WO2023051396A1 - 三环多肽偶联药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供一种三环多肽偶联药物及其应用，具体提供式(Ⅲ)所示化合物及其药学上可接受的盐。
Description
本发明主张如下优先权：
CN2021111505175，申请日：2021年9月29日；
CN2021112166281，申请日：2021年10月19日。
本发明涉及一种三环多肽偶联药物及其应用，具体涉及式(Ⅲ)所示化合物及其药学上可接受的盐。
Nectin-4(poliovirus receptor like 4,PVRL4，结合素-4)是近年来新兴的肿瘤相关靶点，其隶属于Nectin蛋白家族，主要有Nectin 1-4四种亚型，与Nectin-like分子(Necl)共同构成免疫球蛋白样细胞粘附分子，对细胞间粘附和紧密连接的形成和保持具有重要作用。Nectin 1,2,3广泛存在于人体正常组织中，Nectin-4主要在胚胎和胎盘中高表达，在成年人体内表达量大幅度下降。研究表明，Nectin-4在多种肿瘤中过度表达，如膀胱癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌等，使其成为治疗相关癌症的潜在靶点。目前，针对该靶点研发的生物类抗体偶联药物Enfortumab vedotin已于2019年在美国批准上市，作为该靶点的唯一上市药物，其主要适应症被为转移型尿路上皮癌，同时另有多个适应症的临床有效性研究正在开展。因此，开发以Nectin-4为靶点的化学治疗药物具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明提供式(Ⅲ)所示化合物及其药学上可接受的盐，
其中，
R
1选自H和C
1-3烷基；
R
2选自H、C
1-4烷基和
n选自1、2、3和4；
Xi、Xii和Xiii分别独立地选自Cys、hCys、βCys和Pen。
在本发明的一些方案中，上述化合物选自式(III-1)和(III-2)所示结构，
其中，R
1、R
2、Xi、Xii和Xiii如本发明所定义。
本发明提供了式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
R
1选自H或C
1-3烷基；
R
2选自H、C
1-4烷基和
n选自1、2、3和4；
Xi、Xii和Xiii分别独立地选自Cys、hCys、βCys、Pen、Dap和N-methyl-Dap。
在本发明的一些方案中，上述化合物选自式(I-1)和(I-2)所示结构，
其中，R
1、R
2、Xi、Xii和Xiii如本发明所定义。
本发明还有一些方案由上述各变量任意组合而来。
本发明还提供了下式所示化合物或其药学上可接受的盐，
本发明还提供一种药物组合物，其含有治疗或预防有效量的本发明所述化合物及其药学上可接受的盐。
本发明还提供本发明的化合物、药学上可接受的盐及上述药物组合物在制备治疗Nectin-4过表达的实体瘤的药物中的应用。
本发明化合物还提供了如下的制备方法：
本发明还提供了如下的测试方法：
测试方法1本发明化合物与Nectin-4蛋白的结合能力测试
1.实验目的
用SPR法检测待测物与靶蛋白Nectin 4的亲和力。
2.材料和仪器
·Biacore 8K(GE Healthcare)
·96-well Plate(Cat#650101,greiner bio-one)
·CM5芯片(Cat#BR-1005-30,GE Healthcare)
·Amine Coupling Kit(Cat#BR-1000-50,GE Healthcare)
EDC
NHS
1M乙醇胺
·10mM醋酸钠pH4.5(Cat#BR-1003-50,GE Healthcare)
·DMSO(Cat#D4540,Sigma)
·P20(Cat#BR-1000-54,GE Healthcare)
·PBS(Cat#BR-1006-72,GE Healthcare)
·Nectin 4(Cat#1006-72,GE Healthcare)
3.实验方案
本实验采用氨基偶联法，即利用Biacore 8K将靶蛋白Nectin 4直接固定在CM5芯片上，然后将待测物作为分析物，用缓冲液(10mM PBS，pH7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，5％DMSO，0.05％P20)将待测物稀释到所需的浓度梯度，进行多循环动力学检测，每个循环进样180秒，解离180秒，然后再进行下一循环，获得靶蛋白Nectin 4与待测物的亲和力动力学分析数据。最终的数据用Biacore Insight Evaluation Software(V 2.0.15.12933)按1：1模型进行Kinetics拟合分析。
4.实验方法及流程
1)配制缓冲液：10mM PBS，pH7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，5％DMSO，0.05％P20。
2)CM5芯片活化：用400mM EDC和100mM NHS以10μL/min的流速活化420秒。
3)靶蛋白偶联：用10mM醋酸钠(pH 4.5)将靶蛋白稀释到10μg/mL，以10μL/min的流速偶联284s。实验使用了芯片上的1#，2#和3#通道，偶联结果分别为1639.9RU，1747.8RU和1702.2RU。
4)CM5芯片封闭：用1M乙醇胺以10μL/min的流速封闭420秒。
5)分析物浓度：使用缓冲液稀释待测物。待测物从100nM开始2倍梯度稀释至0.78nM。
6)进样分析：待测物工作液每个浓度为一个循环，以30μL/min的流速结合180秒，解离180秒。最后一个循环为5％DMSO溶剂校正循环。
7)所有结果按1:1模型进行kinetics拟合分析。
技术效果
本发明化合物与Nectin-4具有很强的结合作用，体外有显著的抗肿瘤细胞增殖活性，体内小鼠皮下瘤模型表现出强抑瘤效果，具有优异的体外代谢稳定性和PK性质。
图1：本发明化合物在人肺癌NCI-H292细胞皮下异种移植肿瘤模型上的肿瘤增长曲线；
图2：本发明化合物在人肺癌NCI-H292细胞皮下异种移植肿瘤模型上的动物体重变化曲线；
图3：本发明化合物对人乳腺癌MDA-MB-468细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型上肿瘤平均体积达到约500-600mm
3时开始分组给药的肿瘤增长曲线；
图4：本发明化合物对人乳腺癌MDA-MB-468细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型上肿瘤平均体积达到约500-600mm
3时开始分组给药的动物体重变化率。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机胺或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物接触的方式获得酸加成盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任意碱或酸加成盐。
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
术语“药学上可接受的辅料”是指与活性成份一同给药的、有利于活性成份给药的惰性物质，包括但不限于国家食品药品监督管理局许可的可接受的用于人或动物(例如家畜)的任何助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、 溶剂或乳化剂。所述辅料的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
术语“药物组合物”是指一种或多种本发明的化合物或其盐与药学上可接受的辅料组成的混合物。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本发明的化合物。
本发明的药物组合物可通过将本发明的化合物与适宜的药学上可接受的辅料组合而制备，例如可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等。
“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及起到与天然存在的氨基酸类似的作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(例如与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物可以具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指其结构不同于一般的氨基酸化学结构，但起到与天然存在的氨基酸相似的作用的化学化合物。
本发明的氨基酸序列含有二十种天然氨基酸的标准单字母或三字母代码。
术语“治疗”包括抑制、减缓、停止或逆转现有症状或病患的进展或严重程度。
术语“治疗有效量”或“有效量”意指本发明化合物实现以下作用的量：(i)治疗或预防特定疾病、病状或病症，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病状或病症的一或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病状、或病症的一或多种症状发作。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可减少癌细胞数目；减小肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓和优选停止)癌细胞浸润至周围器官中；抑制(即，在一定程度上减缓和优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一或多种症状。对于药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀灭现有癌细胞的程度，其可具有细胞生长抑制性和/或细胞毒性。
除非另有说明，术语“异构体”意在包括几何异构体、顺反异构体、立体异构体、对映异构体、旋光异构体、非对映异构体和互变异构体。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
除非另有说明，术语“对映异构体”或者“旋光异构体”是指互为镜像关系的立体异构体。
除非另有说明，术语“顺反异构体”或者“几何异构体”系由因双键或者成环碳原子单键不能自由旋转而引起。
除非另有说明，术语“非对映异构体”是指分子具有两个或多个手性中心，并且分子间为非镜像的关系的立体异构体。
除非另有说明，“(+)”表示右旋，“(-)”表示左旋，“(±)”表示外消旋。
除非另有说明，用楔形实线键
和楔形虚线键
表示一个立体中心的绝对构型，用直形实线键
和直形虚线键
表示立体中心的相对构型，用波浪线
表示楔形实线键
或楔形虚线键
或用波浪线
表示直形实线键
或直形虚线键
除非另有说明，术语“富含一种异构体”、“异构体富集”、“富含一种对映体”或者“对映体富集”指其中一种异构体或对映体的含量小于100％，并且，该异构体或对映体的含量大于等于60％，或者大于等于70％，或者大于等于80％，或者大于等于90％，或者大于等于95％，或者大于等于96％，或者大于等于97％，或者大于等于98％，或者大于等于99％，或者大于等于99.5％，或者大于等于99.6％，或者大于等于99.7％，或者大于等于99.8％，或者大于等于99.9％。
除非另有说明，术语“异构体过量”或“对映体过量”指两种异构体或两种对映体相对百分数之间的差值。例如，其中一种异构体或对映体的含量为90％，另一种异构体或对映体的含量为10％，则异构体或对映体过量(ee值)为80％。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(
3H)，碘-125(
125I)或C-14(
14C)。又例如，可用重氢取代氢形成氘代药物，氘与碳构成的键比普通氢与碳构成的键更坚固，相比于未氘化药物，氘代药物有降低毒副作用、 增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
当所列举的连接基团没有指明其连接方向，其连接方向是任意的，例如，
中连接基团L为-M-W-，此时-M-W-既可以按与从左往右的读取顺序相同的方向连接环A和环B构成
也可以按照与从左往右的读取顺序相反的方向连接环A和环B构成
所述连接基团、取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
除非另有规定，当某一基团具有一个或多个可连接位点时，该基团的任意一个或多个位点可以通过化学键与其他基团相连。当该化学键的连接方式是不定位的，且可连接位点存在H原子时，则连接化学键时，该位点的H原子的个数会随所连接化学键的个数而对应减少变成相应价数的基团。所述位点与其他基团连接的化学键可以用直形实线键
直形虚线键
或波浪线
表示。例如-OCH
3中的直形实线键表示通过该基团中的氧原子与其他基团相连；
中的直形虚线键表示通过该基团中的氮原子的两端与其他基团相连；
中的波浪线表示通过该苯基基团中的1和2位碳原子与其他基团相连。
除非另有规定，术语“C
1-4烷基”用于表示直链或支链的由1至4个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述C
1-4烷基包括C
1-2、C
1-3和C
2-3烷基等；其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。C
1-4烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(包括n-丙基和异丙基)、丁基(包括n-丁基，异丁基，s-丁基和t-丁基)等。
除非另有规定，术语“C
1-3烷基”用于表示直链或支链的由1至3个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述C
1-3烷基包括C
1-2和C
2-3烷基等；其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。C
1-
3烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(包括n-丙基和异丙基)等。
除非另有说明，本发明中氨基酸Xi、Xii和Xiii通过残基上的巯基与TATA相连；例如，当Xi为Pen时，
都表示
当Xi为βCys时，
都表示
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的常规方法来确认结构，如果本发明涉及化合物的绝对构型，则该绝对构型可以通过本领域常规技术手段予以确证。例如单晶X射线衍射法(SXRD)，把培养出的单晶用Bruker D8venture衍射仪收集衍射强度数据，光源为CuKα辐射，扫描方式：
扫描，收集相关数据后，进一步采用直接法(Shelxs97)解析晶体结构，便可以确证绝对构型。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
化合物依据本领域常规命名原则或者使用
软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
本发明所使用的溶剂可经市售获得，本发明中出现的混合溶剂的比例为体积比，例如，20％MeCN/H
2O表示混合溶剂中MeCN的体积占20％。
本发明采用下述缩略词：eq.代表当量、等量；SPPS代表多肽固相合成法；TFA代表三氟乙酸；DIEA代表二异丙基乙基胺；DMF代表N,N-二甲基甲酰胺；HATU代表2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；EDC代表1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS代表N-羟基琥珀酰亚胺；TIS代表三异丙基硅烷；DTT代表DL-1,4-二硫代苏糖醇；TATA代表
MMAE代表单甲基奥瑞他汀E，结构为：
PABC代表
Cit代表L-瓜氨酸；Val代表L-缬氨酸；Glutaryl代表
β-Ala代表
Sar代表
Sar10代表
Cys代表L-半胱氨酸；hCys代表
βCys代表
Pen代表
N-methyl- Dap代表
1Nal代表1-萘丙氨酸；hArg代表L-高精氨酸；Hyp代表L-羟脯氨酸；Trp代表L-色氨酸；Pro代表L-脯氨酸；Thr代表L-苏氨酸；Ser代表L-丝氨酸；Asp代表L-天门冬氨酸；dAsp代表D-天门冬氨酸；Fmoc代表9-芴甲氧羰基；Boc代表叔丁氧基羰基(Boc)；Trt代表三苯甲基；Pbf代表2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；PBS代表磷酸盐缓冲液。
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
实施例1
合成路线：
1.化合物3的合成
多肽合成：
该多肽使用标准的逐步合成方法合成。
1)将DCM加入到含有CTC Resin树脂(10.0mmol,10g,底物:1.0mmol/g)和Fmoc-Asp(OAll)-OH(3.95g,10.0mmol,1.0eq)的容器中。
2)加入DIEA(4.0eq)然后搅拌2小时.
3)加入MeOH(0.3mL)后，搅拌30min.
4)抽干，然后用DMF冲洗三次，每次氮气鼓动30秒。
5)加入20％哌啶/DMF，然后反应30min。
6)抽干，然后用DMF冲洗五次，每次氮气鼓动30秒。
7)加入下一个Fmoc保护的氨基酸的溶液，30秒后，加入缩合剂，N
2鼓吹反应将近1小时。
8)重复步骤4到步骤7缩合下一个氨基酸，合成化合物3所用到的氨基酸及缩合试剂的加料顺序如表1所示，至完成Fmoc-Lys(Alloc)-OH的连接。
9)抽干，然后用DMF冲洗三次，DCM冲洗三次，每次氮气鼓动30秒。
10)脱OAll和Alloc：在DCM树脂溶液中加入Pd(PPh
3)
4(0.1eq)和PhSiH
3(10.0eq)，N
2鼓吹反应将近15分钟，抽干，重复本步骤三次。
11)抽干，然后用DMF冲洗五次，每次氮气鼓动30秒。
12)关环：加入缩合剂溶液HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.)，N
2鼓吹反应将近1小时。
13)抽干，然后用DMF冲洗三次，甲醇洗三次。每次氮气鼓动30秒，抽干后干燥。
表1加料顺序
| # | 原料 | 缩合试剂 |
| 1 | Fmoc-Asp(OAll)-OH(1.0eq.) | DIEA(4.0eq.) |
| 2 | Fmoc-hArg(Pbf)-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 3 | Fmoc-Lys(Alloc)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
切割和纯化：
向含有侧链保护的多肽的烧瓶中加入切割缓冲溶液(20％HFIP/DCM)，置于室温下搅拌30分钟×2次。收集溶液并旋干，反相制备进行(NH
4HCO
3体系)纯化，冻干得到中间体3。
表2纯化条件
2.化合物4的TFA盐的合成
该多肽使用标准的逐步合成方法合成。
1)将DMF加入到含有Rink amide MBHA树脂(0.5mmol,1.56g,底物:0.32mmol/g)的容器中并且让树脂溶胀2小时。
2)抽干，然后用DMF冲洗三次，每次氮气鼓动30秒。
3)加入20％哌啶/DMF，然后反应30min。
4)抽干，然后用DMF冲洗五次，每次氮气鼓动30秒。
5)加入Fmoc保护的氨基酸溶液30秒，然后加入缩合剂，N
2鼓吹反应将近1小时。
6)重复步骤2到步骤5缩合下一个氨基酸。
合成化合物4所用到的氨基酸及缩合试剂的加料顺序如表3所示。
表3加料顺序
| # | 原料 | 缩合试剂 |
| 1 | Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 2 | Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 3 | Fmoc-Hyp(tBu)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 4 | Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 5 | Fmoc-Thr(tBu)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 6 | Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 7 | Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 8 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 9 | Fmoc-hArg(Pbf)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 10 | Fmoc-Met-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 11 | Fmoc-Pen(Trt)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 12 | Fmoc-dAsp(OtBu)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 13 | Fmoc-1Nal-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 14 | Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 15 | Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
| 16 | 化合物3(2.0eq.) | HATU(1.90eq.)和DIEA(4.0eq.) |
| 17 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 18 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 19 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 20 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 21 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 22 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 23 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 24 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 25 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 26 | Fmoc-Sar-OH(5.0eq.) | HATU(4.75eq.)和DIEA(10.0eq.) |
| 27 | Fmoc-β-Ala-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)和DIEA(6.0eq.) |
多肽切割和纯化：
1)向含有侧链保护的多肽的烧瓶中加入切割缓冲溶液(90％TFA/2.5％TIS/2.5％H
2O/5.0％DTT)，置于室温下搅拌2小时。
2)用冰的异丙醚将该多肽沉降出来，并用离心机(3min,3000rpm)离心分离。
3)用异丙醚再洗两次。
4)干燥粗品多肽得到中间体4的TFA盐。
2.化合物Peptide_1的乙酸盐的合成
将上述中间体4的TFA盐的粗品(2.4g)溶解在50％MeCN/H
2O(1L)中，在室温下向搅拌着的溶液中缓慢加入TATA(0.5mmol)，反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后用NH
4HCO
3调节pH值到8，反应继续在室温搅拌12小时。LCMS显示反应完全，停止搅拌，通过反相制备进行纯化得到化合物Peptide_1的乙酸盐。
表4纯化条件
Peptide_2，Peptide_3的合成可参考Peptide_1的合成，结构见表5。
表5 Peptide_1～3的结构序列
4.化合物INT_1的TFA盐的合成
将化合物1-1(200.0mg,178.0μmol)溶于DMF(5mL)中，在0℃下加入DIEA(31.0μL,178.0μmol)，搅拌10min，同时将化合物1-2(290.4mg,890.1μmol)用另外一个反应瓶，也溶于DMF(5mL)，在0℃下搅拌10min，然后在0℃下将化合物1-1的反应液滴加到搅拌着的化合物1-2的反应液中，此反应液在0℃下搅拌30min，将反应液过滤除去不溶的残渣，滤液直接用反相制备(流动相：A:H
2O含0.075％TFA B:CH
3CN，梯度：10％-40％(B)，42min)纯化，得到化合物INT_1的TFA盐。
5.化合物PDC_1的乙酸盐的合成
将化合物Peptide_1的乙酸盐(34.0mg,10.1μmol)溶于DMF(0.3mL)中，然后加入DIEA(7.00μL,40.4μmol)，在室温下搅拌10分钟。接着将化合物INT_1的TFA盐(13.4mg,10.1μmol)溶于DMF(0.2mL)中，滴加到上述反应液中，然后，在室温下搅拌2小时。将反应液过滤除去不溶的残渣，滤液直接用反相制备(流动相：A:H
2O含0.075％TFA；B:CH
3CN，梯度：10％-40％(B)，42min)纯化，冻干，然后再通过制备转化成乙酸盐，得到化合物PDC_1的乙酸盐。MS m/z:1533.4(M+3H
+)/3.
实施例2
合成路线1：
PDC_2的乙酸盐参考PDC_1的乙酸盐的合成路线制备(用Peptide_2替换Peptide_1参与反应)。MS m/z:1500.5(M+3H
+)/3。
合成路线2：
步骤1：中间体5的合成
该多肽使用标准的逐步合成方法合成。
1)将DMF加入到含有Rink amide MBHA树脂(5.0mmol,8.33g,底物:0.60mmol/g)的容器中并且让树脂溶胀2小时。
2)抽干，然后用DMF冲洗三次，每次氮气鼓动30秒。
3)加入20％哌啶/DMF，然后反应30min。
4)抽干，然后用DMF冲洗五次，每次氮气鼓动30秒。
5)加入Fmoc保护的氨基酸溶液30秒，然后加入缩合剂，N
2鼓吹反应将近1小时。
6)重复步骤2到步骤5缩合下一个氨基酸。
合成中间体5所用到的氨基酸及缩合试剂的加料顺序如表6所示。
表6加料顺序
| # | 原料 | 缩合试剂 |
| 1 | Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 2 | Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 3 | Fmoc-Hyp(tBu)-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 4 | Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 5 | Fmoc-Thr(tBu)-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 6 | Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 7 | Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 8 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) | HBTU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 9 | Fmoc-HArg(Pbf)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 10 | Fmoc-Met-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 11 | Fmoc-Pen(Trt)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 12 | Fmoc-dAsp(OtBu)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 13 | Fmoc-1Nal-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 14 | Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 15 | Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 16 | Fmoc-Asp(OAll)-OH(2.0eq.) | HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.) |
| 17 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 18 | Fmoc-Lys(Alloc)-OH(2.0eq.) | HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.) |
| 19 | 脱去OAll和Alloc保护基 | Pd(PPh 3) 4(0.1eq)and PhSiH 3(10.0eq) |
| 20 | 环合 | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 21 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 22 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 23 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 24 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 25 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 26 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 27 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 28 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 29 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 30 | Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
| 31 | Fmoc-β-Ala-OH(3.0eq.) | HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.) |
7)向含有侧链保护的多肽的烧瓶中加入切割缓冲溶液(90％TFA/2.5％TIS/2.5％H
2O/5.0％DTT)，置于室温下搅拌2小时。
8)用冰的异丙醚将该多肽沉降出来，并用离心机(3min,3000rpm)离心分离。
9)用异丙醚再洗两次。
10)干燥粗品多肽得到中间体5的粗品。
步骤2：Peptide_2的乙酸盐的合成
中间体5粗品(15.0g)溶解在50％MeCN/H
2O(5L)中，在室温下向搅拌着的溶液中缓慢加入TATA(7.5mmol)，反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后用NH
4HCO
3调节pH值到8，反应继续在室温搅拌12小时。LCMS显示反应完全，停止搅拌，通过反相制备(一纯：流动相：A:H
2O含0.075％TFA B:CH
3CN，梯度：10％-40％B相42min，保留时间:29min；二纯：流动相:A:H
2O含0.5％AcOH B:CH
3CN，梯度：20％-40％40min，保留时间:21min；三纯：流动相:A:H
2O含0.5％AcOH B:CH
3CN，梯度：16％-36％(B)；40min，保留时间:26min)进行纯化得到中间体Peptide_2的乙酸盐。
步骤3：PDC_2的乙酸盐的合成
将中间体Peptide_2的乙酸盐(369mg)和INT_1(150mg)溶于DMF(6.00mL)中，加入DIEA(58.0mg)。室温下搅拌5小时,LC-MS显示反应完全，停止反应。将反应液过滤除去不溶的残渣，滤液直接用反相制备(流动相：A:H
2O含0.075％TFA；B:CH
3CN，梯度：10％-40％(B)，42min)纯化，冻干，然后再通过制备转AcOH盐，得到PDC_2的乙酸盐。MS m/z:1500.3(M+3H
+)/3.
实施例3
PDC_3的乙酸盐参考PDC_1的乙酸盐的合成方法制备得到(用Peptide_3替换Peptide_1参与反应)。MS m/z:1504.8(M+3H
+)/3.
生物测试数据：
测试例1本发明化合物与Nectin-4蛋白的结合能力测试
1.实验目的
用SPR法检测待测物与靶蛋白Nectin-4的亲和力。
2.材料和仪器
·Biacore 8K(GE Healthcare)
·96孔板(Cat#650101,greiner bio-one)
·CM5芯片(Cat#BR-1005-30,GE Healthcare)
·Amine Coupling Kit(Cat#BR-1000-50,GE Healthcare)
EDC
NHS
1M乙醇胺
·10mM醋酸钠pH4.5(Cat#BR-1003-50,GE Healthcare)
·DMSO(Cat#D4540,Sigma)
·P20(Cat#BR-1000-54,GE Healthcare)
·PBS(Cat#BR-1006-72,GE Healthcare)
·Nectin-4(Cat#1006-72,GE Healthcare)
3.实验方案
本实验采用氨基偶联法，即利用Biacore 8K将靶蛋白Nectin-4直接固定在CM5芯片上，然后将待测物作为分析物，用缓冲液(10mM PBS，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，5％DMSO，0.05％P20)将待测物稀释到所需的浓度梯度，进行多循环动力学检测，每个循环进样180秒，解离180秒，然后再进行下一循环，获得靶蛋白Nectin-4与待测物的亲和力动力学分析数据。最终的数据用Biacore Insight Evaluation Software(V 2.0.15.12933)按1:1模型进行Kinetics拟合分析。
4.实验方法及流程
1)配制缓冲液：10mM PBS，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，5％DMSO，0.05％P20。
2)CM5芯片活化：用400mM EDC和100mM NHS以10μL/min的流速活化420秒。
3)靶蛋白偶联：用10mM醋酸钠(pH 4.5)将靶蛋白稀释到10μg/mL，以10μL/min的流速偶联284s。实验使用了芯片上的1#，2#和3#通道，偶联结果分别为1639.9RU，1747.8RU和1702.2RU。
4)CM5芯片封闭：用1M乙醇胺以10μL/min的流速封闭420秒。
5)分析物浓度：使用缓冲液稀释待测物。待测物从100nM开始2倍梯度稀释至0.78nM。
6)进样分析：待测物工作液每个浓度为一个循环，以30μL/min的流速结合180秒，解离180秒。最后一个循环为5％DMSO溶剂校正循环。
7)所有结果按1:1模型进行kinetics拟合分析。
5.实验结果
选取5个有效浓度的实验数据用Biacore Insight Evaluation Software(V 2.0.15.12933)按1:1模型进行Kinetics拟合分析，结果见表7：
表7本发明化合物与Human Nectin-4SPR结合结果
| 化合物 | Human Nectin-4 SPR k D(nM) |
| PDC_1的乙酸盐 | 1.4 |
| PDC_2的乙酸盐 | 0.43 a |
| PDC_3的乙酸盐 | 4.13 |
a两次测试的平均值。
结论：本发明化合物与Nectin-4具有很强的结合作用。
测试例2：本发明化合物对NCI-H292和MDA-MB-468细胞体外抗增殖活性
1.实验目的
通过检测本发明化合物在肿瘤细胞系MDA-MB-468和NCI-H292中对体外细胞活性的影响而研究化合物抑制细胞增殖的作用。
2.实验设计：
细胞培养
将肿瘤细胞系按表8所示的培养条件分别放在37℃，无CO
2和37℃，5％CO
2的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。
表8细胞系及其培养方法
| 细胞系 | 细胞类型 | 来源 | 货号 | 生长特点 | 培养方法 |
| NCI-H292 | 人肺癌 | ATCC | CRL-1848 | 贴壁 | RPMI 1640+10％FBS |
| MDA-MB-468 | 人乳腺癌 | ATCC | HTB-132 | 贴壁 | Leibovitz's L-15+10％FBS |
细胞铺板
收集处于对数生长期的细胞，室温，1000rpm离心3min。吸弃上清，5mL培养基重悬细胞，吸取20μL细胞悬液与台盼兰1:1混合，染色3min检测细胞活率，并计数活细胞。将细胞密度调整至3000个/孔。培养板中每孔加入90μL细胞悬液，在空白对照孔中加入不含细胞的培养液。将培养板分别放在37℃，无CO
2和37℃,5％CO
2,及100％相对湿度的培养箱中培养过夜。
化合物存储板制备
制备400X化合物存储板：将测试化合物用DMSO从最高浓度梯度稀释至最低浓度。
表9 400X存储板稀释浓度
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| 浓度(μM) | 400 | 133.33 | 44.444 | 14.815 | 4.938 | 1.646 | 0.549 | 0.183 | 0.061 |
10X化合物工作液的配制及化合物处理细胞
10X化合物工作液的配制：在V形底的96孔板中加入78μL细胞培养液，从400X化合物存储板中吸取2μL各个浓度化合物溶液加入96孔板的细胞培养液中。在溶媒对照和空白对照中加入2μL DMSO。加入化合物或DMSO后用排枪吹打混匀。加药：取10μL的10X化合物工作液按加入到细胞培养板中。在溶媒对照和空白对照中加入10μL DMSO-细胞培养液混合液。将96孔细胞板放回培养箱中培养72h。
CellTiter-Glo发光法细胞活性检测
按照Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)的说明书来进行。在
Multi-mode Plate Reader(EnVision 2104-10)读板器上检测发光信号。
数据分析
用下列公式来计算检测化合物的抑制率(Inhibition rate，IR)：IR(％)＝(1–(RLU化合物–RLU空白对照)/(RLU溶媒对照–RLU空白对照))*100％。在Excel中计算不同浓度化合物的抑制率，然后用GraphPad Prism 6.02软件作抑制曲线图和计算相关参数，包括最小抑制率，最大抑制率及IC
50。
实验结果见表10。
表10本发明化合物抗肿瘤细胞增殖结果
| 肿瘤细胞系 | 化合物 | IC 50(μM) | 最小抑制率(％) | 最大抑制率(％) |
| NCI-H292 | PDC_2的乙酸盐 | 0.0421 | 1.55 | 81.32 |
| MDA-MB-468 | PDC_2的乙酸盐 | 0.0323 | -10.28 | 86.28 |
两轮结果IC
50差值在2倍以内。
结论：本发明化合物在肿瘤细胞系MDA-MB-468和NCI-H292中对体外培养的细胞有明显增殖抑制作用。测试例3：本发明化合物在人肺癌NCI-H292细胞皮下异种移植肿瘤模型上的体内药效
1.实验目的：考察本发明化合物在人肺癌NCI-H292细胞皮下异种移植肿瘤小鼠模型上的体内药效
2.实验设计：
■细胞培养：人肺癌NCI-H292细胞(ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州,货号：CRL-1848)体外单层培养，培养条件为RPMI 1640培养基中加10％胎牛血清，37℃5％CO
2孵箱培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数，接种。
■动物：BALB/c裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重17-21克。
■肿瘤接种：将0.2mL(1×10
7个)NCI-H292细胞皮下接种于每只小鼠的右后背。
■药效研究：肿瘤平均体积达到约100-200mm
3时开始分组静脉注射给药，6只/组。给药剂量：1.5mg/kg，给药频次：QW×3。
■观察：本实验方案的拟定及任何修改将在上海药明康德实验动物伦理委员会(IACUC)进行评估核准后方可实行。实验动物的使用及福利将遵照国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)的规则执行。每天监测动物的健康状况及死亡情况，例行检查包括观察肿瘤生长和药物治疗对动物日常行为表现的影响如行为活动，摄食摄水量，体重变化(每周测量两次体重)，外观体征或其它不正常情况。基于各组动物数量记录组内动物死亡数和副作用。
■实验终止：若动物健康状况持续恶化，或瘤体积超过2000mm
3，或有严重疾病，或疼痛，须处以安乐死。
■数据分析：T检验用于两组间比较。三组或多组间比较用one-way ANOVA。如果F值有显著性差异，应在ANOVA分析之后再进行多重比较。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。
药物配制：
配制药物频率：首次给药前统一配置成储备液分装冻存至-80℃冰箱。
给药体积：根据动物体重调整给药体积(给药体积＝10μL/g)
表11化合物配制详细方案
实验结果：见图1和图2。
实验结论：本发明化合物在人肺癌NCI-H292细胞皮下异种移植肿瘤模型中表现出明显的抑制肿瘤生长作用。
测试例4：本发明化合物对人乳腺癌MDA-MB-468细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究
实验目的：评价本发明化合物在人乳腺癌MDA-MB-468细胞皮下异种移植肿瘤模型上的体内药效。
细胞培养：人乳腺癌MDA-MB-468细胞(ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州,货号：HTB-132)体外单层培养，培养条件为L-15培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃，0％CO
2孵箱培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数，接种。
动物：BALB/c裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克。由北京维通利华公司提供。
肿瘤接种：将0.2mL(1×10
7个)MDA-MB-468细胞(加基质胶，体积比为1:1)皮下接种于每只小鼠的右后背。
给药体积：根据动物体重调整给药体积(给药体积＝10μL/g)
药物配制：待测化合物以25mM L-组氨酸(pH＝7)10％蔗糖为溶媒配成1.5mg/mL均一溶液，储存在-80℃冰箱中。给药当天，稀释成相应浓度，用于IV(静注)组给药。
分组：肿瘤平均体积达到约500-600mm
3时开始分组给药，给药剂量：5mg/kg，给药频次：QW×4。
实验结果见图3和图4。
实验结论：本发明化合物的在人乳腺癌细胞MDA-MB-468皮下异种移植肿瘤模型中，较大体积分组情况下，仍表现出明显的抑制肿瘤生长作用，呈现出剂量相关性，未发现不良反应且平均体重未出现降低5％及以上情况，安全性良好。
测试例5:本发明化合物大鼠血浆药代动力学分析
A.实验目的
测试本发明化合物在SD大鼠体内药代动力学
B.实验操作
以标准方案测试化合物静脉注射后大鼠药代特征，待测化合物配成澄清溶液，溶媒：25mM L-组氨酸(pH＝7)10％蔗糖，给予2只大鼠单次静脉注射3mg/kg待测化合物。按照给药后0.083,0.25,0.5,1,2,4,8,24小时为时间点，收集全血，制备得到血浆，以LC-MS/MS方法分析本发明化合物和其潜在代谢产物MMAE的浓度，并用Phoenix WinNonlin软件计算药代参数。
C.实验结果
实验结果如表12所示。
表12大鼠药代动力学测试结果
结论：本发明化合物在大鼠血液中半衰期短，清除快，代谢产物MMAE的暴露量仅约为本发明化合物暴露量的1/40，安全性良好。
测试例6:食蟹猴血浆药代动力学分析
A.实验目的
测试本发明化合物在食蟹猴体内药代动力学
B.实验操作
以标准方案测试化合物静脉注射后食蟹猴药代特征，待测化合物配成澄清溶液，溶媒：25mM L-组氨酸(pH＝7)10％蔗糖，给予食蟹猴单次静脉注射1mg/kg待测化合物。按照给药后0.083,0.25,0.5,1,2,4,8,24小时为时间点，收集全血，制备得到血浆，以LC-MS/MS方法分析待测化合物和其潜在代谢产物MMAE的浓度，并用Phoenix WinNonlin软件计算药代参数。
C.实验结果
实验结果如表13所示。
表13食蟹猴药代动力学测试结果
结论：本发明化合物在食蟹猴血液中半衰期短，清除快，血液中MMAE释放低于检测限，安全性佳。
测试例7：本发明化合物在小鼠、大鼠和食蟹猴和人肝细胞中的代谢稳定性
A.实验目的
考察本发明化合物在小鼠、大鼠和食蟹猴和人肝细胞中的代谢稳定性
B.实验操作
孵育在96孔板中完成，采用外取法。准备若干96孔样品沉淀板，分别命名为T0、T15、T30、T60、T90、T0-MC、T90-MC和空白基质。提前取出复苏培养液和孵育培养液，放置在37℃水浴锅中预热。从液氮罐中取出冻存的CD-1小鼠、SD大鼠、食蟹猴和人的肝细胞复苏，用孵育培养液将细胞稀释至0.51×10
6cells/mL。将198μL的肝细胞混悬液(0.5×10
6cells/mL)加入到已预热的孵育板中，培养液对照组加入198μL不含肝细胞的孵育培养液至T0-MC和T90-MC孵育板中，所有孵育板在37℃培养箱中预孵育10分钟。然后加入2μL供试品和对照化合物工作液，混匀，放入培养箱内的摇板机中孵育。每个时间点准备3个重复样本。孵育条件为37℃、饱和湿度、含5％CO
2。测试体系中，供试品的终浓度为1μM，对照品的终浓度为3μM，肝细胞的终浓度为0.5×10
6cells/mL，总有机溶剂的终浓度为1.0％，其中DMSO的终浓度为0.1％。
相应时间点孵育结束时，取出孵育板，取出25μL化合物和对照化合物与细胞的混合液分别加入到含有125μL终止液的样品板中。对于空白样品板，直接加入25μL不含肝细胞的孵育培养液。所有样品板封膜后在摇板机上以600rpm摇10分钟后，3220×g离心20分钟。供试品和对照品上清液用纯水以1:3的比例稀释。所有样品混匀后用LC-MS/MS的方法进行分析。
样品中待测化合物和对照品的浓度采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法进行半定量测定，不含标准曲线和质控样品。使用分析物峰面积与内标峰面积的比值来表示样品中的浓度。分析物和内标的保留时间、色谱图采集和色谱图的积分采用软件Analyst(Sciex,Framingham,Massachusetts,USA)进行处理。
C.实验结果
实验结果如表14所示。
表14本发明化合物分别在人、CD-1小鼠、食蟹猴和人肝细胞中的代谢稳定性结果
结论：本发明化合物在4个种属肝微粒体中具有优异的代谢稳定性。
测试例8：本发明化合物在小鼠、大鼠和食蟹猴和人肾S9中的代谢稳定性
A.实验目的
考察本发明化合物在小鼠、大鼠和食蟹猴和人肾S9中的代谢稳定性
B.实验操作
材料：CD-1小鼠，SD大鼠，食蟹猴和人肾S9购买于BioIVT或XenoTech LLC，储存于-80℃冰箱。
实验步骤：准备8块96孔孵育板，分别命名为T0、T5、T15、T30、T45、T60、Blank和NCF60。前6块孵育板对应的反应时间点分别为0、5、15、30、45和60分钟。Blank板中不加入供试品或对照化合物。
在T0、T5、T15、T30、T45、T60板上分别加入2μL供试品工作液(10mM待测化合物的DMSO溶液，用100％乙腈稀释到100μM)和100μL S9工作液(肾S9蛋白浓度为1.0mg/mL)，在Blank板中只添加S9工作液，然后将上述孵育板放置于37℃水浴锅中预孵育大约10分钟。
预孵育结束后，除T0板外，每个样品孔内添加98μL辅酶工作液以启动反应。孵育适当时间(如5、15、30、45和60分钟)后，分别在每个样品孔中加入600μL的终止液(含100ng/mL甲苯磺丁脲和100ng/mL拉贝洛尔的乙腈溶液)以终止反应。T0板的制备：在T0板中先加入600μL终止液然后再加入98μL辅酶工作液。所有样品板摇匀并在3220×g离心20分钟，然后每孔取100μL上清液稀释到300μL纯水中用于液相色谱串联质谱分析。
C.实验结果
实验结果如表15所示。
表15本发明化合物在CD-1小鼠、SD大鼠、食蟹猴和人肾S9中的代谢稳定性结果
结论：本发明化合物在4个种属肾S9中具有优异的代谢稳定性。
测试例9：本发明化合物不同种属血浆稳定性分析
A.实验目的
测试本发明化合物在SD大鼠、食蟹猴和人血浆中的稳定性
B.实验操作
将2μL待测化合物(100μM)的工作液加入到对应的孵育板中，包括T0、T10、T30、T60、T120和T240孵育板，每个样品准备三个平行孔。然后在已经加入工作液的孵育板中对应的加入98μL的SD大鼠、猴和人空白血浆。所有的样品在37℃水浴锅中进行孵育。待测化合物的最终孵育浓度为2μM。每一个孵育时间点结束时，取出相应的孵育板，加入终止液，沉淀蛋白，离心20分钟，取150μL上清液用LC-MS/MS的方法分析。样品中待测化合物的浓度采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法进行半定量测定。
C.实验结果
实验结果如表16所示。
表16本发明化合物分别在SD大鼠、食蟹猴和人血浆中稳定性结果
结论：本发明化合物3个种属中半衰期均大于578.1min，具有优异的稳定性。
Claims (5)
- 式(III)所示化合物或其药学上可接受的盐，
其中，R 1选自H和C 1-3烷基；R 2选自H、C 1-4烷基和
n选自1、2、3和4；Xi、Xii和Xiii分别独立地选自Cys、hCys、βCys和Pen。 - 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，化合物选自式(I-1)和(I-2)所示结构，
其中，R 1、R 2、Xi、Xii和Xiii如权利要求1所定义。 - 下列化合物或其药学上可接受的盐，
- 一种药物组合物，其含有治疗或预防有效量的权利要求1-3中任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐。
- 权利要求1-3中任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求4所述的药物组合物在制备治疗Nectin-4过表达的实体瘤的药物中的应用。
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