JP2024510101A - タンパク質翻訳システム - Google Patents

Abstract

本開示では、無細胞かつａａＲＳフリータンパク質翻訳システム、及びタンパク質及び活性酵素の製造におけるその使用が提供される。

Description

本発明は、そのいくつかの実施形態において、無細胞タンパク質翻訳システムに関し、より具体的には、これに限られるものではないが、アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ無しでのタンパク質及びその鏡像体を合成する方法並びにその使用に関する。

関連出願
本出願は、２０２１年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１５０，６４１号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本開示に取り込まれる。

配列表についての陳述
９０９１２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題され、２０２２年２月１６日に作成され、３６，８６４バイトを含み、本出願の出願と同時に提出されたＡＳＣＩＩファイルは、参照により本開示に取り込まれる。

無細胞タンパク質合成は、基礎科学及び応用科学の分子生物学者にとって重要なツールである。それは、ハイスループット機能的ゲノミクス及びプロテオミクスにおいてますます使用されており、生細胞におけるタンパク質発現と比較して大きな利点がある。無細胞タンパク質合成は、核酸プログラム可能タンパク質アレイ（ＮＡＰＰＡ）などのタンパク質アレイの作製、及びディスプレイ技術を使用する酵素工学に不可欠である。無細胞アプローチは、表現型（発現タンパク質の機能）を遺伝子型と関係づける最速のやり方を提供する。タンパク質合成は、翻訳システムにおいてｍＲＮＡ鋳型を用いて、あるいは連結された（coupled）転写及び翻訳システムにおいてＤＮＡ鋳型（プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲフラグメント）を用いて、数時間で行うことができる。さらに、無細胞タンパク質発現システムは、毒性タンパク質、膜タンパク質、ウイルスタンパク質の発現、及び細胞内プロテアーゼによる迅速なタンパク質分解を受けるタンパク質にとって不可欠である。

ほとんどの無細胞タンパク質発現はライセートに基づき、それは、高い速度でのタンパク質合成に従事している細胞から作られる。最も頻繁に用いられる無細胞発現システムは、翻訳のための高分子成分、例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ、開始因子、伸長因子、及び終結因子、を必要とする。効率的な翻訳を担保するためには、市販の抽出物は、アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生システム及び塩（Ｍｇ２＋、Ｋ＋、他）を補充されなければならない。真核生物システムについては、クレアチンリン酸及びクレアチンホスホキナーゼがエネルギー再生システムとして働き、一方、原核生物システムの場合はホスホエノールピルビン酸及びピルビン酸キナーゼが補充される。連結された転写システム及び翻訳システムに対しては、ポリメラーゼプロモーターの下流にクローニングされた遺伝子の発現を可能にする、ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼが補充される。

タンパク質酵素の出現は、ＲＮＡベースの生命から現代の生物学への移行の鍵である。ｔＲＮＡ－アミノアシル化リボザイムの発見は、リボザイムによって積荷（charge）されるｔＲＮＡを用いる、高度に単純化された翻訳システムからタンパク質酵素を合成する可能性を示唆した。また、ａａＲＳ、ウルザイム（ｕｒｚｙｍｅ）及び化学的アシル化によって調製された事前に積荷したｔＲＮＡを用いる、他のシステムも報告されている。これらの中で、インビトロ選択によって発見された、フレキシザイムと名付けられた非常に堅牢で汎用的なｔＲＮＡ－アミノアシル化リボザイムシステムは、多種多様なアミノ酸をｔＲＮＡに積み込みすることができることが示されている。フレキシザイム及びａａＲＳによって積荷されたｔＲＮＡを用いて、複数の非天然アミノ酸の翻訳ペプチドへの組み込みが達成され、実用場面でのペプチド薬の選択が可能になった。しかしながら、部分的には翻訳収率が低いことのため、ａａＲＳの存在無し（以後、「ａａＲＳフリー」と呼ぶ）にフレキシザイムで積荷されたｔＲＮＡのみを用いた場合、短ペプチド（７アミノ酸残基未満の長さ）のみが翻訳され、一方、ａａＲＳフリー条件下での２０種全てのタンパク質構成アミノ酸を有する完全長の機能性タンパク質酵素のリボソームによる産生は、これまで実証されていないままである。

Ｔｅｒａｓａｋａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．［Ｔｅｒａｓａｋａ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇ．，Ｋａｔｏｈ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２０１４）．Ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｔＲＮＡ ｐａｉｒ ｖｉａ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｅｎｔｅｒ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０，５５５－５５７］は、代償的変異を有するｒＲＮＡ及びｔＲＮＡのペアを用いる改変されたシステムを報告しており、それは、天然の遺伝暗号とは異なる形でプログラムされた遺伝暗号を特に使用し、したがって野生型対応物とは直交してペプチドを合成することができる。これらの翻訳機構により、単一のｍＲＮＡが、人工的にプログラムされた遺伝子暗号に従って２つの異なるペプチドを産生する。

本発明の態様は、無細胞でａａＲＳフリーのタンパク質翻訳／発現／合成システム及び方法、並びにその使用を対象とする。本開示は、フレキシザイムによって積荷（charge）されたｔＲＮＡのみを用いて、Ｍｇ^２＋濃度を下げ、ｔＲＮＡ濃度を上げることによる翻訳収率の改善を通して、異なる機能を有する活性な酵素を含む複数のタンパク質の成功裏な翻訳を提供する。活性なａａＲＳ（ＴｒｐＲＳ）を製造するａａＲＳフリー翻訳システムが実証されるが、この活性なａａＲＳは、さらに、より多くのｔＲＮＡの積荷を触媒した。また、合成Ｌ－フレキシザイムによってＤ－アミノ酸を積み込み（charge）した鏡像ｔＲＮＡも実証される。本開示は、高度に単純化された翻訳装置からａａＲＳを用いずにタンパク質酵素を翻訳することの実現可能性を実証し、鏡像翻訳を実現するための数ダースにもわたる大きなａａＲＳタンパク質を化学的に合成する必要性を緩和する。カチオン枯渇しフレキシザイムで積荷されたｔＲＮＡは、他のａａＲＳタンパク質と組み合わせて、又は組み合わせずに用いられた場合に、完全な又は部分的な非天然ペプチドの翻訳に有用である。

したがって、本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、
タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子；
複数の積荷済みｔＲＮＡ分子；及び
無細胞翻訳ミックス、
を含み、システムにおけるＭｇ^＋２の濃度が１００ｍＭ未満である、
タンパク質を製造するためのシステムが提供される。

いくつかの実施形態によれば、前記システムは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを本質的に欠く。
いくつかの実施形態によれば、前記積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度は６０μＭ超である。
いくつかの実施形態によれば、前記積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度は１６０μＭを超え、Ｍｇ^＋２の濃度は１００ｍＭ未満である。

いくつかの実施形態によれば、前記複数の積荷済みｔＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのｔＲＮＡ分子は、フレキシザイムによって積荷される。
いくつかの実施形態によれば、前記ｔＲＮＡ分子には、非天然アミノ酸残基が積み込みされる。
いくつかの実施形態によれば、前記非天然アミノ酸残基はＤ－アミノ酸残基である。

いくつかの実施形態によれば、前記ｔＲＮＡ分子はＬ－リボ核酸残基を含む（Ｌ－ｔＲＮＡ）。
いくつかの実施形態によれば、Ｌ－ｔＲＮＡが、Ｄ－ポリメラーゼを用いて調製される。
いくつかの実施形態によれば、前記Ｄ－ポリメラーゼは、Ｄｐｏ４の鏡像タンパク質である（Ｄ－Ｄｐｏ４）。

いくつかの実施形態によれば、前記Ｄ－Ｄｐｏ４は、Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓである（配列番号１２６）。
いくつかの実施形態によれば、前記フレキシザイムは、Ｌ－リボ核酸残基を含む（Ｌ－フレキシザイム）。
いくつかの実施形態によれば、前記タンパク質は、活性Ｌタンパク質酵素及び活性Ｄタンパク質酵素からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態のある他の態様によれば、
所定の濃度以下のＭｇ^＋２濃度を有する複数の積荷済みｔＲＮＡ分子を提供すること；及び
積荷済みｔＲＮＡ分子を、タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と無細胞翻訳ミックス中で接触させ、それによりタンパク質を得ること
を含む、本開示で提供されるシステムを用いてタンパク質を製造する方法が提供される。

いくつかの実施形態によれば、前記方法で用いられるシステムは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを本質的に欠く。
いくつかの実施形態によれば、複数の積荷済みｔＲＮＡ分子を提供することは、前記接触ステップの前に、Ｍｇ^＋２の濃度を調整（低下又は枯渇）することを含む。
いくつかの実施形態によれば、Ｍｇ^＋２の濃度を調整することは、例えば、クロマトグラフィー、アルコール沈殿及びペレット洗浄、限外濾過、並びに透析などの技術を用いることを含む。
いくつかの実施形態によれば、複数の積荷済みｔＲＮＡ分子を提供することは、積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度を、ａａＲＳ酵素を含む他のタンパク質翻訳システムにおける積荷済みｔＲＮＡ濃度の２倍を超える濃度に調整することをさらに含む。
いくつかの実施形態によれば、積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度は１６０μＭ超である。

本発明のいくつかの実施形態のある他の態様によれば、Ｌ－ｔＲＮＡにＤ－アミノ酸を積み込みする方法が提供され、方法は、
Ｄ－ポリメラーゼを用いて前記Ｌ－ｔＲＮＡ分子を調製すること；
活性化Ｄ－アミノ酸を準備すること；
Ｌ－アミノアシル化リボザイムを準備すること；及び
前記Ｌ－ｔＲＮＡ、前記Ｌ－アミノアシル化リボザイム、及び前記活性化Ｄ－アミノ酸を接触させ、それによってＤ－アミノ酸積み込みＬ－ｔＲＮＡ分子を得ること、
によって実行される。

いくつかの実施形態によれば、前記Ｌ－アミノアシル化リボザイムはＬ－フレキシザイムである。
いくつかの態様によれば、前記方法は、Ｄ－アミノ酸積み込みＬ－ｔＲＮＡ分子の反応混合物のＰＡＧＥ分析によって分析することができ、ここでＰＡＧＥゲルは、積荷済みｔＲＮＡ種の明白なピーク及び未積荷ｔＲＮＡ種の明白なピークを特徴とする。

本発明のいくつかの実施形態のある他の態様によれば、Ｌ－リボヌクレオチド残基を含むＬ－フレキシザイムが提供される。
いくつかの実施形態では、前記Ｌ－フレキシザイムは、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上のＬ－リボヌクレオチド残基を含む。
いくつかの実施形態では、前記Ｌ－フレキシザイムは、Ｌ－リボヌクレオチド残基からなる。

いくつかの実施形態では、Ｌ－フレキシザイムは、５’－ｇｇａｕｃｇａａａｇａｕｕｕｃｃｇｃａｕｃｃｃｃｇａａａｇｇｇｕａｃａｕｇｇｃｇｕｕａｇｇｕ－３’（配列番号８２）と８０％以上の同一性を示す配列を有する。
本発明のいくつかの実施形態のある他の態様によれば、本開示で提供される方法によって調製されたタンパク質が提供される。
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、少なくとも１つの非標準（non-canonical）アミノ酸残基を含むタンパク質、少なくとも１つのＤ－アミノ酸残基を含むタンパク質、Ｌ－タンパク質、及びＤ－タンパク質からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、ニワトリリゾチーム、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、及び大腸菌ＴｒｐＲＳからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、テキスト情報及び／又は数値情報にデコードすることができる配列を有し、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、ｍＲＮＡ＃６によってコードされる。
本発明のいくつかの実施形態のある他の態様によれば、記載される方法によって得られるランダム化された、又は部分的にランダム化されたペプチドのライブラリが提供され、前記ペプチドの少なくともは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。

特に断りの無い限り、本開示において使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本開示に記載の方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験に用いることができるが、以下には例示的な方法及び／又は材料を記載する。矛盾する場合、特許明細書が、定義を含め、支配する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示的であるにすぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。

本発明のいくつかの実施形態は、単なる例として、添付の図面を参照して本開示に記載されている。ここで図面を具体的にまた詳細に参照するが、図示されている事項は例としてのものであり、本発明の実施形態の例示的な説明のためのものであることが強調されるべきである。これに関して、図面を用いてなされた説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。図面において、

図１は、本発明のいくつかの態様、特には、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いたタンパク質のａａＲＳフリー翻訳（１０）の概略図を示しており、ここでｔＲＮＡ １１は、フレキシザイムシステム１２によって積荷され、タンパク質酵素の翻訳のためのタンパク質構成アミノ酸を表す積荷済みｔＲＮＡ １３の集団を生み出し、また、前記ａａＲＳフリー翻訳は、積荷済みｔＲＮＡがＨＰＬＣによって精製されてＭｇ^２＋１４ｂ混入を減らすステップ１４ａを含み、積荷済みｔＲＮＡ １３がリボソーム１７中でのｍＲＮＡ １６のａａＲＳフリー翻訳のために濃縮されるステップ１５を含み、翻訳されたポリペプチド１８はａａＲＳ １９ｂを含む活性タンパク質酵素１９ａへとフォールディングすることができ、これは、ｔＲＮＡに積荷するのに用いることができ、それによってサイクルを完了させる。 図２は、ＨＰＬＣ精製前後でのｔＲＮＡ積荷収率の酸性ＰＡＧＥ分析を提示する図であり、ここで「Ｕ」は未積荷ｔＲＮＡを表し、「Ｃ」は粗積荷済みｔＲＮＡを表し、「Ｐ」は精製積荷済みｔＲＮＡを表すが、ｔＲＮＡ積荷収率は、総ｔＲＮＡに対する積荷済みｔＲＮＡの積分ピーク面積を用いてソフトウェアパッケージＩＭＡＧＥＪによって決定した。 図３Ａ～Ｅは、本発明のいくつかの実施形態による、鏡像ｔＲＮＡへのａａＲＳフリー積荷へと向かう途上のフレキシザイムによるｔＲＮＡへの積荷の概念及び結果を提示する。これらの図面は、Ｄ－フレキシザイムによって触媒されるＤ－ｔＲＮＡ積荷、及びその鏡像バージョン、つまりＬ－フレキシザイムによって触媒される鏡像ｔＲＮＡ積荷（ＰＤＢソース：１ＥＨＺ（ｔＲＮＡ）、３ＣＵＬ（フレキシザイム）（図３Ａ）、酵素的に転写された鏡像ｔＲＮＡ^Ａｌａ上へのＤ－アラニンのＬ－フレキシザイムによる積荷（比較のために、天然キラリティ対応物と共に）（図３Ｂ）、酵素的に転写された鏡像ｔＲＮＡＧｌｙ上へのグリシンのＬ－フレキシザイムによる積荷（比較のために、天然キラリティ対応物と共に）（図３Ｃ）、酵素的に転写された鏡像ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ上へのＤ－リジンのＬ－フレキシザイムによる積荷（比較のために天然のキラリティ対応物と共に）（図３Ｄ）、酵素的に転写された鏡像ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ上へのＤ－フェニルアラニンのＬ－フレキシザイムによる積荷（比較のために天然のキラリティ対応物と共に）（図３Ｅ）を示し、ここで、ｔＲＮＡ積荷収率は、総ｔＲＮＡに対する積荷済みｔＲＮＡの積分ピーク面積を用いてソフトウェアパッケージＩＭＡＧＥＪを用いて決定された。 同上。 同上。 同上。 同上。 図４Ａ～Ｇは、本発明のいくつかの実施形態による、複数の短ペプチドのａａＲＳフリー翻訳の結果を示している。示されるのは、ｍＲＮＡ＃１からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析（図４Ａ）、トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析された短ペプチドのａａＲＳフリー翻訳収率、ここで、未積荷ｔＲＮＡ濃度は１６０～５４０μＭの範囲としたが、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡ濃度は７０μＭのままであり、この結果、積荷収率は４４～１３％の範囲であった（図４Ｂの上部）、総ｔＲＮＡ濃度を１６～１００３μＭの範囲とし、積荷収率は５６％のままであった（図４Ｂの下部）（エラーバーは３回の独立した実験からの標準偏差を表す）、ｍＲＮＡ＃２（図４Ｃ）、ｍＲＮＡ＃３（図４Ｄ）、ｍＲＮＡ＃４（図４Ｅ）、ｍＲＮＡ＃５（図４Ｆ）、ｍＲＮＡ＃６（図４Ｇ）からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図５Ａ～Ｄは、種々の条件下でのｍＲＮＡ＃１のａａＲＳフリー翻訳の結果を示している。示されるのは、総ｔＲＮＡ濃度を２０～６４４μＭの範囲としたところ、積荷収率は４４％のままであったこと（図５Ａ）、総フレキシザイム濃度を２４０～５２５μＭの範囲としたところ、総ｔＲＮＡ濃度は１６０μＭのままであったこと（図５Ｂ）、フレキシザイム及び０～３８０μＭの未積荷ｔＲＮＡが、（図５Ｃでは）１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中で、及び（図５Ｄでは）１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２中で混合され、エタノール沈殿によって脱塩され、ａａＲＳフリー翻訳ミックスに添加され、ここでフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの濃度は７０μＭのままであったことである（エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す）。 同上。 同上。 同上。 図６Ａ～Ｅは、ａａＲＳフリー翻訳収率を計算するためのトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を示しており、ａａＲＳフリー翻訳収率を計算するための、（図６Ａ～Ｅがそれぞれ）図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄに対応するゲル画像を示し、「Ｍ」は、合成ペプチド標準である（Ｆｐｈ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｄ（配列番号１２５））。 同上。 同上。 同上。 同上。 図７Ａ～Ｂは、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ、及びＡｓｐＲＳの存在下でのインビトロ翻訳実験の結果を示しており、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ、及びＡｓｐＲＳの存在下で２２～６８０μＭの範囲の未積荷、非修飾総ｔＲＮＡ濃度を用いた場合の翻訳産物並びに増強されたフレキシザイムによって事前に積荷されたＦｐｈ－ｔＲＮＡｆＭｅｔのトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図７Ａ）、並びに計算された翻訳収率（図７Ｂ）を示す（エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す）。 同上。 図８Ａ～Ｂは、自らに対応する（cognate）タンパク質構成アミノ酸を有する２１種のｔＲＮＡのフレキシザイム積荷収率を示しており、エタノール沈殿後に決定された積荷収率（図８Ａ）、１４種のフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡのＨＰＬＣ精製後に決定された積荷収率、ここでＮ／Ａはフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの精製が行われなかったことを表す（図８Ｂ）、を示す。 同上。 図９は、ａａＲＳフリー翻訳されたｍＲＮＡ＃６のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を示しており、ａａＲＳフリー翻訳システムにおいて総ｔＲＮＡ濃度が高くなると（５２０μＭ）、２，２５２．７Ｄａの分子量を有する誤翻訳産物が観察されたが、正しく翻訳された産物は２，２４０．７Ｄａの分子量を有したことを示す。ここで、ａ．ｕ．は任意単位（arbitrary unit）を表し、Ｃ、Ｏはそれぞれ、計算されたｍ／ｚ値及び観測されたｍ／ｚ値を表す。 図１０Ａ～Ｃは、ａａＲＳフリー翻訳されたタンパク質酵素、具体的にはニワトリリゾチーム（図１０Ａ）、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（図１０Ｂ）、及び大腸菌ＴｒｐＲＳ（図１０Ｃ）のアミノ酸配列を示している。フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡによって翻訳された位置は、エタノール沈殿又はＨＰＬＣのいずれかによって精製された（下線）。 同上。 同上。 図１１Ａ～Ｇは、ａａＲＳフリー翻訳されたタンパク質酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示しており、図１２Ａに示される全体のゲル画像（図１１Ａ）、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析され、クマシーブリリアントブルーで染色された、ニワトリ卵白から精製された市販のニワトリリゾチームの４００ｎｇ試料（図１１Ｂ）、図１２Ｃに示される全体のゲル画像（図１１Ｃ）、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析され、クマシーブリリアントブルーで染色された、大腸菌ＢＬ２１株から発現及び精製された組換えＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの４００ｎｇ試料（図１１Ｄ）、図１４Ａに示される全体のゲル画像（図１１Ｅ）、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析され、クマシーブリリアントブルーで染色された、大腸菌ＢＬ２１株から発現及び精製された組換え大腸菌ＴｒｐＲＳの３００ｎｇの試料（図１１Ｆ）、並びに、３分間９８℃に加熱して又は加熱無しに１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされた、５μＭのＦｐｈ－ＣＭＥ、１μＭのＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ、及び５μＭのＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ（図１１Ｇ）を示し、ここで、Ｍはベンチマーク蛍光タンパク質標準である。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１２Ａ～Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による、タンパク質酵素のａａＲＳフリー翻訳の概念の実験的証明の結果を示しており、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされたＮ末端ＦＡＭ標識ニワトリリゾチームのａａＲＳフリー翻訳（Ｍは、ベンチマーク蛍光タンパク質標準を表す）（図１２Ａ）、蛍光標識細菌（Micrococcus lysodeikticus）細胞壁材料を基質とした、粗ａａＲＳフリー翻訳されたニワトリリゾチームの酵素アッセイ（図１２Ｂ）、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされた、Ｎ末端ＦＡＭ標識ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼのａａＲＳフリー翻訳（図１２Ｃ）、並びに、セレンテラジンを基質とした、粗ａａＲＳフリー翻訳されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの酵素アッセイ（図１２Ｄ）（ＲＦＵは相対蛍光単位を表し、ＲＬＵは相対発光単位を表す）、を示す。 同上 同上 同上 図１３は、ａａＲＳフリー翻訳されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの収量推定値を示しており、ここで、０、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２５０ｎＭの組換えＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（正方形で示される）を用いて標準曲線がプロットされ、翻訳されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの収量は約２５ｎＭ（三角形で示される）であると推定された。 図１４Ａ～Ｃは、ＴｒｐＲＳのａａＲＳフリー翻訳を示しており、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされたＮ末端ＦＡＭ標識大腸菌ＴｒｐＲＳのａａＲＳフリー翻訳（Ｍは、ベンチマーク蛍光タンパク質標準を表す）（図１４Ａ）、内部Ｃｙ５標識ｔＲＮＡ^Ｔｒｐの配列及び二次構造（図１４Ｂ）、並びに、ＴｒｐＲＳのａａＲＳフリー翻訳を示し、Ｃｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐを基質として用い、８％酸性ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ５モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされた粗ａａＲＳフリー翻訳されたＴｒｐＲＳの酵素アッセイ（図１４Ｃ）を示す。 同上。 同上。 図１５Ａ～Ｂは、Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓによる鏡像ｔＲＮＡ^Ｌｙｓの転写の結果を示しており、Ｌ－ｓｓＤＮＡ鋳型上の５’－ＦＡＭ標識Ｌ－ユニバーサルプライマーの伸長を示し、ここで重合は合成Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓポリメラーゼによって行われ、反応アリコートは異なる時点で終結させられ、７Ｍ尿素での１２％変性ＰＡＧＥゲルによって分析され（図１５Ａ）、並びに、７Ｍ尿素での１０％変性ＰＡＧＥゲルによって分析され、ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，米国）によって染色されたｔＲＮＡ^Ｌｙｓ転写物の鏡像転写及びＩ_２媒介切断（図１５Ｂ）を示す。 同上。 図１６Ａ～Ｂは、酵素的に転写された天然ｔＲＮＡ及び鏡像ｔＲＮＡの生化学的特性決定の結果を示しており、酵素的に転写されたＤ－及びＬ－ｔＲＮＡ^ＡｌａのＲＮａｓｅ Ａ消化（図１６Ａ）、並びに、酵素的に転写されたＤ－及びＬ－ｔＲＮＡ^ＡｌａのＡａＲＳに触媒されるアミノアシル化（図１６Ｂ）を示す。 同上。 図１７Ａ～Ｃは、Ｉ_２媒介切断のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を示しており、Ｉ_２によってホスホロチオエート修飾部位で切断された合成ＤＮＡ－ＲＮＡキメラオリゴ（図１７Ａ）、ネガティブリニアモード下での非切断オリゴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトル（図１７Ｂ）、及びネガティブリニアモード（ｍ／ｚ＞４０００）及びネガティブリフレクトロンモード（ｍ／ｚ＜４０００）下でのＩ_２で切断されたオリゴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトル（図１７Ｃ）を示し、大文字はＤＮＡヌクレオチドを示し、小文字はＲＮＡヌクレオチドを示し、「＊」はホスホロチオエート修飾を示す。ａ．ｕ．は、任意単位を表し、Ｃ、Ｏは、それぞれ計算ｍ／ｚ値及び観測ｍ／ｚ値を表す。 同上。 同上。 図１８Ａ～Ｂは、カチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いた完全又は部分的な非天然ペプチドの翻訳を示しており、インビトロ翻訳システムでカチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いたペプチド薬及び非天然タンパク質の翻訳（図１８Ａ）、並びに、インビトロ翻訳システムでカチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いた、完全又は部分的な非天然タンパク質の翻訳、データ記憶、及びリボソーム／ｍＲＮＡディスプレイ（図１８Ｂ）を示す。 同上。 図１９Ａ～Ｂは、鏡像酵素（Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓ）によって酵素的に転写された完全に機能的なＬ－ｔＲＮＡ分子に事前に活性化されたアミノ酸を積み込みする概念の実験的証明の８％酸性ＰＡＧＥ写真及び分析を示しており、図１９Ａは酵素的に転写されたＬ－ｔＲＮＡへの積み込みの結果を示し、図１９Ｂは合成的に製造されたＬ－ｔＲＮＡへの積み込みの結果を示す。 同上。 図２０Ａ～Ｃは、２つの連続したＤ－フェニルアラニンを含有する短ペプチドのインビトロ翻訳の結果を示しており、ここで図２０Ａは、ｍＲＮＡ＃７からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を示し、図２０Ｂは、ｍＲＮＡ＃８からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を示し、図２０Ｃは、未積荷ｔＲＮＡＰｈｅのみ（ｍＲＮＡ＃７）、２０μＭのＬＰｈｅ－ｔＲＮＡＰｈｅ（ｍＲＮＡ＃７）、２０μＭのＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡ（ｍＲＮＡ＃８）、又は２００μＭのＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡ（ｍＲＮＡ＃８）を用いた場合のｍＲＮＡ＃７又はｍＲＮＡ＃８の翻訳産物の、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンしたトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 同上。 同上。 図２１Ａ～Ｂは、３つの連続したＤ－フェニルアラニンを含有する短ペプチドのインビトロ翻訳の結果を示しており、ここで、図２１Ａは、ｍＲＮＡ＃９からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を示し、図２１Ｂは、未積荷ｔＲＮＡＰｈｅのみ、３０μＭのＬＰｈｅ－ｔＲＮＡＰｈｅ、３０μＭのＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡ、又は３００μＭのＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡを用いた場合のｍＲＮＡ＃９の翻訳産物の、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンしたトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 同上。 図２２は、３つの連続したβ－Ｇｌｎを含有する短ペプチドのインビトロ翻訳の結果を示しており、未積荷ｔＲＮＡのみ、３０μＭのβＧｌｎ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡ、又は３００μＭのβＧｌｎ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡを用いた場合のｍＲＮＡ＃１０の翻訳産物の、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってＣｙ２モード下でスキャンしたトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

本発明は、そのいくつかの実施形態においては、無細胞タンパク質翻訳システム、より具体的には、これらに限定されないが、アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼを含まない、タンパク質及びその鏡像体を合成する方法、並びにその使用に関する。

本発明の原理及び作用は、図面及び付随する説明を参照してよりよく理解され得る。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか、又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は様々なやり方で実施又は実行することができる。

上記で述べたように、フレキシザイムなどのｔＲＮＡ－アミノアシル化リボザイムの発見にもかかわらず、ａａＲＳの非存在下で高度に単純化された翻訳システムからタンパク質酵素を合成することは、実証されていないままである。ａａＲＳフリー翻訳の収率が低い主な理由の１つは、ａａＲＳによるｔＲＮＡアミノアシル化と比較して、フレキシザイムによるｔＲＮＡへの積荷には再利用がないことである。さらに、インビトロ転写された未改変ｔＲＮＡをａａＲＳフリー積荷に用いることも、低い翻訳収率に寄与し得る。

本発明を考案しながら、本願発明者は、フレキシザイムのみによって積荷されたｔＲＮＡを用いて、２０種全てのタンパク質構成アミノ酸を有するタンパク質酵素を翻訳することについてのａａＲＳフリーシステムの能力を試験することに着手した。予備試験の結果は、精製によってフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの濃度を増加させ、カチオンＭｇ２＋の濃度を減少させると、異なる機能の複数のタンパク質酵素、例えばリゾチーム、ルシフェラーゼ、さらにはａａＲＳ自体さえも合成できることを示した。合成鏡像Ｌ－フレキシザイムによって鏡像Ｌ－ｔＲＮＡに鏡像Ｄ－アミノ酸を積み込みすることも実証されており、それは、最終的に鏡像翻訳装置の実現を可能にする。

図１は、本発明のいくつかの態様、特には、フレキシザイムによる積荷済みのｔＲＮＡを用いたタンパク質のａａＲＳフリー翻訳、の概略図を示し（１０）、ｔＲＮＡ １１は、フレキシザイムシステム１２によって積荷され、タンパク質酵素の翻訳のためのタンパク質構成アミノ酸を表す積荷済みｔＲＮＡ １３の集団を生み出し、また、前記ａａＲＳフリー翻訳は、積荷済みｔＲＮＡがＨＰＬＣによって精製されてＭｇ^２＋混入を減らすステップ１４を含み、積荷済みｔＲＮＡ １３がリボソーム１７におけるｍＲＮＡ １６のａａＲＳフリー翻訳のために濃縮されるステップ１５を含み、翻訳されたポリペプチド１８はａａＲＳ １９ｂを含む活性タンパク質酵素１９ａにフォールディングすることができ、これはｔＲＮＡへの積み込みを行ってサイクルを完了するのに用いることができる。

リボザイム積荷済みｔＲＮＡのみのセット（exclusive set of ribozyme-charged tRNAs）を用いた、タンパク質酵素のａａＲＳフリー翻訳が本開示で実証される。ここに示されるのは、前進的でかつ信頼性の高いリボソーム翻訳には、ａａＲＳに触媒されるｔＲＮＡへの積み込み（charging）もｔＲＮＡ再利用も必要とされないという知見であり、このことから、短ペプチドよりも多くの構造モチーフ、したがってより多くの触媒機能を有するタンパク質酵素を、高度に単純化されたａａＲＳフリー翻訳システムから翻訳することできることが明らかになった。特に、現代の天然タンパク質の平均サイズは約２７０～４７０アミノ酸残基である。ＴｒｐＲＳほどに大きなタンパク質のａａＲＳフリー翻訳は、ｔＲＮＡ修飾酵素等の他の重要なタンパク質酵素を産生して、翻訳効率及び忠実度をさらに改善する可能性を示唆している。また、高濃度のリボザイム積荷済みｔＲＮＡがａａＲＳフリー翻訳の収率を大幅に改善するという発見も本開示に示され、このことは、豊富なリボザイム積荷済みｔＲＮＡのフィードストックが原始的な翻訳システムが効率的に作動するために重要であったであろう生物以前の地球上に、タンパク質酵素が出現するための可能な条件を解明する可能性がある。

現在のａａＲＳフリー翻訳システムの制約の１つは、ｔＲＮＡが翻訳システムに添加される前に事前に積荷されるという点で、ｔＲＮＡの積荷は翻訳とは切り離されなければならないことである。これは、フレキシザイムが様々なアミノ酸をｔＲＮＡに積み込みする非特異的触媒であるためである。高濃度のフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを使用し、精製によってＭｇ２＋混入を除去する方法論は、ａａＲＳフリー翻訳の収率を大幅に改善したことが示されており、全てが又は一部が非天然であるアミノ酸群からペプチド又はタンパク質を製造するための、事前積荷済みｔＲＮＡを使用する他のインビトロ翻訳システム（ａａＲＳ有り又は無し）に適用することができ、合成生物学及び創薬の多くの分野における即時適用を可能にする。

タンパク質酵素のａａＲＳフリー翻訳の実現は、鏡像翻訳を実現するためのより実行可能なモデルとして、ａａＲＳを有さない翻訳装置への道を確立する。なぜなら、全てのａａＲＳタンパク質は、総計で、リボソーム、翻訳因子、ａａＲＳ、及びｔＲＮＡを含む大腸菌翻訳装置の分子量（約４．９ＭＤａの総分子量）の２９％（約１．４ＭＤａ）に相当するためである。さらに、本開示で実証される小型の１６９アミノ酸残基 Ｇａｕｓｓｉａルシフィラーゼの翻訳は、鏡像翻訳を試験するための高感度でキラル特異的なアッセイを提供する。

ａａＲＳフリー無細胞翻訳システム：
本開示中上記で論じられたように、無細胞タンパク質合成は、ＤＮＡ鋳型からタンパク質を合成、モニタリング、分析及び精製するための容易かつ迅速な方法を提供すると同時に、とりわけ、非天然アミノ酸（ＵＡＡ；非標準アミノ酸としても知られる）をリボソーム翻訳を介してタンパク質に部位特異的に取り込むことを可能にする、遺伝子暗号拡張法への道を開く。既知のシステムは、直交性ｔＲＮＡ及び直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）を含む直交性翻訳システム（ＯＴＳ）を無細胞反応混合物に外因性添加することに基づくが、本開示で提供されるタンパク質翻訳システムは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）の存在無しにタンパク質の効率的な製造を可能にすることによって、この概念をさらに拡張し、そして、ａａＲＳフリー翻訳システムが本開示で提供される。

本開示の文脈においては、本開示で用いられる場合、「ａａＲＳフリー」という用語は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）を本質的に欠く、転写鋳型（例えば、リボ核酸分子）からタンパク質を調製するためのリボソーム翻訳システム及び／又は方法及び／又はプラットフォームを指す。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを本質的に欠いているとは、タンパク質製造におけるどのステップも、ａａＲＳの使用又は存在を伴わないことを意味する。本発明のいくつかの実施形態によれば、ａａＲＳフリー翻訳のシステム／方法／プラットフォームの定義の唯一の例外は、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼが前記システム／方法／プラットフォームによって製造されるタンパク質産物である実施形態である。ｔＲＮＡシンセターゼ酵素も本質的に欠いているとは、システムがアミノ酸残基をｔＲＮＡに積み込みする手段を含まないこと、及び翻訳のいずれの段階でもａａＲＳ酵素がシステムに導入されないこと、及びアミノ酸残基の全供給が事前に積荷されたｔＲＮＡ分子に由来することを意味する。

したがって、本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、タンパク質を製造するためのシステムが提供され、該システムは：
タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子；
複数の積荷済みｔＲＮＡ分子；及び
無細胞翻訳ミックス、
を含み、前記システムは、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを本質的に欠いており、システムにおけるＭｇ^＋２の濃度は１００ｍＭ未満である。

本開示で用いられる場合「システム」という用語は、タンパク質合成などの複雑な化学反応を実施する助けとなり、必須である反応混合物（すなわち、溶媒、溶質、反応物、及び任意に存在する（optioinal）検出マーカー）及び反応条件（濃度、温度及び混合）を指す。

本発明のいくつかの実施形態の文脈において、「無細胞翻訳ミックス」という語句は、無傷／生存可能な細胞の使用を含まないインビトロタンパク質翻訳混合物を指し、無細胞インビトロタンパク質翻訳反応に不可欠なリボソーム及びリボソーム翻訳因子を含むが、これは、これらの用語が当技術分野で知られている通りである。本発明のいくつかの実施形態の文脈において、「ａａＲＳフリー翻訳ミックス」という語句は、特に断りの無い限り、無細胞（インビトロ）翻訳ミックスがａａＲＳタンパク質を本質的に欠いていることを除いて、当技術分野で知られているとおりの無細胞翻訳ミックスを指す。

タンパク質翻訳システムは、システムによって製造される所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするメッセンジャーＲＮＡ分子を含む。あるいは、システムは、ＤＮＡ鋳型をｍＲＮＡ分子に転写する手段、すなわちＤＮＡ－ＲＮＡ転写を達成するためのＤＮＡ鋳型及び転写因子（例えば、ＲＮＡヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ、及び一般的な転写因子）を含んでもよい。

タンパク質翻訳システムは、複数の積荷済みｔＲＮＡ分子を含み、これらは、本開示では本発明のいくつかの実施形態の文脈において、事前積荷済みｔＲＮＡ転写物とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡ分子は合成的に調製されたポリヌクレオチドであり、他の実施形態では、ｔＲＮＡ分子は酵素的に調製された転写物であり、これら２つのカテゴリー間の重要な違いを以下に説明する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、この複数の積荷済みｔＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡによってコードされ、またｍＲＮＡ分子にコードされるとおりにタンパク質配列中に存在することになるアミノ酸残基が積み込みされているｔＲＮＡ分子を少なくとも含む。複数の積荷済みｔＲＮＡ分子はまた、以下の表Ａ及びＢに示されるような、Ｄ－アミノ酸の残基及び他の非標準アミノ酸残基等の非天然アミノ酸残基が積み込みされたｔＲＮＡ分子を含む。好ましくは、個々の積荷済みｔＲＮＡ分子のそれぞれの頻度及び量は、タンパク質の配列中の各アミノ酸の頻度と一致する。例えば、タンパク質配列中のセリン残基の頻度が８％であり、メチオニンの頻度が１％である場合、システム中の複数の積荷済みｔＲＮＡ分子はその頻度を反映することとなり、ｔＲＮＡ^Ｍｅｔよりも約８倍多いｔＲＮＡ^Ｓｅｒを含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡ分子はＬ－ヌクレオチドから作製され、天然ｔＲＮＡ分子のｔＲＮＡ分子鏡像を与える。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡ分子はＬ－ヌクレオチドからなり、さらに、Ｄ－アミノ酸の残基が積み込みされる。

本開示で用いられる場合、「残基」及び／又は「部分」という用語は、分子の一部、典型的にはその主要部分、又は特定の機能に関係する原子のグループを表す。例えば、「アミノ酸残基」という用語は、アミノ酸が結合している化合物の文脈におけるアミノ酸を指し、ペプチドは、互いに連結されたアミノ酸残基の鎖であり、リボ核酸残基が積み込みされたｔＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ分子に結合したリボ核酸である。

表Ａ～Ｂは、本発明のいくつかの実施形態の文脈において関連する、任意に存在する（optional）アミノ酸残基のいくつかを示す。これらは例であり、限定的なものと見るべきではない。

表Ａ

カチオン枯渇システム：
本開示中上記で開示されたように、本発明の実施形態による、タンパク質を製造するための無細胞ａａＲＳフリーシステムは、低カチオン濃度、より具体的には低マグネシウムイオン濃度で効果的である。マグネシウムは、市販の混合物を含め、ほとんどの無細胞タンパク質翻訳混合物中に比較的高濃度で存在する。マグネシウムは、ほとんどの積荷済みｔＲＮＡ調製物、特にフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡ調製物にも存在する。以下の実施例のセクションに示されるように、本願発明者は、驚くべきことに、無細胞ａａＲＳフリータンパク質翻訳システムにおいてマグネシウム濃度を実用的な最小値まで低下させることが、タンパク質製造の効率及び忠実度を大幅に改善することを見出した。したがって、本開示に開示されるシステムの改善された性能に到達するためには、既知のタンパク質翻訳システムにおける様々な成分から持ち越されるマグネシウムイオンの内在的な存在は、本願発明者によって意図的に低減されなければならなかった。

したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、タンパク質を製造するためのシステムは、これまでのいずれの既知の無細胞タンパク質翻訳システムと比較して低いＭｇ^＋２濃度を特徴とする。より具体的には、本発明によるシステムにおけるマグネシウム濃度は、積荷済みｔＲＮＡ調製物中のＭｇ^＋２濃度よりも低い。絶対値では、システム中のＭｇ^＋２の濃度は、１００ｍＭ未満、９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満又は１０ｍＭ未満である。

いくつかの実施形態では、システムにおけるマグネシウムイオンの濃度は、イオン枯渇法、例えば、限定されないが、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アルコール中での沈殿及びペレット洗浄、限外濾過、並びに透析によって実際に得ることが可能な最小濃度である。

積荷済みｔＲＮＡ濃度：
本開示のシステムのｔＲＮＡ分子は、当技術分野で既知である任意の方法によって事前積荷されてよいが、いくつかの好ましい実施形態では、ｔＲＮＡはフレキシザイムによって積荷される。システム中に存在する積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度もまた、既知の無細胞タンパク質翻訳システムにおけるそれらの濃度と比較しての改変の対象となる。

いくつかの実施形態によれば、積荷済みｔＲＮＡの濃度は、他の既知の無細胞タンパク質翻訳システムにおける当該濃度よりも少なくとも２倍高い。いくつかの実施形態によれば、積荷済みｔＲＮＡの濃度は、５０μＭ超、６０μＭ超、８０μＭ超、９０μＭ超、１００μＭ超、１１０μＭ超、１２０μＭ超、１３０μＭ超、１４０μＭ超、１５０μＭ超、１６０μＭ超、１７０μＭ超、１８０μＭ超、１９０μＭ超、又は２００μＭ超である。

反転キラリティ要素：
本開示で提供されるシステムにはａａＲＳ酵素が必要ないため、該システムは、非天然／非標準アミノ酸残基、中でもＤ－アミノ酸残基を有するタンパク質の翻訳、に特に適している。前記システムは、ｍＲＮＡの全てがＤ－アミノ酸である鎖への翻訳を含め、Ｄ－アミノ酸残基を任意のポリペプチド鎖に挿入するのに用いることができる。以下に実証されるように、前記システムを、完全な鏡像タンパク質を翻訳するために用いた。

本開示中後述に示されるように、Ｌ－リボ核酸残基を含むか、又はＬ－リボ核酸残基からなるｔＲＮＡ分子（Ｌ－ｔＲＮＡ）を用いて前記システムを成功裏に用いることができた。したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、前記システムはＬ－ｔＲＮＡ分子を含む。限定されないが、Ｌ－ｔＲＮＡは、Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２ＳなどのＤ－ポリメラーゼを用いて調製される。しかしながら、Ｌ－ｔＲＮＡ分子を製造する他の方法も本発明の範囲内で想定される。

本発明のいくつかの実施形態では、前記システムは、Ｄ－タンパク質（鏡像タンパク質）を翻訳するために、Ｌ－フレキシザイムによってＤ－アミノ酸残基を事前に積み込みされたＬ－ｔＲＮＡ分子を含む。

Ｌ－アミノアシル化リボザイム：
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記システムは、アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ（ａａＲＳ）活性を有するリボザイム、すなわちアミノアシル化リボザイムによって事前に積荷されたＬ－ｔＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記アミノアシル化リボザイムはフレキシザイムである。いくつかの好ましい実施形態において、前記Ｌ－ｔＲＮＡは、完全に又は実質的にＬ－リボヌクレオチドから構成されたリボザイムであるＬ－フレキシザイムで積荷されている。

したがって、本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、Ｌ－リボヌクレオチドを含むポリリボ核酸分子（ＲＮＡ）（対応する（comparable）天然ＲＮＡ分子に対する鏡像）であって、活性化アミノ酸を用いることによってＲＮＡをアミノアシル化する触媒活性（ｔＲＮＡ積荷活性）を有するポリリボ核酸分子（リボザイム）が提供される。すなわち、本開示では、Ｌ－フレキシザイムが提供される。

後述の実施例セクションにおいて実証されるように、Ｌ－ｔＲＮＡ分子へのＤ－アミノ酸残基の積み込みは、Ｌ－フレキシザイムを用いるとより効率的でより一貫性のあるものとなる。
本開示で提供されるＬ－フレキシザイムは、それらの鏡像体（Ｄ－ａａＲＳリボザイム；Ｄ－フレキシザイム）と実質的に同じ配列を有するか、又は当技術分野で既知のＤ－フレキシザイムに対して８０％以上の配列同一性を示す。例えば、いくつかの実施形態によれば、Ｌ－フレキシザイムは、５’－ｇｇａｕｃｇａａａｇａｕｕｕｃｃｇｃａｕｃｃｃｃｇａａａｇｇｇｕａｃａｕｇｇｃｇｕｕａｇｇｕ－３’（配列番号８２）と８０％以上の同一性を示す配列を有する。

Ｌ－フレキシザイムの態様から生じるのは、Ｌ－ｔＲＮＡ分子に事前に活性化されたＤ－アミノ酸残基を積み込みするためのＬ－フレキシザイムの使用である。したがって、本発明のいくつかの実施形態のある他の態様によれば、Ｌ－ｔＲＮＡにＤ－アミノ酸を積み込みする方法が提供され、該方法は、
活性化Ｄ－アミノ酸を準備すること；
Ｌ－ｔＲＮＡ分子を準備すること；
Ｌ－フレキシザイムを準備すること；及び
前記Ｌ－ｔＲＮＡ、前記Ｌ－フレキシザイム、及び活性化Ｄ－アミノ酸を反応させ、それによってＤ－アミノ酸が積み込まれたＬ－ｔＲＮＡ分子を得ること、
によってなされる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｌ－ｔＲＮＡ分子は、合成装置の産物ではなく、Ｄ－ポリメラーゼを用いて調製される。後述の実施例セクションにおいて実証されるように、Ｌ－フレキシザイムとＬ－ｔＲＮＡとの反応は、Ｌ－ｔＲＮＡの供給源が合成的ではなく酵素的である場合に、ａａＲＳ活性（アミノ酸積み込み）反応の効率及び忠実度における顕著な改善を示した（以下の図３Ａ～図３Ｅ及び図１９Ａ～図１９Ｂに関する説明を参照されたい）。この利点は、Ｄ－アミノ酸積み込みＬ－ｔＲＮＡ分子の反応混合物のＰＡＧＥ分析を用いることで示され、また特定することができ、そこでは積荷済みｔＲＮＡ種の明確なピーク及び未積荷ｔＲＮＡ種の明確なピークが特徴的である。一方、機械で合成したＬ－ｔＲＮＡ分子を用いた反応では、反応混合物は連続的な大きなピークを示し、これは、出発物質として低品質のＬ－ｔＲＮＡを使用することに起因する複数の中間体、ミスマッチ、及びその他の副反応を示すものである。

前記システムを使用する方法：
本開示で提供されるシステムの使用は、他の既知の無細胞タンパク質翻訳システムの使用とは異なり、また、これまでに知られているａａＲＳフリーのタンパク質翻訳システムとさえも異なるが、これは、少なくとも、事前積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度が既知のシステムで用いられる当該濃度よりも高く、Ｍｇ^＋２の濃度が既知のシステムで用いられるＭｇ^＋２濃度よりも低いという意味でそうである。

したがって、本発明のいくつかの実施形態のある他の態様によれば、本開示で提供される無細胞ａａＲＳフリータンパク質翻訳システムを用いてタンパク質を製造する方法が提供され、該方法は、
本開示上記で記載されたＭｇ^＋２濃度以下のＭｇ^＋２濃度（他の既知の無細胞タンパク質翻訳システムの濃度の半分未満、又は１００ｍＭ未満）を有する複数の事前積荷されたｔＲＮＡ分子を準備すること；及び
この複数の積荷済みｔＲＮＡ分子を、所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と無細胞翻訳ミックス中で接触させ、それにより目的のタンパク質を得ること、
によってなされる。

いくつかの実施形態において、前記方法は、事前積荷されたｔＲＮＡ調製物を無細胞翻訳ミックスと接触させる前に、Ｍｇ^＋２の濃度を所望の低濃度に調整することをさらに含む。巨大分子、特に感受性生体高分子、を含むシステムからのイオン、特にカチオン、の枯渇は、当技術分野における任意の既知の手順によって達成することができる。例えば、Ｍｇ^＋２濃度は、これらに限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、アルコール沈殿及びそれに続く沈殿したペレットの洗浄、限外濾過、並びに透析によって低下させることができる。他の手順もまた、本発明の範囲内で想定される。

いくつかの実施形態において、前記方法は、事前積荷されたｔＲＮＡ調製物を無細胞翻訳ミックスと接触させる前に、事前積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度を、この特徴が本開示上記で論じられたように、所望の高濃度に調整することをさらに含む。したがって、いくつかの実施形態において、方法は、積荷済みｔＲＮＡ分子を、ａａＲＳを含むシステムにおける当該濃度よりも少なくとも２倍高い濃度に濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、事前積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度は、１６０μＭ以上である。

以下の実施例セクションは、本開示に開示されるシステム、及び本開示に開示される無細胞かつａａＲＳフリーのタンパク質翻訳システムにおいて前記システムを用いてタンパク質を製造する方法の、いくつかの実施形態の詳細な提示を提供する。

開示されたシステム及び方法の産物：
以下に提示される概念の実験的証明によって実証されるように、本開示で提供されるシステム及び方法は、任意のインビトロ翻訳システム、細胞システム又は任意の天然システムで製造される比較対象の（comparable）タンパク質の構造及び機能を示すことを特徴とするタンパク質を製造するために用いることができる。本発明の規定によって製造されるタンパク質はまた、鏡像出発物質からの反応を触媒して鏡像産物を製造する完全に活性な酵素等の、キラリティ反転要素から製造された鏡像タンパク質とすることもできる。

したがって、本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、本開示で提供されるシステム及び／又は方法によって製造されるタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、鏡像タンパク質（実質的にＤ－アミノ酸残基からなるＤ－タンパク質）である。

本開示で提供されるシステムの使用が実証された例示的なタンパク質としては、ニワトリリゾチーム、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、及び大腸菌ＴｒｐＲＳが挙げられる。

ライブラリ：
いくつかの実施形態によれば、本開示で提供されるシステム及び方法は、ランダム化又は部分的にランダム化されたペプチドのライブラリであって、ペプチドの少なくともが少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むライブラリを作製するのに用いることができる。

本開示で提供されるａａＲＳフリーシステムの１つの利点は、このａａＲＳフリーシステムは効率的に作動するために２１種のｔＲＮＡを必要とすることである。非天然アミノ酸を割り当てる（遺伝暗号リプログラミング）ために利用可能な他の天然ｔＲＮＡ転写物は、２０超存在している。他のタンパク質翻訳システムでは、これらのｔＲＮＡは、ａａＲＳがそれらに天然アミノ酸を積み込みんでしまうために、使用可能ではない。したがって、本発明は、誤って積荷されたｔＲＮＡ分子の問題に陥ることなく、複数の非天然アミノ酸を含むランダム化されたペプチドを翻訳する手段を提供することができる。

本開示で提供されるタンパク質翻訳システムは、代償的変異を有する直交性リボソーム－ｔＲＮＡペアに適用することができる［Ｔｅｒａｓａｋａ，Ｎ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇ．、Ｋａｔｏｈ，Ｔ．及びＳｕｇａ，Ｈ．「Ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｔＲＮＡ ｐａｉｒ ｖｉａ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｅｎｔｅｒ」Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１４，１０，５５５－５５７］。そのような直交性システムでは、直交性ｔＲＮＡはフレキシザイムによって積荷され、いかなるａａＲＳタンパク質によっても積荷可能でなく、非効率性の問題を被るが、それは本発明の規定によって解決される。例えば、既知のａａＲＳフリーシステムは、ヘプタペプチド、例えば（Ｆｐｈ）－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ（配列番号１２５）を翻訳するための収率が低く、収量は約０．１５μＭであり、プロセシビティが低い（７－アミノ酸残基）。本発明の実施形態によるシステムによって与えられる改善された条件下では、収量は、同じヘプタペプチドについて約２μＭである。さらに、以前に実証されたものよりも４８倍長い、３３４個までのアミノ酸残基の翻訳が、本発明の規定を用いて実証されている。したがって、本発明のいくつかの実施形態による、改善された無細胞／ａａＲＳフリーシステムは、より良好な収率（より高濃度のペプチドプール）及びより長い産物（より高い配列多様性）のため、ペプチド薬発見により適合している。

非生物学的使用：
超高密度で高忠実度の情報記憶設備の探索において、本願発明者は、既知の手順を用いてコード及びデコードされ得るが、天然の生化学的要素によって分解され得ない配列を有するタンパク質性巨大分子の製造における、本開示に開示されるシステム及び方法の使用を企画した。タンパク質中に非天然アミノ酸残基を用いることによって、生分解からの保護が与えられる。

さらに、本発明の規定は、テキストにたとえた場合には本質的に文字改変要素（character-modifier）としての字(letter)である非天然アミノ酸を取り込むことによって、データ密度を最大化するのに用いることができる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態では、本開示で提供されるシステムの使用の産物であるタンパク質は、テキスト情報及び／又は数値情報にデコードすることができ、少なくともいくつかの非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする。この概念の実現には、任意の配列のペプチドの翻訳が必要である。本願発明者は、これを２０種のタンパク質構成アミノ酸を用いて図４Ｃ～図４Ｇに実証した。

この概念は、以下の実施例セクションに提示される実証的概念証明実験で実現され、そこでは、本願発明者は、短いメッセージ「ＭＩＴＲＮＡＣＨＡＲＧＩＮＧＳＹＳＴＥＭ」（配列番号１２３）をｍＲＮＡ＃６にコードし（図４Ｇを参照）、成功裏に情報保有ペプチド全長を翻訳した。

本開示で用いられる場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」及びそれらの活用形は、「～を含むが、それに限定はされない」ことを意味する。

用語「～からなる」は、「～を含み、それに限定される」を意味する。
「本質的に～からなる」という用語は、組成物、方法又は構造が追加の成分、ステップ及び／又は部分を含んでもよいが、ただし、含んでもよいのは当該追加の成分、ステップ及び／又は部分が特許請求される組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合に限られることを意味する。

本開示で用いられる場合、特定の物質の文脈における「～を実質的に欠く」及び／又は「～を本質的に欠く」という語句は、前記物質を完全に欠くか、又は組成物の総重量若しくは総体積に対して約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、若しくは約０．１％未満で前記物質を含む組成物を指す。あるいは、プロセス、方法、特性、又は特徴の文脈における「～を実質的に欠く」及び／又は「～を本質的に欠く」という語句は、特定のプロセス／方法ステップ若しくは特定の特性若しくは特定の特徴を完全に欠くプロセス、組成物、構造、若しくは物品、あるいは特定のプロセス／方法ステップが所与の標準的なプロセス／方法と比較して約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、若しくは約０．１％未満で達成されるプロセス／方法、又は所与の標準と比較して約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、若しくは約０．１％未満の特性若しくは特徴で特徴付けられる特性若しくは特徴を指す。

物体又は組成物の元来の特性又は所望の特性又は与えられた特性に適用される場合、本開示で用いられる「実質的に維持する」という用語は、処理された物体又は組成物において特性が２０％を超えて、１０％を超えて、又は５％を超えて変化していないことを意味する。

「例示的」という用語は、本開示では「例、事例、又は例示として働くこと」を意味するために用いられる。「例示的」と記載された任意の実施形態は、必ずしも他の実施形態よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきではなく、かつ／又は他の実施形態からの特徴の取り込みを除外すると解釈されるべきではない。

「任意に（optionally）」又は「代替的に（alternatively）」という語は、本開示では「いくつかの実施形態では与えられ、他の実施形態では与えられない」ことを意味するために用いられる。本発明の任意の特定の実施形態は、複数の「任意に存在する（optional）」特徴を、そのような特徴が矛盾しない限り含むことができる。

本開示で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明らかに指示していない限りは、複数の対象物をも含む。例えば、「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」という用語は、複数の化合物を、それらの混合物を含め、包含する。

本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での説明は、単に便宜及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、及びその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示しているものと見なされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく当てはまる。

本開示において数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内の任意の引用された数字（小数（fractional）又は整数）を含むことを意味する。第１の指示数と第２の指示数と「にわたる（ｒａｎｇｉｎｇ）／（ｒａｎｇｅ）」、及び第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲に及ぶ（ｒａｎｇｉｎｇ）／（ｒａｎｇｅ）」という語句は、本開示では互換的に用いられ、第１及び第２の指示数及びそれらの間の全ての小数（fractional numeral）及び整数を含むことを意味する。

本開示で用いられる場合、「プロセス」及び「方法」という用語は、化学、材料、機械、計算、及びデジタル技術の技術者（practitioners）に知られているか、又は既知の方法、手段、技術、及び手順から容易に開発されるやり方、手段、技術、及び手順を含むがこれらに限定されない、所与のタスクを達成するためのやり方、手段、技術、及び手順を指す。

本出願から得られる特許の存続期間中に、ａａＲＳフリータンパク質翻訳システムについての多くの関連する方法が開発されることが予想され、「ａａＲＳフリータンパク質翻訳システム」という語句の範囲は、そのような新しい技術全てを先験的に含むことが意図される。

明確性のために別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせで与えられてもよいことが理解される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の適切なサブコンビネーションで、又は記載された他の任意の本発明の実施形態において適切となるように、与えられてもよい。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは作動不能でない限り、それらの実施形態の必須な特徴と見なされるべきではない。

上記で概説され、後述の特許請求の範囲のセクションで特許請求される本発明の様々な実施形態及び態様について、以下の実施例は実験的裏付けとなる。

ここで、以下の実施例を参照する。これらは、上記の説明と共に、本発明のいくつかの実施形態を非限定的に例示する、

実施例１
実験手順
材料：
フレキシザイムによる積荷のためのアミノ酸基質を３，５－ジニトロベンジルエステル（ＤＢＥ）として調製したが、ただし、Ａｓｎ及びフルオレセイン（ＦＡＭ）標識Ｐｈｅ（Ｆｐｈ）は、それぞれ４－クロロベンジルチオエステル（ＣＢＴ）及びシアノメチルエステル（ＣＭＥ）として合成された。アミノ酸ＤＢＥは、Ｎａｎｔｏｎｇ Ｐｐｔｉｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ（Ｊｉａｎｇｓｕ、中国）に注文して入手するか、又は以前に報告された方法［Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ．，Ｏｈｔａ，Ａ．，Ａｓｈｉｇａｉ，Ｈ．，及びＳｕｇａ，Ｈ．（２００６）．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔＲＮＡ ａｃｙｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，３５７］に従って社内で合成した。全てのアミノ酸ＤＢＥ基質を、^１Ｈ－ＮＭＲ又は高分解能質量分析によって検証した。Ｆｐｈ－ＣＭＥを合成し、記載されるように高分解能質量分析によって検証した［Ｔｅｒａｓａｋａ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇ．，Ｋａｔｏｈ，Ｔ．，及びＳｕｇａ，Ｈ．（２０１４）．Ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｔＲＮＡ ｐａｉｒ ｖｉａ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｅｎｔｅｒ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０，５５５－５５７］。

Ａｓｎ－ＣＢＴを以下のように合成した：５ｍｌのジクロロメタン中のＢｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ ０．５ｍｍｏｌ、Ｎ，Ｎ－ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジイル）ホスホロジアミドクロリド０．４５ｍｍｏｌ、トリエチルアミン１．５ｍｍｏｌ及び４－クロロベンジルメルカプタン０．５ｍｍｏｌの混合物を室温で４時間撹拌した。溶液を０．５Ｍ ＨＣｌ、０．５Ｎ ＮａＯＨ及び塩水（brine）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、回転蒸発によって濃縮した。Ｂｏｃ保護基及びトリチル保護基を除去するために、１９：１（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ｄｄＨ_２Ｏを含有する２ｍｌ溶液を添加し、室温で４時間撹拌した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３で中和し、ジクロロメタンで抽出し、回転蒸発によって濃縮した。粗生成物をメタノールに溶解し、０．１％ ＴＦＡ中３０～８０％のアセトニトリルの勾配を用いるＣ１８ ＨＰＬＣカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３、５μｍ、１０×１５０ｍｍ、ジーエルサイエンス、日本）によって精製した。生成物を含有する分画をプールし、凍結乾燥し、検証した：^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ ８．４０（ｓ，３Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４４－７．３５（ｍ，４Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５４－４．４６（ｍ，１Ｈ），４．２５（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７８（ｄｈ，Ｊ＝１４．３，７．５，６．４Ｈｚ，２Ｈ）。Ｄ－ＤＮＡオリゴをＧｅｎｅｗｉｚ（Ｊｉａｎｇｓｕ、中国）に注文して入手した。

ＲＮＡオリゴ及びＤＮＡ－ＲＮＡキメラオリゴをＴｓｉｎｇｋｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、中国）から注文して入手した。Ｌ－デオキシヌクレオシド及びＬ－２’－ｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）ホスホラミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、ＭＡ、米国）を用いて、Ｈ－８ ＤＮＡ合成装置（Ｋ＆Ａ Ｌａｂｏｒｇｅｒａｅｔｅ、ドイツ）でＬ－ＤＮＡオリゴ及びＬ－フレキシザイムを合成した。ホスホロチオエート修飾は、Ｓｕｌｆｕｒ ４２試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、米国）を用いて導入した。合成したＬ－オリゴを、６５℃で２時間、濃水酸化アンモニウムによってＣＰＧから切断した。Ｌ－フレキシザイムの合成のために、２’－ＴＢＤＭＳ保護基を、１：１（ｖ／ｖ）トリエチルアミントリヒドロフルオリド／ＤＭＳＯを用いて６５℃で２．５時間処理することによって除去した。

鏡像転写のためのＬ－ＮＴＰを、以前に報告された方法に従って、非保護Ｌ－ヌクレオシド（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、ＭＡ、米国）から調製した［Ｃａｔｏｎ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．，Ｈｏｘｈａｊ，Ｒ．，Ｆｉａｚ，Ｂ．，ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｚ．（２０１３）．Ｕｓｅ ｏｆ ａ ５’－ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．５２，１．３０．１－１．３０．２１］。Ｌ－ＤＮＡオリゴ及びＬ－ＮＴＰを、それぞれ変性ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによって精製した。Ｌ－フレキシザイムをエタノールによって沈殿させ、ＨＰＬＣによって精製した。

ＡｌａＲＳ、ＡｓｐＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＴｒｐＲＳ及びＴｙｒＲＳの遺伝子を増幅し、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡからクローニングした。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼの遺伝子はＧｅｎｅｗｉｚ（Ｊｉａｎｇｓｕ、中国）によって合成された。組換えａａＲＳタンパク質、及びＮ末端ＴＥＶ切断可能Ｈｉｓタグを有するＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを、文献に記載されているように大腸菌ＢＬ２１株から発現させ、精製した［Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．，ａｎｄ Ｕｅｄａ，Ｔ．（２０１０）．ＰＵＲＥ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｉｎ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｙ．Ｅｎｄｏ，Ｋ．Ｔａｋａｉ ａｎｄ Ｔ．Ｕｅｄａ，ｅｄｓ．（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１１－２１］。精製後、ＨｉｓタグをＴＥＶプロテアーゼで切断した。
精製ニワトリ卵白リゾチームは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ、米国）から購入した。

インビトロ転写：
インビトロ転写のための二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型は、部分的に重複した２つのプライマー（１Ｆ及び２Ｒ）（反応液１００μｌあたり、フォワードプライマー１Ｆを２μＭ、リバースプライマー２Ｒを３μＭ、ｄＮＴＰをそれぞれ０．２ｍＭ、及びＥａｓｙＴａｑ（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、中国）を５Ｕ）を５サイクルＰＣＲで交差伸長することによって、又は４つのプライマー（１Ｆ，２Ｒ，３Ｆ及び４Ｒ）（反応液１００μｌあたり、プライマー１Ｆ及び４Ｒをそれぞれ２μＭ、プライマー２Ｒ及び３Ｆをそれぞれ０．０５μＭ、ｄＮＴＰをそれぞれ０．２ｍＭ、及びＥａｓｙＴａｑを５Ｕ）を用いた２５サイクルアセンブリＰＣＲによって調製した。

ＰＣＲ産物をフェノール－クロロホルムによって精製し、続いて限外濾過した。グアノシン以外の５’ヌクレオチドで始まるｔＲＮＡ配列では、自己切断ハンマーヘッドモチーフがｔＲＮＡ配列の上流に配置される［Ｃｕｉ，Ｚ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｖ．，Ｔｎｉｍｏｖ，Ｚ．，Ｍｕｒｅｅｖ，Ｓ．，ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｋ．（２０１５）．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７，４４０４－４４１３］。インビトロ転写用のｄｓＤＮＡ鋳型を構築するための全てのプライマーＤＮＡオリゴ配列を以下の表１に列挙する。

１ｍｌの転写反応システムは、２０μｇの精製ｄｓＤＮＡ鋳型、それぞれ２ｍＭのＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、４００ＵのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）を、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、２ｍＭのＤＴＴ、及び１ｍＭのスペルミジンを含有する１×転写緩衝液中に含有していた。転写反応産物を３７℃で２時間インキュベートし、１０μｌのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、米国）で処理し、さらに０．５時間インキュベートした後、６０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加によって反応停止（quench）させ、続いてエタノール沈殿させた。転写されたＲＮＡを、「破砕及び浸漬」法^７を用いてゲル精製し、脱塩し、限外濾過によって濃縮した。この方法を用いて、５’－三リン酸（Ｇで始まるｔＲＮＡ配列）及び５’－ヒドロキシル末端ｔＲＮＡ（Ａ／Ｕ／Ｃで始まるｔＲＮＡ配列）の両方を調製し、これらは、ｔＲＮＡ^Ｈｉｓを例外として、生理学的５’－一リン酸末端ｔＲＮＡと機能的に等価であることが先に示されている［Ｃｕｉ，Ｚ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｖ．，Ｔｎｉｍｏｖ，Ｚ．，Ｍｕｒｅｅｖ，Ｓ．，ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｋ．（２０１５）．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７，４４０４－４４１３］。したがって、２つのバージョンのｔＲＮＡ^Ｈｉｓを調製した：５’－三リン酸末端ｔＲＮＡ^Ｈｉｓを全てのフレキシザイムによる積荷アッセイで用いた；位置－１に追加のＧを有する５’－一リン酸末端ｔＲＮＡ^Ｈｉｓを、以前に報告された方法によって調製し、ａａＲＳ活性を必要とする対照に用いた。

フレキシザイム触媒ｔＲＮＡ－アミノアシル化：
フレキシザイムに触媒されるｔＲＮＡ積荷を行うための手順は、以前に報告された方法から適応させた［Ｇｏｔｏ，Ｙ．，Ｋａｔｏｈ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２０１１）．Ｆｌｅｘｉｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．６，７７９－７９０］：２０μＭのｔＲＮＡを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ及び１００ｍＭのＫＣｌを含有するｐＨ ７．５の１×フォールディング緩衝液の存在下、３０μＭのジニトロフレキシザイムと混合した。混合物を９５℃で２分間加熱し、２５℃に１０分間冷却し、続いて１００ｍＭのＭｇＣｌ_２を添加した。混合物を室温で１０分間及び冷蔵した金属ブロック上で３分間インキュベートした。５ｍＭ ＤＢＥ基質を冷金属ブロック上のシステムに添加して、積荷反応を開始した。反応産物を４℃で６時間インキュベートし、２×体積の０．６Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ５．２）で反応停止（quench）させ、エタノールによって沈殿させた。以下のアミノ酸については、一般手順に対して調整を加えた：Ｉｌｅ－ＤＢＥ及びＶａｌ－ＤＢＥについては、リフォールディング緩衝液をｐＨ ９．０の５０ｍＭ ビシン－ＫＯＨに変更した；Ｍｅｔ－ＤＢＥ及びＣｙｓ－ＤＢＥについては、基質に５ｍＭのＤＴＴを補充した；Ｐｒｏ－ＤＢＥについては、基質濃度を５ｍＭから４０ｍＭに増加させた；Ｆｐｈ－ＣＭＥについては、３０μＭの増強フレキシザイムを用い、Ｆｐｈ－ＣＭＥ基質濃度を５ｍＭから１ｍＭに減少させ、ＭｇＣｌ_２濃度を１００ｍＭから４００ｍＭに増加させた；Ａｓｎ－ＣＢＴについては、基質濃度を５ｍＭから２５ｍＭに増加させた；Ｔｒｐ－ＤＢＥについては、２０％ ＤＭＳＯをさらに添加した。積荷収率を酸性ＰＡＧＥ分析によって決定した：沈殿した積荷反応産物を、９３％ホルムアミド、ｐＨ ５．２の１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び微量のブロモフェノールブルーを含むローディング緩衝液に溶解させた。酸性ゲルは、８％アクリルアミド、ｐＨ ５．２の１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、及び７Ｍ尿素によって調製した。ｐＨ５．２の泳動バッファーとして１００ｍＭ ＮａＯＡｃを用いて、アルミニウム冷却プレートを備えた４℃の冷蔵庫内で１６時間ゲルを泳動させた。ゲルをＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）で染色し、Ｃｙ２モード下で作動させたＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００でスキャンし、ソフトウェアパッケージＩｍａｇｅＪで分析した［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ａ．；Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．＆Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｋ．Ｗ．（２０１２），「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｔｏ ＩｍａｇｅＪ：２５ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ９（７）：６７１－６７５，ＰＭＩＤ ２２９３０８３４］。ｔＲＮＡ^Ａｓｐを除き、積荷済みｔＲＮＡの収率を計算するために、ピーク面積を積分した。Ａｓｐ－ｔＲＮＡ^Ａｓｐの収率を推定するためにピーク高を用いた。Ａｓｐ－ｔＲＮＡ^Ａｓｐは、未積荷ｔＲＮＡ^Ａｓｐに非常に接近して移動し（図２を参照）、Ａｓｐ－ｔＲＮＡ^Ａｓｐ積荷収率の推定値（約５０％）は、以前に報告された結果と一致した［Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ．，Ｏｈｔａ，Ａ．，Ａｓｈｉｇａｉ，Ｈ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２００６）．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔＲＮＡ ａｃｙｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，３５７］。

図２は、ＨＰＬＣ精製前後のｔＲＮＡ積荷収率の酸性ＰＡＧＥ分析を示す。図中で、「Ｕ」は未積荷ｔＲＮＡを表し、「Ｃ」は粗積荷済みｔＲＮＡを表し、「Ｐ」は精製積荷済みｔＲＮＡを表す。ｔＲＮＡ積荷収率は、総ｔＲＮＡに対する積荷済みｔＲＮＡの積分ピーク面積を用いてソフトウェアパッケージＩｍａｇｅＪによって決定した。

複数の短ペプチドのａａＲＳフリー翻訳：
表２に列挙したプライマーを用いる２５サイクルアセンブリＰＣＲによって、ａａＲＳフリーペプチド翻訳のためのｄｓＤＮＡ鋳型を調製した。

全てのＤＮＡ鋳型を１０％変性ＰＡＧＥによって精製した。ｍＲＮＡ＃１を翻訳するために、各コドンが、１．２５～８０μＭの範囲の対応する（cognate）フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡによってデコードされるように、反応混合物を調整した。前記ｔＲＮＡ濃度は、１６～１０００μＭの総ｔＲＮＡに対応する。フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡのＨＰＬＣ精製を、参考文献に記載されるように行った［Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ Ｆｅｒｒｅ－Ｄ’Ａｍａｒｅ，Ａｄｒｉａｎ Ｒ．（２０１４）．Ｄｉｒｅｃｔ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔＲＮＡ ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｔ－Ｂｏｘ ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ ｕｓｉｎｇ ｔＲＮＡ－ｍＲＮＡ ｓｔａｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｅｒｉｃ ｒｅａｄｏｕｔ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５５，１４８－１５５］。積荷済みｔＲＮＡを保存し、酸性ＰＡＧＥ分析によって判定すると、－８０℃で３日間まで、乾燥ペレットとして安定なままであった。積荷済みｔＲＮＡペレットを０．５×翻訳体積のｐＨ５．２の１ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解させた。連続希釈を実施して、表３に示される濃度の２倍濃縮のｔＲＮＡを作製した。表３は、ａａＲＳフリー翻訳に用いられた総ｔＲＮＡ濃度を示す。

３７℃で５分間プレインキュベートした等量の２×ａａＲＳフリー翻訳ミックスをｔＲＮＡと混合して、翻訳反応を開始した。全ての翻訳反応は、３７℃で２時間インキュベートした。Ｆｐｈ標識ペプチドの翻訳収率を決定するための１７％又は２０％トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の前に、反応混合物を－２０℃に置くことによって翻訳を終了した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｊｉａｎｇｓｕ、中国）によってカスタム合成された０．１２５～４μＭのペプチド標準（Ｆｐｈ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｄ（配列番号１２５））も、較正のためにロードした。未積荷ｔＲＮＡの滴定は、ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ：ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ：ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ：ｔＲＮＡ^Ａｓｐ＝１：２．５：２．５：２．５のモル比で行い、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡと混合し、室温で短時間インキュベートした後、ａａＲＳフリー翻訳システムに添加した。未積荷ｔＲＮＡの最終濃度は、９０～４７０μＭであった。等体積の２×ａａＲＳフリーミックスと混合して翻訳反応を開始する前に、フレキシザイム滴定を、ジニトロ－フレキシザイムを１ｍＭのＮａＯＡｃ中でフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡと混合することによって行った。フレキシザイムの最終濃度は、２４０～５２０μＭであった。フォールディングされたフレキシザイム及びｔＲＮＡ複合体の滴定は、５０μＭのジニトロ－フレキシザイム、６μＭのｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ、それぞれ１５μＭのｔＲＮＡ^Ｌｙｓ、ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ、及びｔＲＮＡ^Ａｓｐを含有するシステムにおいて実行し、ｐＨ７．５の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ及び１００ｍＭ ＫＣｌの存在下で２分間９５℃に加熱した。ミックスを２５℃にゆっくり冷却した後、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２又は１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２のいずれかを添加し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、ミックスをエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで２回洗浄し、風乾した。ペレットを少量のｄｄＨ_２Ｏに溶解し、それぞれ７５０、３７５及び１８８μＭであるフレキシザイム－ｔＲＮＡ複合体の×２濃度に達するように段階希釈した後、ｄｄＨ_２Ｏのみを含有する対照と共に、等量のａａＲＳフリー翻訳システムに添加した。

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ：
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを用いて、ｍＲＮＡ＃２～＃６のａａＲＳフリー翻訳を分析した。ペプチドの脱落を減少させるために、各積荷反応のスケールを各遺伝子におけるコドン存在量に従って調整し、各コドンが等しい濃度のフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡとマッチするようにした（ｍＲＮＡ＃２～＃５についてはコドンあたり１０μＭ、ｍＲＮＡ＃６については５μＭ）。未積荷ｔＲＮＡを含む対照は、（それぞれ）３０μＭのｔＲＮＡ^Ａｓｎ、ｔＲＮＡ^Ｇｌｕ、ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ、ｔＲＮＡ^Ｉｌｅ、及び（それぞれ）５μＭのその他ｔＲＮＡ、並びに１００μＭの各アミノ酸を含有した。積荷反応を反応停止（quench）させ、沈殿させ、７０％エタノールで１回洗浄した。種々のフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの洗浄済みペレットを０．３Ｍ ＮａＯＡｃに溶解し、混合し、エタノールによって再度沈殿させ、－８０℃で保存し、使用前に７０％エタノールで１回洗浄した。ＡａＲＳフリー翻訳は、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを等量の２×ａａＲＳフリー翻訳ミックスと混合することによって行った。３７℃で２時間翻訳した後、ＴＦＡを翻訳システムに添加してｐＨを４未満に低下させ、試料を短時間遠心分離し、上清をＣ１８スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）で脱塩した。溶出後、試料体積を遠心真空濃縮器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）によって約２～３μｌに減少させ、そのうち０．５μｌをポジティブリフレクトロンモード下でのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４８００ ｐｌｕｓ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ ａｎａｌｙｚｅｒ，ＣＡ，米国）に用いた。未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸（各アミノ酸種について１００μＭ）を用いた対照実験を実施し、脱塩し、並行してＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって分析した。対照実験で用いた未積荷ｔＲＮＡの濃度は、ｔＲＮＡ^Ａｓｎ、ｔＲＮＡ^Ｇｌｕ、ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ、ｔＲＮＡ^Ｉｌｅについては（それぞれ）３０μＭであり、その他のｔＲＮＡについては（それぞれ）５μＭであった。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定：
体積２０μｌの粗ａａＲＳフリー翻訳されたＮ末端ＦＡＭ標識大腸菌ＴｒｐＲＳを１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰｒｏｔｅｏＳｉｌｖｅｒ銀染色キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、米国）によって銀染色した。ＥＦ－Ｔｕ（４３ｋＤａ）とＭＴＦ（３４ｋＤａ）との間のタンパク質バンドをゲルから切り出し、５ｍＭのジチオトレイトールによって還元し、１１ｍＭのヨードアセトアミドによってアルキル化した。ゲル内消化を、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中でシークエンシンググレードのトリプシンを用いて３７℃で一晩行った。ペプチドを５０％アセトニトリル水溶液中の０．１％ ＴＦＡを３０分間用いて、２回抽出した。次いで、抽出物を遠心真空濃縮器によって濃縮した。トリプシン消化で生じたペプチドを２０μｌの０．１％ ＴＦＡに溶解し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。上記の濃度を用いた未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸による対照実験を並行して実施し、分析した。

鏡像ｔＲＮＡの酵素的転写：
鏡像転写のためのＤ－ポリメラーゼＤ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓの合成及びフォールディングは、以前に報告された［Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｆａｎ，Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｄｅｎｇ，Ｑ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｍｉｒｒｏｒ－ｉｍａｇｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ．３，１７０３７；Ｘｕ，Ｗ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，ａｎｄ Ｚｈｕ，Ｔ．Ｆ．（２０１７）．Ｔｏｔａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ．３，１７００８；Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｆａｎ，Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｐｅｎａ－Ａｌｃａｎｔａｒａ，Ｇ．，Ｌｉｎｇ，Ｊ．－Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｍｉｒｒｏｒ－ｉｍａｇｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ ５，８４８－８５７］。全てのＬ－ＤＮＡプライマー、鋳型配列及びＬ－核酸オリゴ配列を表４に列挙する。表中、「＊」はホスホロチオエート修飾を示し、大文字はＬ－ＤＮＡヌクレオチドを示し、小文字はＬ－ＲＮＡヌクレオチドを示す。

鏡像一本鎖ＤＮＡ（Ｌ－ｓｓＤＮＡ）鋳型の３’末端につながれた（tethered）２４ｎｔプライマー結合部位を用いて鏡像転写を行って、異なる産物長によってＰＡＧＥによるＲＮＡ精製を容易にした（それにより、Ｌ－ＲＮＡ転写物が９９ヌクレオチドのＬ－ｓｓＤＮＡ鋳型よりも２３ヌクレオチド短くなり、これらは７Ｍ尿素での１２％変性ＰＡＧＥで分離され得る）。Ｌ－プライマーは、ホスホロチオエート修飾Ｌ－ＲＮＡヌクレオチドを３’末端に含むように設計された。鏡像ｔＲＮＡ^Ａｌａ、ｔＲＮＡ^Ｇｌｙ、ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ及びｔＲＮＡ^Ｐｈｅの酵素的転写を行った。鏡像転写後、Ｌ－プライマーは、７０℃のエタノール中１０分間、ホスホロチオエート部位で１００μＭのＩ_２によって効率的に切断され、成熟した鏡像ｔＲＮＡ転写物を生じた。ＲＮａｓｅ Ａ消化のために、０．４μＭのＤ－又はＬ－ｔＲＮＡ^Ａｌａを４μＭのＲＮａｓｅ Ａと混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、７Ｍ尿素での１０％変性ＰＡＧＥによって分析した。ａａＲＳ触媒アミノアシル化のために、５μＭのＤ－又はＬ－ｔＲＮＡ^Ａｌａを、１０ｍＭ ＡＴＰ及び１００μＭのＬ－又はＤ－アラニンの存在下で１μＭのＡｌａＲＳと混合し、３７℃で１時間インキュベートし、８％酸性ＰＡＧＥによって分析した。

鏡像ｔＲＮＡ積荷：
鏡像ｔＲＮＡ積荷を、Ｌ－ｔＲＮＡ濃度及びＬ－フレキシザイム濃度をそれぞれ２μＭ及び１０μＭにスケールダウンしたことを除いて、上記と同じアミノアシル化法を用いて行った。鏡像ｔＲＮＡを合成Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓポリメラーゼによって転写し、天然ｔＲＮＡを、Ｄｐｏ４の組換えＹ１２Ｓ変異体（Ｌ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓ）（配列番号１２６）（ｔＲＮＡ^Ａｌａ、ｔＲＮＡ^Ｇｌｙ及びｔＲＮＡ^Ｌｙｓ）又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ）のいずれかによって合成した。ｔＲＮＡ積荷収率は、総ｔＲＮＡに対する積荷済みｔＲＮＡの積分ピーク面積を用いて、ソフトウェアパッケージＩｍａｇｅＪによって決定した。

実施例２
フレキシザイム触媒ｔＲＮＡアミノアシル化：
２１種のｔＲＮＡに、４６ヌクレオチドのジニトロ－フレキシザイム又は４５ヌクレオチドの増強フレキシザイムによって対応する（cognate）アミノ酸を個別に積み込みした。積荷反応を０．３Ｍ ＮａＯＡｃで反応停止（quench）させ、沈殿させた。ペレットを、適切となるように、７０％エタノール洗浄又はＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステム（日本）のいずれかによって精製した（図８Ａ及び図８Ｂを参照）。

図３Ａ～図３Ｅは、本発明のいくつかの実施形態による、鏡像ｔＲＮＡへのａａＲＳフリー積荷への途上となる、フレキシザイムによるｔＲＮＡへの積荷の概念及び結果を示しており、Ｄ－フレキシザイムによって触媒されるＤ－ｔＲＮＡ積荷、及びその鏡像バージョン、つまりＬ－フレキシザイムによって触媒される鏡像ｔＲＮＡ積荷（ＰＤＢソース：１ＥＨＺ（ｔＲＮＡ）、３ＣＵＬ（フレキシザイム））（図３Ａ）、酵素的に転写された鏡像ｔＲＮＡＡｌａ上へのＬ－フレキシザイムによるＤ－アラニンの積み込み、天然キラリティ対応物も比較のために示される（図３Ｂ）、酵素的に転写された鏡像ｔＲＮＡＧｌｙ上へのＬ－フレキシザイムによるグリシンの積み込み、天然キラリティ対応物も比較のために示される（図３Ｃ）、酵素的に転写された鏡像ｔＲＮＡＬｙｓ上へのＬ－フレキシザイムによるＤ－リジンの積み込み、天然キラリティ対応物も比較のために示される（図３Ｄ）、酵素的に転写された鏡像ｔＲＮＡＰｈｅ上へのＬ－フレキシザイムによるＤ－フェニルアラニンの積み込み、天然キラリティ対応物も比較のために示される（図３Ｅ）、を示す。ｔＲＮＡ積荷収率は、総ｔＲＮＡに対する積荷済みｔＲＮＡの積分ピーク面積を用いてソフトウェアパッケージＩｍａｇｅＪを用いて決定された。

Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ及び３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ、ＭＡ、米国）をＨＰＬＣ精製に使用し、溶出条件は文献から採用した［Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ Ｆｅｒｒｅ（アクサンテギュ）－Ｄ’Ａｍａｒｅ（アクサンテギュ），Ａｄｒｉａｎ Ｒ．（２０１４）．Ｄｉｒｅｃｔ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔＲＮＡ ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｔ－Ｂｏｘ ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ ｕｓｉｎｇ ｔＲＮＡ－ｍＲＮＡ ｓｔａｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｅｒｉｃ ｒｅａｄｏｕｔ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５５，１４８－１５５］。フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを含む画分を沈殿させ、ｐＨ５．２の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解し、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）によって測定した。次いで、所望の量のｔＲＮＡを混合し、エタノールによって再び沈殿させた。ペレットを風乾し、使用まで－８０℃で保存した。

実施例３
無細胞インビトロ翻訳
無細胞インビトロ翻訳ミックスを、以下の改変と共に、以前に報告された方法［Ｔｅｒａｓａｋａ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇ．，Ｋａｔｏｈ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２０１４）．Ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｔＲＮＡ ｐａｉｒ ｖｉａ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｅｎｔｅｒ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０，５５５－５５７］に従って調製した：組換えＩＦ１タンパク質、ＩＦ２タンパク質、ＩＦ３タンパク質、ＥＦ－Ｔｓタンパク質、ＥＦ－Ｔｕタンパク質、ＥＦ－Ｇタンパク質、ＲＦ－２タンパク質、ＲＦ－３タンパク質、ＲＲＦタンパク質、及びＭＴＦタンパク質を、Ｎ末端ＴＥＶ切断可能Ｈｉｓタグと共に、大腸菌ＢＬ２１株で発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｓｅｎｈｕｉ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｔｅｃｈ．、Ｓｕｚｈｏｕ、中国）によって精製し、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、米国）によって切断し、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製し、ｐＨ７．６の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭグルタミン酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、７ｍＭβ－メルカプトエタノール及び３０％グリセロールを含む緩衝液中へと交換した。緩衝液成分及び小分子成分は、文献に記載されているように調製した［Ｇｏｔｏ，Ｙ．，Ｋａｔｏｈ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２０１１）．Ｆｌｅｘｉｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．６，７７９－７９０］。ａａＲＳフリー大腸菌リボソームは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＭＡ、米国）から購入した。

実施例４
タンパク質酵素のａａＲＳフリー翻訳
ニワトリリゾチーム、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、及び大腸菌ＴｒｐＲＳのための２０コドンＤＮＡ鋳型を、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｊｉａｎｇｓｕ、中国）によって合成及びアセンブルし、ｐＵＣ－５７ベクターにクローニングした。表５は、ニワトリリゾチーム、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、及び大腸菌ＴｒｐＲＳのａａＲＳフリー翻訳のためのＤＮＡ鋳型配列を示している。

ＤＮＡプラスミドを二重消化し、使用前に１％アガロースゲルによって精製した。－８０℃から回収したら、乾燥させたフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、ｐＨ５．２の１０～２０μｌの１ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解させた。次いで、溶解させたｔＲＮＡミックスを、３７℃で５分間プレインキュベートしたａａＲＳフリー翻訳ミックスに添加し、ここで最終ＤＮＡ鋳型濃度は約１０ｎｇ／μｌであった。リゾチーム及びルシフェラーゼの翻訳のためには、翻訳される各コドンについて約１μＭのフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いた。ＴｒｐＲＳの翻訳のためには、約１μＭのフレキシザイム積荷済みＦＡＭ標識Ｆｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ、Ｃｙｓ及びＰｒｏ各コドンについて約０．４μＭのフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡ、及び残りの各コドンについて約０．２μＭのフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いた（総ｔＲＮＡ濃度は上記の表３に示される）。ＤＮＡ鋳型を用いない対照実験は、同一のフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡ濃度を用いて行ったが、未積荷ｔＲＮＡを用いた対照実験は、ｔＲＮＡ^Ａｓｎ、ｔＲＮＡ^Ｇｌｕ、ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ、ｔＲＮＡ^Ｉｌｅについては（それぞれ）３０μＭ、他のｔＲＮＡについては（それぞれ）５μＭ、及び遊離アミノ酸については（それぞれ）１００μＭを用いた。翻訳反応は３７℃で、リゾチーム及びルシフェラーゼについては２時間、ＴｒｐＲＳについては４時間インキュベートした。１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析のために、翻訳反応産物から１０μｌのアリコートを試料採取し、２μｌの６×タンパク質ローディング色素と混合し、ローディングのために９８℃で３分間加熱した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ蛍光タンパク質標準は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＭＡ、米国）から購入した。ゲルを、Ｃｙ２モードで作動させたＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）によってスキャンした。

実施例５
ａａＲＳフリー翻訳されたタンパク質酵素の生化学的特性決定
ニワトリリゾチーム、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、及び大腸菌ＴｒｐＲＳのａａＲＳフリー翻訳を、Ｍｅｔ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔを用いて行った。ニワトリリゾチームの翻訳ミックスは、０．１Ｍリン酸ナトリウム及び０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する、等体積の２×フォールディング緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、室温で２４時間インキュベートし、ＥｎｚＣｈｅｋ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）によってアッセイした。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ用の翻訳ミックスは、組換えＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼにおけるジスルフィド結合の形成を促進することが先に示されている［Ｙｕ，Ｔ．，Ｌａｉｒｄ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｒｅｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ，Ｃ．（２０１８）．Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：ａ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７，１５０９－１５１７］、６ｍＭの還元型グルタチオン及び４ｍＭの酸化型グルタチオンを含有する等体積の２×フォールディング緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈し、室温で１６時間インキュベートし、製造者の説明書に従って、Ｐｉｅｒｃｅ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）によってアッセイした。大腸菌ＴｒｐＲＳの翻訳のために、Ｃｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐを２つの合成オリゴの酵素的ライゲーションによって調製し、文献に記載されているように１０％変性ＰＡＧＥによって精製した［Ｓｕｄｄａｌａ，Ｋ．Ｃ．，Ｃａｂｅｌｌｏ－Ｖｉｌｌｅｇａｓ，Ｊ．，Ｍｉｃｈｎｉｃｋａ，Ｍ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃ．，Ｎｉｋｏｎｏｗｉｃｚ，Ｅ．Ｐ．，ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ，Ｎ．Ｇ．（２０１８）．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ Ｔ－ｂｏｘ ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，１８９６］。表６は、内部Ｃｙ５標識されたｔＲＮＡ^Ｔｒｐの酵素的ライゲーションのためのＲＮＡオリゴ配列を示す。

２μＭのＣｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐ、２５０μＭのトリプトファン、及び１ｍＭのＡＴＰの混合物を翻訳完了後に反応混合物に添加し、３７℃で１時間インキュベートし、０．３ＭのＮａＯＡｃで反応停止（quench）させ、フェノール－クロロホルムで抽出した。積荷された試料を８％酸性ＰＡＧＥによって分析し（補足情報）、Ｃｙ５モードで作動させたＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンした。２μＭの未積荷Ｃｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐ、及び１００ｎＭの組換え大腸菌ＴｒｐＲＳによって積荷された２μＭのＣｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐの試料を標準として用いた。ＤＮＡ鋳型を欠く、又は未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸を用いた、全ての対照実験を、同一の条件下でアッセイした。

実施例６
ａａＲＳフリー翻訳の収率の最大化
文献［Ｔｅｒａｓａｋａ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇ．，Ｋａｔｏｈ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２０１４）．Ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｔＲＮＡ ｐａｉｒ ｖｉａ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｅｎｔｅｒ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０，５５５－５５７］に報告されている明らかな低収率の問題に対処するために、ａａＲＳフリー翻訳システムを研究した。理論的根拠は、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの濃度を増加させてｔＲＮＡの再利用の欠乏を補うことによって、ａａＲＳフリー翻訳の収率が改善されるのではないかということであった。先の研究は、ａａＲＳを用いる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）翻訳システムにおいて、過剰なｔＲＮＡの添加は翻訳を阻害することを示した［Ｒｏｊｉａｎｉ，Ｍ．Ｖ．，Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ，Ｈ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｅ．（１９９０）．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈａｒｇｅｄ ａｎｄ ｕｎｃｈａｒｇｅｄ ｔＲＮＡ^Ｔｒｐ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１５１１；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．（１９６９）．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔＲＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６２，５６６］。このことは、未積荷ｔＲＮＡがリボソームＡ部位を占めることによって積荷済みｔＲＮＡに打ち勝つこと、または、多量のｔＲＮＡの添加に起因するカチオン不均衡によるものとされた。しかし、これらの実験は全てａａＲＳの存在下で行われたため、正確な積荷収率は決定されず、非効率的な積荷及び変化したカチオン（例えば、Ｍｇ^２＋）濃度の影響を識別することは困難であった。

ｔＲＮＡ濃度及び積荷収率がａａＲＳフリー翻訳に及ぼす影響を評価するために、フルオレセイン（ＦＡＭ）標識フェニルアラニン（Ｆｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ）を用いた短ペプチドのａａＲＳフリー翻訳を実施して、翻訳収率の定量化を容易にした（図４Ａ～図４Ｂ、図５Ａ～図５Ｄ及び図６Ａ～図６Ｅを参照）。

図４Ａ～図４Ｇは、本発明のいくつかの実施形態による、複数の短ペプチドのａａＲＳフリー翻訳の結果を示す。示されるのは、ｍＲＮＡ＃１から翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析（図４Ａ）、トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析された短ペプチドのａａＲＳフリー翻訳収率、ここで未積荷ｔＲＮＡ濃度は１６０～５４０μＭの範囲とし、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡ濃度は７０μＭとし、その結果、積荷収率は４４～１３％の範囲であった（図４Ｂの上部）、総ｔＲＮＡ濃度は１６～１００３μＭの範囲とし、積荷収率は５６％のままであった（図４Ｂの下部）（エラーバーは３回の独立した実験からの標準偏差を表す）、ｍＲＮＡ＃２（図４Ｃ）、ｍＲＮＡ＃３（図４Ｄ）、ｍＲＮＡ＃４（図４Ｅ）、ｍＲＮＡ＃５（図４Ｆ）及びｍＲＮＡ＃６（図４Ｇ）からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析、ここで５５～１３５μＭの総量の未積荷ｔＲＮＡ及び１００μＭの各アミノ酸を用いた翻訳の対照（ｍＲＮＡ＃１については、５μＭのフレキシザイムによって積荷されたＦＡＭ標識Ｆｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔを対照実験及びａａＲＳフリー翻訳実験の両方に添加）、及び１７０～４１４μＭの総フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いたａａＲＳフリー翻訳のａａＲＳフリー翻訳も行う（表３を参照）。ａ．ｕ．は、任意単位を表し、Ｃ、Ｏは、計算ｍ／ｚ値及び観測ｍ／ｚ値を表す（図４Ｃ～図４Ｇのそれぞれ）。

ｍＲＮＡ鋳型をｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ、ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ、ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ及びｔＲＮＡ^Ａｓｐによってデコードし、そのうちのｔＲＮＡ^ｆＭｅｔには４５ヌクレオチドの増強フレキシザイムによってＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔが積荷され、他のものにはそれらの対応する（cognate）アミノ酸が４６ヌクレオチドのジニトロ－フレキシザイムによって積荷された［Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ．，Ｏｈｔａ，Ａ．，Ａｓｈｉｇａｉ，Ｈ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２００６）．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔＲＮＡ ａｃｙｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，３５７］。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロで転写された未改変ｔＲＮＡは、それらがリボソームペプチド合成アッセイにおいて作用することが示されているので用いられた。各ｔＲＮＡについての個々の積荷収率を、酸性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（酸性ＰＡＧＥ）によって決定し、これを用いて、翻訳システムの加重平均（全体）積荷収率を推定した（表３を参照）。ｔＲＮＡの滴定を、総積荷収率が約４４％であり（モル比１：２：２：２で混合されたＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ：Ｌｙｓ－ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ：Ｔｙｒ－ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ：Ａｓｐ－ｔＲＮＡ^Ａｓｐ）、最終翻訳システムにおける総ｔＲＮＡ濃度が２０～６４４μＭである積荷した総ｔＲＮＡを添加することによって最初に行ったところ、総ｔＲＮＡ濃度が約１６０μＭであるときに翻訳収率が最高レベルに達し、プラトーとなることなく、ｔＲＮＡ濃度がさらに増加すると翻訳収率が低下することを発見した（図５Ａを参照）。

図５Ａ～図５Ｄは、種々の条件下でのｍＲＮＡ＃１のａａＲＳフリー翻訳の結果を示す。示されるのは、総ｔＲＮＡ濃度を２０～６４４μＭの範囲としたところ、積荷収率は４４％のままであったこと（図５Ａ）、総フレキシザイム濃度を２４０～５２５μＭの範囲としたところ、総ｔＲＮＡ濃度は１６０μＭのままであったこと（図５Ｂ）、フレキシザイム及び０～３８０μＭの未積荷ｔＲＮＡが（図５Ｃでは）１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２中に、（図５Ｄでは）１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２中に混合され、エタノール沈殿によって脱塩され、ａａＲＳフリー翻訳ミックスに添加され、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの濃度は７０μＭのままとしたことである（エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す）。

図６Ａ～図６Ｄは、ａａＲＳフリー翻訳収率を計算するためのトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を示しており、ａａＲＳフリー翻訳収率を計算するための、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄに対応するゲル画像（それぞれ図６Ａ～図６Ｅ）を示している。「Ｍ」は、合成ペプチド標準を表す（Ｆｐｈ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｄ）。

観察された阻害は、翻訳システムにおけるフレキシザイムの蓄積によるものでなかった。なぜなら対照実験では、精製されたジニトロ－フレキシザイムを固定された量の総ｔＲＮＡに添加しても翻訳を阻害しなかったからである（図５Ｂを参照）。

次に、７０μＭの積荷済みｔＲＮＡの存在下で、９０～４７０μＭの未積荷ｔＲＮＡをａａＲＳフリー翻訳システムに添加したところ、全体の積荷収率は４４から１３％に減少したが、全体の翻訳収率はほとんど影響を受けなかった（図４Ｂを参照）。

観察された翻訳阻害の原因となり得る別の因子は、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡからのＭｇ^２＋持ち越み（carryover）によるカチオン濃度の増加であると推論された。この理論を検証するために、ａａＲＳフリー翻訳システムに添加する前に、外因性ＭｇＣｌ_２をフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡに添加したところ、翻訳が実際にＭｇＣｌ_２持ち越み（carryover）の増加によって阻害されることが発見された（図５Ｃ及び図５Ｄを参照）。

上記の観察に基づいて、Ｃ１８カラムを装備した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを精製してＭｇ^２＋濃度を低下させた（蛍光消光を最小化するために、代わりに限外濾過によって処理したＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔを除く）。このプロセスはまた、ほとんどのフレキシザイムを除去し、全体的な積荷収率を４４から５６％へと小幅に改善した（図２を参照）。

その後、精製したフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを、ａａＲＳフリー翻訳システムに添加したが、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡのみを濃縮すると、翻訳収率が５倍と大幅に改善されることが観察された。ＨＰＬＣによってＭｇ^２＋混入を減少させると、さらなる２倍の改善が観察され、結果として全体的として約１０倍の翻訳収率の改善が生じ（図４Ｂ及び図５Ａを参照）、最適な総ｔＲＮＡ濃度は１６０μＭから５００μＭにシフトした。

しかしながら、ｔＲＮＡ濃度が５００μＭから１０００μＭにさらに増加すると、全体的な翻訳収率は約５０％低下し、これはＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔに付随するＭｇ^２＋に起因する可能性がある。さらに、ａａＲＳの存在下で高濃度の未積荷ｔＲＮＡを用いる同様の滴定アッセイは、翻訳収率の改善をもたらさず（図７Ａ～図７Ｂを参照）、ａａＲＳフリー翻訳収率の改善が、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの濃度の増加それ自体に起因する可能性が高いことを示唆している。

図７Ａ～図７Ｂは、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ、及びＡｓｐＲＳの存在下でのインビトロ翻訳実験の結果を示しており、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ及びＡｓｐＲＳの存在下で２２～６８０μＭの範囲とした未積荷、非修飾総ｔＲＮＡ濃度を用いた場合の翻訳産物、及び増強されたフレキシザイムによって事前に積荷されたＦｐｈ－ｔＲＮＡｆＭｅｔの、トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図７Ａ）、及び計算された翻訳収率（図７Ｂ）を示している（エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す）。

実施例７

複数の短ペプチドのａａＲＳフリー翻訳
ｔＲＮＡ濃度を増加させるとａａＲＳフリー翻訳の収率を改善することを発見したので、本願発明者は、複数の短ペプチドについてａａＲＳフリー翻訳を試験し、高いフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡ濃度における翻訳忠実度を決定しようと試みた。翻訳開始のための１種のｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ）及び翻訳伸長のための他２０種のｔＲＮＡを含む、２１種の大腸菌ｔＲＮＡからなる最小セットが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写によって得られた。表７は、関係するｔＲＮＡ配列を示す。

各ｔＲＮＡは、フレキシザイムによって別々に積荷され、積荷収率は２０～６０％の範囲であった（図８Ａを参照）。
図８Ａ～図８Ｂは、２１種のｔＲＮＡへの、それらに対応する（cognate）タンパク質構成アミノ酸のフレキシザイムによる積荷収率を示しており、エタノール沈殿後に決定された積荷収率（図８Ａ）、及び１４種のフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの、ＨＰＬＣ精製後に決定された積荷収率を示す。Ｎ／Ａは、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの精製を行わなかったものを示しており（図８Ｂ）、以前に報告されたように精製を促進するため、ｇｌｙ－ｔＲＮＡ^Ｇｌｙに対して可逆的Ｎ－ペンテノイル化を行った。

フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを、ｍＲＮＡ上におけるそれらの対応する（cognate）コドンの存在量に応じたモル比で混合した後、ａａＲＳフリー翻訳システムに１７０～５２０μＭの範囲の最終濃度まで添加した（表３）。本願発明者は、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡのアンチコドンに対してワトソン－クリック塩基対を形成することが可能な５つの異なるｍＲＮＡ配列を設計し、インビトロ転写し、ａａＲＳフリー翻訳された短ペプチドをマトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）によって評価して、翻訳忠実度を試験した（図４Ｃ～図４Ｇを参照）。

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳの結果は、２１種全てのフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡが、リボソームに対して約２００倍モル過剰までにおいて、ｍＲＮＡを正確にデコードしたことを示した（例えば、ｍＲＮＡ＃５の場合、ｔＲＮＡ４１４μＭに対してリボソーム２μＭ）。未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸を用いた対照実験では（図４Ｃ～図４Ｇを参照）、ペプチド産物は検出されず、したがって、リボソーム調製物からのａａＲＳ及び積荷済みｔＲＮＡの混入の懸念は最小限に抑えられている。

特に、本願発明者は、短いメッセージ「ＭＩＴＲＮＡＣＨＡＲＧＩＮＧＳＹＳＴＥＭ」（配列番号１２３）をｍＲＮＡ＃６へとコードし（図４Ｇを参照）、情報保有ペプチド全長の翻訳に成功した。

しかしながら、総ｔＲＮＡ濃度を５２０μＭに増加させた場合、追加の＋１２Ｄａピークが検出された（図９を参照）。これは、高いｔＲＮＡ濃度及び翻訳のための未改変ｔＲＮＡの使用から生じる、ｍＲＮＡのミスデコーディングによるものである可能性がある。

図９は、ａａＲＳフリー翻訳されたｍＲＮＡ＃６のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を示しており、ａａＲＳフリー翻訳システムにおいて総ｔＲＮＡ濃度が高くなると（５２０μＭ）、２，２５２．７Ｄａの分子量を有する誤翻訳産物が観察されたが、正しく翻訳された産物は２，２４０．７Ｄａの分子量を有したことを示している。ａ．ｕ．は任意単位を表し、Ｃ、Ｏはそれぞれ、計算されたｍ／ｚ値及び観測されたｍ／ｚ値を表す。

実施例８
タンパク質酵素のａａＲＳフリー翻訳
短ペプチドの成功裏な翻訳は、フレキシザイムシステムによって積荷された、インビトロ転写された未改変ｔＲＮＡのみを用いるタンパク質酵素のａａＲＳフリー翻訳につながった。二つの小さな酵素、１３０アミノ酸残基のニワトリリゾチーム及び１６９アミノ酸残基のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼをモデルとして選択した。どちらの酵素も大腸菌自体には無く、このことはリボソーム調製物からの混入の懸念を最小化する。

図１０Ａ～図１０Ｃは、ａａＲＳフリー翻訳されたタンパク質酵素である、ニワトリリゾチーム（図１０Ａ）、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（図１０Ｂ）、及び大腸菌ＴｒｐＲＳ（図１０Ｃ）のアミノ酸配列を示している。フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡによって翻訳された位置は、エタノール沈殿又はＨＰＬＣのいずれかによって精製された（下線）。

２１種のフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡからなるサブセット（図１０Ａ～図１０Ｂ中の下線付きアミノ酸）をＨＰＬＣによって精製してＭｇ^２＋持ち越み（carryover）を減少させ、ＨＰＬＣ精製後の個々の積荷収率を酸性ＰＡＧＥによって測定した（図８Ｂを参照）。全体的な積荷収率は約４０％という結果であった。ニワトリリゾチームについて約３３０μＭ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼについて約４３０μＭという総ｔＲＮＡ濃度（表３）は、他のインビトロ翻訳システムで用いられる当該濃度よりも約１０～２０倍高かった［Ｔｅｒａｓａｋａ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇ．，Ｋａｔｏｈ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２０１４）．Ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｔＲＮＡ ｐａｉｒ ｖｉａ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｅｎｔｅｒ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０，５５５－５５７；Ｉｗａｎｅ，Ｙ．，Ｈｉｔｏｍｉ，Ａ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ．，Ｋａｔｏｈ，Ｔ．，Ｇｏｔｏ，Ｙ．，ａｎｄ Ｓｕｇａ，Ｈ．（２０１６）．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｂｏｘｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．８，３１７－３２５；ａｎｄ Ｃｕｉ，Ｚ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｖ．，Ｔｎｉｍｏｖ，Ｚ．，Ｍｕｒｅｅｖ，Ｓ．，ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｋ．（２０１５）．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７，４４０４－４４１３］。

全長タンパク質のａａＲＳフリー翻訳を、ＦＡＭ標識Ｆｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔレポーターを用いて試験した。ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分析すると、蛍光標識された産物のバンドは、ニワトリリゾチーム及びＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの分子量（それぞれ１４．８ｋＤａ及び１８．７ｋＤａ）と一致し、産物のバンドの移動度も、市販のニワトリリゾチーム及び組換えＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの移動度とそれぞれ類似していた（図１１Ａ～図１１Ｄを参照）。

図１１Ａ～図１１Ｇは、ａａＲＳフリー翻訳されたタンパク質酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示しており、図１２Ａに示される全体のゲル画像（図１１Ａ）、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析され、クマシーブリリアントブルーで染色された、ニワトリ卵白から精製された市販のニワトリリゾチーム４００ｎｇの試料（図１１Ｂ）、図１２Ｃに示される全体のゲル画像（図１１Ｃ）、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析され、クマシーブリリアントブルーで染色された、大腸菌ＢＬ２１株から発現及び精製された組換えＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ４００ｎｇの試料（図１１Ｄ）、図１４Ａに示される全体のゲル画像（図１１Ｅ）、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析され、クマシーブリリアントブルーで染色された、大腸菌ＢＬ２１株から発現及び精製された組換え大腸菌ＴｒｐＲＳ ３００ｎｇの試料（図１１Ｆ）、３分間９８℃に加熱して、又は加熱無しに１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされた、５μＭのＦｐｈ－ＣＭＥ、１μＭのＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ、及び５μＭのＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔの試料（図１１Ｇ）を示し、Ｍはベンチマーク蛍光タンパク質標準である。

一方、ＤＮＡ鋳型を欠く対照実験、又は未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸を用いた対照実験では、産物バンドは存在しなかった（図１２Ａ及び図１２Ｃ参照）。

図１２Ａ～図１２Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による、タンパク質酵素のａａＲＳフリー翻訳の概念の実験的証明の結果を示しており、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされたＮ末端ＦＡＭ標識ニワトリリゾチームのａａＲＳフリー翻訳（Ｍは、ベンチマーク蛍光タンパク質標準を表す）（図１２Ａ）、基質として蛍光標識細菌（ミクロコッカス・リゾデイクティカス）細胞壁材料を用いた、粗ａａＲＳフリー翻訳されたニワトリリゾチームの酵素アッセイ（図１２Ｂ）、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされた、Ｎ末端ＦＡＭ標識ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼのａａＲＳフリー翻訳（図１２Ｃ）、及び基質としてセレンテラジンを用いた、粗ａａＲＳフリー翻訳されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの酵素アッセイ（図１２Ｄ）を示す（ＲＦＵは、相対蛍光単位を表し、ＲＬＵは、相対発光単位を表す）。

これらの結果は、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡが加水分解される前に全長タンパク質の合成を達成するようａａＲＳフリー翻訳は十分に進行性であることを示唆した。液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて、切り取られた産物バンドからａａＲＳフリー翻訳されたタンパク質を特徴付ける試みは、リボソームタンパク質の混入のために成功をおさめなかった。しかしながら、これは、本開示中に記載されるように、分子量がリボソームタンパク質のものとはさらに異なる、より大きなタンパク質を翻訳することによって対処された。次に、翻訳開始のためにＦＡＭ標識Ｆｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔを非標識Ｍｅｔ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔで置き換え、酵素アッセイを実施して、翻訳されたタンパク質がインビトロで正しくフォールディングして、自らの対応する触媒活性を有することができるかどうかを試験した。結果は、フォールディング緩衝液中での２４時間までのインキュベートの後で、ａａＲＳフリー翻訳された酵素がそれらの対応する基質に対する触媒作用を行ったことを示した：ニワトリリゾチームはＦＡＭ標識細胞デブリを放出し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは生物発光を放出したが（図１２Ｂ及び図１２Ｄ参照）、ＤＮＡ鋳型を欠いた、又は未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸を用いた対照実験は検出可能なシグナルを生じず、したがって、自己蛍光、又はａａＲＳフリー翻訳システムからの混入した発光の懸念を最小化している。

ａａＲＳフリー翻訳されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの放出された生物発光を組換えルシフェラーゼの既知の標準と比較すると、約２５ｎＭの翻訳収率が示唆され（図１３参照）、これは７アミノ酸残基ペプチドのａａＲＳフリー翻訳の最大収率よりも約８０倍低かった（図４Ｂを参照）が、これはおそらくは、各翻訳コドンにとってのフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの利用可能度が低いこと、及び複数のジスルフィド結合を有するＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼのフォールディング効率が限られていることの結果である。

図１３は、ａａＲＳフリー翻訳されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの収量推定値を示しており、０、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ及び２５０ｎＭの組換えＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（正方形で示される）を用いて標準曲線がプロットされ、翻訳されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの収量は約２５ｎＭであると推定された（三角形で示される）。

実施例９
ａａＲＳのａａＲＳフリー翻訳
本願発明者は、機能的なａａＲＳ自体を製造するためのａａＲＳフリー翻訳システムの可能性の探求を試みた。これは、自己複製翻訳装置を確立する際の重要なステップである。そのために、３３４アミノ酸残基の大腸菌ＴｒｐＲＳをモデルとして用いた。インビトロ転写されたフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの大部分（合計２１種のうち１４種）をＨＰＬＣによって精製してＭｇ^２＋の持ち越み（carryover）を減少させ（図１０Ａにおける下線付きアミノ酸）、約４２％の全体的な積荷収率及び約１７０μＭの総ｔＲＮＡ濃度を得た（表３を参照）。

本願発明者は、ＦＡＭ標識Ｆｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔレポーターを用いて全長タンパク質の翻訳を試験し、３３４アミノ酸残基の大腸菌ＴｒｐＲＳ（３７．８ｋＤａ）を示す産物バンドがＳＤＳ－ＰＡＧＥによって観察されたが（蛍光標識タンパク質バンドの移動度は組換えＴｒｐＲＳのものと類似していた）（図１１Ｅ及び図１１Ｆ参照）、このバンドは、ＤＮＡ鋳型を欠く、又は未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸を用いる対照実験には存在しなかった（図１４Ａを参照）。

図１４Ａ～図１４Ｃは、ＴｒｐＲＳのａａＲＳフリー翻訳を示しており、１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされたＮ末端ＦＡＭ標識大腸菌ＴｒｐＲＳのａａＲＳフリー翻訳（Ｍは、ベンチマーク蛍光タンパク質標準を表す）（図１４Ａ）、内部Ｃｙ５標識ｔＲＮＡ^Ｔｒｐの配列及び二次構造（図１４Ｂ）、及びＣｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐを基質として用い、８％酸性ＰＡＧＥによって分析され、Ｃｙ５モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンされた粗ａａＲＳフリー翻訳ＴｒｐＲＳの酵素アッセイ（図１４Ｃ）を示す。

また、いくつかのより速く移動するバンドも観察されたが、これらは切断型ＴｒｐＲＳ翻訳産物及び未使用のＦｐｈ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔに対応し得る（図１１Ｇを参照）。

ＴｒｐＲＳのａａＲＳフリー翻訳をさらに確認するために、切り取られた産物バンドからのタンパク質含有量をＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、大腸菌ＴｒｐＲＳから４つの重複しないペプチドセグメントを同定し、約１６％の配列カバレッジとなった。一方、未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸を用いた対照実験では、大腸菌ＴｒｐＲＳに対応するペプチドは検出されなかったが、このことは、検出されたＴｒｐＲＳが内因性ａａＲＳの混入に由来するものではないことを示唆している（表８）。

表８は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる、ａａＲＳフリー翻訳された大腸菌ＴｒｐＲＳの検出されたペプチド配列を示している（大腸菌ＴｒｐＲＳのためのＤＮＡ鋳型を用いたａａＲＳフリー翻訳）。

ａａＲＳフリー翻訳されたＴｒｐＲＳのｔＲＮＡ－アミノアシル化活性をさらに試験するために、内部Ｃｙ５標識ｔＲＮＡ基質（Ｃｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐ、図１４Ｂ参照）を設計し、合成した。

Ｃｙ５標識の設置は、他の積荷済みｔＲＮＡ種からの干渉なしに積荷済みＣｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐのインサイチュ検出を可能にする。翻訳開始のためにＭｅｔ－ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔを用い、ＴｒｐＲＳが翻訳された後、Ｃｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐをトリプトファン及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と共にａａＲＳフリー翻訳システムに添加した。ａａＲＳフリー翻訳されたＴｒｐＲＳは、Ｃｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐ上にトリプトファンを首尾よく積荷した一方、ＤＮＡ鋳型を欠くか、又は未積荷ｔＲＮＡ及び遊離アミノ酸を用いる対照実験では、Ｃｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐ積荷は観察されなかった（図１４Ｃを参照）。このことは、観察されたＣｙ５－ｔＲＮＡ^Ｔｒｐ積荷活性は、リボソーム調製物又は残留フレキシザイム活性からの内因性ａａＲＳ混入によるものである可能性は低いことを示唆している。

実施例１０
鏡像ｔＲＮＡへのａａＲＳフリー積荷
合成鏡像Ｌ－フレキシザイムによる、鏡像Ｌ－ｔＲＮＡへの鏡像Ｄ－アミノ酸の積荷を試験するための概念証明実験として（図３Ａ参照）、本願発明者は、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）Ｐ２ ＤＮＡポリメラーゼＩＶ（Ｄｐｏ４）の設計された変異体の鏡像バージョンに基づく、先に確立された鏡像遺伝子転写システムを適用して、鏡像ｔＲＮＡを転写した（図１５Ａを参照）。

図１５Ａ～図１５Ｂは、Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓによる鏡像ｔＲＮＡ^Ｌｙｓの転写の結果を示しており、合成Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓポリメラーゼによって重合された、Ｌ－ｓｓＤＮＡ鋳型上での５’－ＦＡＭ標識Ｌ－ユニバーサルプライマーの伸長、及び異なる時点で終結させられ、７Ｍ尿素での１２％変性ＰＡＧＥゲルによって分析された反応アリコートを示し（図１５Ａ）、７Ｍ尿素での１０％変性ＰＡＧＥゲルによって分析され、ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）によって染色されたｔＲＮＡ^Ｌｙｓ転写物の鏡像転写及びＩ_２媒介切断を示す（図１５Ｂ）。

２１種の異なるＬ－ＲＮＡプライマーを合成する高いコストを回避するために、本願発明者は、鏡像ｔＲＮＡの転写のためにユニバーサルプライマーを適用した（図１５Ｂを参照）。

完全に伸長したプライマーが以前に報告された機構を介してＩ_２によって効率的に切断されて全長鏡像ｔＲＮＡを製造するように、ユニバーサルプライマーを３’末端付近でホスホロチオエートによって修飾した（図１５Ｂを参照）。この全長鏡像ｔＲＮＡは、予想された通り、天然のＲＮａｓｅ Ａ消化に耐性であり、天然のａａＲＳによって積荷することはできないものであった（図１６Ａ～図１６Ｂを参照）。

図１６Ａ～図１６Ｂは、酵素的に転写された天然ｔＲＮＡ及び鏡像ｔＲＮＡの生化学的特性決定の結果を示しており、酵素的に転写されたＤ－及びＬ－ｔＲＮＡ^ＡｌａのＲＮａｓｅ Ａ消化（図１６Ａ）、及び酵素的に転写されたＤ－及びＬ－ｔＲＮＡ^ＡｌａのＡａＲＳ触媒アミノアシル化（図１６Ｂ）を示す。

Ｉ_２媒介切断は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって検証されるように、ヒドロキシル末端５’－末端を有するＲＮＡを生じる（図１７Ａ～図１７Ｃを参照）。
図１７Ａ～図１７Ｃは、Ｉ_２媒介切断のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を示しており、Ｉ_２によってホスホロチオエート修飾部位で切断された合成ＤＮＡ－ＲＮＡキメラオリゴ（図１７Ａ）、ネガティブリニアモード下での非切断オリゴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトル（図１７Ｂ）、ネガティブリニアモード（ｍ／ｚ＞４０００）及びネガティブリフレクトロンモード（ｍ／ｚ＜４０００）下でのＩ_２で切断されたオリゴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトル（図１７Ｃ）を示し、大文字はＤＮＡヌクレオチドを示し、小文字はＲＮＡヌクレオチドを示し、「＊」はホスホロチオエート修飾を示す。ａ．ｕ．は、任意単位を表し、Ｃ、Ｏはそれぞれ、計算ｍ／ｚ値及び観測ｍ／ｚ値を表す。

次に、化学合成された４６ヌクレオチドのＬ－フレキシザイム（ジニトロ－フレキシザイム）を成功裏に用いて、異なるアミノ酸カテゴリー（それぞれ、極性（Ｌｙｓ）、非極性（Ａｌａ）、アキラル（Ｇｌｙ）及び芳香族（Ｐｈｅ））に属する４つの代表的なＤ－アミノ酸（リジン、アラニン、グリシン及びフェニルアラニン）をそれらの対応する（cognate）鏡像ｔＲＮＡに、天然システムの効率に匹敵する類似の効率で積荷した（図３Ｂ～図３Ｅ）。

実施例１１
カチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いた完全又は部分的な非天然ペプチドの翻訳
ペプチド翻訳のために複数の非天然アミノ酸を取り込むためにフレキシザイムシステムを用いることができると推論され、これは他のａａＲＳタンパク質と組み合わせて、又はそれら無しで用いられる。本発明の規定は、非天然ペプチドを、カチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いて、又は少なくとも、Ｍｇ＋２の濃度が可能な最小レベルまで本質的に低下したフレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの調製物を用いて翻訳することができるかどうか、並びにＨＰＬＣ及び限外濾過などの手段により精製し、及びカチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを濃縮することが、翻訳収率を増加させることができるかどうか、特に翻訳困難なペプチドについて、例えば完全又は部分的な非天然のペプチドについて、翻訳収率を増加させることができるかどうかを試験することを可能にする。翻訳システムにおいては、フレキシザイムによって積荷されていない特定のｔＲＮＡの積荷を増強するために、ａａＲＳタンパク質を添加してもよい（図１８Ａ～図１８Ｂを参照）。

図１８Ａ～図１８Ｂは、カチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いた完全又は部分的な非天然のペプチドのフローチャート翻訳を示しており、インビトロ翻訳システムでのカチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いたペプチド薬及び非天然タンパク質の翻訳（図１８Ａを参照）、及びインビトロ翻訳システムでカチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いた完全又は部分的な非天然タンパク質の翻訳、データ記憶、及びリボソーム／ｍＲＮＡディスプレイ（図１８Ｂを参照）を示す。

この実験では、最初に、非天然アミノ酸が未改変ｔＲＮＡに積み込みされる。非天然アミノ酸としては、これらに限定されないが、Ｄ－アミノ酸及びβ－アミノ酸、例えば、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｃｙｓ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｍｅｔ、Ｄ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｔｙｒ、Ｎ－クロロアセチル－Ｄ－Ｔｙｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｎ－クロロアセチル－Ｄ－Ｔｒｐ、Ｌ－β－ホモメチオニン（β－ｈＭｅｔ）、Ｌ－β－ホモグルタミン（β－ｈＧｌｎ）、Ｌ－β－ホモフェニルグリシン（β－ｈＰｈｇ）、２－アミノシクロヘキサンカルボン酸（２－ＡＣＨＣ）又は２－アミノシクロペンタンカルボン酸（２－ＡＣＰＣ）が挙げられ得る。フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡは、ＨＰＬＣを含むがこれに限定されない、カチオン混入を低減するための技術によって精製される。他の精製技術としては、限外濾過及び透析が挙げられ得る。それから、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを１００～５００μＭに濃縮し、インビトロ翻訳のための基質として用いる。翻訳産物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ及びトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。

概念証明として、ペプチド薬を、ａａＲＳフリー翻訳システムを用いて翻訳する。（図１８Ａを参照）
ペプチド薬のアミノ酸配列は、^ＡｃｙＦＡＹＤＲＲ（２－ＡＣＨＣ）ＬＳＮＮ（２－ＡＣＨＣ）ＲＮＹｃＧ－ＮＨ_２（配列番号１２４）であり、最初のアミノ酸はアセチル－Ｄ－Ｔｙｒであり、最後から２番目のアミノ酸はＤ－Ｃｙｓであり、これはアセチル－Ｄ－Ｔｙｒ残基と環状結合を自発的に形成する。このペプチドは、ヒト第ＸＩＩａ因子を阻害することが以前に示されている。翻訳産物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって分析する。

別の概念証明として、１６９アミノ酸残基のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼなどのタンパク質酵素は、ｔＲＮＡ^Ａｓｎ、ｔＲＮＡ^Ｉｌｅ及びｔＲＮＡ^Ｌｙｓを含むがこれらの限定されない、カチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いて翻訳される（図１８Ａを参照）。それ以外のｔＲＮＡは、組換えａａＲＳタンパク質によって積荷されることになる。さらに、非天然アミノ酸であるフルオレセイン標識フェニルアラニン（Ｆｐｈ）を、フレキシザイムによって開始因子ｔＲＮＡ^ｆＭｅｔに積み込みする。翻訳産物は、生物発光及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを測定することによって分析される。Ｆｐｈ残基はＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で蛍光させるので、それによって翻訳されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの純度は、その蛍光に基づいて容易に決定され得る。この適用は、放射性同位体及び面倒なタンパク質精製手順を必要とせず、翻訳純度のハイスループット分析に有用である。

他のａａＲＳタンパク質と組み合わせて、又はそれらを用いずに使用される、カチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡを用いた完全又は部分的な非天然ペプチドの翻訳は、リボソームディスプレイ及びｍＲＮＡディスプレイなどの選択スキームと組み合わせたペプチド薬の選択、並びにアミノ酸文字を用いた完全又は部分的な非天然ペプチドによるデータ記憶に応用され得る（図１８Ｂを参照）。

実施例１２
Ｌ－フレキシザイムを用いる、酵素的に転写されたＬ－ｔＲＮＡの積荷
図１９Ａ～図１９Ｂは、完全に機能的な、酵素的に転写されたＬ－ｔＲＮＡ分子を、事前に活性化されたアミノ酸で積荷する実験的概念証明の、８％酸性ＰＡＧＥ写真及び分析を示しており、図１９Ａは、酵素的に転写されたＬ－ｔＲＮＡの積荷の結果を示し、図１９Ｂは、合成的に作製されたＬ－ｔＲＮＡの積荷の結果を示す。

図１９Ａ～図１９Ｂに見られるように、バンドシフトは、酵素的に転写されたＬ－ｔＲＮＡが積荷されたときに明らかになるが（図１９Ａ）、一方、市販の合成装置によって調製されたＬ－ｔＲＮＡ上に事前に活性化されたアミノ酸をＬ－フレキシザイムで積荷する場合、バンドシフトは観察されず、積荷されたＬ－ｔＲＮＡ分子を、未積荷ｔＲＮＡ分子と見分けることができない。これはおそらく、合成的に調製されたｔＲＮＡの品質が低いためである。

この実験は、酵素的に転写されたＬ－ｔＲＮＡ分子を得ることの利点を明確に証明しており、Ｌ－フレキシザイムを用いること及びＬ－ＲＮＡ分子を酵素的に転写作製できるＤ－酵素を得ることの利点も明確に示している。

実施例１３
２つ又は３つの連続したＤ－フェニルアラニンを含むペプチドの翻訳
カチオン枯渇ｔＲＮＡの濃度を増加させることの効果、及びそれがＤ－アミノ酸などの難易度が高い非天然アミノ酸の翻訳収率を改善できるかどうかを検証するために、本願発明者は、短ペプチド（ｍＲＮＡ＃７）：Ｆｐｈ－ＫＫＫ^ＤＦ^ＤＦＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２７）を翻訳することを試み、そのフルオレセイン標識Ｌ－フェニルアラニン（Ｆｐｈ）及びＬ－リジン（Ｋ）をそれらの対応する（cognate）ｔＲＮＡ上にフレキシザイムによって積み込みし、一方、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）及びＬ－チロシン（Ｙ）をそれらの対応する（cognate）ｔＲＮＡ上にａａＲＳによって積荷した（それぞれＡｓｐＲＳ及びＴｒｙＲＳ）。

以下の表９は、ｍＲＮＡ＃７～ｍＲＮＡ＃１０のインビトロ翻訳のためのｔＲＮＡ配列を示す。

Ｋａｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．［「Ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，２４，ｐｐ．４６－５４］の教示に従って、Ｄ－フェニルアラニン（^ＤＦ）を、Ｄ－アミノ酸取り込みのために最適化された配列を有する改変ｔＲＮＡであるｔＲＮＡ^{ＧｌｕＥ２} _ＣＵＡ（表９を参照）に、フレキシザイムによって積み込みした（^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡ^{ＧｌｕＥ２} _ＣＵＡ）。このペプチドは２つの連続したＤ－フェニルアラニンを含有しているが、これは、同じ配列のペプチドであるが２つの連続したＬ－フェニルアラニンを含有するペプチドと比較して、翻訳が困難で、収率は１５％未満であることが先に示されている［Ａｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ｏｕｔｗｉｔｔｉｎｇ ＥＦ－Ｔｕ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ：ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５，４３，ｐｐ．５６８７－５６９８］。本願発明者は、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡのアンチコドンとワトソン・クリック塩基対を形成することが可能なｍＲＮＡ＃７を設計し、インビトロ転写した（表１０を参照）。

以下の表１０は、ｍＲＮＡ＃７～ｍＲＮＡ＃１０のインビトロ翻訳のためのＤＮＡ鋳型配列を示す。

本願発明者は、インビトロ翻訳のために、２０μＭ又は２００μＭのカチオン枯渇^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡ^{ＧｌｕＥ２} _ＣＵＡを添加した。両方の翻訳反応では、積荷済みｔＲＮＡによる全体的なＭｇ^２＋の持ち越み（carryover）は、本開示に提案されるインビトロ翻訳システムのＭｇ^２＋許容量の限界内（＜１００ｍＭ Ｍｇ^２＋）となるよう制御された。本願発明者はまた、対照として、フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡ^Ｐｈｅ（^ＬＰｈｅ－ｔＲＮＡ^Ｐｈｅ）を用いてｍＲＮＡ＃８（Ｆｐｈ－^ＬＫ^ＬＫ^ＬＫ－^ＬＦ^ＬＦ^ＬＦ－^ＬＤ^ＬＹ^ＬＫ^ＬＤ^ＬＤ^ＬＤ^ＬＤ^ＬＫ（配列番号１２９）（表１０を参照）を並行して翻訳した。

翻訳反応を３７℃で２時間インキュベートし、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ及び２０％トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ結果は、ｍＲＮＡ＃７における２つの連続したＤ－フェニルアラニンの正確な取り込みを示す（図２０Ａ）。しかし、質量ピークは、２００μＭの^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡ^{ＧｌｕＥ２} _ＣＵＡを含む試料においてのみ検出することができ、２０μＭの^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡ^{ＧｌｕＥ２} _ＣＵＡを含む試料においてはできなかった（図２０Ａ）。一方、対照実験では、正確な質量ピークを２０μＭの^ＬＰｈｅ－ｔＲＮＡ^Ｐｈｅを含む試料において検出することができたが、未積荷ｔＲＮＡ^Ｐｈｅのみを含む試料においてはできなかった。さらに、トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、２００μＭの^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡ^{ＧｌｕＥ２} _ＣＵＡを用いた場合のｍＲＮＡ＃７の翻訳収率が、２０μＭの^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡ^{ＧｌｕＥ２} _ＣＵＡを用いた場合の当該翻訳収率よりも約２倍高く、２０μＭの^ＬＰｈｅ－ｔＲＮＡ^Ｐｈｅを用いた対照と類似していたことを示している。

図２０Ａ～図２０Ｃは、２つの連続したＤ－フェニルアラニンを含有する短ペプチドのインビトロ翻訳の結果を示している。図２０Ａは、ｍＲＮＡ＃７からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を示し、図２０Ｂは、ｍＲＮＡ＃８からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を示し、図２０Ｃは、未積荷ｔＲＮＡＰｈｅのみ（ｍＲＮＡ＃７）、２０μＭのＬＰｈｅ－ｔＲＮＡＰｈｅ（ｍＲＮＡ＃７）、２０μＭのＤｐｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡ（ｍＲＮＡ＃８）、又は２００μＭのＤｐｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡ（ｍＲＮＡ＃８）を用いた場合のｍＲＮＡ＃７又はｍＲＮＡ＃８の翻訳産物のトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であって、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンしたものを示す。

２つの連続するＤ－フェニルアラニンを有するｍＲＮＡ＃７の成功した翻訳に励まされて、本願発明者は、ｍＲＮＡ＃９を３つの連続するＤ－フェニルアラニンを有する短ペプチドＦｐｈ－ＫＫＫ^ＤＦ^ＤＦ^ＤＦＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２７）へと翻訳した（表１０を参照）。３つの連続したＤ－フェニルアラニンを有する短ペプチドを翻訳する以前の試みは、同じ配列のペプチドであるが３つの連続したＬ－フェニルアラニンを含有するペプチドと比較して５％未満の収率を示した［Ａｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．、２０１５］。本願発明者は、インビトロ翻訳のために３０μＭ又は３００μＭのカチオン枯渇^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２_ＣＵＡを添加し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ及び２０％トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって翻訳反応を分析した。両方の翻訳反応では、積荷済みｔＲＮＡによる全体的なＭｇ^２＋の持ち越み（carryover）は、本開示に提案されるインビトロ翻訳システムのＭｇ^２＋許容量の限界内（＜１００ｍＭ Ｍｇ^２＋）となるよう制御された。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳの結果は、ｍＲＮＡ＃９における３つの連続したＤ－フェニルアラニンの正確な取り込みを示す（図２１Ａ）。さらに、トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、３００μＭの^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２_ＣＵＡを用いた場合のｍＲＮＡ＃９の翻訳収率が、３０μＭの^ＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２_ＣＵＡを用いた場合の当該翻訳収率よりも約２倍高く、３０μＭの^ＬＰｈｅ－ｔＲＮＡ_Ｐｈｅを用いた対照と類似していたことを示している（図２１Ｂ）。

図２１Ａ～図２１Ｂは、３つの連続したＤ－フェニルアラニンを含有する短ペプチドのインビトロ翻訳の結果を示しており、図２１Ａは、ｍＲＮＡ＃９からの翻訳された短ペプチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を示し、図２１Ｂは、未積荷ｔＲＮＡＰｈｅのみ、３０μＭのＬＰｈｅ－ｔＲＮＡＰｈｅ、３０μＭのＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡ、又は３００μＭのＤＰｈｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡを含むｍＲＮＡ＃９の翻訳産物のトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であって、Ｃｙ２モード下でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってスキャンしたものを示す。

まとめると、これらの結果は、カチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの濃度を約２０～３０μＭから約２００～３００μＭに増加させることによって、Ｄ－アミノ酸（３つまでの連続したＤ－フェニルアラニン）の取り込み効率が著しく改善されたことを示唆している。

実施例１４
３つの連続したβ－アミノ酸を含むペプチドの翻訳
カチオン枯渇ｔＲＮＡの濃度を増加させることでβ－アミノ酸の翻訳収率を改善できるかどうかを試験するために、本願発明者は短ペプチド（ｍＲＮＡ＃１０）：Ｆｐｈ－ＫＫＫ^βＱ^βＱ^βＱＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２９）を翻訳することを試みた（表１０を参照）。本願発明者は、インビトロ翻訳のために３０μＭ又は３００μＭのカチオン枯渇^βＱ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２_ＣＵＡを添加し、２０％トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって翻訳反応を分析した。

両方の翻訳反応において、積荷済みｔＲＮＡによる全体的なＭｇ^２＋の持ち越み（carryover）は、本開示に提案されるインビトロ翻訳システムのＭｇ^２＋許容量の限界内（１００ｍＭ未満のＭｇ^２＋）となるよう制御された。全長翻訳産物がそれらの切断型翻訳産物から分離されるように、翻訳産物をＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２磁気ビーズ（Ｓｉｇｍａ）によって精製した。

トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、３００μＭのβＧｌｎ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２_ＣＵＡを用いた場合のｍＲＮＡ＃１０の翻訳収率が、３０μＭの^βＧｌｎ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２_ＣＵＡを用いた場合の当該翻訳収率よりもわずかに高かったことを示している（図２２）。

図２２は、３つの連続したβ－Ｇｌｎを含有する短ペプチドのインビトロ翻訳の結果を示しており、未積荷ｔＲＮＡのみ、３０μＭのβＧｌｎ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡ、又は３００μＭのβＧｌｎ－ｔＲＮＡＧｌｕＥ２ＣＵＡを用いた場合のｍＲＮＡ＃１０の翻訳産物のトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であって、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００によってＣｙ２モード下でスキャンされたものを示す。

まとめると、これらの結果は、カチオン枯渇フレキシザイム積荷済みｔＲＮＡの濃度を約３０μＭから約３００μＭに増加させることによって、β－アミノ酸（３つまでの連続したβ－Ｇｌｎ）の取り込み効率が改善されたことを示唆している。

本発明をその特定の実施形態との関連で説明してきたが、多くの代替形態、修正形態及び変形形態が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神及び広い範囲に含まれる全てのそのような代替形態、修正形態及び変形形態を包含することが意図されている。

本開示に言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により本開示に取り込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、その全体が参照により本開示に取り込まれる。さらに、本出願におけるいずれの参考文献の引用又は特定も、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めたものとして解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用される限り、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。

さらに、本出願のいずれの優先権書類も、その全体が参照により本開示に取り込まれる。

図６Ａ～図６Ｅは、ａａＲＳフリー翻訳収率を計算するためのトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を示しており、ａａＲＳフリー翻訳収率を計算するための、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄに対応するゲル画像（それぞれ図６Ａ～図６Ｅ）を示している。「Ｍ」は、合成ペプチド標準を表す（Ｆｐｈ－Ｋ－Ｙ－Ｄ－Ｋ－Ｙ－Ｄ）。

Claims (31)

1. タンパク質を製造するためのシステムであって、
   前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子；
   複数の積荷済みｔＲＮＡ分子；及び
   無細胞翻訳ミックス
   を含み、
   前記システムにおけるＭｇ^＋２の濃度が１００ｍＭ未満である、
   前記システム。
2. アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを本質的に欠く、請求書１に記載のシステム。
3. 前記積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度が６０μＭ超である、請求項１～２のいずれか１項に記載のシステム。
4. 前記積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度が１６０μＭ超であり、Ｍｇ^＋２の前記濃度が１００ｍＭ未満である、請求書３に記載のシステム。
5. 前記複数の積荷済みｔＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのｔＲＮＡ分子が、フレキシザイムによって積荷される、請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。
6. 前記ｔＲＮＡ分子に、非天然アミノ酸残基が積荷される、請求項５に記載のシステム。
7. 前記非天然アミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基である、請求項６に記載のシステム。
8. 前記ｔＲＮＡ分子がＬ－リボ核酸残基を含む（Ｌ－ｔＲＮＡ）、請求項７に記載のシステム。
9. 前記Ｌ－ｔＲＮＡがＤ－ポリメラーゼを用いて調製される、請求項８に記載のシステム。
10. 前記Ｄ－ポリメラーゼが、Ｄｐｏ４の鏡像タンパク質（Ｄ－Ｄｐｏ４）である、請求項９に記載のシステム。
11. 前記Ｄ－Ｄｐｏ４がＤ－Ｄｐｏ４－５ｍ－Ｙ１２Ｓである、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記フレキシザイムがＬ－リボ核酸残基を含む（Ｌ－フレキシザイム）、請求項７～１１のいずれか１項に記載のシステム。
13. 前記タンパク質が、活性Ｌタンパク質酵素及び活性Ｄタンパク質酵素からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか１項に記載のシステム。
14. 前記濃度以下のＭｇ^＋２を有する前記複数の積荷済みｔＲＮＡ分子を準備すること；及び
    前記複数の積荷済みｔＲＮＡ分子を、前記タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡ分子と前記無細胞翻訳ミックス中で接触させ、それにより前記タンパク質を得ること
    を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のシステムを用いてタンパク質を製造する方法。
15. 前記準備することが、前記接触の前に、前記Ｍｇ^＋２の濃度を調整することを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記調整することが、クロマトグラフィー、アルコール沈殿及びペレット洗浄、限外濾過、並びに透析からなる群から選択される技術を用いることを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記準備することが、前記積荷済みｔＲＮＡ分子を、ａａＲＳを含むタンパク質翻訳システムにおける積荷済みｔＲＮＡ濃度の２倍を超える濃度に調整することをさらに含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記積荷済みｔＲＮＡ分子の濃度が１６０μＭ超である、請求項１７に記載の方法。
19. Ｌ－ｔＲＮＡにＤ－アミノ酸を積み込みする方法であって、
    Ｄ－ポリメラーゼを用いて前記Ｌ－ｔＲＮＡ分子を調製すること；
    活性化Ｄ－アミノ酸を準備すること；
    Ｌ－アミノアシル化リボザイムを準備すること；及び
    前記Ｌ－ｔＲＮＡ、前記Ｌ－アミノアシル化リボザイム、及び前記活性化Ｄ－アミノ酸を接触させ、それによってＤ－アミノ酸積み込みＬ－ｔＲＮＡ分子を得ること、
    を含む、前記方法。
20. 前記Ｄ－アミノ酸積み込みＬ－ｔＲＮＡ分子の反応混合物のＰＡＧＥ分析が、積荷済みｔＲＮＡ種の個別（distinct）のピーク及び非積荷済みｔＲＮＡ種の個別（distinct）のピークを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
21. 前記Ｌ－アミノアシル化リボザイムがＬ－フレキシザイムである、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. Ｌ－リボヌクレオチド残基を含む、Ｌ－フレキシザイム。
23. Ｌ－リボヌクレオチド残基を５０％以上含む、請求項２２に記載のＬ－フレキシザイム。
24. Ｌ－リボヌクレオチド残基からなる、請求項２２に記載のＬ－フレキシザイム。
25. ５’－ｇｇａｕｃｇａａａｇａｕｕｕｃｃｇｃａｕｃｃｃｃｇａａａｇｇｇｕａｃａｕｇｇｃｇｕｕａｇｇｕ－３’と８０％以上の同一性を示す配列を有する、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のＬ－フレキシザイム。
26. 請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法によって調製されたタンパク質。
27. 少なくとも１つの非標準アミノ酸残基を含むタンパク質、少なくとも１つのＤ－アミノ酸残基を含むタンパク質、Ｌ－タンパク質、及びＤ－タンパク質からなる群から選択される、請求項２６に記載のタンパク質。
28. ニワトリリゾチーム、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、及び大腸菌ＴｒｐＲＳからなる群から選択される、請求項２７に記載のタンパク質。
29. テキスト情報及び／又は数値情報及び／又はデジタル情報にデコードすることができる配列を有し、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を含む、請求項２６に記載のタンパク質。
30. ｍＲＮＡ＃６によってコードされる、請求項２９に記載のタンパク質。
31. 請求項１４～２１のいずれか１項に記載の方法によって得られる、ランダム化又は部分的にランダム化されたペプチドのライブラリであって、前記ペプチドの少なくとも１つが、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、前記ライブラリ。