下記でさらに記載する。

［材料および方法］
＜タンパク質発現＞
ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシン様リピート（ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインとしてまた公知である）、ヒト遺伝子からの残基Ｃｙｓ３１９−Ｇｌｙ５１１は、ｐＥＸＰＲ−ＩＢＡ４２（ＩＢＡ）発現ベクターを使用して、分泌されたＮ末端にＨｉｓ６タグ付き可溶性タンパク質としてＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現させた。発現に続いて、タンパク質をニッケル−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー、それに続くゲル濾過によって精製し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。バッチ毎の可変性をまた、ヘモペキシンドメイン結合二環の存在／非存在下で蛍光熱シフト実験によってモニターした。

＜ペプチド合成＞
ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによって製造されたＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成機、およびＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈによるＳｙｒｏ ＩＩ合成機を使用したＦｍｏｃ化学に基づいた。Ａｒｇ（Ｐｂｆ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）；Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）；Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ（ｔＢｕ）；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）；およびＴｙｒ（ｔＢｕ）（Ｓｉｇｍａ）の側鎖保護基を有する標準的なＦｍｏｃ−アミノ酸を用いた（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）。カップリング試薬は、ＨＣＴＵ（Ｐｅｐｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であり、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を塩基として用い、脱保護はＤＭＦ（ＡＧＴＣ）中の２０％ピペリジンで達成した。合成は０．３７ｍｍｏｌ／ｇｒのＦｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（ＡＧＴＣ）を使用して行い、Ｆｍｏｃ−アミノ酸は４倍過剰で利用し、塩基はアミノ酸に関して４倍過剰であった。アミノ酸は０．２ＭでＤＭＳＯに溶解し、ＨＣＴＵは０．４ＭでＤＭＦに溶解し、ＤＩＰＥＡは１．６ＭでＮ−メチルピロリドン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）に溶解した。条件は、カップリング反応が、ＤＭＦ中の２０〜５０％ＤＭＳＯを含有し、それは固相合成の間の凝集および欠失を低減させ、収率を増強したようなものであった。カップリング時間は一般に３０分であり、脱保護時間は２×５分であった。Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルグリシン（Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｍｅｒｃｋ）を１時間カップリングし、下記の残基についての脱保護およびカップリング時間は、それぞれ、２０分および１時間であった。合成の後、樹脂をジクロロメタンで洗浄し、乾燥させた。側鎖保護基の切断および支持体からの切断は、１０ｍＬの９５：２．５：２．５：２．５ｖ／ｖ／ｖ／ｗのＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ｉＰｒ_３ＳｉＨ／ジチオトレイトールを３時間使用して引き起こした。切断に続いて、使用済み樹脂を濾過によって除去し、濾液を−８０℃にて冷却した３５ｍＬのジエチルエーテルに加えた。ペプチドペレットを遠心分離し、エーテルを含んだ上清を廃棄し、ペプチドペレットを冷エーテルでさらに２回洗浄した。次いで、ペプチドを５〜１０ｍＬのアセトニトリル−水に再可溶化し、凍結乾燥した。小さな試料を、質量分析法による粗生成物の純度の分析のために取り出した（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ）。凍結乾燥に続いて、ペプチド粉末を、０．５ｍＬの１Ｍ ジチオトレイトールを補充したＨ_２Ｏ中の１０ｍＬの６Ｍ グアニジニウム塩酸塩に溶解し、Ｃ８Ｌｕｎａ分取ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上に充填した。溶媒（Ｈ_２Ｏ、アセトニトリル）を、０．１％ヘプタフルオロ酪酸で酸性化した。勾配は、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムを使用して、１５〜２０ｍＬ／分の流量にて、１５分で３０〜７０％アセトニトリルにわたって行った。（ＭＡＬＤＩによって同定するような）純粋な直鎖状ペプチド材料を含有する画分を合わせ、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）で修飾した。このために、直鎖状ペプチドを約３５ｍＬまでＨ_２Ｏで希釈し、アセトニトリル中の約５００μＬの１００ｍＭ ＴＢＭＢを加え、Ｈ_２Ｏ中の５ｍＬの１ＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３で反応を開始させた。反応をＲＴにて約３０〜６０分間進め、反応が完了すると（ＭＡＬＤＩによって判断）、凍結乾燥させた。凍結乾燥に続いて、修飾されたペプチドを上記のように精製し、その間、Ｌｕｎａ Ｃ８をＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）と置き換え、酸を０．１％トリフルオロ酢酸に変更した。正確なＴＭＢ−修飾材料を含有する純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、貯蔵のために−２０℃にて保持した。

全てのアミノ酸を、他に断らない限り、Ｌ−配置において使用した。

非天然アミノ酸を、上記の一般方法を使用してペプチド配列中に組み込んだ。

本明細書において用いられる非天然アミノ酸前駆体のリストを、下記の表において要約する。

薬物動態研究のために使用するペプチドを水中の０．１％ＴＦＡから凍結乾燥し、化合物のＴＦＡ塩または遊離酸を得た。

＜１７−６９−０７−Ｎ２６８および１７−６９−０７−Ｎ２４１を前駆体二環式ペプチドとして使用したＢＴ１７ＢＤＣ−２７およびＢＴ１７ＢＤＣ−２８の合成＞
前駆体ペプチド１７−６９−０７−Ｎ２４１、および１７−６９−０７−Ｎ２６８は、それぞれ、以下の配列：
（ｂＡｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＣ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃ、およびＡＣ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃを有する。両方とも、従前に開示したようにＴＢＭＢと共に環化され、コンジュゲーション部位として使用されるＮ末端において独特のアミノ基を含有し、Ｃ末端においてアミド化されている。

合成スキームを、下記で示す。

前駆体、および中間体チオールペプチドの分子量を、下記の表１において示す。

＜１７−６９−０７−Ｎ３３１の合成＞
ＤＭＳＯ（０．０４２ｍｍｏｌ、８０ｍｇ）中の２．１ｍＬの２０．１ｍＭの二環溶液（１７−６９−０７−Ｎ２６８）を、無水ＤＭＳＯ（０．０５４６ｍｍｏｌ）中の０．６ｍＬの９４．０ｍＭ ＳＭＰＰ ＮＨＳエステル溶液（ＣＡＳ Ｎｒ：８９０４０９−８５−５）に加え、それに続いて、１５４μＬの未希釈のＤＩＰＥＡ（０．８８４ｍｍｏｌ）を加え、このように得られた混合物を室温にて撹拌した。１．５時間後、反応をＬＣＭＳによって試料採取および分析し、反応は完了したと判断した。

４２３μＬの２００ｍＭ ＴＣＥＰ溶液（炭酸水素アンモニウムでｐＨ約８まで中和したトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（０．０８４６ｍｍｏｌ）を、室温にて反応混合物に直接加えた。３０分後、還元反応から試料を採取し、ＬＣＭＳによって完了したと判断した。

精製のために、溶液（約３．０ｍＬ）を希釈し、水（０．１％ＴＦＡ）およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）を移動相として使用して、Ｃ１８カラムを備えたＡＫＴＡ精製器１００（ＹＭＣ−Ａｃｔｕｓ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８分取ＨＰＬＣカラム、１２ｎｍ、１０μｍ、２５０×５０．０ｍｍ）（ＹＭＣ）（３５×２００ｍｍ）によって精製した。勾配は、１００ｍＬ／分の流量で２０分に亘り３５〜６５％アセトニトリルであった。生成物を含有する画分（ＵＶによって判断し、ＬＣＭＳによって決定するように純度によって選択する）を一緒に合わせ、凍結乾燥し、７３ｍｇの純粋な１７−６９−０７−Ｎ３３１（８３％収率）を得た。

＜１７−６９−０７−Ｎ３１９の合成＞
条件および精製は、１７−６９−０７−Ｎ３３１と同様であり、０．２１９ｍｍｏｌ（５８３ｍｇ）の１７−６９−０７−Ｎ２４１から開始し、４１７ｍｇの１７−６９−０７−Ｎ３１９（６８％収率）を得た。

＜ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−Ｐｙの合成＞
ジチオピリジン（３４１ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ（５３１μｌ、３．１ｍｍｏｌ）を有するＤＭ１−ＳＨ（２２９ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１２．４３ｍｌ）溶液に加えた。反応物を混合し、室温にて１．５時間静置した。反応進行をＥＳＩ ＭＳによって評価した。ＥＳＩ−ＭＳによって、生成物がＭＺ８４７．３Ｄａを形成しており、出発材料が消費されたことを確認した。生成物を、９カラム容量に亘る２０〜８０％のアセトニトリル勾配で、０．１％ＴＦＡ含有移動相とともにＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８分取カラムを使用して精製した。反応混合物をアセトニトリル中に希釈し、次いで、水で希釈した（最終アセトニトリル濃度２０％、最終４％ＤＭＦ）。分析用逆相ＨＰＬＣによって＞９５％純度であった画分をプールした。生成物（ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−Ｐｙ）を、１：１のＭｅＣＮ：水中で２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量化し（ｅ＝５９３５Ｍｃｍ−１）、単離した１８５ｍｇ（７０％収率）を得た。

＜ＢＴ１７ＢＤＣ−２７の合成＞
ペプチド１７−６９−０７−Ｎ３３１（２３９ｍｇ、１１９ｍｍｏｌ）を、３０ｍＭの濃度までＤＩＰＥＡ（１２３ｍｌ、５９ｍｍｏｌ）を有する無水ＤＭＦに溶解した。ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−ピリジル（６０ｍｇ、７１ｍｍｏｌ）をまた、２５ｍＭの濃度まで無水ＤＭＦに溶解した。ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−ピリジル溶液をペプチド溶液に加え、混合した。１時間後にＨＰＬＣおよびＭＳによって反応進行を分析した。総反応時間は２時間であった。反応混合物を２％の最終ＤＭＦ濃度まで２０％アセトニトリル／水の溶液中に希釈した。粗反応混合物は、９カラム容量に亘る２０〜９０％のアセトニトリル勾配で、０．１％ＴＦＡ含有移動相とともにＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８分取カラムを使用して精製した。１９０ｍｇの精製ペプチド＞９５％を、４６１ｍｇの総ペプチドインプットを伴って２つの反応から得た（収率３６．２％）。ペプチドを、２８０ｎｍで測定した吸光度を使用して定量化した（ｅ＝１３２２５Ｍｃｍ−１）。

＜ＢＴ１７ＢＤＣ−２８の合成＞
ペプチド１７−６９−０７−Ｎ３１９（２０６ｍｇ、７４ｍｍｏｌ）を、３０ｍＭの濃度までＤＩＰＥＡ（１００ｍｌ、５９ｍｍｏｌ）を有する無水ＤＭＦに溶解した。ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−ピリジル（５０ｍｇ、５９ｍｍｏｌ）はまた、２５ｍＭの濃度まで無水ＤＭＦに溶解した。ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−ピリジル溶液をペプチド溶液に加え、混合した。１時間後にＨＰＬＣおよびＭＳによって反応進行を分析した。総反応時間は３時間であった。反応混合物をアセトニトリル中に希釈し、次いで、水、４％の最終ＤＭＦ濃度、アセトニトリル２０％に希釈した。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製の前に、反応混合物を濾過した。粗反応混合物を上記のように精製し、２３０ｍｇの精製ペプチド＞９５％を、３９５ｍｇの総ペプチドインプットを伴って２つの反応から得た（収率５５．３％）。コンジュゲートを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中で２８０ｎｍにて測定した吸光度を使用して定量化した（ｅ＝１３２２５Ｍｃｍ−１）。

＜ＭＴ１−ＭＭＰへの二環式結合剤の解離速度定数決定（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）＞
直接結合蛍光偏光（Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）（アニソトロピー）アッセイ
直接結合蛍光偏光またはアニソトロピーアッセイは、一定濃度の蛍光トレーサー（ここでは、フルオレセイン化二環式ペプチドを研究する）をその結合パートナー（ここでは、ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメイン）で滴定することによって行う。結合パートナーの濃度が滴定の間に増加すると、極性化シグナルは、結合および非結合材料の画分に比例して変化する。これは定量的な解離速度（Ｋｄ）の決定を可能とする。アッセイデータは、標準的なリガンド結合等式を使用してフィットさせることができる。

典型的には、トレーサーの濃度は理想的には、トレーサー：滴定剤ペアのＫｄをはるかに下回り、選択した濃度は通常、約１ｎＭもしくはそれ未満である。滴定剤（結合パートナー）濃度は、０．１ｎＭから典型的には５μＭまで変化する。範囲は、蛍光偏光における最大変化を観察することができるように選択される。用いる緩衝液は、０．０１％Ｔｗｅｅｎの存在下でのリン酸緩衝食塩水である。実験をブラック３８４ウェル低結合／低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３８２０）において行い、蛍光偏光シグナルをＢＭＧ Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳプレートリーダーを使用して測定した。

テキストにおいて言及されている蛍光トレーサーは、５，６−カルボキシフルオレセインを使用してフルオレセイン化されている二環式ペプチドである。フルオレセイン化は、サルコシンスペーサー（通常、Ｓａｒ５）によって二環コア配列から分離されている、ペプチドのＮ末端アミノ基上で行い得る。これは、Ｎ末端アミノ基がペプチドに特有のものである場合、Ｆｍｏｃ固相合成の間または合成後（ＴＢＭＢとの環化および精製の後）に行うことができる。フルオレセイン化はまた、Ｃ末端上、通常、第１のＣ末端残基として導入されたリジン上で行うことができ、次いで、これはサルコシンスペーサー（通常、Ｓａｒ６）によって二環コア配列から分離される。このように、Ｎ末端トレーサーは、Ｃ末端がフルオレセイン化されている構築物について、Ｆｌｕｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ５−Ａ（ＢｉｃｙｃｌｅＣｏｒｅＳｅｑｕｅｎｃｅ）、および（ＢｉｃｙｃｌｅＣｏｒｅＳｅｑｕｅｎｃｅ）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）として記載される分子フォーマットを有することができる。実施例において使用される蛍光トレーサーは、Ａ−（１７−６９）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）、Ａ−（１７−６９−０７）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）、およびＡ−（１７−６９−１２）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）である。１７−６９蛍光ペプチドの酸性の性質によって、これらは典型的には、濃縮したＤＭＳＯストックとして調製し、これから、希釈物を１００ｍＭのトリスｐＨ８緩衝液中で調製した。

蛍光偏光（ピリジン）を使用した競合アッセイ
ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメイン（ＰＥＸ）へのそれらの高い親和性によって、１７−６９−０７および１７−６９−１２のフルオレセイン化誘導体（それぞれ、１７−６９−０７−Ｎ０４０および１７−６９−１２−Ｎ００５と示される）は、（検出のためにＦＰを使用した）競合実験のために使用することができる。ここで、蛍光ＰＥＸ−結合トレーサーを有するＰＥＸの事前形成された複合体を、遊離非フルオレセイン化二環式ペプチドで滴定する。全ての１７−６９に基づくペプチドは同じ部位において結合すると予想されるため、滴定剤はＰＥＸからの蛍光トレーサーを置換する。複合体の解離は定量的に測定することができ、標的タンパク質に対する競合物（滴定剤）のＫｄを決定した。競合方法の利点は、非フルオレセイン化二環式ペプチドの親和性を正確および急速に決定することができることである。

トレーサーの濃度は通常、Ｋｄもしくはそれ未満（ここでは、１ｎＭ）であり、結合タンパク質（ここでは、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシン）は、トレーサーの＞９０％が結合しているように１５倍過剰である。それに続いて、非蛍光競合物である二環式ペプチド（通常、単に二環コア配列）は、標的タンパク質からの蛍光トレーサーを置換するように滴定する。トレーサーの置換を測定し、蛍光偏光における低下と関連させる。蛍光偏光における低下は、非蛍光滴定剤と結合した標的タンパク質の画分と比例しており、したがって、標的タンパク質への滴定剤の親和性の尺度である。

生データを、蛍光トレーサー、滴定剤、および結合タンパク質の間の平衡を説明する三次方程式の分析的解法にフィットさせる。フィットは、標的タンパク質への蛍光トレーサーの親和性の値を必要とし、これは直接結合ＦＰ実験（従前のセクションを参照されたい）によって別々に決定することができる。曲線の当てはめは、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ１２．０を使用して行い、Ｚｈｉ−Ｘｉｎ Ｗａｎｇ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６０（１９９５）１１１−１１４）によって記載されている等式の適合させたバージョンを使用した。

＜血漿安定性プロファイリング＞
方法＃１：
もとの塊およびその血漿プロテアーゼ誘発フラグメントの質量分析検出（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた急速な血漿安定性プロファイリングアッセイを開発した。フラグメントの性質を評価することによって、好ましい切断部位を決定することができる。ここで、１〜１．５ｍＭのペプチドストック（ＤＭＳＯ中）を、マウス／ラット／ヒト血漿（Ｓｅｒａ ｌａｂｓ、シトレートを抗凝固剤として使用）中に直接希釈し、５０μＭのペプチドの最終濃度を得て、３７℃にて４８時間までインキュベートした。５μＬの試料を適当な時点において採取し、−８０℃にて冷凍した。分析のために、試料を解凍し、２５μＬの３：３：１のアセトニトリル：メタノール：水と混合し、１３ｋにて５分間遠心した。５μＬのペプチド含有上清を吸引し、アセトニトリル：Ｈ_２Ｏの１：１混合物中の３０ｍＭの炭酸水素アンモニウムと混合した。次いで、１μＬのこれをＭＡＬＤＩプレート上に付け、乾燥させ、マトリックス（アルファ−シアノケイ皮酸、Ｓｉｇｍａ、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する１：１アセトニトリル：水中の飽和溶液として調製）を、試料（１μＬ）上に層状にし、乾燥させ、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦを使用して分析した。これは、異なる二環ペプチド配列の間の血漿安定性における比較上の変化を検出する役割を果たし、かつ好ましい切断部位を決定する優れたツールとして機能する、定性的アッセイであることに留意すべきである。

方法＃２
二環式ペプチドの血漿安定性を定量的に得るために、ペプチドストック溶液（ＤＭＳＯ中１６０μＭ）を、最終濃度が４μＭであるように血漿（ヒト、ラットまたはマウス）と混合し、３７℃にてインキュベートした。４０μＬの試料を定期的に２４時間まで採取し、−８０℃にて凍結させた。ＬＣ−ＭＳ分析の前に、試料を解凍し、３容量（ここでは、１２０μＬ）である１部の水、３部のアセトニトリルおよび３部のメタノールと混合した。ミルク状懸濁液を冷却した遠心機中で１４０００ｒｐｍにて４０分間遠心し、参照として同じペプチドの血漿抽出標準曲線（ｐｌａｓｍａ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を使用する一方で、ペプチドを含有する上清を、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ−Ｄ機器を使用して、二重荷電／三重荷電種およびそのＭＳ／ＭＳフラグメントについて定量化した。血漿中の分解の半減期を使用して、分子の比較上の安定性を評価した。

＜ＥＢＣ−１異種移植マウスにおけるＢＴ１７ＢＤＣ−２７およびＢＴ１７ＢＤＣ−２８の有効性。＞
皮下のＥＢＣ−１異種移植腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃヌードマウスを、ＢＤＣまたはビヒクルで処置した。ＢＤＣは毎週３回２週間投薬し、腫瘍が概ね１５０〜２００ｍｍ^３を示したとき投薬を開始した。マウスをモニターし、腫瘍体積および体重の測定値を週に３回記録した。

［実施例１］
＜ＢＴ１７ＢＤＣ−２７およびＢＴ１７−ＢＤＣ−２８の親和性分析＞
２つのＤＭ１−毒素ＢＤＣを調製し（先にＢＴ１７ＢＤＣ−２７およびＢＴ１７ＢＤＣ−２８と言及される）、それによって、同一の立体障害は、分子構築物の二環側に導入させた。立体障害をもたらす基は、Ｒ^３およびＲ^４位において位置しているメチル基である。

ＢＴ１７ＢＤＣ−２８は、二環式ペプチド１７−６９−０７−Ｎ２４１を用い、これは、４つの修飾（Ｄ−Ａｌａ１ １Ｎａｌ４ Ｄ−Ａｌａ５ ｔＢｕＧｌｙ１１）を含有する二環式ペプチドのＮ末端に付着しているｂＡｌａ−Ｓａｒ１０分子スペーサーを含有する。

ＢＴ１７ＢＤＣ−２７は、二環式ペプチド１７−６９−０７−Ｎ２６８を用い、これは、同じ４つの修飾（Ｄ−Ａｌａ１ １Ｎａｌ４ Ｄ−Ａｌａ５ ｔＢｕＧｌｙ１１）を含有する一方で、１７−６９−０７−Ｎ２４１の二環式ペプチドのＮ末端に付着しているｂＡｌａ−Ｓａｒ１０分子スペーサーを欠いている。

１７−６９−０７−Ｎ２４１および１７−６９−０７−Ｎ２６８の二環式ペプチド配列、ならびに蛍光偏光競合実験（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）によって決定するようなＭＴ１−ＭＭＰへのそれらの親和性を、表２において示す。

データから、ｂＡｌａ−Ｓａｒ１０分子スペーサーは、その標的に対する親和性の保持のために必要とされず、このように、エフェクター（ここでは、ＤＭ１）とのコンジュゲーションは恐らく許容されることは明らかである。さらに、親水性分子のＳａｒ１０スペーサーを欠いているＢＤＣは、より低い分子量およびより高い毒素対重量比（ｔｏｘｉｎ ｔｏ ｗｅｉｇｈｔ ｒａｔｉｏ）、およびより大きな全体的疎水性を有し、これらは一致して薬物動態学的および薬力学的挙動に影響を与え得る。

ＢＴ１７ＢＤＣ−２７およびＢＴ１７ＢＤＣ−２８を、スキームＩによって合成した。ここで、アミン含有二環式ペプチド前駆体（それぞれ、１７−６９−０７−Ｎ２６８および１７−６９−０７−Ｎ２４１）を、ＳＭＰＰ（ピリジル−ジスルフィド保護された立体障害のあるジスルフィドを導入する）とコンジュゲートし、還元し、二環式ペプチド上の、遊離しているが立体障害のあるチオールが明らかになった。次いで、これを、ピリジル−ジスルフィド活性化ＤＭ１（ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−Ｐｙ）とジスルフィド交換し、所望の生成物を得た。

［実施例２］
＜ＢＴ１７ＢＤＣ−２７およびＢＴ１７ＢＤＣ−２８のインビトロでの特性決定＞
両方のＢＤＣコンジュゲート構造を、いくつかのインビトロでのパラメーター、例えば、ヒトＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインへの効力の保持、マウス、ラットおよびヒト血漿中の安定性、ならびに還元剤、例えば、ジチオトレイトールに対する安定性について評価した。

データを、下記の表３において要約する。

上記データは、ＭＴ１−ＭＭＰ標的への親和性が保持されるために、Ｓａｒ１０分子スペーサーの非存在下でさえ、構築物が毒素付着を許容することを示す。さらに、立体障害のないジスルフィドＢＤＣと比較した、ＤＴＴに対する相対的安定性は、ＢＴ１７ＢＤＣ−２７およびＢＴ１７ＢＤＣ−２８の両方について実質的に同一であり、分子スペーサーの存在または非存在が、毒素放出速度に対して影響を与えないことを示す。

［実施例３］
＜ＢＴ１７ＢＤＣ−２７およびＢＴ１７ＢＤＣ−２８のインビボでの有効性＞
両方のＢＤＣは、ヒト肺扁平上皮細胞がん株ＥＢＣ−１を使用して、インビボでのマウス異種移植モデルにおいてそれらの有効性について試験した。

ＢＴ１７ＢＤＣ−２７は、１０ｍｇ／ｋｇで１４日以内に腫瘍を除くため、ＢＴ１７ＢＤＣ−２８より効果的であった（図１）。体重の僅かな低減はこの用量で観察可能であった（図２）。逆に、１０ｍｇ／ｋｇで、ＢＴ１７ＢＤＣ−２８は、腫瘍成長の停滞をもたらしたが、活発な退縮をもたらさず（図３）、一方、体重減少はＢＴ１７ＢＤＣ−２８について観察されなかった（図４）。ＢＴ１７ＢＤＣ−２７は、５ｍｇ／ｋｇと等しいかまたはより低い用量での認識できる有効性および忍容性によって、さらなる注目に値する。

Claims (4)

1. ＢＴ１７ＢＤＣ−２７
   

   

   またはＢＴ１７ＢＤＣ−２８
   

   

   から選択される薬物コンジュゲートであって、二環１７−６９−０７−Ｎ２６８が、−ＡＣ_ｉ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）Ｃ_ｉｉＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃ_ｉｉｉ−ＣＯＮＨ_２を示し、二環１７−６９−０７−Ｎ２４１が、−（ｂＡｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＣ_ｉ（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）Ｃ_ｉｉＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ｃ_ｉｉｉ−ＣＯＮＨ_２を示し、Ｃ _ｉ 、Ｃ _ｉｉ 、およびＣ _ｉｉｉ がそれぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し、前記二環がＣ_ｉ、Ｃ_ｉｉ、およびＣ_ｉｉｉ上で環化されて三置換１，３，５−トリスメチルベンゼン構造がもたらされる、薬物コンジュゲート。
2. 以下のスキームＩ：
   

   

   の合成経路を含む、請求項１に記載の薬物コンジュゲートを調製する方法。
3. １種もしくは複数の薬学的に許容される添加剤と組み合わせて、請求項１に記載の薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
4. がん、特に、固形腫瘍、例えば、非小細胞肺がんの予防、抑制または処置において使用するための、請求項１に記載の薬物コンジュゲート。

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