CN117120608A - 蛋白翻译系统 - Google Patents
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Abstract
本文提供了无细胞和无aaRS的蛋白翻译系统，以及其在蛋白和活性酶的生产中的用途。
Description
相关申请
本申请要求2021年2月18日提交的美国临时专利申请No.63/150,641的权益，该临时专利申请的内容通过全文引用并入本文。
序列表声明
与本申请同时提交的ASCII文件(命名为90912Sequence Listing.txt，于2022年2月16日创建，包含36,864字节)通过引用并入本文。
发明领域和背景
在一些实施方案中，本发明涉及无细胞的蛋白翻译系统，且更具体地但非排他地涉及合成蛋白及其镜像对应物的无氨酰基-tRNA合成酶方法及其用途。
无细胞蛋白合成是基础和应用科学中分子生物学家的重要工具。它越来越多地用于高通量功能基因组学和蛋白组学中，与活细胞中的蛋白表达相比具有显著优势。无细胞蛋白合成对于蛋白阵列(例如核酸可编程蛋白阵列(NAPPA))的产生和使用展示技术的酶工程至关重要。无细胞方法提供了将表型(表达的蛋白的功能)与基因型进行关联的最快方法。在翻译系统中使用mRNA模板或在偶联的转录和翻译系统中使用DNA模板(质粒DNA或PCR片段)，可以在几个小时内进行蛋白合成。此外，无细胞蛋白表达系统对于毒性蛋白、膜蛋白、病毒蛋白的表达和对于通过细胞内蛋白酶进行迅速蛋白水解降解的蛋白是必不可少的。
大多数无细胞蛋白表达基于裂解物，其是由参与高蛋白合成速率的细胞产生的。最常用的无细胞表达系统需要用于翻译的大分子成分，例如核糖体、tRNA、氨酰基-tRNA合成酶、起始、延伸和终止因子。为了确保有效的翻译，商业提取物中必须补充氨基酸、能量源(ATP、GTP)、能量再生系统和盐(Mg2+、K+等)。对于真核系统，磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶作为能量再生系统，而原核生物系统补充有磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶。偶联的转录和翻译系统补充有噬菌体衍生的RNA聚合酶，其允许克隆到聚合酶启动子下游的基因的表达。
蛋白酶的出现是从基于RNA的生命过渡到当代生物学的关键。tRNA-氨酰化核酶的发现表明从具有通过核酶装载的tRNA的高度简化的翻译系统合成蛋白酶的可能性。同时，也已经报道了使用由aaRS、urzyme和化学酰化制备的预装载的tRNA的其他系统。其中，通过体外选择发现的一种高度强力和多功能的tRNA-氨酰化核酶系统(称为flexizyme)已显示能够将多种氨基酸装载到tRNA。通过flexizyme和aaRS装载tRNA，实现了将多种非天然将氨基酸掺入翻译的肽，使得肽药物的实际选择成为可能。但是，部分由于翻译产量低，在不存在aaRS的情况下(以下称为“无aaRS”)仅使用flexizyme装载的tRNA时，只有短肽被翻译(长度少于7个氨基酸残基)，而到目前为止，在无aaRS条件下，具有全部20个蛋白原性氨基酸的全长功能蛋白酶的核糖体产生尚未得到证实。
Terasaka,N.et al.[Terasaka,N.,Hayashi,G.,Katoh,T.,and Suga,H.(2014).An orthogonal ribosome-tRNA pair via engineering ofthe peptidyl transferasecenter.Nat.Chem.Biol.10,555-557]报道了使用具有补偿性突变的rRNA和tRNA对的工程化系统，其专门使用与天然存在的遗传密码不同地程序化的遗传密码，并且因此能够合成与野生型对应物正交的肽。通过这些翻译机制，单个mRNA根据人工程序化的遗传密码产生两个不同的肽。
发明概述
本发明的方面涉及无细胞和无aaRS的蛋白翻译/表达/合成系统和方法及其用途。本公开内容通过改善翻译产量(其是通过降低Mg2+浓度和增加tRNA浓度)，仅使用flexizyme装载的tRNA，提供了多种蛋白，包括具有不同功能的活性酶的成功翻译。展示了无aaRS的翻译系统，该系统产生活性aaRS(TrpRS)，其进而催化更多tRNA的装载。另外，展示了通过合成的L-flexizyme用D-氨基酸装载的镜像tRNA。本公开内容展示了从没有aaRS的高度简化的翻译装置翻译蛋白酶的可行性，并且对于实现镜像翻译，放宽了化学合成数十种大aaRS蛋白的需要。当与或不与其他aaRS蛋白结合使用时，阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA可用于完整或部分非天然肽的翻译。
因此，根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了用于生产蛋白的系统，该系统包括：
编码蛋白的mRNA分子；
多个装载的tRNA分子；和
无细胞的翻译混合物，
其中所述系统中Mg+2的浓度低于100mM。
根据一些实施方案，所述系统基本上没有氨酰基tRNA合成酶。
根据一些实施方案，所述装载的tRNA分子的浓度大于60μM。
根据一些实施方案，所述装载的tRNA分子的浓度大于160μM，并且Mg+2的浓度远低于100mM。
根据一些实施方案，所述多个装载的tRNA分子中的至少一个tRNA分子由flexizyme装载。
根据一些实施方案，所述tRNA分子用非天然氨基酸残基装载。
根据一些实施方案，所述非天然氨基酸残基是D-氨基酸残基。
根据一些实施方案，所述tRNA分子包含L-核糖核酸残基(L-tRNA)。
根据一些实施方案，使用D-聚合酶制备L-tRNA。
根据一些实施方案，所述D-聚合酶是Dpo4的镜像蛋白(D-Dpo4)。
根据一些实施方案，所述D-Dpo4是D-Dpo4-5m-Y12S(SEQ IDNo.126)。
根据一些实施方案，所述flexizyme包含L-核糖核酸残基(L-flexizyme)。
根据一些实施方案，所述蛋白选自活性L蛋白酶和活性D蛋白酶。
根据本发明的一些实施方案的另一方面，提供了使用本文提供的系统生产蛋白的方法，该方法包括：
提供多个具有不超过所述Mg+2浓度的装载的tRNA分子；和
使所述装载的tRNA分子与编码蛋白的mRNA分子在无细胞翻译混合物中接触，从而获得蛋白。
根据一些实施方案，所述方法中使用的系统基本上没有氨酰基tRNA合成酶。
根据一些实施方案，提供多个装载的tRNA分子包括，在接触步骤之前，调节(降低或耗尽)Mg+2的浓度。
根据一些实施方案，调节Mg+2的浓度包括使用诸如，例如色谱法、醇沉淀和沉淀物洗涤、超滤和渗析的技术。
根据一些实施方案，提供多个装载的tRNA分子包括进一步包括将装载的tRNA分子的浓度调节至大于包括aaRS酶的其他蛋白翻译系统中的装载的tRNA浓度的2倍的浓度。
根据一些实施方案，装载的tRNA分子的浓度大于160μM。
根据本发明的一些实施方案的另一方面，提供了用D-氨基酸装载L-tRNA的方法，该方法通过以下步骤实现：
用D-聚合酶制备L-tRNA分子；
提供活化的D-氨基酸；
提供L-氨酰化核酶；和
使所述L-tRNA、所述L-氨酰化核酶和所述活化的D-氨基酸接触，从而获得D-氨基酸装载的L-tRNA分子。
根据一些实施方案，所述L-氨基酰化核酶是L-flexizyme。
根据一些实施方案，可以通过D-氨基酸装载的L-tRNA分子的反应混合物的PAGE分析来分析所述方法，其中PAGE凝胶的特征在于装载的tRNA种类的独特峰和未装载的tRNA种类的独特峰。
根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了包括L-核糖核苷酸残基的L-flexizyme。
在一些实施方案中，L-flexizyme包含至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的L-核糖核苷酸残基。
在一些实施方案中，L-flexizyme由L-核糖核苷酸残基组成。
在一些实施方案中，L-flexizyme具有与5'-ggaucgaaagauuuccgcauccccgaaaggguacauggcguuaggu-3'(SEQ ID No.82)显示至少80％同一性的序列。
根据本发明的一些实施方案的另一方面，提供了通过本文提供的方法制备的蛋白。
在一些实施方案中，所述蛋白选自包含至少一个非规范性氨基酸残基的蛋白、包含至少一个D-氨基酸残基的蛋白、L蛋白和D蛋白。
在一些实施方案中，所述蛋白选自鸡溶菌酶、Gaussia荧光素酶和大肠杆菌TrpRS。
在一些实施方案中，所述蛋白具有可被解码为文本和/或数字信息的序列，并且包含天然氨基酸和/或非天然氨基酸。
在一些实施方案中，所述蛋白由mRNA#6编码。
根据本发明一些实施方案的另一方面，提供了通过提供的方法获得的随机化或部分随机化的肽的文库，其中至少所述肽包含至少一个非天然氨基酸。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践或测试，但是下面描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并且并非意图一定是限制性的。
附图的几个视图的简要说明
本文仅通过示例的方式，参考附图描述了本发明的一些实施方案。现在具体地详细参考附图，要强调的是，所示出的细节是示例性的，并且用于说明性讨论本发明的实施方案的目的。在这方面，附图的说明使得本领域技术人员能够明白可以如何实践本发明的实施方案。
在图中：
图1显示本发明的一些方面，并且特别是使用flexizyme装载的tRNA(10)的无aaRS的蛋白翻译的示意性概述说明，其中tRNA 11由flexizyme系统12装载，产生装载的tRNA 13的群体，其代表用于蛋白酶的翻译的蛋白原性氨基酸，并且包括步骤14a，其中装载的tRNA通过HPLC纯化以减少Mg2+14b污染，并且包括步骤15，其中浓缩装载的tRNA 13，用于将核糖体17中的mRNA 16无aaRS翻译为翻译的多肽18，其可以折叠成活性蛋白酶19a，包括aaRS19b，其可以用于装载tRNA以完成循环；
图2显示HPLC纯化之前和之后tRNA装载产量的酸性PAGE分析，其中“U”代表未装载的tRNA，“C”代表粗制的装载的tRNA，“P”代表纯化的装载的tRNA，而tRNA装载产量由软件包IMAGEJ使用装载的tRNA相对于总tRNA的积分峰面积确定；
图3A-E显示根据本发明的一些实施方案，从tRNA的flexizyme装载至镜像tRNA的无aaRS装载途中的概念和结果，显示由D-flexizyme催化的D-tRNA装载，及其镜像形式，由L-flexizyme(PDB来源:1EHZ(tRNA),3CUL(flexizyme)催化的镜像tRNA装载(图3A),L-flexizyme将D-丙氨酸装载到酶促转录的镜像tRNAAla上，并且显示天然手性对应物用于比较(图3B)，L-flexizyme将甘氨酸装载到酶促转录的镜像tRNAGly上，并且显示天然手性对应物用于比较(图3C)，L-flexizyme将D-赖氨酸装载到酶促转录的镜像tRNALys上，并且显示天然手性对应物用于比较(图3D)，L-flexizyme将D-苯丙氨酸装载到酶促转录的镜像tRNAPhe上，并且显示天然手性对应物用于比较(图3E)，而tRNA装载产量使用软件包IMAGEJ，使用装载的tRNA相对于总tRNA的积分峰面积确定；
图4A-G显示根据本发明的一些实施方案的多个短肽的无aaRS翻译的结果，显示来自mRNA#1的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析(图4A)，通过Tricine-SDS-PAGE分析的短肽的无aaRS的翻译产量，显示未装载的tRNA浓度范围为160-540μM，而flexizyme装载的tRNA浓度保持在70μM，导致装载产量范围为44-13％(图4B的上部)，并且总tRNA浓度范围为16-1003μM，而装载产量保持在56％(图4B的下部)(误差柱代表来自三个独立实验的标准差)，来自mRNA#2(图4C)，mRNA#3(图4D)，mRNA#4(图4E)，mRNA#5(图4F)和mRNA#6(图4G)的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析；
图5A-D显示在各种条件下mRNA#1的无aaRS翻译的结果，显示总tRNA浓度范围为20-644μM，而装载产量保持在44％(图5A)，总flexizyme浓度范围为240-525μM，而总tRNA浓度保持在160μM(图5B)，将flexizyme和0-380μM的未装载的tRNA混入(图5C)10mM MgCl2和(图5D)100mM MgCl2中，通过乙醇沉淀法脱盐，并添加到无aaRS的翻译混合物中，其中flexizyme装载的tRNA的浓度保持在70μM(误差柱，来自三个独立实验的标准差)；
图6A-E显示用于计算无aaRS翻译产量的tricine-SDS-PAGE凝胶分析，显示对应于图4B、图5A、图5B、图5C和图D的凝胶图像(分别为图6A-E)，其用于计算无aaRS翻译产量，其中“M”为合成肽标准品(Fph-K-Y-D-K-Y-D(SEQ ID No.125))。
图7A-B显示在LysRS、TyrRS和AspRS存在下的体外翻译实验的结果，显示在LysRS、TyrRS和AspRS存在下使用范围为22-680μM的未装载、未修饰的总tRNA浓度的翻译产物以及由增强的flexizyme预先装载的Fph-tRNAfMet的Tricine-SDS-PAGE分析(图7A)和计算的翻译产量(图7B)(误差柱，来自三个独立实验的标准偏差)；
图8A-B显示使用它们的关连蛋白原性氨基酸对21个tRNA的flexizyme装载产量，显示乙醇沉淀后测定的装载产量(图8A)，以及14个flexizyme装载的tRNA的HPLC纯化后测定的装载产量。N/A，未进行flexizyme装载的tRNA的纯化(图8B)。
图9显示无aaRS翻译的mRNA#6的MALDI-TOF MS分析，显示在无aaRS的翻译系统中具有较高的总tRNA浓度(520μM)时，观察到错误翻译的产物，其分子量为2,252.7Da，而正确翻译的产物的M.W.为2,240.7Da。a.u.，任意单位；C，O：分别为计算和观察到的m/z值；
图10A-C显示无aaRS翻译的蛋白酶：鸡溶菌酶(图10A)、Gaussia荧光素酶(图10B)和大肠杆菌TrpRS(图10C)的氨基酸序列，而由flexizyme装载的tRNA翻译的位置通过乙醇沉淀或通过HPLC(下划线)纯化；
图11A-G显示无aaRS翻译的蛋白酶的SDS-PAGE分析，显示在图12A中显示的整个凝胶图像(图11A)，在15％SDS-PAGE中分析，并用考马斯亮蓝染色的从鸡蛋清纯化的400ng商业鸡溶菌酶的样品(图11B)，在图12C中显示的整个凝胶图像(图11C)，在15％SDS-PAGE中分析，并用考马斯亮蓝染色的从大肠杆菌菌株BL21表达和纯化的400ng重组Gaussia荧光素酶的样品(图11D)，在图14A中显示的整个凝胶图像(图11E)，在15％SDS-PAGE中分析，并用考马斯亮蓝染色的从大肠杆菌菌株BL21表达和纯化的300ng重组大肠杆菌TrpRS的样品(图11F)，和通过15％SDS-PAGE分析(加热或不加热至98℃持续3分钟)并且通过Typhoon FLA9500在Cy2模式下扫描的5μMFph-CME、1μMFph-tRNAfMe和5μMFph-tRNAfMet的样品(图11G)，其中M是基准荧光蛋白标准品。
图12A-D显示根据本发明的一些实施方案的蛋白酶的无aaRS翻译的概念的实验证明的结果，其显示通过15％SDS-PAGE分析并且通过Typhoon FLA 9500在Cy2模式下扫描的N末端FAM标记的鸡溶菌酶的无aaRS翻译(M代表基准荧光蛋白标准品)(图12A)，以荧光标记的细菌(溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus))细胞壁材料为底物，对粗制无aaRS翻译的鸡溶菌酶进行的酶促测定(图12B)，通过15％SDS-PAGE分析并且通过Typhoon FLA9500在Cy2模式下扫描的N末端FAM标记的Gaussia荧光素酶的无aaRS翻译(图12C)，以及以腔肠素为底物，对粗制无aaRS翻译的Gaussia荧光素酶的酶促测定(图12D)(RFU，相对荧光单位，RLU，相对发光单位)；
图13显示无aaRS翻译的Gaussia荧光素酶的产量估计值，其中使用0、25nM，50nM，100nM和250nM的重组Gaussia荧光素酶绘制标准曲线(以正方形表示)，并且翻译的Gaussia荧光素酶的产量估计为约25nM(以三角形表示)；
图14A-C显示TrpRS的无aaRS翻译，显示通过15％SDS-PAGE分析并且通过TyphoonFLA 9500在Cy2模式下扫描的N末端FAM标记的大肠杆菌TrpRS的无aaRS翻译(M代表基准荧光蛋白标准品)(图14A)，内部Cy5标记的tRNATrp的序列和二级结构(图14B)，以及通过8％酸性PAGE并且通过Typhoon FLA 9500在Cy2模式下扫描的，以Cy5-tRNATrp为底物的粗制无aaRS翻译的TrpRS的酶促测定(图14C)；
图15A-B显示通过D-Dpo4-5m-Y12S对镜像tRNALys的转录结果，显示由合成的D-Dpo4-5m-Y12S聚合酶聚合的5'-FAM标记的L-通用引物在L-ssDNA模板上的延伸，以及在不同时间点终止并通过在7M尿素中的12％变性PAGE凝胶进行分析的反应等分试样(图15A)，并显示镜像转录和tRNALys转录物的I2介导的切割，其通过在7M尿素中的10％变性PAGE凝胶分析，并通过Thermo Fisher Scientific,MA,U.S的SYBR-Green II染色(图15B)；
图16A-B显示酶促转录的天然和镜像tRNA的生物化学表征的结果，显示酶促转录的D-和L-tRNAAla的RNA酶A消化(图16A)，以及酶促转录的D-和tRNAAla的AaRS催化的氨酰化(图16B)；
图17A-C显示对I2介导的切割的MALDI-TOF MS分析，显示在硫代磷酸酯修饰位点通过I2切割的合成DNA-RNA嵌合寡核苷酸(图17A)，未切割的寡核苷酸在负线性模式下的MALDI-TOF MS光谱(图17B)，I2切割的寡核苷酸在负线性模式(m/z>4000)和负反射电子模式(m/z<4000)下的MALDI-TOF MS光谱(图17C)，其中大写字母表示DNA核苷酸，小写字母表示RNA核苷酸，“*”表示硫代磷酸酯修饰。a.u.，任意单位；C，O：分别为计算和观察到的m/z值；
图18A-B显示使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA的完整或部分非天然肽的翻译，显示在体外翻译系统中使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA对肽药物和非天然蛋白的翻译(图18A)，以及在体外翻译系统中使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA对完全或部分非天然蛋白的翻译、数据存储和核糖体/mRNA展示(图18B)；
图19A-B显示8％酸性PAGE照片，以及使用预先活化的氨基酸装载完全功能性L-tRNA分子的实验性的概念验证，所述分子通过镜像酶(D-Dpo4-5m-Y12S)酶促转录，其中图19A显示装载酶促转录的L-tRNA的结果，并且图19B显示装载合成产生的L-tRNA的结果；
图20A-C显示含有两个连续D-苯丙氨酸的短肽的体外翻译结果，其中图20A显示来自mRNA#7的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析，图20B显示来自mRNA#8的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析，并且图20C显示使用仅未装载的tRNAPhe(mRNA#7)、20μM LPhe-tRNAPhe(mRNA#7)、20μM DPhe-tRNAGluE2CUA(mRNA#8)，或200μM DPhe-tRNAGluE2CUA(mRNA#8)的mRNA#7或mRNA#8的翻译产物的Tricine-SDS-PAGE分析，由Typhoon FLA 9500在Cy2模式下扫描；
图21A-B显示含有三个连续D-苯丙氨酸的短肽的体外翻译结果，其中图21A显示来自mRNA#9的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析，并且图21B显示使用仅未装载的tRNAPhe、30μM LPhe-tRNAPhe、30μM DPhe-tRNAGluE2CUA或300μM DPhe-tRNAGluE2CUA的mRNA#9的翻译产物的Tricine-SDS-PAGE分析，通过Typhoon FLA 9500在Cy2模式下扫描；和
图22显示含有三个连续β-Gln的短肽的体外翻译结果，显示使用仅未装载的tRNA、30μMβGln-tRNAGluE2CUA或300μMβGln-tRNAGluE2CUA的mRNA#10翻译产物的Tricine-SDS-PAGE分析，由Typhoon FLA 9500在Cy2模式下扫描。
本发明的一些具体实施方案的描述
在一些实施方案中，本发明涉及无细胞的蛋白翻译系统，且更具体地但非排他地涉及合成蛋白及其镜像对应物的无氨酰基-tRNA合成酶方法及其用途。
参考附图和随附的说明可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明的应用并不一定限于以下说明书中阐述的或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其他实施方案，或者能够以各种方式被实践或执行。
如上所讨论的，尽管发现了tRNA-氨酰化核酶如flexizyme，但在没有aaRS的情况下由高度简化的翻译系统合成蛋白酶仍未被证实。无aaRS翻译的产量低的主要原因之一是，与通过aaRS的tRNA氨酰化相比，tRNA的flexizyme装载缺乏再循环。另外，将体外转录的未修饰的tRNA用于无aaRS装载也可能导致翻译产量低。
在构思本发明的同时，发明人着手测试无aaRS系统使用专门由flexizyme装载的tRNA来翻译具有全部20个蛋白原性氨基酸的蛋白酶的能力。初步结果表明，增加flexizyme装载的tRNA的浓度并通过纯化降低阳离子Mg2+的浓度，可以合成具有不同功能的多种蛋白酶，例如溶菌酶、荧光素酶，以及甚至aaRS本身。还已经证明了通过合成的镜像L-flexizyme用镜像D-氨基酸装载镜像L-tRNA，其最终使得能够实现镜像翻译装置。
图1显示本发明的一些方面，并且特别是使用flexizyme装载的tRNA(10)的无aaRS的蛋白翻译的示意性概述说明，其中tRNA 11由flexizyme系统12装载，产生装载的tRNA 13的群体，其代表用于蛋白酶的翻译的蛋白原性氨基酸，并且包括步骤14，其中装载的tRNA通过HPLC纯化以减少Mg2+污染，并且包括步骤15，其中浓缩装载的tRNA 13，用于将核糖体17中的mRNA 16无aaRS翻译为翻译的多肽18，其可以折叠成活性蛋白酶19a，包括aaRS19b，其可以用于装载tRNA以完成循环。
本文展示了用专门的一组核酶装载的tRNA进行的蛋白酶的无aaRS翻译。显示以下发现：有序和忠实的核糖体翻译既不需要aaRS催化的tRNA装载，又不需要tRNA再循环，这导致了以下启示，即与短肽相比，具有更多结构基序并因此具有更多催化功能的蛋白酶可以从高度简化的无aaRS翻译系统翻译。值得注意的是，现代天然蛋白的平均大小为约270-470aa。与TrpRS一样大的蛋白的无aaRS翻译提示产生其他重要的蛋白酶，例如tRNA修饰酶，以进一步改善翻译效率和保真度的可能性。本文还显示高浓度的核酶装载的tRNA大大改善了无aaRS翻译的产量的发现，这可能揭示了在生命起源前的地球出现蛋白酶的可能条件，其中核酶装载的tRNA的充足给料可能对于原始翻译系统有效运行是重要的。
当前的无aaRS翻译系统的局限性之一是，必须将tRNA的装载与翻译脱离，即在加入到翻译系统之前对它们预先装载，因为flexizyme是一种非特异性的催化剂，其将多种氨基酸装载到tRNA。使用高浓度的flexizyme装载的tRNA并通过纯化去除Mg2+污染的方法(其显示大大改善了无aaRS翻译的产量)可以应用于使用预先装载的tRNA的其他体外翻译系统(有或没有aaRS)以从全部或部分非天然氨基酸生产肽或蛋白，使得能够在合成生物学和药物发现的许多领域中立即应用。
蛋白酶的无aaRS翻译的实现为没有任何aaRS的翻译装置建立了一条途径，作为实现镜像翻译的更可行的模型，因为所有aaRS蛋白合计占大肠杆菌翻译装置(包括核糖体，翻译因子，aaRS和tRNA(总分子量约为4.9MDa))的分子量的29％(约1.4MDa)。此外，本文展示的小169-aa Gaussia荧光素酶的翻译提供了灵敏且手性特异性的测定法，用于测试镜像翻译。
无AaRS无细胞翻译系统：
如上文所讨论的，无细胞蛋白合成为从DNA模板合成、监测、分析和纯化蛋白提供了一种简便和快速的方法，同时为遗传密码扩展方法开辟了道路，所述方法尤其允许经由核糖体翻译将非天然氨基酸(UAA；也称为非规范性氨基酸)位点特异性地掺入蛋白中。尽管已知的系统基于向无细胞反应混合物中外源添加正交翻译系统(OTS)，包括正交tRNA和正交氨酰基tRNA合成酶(aaRS)，但本文提供的蛋白翻译系统扩展了这一概念，甚至进一步，通过允许在不存在任何氨酰基tRNA合成酶(aaRS)的情况下有效生产蛋白，因此本文提供了无aaRS翻译系统。
在本公开内容的上下文中，如本文所用，术语“无aaRS的”是指用于从转录模板(例如，核糖核酸分子)制备蛋白的核糖体翻译系统和/或方法和/或平台，其基本上没有氨酰基tRNA合成酶(aaRS)。基本上没有氨酰基tRNA合成酶是指蛋白生产的步骤均不涉及aaRS的使用或存在。根据本发明的一些实施方案，无aaRS翻译系统/方法/平台的定义的唯一例外是以下实施方案：其中氨酰基tRNA合成酶是由此生产的蛋白产物。基本上没有任何tRNA合成酶，是指该系统不包括将氨基酸残基装载到tRNA的方法，并且aaRS酶在翻译的任何阶段均不会引入系统中，并且氨基酸残基的全部供应来自预先装载的tRNA分子。
因此，根据本发明一些实施方案的一方面，提供了用于生产蛋白的系统，该系统包括：
编码蛋白的mRNA分子；
多个装载的tRNA分子；和
无细胞的翻译混合物，
其中所述系统基本上没有氨酰基tRNA合成酶，所述系统中Mg+2的浓度低于100mM。
如本文所用，术语“系统”是指有利于实现复杂化学反应，如蛋白合成且对其必不可少的反应混合物(即溶剂、溶质、反应物和任选的检测标记物)和反应条件(浓度、温度和混合)。
在本发明的一些实施方案的上下文中，短语“无细胞的翻译混合物”是指不涉及使用完整/活细胞的体外蛋白翻译混合物，并且包括无细胞体外蛋白翻译反应所必需的核糖体和核糖体翻译因子(如这些术语在本领域所已知的)。在本发明的一些实施方案的上下文中，如本领域已知的，短语“无aaRS的翻译混合物”是指无细胞的翻译混合物，例外是无细胞的(体外)翻译混合物基本上没有aaRS蛋白，除非另有说明。
蛋白翻译系统包括信使RNA分子，其编码该系统要生产的所需蛋白的氨基酸序列。或者，该系统可以包括将DNA模板转录成mRNA分子的工具，即实现DNA到RNA转录的DNA模板和转录因子(例如，RNA核苷酸、RNA聚合酶和一般转录因子)。
蛋白翻译系统包括多个装载的tRNA分子，其在本发明的一些实施方案的上下文中在本文中也称为预先装载的tRNA转录物。在一些实施方案中，tRNA分子是合成制备的多核苷酸，并且在其他实施方案中，tRNA分子是酶促制备的转录物，并且下文讨论了两种类别之间的相关差异。
根据本发明的一些实施方案，这种多个装载的tRNA分子至少包括这样的tRNA分子：其装载了由mRNA编码的氨基酸残基，并且将存在于由mRNA编码的蛋白序列中。多个装载的tRNA分子还包括装载了非天然氨基酸残基的tRNA分子，所述非天然氨基酸残基包括D-氨基酸的残基和其他非规范性氨基酸残基，如以下表A和B中所示。优选地，每个单独的装载的tRNA分子的频率和数量与蛋白的序列中每个氨基酸的频率匹配。例如，如果蛋白序列中丝氨酸残基的频率为8％，并且甲硫氨酸的频率为1％，则系统中多个装载的tRNA分子将反映该频率，并且包含的tRNASer是tRNAMet的约8倍。在一些实施方案中，tRNA分子由L-核苷酸组成，使得tRNA分子成为天然存在的tRNA分子的镜像。在一些实施方案中，tRNA分子由L-核苷酸组成，并进一步用D-氨基酸的残基装载。
如本文所用，术语“残基”和/或“部分”描述分子的一部分，并且通常描述其主要部分，或属于特定功能的一组原子。例如，术语“氨基酸残基”是指在其上连接有氨基酸的化合物的背景中的氨基酸；肽是彼此连接的氨基酸残基链；装载了核糖核酸残基的tRNA分子是与tRNA分子连接的核糖核酸。
表A-B列出了在本发明的一些实施方案的上下文中相关的一些任选的氨基酸残基；注意，这些仅是示例，不应视为限制。
表A
表B
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表B(续)
阳离子耗尽的系统：
如上所公开的，根据本发明的实施方案，用于生产蛋白的无细胞无aaRS系统在低阳离子浓度，更具体地在低镁离子浓度下是有效的。镁在大多数无细胞蛋白翻译混合物(包括商业混合物)中以相对高浓度存在。镁还存在于大多数装载的tRNA制品，尤其是flexizyme装载的tRNA制品中。如下文实施例部分中展示的，本发明人惊奇地发现，在无细胞无aaRS的蛋白翻译系统中将镁浓度降低到实际的最低水平大大改善了蛋白生产的效率和保真度。因此，发明人必须有目的地减少在已知蛋白翻译系统中从各种组分携带的镁离子的固有存在，以便获得本文公开的系统的改进的性能。
因此，根据本发明的一些实施方案，与迄今为止任何已知的无细胞蛋白翻译系统相比，用于生产蛋白的系统的特征在于低Mg+2浓度。更具体地，根据本发明，系统中的镁浓度低于装载的tRNA制品中的Mg+2浓度。在绝对值中，系统中Mg+2的浓度低于100mM,90mM,80mM,70mM,60mM,50mM,40mM,30mM,20mM或低于10mM。
在一些实施方案中，系统中镁离子的浓度是实际上可能通过离子耗尽方法获得的最小浓度，所述方法例如但不限于色谱法(HPLC)、在醇中沉淀和沉淀物洗涤、超滤和渗析。
装载的tRNA浓度：
可以通过本领域已知的任何方法对当前公开的系统的tRNA分子进行预先装载，并且在一些优选的实施方案中，通过flexizyme装载tRNA。与已知的无细胞蛋白翻译系统中它们的浓度相比，系统中存在的装载的tRNA分子的浓度也会进行调整。
根据一些实施方案，装载的tRNA的浓度是其他已知的无细胞蛋白翻译系统中的至少2倍。根据一些实施方案，装载的tRNA的浓度大于50μM,60μM,80μM,90μM,100μM,110μM,120μM,130μM,140μM,150μM,160μM,170μM,180μM,190μM，或大于200μM。
反手性元件：
由于本文提供的系统中不需要aaRS酶，因此该系统特别适用于翻译具有非天然/非规范性氨基酸残基(并且其中包括D-氨基酸残基)的蛋白。该系统可用于将D-氨基酸残基插入任何多肽链，包括将mRNA翻译成全D-aa链。如下所展示的，该系统已用于翻译完整的镜像蛋白。
如下文所示，该系统成功地与包括L-核糖核酸残基或由L-核糖核酸残基组成的tRNA分子(L-tRNA)一起使用。因此，根据本发明的一些实施方案，该系统包括L-tRNA分子。非限制性地，使用D-聚合酶如D-Dpo4-5m-Y12S制备L-tRNA；然而，在本发明的范围内还考虑生产L-tRNA分子的其他方法。
在本发明的一些实施方案中，该系统包含通过L-flexizyme用D-氨基酸残基预先装载的L-tRNA分子，以翻译D-蛋白(镜像蛋白)。
L-氨酰化核酶：
根据本发明的一些实施方案，该系统包括由具有氨酰基-tRNA合成酶(aaRS)活性的核酶(即，氨酰化核酶)预先装载的L-tRNA。在一些实施方案中，氨酰化核酶是flexizyme。在一些优选的实施方案中，L-tRNA用L-flexizyme装载，L-flexizyme是完全或基本上由L-核糖核苷酸组成的核酶。
因此，根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了包含具有催化活性的L-核糖核苷酸(相对于可比较的天然存在的RNA分子的镜像)的多核糖核酸分子(RNA)(核酶)，其通过使用活化的氨基酸将RNA氨酰基化(tRNA装载活性)；即，本文提供的是L-flexizyme。
如下文实施例部分所证明的，使用L-flexizyme，用D-氨基酸残基装载L-tRNA分子更有效且更一致。
本文提供的L-flexizyme与它们的镜像对应物(D-aaRS核酶；D-flexizyme)具有基本相同的序列，或相对于本领域已知的D-flexizyme显示至少80％的序列同一性。例如，根据一些实施方案，L-flexizyme具有与5'-ggaucgaaagauuuccgcauccccgaaaggguacauggcguuaggu-3'(SEQ ID No.82)显示至少80％同一性的序列。
从L-flexizyme的方面出发，是使用L-flexizyme用预先活化的D-氨基酸残基装载L-tRNA分子。因此，根据本发明的一些实施方案的另一方面，提供了用D-氨基酸装载L-tRNA的方法，该方法通过以下步骤实现：
提供活化的D-氨基酸；
提供L-tRNA分子；
提供L-flexizyme；和
使L-tRNA、L-flexizyme和活化的D-氨基酸反应，从而获得D-氨基酸装载的L-tRNA分子。
根据本发明的一些实施方案，与合成机器产物相反，使用D-聚合酶制备L-tRNA分子。如下文实施例部分所证实的，当L-tRNA的来源是酶促的而不是合成的时，L-flexizyme与L-tRNA的反应显示出aaRS活性(氨基酸装载)反应的效率和保真度的显著改善(参见下文关于图3A-E和图19A-B的讨论)。使用D-氨基酸装载的L-tRNA分子的反应混合物的PAGE分析，可以看出并识别出这一优势，其特征在于装载的tRNA种类的独特峰和未装载的tRNA种类的独特峰，而在使用机器合成的L-tRNA分子的反应中，反应混合物显示出连续的大峰，表明由于使用较低质量的L-tRNA作为起始原料而产生的多种中间体、错配和其他副反应。
使用该系统的方法：
本文提供的系统的使用与其他已知的无细胞蛋白翻译系统的使用不同，甚至与迄今为止已知的无aaRS蛋白翻译系统的使用不同，至少在以下方面不同：预先装载的tRNA分子的浓度高于已知系统中使用的浓度，并且Mg+2的浓度低于已知系统中使用的浓度。
因此，根据本发明的一些实施方案的另一方面，提供了使用本文提供的无细胞无aaRS蛋白翻译系统生产蛋白的方法，该方法通过以下步骤实现：
提供多个预先装载的tRNA分子，其具有不超过上文所讨论的Mg+2的浓度(小于其他已知无细胞蛋白翻译系统浓度的一半或小于100mM)；和
在无细胞翻译混合物中，使这种多个装载的tRNA分子与编码所需蛋白的mRNA分子接触，从而获得目标蛋白。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在使预先装载的tRNA制品与无细胞翻译混合物接触之前，将Mg+2的浓度调节至所需的低浓度。从包含大分子，特别是敏感的生物大分子的系统中耗尽离子，特别是阳离子，可以通过本领域中任何已知的程序来实现。例如，可通过色谱法(例如，HPLC)、醇沉淀以及随后洗涤沉淀的沉淀物、超滤和渗析(不限于此)来降低Mg+2浓度；在本发明的范围内还可以考虑其他程序。
在一些实施方案中，该方法进一步包括，在使预先装载的tRNA制品与无细胞翻译混合物接触之前，将预先装载的tRNA分子的浓度调节所需的高浓度，并且该特征在上文中讨论。因此，在一些实施方案中，该方法进一步包括将装载的tRNA分子浓缩至包括aaRS的系统中的浓度的至少2倍。在一些实施方案中，预先装载的tRNA分子的该浓度为至少160μM。
下文的实施例部分提供了本文公开的系统的几个实施方案以及在本文公开的无细胞、无aaRS的蛋白翻译系统中使用该系统生产蛋白的方法的详细介绍。
所公开的系统和方法的产物：
如下文呈现的实验性概念验证所证明的，本文提供的系统和方法可用于生产蛋白，其特征在于表现出在任何体外翻译系统、细胞系统或在任何天然存在的系统中生产的可比蛋白的结构和功能。由本发明的规定生产的蛋白也可以是由手性相反元件生产的镜像蛋白，包括催化来自镜像起始材料的反应并生产镜像产物的全活性酶。
因此，根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了通过本文提供的系统和/或方法生产的蛋白。在一些实施方案中，该蛋白是镜像蛋白(基本上由D-氨基酸残基组成的D-蛋白)。
证明本文提供的系统的用途的示例性蛋白包括鸡溶菌酶、Gaussia荧光素酶和大肠杆菌TrpRS。
文库：
根据一些实施方案，本文提供的系统和方法可用于生产随机化或部分随机化的肽的文库，其中至少所述肽包含至少一种非天然氨基酸。
本文提供的无aaRS的系统的一个优势是，它需要21个tRNA来有效运行。有超过20种其他天然tRNA转录物可用于分配非天然氨基酸(遗传密码重编程)，并且在其他蛋白翻译系统中，这些tRNA不可用，因为aaRS会给它们装载天然氨基酸。因此，本发明可以提供翻译具有多个非天然氨基酸的随机化肽的手段，而不会遇到错误装载的tRNA分子的问题。
本文提供的蛋白翻译系统可以应用于具有补偿性突变的正交核糖体-tRNA对[Terasaka,N.,Hayashi,G.,Katoh,T.,and Suga,H.“An orthogonal ribosome-tRNA pairvia engineering ofthepeptidyl transferase center”Nat.Chem.Biol.,2014,10,555-557]。在这样的正交系统中，正交tRNA由flexizyme装载而不可由任何aaRS蛋白装载，但是存在效率低下的问题，该问题通过本发明的提供得以解决。例如，已知的无aaRS的系统在翻译七肽例如(Fph)-Lys-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Asp(SEQ ID No.125)时产量低，产量约为0.15μM，并且持续合成能力低(7-aa)。在根据本发明实施方案的系统所提供的改善的条件下，相同的七肽的产量为约2μM。而且，已经使用本发明的提供证明了多达334个氨基酸残基的翻译，是先前证明长度的48倍。因此，根据本发明的一些实施方案，改进的无细胞/无aaRS的系统由于更好的产量(更浓缩的肽库)和更长的产品(更高的序列多样性)而更适合于肽药物发现。
非生物用途：
在寻找超高密度、高保真度的信息存储设备的过程中，本发明人考虑了本文公开的系统和方法在蛋白性大分子的生产中的应用，所述蛋白性大分子的序列可以使用已知程序进行编码和解码，但是不能被天然存在的生化元件降解。通过在蛋白中使用非天然存在的氨基酸残基，提供了防止生物降解的保护。
而且，本发明的提供可通过掺入非天然氨基酸而用于使数据密度最大化，所述非天然氨基酸在文本类比中基本上是字符修饰符的字母。
因此，在本发明的一些实施方案中，作为使用本文提供的系统的产物的蛋白的特征在于具有可被解码为文本和/或数字信息并且至少包括一些非天然存在的氨基酸残基的氨基酸序列。该概念的实现需要翻译任意序列的肽。发明人在图4C-G中用20种蛋白原性氨基酸证明了这一点。
该概念在下文的实施例部分中显示的示范性概念验证实验中得以实现，其中发明人将短信息“MITRNACHARGINGSYSTEM(SEQ IDNo.125)”编码为mRNA#6(参见图4G)，并成功翻译了全长的携带信息的肽。
如本文所用，术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“含有”、“包括”、“包含”、“具有”及其变化形式表示“包括但不限于”。
术语“由...组成”是指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是所述另外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基础和新颖特征。
如本文所用，在某种物质的上下文中，短语“基本上没有”和/或“实质上没有”是指组合物完全没有该物质或包括少于占组合物总重量或体积的约百分之5、1、0.5或0.1的该物质。替代地，在过程、方法、特性或特征的上下文中，短语“基本上没有”和/或“实质上没有”是指过程、组合物、结构或物品完全没有某种过程/方法步骤，或与给定的标准过程/方法相比，某种特性或某种特征，或过程/方法，其中某种过程/方法步骤实现少于约百分之5、1、0.5或0.1，或特性或特征的特征在于与给定标准相比，少于该特性或特征的约百分之5、1、0.5或0.1。
当应用于物体或组合物的原始特性或期望特性或提供的特性时，如本文所用，术语“基本上保持”表示在加工的物体或组合物中，该特性的变化不超过20％，10％或不超过5％。
术语“示例性”在本文中用来表示“用作示例、实例或说明”。被描述为“示例性”的任何实施方案并不必须被解释为比其他实施方案优选或有利和/或从其他实施方案中排除特征的并入。
词语“任选地”或“替代地”在本文中用来表示“在一些实施方案中提供并且在其他实施方案中不提供”。本发明的任何特定实施方案可以包括多个“任选的”特征，除非这些特征冲突。
如本文所使用，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该将范围的描述视为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围例如从1到6的描述应被视为已具体公开了从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等的子范围，以及该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。该应用与范围的广度无关。
每当在本文指出数值范围时，其意图是包括指定范围内的任何引用的数字(小数或整数)。短语在第一指定数字和第二指定数字“之间的范围/范围”和从第一指定数字“到”第二指定数字的“范围/范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指定数字以及它们之间的所有小数和整数。
如本文中所使用的，术语“过程”和“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、材料、机械、计算和数字领域的从业者已知的或易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
可以预期，在从本申请成熟得到的专利的有效期内，将开发许多用于无aaRS的蛋白翻译系统的方法，并且短语“无aaRS的蛋白翻译系统”的范围旨在先验地包括所有此类新技术。
应当理解，为了清楚起见在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以分开地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所述的实施方案中合适地提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方案没有那些要素就不起作用。
如上文描述的以及如下文权利要求书部分所要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，其与上文描述一起以非限制性方式示出了本发明的一些实施方案。
实施例1
实验程序
材料：
用于flexizyme装载的氨基酸底物制备为3,5-二硝基苄基酯(DBE)，例外是Asn和荧光素(FAM)标记的Phe(Fph)，其分别合成为4-氯苄基硫酯(CBT)和氰基甲基酯(CME)。氨基酸DBE可以从Nantong Pptide Biotech Ltd(中国江苏省)订购，或根据先前报道的方法[Murakami,H.,Ohta,A.,Ashigai,H.,and Suga,H.(2006).Ahighly flexible tRNAacylationmethod fornon-naturalpolypeptide synthesis.Nat.Methods3,357]内部合成。所有氨基酸DBE底物均通过1H-NMR或高分辨率质谱法验证。如所述的[Terasaka,N.,Hayashi,G.,Katoh,T.,and Suga,H.(2014).An orthogonal ribosome-tRNA pair viaengineering ofthe peptidyl transferase center.Nat.Chem.Biol.10,555-557]通过高分辨率质谱法合成并验证了Fph-CME。
Asn-CBT的合成如下：将0.5mmol Boc-Asn(Trt)-OH，0.45mmol N,N-双(2-氧代-3-恶唑烷基)二氨基磷酰氯、1.5mmol三乙胺和0.5mmol4-氯苄基硫醇在5ml二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌4小时。用0.5M HCl、0.5N NaOH和盐水洗涤溶液。有机层在无水Na2SO4上干燥并通过旋转蒸发浓缩。为了除去Boc和三苯甲基保护基，加入含有19：1(v/v)三氟乙酸(TFA)/ddH2O的2ml溶液，并在室温下搅拌4小时。溶液用饱和NaHCO3中和，用二氯甲烷萃取，并通过旋转蒸发浓缩。将粗产物溶解在甲醇中，并通过C18 HPLC柱(Inertsil ODS-3,5μm,10×150mm,GL Sciences，日本)使用在0.1％TFA中的30-80％乙腈的梯度进行纯化。合并包含产物的级分，冻干并验证：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.40(s,3H),7.74(d,J＝9.3Hz,1H),7.44-7.35(m,4H),7.33(d,J＝9.5Hz,1H),4.54-4.46(m,1H),4.25(d,J＝9.4Hz,2H),2.78(dh,J＝14.3,7.5,6.4Hz,2H)。D-DNA寡核苷酸购自Genewiz(中国江苏省)。
RNA寡核苷酸和DNA-RNA嵌合寡核苷酸购自Tsingke(中国北京)。使用L-脱氧核苷和L-2'-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)亚磷酰胺(Chemgenes，MA，美国)在H-8DNA合成仪(德国K&A Laborgeraete)上合成L-DNA寡核苷酸和L-flexizyme。使用Sulphur42试剂(Sigma-Aldrich,MO,美国)引入硫代磷酸酯修饰。在65℃下通过浓氢氧化铵从CPG上切割合成的L-寡核苷酸2小时。为了合成L-flexizyme，通过在65℃下用1：1(v/v)三乙胺三氟化氢/DMSO处理2.5小时来除去2'-TBDMS保护基。
用于镜像转录的L-NTP是根据先前报道的方法[Caton-Williams,J.,Hoxhaj,R.,Fiaz,B.,and Huang,Z.(2013).Use of a 5'-regioselective phosphitylating reagentfor one-pot synthesis ofnucleoside 5'-triphosphates from unprotectednucleosides.Curr.Protoc.Nucleic Acid Chem.52,1.30.1-1.30.21]从未保护的L-核苷(Chemgenes,MA,美国)制备的。分别通过变性PAGE和HPLC纯化L-DNA寡核苷酸和L-NTP。L-flexizyme通过乙醇沉淀并通过HPLC纯化。
从大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA扩增并克隆了AlaRS、AspRS、LysRS、TrpRS和TyrRS的基因。Gaussia荧光素酶基因由Genewiz(中国江苏省)合成。按照文献中的描述[Shimizu,Y.,and Ueda,T.(2010).PURE technology.In Cell-Free ProteinProduction:Methods and Protocols,Y.Endo,K.Takai and T.Ueda,eds.(Totowa,NJ:Humana Press),pp.11-21]从大肠杆菌菌株BL21表达并纯化重组aaRS蛋白和具有N末端TEV可切割的His标签的Gaussia荧光素酶。纯化后，用TEV蛋白酶切割His标签。
纯化的鸡蛋清溶菌酶购自Sigma-Aldrich(MO,美国)。
体外转录：
通过在5个循环的PCR中交叉延伸两个部分重叠的引物(1F和2R)(每100μl反应2μM正向引物1F，3μM反向引物2R，0.2mM每种dNTP和5U EasyTaq(TransGen Biotech,中国北京)，或通过使用4种引物(1F,2R,3F和4R)(每100μl反应2μM每种引物1F和4R,0.05μM每种引物2R和3F,0.2mM每种dNTP和5U EasyTaq)的25个循环的组装PCR，制备用于体外转录的双链DNA(dsDNA)模板。
通过苯酚-氯仿纯化PCR产物，然后超滤。对于以除鸟苷以外的5'核苷酸开始的tRNA序列，将自我切割的锤头基序置于tRNA序列的上游[Cui,Z.,Stein,V.,Tnimov,Z.,Mureev,S.,and Alexandrov,K.(2015).Semisynthetic tRNA complement mediates invitro protein synthesis.J.Am.Chem.Soc.137,4404-4413]。下表1中列出了用于组装dsDNA模板体外转录的所有引物DNA寡核苷酸序列。
表1
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1ml转录反应系统在含有25mM MgCl2、40mM Tris-HCl pH 8.0、2mM DTT和1mM亚精胺的1×转录缓冲液中含有20μg纯化的dsDNA模板、2mM每种NTP、0.1mg/ml T7 RNA聚合酶、400U RiboLock RNA酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific，MA，美国)。将转录反应在37℃孵育2小时，用10μl DNA酶I(NewEnglandBiolabs，MA，美国)处理，并且再孵育0.5小时，然后通过加入60μl的0.5M EDTA淬灭，然后乙醇沉淀。使用“粉碎和浸泡”方法对转录的RNA进行凝胶纯化，脱盐并通过超滤浓缩。5'-三磷酸(以G起始的tRNA序列)和5'-羟基终止的tRNA(以A/U/C起始的tRNA序列)两者均使用此方法制备，先前已证明其功能上等同于生理性5'-单磷酸终止的tRNA，但tRNAHis例外[Cui,Z.,Stein,V.,Tnimov,Z.,Mureev,S.,andAlexandrov,K.(2015).Semisynthetic tRNA complement mediates in vitroprotein synthesis.J.Am.Chem.Soc.137,4404-4413]。因此，制备了两种形式的tRNAHis：在所有的flexizyme装载测定中均使用了5'-三磷酸终止的tRNAHis；通过先前报道的方法制备了在-1位带有额外G的5'-单磷酸终止的tRNAHis，并用于需要aaRS活性的对照中。
flexizyme催化的tRNA-氨酰化：
进行flexizyme催化的tRNA装载的程序改编自先前报道的方法[Goto,Y.,Katoh,T.,and Suga,H.(2011).Flexizymes for genetic code reprogramming.Nat.Protoc.6,779-790]：在pH 7.5的含有50mM HEPES-KOH和100mM KCl的1x折叠缓冲液的存在下，将20μMtRNA与30μM二硝基-flexizyme混合。将混合物在95℃加热2分钟，冷却至25℃10分钟，然后添加100mM MgCl2。将混合物在室温下孵育10分钟，并且在冷藏的金属块上孵育3分钟。在冷金属块上将5mM DBE底物添加到系统中以启动装载反应。将反应在4℃下孵育6小时，并用2倍体积的pH 5.2的0.6MNaOAc淬灭，并用乙醇沉淀。对于以下氨基酸，对通用程序进行了调整：对于Ile-DBE和Val-DBE，将重折叠缓冲液更改为pH 9.0的50mM bicine-KOH；对于Met-DBE和Cys-DBE，在底物中补充5mM的DTT；对于Pro-DBE，底物浓度从5mM增加到40mM；对于Fph-CME，使用30μM增强的flexizyme，Fph-CME底物浓度从5降低到1mM，并且MgCl2浓度从100增加到400mM；对于Asn-CBT，底物浓度从5mM增加到25mM；对于Trp-DBE，添加了额外的20％DMSO。通过酸性PAGE分析确定装载产量：将沉淀的装载反应物溶解在含有93％甲酰胺，pH 5.2的100mMNaOAc，10mMEDTA和痕量溴酚蓝的上样缓冲液中。酸性凝胶由8％丙烯酰胺，pH 5.2的100mMNaOAc和7M尿素制备。将凝胶在带有铝冷却板的4℃冰箱中以100mM NaOAc作为pH 5.2的运行缓冲液运行16小时。凝胶用SYBR-Green II(Thermo Fisher Scientific，MA，U.S)染色，用在Cy2模式下运行的Typhoon FLA 9500扫描，并用软件包ImageJ[Schneider,C.A.；Rasband,W.S.&Eliceiri,K.W.(2012),"NIH Image to ImageJ:25yearsofimage analysis",Nature methods 9(7):671-675,PMID 22930834]分析。对峰面积进行积分以计算装载的tRNA的产量，但tRNAAsp例外。峰高度用于估计与未装载的tRNAAsp非常紧密迁移的Asp-tRNAAsp的产量(参见图2)，并且对Asp-tRNAAsp的装载产量的估计(约50％)与先前报道的结果[Murakami,H.,Ohta,A.,Ashigai,H.,and Suga,H.(2006).A highlyflexible tRNA acylation method for non-natural polypeptidesynthesis.Nat.Methods 3,357]一致。
图2显示HPLC纯化之前和之后tRNA装载产量的酸性PAGE分析，其中“U”代表未装载的tRNA，“C”代表粗制的装载的tRNA，“P”代表纯化的装载的tRNA，而tRNA装载产量由软件包IMAGEJ使用装载的tRNA相对于总tRNA的积分峰面积确定
多种短肽的无AaRS翻译：
使用表2中列出的引物，通过25个循环的组装PCR制备了无aaRS肽翻译的dsDNA模板。
表2
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通过10％变性PAGE纯化所有DNA模板。为了翻译mRNA#1，调整反应混合物，以使每个密码子都被范围为1.25-80μM(相当于16-1000μM总tRNA)的flexizyme装载的关连tRNA解码。如参考文献[Zhang,J.,and Ferré-D’Amaré,Adrian R.(2014).Direct evaluation oftRNA aminoacylation status by the T-Box riboswitch using tRNA-mRNA stackingand steric readout.Mol.Cell 55,148-155]中所述进行flexizyme装载的tRNA的HPLC纯化。储存装载的tRNA，并且在-80℃作为干燥的沉淀物保持稳定多达3天，这是通过酸性PAGE分析确定的。将装载的tRNA沉淀物溶解于0.5x翻译体积的1mM pH 5.2NaOAc中。进行连续稀释以产生浓度为表3所示浓度两倍的tRNA。表3列出了用于无aaRS翻译的总tRNA浓度。
表3
将等体积的2×无aaRS翻译混合物(其已经在37℃预孵育5分钟)与tRNA混合以启动翻译反应。所有翻译反应均在37℃孵育2小时。通过将反应混合物置于-20℃终止翻译，然后通过17％或20％Tricine-SDS-PAGE分析以确定Fph标记的肽的翻译产量。0.125-4μM的肽标准品(Fph-K-Y-D-K-Y-D(SEQ ID No.125)，由中国江苏的Genscript定制合成)也上样用于校准。用tRNAfMet:tRNALys:tRNATyr:tRNAAsp＝1:2.5:2.5:2.5的摩尔比进行未装载的tRNA的滴定，与flexizyme装载的tRNA混合，在室温下短暂孵育，然后添加到无aaRS的翻译系统中。未装载的tRNA的终浓度为90-470μM。通过在1mM NaOAc中将二硝基-flexizyme与flexizyme装载的tRNA混合，进行flexizyme滴定，然后与等体积的2×无aaRS翻译混合物混合以起始翻译反应。flexizyme的终浓度在240-520μM之间。在包含50μM二硝基-flexizyme，6μMtRNAfMet，tRNALys、tRNATyr和tRNAAsp各15μM的系统中进行折叠的flexizyme和tRNA复合物的滴定，在pH 7.5的50mM HEPES-KOH和100mM KCl存在下加热至95℃持续2分钟。将混合物缓慢冷却至25℃，然后添加100mM MgCl2或10mM MgCl2，在室温下孵育10分钟。然后将混合物用乙醇沉淀，用70％乙醇洗涤两次并风干。以小体积沉淀物将溶解在ddH2O中，并且连续稀释，以分别达到750、375和188μM的flexizyme-tRNA复合物的2×浓度，然后与仅含ddH2O的对照一起添加到等体积的无aaRS翻译系统中。
MALDI-TOF MS：
MALDI-TOF MS用于分析mRNA#2至#6的无aaRS翻译。为了减少肽脱落，根据每个基因中的密码子丰度调整每个装载反应的规模，以使每个密码子都与等浓度的flexizyme装载的tRNA匹配(对于mRNA#2到#5，每个密码子10μM，对于mRNA#6，5μM)。使用未装载的tRNA的对照包含30μM(每种)tRNAAsn,tRNAGlu,tRNALys,tRNAIle，和5μM(每种)其他tRNA，以及每种氨基酸各100μM。将装载反应淬灭，沉淀，并用70％乙醇洗涤一次。将洗涤过的不同flexizyme装载的tRNA的沉淀物溶解在0.3M NaOAc中，混合，再次用乙醇沉淀，在-80℃下保存，并在使用前用70％乙醇洗涤一次。通过将flexizyme装载的tRNA与等体积的2×无aaRS的翻译混合物混合来进行无aaRS的翻译。在37℃翻译2小时后，将TFA添加到翻译系统中以将pH降低至<4，并且将样品短暂离心，并且使用C18旋转柱(Thermo Fisher Scientific,MA,美国)将上清液脱盐。洗脱后，通过离心真空浓缩仪(Eppendorf，德国)将样品体积减少至约2-3μl，其中0.5μl用于在正反射模式下(Applied Biosystems 4800plus MALDI TOF/TOF分析仪,CA,美国)进行MALDI-TOF分析。进行使用未装载的tRNA和游离氨基酸(每种氨基酸种类各100μM)的对照实验，脱盐，并通过MALDI-TOF MS进行平行分析。对照实验中使用的未装载的tRNA的浓度为：30μM(每种)tRNAAsn,tRNAGlu,tRNALys,tRNAIle和5μM(每种)其他tRNA。
通过LC-MS/MS进行蛋白鉴定：
通过15％SDS-PAGE分离20μl体积的粗制无aaRS翻译的N-末端FAM标记的大肠杆菌TrpRS，并通过ProteoSilver银染色试剂盒(Sigma-Aldrich,MO,美国)进行银染色。从凝胶上切下EF-Tu(43kDa)和MTF(34kDa)之间的蛋白条带，用5mM二硫苏糖醇还原，并用11mM碘乙酰胺烷基化。用测序级胰蛋白酶在50mM碳酸氢铵中于37℃进行凝胶内消化过夜。将肽用50％乙腈水溶液中的0.1％TFA提取两次，持续30分钟。然后将提取物通过离心真空浓缩仪浓缩。将胰蛋白酶解肽溶解在20μl 0.1％TFA中，并通过LC-MS/MS分析。使用上述浓度进行使用未装载的tRNA和游离氨基酸的对照实验，并进行平行分析。
镜像tRNA的酶促转录：
先前报道了用于镜像转录的D-聚合酶D-Dpo4-5m-Y12S的合成和折叠[Jiang,W.,Zhang,B.,Fan,C.,Wang,M.,Wang,J.,Deng,Q.,Liu,X.,Chen,J.,Zheng,J.,Liu,L.,et al.(2017).Mirror-image polymerase chain reaction.Cell Discov.3,17037；Xu,W.,Jiang,W.,Wang,J.,Yu,L.,Chen,J.,Liu,X.,Liu,L.,and Zhu,T.F.(2017).Totalchemical synthesis of a thermostable enzyme capable ofpolymerase chainreaction.Cell Discov.3,17008；Wang,M.,Jiang,W.,Liu,X.,Wang,J.,Zhang,B.,Fan,C.,Liu,L.,Pena-Alcantara,G.,Ling,J.-J.,Chen,J.,et al.(2019).Mirror-image genetranscription and reverse transcription.Chem 5,848-857]。表4列出了所有L-DNA引物、模板序列和L-核酸寡核苷酸序列，其中“*”表示硫代磷酸酯修饰，大写字母表示L-DNA核苷酸，并且小写字母表示L-RNA核苷酸。
表4
镜像转录是用束缚于镜像单链DNA(L-ssDNA)模板的3'末端的24-nt引物结合位点进行的，以促进通过PAGE经由不同的产物长度进行RNA纯化(使得L-RNA转录物将比99-ntL-ssDNA模板短23nt，其可以在7M尿素中的12％变性PAGE上分离)。L-引物被设计为在3'-末端包括硫代磷酸酯修饰的L-RNA核苷酸。进行镜像tRNAAla、tRNAGly、tRNALys和tRNAPhe的酶促转录。镜像转录后，L-引物在70℃的乙醇中由100μM I2在硫代磷酸酯位点有效切割10分钟，产生成熟的镜像tRNA转录物。对于RNA酶A消化，将0.4μM的D-或L-tRNAAla与4μM的RNA酶A混合，在37℃孵育15分钟，并通过在7M尿素中的10％变性PAGE分析。对于aaRS催化的氨酰化，在10mM ATP和100μM L-或D-丙氨酸存在下，将5μM的D-或L-tRNAAla与1μM的AlaRS混合，在37℃孵育1小时，并且通过8％酸性PAGE分析。
镜像tRNA装载：
使用与上述相同的氨酰化方法进行镜像tRNA装载，不同之处在于L-tRNA和L-flexizyme的浓度分别按比例降至2μM和10μM。通过合成的D-Dpo4-5m-Y12S聚合酶转录镜像tRNA，并通过Dpo4的重组Y12S突变体(L-Dpo4-5m-Y12S)(SEQ ID No.126)(tRNAAla、tRNAGly和tRNALys)或通过T7 RNA聚合酶(tRNAPhe)合成天然tRNA。通过软件包ImageJ，使用装载的tRNA相对于总tRNA的积分峰面积来确定tRNA装载产量。
实施例2
flexizyme催化的tRNA氨酰化
通过46-nt二硝基flexizyme-或45-nt增强flexizyme将21个tRNA分别用关连氨基酸装载。用0.3MNaOAc淬灭装载反应并沉淀。适当地通过70％乙醇洗涤或ShimadzuProminence HPLC系统(日本)纯化沉淀物(参见图8A和图8B)。
图3A-E显示根据本发明的一些实施方案，从tRNA的flexizyme装载至镜像tRNA的无aaRS装载途中的概念和结果，显示由D-flexizyme催化的D-tRNA装载，及其镜像形式，由L-flexizyme(PDB来源:1EHZ(tRNA),3CUL(flexizyme)催化的镜像tRNA装载(图3A),L-flexizyme将D-丙氨酸装载到酶促转录的镜像tRNAAla上，并且显示天然手性对应物用于比较(图3B)，L-flexizyme将甘氨酸装载到酶促转录的镜像tRNAGly上，并且显示天然手性对应物用于比较(图3C)，L-flexizyme将D-赖氨酸装载到酶促转录的镜像tRNALys上，并且显示天然手性对应物用于比较(图3D)，L-flexizyme将D-苯丙氨酸装载到酶促转录的镜像tRNAPhe上，并且显示天然手性对应物用于比较(图3E)，而tRNA装载产量使用软件包IMAGEJ，使用装载的tRNA相对于总tRNA的积分峰面积确定。
使用Symmetry ShieldRP18柱(3.5μm，4.6×150mm和3.5μm，4.6×100mm)(WatersCorp，MA，美国)进行HPLC纯化，洗脱条件根据文献[Zhang,J.,and Ferré-D’Amaré,AdrianR.(2014).Direct evaluation of tRNA aminoacylation status by the T-Boxriboswitch using tRNA-mRNA stacking and steric readout.Mol.Cell 55,148-155]调整。沉淀含有flexizyme装载的tRNA的级分，溶解于pH 5.2的10mMNaOAc中，并通过Nanodrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific,MA,美国)测量浓度。然后混合所需量的tRNA，并再次用乙醇沉淀。将沉淀物风干并在-80℃下储存直至使用。
实施例3
无细胞体外翻译
根据先前报道的方法[Terasaka,N.,Hayashi,G.,Katoh,T.,and Suga,H.(2014).An orthogonal ribosome-tRNA pair via engineering of the peptidyl transferasecenter.Nat.Chem.Biol.10,555-557]制备无细胞体外翻译混合物，并进行了以下修改：重组IF1,IF2,IF3,EF-Ts,EF-Tu,EF-G,RF-2,RF-3,RRF和MTF蛋白在大肠杆菌菌株BL21中表达，带有N端TEV可切割的His标签，通过Ni-NTA Superflow树脂(Senhui MicrosphereTech，苏州，中国)纯化，通过TEV蛋白酶(Sigma-Aldrich,MO,美国)切割，进一步通过离子交换色谱纯化，并交换到包含pH 7.6的50mM HEPES，100mM谷氨酸钾，10mM乙酸镁，7mMβ-巯基乙醇和30％甘油的缓冲液中。如文献[Goto,Y.,Katoh,T.,and Suga,H.(2011).Flexizymesfor genetic code reprogramming.Nat.Protoc.6,779-790]中所述制备缓冲剂组分和小分子成分。无aaRS的大肠杆菌核糖体购自New England Biolabs(MA,美国)。
实施例4
蛋白酶的无AaRS翻译
由Genewiz(江苏，中国)合成并组装了鸡溶菌酶、Gaussia荧光素酶和大肠杆菌TrpRS的20个密码子的DNA模板并克隆到pUC-57载体中。表5显示用于鸡溶菌酶、Gaussia荧光素酶和大肠杆菌TrpRS的无aaRS翻译的DNA模板序列。
表5
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使用前，将DNA质粒进行双重消化并通过1％琼脂糖凝胶纯化。从-80℃取回后，将干燥的flexizyme装载的tRNA沉淀物用70％乙醇洗涤两次，并溶解于10-20μl的pH 5.2的1mM NaOAc中。然后将溶解的tRNA混合物添加到已在37℃预孵育5分钟的无aaRS的翻译混合物中，最终DNA模板浓度为约10ng/μl。对于溶菌酶和萤光素酶的翻译，每个翻译的密码子使用约1μM flexizyme装载的tRNA；对于TrpRS的翻译，使用约1μM的flexizyme装载的FAM标记的Fph-tRNAfMet、约0.4μM的flexizyme装载的tRNA(对于每个Cys和Pro密码子)和约0.2μM的flexizyme装载的tRNA(对于每个剩余的密码子)(总tRNA浓度在上文表3中提供)。使用相同的flexizyme装载的tRNA浓度进行无DNA模板的对照实验，而具有未装载的tRNA的对照实验对于tRNAAsn,tRNAGlu,tRNALys,tRNAIle使用30μM(每种)，并且对于其他tRNA使用5μM(每种)，以及对于游离氨基酸使用100μM(每种)。对于溶菌酶和萤光素酶，将翻译反应在37℃孵育2小时，并且对于TrpRS，孵育4小时。为了通过15％SDS-PAGE进行分析，从翻译反应中取样了10μl等分试样，与2μl的6×蛋白上样染料混合，并在98℃加热3分钟以进行上样。AlexaFluor488标记的Benchmark荧光蛋白标准品购自Thermo Fisher Scientific(MA，美国)。通过在Cy2模式下操作的Typhoon FLA 9500(GE Healthcare，英国)扫描凝胶。
实施例5
无aaRS翻译的蛋白酶的生化表征
用Met-tRNAfMet对鸡溶菌酶、Gaussia荧光素酶和大肠杆菌TrpRS进行无AaRS翻译。鸡溶菌酶的翻译混合物用等体积的pH 7.5的含有0.1M磷酸钠和0.1M NaCl的2×折叠缓冲液稀释，在室温下孵育24小时，并通过EnzChek溶菌酶测定试剂盒(Thermo FisherScientific,MA,美国)测定。用等体积的pH 7.3的含有6mM还原的和4mM氧化的谷胱甘肽的2×折叠缓冲液稀释Gaussia荧光素酶的翻译混合物，所述缓冲液先前显示促进重组Gaussia荧光素酶中的二硫键形成[Yu,T.,Laird,J.R.,Prescher,J.A.,and Thorpe,C.(2018).Gaussia princeps luciferase:a bioluminescent substrate for oxidative proteinfolding.Protein Science 27,1509-1517]，在室温下孵育16小时，并根据制造商的说明通过Pierce Gaussia荧光素酶发光测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,MA,美国)进行了测定。对于大肠杆菌TrpRS的翻译，通过酶促连接两个合成的寡核苷酸制备Cy5-tRNATrp，并按照文献[Suddala,K.C.,Cabello-Villegas,J.,Michnicka,M.,Marshall,C.,Nikonowicz,E.P.,and Walter,N.G.(2018).Hierarchical mechanism ofamino acidsensing by the T-box riboswitch.Nat.Commun.9,1896]中的描述通过10％变性PAGE纯化。表6显示用于内部Cy5标记的tRNATrp的酶促连接的RNA寡核苷酸序列。
表6
翻译完成后，将2μM Cy5-tRNATrp、250μM色氨酸和1mM ATP的混合物添加到反应混合物中，在37℃孵育1小时，通过0.3MNaOAc淬灭，并用苯酚-氯仿提取。装载的样品通过8％酸性PAGE(Supplemental Information)进行分析，并通过在Cy5模式下运行的TyphoonFLA9500进行扫描。将2μM未装载的Cy5-tRNATrp和2μM由100nM重组大肠杆菌TrpRS装载的Cy5-tRNATrp的样品用作标准品。在相同条件下测定所有缺少DNA模板或使用未装载的tRNA和游离氨基酸的对照实验。
实施例6
最大化无aaRS翻译的产量
对无aaRS的翻译系统进行了研究，以解决文献[Terasaka,N.,Hayashi,G.,Katoh,T.,and Suga,H.(2014).An orthogonal ribosome-tRNA pair via engineering ofthepeptidyl transferase center.Nat.Chem.Biol.10,555-557]中报道的明显的低产量问题。基本原理是，通过增加flexizyme装载的tRNA的浓度来补偿tRNA再循环的缺乏，从而可能改善无aaRS翻译的产量。较早的研究显示，在具有aaRS的大肠杆菌(E.coli)翻译系统中添加过量的tRNA会抑制翻译[Rojiani,M.V.,Jakubowski,H.,and Goldman,E.(1990).Relationship between protein synthesis and concentrations ofchargedanduncharged tRNATrp inEscherichia coli.Proc.Natl Acad.Sci.USA 87,1511；Anderson,W.F.(1969).The effect oftRNA concentration onthe rate ofproteinsynthesis.Proc.Natl Acad.Sci.USA 62,566]，这归因于未装载的tRNA通过占据核糖体A位点而竞争掉装载的tRNA，或者由于添加大量tRNA而导致的阳离子失衡。但是，所有这些实验都是在aaRS的存在下进行的，并因此未确定确切的装载产量，使得难以区分效率低下的装载和改变的阳离子浓度(例如Mg2+)的影响。
为了评估tRNA浓度和装载产量对无aaRS的翻译的影响，使用荧光素(FAM)标记的苯丙氨酸(Fph-tRNAfMet)对短肽进行无aaRS翻译，以方便翻译产量的定量(参见图4A-B、图5A-D和图6A-E)。
图4A-G显示根据本发明的一些实施方案的多个短肽的无aaRS翻译的结果，显示来自mRNA#1的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析(图4A)，通过Tricine-SDS-PAGE分析的短肽的无aaRS的翻译产量，显示未装载的tRNA浓度范围为160-540μM，而flexizyme装载的tRNA浓度保持在70μM，导致装载产量范围为44-13％(图4B的上部)，并且总tRNA浓度范围为16-1003μM，而装载产量保持在56％(图4B的下部)(误差柱代表来自三个独立实验的标准差)，来自mRNA#2(图4C)，mRNA#3(图4D)，mRNA#4(图4E)，mRNA#5(图4F)和mRNA#6(图4G)的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析，翻译的对照具有55-135μM的总的未装载的tRNA和100μM的每种氨基酸(对于mRNA#1，将5μM的flexizyme装载的FAM标记的Fph-tRNAfMet添加到对照和无aaRS的翻译实验两者中)，并且无aaRS翻译的无aaRS翻译具有170-414μM的总的flexizyme装载的tRNA(参见表3)。a.u.，任意单位；C，O：计算的和观察到的m/z值(分别为图4C-G)。
mRNA模板通过tRNAfMet、tRNALys、tRNATyr和tRNAAsp进行解码，其中tRNAfMet通过45-nt增强的flexizyme用Fph-tRNAfMet装载，并且其他的通过46-nt二硝基-flexizyme装载它们的关连氨基酸[Murakami,H.,Ohta,A.,Ashigai,H.,and Suga,H.(2006).Ahighlyflexible tRNA acylationmethod fornon-naturalpolypeptidesynthesis.Nat.Methods3,357]。使用了由T7 RNA聚合酶体外转录的未修饰的tRNA，因为已证明它们在核糖体肽合成测定中起作用。在酸性条件下(酸性PAGE)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确定每个tRNA的单个装载产量，其用于推导翻译系统的加权平均(总体)装载产量(参见表3)。首先通过添加装载的总tRNA进行tRNA滴定，总装载产量为约44％(摩尔比为1:2:2:2的混合的Fph-tRNAfMet:Lys-tRNALys:Tyr-tRNATyr:Asp-tRNAAsp)，并且最终翻译系统中的总tRNA浓度为20-644μM，并且发现当总tRNA浓度为约160μM时，翻译产量达到最高水平，并且在没有停滞状态的情况下，随着tRNA浓度的进一步增加，翻译产量降低了(参见图5A)。
图5A-D显示在各种条件下mRNA#1的无aaRS翻译的结果，显示总tRNA浓度范围为20-644μM，而装载产量保持在44％(图5A)，总flexizyme浓度范围为240-525μM，而总tRNA浓度保持在160μM(图5B)，将flexizyme和0-380μM的未装载的tRNA混入(图5C)10mM MgCl2和(图5D)100mM MgCl2中，通过乙醇沉淀法脱盐，并添加到无aaRS的翻译混合物中，其中flexizyme装载的tRNA的浓度保持在70μM(误差柱，来自三个独立实验的标准差)；
图6A-D显示用于计算无aaRS翻译产量的tricine-SDS-PAGE凝胶分析，显示对应于图4B、图5A、图5B、图5C和图D的凝胶图像(分别为图6A-E)，其用于计算无aaRS翻译产量，其中“M”为合成肽标准品(Fph-K-Y-D-K-Y-D)。
观察到的抑制不归因于翻译系统中的flexizyme积累，因为在对照实验中，向固定量的总tRNA中添加纯化的二硝基-flexizyme不会抑制翻译(参见图5B)。
接下来，在70μM装载的tRNA存在的情况下，将90-470μM未装载的tRNA添加到无aaRS的翻译系统中，总装载产量从44％降至13％，但是总翻译产量在很大程度上保持不受影响(参见图4B)。
有理由认为，另一个可能导致观察到的翻译抑制的因素是由于flexizyme装载的tRNA携带Mg2+导致阳离子浓度增加。为了检验该理论，将外源MgCl2加入到flexizyme装载的tRNA中，然后添加到无aaRS的翻译系统中，并且发现翻译确实受到增加的MgCl2携带的抑制(参见图5C和图5D)。
基于上述观察结果，使用配备C18柱的高效液相色谱(HPLC)纯化flexizyme装载的tRNA，以降低Mg2+的浓度(Fph-tRNAfMet除外，其替代地通过超滤处理以使荧光猝灭最少)。该过程也去除了大部分的flexizyme，并且使总装载产量从44％适度地改善到56％(参见图2)。
此后，将纯化的flexizyme装载的tRNA添加到无aaRS的翻译系统中，并且观察到，由于仅浓缩flexizyme装载的tRNA，翻译产量显著改善了5倍。在通过HPLC减少Mg2+污染后观察到另外的2倍的改善，导致翻译产量总体改善约10倍(参见图4B和图5A)，最佳的总tRNA浓度从160改变为500μM。
但是，当tRNA浓度进一步从500μM增加到1000μM时，总翻译产量降低了约50％，这可能是由与Fph-tRNAfMet相关的Mg2+引起的。此外，在存在aaRS的情况下使用高浓度的未装载的tRNA进行相似的滴定测定没有导致翻译产量的改善(参见图7A-B)，表明无aaRS的翻译产量的改善可能是由flexizyme装载的tRNA本身的浓度增加导致的。
图7A-B显示在LysRS、TyrRS和AspRS存在下的体外翻译实验的结果，显示在LysRS、TyrRS和AspRS存在下使用范围为22-680μM的未装载、未修饰的总tRNA浓度的翻译产物以及由增强的flexizyme预先装载的Fph-tRNAfMet的Tricine-SDS-PAGE分析(图7A)和计算的翻译产量(图7B)(误差柱，来自三个独立实验的标准偏差。
实施例7
多种短肽的无AaRS翻译
由于已经发现增加的tRNA浓度改善了无aaRS翻译的产量，本发明人已经寻求测试对多个短肽的无aaRS翻译并确定在高flexizyme装载的tRNA浓度下的翻译保真度。通过T7RNA聚合酶的体外转录获得了最小的一组21个大肠杆菌tRNA，包括用于翻译起始的1个tRNA(tRNAfMet)和用于翻译延伸的另外20个。表7显示相关的tRNA序列。
表7
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通过flexizyme分别给每个tRNA装载，装载产量范围为20-60％(参见图8A)。
图8A-B显示使用它们的关连蛋白原性氨基酸对21个tRNA的flexizyme装载产量，显示乙醇沉淀后测定的装载产量(图8A)，以及14个flexizyme装载的tRNA的HPLC纯化后测定的装载产量。N/A，未进行flexizyme装载的tRNA的纯化(图8B)，其中如先前报道对gly-tRNAGly进行可逆的N-戊烯酰化以促进纯化。
将flexizyme装载的tRNA以根据mRNA上它们的关连密码子的丰度的摩尔比进行混合，然后添加至无aaRS的翻译系统中，达到范围为170-520μM的终浓度(表3)。发明人设计并体外转录了5种不同的mRNA序列，这些序列允许与flexizyme装载的tRNA的反密码子进行Watson-Crick碱基配对，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)评估了无aaRS翻译的短肽以测试翻译保真度(参见图4C-G)。
MALDI-TOF MS结果显示，所有21个flexizyme装载的tRNA均能以相对于核糖体高达约200倍摩尔过量准确解码mRNA(例如使用mRNA#5，414μM tRNAv.s.2μM核糖体)。在使用未装载的tRNA和游离氨基酸的对照实验中(参见图4C-G)，未检测到肽产物，因此最小化了来自核糖体制备的aaRS和装载的tRNA的污染问题。
值得注意的是，发明人将短信息“MITRNACHARGINGSYSTEM”(SEQ ID No.123)编码为mRNA#6(参见图4G)，并成功翻译了携带全长信息的肽。
然而，当总tRNA浓度增加至520μM时，检测到另外的+12Da峰(参见图9)，这可能是由于高tRNA浓度和未修饰的tRNA用于翻译而导致的mRNA错误解码。
图9显示无aaRS翻译的mRNA#6的MALDI-TOF MS分析，显示在无aaRS的翻译系统中具有较高的总tRNA浓度(520μM)时，观察到错误翻译的产物，其分子量为2,252.7Da，而正确翻译的产物的M.W.为2,240.7Da。a.u.，任意单位；C，O：分别为计算和观察到的m/z值。
实施例8
蛋白酶的无AaRS翻译
短肽的成功翻译仅在使用flexizyme系统装载的体外转录的未修饰tRNA时导致蛋白酶的无aaRS翻译。选择两种小酶，即130-aa鸡溶菌酶和169-aa Gaussia荧光素酶作为模型。两种酶都不是大肠杆菌天然的，并且因此将来自核糖体制备的污染问题降至最低。
图10A-C显示无aaRS翻译的蛋白酶：鸡溶菌酶(图10A)、Gaussia荧光素酶(图10B)和大肠杆菌TrpRS(图10C)的氨基酸序列，而由flexizyme装载的tRNA翻译的位置通过乙醇沉淀或通过HPLC(下划线)纯化。
通过HPLC纯化21个flexizyme装载的tRNA的子集(图10A-B中带下划线的氨基酸)，以减少Mg2+携带，并且通过酸性PAGE确定HPLC纯化后的各个装载产量(参见图8B)，导致总体装载产量为约40％。鸡溶菌酶的总tRNA浓度为约330μM，并且Gaussia荧光素酶的总tRNA浓度为约430μM(表3)，所述浓度是其他体外翻译系统[Terasaka,N.,Hayashi,G.,Katoh,T.,and Suga,H.(2014).An orthogonal ribosome-tRNA pair via engineering ofthepeptidyl transferase center.Nat.Chem.Biol.10,555-557；Iwane,Y.,Hitomi,A.,Murakami,H.,Katoh,T.,Goto,Y.,and Suga,H.(2016).Expanding the amino acidrepertoire of ribosomal polypeptide synthesis via the artificial division ofcodon boxes.Nat.Chem.8,317-325；和Cui,Z.,Stein,V.,Tnimov,Z.,Mureev,S.,andAlexandrov,K.(2015).Semisynthetic tRNA complement mediates in vitro proteinsynthesis.J.Am.Chem.Soc.137,4404-4413]中使用的总tRNA浓度的约10至20倍。
使用FAM标记的Fph-tRNAfMet报告基因测试全长蛋白的无aaRS翻译。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，荧光标记的产物条带与鸡溶菌酶和Gaussia荧光素酶的分子量(分别为14.8kDa和18.7kDa)一致，并且产物条带的迁移率也分别与商业鸡溶菌酶和重组Gaussia荧光素酶相似(参见图11A-D)。
图11A-G显示无aaRS翻译的蛋白酶的SDS-PAGE分析，显示在图12A中显示的整个凝胶图像(图11A)，在15％SDS-PAGE中分析，并用考马斯亮蓝染色的从鸡蛋清纯化的400ng商业鸡溶菌酶的样品(图11B)，在图12C中显示的整个凝胶图像(图11C)，在15％SDS-PAGE中分析，并用考马斯亮蓝染色的从大肠杆菌菌株BL21表达和纯化的400ng重组Gaussia荧光素酶的样品(图11D)，在图14A中显示的整个凝胶图像(图11E)，在15％SDS-PAGE中分析，并用考马斯亮蓝染色的从大肠杆菌菌株BL21表达和纯化的300ng重组大肠杆菌TrpRS的样品(图11F)，和通过15％SDS-PAGE分析(加热或不加热至98℃持续3分钟)并且通过Typhoon FLA9500在Cy2模式下扫描的5μM Fph-CME、1μM Fph-tRNAfMe和5μM ofFph-tRNAfMet的样品(图11G)，其中M是基准荧光蛋白标准品。
相比之下，在分别缺乏DNA模板，或使用未装载的tRNA和游离氨基酸的对照实验中不存在产物条带(参见图12A和图12C)。
图12A-D显示根据本发明的一些实施方案的蛋白酶的无aaRS翻译的概念的实验证明的结果，其显示通过15％SDS-PAGE分析并且通过Typhoon FLA 9500在Cy2模式下扫描的N末端FAM标记的鸡溶菌酶的无aaRS翻译(M代表基准荧光蛋白标准品)(图12A)，以荧光标记的细菌(溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus))细胞壁材料为底物，对粗制无aaRS翻译的鸡溶菌酶进行的酶促测定(图12B)，通过15％SDS-PAGE分析并且通过Typhoon FLA9500在Cy2模式下扫描的N末端FAM标记的Gaussia荧光素酶的无aaRS翻译(图12C)，以及以腔肠素为底物，对粗制无aaRS翻译的Gaussia荧光素酶的酶促测定(图12D)(RFU，相对荧光单位，RLU，相对发光单位)。
这些结果表明，在flexizyme装载的tRNA水解之前，无aaRS翻译足以进行以完成全长蛋白的合成。由于核糖体蛋白污染，使用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)从切除的产物条带中表征无aaRS的翻译蛋白的尝试不成功；然而，如本文所述，这通过翻译分子量与核糖体蛋白的分子量差异更大的更大蛋白来解决。接下来，将FAM标记的Fph-tRNAfMet替换为未标记的Met-tRNAfMet，以进行翻译起始，并进行酶促测定，以测试翻译的蛋白能否在体外正确折叠并具有其相应的催化活性。结果显示，在折叠缓冲液中孵育高达24小时后，无aaRS翻译的酶对其相应底物进行催化：分别地，鸡溶菌酶释放FAM标记的细胞碎片且Gaussia荧光素酶发出生物发光(参见，图12B和图12D)，而缺乏DNA模板，或使用未装载的tRNA和游离氨基酸的对照实验不产生可检测的信号，从而使来自无aaRS翻译系统的自发荧光或污染发光的污染问题最小化。
将无aaRS翻译的Gaussia荧光素酶的发射生物发光与重组荧光素酶的已知标准品进行比较，显示翻译产量为约25nM(参见图13)，其是7-aa肽的无aaRS翻译的最大产量的约1/80(参见图4B)，这可能是由于每个翻译的密码子的flexizyme装载的tRNA可用性较低，以及带有多个二硫键的Gaussia荧光素酶的折叠效率有限的结果。
图13显示无aaRS翻译的Gaussia荧光素酶的产量估计值，其中使用0、25nM，50nM，100nM和250nM的重组Gaussia荧光素酶绘制标准曲线(以正方形表示)，并且翻译的Gaussia荧光素酶的产量估计为约25nM(以三角形表示)
实施例9
aaRS的无aaRS翻译
发明人试图探索无aaRS的翻译系统生产功能性aaRS自身的可能性，这是建立自复制翻译装置的重要步骤。为此，将334-aa大肠杆菌TrpRS用作模型。通过HPLC纯化了大部分(总共21个中的14个)体外转录的flexizyme装载的tRNA，以减少Mg2+携带(图10A中带下划线的氨基酸)，导致总装载产量为约42％，tRNA浓度为约170μM(参见表3)。
发明人使用FAM标记的Fph-tRNAfMet报告基因测试全长蛋白的翻译，并通过SDS-PAGE观察到了指示334-aa大肠杆菌TrpRS(37.8kDa)的产物带(荧光标记的蛋白条带的迁移率类似于重组TrpRS的条带)(参见图11E和图11F)，而在缺乏DNA模板，或使用未装载的tRNA和游离氨基酸的对照实验中，该条带不存在(参见图11E)。
图14A-C显示TrpRS的无aaRS翻译，显示通过15％SDS-PAGE分析并且通过TyphoonFLA 9500在Cy2模式下扫描的N末端FAM标记的大肠杆菌TrpRS的无aaRS翻译(M代表基准荧光蛋白标准品(图14A)，内部Cy5标记的tRNATrp的序列和二级结构(图14B)，以及通过8％酸性PAGE并且通过TyphoonFLA 9500在Cy2模式下扫描的，以Cy5-tRNATrp为底物的粗制无aaRS翻译的TrpRS的酶促测定(图14C)。
还观察到了几个更快的迁移条带，其可能对应于截短的TrpRS翻译产物和未使用的Fph-tRNAfMet(参见图11G)。
为了进一步确认TrpRS的无aaRS翻译，使用LC-MS/MS分析了切下的产物条带的蛋白含量，并从大肠杆菌TrpRS中鉴定出4个非重叠的肽段，得到约16％的序列覆盖。相比之下，在使用未装载的tRNA和游离氨基酸的对照实验中未检测到对应于大肠杆菌TrpRS的肽，这表明检测到的TrpRS并非来自内源性aaRS污染(表8)。
表8显示通过LC-MS/MS检测到的无aaRS翻译的大肠杆菌TrpRS的肽序列(使用大肠杆菌TrpRS的DNA模板的无aaRS翻译)。
表8
为了进一步测试无aaRS翻译的TrpRS的tRNA-氨酰化活性，设计并合成了内部Cy5标记的tRNA底物(Cy5-tRNATrp，参见图14B)。
Cy5标记的安装将允许原位检测装载的Cy5-tRNATrp，而不受其他装载的tRNA种类的干扰。使用Met-tRNAfMet进行翻译起始，并且在翻译TrpRS之后，将Cy5-tRNATrp与色氨酸和三磷酸腺苷(ATP)一起添加到无aaRS翻译系统中。无aaRS翻译的TrpRS成功地将色氨酸装载到Cy5-tRNATrp上，而在缺乏DNA模板，或使用未装载的tRNA和游离氨基酸的对照实验中，未观察到Cy5-tRNATrp装载(参见图14C)，表明观察到的Cy5-tRNATrp装载活性不太可能是由于来自核糖体制备或残留的flexizyme活性的内源性aaRS污染。
实施例10
镜像tRNA的无AaRS装载
作为通过合成镜像L-flexizyme测试用镜像D-氨基酸装载镜像L-tRNA的概念验证实验(见图3A)，本发明人应用了先前建立的镜像基因转录系统，该系统基于设计的硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)P2 DNA聚合酶IV(Dpo4)突变体的镜像版本，用于转录镜像tRNA(参见图15A)。
图15A-B显示通过D-Dpo4-5m-Y12S对镜像tRNALys的转录结果，显示由合成D-Dpo4-5m-Y12S聚合酶聚合的5'-FAM标记的L-通用引物在L-ssDNA模板上的延伸，以及在不同时间点终止并通过在7M尿素中的12％变性PAGE凝胶进行分析的反应等分试样(图15A)，并显示镜像转录和tRNALys转录物的I2介导的切割，其通过在7M尿素中的10％变性PAGE凝胶分析，并通过Thermo Fisher Scientific,MA,美国的SYBR-Green II染色(图15B)。
为了避免合成21种不同的L-RNA引物的高成本，本发明人将通用引物应用于镜像tRNA的转录(参见图15B)。
通用引物由硫代磷酸酯在3'端附近修饰，从而完全延伸的引物经由先前报道的机制被I2有效切割，产生全长镜像tRNA(参见图15B)，如预期的，其抗天然RNA酶A消化，并且不能被天然aaRS装载(参见图16A-B)。
图16A-B显示酶促转录的天然和镜像tRNA的生物化学表征的结果，显示酶促转录的D-和L-tRNAAla的RNA酶A消化(图16A)，以及酶促转录的D-和tRNAAla的AaRS催化的氨酰化(图16B)。
如由MALDI-TOF MS所证实的，I2介导的切割产生具有羟基封端的5'-末端的RNA(参见图17A-C)。
图17A-C显示对I2介导的切割的MALDI-TOF MS分析，显示在硫代磷酸酯修饰位点通过I2切割的合成DNA-RNA嵌合寡核苷酸(图17A)，未切割的寡核苷酸在负线性模式下的MALDI-TOF MS光谱(图17B)，I2切割的寡核苷酸在负线性模式(m/z>4000)和负反射镜模式(m/z<4000)下的MALDI-TOF MS光谱(图17C)，其中大写字母表示DNA核苷酸，小写字母表示RNA核苷酸，“*”表示硫代磷酸酯修饰。a.u.，任意单位；C，O：分别为计算和观察到的m/z值。
接下来，成功地使用化学合成的46-nt L-flexizyme(二硝基-flexizyme)装载属于不同的氨基酸类别(分别为极性(Lys)、非极性(Ala)、非手性(Gly)和芳香族(Phe))的4个代表性D-氨基酸(赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸)到它们的关连镜像tRNA，其具有与天然系统的效率可比的相似效率(参见图3B-E)。
实施例11
使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA翻译完全或部分非天然肽
有理由认为，flexizyme系统可用于掺入多种非天然氨基酸进行肽翻译，与或不与其他aaRS蛋白结合使用。本发明的提供允许测试是否可以使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA或至少flexizyme装载的tRNA的制品来翻译非天然肽(其中Mg+2的浓度基本上降低到可能的最低水平)，以及通过诸如HPLC和超滤的手段纯化，并且浓缩阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA是否可以增加翻译产量(特别是对于难以翻译的肽，诸如完全或部分非天然肽)。在翻译系统中，可以添加aaRS蛋白以增强某些不由flexizyme装载的tRNA的装载(参见图18A-B)。
图18A-B显示使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA的完整或部分非天然肽的翻译，显示在体外翻译系统中使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA对肽药物和非天然蛋白的翻译(图18A)，以及在体外翻译系统中使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA对完全或部分非天然蛋白的翻译、数据存储和核糖体/mRNA展示(图18B)
在该实验中，首先将非天然氨基酸装载到未修饰的tRNA上。非天然氨基酸可包括但不限于D-氨基酸和β-氨基酸，例如D-Phe，D-His，D-Cys，D-Ala，D-Ser，D-Met，D-Thr，D-Tyr，N-氯乙酰基-D-Tyr，D-Trp，N-氯乙酰基-D-Trp，L-β-高甲硫氨酸(β-hMet)，L-β-高谷氨酰胺(β-hGln)，L-β-高苯基甘氨酸(β-hPhg)，2-氨基环己烷甲酸(2-ACHC)或2-氨基环戊烷甲酸(2-ACPC)。通过包括但不限于HPLC的技术纯化flexizyme装载的tRNA，以减少阳离子污染。其他纯化技术可包括超滤和渗析。然后将flexizyme装载的tRNA浓缩至100至500μM，并用作体外翻译的底物。通过MALDI-TOF MS和Tricine-SDS-PAGE分析产物。
作为概念验证，使用无aaRS的翻译系统翻译肽药物(参见图18A)。
肽药物的氨基酸序列是AcyFAYDRR(2-ACHC)LSNN(2-ACHC)RNYcG-NH2(SEQ IDNo.124)，其中第一个氨基酸是乙酰基-D-Tyr，倒数第二个氨基酸是D-Cys，它自发地与乙酰基-D-Tyr残基形成环状键。先前显示该肽抑制人因子XIIa。通过MALDI-TOF MS分析翻译产物。
作为另一种概念验证，使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA，包括但不限于tRNAAsn,tRNAIle和tRNALys翻译蛋白酶，例如169-aa Gaussia荧光素酶(参见图18A)。其他tRNA将由重组aaRS蛋白装载。另外，一种非天然氨基酸，即荧光素标记的苯丙氨酸(Fph)，通过flexizyme被装载到起始物tRNAfMet上。通过测量生物发光以及SDS-PAGE分析翻译产物。由于Fph残基将使Gaussia荧光素酶在SDS-PAGE凝胶上发荧光，因此可以根据其荧光容易地确定翻译的Gaussia荧光素酶的纯度。此应用可用于翻译纯度的高通量分析，而无需放射性同位素和费力的蛋白纯化程序。
与或不与其他aaRS蛋白结合使用的、使用阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA翻译完全或部分非天然肽，可以应用于肽药物的选择(结合选择方案如核糖体展示和mRNA展示)，以及通过带有氨基酸字母的完全或部分非天然肽的数据存储(参见图18B)。
实施例12
使用L-flexizyme装载酶促转录的L-tRNA
图19A-B显示8％酸性PAGE照片，以及使用预先活化的氨基酸装载完全功能性的、酶促转录的L-tRNA分子的实验性的概念验证，其中图19A显示装载酶促转录的L-tRNA的结果，并且图19B显示装载合成产生的L-tRNA的结果。
如图19A-B中可见，随着酶促转录的L-tRNA开始被装载，显示出条带迁移(图19A)，而在L-flexizyme将预活化氨基酸装载到由商业合成仪制备的L-tRNA上的情况下，没有观察到条带迁移并且装载的L-tRNA分子不能与未装载的tRNA分子区分开，这可能是由于合成制备的tRNA的质量较差。
该实验清楚地证明了获得酶促转录的L-tRNA分子的益处，也清楚地显示了使用L-flexizyme和获得可以酶促转录L-RNA分子的D-酶的益处。
实施例13
包含两个或三个连续D-苯丙氨酸的肽的翻译
为了验证增加阳离子耗尽的tRNA浓度的效果以及它是否可以改善具有挑战性的非天然氨基酸(例如D-氨基酸)的翻译产量，发明人尝试翻译短肽(mRNA#7)：Fph-KKKDFDFDYKDDDDK(SEQ IDNo.127)，其中荧光素标记的L-苯丙氨酸(Fph)和L-赖氨酸(K)通过flexizyme装载到它们的关连tRNA上，而L-天冬氨酸(D)和L-酪氨酸(Y)通过aaRS(分别为AspRS和TryRS)装载到它们的关连tRNA上。
下面的表9显示了用于将mRNA#7体外翻译为mRNA#10的tRNA序列。
表9
按照Katoh,T.et al.[“Consecutive Elongation ofD-Amino Acids inTranslation”,Cell Chemical Biology,2017,24,pp.46-54]的教导，通过flexizyme将D-苯丙氨酸(DF)装载到工程化tRNA,即tRNAGluE2 CUA上(参见表9)，其序列针对D-氨基酸掺入进行了优化(DPhe-tRNAGluE2 CUA)。该肽含有两个连续的D-苯丙氨酸，与相同序列但含有两个连续的L-苯丙氨酸的肽相比，先前已显示该肽难以翻译，产量低于15％[Achenbach,J.etal.,“Outwitting EF-Tu and the ribosome:translation with D-amino acids”,Nucleic Acids Research,2015,43,pp.5687-5698]。发明人设计并体外转录了允许与flexizyme装载的tRNA的反密码子Watson-Crick碱基配对的mRNA#7(参见表10)。
下表10显示用于将mRNA#7体外翻译为mRNA#10的DNA模板序列。
表10
发明人添加了20μM或200μM阳离子耗尽的DPhe-tRNAGluE2 CUA用于体外翻译。对于这两个翻译反应，装载的tRNA的总体Mg2+携带被控制在本文提出的体外翻译系统的Mg2+耐受限度内(<100mM Mg2+)。发明人还使用flexizyme装载的tRNAPhe(LPhe-tRNAPhe)(参见表10)作为对照，平行翻译mRNA#8(Fph-LKLKLK-LFLFLF-LDLYLKLDLDLDLDLK(SEQ ID No.129)。
翻译反应在37℃孵育2小时，并通过MALDI-TOF MS和20％Tricine-SDS-PAGE进行分析。MALDI-TOF MS结果显示两个连续的D-苯丙氨酸准确掺入mRNA#7中(图20A)，但质量峰只能在具有200μMDPhe-tRNAGluE2 CUA的样品中检测到，而不能在具有20μMDPhe-tRNAGluE2 CUA的样品中检测到(图20A)，而在对照实验中，可以在具有20μM LPhe-tRNAPhe的样品中检测到准确的质量峰，但在仅具有未装载的tRNAPhe的样品中检测不到。此外，Tricine-SDS-PAGE结果显示，使用200μM DPhe-tRNAGluE2 CUA的mRNA#7的翻译产量是使用200μM DPhe-tRNAGluE2 CUA的翻译产量的约2倍，并且与使用20μM LPhe-tRNAPhe的对照相似。
图20A-C显示含有两个连续D-苯丙氨酸的短肽的体外翻译结果，其中图20A显示来自mRNA#7的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析，图20B显示来自mRNA#8的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析，并且图20C显示使用仅未装载的tRNAPhe的mRNA#7或mRNA#8(mRNA#7)、20μM LPhe-tRNAPhe(mRNA#7)、20μM DPhe-tRNAGluE2CUA(mRNA#8)，或200μM DPhe-tRNAGluE2CUA(mRNA#8)的翻译产物的Tricine-SDS-PAGE分析，由Typhoon FLA 9500在Cy2模式下扫描。
受到具有两个连续D-苯丙氨酸的mRNA#7的成功翻译的鼓励，发明人将mRNA#9翻译成具有三个连续D-苯丙氨酸的短肽Fph-KKKDFDFDFDYKDDDDK(SEQ ID No.127)(参见表10)。之前用三个连续D-苯丙氨酸翻译短肽的尝试显示，与相同序列但含有三个连续L-苯丙氨酸的肽相比，产量低于5％[Achenbach,J.et al.,2015]。发明人添加30μM或300μM阳离子耗尽的DPhe-tRNAGluE2CUA用于体外翻译，并通过MALDI-TOF MS和20％Tricine-SDS-PAGE分析翻译反应。对于这两个翻译反应，装载的tRNA的总体Mg2+携带被控制在本文提出的体外翻译系统的Mg2+耐受限度内(<100mM Mg2+)。MALDI-TOF MS结果显示三个连续的D-苯丙氨酸准确掺入mRNA#9中(图21A)。此外，Tricine-SDS-PAGE结果显示，使用300μMDPhe-tRNAGluE2CUA的mRNA#9的翻译产量是使用30μMDPhe-tRNAGluE2CUA的翻译产量的约2倍，并且与使用30μM 30μMLPhe-tRNAPhe的对照相似(图21B)。
图21A-B显示含有三个连续D-苯丙氨酸的短肽的体外翻译结果，其中图21A显示来自mRNA#9的翻译的短肽的MALDI-TOF-MS分析，并且图21B显示使用仅未装载的tRNAPhe、30μM LPhe-tRNAPhe、30μM DPhe-tRNAGluE2CUA或300μM DPhe-tRNAGluE2CUA的mRNA#9翻译产物的Tricine-SDS-PAGE分析，通过TyphoonFLA 9500在Cy2模式下扫描。
总而言之，这些结果表明，通过将阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA的浓度从约20-30μM增加至约200-300μM，D-氨基酸(最多三个连续的D-苯丙氨酸)的掺入效率显著改善。
实施例14
包含三个连续β-氨基酸的肽的翻译
为了测试增加阳离子耗尽的tRNA的浓度是否可以改善β-氨基酸的翻译产量，发明人尝试翻译短肽(mRNA#10):Fph-KKKβQβQβQDYKDDDDK(SEQ ID No.129)(参见表10)。发明人添加30μM或300μM阳离子耗尽的βQ-tRNAGluE2CUA用于体外翻译，并通过20％Tricine-SDS-PAGE分析翻译反应。
在两个翻译反应中，装载的tRNA的总体Mg2+携带被控制在本文提出的体外翻译系统的Mg2+耐受限度内(小于100mM Mg2+)。翻译产物通过ANTI-FLAG M2磁珠(Sigma)纯化，从而将全长翻译产物与那些截短的翻译产物分离。
Tricine-SDS-PAGE结果显示，使用300μMβGln-tRNAGluE2CUA的mRNA#10的翻译产率略高于用使用30μMβGln-tRNAGluE2CUA的翻译产率(图22)。
图22显示含有三个连续β-Gln的短肽的体外翻译结果，显示使用仅未装载的tRNA、30μMβGln-tRNAGluE2CUA或300μMβGln-tRNAGluE2CUA的mRNA#10翻译产物的Tricine-SDS-PAGE分析，由Typhoon FLA 9500在Cy2模式下扫描。
总而言之，这些结果表明，通过将阳离子耗尽的flexizyme装载的tRNA的浓度从约30μM增加至约300μM，β-氨基酸(最多三个连续的β-Gln)的掺入效率得到改善。
尽管已经结合本发明的特定实施方案描述了本发明，但是显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入说明书，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入本文。另外，在本申请中对任何参考文献的引用或标识均不应解释为承认所述参考文献可用作本发明的现有技术。就使用章节标题而言，不应将其解释为必然的限制。
此外，本申请的任何优先权文件均通过全文引用并入本文。
序列表
<110> 清华大学
ZHU, Ting
CHEN, Ji
CHEN, Mengyin
<120> 蛋白翻译系统
<130> 90912
<150> US 63/150,641
<151> 2021-02-18
<160> 130
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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ccaggctgcg ccaatcaccg gacgctttcg cgtttcgtcg tttccgactc at 52
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<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 65
cgaagctcag tcgtacttgt cgtacttcat tggtatat 38
<210> 66
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 66
ttaactttaa gaaggagata taccaatgaa gaagtacgac t 41
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 67
cgaagcttac atccgcgagt cgtacttctt cattggtata tct 43
<210> 68
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 68
ttaactttaa gaaggagata taccaatgaa gtggctcccg aa 42
<210> 69
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 69
cgaagcttag gccgtctgct tcgggagcca cttcattggt ata 43
<210> 70
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 70
ttaactttaa gaaggagata taccaatgtt cgagtgccac aacg 44
<210> 71
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 71
cgaagcttac ttgccgatct tgacgttgtg gcactcgaac att 43
<210> 72
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 72
ttaactttaa gaaggagata taccaatgaa ggtcaagtgg cagcc 45
<210> 73
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 73
cgaagcttac ttgagcggct gcggctgcgg ctgccacttg acctt 45
<210> 74
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 74
ttaactttaa gaaggagata taccaatgat cacgcggaac gcctgccacg cccggg 56
<210> 75
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 75
cgaagcttac atctccgtcg agtacgagcc gttgatgccc cgggcgtggc agg 53
<210> 76
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L-核酸寡核苷酸序列
<400> 76
tggtggagct aagcgggatc gaaccgctga cctcttgcat gccatgcaag cgctctccca 60
gctgagctat agcccctata gtgagtcgta ttagaaccg 99
<210> 77
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L-核酸寡核苷酸序列
<400> 77
tggagcggga aacgagactc gaactcgcga ccccgacctt ggcaaggtcg tgctctacca 60
actgagctat tcccgctata gtgagtcgta ttagaaccg 99
<210> 78
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L-核酸寡核苷酸序列
<400> 78
tggtgggtcg tgcaggattc gaacctgcga ccaattgatt aagagtcaac tgctctacca 60
actgagctaa cgaccctata gtgagtcgta ttagaaccg 99
<210> 79
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L-核酸寡核苷酸序列
<400> 79
tggtgcccgg actcggaatc gaaccaagga cacggggatt ttcaatcccc tgctctaccg 60
actgagctat ccgggctata gtgagtcgta ttagaaccg 99
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸寡核苷酸序列
<400> 80
cggttctaat acgactcact atag 24
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸寡核苷酸序列
<400> 81
cggttctaat acgactcact ata 23
<210> 82
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L-flexizyme核酸序列
<400> 82
ggaucgaaag auuuccgcau ccccgaaagg guacauggcg uuaggu 46
<210> 83
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鸡溶菌酶
<400> 83
atgaaggtct tcggccggtg cgagctcgcc gccgccatga agcggcacgg cctcgacaac 60
taccggggct actcgctcgg caactgggtc tgcgccgcca agttcgagtc gaacttcaac 120
acgcaggcca cgaaccggaa cacggacggc tcgacggact acggcatcct ccagatcaac 180
tcgcggtggt ggtgcaacga cggccggacg ccgggctcgc ggaacctctg caacatcccg 240
tgctcggccc tcctctcgtc ggacatcacg gcctcggtca actgcgccaa gaagatcgtc 300
tcggacggca acggcatgaa cgcctgggtc gcctggcgga accggtgcaa gggcacggac 360
gtccaggcct ggatccgggg ctgccggctc taa 393
<210> 84
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gaussia荧光素酶
<400> 84
atgaagccga cggagaacaa cgaggacttc aacatcgtcg ccgtcgcctc gaacttcgcc 60
acgacggacc tcgacgccga ccggggcaag ctcccgggca agaagctccc gctcgaggtc 120
ctcaaggaga tggaggccaa cgcccggaag gccggctgca cgcggggctg cctcatctgc 180
ctctcgcaca tcaagtgcac gccgaagatg aagaagttca tcccgggccg gtgccacacg 240
tacgagggcg acaaggagtc ggcccagggc ggcatcggcg aggccatcgt cgacatcccg 300
gagatcccgg gcttcaagga cctcgagccg atggagcagt tcatcgccca ggtcgacctc 360
tgcgtcgact gcacgacggg ctgcctcaag ggcctcgcca acgtccagtg ctcggacctc 420
ctcaagaagt ggctcccgca gcggtgcgcc acgttcgcct cgaagatcca gggccaggtc 480
gacaagatca agggcgccgg cggcgactaa 510
<210> 85
<211> 1005
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 85
atgacgaagc cgatcgtctt ctcgggcgcc cagccgtcgg gcgagctcac gatcggcaac 60
tacatgggcg ccctccggca gtgggtcaac atgcaggacg actaccactg catctactgc 120
atcgtcgacc agcacgccat cacggtccgg caggacgccc agaagctccg gaaggccacg 180
ctcgacacgc tcgccctcta cctcgcctgc ggcatcgacc cggagaagtc gacgatcttc 240
gtccagtcgc acgtcccgga gcacgcccag ctcggctggg ccctcaactg ctacacgtac 300
ttcggcgagc tctcgcggat gacgcagttc aaggacaagt cggcccggta cgccgagaac 360
atcaacgccg gcctcttcga ctacccggtc ctcatggccg ccgacatcct cctctaccag 420
acgaacctcg tcccggtcgg cgaggaccag aagcagcacc tcgagctctc gcgggacatc 480
gcccagcggt tcaacgccct ctacggcgag atcttcaagg tcccggagcc gttcatcccg 540
aagtcgggcg cccgggtcat gtcgctcctc gagccgacga agaagatgtc gaagtcggac 600
gacaaccgga acaacgtcat cggcctcctc gaggacccga agtcggtcgt caagaagatc 660
aagcgggccg tcacggactc ggacgagccg ccggtcgtcc ggtacgacgt ccagaacaag 720
gccggcgtct cgaacctcct cgacatcctc tcggccgtca cgggccagtc gatcccggag 780
ctcgagaagc agttcgaggg caagatgtac ggccacctca agggcgaggt cgccgacgcc 840
gtctcgggca tgctcacgga gctccaggag cggtaccacc ggttccggaa cgacgaggcc 900
ttcctccagc aggtcatgaa ggacggcgcc gagaaggcct cggtccacgc ctcgcggacg 960
ctcaaggccg tctacgaggc catcggcttc gtcgccaagc cgtaa 1005
<210> 86
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链寡核苷酸
<400> 86
aggggcguag uucaauuggu agagcaccgg ucucc 35
<210> 87
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'磷酸化的
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 缀合于Cy5
<400> 87
aaaaccgggu tuugggaguu cgagucucuc cgccccugcc a 41
<210> 88
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 88
ggggcuauag cucagcuggg agagcgcuug cauggcaugc aagaggucag cgguucgauc 60
ccgcuuagcu ccacca 76
<210> 89
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 89
gcgcccguag cucagcugga uagagcgcug cccuccggag gcagaggucu cagguucgaa 60
uccugucggg cgcgcca 77
<210> 90
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 90
uccucuguag uucagucggu agaacggcgg acuguuaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag gagcca 76
<210> 91
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 91
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccugucacg cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgcca 77
<210> 92
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 92
ggcgcguuaa caaagcgguu auguagcgga uugcaaaucc gucuaguccg guucgacucc 60
ggaacgcgcc ucca 74
<210> 93
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 93
ggcggggugg agcagccugg uagcucgucg ggcucauaac ccgaagaucg ucgguucaaa 60
uccggccccc gcaacca 77
<210> 94
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 94
ugggguaucg ccaagcggua aggcaccgga uucugauucc ggcauuccga gguucgaauc 60
cucguacccc agcca 75
<210> 95
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 95
gccccuucgu cuagaggccc aggacaccgc ccucucacgg cgguaacagg gguucgaauc 60
cccuagggga cgcca 75
<210> 96
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 96
gcgggaauag cucaguuggu agagcacgac cuugccaagg ucggggucgc gaguucgagu 60
cucguuuccc gcucca 76
<210> 97
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 97
guggcuauag cucaguuggu agagcccugg auugugauuc caguugucgu ggguucgaau 60
cccauuagcc acccca 76
<210> 98
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 98
gggcuuguag cucagguggu uagagcgcac cccugauaag ggugaggucg gugguucaag 60
uccacucagg cccacca 77
<210> 99
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 99
gccgaggugg uggaauuggu agacacgcua ccuugaggug guagugccca auagggcuua 60
cggguucaag ucccguccuc gguacca 87
<210> 100
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 100
gggucguuag cucaguuggu agagcaguug acucuuaauc aauuggucgc agguucgaau 60
ccugcacgac ccacca 76
<210> 101
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 101
ggcuacguag cucaguuggu uagagcacau cacucauaau gaugggguca cagguucgaa 60
ucccgucgua gccacca 77
<210> 102
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 102
gcccggauag cucagucggu agagcagggg auugaaaauc cccguguccu ugguucgauu 60
ccgaguccgg gcacca 76
<210> 103
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 103
cggugauugg cgcagccugg uagcgcacuu cguucgggac gaaggggucg gagguucgaa 60
uccucuauca ccgacca 77
<210> 104
<211> 90
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 104
ggagagaugc cggagcggcu gaacggaccg gucucgaaaa ccggaguagg ggcaacucua 60
ccggggguuc aaaucccccu cucuccgcca 90
<210> 105
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 105
gccgauauag cucaguuggu agagcagcgc auucguaaug cgaaggucgu agguucgacu 60
ccuauuaucg gcacca 76
<210> 106
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 106
aggggcguag uucaauuggu agagcaccgg ucuccaaaac cggguguugg gaguucgagu 60
cucuccgccc cugcca 76
<210> 107
<211> 85
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 107
ggugggguuc ccgagcggcc aaagggagca gacuguaaau cugccgucau cgacuucgaa 60
gguucgaauc cuucccccac cacca 85
<210> 108
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 108
gcguccguag cucaguuggu uagagcacca ccuugacaug gugggggucg gugguucgag 60
uccacucgga cgcacca 77
<210> 109
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过LC-MS/MS检测的无aaRS翻译的大肠杆菌TrpRS
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 半胱氨酸氨基甲酰甲基化 (CAM)
<400> 109
Lys Ala Thr Leu Asp Thr Leu Ala Leu Tyr Leu Ala Xaa Gly Ile Asp
1 5 10 15
Pro Glu Lys
<210> 110
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过LC-MS/MS检测的无aaRS翻译的大肠杆菌TrpRS
<400> 110
Ala Val Tyr Glu Ala Ile Gly Phe Val Ala Lys Pro
1 5 10
<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过LC-MS/MS检测的无aaRS翻译的大肠杆菌TrpRS
<400> 111
Ala Val Thr Asp Ser Asp Glu Pro Pro Val Val Arg
1 5 10
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过LC-MS/MS检测的无aaRS翻译的大肠杆菌TrpRS
<400> 112
Phe Asn Ala Leu Tyr Gly Glu Ile Phe Lys
1 5 10
<210> 113
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 113
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccugucacg cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgcca 77
<210> 114
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 114
ggcggggugg agcagccugg uagcucgucg ggcucauaac ccgaagaucg ucgguucaaa 60
uccggccccc gcaacca 77
<210> 115
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 115
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucuaacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgcca 76
<210> 116
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 116
gggucguuag cucaguuggu agagcaguug acucuuaauc aauuggucgc agguucgaau 60
ccugcacgac ccacca 76
<210> 117
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 117
gcccggauag cucagucggu agagcagggg auugaaaauc cccguguccu ugguucgauu 60
ccgaguccgg gcacca 76
<210> 118
<211> 85
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tRNA序列
<400> 118
ggugggguuc ccgagcggcc aaagggagca gacuguaaau cugccgucau cgacuucgaa 60
gguucgaauc cuucccccac cacca 85
<210> 119
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于体外翻译的DNA模板序列
<400> 119
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatataccaa tgaagaagaa 60
gttcttcttc gactacaagg acgacgacga caagtaagct tcg 103
<210> 120
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于体外翻译的DNA模板序列
<400> 120
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatataccaa tgaagaagaa 60
gtagtaggac tacaaggacg acgacgacaa gtaagcttcg 100
<210> 121
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于体外翻译的DNA模板序列
<400> 121
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatataccaa tgaagaagaa 60
gtagtagtag gactacaagg acgacgacga caagtaagct tcg 103
<210> 122
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于体外翻译的DNA模板序列
<400> 122
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatataccaa tgaagaagaa 60
gtagtagtag gactacaagg acgacgacga caagtaagct tcg 103
<210> 123
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码为mRNA #6的短信息肽
<400> 123
Met Ile Thr Arg Asn Ala Cys His Ala Arg Gly Ile Asn Gly Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Thr Glu Met
20
<210> 124
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 先前显示抑制人因子 XIIa 的肽药物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-D-Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 2-氨基环己烷甲酸(2-ACHC)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 2-氨基环己烷甲酸(2-ACHC)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> D-Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> C' 酰胺化的
<400> 124
Tyr Phe Ala Tyr Asp Arg Arg Xaa Leu Ser Asn Asn Xaa Arg Asn Tyr
1 5 10 15
Cys Gly
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 荧光素(FAM)标记的
<400> 125
Phe Lys Tyr Asp Lys Tyr Asp
1 5
<210> 126
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-Dpo4-5m-Y12S,
(Y12S, C31S, S86C, N123A, S207A, S313A)
<400> 126
Met Ile Val Leu Phe Val Asp Phe Asp Tyr Phe Ser Ala Gln Val Glu
1 5 10 15
Glu Val Leu Asn Pro Ser Leu Lys Gly Lys Pro Val Val Val Ser Val
20 25 30
Phe Ser Gly Arg Phe Glu Asp Ser Gly Ala Val Ala Thr Ala Asn Tyr
35 40 45
Glu Ala Arg Lys Phe Gly Val Lys Ala Gly Ile Pro Ile Val Glu Ala
50 55 60
Lys Lys Ile Leu Pro Asn Ala Val Tyr Leu Pro Met Arg Lys Glu Val
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Val Ser Cys Arg Ile Met Asn Leu Leu Arg Glu Tyr Ser
85 90 95
Glu Lys Ile Glu Ile Ala Ser Ile Asp Glu Ala Tyr Leu Asp Ile Ser
100 105 110
Asp Lys Val Arg Asp Tyr Arg Glu Ala Tyr Ala Leu Gly Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Asn Lys Ile Leu Glu Lys Glu Lys Ile Thr Val Thr Val Gly Ile
130 135 140
Ser Lys Asn Lys Val Phe Ala Lys Ile Ala Ala Asp Met Ala Lys Pro
145 150 155 160
Asn Gly Ile Lys Val Ile Asp Asp Glu Glu Val Lys Arg Leu Ile Arg
165 170 175
Glu Leu Asp Ile Ala Asp Val Pro Gly Ile Gly Asn Ile Thr Ala Glu
180 185 190
Lys Leu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Lys Leu Val Asp Thr Leu Ala Ile
195 200 205
Glu Phe Asp Lys Leu Lys Gly Met Ile Gly Glu Ala Lys Ala Lys Tyr
210 215 220
Leu Ile Ser Leu Ala Arg Asp Glu Tyr Asn Glu Pro Ile Arg Thr Arg
225 230 235 240
Val Arg Lys Ser Ile Gly Arg Ile Val Thr Met Lys Arg Asn Ser Arg
245 250 255
Asn Leu Glu Glu Ile Lys Pro Tyr Leu Phe Arg Ala Ile Glu Glu Ser
260 265 270
Tyr Tyr Lys Leu Asp Lys Arg Ile Pro Lys Ala Ile His Val Val Ala
275 280 285
Val Thr Glu Asp Leu Asp Ile Val Ser Arg Gly Arg Thr Phe Pro His
290 295 300
Gly Ile Ser Lys Glu Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val Lys Leu Leu Gln
305 310 315 320
Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Arg Lys Ile Arg Arg Ile Gly Val Arg
325 330 335
Phe Ser Lys Phe Ile Glu Ala Ile Gly Leu Asp Lys Phe Phe Asp Thr
340 345 350
<210> 127
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短肽(mRNA #7的翻译)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 荧光素标记的L-苯丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> D-苯丙氨酸
<400> 127
Phe Lys Lys Lys Phe Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10
<210> 128
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短肽(mRNA #7的翻译)
<400> 128
Phe Lys Lys Lys Phe Phe Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10 15
<210> 129
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短肽(mRNA #7的翻译)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 荧光素标记的L-苯丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(7)
<223> D-苯丙氨酸
<400> 129
Phe Lys Lys Lys Phe Phe Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10 15
<210> 130
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短肽(mRNA #10的翻译)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 荧光素标记的L-苯丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(7)
<223> betta-氨基酸
<400> 130
Phe Lys Lys Lys Gln Gln Gln Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10 15
Claims (31)
1.用于生产蛋白的系统，其包含：
编码蛋白的mRNA分子；
多个装载的tRNA分子；和
无细胞的翻译混合物，
其中所述系统中Mg+2的浓度低于100mM。
2.权利要求1的系统，其基本上没有氨酰基tRNA合成酶。
3.权利要求1-2的任一项的系统，其中所述装载的tRNA分子的浓度大于60μM。
4.权利要求3的系统，其中所述装载的tRNA分子的所述浓度大于160μM，并且Mg+2的所述浓度远低于100mM。
5.权利要求1-4的任一项的系统，其中所述多个装载的tRNA分子中的至少一个tRNA分子由flexizyme装载。
6.权利要求5的系统，其中所述tRNA分子用非天然氨基酸残基装载。
7.权利要求6的系统，其中所述非天然氨基酸残基是D-氨基酸残基。
8.权利要求7的系统，其中所述tRNA分子包含L-核糖核酸残基(L-tRNA)。
9.权利要求8的系统，其中使用D-聚合酶制备所述L-tRNA。
10.权利要求9的系统，其中所述D-聚合酶是Dpo4的镜像蛋白(D-Dpo4)。
11.权利要求10的系统，其中所述D-Dpo4是D-Dpo4-5m-Y12S。
12.权利要求7-11的任一项的系统，其中所述flexizyme包含L-核糖核酸残基(L-flexizyme)。
13.权利要求1-12的任一项的系统，其中所述蛋白选自活性L蛋白酶和活性D蛋白酶。
14.使用权利要求1-13的任一项的系统生产蛋白的方法，该方法包括：
提供所述多个具有不超过所述Mg+2浓度的装载的tRNA分子；和
使所述多个装载的tRNA分子与所述编码蛋白的mRNA分子在所述无细胞的翻译混合物中接触，从而获得蛋白。
15.权利要求14的方法，其中所述提供包括，在所述接触之前，调节Mg+2的所述浓度。
16.权利要求15的方法，其中所述调节包括使用选自色谱法、醇沉淀和沉淀物洗涤、超滤和渗析的技术。
17.权利要求14-16的任一项的方法，其中所述提供进一步包括将所述装载的tRNA分子调节至大于包括aaRS的蛋白翻译系统中的装载的tRNA浓度的2倍的浓度。
18.权利要求17的方法，其中所述装载的tRNA分子的所述浓度大于160μM。
19.用D-氨基酸装载L-tRNA的方法，包括：
用D-聚合酶制备L-tRNA分子；
提供活化的D-氨基酸；
提供L-氨酰化核酶；和
使所述L-tRNA、所述L-氨酰化核酶和所述活化的D-氨基酸接触，从而获得D-氨基酸装载的L-tRNA分子。
20.权利要求19的方法，其中所述D-氨基酸装载的L-tRNA分子的反应混合物的PAGE分析的特征在于装载的tRNA种类的独特峰和未装载的tRNA种类的独特峰。
21.权利要求19-20的任一项的方法，其中所述L-氨酰化核酶是L-flexizyme。
22.包含L-核糖核苷酸残基的L-flexizyme。
23.权利要求22的L-flexizyme，其包含至少50％的L-核糖核苷酸残基。
24.权利要求22的L-flexizyme，其由L-核糖核苷酸残基组成。
25.权利要求22-24的任一项的L-flexizyme，其具有与5′-ggaucgaaagauuuccgcauccccgaaaggguacauggcguuaggu-3′显示至少80％同一性的序列。
26.通过权利要求14-17的任一项的方法制备的蛋白。
27.权利要求26的蛋白，其选自包含至少一个非规范性氨基酸残基的蛋白、包含至少一个D-氨基酸残基的蛋白、L蛋白和D蛋白
28.权利要求27的蛋白，其选自鸡溶菌酶、Gaussia荧光素酶和大肠杆菌TrpRS。
29.权利要求26的蛋白，其具有可被解码为文本信息和/或数字信息和/或数据信息的序列，并且包含天然氨基酸和/或非天然氨基酸。
30.权利要求29的蛋白，其由mRNA#6编码。
31.通过权利要求14-21的任一项的方法获得的随机化或部分随机化的肽的文库，其中至少所述肽包含至少一个非天然氨基酸。
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