JP6057297B2 - 核酸構築物、核酸−蛋白質複合体、及びその利用 - Google Patents
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Description
[1] 5’−非翻訳領域およびコード領域を含む核酸構築物であって、前記コード領域が提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列および第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、前記5’−非翻訳領域が第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含み、翻訳系に導入されたときに、前記核酸構築物のコード領域から翻訳される融合蛋白質が、前記第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合によって、前記核酸構築物に対応するRNAと複合体を形成する、核酸構築物。
[2]第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがboxB-associating peptide (Bap)およびCv-associating peptide (Cvap)ダイマーであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびCv配列である、[1]に記載の核酸構築物。
[3]第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびRevであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびapI配列またはapII配列である、[1]に記載の核酸構築物。
[4]第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびBIV Tatであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびBIV TAR配列である、[1]に記載の核酸構築物。
[5]前記5’−非翻訳領域がboxB配列、Cv配列およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Cvapダイマーコード配列およびスペーサーコード配列を含む、[2]に記載の核酸構築物。
[6]前記5’−非翻訳領域がboxB配列、apI配列またはapII配列、およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Revコード配列およびスペーサーコード配列を含む、[3]に記載の核酸構築物。
[7]前記5’−非翻訳領域がboxB配列、BIV TAR配列およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、BIV Tatコード配列およびスペーサーコード配列を含む、[4]に記載の核酸構築物。
[8]前記5’−非翻訳領域がリボソーム結合配列を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸構築物。
[9]提示対象ポリペプチドコード配列がランダムポリペプチドをコードする配列である、[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸構築物。
[10]5’−非翻訳領域およびコード領域を含む核酸構築物と、
前記コード領域から翻訳される融合蛋白質とを含む核酸−蛋白質複合体であって、前記コード領域が、提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列及び第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、
前記5’−非翻訳領域が、第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含み、
前記第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合によって形成される、
核酸−蛋白質複合体。
[11] リボソームを含まない、[10]に記載の核酸−蛋白質複合体。
[12]第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびCvapダイマーであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびCv配列である、[10]または[11]に記載の核酸−蛋白質複合体。
[13]提示対象ポリペプチドコード配列がランダムポリペプチドをコードする配列である、[10]〜[12]のいずれかに記載の核酸−蛋白質複合体。
[14] [1]〜[9]のいずれかに記載の核酸構築物を翻訳系に導入して前記コード領域にコードされる融合蛋白質を発現させ、第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合を介して該融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させることにより、提示対象ポリペプチドを核酸構築物上に提示させることを特徴とする、ポリペプチドを核酸上に提示させる方法。
[15]融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させた後、リボソームを核酸構築物から解離させる工程を含む、[14]に記載の方法。
[16]標的物質に結合するポリペプチド配列を選択する方法であって、次の工程(1)〜(3)を繰り返すことを特徴とする方法。
(1)[9]に記載の核酸構築物からランダムポリペプチドと第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドとの融合蛋白質を発現させ、核酸構築物に対応するRNA上にランダムポリペプチドライブラリーを提示する工程;
(2)標的物質に前記ライブラリーを接触させる工程;および
(3)標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合蛋白質を選択し、選択された融合蛋白質をコードする核酸配列を増幅する工程。
[17]前記工程(1)と(2)の間に、リボソームを核酸構築物から解離させる工程を含む、[16]に記載の方法。
[18] [1]〜[9]のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ポリペプチドを核酸上に提示させるためのキット。
また、本発明の方法によれば、ペプチド-リボソーム-RNA複合体形成後にリボソームを除去しても、ポリペプチドとそれをコードする配列を含む核酸との複合体が維持されるため、リボソームディスプレイ法のもう一つの問題であった「複合体のリボソームと標的分子との立体障害」を完全に解消することができる。これにより、リボソームへの非特異的結合が除けるとともに、これまでに選択できなかったより強力な標的結合性を有するペプチドアプタマーの選択が可能となる。
本発明の核酸構築物は5’−非翻訳領域およびコード領域を含み、コード領域は提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列および第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、5’−非翻訳領域は第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含む。
そして、本発明の核酸構築物は、翻訳系に導入されたときに、前記コード領域から翻訳される融合蛋白質が、該融合蛋白質に含まれる第一の核酸結合性ポリペプチドと第二の核酸結合性ポリペプチドがそれぞれ5’−非翻訳領域の第一の配列および第二の配列に結合することによって、核酸構築物に対応するRNAと複合体を形成する。
第一の配列と第二の配列の間は3〜15塩基であることが蛋白質-RNA複合体の安定化の面から好ましい。
そして、5’−非翻訳領域においては、第一の配列と第二の配列の後にリボソーム結合配列(RBS)が存在することが好ましい。その場合、第一の配列と第二の配列のうち3’側に存在する配列とリボソーム結合配列との間隔は30〜40塩基であることがリボソームの結合しやすさの面から好ましい。
リボソーム結合配列としては、Shine-Dalgarno(SD)配列が挙げられ、例えば、配列番号5の塩基番号92〜97の配列が例示される。
Cvapコード配列としては、配列番号6のアミノ酸番号70〜199をコードする配列が例示され、より具体的には、配列番号5の塩基番号313〜702で示される配列が挙げられる。ただし、前記Cv配列に結合することができる限り、配列番号6のアミノ酸番号70〜199のアミノ酸配列において1〜数個(例えば、2〜5個、もしくは2〜10個)のアミノ酸が置換、欠失または付加されてもよい。
CvapはダイマーでCv配列に結合することが知られているので、コード領域には前記Cvapコード配列が2つ含まれる必要がある。Cvapダイマーコード配列はCvapコード配列が連続して2つつながったものでもよいが、間にリンカーコード配列を介してCvapコード配列が2つつながった配列でもよい。
BIV Tatの配列としては、配列番号35が例示されるが、前記BIV TAR配列に結合することができる限り、配列番号35のアミノ酸配列において1〜数個(例えば、2,3個)のアミノ酸が置換、欠失または付加されてもよい。
その他の例示するポリペプチド各配列においても、標的配列に結合できる限り、1〜数個(例えば、2,3個)のアミノ酸が置換、欠失または付加されてもよい。
また、ペプチド配列中に、RXR配列(Xは任意のアミノ酸)、RX1X2R配列(配列番号42、X1,X2は任意のアミノ酸)、RR配列の1種以上、より好ましくは2種以上、特に好ましくは3種全てが存在するポリペプチドを使用することが好ましい。
また、ペプチド配列中に、RXR配列、RX1X2R配列(配列番号42、X1,X2は任意のアミノ酸)、RRXRR配列(配列番号43、Xは任意のアミノ酸)の1種以上、より好ましくは2種以上、特に好ましくは3種全てが存在するポリペプチドを使用することも好ましい。
・HIV-1 Tat:GRKKRRQRRR (10 mer)(配列番号44)
・JDV Tat:GRRKKRGTRGKGRKIHY (17 mer) (配列番号45)
・λ N:MDAQTRRRERRAEKQAQWKAAN (22 mer) (配列番号46)
・λ N mutant:GNARTRRRERRAEKQAQWKAAN (22 mer) (配列番号47)
・P22 N:NAKTRRHERRRKLAIER (17 mer) (配列番号48)
・φ21N:TAKTRYKARRAELIAERR (18 mer) (配列番号49)
・BMV Gag:KMTRAQRRAAARRNRWTAR (19 mer) (配列番号50)
・CCMV Gag:KLTRAQRRAAARKNKRNTR (19 mer) (配列番号51)
・Spuma Gag:TRALRRQLAER (11 mer) (配列番号52)
・Yeast PRP6:TRRNKRNRIQEQLNRK (16 mer) (配列番号53)
・Human U2AF:SQMTRQARRLYV (12 mer) (配列番号54)
・HTLV-II Rex:TRRQRTRRARRNR (13 mer) (配列番号55)
・FHV coat:RRRRNRTRRNRRRVR (15 mer) (配列番号56)
・S3:RRVAFRRIVRKAITRAQRR (19 mer) (配列番号57)
・S7:KTKLERRNK (9 mer) (配列番号58)
・S28:RKLRVHRRNNR (11 mer) (配列番号59)
・L16:RRAMSRKFRRNSK (13 mer) (配列番号60)
・L35:RAKKTRALRR (10 mer) (配列番号61)
このうち、HIV-1 TatはHIV-1 TAR(5’-CCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGG-3’:配列番号62)に結合し、JDV TatはJDV TAR(5’-GCUCUGGAUAGCUGACAGCUCCGAGC-3’:配列番号63)に結合する。
例えば、上記で例示した配列に加え、下記のような配列が挙げられる。
・P22 boxB:5’-GCGCUGACAAAGCGC-3’ (15 mer) (配列番号64)
・HIV-1 RRE:5’-GGUCUGGGCGCAGCGCAAGCUGACGGUACAGGCC-3’ (34 mer) (配列番号65)
ただし、核酸結合性ポリペプチドが結合することができる限り、これらの配列において1〜数個(例えば、2,3個)の塩基が置換、欠失または付加されてもよい。
第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列と第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列の間隔は60〜75塩基であることが蛋白質-RNA複合体の安定化の面から好ましい。
ここで、提示対象ポリペプチドコード配列は、既知の配列でもランダム配列でもよい。また、長さも特に制限はなく、短いペプチドでも、蛋白質でもよい。
その由来は特に制限されず、ヒトを含む哺乳動物、植物、ウイルス、酵母、あるいは細菌など、あらゆる生物に由来する天然の配列を持つポリペプチドを用いることができる。あるいは、前記天然ポリペプチドの一部や、アミノ酸配列を改変した変異ポリペプチドを提示対象ポリペプチドとして利用することもできる。更に、人工的に設計されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提示対象ポリペプチドとすることもできる。
例えば、NRYコドンの繰り返しを利用することで、8種類のアミノ酸(Ser, Asn, Gly, Asp, Arg, His, CysまたはTyr)がランダムに出現するペプチド配列を発現させることが
できる。
N = A, G, C, T
R = A, G
Y = C, T
なお、ランダムポリペプチドが非天然のアミノ酸を含む場合は、コドンを公知の手段にしたがって改変すればよい。
スペーサー配列は10〜200アミノ酸の配列とすることが好ましい。スペーサー配列のアミノ酸配列は、提示対象蛋白質と標的物質との結合反応に悪影響を与えない配列であれば特に制限されないが、水溶性が高く、特殊な3次元構造をとらない配列であることが好ましく、具体的には、主にグリシンとセリンを含むいわゆるGSリンカーやファージのgeneIIIの部分配列などを用いることができる。
DNAの場合は、RNAを転写させるためのプロモーター配列を5’非翻訳領域の上流に付加することが好ましい。
プロモーターは、使用する発現系に応じて適宜、選択することができる。例えば、大腸菌細胞や大腸菌由来の無細胞翻訳系を用いる場合、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター等の大腸菌で機能するプロモーターが例示される。
そして、配列番号6,10,12,14,16にこれらの核酸から翻訳される融合蛋白質のアミノ酸配列を示した。ただし、本発明の核酸構築物とそれにコードされる融合蛋白質はこれらに限定されない。
上記核酸構築物およびそれを含むベクターはMolecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)などに記載されている公知の遺伝子学的手法によって作製することができる。
上記核酸構築物を翻訳系に導入して前記コード領域にコードされる融合蛋白質を発現させることにより、第一の核酸結合性ポリペプチドと第一の配列との結合および第二の核酸結合性ポリペプチドと第二の配列との結合を介して融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させることができ、提示対象ポリペプチドをRNA上に提示させることができる。
なお、核酸構築物としてDNAを用いる場合は、プロモーターに応じたRNAポリメラーゼを加える。
本発明のポリペプチド配列の選択方法では、次の工程(1)〜(3)を繰り返す。
(1)本発明の核酸構築物からランダムポリペプチドと第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドとの融合蛋白質を発現させ、核酸構築物に対応するRNA上にランダムポリペプチドライブラリーを提示する工程;
(2)標的物質に前記ライブラリーを接触させる工程;および
(3)標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合蛋白質を選択し、選択された融合蛋白質をコードする核酸配列を増幅する工程。
(I)標的物質にポリペプチドライブラリーを接触させる。
(II)標的ポリペプチドに結合しなかった、ライブラリーに含まれていたその他のポリペプチドを除去する。例えば、洗浄により除去することができる。
(III)除去されなかったポリペプチド、すなわち標的ポリペプチドに特異的に結合していたポリペプチドを回収する。
(IV)必要に応じ(I)から(III)の操作を複数回繰り返す。
ここでは、安定架橋型リボソームディスプレイ法の開発として、ペプチドライブラリーを翻訳するために利用するmRNAテンプレートの5'端に、二つのRNAモチーフ(boxBとCv)を導入した。さらに、ペプチドライブラリーをコードする配列の下流に、各RNAモチーフに特異的に結合するペプチド(Bap)および蛋白質(Cvapダイマー)をコードする配列を導入した。これにより、mRNAテンプレートの試験管内翻訳により発現したペプチド(Bap)と蛋白質(Cvapダイマー)が、各RNAモチーフと親和的に架橋構造を形成するため、これまでにない安定性を獲得した「ペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体(図1(2))」を合成することができる。
プラスミドDNA-I は、SD配列・開始コドン・SfiI制限酵素サイト(1)・SfiI制限酵素サイト(2)・Bap配列・Cvap配列・Ps配列の順に並んだ人工配列を、市販プラスミドのクローニングサイトに導入することで構築した。また、プラスミドDNA-IIは、T7プロモーター配列・SD配列・開始コドン・SfiI制限酵素サイト(1)・SfiI制限酵素サイト(2)・Bap配列・Cvap配列・Ps配列の順に並んだ人工配列を、市販プラスミドのクローニングサイトに導入することで構築した。
1. Selection buffer(250μl)と「ペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体」を有する翻訳液(50μl)を混合し、ビーズ(15μl)を添加した後、インキュベート(1 h, 4℃)する。
2. 1で処理したビーズをWashing buffer(300μl)で5回洗浄する。
3. 2で処理したビーズにFLAGペプチド(100μl)を添加し、さらにインキュベート(0.5 h,4℃)する。4. 1000rpm(5 min)でビーズを沈降させた後、上清(100μl)を回収する。
5. 4で回収したmRNAを精製(QIAGEN社製RNeasy kit)し、それをもとに逆転写(TAKARA社製PrimeScript Reverse Transcriptase)を行うことでcDNAを合成する。
6. 5で合成したcDNAを鋳型にしてPCR(TAKARA社製 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)を行い、そのPCR産物を電気泳動することで、mRNAの回収量を確認する。
Washing buffer : Tris-HCl(50 mM, pH 7.5), NaCl(150 mM), 0.5 % Tween
Selection buffer : Tris-HCl(60 mM, pH 7.5), NaCl(180 mM)
ビーズ : ANTI-FLAG-M2-Affinity Gel (SIGMA-ALDRICH社製)
FLAGペプチド (SIGMA-ALDRICH社製)
従来、リボソームディスプレイ法によるペプチド選択実験において問題とされてきた「複合体におけるリボソームと標的分子との立体障害」を解消することができれば、これまでに選択できなかったより強力な標的結合性ペプチドの創出が可能となる。
そこで今回、mRNAディスプレイ法とは全く異なる簡便な方法により、リボソームを有さない「ペプチド-mRNA複合体」を合成し、それら利用する新規ディスプレイ法の開発に取り組んだ。
(A)プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp1(配列番号25)とrp1(配列番号29)を用いてPCRによりDNAテンプレート1-S(配列番号9)を増幅した。
(B)プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp2(配列番号26)とrp1(配列番号29)を用いてPCRによりDNAテンプレート2-S(配列番号11)を増幅した。
(C)プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp3(配列番号27)とrp1(配列番号29)を用いてPCRによりDNAテンプレート3-S(配列番号13)を増幅した。
(D)プラスミドDNA-II-FLAGを鋳型に、プライマーはfp4(配列番号28)とrp1(配列番号29)を用いてPCRによりDNAテンプレート4-S(配列番号15)を増幅した。
プライマーfp1は配列番号3の塩基番号1〜24の配列を含み、T7プロモーターを含んでいる。
プライマーfp2は配列番号3の塩基番号1〜24の配列を含み、T7プロモーター、boxB配列を含んでいる。
プライマーfp3は配列番号3の塩基番号1〜24の配列を含み、T7プロモーター、Cv配列を含んでいる。
プライマーfp4は配列番号5の塩基番号1〜35の配列を含み、T7プロモーター、boxB配列、Cv配列を含んでいる。
プライマーrp1は配列番号3の塩基番号1094〜1113および配列番号5の塩基番号1157〜1176に相補的な配列を含み、終止コドンを含んでいる。
(A)プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp1(配列番号25)とrp3(配列番号31)を用いてPCRによりDNAテンプレート1-NS(配列番号9の最後に、taatgaの代わりに配列番号5の1177〜1626が付加した配列)を増幅した。
(B)プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp2(配列番号26)とrp3(配列番号31)を用いてPCRによりDNAテンプレート2-NS(配列番号11の最後に、taatgaの代わりに配列番号5の1177〜1626が付加した配列)を増幅した。
(C)プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp3(配列番号27)とrp3(配列番号31)を用いてPCRによりDNAテンプレート3-NS(配列番号13の最後に、taatgaの代わりに配列番号5の1177〜1626が付加した配列)を増幅した。
(D)プラスミドDNA-II-FLAGを鋳型に、プライマーはfp4(配列番号28)とrp3(配列番号31)を用いてPCRによりDNAテンプレート4-NS(配列番号15の最後に、taatgaの代わりに配列番号5の1177〜1626が付加した配列)を増幅した。
プライマーrp3は配列番号3の塩基番号1544〜1563および配列番号5の塩基番号1607〜1626に相補的な配列を含み、終止コドンを含んでいない。
1. Selection buffer(250μl)と各複合体を有する翻訳液(50μl)を混合し、ビーズ(15μl)を添加した後、インキュベート(1 h, 4℃)する。
2. 1で処理したビーズをWashing buffer(300μl)で5回洗浄する。
3. 2で処理したビーズにFLAGペプチド(100μl)を添加し、さらにインキュベート(0.5 h,4℃)する。
4. 1000rpm(5 min)でビーズを沈降させた後、上清(100μl)を回収する。
5. 4で回収したmRNAを精製(QIAGEN社製RNeasy kit)し、それをもとに逆転写(TAKARA社製PrimeScript Reverse Transcriptase)を行うことでcDNAを合成する。
6. 5で合成したcDNAを鋳型にしてPCR(TAKARA社製 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)を行い、そのPCR産物を電気泳動することで、mRNAの回収量を確認する。
Washing buffer : Tris-HCl(50 mM, pH 7.5), NaCl(150 mM), EDTA(50 mM), 0.5 % Tween
Selection buffer : Tris-HCl(60 mM, pH 7.5), NaCl(180 mM), EDTA(60 mM)
ビーズ : ANTI-FLAG-M2-Affinity Gel (SIGMA-ALDRICH社製)
FLAGペプチド (SIGMA-ALDRICH社製)
上記の実験により、「安定架橋型リボソームディスプレイ法」および「安定架橋型ディスプレイ法」を利用して、標的分子に特異的に結合するペプチドの選択実験を行えることが明らかとなった。
プライマーrp2は配列番号5の塩基番号1157〜1176に相補的な配列を含み、FLAGコード配列と終止コドンを含んでいる。
この結果は、プラスミドDNA-IIの利用により、様々なペプチド(プロテイン)ライブラリーを導入した「ペプチド(プロテイン)-Bap-Cvap-mRNA複合体」の合成が可能であり、目的のペプチド(プロテイン)アプタマーの選択実験を行うことが可能であることを示唆している。
安定架橋型リボソーマル複合体の多様化およびコンパクト化の可能性を模索すると共に、RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体の多目的利用(例:機能性核酸・核酸医薬などのデリバリー)の潜在性を見出すため、RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体(図8)の新たな創成に取り組んだ。ここでは、天然に存在するRNAモチーフ-ペプチド相互作用および人工的に見出されたRNAモチーフ-ペプチド相互作用を規範として、ヘテロなタンデム化RNAモチーフとそれらに結合するタンデム化ペプチドを新規に設計した(図8と表1)。そして、化学的手法により合成した各種RNAモチーフとペプチドを混合した後、電気泳動によるゲルシフトアッセイにより、RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体の形成の可否について評価した(今回の実験は、下記の条件と手順に従って実行した)。
(1)下記サンプルバッファーにより、RNAモチーフ溶液(1μM)を調製する。そして、70℃でインキュベーションした後、室温で放置する。
(2)下記サンプルバッファーにより調製した各種ペプチド溶液(1μM)と上記RNAモチーフ溶液を混合した後、総量10μLにメスアップする(最終のRNAのモル量:4 pmol)。
(3)10% PAGEにより、RNAモチーフとRNAモチーフ-ペプチド架橋構造体を分離した後、ゲルをSYBRGで染色してイメージ像を測定した(例:図9)。
・サンプルバッファー:Tris-acetate (50 mM, pH7.5)、KCl (150 mM)、Tween-20 (0.1 %)、
Mg(AcO)2(50 mM)、Zn(AcO)2 (0.1 mM)
・電気泳動バッファー:Tris-acetate (10 mM, pH 7.5)
Bap : GNARTRRRERRAMERATLPQVLG(配列番号33)
Rev : TRQARRNRRRRWRERQR(配列番号34)
BIV Tat : SGPRPRGTRGKGRRIRR(配列番号35)
GS2 : GGGSGGGS(配列番号36)
GS3 : GGGSGGGSGGGS(配列番号37)
boxB : GGCCCUGAAAAAGGGCC(配列番号38)
ap I : GGCUGGACUCGUACUUCGGUACUGGAGAAACAGCC(配列番号39)
ap II : GGUGUCUUGGAGUGCUGAUCGGACACC(配列番号40)
BIV TAR : GCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGC(配列番号41)
1.Plasmid DNA-I full塩基配列
2.Plasmid DNA-II full塩基配列
3.Plasmid DNA-I-FLAG partial塩基配列
4.3のアミノ酸配列
5.Plasmid DNA-II-FLAG partial塩基配列
6.5のアミノ酸配列
7.Plasmid DNA-I-FLAG full塩基配列
8.Plasmid DNA-II-FLAG full塩基配列
9.DNA-I-fp1-rp1塩基配列
10.9のアミノ酸配列
11.DNA-I-fp2-rp1塩基配列
12.11のアミノ酸配列
13.DNA-I-fp3-rp1塩基配列
14.13のアミノ酸配列
15.DNA-I-fp4-rp1塩基配列
16.15のアミノ酸配列
17.Plasmid DNA-II-H6 full塩基配列
18.17のアミノ酸配列
19.Plasmid DNA-II-EGF full塩基配列
20.19のアミノ酸配列
21.Plasmid DNA-II-FKBP12 full塩基配列
22.21のアミノ酸配列
23.Plasmid DNA-II-CypA full塩基配列
24.23のアミノ酸配列
25.プライマーfp1塩基配列
26.プライマーfp2塩基配列
27.プライマーfp3塩基配列
28.プライマーfp4塩基配列
29.プライマーrp1塩基配列
30.プライマーrp2塩基配列
31.プライマーrp3塩基配列
32.secMアミノ酸配列
33.Bap
34.Rev
35.BIV Tat
36.linker 1
37.linker 2
38.boxB
39.apI
40.apII
41.BIV TAR
42.consensus sequence 1
43.consensus sequence 2
44.HIV-1 Tat
45.JDV Tat
46.λN
47.λN mutant
48.P22N
49.φ21N
50.BMV Gag
51.CCMV Gag
52.Spuma Gag
53.Yeast PRP6
54.Human U2AF
55.HTLV-II Rex
56.FHV coat
57.S3
58.S7
59.S28
60.L16
61.L35
62.HIV-1 TAR
63.JDV TAR
64.P22 boxB
65.HIV-1 RRE
Claims (18)
- 5’−非翻訳領域およびコード領域を含む核酸構築物であって、前記コード領域が提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列および第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、前記5’−非翻訳領域が第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含み、翻訳系に導入されたときに、前記核酸構築物のコード領域から翻訳される融合蛋白質が、前記第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合によって、前記核酸構築物に対応するRNAと複合体を形成する、核酸構築物。
- 第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがboxB-associating peptide (Bap)およびCv-associating peptide (Cvap)ダイマーであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびCv配列である、請求項1に記載の核酸構築物。
- 第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびhuman
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) regulator of viral expression (Rev)のaptamer I (apI)配列またはaptamer II (apII)配列への結合ドメインであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびapI配列またはapII配列である、請求項1に記載の核酸構築物。 - 第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびbovine immunodeficiency virus (BIV) trans-activator protein (Tat)のBIV trans-activation response element (TAR)配列への結合ドメインであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびBIV TAR配列である、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記5’−非翻訳領域がboxB配列、Cv配列およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Cvapダイマーコード配列およびスペーサーコード配列を含む、請求項2に記載の核酸構築物。
- 前記5’−非翻訳領域がboxB配列、apI配列またはapII配列、およびリボソーム結合配
列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Revコード配列およびスペーサーコード配列を含む、請求項3に記載の核酸構築物。 - 前記5’−非翻訳領域がboxB配列、BIV TAR配列およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、BIV Tatコード配列およびスペーサーコード配列を含む、請求項4に記載の核酸構築物。
- 前記5’−非翻訳領域がリボソーム結合配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 提示対象ポリペプチドコード配列がランダムポリペプチドをコードする配列である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 5’−非翻訳領域およびコード領域を含む核酸構築物と、
前記コード領域から翻訳される融合蛋白質とを含む核酸−蛋白質複合体であって、
前記コード領域が、提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列及び第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、
前記5’−非翻訳領域が、第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含み、前記第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合によって形成される、
核酸−蛋白質複合体。 - リボソームを含まない、請求項10に記載の核酸−蛋白質複合体。
- 第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびCvapダイマーであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびCv配列である、請求項10または11に記載の核酸−蛋白質複合体。
- 提示対象ポリペプチドコード配列がランダムポリペプチドをコードする配列である、請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸−蛋白質複合体。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸構築物を翻訳系に導入して前記コード領域にコードされる融合蛋白質を発現させ、第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合を介して該融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させることにより、提示対象ポリペプチドを核酸構築物に対応するRNA上に提示させることを特徴とする、ポリペプチドを核酸上に提示させる方法。
- 融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させた後、リボソームを核酸構築物から解離させる工程を含む、請求項14に記載の方法。
- 標的物質に結合するポリペプチド配列を選択する方法であって、次の工程(1)〜(3)を繰り返すことを特徴とする方法。
(1)請求項9に記載の核酸構築物からランダムポリペプチドと第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドとの融合蛋白質を発現させ、核酸構築物に対応するRNA上にランダムポリペプチドライブラリーを提示する工程;
(2)標的物質に前記ライブラリーを接触させる工程;および
(3)標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合蛋白質を選択し、選択された融合蛋白質をコードする核酸配列を増幅する工程。 - 前記工程(1)と(2)の間に、リボソームを核酸構築物から解離させる工程を含む、請求項16に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ポリペプチドを核酸上に提示させるためのキット。
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