JP7461652B2 - 化合物ライブラリー及び化合物ライブラリーの製造方法 - Google Patents

化合物ライブラリー及び化合物ライブラリーの製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、化合物ライブラリー及び化合物ライブラリーの製造方法等に関する。
近年ゲノムシーケンス技術の高まりとともにRiPPs (Ribosomally synthesized and Post-translationally modified Peptides)と呼ばれる、リボソームで合成されたのち翻訳後修飾を受けて生合成されるペプチド化合物群が着目されている（非特許文献１）。RiPPsは生合成遺伝子クラスター内に存在する構造遺伝子と呼ばれる生合成遺伝子がリボソームによって翻訳されることで前駆体ペプチドが合成される。その後、その他の生合成遺伝子がコードする翻訳後修飾酵素によってアゾール環形成やデヒドロアミノ酸形成などの多様な修飾が前駆体ペプチドに複数施され、成熟産物が合成される。
チオペプチドはRiPPsの一種であり、強力な翻訳阻害活性、多剤耐性菌への抗菌作用、抗寄生虫作用、抗ウィルス作用、免疫抑制作用、抗ガン作用等、興味深い生理活性を有する。チオペプチドとしては、例えば、ラクタゾールA, B, Cが知られている。また、放線菌Streptomyces lactacystinaeusのゲノム中からラクタゾール生合成遺伝子クラスターであるlazA-Fが発見されたことが報告されている（非特許文献２）。
Figure 0007461652000001
上述したようにチオペプチドは、興味深い活性を有するため、医薬品候補や研究用ツールとして注目されており、多様な構造のペプチドを含むライブラリーを開発し、標的物質に親和性を有するチオペプチドをスクリーニングしようとする様々な試みがなされている。
チオペプチド生合成機構を利用した、チオペプチドアナログ作製の試みはWalshらによって行われており、WalshらはGE37468とThiocillin生合成経路を用いて、構造遺伝子に変異を入れることでin vivoにてチオペプチドアナログを作製した（非特許文献３及び４）。
また、非特許文献４にはThiocillinについては、Bacillus cereus ATCC 14579を宿主として用いている。こちらでは、マクロ環の大きさを変えるようなアナログの作製を試みている。Thiocillinは26員環のマクロ環構造を持つが、構造遺伝子に変異を加えることで、23, 26, 29, 32, 35員環のマクロ環を持つアナログの作製できたことが報告されている。
ペプチド構造を有する化合物のライブラリーを得る方法としては、in vitro（試験管内）にて行う方法が知られている。
無細胞翻訳系は、細胞から抽出したタンパク質合成機能を利用して目的のペプチド、又はタンパク質を試験管内で合成する系である。無細胞翻訳系の中にも、ウサギ網状赤血球やコムギ胚芽、大腸菌などの細胞から抽出した翻訳因子を直接使うものと、リボソーム以外の31種の翻訳タンパク質を組換えタンパク質として一つずつ調製し混ぜ合わせる再構成無細胞翻訳系と呼ばれるものが存在する（非特許文献５）。
細胞抽出物を直接使うものに比べ、再構成無細胞翻訳系はヌクレアーゼやプロテアーゼを含まない点でペプチド又はタンパク質を高効率で合成することができるというメリットがある。
無細胞翻訳系は、タンパク質を合成する手法は化学合成法や遺伝子組換え生物による生産法などに比べて、その合成スピードが速く、簡便性に優れる。そのため、無細胞翻訳系は創薬研究にも使用されており、例えば、「Flexible In vitro Translationシステム (FITシステム) 」が知られている（非特許文献６）。FITシステムは、非タンパク質性アミノ酸の入ったペプチドを無細胞翻訳系で作り上げるシステムであり、これによって環状構造などを持つ特殊ペプチドライブラリーを構築することができる。
Arnison, P. G. et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep 30, 108-160, (2013). Hayashi, S. et al. Genome mining reveals a minimum gene set for the biosynthesis of 32-membered macrocyclic thiopeptides lactazoles. Chem Biol 21, 679-688, (2014). Young, T. S., Dorrestein, P. C. & Walsh, C. T. Codon randomization for rapid exploration of chemical space in thiopeptide antibiotic variants. Chem Biol 19, 1600-1610, (2012). Bowers, A. A., Acker, M. G., Young, T. S. & Walsh, C. T. Generation of thiocillin ring size variants by prepeptide gene replacement and in vivo processing by Bacillus cereus. J Am Chem Soc 134, 10313-10316, (2012). Shimizu, Y. et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol 19, 751-755, (2001). Goto, Y., Katoh, T. & Suga, H. Flexizymes for genetic code reprogramming. Nat Protoc 6, 779-790, (2011).
無細胞翻訳系ではわずか30分で目的のペプチド又はタンパク質を合成することができ、また、鋳型となるDNAやmRNAを多種合成できればそれに応じた多種類のペプチド又はタンパク質を容易に合成することができる。このように簡便で素早く多種類のタンパク質を合成できることから、化合物ライブラリーを得るために無細胞翻訳系が有用である。しかしながら、無細胞翻訳系の利点を生かし、無細胞翻訳系とチオペプチド生合成系とを結びつけ、多様な構造を有するペプチド化合物ライブラリーを試験管内で構築することは知られていない。
また、非特許文献２には、ラクタゾール生合成遺伝子クラスターであるlazA-Fが発見されたことが開示されているものの、lazB-Fから発現した酵素LazB-Fが有する機能は決定されておらず、またこれらの酵素を用いて試験管内で反応を行うことは開示されていない。
さらに、酵素LazB-F等のチオペプチド生合成酵素が、非天然型配列を含む多様なアミノ酸配列に対してチオペプチドを形成する可能性（基質許容性）は不明であり、上記チオペプチド生合成酵素がライブラリー構築に応用できる可能性も未知である。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、チオペプチド生合成系を使用して、ペプチド化合物ライブラリーを製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、所定のチオペプチド生合成酵素を用いることにより多様な構造のペプチド化合物を合成することができ、また、無細胞翻訳系とチオペプチド生合成系とを使用して、ペプチド化合物ライブラリーを創出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
式(I);
Figure 0007461652000002
 ［式(I)中、
m個のXa, 並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
mは、2から40より選択される整数であり、
環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
試験管内で、式(II)；
LP－X－(Xa)m－Y－Z (II)
［式(II)中、
Xは、式(1)；
Figure 0007461652000003
 （R2は、水素原子又は炭化水素基である。）
で表される基を表し、
Yは、4つの、アミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基であって、式(2)；
Figure 0007461652000004
 （R1及びB1は、前記と同義であり、R3は、水素又は炭化水素基を表す。）
で表される基を含有し、
m個のXa、m及びZは、前記と同義であり、
LPは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基を表す。］
で示される2種以上のペプチドに、マクロ環化酵素を作用させ、LPが存在する場合にはLPを脱離させながら含窒素六員環Aを形成し、式(I)で表される2種以上の環状化合物を生成する工程を含む、化合物ライブラリーの製造方法。
［２］
LPが、11個以上100個以下のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基である、［１］に記載の製造方法。
［３］
mが、2から24より選択される整数である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］
Yが、以下の式(3)で表される基である、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
Figure 0007461652000005
 (R1, R3, R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又は炭化水素基を表し、B1及びB2は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。)
［５］
Yが、以下の式(3')で表される基である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
Figure 0007461652000006
 (R1, R3, R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、B1及びB2は、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を表す。ただし、B1及び／又はB2が硫黄原子であるとき、R1及びR5は水素である。)
［６］
Yが、以下の式(3'')で表される基である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
Figure 0007461652000007
 (R1, R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、B1及びB2は、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を表す。ただし、B1及び／又はB2が硫黄原子であるとき、R1及びR5は水素である。)
［７］
Yが、以下の式(3-1)で表される基である、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
Figure 0007461652000008
 ［８］
マクロ環化酵素が、LazC及び／又はLazCと相同性を有する酵素を含む、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］
式(I);
Figure 0007461652000009
 ［式(I)中、
m個のXa, 並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
mは、2から40より選択される整数であり、
環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
式(III)で表される前駆体ペプチド；
LP'－X'－(Xa')m'－Y'－Z' (III)
［式(III)中、
X'は、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
Y'は、－Y'(10)－Y'(11)－Y'(12)－Y'(13)－で表される4つのアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、Y'(10)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Y'(11)は、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであり、Y'(12)は、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(13)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
m'個のXa'、m'及びZ'は、それぞれ前記式(I)におけるm個のXa、m及びZと同義であり、
LP'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表す。］
をコードするmRNAライブラリーを製造する工程と；
前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、第一のペプチドライブラリーを製造する工程と；
アゾール環形成酵素と前記第一のペプチドライブラリーとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成し、第二のペプチドライブラリーを製造する工程と；
グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素と前記第二のペプチドライブラリーとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換し、第三のペプチドライブラリーを製造する工程と；
マクロ環化酵素と前記第三のペプチドライブラリーとを反応させ、LP'が存在する場合にはLP'を脱離させながら含窒素六員環を形成し、式(I)で表される2種以上の環状化合物を生成する工程；
を含む、化合物ライブラリーの製造方法。
［１０］
式(I);
Figure 0007461652000010
 ［式(I)中、
m個のXa, 並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
mは、2から40より選択される整数であり、
環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
式(III)で表される前駆体ペプチド；
LP'－X'－(Xa')m'－Y'－Z' (III)
［式(III)中、
X'は、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
Y'は、－Y'(10)－Y'(11)－Y'(12)－Y'(13)－で表される4つのアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、Y'(10)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Y'(11)は、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであり、Y'(12)は、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(13)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
m'個のXa'、m'及びZ'は、それぞれ前記式(I)におけるm個のXa、m及びZと同義であり、
LP'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表す。］
をコードするmRNAライブラリーを製造する工程と；
前記mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、第一のペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
アゾール環形成酵素と前記第一のペプチド－mRNA複合体ライブラリーとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成し、第二のペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素と前記第二のペプチド－mRNA複合体ライブラリーとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換し、第三のペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
マクロ環化酵素と前記第三のペプチド－mRNA複合体ライブラリーとを反応させ、LP'が存在する場合にはLP'を脱離させながら含窒素六員環を形成し、式(I)で表される2種以上の環状化合物を生成する工程；
を含む、化合物ライブラリーの製造方法。
［１１］
LP'が、11個以上100個以下のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドである、［９］又は［１０］に記載の製造方法。
［１２］
mが、2から24より選択される整数である、［９］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
Y'(10)が、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、
Y'(13)が、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログである、［９］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］
Y'(11)が、セリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
Y'(12)が、セリン若しくはトレオニン、又はそのアナログである、［９］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］
Y'(11)が、セリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
Y'(12)が、セリン又はそのアナログである、［９］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］
Y'(10)が、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、
Y'(11)が、セリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
Y'(12)が、セリンであり、
Y'(13)が、セリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログである、
［９］～［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］
式(III)中の(Xa')m'において、X'に隣接するアミノ酸残基Xa'(1)が、酸性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログである、［９］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］
式(III)中の(Xa')m'において、m'番目のアミノ酸残基Xa'(m')が、酸性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログである、［９］～［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］
式(III)中の(Xa')m'において、m'－1番目のアミノ酸残基Xa'(m'－1)が、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログである、［９］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］
アゾール環形成酵素が、LazD、LazE、及びLazF、並びに／又はこれらと相同性を有する酵素を含む、［９］～［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］
α,β-不飽和アミノ酸形成酵素が、LazB及びLazF、並びに／又はこれらと相同性を有する酵素を含む、［９］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］
マクロ環化酵素が、LazC及び／又はLazCと相同性を有する酵素を含む、［９］～［２１］のいずれかに記載の製造方法。
［２３］
グルタミル化反応における補基質tRNAGluが、放線菌由来のtRNAGluであり、
アミノアシル化酵素GluRSが、放線菌由来のGluRSである、［９］～［２２］のいずれかに記載の製造方法。
［２４］
式(I);
Figure 0007461652000011
 ［式(I)中、
m個のXa, 並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
mは、2から40より選択される整数であり、
環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーであって、
式(I)で表される環状化合物の少なくとも一つは、非天然型である、化合物ライブラリー。
［２５］
標的物質に結合する式(I)で表される環状化合物を同定するスクリーニング方法であって、
［１］～［２３］のいずれかに記載の製造方法で製造された化合物ライブラリー又は［２４］に記載の化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
前記標的物質と結合した式(I)で表される環状化合物を選択する工程と、を含む方法。
［２６］
標的物質に結合する式(I)で表される環状化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、
［１］～［２３］のいずれかに記載の製造方法で製造された化合物ライブラリー又は［２４］に記載の化合物ライブラリーを含む、キット。
［２７］
式(I);
Figure 0007461652000012
 ［式(I)中、
m個のXa, 並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
mは、2から40より選択される整数であり、
環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
で表される環状化合物の製造方法であって、
試験管内で、式(II)；
LP－X－(Xa)m－Y－Z (II)
［式(II)中、
Xは、式(1)；
Figure 0007461652000013
 （R2は、水素又は炭化水素基である。）
で表される基を表し、
Yは、4つの、アミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、式(2)；
Figure 0007461652000014
 （R1及びR3は、それぞれ水素又は炭化水素基を表し、B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。）
で表される基を含有し、
m個のXa、m及びZは、前記と同義であり、
LPは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基を表す。］
で示されるペプチドに、マクロ環化酵素を作用させ、LPが存在する場合にはLPを脱離させながら含窒素六員環Aを形成し、式(I)で表される環状化合物を生成する工程を含む、製造方法。
［２８］
式(I);
Figure 0007461652000015
 ［式(I)中、
m個のXa, Xb, 及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
mは、2から40より選択される整数であり、
環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
で表される環状化合物の製造方法であって：
式(III)で表される前駆体ペプチド；
LP'－X'－(Xa')m'－Y'－Z' (III)
［式(III)中、
X'は、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
Y'は、－Y'(10)－Y'(11)－Y'(12)－Y'(13)－で表される4つのアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、Y'(10)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Y'(11)は、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであり、Y'(12)は、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(13)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
m'個のXa'、m'及びZ'は、それぞれ式(I)におけるm個のXa、m及びZと同義であり、
LP'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表す。］
をコードするmRNAを製造する工程と；
前記mRNAを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、
第一のペプチドを製造する工程と；
アゾール環形成酵素と前記第一のペプチドとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成し、第二のペプチドを製造する工程と；
グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素と前記第二のペプチドとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換し、第三のペプチドを製造する工程と；
マクロ環化酵素と前記第三のペプチドとを反応させ、LP'が存在する場合にはLP'を脱離させながら含窒素六員環を形成し、式(I)で表される環状化合物を生成する工程；
を含む、製造方法。
本発明によれば、合成や、in vivoによって作製する化合物ライブラリーよりもはるかに多様性に富んだ化合物ライブラリーを、迅速且つ簡便な方法で得ることができる。かかる化合物ライブラリーを用いれば、標的物質に結合する化合物のスクリーニングを行うことが可能である。
また、本発明の化合物ライブラリーにmRNAディスプレイ法を応用し、化合物のペプチド部分をコードするmRNAとの複合体のライブラリーを作製すれば、スクリーニングにより同定された化合物をコードする核酸配列を決定でき、化合物の構造と活性との関係を容易に解析できる。
LazA及びLazA*の配列を示す図である。 lazA DNAテンプレートの概略図である。T7プロモーター配列、翻訳促進配列、SD配列及びLazA*がコードされたDNAテンプレートであり、全長214塩基対からなる。 大腸菌型コドンに変更したlazAの塩基配列を示す図である。 プライマー伸長及びPCRの概略図である。 大腸菌と、ラクタゾール生産菌のtRNAGlu塩基配列のアライメントを示す図である。MibBの基質認識に重要であった、72番目と73番目の塩基を枠線で強調している。 In vitro転写の鋳型となるtRNAGluのDNAテンプレート(全長97 bp)を示す図である。 アゾール環形成反応(5時間)の後にα,β-不飽和アミノ酸形成反応を行った結果を示す図である。A. LazA*のみの反応系 B. LazA*にLazD, LazE, LazFを加え、5時間反応させた系 C. Bの反応後、LazB, LazF, tRNAGlu(CUC), GluRSを加えた反応系 m/z 5656.5はm/z5502.5のデヒドロアラニンにDTT(分子量154)がマイケル付加したペプチド、m/z 5674.5は4脱水物にDTT(分子量154)がマイケル付加したペプチドだと考えている。 α,β-不飽和アミノ酸形成反応(5時間)の後にアゾール環形成反応を行った結果を示す図である。A. LazA*のみの反応系 B. LazA*にLazB, LazF, tRNAGlu(CUC), GluRSを加え、5時間反応させた系 C. Bの反応後、LazD, LazE, LazFを加えた反応系である。 LazCの反応 (m/z 2000～)の結果を示す図である。A. LazA*のみの反応系。 B. LazA*にLazD, LazE, LazFを加えた反応系 C. LazA*にLazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu, GluRSを加えた反応系 D. LazA*にLazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu, GluRS, LazCを加えた反応系である。 図9のDと同じMSスペクトルのm/z1415～1435を拡大し、重ね合わせたものである。LazC(+)の系で特異的にラクタゾールAのNa付加物(計算値1423.369)のシグナルが見えた。 Ala挿入アナログ生成時に切り出されたリーダーペプチドのLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 Ala挿入アナログ生成時に切り出されたリーダーペプチドのピーク面積を示す図である。 Ala複数挿入アナログ及び欠失アナログ生成時に切り出されたリーダーペプチドのLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 Ala複数挿入アナログ及び欠失アナログ生成時に切り出されたリーダーペプチドのピーク面積を示す図である。 4SCSC7_4AAAA7アナログ生成時に切り出されたリーダーペプチドのLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 Ala置換前駆体ペプチドを基質にしたLazC反応で切り出されたリーダーペプチドのLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 Trp(2), Gly(3)置換アナログを基質にしたLaz酵素群反応産物のLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 Gln(8), Ala(9)置換アナログを基質にしたLaz酵素群反応産物のLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 Gln(15), Pro(16)置換アナログを基質にしたLaz酵素群反応産物のLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 マクロ環内の残基(Trp(2), Gly(3), Gln(8), Ala(9), Gln(15), Pro(16))を置換した際の反応の結果を示す図である。 Ala複数挿入前駆体ペプチドを基質にしたLaz酵素群反応産物のLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 複数欠失前駆体ペプチドを基質にしたLaz酵素群反応産物のLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 Ala複数挿入前駆体ペプチドを基質にしたLaz酵素群反応産物の切り出されたリーダーペプチドのピーク面積である。 複数欠失前駆体ペプチドを基質にしたLaz酵素群反応産物の切り出されたリーダーペプチドのピーク面積である。 Ala及びAsn複数挿入前駆体ペプチド又は複数欠失前駆体ペプチドを基質にしたLaz酵素群による反応産物のLC-MSクロマトグラム(brEIC)である。 Ala置換アナログにおけるLaz酵素群による反応産物のLC-MSクロマトグラム(brEIC)である。 Lys置換アナログにおけるLaz酵素群による反応産物のLC-MSクロマトグラム(brEIC)である。 Glu置換アナログにおけるLaz酵素群による反応産物のLC-MSクロマトグラム(brEIC)である。 Ser(10), Ser(11), Cys(13)置換アナログを基質にしたLazC反応で切り出されたリーダーペプチドのLC-MSクロマトグラム(EIC)を示す図である。 C末端領域についてのアナログ（置換及び伸長）におけるLaz酵素群による反応産物のLC-MSクロマトグラム(brEIC)である。 環内部の配列をランダムとしたアナログ、及び、環内部の配列をランダムとし且つC末端領域を伸長したアナログにおけるLaz酵素群による反応産物のLC-MSクロマトグラム(brEIC)である。 LazA*を基質としたときの、LazD, LazE, LazFによるアゾール環形成反応及び、LazB, LazFによるα,β-不飽和アミノ酸形成反応の結果である。 LP-30を基質としたときの、LazD, LazE, LazFによるアゾール環形成反応及び、LazB, LazFによるα,β-不飽和アミノ酸形成反応の結果である。 LP-25を基質としたときの、LazD, LazE, LazFによるアゾール環形成反応及び、LazB, LazFによるα,β-不飽和アミノ酸形成反応の結果である。 LP-20を基質としたときの、LazD, LazE, LazFによるアゾール環形成反応及び、LazB, LazFによるα,β-不飽和アミノ酸形成反応の結果である。 LP-15を基質としたときの、LazD, LazE, LazFによるアゾール環形成反応及び、LazB, LazFによるα,β-不飽和アミノ酸形成反応の結果である。 リーダーペプチドトランケート前駆体ペプチドを基質に用いたリーダーペプチドのLC-MSクロマトグラム(EIC)である。 LP-25におけるリーダーペプチドの-25から-1に位置するアミノ酸残基をそれぞれAlaに置換した改変前駆体ペプチドの模式図である。 -25から-1に位置するアミノ酸残基が置換された各改変前駆体ペプチドの反応産物中のリーダーペプチドのLC-MSクロマトグラム(EIC)を示す図である。 化合物ライブラリーのデザインを示す図である。 mRNAライブラリーが調製されたことを示す電気泳動ゲルの図である。なお、図中の６から１１は、各々５、６、７、８、９、及び１０残基からなる任意のアミノ酸配列を含むmRNAライブラリーであることを指す。 作製したmRNAライブラリーの逆転写産物のDNA配列をシーケンシングした際のシーケンスクオリティスコアQを示すグラフである。 作製したmRNAライブラリーの長さを評価し、フレームシフトの度合いを解析した結果を示す図である。 ライブラリーの不変領域が正しく特定の配列になっていることと、可変領域が偏りなくランダムな配列となっていることとを、確認するため、作製したmRNAライブラリーの配列保存性を評価した結果を示す図である。 作製したmRNAライブラリーに含まれるランダム領域の各アミノ酸頻度を分析した結果を示す図である。 mRNAライブラリーからペプチド－mRNA複合体ライブライブラリーを構築し、さらにLazB-F酵素を作用させて環状ペプチドを含む化合物ライブラリーを構築する工程を含む、iPGMに結合する環状ペプチドを取得した際のスキームを示す図である。 図５２のスキームで実施されたセレクション実験によって取得されたcDNAの回収率のグラフを示す図である。 非タンパク質性アミノ酸を含んだアナログ作成において、非タンパク質性アミノ酸の導入のためにリプログラミング可能な、4種のコドンを示す概略図である。 非タンパク質性アミノ酸を含んだアナログ作成のために用意したDNAテンプレートの概略図である。枠線で囲んだW及びKに相当する、tgg及びaagコドンをリプログラミングすることで、非タンパク質性アミノ酸を基質ペプチドに導入した。 非タンパク質性アミノ酸置換アナログNMeGlyにおけるLaz酵素群による反応産物のLC-MSクロマトグラム(brEIC)である。 非タンパク質性アミノ酸置換アナログNMeAlaにおけるLaz酵素群による反応産物のLC-MSクロマトグラム(brEIC)である。 mRNA上にディスプレイされた前駆体ペプチドがラクタゾール生合成酵素によって修飾されることを明らかにするための実験手順を示す概略図である。 ペプチド－mRNA複合体を基質にしたLazC反応で切り出されたリーダーペプチドのLC-MSクロマトグラムを示す図である。 酵素の添加パターンI, II, III, IVでの反応の結果を示す図である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施形態に制限されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
本発明の化合物ライブラリーの製造方法の一つは、
式(I);
Figure 0007461652000016
 ［式(I)中、
m個のXa, 並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
mは、2から40より選択される整数であり、
環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
試験管内で、式(II)；
LP－X－(Xa)m－Y－Z (II)
［式(II)中、
Xは、式(1)；
Figure 0007461652000017
 （R2は、水素原子又は炭化水素基である。）
で表される基を表し、
Yは、4つの、アミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基であって、式(2)；
Figure 0007461652000018
 （R1及びR3は、それぞれ水素又は炭化水素基を表し、B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。）
で表される基を含有し、
m個のXaは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
LPは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
mは、2から40より選択される整数である。］
で示される2種以上のペプチドに、マクロ環化酵素を作用させ、LPが存在する場合にはLPを脱離させながら含窒素六員環Aを形成し、式(I)で表される2種以上の環状化合物を生成する工程を含む、化合物ライブラリーの製造方法である。
なお、式（I）及び式（II）中の、ｍ個のXaは、それぞれ独立して、同一でも異なっていてもよく、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
また、式（1）及び式（2）中の、R2又はR3を含む不飽和二重結合は、E体又はZ体の単一の異性体であってもよく、E体及びZ体の混合物であってもよいが、式（1）は、好ましくは、
Figure 0007461652000019
 で表され、式（2）は、好ましくは、
Figure 0007461652000020
 で表される。
本発明の化合物ライブラリーの製造方法の一つは、
上記式(I)で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
式(III)で表される前駆体ペプチド；
LP'－X'－(Xa')m'－Y'－Z' (III)
［式(III)中、
X'は、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
Y'は、－Y'(10)－Y'(11)－Y'(12)－Y'(13)－で表される4つのアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、Y'(10)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Y'(11)は、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであり、Y'(12)は、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(13)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
m'個のXa'は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
LP'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
Z'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
m'は、2から40より選択される整数である。］
をコードするmRNAライブラリーを製造する工程と；
前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、第一のペプチドライブラリーを製造する工程と；
アゾール環形成酵素と前記第一のペプチドライブラリーとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成し、第二のペプチドライブラリーを製造する工程と；
グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素と前記第二のペプチドライブラリーとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換し、第三のペプチドライブラリーを製造する工程と；
マクロ環化酵素と前記第三のペプチドライブラリーとを反応させ、LP'が存在する場合にはLP'を脱離させながら含窒素六員環を形成し、式(I)で表される2種以上の環状化合物を生成する工程；
を含む、化合物ライブラリーの製造方法である。
式（III）中の、m'個のXa'は、それぞれ独立して、同一でも異なっていてもよく、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
上記α,β-不飽和アミノ酸形成酵素における「α,β-不飽和アミノ酸」とは、以下の［化２１］に示すように、アミノ酸又はそのアナログ中のα位炭素と、上記α位炭素に隣接するβ位炭素との間で不飽和二重結合が形成されたアミノ酸を指す。上記不飽和二重結合は、E体又はZ体の単一の異性体であってもよく、E体及びZ体の混合物であってもよい。
Figure 0007461652000021
 （式中、Raは、任意の有機基である。）
また、本発明の化合物ライブラリーの製造方法の一つは、式(I)で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
式(III)で表される前駆体ペプチドをコードするmRNAライブラリーを製造する工程と；
前記mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、第一のペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
アゾール環形成酵素と前記第一のペプチド－mRNA複合体ライブラリーとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成し、第二のペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素と前記第二のペプチド－mRNA複合体ライブラリーとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換し、第三のペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
マクロ環化酵素と前記第三のペプチド－mRNA複合体ライブラリーとを反応させ、LP'が存在する場合にはLP'を脱離させながら含窒素六員環を形成し、式(I)で表される2種以上の環状化合物を生成する工程；
を含む、化合物ライブラリーの製造方法である。
本発明の化合物ライブラリーの製造方法によれば、翻訳後修飾反応の工程において、通常試験管内で酵素を利用する場合にリーダーペプチドを取り除く必要があったところ、リーダーペプチドを除去する工程を設けることなく、簡便に翻訳後修飾及びマクロ環化された化合物の化合物ライブラリーを製造することができる。
本明細書において、「アミノ酸」とは、タンパク質性アミノ酸（proteinogenic amino acids）である。本明細書において「タンパク質性アミノ酸」は、タンパク質を構成するアミノ酸（Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、及びVal）を意味する。本明細書においてアミノ酸は、慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。
本明細書において「アミノ酸のアナログ」は、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を含み、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を「非タンパク質性アミノ酸（non-proteinogenic amino acids）」ともいう。非タンパク質性アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニン等）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ジアミノプロピオン酸、β-メチルシステイン、β-イソプロピルセリン、β-フェニルセリン等）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）が挙げられるがこれらに限定されない。また、本明細書において「アミノ酸のアナログ」には、タンパク質性アミノ酸又は非タンパク質性アミノ酸の変異体や誘導体も包含され、具体的には、タンパク質性アミノ酸又は非タンパク質性アミノ酸から生成する、α,β-不飽和アミノ酸、及びアゾール等の誘導体も含まれる。
本発明におけるペプチドがアミノ酸アナログとしてα,β-不飽和アミノ酸を含むとき、当該アミノ酸のアナログとしてのα,β-不飽和アミノ酸は、具体的には以下の構造analog (I)が挙げられる。
Figure 0007461652000022
 （RX1は、水素原子又は炭化水素基である。）
本発明におけるペプチドがアミノ酸アナログとしてアゾールを含むとき、当該アミノ酸のアナログとしてのアゾールは、具体的には以下の構造analog (II)が挙げられる。
Figure 0007461652000023
 （BXは、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、RX2は、水素原子又は炭化水素基である。）
本明細書における化学構造式には、互変異性体、幾何異性体、光学異性体等が包含される。
特にCysのアナログとしては、例えば以下の式で表されるものが挙げられるがこれに限定されない。また、Cysのアナログは、以下の式から派生する上述のanalog (I)及びanalog (II)であってもよい。
Figure 0007461652000024
 ［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1－10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
特にSer、Thrのアナログとしては、例えば以下の式で表されるものが挙げられるが、これらに限定されない。また、Ser、Thrのアナログは、それぞれ、以下の式から派生する上述のanalog (I)及びanalog (II)であってもよい。
Figure 0007461652000025
 ［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1－10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
特にジアミノプロピオン酸（Dap）のアナログとしては、例えば以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。また、ジアミノプロピオン酸のアナログは、以下の式から派生する上述のanalog (I)及びanalog (II)であってもよい。
Figure 0007461652000026
 ［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1－10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
本明細書における炭化水素基とは、置換基を有していてもよい炭素数1－10のアルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基が好適に挙げられる。本明細書における炭化水素基としては、好ましくは炭素数1－6のアルキル基、置換基を有していてもよいフェニル基であり、より好ましくは炭素数1－4のアルキル基、フェニル基であり、さらに好ましくはメチル基である。
本明細書における置換基としては、アルキル基、芳香族基、ハロゲン基、アジド基、アミノ基等が挙げられ、好ましくは炭素数1－4のアルキル基であり、より好ましくはメチル基である。
式(I)中の置換基を有していてもよい含窒素六員環としては、式(1)と式(2)との反応、すなわち、2+4環化付加によって生じる含窒素六員環であれば特に制限されず、具体的には、以下の構造が挙げられる。
Figure 0007461652000027
 （これらの構造中のRA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素又は炭化水素基である。RA1及びRA2は、好ましくは水素又は炭素数1－4のアルキル基であり、より好ましくは水素又はメチル基である。）
LP及びLP'は、リーダーペプチドともいい、1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表す。なお、LP及びLP'は存在していても、存在していなくてもよい。LP及びLP'が存在することにより、マクロ環化酵素、アゾール環形成酵素、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素等の酵素によって、前駆体ペプチドが認識されやすく、反応が円滑に進行する傾向にある。
LP及びLP'を構成するアミノ酸及び／又はそのアナログの数は、修飾酵素による基質認識が十分にされるようにするため、LPについては、好ましくは11個以上100個以下であり、より好ましくは11個以上60個以下であり、さらに好ましくは16個以上45個以下であり、LP'については、好ましくは11個以上100個以下であり、より好ましくは11個以上60個以下であり、さらに好ましくは16個以上45個以下である。
アゾール環形成酵素は、チオペプチド様の修飾構造を持つGoadsporinにおいて重要なリーダーペプチド領域が明らかにされている（Ozaki, T. et al. Dissection of goadsporin biosynthesis by in vitro reconstitution leading to designer analogues expressed in vivo. Nat Commun 8, 14207, doi:10.1038/ncomms14207 (2017).）。表1に、Goadsporin生合成における、リーダーペプチド切り縮め実験の結果を示す。
Figure 0007461652000028
表に示されるように、ゴードスポリンの前駆体ペプチドGodAのリーダーペプチド領域をN末端側から削った、リーダートランケート前駆体ペプチドを基質として用いている。リーダーペプチド領域が20残基(LP-20)以上であればアゾール環が6つ形成しているが、リーダーペプチド領域が15残基(LP-15)になるとアゾール環形成の効率が落ちている。また、より短くしたもの(LP-10, -5)ではアゾール環形成が見られなくなっている。
LPの配列は特に限定されないが、式(II)中のXを1番目として-20番目～-1番目（-1番目はXに隣接）のアミノ酸がN末端から順に-(-20番目)LSELTVTSLRDTVALPENGA(-1番目)-のペプチド又はこのペプチドと相同性を有するペプチドであることが好ましい。LPにおける、-LSELTVTSLRDTVALPENGA-のペプチドに対する相同性は、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上である。
LP'の配列は特に限定されないが、式(III)中のXを1番目として-25番目～-1番目のアミノ酸がN末端から順に-(-25番目)LQDLDLSELTVTSLRDTVALPENGA(-1番目)-のペプチド又はこのペプチドと相同性を有するペプチドであることが好ましい。LP'における、-LQDLDLSELTVTSLRDTVALPENGA-のペプチドに対する相同性は、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上である。
LP及びLP'の配列は、それぞれ、Xを1番目として-30番目～-1番目のアミノ酸がN末端から順に-(-30番目)VESLDLQDLDLSELTVTSLRDTVALPENGA(-1番目)-のペプチド又はこのペプチドと相同性を有するペプチドであることがより好ましく、Xを1番目として-38番目～-1番目のアミノ酸がN末端から順に-(-38番目)MSDITASRVESLDLQDLDLSELTVTSLRDTVALPENGA(-1番目)-のペプチド又はこのペプチドと相同性を有するペプチドであることがさらに好ましい。これらのペプチドに対する相同性は、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上である。
LP'においては、式(III)中のXを1番目として-17番目が疎水性アミノ酸又はその誘導体であることが好ましく、ロイシン又はそのアナログであることがより好ましく、ロイシンであることがさらに好ましい。
LP'においては、式(III)中のXを1番目として-20番目が、疎水性アミノ酸又はその誘導体であることが好ましく、ロイシン又はその誘導体であることがより好ましく、ロイシンであることがさらに好ましい。
LP'においては、式(III)中のXを1番目として-21番目が、酸性アミノ酸又はその誘導体であることが好ましく、アスパラギン酸又はその誘導体であることがより好ましく、アスパラギン酸であることがさらに好ましい。
また、LP'においては、式(III)中のXを1番目として-17番目及び-20番目が疎水性アミノ酸又はその誘導体であることが好ましく、ロイシン又はその誘導体であることがより好ましく、ロイシンであることがさらに好ましい。
さらに、LP'においては、式(III)中のXを1番目として-17番目及び-20番目が疎水性アミノ酸又はその誘導体であり、且つ-21番目が酸性アミノ酸又はその誘導体であることが好ましく、-17番目及び-20番目がロイシン又はその誘導体であり、且つ-21番目がアスパラギン酸又はその誘導体であることがより好ましく、-17番目及び-20番目がロイシンであり、且つ-21番目がアスパラギン酸であることがさらに好ましい。
式(I)及び式(II)におけるZ、式(III)におけるZ'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表す。
Z及びZ'は、存在する場合、その配列及びアミノ酸の種類は特に制限されないが、好ましくは1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであり、より好ましくは1～50個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであり、さらに好ましくは1～40個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであり、よりさらに好ましくは3～30個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドである。式(I)及び式(II)におけるZ、式(III)におけるZ'において、XcあるいはYに隣接するアミノ酸は、特に限定されないが、酸性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログであることが好ましい。
式(I)及び式(II)におけるm、式(III)におけるm'は、2から40より選択される整数であり、好ましくは2以上24以下の整数であり、より好ましくは2以上20以下の整数であり、さらに好ましくは2以上16以下の整数である。m及びm'が2から40より選択される整数であることにより、マクロ環化酵素を作用させたとき、円滑に環化が進行する傾向にある。
式(I)におけるYは、4つの、アミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基であって、以下の式(2)で表される基を含有する。式(2)で表される基は、4つの、アミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基における、2つのアミノ酸及び／又はそのアナログ分の残基である。Yにおける、式(2)で表される基以外のペプチド残基は、任意の2つのアミノ酸及び／又はそのアナログ分の残基である。
Figure 0007461652000029
 （R1及びR3は、それぞれ水素又は炭化水素基を表し、B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。）
式(I)におけるYは、4つの、アミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基であって、以下の式(2-1)又は式(2-2)で表される基を含有することが好ましい。
Figure 0007461652000030
 (R1, R4及びR5は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。)
Figure 0007461652000031
 (R1, R3及びR5は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、B1及びB2は、それぞれ酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。)
式(I)におけるYは、好ましくは以下の式(3)で表される基である。
Figure 0007461652000032
 (R1, R3, R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又は炭化水素基を表し、B1及びB2は、それぞれ酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。)
式(I)におけるYは、より好ましくは以下の式(3')で表される基である。
Figure 0007461652000033
 (R1, R3, R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、B1及びB2は、それぞれ酸素原子又は硫黄原子を表す。ただし、B1及び／又はB2が硫黄原子であるとき、R1及びR5は水素である。)
式(3)及び式(3')で表される基は、好ましくは以下の式で表される。
Figure 0007461652000034
式(I)におけるYは、さらに好ましくは以下の式(3'')で表される基である。
Figure 0007461652000035
 (R1, R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、B1及びB2は、それぞれ酸素原子又は硫黄原子を表す。ただし、B1及び／又はB2が硫黄原子であるとき、R1及びR5は水素である。)
式(3'')で表される基は、好ましくは以下の式で表される。
Figure 0007461652000036
式(I)におけるYは、よりさらに好ましくは以下の式(3-1)で表される基である。
Figure 0007461652000037
式(III)におけるY'は、－Y'(10)－Y'(11)－Y'(12)－Y'(13)－で表される4つのアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、Y'(10)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Y'(11)は、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであり、Y'(12)は、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、Y'(13)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
Y'(11)は、好ましくはセリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、より好ましくはセリン、システイン、又はトレオニンであり、さらに好ましくはセリンである。
Y'(12)は、好ましくはセリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、より好ましくはセリン又はそのアナログであり、さらに好ましくはセリンである。
Y'(11)がセリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、且つ、Y'(12)がセリン又はそのアナログであることが好ましい。
また、Y'(10)は、特に限定されないが、マクロ環化反応の効率の観点から、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであることが好ましい。Y'(13)は、特に限定されないが、マクロ環化反応の効率の観点から、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであることが好ましい。
Y'(10)は、より好ましくはセリン又はトレオニンであり、さらに好ましくはセリンである。
Y'(13)は、より好ましくはセリン、システイン、又はトレオニンであり、さらに好ましくはシステインである。
Y'(10)がセリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(11)がセリン、システイン、若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(12)がセリン又はそのアナログであり、且つ、Y'(13)がセリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであることが好ましく、Y'(10)がセリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(11)がセリン、システイン、若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(12)がセリンであり、且つ、Y'(13)がセリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであることがより好ましく、Y'(10)がセリンであり、Y'(11)がセリンであり、Y'(12)がセリンであり、且つ、Y'(13)がシステインであることがさらに好ましい。
式(III)中の(Xa')m'において、Xa'(1)におけるアミノ酸が、酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸のアナログであると、酵素反応の効率が低下する傾向にある。
したがって、式(III)中の(Xa')m'において、X'に隣接するアミノ酸残基Xa'(1)は、好ましくは、酸性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログであることが好ましい。
式(III)中の(Xa')m'において、Y'(10)のN側で隣接するアミノ酸残基、すなわち、m'番目のアミノ酸残基Xa'(m')が、酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸のアナログであると、酵素反応の効率が低下する傾向にある。
したがって、式(III)中の(Xa')m'において、m'番目のアミノ酸残基Xa'(m')は、好ましくは、酸性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログであることが好ましい。
式(III)中の(Xa')m'において、上記Xa'(m')のN側で隣接するアミノ酸残基、すなわち、m'－1番目のアミノ酸残基Xa'(m'－1)が、酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸のアナログ、若しくは、塩基性アミノ酸又は塩基性アミノ酸のアナログであると、酵素反応の効率が低下する傾向にある。
したがって、式(III)中の(Xa')m'において、m'－1番目のアミノ酸残基Xa'(m'－1)は、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログであることが好ましい。
式（III）中のZ’におけるY'(13)に隣接するアミノ酸は、任意のアミノ酸及びそのアナログであるが、酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸のアナログであると、酵素反応の効率が低下する傾向にある。
したがって、式(III)中のZ’におけるY'(13)に隣接するアミノ酸は、酸性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログであることが好ましい。
本発明のペプチドライブラリーの製造方法においては、アゾール環形成酵素、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素、マクロ環化酵素が使用される。
本発明のペプチドライブラリーの製造方法におけるアゾール環形成酵素としては、LazD, LazE, LazFを含むことが好ましい。アゾール環形成酵素としては、LazD, LazE, LazFのそれぞれと相同性を有する酵素を用いることもできる。
LazD, LazE, LazFのそれぞれと相同性を有する酵素としては、例えば、以下の表２に示す酵素が挙げられ、これらは2種以上の酵素を組み合わせて用いてよい。LazD, LazE, LazFのそれぞれと相同性を有する酵素は、LazD, LazE, LazFのホモログともいい、「ホモログ」とは、LazD, LazE, LazF以外の酵素であって、後述する実施例と同様のアゾール環形成反応を、任意のペプチドに対してLazD, LazE, LazFと同濃度で用いて行い、アゾール環化されたペプチドを検出することの可能な酵素を意味する。
LazD, LazE, LazFのホモログの相同性としては、LazD, LazE, LazFのアライメントに対してそれぞれ相同性20％以上であればよい。本明細書における「相同性を有する酵素」には、オリジナルの酵素のアライメントに対する相同性（％）が20％以上の酵素も含まれる。LazD, LazE, LazFのそれぞれのアライメントの相同性（％）に基づいて、LazD, LazE, LazFと同様に使用できる見出された酵素を、表３－１及び表３－２（LazDに関して）、表４－１～表４－８１（LazEに関して）、及び表５Ａ－１～表５Ａ－５１（LazFに関して）に示す。これらの表に示される酵素は、BLASTによる相同性検索により見出された。
本発明におけるアゾール環形成においてLazD, LazE, LazFを用いる場合、LazD及びLazEがアゾリンを形成し、続いてLazF（LazFに含まれるC末端側のアゾール環形成にかかるドメイン）がアゾールを形成することにより、アゾール環が構築される。本発明におけるアゾール環形成酵素とは、アゾリン形成、及びアゾール形成に関与する酵素を含む一群である。
ここで、LazD及びLazEのホモログは、それぞれ、アゾリン形成にかかるドメインと他の機能にかかるドメインとを一緒に含む酵素（bi-functionalな酵素ともいう）であってもよく、アゾリン形成にかかるドメインを別々に含む２つ以上の酵素であってもよい。また、LazFは、C末端側のアゾール形成にかかるドメインと、N末端側のα,β-不飽和アミノ酸形成にかかるドメインとを含む。したがって、アゾール環形成酵素としてのLazFのホモログは、アゾール形成にかかるドメインを少なくとも含む酵素であればよく、アゾール形成にかかるドメインを別々に含む２つ以上の酵素であってもよい。
以上のとおり、アゾール環形成酵素は、少なくとも、アゾリン形成、及びアゾール形成にかかるドメインを含んでいれば、特に制限されない。LazD, LazE, LazFのホモログは、LazD, LazE, LazF中のアゾリン形成及びアゾール形成にかかるドメインに対して、相同性80％以上のドメインを含むことが好ましく、相同性85％以上のドメインを含むことがより好ましく、相同性90％以上のドメインを含むことがさらに好ましい。
本発明のペプチドライブラリーの製造方法におけるα,β-不飽和アミノ酸形成酵素としては、LazB及びLazFを含むことが好ましい。α,β-不飽和アミノ酸形成酵素としては、LazB及びLazFのそれぞれと相同性を有する酵素を用いることもできる。
LazB及びLazFのそれぞれと相同性を有する酵素としては、例えば、以下の表６－１～表６－１３（LazBに関して）及び表５Ｂ－１～表５Ｂ－３２（LazFに関して）に示す酵素が挙げられ、これらは2種以上の酵素を組み合わせて用いてよい。
LazB及びLazFのそれぞれと相同性を有する酵素は、LazB, LazFのホモログともいい、「ホモログ」とは、LazB, LazF以外の酵素であって、後述する実施例と同様のα,β-不飽和アミノ酸形成反応を、任意のペプチドに対してLazB, LazFと同濃度で用いて行い、α,β-不飽和アミノ酸が形成されたペプチドを検出することの可能な酵素を意味する。
LazB及びLazFのホモログの相同性としては、LazB, LazFに対してそれぞれ相同性20％以上であればよい。
本発明におけるα,β-不飽和アミノ酸形成においてLazB及びLazFを用いる場合、LazBがグルタミル化を行い、続いてLazF（LazFのN末端側のα,β-不飽和アミノ酸形成にかかるドメイン）が脱グルタミル酸を起こさせることにより、α,β-不飽和アミノ酸が構築される。本発明におけるα,β-不飽和アミノ酸形成酵素とは、グルタミル化、及び脱グルタミル酸に関与する酵素を含む一群である。
ここで、LazB及びLazFのホモログは、グルタミル化及び脱グルタミル酸にかかるドメインと他の機能にかかるドメインとを一緒に含む酵素（bi-functionalな酵素ともいう）であってもよく、グルタミル化及び脱グルタミル酸にかかるドメインを別々に含む２つ以上の酵素であってもよい。
以上のとおり、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素は、少なくとも、グルタミル化及び脱グルタミル酸にかかるドメインを含んでいれば、特に制限されない。LazB及びLazFのホモログは、LazB及びLazF中のグルタミル化及び脱グルタミル酸にかかるドメインに対して、相同性80％以上のドメインを含むことが好ましく、相同性85％以上のドメインを含むことがより好ましく、相同性90％以上のドメインを含むことがさらに好ましい。
本発明のペプチドライブラリーの製造方法におけるマクロ環化酵素としては、LazCを含むことが好ましい。マクロ環化酵素としては、LazCと相同性を有する酵素を用いることもできる。
LazCと相同性を有する酵素としては、例えば、以下の表７－１～表７－６に示す酵素が挙げられ、これらは2種以上の酵素を組み合わせて用いてよい。
LazCと相同性を有する酵素は、LazCのホモログともいい、「ホモログ」とは、LazC以外の酵素であって、後述する実施例と同様のマクロ環化反応を、任意のペプチドに対してLazCと同濃度で用いて行い、マクロ環が形成されたペプチドを検出することの可能な酵素を意味する。
LazCのホモログの相同性としては、LazCに対して相同性20％以上であればよい。
マクロ環化酵素は、少なくともマクロ環化にかかるドメインを含んでいれば特に制限されず、LazCのホモログは、マクロ環化にかかるドメインと他の機能にかかるドメインとを一緒に含む酵素（bi-functionalな酵素ともいう）であってもよく、マクロ環化にかかるドメインを２つ以上の酵素で別々に含んでいてもよい。LazCのホモログは、LazC中のマクロ環化にかかるドメインに対して、相同性80％以上のドメインを含むことが好ましく、相同性85％以上のドメインを含むことがより好ましく、相同性90％以上のドメインを含むことがさらに好ましい。
本明細書において、「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列とY％以上の相同性を有する」とは、2つのポリペプチドのアミノ酸配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号Xに示す全アミノ酸数に対する割合が、Y％以上であることを意味する。
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本発明におけるα,β-不飽和アミノ酸形成酵素とペプチドとの反応は、グルタミル化反応における補基質及びアミノアシル化酵素の存在下で行われる。ここでグルタミル化反応における補基質及びアミノアシル化酵素は、無細胞翻訳系由来のものであってもよく、当該無細胞翻訳系に含まれるもの以外のものであってもよい。すなわち、本発明におけるα,β-不飽和アミノ酸形成酵素とペプチドとの反応は、無細胞翻訳系にグルタミル化反応における補基質及びアミノアシル化酵素を含む場合には無細胞翻訳系中のものを使用して行ってよく、また、上記無細胞翻訳系に含まれないグルタミル化反応における補基質及び／又はアミノアシル化酵素を別途添加して、それらの存在下で行ってもよい。無細胞翻訳系に含まれる補基質及びアミノアシル化酵素を使用するか、当該無細胞翻訳系以外の補基質及びアミノアシル化酵素を使用するかは、使用するα,β-不飽和アミノ酸形成酵素の種類等に応じて適宜選択すればよい。
HHpredによるアミノ酸配列の相同性情報から、LazBはLactococcus lactisの持つＩ型ランチペプチドNisinの生合成酵素NisBのN末端側領域と13%のIdentityを示した。NisBはNisin生合成において、Ser, Thrの脱水によって、デヒドロアラニン, デヒドロブチリンなどのα,β-不飽和アミノ酸の形成を触媒している。
RiPPs化合物において、デヒドロアラニンやデヒドロブチリンなどのα,β-不飽和アミノ酸は、Ser, Thrの脱水反応によって形成されることがすでに報告されている。また、Ser, Thrの脱水機構は大きく分けて二種類の異なる機構が報告されている。一つは、チオペプチドやＩ型ランチペプチドで見られるtRNA依存型の脱水機構であり、もう一つはII～IV型ランチペプチドで見られるATP依存型の脱水機構である。
tRNA型脱水機構は、NisBによって明らかにされており、以下に示すように、グルタミルtRNAにアミノアシル化されたグルタミン酸がヒドロキシ基に付加されるグルタミル化と、そのグルタミン酸の脱離によってデヒドロアミノ酸が形成する。
Figure 0007461652000224
他のチオペプチド類のα,β-不飽和アミノ酸形成はtRNA型脱水機構であることが知られており（Nature Volume 517, pages 509-512, (2015)）、LazBがNisBのN末端側領域と相同性が高い点から、LazBはグルタミルtRNAGluを用いたグルタミル化反応を触媒していると推定される。
したがって、本発明において、α,β-不飽和アミノ酸を形成する反応では、補基質としてグルタミルtRNAGluを用いる。本発明において、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素として特にLazB及びLazF、並びに／又はこれらと相同性を有する酵素を用いるとき、tRNAGluは、少なくともα,β-不飽和アミノ酸形成酵素に許容される限りは特に制限されないが、反応を効率良く進行させる観点から、放線菌由来のtRNAGlu及び／又は大腸菌由来のtRNAGluを用いることが好ましく、ラクタゾール生産菌である放線菌Streptomyces lactacystinaeus由来のtRNAGlu及び／又はラクタゾールの異種発現宿主として用いられるStreptomyces lividans由来のtRNAGluを用いることがより好ましい。
また、tRNAGluからグルタミルtRNAGluを形成するために、アミノアシル化酵素GluRSが用いられる。GluRSは、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素として特にLazB及びLazF、並びに／又はこれらと相同性を有する酵素を用いるとき、用いられるtRNAGluがグルタミル化される限りは特に制限されないが、放線菌由来のGluRS及び／又は大腸菌由来のGluRSであることが好ましく、ラクタゾール生産菌である放線菌Streptomyces lactacystinaeus由来のGluRS及び／又はラクタゾールの異種発現宿主として用いられるStreptomyces lividans由来のGluRSであることがより好ましい。放線菌由来のGluRSとは、放線菌から抽出したGluRSであってもよく、放線菌ゲノム内のGluRSを組換えタンパク質として得たものであってもよい。大腸菌由来のGluRSとは、大腸菌から抽出したGluRSであってもよく、大腸菌ゲノム内のGluRSを組換えタンパク質として得たものであってもよい。
式(II)で示されるペプチドは、例えば、式(III)で示される前駆体ペプチドから、アゾール環形成酵素、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素、マクロ環化酵素を作用させて調製してもよく、式(III)で示される前駆体ペプチドを出発物とし公知の有機化学手法により調製してもよい。また、式(II)で示されるペプチドは、公知のペプチド合成方法、例えば、J. Am.Chem. Soc 2015, 137, 3494-3497、及びJ. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 13461-13464等に記載の有機合成手法に準拠して調製してもよい。
具体的には、式(II)で示されるペプチドは、例えば、式(III)で示される前駆体ペプチドに対し、一般的な酸又は塩基触媒を作用させることにより、ペプチド中のカルボニル基とヒドロキシ基又はチオール基とを分子内で脱水縮合させることによりアゾール環を形成し、その後、ペプチド中のヒドロキシ基を脱離基へと変換し、一般的な塩基を作用させることにより、α,β-不飽和アミノ酸を形成することによって、得ることができる。また、セレノシステイン、フェニルセレノシステイン及びセレノリシン等のγ位にセレン原子を有するアミノ酸を用いて式(III)で示される前駆体ペプチドを調製し、過酸化水素等の酸化剤で処理することによりセレノキシドへと誘導し、続くβ脱離によってα,β-不飽和アミノ酸を形成してもよい。
本明細書において「無細胞翻訳系」とは、細胞を含まない翻訳系をいい、無細胞翻訳系としては、例えば、大腸菌抽出液、小麦胚芽抽出液、ウサギ赤血球抽出液、昆虫細胞抽出液等を用いることができる。また、それぞれ精製したリボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、リボソームRNA、アミノ酸、rRNA、GTP、ATP、翻訳開始因子（IF）伸長因子（EF）、終結因子（RF）、及びリボソーム再生因子（RRF）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を再構成することで構築した、再構成型の無細胞翻訳系を用いてもよい。
DNAからの転写を併せて行うためにRNAポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のRTS-100（登録商標）、再構成型翻訳系としてはPGI社のPURESYSTEM（登録商標）やNew England BioLabs社のPURExpressR In Vitro Protein Synthesis Kit等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
また、大腸菌のリボソームを用いる系として、例えば次の文献に記載された技術が公知である：H. F. Kung et al., 1977. The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894; M. C. Gonza et al., 1985, Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, 1648-1652; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg, 1996, Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16; Y. Shimizu et al., 2001, Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755; H. Ohashi et al., 2007, Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。
無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。
なお、本発明の無細胞翻訳系は、転写に必要な因子を加えて、翻訳のみならず転写に用いてもよい。
本発明の一つは、式(I)で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーであって、式(I)で表される環状化合物の少なくとも一つが、非天然型である、化合物ライブラリーである。
非天然型とは、天然に存在するラクタゾール等とは異なる構造であることを指す。
本発明の一つは、標的物質に結合する式(I)で表される環状化合物を同定するスクリーニング方法であって、本発明の製造方法で製造された化合物ライブラリー又は本発明の化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、前記標的物質と結合した式(I)で表される環状化合物を選択する工程と、スクリーニング方法である。
本発明の一つは、標的物質に結合する式(I)で表される環状化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、本発明の製造方法で製造された化合物ライブラリー又は本発明の化合物ライブラリーを含む、スクリーニング用キットである。
本発明の一つは、式(I)で表される環状化合物の製造方法であって、試験管内で、式(II)で示されるペプチドに、マクロ環化酵素を作用させ、LPを脱離させながら含窒素六員環Aを形成し、式(I)で表される環状化合物を生成する工程を含む、製造方法である。
また、本発明の一つは、式(I)で表される環状化合物の製造方法であって、式(III)で表される前駆体ペプチドをコードするmRNAを製造する工程と；前記mRNAを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、第一のペプチドを製造する工程と；アゾール環形成酵素と前記第一のペプチドとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成し、第二のペプチドを製造する工程と；グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素と前記第二のペプチドとを反応させ、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換し、第三のペプチドを製造する工程と；マクロ環化酵素と前記第三のペプチドとを反応させ、LPを脱離させながら含窒素六員環を形成し、式(I)で表される環状化合物を生成する工程；を含む、製造方法である。
本発明の化合物ライブラリーの製造方法及び環状化合物の製造方法は、第一のペプチドライブラリーあるいは第一のペプチド、第二のペプチドライブラリーあるいは第二のペプチド、第三のペプチドライブラリーあるいは第三のペプチド、及び環状化合物を製造する工程を含む場合、これらの工程は一つの系に酵素や補基質を添加して一挙に反応を行う態様、すなわち、これらの製造ステップが系内で一連に進行する態様も包含し、酵素を順に添加して反応させることによってステップワイズに反応を行う態様も包含する。
本発明の化合物ライブラリーの製造方法及び環状化合物の製造方法が包含する具体的な態様としては、例えば、
前駆体ペプチド又はピューロマイシン結合mRNAライブラリーを含む系に、まずアゾール環形成酵素を添加して反応を行い、次に必要に応じてグルタミル化反応における補基質tRNAGlu及び／又はアミノアシル化酵素GluRSを加え、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素を添加して反応を行い、さらにマクロ環化酵素を添加して反応を行う態様（パターンI）；
前駆体ペプチド又はピューロマイシン結合mRNAライブラリーを含む系に、まず必要に応じてグルタミル化反応における補基質tRNAGlu及び／又はアミノアシル化酵素GluRSを加え、アゾール環形成酵素、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素を添加して反応を行い、次にマクロ環化酵素を添加して反応を行う態様（パターンII）；
前駆体ペプチド又はピューロマイシン結合mRNAライブラリーを含む系に、まずアゾール環形成酵素を添加して反応を行い、次に必要に応じてグルタミル化反応における補基質tRNAGlu及び／又はアミノアシル化酵素GluRSを加え、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素、マクロ環化酵素を添加して反応を行う態様（パターンIII）；
前駆体ペプチド又はピューロマイシン結合mRNAライブラリーを含む系に、必要に応じてグルタミル化反応における補基質tRNAGlu及び／又はアミノアシル化酵素GluRSを加え、アゾール環形成酵素、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素、マクロ環化酵素を添加して反応を行う態様（パターンIV）；
が、挙げられる。
＜前駆体ペプチドの合成＞
試験管内でラクタゾール生合成の再構築を行うため、無細胞翻訳系を用いて前駆体ペプチドを調製した。LazAのC末端側の数アミノ酸は細胞内在性のプロテアーゼにより切断されると考えられる。そこで、精製品のあるラクタゾールAに合わせて、C末端側3残基(QDM)分を切り縮めたLazA*の合成を行った。LazA及びLazA*の配列を図１に示した。
（DNAテンプレートの作製）
無細胞翻訳系を用いて前駆体ペプチドを合成するために、まず、鋳型となるDNAテンプレートを作製した。
前駆体ペプチドLazAをコードする塩基配列のほかに、T7プロモーター配列やSD配列、リボソーム結合配列を含んだDNAテンプレートの作製を試みた。プロモーター配列やSD配列、リボソーム結合配列については、FIT-GSシステム(Goadsporin)で用いたDNAテンプレート（Ozaki, T. et al. Dissection of goadsporin biosynthesis by in vitro reconstitution leading to designer analogues expressed in vivo. Nat Commun 8, 14207, doi:10.1038/ncomms14207 (2017).）を参考にした。図２にlazA DNAテンプレートの概略図を示した。
前駆体ペプチドをコードする塩基配列については、無細胞翻訳系で大腸菌由来のRNAポリメラーゼやリボソームを利用するため、放線菌型のコドンから大腸菌型に変える必要があった。そのため、表８に示すような大腸菌のコドン使用頻度をもとに最適な塩基配列となるようにDNAテンプレートを設計した。設計した前駆体ペプチドの塩基配列を図３に示した。
Figure 0007461652000225
続いて、設計したDNAテンプレートの調製に取り組んだ。DNAテンプレートの塩基配列は214塩基対であったため、6つのプライマーを用いたプライマー伸長及びPCRによって調製した。プライマー伸長の概略図を図４に示した。また、プライマー伸長の系の反応組成、反応条件、ＰＣＲの系の反応組成、及び反応条件を表９～１５に示した。
調製したDNAテンプレートが目的の長さの塩基対を持つことは、電気泳動によって確認した。長さを確認したDNAテンプレートは、FastGene/PCR Extraction Kit (日本ジェネティクス)を用いて精製し、20 μlのMilliQ水で溶出した。
Figure 0007461652000226
Figure 0007461652000227
Figure 0007461652000228
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（無細胞翻訳系での翻訳反応）
次に、上述した（DNAテンプレートの作製）にて作製したDNAテンプレートを鋳型にして無細胞翻訳系で翻訳反応をおこない、前駆体ペプチドLazAを作製した。
本実験で使用した無細胞翻訳系は、東京大学大学院理学系研究科化学専攻の菅研究室が調製したものを使用した。無細胞翻訳系の調製は、Goto, Y., Katoh, T. & Suga, H. Flexizymes for genetic code reprogramming. Nat Protoc 6, 779-790, (2011)に記載されている。無細胞翻訳系の構成タンパク質としては、E. coli A19由来のリボソーム、翻訳伸長因子(IF1, IF2, IF3)、翻訳伸長因子(EF-G, EF-Tu, EF-Ts)、翻訳終結因子(RF2, RF3, RRF)、アミノアシルtRNA合成酵素、メチオニルtRNAホルミル転移酵素、T7 RNAポリメラーゼ、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロホスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼを使用した。
無細胞翻訳系は補因子などが入っているA溶液(Solution A)と、タンパク質が入っているB溶液(Solution B)の二つの溶液に分けて-80℃で保存してあるものを使用した。A溶液及びB溶液の組成はNature Protocols, 2011に記載されているものを使用した。メチオニルtRNAホルミル転移酵素の働きによって、合成されるペプチドのN末端のアミノ酸はホルミルメチオニンとなる。
調製したDNAテンプレートを鋳型とし、無細胞翻訳系を用いて試験管内翻訳反応を行った。試験管内翻訳系内の組成を表１６に示した。また、反応は、気相インキュベーターを用いて、３７℃で３０分インキュベーションすることにより行った。
試験管内翻訳反応後、zip tip C18を用いて脱塩操作を行った。続いて、シナピン酸をマトリックスに用いて、脱塩した翻訳ペプチドをMALDI-TOFMSで分析した。MALDI-TOF MSでの分析の結果、理論値が[M+H]+ 5672.6であるところ、[M+H]+ 5672.4にピークが観測されたことから、目的の前駆体ペプチドLazA*の合成ができたことが確認された。
Figure 0007461652000233
＜LazB, LazC, LazD, LazE, LazF、補基質、GluRSの調製＞
ライブラリーの製造に使用した酵素は以下のとおり調製した。
（LazBの調製）
ヒートショック法によりlazB-opt/ pET26bをタンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に導入し、形質転換体を取得した。そのうち1コロニーについて6 mlのLB培地を用いて37℃ 16時間の前培養を行い、これを200 mlのZYM-5052培地に4 ml植菌した。続いて18℃ 180 rpmで20時間の本培養を行った。培養後の菌体は4720×gで10分間遠心し、集菌した後-80℃で保管した。組換えタンパク質の抽出のため、菌体を50 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole pH8.0へ懸濁した。懸濁した菌体を超音波で破砕し、懸濁液を4℃ 10300×gで30分遠心した。得られた上清からBio-Scale TM Mini Profinity TM IMACカートリッジ(Bio-Rad) によってタンパク質をHis-tag精製した。懸濁したものと同様のバッファーを用いて洗浄し、imidazole濃度を200 mMまで上げたバッファーで溶出した。溶出画分をBio-Gel P-6脱塩カートリッジ(Bio-Rad)で脱塩し緩衝液を25 mM HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl 及び5% glycerolに交換した。LazB精製画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行ったところ、分子量約96 kDaのところにHis-Tag結合LazBに相当するバンドが観測され、目的のタンパク質が正しく得られていることが確認された。UV280 nmの吸光度から計算された濃度は17.9 μM (約1.7 mg/ml)であった。
（LazCの調製）
ヒートショック法によりlazC -opt/ pET26bをタンパク質発現用大腸菌BL21(DE3) に導入し、形質転換体を取得した。そのうち1コロニーについて6 mlのLB培地を用いて37℃ 16時間の前培養を行い、これを200 mlのZYM-5052培地に4 ml植菌した。続いて18℃ 180 rpmで20時間の本培養を行った。培養後の菌体はLazBと同様の方法で精製、脱塩し、緩衝液を25 mM HEPES pH 6.8, 500 mM NaClに交換した。LazC精製画分のSDS-PAGEを行ったところ、分子量約45 kDaのところにHis-Tag結合LazCに相当するバンドが観測され、目的のタンパク質が正しく得られていることが確認された。UV280 nmの吸光度から計算された濃度は23.0 μM (約1.0 mg/ml)であった。
（LazDの調製）
LazDの精製にあたり、pET26bベクターや、pET16ベクター及びシャペロンとの共発現などを試みたが、いずれも発現量が弱いうえに不溶化してしまい可溶化タンパク質は得られなかった。そこでコールドショック発現系のpColdベクターを試した。
ヒートショック法によりlazD-opt/ pColdIIをタンパク質発現用大腸菌BL21(DE3) に導入し、形質転換体を取得した。そのうち1コロニーについて20 mlのLB培地を用いて37℃、16時間の前培養を行い、これを800 mlのLB培地に16 ml植菌した。続いて37℃ 150 rpmで2時間培養したのち氷冷し、IPTGを終濃度0.1 mMとなるように加え15℃ 180 rpmで18時間培養した。培養後の菌体は4720×gで10分間遠心し、集菌した後速やかに、菌体を50 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole pH8.0, 2 mM DTTへ懸濁した。懸濁した菌体を超音波で破砕し、懸濁液を4℃ 10300×gで30分遠心した。得られた上清からBio-Scale TM Mini Profinity TM IMACカートリッジによってタンパク質をHis-tag精製した。懸濁したものと同様のバッファーを用いて洗浄し、imidazole濃度を200 mMまで上げたバッファーで溶出した。溶出画分をBio-Gel P-6脱塩カートリッジで脱塩し緩衝液を25 mM HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM DTTに交換した。LazD精製画分のSDS-PAGEを行ったところ、分子量約58 kDaのところにHis-Tag結合LazDに相当するバンドが観測され、目的のタンパク質が正しく得られていることが確認された。30 kDaの限外ろ過膜を用いて限外ろ過することで約4倍に濃縮した。濃縮した画分のUV280 nmの吸光度から計算された濃度は41.7 μM (約2.4 mg/ml)であった。
（LazEの調製）
LazEの発現、精製の際も、LazDと同様にpET26bベクターや、pET16ベクター及びシャペロンとの共発現などを試みたが、いずれも発現量が弱いうえに不溶化してしまい可溶化タンパク質は得られなかった。そこでコールドショック発現系のpColdベクターを試した。
ヒートショック法によりlazE-opt/ pColdIIをタンパク質発現用大腸菌BL21(DE3) に導入し、形質転換体を取得した。そのうち1コロニーについて20 mlのLB培地を用いて37℃ 16時間の前培養を行い、これを800 mlのLB培地に16 ml植菌した。続いて37℃ 150 rpmで2時間培養したのち氷冷し、IPTGを終濃度0.1 mMとなるように加え15℃ 180 rpmで18時間培養した。培養後の菌体はLazDと同様の方法で精製、脱塩した。LazE精製画分のSDS-PAGEを行ったところ、分子量約74 kDaのところにHis-Tag結合LazEに相当するバンドが観測され、目的のタンパク質が正しく得られていることが確認された。30 kDaの限外ろ過膜を用いて限外ろ過することで約7倍に濃縮した。濃縮した画分のUV280 nmの吸光度から計算された濃度は22.6 μM (約1.7 mg/ml)であった。
（LazFの調製）
ヒートショック法によりlazF / pET26bをタンパク質発現用大腸菌BL21(DE3) に導入し、形質転換体を取得した。そのうち1コロニーについて6 mlのLB培地を用いて37℃ 16時間の前培養を行い、これを200 mlのZYM-5052培地に4 ml植菌した。続いて18℃ 180 rpmで20時間の本培養を行った。培養後の菌体はLazBと同様の方法で精製、脱塩し、緩衝液を25 mM HEPES pH 6.8, 500 mM NaClに交換した。LazF精製画分のSDS-PAGEを行ったところ、分子量約61 kDaのところにHis-Tag結合LazFに相当するバンドが観測され、目的のタンパク質が正しく得られていることが確認された。精製されたLazFは、フラビンが結合していることを示唆する黄色を呈していた。なお、山下らによって、FMNがLazFと非共有結合していることが明らかにされている（Ozaki, T. et al. Dissection of goadsporin biosynthesis by in vitro reconstitution leading to designer analogues expressed in vivo. Nat Commun 8, 14207, (2017).）。ブラッドフォード法によって計算されたLazFの濃度は32.9 μM (約2.0 mg/ml)であった。
（補基質の調製）
LazBによるグルタミル化反応における補基質となる、ラクタゾール生産菌由来のtRNAGluをin vitro転写によって調製した。
（１）DNAテンプレートの合成
初めに、ラクタゾール生産菌である放線菌Streptomyces lactacystinaeusのゲノム内から、tRNAGlu配列を見つけ出した。S. lactacystinaeusのゲノム内には4コピーのtRNAGluがコードされていた。そのうち3コピーが完全に同一の塩基配列を持つtRNAGlu (CUC)であり、残りの1コピーがtRNAGlu (UUC) であった。図５に大腸菌、及び生産菌のtRNAGlu塩基配列のアライメントを示した。図５にあるように、アンチコドンがUUCのtRNAGluは72, 73番目の塩基がCAとなっており、アンチコドンがCUCのtRNAGluは72, 73番目の塩基がUAとなっていた。
二種のtRNAGluを調製し、二種のtRNAGlu(CUCとUUC)の鋳型となるDNAテンプレートをそれぞれ調製した（図６参照）。DNAテンプレートの合成は、前駆体ペプチド用DNAテンプレート合成と同様の操作で行った。プライマー伸長の系の反応組成、反応条件、ＰＣＲの系の反応組成、及び反応条件を表１７～２２に示した。
2nd PCR産物のうち2 μlを電気泳動して、目的の長さのDNAテンプレートが増幅していることを確認した。増幅を確認した2nd PCR産物をフェノールクロロホルム抽出することにより、タンパク質を取り除いた。最後にエタノール沈殿をしたのち、ペレットを400 μlのMilliQ水に溶解した。
Figure 0007461652000234
Figure 0007461652000235
Figure 0007461652000236
Figure 0007461652000237
Figure 0007461652000238
Figure 0007461652000239
（２）In vitro転写反応
合成したDNAテンプレートを鋳型にしてin vitro転写反応を以下の表２３の反応条件で行った。なお、転写反応は、37℃で20時間インキュベーションすることにより行った。
In vitro転写反応終了後、DNase処理をして鋳型DNAを分解した。その後、イソプロパノール沈殿をして、タンパク質を取り除いた。イソプロパノール沈殿後のペレットは400 μlのMilliQで溶解し、変性ゲルを用いてゲル精製を行った。ゲル精製後のRNA溶液を再びエタノール沈殿した後、Nanodropを用いて濃度を測定し250 μM溶液となるように調整して-80℃で保存した。
Figure 0007461652000240
（GluRSの調製）
アミノアシル化酵素GluRSは以下に示すようにグルタミン酸にtRNAGluをアミノアシル化する。放線菌型のGluRSを組換えタンパク質として取得した。
Figure 0007461652000241
ラクタゾール生産菌S. lactacystinaeusの菌株及びゲノムDNAが手に入らなかったため、ラクタゾールの異種発現宿主として用いられたS. lividansゲノム内のGluRSを組換えタンパク質として取得した（Hayashi, S. et al. Genome mining reveals a minimum gene set for the biosynthesis of 32-membered macrocyclic thiopeptides lactazoles. Chem Biol 21, 679-688, (2014).）。
具体的には、まず、S. lividansのゲノム抽出物を鋳型にして、プライマーgluRS-Fw-NdeIとgluRS-Rv-XhoIを用いてPCRでgluRS領域を増幅した。増幅した断片をNdeI, XhoIでpET26bベクターへクローニングし、gluRS/pET26bを取得した。
次に、ヒートショック法によりgluRS / pET26bをタンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に導入し、形質転換体を取得した。そのうち1コロニーについて6 mlのLB培地を用いて37℃ 16時間の前培養を行い、これを200 mlのLB培地に4 ml植菌した。続いて37℃ 150 rpmで2時間振盪培養したのち氷冷し、IPTGを終濃度0.1 mMとなるように加え、18℃ 180 rpmで20時間振盪培養した。培養後の菌体は4720×gで10分間遠心し、集菌した後-80℃で保管した。組換えタンパク質抽出のため、菌体を50 mM Tris-HCl pH8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole pH8.0へと懸濁した。懸濁した菌体を超音波で破砕し、懸濁液を4℃ 10300×gで30分遠心した。得られた上清からNi-NTAによってタンパク質をHis-tag精製した。懸濁したものと同様のバッファーを用いて洗浄し、imidazole濃度を200 mMまで上げたバッファーで溶出した。溶出した溶液をTris-HCl pH7.5で一晩透析した。His-tag精製後の放線菌型GluRSのSDS-PAGEを行ったところ、分子量約55kDa のところにHis-Tag結合GluRSに相当するバンドが観測され、目的のタンパク質が正しく得られていることが確認された。UV280 nmの吸光度から計算された濃度は39.0 μM (約2.1 mg/ml)であった。
＜環状化合物の調製＞
上述の＜前駆体ペプチドの合成＞によって得られた前駆体ペプチドから、式(I)で示される環状化合物の形成を行った。
［実施例１］ アゾール環の形成及びα,β-不飽和アミノ酸の形成
初めにLazD, LazE, LazFを用いてアゾール環形成反応を完全に進行させ、時間差をつけてLazBやtRNAGluを加えてα,β-不飽和アミノ酸形成反応を進行させるというステップワイズの反応を行った。
無細胞翻訳系5.0 μlのスケールでLazA*を合成した。ここに補酵素及びLazD, LazE, LazFを加えた反応液25μlを25℃で5時間反応させた。5時間の反応後、半量の12.5μlをzip tip C18を用いて脱塩し、MALDI-TOF MSで分析した。残りの半量12.5μlにLazB, tRNAGlu, GluRSを加えて再び25℃, 15時間反応を行った。
アゾール環の形成反応の系の組成、α,β-不飽和アミノ酸の形成反応の系の組成を、それぞれ表２４及び表２５に示した。
MALDI-TOF MSによる分析の結果、図７に示すように、LazD, LazE, LazFによる5時間の反応で、4つのアゾール環形成反応がほとんど進行していることがわかった。ここにLazB, LazF, tRNAGlu, GluRSを加えると、MALDI-TOF MSによってm/z 5502.5のメジャー反応産物が検出された。これは、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素によって-90Daのマスシフトが起きていることを表しており、5分子のH2Oの脱水が起こったことから、LazA*から、アゾール環及びデヒドロアラニンが形成されたことが確認された。
以上のとおり、ラクタゾール生合成経路におけるアゾール環形成、α,β-不飽和アミノ酸形成の試験管内再構築を達成した。
Figure 0007461652000242
Figure 0007461652000243
［比較例１］ アゾール環の形成及びα,β-不飽和アミノ酸の形成
アゾール環形成酵素LazD, LazE, LazFとα,β-不飽和アミノ酸形成酵素LazB, LazFを同時に反応させ反応生成物を分析した。
無細胞翻訳系2.5 μlのスケールでLazA*を合成した。ここに、LazD, LazE, LazF, LazB及びその他補基質を以下の組成で加え反応させた。反応は、25℃で20時間インキュベーションすることより行った。反応後、zip tip C18を用いて反応液の脱塩を行い、MALDI-TOF MSで分析した。
アゾール環及びα,β-不飽和アミノ酸の形成反応の系の組成を、表２６に示した。
MALDI-TOF MSの解析の結果、主要反応産物となっているのは、m/z 5502.6, 5656.6, 5675.6, 5695.7の4つであり、4つのアゾール環及び4つのデヒドロアラニンが形成した目的物のペプチド(m/z 5520) に伴うピークは確認されなかった。また、観察された4つのピークは考えうる中間体(様々なアゾール環形成数、α,β-不飽和アミノ酸形成数及びグルタミル化形成数の組み合わせ)のどのm/zとも一致していなかった。m/z 5656.6, 5675.6, 5695.7の3つのピークは、デヒドロアラニンに対して求核性の強いチオール基を持つ化合物などがマイケル付加反応をした結果生じた化合物由来のピークであることが予想された。
Figure 0007461652000244
［比較例２］ アゾール環の形成及びα,β-不飽和アミノ酸の形成
実施例１における、アゾール環形成反応のち、α,β-不飽和アミノ酸形成反応を進行させるというステップワイズの反応から、α,β-不飽和アミノ酸形成反応のち、アゾール環形成反応を進行させるというステップワイズの反応に変更した。具体的には以下のとおり行った。
無細胞翻訳系5.0 μlのスケールでLazA*を合成した。ここに、LazB, tRNAGlu, GluRSを加えて25℃で5時間反応させた。5時間の反応後、半量をzip tip C18を用いて脱塩し、MALDI-TOF MSで分析した。残りの半量にLazD, LazE, LazFを加えて再び25℃, 15時間反応を行った。
α,β-不飽和アミノ酸の形成反応の系の組成、アゾール環の形成反応の系の組成を、それぞれ表２７及び表２８に示した。
MALDI-TOF MSによる分析の結果、図８に示されるように、LazB, LazF, tRNAGlu, GluRSによる5時間の反応で、α,β-不飽和アミノ酸形成に伴う1, 2分子の脱水反応が確かめられた。ここにアゾール環形成酵素LazD, LazE, LazFを加えると、図７に示されるチャートとは異なり、修飾状態が異なるペプチドのピークと考えられる多数のピークが検出された。すなわち、先にα,β-不飽和アミノ酸形成反応が進行してしまうと、その後の修飾反応が円滑に進行しなくなるといえる。
Figure 0007461652000245
Figure 0007461652000246
［実施例２］ マクロ環化反応
上記［実施例１］にて述べたように、アゾール環形成、α,β-不飽和アミノ酸形成の試験管内再構築を達成した。続いて、調製した組換え酵素を用いてマクロ環化反応を行った。マクロ環化反応に関与すると予想される生合成酵素LazCを用いて反応を行った。
無細胞翻訳系5.0 μlのスケールでLazA*を合成した。ここに、LazD, LazE, LazF, LazB, LazC及びその他補基質を以下の組成で加え全量30 μlの反応系で反応させた。反応系はA. LazA*のみの反応系；B. LazA*+LazD, LazE, LazF；C. LazA*+LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu, GluRS；D. LazA*+LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu, GluRS, LazC；の4つの反応系で行った。反応は、それぞれ25℃で20時間インキュベーションすることにより行った。反応系の組成を表２９に示した。
反応後、zip tip C18を用いて反応液の脱塩を行い、MALDI-TOF MSで分析した。分析の際、半量の15 μlはシナピン酸(SA)をマトリックスとして用い、残りの半量はCHCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)をマトリックスに用いた。シナピン酸をマトリックスに用いたサンプルは分子量2000以上の領域を測定した。CHCAをマトリックスに用いたサンプルは分子量3000以下の領域を測定した。
MALDI-TOF MSによる分析の結果を図９に示した。図９に示すように、LazCを加えた系で、m/z 5400～5800の領域のペプチドが消失していること、及び代わりにm/z4102.1のペプチドが蓄積していることから、LazCが基質を消費したことが明らかとなった。また、m/z 4102.1のシグナルはLazCによって切り出されるリーダーペプチドのm/z (計算値 m/z 4102.1)と一致した。さらに、このm/z4102.1のピークについて、MALDI-TOF MS/MS解析を行ったところ、このピークはリーダーペプチドに由来することが明らかとなった。
また、図１０に示すように、LazC(+)とLazC(-)でマススペクトルを比較したところ、LazC(+)の系でラクタゾールA(計算値1423.369)のNa付加体とm/zが一致するピークを確認した。さらに、LC-MS、LC/MS/MSによっても酵素反応産物に環化化合物が合成できていることが確認された。
リーダーペプチドのm/zは検出しやすいことから、マクロ環化生成物の生成の有無を簡便に判断するための指標とすることができる。
以上のとおり、試験管内でのラクタゾールAの酵素による環化化合物の合成方法を確立した。
Figure 0007461652000247
＜基質許容性＞
上述のとおり構築した、試験管内でのラクタゾールAの酵素による環化化合物の合成方法に適用できる基質許容性を調べた。
［実施例３］ 前駆体ペプチドの長さに対する基質許容性１
マクロ環化酵素LazCによる32員環以外のマクロ環形成の可能性を確かめるため、コアペプチド領域にAlaを挿入したAla挿入前駆体ペプチドを作製し、これらを基質としてマクロ環化を行った。
実施例１と同様に、プライマー伸長及びPCRによって、変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的のAla挿入前駆体ペプチドが合成されていることを確認した。続いて、翻訳合成したAla挿入前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu(CUC), GluRS, LazCを加えて反応させた。アゾール環、α,β-不飽和アミノ酸、及びマクロ環形成反応の組成を表３０に示す。反応は、25℃で20時間インキュベーションすることにより行った。反応産物をMALDI-TOF MS及びLC-MSで分析した。
作製した前駆体ペプチドの配列及び各前駆体ペプチドから得られたアゾール環及びα,β-不飽和アミノ酸形成数を表３１に示す。各前駆体ペプチドは、ネイティブ(LazA*)と同様のアゾール環形成数及びα,β-不飽和アミノ酸形成数を見せた。このことから、Alaを挿入してもアゾール環形成、α,β-不飽和アミノ酸形成にはあまり影響がないことがわかった。なお、表中"4, 5"などの表記は2つのピークがほぼ同じ強度であることを表している。以下の表における上記表記も、同様の意味である。
また、マクロ環形成反応の反応産物の、LazC反応で切り出されるリーダーペプチドについてもマスクロマトグラムを図１１に示す。リーダーペプチドは基本的にはLazCのマクロ環化反応特異的に切り出される。クロマトグラムにおけるイオン強度が飽和しておらず、ダイナミックレンジに入っていると仮定し、切り出されたリーダーペプチドのピーク強度とマクロ環化効率が比例していると考えた。そこで、各アナログにおける脱離したリーダーペプチドのピーク面積を図１２にまとめた。図１１、図１２から明らかなように、LazCは環拡大を許容することがわかった。
Figure 0007461652000248
Figure 0007461652000249
［実施例３］ 前駆体ペプチドの長さに対する基質許容性２
1残基のAlaを挿入したAla挿入前駆体ペプチドの多くがLazCによるマクロ環化反応を受けて、環拡大したマクロ環化合物となった。そこで、LazCがどれほど大きな環を形成できるのか、また逆にどれほど小さな環を形成できるのかを調べるため、2, 3残基のAlaを挿入した変異前駆体ペプチド及び、LazA*から1, 2残基のアミノ酸を欠失した変異前駆体ペプチドを作製し、それらを基質にしてLazCと反応させた。
実施例２における方法に準じて、表３２に示す前駆体ペプチドを調製し、各前駆体ペプチドに対し、アゾール環、α,β-不飽和アミノ酸、及びマクロ環形成反応を行った。各アナログのマクロ環化の際に切り出されるリーダーペプチドのクロマトグラムを図１３に示す。リーダーペプチドのピーク面積を図１４に示す。
Figure 0007461652000250
実施例３及び４から、LazCは、26員環から41員環までのマクロ環の生成に成功しており、マクロ環の大きさに対して寛容な基質許容性を有することがわかった。
［実施例５］Ser(4), Cys(5), Ser(6), Cys(7)置換アナログ
アゾール環及びα,β-不飽和アミノ酸に変換されるアミノ酸残基であるSer(4), Cys(5), Ser(6). Cys(7)を全てAlaに置換した4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドを作製し、基質としてLazCと反応させた。
実施例３の方法に準じて、4SCSC7_4AAAA7をコードする変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的の変異前駆体ペプチドが合成されていることを確認した。続いて、翻訳合成した変異前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu(CUC), GluRS, LazCを加えて反応させた。反応産物をMALDI-TOF MS及びLC-MSで分析した。
作製した4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドのアミノ酸配列を表３３に記す。
反応産物中のリーダーペプチドのクロマトグラムを図１５に示す。4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドでもLazA*と同等量のリーダーペプチド脱離が見られたことから、LazCの基質認識において、Ser(4), Cys(5), Ser(6). Cys(7)は重要でないことが分かった。
Figure 0007461652000251
［実施例６］Ser(11), Ser(12), Cys(13), Ser(10)置換アナログ
Ser(11), Ser(12), Cys(13)及びその周辺のSer(10)について、それぞれを一つずつAlaに置換した変異前駆体ペプチドを作製し、それらがLazCの基質として認識されるのかを解析した。
実施例３の方法に準じて、表３４に記載のアナログをコードする変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的の変異前駆体ペプチドが合成されていることを確認した。続いて、翻訳合成した変異前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu(CUC), GluRS, LazCを加えて反応させた。反応産物をMALDI-TOF MS及びLC-MSで分析した。
作製した前駆体ペプチドのアミノ酸配列、及びアゾール環及びα,β-不飽和アミノ酸形成数を表３４に記す。
反応産物中のリーダーペプチドのクロマトグラムを図１６に示す。S11AとC13Aでは切り出されたリーダーペプチドがわずかに見られるが、S11A, S12Aではほとんど見られなかった。このことから、LazCが基質として認識するためには、Ser(11)とSer(12)が重要であり、Ser(10)とCys(13)も比較的重要であることが明らかになった。
Figure 0007461652000252
［実施例７］Trp(2), Gly(3), Gln(8), Ala(9), Gln(15), Pro(16)置換アナログ
実施例５によってSer(4), Cys(5), Ser(6), Cys(7)が置換されていたとしてもマクロ環化が進行することが明らかとなり、実施例６によって、LazCが基質として認識するためには、Ser(11)とSer(12)が重要であり、Ser(10)とCys(13)も比較的重要であることが明らかになった。
マクロ環内に含まれることになる、その他のアミノ酸Trp(2), Gly(3), Gln(8), Ala(9)について、置換が可能であるかの検討を行った。また、マクロ環外のアミノ酸について、Gln(15), Pro(16)置換アナログについてもマクロ環化が進行するか検討を行った。
実施例３の方法に準じて、表３５に示す前駆体ペプチドをコードする変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的の変異前駆体ペプチドが合成されていることを確認した。続いて、翻訳合成した変異前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu(CUC), GluRS, LazCを加えて反応させた。反応産物をMALDI-TOF MS及びLC-MSで分析した。LC-MSの分析結果（リーダーペプチド及びマクロ環化物のMSピーク）を図１７、１８、及び１９に示す。
なお、表中、"3, (2)"などの"( )"表記はマイナーピークを表す。以下の表における上記表記は、同様の意味である。
また、マクロ環内の残基(Trp(2), Gly(3), Gln(8), Ala(9), Gln(15), Pro(16))を置換した際の反応効率の結果をまとめた図を図２０に示す。図２０中、括弧が付されたアミノ酸残基は、反応効率が低下した残基を意味する。
Figure 0007461652000253
［実施例８－１］前駆体ペプチドの長さに対する基質許容性３
LazCが触媒できるマクロ環の大きさをさらに検討するため、4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドに複数のAlaを挿入したAla複数挿入前駆体ペプチドと、逆に複数の残基を欠失させた複数欠失前駆体ペプチドを作製した。
実施例３の方法に準じて、4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドに1～7つのAlaを挿入した前駆体ペプチド、及び4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドから1～8つのアミノ酸残基を欠失した前駆体ペプチドをコードする変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的の変異前駆体ペプチドが合成されていることを確認した。続いて、翻訳合成した変異前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu(CUC), GluRS, LazCを加えて反応させた。反応産物をMALDI-TOF MS及びLC-MSで分析した。
作製したAla複数挿入及び複数欠失前駆体ペプチドのアミノ酸配列、及びアゾール環及びα,β-不飽和アミノ酸形成数を表３６に記す。各変異前駆体ペプチドで同様のアゾール環形成、α,β-不飽和アミノ酸形成が見られることから、LazD, LazE, LazF, LazBはこれら変異前駆体ペプチドを基質として許容することが分かった。このことは、アゾール環形成酵素とα,β-不飽和アミノ酸形成酵素の基質認識において、リーダーペプチド領域からの距離は重要ではなく、基質となる残基の周りのアミノ酸配列の並びが重要であると示唆している。
反応産物中のリーダーペプチドのクロマトグラムを図２１、図２２に示す。また、リーダーペプチドのピーク面積を図２３、図２４に示す。
Figure 0007461652000254
［実施例８－２］前駆体ペプチドの長さに対する基質許容性４
Laz酵素群が形成できるマクロ環の大きさをさらに検討するため、4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドに複数のAla及びAsnを挿入したAla及びAsn複数挿入前駆体ペプチドと、逆に複数の残基を欠失させた複数欠失前駆体ペプチドを作製した。
実施例３の方法に準じて、4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドにAla及びAsnを挿入した前駆体ペプチド、及び4SCSC7_4AAAA7前駆体ペプチドからアミノ酸残基を欠失した前駆体ペプチドをコードする変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的の変異前駆体ペプチドが合成されていることを確認した。続いて、翻訳合成した変異前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu(CUC), GluRS, LazCを加えて反応させた。反応産物をLC-MSで分析した。本実験では、前駆体ペプチドの4価もしくは5価のm/z値の前後400もしくは600の範囲に検出されたピークを積算した広範囲の抽出イオンクロマトグラム（brEIC）によってLaz酵素群による修飾反応とマクロ環化生成物の生成を確認した。brEICでは、前駆体ペプチド・アゾリン/アゾール/脱水アミノ酸を有する直鎖中間体ペプチド・LazC反応によるリーダーペプチド断片（LP-NH2）の全ての存在を同時に確認することができる。各反応産物のbrEICを図２５に示す。
［実施例９－１］Cys置換アナログにおけるアゾール環形成酵素の基質許容性
アゾール環形成酵素の基質認識を明らかにするため、コアペプチド領域の残基を一つずつCysに置換したCys置換前駆体ペプチドを作製し、アゾール環形成酵素と反応させた。
実施例３の方法に準じて、コアペプチド領域のアミノ酸残基をひとつずつCysに置換したCys置換前駆体ペプチドをコードする変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的の変異前駆体ペプチドが合成されていることを確認した。続いて、翻訳合成した変異前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazFを加えて反応させた。反応産物をMALDI-TOF MSで分析した。
作製したCys置換前駆体ペプチドのアミノ酸配列と、観測されたアゾール環形成数を表３７に記す。アゾール環形成酵素はCys, Serが密集した領域を認識しており、その領域内のCys, Ser残基をアゾール環化する傾向があることが分かった。
Figure 0007461652000255
［実施例９－２］Ala置換アナログにおけるマクロ環化の基質許容性
実施例１と同様に、プライマー伸長及びPCRによって、変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで、以下に示すネイティブ型における１～１６番目の各アミノ酸をAlaに置き換えた、S1A, W2A, G3A, S4A, C5A, S6A, C7A, Q8A, S10A, S11A, S12A, C13A, Q15A, P16A改変前駆体ペプチド（図２６参照）を合成した。
Figure 0007461652000256
続いて、上述した改変前駆体ペプチドに対して、実施例８－２と同様にして反応を行い、反応産物をLC-MSで分析した。前駆体ペプチドの4価のm/z値の前後400の範囲に検出されたピークを積算した広範囲の抽出イオンクロマトグラム（brEIC）によってLaz酵素群による修飾反応とマクロ環化生成物の生成を確認した。各反応産物のbrEICを図２６に示す。なお、クロマトグラムにおいて、S1A, S11A, S12Aについてのマクロ環化産物のピークは観測されなかった。
［実施例９－３］Lys置換アナログにおけるマクロ環化の基質許容性
実施例１と同様に、プライマー伸長及びPCRによって、変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで、以下に示すネイティブ型における２～９、１４～１６番目の各アミノ酸をLysに置き換えた、W2K, G3K, A4K, A5K, A6K, A7K, Q8K, A9K, Q15K, P16K改変前駆体ペプチド（図２７参照）を合成した。
Figure 0007461652000257
続いて、上述した改変前駆体ペプチドに対して、実施例９－２に記載の手順に準拠して反応を行い、反応産物をLC-MSで分析した。前駆体ペプチドの4価のm/z値の前後400の範囲に検出されたピークを積算した広範囲の抽出イオンクロマトグラム（brEIC）によってLaz酵素群による修飾反応とマクロ環化生成物の生成を確認した。各反応産物のbrEICを図２７に示す。
［実施例９－４］Glu置換アナログにおけるマクロ環化の基質許容性
実施例９－３と同様に、ネイティブ型における２～９、１５～１６番目の各アミノ酸をGluに置き換えた、W2E, G3E, A4E, A5E, A6E, A7E, Q8E, A9E, Q15E, P16E改変前駆体ペプチド（図２８参照）を合成した。続いて、上述した改変前駆体ペプチドに対して、実施例９－２に記載の手順に準拠して反応を行い、反応産物をLC-MSで分析した。前駆体ペプチドの4価のm/z値の前後400の範囲に検出されたピークを積算した広範囲の抽出イオンクロマトグラム（brEIC）によってLaz酵素群による修飾反応とマクロ環化生成物の生成を確認した。各反応産物のbrEICを図２８に示す。
［実施例１０－１］Ser(10), Ser(11), Cys(13)置換アナログにおけるマクロ環化の基質許容性
実施例１と同様に、プライマー伸長及びPCRによって、変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的のS10T, S11T, S11C, C13S, C13T改変前駆体ペプチド（表３８参照）が合成されていることを確認した。
続いて、翻訳合成したS10T, S11T, S11C, C13S, C13T改変前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu(CUC), GluRS, LazCを加えて反応させた。アゾール環、α,β-不飽和アミノ酸、及びマクロ環形成反応の組成を表３９に示す。反応は、25℃で20時間インキュベーションすることにより行った。反応産物をMALDI-TOF MS及びLC-MSで分析した。反応産物中のリーダーペプチドのクロマトグラムを図２９に示す。
Figure 0007461652000258
Figure 0007461652000259
［実施例１０－２］C末端領域についてのアナログ（置換及び伸長）におけるマクロ環化の基質許容性
実施例１と同様に、プライマー伸長及びPCRによって、変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで、図３０に示す、C末端領域についての改変前駆体ペプチドを得た。続いて、翻訳合成したC末端領域についての改変前駆体ペプチドに対して、実施例１０－１に記載の手順に準拠して反応を行い、反応産物をLC-MSで分析した。前駆体ペプチドの5価のm/z値の前後400の範囲に検出されたピークを積算した広範囲の抽出イオンクロマトグラム（brEIC）によってLaz酵素群による修飾反応とマクロ環化生成物の生成を確認した。各反応産物のbrEICを図３０に示す。
［実施例１０－３］環内部の配列をランダムな人工配列としたアナログ、及び、環内部の配列をランダムとし且つC末端領域を伸長したアナログにおけるマクロ環化の基質許容性
実施例１と同様に、プライマー伸長及びPCRによって、変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで、目的の図３１に示す、環内部の配列をランダムとした改変前駆体ペプチド（図３１のａ）、及び、環内部の配列をランダムとし且つC末端領域を伸長した改変前駆体ペプチド（図３１のｂ）を得た。続いて、翻訳合成したC末端領域についての改変前駆体ペプチドに対して、まず、LazD, LazE, LazFを加え25℃6時間反応を行い、その後LazB、補基質tRNAGlu、アミノアシル化酵素GluRS、LazCを加え25℃12時間反応を行い、反応産物をLC-MSで分析した。前駆体ペプチドの4価もしくは5価のm/z値の前後600の範囲に検出されたピークを積算した広範囲の抽出イオンクロマトグラム（brEIC）によってLaz酵素群による修飾反応とマクロ環化生成物の生成を確認した。各反応産物のbrEICを図３１に示す。
［実施例１１］リーダーペプチドの認識
ラクタゾール生合成酵素におけるリーダーペプチドの役割を明らかにするため、リーダーペプチドトランケート前駆体ペプチドを作製し、これを基質として各修飾酵素と反応させた。
38残基あるリーダーペプチドを、N末端側から切り縮めた変異前駆体ペプチドを作製した。作製した変異前駆体ペプチドは、リーダーペプチドを30, 25, 20, 15残基としたもので、それぞれLP-30, LP-25, LP-20, LP-15と名付けた。これら4種の変異前駆体ペプチドを基質にして、アゾール環形成反応、α,β-不飽和アミノ酸形成反応、マクロ環化反応を行った。反応産物をMALDI-TOF MS及びLC-MSで解析することで反応の進行の有無を確かめた。
作製したリーダーペプチドトランケート前駆体ペプチドのアミノ酸配列を表４０に記す。配列のSWGSCSCQASSSCAQPはコアペプチド領域である。また、翻訳合成しているためN末端は常にホルミルメチオニンである。各変異前駆体ペプチドを基質としてLazD, LazE, LazFによるアゾール環形成反応及び、LazB, LazFによるα,β-不飽和アミノ酸形成反応の結果、LP-25までは、アゾール環形成及びα,β-不飽和アミノ酸形成がほとんど完全に進行したが、LP-20では、アゾール環形成及びα,β-不飽和アミノ酸形成の効率が低下することがわかった。マスクロマトグラムの結果を図３２～３６に示す。
各変異前駆体ペプチドを基質としてLazCによるマクロ環化反応によって生じるリーダーペプチドのマスクロマトグラムを図３７に示す。
以上の結果から、ラクタゾール生合成における、アゾール環形成酵素、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素においてリーダーペプチドの重要部位は、Leu(-25)よりC末端側であることがわかった。また、マクロ環化酵素については、少なくともLeu(-20)よりC末端側領域があれば反応が進行することが分かった。
Figure 0007461652000260
［実施例１２］リーダーペプチドのAlaスキャニング実験
図３８に示すLP-25におけるリーダーペプチドの-1から-25に位置するアミノ酸残基をそれぞれAlaに置換した改変前駆体ペプチドを調製し、アゾール環、α,β-不飽和アミノ酸、及びマクロ環形成反応に対する基質許容性を確認した。
具体的には、実施例１と同様に、プライマー伸長及びPCRによって、変異DNAテンプレートを作製し、無細胞翻訳系で翻訳することで目的のリーダーペプチド部位の改変体である改変前駆体ペプチドが合成されていることを確認した。
続いて、翻訳合成したAla挿入前駆体ペプチドに対して、LazD, LazE, LazF, LazB, tRNAGlu(CUC), GluRS, LazCを加えて反応させた。アゾール環、α,β-不飽和アミノ酸、及びマクロ環形成反応の組成を表４１に示す。反応は、25℃で20時間インキュベーションすることにより行った。反応産物をMALDI-TOF MS及びLC-MSで分析した。
-1から-25に位置するアミノ酸残基が置換された各改変前駆体ペプチドの反応産物中のリーダーペプチドのクロマトグラムを図３９に示す。図３９中、例えば「LP-25_S-19A」は、「-19に位置するアミノ酸（S）がAla置換された改変前駆体ペプチド」を意味し、その他の改変前駆体ペプチドも同様に表記する。
Figure 0007461652000261
［実施例１３］化合物ライブラリーの調製及びスクリーニング
図４０に示すように、「リーダーペプチド－Ser－５から１０残基からなる任意のアミノ酸配列－Ser－Ser－Ser－Cys－３残基からなる任意のアミノ酸配列」を含むペプチドから構成される化合物ライブラリーをデザインした。上記の化合物ライブラリーのデザインに基づき、DNAライブラリーを調製した。DNAライブラリーの調製に際しては、Chemistry & Biology 18, 1562-1570 (2011), 及びChemistry & Biology 21, 766-774 (2014)に記載の方法に準拠した。上記DNAライブラリーを試験管内で転写することでmRNAライブラリーを調製した。mRNAライブラリーは、図４１の電気泳動ゲルに示すように合成できていることが確認された。なお、電気泳動ゲルの図中の６から１１は、各々５、６、７、８、９、及び１０残基からなる任意のアミノ酸配列を含むmRNAライブラリーであることを指す。作製したmRNAライブラリーが正しい配列を有することを確認するため、mRNAライブラリーを逆転写した後に、得られたDNAの配列をハイスループットシークエンサー（MiSeq、イルミナ社）により解析した。また、DNA配列をシーケンシングする際のシーケンスクオリティスコアQ（図４２）、フレームシフト解析（図４３）、配列保存性プロット（図４４）、アミノ酸頻度分析（図４５）の結果から、mRNAライブラリーがデザイン通りに正しく構築されていることが確認された。
また、図４６に示すスキームのとおり、上述のmRNAライブラリーからペプチド－mRNA複合体ライブライブラリーを構築し、さらにLazB-F酵素を作用させてチオペプチドを含む化合物ライブラリーを構築した。その後、上記化合物ライブラリーを酵素iPGMと相互作用する環状ペプチドをスクリーニングする工程に供したところ、図４７に示すcDNAの回収率のグラフから分かるように、iPGMに結合する環状ペプチドが取得できた。
以上の結果から、アゾール環形成酵素、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素、及びマクロ環化酵素を用いることを特徴とする本発明の製造方法によって、化合物ライブラリーを提供できることが示された。
［実施例１４－１］非タンパク質性アミノ酸を含む環状ペプチドの合成
図４８に示すリプログラミングのスキームに基づき、アゾール環形成、α,β-不飽和アミノ酸形成、及びマクロ環化を行う前の前駆体ペプチドのコアペプチド部分に非タンパク質性アミノ酸を導入した。DNAテンプレート及び当該テンプレートから生成するペプチドを図４９に示す。図４９中、枠線を付したコドン及びアミノ酸がリプログラミングされるコドン及びアミノ酸を指し、非タンパク質性アミノ酸の導入される位置となる。
実施例１に記載の方法に準拠して、上記DNAテンプレートを翻訳し、さらにLazB, C, D, E, Fの酵素を作用させる工程を経て、環状ペプチドへと誘導した。翻訳後及び環状ペプチド化まで行った時点の生成物のLC/MSを測定し、非タンパク質性アミノ酸が導入されたDNAテンプレートにおける翻訳の進行と、環状ペプチドの生成の有無とを確認した。結果を表４２～表４４に示す。表中「観測結果」に示されるｍ／ｚは、観測されたMSの値であり、環状ペプチドのMSの値である。
導入された非天然アミノ酸の構造は、以下のとおりである。
なお、表４３中、v.064及びv.082は、リプログラミングされるコドンを含まないDNAテンプレートから得られた前駆体ペプチドである。v.064及びv.082においても、環状ペプチドのMSが観測された。v.064及びv.082から環状ペプチドが得られたことは、式(II)及び式(III)におけるZ及びZ'に相当するペプチドの長さ及び種類が制限されないことを指す。
Figure 0007461652000262
Figure 0007461652000263
Figure 0007461652000264
Figure 0007461652000265
［実施例１４－２］非タンパク質性アミノ酸置換アナログNMeGlyにおけるマクロ環化の基質許容性
実施例９－２と同様に、ネイティブ型における２～９、１３～１６番目の各アミノ酸をNMeGlyに置き換えた、W2NMeGly, G3NMeGly, A4NMeGly, A5NMeGly, A6NMeGly, A7NMeGly, Q8NMeGly, A9NMeGly, C13NMeGly, A14NMeGly, Q15NMeGly, P16NMeGly改変前駆体ペプチド（図５０参照）を合成した。なお、遺伝暗号のリプログラミングの都合上前駆体ペプチドのN末端残基はホルミルメチオニン（fMet）ではなく、ビオチン化フェニルアラニン（bioF）に変更した。続いて、上述した改変前駆体ペプチドに対して、実施例９－２に記載の手順に準拠して反応を行い、反応産物をLC-MSで分析した。前駆体ペプチドの4価のm/z値の前後400の範囲に検出されたピークを積算した広範囲の抽出イオンクロマトグラム（brEIC）によってLaz酵素群による修飾反応とマクロ環化生成物の生成を確認した。各反応産物のbrEICを図５０に示す。
［実施例１４－３］非タンパク質性アミノ酸置換アナログNMeAlaにおけるマクロ環化の基質許容性
実施例９－２と同様に、ネイティブ型における２～９、１３～１６番目の各アミノ酸をNMeAlaに置き換えた、W2NMeAla, G3NMeAla, A4NMeAla, A5NMeAla, A6NMeAla, A7NMeAla, Q8NMeAla, A9NMeAla, C13NMeAla, A14NMeAla, Q15NMeAla, P16NMeAla改変前駆体ペプチド（図５１参照）を合成した。なお、遺伝暗号のリプログラミングの都合上前駆体ペプチドのN末端残基はホルミルメチオニン（fMet）ではなく、ビオチン化フェニルアラニン（bioF）に変更した。続いて、上述した改変前駆体ペプチドに対して、実施例９－２に記載の手順に準拠して反応を行い、反応産物をLC-MSで分析した。前駆体ペプチドの4価のm/z値の前後400の範囲に検出されたピークを積算した広範囲の抽出イオンクロマトグラム（brEIC）によってLaz酵素群による修飾反応とマクロ環化生成物の生成を確認した。各反応産物のbrEICを図５１に示す。
［実施例１５］mRNA上にディスプレイされた前駆体ペプチドでの反応
mRNA上にディスプレイされた前駆体ペプチドがラクタゾール生合成酵素によって修飾されることを明らかにするため、図５２に概略した実験を行った。前駆体ペプチドをコードしたmRNAの3'領域に対して、T4RNAリガーゼを用いてピューロマイシンでラベル化したDNAリンカーを連結した。このピューロマイシンでラベル化したmRNAを鋳型として翻訳合成することで、前駆体ペプチドとmRNA上にディスプレイされた前駆体ペプチドとの混合物を得た。mRNAに相補的なビオチン化DNAとストレプトアビジンビーズとを用いることで、この混合物からmRNA上にディスプレイされた前駆体ペプチドを単離した。これに対してLaz酵素群とインキュベーションすることで修飾反応を実施し、生成物をLC-MSによって解析した。その結果、図５３に示した通り、修飾反応が進行した際に生成するリーダーペプチド断片が検出できたことから、mRNA上にディスプレイされた前駆体ペプチドがラクタゾール生合成酵素によって修飾されることが実証された。
［実施例１６］各酵素を添加する順番による反応への影響の検討
反応系に酵素を添加する順番を変えることによって、前駆体ペプチドに対する反応の影響について検討を行った。
図５４に示すI, II, III, IVの酵素の添加パターンで、無細胞翻訳系による前駆体ペプチドLazA*の反応を試みた。Iでは、まず、LazD, LazE, LazFを加え25℃16時間反応を行い、次にLazBならびに補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSを加え25℃で6時間反応を行い、その後LazCを加え25℃0.5時間反応を行った。IIでは、まず、LazD, LazE, LazF, LazB、補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSを加え25℃で16時間反応を行い、その後LazCを加え25℃0.5時間反応を行った。IIIでは、まず、LazD, LazE, LazFを加え25℃6時間反応を行い、その後LazB、補基質tRNAGlu、アミノアシル化酵素GluRS、LazCを加え25℃12時間反応を行った。IVでは、LazD, LazE, LazF、LazB、補基質tRNAGlu、アミノアシル化酵素GluRS、LazCを加え25℃16時間反応を行った。
I、II、III、IVの結果を図５４に示す。I及びIIにおいては、Dha野生型ラクタゾールA中で修飾されていないSer4が脱水された修飾体であるDha4-ラクタゾールAが得られた。酵素及びその他の補基質の添加の順番を変えることにより、得られる環状ペプチドにおけるデヒドロアラニンDhaの導入量を制御することができることがわかった。また、IIIではI、II、IVと比べて、より効率良くマクロ環化産物を与えることがわかった。

Claims (28)

  1. 式(I);
    Figure 0007461652000266
     ［式(I)中、
    m個のXa、並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
    Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
    mは、2から40より選択される整数であり、
    環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
    B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
    R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
    で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
    試験管内で、式(II)；
    LP－X－(Xa)m－Y－Z (II)
    ［式(II)中、
    Xは、式(1)；
    Figure 0007461652000267
     （R2は、水素原子又は炭化水素基である。）
    で表される基を表し、
    Yは、4つの、アミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基であって、式(2)；
    Figure 0007461652000268
     （R1及びB1は、前記と同義であり、R3は、水素又は炭化水素基を表す。）
    で表される基を含有し、
    m個のXa、m及びZは、前記と同義であり、
    LPは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基を表す。］
    で示される2種以上のペプチドに、マクロ環化酵素を作用させ、LPが存在する場合にはLPを脱離させながら含窒素六員環Aを形成し、式(I)で表される2種以上の環状化合物を生成する工程を含む、化合物ライブラリーの製造方法。
  2. LPが、11個以上100個以下のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基である、請求項１に記載の製造方法。
  3. mが、2から24より選択される整数である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. Yが、以下の式(3)で表される基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
    Figure 0007461652000269
     (R1、R3、R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又は炭化水素基を表し、B1及びB2は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。)
  5. Yが、以下の式(3')で表される基である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方
    法。
    Figure 0007461652000270
     (R1、R3、R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、B1及びB2は、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を表す。ただし、B1及び／又はB2が硫黄原子であるとき、R1及びR5は水素である。)
  6. Yが、以下の式(3'')で表される基である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
    Figure 0007461652000271
     (R1、R4及びR5は、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、B1及びB2は、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を表す。ただし、B1及び／又はB2が硫黄原子であるとき、R1及びR5は水素である。)
  7. Yが、以下の式(3-1)で表される基である、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
    Figure 0007461652000272
  8. マクロ環化酵素が、LazC及び／又はLazCと相同性を有する酵素を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 式(I);
    Figure 0007461652000273
     ［式(I)中、
    m個のXa、並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
    Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
    mは、2から40より選択される整数であり、
    環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
    B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
    R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
    で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
    式(III)で表される前駆体ペプチド；
    LP'－X'－(Xa')m'－Y'－Z' (III)
    ［式(III)中、
    X'は、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
    Y'は、－Y'(10)－Y'(11)－Y'(12)－Y'(13)－で表される4つのアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、Y'(10)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Y'(11)は、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであり、Y'(12)は、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(13)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
    m'個のXa'、m'及びZ'は、それぞれ前記式(I)におけるm個のXa、m及びZと同義であり、
    LP'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表す。］
    をコードするmRNAライブラリーを製造する工程と；
    前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、第一のペプチドライブラリーを製造する工程と；
    以下の各反応：
    アゾール環形成酵素により、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成する第１反応；
    グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素により、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換する第２反応；及び
    マクロ環化酵素により、LP'が存在する場合にはLP'を脱離させながら含窒素六員環を形成する第３反応；
    により、前記第一のペプチドライブラリーから前記式(I)で表される環状化合物を2種以上含む化合物ライブラリーを生成する工程と；
    を含み、
    前記第１反応、第２反応及び第３反応は、系内で一連に進行してもよく、ステップワイズに進行してもよい、
    化合物ライブラリーの製造方法。
  10. 式(I);
    Figure 0007461652000274
     ［式(I)中、
    m個のXa、並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
    Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
    mは、2から40より選択される整数であり、
    環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
    B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
    R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
    で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーの製造方法であって：
    式(III)で表される前駆体ペプチド；
    LP'－X'－(Xa')m'－Y'－Z' (III)
    ［式(III)中、
    X'は、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
    Y'は、－Y'(10)－Y'(11)－Y'(12)－Y'(13)－で表される4つのアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、Y'(10)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Y'(11)は、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであり、Y'(12)は、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(13)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
    m'個のXa'、m'及びZ'は、それぞれ前記式(I)におけるm個のXa、m及びZと同義であり、
    LP'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表す。］
    をコードするmRNAライブラリーを製造する工程と；
    前記mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
    前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、第一のペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
    以下の各反応：
    アゾール環形成酵素により、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成する第１反応；
    グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素により、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換する第２反応；及び
    マクロ環化酵素により、LP'が存在する場合にはLP'を脱離させながら含窒素六員環を形成する第３反応；
    により、前記第一のペプチド－mRNA複合体ライブラリーから前記式(I)で表される環状化合物を2種以上含む化合物ライブラリーを生成する工程と；
    を含み、
    前記第１反応、第２反応及び第３反応は、系内で一連に進行してもよく、ステップワイズに進行してもよい、
    化合物ライブラリーの製造方法。
  11. LP'が、11個以上100個以下のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドである、請求項９又は１０に記載の製造方法。
  12. mが、2から24より選択される整数である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. Y'(10)が、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、
    Y'(13)が、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の製造方法。
  14. Y'(11)が、セリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
    Y'(12)が、セリン若しくはトレオニン、又はそのアナログである、請求項９～１３のいずれか一項に記載の製造方法。
  15. Y'(11)が、セリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
    Y'(12)が、セリン又はそのアナログである、請求項９～１４のいずれか一項に記載の製造方法。
  16. Y'(10)が、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、
    Y'(11)が、セリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
    Y'(12)が、セリンであり、
    Y'(13)が、セリン、システイン、若しくはトレオニン、又はこれらのアナログである、
    請求項９～１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  17. 式(III)中の(Xa')m'において、X'に隣接するアミノ酸残基Xa'(1)が、酸性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログである、請求項９～１６のいずれか一項に記載の製造方法。
  18. 式(III)中の(Xa')m'において、m'番目のアミノ酸残基Xa'(m')が、酸性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログである、請求項９～１７のいずれか一項に記載の製造方法。
  19. 式(III)中の(Xa')m'において、m'－1番目のアミノ酸残基Xa'(m'－1)が、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸以外のアミノ酸又はそのアナログである、請求項９～１８のいずれか一項に記載の製造方法。
  20. アゾール環形成酵素が、LazD、LazE、及びLazF、並びに／又はこれらと相同性を有する酵素を含む、請求項９～１９のいずれか一項に記載の製造方法。
  21. α,β-不飽和アミノ酸形成酵素が、LazB及びLazF、並びに／又はこれらと相同性を有する酵素を含む、請求項９～２０のいずれか一項に記載の製造方法。
  22. マクロ環化酵素が、LazC及び／又はLazCと相同性を有する酵素を含む、請求項９～２１のいずれか一項に記載の製造方法。
  23. グルタミル化反応における補基質tRNAGluが、放線菌由来のtRNAGluであり、
    アミノアシル化酵素GluRSが、放線菌由来のGluRSである、請求項９～２２のいずれか一項に記載の製造方法。
  24. 式(I);
    Figure 0007461652000275
     ［式(I)中、
    m個のXa、並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
    Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
    mは、2から40より選択される整数であり、
    環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
    B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
    R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
    で表される環状化合物を2種以上含む、化合物ライブラリーであって、
    式(I)で表される環状化合物の少なくとも一つは、非天然型である、化合物ライブラリー。
  25. 標的物質に結合する式(I)で表される環状化合物を同定するスクリーニング方法であって、
    請求項１～２３のいずれか１項に記載の製造方法で製造された化合物ライブラリー又は請求項２４に記載の化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
    前記標的物質と結合した式(I)で表される環状化合物を選択する工程と、を含む方法。
  26. 標的物質に結合する式(I)で表される環状化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、
    請求項１～２３のいずれか１項に記載の製造方法で製造された化合物ライブラリー又は請求項２４に記載の化合物ライブラリーを含む、キット。
  27. 式(I);
    Figure 0007461652000276
     ［式(I)中、
    m個のXa、並びにXb及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
    Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
    mは、2から40より選択される整数であり、
    環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
    B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
    R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
    で表される環状化合物の製造方法であって、
    試験管内で、式(II)；
    LP－X－(Xa)m－Y－Z (II)
    ［式(II)中、
    Xは、式(1)；
    Figure 0007461652000277
     （R2は、水素又は炭化水素基である。）
    で表される基を表し、
    Yは、4つの、アミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、式(2)；
    Figure 0007461652000278
     （R1及びR3は、それぞれ水素又は炭化水素基を表し、B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基を表す。）
    で表される基を含有し、
    m個のXa、m及びZは、前記と同義であり、
    LPは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチド残基を表す。］
    で示されるペプチドに、マクロ環化酵素を作用させ、LPが存在する場合にはLPを脱離させながら含窒素六員環Aを形成し、式(I)で表される環状化合物を生成する工程を含む、製造方法。
  28. 式(I);
    Figure 0007461652000279
     ［式(I)中、
    m個のXa、Xb、及びXcは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、
    Zは、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表し、
    mは、2から40より選択される整数であり、
    環Aは、置換基を有していてもよい含窒素6員環であり、
    B1は、酸素原子、硫黄原子、又はNH基であり、
    R1は、水素原子又は炭化水素基である。］
    で表される環状化合物の製造方法であって：
    式(III)で表される前駆体ペプチド；
    LP'－X'－(Xa')m'－Y'－Z' (III)
    ［式(III)中、
    X'は、セリン若しくはトレオニン、又はこれらのアナログであり、
    Y'は、－Y'(10)－Y'(11)－Y'(12)－Y'(13)－で表される4つのアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドであって、Y'(10)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Y'(11)は、セリン、システイン、トレオニン、若しくはジアミノプロピオン酸又はこれらのアナログであり、Y'(12)は、セリン若しくはトレオニン又はこれらのアナログであり、Y'(13)は、任意のアミノ酸及びそのアナログからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
    m'個のXa'、m'及びZ'は、それぞれ式(I)におけるm個のXa、m及びZと同義であり、
    LP'は、存在していても、存在していなくてもよく、存在する場合には1～100個のアミノ酸及び／又はそのアナログからなるペプチドを表す。］
    をコードするmRNAを製造する工程と；
    前記mRNAを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、第一のペプチドを製造する工程と；
    以下の各反応：
    アゾール環形成酵素により、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のY'(11)にアゾール環を形成する第１反応；
    グルタミル化反応における補基質tRNAGlu及びアミノアシル化酵素GluRSの存在下、α,β-不飽和アミノ酸形成酵素により、少なくとも、前記前駆体ペプチド中のX'及びY'(12)をα,β-不飽和アミノ酸残基へと変換する第２反応；及び
    マクロ環化酵素により、LP'が存在する場合にはLP'を脱離させながら含窒素六員環を形成する第３反応；
    により、前記第一のペプチドから前記式(I)で表される環状化合物を生成する工程と；
    を含み、
    前記第１反応、第２反応及び第３反応は、系内で一連に進行してもよく、ステップワイズに進行してもよい、
    製造方法。
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