JP7079018B6 - Ｄ－アミノ酸及びβ－アミノ酸の取り込みを増強するｔＲＮＡのＤ及びＴアームの改変 - Google Patents

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Description

本発明は、非タンパク質性アミノ酸の取り込みを増強するｔＲＮＡのＤ及びＴアームの改変に関する。
天然においては、リボソーム翻訳系は、１９のタンパク質性Ｌ－アミノ酸及びグリシンを利用するが、Ｄ－アミノ酸やβ－アミノ酸のような非タンパク質性アミノ酸は、リボソーム翻訳系によるペプチド合成やタンパク質合成においては除外されている。Ｄ－アミノ酸やβ－アミノ酸は、様々な天然ペプチドに見出されているが、通常、非リボソーム翻訳系により合成されている。
そこで、これらの非タンパク質性アミノ酸を導入するための様々な方法が開発されている。
例えば、Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＦＩＴ）系のような再構成されたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系と組み合わされた遺伝子コードの再プログラミングにより、Ｄ－アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、β－アミノ酸、およびα－ヒドロキシ酸といった非タンパク質性アミノ酸が導入されている（非特許文献１－９）。
しかしながら、非特許文献４、５及び１０－１２に開示されるように、ペプチド鎖にある種のＤ－アミノ酸を導入することに成功しているものの、Ｄ－アミノ酸の連続した導入は未だ大きな課題を有していた（非特許文献４及び１２）。
非特許文献５には、フレキシザイムによって調製されたＤ－アミノ酸でプレチャージしたｔＲＮＡGluE2を使用することで、ＦＩＴシステムを用いたＤ－アミノ酸の連続的な取り込みが開示されている。非特許文献５に開示された方法では、ＥＦ－Ｔｕのより高濃度であることが、Ｄ－アミノアシルｔＲＮＡのアコモデーションの増強に貢献していると考えられている。しかしながら、２つの連続したＤ－Ａｌａを有するペプチドの全体的な発現レベルは、０．３μＭ未満であり、全Ｌ型ペプチドにおける濃度の約１．４μＭと比べて依然として低かった。
また、β－アミノ酸についても、ぺプチド鎖に特定のβ－アミノ酸を導入することに成功しているものの、β－アミノ酸の連続した導入には大きな課題があった（非特許文献８及び１３－１８）。
Murakami, H. et al. Nat. Methods 3, 357-359 (2006). Goto, Y. et al. Nat. Protoc. 6, 779-790 (2011). Goto, Y. et al. RNA 14, 1390-1398 (2008). Fujino, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 135, 1830-1837 (2013). Katoh, T. et al. Cell Chem. Biol. 24, 46-54 (2017). Kawakami, T. et al. Chem Biol 15, 32-42 (2008). Kawakami, T. et al. J Am Chem Soc 135, 12297-12304 (2013). Fujino, T. et al. J Am Chem Soc 138, 1962-1969 (2016). Ohta, A. et al. Chem Biol 14, 1315-1322 (2007). Dedkova, L.M. et al. J. Am. Chem. Soc. 125, 6616-6617 (2003). Dedkova, L.M. et al. Biochemistry 45, 15541-15551 (2006). Achenbach, J. et al. Nucleic Acids Res 43, 5687-5698 (2015). Heckler, T. G. et al. J. Biol. Chem. 258, 4492-4495 (1983). Maini, R. et al. Biochemistry 54, 3694-3706 (2015). Iqbal, E. S. et al. Org. Biomol. Chem. 16, 1073-1078 (2018). Dedkova, L. M. et al. Biochemistry 51, 401-415 (2011). Maini, R. et al. Bioorg. Med. Chem. 21, 1088-1096 (2013). Czekster, C. M. et al. J. Am. Chem. Soc. 138, 5194-5197 (2016).
本発明が解決しようとする課題は、無細胞翻訳系で翻訳する際に、非タンパク質性アミノ酸が連続して結合したペプチドを合成することのできる新規翻訳系を提供することである。
本発明者らは、鋭意検討した結果、アミノアシルｔＲＮＡのＤ及びＴアームに着目し、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は以下のとおりである。
（１）
配列番号１で示される塩基配列を含有し、非タンパク質性アミノ酸をコードするｔＲＮＡ。
Ｎ1Ｎ2ＧＣＮ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8Ｎ9Ｎ10Ｎ11ＧＣＮ12Ｎ13 （配列番号１）
（配列番号１において、
Ｎ1～Ｎ13は、それぞれ任意の塩基を示し、Ｎ3～Ｎ11はＤループを形成し、
Ｎ1Ｎ2ＧＣが、Ｎ13Ｎ12ＣＧと塩基対を形成する。）
（２）
配列番号２で示される塩基配列をさらに含有する、（１）に記載のｔＲＮＡ。
ＡＧＧＧＧ（Ｎ14）mＣＣＣＣＵ （配列番号２）
（配列番号２において、
Ｎ14は、任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ14）mはＴループを形成し、
ＡＧＧＧＧが、ＵＣＣＣＣと塩基対を形成する。）
（３）
３’末端にチャージされた非タンパク質性アミノ酸が、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はα，α－二置換アミノ酸である、（１）又は（２）に記載のｔＲＮＡ。
（４）
（１）～（３）のいずれかに記載のｔＲＮＡを含み、２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合するペプチドを合成するための翻訳系。
（５）
（１）～（３）のいずれかに記載のｔＲＮＡを用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドライブラリの製造方法。
（６）
（１）～（３）のいずれかに記載のｔＲＮＡを用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリの製造方法。
（７）
（５）に記載の方法によって製造されるペプチドライブラリ又は（６）に記載の方法によって製造されるペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
（８）
２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合するペプチドを含む、（７）に記載のペプチドライブラリ又はペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
（９）
４以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合し、非タンパク質性アミノ酸間で分子内架橋したペプチドを含む、（８）に記載のペプチドライブラリ又はペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリ。
本発明によれば、無細胞翻訳系で翻訳する際に、非タンパク質性アミノ酸が連続して結合したペプチドを合成することのできる新規翻訳系を提供することができる。
図１は、ＥＦ－Ｐによるプロリン及びＤ－アミノ酸の取り込みの促進の模式図を示す。図１Ａは、２つのプロリン（Ｐｒｏ）間のペプチド結合形成を促進する原核生物翻訳因子であるＥＦ－Ｐを示す。ＥＦ－Ｐの役割は、連続したプロリンの取り込みを促進することである。ＥＦ－Ｐは、Ｅ部位とＰ部位間のリボソームに結合し、Ｐ部位のペプチジルプロリルｔＲＮＡと相関して、Ｐ部位のペプチジルプロリルｔＲＮＡとＡ部位のプロリルｔＲＮＡとのペプチジルトランスファーを促進する。図１Ｂは、ｔＲＮＡPro1のＤ－アームおよびｔＲＮＡGluE2のＴ－ステムのキメラ構造を有するｔＲＮＡPro1E2の構造を示す。 図２は、ＥＦ－ＰによるＤ－アミノ酸の取り込みの促進を示す。図２Ａは、実施例で用いられたｍＲ１及びｍＲ２のｍＲＮＡ配列及びそれに対応したｒＰ１及びｒＰ２のペプチド配列を示す。任意に選択されたコドンは、ＮＮＮに導入され、プレチャージしたＤ－アミノアシルｔＲＮＡを用いてＤ－アミノ酸（Ｘ）の取り込みに使用される。ｆｌａｇのアミノ酸配列は、ＤＹＫＤＤＤＤＫである。図２Ｂは、ＣＣＧコドンでＤ－アミノ酸の取り込みに用いられるｔＲＮＡの構造を示す。野生型のｔＲＮＡPro1 CGG（ＷＴ）は、１３及び２２位にＣ／Ｇ塩基対を有する。ｔＲＮＡPro1 CGG（Ｃ１３Ｇ）変異体は、Ｃ－ｔｏ－Ｇ変異を１３位に有するが、塩基対形成を崩壊させる。アンチコドンループの配列は、異なるコドンでデコードするために任意に変更可能である。図２Ｃは、２つのＤ－アラニンが導入されたｒＰ１ペプチドの発現レベルを示す。Ｄ－アラニン取り込みのために用いられたコドンを示す。黒色バーは、ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系であることを示し、白抜きバーは、ＥＦ－Ｐ（－）の翻訳系であることを示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率を意味する。ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系におけるＥＦ－Ｐの濃度は、５μＭであった。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。図２Ｄ及び図２Ｅは、２又は３つの連続したＤ－アミノ酸又はＡｉｂ（２－アミノ酪酸）を含むｒＰ１ペプチド（図２Ｄ）及びｒＰ２ペプチド（図２Ｅ）の発現レベルを示す。野生型のｔＲＮＡPro1 CGG（ＷＴ）（通常のバー）又はＣ１３Ｇ変異体であるｔＲＮＡPro1 CGG（ドットのバー）がＣＣＧコドンでＤ－アミノ酸又はＡｉｂの取り込みに用いられた。黒色バーは、ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系であることを示し、白抜きバーは、ＥＦ－Ｐ（－）の翻訳系であることを示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率を意味する。ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系におけるＥＦ－Ｐの濃度は、５μＭであった。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。Ｄ－ヒスチジン及びＡｉｂの取り込みを示す拡大したグラフを図２Ｄでの右上に示す。図２Ｄ及び図２Ｅは、ＥＦ－Ｐが、Ｐ部位ペプチジルＤ－アミノアシルｔＲＮＡをペプチジルＬ－プロリンｔＲＮＡを認識するのと同様に、認識していることを示している。 図３Ａは、２つの連続したＤ－アラニンを有するｒＰ１ペプチドのトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す（図２Ｃを参照）。図３Ｂは、２又は３つの連続したＬ－プロリンを含むｒＰ１ペプチド及びｒＰ２ペプチドの発現レベルを示す。ＣＣＧコドンで、野生型のｔＲＮＡPro1 CGG（ＷＴ）（通常のバー）又はＣ１３Ｇ変異体であるｔＲＮＡPro1 CGG（ドットのバー）がＬ－プロリンの取り込みに用いられた。黒色バーは、ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系であることを示し、白抜きバーは、ＥＦ－Ｐ（－）の翻訳系であることを示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率を意味する。ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系におけるＥＦ－Ｐの濃度は、５μＭであった。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。図３Ｃ及び図３Ｄは、２又は３つの連続したＬ－プロリン（図３Ｃ）又はＤ－アミノ酸及びＡｉｂ（図３Ｄ）を有するｒＰ１ペプチド及びｒＰ２ペプチドのトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ＥＦ－Ｐの存在下あるいは非存在下で２．５μＬ 反応液中で、３７℃で１５分、翻訳を行った（図２Ｄ及び２Ｅを参照）。図３Ｅは、ｒＰ１ペプチド及びｒＰ２ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す。野生型のｔＲＮＡPro1 が、Ｌ－プロリン、Ｄ－アミノ酸及びＡｉｂの取り込みのために用いられた。矢印は、それぞれ目的物に応答するピークを示す。理論値及び実測値は、ｍ／ｚで示す。 図４は、Ｄ－Ａｌａ含有ペプチドの翻訳におけるＥＦ－Ｐの滴定及び時間経過分析を示す。図４Ａは、ＣＣＧコドンで、２つの連続したＤ－アラニンを含むｒＰ１ペプチドの翻訳におけるＥＦ－Ｐ濃度の滴定を示す。翻訳時間は４０分（黒丸）又は１５分（黒四角）とした。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。図４Ｂは、２つの連続したＤ－アラニンを含むｒＰ１ペプチドの翻訳の時間経過分析を示す。黒丸及び黒四角はそれぞれＥＦ－Ｐ（＋）及びＥＦ－Ｐ（－）の翻訳系での結果を示す。ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系におけるＥＦ－Ｐの濃度は、５μＭであった。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。 図５は、Ｄ－アミノ酸取り込みのＥＦ－Ｐ依存性促進に対するｔＲＮＡ構造の効果を示す。図５Ａは、Ｄ－アミノ酸の取り込みに使用されるｔＲＮＡの構造を示す。ｔＲＮＡPro1E1 CGG及びｔＲＮＡPro1E2 CGGの薄い文字は、それぞれ野生型ｔＲＮＡPro1 CGG配列からの変異を示す（これらの変異を導入したｔＲＮＡを、大腸菌プロリルｔＲＮＡ合成酵素は、認識することができない。）。図５Ｂは、ＣＣＧコドンで、２つの連続したＤ－アラニンを含むｒＰ１ペプチドの発現レベルを示す。Ｄ－アラニン取り込みに使用されるｔＲＮＡが示されている。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率を意味する。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。 図６Ａは、２つの連続したＤ－アラニンを取り込むための様々なｔＲＮＡを用いて合成したｒＰ１ペプチドのトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ＥＦ－Ｐの存在下あるいは非存在下で２．５μＬ 反応液中で、３７℃で１５分、翻訳を行った（図５Ｂを参照）。図６Ｂは、ｒＰ３、ｒＰ４、ｒＰ５，ｒＰ６及びｒＰ７ペプチドのトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ｔＲＮＡPro1E2をＤ－アミノ酸の取り込みに使用した。ＥＦ－Ｐの存在下あるいは非存在下で２．５μＬ 反応液中で、３７℃で１５分、翻訳を行った（図７Ｂを参照）。図６Ｃは、５μＭ ＥＦ－ＰとｔＲＮＡPro1E2を用いて合成した、ｒＰ３、ｒＰ４、ｒＰ５，ｒＰ６及びｒＰ７ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す。矢印は、それぞれ目的物に応答するピークを示す。理論値及び実測値は、ｍ／ｚで示す。なお、ｒＰ７ペプチドは、主に、Ｄ－システインへの２－メルカプトエタノール付加物として検出された。 図７は、ＥＦ－Ｐによって促進される種々のペプチド配列へのＤ－アミノ酸の取り込みを示す。図７Ａは、ｍＲＮＡ配列（ｍＲ３、ｍＲ４、ｍＲ５、ｍＲ６及びｍＲ７）並びに対応するペプチド配列（ｒＰ３、ｒＰ４、ｒＰ５、ｒＰ６及びｒＰ７）を示す。図７Ｂは、ｔＲＮＡPro1E2変異体をＤ－アミノ酸の取り込みに使用した、ｒＰ３、ｒＰ４、ｒＰ５、ｒＰ６及びｒＰ７の各ペプチドの発現レベルを示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率を意味する。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。 図８は、ジスルフィド結合又はチオエーテル結合による環状Ｄ－ペプチドの翻訳を示す。図８Ａは、ｍＲＮＡ配列（ｍＲ８及びｍＲ９）並びに対応するペプチド配列（ｒＰ８及びｒＰ９）を示す。ｒＰ８ペプチドに含まれる２つのＤ－システインはジスルフィド結合を形成して大環状構造を形成する。ｒＰ９ペプチド中のＤ－システインのスルフヒドリル基は、Ｎ末端クロロアセチル（ＣｌＡｃ）基のα－炭素を攻撃してチオエーテル結合を形成し、大環状構造を形成する。図８Ｂ及び図８Ｃは、ｔＲＮＡPro1E2またはｔＲＮＡGluE2をＤ－アミノ酸の取り込みに使用したｒＰ８ペプチド（図８Ｂ）及びｒＰ９ペプチド（図８Ｃ）の発現レベルを示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率を意味する。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。 図９Ａ及び図９Ｂは、ｒＰ８ペプチド（図９Ａ）及びｒＰ９ペプチド（図９Ｂ）のトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ｔＲＮＡPro1E2又はｔＲＮＡGluE2をＤ－アミノ酸の取り込みに使用した。ＥＦ－Ｐの存在下あるいは非存在下で２．５μＬ 反応液中で、３７℃で１５分、翻訳を行った（図８Ｂ及び８Ｃを参照）。図９Ｃは、５μＭ ＥＦ－ＰとｔＲＮＡPro1E2を用いて合成した、ｒＰ８ペプチド及びｒＰ９ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す。矢印は、それぞれ目的物に応答するピークを示す。理論値及び実測値は、ｍ／ｚで示す。 図１０は、ＥＦ－Ｐによるβ－アミノ酸の取り込みの促進を示す。図１０ａは、ＣＣＧコドンでβ－アミノ酸の取り込みに用いられるｔＲＮＡの構造を示す。図１０ｂは、β－アミノ酸の構造を示す。図１０ｃは、図２Ａ同様に、β－アミノ酸の取り込みのために、実施例で用いられたｍＲ１のｍＲＮＡ配列及びそれに対応したｒＰ１のペプチド配列を示す。ＣＣＧコドンは、プレチャージしたβ－アミノアシルｔＲＮＡを用いてβ－アミノ酸（Ｘａａ）の取り込みに使用される。ｆｌａｇのアミノ酸配列は、ＤＹＫＤＤＤＤＫである。図１０ｄは、２つの連続したβ－アミノ酸又はＤ－アラニンを含むｒＰ１ペプチドの発現レベルを示す。野生型のｔＲＮＡPro1 CGG（ＷＴ）（通常のバー）又はＣ１３Ｇ変異体であるｔＲＮＡPro1 CGG（ドットのバー）がＣＣＧコドンでβ－アミノ酸又はＤ－アラニンの取り込みに用いられた。黒色バーは、ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系であることを示し、白抜きバーは、ＥＦ－Ｐ（－）の翻訳系であることを示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率を意味する。ＥＦ－Ｐ（＋）の翻訳系におけるＥＦ－Ｐの濃度は、５μＭであった。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。図１０ｅ及び図１０ｆは、２つの連続したβ－アミノ酸を含むｒＰ１ペプチドの翻訳におけるＥＦ－Ｐ濃度の滴定を示す。滴定のために、リシル化（Ｌｙｓｙｌａｔｅｄ）ＥＦ－Ｐ（黒丸）又は非修飾ＥＦ－Ｐ（白丸）が用いられた。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。 図１１は、β－アミノ酸取り込みのＥＦ－Ｐ依存性促進に対するｔＲＮＡ構造の効果を示す。図１１ａは、β－アミノ酸の取り込みに使用されるｔＲＮＡの構造を示す。ドットの線は、ＥＦ－Ｔｕ及びＥＦ－Ｐ結合のために、最適化されたＴステムモチーフ又はＤアームモチーフを示す。図１１ｂは、２つの連続したβｈＭを含むｒＰ１ペプチドの発現レベルを示す。βｈＭ取り込みに使用されるｔＲＮＡが示されている。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率を意味する。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。図１１ｃは、β－アミノ酸取り込みのために最適化されたＤアームモチーフとＴステムモチーフを有するｔＲＮＡPro1E2の構造を示す。 図１２は、７つまでの連続したβ－アミノ酸の取り込みを示す。図１２ａは、図２Ａ同様に、β－アミノ酸の取り込みのために、実施例で用いられたｍＲ２のｍＲＮＡ配列及びそれに対応したｒＰ２のペプチド配列を示す。２～７つの連続したβｈＭが、ｔＲＮＡPro1E2 CGGを用いて、ＣＣＧコドン（ｎ＝２～７）で取り込まれた。図１２ｂは、連続したβｈＭを含むｒＰ２ペプチドの発現レベルを示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率あるいは発現レベル（μＭ）を意味する。Ｎ．Ｄ．は、検出できなかったことを意味する。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。図１２ｃは、２～７つの連続したβｈＭが取り込まれたｒＰ２ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す。５μＭ ＥＦ－Ｐが翻訳系に存在した。矢印は、それぞれ目的物に応答するピークを示す。理論値及び実測値は、ｍ／ｚで示す。 図１３は、２種のβ－アミノ酸の取り込みを示す。図１３ａは、図２Ａ同様に、β－アミノ酸の取り込みのために、実施例で用いられたｍＲ３－３～ｍＲ３－７のｍＲＮＡ配列及びそれに対応したｒＰ３－３～ｒＰ３－７のペプチド配列を示す。βｈＭ及びβｈＦが、ｔＲＮＡPro1E2 GAU及びｔＲＮＡPro1E2 GUGを用いて、ＡＵＵコドン及びＣＡＵコドンで、おのおの取り込まれた。図１３ｂは、ｒＰ３－３ペプチド～ｒＰ３－７ペプチドの発現レベルを示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率あるいは発現レベル（μＭ）を意味する。Ｎ．Ｄ．は、検出できなかったことを意味する。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。図１３ｃは、βｈＭ及びβｈＦが取り込まれたｒＰ３－３ペプチド～ｒＰ３－７ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す。５μＭ ＥＦ－Ｐが翻訳系に存在した。矢印は、それぞれ目的物に応答するピークを示す。理論値及び実測値は、ｍ／ｚで示す。 図１４は、複数のＤ－アミノ酸及びβ－アミノ酸の取り込みを示す。図１４ａは、図２Ａ同様に、Ｄ－アミノ酸及びβ－アミノ酸の取り込みのために、実施例で用いられたｍＲ４～ｍＲ１１のｍＲＮＡ配列及びそれに対応したｒＰ４～ｒＰ１１のペプチド配列を示す。βｈＭ及びβｈＦが、ｔＲＮＡPro1E2 GAU及びｔＲＮＡPro1E2 GUGを用いて、ＡＵＵコドン及びＣＡＵコドンで、Ｄ－アミノ酸が、ｔＲＮＡPro1E2 GGUを用いて、ＡＣＵコドンで、おのおの取り込まれた。図１４ｂは、大環状ペプチドｒＰ１１の構造を示す。Ｄ－システインのチオール基が、Ｎ末端クロロアセチル基と反応してチオエーテル結合を形成して、大環状構造を産生する。図１４ｃ及び図１４ｄは、ｒＰ４ペプチドｒＰ９ペプチド、ｒＰ１０ペプチド～ｒＰ１１ペプチドの発現レベルを、おのおの示す。バーの上の数字は、ＥＦ－Ｐ（－）に対するＥＦ－Ｐ（＋）における割合として計算した翻訳収率あるいは発現レベル（μＭ）を意味する。Ｎ．Ｄ．は、検出できなかったことを意味する。翻訳時間は１５分であり、エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。 図１５ａは、β－アミノ酸又はＤ－アラニンを取り込んだｒＰ１ペプチドのトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。これらのアミノ酸の取り込みに使用されるｔＲＮＡが示されている。各バンドの定量化は、図１０ｄを参照。図１５ｂは、ｒＰ１ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す。野生型ｔＲＮＡPro1が、これらのアミノ酸の取り込みに用いられた。５μＭ ＥＦ－Ｐが翻訳系に存在した。矢印は、それぞれ目的物に応答するピークを示す。理論値及び実測値は、ｍ／ｚで示す。 図１６ａ～図１６ｄは、それぞれ、ｒＰ１ペプチド（図１６ａ）、ｒＰ２ペプチド（図１６ｂ）、ｒＰ３－３ペプチド～ｒＰ３－７ペプチド（図１６ｃ）及びｒＰ４ペプチド～ｒＰ１１ペプチド（図１６ｄ）のトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各バンドの定量化は、図１１ｂ、図１２ｂ、図１３ｂ並びに図１４ｃ及び図１４ｄを、それぞれ参照。図１６ｅは、ｒＰ４ペプチド～ｒＰ１１ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す。野生型ｔＲＮＡPro1が、これらのアミノ酸の取り込みに用いられた。５μＭ ＥＦ－Ｐが翻訳系に存在した。矢印は、それぞれ目的物に応答するピークを示す。理論値及び実測値は、ｍ／ｚで示す。
本発明のｔＲＮＡは、配列番号１で示される塩基配列を含有し、非タンパク質性アミノ酸をコードするｔＲＮＡである。
Ｎ1Ｎ2ＧＣＮ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8Ｎ9Ｎ10Ｎ11ＧＣＮ12Ｎ13 （配列番号１）
配列番号１において、
Ｎ1～Ｎ13は、それぞれ任意の塩基を示し、Ｎ3～Ｎ11はＤループを形成し、
Ｎ1Ｎ2ＧＣが、Ｎ13Ｎ12ＣＧと塩基対を形成する。
翻訳因子であるＥＦ－Ｐタンパク質は、プロリン－プロリン（Ｐｒｏ－Ｐｒｏ）結合形成の伸長を促進する上で重要な役割を担っていて、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ配列においてペプチジル－ｔＲＮＡの脱落によって引き起こされる翻訳伸長の停止（リボソームストール）を緩和する。
ＥＦ－Ｐタンパク質は、プロリン選択的ペプチジルトランスファーの促進のために、ｔＲＮＡProアイソアクセプターに見出される特定のＤアームモチーフである、４塩基対の安定なＤステム配列によって閉じた構造を有する９塩基のＤループを認識し、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ転移反応の速度促進は、ｔＲＮＡProに依存する。
本発明においては、配列番号１で示される塩基配列は、ＤループとＤステムからなるＤアームであり、配列番号１で示される塩基配列をｔＲＮＡに導入することにより、ＥＦ－Ｐペプチドによるぺプチジルトランスファーが促進できる。
本発明の配列番号１で示される塩基配列を含有するｔＲＮＡにおける、他の構造、すなわち、アクセプターステム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、バリアブルループ、Ｔアームの塩基配列は、任意であってよい。中でも、アンチコドンループは、非タンパク質性アミノ酸を割り当てるコドンに対応した塩基配列を適宜有していればよい。
ｔＲＮＡの３’末端は、ＣＣＡ配列を有し、任意のアミノ酸と結合する。本発明のｔＲＮＡは、非タンパク質性アミノ酸と結合している。
本明細書では、ｔＲＮＡが非タンパク質性アミノ酸をコードするとは、ｔＲＮＡが、非タンパク質性アミノ酸とｔＲＮＡのＣＣＡ配列を介して結合していることを意味する。
配列番号１において、それぞれ、Ｎ1Ｎ2とＮ13Ｎ12が塩基対を形成する限り、任意の塩基を選択し得るが、Ｎ1はＧであり、Ｎ13はＣであることが好ましい。また、Ｎ2はＣであり、Ｎ12はＧであることが好ましい。
配列番号１で示される塩基配列は、配列番号３で示される塩基配列であること好ましい。
ＧＣＧＣＮ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8Ｎ9Ｎ10Ｎ11ＧＣＧＣ （配列番号３）
配列番号３において、
Ｎ3～Ｎ11は、前記と同義であり、ＧＣＧＣが、ＣＧＣＧと塩基対を形成する。
配列番号１及び配列番号３におけるＮ3～Ｎ11の塩基配列は、配列番号４で示される塩基配列であることが好ましい。
ＡＧＣＣＵＧＧＵＡ （配列番号４）
配列番号４で示される塩基配列は、ｔＲＮＡにおけるＤループを形成する。
配列番号４においては、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、Ｄループを形成する９個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
配列番号１で示される塩基配列は、配列番号５で示される塩基配列であること好ましく、配列番号６で示される塩基配列であることが好ましい。
Ｎ1Ｎ2ＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣＮ12Ｎ13 （配列番号５）
配列番号５において、
Ｎ1、Ｎ2、Ｎ12及びＮ13は、前記と同義であり、Ｎ1Ｎ2ＧＣが、Ｎ13Ｎ12ＣＧと塩基対を形成する。
ＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣＧＣ （配列番号６）
配列番号５及び配列番号６においては、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。
配列番号５及び６において塩基が複数置換されるとは、Ｄループを形成する９個の塩基を示す配列番号４において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
アミノアシルｔＲＮＡのＴステムは、ＥＦ－Ｔｕタンパク質との相互作用を調節し、Ｎ－メチルアミノ酸のような非タンパク質性アミノ酸の取り込みを増強する。
本発明においては、配列番号２で示される塩基配列は、ＴループとＴステムからなるＴアームであり、配列番号２で示される塩基配列をｔＲＮＡに導入することにより、非タンパク質性アミノ酸をペプチドあるいはタンパク質に導入するにあたり、ＥＦ－Ｔｕタンパク質によるアコモデーションが促進される。
本発明のｔＲＮＡは、配列番号２で示される塩基配列をさらに含有するｔＲＮＡであることが好ましい。
ＡＧＧＧＧ（Ｎ14）mＣＣＣＣＵ （配列番号２）
配列番号２において、
Ｎ14は、任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ14）mはＴループを形成し、
ＡＧＧＧＧが、ＵＣＣＣＣと塩基対を形成する。
ｍは、（Ｎ14）mはＴループを形成する限り特に限定されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の整数であり得、６～８の整数であることが好ましい。
（Ｎ14）mは、ｔＲＮＡGluE2のＴループに由来する配列番号７で示される塩基配列であることが好ましい。
ＵＵＣＧＡＡＵ （配列番号７）
配列番号７においては、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。
塩基が複数置換されるとは、Ｔループを形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
配列番号２において、塩基対を形成するＡＧＧＧＧとＵＣＣＣＣとは、Ｔステムを形成する。
Ｔステムを形成する塩基配列において、塩基対を形成する限り、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。
配列番号２のＴステムにおいて塩基が複数置換されるとは、Ｔステムを形成する１０個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、２個の塩基が置換されていてもよく、４個の塩基が置換されていてもよく、６個の塩基が置換されていてもよく、塩基対を形成する限り、１個、３個、５個の塩基が置換されていてもよい。
本発明の好適なｔＲＮＡとしては、ＥＦ－Ｐタンパク質によるぺプチジルトランスファーの促進作用及びＥＦ－Ｔｕタンパク質によるアコモデーションの促進作用を発揮させるために、配列番号１で示される塩基配列と配列番号２で示される塩基配列の双方を含有する。
本発明のｔＲＮＡは、好適には、ｔＲＮＡPro1およびｔＲＮＡGluE2のキメラであり、かかるｔＲＮＡを、本明細書においては、ｔＲＮＡPro1E2と呼ぶ。
具体的には、ｔＲＮＡGluE2のＴステムがｔＲＮＡPro1に導入されていることが好ましい。
Ｄ－アミノ酸やβ－アミノ酸等の非タンパク質性アミノ酸でプレチャージされたｔＲＮＡPro1E2とＥＦ－Ｐタンパク質との組み合わせにより、線状ペプチドだけでなく、当該非タンパク質性アミノ酸を連続して、例えば、４つあるいは５つの連続した非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドの発現レベルを増強することができる。
本発明に用いられるｔＲＮＡにおいて、配列番号１及び／又は配列番号２以外の塩基配列については、野生型ｔＲＮＡに由来する配列であってもよく、大腸菌由来野生型ｔＲＮＡに由来する配列であってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写で調製した人工ｔＲＮＡであってもよい。
本発明において、翻訳系は、本発明のｔＲＮＡを含み、当該ｔＲＮＡを含むことにより、一般的には連続導入が難しいアミノ酸が連続して結合するペプチドを合成することができる翻訳系となるが、より具体的には、２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合するペプチドを合成することができる翻訳系となる。
翻訳系には、本発明のｔＲＮＡを含む限り、特に限定されずに、無細胞翻訳系で用いられる構成要素を含む。
翻訳系は、ＥＦ－Ｐタンパク質を含有することが好適であり、さらに、ＥＦ－Ｔｕタンパク質を含有することが好適である。
本発明における翻訳系では、フレキシザイムを利用したコドンの再割当において、ＮＮＮとして適宜選択したコドンに対して、非タンパク質性アミノ酸を割り当てる。
本発明における翻訳系では、天然の翻訳系を使用してもよい。天然の翻訳系においては、各アミノ酸に対応したアンチコドンを有するｔＲＮＡが存在し、各ｔＲＮＡは、アンチコドンループ以外の領域においてもそれぞれ固有の配列を有する。
本発明においては、配列番号１及び／又は配列番号２で示される塩基配列を導入すれば、他の配列については、それら天然の翻訳系におけるｔＲＮＡの固有の配列を割り当てられるという意味で、アクセプターステム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、バリアブルループの塩基配列は、任意であり得る。
本発明における翻訳系では、フレキシザイムを利用し、ＮＮＮのすべてに任意のアミノ酸を再割当してもよく（Ｎは任意の塩基である。）、その場合、ｔＲＮＡをすべて人工のものとしてもよい。この場合、翻訳系に加える各ＮＮＮに対応する伸長ｔＲＮＡは、全長の８５％以上又は９０％以上が同一の塩基配列からなるものであってもよく、アンチコドンを除いた配列のうち、ほとんど配列が同じである伸長ｔＲＮＡ群を用いることもできる。
本明細書において、アンチコドンループとは、ｔＲＮＡにおけるアンチコドンを含む一本鎖のループ部分を示す。アンチコドンループの配列は、コドン－アンチコドンの相互作用を相補するように、当業者が適宜決定することが可能である。
本発明のｔＲＮＡは、公知の無細胞翻訳系で用いてぺプチドを翻訳することで、２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合するペプチドを合成することができる。
用いられる無細胞翻訳系は、特に限定されない。
ペプチドライブラリの製造方法においては、適当なコドンでコードされる非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドであって、２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続したペプチドを製造することができたり、２以上の複数の非タンパク質性アミノ酸を有するペプチドを効率よく製造できるので、より多様性に富むライブラリを提供することができる。
本発明においては、ペプチドライブラリの各ペプチドをコードするｍＲＮＡを含み、各ｍＲＮＡが１又は複数の非タンパク質性アミノ酸をコードするＮＮＮを含むｍＲＮＡライブラリを調製する工程と；
ＮＮＮのいずれかのコドンに対するアンチコドンを有し、該コドンに対応する非タンパク質性アミノ酸がチャージされたｔＲＮＡを加えた無細胞翻訳系で、ｍＲＮＡライブラリの各ｍＲＮＡを翻訳する工程と、を含む。ペプチドライブラリの製造方法とすることができる。
本発明において、ペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリの製造方法は、上述したペプチドライブラリの製造方法において、ｍＲＮＡライブラリを調製する際、各ｍＲＮＡのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の下流領域にピューロマイシンを結合させることによって行われる。ピューロマイシンは、ペプチドや核酸で構成されるリンカーを介してｍＲＮＡに結合させてもよい。ｍＲＮＡのＯＲＦ下流領域にピューロマイシンを結合させることにより、ｍＲＮＡのＯＲＦを翻訳したリボソームがピューロマイシンを取り込み、ｍＲＮＡとペプチドの複合体が形成される。このようなペプチド－ｍＲＮＡ複合体は、遺伝子型と表現型を対応付けることができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイに応用できる。
本発明においては、まず、非タンパク質性アミノ酸を割り当てるＮＮＮを選択し、ＮＮＮのアンチコドンをアンチコドンループ内に有し、非タンパク質性アミノ酸をコードするｔＲＮＡをフレキシザイム等を用いて調製する。
次いで、各ｍＲＮＡが１又は複数の非タンパク質性アミノ酸をコードするＮＮＮを含むｍＲＮＡライブラリを調製し、翻訳することで、割り当てられた非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドを発現させることができる。
本明細書において、「ＮＮＮ」は、アミノ酸を指定するコドンを意味し、コドンを形成する３つのＮは、それぞれ独立に、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）から選択される。１つのｍＲＮＡには、非タンパク質性アミノ酸がコードされたＮＮＮが複数含まれていてよい。
本発明においては、非タンパク質性アミノ酸をコードしないＮＮＮには、任意のアミノ酸が再割当されていてもよいし、天然の遺伝暗号に基づいたコドンとアミノ酸との関係を用いてもよい。
再割当においては、天然の遺伝暗号表におけるコドンとアミノ酸の関係とは異なるものを割り当てることもできるし、同一のものを割り当てることもできる。
「天然の遺伝暗号表」とは、生体においてｍＲＮＡのトリプレット（コドン）に割り当てられたアミノ酸を示した表であり、下記表１に示す。
Figure 0007079018000001
各コドンに対する、天然の遺伝暗号表とは異なるアミノ酸の割り当ては、例えば、人工アミノアシル化ＲＮＡ触媒フレキシザイム（Ｆｌｅｘｉｚｙｍｅ）を利用したコドン再割当によって実現される。フレキシザイムによれば、任意のアンチコドンを有するｔＲＮＡに所望のアミノ酸を結合させることができるので、任意のコドンに任意のアミノ酸を割り当てることが可能となる。
本明細書において、アミノ酸としては、タンパク質性アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含み、例えば、タンパク質性Ｌ－アミノ酸、アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
タンパク質性アミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）は、当業界に周知の３文字表記により表すと、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。
非タンパク質性アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）としては、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。
非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α－二置換アミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｎ－アルキル－α－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、α－ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）等が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
非タンパク質性アミノ酸が、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はα，α－二置換アミノ酸であることが好適であり、Ｄ－アミノ酸又はβ－アミノ酸であることがより好適である。
本発明においては、ペプチドを１×１０6種以上含むペプチドライブラリを製造することができる。
各ペプチドに含まれるＮＮＮでコードされるアミノ酸の数は、非タンパク質性アミノ酸が含まれる限り、特に限定されないが、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個等とすることができる。各ｍＲＮＡにおける非タンパク質性アミノ酸をコードするＮＮＮの位置は特に限定されず、本発明のｔＲＮＡを用いることで、非タンパク質性アミノ酸をコードするＮＮＮが連続して配置されるｍＲＮＡからも、タンパク質性アミノ酸のライブラリ合成と同程度で、非タンパク質性アミノ酸が連続して配置されたペプチドが翻訳される。
コドン再割当には、翻訳系の構成因子を目的に合わせて自由に取り除き、必要な成分だけを再構成してできる翻訳系を利用できる。例えば、特定のアミノ酸を除去した翻訳系を再構成すると、当該アミノ酸に対応するコドンが、いずれのアミノ酸もコードしない空きコドンになる。そこで、フレキシザイム等を利用して、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡに任意のアミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行うと、当該任意のアミノ酸がそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに当該任意のアミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。
本明細書において「無細胞翻訳系」とは、細胞を含まない翻訳系をいい、無細胞翻訳系としては、例えば、大腸菌抽出液、小麦胚芽抽出液、ウサギ赤血球抽出液、昆虫細胞抽出液等を用いることができる。また、それぞれ精製したリボソームタンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）、リボソームＲＮＡ、アミノ酸、ｒＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子（ＩＦ）、伸長因子（ＥＦ）、終結因子（ＲＦ）、およびリボソーム再生因子（ＲＲＦ）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を再構成することで構築した、再構成型の無細胞翻訳系を用いても良い。
ＤＮＡからの転写を併せて行うためにＲＮＡポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のＲＴＳ－１００（登録商標）、再構成型翻訳系としてはＰＧＩ社のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）やＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社のＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓＲ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
また、大腸菌のリボソームを用いる系として、例えば次の文献に記載された技術が公知である：H. F. Kung et al., 1977. The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894; M. C. Gonza et al., 1985, Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, 1648-1652; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg, 1996, Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16; Y. Shimizu et al., 2001, Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755; H. Ohashi et al., 2007, Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。
無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。
なお、本発明の無細胞翻訳系は、転写に必要な因子を加えて、翻訳のみならず転写に用いてもよい。
本発明において得られるペプチドは、環状ペプチドであってもよく、例えば、下記表１に示す官能基１を有するアミノ酸と、対応する官能基２を有するアミノ酸が環状化した環状ペプチドとすることができる。
官能基１と２はどちらがＮ末端側にきてもよく、Ｎ末端とＣ末端に配置してもよいし、一方を末端アミノ酸、他方を非末端アミノ酸としてもよいし、両方を非末端アミノ酸としてもよい。
官能基１と官能基２により形成される結合が、環状ペプチドにおける分子環状構造を形成するための化学架橋構造といえる。
Figure 0007079018000002
 式中、Ｘ1は脱離基であり、脱離基としては、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ等のハロゲン原子が挙げられ、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香環である。
（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、クロロアセチル化したアミノ酸を用いることができる。クロロアセチル化アミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-alanine、N-chloroacetyl-L-phenylalanine、N-chloroacetyl-L-tyrosine、N-chloroacetyl-L-tryptophan、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-chloroacetyl-L-diaminobutyric acid、δ-N-chloroacetyl-L-ornithine、ε-N-chloroacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。
（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-tryptophan及びN-chloroacetyl-L-tyrosineが好適に用いられ、Ｄ体であることがより好適である。
なお、本明細書において、Ｌ体であることを明示して記載する場合があるが、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよいことを意味し、また、Ｌ体とＤ体の任意の割合での混合物であってもよい。Ｌ体及びＤ体であることを明示して記載していない場合についても、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよいことを意味し、また、Ｌ体とＤ体の任意の割合での混合物であってもよい。
（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、cysteineが好適に用いられる。
（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
（Ｂ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、propargylglycine、homopropargylglycine、2-amino-6-heptynoic acid、2-amino-7-octynoic acid、及び2-amino-8-nonynoic acid等が挙げられる。
4-pentynoyl化や5-hexynoyl化したアミノ酸を用いてもよい。
4-pentynoyl化アミノ酸としては、例えば、N-(4-pentenoyl)-L-alanine、N-(4-pentenoyl)-L-phenylalanine、N-(4-pentenoyl)-L-tyrosine、N-(4-pentenoyl)-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-(4-pentenoyl)-L-diaminopropanoic acid、γ-N-(4-pentenoyl)-L-diaminobutyric acid、σ-N-(4-pentenoyl)-L-ornithine、ε-N-(4-pentenoyl)-L-lysine、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。
5-hexynoyl化アミノ酸としては、4-pentynoyl化アミノ酸として例示した化合物において、4-pentynoyl基が、5-hexynoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
（Ｂ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、azidoalanine、2-amino-4-azidobutanoic acid、azidoptonorvaline、azidonorleucine、2-amino-7-azidoheptanoic acid、及び2-amino-8-azidooctanoic acid等が挙げられる。
azidoacetyl化や3-azidopentanoyl化したアミノ酸を用いることもできる。
azidoacetyl化アミノ酸としては、例えば、N-azidoacetyl-L-alanine、N-azidoacetyl-L-phenylalanine、N-azidoacetyl-L-tyrosine、N-azidoacetyl-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-azidoacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-azidoacetyl-L-ornithine、ε-N-azidoacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
3-azidopentanoyl化アミノ酸としては、azidoacetyl化アミノ酸として例示した化合物において、azidoacetyl基が、3-azidopentanoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
（Ｂ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｂ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
（Ｃ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、N-(4-aminomethyl-benzoyl)-phenylalanine (AMBF)及び3-aminomethyltyrosine等が挙げられる。
（Ｃ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、5-hydroxytryptophan(WOH)等が挙げられる。
（Ｃ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｃ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)及び国際公開第２００８／１１７８３３号に記載された方法等が挙げられる。
（Ｄ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、2-amino-6-chloro-hexynoic acid、2-amino-7-chloro-heptynoic acid、及び2-amino-8-chloro-octynoic acid等が挙げられる。
（Ｄ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
（Ｄ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｄ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、国際公開第２０１２／０７４１２９号に記載された方法等が挙げられる。
（Ｅ－１）のアミノ酸としては、例えば、N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。
（Ｅ－２）のアミノ酸としては、例えば、cysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、 mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8- mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
（Ｅ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｅ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、（Ａ－１）と（Ａ－２）の環状化方法や（Ｄ－１）と（Ｄ－２）の環状化方法を参考にして行うことができる。
環形成アミノ酸としては、（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸との組み合わせが好ましく、脱離基でＨが置換されたＮ－アセチルトリプトファンとcysteineの組み合わせがより好ましく、N-haloacetyl-D-tyrosine又はN-haloacetyl-D-tryptophan、好適にはN-chloroacetyl-D-tyrosine又はN-chloroacetyl-D-tryptophanとcysteine(Cys)の組み合わせがさらに好ましい。
本発明においては、ペプチドライブラリ又はペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリも提供する。
本発明のｔＲＮＡを用いてペプチドライブラリを製造することで、Ｌ－アミノ酸からなるペプチドの発現レベルと同程度で、非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドを合成できるため、従来のペプチドライブラリに比して、非タンパク質性アミノ酸の導入において多様性に富むペプチドライブラリとすることができる。
中でも、２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合するペプチドを含むライブラリとすることができる。
本発明のｔＲＮＡを用いてペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリを製造することで、Ｌ－アミノ酸からなるペプチドの発現レベルと同程度で、非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドを合成できるため、従来のペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリに比して、非タンパク質性アミノ酸の導入において多様性に富むペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリとすることができる。
中でも、２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合するペプチドを含むライブラリとすることができる。
また、本発明においては、ペプチドライブラリ及びペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリにおけるペプチド構造として、４以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合し、非タンパク質性アミノ酸間で分子内架橋した構造を含むライブラリとすることができる。
４以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合した構造において、非タンパク質性アミノ酸間で分子内架橋させるには、無細胞翻訳系で翻訳し、環状化する際に用いられる非タンパク質性アミノ酸を利用して分子内架橋を構築することができる。
好適には、Ｄ－システインとＤ－システインによるジスルフィド結合、又はＣｌＡｃ基を導入した非タンパク質性アミノ酸とＤ－システインによるチオエーテル結合が挙げられる。
本発明においては、本発明に係るｔＲＮＡを用いて製造されたペプチドライブラリを用いた、標的物質に結合するペプチドを同定するためのスクリーニング方法も提供する。
スクリーニング方法としては、本発明に係るｔＲＮＡを用いて製造されたペプチドライブラリと標的物質を接触させてインキュベートする工程を含む。
本明細書において、標的物質は特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、脂質等とすることができる。
スクリーニング方法としては、標的物質と結合したペプチドを選択する工程をさらに含む。標的物質と結合したペプチドの選択は、例えば、ペプチドを公知の方法に従って検出可能に標識し、上記接触工程の後、緩衝液で固相担体表面を洗浄し、標的物質に結合している化合物を検出して行う。
検出可能な標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子が挙げられる。酵素の場合、酵素の基質を加えて発色させ、検出することもできる。また、ペプチドにビオチンを結合させ、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
ペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリの場合、ＴＲＡＰディスプレイ法を応用してスクリーニングを行うことができる。
この場合、まず、ペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリに対して逆転写反応を行った後、当該ライブラリと標的物質とを接触させる。標的物質に結合する複合体を選択し、このＤＮＡをＰＣＲで増幅する。このＤＮＡをＴＲＡＰ反応系に加えることで、再度ペプチド－ｍＲＮＡ複合体ライブラリを作製し、同様の操作を繰り返す。
これにより、標的物質に高い親和性を有するペプチド－ｍＲＮＡ複合体が濃縮されるので、濃縮された複合体のＤＮＡの配列を解析して、標的物質に結合するペプチドを効率よく同定することができる。
本明細書において引用されるすべての非特許文献及び参考文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
フレキシザイム及びｔＲＮＡの調製
Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、２－アミノイソブチル酸及びＬ－プロリンのプレチャージのために用いたフレキシザイム（ｄＦｘ又はｅＦｘ）及びｔＲＮＡ（表３）は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。
フレキシザイム（ｄＦｘ又はｅＦｘ）あるいはｔＲＮＡ配列の前にＴ７プロモーターを有する鋳型ＤＮＡがフォワード及びリバース伸長プライマー対（表４）の伸長により調製され、次いで、フォワード及びリバース伸長プライマー対（表５）を用いてＰＣＲを行った。
Figure 0007079018000003
Figure 0007079018000004
Figure 0007079018000005
表５中、Ｇｍは、２’－Ｏ－メチルグアノシンを表す。
ＰＣＲ産物は、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿及び次いで、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１２０ｎＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、０．０４Ｕ／μＬ ＲＮａｓｉｎ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び３．７５ｍＭ ＮＴＰ ｍｉｘを含む反応混合物２５０μＬ中で、３７℃で１６時間の転写に用いられた。
ｔＲＮＡ調製においては、５’末端（Ｇ又はＣ）のヌクレオチドに応じて、上記溶液に、５ｍＭ ＧＭＰ又はＣＭＰが添加された。得られたＲＮＡ転写物は、ＲＱ１ ＤＮａｓｅ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃で３０分間処理され、次いで、６Ｍ 尿素を含む８％（ｔＲＮＡ）あるいは１２％（フレキシザイム）ポリアクリルアミドゲルで精製した。
ｔＲＮＡのアミノアシル化
Ｄ－アミノ酸とβ－アミノ酸は、３，５－ジニトロベンジルエステル（ＤＢＥ）かシアノメチルエステル（ＣＭＥ）としてプレ活性化し、ｔＲＮＡへ、適切なフレキシザイム（ＤＢＥ活性化アミノ酸ではｄＦｘ、ＣＭＥ活性化アミノ酸ではｅＦｘ）を用いてチャージした。
Ｄ－アラニン、Ｄ－セリン及びＤ－システイン、Ｌ－β－ホモグルタミン（βｈＱ）、Ｌ－β－ホモメチオニン（βｈＭ）、Ｌ－β－ホモフェニルグリシン（βｈＦ）、Ｌ－プロリン及び２－アミノ酪酸（Ａｉｂ）は、ＤＢＥ活性化し、クロロアセチル Ｄ－フェニルアラニン（Ｄ－ClAcＰｈｅ）は、ＣＭＥ活性化した。上記活性化アミノ酸は、非特許文献１及び参考文献１８に記載の方法に沿って合成した。
フレキシザイム反応（アミノアシル化）は、０℃で、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（Ｄ－アミノ酸では、ｐＨ ７．５、β－アミノ酸では、ｐＨ ８．７）、６００ｍＭ ＭｇＣｌ2，２０％ ＤＭＳＯ、２５μＭ ｄＦｘ又はｅＦｘ，２５μＭ ｔＲＮＡ及び５ｍＭ 活性化アミノ酸を含む反応混合物中で行った。
ｅＦｘが、Ｄ－ClAcＰｈｅ－ＣＭＥのために用いられ、ｄＦｘが他のアミノ酸のために用いられた。反応時間は、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ClAcＰｈｅ、Ｌ－Ｐｒｏ及びＡｉｂのためには２時間であり、Ｄ－Ｓｅｒ及びＤ－Ｃｙｓのためには６時間であり、β－アミノ酸のためには２２時間とした。アミノアシルｔＲＮＡは、エタノール沈殿により回収され、次いで、ペレットを酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）を含む７０％エタノールで２回、７０％エタノールで１回洗浄し、１ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）に溶解した。
ＥＦ－Ｐの調製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＦ－Ｐ遺伝子を、トロンビン部位の代わりにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ認識部位を有する修飾されたｐＥＴ２８ａベクターにクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥｐｍＡ及びＥｐｍＢ遺伝子は、ｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクターにクローニングした。これらのベクターをＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）に共導入した。細胞を０．５ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地で、３７℃で２時間培養し、超音波処理により溶解した。細胞溶解物をＮｉ－ＮＴＡカラムに適用して、ヒスチジン標識ＥＦ－Ｐを精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭイミダゾール及び１ｍＭ ２－メルカプトエタノール）で洗浄した後、ヒスチジン標識ＥＦ－Ｐを３００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。Ｔｕｒｂｏ３Ｃプロテアーゼを溶出液に添加してヒスチジンタグを切断し、緩衝液Ａに対して４℃で一晩透析した。サンプルをＮｉ－ＮＴＡカラムに適用して、フロースルー及び洗浄画分をヒスチジンタグのないＥＦ－Ｐとして回収した。次に、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ １０ｋ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でタンパク質を濃縮した。ＥＦ－Ｐの改変は、参考文献３に記載された質量分析によって確認した。
モデルペプチドの翻訳及び定量化
モデルペプチドの翻訳は、ＩＦ２、ＥＦ－Ｇ及びＥＦ－Ｔｕ／Ｔｓの濃度（それぞれ、３、０．１及び２０μＭ）がＤ－アミノ酸及びβ－アミノ酸取り込みのために最適化された改変ＦＩＴ（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）系で行った（非特許文献５を参照）。
修正されたＦＩＴシステムの構成は以下の通りである。
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１２．３ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、２０ｍＭ クレアチンリン酸、０．１ｍＭ １０－ホルミル－５，６，７，８－テトラヒドロ葉酸、２ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ ＤＴＴ、１．５ｍｇ／ｍＬ Ｅ．ｃｏｌｉトータルｔＲＮＡ、１．２μＭ Ｅ．ｃｏｌｉリボソーム、０．６μＭメチオニルｔＲＮＡホルミルトランスフェラーゼ、２．７μＭ ＩＦ１、３μＭ ＩＦ２、１．５μＭ ＩＦ３、０．１μＭ ＥＦ－Ｇ、２０μＭ ＥＦ－Ｔｕ／Ｔｓ、０．２５μＭ ＲＦ２、０．１７μＭ ＲＦ３、０．５μＭ ＲＲＦ、４μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍＬ ミオキナーゼ、０．１μＭ 無機ピロホスファターゼ、０．１μＭ ヌクレオチド二リン酸キナーゼ、０．１μＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、０．１３μＭ ＡｓｐＲＳ、０．１１μＭ ＬｙｓＲＳ、０．０３μＭ ＭｅｔＲＳ、０．０２μＭ ＴｙｒＲＳ、０．０５ｍＭ ［14Ｃ］アスパラギン酸、０．５ｍＭ リジン、０．５ｍＭ メチオニン、０．５ｍＭ チロシン、各２５μＭプレチャージされたアミノアシルｔＲＮＡ及び０．５μＭ ＤＮＡテンプレート。ｒＰ１およびｒＰ２やβ－アミノ酸含有ペプチドの翻訳のために、０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ及び０．５ｍＭ グリシンも上記溶液に加えた。
翻訳反応は、３７℃で、２．５μＬの溶液中で行い、等容量の停止溶液（０．９Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．４５）、８％ ＳＤＳ、３０％ グリセロール及び０．００１％ キシレンシアノール）を加えて停止させ、９５℃で２分間又は３分間インキュベートした。次に、サンプルを１５％ トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ７０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたオートラジオグラフィーにより分析した。ペプチド収量は、［14Ｃ］Ａｓｐバンドの強度によって正規化した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析のために、０．５ｍＭ非放射性アスパラギン酸を［14Ｃ］アスパラギン酸の代わりに上記溶液に添加した。翻訳を３７℃で２０分間又は４０分間行った後、等容量の２ｘＨＢＳ緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈した。次に、ペプチドを抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）で精製した。反応混合物を５μＬのゲルビーズに添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。ゲルビーズ上のペプチドを２５μＬの１×ＨＢＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、ペプチドをビーズから０．２％ トリフルオロ酢酸１５μＬで溶出させた。次いで、ペプチドをＳＰＥ Ｃ－ｔｉｐ（Ｎｉｋｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｓ）で脱塩し、５０％ 飽和（Ｒ）シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸を含む０．５％ 酢酸溶液である８０％アセトニトリル１．２μＬで溶出した。反射／陽性モードでｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－質量分析を行った。ペプチド質量標準ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を外部質量較正に使用した。
連続したＤ－アミノ酸取り込みの促進のためのＥＦ－Ｐによって認識されるｔＲＮＡ Pro1 の本質的なＤアーム構造
ＥＦ－Ｐが、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ伸長におけるぺプチジルトランスファー（ＰＴ）速度の増強能を有するため、新生ペプチド鎖において、いくつかのＤ－アミノ酸のゆっくりとした取り込みを促進し得ることを確認するために、以下の実験を行った。
初めに、おのおの、２又は３の連結したＤ－アミノ酸をコードする２つのｍＲＮＡコンストラクト（ｍＲ１及びｍＲ２）を調製した（図２Ａ）。
Ｄ－アミノ酸は、フレキシザイム技術により、対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡPro1誘導体にプレチャージされ、ｒＰ１ペプチド又はｒＰ２ペプチドを合成するために、５μＭ ＥＦ－Ｐタンパク質を含むＦＩＴシステムにおいて用いられた。
特定のＦＩＴシステムでは、［14Ｃ］Ａｓｐ、コールドＭｅｔ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ及び対応するＡＲＳが添加され、ｍＲＮＡ（ｍＲ１及びｍＲ２）によってコードされない他のアミノ酸／ＡＲＳ対は省略された。代わりに、Ｄ－アミノアシルｔＲＮＡを添加して、Ｄ－アミノ酸をＮＮＮコドンに割り当てた。ＩＦ－２、ＥＦ－Ｔｕ及びＥＦ－Ｇの濃度は、Ｄ－アミノ酸の連続取り込みのためにあらかじめ最適化された値である３μＭ、２０μＭ及び０．１μＭにそれぞれ設定した（非特許文献２及び５）。野生型（ＷＴ）ｔＲＮＡPro1 CGGはＤステムの端に位置する１３位及び２２位にＣ／Ｇ塩基対を有するが、変異体ｔＲＮＡPro1 CGGは１３位にＣ－ｔｏ－Ｇ点変異を有し、塩基対形成を破壊する（図２Ｂ）。ＥＦ－Ｐは、ＷＴ ｔＲＮＡPro1の４塩基対の安定なＤステム構造で閉じられた９塩基のＤループを厳密に認識するので、Ｃ１３Ｇ変異はＥＦ－Ｐによる認識を減少させた。したがって、ｍＲ１及びｍＲ２においてＤ－アミノ酸を指定するＮＮＮコドンを解読するために、ｔＲＮＡPro1 CGG及び陰性対照としてＣ１３Ｇ変異体を用いた。ｔＲＮＡPro1のアンチコドンは、標的コドンを解読するために他のものに変更することができた（図２Ｃ）。
ＷＴ Ｄ－Ａｌａ－ｔＲＮＡPro1を用いて、ｍＲ１においては、ｒＰ１ペプチド（ｒＰ１－Ｄ－Ａｌａ2）に２つの連続したＤ－アラニンを導入するための３つの異なるコドン（ＮＮＮ＝ＣＣＧ、ＡＣＵ又はＣＡＣ）を試験した（図２Ｃ、図３Ａ）。
得られたペプチドは、トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離され、オートラジオグラフィーで定量化した。ＥＦ－Ｐの付加が、ｒＰ１ペプチド（ｒＰ１－Ｄ－Ａｌａ2）の発現レベルに、同様の範囲で（０．４～０．６μＭ）、コドンに依らず、重大な改良をもたらした。ＥＦ－Ｐを含まないＤ－Ａｌａ取り込みのバックグラウンドレベルの差異（ＣＣＧ、ＡＣＵ及びＣＡＣについて、それぞれ２．６倍、４．７倍及び１２倍）のために、増強効果の見掛けのレベルはコドンによることとなった。陽性対照として、Ｌ－Ｐｒｏ－ｔＲＮＡPro1を用いて、ｒＰ１－Ｌ－Ｐｒｏ2及びｒＰ２－Ｌ－Ｐｒｏ3ペプチドのＸ残基の位置に連続するＬ－Ｐｒｏ取り込みのＥＦ－Ｐ増強を行ったところ、それぞれ、１．４倍及び２２倍の改善効果が見られた。（図３Ｂ及び３Ｃ）
次に、ＥＦ－ＰがｍＲ１上のＣＣＧコドンを抑制するｔＲＮＡPro1 CGGにチャージしたＤ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｃｙｓ及びＤ－Ｈｉｓの取り込みを増強できるかどうかを調べた（図２Ｄ、図３Ｄ）。増強効果は５．４倍、８．４倍及び２．１倍であり、ＥＦ－ＰがこれらのＤ－アミノ酸の２回の連続した取り込みを２～１０倍の範囲で増強することが示された。その一方、ｔＲＮＡPro1 CGGのＣ１３Ｇ変異体を用いると、ｒＰ１－Ｄ－Ｘ2ペプチドで、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｃｙｓ及びＤ－Ｈｉｓの２．１倍、２．４倍、３．５倍及び０．９倍でＥＦ－Ｐ増強効果を低下させた。絶対発現レベルは、Ｃ１３Ｇ／ＥＦ－ＰよりもＷＴ／ＥＦ－Ｐの使用により２倍以上に増強されたことから、各場合においてＥＦ－Ｐの効果が確実に観察された。これらペプチドの正確な発現は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により確認した（図３Ｅ）。
続いて、キラルではないα，α―ジメチル置換アミノ酸（Ａｉｂ、２－アミノ酪酸）を用いた（図２Ｄ、図３Ｄ及び３Ｅ）。
α、α－二置換はＤ－アミノ酸のようなリボソームＰＴ中心に同様の状況を設定し、Ａｉｂの連続取り込みの効率が非常に低いことが確認できた。ｒＰ１－Ａｉｂ2ペプチドへのＡｉｂ取り込みに対するＥＦ－Ｐ増強は、ＷＴ ｔＲＮＡPro1の使用により２０倍であり、Ｃ１３Ｇ変異体により５倍であった。発現レベルは、ＷＴ／ＥＦ－Ｐの組み合わせにより３倍以上に増強された。
次に、ｒＰ２ペプチドの新生鎖にＤ－Ａｌａ及びＡｉｂの３つの連続した取り込みを調べた（図２Ｅ、図３Ｄ及び３Ｅ）。ｒＰ２－Ｄ－Ａｌａ3ペプチドへのＤ－Ａｌａの取り込みのＥＦ－Ｐによる増強効果はＷＴ ｔＲＮＡPro1 CGGを用いて１．９倍であったが、Ｃ１３Ｇ変異体を用いた場合は、ＥＦ－Ｐの存在に関わらず検出限界以下あった。ｒＰ２－Ａｉｂ3がＷＴ ｔＲＮＡPro1 CGGを用いて発現させた場合、ＥＦ－Ｐによる増強効果は３倍であったが、Ｃ１３Ｇ変異体を用いた場合には、その効果は観察されなかった。これらの結果から、ＥＦ－ＰがＤ－アミノ酸の連続的な取り込みの発現レベルを刺激することが示されている。
我々はまた、ＷＴ Ｄ－Ａｌａ－ｔＲＮＡPro1 CGGの存在下でｒＰ１－Ｄ－Ａｌａ2のペプチドの発現レベルの関数としてＥＦ－Ｐ濃度を滴定した（図４Ａ）。ＥＦ－Ｐ（１０及び１５μＭ）の濃度が高いほどＥＦ－Ｐの効果は低下したが、４０及び１５分の時点での滴定実験では、５－７μＭのＥＦ－ＰがｒＰ１－Ｄ－Ａｌａ2ペプチドの発現の最大レベルを示した。実施例における翻訳系のリボソームの濃度が１．２μＭであることを考慮すると、ＥＦ－Ｐの最適濃度はリボソーム濃度の約５倍であった。
ｒＰ１－Ｄ－Ａｌａ2ペプチドの翻訳の時間経過分析を、ＥＦ－Ｐの存在下（５μＭ）及びＥＦ－Ｐの非存在下で行った。両条件において、全長ペプチドの収量は５０分でプラトー化した（図４Ｂ）。５０分で、ｒＰ１－Ｄ－Ａｌａ2ペプチドの発現レベルは、５μＭ ＥＦ－Ｐの存在下で約１μＭに達した。かかる濃度は、Ｌ－Ａｌａ2を含む完全Ｌ－ペプチドの発現レベルに匹敵した（参考文献３）。
連続したＤ－アラニンの取り込みをさらに増強させるｔＲＮＡ Pro1 へのＴステム構造の改変
ｔＲＮＡGluE2のＴステムをｔＲＮＡPro1に導入して、本明細書で、ｔＲＮＡPro1E1と言及するキメラｔＲＮＡを作成した（図５Ａ、ｔＲＮＡPro1E1 CGG）。
さらに、ＰｒｏＲＳに認識される識別塩基に付加的な変異を有する（参考文献９）、本明細書で、ｔＲＮＡPro1E2 CGGと言及する別のキメラｔＲＮＡを作成した。かかる変異を導入したことにより、ｔＲＮＡPro1E2 CGGは、ＰｒｏＲＳによりＰｒｏをチャージされなくなった。すなわち、ＰｒｏＲＳに対して直交性を有する。
ＷＴｔＲＮＡPro1 CGG、ｔＲＮＡPro1E1 CGG、ｔＲＮＡPro1E2 CGG、ｔＲＮＡGluE2 CGG及びｔＲＮＡAsnE2 CGG用いて（図５Ａ）、ｒＰ１－Ｄ－Ａｌａ2への２つの連続したＤ－アラニンの取り込み能を比較した（図５Ｂ、図６Ａ）。
その結果、試験された他のｔＲＮＡとの比較により、ＥＦ－ＰとｔＲＮＡPro1E1 CGG（４．１倍）及びｔＲＮＡPro1E2 CGG（５．０倍）の組合せによって、４倍以上のペプチド発現レベルの増強が確認された。
このことは、明確にキメラｔＲＮＡGluE2のＴステムとｔＲＮＡPro1のＤアームに由来するキメラｔＲＮＡPro1E1及びｔＲＮＡPro1E2が、ＥＦ－ＰとＥＦ－Ｔｕにアシストされて、トータルのＰＴ速度を増強していることを意味している。
ＥＦ－Ｐにより増強された複数のＤ－アミノ酸の取り込み
Ｄ－Ａｌａ－ｔＲＮＡPro1E2及びＥＦ－Ｐの組合せは、ｒＰａ－Ｄ－Ａｌａ2の発現レベルの増強を可能にする。
５つの異なる鋳型ｍＲＮＡを調製して（図７Ａ、ｍＲ３～ｍＲ７）、１～３の異なるＤ－アミノ酸をその配列中に含む対応するペプチドを合成した（図７Ａ、ｒＰ３～ｒＰ７ぺプチド）。
これらのｍＲＮＡにおいては、Ｄ－Ａｌａ－ｔＲＮＡPro1E2 GAU、Ｄ－Ｃｙｓ－ｔＲＮＡPro1E2 GUG及びＤ－Ｓｅｒ－ｔＲＮＡPro1E2 GGUが、それぞれ、ＡＵＵ、ＣＡＵ及びＡＣＵコドンに各々割り当てられた。５μＭ ＥＦ－Ｐの存在下、ｒＰ３及びｒＰ４発現が増強していることを確認した（図６Ｂ）。一方、ＥＦ－Ｐの非存在下では、バンドは検出されなかった。すなわち、２種類の２つ連続したＤ－アミノ酸（Ｄ－Ａｌａ2－ＹＹ－Ｄ－Ａｌａ2またはＤ－Ａｌａ2－ＹＹ－Ｄ－Ｃｙｓ2；Ｙ＝Ｌ－Ｔｙｒ）を含むｒＰ３及びｒＰ４においては、極めて増強した発現が確認された。
２種類の２つ連続したＤ－アミノ酸（Ｄ－Ａｌａ2－ＹＹ－Ｄ－Ｓｅｒ2）を含むｒＰ５ペプチドにおいては、ＥＦ－Ｐの非存在下でも、検出可能なレベルのｒＰ５ペプチドを発現したが、ＥＦ－Ｐの添加は、１３倍の発現レベルの増強を示した（図６Ｂ、図７Ｂ）。
Ｌ－アミノ酸とＤ－アミノ酸を交互に含むｒＰ６及びｒＰ７ぺプチドの発現は少ないものの、ＥＦ－Ｐ存在下でも検出可能であった。一方、ＥＦ－Ｐの添加は、それぞれで、３．３倍及び３．０倍の発現レベルの増強を示した（図６Ｂ、図７Ｂ）。
各ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－質量分析は、ＥＦ－Ｐの存在下での予想される分子量を示した（図６Ｃ）。
これらの結果は、ＥＦ－ＰとＤ－アミノアシル－ｔＲＮＡPro1E2の組合せが、複数種のＤ－アミノ酸を含むペプチドの発現レベルの増強において、顕著なインパクトを与えることを示唆している。
ＥＦ－Ｐにより刺激される環状Ｄ―ペプチドのリボソーム合成
ＦＩＴシステムを用いてｔＲＮＡGluE2誘導体を用いて大環状Ｄ－ペプチドの発現を実証したところ、大環状Ｄ－ペプチドの発現レベルは、大環状Ｌ－ペプチドよりも４倍低かった。
そこで、ｔＲＮＡPro1E2を用いたところ、大環状Ｄ－ペプチドの発現レベルが増強した。具体的には、ＥＦ－Ｐにより２つのモデルＤ－ペプチドであるｒＰ８及びｒＰ９ペプチドの発現レベルを増強させることに成功した（図８）。
ｒＰ８は、Ｄ－Ｃｙｓ－Ｄ－Ｓｅｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｓｅｒ－Ｄ－Ｃｙｓを含む。
ＥＦ－Ｐと共に伸長キャリアとしてｔＲＮＡPro1E2を用いて発現したｒＰ８ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－質量分析は、これらのＤ－アミノ酸が正しく導入され、２つのＤ－Ｃｙｓ残基がジスルフィド結合を形成して大環状構造を与えることを示した（図９Ｃ）。
ｒＰ８ペプチドのトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、Ｄ－アミノアシル－ｔＲＮＡPro1E2と対になったＥＦ－Ｐが、ＥＦ－Ｐ不活性Ｄ－アミノアシル－ｔＲＮＡGluE2を用いて発現されたものと比較して、発現レベルで、約８倍増強することができた（図８Ｂ、図９Ａ）。
同様の方法で、Ｄ－ClAcＰｈｅ－Ｄ－Ｓｅｒ－Ｄ－Ｓｅｒ－Ｄ－Ｃｙｓ連続ストレッチを含む別のモデルＤ－ペプチドであるｒＰ９ペプチドを設計した。Ｄ－ClAcＰｈｅのＮ末端クロロアセチル基はＤ－Ｃｙｓのスルフヒドリル基と反応して、チオエーテル大環状構造を形成した（図８Ａ）。ｒＰ９ペプチドの発現は、ｔＲＮＡGluE2を用いた場合と比較して、Ｄ－アミノアシル－ｔＲＮＡPro1E2と対になったＥＦ－Ｐにより、約１０倍に増強され（図８Ｃ）、チオエーテル大環状Ｄ－ペプチドが効率的に産生され得ることが示された（図９Ｃ）。
ＥＦ－Ｐにより増強された連続したβ－アミノ酸の取り込み
Ｄ－アミノ酸の取り込みについて上記した方法に準じて、以下行った。
βｈＱ、βｈＭ及びβｈＦ（図１０ｂ）が、野生型（ＷＴ）ｔＲＮＡPro1 CGG又はＣ１３Ｇ変異ｔＲＮＡPro1 CGG（図１０ａ）にフレキシザイム技術によりプレチャージされ、ｒＰ１ペプチド合成するために、５μＭ ＥＦ－Ｐタンパク質を含むＦＩＴシステムにおいて、鋳型ｍＲＮＡであるｍＲ１（図１０ｃ）の翻訳に用いられた。
β－アミノ酸の前のＴｙｒ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｔｙｓ－Ｌｙｓ配列は、発現されたペプチドが、トリシンＳＤＳーＰＡＧＥやＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－質量分析における検出のために導入している配列である。
ペプチドは、［14Ｃ］Ａｓｐの存在下に発現され、１５％トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥに供され、Ｃ末端のフラグータグ領域に導入された［14Ｃ］Ａｓｐの強度によってオートラジオグラフィーで定量化した（図１０ｄ、図１５ａ）。
コールドＡｓｐの存在下で、同じペプチドの発現は、ＥＦ－Ｐの非存在下でも、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－質量分析により確認した（図１５ｂ）。ただし、ＥＦ－Ｐの存在により、ＷＴ ｔＲＮＡPro1 CGGが用いられた場合には、β－アミノ酸の取り込みは増大した（図１０ｄ、βｈＱにおいて１．７倍、βｈＭにおいて４．６倍、βｈＦにおいて１．３倍）。
これらの結果は、明確に、ＥＦ－Ｐが、ｔＲＮＡPro1のＤアーム構造を認識していることを示しており、応答するβ－アミノ酸の取り込みを促進している。
続いて、ｒＰ１ペプチドへの、βｈＱ及びβｈＭの取り込みにおけるＥＦ－Ｐの最適化濃度の検討を行い（参考文献１及び２）、β－アミノ酸の取り込みにおいては、ＥＦ－Ｐ濃度が５～１０μＭ程度であることが良好であった。同様の傾向が、Ｄ－アラニンの取り込みにおいても確認された。
これらの結果は、ＥＦ－Ｐが、リボソームのＥ部位を占め、そして、Ｐ部位からＥ部位へのデアシルｔＲＮＡのトランスロケーションを阻害していると考えられた。
連続したβ－アラニンの取り込みにおけるＥＦ－Ｔｕ結合を増強させるｔＲＮＡ Pro1 のＴステム構造の改変
図１１ａに示すｔＲＮＡに、フレキシザイム技術によりβｈＭをチャージして、βｈＭをチャージしたｔＲＮＡ間でさらなる取り込み増強が起こるか対比した。
大腸菌ｔＲＮＡAsnに基づく、ＴステムもＤアームも最適化されていないｔＲＮＡAsnE2、ＥＦ－Ｔｕ結合に最適化したＴステムを有するｔＲＮＡGluの派生物であるｔＲＮＡGluE2及びｔＲＮＡPro1において、βｈＭ－ｔＲＮＡPro1E2は、ＲＦ－Ｐの存在下で７．３倍の取り込みの増強効果を示し、ＥＦ－Ｐ存在下でのβｈＭ－ｔＲＮＡPro1に対して、２倍近い取り込みの増強効果を示した（図１１ｂ）。
７つの連続したβ－アミノ酸の取り込み
βｈＭをチャージしたｔＲＮＡGluE2 CGGを用いて、ｍＲ２の２～７つの連続したＣＧＧコドンに対してβｈＭを導入して、ｍＲ２に対応するｒＰ２－βｈＭnペプチドを合成した（図１２、図１６ｂ）。
連続するβｈＭの数の増加に伴い、ｒＰ２－βｈＭnペプチドの翻訳効率は減少したものの、ＥＦ－Ｐの存在下で、βｈＭを連続して７つ含む完全長のｒＰ２ペプチドを検出することができた（図１２ｂ及び図１２ｃ）。
また、ｒＰ２－βｈＭ2ペプチド及びｒＰ２－βｈＭ3ペプチドでは、ＥＦ－Ｐによる顕著な取り込みの増強効果が確認された（それぞれ５．９倍、１６．２倍）。
同様に、βｈＭ及びβｈＦを、それぞれ、ｔＲＮＡPro1E2 GAU及びｔＲＮＡPro1E2 GUGにプレチャージし、ＡＵＵコドン及びＣＡＵコドンで、おのおの取り込んだｒＰ３－３ペプチド～ｒＰ３－７ペプチドを合成した（図１３ａ）。
ｒＰ３－３ペプチド～ｒＰ３－７ペプチドの発現が、ＥＦ－Ｐの存在下で確認された（図１３ｂ、図１３ｃ、図１６ｃ）。
また、ｒＰ３－３ペプチド～ｒＰ３－５ペプチドでは、ＥＦ－Ｐによる顕著な取り込みの増強効果が確認された（それぞれ７．４倍、２１．７倍、３０．３倍）。加えて、ｒＰ３－６ペプチド～ｒＰ３－７ペプチドでは、ＥＦ－Ｐにより、発現が、Ｎ．Ｄ．から検出可能になるという増強効果が確認された。
複数のＤ－アミノ酸及びβ－アミノ酸の取り込み
本法の汎用性を示すために、３種類のβ－アミノ酸、４種類のＤ－アミノ酸を様々な位置に取り込んだ８種類のｒＰ４ペプチド～ｒＰ１１ペプチドを合成した（図１４ａ及び図１４ｂ）。
また、ｒＰ４ペプチド～ｒＰ５ペプチドでは、ＥＦ－Ｐによる取り込みの増強効果が確認された（図１４ｃ、図１６ｄ、それぞれ１．９倍、１．６倍）。ｒＰ６ペプチド～ｒＰ７ペプチドでは、連続したβ－アミノ酸の２つのセットが取り込まれていて、ＥＦ－Ｐによる取り込みの増強効果が確認された（図１４ｃ、図１６ｄ、それぞれ１２．３倍、１９．３倍）。ｒＰ８ペプチド～ｒＰ９ペプチドでは、β－アミノ酸とＤ－アミノ酸の組み合わせが取り込まれていて、ＥＦ－Ｐにより、検出可能となるまで取り込みの増強効果が確認された（図１４ｃ、図１６ｄ、ｒＰ８ペプチドでは、９．２倍、ｒＰ８ペプチドでは、０．０４μＭ）。
チオエーテル結合による、連続したβ－アミノ酸を取り込んだ大環状ペプチド（ｒＰ１０ペプチド～ｒＰ１１ペプチド）を合成した（図１４ａ）。開始ＡＵＧコドンが、Ｄ－ClAcＰｈｅに割り当てられ、Ｄ－ClAcＰｈｅのクロロアセチル基が、下流のＤ－システインの側鎖チオール基と反応して、チオエーテル結合を形成する。ｒＰ１０ペプチド～ｒＰ１１ペプチドでも、ＥＦ－Ｐによる取り込みの増強効果が確認された（図１４ｄ、図１６ｄ、それぞれ３．２倍、２．３倍）。
取り込みミスによる副生成物を産生することなり、これあらのペプチドが合成されていることを、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＲ－質量分析により確認した（図１６ｅ）。
参考文献
１．Ude, S. et al. Translation elongation factor EF-P alleviates ribosome stalling at polyproline stretches. Science 339, 82-5 (2013).
２．Doerfel, L.K. et al. EF-P is essential for rapid synthesis of proteins containing consecutive proline residues. Science 339, 85-8 (2013).
３．Katoh, T., Wohlgemuth, I., Nagano, M., Rodnina, M.V. & Suga, H. Essential structural elements in tRNA(Pro) for EF-P-mediated alleviation of translation stalling. Nat Commun 7, 11657 (2016).
４．LaRiviere, F.J., Wolfson, A.D. & Uhlenbeck, O.C. Uniform binding of aminoacyl-tRNAs to elongation factor Tu by thermodynamic compensation. Science 294, 165-8 (2001).
５．Dale, T., Sanderson, L.E. & Uhlenbeck, O.C. The affinity of elongation factor Tu for an aminoacyl-tRNA is modulated by the esterified amino acid. Biochemistry 43, 6159-66 (2004).
６．Becker, H.D. & Kern, D. Thermus thermophilus: a link in evolution of the tRNA-dependent amino acid amidation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 12832-7 (1998).
７．Stanzel, M., Schon, A. & Sprinzl, M. Discrimination against misacylated tRNA by chloroplast elongation factor Tu. Eur J Biochem 219, 435-9 (1994).
８．Schrader, J.M., Chapman, S.J. & Uhlenbeck, O.C. Tuning the affinity of aminoacyl-tRNA to elongation factor Tu for optimal decoding. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 5215-20 (2011).
９．Hasegawa, T. & Yokogawa, T. Escherichia coli proline tRNA: structure and recognition sites for prolyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Symp. Ser. 44, 7-8 (2000).
１０．Pavlov, M.Y. et al. Slow peptide bond formation by proline and other N-alkylamino acids in translation. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 50-4 (2009).
１１．Doerfel, L.K. et al. Entropic Contribution of Elongation Factor P to Proline Positioning at the Catalytic Center of the Ribosome. J Am Chem Soc 137, 12997-3006 (2015).
１２．Wohlgemuth, I., Brenner, S., Beringer, M. & Rodnina, M.V. Modulation of the rate of peptidyl transfer on the ribosome by the nature of substrates. J Biol Chem 283, 32229-35 (2008).
１３．Johansson, M. et al. pH-sensitivity of the ribosomal peptidyl transfer reaction dependent on the identity of the A-site aminoacyl-tRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 79-84 (2011).
１４．Melnikov, S. et al. Molecular insights into protein synthesis with proline residues. EMBO Rep 17, 1776-1784 (2016).
１５．Driggers, E.M., Hale, S.P., Lee, J. & Terrett, N.K. The exploration of macrocycles for drug discovery--an underexploited structural class. Nat Rev Drug Discov 7, 608-24 (2008).
１６．Hipolito, C.J. & Suga, H. Ribosomal production and in vitro selection of natural product-like peptidomimetics: the FIT and RaPID systems. Curr Opin Chem Biol 16, 196-203 (2012).
１７．Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y. & Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annu Rev Biochem 83, 727-52 (2014).
１８．Saito, H., Kourouklis, D. & Suga, H. An in vitro evolved precursor tRNA with aminoacylation activity. EMBO J 20, 1797-806 (2001).

Claims (10)

  1. 配列番号１で示される塩基配列及び配列番号２で示される塩基配列を含有し、非タンパク質性アミノ酸をコードするｔＲＮＡ。
    Ｎ1Ｎ2ＧＣＮ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8Ｎ9Ｎ10Ｎ11ＧＣＮ12Ｎ13 （配列番号１）
    ＡＧＧＧＧ（Ｎ14）mＣＣＣＣＵ （配列番号２）
    （配列番号１において、
    Ｎ1～Ｎ13は、それぞれ任意の塩基を示し、Ｎ3～Ｎ11はＤループを形成し、
    ５’－Ｎ1Ｎ2ＧＣ－３’が、３’－Ｎ13Ｎ12ＣＧ－５’と塩基対を形成し、
    配列番号２において、
    Ｎ14は、任意の塩基を示し、ｍは、１以上の整数であり、（Ｎ14）mはＴループを形成し、
    ５’－ＡＧＧＧＧ－３’が、３’－ＵＣＣＣＣ－５’と塩基対を形成する。）
  2. 非タンパク質性アミノ酸が、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸又はα，α－二置換アミノ酸である、請求項１に記載のｔＲＮＡ。
  3. 配列番号１で示される塩基配列を含有し、３’末端にＤ－アミノ酸、β－アミノ酸又はα，α－二置換アミノ酸がチャージされている伸長ｔＲＮＡ。
    Ｎ1Ｎ2ＧＣＮ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8Ｎ9Ｎ10Ｎ11ＧＣＮ12Ｎ13 （配列番号１）
    （配列番号１において、
    Ｎ1～Ｎ13は、それぞれ任意の塩基を示し、Ｎ3～Ｎ11はＤループを形成し、
    ５’－Ｎ1Ｎ2ＧＣ－３’が、３’－Ｎ13Ｎ12ＣＧ－５’と塩基対を形成する。）
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のｔＲＮＡを含み、２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合するペプチドを合成するための翻訳系。
  5. 請求項１～３のいずれか１項に記載のｔＲＮＡを用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドライブラリの製造方法。
  6. 請求項１～３のいずれか１項に記載のｔＲＮＡを用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体ライブラリの製造方法。
  7. 請求項１～３のいずれか１項に記載のｔＲＮＡを用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドの製造方法。
  8. 請求項１～３のいずれか１項に記載のｔＲＮＡを用いて、無細胞翻訳系で翻訳する工程を含む、ペプチドと該ペプチドをコードするｍＲＮＡとの複合体の製造方法。
  9. 前記ペプチドが、２以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合するペプチドを含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 前記ペプチドが、４以上の非タンパク質性アミノ酸が連続して結合し、非タンパク質性アミノ酸間で分子内架橋したペプチドを含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の製造方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7566294B2 (ja) 2019-11-19 2024-10-15 国立大学法人 東京大学 Ｎ－メチルアミノ酸の取り込みを増強するｔＲＮＡのＴステムの改変
WO2021132546A1 (ja) 2019-12-26 2021-07-01 中外製薬株式会社 翻訳用組成物及びペプチドの製造方法
US20230117920A1 (en) 2019-12-27 2023-04-20 The University Of Tokyo Library Construction Method, Cyclic Peptide, FXIIa Binder and IFNGR1 Binder
US20230295613A1 (en) * 2020-02-14 2023-09-21 Northwestern University Long chain carbon and cyclic amino acids substrates for genetic code reprogramming

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008125396A (ja) 2006-11-17 2008-06-05 Univ Of Tokyo Ｎ末端に非天然骨格をもつポリペプチドの翻訳合成とその応用
WO2011049157A1 (ja) 2009-10-22 2011-04-28 ペプチドリーム株式会社 ペプチド翻訳合成におけるrapidディスプレイ法
WO2012074130A1 (ja) 2010-12-03 2012-06-07 国立大学法人東京大学 ペプチドライブラリーの製造方法、ペプチドライブラリー、及びスクリーニング方法
WO2012074129A1 (ja) 2010-12-03 2012-06-07 国立大学法人東京大学 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060200878A1 (en) * 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
EP2990411B1 (en) 2007-03-26 2017-05-03 The University of Tokyo Process for synthesizing cyclic peptide compound
JP5818237B2 (ja) * 2010-09-09 2015-11-18 国立大学法人 東京大学 Ｎ−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法
JP6440055B2 (ja) * 2013-05-10 2018-12-19 国立大学法人 東京大学 ペプチドライブラリの製造方法、ペプチドライブラリ、及びスクリーニング方法
WO2014194129A2 (en) * 2013-05-29 2014-12-04 Brigham Young University Cell-free synthetic incorporation of non-natural amino acids into proteins
JP6754997B2 (ja) 2013-08-26 2020-09-16 国立大学法人 東京大学 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008125396A (ja) 2006-11-17 2008-06-05 Univ Of Tokyo Ｎ末端に非天然骨格をもつポリペプチドの翻訳合成とその応用
WO2011049157A1 (ja) 2009-10-22 2011-04-28 ペプチドリーム株式会社 ペプチド翻訳合成におけるrapidディスプレイ法
WO2012074130A1 (ja) 2010-12-03 2012-06-07 国立大学法人東京大学 ペプチドライブラリーの製造方法、ペプチドライブラリー、及びスクリーニング方法
WO2012074129A1 (ja) 2010-12-03 2012-06-07 国立大学法人東京大学 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATO T. et al.，Consecutive Elongation of D-Amino Acids in Translation，Cell Chemical Biology, Epub 2016 Dec 29, vol.24, no.1, p.46-54
KATO T. et al.，Essential structural elements in tRNAPro for EF-P-mediated alleviation of translation stalling，Nature Communications, 2016, 7:11657
KATO T. et al.，Logical engineering of D-arm and T-stem of tRNA that enhances D-amino acid incorporation，Nucleic Acids Research, Epub 2017 Nov 16, vol.45, no.22, p.12601-12610
小嶋達矢ほか，遺伝子暗号リプログラミン技術，生物物理, 2012, vol.52, no.1, p.004-009

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