JPWO2017213158A1 - リボソームディスプレイ複合体およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、複雑な反応手順を経ることなく調製可能であり、且つ、リボソームの機能（特にポリペプチドライブラリ作製の為の機能）を損なうことなく提示ポリペプチドが修飾されたリボソーム複合体、および当該リボソーム複合体の調製方法を提供することである。本発明に係るリボソームディスプレイ複合体の製造方法は、リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いてｍＲＮＡ分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、当該ｍＲＮＡ分子および当該リボソームを含むリボソーム複合体を得る工程、および、上記未修飾ポリペプチド鎖に含まれる上記側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、上記未修飾ポリペプチド鎖を修飾する工程を含むことを特徴とする。
Description
本発明は、新規なリボソームディスプレイ複合体とその製造方法に関するものである。
近年、様々なアミノ酸配列のポリペプチドライブラリの中から、特定の疾患に対する治療薬や、標的分子に親和性の高い分子などを選択することが行われるようになっている。その理由としては、ポリペプチドは特異性や選択性が高いので、低分子化合物に比べて副作用などが少ないと考えられることによる。また、ランダムプライマーを用いたＰＣＲ技術により、特定部分のアミノ酸配列をランダム化したポリペプチドをコードするＤＮＡが容易に得られるため、低分子化合物のライブラリに比べ、多くのポリペプチドを含むライブラリを容易に調製できるという利点もある（非特許文献１〜３）。
一方で、抗体などのポリペプチドを機能性分子で化学的に修飾してその機能を拡張した医薬品の開発に注目が集まっている。例えば、非特許文献４と５には、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が抗がん剤に応用された例が記載されている。ポリペプチドと機能性分子が連結したこのような化合物は、ポリペプチドの特性と機能性分子の機能がハイブリッドし、それぞれの特徴を生かしたりそれぞれの欠点を補う分子として、創薬分野において注目される（非特許文献６〜１０）。
例えば、ポリペプチドは標的分子への特異性が高いので、低分子医薬品と比較して副作用などが低いと考えられる。一方で、ポリペプチドは生体内でプロテアーゼやペプチダーゼ等により分解されるので不安定である。そこで、非天然アミノ酸を導入したり、修飾試薬を使って環状化することにより、生体内での安定性が向上することがある。さらに、環状化により構造が安定化するため、標的化合物への親和性や選択性が向上したり、分解酵素に対する耐性や細胞膜透過性が発現することもある（非特許文献６〜１０）。
このように、ポリペプチドに、環状化のための修飾試薬や抗がん剤といった機能性分子が連結したポリペプチドライブラリを作製する技術が注目される。
このように、ポリペプチドに、環状化のための修飾試薬や抗がん剤といった機能性分子が連結したポリペプチドライブラリを作製する技術が注目される。
このような機能性分子とポリペプチドが連結した化合物のライブラリを作製する技術としては、提示するポリペプチド（表現型）とそれをコードする遺伝子（遺伝型）が１対１で対応付けされた複合体がある（非特許文献１）。
この方法としてファージディスプレイ法がしばしば用いられる。ファージディスプレイ法において、バクテリオファージ上にポリペプチドを提示させ、そのポリペプチドに対して修飾を施すことによりライブラリを作製する手法も知られている。このファージディスプレイ法によるライブラリは、比較的簡単な設備で安価に製造できる。作製されたライブラリは、有用なポリペプチドを単離するためのスクリーニングに用いることができる。しかし、ファージに提示したポリペプチドと機能性分子を特異的に連結する操作は難しく、また工程が多くて煩雑であるため数例しか報告がない（非特許文献６，７，１０）。
一方で、機能性分子が結合したポリペプチドライブラリとしては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系により特殊アミノ酸をポリペプチド鎖の特性の位置に取り込ませ、当該ペプチドを構成するアミノ酸残基と反応性官能基とを反応させて環化したものが知られている（非特許文献８，９）。また、ｍＲＮＡディスプレイ法において、ｍＲＮＡ−ペプチド複合体に修飾試薬を直接反応させ環状化する方法が報告されている（非特許文献９）。
このｉｎ ｖｉｒｔｏ翻訳系を用いたライブラリ作製方法は、ファージディスプレイ法と比較して多様性の観点で非常に優れている。このｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の方法としては、例えばリボソームディスプレイ法（ＲＤ法）、ｍＲＮＡディスプレイ法、ｃＤＮＡディスプレイ法などがある。このうち、リボソームディスプレイ法（ＲＤ法）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系とｍＲＮＡさえあれば、それらを混合するだけで、１０12種類以上のポリペプチドライブラリが数分で作製できる点で優れている。一方、ｍＲＮＡディスプレイ法とｃＤＮＡディスプレイ法は、ｍＲＮＡとピューロマイシンＤＮＡのアニール工程など、ライブラリ作製のための工程が多く煩雑である。
しかしＲＤ法において、ポリペプチドに機能性分子を連結させる方法の報告はない。その原因としては、ＲＤ法で用いられる表現型−遺伝型の複合体は、提示するペプチドと遺伝子を含む核酸がリボソームを介した非共有結合により形成されていることや、リボソーム自体の機能性分子連結反応に対する脆弱性が挙げられる。即ち、１）共有結合で遺伝型−表現型複合体をつくるｍＲＮＡディスプレイ法に比べて複合体が不安定であり、２）リボソームを形成するリボソーマルタンパク質に含まれるシステインやリジンなどに反応性があるために、機能性分子を連結させるとリボソーム自体の機能や複合体の機能が低下しやすくなることなどがＲＤ法で機能性分子を連結させた報告がない理由である。実際、例えば大腸菌の５５種類のリボソーマルタンパク質には合計で３６個のシステインと６８６個のリジンが存在する。
例えば、システインは、ポリペプチドの残基の１つとして、構造的・機能的に特に重要な役割を果たす。システイン残基のＳＨ基は、同ポリペプチド内および異なるポリペプチドのシステイン残基のＳＨ基とジスルフィド結合を形成する。このジスルフィド結合は、しばしばポリペプチドの高次構造形成に貢献する。ＳＨ基はジスルフィド結合形成のほかにも多様な反応の基質となりえるので、ポリペプチド鎖を人為的に修飾するにあたり、修飾部位としてよい候補となる。その反面、その反応性が高いがゆえに、特定のシステイン残基に対して特異的に修飾したい場合に、別の意図しない位置での反応が起こる可能性がある。これによりポリペプチドの高次構造が損なわれたりすることがしばしばある。リジン、ヒスチジンやトリプトファンも同様である。従って、システイン、リジン、ヒスチジン、トリプトファンが複数含まれるポリペプチド、リボソーム又はそれらを含むＲＤ複合体において、それらの機能を損なうことなく、目的のシステインを修飾する方法をデザインすることは容易なことではない。具体的には、遺伝子工学により意図しないシステインをリボソーマルタンパク質から除去する方法や、意図しないシステインが反応しないような予備的反応を含む複雑な反応工程手順が必要になる。このような工程をライブラリ作製工程に組み込むと、ＲＤ法の特徴である工程が少なくライブラリが作製できるというメリットが失われることになる。
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実際、本発明者らは、修飾試薬としての環化試薬（１，３−ジブロモ−２−プロパノン；ＤＢＰ）をリボソームに作用させた後に、ＲＤ複合体形成工程を行った場合、ＲＤ複合体の形成ができなくなることを実験的に確認している。
従って本発明の課題は、複雑な反応手順を経ることなく調製可能であり、且つ、リボソームの機能（特にポリペプチドライブラリ作製の為の機能）を損なうことなく提示ポリペプチドが修飾されたリボソーム複合体、および当該リボソーム複合体の調製方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、リボソームディスプレイ法により修飾されたポリペプチドライブラリを作製するに当たり、リボソームにはそのリボソーマルタンパク質内にシステインなど反応性側鎖官能基を有するアミノ酸残基を多数含むため、人工物で修飾する際にその機能を失うリスクが存在していたが、人工物による修飾のタイミングを適切にすれば、ＲＮＡとそこから翻訳されたポリペプチドとを結合するリボソームの接着機能については本来の機能を失うことなく維持することができ、リボソームディスプレイ複合体においてポリペプチドを簡便、容易に修飾できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
［１］ ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体を製造するための方法であって、
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される１以上の反応性アミノ酸残基を含み、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記ｍＲＮＡ分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、
上記リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いて上記ｍＲＮＡ分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、上記ｍＲＮＡ分子および上記リボソームを含むリボソーム複合体を得る工程、および、
上記未修飾ポリペプチド鎖に含まれる上記側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、上記未修飾ポリペプチド鎖を修飾する工程を含むことを特徴とする方法。
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される１以上の反応性アミノ酸残基を含み、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記ｍＲＮＡ分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、
上記リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いて上記ｍＲＮＡ分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、上記ｍＲＮＡ分子および上記リボソームを含むリボソーム複合体を得る工程、および、
上記未修飾ポリペプチド鎖に含まれる上記側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、上記未修飾ポリペプチド鎖を修飾する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］ 前記修飾試薬が、下記式（１）で表される化合物である上記［１］に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
（式中、Ａは、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基の側鎖と反応して結合を形成可能な基を表し、Ｂは連結基又は単結合を表し、Ｃは機能性基を表す。ａは１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ａが２以上の整数を表す場合、複数のＡは互いに同一であっても異なっていてもよい）
［３］ 前記Ａが、ハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、カルベン含有基、ジスルフィド結合含有基、或いはチオール基である上記［２］に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［４］ 前記連結基Ｂが、ヘテロ原子含有極性基、炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
前記ヘテロ原子含有極性基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−（式中、Ｒ1は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−（式中、Ｒ2は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−Ｎ＝Ｎ−、又は−ＳＯ2−であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基である上記［２］または［３］に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
前記ヘテロ原子含有極性基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−（式中、Ｒ1は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−（式中、Ｒ2は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−Ｎ＝Ｎ−、又は−ＳＯ2−であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基である上記［２］または［３］に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［５］ 前記連結基Ｂが、−Ｂ１−単位、−Ｂ２−単位、−Ｂ２−Ｂ１−単位、又は−Ｂ２−Ｂ１−Ｂ３−単位を有し、
Ｂ１が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
Ｂ２及びＢ３がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
Ｂ１又はＢ２が前記Ａと結合しており、
ヘテロ原子含有極性基及び置換基が前記と同じ意味である上記［４］に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
Ｂ１が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
Ｂ２及びＢ３がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
Ｂ１又はＢ２が前記Ａと結合しており、
ヘテロ原子含有極性基及び置換基が前記と同じ意味である上記［４］に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［６］ 前記修飾試薬が、下記式
（式中、Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３は前記に同じ。ｎは１以上の整数を表す。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３のいずれか一つ以上には、前記Ｃの１つ以上が結合していてもよい）
のいずれかで表される上記［５］に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
のいずれかで表される上記［５］に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［７］ 前記Ａがハロゲン化アルキルであるとき、このハロゲノ基が結合する炭素原子が、カルボニル基のα位の炭素原子、又は芳香族環に直結する炭素原子である上記［２］〜［６］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［８］ 前記ポリペプチド鎖が、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基からなる群より選択される２以上の反応性アミノ酸残基を含み、
前記式（１）の修飾試薬でａが２以上であり、
未修飾ポリペプチド鎖に含まれる側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させる前記工程で、ポリペプチド鎖と修飾試薬の間に環を形成する上記［２］〜［７］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
前記式（１）の修飾試薬でａが２以上であり、
未修飾ポリペプチド鎖に含まれる側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させる前記工程で、ポリペプチド鎖と修飾試薬の間に環を形成する上記［２］〜［７］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［９］ 前記ポリペプチド鎖が１００〜５０００アミノ酸残基からなる上記［１］〜［８］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［１０］ 前記反応性アミノ酸残基を、前記ポリペプチド鎖のＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置に有する上記［１］〜［９］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［１１］ 前記ポリペプチド鎖がＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置に１〜３０アミノ酸残基のランダム配列を含む上記［１］〜［１０］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［１２］ 前記リボソームが、大腸菌由来のリボソームである上記［１］〜［１１］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
［１３］ ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含み、
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される１以上の反応性アミノ酸残基を含み、且つ、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記ｍＲＮＡ分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであることを特徴とするリボソームディスプレイ複合体。
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される１以上の反応性アミノ酸残基を含み、且つ、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記ｍＲＮＡ分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであることを特徴とするリボソームディスプレイ複合体。
［１４］ 前記側鎖反応性官能基の修飾構造が、下記式（２）で表される化学構造である上記［１３］に記載のリボソームディスプレイ複合体。
（式中、Ａｘは、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基又はトリプトファン残基の側鎖と反応して形成される結合基を表し、Ｂは連結基又は単結合を表し、Ｃは機能性基を表す。ａは１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ａが２以上の整数を表す場合、複数のＡｘは互いに同一であっても異なっていてもよい）
［１５］ 前記Ａｘが、ハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、カルベン含有基、ジスルフィド結合含有基、或いはチオール基と、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基又はトリプトファン残基の側鎖とが形成する化学結合である上記［１４］に記載のリボソームディスプレイ複合体。
［１６］ 前記連結基Ｂが、ヘテロ原子含有極性基、炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
前記ヘテロ原子含有極性基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−（式中、Ｒ1は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−（式中、Ｒ2は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−Ｎ＝Ｎ−、又は−ＳＯ2−であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基である上記［１５］に記載のリボソームディスプレイ複合体。
前記ヘテロ原子含有極性基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−（式中、Ｒ1は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−（式中、Ｒ2は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−Ｎ＝Ｎ−、又は−ＳＯ2−であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基である上記［１５］に記載のリボソームディスプレイ複合体。
［１７］ 前記連結基Ｂが、−Ｂ１−単位、−Ｂ２−単位、−Ｂ２−Ｂ１−単位、又は−Ｂ２−Ｂ１−Ｂ３−単位を有し、
Ｂ１が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
Ｂ２及びＢ３がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
Ｂ１又はＢ２が前記Ａｘと結合しており、
ヘテロ原子含有極性基及び置換基が前記と同じ意味である上記［１６］に記載のリボソームディスプレイ複合体。
Ｂ１が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
Ｂ２及びＢ３がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
Ｂ１又はＢ２が前記Ａｘと結合しており、
ヘテロ原子含有極性基及び置換基が前記と同じ意味である上記［１６］に記載のリボソームディスプレイ複合体。
［１８］ 前記修飾構造が、下記式
（式中、Ａｘ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３は前記に同じ。ｎは１以上の整数を表す。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３のいずれか一つ以上には、前記Ｃの１つ以上が結合していてもよい）
で表される上記［１７］に記載のリボソームディスプレイ複合体。
で表される上記［１７］に記載のリボソームディスプレイ複合体。
［１９］ 前記Ａｘがハロゲン化アルキルと、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基の側鎖とが形成する化学結合であるとき、このハロゲノ基が結合する炭素原子が、カルボニル基のα位の炭素原子、又は芳香族環に直結する炭素原子である上記［１４］〜［１８］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
［２０］ 前記ポリペプチド鎖が、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、およびトリプトファン残基からなる群より選択される２以上の反応性アミノ酸残基を含み、
前記式（２）の修飾構造でａが２以上であり、
ポリペプチド鎖と式（２）の修飾構造とで環が形成されている上記［１４］〜［１９］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
前記式（２）の修飾構造でａが２以上であり、
ポリペプチド鎖と式（２）の修飾構造とで環が形成されている上記［１４］〜［１９］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
［２１］ 前記ポリペプチド鎖が１００〜５０００アミノ酸残基からなる上記［１３］〜［２０］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
［２２］ 前記反応性アミノ酸残基を、前記ポリペプチド鎖のＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置に有する上記［１３］〜［２１］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
［２３］ 前記ポリペプチド鎖がＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置に１〜３０アミノ酸残基のランダム配列を含む上記［１３］〜［２２］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
［２４］ 前記リボソームが、大腸菌由来のリボソームである上記［１３］〜［２３］のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
本発明によれば、提示ポリペプチドのシステイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基またはトリプトファン残基を機能性分子により修飾したリボソーム複合体を極めて簡便な工程により提供することができる。リボソーム複合体はその構成因子であるリボソーマルタンパク質中にシステイン残基など反応性側鎖官能基を有するアミノ酸残基を、提示ポリペプチドに比べてはるかに多数有することを考えると、非常に驚くべき効果である。つまり、リボソームは５５個のリボソーマルタンパク質と３本のＲＮＡにより構成されており、あるリボソームには、合計で３６個のシステイン、６８６個のリジン、１５１個のヒスチジンが含まれる。それにも関わらず、ポリペプチドとｍＲＮＡの接着機能を阻害することなく（すなわちＲＤ複合体を維持したまま）、極めて簡便な工程で提示ポリペプチドを化学修飾できるという本発明の効果は、予想外であり且つ極めて有用である。
以下、先ず、本発明に係るリボソームディスプレイ複合体の製造方法につき説明する。
（１） リボソームディスプレイ複合体の調製工程
本工程では、リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いてｍＲＮＡ分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含むリボソーム複合体を得る。
本工程では、リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いてｍＲＮＡ分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含むリボソーム複合体を得る。
リボソームを利用した無細胞ペプチドの合成系は、細胞内で行われるＲＮＡ情報に基づくポリペプチドの合成に必要な化合物を用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡからポリペプチドを合成するものである。具体的には、開始因子、伸張因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素など、ｍＲＮＡの翻訳やエネルギー再生などに必要なタンパク質、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＮＴＰ、緩衝液などを含む反応系にｍＲＮＡ分子を添加し、添加したｍＲＮＡに応じたポリペプチドを合成させる。無細胞ペプチド合成のためのキットは市販されているため、ｍＲＮＡ分子以外は市販キットを利用すればよい。
本工程で調製するリボソームディスプレイ複合体は、ｍＲＮＡ、その翻訳物であるポリペプチド鎖、およびリボソームを含む。以下、リボソームディスプレイを「ＲＤ」と略記する場合がある。
本発明に係るＲＤ複合体に含まれるポリペプチド鎖は、次工程で修飾に利用するシステイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、およびトリプトファン残基からなる群より選択される１以上の反応性アミノ酸残基を含む。反応性アミノ酸残基の数としては、ポリペプチド鎖を環状化することにより安定性などがより一層向上することがあるため、２以上が好ましい。一方、反応点が多いとＲＤ複合体に結合する修飾試薬の数や位置が安定せず、アミノ酸配列に由来するポリペプチド鎖の特性が比較し難くなる場合があるので、上記反応性アミノ酸残基の数としては１０以下が好ましい。
上記反応性アミノ酸残基としては、システイン残基および／またはリジン残基が好ましい。また、例えばシステイン残基がジスルフィド結合によりポリペプチドの高次構造の安定化に関与しているような場合には、別途、上記反応性アミノ酸残基を導入することが好ましい。
反応性アミノ酸残基の位置は適宜選択すればよく、例えば、リボソームの出口トンネル（exit tunnel）から外に出ている部分であり、具体的にはＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置およびＣ末端から３０番目の位置を含む）とすることが好ましい。本発明ではＲＤ複合体の状態でポリペプチド鎖を修飾するので、反応性アミノ酸残基が上記位置にあれば、修飾反応がリボソームにより立体的に阻害され難くなり得る。上記のＣ末端からの位置としては、５０番目が好ましく、１００番目がより好ましい。また反応性アミノ酸残基の位置をＮ末端側から数えた場合、その位置は、ポリペプチドの鎖長に応じて適宜設定できるが、例えば、Ｎ末端から２〜１０００番目の位置であり、好ましくはＮ末端から２〜１００番目の位置であり、より好ましくはＮ末端から２〜５０番目の位置である。
また、ポリペプチドライブラリとして有用であるように、ポリペプチド鎖は、特定位置にランダム配列を含むものが好ましい。かかるランダム配列の中から、所定の目的に応じた有用なアミノ酸配列を特定し得る。ランダム配列の位置も適宜選択すればよいが、例えば、反応性アミノ酸残基の位置と同様に、Ｎ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置およびＣ末端から３０番目の位置を含む）とすることが好ましい。即ち、反応性アミノ酸残基は、ランダム配列内に含まれることが好ましい。従ってランダム配列の好ましい位置は、反応性アミノ酸残基の好ましい位置と同じ範囲から設定できる。ランダム配列のアミノ酸数も適宜調整すればよいが、例えば、１以上、３０以下とすることができる。ランダム配列数の上限は特に制限されないが、１０以下が好ましい。また、このようなランダム配列は、ポリペプチド鎖中、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。１つのランダム配列が長くなるほど、またランダム配列の数が多くなるほど、ポリペプチドライブラリの多様性を高めることができる。
その他、ポリペプチド鎖は、目的に応じたアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）配列やポリＨｉｓ配列など、ポリペプチド鎖の精製のための配列や、プロテアーゼなどにより選択的に切断される配列、スペーサー配列などを挙げることができる。
ｍＲＮＡは、少なくとも上記ポリペプチド鎖をコードする塩基配列を含む。その他、翻訳などに必要な配列を有していてもよい。当該ｍＲＮＡは、同じＲＤ複合体中のポリペプチドをコードするものであることから、ライブラリの中から特定のＲＤ複合体が選択された場合、当該ｍＲＮＡの塩基配列を解析することにより、有用なポリペプチドのアミノ酸配列を間接的に特定することが可能になる。
ポリペプチド鎖のアミノ酸残基数は特に制限されないが、例えば、１００以上、５０００以下とすることができる。当該アミノ酸残基数としては、１５０以上がより好ましく、２００以上がよりさらに好ましく、また、８００以下または６００以下がより好ましく、５００以下がよりさらに好ましい。
リボソームは、生体から精製されたものを用いることができる。例えば、大腸菌由来のリボソームを用いればよい。
細胞内におけるポリペプチド合成では、ポリペプチドが合成されると解離因子がｍＲＮＡの終止コドンに結合し、ポリペプチド鎖が遊離し、ｍＲＮＡもリボソームから解離する。しかし、本工程ではポリペプチド鎖、ｍＲＮＡおよびリボソームを含むＲＤ複合体を調製することを目的とするので、ポリペプチド鎖が遊離しない処置をする必要がある。かかる処置としては、公知のものを用いることができる。例えば、ｍＲＮＡから終止コドンを除いたり、ｍＲＮＡの３’末端にアレスト配列と呼ばれる翻訳伸張停止配列を配置したり、無細胞ペプチド合成系に解離因子やリボソーム再生因子を添加しないことが挙げられる。
ＲＤ複合体の合成後、ＲＤ複合体の精製方法としては常法を用いればよい。例えば、ポリペプチド鎖にＦＬＡＧ（登録商標）配列やポリＨｉｓ配列が存在する場合には、これら配列に応じた公知の精製方法を適用することができる。
（２） ポリペプチド鎖の修飾工程
以上の様にして未修飾ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含むリボソーム複合体を製造した後、本工程では、その未修飾ポリペプチド鎖に含まれる側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、未修飾ポリペプチド鎖を修飾する。未修飾ポリペプチド鎖を含むリボソーム複合体を製造してから修飾試薬と反応させると、ＲＤ複合体が維持されたまま（すなわちリボソームにおけるポリペプチドとｍＲＮＡの接着機能を阻害することなく）、極めて簡便な工程でポリペプチド鎖を化学修飾できる。
以上の様にして未修飾ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含むリボソーム複合体を製造した後、本工程では、その未修飾ポリペプチド鎖に含まれる側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、未修飾ポリペプチド鎖を修飾する。未修飾ポリペプチド鎖を含むリボソーム複合体を製造してから修飾試薬と反応させると、ＲＤ複合体が維持されたまま（すなわちリボソームにおけるポリペプチドとｍＲＮＡの接着機能を阻害することなく）、極めて簡便な工程でポリペプチド鎖を化学修飾できる。
なお、リボソームはｒＲＮＡとタンパク質との複合体である巨大分子であるため、ＲＤ複合体に含まれる提示ポリペプチドに比べて多数の反応性アミノ酸残基を含む。しかし、ＲＤ複合体を作製した後に修飾試薬を作用させた場合でも、ＲＤ複合体に含まれる提示ポリペプチド鎖を修飾することが可能であり、かつＲＤ複合体もその維持が可能である。
未修飾ポリペプチド鎖の修飾に用いられる修飾試薬としては、例えば、下記式（１）で表される化合物を用いることができる。
上記式中、Ａは、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基の側鎖と反応して結合を形成可能な基を表す。即ち、システイン残基のチオール基、リジン残基の側鎖アミノ基（−ＮＨ2）、又はヒスチジン残基およびリプトファン残基の側鎖アミノ基（＞ＮＨ）と反応して結合を形成可能な基を表す。
具体的には、Ａとしては、ハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、カルベン含有基、ジスルフィド結合含有基、或いはチオール基を挙げることができる。
ハロゲン化アルキル基におけるハロゲノ基としては、クロロ基、ブロモ基またはヨード基を挙げることができる。また、ハロゲン化アルキル基におけるアルキレン基としては、直鎖アルキレン基でも分岐鎖アルキレン基であってもよく、例えば、Ｃ1-20アルキレン基を挙げることができ、Ｃ1-10アルキレン基が好ましく、Ｃ1-6アルキレン基またはＣ1-4アルキレン基がより好ましく、Ｃ1-2アルキレン基がよりさらに好ましい。また、ハロゲン化アルキル基としては、ハロゲノ基が結合している炭素原子が、Ｂに含まれるカルボニル基または芳香族環に直結しているものが好ましい。ハロゲン化アルキル基は、チオール基と結合可能である他、アミノ基とも結合し得る。
活性化カルボニル基には、活性化エステル基、ホルミル基などが含まれる。活性化エステル基としては、例えば、スクシンイミド基などのイミドエステル基、４−ニトロフェノールエステル基、ＨＯＢｔエステル基、ＨＯＡｔエステル基、Ｏｘｙｍａエステル基などを挙げることができる。活性化カルボニル基は、例えばシステイン残基の側鎖チオールと結合可能である他、アミノ基とも結合し得る。またホルミル基は、例えばリジンの側鎖アミノ基に還元的アミノ化反応により結合可能である。
不飽和炭化水素基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を有する不飽和炭化水素基をいい、ビニル基、プロパルギル基などが含まれ、ビニルカルボニル基、プロパルギルカルボニル基、ビニルスルホニル基などが好ましい。不飽和炭化水素基は、例えば、マイケル付加や求核置換反応によりアミノ基やチオール基と結合させることができる。
スルホニル含有基としては、例えば、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルホン酸エステル基（例えば、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基など）などを挙げることができ、いわゆる脱離基としてチオール基やアミノ基と反応可能である。アルキルスルホニル基としては、メタンスルホニル基、クロロメタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基などを挙げることができ、アリールスルホニル基としては、例えば、ベンゼンスルホニル基、トルエンスルホニル基などを挙げることができる。また、スルホン酸エステル基としては、例えば、メタンスルホニルオキシ基、クロロメタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、ベンゼンスルホニルオキシ基、トルエンスルホニルオキシ基を挙げることができる。
カルベン発生基としては、例えば、ジアゾ含有基、ジアジリン構造含有基などが挙げられ、好ましくはカルボニルに隣接する炭素原子にジアゾ基が結合している基が挙げられる。ジアゾ基が脱離することで、カルベンが発生し、チオールと結合することができる。またカルベン含有基としては、種々のカルベン発生基からカルベンが生じた後の基が挙げられる。
ジスルフィド結合含有基とチオール基は、システイン残基の側鎖チオール基とジスルフィド結合を形成することができる。
エポキシ基、イソシアネート基およびチオイソシアネート基は、チオール基とアミノ基の両方と反応可能である。
Ａの数、即ちａとしては２以上の整数が好ましい。Ａが２以上であり且つ側鎖反応性官能基が２以上あれば、ポリペプチド鎖を環化することが可能になる。環化されたポリペプチド鎖は、安定性などがより一層向上する可能性がある。
上記式中、Ｂは連結基又は単結合を表す。連結基であるＢとしては、ヘテロ原子含有極性基、脂肪族炭化水素基および芳香族環を挙げることができる。
ヘテロ原子含有極性基としては、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−（式中、Ｒ1は水素原子、炭化水素基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、又は連結基末端の結合手を表す。なおＲが結合手の場合、連結基の価数は３になる（以下、同様））、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−（式中、Ｒ2は水素原子、炭化水素基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、又は連結基末端の結合手を表す）、−Ｃ（＝Ｎ−Ｒ3）−（式中、Ｒ3は、置換基を有していてもよい鎖状または環状の脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族環基またはヘテロ原子含有基、および、何らかの機能を付加するための機能性基からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を含む基、水素原子、または連結基末端の結合手を表す）、−Ｎ＝Ｎ−、および−ＳＯ2−を挙げることができる。
脂肪族炭化水素基としては、直鎖アルキレン基、分岐鎖アルキレン基および環状鎖アルキレン基のいずれであってもよく、例えば、Ｃ1-20アルキレン基を挙げることができ、Ｃ1-10アルキレン基が好ましく、Ｃ1-6アルキレン基またはＣ1-4アルキレン基がより好ましく、Ｃ2-4アルキレン基がよりさらに好ましい。当該脂肪族炭化水素基の炭素原子間または末端には、上記ヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく、また、置換基を有していてもよい。置換基としては、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基を挙げることができる。アリール基としては、Ｃ6-10アリール基が好ましく、フェニル基またはナフチル基がより好ましく、フェニル基が好ましい。置換基数は、置換可能である限り特に制限されないが、例えば１以上、４以下とすることができ、３以下または２以下が好ましく、１が好ましい。置換基数が２以上である場合、それら置換基は互いに同一であっても異なっていてもよい。
芳香族環基としては、フェニル基、インデニル基、ナフチル基、ビフェニル基などのＣ6-10アリール基が好ましく、フェニル基またはナフチル基がより好ましく、フェニル基が好ましい。芳香族環基は置換基を有していてもよく、置換基としては、ハロゲノ基、アルキル基、好ましくはＣ1-6アルキル基、アラルキル基、好ましくはベンジル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、好ましくは（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、ヒドロキシアルキル基、好ましくはヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル基、又はカルボキシアルキル基、好ましくはカルボキシ−Ｃ1-6アルキル基を挙げることができる。置換基数は、置換可能である限り特に制限されないが、例えば１以上、４以下とすることができ、３以下または２以下が好ましく、１が好ましい。置換基数が２以上である場合、それら置換基は互いに同一であっても異なっていてもよい。
前記連結基Ｂは、好ましくは−Ｂ１−単位、−Ｂ２−単位、−Ｂ２−Ｂ１−単位、又は−Ｂ２−Ｂ１−Ｂ３−単位を有する。Ｂ１は、炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、Ｂ２及びＢ３は、それぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、Ｂ１又はＢ２は前記Ａと結合するものである。ここで、ヘテロ原子含有極性基及び置換基は、前記と同じ意味を有する。
ヘテロ原子含有基としては、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ3−（式中、Ｒ3は水素原子、炭化水素基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、又は連結基末端の結合手を表す。なおＲが結合手の場合、連結基の価数は３になる（以下、同様））、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ4−（式中、Ｒ4は水素原子、炭化水素基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、又は連結基末端の結合手を表す）、−Ｎ＝Ｎ−、および−ＳＯ2−を挙げることができる。
上記式中、Ｃは、ポリペプチドに何らかの機能を付加するための機能性基を表す。当該機能性基は、使用目的などに応じて適宜選択すればよく、特に制限されないが、例えば、ポリペプチドを環状化するリンカー化合物の他、蛍光物質などの発光物質、色素、放射性物質、薬剤、毒素、核酸、アミノ酸、ペプチド、糖類、脂質、および各種ポリマー等、並びにこれらの組合せが挙げられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、およびシアニン類の蛍光色素を挙げることができる。
具体的な修飾試薬としては、例えば、下記式で表されるいずれかのものを挙げることができる。
（式中、Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３は前記に同じ。ｎは１以上の整数を表す。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３のいずれか一つ以上には、前記Ｃの１つ以上が結合していてもよい）
なお前記式（１ａ）〜（１ｆ）で表される化合物は、機能性基Ｃ（蛍光色素、標識単位のいずれかを含む基）を有し、機能性基Ｃは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３のいずれかに結合している。また、水溶性向上のため、スルホン酸基（−ＳＯ2−ＯＨ）やスルホン酸塩基（−ＳＯ2−Ｏ-Ｍ+）などの水溶性置換基を有していてもよい。Ｍ+としては、ナトリウムイオンやカリウムイオンなどのアルカリ金属イオンを挙げることができる。
なお前記式（１ａ）〜（１ｆ）で表される化合物は、機能性基Ｃ（蛍光色素、標識単位のいずれかを含む基）を有し、機能性基Ｃは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３のいずれかに結合している。また、水溶性向上のため、スルホン酸基（−ＳＯ2−ＯＨ）やスルホン酸塩基（−ＳＯ2−Ｏ-Ｍ+）などの水溶性置換基を有していてもよい。Ｍ+としては、ナトリウムイオンやカリウムイオンなどのアルカリ金属イオンを挙げることができる。
式（１ａ）の具体例には、例えば、Ａがハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基（特に活性化エステル基）、又はエポキシ基であり、Ｂ１が脂肪族炭化水素基、又は芳香族環であり、ｎが２又は３である化合物が含まれ、特に下記式で表される化合物が含まれる。
式（１ｂ）の具体例には、Ａがハロゲン化アルキル基であり、Ｂ２が酸素原子含有極性基（特に−ＣＯ−）、又は窒素原子含有極性基（特に−Ｃ（＝Ｎ−Ｒ5）−（式中、Ｒ5は、置換基を有していてもよい鎖状または環状の脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族環基またはヘテロ原子含有基、および、何らかの機能を付加するための機能性基からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を含む基、水素原子、または連結基末端の結合手を表す）であり、ｎが２である化合物が含まれ、特に下記式で表される化合物が含まれる。
式（１ｃ）の具体例には、Ａがハロゲン化アルキル基、又は活性化カルボニル基（特に活性化エステル基）であり、Ｂ１が脂肪族炭化水素基、炭素原子間に酸素原子が挿入されている脂肪族炭化水素基、又は芳香族環であり、Ｂ２が酸素原子、窒素原子などを含有する極性基（特に−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−）であり、ｎが１、２又は３である化合物が含まれ、特に下記式で表される化合物が含まれる。
式（１ｄ）の具体例には、Ａがハロゲン化アルキル基であり、Ｂ１が脂肪族炭化水素基であり、Ｂ２が酸素原子及び窒素原子を含有する極性基（特に−ＣＯＮＨ−）であり、ｎが３である化合物が含まれ、特に下記式で表される化合物が含まれる。
式（１ｅ）の具体例には、Ａがハロゲン化アルキル基であり、Ｂ１が芳香族環であり、Ｂ２、Ｂ３が酸素原子、窒素原子などを含有する極性基（特に−ＣＯＯ−、−Ｎ＝Ｎ−など）であり、ｎが２である化合物が含まれ、特に下記式であらわされる化合物が含まれる。
ＲＤ複合体中のポリペプチド鎖を修飾するための条件は、修飾すべき側鎖反応性官能基の種類と使用する修飾試薬に応じて適宜設定することができる。例えば、システイン残基の側鎖チオール基を修飾すべき場合には、還元剤によりジスルフィド結合を切断してチオール基とした上で、修飾試薬を反応させればよい。還元剤としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンナトリウム塩、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノールなどが挙げられる。
また、側鎖アミノ基に修飾試薬のハロゲン化アルキル基やエポキシ基などを反応させる場合には、塩基を添加してもよい。塩基としては、例えば、炭酸水素ナトリウムなどの炭酸水素塩；炭酸ナトリウムなどの炭酸塩；水酸化ナトリウムなどの金属水酸化物；ピリジンやトリエチルアミンなどの有機塩基などが例示できる。
修飾試薬を反応させる時の反応溶媒としては、通常、水が使用される。また反応温度は、例えば、０〜３０℃程度、好ましくは１〜２０℃程度、より好ましくは１〜１０℃程度である。
修飾試薬の反応時のｐＨは、使用する修飾試薬などに応じて適宜調整すればよく特に制限されないが、例えば、４．０〜１０．０程度の範囲から選択でき、好ましくは５．０〜９．０程度、より好ましくは６．０〜８．０程度である。より好ましい範囲は修飾試薬に応じて異なるが、ポリペプチド鎖当たりの修飾試薬導入数が２以上になる事を抑制する観点から、ｐＨを７．０〜７．５に調整してもよい。
修飾試薬の量は、試薬の種類に応じて適宜設定でき、例えば、未修飾ポリペプチド鎖を含むリボソーム複合体１モルに対して、例えば、１，０００モル以上、好ましくは１０，０００モル以上であり、より好ましくは６０，０００モル以上であり、よりさらに好ましくは１００，０００モル以上である。その上限は特に限定されないが、例えば、１００，０００，０００モル以下、好ましくは５０，０００，０００モル以下、より好ましくは２０，０００，０００モル以下、よりさらに好ましくは１０，０００，０００モル以下である。
ポリペプチド鎖を修飾した後、ＲＤ複合体は常法により精製することができる。例えば、ポリペプチド鎖にＦＬＡＧ（登録商標）配列やポリＨｉｓ配列などのタグ配列が存在する場合には、これら配列に応じた公知の精製方法を適用することができる。なお、タグ配列に特異的な抗体を結合させた担体とＲＤ複合体とは、修飾試薬を反応させる前からアフィニティ結合させていてもよい。このアフィニティ結合は、修飾子薬の反応の間に切断されず、修飾試薬の反応後、このアフィニティ結合を利用してＲＤ複合体を精製してもよい。
上記本発明方法で製造されるＲＤ複合体は、ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含み、当該ポリペプチド鎖中のシステイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される１以上の反応性アミノ酸残基が使用した修飾試薬により修飾されており、当該ｍＲＮＡ分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものである。このＲＤ複合体は、前記式（１）、（１ａ）〜（１ｅ）において、基Ａがその反応結果である基Ａｘ（Ａｘは、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基の側鎖と反応して形成される結合基）に置き換わった構造を有している点で、非修飾のＲＤ複合体と区別される。
本願は、２０１６年６月７日に出願された日本国特許出願第２０１６−１１３９３５号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１６年６月７日に出願された日本国特許出願第２０１６−１１３９３５号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
実施例１
（１）ＲＮＡライブラリの作製
本（１）項では、ＮＮＫ法を用い、（ＮＮＫ）10［式中、ＮはＡ、Ｕ、ＧまたはＣを示し、ＫはＧまたはＵを示し、ＮＮＫはすべてのコドンに対応する］の配列を含む配列を有するＲＮＡを１０12以上含むＲＮＡライブラリを作製する方法について説明する。
（１）ＲＮＡライブラリの作製
本（１）項では、ＮＮＫ法を用い、（ＮＮＫ）10［式中、ＮはＡ、Ｕ、ＧまたはＣを示し、ＫはＧまたはＵを示し、ＮＮＫはすべてのコドンに対応する］の配列を含む配列を有するＲＮＡを１０12以上含むＲＮＡライブラリを作製する方法について説明する。
このＲＮＡライブラリ作製の為に、図１の構造を有する鋳型ＤＮＡ（塩基配列：配列番号１，アミノ酸配列：配列番号２）を用いた。具体的には、表１に示す組成を有する反応液を用い、表２のＰＣＲサイクルでプラスミドを鋳型ＤＮＡとして５’フラグメントを調製した。表１中、５ＦＦｎｅｗ＿１３０８１６はフォワードプライマーであり、Ｍａ３ｆｒａｇ＿Ｒ０５０２はリバースプライマーである。
次に、表３に示す組成を有する反応液を用い、表４のＰＣＲサイクルで鋳型ＤＮＡの３’フラグメントを調製した。表３中、Ｍａ１０ＮＮＫ＿Ｆ０５０２はフォワードプライマーであり、３Ｆ−Ｒはリバースプライマーである。
次に、表５に示す組成を有する反応液を用い、表６のＰＣＲサイクルでｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを行い、上記５’フラグメントと３’フラグメントを連結し、全長を増幅して鋳型ＤＮＡを得た。なお、表５中、Ｘ〜Ｚは、１×１０12の５’フラグメントと３’フラグメントを用い、反応液にＨ2Ｏを加えて総量を６０μＬに調整したことを示す。
得られた上記鋳型ＤＮＡを鋳型とし、表７に示す組成を有する反応液を用い、３７℃で５時間反応させることにより、配列番号３の塩基配列を有する１０12以上のｍＲＮＡを含むＲＮＡライブラリを得た。このライブラリに含まれるｍＲＮＡは、図１に示す様に５’側から順にＦＬＡＧ（登録商標）サイト、Ｈｉｓ６サイト、ランダム配列、ＴＥＶプロテアーゼサイト、スペーサー配列を有しており、終止コドンを有さない。
（２）リボソームディスプレイ複合体ライブラリの作製
再構成型無細胞タンパク質合成キット（ジーンフロンティア社製「ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ（登録商標）」）を用い、上記ＲＮＡライブラリからリボソームディスプレイ（ＲＤ）複合体を調製した。別途、ストレプトアビジン−磁性粒子（「ＮａｎｏＬｉｎｋTM Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ」Ｓｏｌｕｌｉｎｋ社製）５μＬを、１５０μＬに希釈した。上記ＲＤ複合体反応液と、抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２０μＬ）を混合し、４℃で６０分間攪拌した。ペプチド部分にＦＬＡＧ配列を有するＲＤ複合体が選択的に結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体結合アガロースビーズを回収した。
再構成型無細胞タンパク質合成キット（ジーンフロンティア社製「ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ（登録商標）」）を用い、上記ＲＮＡライブラリからリボソームディスプレイ（ＲＤ）複合体を調製した。別途、ストレプトアビジン−磁性粒子（「ＮａｎｏＬｉｎｋTM Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ」Ｓｏｌｕｌｉｎｋ社製）５μＬを、１５０μＬに希釈した。上記ＲＤ複合体反応液と、抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２０μＬ）を混合し、４℃で６０分間攪拌した。ペプチド部分にＦＬＡＧ配列を有するＲＤ複合体が選択的に結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体結合アガロースビーズを回収した。
（３）ペプチドの環化反応
上記で回収したアガロースビーズを８０μＬに希釈した後、還元剤として１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（４μＬ）（終濃度０．５ｍＭ）と、修飾試薬として４０ｍＭ １，３−ジブロモ−２−プロパノン（４μＬ）（終濃度２ｍＭ）を添加し、４℃で３時間環化反応させた。なお、このとき還元剤の添加は必須ではない。環化反応後、ＦＬＡＧペプチドを添加することにより、ＲＤ複合体をアガロースビーズから分離した。
上記で回収したアガロースビーズを８０μＬに希釈した後、還元剤として１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（４μＬ）（終濃度０．５ｍＭ）と、修飾試薬として４０ｍＭ １，３−ジブロモ−２−プロパノン（４μＬ）（終濃度２ｍＭ）を添加し、４℃で３時間環化反応させた。なお、このとき還元剤の添加は必須ではない。環化反応後、ＦＬＡＧペプチドを添加することにより、ＲＤ複合体をアガロースビーズから分離した。
（４）ＨＳＰ９０親和性ペプチドの選択
別途、上記ストレプトアビジン−磁性粒子希釈液（５μＬ）に、ヒートショックタンパク質であるＨＳＰ９０にビオチンを結合させたものをモル比が１：１となるように混合し、４℃で攪拌することで、磁性粒子にＨＳＰ９０を結合させた。また、比較のために、ＨＳＰ９０を結合させない以外は同様にして磁性粒子懸濁液を調製した。
別途、上記ストレプトアビジン−磁性粒子希釈液（５μＬ）に、ヒートショックタンパク質であるＨＳＰ９０にビオチンを結合させたものをモル比が１：１となるように混合し、４℃で攪拌することで、磁性粒子にＨＳＰ９０を結合させた。また、比較のために、ＨＳＰ９０を結合させない以外は同様にして磁性粒子懸濁液を調製した。
上記（３）で得たペプチド環化ＲＤ複合体溶液と磁性粒子懸濁液を混合し、４℃で１時間攪拌した。磁気スタンドを用いて磁性粒子を回収し、０．０５ＭのＥＤＴＡを加えることにより磁性粒子上のＨＳＰ９０に結合しているＲＤ複合体からＲＮＡを解離させた。磁気スタンドを用いて磁性粒子を除去した後、ＲＮＡ濃縮・精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製「ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ」）を用いてＲＮＡを精製した。次いで、表８に示す組成で６５℃にて５分間反応させた後、当該反応液につき、表９に示す組成で５０℃にて１時間、さらに７０℃で１５分間反応させることにより逆転写した。
上記逆転写反応で得られたｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲに付して、ランダム配列を含む配列を増幅した。具体的には、表１０に示す組成の反応液を用い、表１１のＰＣＲサイクルでＰＣＲを行った。
別途、上記（１）において、ＰＣＲサイクル中６８℃での加熱時間を１５秒間に変更した以外は同様にして５’フラグメント（配列番号６）を調製し、また、フォワードプライマーとして３ｆｒａｇＦ＿１４０４０７を用い且つＰＣＲサイクル中６８℃での加熱時間を２５秒間に変更した以外は同様にして３’フラグメント（配列番号７）を調製した。次いで、得られた５’フラグメントと３’フラグメントに加えて上記のランダム配列を含むｃＤＮＡ溶液を用い、且つポリメラーゼの使用量を０．６μＬに変更した以外は同様にして、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲにより各フラグメントを連結し、得られたＤＮＡを増幅させた。
得られたＤＮＡを用い、前記（１）と同様にしてｍＲＮＡを転写し、前記（２）「リボソームディスプレイ複合体ライブラリの作製」工程に戻し、以下、上記と同様にしてＨＳＰ９０に親和性を有するＲＤ複合体を回収した。ＨＳＰ９０に結合するＲＤ複合体に含まれるｍＲＮＡ量が増加しなくなることを確認できるまで、以上の操作を繰り返した。以下、１回の繰り返しを「ラウンド」と称する。ラウンド１〜３では、ＲＤ複合体と使用するＨＳＰ９０のモル比をＲＤ複合体：ＨＳＰ９０＝３：１に調整し、ラウンド４〜５では当該モル比を１０：１に調整した。結果を、ＨＳＰ９０と接触させる前のｍＲＮＡ量とＨＳＰ９０を用いない場合のｍＲＮＡ量と共に図２に示す。図２に示す結果のとおり、ＨＳＰ９０に結合するＲＤ複合体はラウンド１に比べてラウンド２に比べて増加していたが、ラウンド２以降は増加が認められなくなっており、ＨＳＰ９０に対する親和性を有するＲＤ複合体の濃縮は完了したと考えられた。
（５）ＨＳＰ９０親和性ペプチドの同定
配列の濃縮が確認されたラウンドの全長鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行うことで、末端にＡを付加した。この突出末端とクローニングキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製「ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」）を用いて、付属のプラスミドＤＮＡにライゲーションした。得られたプラスミドを用いて、ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌを形質転換し、培養した。培養により形成されたコロニーから抽出した各クローンのプラスミドを用いて、上記全長鎖ＤＮＡのアミノ酸配列を解析した。得られたアミノ酸配列のうち、ランダム部分（ＮＮＫ部分）の配列を表１２に示す。
配列の濃縮が確認されたラウンドの全長鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行うことで、末端にＡを付加した。この突出末端とクローニングキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製「ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」）を用いて、付属のプラスミドＤＮＡにライゲーションした。得られたプラスミドを用いて、ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌを形質転換し、培養した。培養により形成されたコロニーから抽出した各クローンのプラスミドを用いて、上記全長鎖ＤＮＡのアミノ酸配列を解析した。得られたアミノ酸配列のうち、ランダム部分（ＮＮＫ部分）の配列を表１２に示す。
表１２のとおり、本発明に係るスクリーニング方法により１０12以上のｍＲＮＡを含むライブラリからＨＳＰ９０に親和性を有するペプチドをコードするものを１６種類まで選択することができ、また、選択されたペプチドはアミノ酸配列が類似していることが明らかとなった。
（６）獲得した配列の結合能確認
上記（５）にて獲得した各クローンのＨＳＰ９０に対する親和性の確認を行った。具体的には、上記（５）で合成した各クローンの全長ＤＮＡを鋳型とし、上記（１）と同様にしてＲＮＡを合成し、上記（２）と同様にリボソームディスプレイ複合体を作製した。また、その一部のポリペプチドを、上記（３）と同様にして環化した。得られた各リボソームディスプレイ複合体のＨＳＰ９０に対する親和性を、上記（４）と同様にして調べた。回収した複合体の量を定量することで、各クローンのＨＳＰ９０に対する親和性を求めた。結果を図３に示す。図３中のアルファベットは、上記表１２中の配列記号に相当する。
上記（５）にて獲得した各クローンのＨＳＰ９０に対する親和性の確認を行った。具体的には、上記（５）で合成した各クローンの全長ＤＮＡを鋳型とし、上記（１）と同様にしてＲＮＡを合成し、上記（２）と同様にリボソームディスプレイ複合体を作製した。また、その一部のポリペプチドを、上記（３）と同様にして環化した。得られた各リボソームディスプレイ複合体のＨＳＰ９０に対する親和性を、上記（４）と同様にして調べた。回収した複合体の量を定量することで、各クローンのＨＳＰ９０に対する親和性を求めた。結果を図３に示す。図３中のアルファベットは、上記表１２中の配列記号に相当する。
図３に示す結果のとおり、ＨＳＰ９０に対する親和性を調べたリボソームディスプレイ複合体の内３種のポリペプチドがＨＳＰ９０に親和性を示し、そのうち２種類については、修飾試薬が連結された環状態において１０倍以上強く結合することが示唆された。これらの結果から、ＲＤ複合体の機能を維持したまま、ＲＤ複合体に提示されたポリペプチドに修飾試薬を連結することができたことを示していると考えている。また、修飾試薬の有無により親和性が６倍程度のクローンが取得できた。即ち、ポリペプチドを環化することによりＨＳＰ９０に対する親和性が増したことが示唆されており、修飾試薬を連結することの有用性を示している。
実施例２：ペプチドの環化反応
再構成型無細胞タンパク質合成キット（ジーンフロンティア社製「ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ（登録商標）」）を用い、反応液５０μＬに、ＦＬＡＧ配列、Ｈｉｓ６配列およびＴＥＶプロテアーゼサイトをコードする塩基配列を有するＲＮＡ（配列番号８）２．５×１０13分子を混合し、３７℃で３５分間反応させることによりＲＤ複合体を作製し、反応液に抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２μＬ）を加えてＲＤ複合体を結合させた。さらに、還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ナトリウム塩（ｐＨ７，終濃度０．５ｍＭ）と、図４に示す各修飾試薬を終濃度２ｍＭで加え、４℃で３時間攪拌することによりビーズ上でＲＤ複合体中のペプチドを環化した。反応後、ＦＬＡＧペプチド（配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ，５ｍｇ）を加えることによりＲＤ複合体をビーズから遊離させた。反応液からビーズを分離除去し、Ｍｇ2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５，１００μＬ）を加えて複合体を解離させた後、Ｈｉｓ−ｔａｇビーズでペプチド鎖を精製した。精製したポリペプチドをＴＥＶプロテアーゼで切断した後、環状化部位を含みＮ末端がホルミル化されている断片ペプチド（配列番号９）の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで測定した。修飾試薬の化学構造と得られたマススペクトルチャートを図４に示す。図４中、（ａ）は修飾試薬を添加しない反応液のマススペクトルチャートであり、（ｅ）はＲＮＡを用いない以外は同様に反応させた反応液のマススペクトルチャートでありバックグラウンドのシグナルを示すものである。また、白矢印は未環化ペプチド鎖のピークを示し、黒矢印は環化ペプチド鎖のピークを示す。
再構成型無細胞タンパク質合成キット（ジーンフロンティア社製「ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ（登録商標）」）を用い、反応液５０μＬに、ＦＬＡＧ配列、Ｈｉｓ６配列およびＴＥＶプロテアーゼサイトをコードする塩基配列を有するＲＮＡ（配列番号８）２．５×１０13分子を混合し、３７℃で３５分間反応させることによりＲＤ複合体を作製し、反応液に抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２μＬ）を加えてＲＤ複合体を結合させた。さらに、還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ナトリウム塩（ｐＨ７，終濃度０．５ｍＭ）と、図４に示す各修飾試薬を終濃度２ｍＭで加え、４℃で３時間攪拌することによりビーズ上でＲＤ複合体中のペプチドを環化した。反応後、ＦＬＡＧペプチド（配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ，５ｍｇ）を加えることによりＲＤ複合体をビーズから遊離させた。反応液からビーズを分離除去し、Ｍｇ2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５，１００μＬ）を加えて複合体を解離させた後、Ｈｉｓ−ｔａｇビーズでペプチド鎖を精製した。精製したポリペプチドをＴＥＶプロテアーゼで切断した後、環状化部位を含みＮ末端がホルミル化されている断片ペプチド（配列番号９）の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで測定した。修飾試薬の化学構造と得られたマススペクトルチャートを図４に示す。図４中、（ａ）は修飾試薬を添加しない反応液のマススペクトルチャートであり、（ｅ）はＲＮＡを用いない以外は同様に反応させた反応液のマススペクトルチャートでありバックグラウンドのシグナルを示すものである。また、白矢印は未環化ペプチド鎖のピークを示し、黒矢印は環化ペプチド鎖のピークを示す。
図４に示す結果のとおり、修飾試薬として１，３−ジブロモ−２−プロパノンを用いた場合（ｂ）と１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンを用いた場合（ｃ）では、環化反応が進行していることが分かった。修飾試薬として１，５−ヘキサジン ジエポキシドを用いた場合（ｄ）、反応効率は比較的低いものの環状化合物の確認はできることから、エポキシドも環化試薬として使用できると考えられる。
なお、各マススペクトルチャートでは、使用した修飾試薬１分子分の分子量が増加したピークが明確に認められている一方で、２以上の分子分の分子量が増加したピークは明確に認められない。かかる結果より、修飾試薬は１分子のみがポリペプチド鎖に結合したものと考えられる。
実施例３：ペプチドの環化反応
ＲＮＡとして配列番号１０の塩基配列を有するものを用い、修飾試薬として図５に示すものを用いた以外は上記実施例２と同様にして、環化反応を行った。結果を図５に示す。
ＲＮＡとして配列番号１０の塩基配列を有するものを用い、修飾試薬として図５に示すものを用いた以外は上記実施例２と同様にして、環化反応を行った。結果を図５に示す。
図５のとおり、マレイミド型修飾試薬（図５（ｂ））とハロアセチルアミノ型修飾試薬化合物（図５（ｃ）、（ｄ））ともに、環化試薬として使用できることが明らかとなった。
本実験でも、各マススペクトルチャートでは、使用した修飾試薬１分子分の分子量が増加したピークが明確に認められている。それに加えて、その他のピークも認められるが、２以上の修飾試薬が結合したＲＤ複合体の計算上の分子量とは異なっていることから、プロテアーゼ処理で除去しきれなかったリボソーマルタンパク質に由来するものであると考えられる。かかる結果より、修飾試薬は１分子のみがポリペプチド鎖に結合したものと考えられる。
実施例４：ペプチドの環化反応
ＲＮＡとして配列番号１１塩基配列を有するものを用い、修飾試薬としてスベリン酸ジサクシンイミジルを用い、反応液のｐＨを７．４、７．７または８．０に変更した以外は上記実施例２と同様にして、環化反応を行った。反応液のｐＨが７．４の場合の結果を図６に、ｐＨが７．７の場合の結果を図７に、ｐＨが８．０の場合の結果を図８に示す。
ＲＮＡとして配列番号１１塩基配列を有するものを用い、修飾試薬としてスベリン酸ジサクシンイミジルを用い、反応液のｐＨを７．４、７．７または８．０に変更した以外は上記実施例２と同様にして、環化反応を行った。反応液のｐＨが７．４の場合の結果を図６に、ｐＨが７．７の場合の結果を図７に、ｐＨが８．０の場合の結果を図８に示す。
図６〜８のとおり、いずれのｐＨでも反応が進行していた。また、ｐＨが高いほど修飾試薬がさらに１分子（合計で２分子）付加した化合物のピークの強度が強くなることから、修飾試薬がヒスチジンやトリプトファンといった塩基性アミノ酸にも付加していることが示唆された。
但し、３分子以上の修飾試薬が結合したＲＤ複合体のピークは明確に認められないことから、本実験でも、１分子または２分子の修飾試薬がポリペプチド鎖に結合していると考えられる。
実施例５：ペプチドの環化反応
配列番号１２〜１４のアミノ酸配列をコードするＲＮＡと修飾試薬としてスベリン酸ジサクシンイミジルを用いた以外は上記実施例２と同様にして、環化反応を行った。配列番号１２のアミノ酸配列の結果を図９に、配列番号１３のアミノ酸配列の結果を図１０に、配列番号１４のアミノ酸配列の結果を図１１に示す。
配列番号１２〜１４のアミノ酸配列をコードするＲＮＡと修飾試薬としてスベリン酸ジサクシンイミジルを用いた以外は上記実施例２と同様にして、環化反応を行った。配列番号１２のアミノ酸配列の結果を図９に、配列番号１３のアミノ酸配列の結果を図１０に、配列番号１４のアミノ酸配列の結果を図１１に示す。
図９〜１１のとおり、２つの活性カルボキシ基を有するジスクシンイミジル化合物は、２つのリジン側鎖アミノ基と反応してペプチドを環化することが示唆され、さらに、ヒスチジン側鎖の第二級アミノ基とも反応していることが示唆された。
また、本実験でも反応後のＲＤ複合体の主なピークは１分子または２分子の修飾試薬が結合したものであることから、１分子または２分子の修飾試薬がポリペプチド鎖に結合していると考えられる。
実施例６：ペプチドのビオチン化反応
配列番号１３のペプチド配列をコードするＲＮＡを用い、修飾試薬としてＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いた以外は上記実施例２と同様にして、ペプチドへの修飾を行った。図１２に示すとおり、ビオチン化されたことを示唆するシグナルを得た。このペプチド配列は２つのリジンを含むため、１つビオチン化されたペプチドに加え（黒矢印）、２つビオチンが導入されたペプチドも検出できた（斜線矢印）。このように、本実験でも、１分子または２分子の修飾試薬がポリペプチド鎖に結合していると考えられる。
配列番号１３のペプチド配列をコードするＲＮＡを用い、修飾試薬としてＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いた以外は上記実施例２と同様にして、ペプチドへの修飾を行った。図１２に示すとおり、ビオチン化されたことを示唆するシグナルを得た。このペプチド配列は２つのリジンを含むため、１つビオチン化されたペプチドに加え（黒矢印）、２つビオチンが導入されたペプチドも検出できた（斜線矢印）。このように、本実験でも、１分子または２分子の修飾試薬がポリペプチド鎖に結合していると考えられる。
実施例７：ペプチドの環化反応およびビオチン化反応
配列番号１２のペプチド配列をコードするＲＮＡを用い、修飾試薬として１，３−ジブロモ−２−プロパノンまたはＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いた以外は上記実施例２と同様にして、ビオチン修飾されたＲＤ複合体を作製した。ビオチン化された複合体に上記ストレプトアビジン−磁性粒子希釈液（５μＬ）を加え、磁気スタンドを用いて磁性粒子を回収した。回収した磁性粒子に０．０５ＭのＥＤＴＡを加えることにより、磁性粒子上のＨＳＰ９０に結合しているＲＤ複合体からＲＮＡを解離させた。磁気スタンドを用いて磁性粒子を除去した後、ＲＮＡ濃縮・精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製「ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ」）によりＲＮＡを精製した。各修飾試薬で修飾した場合のＲＮＡ回収量を定量ＲＴ−ＰＣＲで測定し、修飾試薬なしで行った条件での回収量をバックグラウンドとして、相対的に比較した。結果を図１３に示す。図１３に示す結果の通り、ＲＤ複合体に対してＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎでのビオチン化が進行し、ＲＮＡが回収できたことを示唆する結果を得た。
配列番号１２のペプチド配列をコードするＲＮＡを用い、修飾試薬として１，３−ジブロモ−２−プロパノンまたはＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いた以外は上記実施例２と同様にして、ビオチン修飾されたＲＤ複合体を作製した。ビオチン化された複合体に上記ストレプトアビジン−磁性粒子希釈液（５μＬ）を加え、磁気スタンドを用いて磁性粒子を回収した。回収した磁性粒子に０．０５ＭのＥＤＴＡを加えることにより、磁性粒子上のＨＳＰ９０に結合しているＲＤ複合体からＲＮＡを解離させた。磁気スタンドを用いて磁性粒子を除去した後、ＲＮＡ濃縮・精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製「ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ」）によりＲＮＡを精製した。各修飾試薬で修飾した場合のＲＮＡ回収量を定量ＲＴ−ＰＣＲで測定し、修飾試薬なしで行った条件での回収量をバックグラウンドとして、相対的に比較した。結果を図１３に示す。図１３に示す結果の通り、ＲＤ複合体に対してＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎでのビオチン化が進行し、ＲＮＡが回収できたことを示唆する結果を得た。
実施例８：修飾条件の比較
（１）条件１
再構成型無細胞タンパク質合成キット（ジーンフロンティア社製「ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ（登録商標）」）を用い、反応液５０μＬに含まれるリボソームに、還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ナトリウム塩（ｐＨ７，終濃度０．５ｍＭ）と、修飾試薬として１，３−ジブロモ−２−プロパノンを終濃度２ｍＭで加え、４℃で３時間反応した。次いで、上記再構成型無細胞タンパク質合成キットのリボソーム以外の因子（反応液５０μＬに必要量）と、ＲＮＡ（配列番号８）２．５×１０12分子を加えて混合し、３７℃で３５分間反応させることによりＲＤ複合体の調製を行った。この反応液に抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２μＬ）を加えて、ＲＤ複合体を結合させた。ここでは何も加えずに、４℃で３時間攪拌した。攪拌後、ＦＬＡＧペプチド（配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ，５ｍｇ）を加えることによりＲＤ複合体をビーズから遊離させた。得られたＲＤ複合体の量を、定量ＲＴ−ＰＣＲで求めた。結果を図１４に示す。
（１）条件１
再構成型無細胞タンパク質合成キット（ジーンフロンティア社製「ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ（登録商標）」）を用い、反応液５０μＬに含まれるリボソームに、還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ナトリウム塩（ｐＨ７，終濃度０．５ｍＭ）と、修飾試薬として１，３−ジブロモ−２−プロパノンを終濃度２ｍＭで加え、４℃で３時間反応した。次いで、上記再構成型無細胞タンパク質合成キットのリボソーム以外の因子（反応液５０μＬに必要量）と、ＲＮＡ（配列番号８）２．５×１０12分子を加えて混合し、３７℃で３５分間反応させることによりＲＤ複合体の調製を行った。この反応液に抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２μＬ）を加えて、ＲＤ複合体を結合させた。ここでは何も加えずに、４℃で３時間攪拌した。攪拌後、ＦＬＡＧペプチド（配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ，５ｍｇ）を加えることによりＲＤ複合体をビーズから遊離させた。得られたＲＤ複合体の量を、定量ＲＴ−ＰＣＲで求めた。結果を図１４に示す。
（２）条件２
条件２では、上記実施例と同様に、ＲＤ複合体を作製した後に修飾試薬を作用させた。具体的には、上記再構成型無細胞タンパク質合成キットを用い、反応液５０μＬに含まれるリボソームに対して、修飾試薬を加えずに４℃で３時間インキュベーションした。次いで、条件１と同様の操作によりＲＤ複合体を調製し、この反応液に抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２μＬ）を加えてＲＤ複合体を結合させた。さらに、還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ナトリウム塩（ｐＨ７，終濃度０．５ｍＭ）と、修飾試薬として１，３−ジブロモ−２−プロパノンを終濃度２ｍＭで加え、４℃で３時間攪拌することによりビーズ上でＲＤ複合体の修飾を行った。なお、添加した修飾試薬（１，３−ジブロモ−２−プロパノン）の量は、ＲＤ複合体１モルに対して１，０００，０００倍モルとなる。反応後、ＦＬＡＧペプチド（配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ，５ｍｇ）を加えることによりＲＤ複合体をビーズから遊離させた。得られたＲＤ複合体の量を、定量ＲＴ−ＰＣＲで求めた。結果を図１４に示す。
条件２では、上記実施例と同様に、ＲＤ複合体を作製した後に修飾試薬を作用させた。具体的には、上記再構成型無細胞タンパク質合成キットを用い、反応液５０μＬに含まれるリボソームに対して、修飾試薬を加えずに４℃で３時間インキュベーションした。次いで、条件１と同様の操作によりＲＤ複合体を調製し、この反応液に抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２μＬ）を加えてＲＤ複合体を結合させた。さらに、還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ナトリウム塩（ｐＨ７，終濃度０．５ｍＭ）と、修飾試薬として１，３−ジブロモ−２−プロパノンを終濃度２ｍＭで加え、４℃で３時間攪拌することによりビーズ上でＲＤ複合体の修飾を行った。なお、添加した修飾試薬（１，３−ジブロモ−２−プロパノン）の量は、ＲＤ複合体１モルに対して１，０００，０００倍モルとなる。反応後、ＦＬＡＧペプチド（配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ，５ｍｇ）を加えることによりＲＤ複合体をビーズから遊離させた。得られたＲＤ複合体の量を、定量ＲＴ−ＰＣＲで求めた。結果を図１４に示す。
図１４に示す結果のとおり、リボソームに修飾試薬を作用させてからＲＤ複合体を作製しようとしても、ＲＤ複合体は得られなかった。それに対して、ＲＤ複合体に対して修飾試薬を作用させても、得られたＲＤ複合体は分解などをおこさないことが明らかとなった。また、上記実施例の結果より、修飾試薬は少なくともＲＤ複合体中のペプチドに反応していると考えられる。
Claims (24)
- ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体を製造するための方法であって、
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される１以上の反応性アミノ酸残基を含み、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記ｍＲＮＡ分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、
上記リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いて上記ｍＲＮＡ分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、上記ｍＲＮＡ分子および上記リボソームを含むリボソーム複合体を得る工程、および、
上記未修飾ポリペプチド鎖に含まれる上記側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、上記未修飾ポリペプチド鎖を修飾する工程を含むことを特徴とする方法。 - 前記修飾試薬が、下記式（１）で表される化合物である請求項１に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
（式中、Ａは、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基の側鎖と反応して結合を形成可能な基を表し、Ｂは連結基又は単結合を表し、Ｃは機能性基を表す。ａは１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ａが２以上の整数を表す場合、複数のＡは互いに同一であっても異なっていてもよい） - 前記Ａが、ハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、カルベン含有基、ジスルフィド結合含有基、或いはチオール基である請求項２に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記連結基Ｂが、ヘテロ原子含有極性基、炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
前記ヘテロ原子含有極性基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−（式中、Ｒ1は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−（式中、Ｒ2は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−Ｎ＝Ｎ−、又は−ＳＯ2−であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基である請求項２または３に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。 - 前記連結基Ｂが、−Ｂ１−単位、−Ｂ２−単位、−Ｂ２−Ｂ１−単位、又は−Ｂ２−Ｂ１−Ｂ３−単位を有し、
Ｂ１が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
Ｂ２及びＢ３がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
Ｂ１又はＢ２が前記Ａと結合しており、
ヘテロ原子含有極性基及び置換基が前記と同じ意味である請求項４に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。 - 前記修飾試薬が、下記式
（式中、Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３は前記に同じ。ｎは１以上の整数を表す。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３のいずれか一つ以上には、前記Ｃの１つ以上が結合していてもよい）
のいずれかで表される請求項５に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。 - 前記Ａがハロゲン化アルキルであるとき、このハロゲノ基が結合する炭素原子が、カルボニル基のα位の炭素原子、又は芳香族環に直結する炭素原子である請求項２〜６のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記ポリペプチド鎖が、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基からなる群より選択される２以上の反応性アミノ酸残基を含み、
前記式（１）の修飾試薬でａが２以上であり、
未修飾ポリペプチド鎖に含まれる側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させる前記工程で、ポリペプチド鎖と修飾試薬の間に環を形成する請求項２〜７のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。 - 前記ポリペプチド鎖が１００〜５０００アミノ酸残基からなる請求項１〜８のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記反応性アミノ酸残基を、前記ポリペプチド鎖のＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置に有する請求項１〜９のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記ポリペプチド鎖がＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置に１〜３０アミノ酸残基のランダム配列を含む請求項１〜１０のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記リボソームが、大腸菌由来のリボソームである請求項１〜１１のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- ポリペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子およびリボソームを含み、
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される１以上の反応性アミノ酸残基を含み、且つ、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記ｍＲＮＡ分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであることを特徴とするリボソームディスプレイ複合体。 - 前記側鎖反応性官能基の修飾構造が、下記式（２）で表される化学構造である請求項１３に記載のリボソームディスプレイ複合体。
（式中、Ａｘは、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基又はトリプトファン残基の側鎖と反応して形成される結合基を表し、Ｂは連結基又は単結合を表し、Ｃは機能性基を表す。ａは１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ａが２以上の整数を表す場合、複数のＡｘは互いに同一であっても異なっていてもよい） - 前記Ａｘが、ハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、カルベン含有基、ジスルフィド結合含有基、或いはチオール基と、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基又はトリプトファン残基の側鎖とが形成する化学結合である請求項１４に記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記連結基Ｂが、ヘテロ原子含有極性基、炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
前記ヘテロ原子含有極性基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−（式中、Ｒ1は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−（式中、Ｒ2は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す）、−Ｎ＝Ｎ−、又は−ＳＯ2−であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基である請求項１５に記載のリボソームディスプレイ複合体。 - 前記連結基Ｂが、−Ｂ１−単位、−Ｂ２−単位、−Ｂ２−Ｂ１−単位、又は−Ｂ２−Ｂ１−Ｂ３−単位を有し、
Ｂ１が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる１種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
Ｂ２及びＢ３がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
Ｂ１又はＢ２が前記Ａｘと結合しており、 ヘテロ原子含有極性基及び置換基が前記と同じ意味である請求項１６に記載のリボソームディスプレイ複合体。 - 前記修飾構造が、下記式
（式中、Ａｘ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３は前記に同じ。ｎは１以上の整数を表す。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３のいずれか一つ以上には、前記Ｃの１つ以上が結合していてもよい）
で表される請求項１７に記載のリボソームディスプレイ複合体。 - 前記Ａｘがハロゲン化アルキルと、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基の側鎖とが形成する化学結合であるとき、このハロゲノ基が結合する炭素原子が、カルボニル基のα位の炭素原子、又は芳香族環に直結する炭素原子である請求項１４〜１８のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記ポリペプチド鎖が、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、およびトリプトファン残基からなる群より選択される２以上の反応性アミノ酸残基を含み、
前記式（２）の修飾構造でａが２以上であり、
ポリペプチド鎖と式（２）の修飾構造とで環が形成されている請求項１４〜１９のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。 - 前記ポリペプチド鎖が１００〜５０００アミノ酸残基からなる請求項１３〜２０のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記反応性アミノ酸残基を、前記ポリペプチド鎖のＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置に有する請求項１３〜２１のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記ポリペプチド鎖がＮ末端から２番目〜Ｃ末端から３０番目の位置に１〜３０アミノ酸残基のランダム配列を含む請求項１３〜２２のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記リボソームが、大腸菌由来のリボソームである請求項１３〜２３のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
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