JP2013518558A - 構造化されたペプチドプロセシング - Google Patents
構造化されたペプチドプロセシング Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013518558A JP2013518558A JP2011548606A JP2011548606A JP2013518558A JP 2013518558 A JP2013518558 A JP 2013518558A JP 2011548606 A JP2011548606 A JP 2011548606A JP 2011548606 A JP2011548606 A JP 2011548606A JP 2013518558 A JP2013518558 A JP 2013518558A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- repertoire
- target
- ligand
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
Description
(a)遺伝学的ディスプレイ系において1以上のペプチドリガンドを提示するステップと、ここで、前記ポリペプチドは、分子足場と共有結合を形成する2以上の反応基と、2つの前記反応基間に内在する2以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも1つのループとを含み、
(b)前記ペプチドリガンドを1以上のプロテアーゼに曝露するステップと、
(c)前記ペプチドリガンドを標的に対する結合についてスクリーニングし、標的に結合するリガンドを選択するステップと
を含む、2以上のアミノ酸残基において分子足場に共有結合しているポリペプチドを含む、1以上のペプチドリガンドを調製するための方法が提供される。
(a)遺伝学的ディスプレイ系において1以上のペプチドリガンドを提示するステップと、ここで、前記ポリペプチドは、分子足場と共有結合を形成する2以上の反応基と、2つの反応基間に内在する2以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも1つのループとを含み、
(b)前記ペプチドリガンドを標的に対する結合についてスクリーニングし、標的に結合するリガンドを選択するステップと、
(c)標的に結合する前記ペプチドリガンドを1以上のプロテアーゼに曝露するステップと、
(d)前記ペプチドリガンドを標的に対する結合についてさらにスクリーニングするステップと
を含む、2以上のアミノ酸残基において分子足場に共有結合しているポリペプチドを含む、1以上のペプチドリガンドを調製するための方法を提供する。
ペプチドリガンドの設計および製造は、本発明者らの国際公開公報WO2009/098450号、ならびに国際特許出願WO2004/077062号およびWO2006/078161号に記載されている。以下の態様は、ペプチドリガンドの構築を要約する。
分子足場は、「分子コア」または「連結化合物」と呼ばれることもある。好適には、分子足場は、分子対称性を有する。好適には、分子足場は3つの足場反応基を有し、3回対称性を有する。これには、単一の反応生成物のみを生成するという利点がある。分子足場が対称分子でない場合には、複数の反応生成物が生成される可能性がある。これは、複雑な状態を引き起こし得るか、または、所望の異性体をその他の反応生成物から分離することを必要とし得る。
コードされたポリペプチドの反応基は、好適には天然もしくは非天然アミノ酸の側鎖により提供される。コードされたポリペプチドの反応基は、好適にはチオール基、アミノ基、カルボキシル基、グアニジウム基、フェノール基またはヒドロキシル基から選択される。コードされたポリペプチドの反応基は、好適にはアジド基、ケト−カルボニル基、アルキン基、ビニル基、またはハロゲン化アリール基から選択されてよい。分子足場に連結するためのコードされたポリペプチドの反応基は、好適にはポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
本発明の分子足場は、ポリペプチド上の官能基また反応基を介してポリペプチドに結合させることができる。これらは、一般にポリペプチドポリマー中に見出される特定のアミノ酸の側鎖から形成される。かかる反応基は、システイン側鎖、リジン側鎖、あるいはN末端アミン基または任意のその他の適した反応基であってよい。
ファージ感染力を破壊することなくファージペプチドに足場を結合させるための詳細な条件は、本発明者らの国際特許出願WO2009/098450号に記載されている。足場分子の結合は、次の原理を伴う。
<プロテアーゼ切断>
一部の実施形態では、本発明のポリペプチド要素は、それらが分子足場/分子コアに繋ぎ止められるとすぐにタンパク質分解によって切断される。この切断により、分子足場/分子コアに繋ぎ止められた別個のペプチド断片を有するリガンドが生成される。
もう1つの実施形態では、ポリペプチドは、プロテアーゼ切断に対して耐性であり得る。一般に、切断するためにプロテアーゼがポリペプチドに物理的に接近することができないので、しっかりと折りたたまれたポリペプチド構造は、プロテアーゼに対する耐性がより高い。そのため、ペプチドリガンド中の足場および足場結合の操作によって、ポリペプチドループの折りたたみに影響を及ぼすことにより、プロテアーゼ感受性を調節することができる。
(a)ポリペプチドの第1のレパートリーを準備するステップと、
(b)前記ポリペプチドを、ポリペプチド複合体のレパートリーを形成するように2以上のアミノ酸残基においてポリペプチドに結合する分子足場に対してコンジュゲートするステップと、
(c)前記レパートリーを標的に対する結合についてスクリーニングし、標的に結合する第1のレパートリーのメンバーを選択するステップと、
(d)所望により、選択したレパートリーを還元剤で処理するステップと、
(e)レパートリーをプロテアーゼで処理するステップと、
(f)前記レパートリーを標的との結合についてさらにスクリーニングするステップと
を含む、増大したプロテアーゼ耐性を有するペプチドリガンドを選択するための方法を提供する。
(a)ポリペプチドの第1のレパートリーを準備するステップと、
(b)前記ポリペプチドを、ポリペプチド複合体のレパートリーを形成するように2以上のアミノ酸残基においてポリペプチドに結合する分子足場に対してコンジュゲートするステップと、
(c)所望により、レパートリーを還元剤で処理するステップと、
(d)レパートリーをプロテアーゼで処理するステップと、
(e)前記レパートリーを標的に対する結合についてスクリーニングし、プロテアーゼでの処理の後に標的に結合する、第1レパートリーのメンバーを選択するステップと
を含む、プロテアーゼにより切断されたペプチドリガンドを選択するための方法を提供する。
一態様では、ファージ上に提示されるペプチドの切断は、規定されたプロテアーゼ切断部位で行われ得る。切断部位は、プロテアーゼが直鎖状ペプチドを切断することのできるペプチドの配列中の位置である。例えば、そのような部位は、ランダム変異誘発に起因するものであっても、切断部位を含むペプチドの選択によるものであっても、ファージ上に提示されるペプチドに天然に存在し得る。
本発明のペプチドリガンドは、どんな所定の標的にも結合するよう設計することができる。当業者は、標的分子の選択が大規模で多様であることを理解する。それらは、例として、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素の酵素補因子またはDNA結合タンパク質であり得る。適したサイトカインおよび増殖因子としては、限定されるものではないが:ApoE、Apo−SAA、BDNF、カルジオトロフィン−1、EGF、EGF受容体、ENA78、エオタキシン、エオタキシン−2、エクソダス−2、酸性FGF、塩基性FGF、線維芽細胞増殖因子−10、FLT3リガンド、フラクタルカイン(CX3C)、GDNF、G−CSF、GM−CSF、GF−I、インスリン、IFNy、IGF−I、IGF−II、IL−la、IL−1(3、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8(72a.a.)、IL−8(77a.a.)、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−17a、IL−17c、IL−17d、IL−17e、IL−17f、IL−18(IGIF)、IL−21、IL−22、IL−23、IL−31、IL−32、IL−33、IL−34、インヒビンα、インヒビンβ、IP−10、ケラチノサイト増殖因子−2(KGF−2)、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー管抑制因子、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、M−CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP−1(MCAF)、MCP−2、MCP−3、MCP−4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP−la、MIP−1p、MIP−3a、MIP3、MIP−4、骨髄系前駆細胞抑制因子−1(MPIF−1)、NAP−2、ニュールツリン、神経成長因子、P−NGF、NT−3、NT−4、オンコスタチンM、PDGF−AA、PDGF−AB、PDGF−BB、PF−4、RANTES、SDFla、SDFlp、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF−α、TGF−β、TGF−2、TGF−3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF−α、TNF−β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL−1、TPO、VEGF、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP−2、GRO/MGSA、GRO−β、GRO−γ、HCC1,1−309、HER1、HER2、HER3およびHER4が含まれる;サイトカイン受容体には、前述のサイトカインの受容体が含まれる。ケモカイン標的には、CCケモカインリガンドCCL21/6Ckine、CCL12/MCP−5、CCL6/C10、CCL22/MDC、CCL14/HCC−1/HCC−3、CCL3L1/MIP−1αイソ型LD78β、CCL23/Ckβ8−1、CCL3/MIP−1α、CCL28、CCL4L1/LAG−1、CCL27/CTACK、CCL4/MIP−1β、CCL24/エオタキシン−2/MPIF−2、CCL15/MIP−1δ、CCL26類(CCL26−like)/エオタキシン3類(Eotaxin−3−like)、CCL9/10/MIP−1γ、CCL26/エオタキシン−3、CCL19/MIP−3β、CCL11/エオタキシン、CCL20/MIP−3α、CCL14a/HCC−1、CCL23/MPIF−1、CCL14b/HCC−3、CCL18/PARC、CCL16/HCC−4、CCL5/RANTES、CCL1/I−309/TCA−3、TAFA1/FAM19A1、MCK−2、TAFA5/FAM19A5、CCL2/JE/MCP−1、TAFA3/FAM19A3、CCL8/MCP−2、TAFA4/FAM19A4、CCL7/MCP−3/MARC、CCL17/TARC、CCL13/MCP−4およびCCL25/TECKが含まれる;ケモカイン受容体には、CCR1、CCR7、CCR2、CCR8、CCR3、CCR9、CCR4、CCR10、CCR5、CCRL2/LCCR/CRAM−A/BおよびCCR6が含まれる;CXCケモカインリガンドとしては、CXCL13/BLC/BCA−1、CXCL10/IP−10/CRG−2、CXCL14/BRAK、LIX、CXCL16、CXCL15/ラングカイン(Lungkine)、CXCL5/ENA−78、CXCL9/MIG、CXCL6/GCP−2、CXCL7/NAP−2、CXCL1/2/3/GRO、CXCL4/PF4、CXCL1/GROα/KC/CINC−1、CXCL12/SDF−1α、CXCL2/GROβ/MIP−2/CINC−3、CXCL12/SDF−1β、CXCL3/GROγ/CINC−2/DCIP−1、CXCL12/SDF−1、CXCL11/I−TAC、CXCL7/胸腺ケモカイン−1およびCXCL8/IL−8が含まれる;CXCケモカイン受容体には、CXCR3、CXCR7/RDC−1、CXCR4、CXCR1/IL−8RA、CXCR5、CXCR2/IL−8RBおよびCXCR6が含まれる;TNFスーパーファミリーリガンドには、4−1BBリガンド/TNFSF9、LIGHT/TNFSF14、APRIL/TNFSF13、リンホトキシン、BAFF/BLyS/TNFSF13B、リンホトキシンβ/TNFSF3、CD27リガンド/TNFSF7、OX40リガンド/TNFSF4、CD30リガンド/TNFSF8、TL1A/TNFSF15、CD40リガンド/TNFSF5、TNF−α/TNFSF1A、EDA(pan)、TNF−β/TNFSF1B、EDA−A1/エクトジスプラシンA1、TRAIL/TNFSF10、EDA−A2、TRANCE/TNFSF11、Fasリガンド/TNFSF6、TWEAK/TNFSF12およびGITRリガンド/TNFSF18が含まれる;TNFスーパーファミリー受容体には、4−1BB/TNFRSF9/CD137、NGF R/TNFRSF16、BAFF R/TNFRSF13C、オステオプロテジェリン/TNFRSF11B、BCMA/TNFRSF17、OX40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11A、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5、TACI/TNFRSF13B、DcR3/TNFRSF6B、TNFRH3/TNFRSF26、DcTRAIL R1/TNFRSF23、TNFRI/TNFRSF1A、DcTRAIL R2/TNFRSF22、TNF RII/TNFRSF1B、DR3/TNFRSF25、TRAIL R1/TNFRSF10A、DR6/TNFRSF21、TRAIL R2/TNFRSF10B、EDAR、TRAIL R3/TNFRSF10C、Fas/TNFRSF6/CD95、TRAIL R4/TNFRSF10D、GITR/TNFRSF18、TROY/TNFRSF19、HVEM/TNFRSF14、TWEAK R/TNFRSF12、リンホトキシンβ R/TNFRSF3およびXEDARが含まれる;TLR−1、TLR−2、TLR−3、TLR−4、TLR−5、TLR−6、TLR−7、TLR−8およびTLR−9を含むトール様受容体;カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンF、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP26、MMP27、MMP28、ウロキナーゼ、カリクレイン(KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14およびKLK15を含む)を含む、酵素;補体系の成分;細胞内シグナル分子および転写因子;p53;およびMDM2。
MDM2は、腫瘍抑制因子であるp53のトランス活性化ドメインを認識する、酵素(E3ユビキチンリガーゼ)であり、プロテオソームによるp53のユビキチン化および分解を引き起こす。p53−MDM2相互作用のヌトリン(nutlin)阻害剤は、p53経路のインビボ活性化を導くことができ、そのような薬剤が抗癌剤としての可能性を有し得ることが示唆されてきた。本発明者らは、標的「抗原」であるMDM2に対する2つの二環式ペプチド(PEP10およびPEP48)の選択をここに記載する。各々の合成ペプチドの親和性は、マイクロモル以下であって、250〜750nMの範囲内であった。競合ELISAにより、少なくとも1つのペプチドが、p53−MDM2相互作用を阻止することが既に示されている直鎖状ペプチドと同じ部位に結合することが示された。
少なくとも4×109クローンの多様性を有するファージペプチドライブラリーを調製し、TBMBを以前に記載されるように、少しの変更とともにコンジュゲートした。
1.以前に記載したファージのcx6ライブラリー(TG1細胞から調製)を用いて非サプレッサー株HB2151(Carter,Bedouelle & Winter.1985.Nucleic Acids Res.13:4431−43)を感染させ、感染細胞を播種した。約8mlの2xTY培地中、30μg/mlクロラムフェニコール、10%グリセロール(v/v)の中に細菌をプレートからこすり落とした。
2.約0.8mlの原液を、30μg/mlクロラムフェニコールを含む800mlの2xTY培地に添加して、600nmで約0.1のODを得た。培養物を30℃にてインキュベートし、2リットルのフラスコ中で200rpmにて16時間振盪した。
3.細胞培養を、4,000rpm(ヘレウス社製Megafuge−2R)で4℃にて30分間遠心した。上清を200ml冷20%PEG/2.5MのNaCLに移した。この混合物を氷上に1時間放置した。
4.沈殿した上清/ファージ混合物を、4℃にて30分間遠心沈殿し、上清を捨てた。
5.ファージを、35mlのPBS/5mMのEDTAに再懸濁し、それに続いて4000rpm(ヘレウス社製Megafuge−2R)で15分間回転させて細胞残屑を除去した。上清を新しい50mlファルコンチューブに移した。
1.5mlの8mMのTCEP(H2O中)を、ファージに添加して、終濃度1mMのTCEPを得た。チューブを数回転倒混和し、42℃の水浴中で1時間インキュベートした。
2.TCEPを、2回目のPEG沈殿により除去した。10mlの20%PEG/2.5MのNaCL(脱気溶液)を添加し、混合し、氷上で45分間インキュベートして、4℃、4000rpmで30分間回転させた。
3.上清を注意深く取り出し、12mlのPBS/5mMのEDTA、10μMのTCEP(脱気するバッファー)にペレットを再懸濁した。
4.3mlのアセトニトリル/50μMのTBMBを、12mlの還元したファージに添加して、10μMのTBMB終濃度を得た。チューブを数回反転させ、水浴中30℃にて1時間放置した。ファージを氷上で冷却し、1/5量の20%PEG/2.5MのNaCLで30分間沈殿させた。4000rpm(ヘレウス社製Megafuge−2R)にて20分間回転させることによりファージを回収した。上清を取り出し、ファージを4mlのPBSに再懸濁させた。ファージを2mlのエッペンドルフチューブに移し、13000rpm(エッペンドルフ社製卓上遠心機)で10分間回転させた。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ファージの感染力を測定した。
1回目の選択
1.上記のように精製し化学的にコンジュゲートさせたファージを、ストレプトアビジンでコートしたダイナビーズ(ダイナル・バイオテク社)の表面上に固定化されたビオチン化MDM2(bio−MDM2)ペプチド(res2−125)に対して選択した。80μlのビーズをまず洗浄し、PBS中2%(w/v)のマーベル社製粉乳(PBSM)で40分間ブロッキングし、それに続いて総量1mlで100nM bio−MDM2とともに20分間インキュベートした。
2.化学的に修飾したファージ(1010〜1011TU)を、PBSMとともに40分間インキュベートした。
3.ステップ1のブロックされたAgコートビーズを、PBS中0.1%Tween(PBST)で過剰なAgから洗浄し、総量1mlでブロックされたファージとともに30分間インキュベートした。
4.非結合ファージを、PBSTで10回、その後PBSで2回洗浄した。各々の3度目の洗浄段階の後、ファージコートビーズを新しいエッペンドルフチューブに移した。
5.回転ホイール上で、500μlのpH2.2、50mMグリシンとともに10分間インキュベートすることにより、ファージを溶出した。溶出したファージを、250μlの1Mトリス、pH7.5で中和した。
6.375μlのファージを、10mlのHB2151細胞とともに、振盪せずに、37℃にて90分間インキュベートした。
7.次に、感染細胞を37℃にて30分間振盪した後、クロラムフェニコールプレート(20×20cm)に播種した。
8.コロニーをプレートから、上記のように、2xTY、クロラムフェニコール、10%グリセロールの中にこすり落とし、グリセロール原液として−80℃にて貯蔵した。細胞の画分を用いて2回目の選択のためのファージを調製した。
2回目の選択は、わずかの修飾を除いて1回目の選択と同様に行った。
1.ニュートラアビジンでコートした磁性ビーズを、ストレプトアビジンでコートしたものの代わりに使用した。
2.選択で使用した抗原の量は20nMであった。
3.化学的に修飾されたファージ(1010〜5×1010TU)を最初に50μg/mlのキモトリプシンで2分間処理した後、PBSMで40分間ブロッキングした。
4.非結合ファージを、PBSTで15回、その後PBSで2回、そのほかの点では上記の通り洗浄した。
上記のような一般的なプロトコールを用いてクローン48を選択し、一方クローン10を、導入されている修飾プロトコールの結果として開発した。これらの修飾は、以下の通りである。
1.1回目では、化学的に修飾されたファージを50μg/mlのキモトリプシンで2分間前処理した後、PBSMで40分間ブロッキングした。
2.2回目では、化学的に修飾されたファージを最初に5mM DTTで20分間還元した後、50μg/mlのキモトリプシンで2分間インキュベートし、PBSMで40分間ブロッキングした。
ファージクローン48およびファージクローン10由来のコードペプチドを、遊離N末端およびC末端を用いて合成した。PEP10:H−Ser−Cys−Glu−Leu−Trp−Asn−Pro−Lys−Cys−Arg−Leu−Ser−Pro−Phe−Glu−Cys−Lys−Gly−OH;PEP48:H−Ser−Cys−Val−Arg−Phe−Gly−Trp−Thr−Cys−Asp−Asn−Ser−Trp−His−Gly−Cys−Lys−Gly−OH。
最初の反応を実施して、ファージ選択の間に用いた条件を再現した。一般に、5mgの精製ペプチドを水1mlに溶解させ、0.8mlの50mM NH3HCO3を添加し、それに続いて40μlのTCEPを添加した。MeCNに溶解したTBMB(ペプチドの重量に基づいて3当量)を、この反応に加えた。反応を1.5時間放置した後、HPLCでモニターした。完了すると、反応をHPLCにより精製した。一般に、0.5〜1.5mgの最終生成物が得られた。この方法は、多くの副生成物を生じ、主な生成物は所望の質量+250amuである。これは、TCEPの目的生成物への添加に相当し、この生成物の収量は反応時間とともに増加する。加えて、2回目のTBMBの添加に相当する、その他の質量のより高い生成物が、MALDI−TOF質量分析で観察されたが、単離されなかった。
ファージELISAアッセイ
0.6μg/mLのビオチン化MDM2ペプチド(res2〜125)を、ストレプトアビジンコートプレート(ロシュ社)上に固定化した。プレートをPBSM(但し粉乳中4%)でブロッキングし、直鎖状またはTBMBコンジュゲートファージ(5mM DTTの存在下または不在下、PBSM中107TU/ウェル)を、プレート上で室温にて50分間インキュベートした。同様に、ファージを最初に5mM DTT中で20分間還元し、キモトリプシン(PBS中50μg/ml)で2分間処理し、PBSM(終濃度)と混合し、プレート上で50分間室温にてインキュベートした。抗−M13−HRPモノクローナル抗体(1:5000、アマシャム社)を用いてファージを検出した。
滴定実験は、実験室のソフトウェアにより制御されたハミルトン社製Microlab滴定装置を備えたホリバ・ジョバンイボン社製蛍光光度計で実施した。用いたλexおよびλemは、それぞれ295nmおよび350nmであった。励起および発光のスリット幅は、5nmおよび15nmであり、10秒の積分時間を各々の測定に用いた。ペプチド10、48中のトリプトファンの内部蛍光を用いて、MDM2(res2〜125)に対するそれらの結合親和性を測定した。実験は23℃にてPBS中、5mMのDTTで実施した。通常は250μlのMDM2(150μM)を、1.2mlのペプチド(1μM)に滴定した。滴定データを、平衡Kd=[A][B]/[AB]に対する二次方程式の解(quadratic solution)を用いて標準的な1:1結合モデルで分析した。Kdは、解離速度であり、[A]および[B]は、それぞれ、滴定剤(MDM2)および蛍光ペプチド10および48の濃度をさす。フィッティング方程式には、線形ドリフト(linear drift)を説明するために余分の項目を含めた。
PEP10+MDM2、測定値λex=295nm、Kd=267nM;
PEP48+MDM2、測定値λex=280nm、Kd=760nM;
PEP48+MDM2、測定値λex=295nm、Kd=567nM
PEP48ファージとMDM2の結合は、MDM2にp53部位でKd=3.3nMで結合するペプチドpMI(TSFAEYWNLLSP)に競合された(Pazgier et.al.,2009 PNAS,106,4665−4670)。0.6μg/mlのビオチン化MDM2ペプチド(res2〜125)を、ストレプトアビジンコートプレート(ロシュ社)上に固定化した。プレートをPBSMでブロッキングした。TBMB−コンジュゲートファージ(1%PBSM中107TU/ウェル)を、一連の濃度のpDI(6.94nM〜1μM)と前もって混合し、プレート上で75分間室温にてインキュベートした。抗M13−HRPモノクローナル抗体(1:5000、アマシャム社)を用いてファージを検出した。PEP48ファージとMDM2の結合は、pMIペプチドの添加により抑制され、IC50=125nMと推定された。
Heinis et al.,2009の二環式ペプチドPK15およびCG4を、それぞれカリクレインおよびカテプシンGプロテアーゼに対して選択した。二環式ペプチドがこれらのプロテアーゼによる消化に耐性であれば、それは驚くことではなく、特に足場が制約された機能は、タンパク質分解作用に対する保護の助けとなるはずである。
表:様々なプロテアーゼによるペプチド複合体の消化。
方法に関しては、次の実施例3を参照されたい。タンパク質分解は、37℃で行われた。カテプシンGおよびカリクレイン(kalikrein)反応は、pH7.4の10mMトリス、150mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mMのCaCl2、0.1%BSA、0.01%トリトンX100、5%DMSO中で実施された。キモトリプシン反応は、pH7.4の100mMトリス、10mMのCaCl2中で実施された。プロナーゼおよびプロテイナーゼK反応は、pH7.4の100mMトリス、0.5%SDS中で実施された。スブチリシン反応は、pH7.5の50mMのKH2PO4中で実施された。トリプシン反応は、pH7.6の67mMリン酸ナトリウム中で実施された。血清を含む反応条件は、ペプチドを1×PBS(総容量24μl)に溶解することおよび6μlのヒト血清をこの反応に添加することを伴う。
PK15のトリプシンおよびキモトリプシン切断部位を同定するため、本発明者らは、上の実施例2に記載されるように、ヨードアセトアミド誘導体化ペプチドとTBMB複合体の両方を使用した。タンパク質分解条件も、実施例2に記載される通りであった。質量分析による解析により、切断された種の分子量の分析から、本発明者らはヨードアセトアミド誘導体化ペプチド(AC*SDRFRNC*PADEALC*G)において、R7およびR9は、両方ともトリプシンに切断され、F8はキモトリプシンに切断されたことを示すことができた。実施例2に述べたようにその切断がはるかに遅い速度であったことを除いて、同じ切断部位がTBMBコンジュゲートペプチドにも見られた。さらに、トリプシンによる、最初の切断段階はR7であり、その後、より長いインキュベーションでR9での切断が続く。
ペプチドおよび複合体を、バリアン940 HPLCを用いて、Proteo C12(4μ、フェノメネクス社)カラムで精製した。用いたバッファーは、0.1%TFA(A)および90%MeCN、0.1%TFA(B)であった。一般に、サンプルは、10〜65%のバッファーB勾配で23分にわたって溶出された。
PK15ビシクロ複合体は、実施例2に記載されるように、直鎖型よりもキモトリプシンおよびトリプシンによる消化に耐性が高い。しかし、延長されたインキュベーションの後、実施例3に記載されるように、それはトリプシンによりアルギニン残基で切断され、フェニルアラニンの後にキモトリプシンにより切断される。アミノ酸側鎖に変化を作ることにより、タンパク質分解に対するさらなる耐性をもたらすことが可能であり得る。また、本明細書に記載され、D−アミノ酸、またはN−メチル化、または還元ペプチド結合の、切断の部位の近傍への導入により例証されるようにペプチド骨格に変化を作ることによりそうすることも可能であり得る。従って、PK15のプロテアーゼ切断部位で耐性をもたらすために、次の変異体を合成した。
H−ACSDR f RNCPADEALCG−OH(ここでfは、D−Pheを表す)、およびH−ACSDRF−(NMeArg)−NCPADEALCG−OH、およびH−ACSDRF Y[CH2NH] RNCPADEALCG−OH(ここでY[CH2NH]は、還元ペプチド結合を表す)。
THF:テトラヒドロフラン;NMM:N−メチルモルホリン;IBCF:イソ−ブチルクロロホルメート;DMF:N,N−ジメチルホルムアミド;DiPEA:ジイソプロピルエチルアミン;TFA:トリフルオロ酢酸;EDT:エタンジチオール;PyBOP:ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩;PyBrOP:ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
Claims (21)
- (a)遺伝学的ディスプレイ系において1以上のペプチドリガンドを提示するステップと、ここで、ポリペプチドは、分子足場と共有結合を形成する2以上の反応基と、2つの前記反応基間に内在する2以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも1つのループとを含み、
(b)前記ペプチドリガンドを1以上のプロテアーゼに曝露するステップと、
(c)前記ペプチドリガンドを標的に対する結合についてスクリーニングし、前記標的に結合するリガンドを選択するステップと
を含む、2以上のアミノ酸残基において分子足場に共有結合しているポリペプチドを含む1以上のペプチドリガンドを調製するための方法。 - (a)遺伝学的ディスプレイ系において1以上のペプチドリガンドを提示するステップと、ここで、ポリペプチドは、分子足場と共有結合を形成する2以上の反応基と、2つの前記反応基間に内在する2以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも1つのループとを含み、
(b)前記ペプチドリガンドを標的に対する結合についてスクリーニングし、前記標的に結合する該リガンドを選択するステップと、
(c)前記標的に結合する前記ペプチドリガンドを1以上のプロテアーゼに曝露するステップと、
(d)前記ペプチドリガンドを標的に対する結合についてさらにスクリーニングするステップと
を含む、2以上のアミノ酸残基において分子足場に共有結合しているポリペプチドを含む1以上のペプチドリガンドを調製するための方法。 - 前記遺伝子ディスプレイ系は、ファージディスプレイである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記標的に対する結合について選択された前記ペプチドリガンドは、プロテアーゼ切断に耐性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロテアーゼへの曝露は、還元剤の存在下で実施される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1以上のペプチドリガンドは、ペプチドリガンドのレパートリーである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 各々が、分子足場と共有結合した2以上の反応基を含むポリペプチドと、2つの前記反応基間に内在する2以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも1つのループとを含む、ペプチドリガンドのレパートリーであって、前記レパートリーはプロテアーゼ耐性である、ペプチドリガンドのレパートリー。
- 未処理である、請求項7に記載のレパートリー。
- 1以上の標的に対する結合について選択されている、請求項7に記載のレパートリー。
- 各々のポリペプチドが、分子足場と共有結合した3以上の反応基を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載のレパートリー。
- 前記標的に対する結合について選択された前記ペプチドリガンドが、プロテアーゼ切断に感受性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロテアーゼへの曝露が、還元剤の存在下で実施される、請求項11に記載の方法。
- 前記選択されたペプチドリガンドが、2以上の独立したポリペプチドを含み、そのポリペプチドの各々が少なくとも1カ所で分子足場に結合している、請求項12に記載の方法。
- 前記1以上のペプチドリガンドが、ペプチドリガンドのレパートリーである、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 各々のリガンドが2以上の独立したポリペプチドを含み、その各々が少なくとも1カ所において分子足場に結合している、ペプチドリガンドのレパートリー。
- 前記ペプチドリガンドが、1以上の標的と特異的に結合する能力のある、請求項15に記載のレパートリー。
- 前記ペプチドリガンドが多重特異性である、請求項16に記載のレパートリー。
- ファージ上に提示される、請求項15〜17のいずれか一項に記載のレパートリー。
- 前記ペプチドリガンドの標的に対する該結合特異性が、1以上のペプチドループのプロテアーゼ切断によって変更される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的に結合する前記ペプチドリガンドが、
(a)アミノ酸側鎖の修飾または置換、または、
(b)ポリペプチド骨格の修飾
によってさらに修飾される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記骨格の修飾が、前記プロテアーゼ切断部位の近くに、D−アミノ酸、還元ペプチド結合、およびN−メチル化を導入することからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/EP2010/000690 WO2010089116A1 (en) | 2009-02-04 | 2010-02-04 | Structured peptide processing |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013518558A true JP2013518558A (ja) | 2013-05-23 |
Family
ID=48668182
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011548606A Pending JP2013518558A (ja) | 2010-02-04 | 2010-02-04 | 構造化されたペプチドプロセシング |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2013518558A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017213158A1 (ja) * | 2016-06-07 | 2017-12-14 | 株式会社カネカ | リボソームディスプレイ複合体およびその製造方法 |
JP2018502825A (ja) * | 2014-10-29 | 2018-02-01 | バイサイクル・セラピューティクス・リミテッド | Mt1−mmpに特異的な二環性ペプチドリガンド |
JP2019523214A (ja) * | 2016-05-04 | 2019-08-22 | バイスクルアールディー・リミテッド | Mt1−mmpに対して特異的な二環式ペプチド−毒素コンジュゲート |
JP2022514618A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-14 | バイスクルテクス・リミテッド | Pd-l1に特異的な二環式ペプチドリガンド |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002119294A (ja) * | 1990-12-03 | 2002-04-23 | Genentech Inc | 改変された結合性を有する変異タンパク質の豊富化法 |
WO2009098450A2 (en) * | 2008-02-05 | 2009-08-13 | Medical Research Council | Methods and compositions |
JP2010528645A (ja) * | 2007-06-06 | 2010-08-26 | ドマンティス リミテッド | プロテアーゼ耐性ポリペプチドを選択する方法 |
-
2010
- 2010-02-04 JP JP2011548606A patent/JP2013518558A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002119294A (ja) * | 1990-12-03 | 2002-04-23 | Genentech Inc | 改変された結合性を有する変異タンパク質の豊富化法 |
JP2010528645A (ja) * | 2007-06-06 | 2010-08-26 | ドマンティス リミテッド | プロテアーゼ耐性ポリペプチドを選択する方法 |
WO2009098450A2 (en) * | 2008-02-05 | 2009-08-13 | Medical Research Council | Methods and compositions |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HEINIS C. ET AL., NATURE CHEMICAL BIOLOGY, vol. 5, no. 7, JPN6014020581, July 2009 (2009-07-01), pages 502 - 507, ISSN: 0002815599 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018502825A (ja) * | 2014-10-29 | 2018-02-01 | バイサイクル・セラピューティクス・リミテッド | Mt1−mmpに特異的な二環性ペプチドリガンド |
JP2021130672A (ja) * | 2014-10-29 | 2021-09-09 | バイスクルアールディー・リミテッド | Mt1−mmpに特異的な二環性ペプチドリガンド |
JP7116217B2 (ja) | 2014-10-29 | 2022-08-09 | バイスクルアールディー・リミテッド | Mt1-mmpに特異的な二環性ペプチドリガンド |
JP2019523214A (ja) * | 2016-05-04 | 2019-08-22 | バイスクルアールディー・リミテッド | Mt1−mmpに対して特異的な二環式ペプチド−毒素コンジュゲート |
WO2017213158A1 (ja) * | 2016-06-07 | 2017-12-14 | 株式会社カネカ | リボソームディスプレイ複合体およびその製造方法 |
JPWO2017213158A1 (ja) * | 2016-06-07 | 2019-05-09 | 株式会社カネカ | リボソームディスプレイ複合体およびその製造方法 |
US11248226B2 (en) | 2016-06-07 | 2022-02-15 | Kaneka Corporation | Ribosome display complex and production method therefor |
JP7093300B2 (ja) | 2016-06-07 | 2022-06-29 | 株式会社カネカ | リボソームディスプレイ複合体およびその製造方法 |
JP2022514618A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-14 | バイスクルテクス・リミテッド | Pd-l1に特異的な二環式ペプチドリガンド |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9644201B2 (en) | Structured peptide processing | |
DK2464727T3 (en) | PEPTIDE LIBRARIES | |
JP2013518807A (ja) | 多重特異性ペプチド | |
JP2013518558A (ja) | 構造化されたペプチドプロセシング | |
JP2015214568A (ja) | 多重特異性ペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20130422 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140523 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140821 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150313 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150713 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20150901 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20151002 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160908 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20161011 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20161110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161213 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170411 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170511 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170615 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170920 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171023 |