CN109312324A

CN109312324A - 核糖体展示复合体及其制造方法

Info

Publication number: CN109312324A
Application number: CN201780035798.5A
Authority: CN
Inventors: 北宽士; 鹿仓敏裕; 前田博文; 高津庆士
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2037-06-06
Also published as: EP3467107A1; US11248226B2; DK3467107T3; EP3467107A4; JP7093300B2; CN109312324B; US20190169600A1; WO2017213158A1; EP3467107B1; JPWO2017213158A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种核糖体复合体、及该核糖体复合体的制备方法，所述核糖体复合体能够在不经过复杂的反应步骤的情况下制备，并且在不会损害核糖体的功能(特别是用于制作多肽文库的功能)的情况下修饰有呈递多肽。本发明的核糖体展示复合体的制造方法的特征在于包括如下工序：使用利用了核糖体的无细胞肽合成体系对mRNA分子进行翻译，得到包含未修饰多肽链、该mRNA分子和该核糖体的核糖体复合体的工序；及通过使上述未修饰多肽链中所含的上述侧链反应性官能团与修饰试剂反应，来修饰上述未修饰多肽链的工序。

Description

核糖体展示复合体及其制造方法

技术领域

本发明涉及新型的核糖体展示复合体及其制造方法。

背景技术

近些年，正进行着从各种各样的氨基酸序列的多肽文库中选择针对特定疾病的治疗药、与靶分子亲和性高的分子等的研究。作为其理由，可认为由于多肽的特异性、选择性高，因此与低分子化合物相比副作用等少。另外，通过使用了随机引物的PCR技术，可以容易地得到编码使特定部分的氨基酸序列随机化了的多肽的DNA，因此与低分子化合物的文库相比，还具有能够容易地制备包含大量多肽的文库这样的优点(非专利文献1～3)。

另一方面，针对通过功能性分子对抗体等多肽进行化学性修饰而使其功能得以扩展的药品开发受到关注。例如，非专利文献4和5中记载了将抗体药物复合体(ADC)应用于抗癌剂的例子。这种多肽与功能性分子连接而成的化合物混合了多肽的特性和功能性分子的功能，在药物研发领域作为发挥各自的特征或弥补各自的缺点的分子引起关注(非专利文献6～10)。

例如，可认为由于多肽与靶分子的特异性高，因此与低分子药品相比副作用等低。另一方面，多肽由于在生物体内被蛋白酶、肽酶等降解而不稳定。因此，有时通过导入非天然氨基酸或使用修饰试剂进行环化来提高在生物体内的稳定性。此外，为了通过环化使结构稳定化，因此还有提高与靶向化合物的亲和性、选择性、或表现出针对降解酶的耐性、细胞膜透过性的情况(非专利文献6～10)。

由此，将用于环化的修饰试剂、抗癌剂的功能性分子与多肽连接而制成多肽文库的技术受到关注。

作为制作这样的功能性分子与多肽连接而成的化合物的文库的技术，有所呈递的多肽(表达型)与编码该多肽的基因(遗传型)以1对1匹配而成的复合体(非专利文献1)。

作为其方法通常使用噬菌体展示法。在噬菌体展示法中，还知晓通过使多肽呈递在噬菌体上，并对该多肽实施修饰来制作文库的方法。基于该噬菌体展示法得到的文库能够以相对简单的设备来廉价地制造。制得的文库能够用于为分离有用的多肽而进行的筛选。然而，将呈递在噬菌体上的多肽与功能性分子特异性连接的操作较难，而且工序繁多且复杂，因此仅有几例报道(非专利文献6、7、10)。

另一方面，作为结合有功能性分子的多肽文库，已知是通过体外翻译体系将特殊氨基酸组入多肽链的特性位置，使构成该肽的氨基酸残基与反应性官能团反应并环化成而得到的(非专利文献8、9)。另外，在mRNA展示法中，报道了使修饰试剂与mRNA-肽复合体直接反应并环化的方法(非专利文献9)。

使用了该体外翻译体系的文库制作方法与噬菌体展示法相比，从多样性的观点考虑是非常优异的。作为该体外翻译体系的方法，例如有核糖体展示法(RD法)、mRNA展示法、cDNA展示法等。这些方法中，核糖体展示法(RD法)只要有体外翻译体系和mRNA，且仅通过将它们混合，就能够制作以数量计10¹²种以上的多肽文库，在这点上是优异的。另一方面，mRNA展示法和cDNA展示法中，如mRNA和嘌呤霉素DNA的退火工序等用于制作文库的工序繁多且复杂。

然而，对于RD法，没有报道使功能性分子与多肽连接的方法。作为其原因，可列举出：对于RD法中使用的表达型-遗传型的复合体，呈递的肽与包含基因的核酸通过核糖体介导的非共价键而形成；对核糖体本身的功能性分子连接反应的脆弱性。即，没有利用RD法连接功能性分子的报道的原因在于：1)与通过共价键制作遗传型-表达型复合体的mRNA展示法相比，复合体不稳定，2)与形成核糖体的核糖体蛋白中所含的半胱氨酸、赖氨酸等具有反应性，因此与功能性分子连接时核糖体本身的功能、复合体的功能容易降低等。实际上，例如大肠杆菌的55种核糖体蛋白中总计存在36个半胱氨酸和686个赖氨酸。

例如，半胱氨酸作为多肽的一个残基在结构/功能上发挥特别重要的作用。半胱氨酸残基的SH基与同一多肽内和不同的多肽的半胱氨酸残基的SH基形成二硫键。该二硫键通常有助于形成多肽的高级结构。SH基除了形成二硫键之外还可成为各种反应的基质，因此在对多肽链进行人为修饰时，成为可作为修饰部位的候补。另一方面，由于其反应性高，因此在需要对特定的半胱氨酸残基进行特异性修饰时，可能会在其它非预期的位置发生反应。由此经常会出现损害多肽的高级结构的情况。赖氨酸、组氨酸、色氨酸也是同样的。因此，对于包含多个半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸的多肽、核糖体或包含它们的RD复合体，在不损害它们的功能的前提下设计出修饰目标半胱氨酸的方法的技术并不容易。具体而言，需要：利用基因工程从核糖体蛋白中去除非预期的半胱氨酸的方法、包括使非预期的半胱氨酸不反应那样的预备反应的复杂的反应工序步骤。若将这样的工序组入文库制作工序时，会失去作为RD法的特征的能够工序少地制作文库这样的优点。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：H.Leemhuis，另外3名，“New genotype-phenotype linkages fordirected evolution of functional proteins”，Current Opinion in StructuralBiology 2005，15：472-478

非专利文献2：D.Lipovsek，另外1名，“In-vitro protein evolution byribosome display and mRNA display”，Journal of immunological methods，290(2004)，51-67

非专利文献3：H.M.E.Azzazy，另外1名，“Phage display technology:clinicalapplications and recent innovations”，Clinical Biochemistry，35(2002)，425-445

非专利文献4：H.L.Perez，另外6名，“Antibody-drug conjugates:currentstatus and future directions”，Drug Discovery Today，Volume 19，Number 7，July2014

非专利文献5：S.C.Alley，另外2名，“Antibody-drug conjugates:targeted drugdelivery for cancer”，Current Opinion in Chemical Biology，2010，14：529-537

非专利文献6：C.Heinis，另外3名，“Phage-encoded combinatorial chemicallibraries based on bicyclic peptides”，Nature Chemical Biology，5，502-507(2009)

非专利文献7：I.R.Rebollo，另外1名，“Phage selection of bicyclicpeptides”，Methods 60(2013)，46-54

非专利文献8：T.Kawakami，另外2名，“Messenger RNA-ProgrammedIncorporation of Multiple N-Methyl-Amino Acids into Linear and CyclicPeptides”，Chemistry&Biology，vol.15(1)，p.32-42，January 2008

非专利文献9：K.Josephson，另外2名，“mRNA display:from basic principlesto macrocycle drug discovery”，Drug Discovery Today，volume 19，Number 4，April2014，pp.388-399

非专利文献10：K.Fukunaga，另外4名，“Construction of a crown ether-likesupramolecular library by conjugation of genetically-encoded peptide linkersdisplayed on bacteriophage T7”，Chemical Communications，2014，50，3921-3923

发明内容

发明要解决的问题

实际上，本发明人等经试验证实了：使作为修饰试剂的环化试剂(1,3-二溴-2-丙酮；DBP)作用于核糖体后，进行RD复合体形成工序的情况，无法形成RD复合体。

因此，本发明的课题在于提供核糖体复合体、及该核糖体复合体的制备方法，所述核糖体复合体能够在不经过复杂的反应步骤的情况下制备，并且在不损害核糖体的功能(特别是用于制作多肽文库的功能)的情况下修饰有呈递多肽。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究。其结果发现：在通过核糖体展示法制作经修饰的多肽文库时，由于核糖体中在其核糖体蛋白内包含大量如半胱氨酸残基等具有反应性侧链官能团的氨基酸残基，因此在利用人工物进行修饰时存在失去其功能的风险，但只要使人工物进行修饰的时机适宜，就能够在不失去本来的功能的前提下使RNA与由其翻译成的多肽进行结合的核糖体的粘接功能得以维持，对于核糖体展示复合体能够简便、容易地修饰多肽，以至完成了本发明。

以下示出本发明。

[1]一种核糖体展示复合体的制造方法，其特征在于，其是用于制造包含多肽链、mRNA分子和核糖体的核糖体展示复合体的方法，

所述多肽链包含选自由半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基和色氨酸残基组成的组中的1种以上的反应性氨基酸残基，并且该反应性氨基酸残基的侧链反应性官能团被修饰，

所述mRNA分子包含编码所述多肽链的氨基酸序列的碱基序列，

所述方法包括如下工序：

使用利用了所述核糖体的无细胞肽合成体系对所述mRNA分子进行翻译，得到包含未修饰多肽链、所述mRNA分子和所述核糖体的核糖体复合体的工序；及

通过使所述未修饰多肽链中所含的所述侧链反应性官能团与修饰试剂反应，来修饰所述未修饰多肽链的工序。

[2]根据上述[1]所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述修饰试剂是下述式(1)所示的化合物，

式(1)中，A表示能与半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基的侧链反应而形成键的基团，B表示连接基团或单键，C表示功能性基团，a表示1以上的整数，c表示0或1以上的整数，a表示2以上的整数时，多个A任选彼此相同或不同。

[3]根据上述[2]所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述A为卤代烷基、活化羰基、不饱和烃基、环氧基、含磺酰基的基团、异氰酸酯基、硫代异氰酸酯基、卡宾生成基团、含卡宾的基团、含二硫键的基团或巯基。

[4]根据上述[2]或[3]所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述连接基团B是单独具有或组合具有选自含杂原子的极性基团、在碳原子之间任选插入含杂原子的极性基团且任选具有取代基的链状或环状的脂肪族烃基、及任选具有取代基的芳香族环中的1种以上的基团，

所述含杂原子的极性基团为-O-、-S-、-NR¹-、-CO-、-COO-、-CONR²-、-N＝N-或-SO₂-，式中，R¹表示氢原子、烃基或连接基团末端的原子键，R²表示氢原子、烃基或连接基团末端的原子键，

所述脂肪族烃基的取代基为卤代基、芳基、羧基、烷氧羰基或羟基，

所述芳香族环的取代基为卤代基、烷基、芳烷基、羧基、烷氧羰基、羟烷基或羧烷基。

[5]根据上述[4]所述的核糖体展示复合体的制造方法，所述连接基团B具有-B1-单元、-B2-单元、-B2-B1-单元或-B2-B1-B3-单元，

B1是单独具有或组合具有选自在碳原子之间任选插入含杂原子的极性基团且任选具有取代基的链状或环状的脂肪族烃基、及任选具有取代基的芳香族环中的1种以上的基团，

B2和B3分别独立地为含杂原子的极性基团，

B1或B2与所述A键合，

含杂原子的极性基团和取代基与前述含义相同。

[6]根据上述[5]所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，

所述修饰试剂由下述式中的任一者表示，

式中，A、B1、B2、B3与前述相同，n表示1以上的整数，B1、B2、B3中任意一个或多个上任选键合有1个以上所述C。

[7]根据上述[2]～[6]中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述A为卤代烷基时，该卤代基所键合的碳原子为羰基的α位的碳原子或与芳香族环直接键合的碳原子。

[8]根据上述[2]～[7]中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，所述多肽链包含选自由半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基组成的组中的2种以上的反应性氨基酸残基，

在所述式(1)的修饰试剂中a为2以上，

在使未修饰多肽链中所含的侧链反应性官能团与修饰试剂反应的所述工序中，在多肽链与修饰试剂之间形成环。

[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述多肽链由100～5000个氨基酸残基构成。

[10]根据上述[1]～[9]中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，在所述多肽链的从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置具有所述反应性氨基酸残基。

[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述多肽链在从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置包含1～30个氨基酸残基的随机序列。

[12]根据上述[1]～[11]中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述核糖体为源自大肠杆菌的核糖体。

[13]一种核糖体展示复合体，其特征在于，其包含多肽链、mRNA分子和核糖体，

所述mRNA分子包含编码所述多肽链的氨基酸序列的碱基序列。

[14]根据上述[13]所述的核糖体展示复合体，其中，所述侧链反应性官能团的修饰结构是由下述式(2)所示的化学结构，

式(2)中，Ax表示与半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基的侧链反应而形成的键合基团，B表示连接基团或单键，C表示功能性基团，a表示1以上的整数，c表示0或1以上的整数，a表示2以上的整数时，多个Ax任选彼此相同或不同。

[15]根据上述[14]所述的核糖体展示复合体，其中，所述Ax是卤代烷基、活化羰基、不饱和烃基、环氧基、含磺酰基的基团、异氰酸酯基、硫代异氰酸酯基、卡宾生成基团、含卡宾的基团、含二硫键的基团或巯基、与半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基的侧链所形成的化学键。

[16]根据上述[15]所述的核糖体展示复合体，其中，所述连接基团B是单独具有或组合具有选自含杂原子的极性基团、在碳原子之间任选插入含杂原子的极性基团且任选具有取代基的链状或环状的脂肪族烃基、及任选具有取代基的芳香族环中的1种以上的基团，

[17]根据上述[16]所述的核糖体展示复合体，其中，所述连接基团B具有-B1-单元、-B2-单元、-B2-B1-单元或-B2-B1-B3-单元，

B2和B3分别独立地为含杂原子的极性基团，

B1或B2与所述Ax键合，含杂原子的极性基团和取代基与前述含义相同。

[18]根据上述[17]所述的核糖体展示复合体，其中，所述修饰结构由下述式表示，

式中，Ax、B1、B2、B3与前述相同，n表示1以上的整数，B1、B2、B3中任意一个或多个上任选键合有1个以上所述C。

[19]根据上述[14]～[18]中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述Ax是卤代烷基、与半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基的侧链所形成的化学键时，该卤代基所键合的碳原子为羰基的α位的碳原子或与芳香族环直接键合的碳原子。

[20]根据上述[14]～[19]中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述多肽链包含选自由半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基和色氨酸残基组成的组中的2种以上的反应性氨基酸残基，

在所述式(2)的修饰结构中a为2以上，

由多肽链和式(2)的修饰结构形成了环。

[21]根据上述[13]～[20]中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述多肽链由100～5000个氨基酸残基构成。

[22]根据上述[13]～[21]中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，在所述多肽链的从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置具有所述反应性氨基酸残基。

[23]根据上述[13]～[22]中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述多肽链在从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置包含1～30个氨基酸残基的随机序列。

[24]根据上述[13]～[23]中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述核糖体为源自大肠杆菌的核糖体。

发明的效果

根据本发明，能够通过极其简单的工序提供利用功能性分子对呈递多肽的半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基进行了修饰的核糖体复合体。若考虑到核糖体复合体在作为其构成因子的核糖体蛋白中具有远超过呈递多肽的如半胱氨酸残基等具有反应性侧链官能团的氨基酸残基，则这是非常惊人的效果。即，核糖体由55个核糖体蛋白和3条RNA构成，在某些核糖体中包含总计36个半胱氨酸、686个赖氨酸、151个组氨酸。尽管如此，在不阻碍多肽与mRNA的粘接功能的前提(即维持RD复合体的状态)下通过极其简单的工序能对呈递多肽进行化学修饰这样的本发明的效果是预料不到的，而且是极其有用的。

附图说明

图1是用于制作本发明的核糖体展示复合体而使用的模板DNA的结构的示意图。

图2是示出测定了核糖体展示复合体与结合有HSP90的磁性颗粒和未结合HSP90的磁性颗粒的结合量的结果的图表。

图3是示出测定了修饰了多肽链的核糖体展示复合体、以及未修饰多肽链的核糖体展示复合体与HSP90的亲和性的结果的图表。

图4是使各修饰试剂与核糖体展示复合反应得到的物质的质谱图。

图5是使各修饰试剂与核糖体展示复合反应得到的物质的质谱图。

图6是在pH7.4下使核糖体展示复合体进行环化反应时的质谱图。

图7是在pH7.7下使核糖体展示复合体进行环化反应时的质谱图。

图8是在pH8.0下使核糖体展示复合体进行环化反应时的质谱图。

图9是通过辛二酸二琥珀酰亚胺酯使具有序列号12的氨基酸序列的核糖体展示复合体环化时的质谱图。

图10是通过辛二酸二琥珀酰亚胺酯使具有序列号13的氨基酸序列的核糖体展示复合体环化时的质谱图。

图11是通过辛二酸二琥珀酰亚胺酯使具有序列号14的氨基酸序列的核糖体展示复合体环化时的质谱图。

图12是通过EZ-Link NHS-PEG4-生物素(NHS-PEG4-Biotin)修饰具有序列号13的氨基酸序列的核糖体展示复合体时的质谱图。

图13是相对地示出未修饰核糖体展示复合体或者用1,3-二溴-2-丙酮或EZ-LinkNHS-PEG4-生物素修饰了的核糖体展示复合体、与HSP90的亲和性的图表。

图14是用于比较变更了修饰试剂的添加时期所制成的核糖体展示复合体的量的图表。

具体实施方式

以下，首先对本发明的核糖体展示复合体的制造方法进行说明。

(1)核糖体展示复合体的制备工序

该工序中，使用利用了核糖体的无细胞肽合成体系对mRNA分子进行翻译，得到包含未修饰多肽链、mRNA分子和核糖体的核糖体复合体。

利用了核糖体的无细胞肽的合成体系是使用在细胞内进行的基于RNA信息进行多肽合成所需的化合物、在体外由mRNA合成多肽的体系。具体而言，在包含起始因子、延伸因子、氨基酰tRNA合成酶等mRNA的翻译、能量再生等所需的蛋白质、核糖体、tRNA、氨基酸、NTP、缓冲液等的反应体系中添加mRNA分子，合成与所添加的mRNA对应的多肽。用于合成无细胞肽的试剂盒有市售品，因此除了mRNA分子之外利用市售试剂盒即可。

该工序中制备的核糖体展示复合体包含mRNA、作为其翻译产物的多肽链、及核糖体。以下有时将核糖体展示简记为“RD”。

本发明的RD复合体中所含的多肽链包含选自由在以下工序中用于修饰的半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基和色氨酸残基组成的组中的1种以上反应性氨基酸残基。作为反应性氨基酸残基的数量，有时通过使多肽链环化而进一步提高稳定性等，因此优选2个以上。另一方面，由于存在反应位点多时与RD复合体结合的修饰试剂的数量、位置不稳定而难以与源自氨基酸序列的多肽链的特性进行比较的情况，因此作为上述反应性氨基酸残基的数量优选10个以下。

作为上述反应性氨基酸残基，优选半胱氨酸残基及/或赖氨酸残基。另外，在例如半胱氨酸残基参与通过二硫键使多肽的高级结构稳定化的情况下，优选另行导入上述反应性氨基酸残基。

反应性氨基酸残基的位置进行适宜选择即可，例如优选：是从核糖体的出口通道(exit tunnel)中伸出至外部的部分，具体而言是从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置(包括从N末端起第2位的位置及从C末端起第30位的位置)。本发明中，由于在RD复合体的状态下修饰多肽链，因此若反应性氨基酸残基位于上述位置，则修饰反应难以被核糖体空间阻碍。作为从上述的C末端起的位置，优选第50位、更优选第100位。另外从N末端侧起计数反应性氨基酸残基的位置时，其位置可以根据多肽的链长进行适宜设定，例如为从N末端起第2～1000位的位置，优选为从N末端起第2～100位的位置，更优选为从N末端起第2～50位的位置。

另外，为了作为多肽文库发挥作用，多肽链优选在特定位置包含随机序列。从上述随机序列中可以确定对应于预定目的的有用的氨基酸序列。随机序列的位置也可进行适宜选择，例如，优选：与反应性氨基酸残基的位置同样地设为从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置(包括从N末端起第2位的位置及从C末端起第30位的位置)。即，反应性氨基酸残基优选包含在随机序列内。因此，随机序列的优选位置可以设定在与反应性氨基酸残基的优选位置相同的范围内。随机序列的氨基酸数也可进行适宜选择，例如，可以设为1个以上且30个以下。随机序列数的上限没有特别限制，优选10个以下。另外，这样的随机序列在多肽链中可以是1个或2个以上。1个随机序列越长且随机序列的数量越多则越能提高多肽文库的多样性。

此外，多肽链任选具有与目的对应的氨基酸序列。例如可以列举出：FLAG(注册商标)序列、聚His序列等用于纯化多肽链的序列、被蛋白酶等选择性切断的序列、间隔序列等。

mRNA至少包含编码上述多肽链的碱基序列。此外，任选具有翻译等所需的序列。该mRNA由于是编码相同RD复合体中的多肽的mRNA，因此在从文库中选择特定的RD复合体时，通过解析该mRNA的碱基序列而能够间接地确定有用的多肽的氨基酸序列。

多肽链的氨基酸残基数没有特别限制，例如可以设为100个以上且5000个以下。作为该氨基酸残基数，更优选150个以上、更进一步优选200个以上，另外，更优选800个以下或600个以下、更进一步优选500个以下。

核糖体可以使用由生物体经纯化而成的物质。例如，使用源自大肠杆菌的核糖体即可。

在细胞内的多肽合成中，一旦多肽被合成出则解离因子与mRNA的终止密码子结合，多肽链游离，mRNA也从核糖体中解离。然而，在该工序中由于目的在于制备包含多肽链、mRNA及核糖体的RD复合体，因此需要进行不使多肽链游离的处置。作为上述处置，可以使用公知的方法。例如可列举出：从mRNA中去除终止密码子、或者在mRNA的3’末端配置被称为逮捕序列(arrest sequence)的翻译延伸终止序列、或在无细胞肽合成体系中不添加解离因子、核糖体再生因子。

合成RD复合体后，作为RD复合体的纯化方法使用常规方法即可。例如，在多肽链中存在FLAG(注册商标)序列、聚His序列的情况下，可以使用与这些序列对应的公知的纯化方法。

(2)多肽链的修饰工序

在如上述那样制造包含未修饰多肽链、mRNA分子和核糖体的核糖体复合体后，在该工序中通过使该未修饰多肽链中所含的侧链反应性官能团与修饰试剂反应来对未修饰多肽链进行修饰。若制造包含未修饰多肽链的核糖体复合体后与修饰试剂反应，则能够在维持RD复合体的状态下(即不损害核糖体中的多肽与mRNA的粘接功能的前提下)通过极其简单的工序化学修饰多肽链。

需要说明的是，由于核糖体是作为rRNA与蛋白质的复合体的巨型分子，因此与RD复合体中所含的呈递多肽相比，包含大量反应性氨基酸残基。然而，即使在制作RD复合体后使之与修饰试剂起作用的情况下，也能够对RD复合体中所含的呈递多肽链进行修饰，且也可以维持RD复合体。

作为用于修饰未修饰多肽链的修饰试剂，例如可以使用下述式(1)所示的化合物。

上述式中，A表示能与半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基的侧链反应而形成键的基团。即，表示能与半胱氨酸残基的巯基、赖氨酸残基的侧链氨基(-NH₂)或组氨酸残基及色氨酸残基的侧链氨基(＞NH)反应而形成键的基团。

具体而言，作为A，可以列举出：卤代烷基、活化羰基、不饱和烃基、环氧基、含磺酰基的基团、异氰酸酯基、硫代异氰酸酯基、卡宾生成基团、含卡宾的基团、含二硫键的基团或巯基。

作为卤代烷基中的卤代基，可以列举出：氯基、溴基或碘基。另外，作为卤代烷基中的亚烷基，可以是直链亚烷基或支链亚烷基，例如可以列举出C_1-20亚烷基，优选C_1-10亚烷基、更优选C_1-6亚烷基或C_1-4亚烷基、更进一步优选C_1-2亚烷基。另外，作为卤代烷基，卤代基所键合的碳原子优选与B中所含的羰基或芳香族环直接连接。卤代烷基除了能与巯基键合之外还可以与氨基键合。

活化羰基包括活化酯基、甲酰基等。作为活化酯基，例如可以列举出：琥珀酰亚胺基等酰亚胺酯基、4-硝基苯酚酯基、HOBt酯基、HOAt酯基、Oxyma酯基等。活化羰基除了能与例如半胱氨酸残基的侧链硫醇键合之外还可以与氨基键合。另外甲酰基例如可以通过还原性氨基化反应而与赖氨酸的侧链氨基键合。

不饱和烃基是指具有至少1个碳-碳双键或碳-碳三键的不饱和烃基，包括乙烯基、炔丙基等，优选乙烯基羰基、炔丙基羰基、乙烯基磺酰基等。不饱和烃基例如可以通过迈克尔加成、亲核取代反应与氨基、巯基键合。

作为含磺酰基的基团，例如可以列举出：烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺酸酯基(例如，烷基磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基等)等，作为所谓的离去基团能与巯基、氨基反应。作为烷基磺酰基，可以列举出：甲磺酰基、氯甲磺酰基、三氟甲磺酰基等，作为芳基磺酰基，例如可以列举出：苯磺酰基、甲苯磺酰基等。另外，作为磺酸酯基，例如可以列举出：甲磺酰基氧基、氯甲磺酰基氧基、三氟甲磺酰基氧基、苯磺酰基氧基、甲苯磺酰基氧基。

作为卡宾生成基团，例如可列举出：含重氮的基团、含Diazirinyl结构的基团等，优选可列举出重氮基与邻接羰基的碳原子键合的基团。由于重氮基脱离而能够生成卡宾且与硫醇键合。另外作为含卡宾的基团，可列举出由各种卡宾生成基团生成卡宾后的基团。

含二硫键的基团和巯基能与半胱氨酸残基的侧链巯基形成二硫键。

环氧基、异氰酸酯基及硫代异氰酸酯基能与巯基和氨基这两者反应。

A的数量即作为a优选2以上的整数。若A为2以上且侧链反应性官能团为2以上，则能使多肽链环化。经环化的多肽链能够进一步提高稳定性等。

上述式中，B表示连接基团或单键。作为连接基团的B，可以列举出：含杂原子的极性基团、脂肪族烃基及芳香族环。

作为含杂原子的极性基团，可以列举出：-O-、-S-、-NR¹-(式中，R¹表示氢原子、烃基(优选为C_1-6烷基)或连接基团末端的原子键。需要说明的是，R为原子键时，连接基团的价数为3(以下同样))、-CO-、-COO-、-CONR²-(式中，R²为氢原子、烃基(优选为C_1-6烷基)或连接基团末端的原子键)、-C(＝N-R³)-(式中，R³表示包含选自由任选具有取代基的链状或环状的脂肪族烃基、任选具有取代基的芳香族环基或含杂原子的基团、及用于附加某种功能的功能性基团组成的组中的至少1种以上的基团、氢原子或连接基团末端的原子键)、-N＝N-、及-SO₂-。

作为脂肪族烃基，可以是直链亚烷基、支链亚烷基及环状链亚烷基中的任一种，例如可以列举出C_1-20亚烷基，优选C_1-10亚烷基、更优选C_1-6亚烷基或C_1-4亚烷基、更进一步优选C_2-4亚烷基。在该脂肪族烃基的碳原子间或末端任选插入上述含杂原子的极性基团，另外任选具有取代基。作为取代基，可以列举出：卤代基、芳基、羧基、烷氧羰基或羟基。作为芳基，优选C_6-10芳基、更优选苯基或萘基、优选苯基。取代基数只要能取代就没有特别限制，例如可以为1个以上且4个以下，优选3个以下或2个以下、优选1个。取代基数为2个以上时，这些取代基任选彼此相同或不同。

作为芳香族环基，优选苯基、茚基、萘基、联苯基等C_6-10芳基、更优选苯基或萘基、优选苯基。芳香族环基任选具有取代基，作为取代基，可以列举出：卤代基、烷基、优选为C_1-6烷基、芳烷基、优选为苄基、羧基、烷氧羰基、优选为(C_1-6烷氧基)羰基、羟烷基、优选为羟基-C_1-6烷基或羧烷基、优选为羧基-C_1-6烷基。取代基数只要能取代就没有特别限制，例如可以为1个以上且4个以下，优选3个以下或2个以下、优选1个。取代基数为2以上时，这些取代基任选彼此相同或不同。

前述连接基团B优选具有-B1-单元、-B2-单元、-B2-B1-单元或-B2-B1-B3-单元。B1是单独具有或组合具有选自在碳原子之间任选插入含杂原子的极性基团且任选具有取代基的链状或环状的脂肪族烃基、及任选具有取代基的芳香族环中的1种以上的基团，B2和B3分别独立地为含杂原子的极性基团，B1或B2与前述A键合。此处，含杂原子的极性基团和取代基具有与前述相同的含义。

作为含杂原子的基团，可以列举出：-O-、-S-、-NR³-(式中，R³表示氢原子、烃基(优选为C_1-6烷基)或连接基团末端的原子键。需要说明的是，R为原子键时，连接基团的价数为3(以下同样))、-CO-、-COO-、-CONR⁴-(式中，R⁴为氢原子、烃基(优选为C_1-6烷基)或连接基团末端的原子键)、-N＝N-、及-SO₂-。

上述式中，C表示用于使多肽附加某种功能的功能性基团。该功能性基团只要根据使用目的等适宜选择即可，没有特别限制，例如除了使多肽环化的连接体化合物之外可列举出：荧光物质等发光物质、色素、放射性物质、药剂、毒素、核酸、氨基酸、肽、糖类、脂质、及各种聚合物等以及它们的组合。作为荧光物质，例如可以列举出：荧光素类、罗丹明类、香豆素类、芘类、及花青类的荧光色素。

作为具体的修饰试剂，例如可以列举出下述式子所示的任一种。

(式中，A、B1、B2、B3与前述相同。n表示1以上的整数。B1、B2、B3中任意一个或多个上任选键合有1个以上前述C)

需要说明的是，前述式(1a)～(1f)所示的化合物具有功能性基团C(包含荧光色素、标记单元中任一种的基团)，功能性基团C与B1、B2、B3中的任一者键合。另外，为了提高水溶性而任选具有磺酸基(-SO₂-OH)、磺酸盐基(-SO₂-O-M⁺)等水溶性取代基。作为M⁺，可以列举出：钠离子、钾离子等碱金属离子。

式(1a)的具体例中包含例如：A为卤代烷基、活化羰基(特别是活化酯基)或环氧基团，B1为脂肪族烃基或芳香族环，n为2或3的化合物；尤其包含下述式子所示的化合物。

式(1b)的具体例中包含：A为卤代烷基，B2为含有氧原子的极性基团(特别是-CO-)或含有氮原子的极性基团(特别是-C(＝N-R⁵)-(式中，R⁵表示包含选自由任选具有取代基的链状或环状的脂肪族烃基、任选具有取代基的芳香族环基或含杂原子的基团、及用于附加某种功能的功能性基团组成的组中的至少1种以上的基团、氢原子或连接基团末端的原子键)，n为2的化合物；尤其包含下述式子所示的化合物。

式(1c)的具体例中包含：A为卤代烷基或活化羰基(特别是活化酯基)，B1为脂肪族烃基、在碳原子之间插入了氧原子的脂肪族烃基或芳香族环，B2为含有氧原子、氮原子等的极性基团(特别是-COO-、-CONH-)，n为1、2或3的化合物；尤其包含下述式子所示的化合物。

式(1d)的具体例中包含：A为卤代烷基，B1为脂肪族烃基，B2为含有氧原子和氮原子的极性基团(特别是-CONH-)，n为3的化合物；尤其包含下述式子所示的化合物。

式(1e)的具体例中包含：A为卤代烷基，B1为芳香族环，B2、B3为含有氧原子、氮原子等的极性基团(特别是-COO-、-N＝N-等)，n为2的化合物；尤其包含由下述式子所示的化合物。

用于修饰RD复合体中的多肽链的条件可以根据需要修饰的侧链反应性官能团的种类和所使用的修饰试剂来进行适宜设定。例如，在需要修饰半胱氨酸残基的侧链巯基时，通过还原剂来切断二硫键而形成巯基后，与修饰试剂反应即可。作为还原剂，例如可列举出：三(2-羧乙基)膦钠盐、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等。

另外，在使修饰试剂的卤代烷基、环氧基等与侧链氨基反应时，任选添加碱。作为碱，例如可以示例出：碳酸氢钠等碳酸氢盐；碳酸钠等碳酸盐；氢氧化钠等金属氢氧化物；吡啶、三乙胺等有机碱等。

作为使修饰试剂反应时的反应溶剂，通常可使用水。另外反应温度例如为0～30℃左右、优选为1～20℃左右、更优选为1～10℃左右。

修饰试剂反应时的pH根据所使用的修饰试剂等进行适宜调节即可，没有特别限制，例如可以选自4.0～10.0左右的范围、优选为5.0～9.0左右、更优选为6.0～8.0左右。更优选的范围根据修饰试剂不同而异，但从抑制每一多肽链的修饰试剂导入数为2个以上的观点出发，可以将pH调节为7.0～7.5。

修饰试剂的量可以根据试剂的种类进行适宜设定，例如，相对于包含未修饰多肽链的核糖体复合体1摩尔，例如为1000摩尔以上、优选为10000摩尔以上，更优选为60000摩尔以上，更进一步优选为100000摩尔以上。其上限没有特别限定，例如，100000000摩尔以下，优选为50000000摩尔以下，更优选为20000000摩尔以下，更进一步优选为10000000摩尔以下。

修饰多肽链后，可以利用常规方法对RD复合体进行纯化。例如，多肽链中存在FLAG(注册商标)序列、聚His序列等标签序列时，可以使用与这些序列对应的公知的纯化方法。需要说明的是，在使修饰试剂反应之前，可以使结合有对标签序列特异的抗体的载体与RD复合体亲和性结合。该亲和性结合在修饰试剂反应期间不会被切断，而在修饰试剂反应后则可以利用该亲和性结合对RD复合体进行纯化。

利用上述本发明方法制造的RD复合体包含多肽链、mRNA分子和核糖体，通过该多肽链中的选自由半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基和色氨酸残基组成的组中的1种以上反应性氨基酸残基被所使用的修饰试剂修饰，该mRNA分子包含编码上述多肽链的氨基酸序列的碱基序列。在该RD复合体具有前述式(1)、(1a)～(1e)中、基团A被置换为作为其反应结果的基团Ax(Ax是与半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基的侧链反应而形成的键合基团)的结构，从该点出发就可以与非修饰的RD复合体区分开。

本申请主张基于2016年6月7日申请的日本专利申请第2016-113935号的优先权。2016年6月7日申请的日本专利申请第2016-113935号的说明书的全部内容作为参考引用至本申请中。

实施例

以下，列举实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明不受下述实施例的限制，并且不用说可以在符合前/后述内容的范围内进行适当变更地加以实施，这些实施例均包括在本发明的技术的范围内。

实施例1

(1)RNA文库的制作

该(1)项目中，对于使用NNK法制作包含10¹²以上的RNA的RNA文库的方法进行说明，所述RNA具有包含(NNK)₁₀[式中，N表示A、U、G或C，K表示G或U，NNK对应于所有的密码子]序列的序列。

为了制作该RNA文库，使用具有图1的结构的模板DNA(碱基序列：序列号1，氨基酸序列：序列号2)。具体而言，使用具有表1所示的组成的反应液，在表2的PCR循环中将质粒作为模板DNA制备了5’片段。表1中，5FFnew_130816为正向引物，Ma3frag_R0502为反向引物。

[表1]

[表2]

接着，使用具有表3所示的组成的反应液，按照表4的PCR循环制备了模板DNA的3’片段。表3中，Ma10NNK_F0502为正向引物，3F-R为反向引物。

[表3]

[表4]

接着，使用具有表5所示的组成的反应液，按照表6的PCR循环进行重叠PCR(overlapping PCR)，连接上述5’片段和3’片段，扩增全长而得到模板DNA。需要说明的是，表5中，X～Z表示使用1×10¹²的5’片段和3’片段，在反应液中加入H₂O并将总量调节为60μL。

[表5]

[表6]

通过将得到的上述模板DNA作为模板，使用具有表7所示的组成的反应液，在37℃下反应5小时，从而得到包含具有序列号3的碱基序列的10¹²以上的mRNA的RNA文库。该文库中所含的mRNA如图1所示从5’侧起依次具有FLAG(注册商标)位点、His6位点、随机序列、TEV蛋白酶位点、间隔序列，不具有终止密码子。

[表7]

(2)核糖体展示复合体文库的制作

使用重组型无细胞蛋白合成试剂盒(GeneFrontier Corporation制“PURE frex(注册商标)”)，基于上述RNA文库制备了核糖体展示(RD)复合体。另行将链亲合素-磁性颗粒(“NanoLink ^TM Streptavidin MagneticBeads”Solulink公司制)5μL稀释至150μL。混合上述RD复合体反应液和抗FLAG(注册商标)M2抗体结合琼脂糖珠(Sigma-Aldrich公司制，20μL)，在4℃下搅拌60分钟。回收了在肽部分选择性结合了具有FLAG序列的RD复合体的抗FLAG M2抗体结合琼脂糖珠。

(3)肽的环化反应

将上述回收的琼脂糖珠稀释至80μL后，添加作为还原剂的10mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(4μL)(最终浓度0.5mM)和作为修饰试剂的40mM 1,3-二溴-2-丙酮(4μL)(最终浓度2mM)，在4℃下进行3小时环化反应。需要说明的是，此时还原剂的添加不是必须的。在环化反应后通过添加FLAG肽而从琼脂糖珠中分离了RD复合体。

(4)HSP90亲和性肽的选择

另行在上述链亲合素-磁性颗粒稀释液(5μL)中以摩尔比为1：1的方式混合使生物素与作为热休克蛋白质的HSP90结合而成的物质，在4℃下搅拌而使HSP90与磁性颗粒结合。另外，为了进行比较而未结合HSP90，除此以外同样地制备了磁性颗粒悬浮液。

混合上述(3)中得到的肽环化RD复合体溶液和磁性颗粒悬浮液，在4℃下搅拌1小时。使用磁力架回收磁性颗粒，并加入0.05M的EDTA，由此从与磁性颗粒上的HSP90结合的RD复合体中分离了RNA。使用磁力架去除磁性颗粒后，使用RNA浓缩/纯化试剂盒(QIAGEN公司制“RNeasy MinElute Cleanup Kit”)对RNA进行了纯化。接着，以表8所示的组成在65℃下反应5分钟后，针对该反应液，以表9所示的组成在50℃下反应1小时、进而在70℃下反应15分钟，由此进行了逆转录。

[表8]

[表9]

将上述逆转录反应中得到的cDNA用于RT-PCR，扩增了包含随机序列的序列。具体而言，使用表10所示的组成的反应液，通过表11的PCR循环进行了PCR。

[表10]

[表11]

另行，在上述(1)中，将PCR循环中在68℃下的加热时间变更为15秒，除此以外同样地制备了5’片段(序列号6)，另外，作为正向引物使用3fragF_140407、并且将PCR循环中在68℃下的加热时间变更为25秒，除此以外同样地制备了3’片段(序列号7)。接着，除了使用得到的5’片段和3’片段之外使用包含上述随机序列的cDNA溶液，且将聚合酶的用量变更为0.6μL，除此以外同样地进行，通过重叠PCR连接各片段，扩增了得到的DNA。

使用得到的DNA，与前述(1)同样地转录mRNA，返回前述(2)“核糖体展示复合体文库的制作”工序，以下，与上述同样地回收了具有与HSP90亲和性的RD复合体。重复以上的操作直至确认与HSP90结合的RD复合体中所含的mRNA量不再增加为止。以下将1次重复称为“轮(round)”。在第1～3轮中，将RD复合体与所使用的HSP90的摩尔比调节为RD复合体：HSP90＝3：1，在第4～5轮中将该摩尔比调节为10：1。将结果连同与HSP90接触之前的mRNA量和未使用HSP90时的mRNA量一起示于图2。如图2所示的结果那样，与HSP90结合的RD复合体与第1轮相比在第2轮增加，但第2轮之后未观察到增加，可认为完成了具有对HSP90的亲和性的RD复合体的浓缩。

(5)HSP90亲和性肽的鉴定

将确认了序列浓缩的轮的全长链DNA作为模板，使用Taq聚合酶进行PCR，由此在末端添加了A。使用该突出末端和克隆试剂盒(Promega公司制“pGEM T Easy Cloning Kit”)连接在附属的质粒DNA上。使用得到的质粒对JM109感受态细胞进行转化、培养。使用从通过培养而形成的集落中提取的各克隆的质粒对上述全长链DNA的氨基酸序列进行了解析。将得到的氨基酸序列中的、随机部分(NNK部分)的序列示于表12。

[表12]

如表12所示，利用本发明的筛选方法能够从包含10¹²以上mRNA的文库中选择编码与HSP90具有亲和性的肽的16种肽，另外，证实了所选择的肽的氨基酸序列类似。

(6)获得的序列的结合能力的确认

进行了通过上述(5)获得的各克隆与HSP90的亲和性的确认。具体而言，将通过上述(5)合成的各克隆的全长DNA作为模板，与上述(1)同样地合成RNA，与上述(2)同样地制作了核糖体展示复合体。另外，将其一部分多肽与上述(3)同样地环化。与上述(4)同样地研究了得到的各核糖体展示复合体与HSP90的亲和性。通过对回收的复合体的量进行定量，由此求出各克隆与HSP90的亲和性。将结果示于图3。图3中的字母相当于上述表12中的序列记号。

如图3所示的结果所示，在研究了与HSP90的亲和性的核糖体展示复合体中，3种多肽对HSP90显示出亲和性，对于其中的2种，启示出在连接了修饰试剂的环状态下键合增强10倍以上。由这些结果表明，能够在维持RD复合体的功能的状态下使呈递在RD复合体上的多肽与修饰试剂连接。另外，根据修饰试剂的有无而能够获得亲和性为6倍左右的克隆。即，启示出通过将多肽环化而使与HSP90的亲和性增加，显示出连接修饰试剂的有用性。

实施例2：肽的环化反应

使用重组型无细胞蛋白合成试剂盒(GeneFrontier Corporation制“PURE frex(注册商标)”)，在反应液50μL中混合具有FLAG序列、His6序列及编码TEV蛋白酶位点的碱基序列的RNA(序列号8)2.5×10¹³分子，在37℃下反应35分钟，由此制作RD复合体，在反应液中加入抗FLAG(注册商标)M2抗体结合琼脂糖珠(Sigma-Aldrich公司制，2μL)并与RD复合体结合。进而，加入作为还原剂的三(2-羧乙基)钠盐(pH7，最终浓度0.5mM)和图4所示的最终浓度2mM的各修饰试剂，在4℃下搅拌3小时，由此在珠上使RD复合体中的肽环化。反应后，通过加入FLAG肽(序列：DYKDDDDK，5mg)而使RD复合体从珠上游离。从反应液中分离去除珠，加入不包含Mg²⁺的磷酸缓冲生理盐水(pH7.5，100μL)使复合体解离后，通过His-tag珠使肽链纯化。用TEV蛋白酶切断纯化的多肽后，通过MALDI-TOFMS测定包含环化部位且N末端被甲酰化的片段肽(序列号9)的分子量。将修饰试剂的化学结构和得到的质谱图示于图4。图4中，图4的(a)是未添加修饰试剂的反应液的质谱图，图4的(e)是除了未使用RNA以外同样进行了反应的反应液的质谱图且示出背景的信号。另外，白色箭头表示未环化肽链的峰，黑色箭头表示环化肽链的峰。

如图4所示的结果所示可知，作为修饰试剂使用了1,3-二溴-2-丙酮的情况(b)与使用了1,3-双(溴甲基)苯的情况(c)进行了环化反应。作为修饰试剂使用了1,5-六氮苯二环氧化物的情况(d)、反应效率相对较低但能够确认为环状化合物，因此可认为环氧化物也可用作环化试剂。

需要说明的是，在各质谱图中，明确地观察到所使用的修饰试剂增加了1个分子的分子量的峰，另一方面，未明确地观察到增加了2个以上分子的分子量的峰。根据上述结果，可认为修饰试剂仅1个分子与多肽链键合。

实施例3：肽的环化反应

作为RNA使用具有序列号10的碱基序列的RNA，作为修饰试剂使用图5所示的物质，除此以外与上述实施例2同样地进行了环化反应。将结果示于图5。

如图5所示，明确了马来酰亚胺型修饰试剂(图5的(b))和卤代乙酰氨基型修饰试剂化合物(图5的(c)、(d))均能用作环化试剂。

在该实验中，各质谱图中也明确地观察到所使用的修饰试剂增加了1个分子的分子量的峰。除此以外也观察到其它峰，但由于与结合了2个以上修饰试剂的RD复合体的计算上的分子量不同，因此可认为是源自无法通过蛋白酶处理去除的核糖体蛋白的物质。根据上述结果，可认为修饰试剂仅1个分子与多肽链键合。

实施例4：肽的环化反应

作为RNA使用具有序列号11碱基序列的RNA，作为修饰试剂使用辛二酸二琥珀酰亚胺酯，将反应液的pH变更为7.4、7.7或8.0，除此以外与上述实施例2同样地进行了环化反应。将反应液的pH为7.4时的结果示于图6，将pH为7.7时的结果示于图7，将pH为8.0时的结果示于图8。

如图6～8所示，在任意pH下均进行了反应。另外，由pH越高修饰试剂进一步添加了1个分子(总计2个分子)的化合物的峰的强度越强，由此启示出修饰试剂中还添加了组氨酸、色氨酸之类的碱性氨基酸。

但是，由于未明确地观察到结合了3个分子以上的修饰试剂的RD复合体的峰，因此在该实验中也可认为1个分子或2个分子的修饰试剂与多肽链键合。

实施例5：肽的环化反应

使用了编码序列号12～14的氨基酸序列的RNA和作为修饰试剂的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，除此以外与上述实施例2同样地进行了环化反应。将序列号12的氨基酸序列的结果示于图9，将序列号13的氨基酸序列的结果示于图10，将序列号14的氨基酸序列的结果示于图11。

如图9～11所示，启示出：具有2个活性羧基的二琥珀酰亚胺基化合物与2个赖氨酸侧链氨基反应而使肽环化，而且启示出也与组氨酸侧链的仲氨基发生了反应。

另外，由于在该实验中反应后的RD复合体的主峰也是结合了1个分子或2个分子的修饰试剂而得到的，因此可认为1个分子或2个分子的修饰试剂与多肽链键合。

实施例6：肽的生物素化反应

使用编码序列号13的肽序列的RNA，作为修饰试剂使用EZ-Link NHS-PEG4-生物素(EZ-Link NHS-PEG4-Biotin)(Thermo Fisher公司制)，除此以外与上述实施例2同样地对肽进行了修饰。如图12所示，得到表明经生物素化的信号。该肽序列包含2个赖氨酸，因此除了检测出1个经生物素化的肽之外(黑箭头)还可以检测出导入了2个生物素的肽(斜线箭头)。由此，可认为在该实验中1个分子或2个分子的修饰试剂与多肽链键合。

实施例7：肽的环化反应及生物素化反应

使用编码序列号12的肽序列的RNA，作为修饰试剂使用1,3-二溴-2-丙酮或EZ-Link NHS-PEG4-生物素(Thermo Fisher公司制)，除此以外与上述实施例2同样地制作了经生物素修饰的RD复合体。在经生物素化的复合体中加入上述链亲合素-磁性颗粒稀释液(5μL)，使用磁力架回收了磁性颗粒。通过在回收的磁性颗粒中加入0.05M的EDTA，由此从与磁性颗粒上的HSP90结合的RD复合体中解离RNA。使用磁力架去除磁性颗粒后，通过RNA浓缩/纯化试剂盒(QIAGEN公司制“RNeasy MinElute Cleanup Kit”)对RNA进行纯化。通过定量RT-PCR测定利用各修饰试剂修饰时的RNA回收量，将在无修饰试剂下进行的条件下的回收量作为背景(background)，相对地进行了比较。将结果示于图13。如图13所示的结果所示，得到启示出用NHS-PEG4-生物素对RD复合体进行生物素化而能够回收RNA的结果。

实施例8：修饰条件的比较

(1)条件1

使用重组型无细胞蛋白合成试剂盒(GeneFrontier Corporation制“PURE frex(注册商标)”)，在反应液50μL中所含的核糖体加入作为还原剂的三(2-羧乙基)钠盐(pH7，最终浓度0.5mM)和作为修饰试剂的最终浓度2mM的1,3-二溴-2-丙酮，在4℃下反应3小时。接着，加入上述重组型无细胞蛋白合成试剂盒的核糖体除外的因子(反应液50μL所需量)和RNA(序列号8)2.5×10¹²分子并进行混合，在37℃下反应35分钟，由此进行了RD复合体的制备。在该反应液中加入抗FLAG(注册商标)M2抗体结合琼脂糖珠(Sigma-Aldrich公司制，2μL)，使之结合RD复合体。此处不添加任何物质，在4℃下搅拌3小时。搅拌后加入FLAG肽(序列：DYKDDDDK，5mg)而从使RD复合体从珠上游离。通过定量RT-PCR求出得到的RD复合体的量。将结果示于图14。

(2)条件2

条件2中，与上述实施例同样地制作RD复合体后使修饰试剂发挥作用。具体而言，使用上述重组型无细胞蛋白合成试剂盒，对于反应液50μL中所含的核糖体不添加修饰试剂且在4℃下进行3小时孵育。接着，通过与条件1同样的操作制备RD复合体，在该反应液中加入抗FLAG(注册商标)M2抗体结合琼脂糖珠(Sigma-Aldrich公司制，2μL)使之结合RD复合体。进而，加入作为还原剂的三(2-羧乙基)钠盐(pH7，最终浓度0.5m M)和作为修饰试剂的最终浓度2mM的1,3-二溴-2-丙酮，通过在4℃下搅拌3小时而进行了在珠上的RD复合体的修饰。需要说明的是，添加的修饰试剂(1,3-二溴-2-丙酮)的量相对于RD复合体1摩尔为1000000倍摩尔。反应后，通过加入FLAG肽(序列：DYKDDDDK，5mg)而使RD复合体从珠上游离。通过定量RT-PCR求出得到的RD复合体的量。将结果示于图14。

如图14所示的结果所示，表明了即使在使修饰试剂作用于核糖体后制作RD复合体，也未得到RD复合体。相对于此，即使使修饰试剂作用于RD复合体，得到的RD复合体也不会发生分解等。另外，根据上述实施例的结果，可认为修饰试剂至少与RD复合体中的肽发生了反应。

序列表

<110> 株式会社钟化（KANEKA CORPORATION）

<120> 核糖体展示复合体及其制造方法（RIBOSOME DISPLY COMOPLEX ANDPRODUCTION METHOD THEREOF）

<130> B160242

<150> JP 2016-113935

<151> 2016-06-07

<160> 14

<210> 1

<211> 707

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<221> CDS

<222> 201..230

<223> K表示任何碱基

<223> N表示G或T

<400> 1

AAGCTTGGTA CCGAGCTCGG ATCCACTAGT AACGGCCGCC AGTGTGCTGG AATTCGCCCT 60

TGAAATTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACAACGGTT TCCCTCTAGA AATAATTTTG 120

TTTAACTTTA AGAAGGAGAT ATACCAATGG ACTATAAAGA TGACGATGAC AAAGGTCACC 180

ATCATCACCA TCACGGTTGC NNKNNKNNKN NKNNKNNKNN KNNKNNKNNK TGCGGCGAAA 240

ACCTGTATTT CCAGGGCGGT GCAGGTGGCA GCGGAGGTGG TGGCAGCGGA GGTGAATATC 300

AAGGCCAATC GTCTGACCAG AAGCAAGCTG AAGAGGCGGC AGCGAAAGCG GCGGCAGATG 360

CTAAAGCGAA GGCCGAAGCA GATGCTAAAG CTGCGGAAGA AGCAGCGAAG AAAGCGGCTG 420

CAGACGCAAA GAAAAAAGCA GAAGCAGAAG CCGCCAAAGC CGCAGCCGAA GCGCAGAAAA 480

AAGCCGAGGC AGCCGCTGCG GCACTGAAGA AGAAAGCGGA AGCGGCAGAA GCAGCTGCAG 540

CTGAAGCAAG AAAGAAAGCG GCAACTGAAG CTGCTGAAAA AGCCAAAGCA GAAGCTGAGA 600

AGAAAGCGGC TGCTGAAAAG GCTGCAGCTG ATAAGGCAAA ATTCAGCACG CCCGTCTGGA 660

TAAGCCAGGC GCAAGGCATC CGTGCTGGCC CTCAACGCCT CACCTAA 707

<210> 2

<211> 186

<212> PRT

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于文库的设计的肽

<223> Xaa表示任何氨基酸

<400> 2

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly His His His His His His

1 5 10 15

Gly Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Glu Asn

20 25 30

Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Gly Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Gln Lys Gln Ala Glu Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Asp Ala

65 70 75 80

Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Ala Ala Asp Ala Lys Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Ala Glu Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Gln Lys Lys

100 105 110

Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys Lys Ala Glu Ala Ala Glu

115 120 125

Ala Ala Ala Ala Glu Ala Arg Lys Lys Ala Ala Thr Glu Ala Ala Glu

130 135 140

Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Lys Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ala

145 150 155 160

Ala Asp Lys Ala Lys Phe Ser Thr Pro Val Trp Ile Ser Gln Ala Gln

165 170 175

Gly Ile Arg Ala Gly Pro Gln Arg Leu Thr

180 185

<210> 3

<211> 637

<212> RNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<221> CDS

<222> 201..230

<223> K表示任何碱基

<223> N表示G或T

<400> 3

GGGAGACCAC AACGGUUUCC CUCUAGAAAU AAUUUUGUUU AACUUUAAGA GGAGAUAUAC 60

CAAUGGACUA UAAAGAUGAC GAUGACAAAG GUCACCAUCA UCACCAUCAC GGUUGCNNKN 120

NKNNKNNKNN KNNKNNKNNK NNKNNKUGCG GCGAAAACCU GUAUUUCCAG GGCGGUGCAG 180

GUGGCAGCGG AGGUGGUGGC AGCGGAGGUG AAUAUCAAGG CCAAUCGUCU GACCAGAAGC 240

AAGCUGAAGA GGCGGCAGCG AAAGCGGCGG CAGAUGCUAA AGCGAAGGCC GAAGCAGAUG 300

CUAAAGCUGC GGAAGAAGCA GCGAAGAAAG CGGCUGCAGA CGCAAAGAAA AAAGCAGAAG 360

CAGAAGCCGC CAAAGCCGCA GCCGAAGCGC AGAAAAAAGC CGAGGCAGCC GCUGCGGCAC 420

UGAAGAAGAA AGCGGAAGCG GCAGAAGCAG CUGCAGCUGA AGCAAGAAAG AAAGCGGCAA 480

CUGAAGCUGC UGAAAAAGCC AAAGCAGAAG CUGAGAAGAA AGCGGCUGCU GAAAAGGCUG 540

CAGCUGAUAA GGCAAAAUUC AGCACGCCCG UCUGGAUAAG CCAGGCGCAA GGCAUCCGUG 600

CUGGCCCUCA ACGCCUCACC UAAUGAAUAA CUAAUCC 637

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 4

CAAAGGTCAC CATCATCACC ATCACGGTTG C 31

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 5

TGCACCGCCC TGGAAATACA GGTTTTCGCC GCA 33

<210> 6

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 5'片段

<400> 6

AAGCTTGGTA CCGAGCTCGG ATCCACTAGT AACGGCCGCC AGTGTGCTGG AATTCGCCCT 60

TGAAATTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACAACGGTT TCCCTCTAGA AATAATTTTG 120

TTTAACTTTA AGAAGGAGAT ATACCAATGG ACTATAAAGA TGACGATGAC AAAGGTCACC 180

ATCATCACCA TCACGGTTGC 200

<210> 7

<211> 491

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 3'片段

<400> 7

TGCGGCGAAA ACCTGTATTT CCAGGGCGGT GCAGGTGGCA GCGGAGGTGG TGGCAGCGGA 60

GGTGAATATC AAGGCCAATC GTCTGACCAG AAGCAAGCTG AAGAGGCGGC AGCGAAAGCG 120

GCGGCAGATG CTAAAGCGAA GGCCGAAGCA GATGCTAAAG CTGCGGAAGA AGCAGCGAAG 180

AAAGCGGCTG CAGACGCAAA GAAAAAAGCA GAAGCAGAAG CCGCCAAAGC CGCAGCCGAA 240

GCGCAGAAAA AAGCCGAGGC AGCCGCTGCG GCACTGAAGA AGAAAGCGGA AGCGGCAGAA 300

GCAGCTGCAG CTGAAGCAAG AAAGAAAGCG GCAACTGAAG CTGCTGAAAA AGCCAAAGCA 360

GAAGCTGAGA AGAAAGCGGC TGCTGAAAAG GCTGCAGCTG ATAAGGCAAA ATTCAGCACG 420

CCCGTCTGGA TAAGCCAGGC GCAAGGCATC CGTGCTGGCC CTCAACGCCT CACCTAATGA 480

ATAACTAATC C 491

<210> 8

<211> 661

<212> RNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<221> CDS

<223> 设计的RNA，以编码对HSP90具有亲和力的肽

<400> 8

GGGAGACCAC AACGGUUUCC CUCUAGAAAU AAUUUUGUUU AACUUUAAGA AGGAGAUAUA 60

CCAAUGGACU AUAAAGAUGA CGAUGACAAA GGUCACCAUC AUCACCAUCA CGGUUGCAAG 120

CGUCUGCGGG GGCCAUGGGA GUGGCUGAGG UGCGGCGAAA ACCUGUAUUU CCAGGGCGGU 180

GCAGGUGGCA GCGGAGGUGG UGGCAGCGGA GGUGAAUAUC AAGGCCAAUC GUCUGACCAG 240

AAGCAAGCUG AAGAGGCGGC AGCGAAAGCG GCGGCAGAUG CUAAAGCGAA GGCCGAAGCA 300

GAUGCUAAAG CUGCGGAAGA AGCAGCGAAG AAAGCGGCUG CAGACGCAAA GAAAAAAGCA 360

GAAGCAGAAG CCGCCAAAGC CGCAGCCGAA GCGCAGAAAA AAGCCGAGGC AGCCGCUGCG 420

GCACUGAAGA AGAAAGCGGA AGCGGCAGAA GCAGCUGCAG CUGAAGCAAG AAAGAAAGCG 480

GCAACUGAAG CUGCUGAAAA AGCCAAAGCA GAAGCUGAGA AGAAAGCGGC UGCUGAAAAG 540

GCUGCAGCUG AUAAGGCAAA AUUCAGCACG CCCGUCUGGA UAAGCCAGGC GCAAGGCAUC 600

CGUGCUGGCC CUCAACGCCU CACCUAAUGA AUAACUAAUC CAAUCGAAUU CCCGCGGCCG 660

C 661

<210> 9

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<221> 甲酰化

<222> 1

<223> 肽片段

<400> 9

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly His His His His His His

1 5 10 15

Gly Cys Lys Arg Leu Arg Gly Pro Trp Glu Trp Leu Arg Cys Gly Glu

20 25 30

Asn Leu Tyr Phe Gln

35

<210> 10

<211> 638

<212> RNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<221> CDS

<223> 设计的RNA，以编码对HSP90具有亲和力的肽

<400> 10

GGGAGACCAC AACGGUUUCC CUCUAGAAAU AAUUUUGUUU AACUUUAAGA AGGAGAUAUA 60

CCAAUGGACU AUAAAGAUGA CGAUGACAAA GGUCACCAUC AUCACCAUCA CGGUUGCUGG 120

GUGUUCCGUU GGGGCAAGUG GUCUGCGUGC GGCGAAAACC UGUAUUUCCA GGGCGGUGCA 180

GGUGGCAGCG GAGGUGGUGG CAGCGGAGGU GAAUAUCAAG GCCAAUCGUC UGACCAGAAG 240

CAAGCUGAAG AGGCGGCAGC GAAAGCGGCG GCAGAUGCUA AAGCGAAGGC CGAAGCAGAU 300

GCUAAAGCUG CGGAAGAAGC AGCGAAGAAA GCGGCUGCAG ACGCAAAGAA AAAAGCAGAA 360

GCAGAAGCCG CCAAAGCCGC AGCCGAAGCG CAGAAAAAAG CCGAGGCAGC CGCUGCGGCA 420

CUGAAGAAGA AAGCGGAAGC GGCAGAAGCA GCUGCAGCUG AAGCAAGAAA GAAAGCGGCA 480

ACUGAAGCUG CUGAAAAAGC CAAAGCAGAA GCUGAGAAGA AAGCGGCUGC UGAAAAGGCU 540

GCAGCUGAUA AGGCAAAAUU CAGCACGCCC GUCUGGAUAA GCCAGGCGCA AGGCAUCCGU 600

GCUGGCCCUC AACGCCUCAC CUAAUGAAUA ACUAAUCC 638

<210> 11

<211> 652

<212> RNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<221> CDS

<223> 设计的RNA，以编码对HSP90具有亲和力的肽

<400> 11

GGGAGACCAC AACGGUUUCC CUCUAGAAAU AAUUUUGUUU AACUUUAAGA AGGAGAUAUA 60

CCAAUGGACU AUAAAGAUGA CGAUGAUAAG GGCUGUGCGG GGCGUUGGAA UGUUCUGUGG 120

AGGACGUAUA CUUAUAUGCA CUGUGGUGAG AAUCUCUACU UUCAAGGUGG CGCCGGUGGC 180

AGCGGAGGUG GUGGCAGCGG AGGUGAAUAU CAAGGCCAAU CGUCUGACCA GAAGCAAGCU 240

GAAGAGGCGG CAGCGAAAGC GGCGGCAGAU GCUAAAGCGA AGGCCGAAGC AGAUGCUAAA 300

GCUGCGGAAG AAGCAGCGAA GAAAGCGGCU GCAGACGCAA AGAAAAAAGC AGAAGCAGAA 360

GCCGCCAAAG CCGCAGCCGA AGCGCAGAAA AAAGCCGAGG CAGCCGCUGC GGCACUGAAG 420

AAGAAAGCGG AAGCGGCAGA AGCAGCUGCA GCUGAAGCAA GAAAGAAAGC GGCAACUGAA 480

GCUGCUGAAA AAGCCAAAGC AGAAGCUGAG AAGAAAGCGG CUGCUGAAAA GGCUGCAGCU 540

GAUAAGGCAA AAUUCAGCAC GCCCGUCUGG AUAAGCCAGG CGCAAGGCAU CCGUGCUGGC 600

CCUCAACGCC UCACCUAAUG AAUAACUAAU CCAGUCACGU AUCGAGUCAU GC 652

<210> 12

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 设计的对HSP90具有亲和力的肽

<400> 12

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Cys Val Arg Leu Trp Val

1 5 10 15

Arg Phe Arg Gly Leu Arg Trp Arg Leu Tyr Cys Gly Glu Asn Leu Tyr

20 25 30

Phe Gln

<210> 13

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 设计的对HSP90具有亲和力的肽

<400> 13

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Cys Leu Ser Arg Leu Ala

1 5 10 15

Tyr Arg Pro Trp Tyr Leu Cys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

20 25 30

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 设计的对HSP90具有亲和力的肽

<400> 14

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Cys Leu Ile Leu Pro Tyr

1 5 10 15

Ser His Thr Gly Trp Gln Cys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

20 25 30

Claims

1.一种核糖体展示复合体的制造方法，其特征在于，其是用于制造包含多肽链、mRNA分子和核糖体的核糖体展示复合体的方法，

所述mRNA分子包含编码所述多肽链的氨基酸序列的碱基序列，

所述方法包括如下工序：

2.根据权利要求1所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述修饰试剂是下述式(1)所示的化合物，

3.根据权利要求2所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述A为卤代烷基、活化羰基、不饱和烃基、环氧基、含磺酰基的基团、异氰酸酯基、硫代异氰酸酯基、卡宾生成基团、含卡宾的基团、含二硫键的基团或巯基。

4.根据权利要求2或3所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述连接基团B是单独具有或组合具有选自含杂原子的极性基团、在碳原子之间任选插入含杂原子的极性基团且任选具有取代基的链状或环状的脂肪族烃基、及任选具有取代基的芳香族环中的1种以上的基团，

5.根据权利要求4所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，

所述连接基团B具有-B1-单元、-B2-单元、-B2-B1-单元或-B2-B1-B3-单元，

B2和B3分别独立地为含杂原子的极性基团，

B1或B2与所述A键合，

含杂原子的极性基团和取代基与前述含义相同。

6.根据权利要求5所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，

所述修饰试剂由下述式中的任一者表示，

7.根据权利要求2～6中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述A为卤代烷基时，该卤代基所键合的碳原子为羰基的α位的碳原子或与芳香族环直接键合的碳原子。

8.根据权利要求2～7中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述多肽链包含选自由半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基组成的组中的2种以上的反应性氨基酸残基，

在所述式(1)的修饰试剂中a为2以上，

9.根据权利要求1～8中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述多肽链由100～5000个氨基酸残基构成。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，在所述多肽链的从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置具有所述反应性氨基酸残基。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述多肽链在从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置包含1～30个氨基酸残基的随机序列。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的核糖体展示复合体的制造方法，其中，所述核糖体为源自大肠杆菌的核糖体。

13.一种核糖体展示复合体，其特征在于，其包含多肽链、mRNA分子和核糖体，

所述mRNA分子包含编码所述多肽链的氨基酸序列的碱基序列。

14.根据权利要求13所述的核糖体展示复合体，其中，所述侧链反应性官能团的修饰结构是由下述式(2)所示的化学结构，

15.根据权利要求14所述的核糖体展示复合体，其中，所述Ax是卤代烷基、活化羰基、不饱和烃基、环氧基、含磺酰基的基团、异氰酸酯基、硫代异氰酸酯基、卡宾生成基团、含卡宾的基团、含二硫键的基团或巯基、与半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基的侧链所形成的化学键。

16.根据权利要求15所述的核糖体展示复合体，其中，所述连接基团B是单独具有或组合具有选自含杂原子的极性基团、在碳原子之间任选插入含杂原子的极性基团且任选具有取代基的链状或环状的脂肪族烃基、及任选具有取代基的芳香族环中的1种以上的基团，

17.根据权利要求16所述的核糖体展示复合体，其中，所述连接基团B具有-B1-单元、-B2-单元、-B2-B1-单元或-B2-B1-B3-单元，

B2和B3分别独立地为含杂原子的极性基团，

18.根据权利要求17所述的核糖体展示复合体，其中，所述修饰结构由下述式表示，

19.根据权利要求14～18中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述Ax是卤代烷基、与半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基或色氨酸残基的侧链所形成的化学键时，该卤代基所键合的碳原子为羰基的α位的碳原子或与芳香族环直接键合的碳原子。

20.根据权利要求14～19中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述多肽链包含选自由半胱氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基和色氨酸残基组成的组中的2种以上的反应性氨基酸残基，

在所述式(2)的修饰结构中a为2以上，

由多肽链和式(2)的修饰结构形成了环。

21.根据权利要求13～20中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述多肽链由100～5000个氨基酸残基构成。

22.根据权利要求13～21中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，在所述多肽链的从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置具有所述反应性氨基酸残基。

23.根据权利要求13～22中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述多肽链在从N末端起第2位～从C末端起第30位的位置包含1～30个氨基酸残基的随机序列。

24.根据权利要求13～23中任一项所述的核糖体展示复合体，其中，所述核糖体为源自大肠杆菌的核糖体。