CN107148425A - 对mt1‑mmp特异性的双环肽配体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与分子骨架共价结合的多肽，使得在与骨架的连接点之间对接两个或多个肽环。特别地，本发明描述了作为膜1型金属蛋白酶(MT1‑MMP)的高亲和力结合剂的肽。本发明还描述了包含所述肽的药物缀合物，所述肽与可用于成像和靶向癌症治疗的一种或多种效应子和/或官能团缀合。

Description

对MT1-MMP特异性的双环肽配体
技术领域
本发明涉及与分子骨架(molecular scaffold)共价结合的多肽，使得在与骨架的连接点之间对接(subtend)两个或多个肽环。特别地，本发明描述作为膜1型金属蛋白酶(MT1-MMP)的高亲和力结合剂的肽。本发明还描述包含所述肽的药物缀合物，所述肽与可用于成像和靶向癌症治疗的一种或多种效应子(effector)和/或官能团缀合。
背景技术
环肽能够以高亲和力和靶向特异性结合于蛋白质靶标，因此是治疗学发展的有吸引力的一类分子。事实上，临床上已经成功使用了几种环肽，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制剂药物环孢菌素或抗癌药奥曲肽(Driggers等人(2008),Nat Rev Drug Discov 7(7),608-24)。良好的结合性质来源于肽和靶标之间形成的相对大的相互作用表面以及环状结构的降低的构象柔性。典型地，大环结合于数百平方埃的表面，例如环肽CXCR4拮抗剂CVX15(Wu等人(2007),Science 330,1066-71)，结合整合蛋白αVb3的具有Arg-Gly-Asp基序的环肽(Xiong等人(2002),Science 296(5565),151-5)，或与尿激酶型纤溶酶原激活物结合的环肽抑制剂upain-1(Zhao等人(2007),J Struct Biol 160(1),1-10)。
由于其环状构型，肽大环化合物较线性肽柔性小，导致其与靶标结合时熵的损失较小并产生更高的结合亲和力。降低的柔性还导致锁定靶标特异性构象，与线性肽相比增加结合特异性。这种作用已经通过一种有效的、选择性基质金属蛋白酶8(MMP-8)抑制剂来例证，当其环被打开时该抑制剂丧失对其它MMP的选择性(Cherney等人(1998),J Med Chem41(11),1749-51)。通过大环化获得的有利的结合性质在具有一个以上肽环的多环肽中更为显着，例如在万古霉素、乳链菌肽和放线菌素中。
不同的研究团队以前已经将具有半胱氨酸残基的多肽连接到合成分子结构上(Kemp和McNamara(1985),J.Org.Chem；Timmerman等人(2005),ChemBioChem)。Meloen及其同事已经使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速和定量地环化到合成骨架上，用于蛋白质表面的结构模拟(Timmerman等人(2005),ChemBioChem)。WO 2004/077062和WO2006/078161中公开了产生候选药物化合物的方法，其中所述化合物通过将含半胱氨酸的多肽与分子骨架例如三(溴甲基)苯连接产生。
已经开发了基于噬菌体展示的组合方法以产生并筛选出对于目标靶标的双环肽的大型文库(Heinis等人(2009),Nat Chem Biol 5(7),502-7和WO2009/098450)。简言之，在噬菌体上展示含有三个半胱氨酸残基和六个随机氨基酸的两个区域(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)的线性肽的组合文库，并通过将半胱氨酸侧链共价连接至一个小分子(三(溴甲基)苯)而环化。
发明内容
根据本发明的第一方面，本发明提供一种对MT1-MMP特异性的肽配体，其包含多肽和分子骨架，所述多肽含有至少三个半胱氨酸残基，并被至少两个环序列分隔；所述分子骨架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在所述分子骨架上形成至少两个多肽环；其中所述肽配体包含式(I)的氨基酸序列：
-Ci-X-U/O-X-X-G-Cii-E-D-F-Y-X-X-Ciii-(SEQ ID NO:1)
(I)
或其修饰的衍生物，或其药学上可接受的盐；
其中：
Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X代表任何氨基酸残基；
U代表选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基；和
O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基。
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种药物缀合物，其包含与一个或多个效应子和/或官能团例如细胞毒性剂，特别是DM1和MMAE缀合的如本文定义的肽配体。
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种缀合物，其包含与一个或多个效应子和/或官能团例如带有螯合基团的放射性核素，特别是DOTA缀合的如本文所定义的肽配体。
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文定义的肽配体或药物缀合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种如本文定义的肽配体，其用于预防、抑制或治疗癌症，特别是实体瘤如非小细胞肺癌的用途。
附图说明
图1：17-69-07-N219的小鼠血浆稳定性。如图例中所示，监测数个离子，以及MRM模式中的两个转换。离子之间存在很好的相关性。小鼠血浆中肽在37℃的半衰期为6小时。
图2：小鼠中双环肽17-69-07-N004的PK曲线(profile)。每个时间点2只动物。
图3：两种稳定化的17-69-07分子(在9位具有4-溴苯丙氨酸：17-69-07-N244，在9位不具有4-溴苯丙氨酸：17-69-07-N231)的(A)小鼠和(B)人血浆稳定性，与非稳定化的17-69-07-N219相比。监测给定分析物的数个MRM转换，其彼此之间很好关联。为了该图的目的，仅显示一个转换。
图4：177Lu 17-69-07-N144在HT-1080异种移植小鼠中的生物分布。
图5：177Lu 17-69-07-N246在HT-1080异种移植小鼠中的生物分布。
图6：177Lu 17-69-07-N248在HT-1080异种移植小鼠中的生物分布。
图7：(A)：BT17BDC-1和9的平均肿瘤体积相对于时间的图。在第0、2、4、7、9和11天施用剂量。(B)：治疗期间的体重，其表明药物相关的毒理学和整体动物健康。
图8：使用具有17-69的固定环2个残基的文库的亲和力成熟得出的序列输出列表。右边的序列标志图显示了环1残基1、2、3、4和5中的残基的总体偏好。
图9：上图：BT17BDC-17在EBC-1异种移植小鼠中平均肿瘤体积相对于时间的图。在第0、2、4、7、9、11和14天施用剂量。下图：治疗期间的体重，其表明药物相关的毒理学和整体动物健康。
图10：上图：BT17BDC-18在EBC-1异种移植小鼠中平均肿瘤体积相对于时间的图。在第0、2、4、7、9、11和14天施用剂量。下图：治疗期间的体重，其表明药物相关的毒理学和整体动物健康。
图11：上图：BT17BDC-19在EBC-1异种移植小鼠中平均肿瘤体积相对于时间的图。在第0、2、4、7、9、11和14天施用剂量。下图：治疗期间的体重，其表明药物相关的毒理学和整体动物健康。
图12：上图：BT17BDC-20在EBC-1异种移植小鼠中平均肿瘤体积相对于时间的图。在第0、2、4、7、9、11和14天施用剂量。下图：治疗期间的体重，其表明药物相关的毒理学和整体动物健康。
图13：与特定BDC相关的肿瘤体积随时间的曲线下面积(AUC)相对于对应剂量组的图。使用标准IC 50方程，使用在零时刻对肿瘤体积进行归一化的所有可用数据点进行曲线拟合。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义，例如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域。对于分子生物学、遗传和生物化学方法使用标准技术(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版,John Wiley&Sons,Inc.)，其通过引用并入本文。
术语
编号
当提及式(I)化合物中的氨基酸残基的位置时，半胱氨酸残基(Ci、Cii和Ciii)的编号省略，因为其是不变的，因此式(I)化合物中的氨基酸残基的编号如下所示：
-Ci-X1-U/O2-X3-X4-G5-Cii-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-Ciii-(SEQ ID NO:1)。
对于本说明书的目的，假设所有双环肽与TBMB(1,3,5-三(溴甲基)苯)环化得到三取代的1,3,5-三甲基苯结构。在Ci、Cii和Ciii上发生与TBMB的环化反应。
双环肽核心序列
对本文公开的每个双环肽指定一个独有的核心序列号，其被定义为第一N-末端半胱氨酸(Ci)和最后一个C-末端半胱氨酸(Ciii)之间的氨基酸序列。在标识符17-69-07的例子中，核心序列是CiYNEFGCiiEDFYDICiii(SEQ ID NO：2)，并且其被称为“17-69-07”或“(17-69-07)”。
肽编码
对本文公开的某些双环肽也指定一个独有的标识符，使用肽编码，例如17-69-07-N241，其中N241表示17-69-07双环核心序列的特定衍生物。17-69-07的不同衍生物具有不同的N数字，即N001、N002、Nxxx。
分子格式
将双环核心序列的N-末端或C-末端延伸部分添加到核心序列的左侧或右侧，用连字符分隔。例如，N末端βAla-Sar10-Ala尾部将被表示为：
βAla-Sar10-A-(17-69-07)
并且具有βAla-Sar10-A-CYNEFGCEDFYDIC(SEQ ID NO：3)的全序列。
修饰
双环核心序列中的非天然氨基酸取代在分子格式描述(Molecular Formatdescription)之后表示。例如，如果17-69-07中的酪氨酸1被D-丙氨酸取代，则描述为(17-69-07)D-Ala1，并且全序列将被描述为C(D-Ala1)NEFGCEDFYDIC(SEQ ID NO：4)。
如果将N末端或C末端的尾部连接到还含有对核心序列的修饰的双环肽，则以17-69-07-N241为例，分子格式描述是：
βAla-Sar10-A-(17-69-07)DAla1 1NAl4 DAla5 tBuGly11。
因此，17-69-07-N241的全氨基酸序列为：
βAla-Sar10-A-C(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C(SEQ ID NO：5)。
肽配体
本文所述的肽配体是指与分子骨架共价结合的肽。典型地，这样的肽包含能够与骨架形成共价键的两个或多个反应性基团(即，半胱氨酸残基)，和所述反应性基团之间的对接的序列，所述序列被称为环序列，因为当肽与骨架结合时其形成环肽。在这种情况中，肽包含至少三个半胱氨酸残基(本文称为Ci、Ci和Ciii)，并在骨架上形成至少两个环。
本领域技术人员将理解，式(I)的1、3、4、10和11位的X可以代表在丙氨酸扫描结果(参见表5)和选择输出(图8)之后的任何氨基酸，其允许在这些位置良好耐受的取代。
在一个实施方案中，式(I)的1位的X选自任何一种以下氨基酸：Y、M、F或V。在一个进一步实施方案中，式(I)的1位的X选自Y、M或F。在一个更进一步实施方案中，式(I)的1位的X选自Y或M。在一个依然更进一步实施方案中，式(I)的1位的X选自Y。
在一个实施方案中，式(I)的2位的U/O选自U，例如N。在一个替代实施方案中，式(I)的2位的U/O选自O，例如G。
在一个实施方案中，式(I)的3位的X选自U或Z，其中U代表选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基，并且Z代表选自D或E的极性、带负电荷的氨基酸残基。在一个进一步实施方案中，式(I)的3位的U选自Q。在一个替代实施方案中，式(I)的3位的Z选自E。
在一个实施方案中，式(I)的4位的X选自J，其中J代表选自F、W和Y的非极性芳香族氨基酸残基。在一个进一步实施方案中，式(I)的4位的J选自F。在替代实施方案中，式(I)的4位的J选自Y。在替代实施方案中，式(I)的4位的J选自W。
在一个实施方案中，式(I)的10位的X选自Z，其中Z代表选自D或E的极性、带负电荷的氨基酸残基。在一个实施方案中，式(I)的10位处的Z选自D。
在一个实施方案中，式(I)的11位的X选自O，其中O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基。在一个实施方案中，式(I)的11位的O选自I。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Ia)的化合物：
-Ci-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-Cii-E-D-F-Y-Z-O-Ciii-(SEQ ID NO：6)
(Ia)；
其中，U、O、J和Z如本文之前所定义。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Ib)的化合物：
-Ci-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：7)
(Ib)。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Ic)的化合物：
-Ci-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：8)
(Ic)。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Id)的化合物：
-Ci-Y/M-N-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：9)
(Id)。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Ie)的化合物：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)
(Ie)。
在一个更进一步实施方案中，式(I)的肽包含选自以下的序列：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)；
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-12)(SEQ ID NO：10)；
-Ci-F-G-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-02)(SEQ ID NO：11)；
-Ci-V-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-03)(SEQ ID NO：12)；
-Ci-F-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-04)(SEQ ID NO：13)；
-Ci-Y-N-E-Y-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07-N057)(SEQ ID NO：14)；和
-Ci-Y-N-E-W-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-44-N002)(SEQ ID NO：15)。
在对于MT1-MMP的血红素结合蛋白结构域的亲和力成熟后该实施方案的肽被鉴定为有效的候选物(参见实施例1和表1和8)。
在一个依然更进一步实施方案中，式(I)的肽包含选自以下的序列：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)；和
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-12)(SEQ ID NO：10)。
在对于MT1-MMP的血红素结合蛋白结构域的亲和力成熟，合成核心双环序列，和使用竞争实验定量测量亲和力后，本实施方案的肽被鉴定为最高亲和力的候选物(参见实施例1和表1-3)。
在一个依然更进一步实施方案中，式(I)的肽包含选自-Ci-Y-N-E-F-G-Ci-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)的序列。该实施方案的肽被鉴定为式(I)中肽配体家族中最有效和稳定的成员(参见实施例1至4)。
在一个实施方案中，本发明的某些肽配体与鼠、狗、食蟹猴和人MT1-MMP完全交叉反应。在一个进一步实施方案中，本发明的具体示例的肽配体与鼠、狗、食蟹猴和人MT1-MMP完全交叉反应。例如，本文呈现的数据证明17-69-07的非稳定和稳定的衍生物(即17-69-07-N219和17-69-07-N241)都是完全交叉反应的(参见表13)。
在一个更进一步实施方案中，本发明的肽配体对MT1-MMP是选择性的，但不与MMP-1、MMP-2、MMP-15和MMP-16交叉反应。本文呈现数据证明17-69-07核心序列和稳定变体17-69-07-N258对于MT1-MMP是唯一选择性的(参见表14)。
肽配体的优点
本发明的某些双环肽具有许多有利的性质，使得它们被认为是用于注射、吸入、鼻、眼、口服或局部施用的合适的药物样分子。这些有利的性质包括：
-物种交叉反应。这是临床前药代动力学和药代动力学评估的典型要求；
-蛋白酶稳定性。理想的双环肽配体应该证明对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定的”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、细胞内蛋白酶等的稳定性。应保持不同物种之间的蛋白酶稳定性，使得可以在动物模型中开发双环先导候选物并且可以有信心地施用给人类；
-理想的溶解度曲线。这是带电荷的和亲水的残基对于疏水残基和分子内/分子间氢键的比例的函数，这对于制剂和吸收目的很重要；和
-循环中最佳的血浆半衰期。根据临床指征和治疗方案，可能需要在急性疾病管理情况中开发用于短时间暴露的双环肽，或开发具有增强的循环保留性的双环肽，因此对于更慢性的疾病状态的管理是最佳的。驱使合意的血浆半衰期的其它因素是用于最大治疗功效的持续暴露相对于由于药剂的持续暴露引起的所伴随的毒理学的要求。
药学上可接受的盐
将理解盐形式在本发明的范围内，并且提及式(I)的化合物则包括所述化合物的盐形式。
本发明的盐可以通过常规的化学方法，例如Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.Heinrich Stahl(编辑),Camille G.Wermuth(编辑),ISBN:3-90639-026-8,Hardcover,388页,2002年8月中描述的方法，由含有碱或酸部分的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应制备。
酸式加成盐(单盐或二盐)可以用各种酸(无机和有机酸)形成。酸式加成盐的示例包括与选自以下的酸形成的单盐或二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、十二烷基磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如D-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙磺酸、乳酸(如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、丹宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸和阳离子交换树脂。
一组特别的盐包括由乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸盐)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖醛酸形成的盐。一种特别的盐是盐酸盐。另一种特别的盐是乙酸盐。
如果化合物是阴离子的或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，则可以用产生适当的阳离子的有机或无机碱形成盐。合适的无机阳离子的示例包括但不限于碱金属离子如Li+、Na+和K+，碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+，以及其它阳离子如Al3+或Zn+。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即NH4+)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的取代铵离子的示例为衍生自：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸的那些。常见的季铵离子的示例是N(CH3)4 +。
当式(I)的化合物含有胺官能团时，例如根据本领域技术人员熟知的方法通过与烷基化剂反应，它们可以形成季铵盐。这样的季铵化合物在式(I)的范围内。
修饰的衍生物
应当理解，如本文定义的肽配体的修饰的衍生物在本发明的范围内。这种合适的修饰的衍生物的示例包含一个或多个选自以下的修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基(例如用一个或多个等排或等电子氨基酸替换一个或多个极性氨基酸残基；用其它非天然的等排或等电子氨基酸替换一个或多个非极性氨基酸残基)；加入间隔子基团；用一个或多个抗氧化氨基酸残基替换一个或多个氧化敏感性氨基酸残基；用丙氨酸替换一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体中一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键(surrogate bond)替换一个或多个肽键；肽骨架(peptide backbone)长度修饰；用另一个化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，用合适的胺、硫醇、羧酸和酚反应性试剂修饰氨基酸如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和酪氨酸，以功能化所述氨基酸，和引入或替换氨基酸，所述氨基酸引入适合于官能化的正交反应，例如携带氨基酸的叠氮化物或炔烃基团分别允许携带炔烃或叠氮化物的部分的官能化。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含在氨基酸1位和/或9位的修饰。本文呈现的数据显示这些位置，特别是存在酪氨酸的位置对蛋白水解降解最为敏感。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端和/或C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，其中所述修饰的衍生物包含使用合适的氨基反应性化学的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应性化学的C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，所述N-末端或C-末端修饰包含加入效应子基团，包括但不限于细胞毒性剂、放射螯合剂(radiochelator)或发色团。
在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端修饰。在一个进一步实施方案中，N-末端修饰包含N-末端乙酰基，例如本文公开的17-69-07-N004。在该实施方案中，在肽合成期间，N-末端半胱氨酸基团(该基团本文中称为Ci)被乙酸酐或其它合适的试剂封端，导致N-末端乙酰化的分子。该实施方案提供了除去氨基肽酶的潜在识别位点并避免双环肽降解潜力的优点。
在一个替代实施方案中，N-末端修饰包含加入有助于效应子基团缀合和保持双环肽对其靶标的效力的分子间隔子基团，例如Ala、G-Sar10-A或bAla-Sar10-A基团。本文呈现的数据显示将这些基团加入双环肽17-69-07不会改变对靶蛋白的效力(表11-12)。
在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，C-末端修饰包含酰胺基。在该实施方案中，C-末端半胱氨酸基团(该基团本文中称为Ciii)在肽合成期间被合成为酰胺，导致C末端酰胺化的分子。该实施方案提供了除去羧肽酶的潜在识别位点并降低双环肽的蛋白水解降解潜力的优点。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，可以选择非天然氨基酸，其具有不被降解蛋白酶识别，也不对靶标效力产生任何副作用的等排/等电子侧链。
可替代地，可以使用具有约束的氨基酸侧链的非天然氨基酸，使得在构象和空间上阻碍邻近肽键的蛋白水解。特别地，这些涉及脯氨酸类似物、大体侧链、Cα-二取代衍生物(例如，氨基异丁酸，Aib)、和环氨基酸、为氨基-环丙基羧酸的简单的衍生物。
在一个实施方案中，非天然氨基酸残基取代于4位。本文呈现的数据显示在该位置上许多非天然氨基酸残基被良好耐受(参见表8)。在一个进一步实施方案中，非天然氨基酸残基，例如存在于4位的那些，选自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、环己基甘氨酸、苯基甘氨酸、叔丁基甘氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、环己基丙氨酸和高苯丙氨酸。
在一个更进一步实施方案中，非天然氨基酸残基，例如存在于4位的那些，选自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯丙氨酸。本文呈现的数据显示与未修饰的野生型序列相比，这些取代增加了亲和力(参见表8)。
在一个更进一步实施方案中，非天然氨基酸残基，例如存在于4位的那些，选自：1-萘基丙氨酸。本文呈现的数据显示与野生型相比，该取代提供了最大程度的亲和力增强(大于7倍)(参见表8)。
在一个实施方案中，将非天然氨基酸残基引入9位和/或11位。本文呈现的数据显示在这些位置上许多非天然氨基酸残基被良好耐受(参见表9)。
在一个进一步实施方案中，非天然氨基酸残基，例如存在于9位的那些，选自：4-溴苯丙氨酸、五氟-苯丙氨酸。
在一个进一步实施方案中，非天然氨基酸残基，例如存在于11位的那些，选自：叔丁基甘氨酸。
在一个进一步实施方案中，非天然氨基酸残基，例如存在于9位的那些，选自：4-溴苯丙氨酸。本文呈现的数据显示Tyr 9蛋白水解识别点的改变(参见表9)。
在一个进一步实施方案中，非天然氨基酸残基，例如存在于11位的那些，选自：叔丁基甘氨酸。本文提供的数据显示活性增强，并通过空间位阻强力保护邻近氨基酸骨架免受蛋白水解(参见表9)。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含多个上面提及的修饰，例如2、3、4或5个或更多个修饰。在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含2、3、4或5个或更多个以下修饰，例如所有以下5个修饰：1位和5位的D-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸，9位的4-溴苯丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。本文提供的数据显示该多取代(17-69-07-N252、17-69-07-N244和17-69-07-N255)与优于野生型的效力相一致(参见表10-12)。在一个更进一步实施方案中，修饰的衍生物包含以下修饰：1位和5位的D-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。本文呈现的数据显示该多取代(17-69-07-N239)与优于野生型的效力相一致(参见表11)。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含加入间隔子基团。在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含向N-末端半胱氨酸(Ci)和/或C-末端半胱氨酸(Ciii)加入间隔子基团。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个抗氧化氨基酸残基替换一个或多个氧化敏感性氨基酸残基。在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含用萘基丙氨酸或丙氨酸残基替换色氨酸残基。该实施方案提供改善所得到的双环肽配体的药物稳定性特征的优点。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个疏水性氨基酸残基替换一个或多个带电荷的氨基酸残基。在替代实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个带电荷的氨基酸残基替换一个或多个疏水性氨基酸残基。带电荷的氨基酸残基对于疏水性氨基酸残基的正确平衡是双环肽配体的重要特征。例如，疏水性氨基酸残基影响血浆蛋白结合的程度，因此影响血浆中游离可利用级分的浓度，而带电荷的氨基酸残基(特别是精氨酸)可以影响肽与磷脂膜在细胞表面的相互作用。两者组合可以影响肽药物的半衰期、分布容积和暴露容积，并可以根据临床终点进行调整。另外，带电荷的氨基酸残基对于疏水性氨基酸残基的正确组合和数量可以减少注射部位的刺激(如果肽药物已经被皮下施用)。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基。据信该实施方案通过空间位阻增加蛋白水解稳定性并通过D-氨基酸的倾向来稳定β-转角的构象(Tugyi等人(2005)PNAS,102(2),413–418)。
在一个进一步实施方案中，将1位的氨基酸残基替换为D-氨基酸，例如D-丙氨酸。本文呈现的数据证明效力保留而不会导致降解(参见表6)。
在一个进一步实施方案中，将5位的氨基酸残基替换为D-氨基酸，例如D-丙氨酸或D-精氨酸。本文呈现的数据显示了效力保留而不会导致降解(参见表7)。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含除去任何氨基酸残基和用丙氨酸的取代。该实施方案提供除去潜在的蛋白水解攻击位点的优点。
应当注意，上述提及的每种修饰用于有意地改善肽的效力或稳定性。基于修饰的进一步的效力改善可以通过以下机制来实现：
-合并入展现疏水效应并导致降低速率的疏水部分，从而实现更高的亲和力；
-合并入展现长期离子相互作用的带电荷基团，导致速率更快和更高的亲和力(参见例如Schreiber等人,Rapid,electrostatically assisted association of proteins(1996),Nature Struct.Biol.3,427-31)；和
-通过例如正确地约束氨基酸的侧链，从而使靶标结合后的熵损失最小化；约束骨架的扭转角，从而使靶标结合后的熵损失最小化；和出于相同的原因而在分子中引入另外的环化，在肽中合并入另外的约束。
(综述参见Gentilucci等人,Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16,3185-203,和Nestor等人,Curr.Medicinal Chem(2009),16,4399-418)。
同位素变体
本发明包括本发明的所有药学上可接受的(放射性)同位素标记的化合物，即式(I)的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子数的原子代替，但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数，和式(I)的化合物，其中连接能够保持住相关的(放射性)同位素的金属螯合基团(称为“效应子”)，和式(I)的化合物，其中某些官能团被相关的(放射性)同位素或同位素标记的官能团共价替换。
适合于包含在本发明化合物中的同位素的示例包括氢的同位素，如2H(D)和3H(T)，碳，如11C、13C和14C，氯，如36Cl，氟，如18F，碘，如123I、125I和131I，氮，如13N和15N，氧，如15O、17O和18O，磷，如32P，硫，如35S，铜，如64Cu，镓，如67Ga或68Ga，钇，如90Y，和镥，如177Lu，铋，如213Bi。
某些同位素标记的式(I)的化合物，例如合并入放射性同位素的化合物，可用于药物和/或底物组织分布研究，并临床评估患病组织如肿瘤和其它地方的MT1-MMP靶标的存在和/或不存在。式(I)的化合物可以进一步具有有价值的诊断性质，因为它们可用于检测或鉴定标记化合物与其它分子、肽、蛋白质、酶或受体之间的复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用用标记试剂如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、发光蛋白和荧光素酶)标记的化合物。放射性同位素氚，即3H(T)和碳-14，即14C，鉴于其容易合并入和现有的检测手段，而特别用于该目的。
用较重的同位素如氘(即2H(D))取代可以提供由更大的代谢稳定性，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求产生的某些治疗优势，因此在一些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素(如11C、18F、15O和13N)取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查靶标占有率。
将同位素合并入金属螯合效应子基团(如64Cu、67Ga、68Ga和177Lu)可用于使用PET或SPECT成像显现肿瘤特异性抗原。特别地，这样的生物分布数据在本文实施例3中呈现。
将同位素合并入金属螯合效应子基团(例如，但不限于90Y、177Lu和213Bi)可提供靶向放射治疗的选择，其中携带金属螯合剂的式(I)的化合物将治疗性放射性核素携带至靶蛋白和作用位点。
同位素标记的式(I)的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于所附实施例中所述的方法，使用适当的同位素标记的试剂替代之前采用的未标记的试剂制备。
结合活性
在本文中，特异性是指配体与其同源靶标结合或以其他方式相互作用以排除与靶标相似的实体的能力。例如，特异性可以指配体抑制人酶而不是来自不同物种的同源酶的相互作用的能力。使用本文描述的方法，可以调节特异性，即增加或减少特异性，以使配体或多或少地能够与预期靶标的同源物或旁系同源物相互作用。特异性并不意味着与活性、亲和力或亲合力同义，并且配体对其靶标的作用的效力(如，例如结合亲和力或抑制水平)不一定与其特异性相关。
如本文所使用，结合活性是指来源于结合试验的定量结合测量，例如如本文所述。因此，结合活性是指在给定靶标浓度下结合的肽配体的量。
多重特异性是结合两个或多个靶标的能力。典型地，由于其构象性质，结合肽能够结合单个靶标，例如抗体情况下的表位。然而，可以开发肽，其可以结合两个或更多靶标的肽，双重特异性抗体，例如，如本领域已知的如上所述。在本发明中，肽配体能够结合两个或多个靶标，因此是多重特异性的。适当地，它们与两个靶标结合，并且是双重特异性的。结合可以是独立的，这意味着肽上的靶标结合位点在结构上不受一种或另一种靶标的结合的阻碍。在这种情况下，两个靶标可以独立地结合。更一般地，预期一个靶标的结合将至少部分地阻碍另一个靶标的结合。
双重特异性配体和包含两个相关靶标的具有特异性的配体之间存在根本区别。在第一种情况下，配体对于两个靶标单独具有特异性，并且以特定方式与每个靶标相互作用。例如，配体中的第一环可以与第一靶标结合，而第二环与第二靶标结合。在第二种情况下，配体是非特异性的，因为它不区分两个靶标，例如通过与两者共同的靶标的表位相互作用。
在本发明的上下文中，对于例如靶标和同源物具有活性的配体有可能是双重特异性配体。然而，在一个实施方案中，配体不是双重特异性的，但是具有不太精确的特异性，使得其结合靶标和一种或多种同源物。一般地，由于缺少针对双重特异性的选择性压力，尚未针对靶标和同源物选择的配体不太可能是双重特异性的。在提供调节的结合表面从而可以获得良好的靶标和同源物交叉反应性，同时保持对较少相关同系物的高选择性中，双环肽中的环长度可以是决定性的。
如果配体是真正的双重特异性的，在一个实施方案中，配体的至少一种靶标特异性在选择的配体中是常见的，并且该特异性的水平可以通过本文公开的方法调节。第二或进一步的特异性不需要分享，也不必是本文所述程序的主题。
靶标是肽配体与其结合或以其它方式相互作用的分子或其部分。虽然结合被认为是大多数种类的活性的先决条件，而且其本身可能是一种活性，但也可以设想其它活性。因此，本发明不需要直接或间接地测量结合。
分子骨架是能够在多个位点连接肽以赋予肽一种或多种结构特征的任何分子。优选地，分子骨架包含至少三个肽的连接点，称为骨架反应性基团。这些基团能够与肽上的半胱氨酸残基(Ci、Cii和Ciii)反应以形成共价键。它们不仅形成二硫键(其经历还原性裂解并伴随分子分解)，还形成稳定的共价硫醚键。分子骨架的优选结构如下所述。
分子骨架
分子骨架表述于例如WO 2009/098450和本文引用的参考文献，特别是WO 2004/077062和WO 2006/078161中。
如上述文献中所指出的，分子骨架可以是小分子，例如小的有机分子。
在一个实施方案中，分子骨架可以是或可以基于天然单体，例如核苷、糖或类固醇。例如，分子骨架可以包含这样实体的短聚合物，例如二聚体或三聚体。
在一个实施方案中，分子骨架是已知毒性的化合物，例如低毒性的化合物。合适的化合物的示例包括胆固醇、核苷酸、类固醇或现有的药物如他马西泮。
在一个实施方案中，分子骨架可以是大分子。在一个实施方案中，分子骨架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。
在一个实施方案中，分子骨架包含能够与多肽的官能团反应形成共价键的反应性基团。
分子骨架可以包括与肽形成连接的化学基团，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤化物和酰基卤化物。
在一个实施方案中，分子骨架可以包含三(溴甲基)苯，特别是1,3,5-三(溴甲基)苯(‘TBMB’)或其衍生物，或可以由其组成。
在一个实施方案中，分子骨架是2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。该分子类似于1,3,5-三(溴甲基)苯，但含有三个另外与苯环连接的甲基。这具有以下优点：另外的甲基可以与多肽形成进一步的联系，并因此增加另外的结构约束。
本发明的分子骨架含有允许本发明编码文库的多肽的官能团与分子骨架形成共价键的化学基团。所述化学基团选自多种官能团，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤化物和酰基卤化物。
可用于分子骨架上与半胱氨酸的巯基反应的骨架反应性基团是烷基卤化物(或也称为卤代烃或卤代烷)。
示例包括溴甲基苯(以TBMB为例的骨架反应性基团)或碘乙酰胺。用于选择性地将化合物与蛋白质中的半胱氨酸偶联的其它骨架反应性基团是马来酰亚胺。可用作本发明分子骨架的马来酰亚胺的示例包括：三-(2-马来酰亚氨基乙基)胺、三-(2-马来酰亚氨基乙基)苯、三-(马来酰亚氨基)苯。硒代半胱氨酸也是与半胱氨酸具有相似反应性的天然氨基酸，并可用于相同的反应。因此，无论何时提及半胱氨酸，除非上下文另有说明，否则通常可以替换硒代半胱氨酸。
效应子和官能团
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种药物缀合物，其包含与一个或多个效应物和/或官能团缀合的如本文定义的肽配体。
效应子和/或官能团可以连接于例如多肽的N和/或C末端、多肽内的氨基酸、或分子骨架。
合适的效应子基团包括抗体及其部分或片段。例如，除了一个或多个恒定结构域之外，效应子基团可以包括抗体轻链恒定区(CL)、抗体CH1重链结构域、抗体CH2重链结构域、抗体CH3重链结构域、或其任何组合。效应子基团还可以包含抗体的铰链区(通常在IgG分子的CH1和CH2结构域之间发现这种区域)。
在本发明该方面的一个进一步实施方案中，根据本发明的效应子基团是IgG分子的Fc区。有利地，根据本发明的肽配体-效应子基团包含具有一天或更多、两天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多、6天或更多、或7天或更多的tβ半衰期的肽配体Fc融合物，或由其组成。最有利地，根据本发明的肽配体包含具有一天或更多的tβ半衰期的肽配体Fc融合物，或由其组成。
官能团通常包括结合基团、药物、用于连接其它实体的反应性基团、有助于将大环肽摄取入细胞中的官能团等。
肽透入细胞的能力将允许肽针对细胞内靶标是有效的。可以被具有透入细胞能力的肽接近的靶标包括转录因子、细胞内信号传导分子如酪氨酸激酶和参与细胞凋亡途径的分子。能够穿透细胞的官能团包括已经加入肽或分子骨架的肽或化学基团。肽，如衍生自如VP22、HIV-Tat、果蝇(触角足突变(Antennapedia))的同源盒蛋白的那些，例如，如Chen和Harrison,Biochemical Society Transactions(2007)Volume 35,part 4,p821；Gupta等人，Advanced Drug Discovery Reviews(2004)Volume 57 9637中所描述。已经显示在通过质膜的易位中有效的短肽的示例包括来自触角足突变果蝇蛋白的16个氨基酸穿透肽(Derossi等人(1994)J Biol.Chem.Volume 269p10444)、18个氨基酸的“模型两亲肽”(Oehlke等人(1998)Biochim Biophys Acts Volume 1414p127)和HIV TAT蛋白的富含精氨酸的区域。非肽方法包括使用可以容易地连接到生物分子上的小分子模拟物或SMOC(Okuyama等人(2007)Nature Methods Volume 4p153)。将胍基添加到分子中的其它化学策略也增强细胞穿透(Elson-Scwab等人(2007)J Biol Chem Volume 282p13585)。可以将小分子量分子如类固醇加入到分子骨架中以增强细胞摄取。
可以与肽配体连接的一类官能团包括抗体及其结合片段，如Fab、Fv或单结构域片段。特别地，可以使用与蛋白质结合的能够增加体内肽配体的半衰期的抗体。
也可以合并入与许多细胞上存在的整合蛋白结合的RGD肽。
在一个实施方案中，根据本发明的肽配体-效应子基团具有选自12小时或更多、24小时或更多、2天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多、6天或更多、7天或更多、8天或更多、9天或更多、10天或更多、11天或更多、12天或更多、13天或更多、14天或更多、15天或更多、或20天或更多的tβ半衰期。有利地，根据本发明的肽配体-效应子基团或组合物将具有12至60小时范围内的tβ半衰期。在一个进一步实施方案中，其将具有一天或更长的tβ半衰期。在一个依然进一步实施方案中，它将在12至26小时的范围内。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述官能团选自金属螯合剂，其适合于络合具有药用相关性的金属放射性同位素。当与所述放射性同位素络合时，这样的效应子可以呈现用于癌症治疗的有用试剂。合适的示例包括DOTA、NOTA、EDTA、DTPA、HEHA、SarAr等(Targeted Radionuclide therapy,Tod Speer,Wolters/Kluver Lippincott Williams&Wilkins,2011)。
可能的效应子基团还包括酶，例如用于酶/前药治疗的羧肽酶G2，其中肽配体替换ADEPT中的抗体。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述官能团选自药物，例如用于癌症治疗的细胞毒性剂。合适的示例包括：烷化剂如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物，包括长春花生物碱类，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)，最初称为紫杉醇(Taxol)；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和拓扑替康，以及II型抑制剂，包括安丫啶、依托泊苷，依托泊苷磷酸酯和替尼泊苷。其它试剂可以包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素(用于肾移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素、刺胞霉素等。
在本发明的一个进一步特别的实施方案中，细胞毒性剂选自美登木素生物碱类(如DM1)或单甲基奥里斯他汀类(例如MMAE)。
DM1是一种细胞毒性剂，其是美登素的含巯基衍生物，并具有以下结构：
单甲基奥里斯他汀E(MMAE)是合成的抗肿瘤剂，并具有以下结构：
在本文的实施例4和5中呈现的数据证明了与包含DM1或MMAE的毒素缀合的肽配体的作用。
在一个实施方案中，细胞毒性剂通过可裂解的键(例如二硫键或蛋白酶敏感键)与双环肽连接。在一个进一步实施方案中，与二硫键相邻的基团被修饰以控制二硫键的阻碍，并且由此控制细胞毒性剂的裂解和伴随释放的速率。
已发表的工作确定了通过在二硫键的任一侧引入空间位阻来改变二硫键的还原敏感性的潜力(Kellogg等人(2011)Bioconjugate Chemistry,22,717)。更大程度的空间位阻降低细胞内谷胱甘肽和细胞外(全身的)还原剂的还原速率，从而降低了细胞内外释放毒素的容易程度。因此，可以通过仔细选择二硫键的任一侧的阻碍程度来实现循环中二硫化物稳定性(其使毒素的不良副作用最小化)对于细胞内环境中的有效释放(其最大化治疗效果)的最佳选择。
通过在分子构建物的靶向实体(这里是双环肽)或毒素这侧上引入一个或多个甲基来调节二硫键的任一侧的阻碍。
因此，在一个实施方案中，细胞毒性剂为选自式(II)的化合物的美登木素生物碱：
其中n代表选自1至10的整数；和
R1和R2独立地代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基。
本文所用的术语C1-6烷基是指分别含有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃基团。这些基团的示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基或己基等。
除非上下文另有说明，本文所用的术语“杂环基”和“碳环基”包括芳香族和非芳香族环系统。因此，例如，术语“杂环基基团”和“碳环基基团”在其范围内包括芳香族、非芳香族、不饱和、部分饱和和完全饱和的碳环基或杂环基环系统。一般地，除非上下文另有说明，这些基团可以是单环或双环(包括稠合和桥连的双环基团)，并且可以含有例如3至12个环成员，更通常为5至10个环成员。
在式(II)的化合物的一个实施方案中，R1和R2独立地代表氢或甲基。
在式(II)的化合物的一个实施方案中，n代表1，并且R1和R2均代表氢(即美登素衍生物DM1)。
在式(II)的化合物的一个替代实施方案中，n代表2，R1代表氢并且R2代表甲基(即美登素衍生物DM3)。
在式(II)的化合物的一个实施方案中，n代表2，并且R1和R2均代表甲基(即美登素衍生物DM4)。
应当理解，式(II)的细胞毒性剂可以形成二硫键，并且在具有式(I)的双环肽的缀合物结构中，巯基-毒素(II)和巯基-双环肽(III)之间的二硫键连接是通过数种可能的合成方案引入的，两种在方案II或方案III中描述。
在一个实施方案中，所述缀合物的双环肽组分具有式(III)所示的结构：
其中m代表选自0至10的整数，和
R3和R4独立地代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基。
在式(III)的化合物的一个实施方案中，R3和R4独立地代表氢或甲基。
其中R3和R4均为氢的式(III)的化合物被认为是不受阻碍的，并且其中R3和R4中的一个或全部代表甲基的式(III)的化合物被认为是受阻碍的。
应当理解，式(III)的双环肽可以形成二硫键，并且在具有式(II)的细胞毒性剂的缀合物结构中，巯基-毒素(II)和巯基-双环肽(III)之间的二硫键连接是通过数种可能的合成方案引入的，一种在方案II中描述。
在一个实施方案中，通过式(IV)定义的连接子将细胞毒性剂与双环肽连接：
其中R1、R2、R3和R4代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基；
毒素指本文定义的任何合适的细胞毒性剂；
双环代表本文定义的任何合适的双环肽；
n代表选自1至10的整数；和
m代表选自0至10的整数。
在一个实施方案中，R1、R2、R3和R4代表氢或甲基。
当R1、R2、R3和R4各自为氢时，二硫键最不受阻碍并且最易于还原。当R1、R2、R3和R4各自为甲基时，二硫键最受阻碍并且最不易于还原。氢和甲基的部分取代产生抗还原作用的逐渐增加，以及伴随的毒素裂解和释放。
在一个实施方案中，化合物(IV)的毒素是美登素，并且缀合物包含式(V)的化合物：
其中R1、R2、R3和R4代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基；
双环代表本文定义的任何合适的双环肽；
n代表选自1至10的整数；和
m代表选自0至10的整数。
在式(V)的化合物的一个进一步实施方案中，n代表1并且R1、R2、R3和R4各自代表氢，即式(V)a的化合物：
式(V)a的BDC被称为BT17BDC-17。BDC BT17BDC-17中不受阻碍的二硫化合物相当于BT17BDC-9，其差异在于双环肽部分：BT17BDC-9采用非稳定化序列(17-69-07-N219)，而BT17BDC-17采用与毒素-二硫化物构建体酰胺键合的稳定的双环肽配对物(17-69-07-N241)。n＝1的美登素的这种非阻碍性衍生物被称为DM1。
在式(V)的化合物的一个进一步实施方案中，n代表1，R1代表甲基，并且R2、R3和R4各自代表氢，即式(V)b的化合物：
式(V)b的BDC被称为BT17BDC-18，并且在双环肽这侧含有单个阻碍甲基，并且在抗体药物缀合物的情况下，其对还原剂如二硫苏糖醇的敏感性降低7倍(与非阻碍二硫化物相比)(Kellogg等人(2011)Bioconjugate Chemistry,22,717)。降低的还原敏感性与较低的毒素释放速率相关。n＝1的美登素的这种非阻碍性衍生物被称为DM1。BT17BDC-18采用其与毒素-二硫化物构建体酰胺键合的稳定的双环肽配对物(17-69-07-N241)。
在式(V)的化合物的一个进一步实施方案中，n代表2，R1和R2均代表氢，并且R3和R4均代表甲基，即式(V)c的化合物：
式(V)c的BDC被称为BT17BDC-19，并且在美登素这侧含有两个受阻的甲基，并且在抗体药物缀合物的情况下，其对还原剂如二硫苏糖醇的敏感性降低14倍。降低的还原敏感性与较低的毒素释放速率相关。n＝2的美登素的这种受阻碍的衍生物被称为DM4。BT17BDC-19采用与毒素-二硫化物构建体酰胺键合的稳定的双环肽配对物(17-69-07-N241)。
在式(V)的化合物的一个进一步实施方案中，n代表2，R1和R3均代表甲基，并且R2和R4均代表氢，即式(V)d的化合物：
式(V)d的BDC被称为BT17BDC-20，并且在美登素这侧含有一个阻碍的甲基，和在双环肽这侧含有一个阻碍的甲基，并且在抗体药物缀合物的情况下，其对还原剂如二硫苏糖醇的敏感性降低170倍。降低的还原敏感性与较低的毒素释放速率相关。n＝2的美登素的这种受阻碍的衍生物被称为DM3。BT17BDC-20采用与毒素-二硫化物构建体酰胺键合的稳定的双环肽配对物(17-69-07-N241)。
实际上，在抗体药物缀合物的情况下，动物模型中功效对于耐受性的平衡显示其最佳值与某些水平的阻碍相关，即DM4的情况(Kellogg等人(2011)BioconjugateChemistry,22,717)，这在BT17BDC-19中也是如此。
在一个实施方案中，缀合物选自BT17BDC-9、BT17BDC-17(式(V)a的化合物)、BT17BDC-18(式(V)b的化合物)、BT17BDC-19(式(V)c的化合物)和BT17BDC-20(式(V)d的化合物)。在实施例5和表16和17中呈现的数据表明BT17BDC-9、BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20的有益性质。
在一个进一步实施方案中，缀合物选自BT17BDC-9、BT17BDC-17(式(V)a的化合物)、BT17BDC-18(式(V)b的化合物)和BT17BDC-19(式(V)c的化合物)。实施例5和表16和17中呈现的数据表明这些缀合物被认为是用于靶向癌症治疗的合适分子。
在一个进一步实施方案中，缀合物选自BT17BDC-17(式(V)a的化合物)、BT17BDC-18(式(V)b的化合物)和BT17BDC-19(式(V)c的化合物)。实施例5和表16和17中呈现的数据表明这些缀合物被认为是用于靶向癌症治疗的合适分子，并且在有效剂量下具有良好的耐受性。
合成
本发明的肽可以通过标准技术合成制备，然后在体外与分子骨架反应。当进行此操作时，可以使用标准化学方法。这使得能够快速大规模制备可溶性材料用于进一步的下游实验或验证。这样的方法可以使用例如Timmerman等人(同上)中公开的常规化学方法来实现。
因此，本发明还涉及如本文所述选择的多肽或缀合物的制备，其中制备包括如下说明的任选的进一步步骤。在一个实施方案中，这些步骤在通过化学合成制得的最终产物多肽/缀合物上进行。
当制备缀合物或复合物时，目标多肽中的氨基酸残基任选可以被取代。
肽也可以被延伸，以合并入例如另一个环，因此引入多个特异性。
为了延伸肽，可以使用标准固相或溶液相化学法，使用正交保护的赖氨酸(和类似物)，简单地在其N-末端或C-末端或在环内化学延伸。可以使用标准(生物)缀合技术来引入活化的或可活化的N-或C-末端。可替代地，可以通过片段缩合或天然化学连接进行添加(例如，如(Dawson等人1994.Synthesis of Proteins by Native ChemicalLigation.Science 266:776-779)中所述)，或通过酶，例如使用如(Chang等人Proc NatlAcad Sci U S A.1994Dec 20；91(26):12544-8或Hikari等人Bioorganic&MedicinalChemistry Letters Volume 18,Issue 22,15November 2008,Pages 6000-6003)中描述的subtiligase进行添加。
可替代地，可以通过二硫键进一步缀合来延伸或修饰肽。这具有允许第一和第二肽在细胞的还原环境中彼此分离一次的另外的优点。在这种情况下，可以在第一肽的化学合成期间加入分子骨架(例如TBMB)，以使得与三个半胱氨酸基团反应；然后可以将另外的半胱氨酸或硫醇附加到第一肽的N或C末端，使得该半胱氨酸或硫醇仅与第二肽的游离半胱氨酸或硫醇反应，形成二硫键连接的双环肽-肽缀合物。
类似的技术同样适用于两种双环和双重特异性大环化合物的合成/偶联，潜在地产生四重特异性分子。
此外，可以以相同的方式，使用适当的化学方法，在N-或C-末端或通过侧链的偶联来完成其它官能团或效应子基团的加入。在一个实施例中，以不阻碍任一实体的活性的方式进行偶联。
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供制备如本文定义的药物缀合物的方法，其包含方案I、II或III中任一项所述的合成路线。
药物组合物
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文定义的肽配体或药物缀合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
一般地，本发明的肽配体将与药理学上适当的赋形剂或载体一起以纯化的形式使用。典型地，这些赋形剂或载体包括水性或醇/水溶液、乳剂或混悬液，包括生理盐水和/或缓冲介质。肠胃外空白载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸林格氏试剂。如果必要，合适的生理学上可接受的佐剂可以选自增稠剂如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐，以将多肽复合物保持在混悬液中。
静脉内空白载体包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版)。
本发明的肽配体可以用作单独施用的组合物，或者与其他试剂结合施用。这些可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，例如环孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括与本发明的蛋白配体结合的各种细胞毒素或其它试剂的“鸡尾酒混合物”，或甚至包括具有不同特异性的根据本发明选择的多肽的组合，例如使用不同靶配体选择的多肽，无论是否在施用之前汇集。
根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员通常已知的那些。对于治疗方法，包括但不限于免疫治疗法，本发明的肽配体可以根据标准技术施用于任何患者。施用可以通过任何适当的模式，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹腔内、经皮、经肺途径、或者适当地通过直接导管输注。施用的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和状况，其它药物的联合施用，相反指征和临床医生要考虑的其它参数。
本发明的肽配体可以被冻干储存并在使用前重构在合适的载体中。已经证明这种技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调整水平以进行补偿。
可以施用含有本发明肽配体或其鸡尾酒混合物的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，将完成所选细胞群体的至少部分抑制、压制、调节、杀死或某些其它可测量参数的足够量定义为“治疗有效剂量”。实现该剂量所需的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但通常每千克体重0.005至5.0mg所选择的肽配体，更常用0.05至2.0mg/kg/剂量的剂量。对于预防性应用，含有本发明肽配体或其鸡尾酒混合物的组合物也可以以相似或稍低的剂量施用。
包含根据本发明的肽配体的组合物可以用于在预防和治疗环境中帮助改变、灭活、杀死或除去哺乳动物中的选择性靶细胞群体。此外，本文所述的肽配体可以体外(extracorporeally)或体外(in vitro)选择性使用以从细胞的异质集合物中杀死、消耗或以其它方式有效去除靶细胞群体。来自哺乳动物的血液可以与选择的肽配体体外组合，由此根据标准技术将不期望的细胞杀死或以其它方式从血液中除去以返回哺乳动物。
治疗用途
本发明的双环肽具有作为膜1型金属蛋白酶(MT1-MMP，也称为MMP14)的高亲和力结合剂的特异性用途。MT1-MMP是一种跨膜金属蛋白酶，其直接通过降解其数种组分并间接通过活化pro-MMP2在细胞外基质重塑中发挥主要作用。MT1-MMP对于肿瘤血管发生至关重要(Sounni等人(2002)FASEB J.16(6),555-564)，并且在多种实体瘤上过表达，因此本发明的MT1-MMP结合的双环肽在靶向治疗癌症，特别是实体瘤如非小细胞肺癌中具有特殊用途。在一个实施方案中，本发明的双环肽对人MT1-MMP是特异性的。在一个进一步实施方案中，本发明的双环肽对小鼠MT1-MMP是特异性的。在一个更进一步实施方案中，本发明的双环肽对人和小鼠MT1-MMP是特异性的。在一个更进一步实施方案中，本发明的双环肽对人、小鼠和狗MT1-MMP是特异性的。
根据本发明的方法选择的多肽配体可用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外试验和试剂应用等。具有选择的特异性水平的配体在其中需要交叉反应性的涉及在非人动物中进行测试的应用中是有用的，或在需要仔细控制与同系物或旁系同源物的交叉反应性的诊断应用中是有用的。在一些应用中，例如疫苗应用，可以利用引发对预定范围的抗原的免疫应答的能力来定制针对特定疾病和病原体的疫苗。
对于哺乳动物施用，优选至少90至95％同质性的基本上纯的肽配体，并且对于药物用途，特别是当哺乳动物是人时，最优选优选98至99％或更高同质性。一旦按需要被纯化(部分或同质的)，所选择的多肽可以在诊断或治疗(包括体外)或开发和进行测试程序、免疫荧光染色等中使用(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)Immunological Methods,Volumes I and II,Academic Press,NY)。
本发明的肽配体的效应子基团和缀合物典型地可用于预防、抑制或治疗癌症，特别是实体瘤如非小细胞肺癌。
因此，根据本发明的一个进一步方面，本发明提供本文定义的肽配体的效应子基团和药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗癌症，特别是实体瘤如非小细胞肺癌的用途。
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种预防、抑制或治疗癌症，特别是实体瘤如非小细胞肺癌的方法，其包括向有需要的患者施用如本文定义的肽配体的效应子基团和药物缀合物。
可以治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应物)的示例包括但不限于上皮起源的肿瘤(各种类型的腺瘤和癌，包括腺癌、鳞状癌、移行细胞癌和其它癌)，例如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食管、胃(stomach)(胃部的(gastric))、小肠、结肠、直肠和肛门)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈部癌(例如舌头、口腔、喉、咽、鼻咽、扁桃体、唾液腺、鼻腔和鼻旁窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、子宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤和附属物癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、发育异常痣)；血液学恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和恶变前血液病和边缘恶性肿瘤的疾病包括血液学恶性肿瘤和淋巴系统的相关病症(例如急性淋巴细胞白血病[ALL]、慢性淋巴细胞性白血病[CLL]、B-细胞淋巴瘤如弥漫大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、布基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、天然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、不确定意义的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴细胞增生性疾病)，以及血液学恶性肿瘤和骨髓系相关病症(例如急性髓细胞白血病[AML]、慢性髓细胞白血病[CML]、慢性骨髓单核细胞白血病[CMML]、嗜酸细胞增多综合征、骨髓增生性疾病如红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞性白血病)；间叶细胞源的肿瘤，例如软组织、骨和软骨的肉瘤如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因氏肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织细胞瘤、和隆突性皮肤纤维肉瘤；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞肿瘤、甲状旁腺肿瘤、良性肿瘤和甲状腺髓样癌)；眼和附属器肿瘤(例如成视网膜细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、水泡状胎块和绒毛癌)；和儿科和胚胎肿瘤(例如成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、维耳姆斯瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其它综合症，其使患者易患恶性肿瘤(例如着色性干皮症)。
本文引用术语“预防”涉及在诱导疾病之前施用保护性组合物。“抑制”是指在诱导事件之后但在临床出现疾病之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状明显后施用保护性组合物。
可用于筛选肽配体在保护或治疗疾病中的有效性的动物模型系统是可用的。通过本发明促进了动物模型系统的使用，本发明允许开发可与人和动物靶标交叉反应的多肽配体，以允许使用动物模型。
下面参照以下实施例进一步说明本发明。
实施例
材料和方法
噬菌体选择
如Heinis等人(2009),Nat Chem Biol 5(7),502-507、WO 2009/098450、WO 2013/050615和WO 2013/050616中所述，产生6x6双环噬菌体文库。使用所述6x6噬菌体文库针对生物素化的人MT1-MMP血红素结合蛋白结合域进行噬菌体展示选择。
蛋白质表达
使用pEXPR-IBA42(IBA)表达载体，将MT1-MMP血红素结合蛋白样重复序列(也称为MT1-MMP血红素结合蛋白结构域)，来自人类基因的残基Cys319-Gly511在HEK293细胞中瞬时表达，作为分泌型N末端His6标记的可溶性蛋白。表达后，通过镍-NTA亲和层析法纯化蛋白质，然后进行凝胶过滤，并通过SDS-PAGE检测纯度。还通过荧光热转移实验，在存在/不存在血红素结合蛋白结构域结合双环的情况下，监测批次间的变化性。
肽合成
基于Fmoc化学法进行肽合成，使用由Peptide Instruments制造的Symphony肽合成仪和MultiSynTech制造的Syro II合成仪。采用标准的Fmoc-氨基酸(Sigma，Merck)，其具有以下侧链保护基：Arg(Pbf)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、GIu(OtBu)、Gln(Trt)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、和Tyr(tBu)(Sigma)。偶联剂为HCTU(Pepceuticals)，采用二异丙基乙基胺(DIPEA，Sigma)作为碱，并用DMF中20％的哌啶(AGTC)实现脱保护。使用0.37mmol/gr Fmoc-Rink酰胺AM树脂(AGTC)进行合成，使用四倍过量的Fmoc-氨基酸，并且碱相对于氨基酸四倍过量。将氨基酸以0.2M溶解于DMSO中，HCTU以0.4M溶解于DMF中，DIPEA以1.6M溶解于N-甲基吡咯烷酮(Alfa Aesar)中。条件使得偶联反应物包含在DMF中20至50％的DMSO中，这在固相合成期间减少聚集和缺失并提高产率。偶联时间一般为30分钟，并且脱保护时间为2×5分钟。将Fmoc-N-甲基甘氨酸(Fmoc-Sar-OH，Merck)偶联1小时，并且随后的残基的脱保护和偶联时间分别为20分钟和1小时。合成后，用二氯甲烷洗涤树脂并干燥。使用10mL95:2.5:2.5:2.5v/v/v/w TFA/H2O/iPr3SiH/二硫苏糖醇，进行从载体上的侧链保护基团的裂解3小时。裂解后，通过过滤除去用过的树脂，并将滤液加入至35mL已经于-80℃冷却的乙醚中。将肽球状物离心，弃去乙醚上清液，并将肽球状物用冷乙醚洗涤两次以上。然后，将肽重新溶解于5-10mL的乙腈-水中并冻干。取出少量样品用于通过质谱(MALDI-TOF，Voyager DE来自Applied Biosystems)分析粗产物的纯度。冻干后，将肽粉末吸收于补充有0.5mL 1M的二硫苏糖醇的10mL 6M胍盐酸盐的水溶液中，并加载于C8Luna制备型HPLC柱(Phenomenex)上。用0.1％的七氟丁酸酸化溶剂(H2O，乙腈)。使用Gilson制备型HPLC系统，梯度为15分钟内30-70％乙腈，流速为15-20mL/min。合并含有纯线性肽材料(通过MALDI鉴定)的级分，并用1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB，Sigma)修饰。为此，将线性肽用H2O稀释至～35mL，加入～500μL 100mM TBMB的乙腈溶液，并用5mL 1M NH4HCO3的水溶液引发反应。反应在室温进行～30-60分钟，并且一旦反应完成(用MALDI判断)即可冻干。冻干后，如上所述纯化修饰的肽，同时用Gemini C18柱(Phenomenex)替换Luna C8，并将酸变为0.1％三氟乙酸。合并含有正确TMB修饰材料的级分，冻干，置于-20℃保存。
除非另有说明，所有的氨基酸均使用L-构型。
在固相肽合成期间，使用受保护的前体DOTA(tBu)3(TCI，CAS 137076-54-1)将DOTA偶联至肽链上。
使用如上所述的一般方法将非天然氨基酸合并入肽序列。
本文中采用的非天然氨基酸前体列表总结在下表中：
用于药代动力学研究的肽从0.1％TFA水溶液中冻干，得到化合物的TFA盐或游离酸。
使用17-69-07-N219作为前体双环肽合成BDC
使用17-69-07-N219作为前体肽，合成两种双环药物缀合物(BDC)。将活化的vcMMAE或二硫化物-DM1构建体(溶解在DMSO中)在水性条件(100磷酸钠pH8)中以1.4×过量直接与17-69-07-N219缀合(参见方案I和II)。浓度为9mg/mL肽或更高浓度。反应后进行LC/MS，并在3.5小时后判断为完成。然后使用C18半制备柱进行标准反相纯化。分离纯度大于95％的级分并冻干。这些材料不含有可测量的游离毒素。对于体外和体内研究，将冻干粉末吸收为浓缩的DMSO储存液(100mg/mL)，并在适当的缓冲液中稀释以供进一步使用。
使用17-69-07-N241作为前体双环肽合成BDC
对于BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20的合成，使用二硫化物美登木素生物碱类的以下N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)：
其中R1、R2、R3、R4、m和n分别如本文之前对于BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20的式(V)a、(V)b、(V)c、(V)d的化合物的定义。
BT17BDC-18进一步通过如下文和方案III所述的可替代路线合成。这里，通过将17-69-07-N241与SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯)在DMSO中反应合成17-69-07-N277。于室温，17-69-07-N241的浓度为10mM或更高，具有1.3倍过量的SPP和20倍过量的二异丙基乙基胺。1小时后，通过LCMS判断反应完成。如上所述通过反相进行纯化。将适当的级分冻干。
在氮气层下，于室温，17-69-07-N277在半水性条件(补充有2mM EDTA的50％二甲基乙酰胺和50％100mM乙酸钠pH 5.0)中与1.15当量DM1(作为游离硫醇)进行二硫键交换21小时。反应中17-69-07-N277的浓度为10mM或更高。
然后使用C18半制备柱进行标准反相纯化。分离纯度大于95％的级分并冻干。材料不含有可测量的游离毒素。对于体外和体内研究，如上所述将冻干粉末溶解于水性制剂中，或直接吸收于适当的缓冲液中。
双环结合物对MT1-MMP的解离速率常数测定
直接结合荧光偏振(各向异性)试验
直接结合荧光偏振或各向异性试验通过用其结合配对体(本文为MT1-MMP血红素结合蛋白结构域)滴定恒定浓度的荧光示踪剂(本文为待研究的荧光双环肽)进行。随着滴定过程中结合配对体的浓度增加，极化信号与结合和未结合材料的份数成比例变化。这允许定量地确定解离速率(Kd)。试验数据可以使用标准配体结合方程拟合。
典型地，示踪剂的理想浓度远低于示踪剂的Kd：滴定剂对，并且所选择的浓度通常为～1nM或更小。滴定剂(结合配对体)浓度从0.1nM变化至典型的5μM。选择该范围使得可以观察到荧光偏振的最大变化。采用的缓冲液是在0.01％吐温存在下的磷酸盐缓冲盐水。实验在黑色384孔低结合/低体积板(Corning 3820)中进行，并且使用BMG Pherastar FS平板读数器测量荧光偏振信号。
本文中提及的荧光示踪剂是已经使用5,6-羧基荧光素荧光素化(fluoresceinated)的双环肽。可以在肽的N末端氨基上进行荧光素化，所述肽通过肌氨酸间隔子(通常为Sar5)与双环核心序列分隔。这可以在Fmoc固相合成期间或如果N末端氨基是肽独有的，在合成后(用TBMB环化后和纯化后)进行。荧光素化还可以在C末端进行，通常在作为第一个C末端残基引入的赖氨酸上进行，然后通过肌氨酸间隔子(通常为Sar6)与双环核心序列分隔。因此，N末端示踪剂可以具有描述为Fluo-Gly-Sar5-A(BicycleCoreSequence)和(BicycleCoreSequence)-A-Sar6-K(Fluo)用于C末端荧光素化构建体的分子格式。实施例中使用的荧光示踪剂是A-(17-69)-A-Sar6-K(Fluo)、A-(17-69-07)-A-Sar6-K(Fluo)、和A-(17-69-12)-A-Sar6-K(Fluo)。由于17-69荧光肽的酸性性质，其典型地以浓缩的DMSO储备液制备，由此在100mM Tris pH8缓冲液中制备稀释液。
使用荧光偏振(各向异性)的竞争试验
由于其对MT1-MMP血红素结合蛋白结构域(PEX)的高亲和力，17-69-07和17-69-12的荧光素化衍生物(分别表示为17-69-07-N040和17-69-12-N005)可用于竞争实验(使用FP进行检测)。本文中，用游离的、非荧光素化双环肽滴定PEX与荧光PEX结合示踪剂的预先形成的复合物。由于预期所有基于17-69的肽在相同的位点结合，所以滴定剂将从PEX置换荧光示踪剂。可以定量地测量复合物的解离，并确定竞争者(滴定剂)对靶蛋白的Kd。竞争方法的优点是可以准确和快速地确定非荧光素化双环肽的亲和力。
示踪剂的浓度通常为Kd或以下(本文中为1nM)，并且结合蛋白(本文中为MT1-MMP的血红素结合蛋白)为15倍过量，使得结合了>90％的示踪剂。随后，滴定非荧光竞争剂双环肽(通常仅仅是双环核心序列)，使得其从靶蛋白置换荧光示踪剂。测量示踪剂的置换并与荧光偏振的下降相关联。荧光偏振的降低与非荧光滴定剂结合的靶蛋白的份数成比例，因此是测量滴定剂对靶蛋白的亲和力。
原始数据适合于描述荧光示踪剂、滴定剂和结合蛋白之间平衡的三次方程的解析解。拟合需要荧光示踪剂对靶蛋白的亲和力的值，其可以通过直接结合FP实验单独确定(参见前面的部分)。使用Sigmaplot 12.0进行曲线拟合，并使用Zhi-Xin Wang(FEBS Letters360(1995)111-114)描述的方程式的改编版本。
血浆稳定性分析
方法1：
开发了采用质谱检测(MALDI-TOF，Voyager DE，Applied Biosystems)母体质量以及其血浆-蛋白酶诱导的片段的快速血浆稳定性分析测定。通过评估片段的性质，可以确定优选的裂解位点。本文中，将1-1.5mM肽储备液(DMSO中)直接稀释到小鼠/大鼠/人血浆(Sera实验室，使用柠檬酸盐作为抗凝血剂)中，得到最终浓度为50μM肽，并且于37℃孵育长达48小时。在适当的时间点取5μL样品，并在-80℃冷冻。用于分析，将样品除霜，与25μL的3:3:1乙腈:甲醇:水混合，并于13k离心5分钟。吸出5μL含肽的上清液，并与在乙腈:H2O的1:1混合物中的30mM碳酸氢铵混合。然后将其中1μL点在MALDI板上，干燥，并将Matrix(α-氰基肉桂酸，Sigma，制备成含有0.1％三氟乙酸的1:1乙腈:水中的饱和溶液)层铺在样品(1μL)上，干燥，并使用MALDI TOF分析。应当注意，这是一种定性试验用于检测不同双环肽序列之间血浆稳定性的对比变化，并且作为确定优选的裂解位点的优异工具起作用。
方法2：
为了定量获得双环肽的血浆稳定性，将肽储备液(DMSO中200μM)与血浆(人或小鼠)混合，使得最终浓度为10μM。长达8小时定期取出40μL样品，并在-80℃冷冻。在LC-MS分析之前，将样品除霜，并与3体积(本文中为120μL)1:1乙腈/MeOH水混合。将乳状混悬液以13000rpm离心30分钟，并使用Waters Xevo TQ-D仪器定量含肽的上清液的双重/三重带电荷物质和其MS/MS片段，同时使用同一肽的血浆提取标准曲线作为参考。血浆中降解的半衰期用于评估分子的对比稳定性。
17-69-07在小鼠中的药代动力学，代谢物鉴定
17-69-07-N004的药代动力学
使用双环肽17-69-04-N004获得小鼠药代动力学，其作为1.19mg/mL溶液的5mL/kg推注，以单次静脉注射5.925mg/kg剂量给予一组12只雄性CD1小鼠。从100μL 23.7mg/mLDMSO储备液中制备配制的溶液，所述储备液在给药之前立即用1.9mL磷酸盐缓冲盐水稀释，得到由pH7.4的PBS中的5％DMSO组成的空白载体。经终端麻醉下的心脏穿刺，于给药后0.08、0.5、1、2和4小时，在每个时间点从两只动物取血样，并转移到EDTA管中进行血浆生成。血浆样品立即冷冻在-20℃。
用于分析，将样品快速解冻，并用3体积的提取溶剂(2:9:9的10mM碳酸氢铵，pH8、乙腈和甲醇的混合物，含有分析内标)处理50μL等分试样。通过离心除去沉淀的蛋白，并通过LC-MS/MS分析上清液。样品的定量参考在对照小鼠血浆中制备的校准线。
使用Summit Research Services的软件包PK Solutions 2.0，通过非房室分析测定药代动力学参数。
术语的定义：
Cmax：最大测量浓度；
Tmax：测量到最大浓度的时间；
AUC 0-t：从0分钟到最后的可量化数据点的血浆药物浓度/时间曲线下面积；和
AUC 0-∞：从0分钟基于终末半衰期外推到超出最终数据点的血浆药物浓度/时间曲线下的面积。
小鼠血浆中双环肽代谢物的鉴定
可以使用三种血浆样品(0.5、1和2小时)分析17-69-07-N004的潜在小鼠体内代谢物。通过HPLC-MS和带有LTQ Orbitrap XL质谱仪的HPLC-MS/MS进行分析。在血液循环中寻找肽代谢物的方法是计算假定代谢物的精确质量(10ppm窗)(加入1或2滴水(+18，+36)分别用于环1和/或环2的裂解；然后从环1和/或环2丢失单个氨基酸或丢失氨基酸的延伸)。其次，通过与空白小鼠血浆比较总离子色谱图进行手动搜索。
BT17BDC-1和BT17BDC-9在HT-1080异种移植小鼠中的功效
用BDC或空白载体(PBS)处理携带皮下HT-1080异种移植肿瘤的Balb/c裸鼠。给予BDC每周3次持续2周，当肿瘤测量约150-200mm3时开始给药。监测小鼠，每周记录3次肿瘤体积和体重的测量值。
实施例1：使用MT1-MMP血红素结合蛋白结构域鉴定具有高亲和力的双环肽
采用先前建立的生成双环肽噬菌体文库的方法，对人MT1-MMP的血红素结合蛋白结构域进行选择。采用连续降低浓度的靶标从天然文库进行三轮选择后，对输出进行测序。双环肽17-69(CKNRGFGCEDFYDIC)(SEQ ID NO：16)被鉴定为最丰富的序列输出之一，并且通过α筛选(Alphascreen)验证了与靶标的定性结合。
产生了三个小噬菌体文库，提供17-69序列的3个部分的全序列覆盖。对这三个文库进行两轮针对血红素结合蛋白的选择。有趣的是，最有希望的序列输出是5×6双环肽，而起始文库是6×6格式。由于双环肽对靶蛋白的较高亲和力，可能选择较短的环长度。更短的环长度是由于在构建噬菌体文库期间合并入的不正确合成的引物导致的。
主要序列输出是肽17-69-07，其具有序列CYNEFGCEDFYDIC(SEQ ID NO：2)。
基于观察到5×6格式显示最有成效，并且需要5×6结合物之间的区别，产生另外两个文库来测试产生双环肽17-69-02、17-69-03、17-69-04和17-69-12的第一个环的有意截断。这些包含在图8中公开的序列中。
某些残基的倾向是明显的，尽管结合试验不能区分最佳结合物之间的区别因为它们已经达到测试上限。
使用α筛选测试最常发生的序列的血红素结合蛋白结合，其中所有信号高于原始17-69序列(参见表1)：
表1：使用本发明的双环肽的血红素结合蛋白结合测试
由于所有基于17-69的亲和力成熟克隆产生接近测试上限的信号，表1所示的图不允许明确鉴定最佳克隆。
因此，一些肽被合成为荧光素化衍生物(17-69、17-69-07和17-69-12)，并用于直接结合荧光偏振(FP)实验。本文中，荧光素通过连接子(通常为Sar6)与双环序列分隔，位于核心序列的N或C末端(表2)。
表2：直接结合荧光偏振(FP)实验的结果
17-69-07和17-69-12的荧光素化衍生物(表示为17-69-07-N040和17-69-12-N005)分别显示出0.52和3.1nM解离速率的强结合。它们比原来非成熟的17-69序列(17-69-N004)显着改善。似乎包含5×6格式的序列在亲和力成熟文库的情况下诱导高亲和力。
由于它们对MT1-MMP血红素结合蛋白结构域(PEX)的高亲和力，17-69-07和17-69-12的荧光素化衍生物(表示为17-69-07-N040和17-69-12-N005)用于随后的竞争实验(使用FP进行检测)。本文中，用游离的、非荧光素化双环肽滴定PEX与荧光PEX结合示踪剂的预形成复合物。由于预期所有基于17-69的肽(含有保守的第二环基序CEDFYDIC；SEQ ID NO：17)在相同的位点结合，所以滴定剂将从PEX置换荧光示踪剂。可以定量测定复合物的离解，并确定竞争者(滴定剂)的Kd。竞争方法的优点是可以准确和快速地确定非荧光素化双环肽的亲和力。
在这种情况下，重要的是要验证17-69-07和17-69-12核心序列对PEX的高亲和力负全部责任。因此，肽被合成为具有N和C末端丙氨酸的变体，从而密切地模拟噬菌体颗粒上表达的序列，但缺少与荧光素化构建体一起使用的Sar5/6分子间隔子。
通过竞争实验确定的亲和力与用荧光素化衍生物获得的亲和力几乎相同，明确地证明核心双环序列负责与PEX的高亲和力结合(表3)。此外，荧光素化构建体显示分子间隔子和效应子基团(本文中作为-A-Sar6-K(荧光素))的C-末端连接是可以耐受的。
表3：直接结合荧光偏振(FP)实验的结果
实施例2：17-69-07核心序列的蛋白水解稳定性
17-69-07的小鼠血浆稳定性
对于人类的治疗应用和对于动物物种的临床前评估，先导双环肽在静脉内施用后在循环中足够稳定是相关的。需要足够的稳定性，使得足够水平的双环肽可以与其靶标结合并发挥其生物学功能。
临床前模型通常采用如小鼠、大鼠、兔和食蟹猴等物种。首先，使用本文如上所述的方法(方法2)，在小鼠血浆的存在下，评估双环肽17-69-07-N219的稳定性。双环核心序列保留17-69-07序列的原始天然蛋白原性氨基酸，并且还包含用于与效应子基团缀合的N末端分子间隔子(序列：G-Sar10-ACYNEFGCEDFYDIC；SEQ ID NO：20)。尽管存在分子间隔子，但保留了17-69-07-N219对PEX的亲和力(Kd＝0.82nM)。
该化合物在离体小鼠血浆中显示出适度的稳定性，半衰期为6小时(参见图1)。
鉴定17-69-07的离体/体内蛋白水解切割位点
为了了解小鼠血浆中17-69-07-N219降解的化学性质，使用MALDI-TOF分析样品的任何潜在的降解产物。质谱显示可能的酪氨酸损失，这意味着开环(水解)和环1中Tyr1和/或环2中Tyr9中的去除。
使用最小双环肽17-69-07-N004(Ac-CYNEFGCEDFYDIC(SEQ ID NO：2)，其构成17-69-07的最小核心双环肽)进行小鼠药代动力学(PK)研究以确定体内循环的清除率和消除率。进一步分析所得血液样品，并分析血浆样品中17-69-07-N004的任何潜在的蛋白水解降解产物。
PK图示于图2。
表4:17-69-07-N004的药代动力学参数
NC：由于有限的数据而未计算
表4显示肽的消除半衰期为14分钟，并且以20.7mL/min/kg清除。清除率大于在小鼠中观察到的肾小球滤过率(Qi等人,American Journal of Physiology-RenalPhysiology(2004)Vol.286no.3,F590-F596中总结)，表明肽被另外的方式，例如由血浆和内皮蛋白酶驱动的蛋白水解清除。
为了解决体内蛋白水解是否明显有助于清除，使用LC-MS/MS技术，使在t＝0.5、1和2小时采集的血浆样品经历双环片段的靶向分析。
可以鉴定多种蛋白水解代谢物，并且具有最强信号的片段在下面降序列出：
Ac-CiYNEFGCiiEDFYDICiii(SEQ ID NO：2)：
环1中切除YNE；
环1中切除YNEF(SEQ ID NO：21)；
环1中切除YNEFG(SEQ ID NO：22)(去除全部环)；
环1和/或2中切除Y；
环2中切除YD；
环2中切除FYD；
环2中切除YDI；和
环2中切除EDFYDI(SEQ ID NO：23)(去除全部环)。
前三种代谢物以中等信号水平存在，而剩余的片段只能以痕量检测。
总之，离体和体内代谢物显示集中于Tyr 1/9处或附近的初始裂解，随后连续除去附近的残基。这最终导致完整的一个或两个环的去除。
17-69-07序列的蛋白水解稳定性和效力增强
稳定肽序列免于蛋白水解降解的方法很多(论述参见Gentilucci等人,Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16,3185-203，和Nestor等人,Curr.MedicinalChem(2009),16,4399-418)，和WO 2009/098450、WO 2013/050615和WO 2013/050616)。简言之，它们包括对蛋白酶提供识别位点的氨基酸的取代，切割位点处的氨基酸骨架的改变(即N-甲基化，伪肽键等)，邻近的键的空间位阻(即β-取代的氨基酸)，和包含D-对映体氨基酸。这些修饰(即N-甲基化，D-氨基酸)中的一些可以保护/屏蔽蛋白水解切割位点免于水解，即使它们位于远离切割位点的两个残基。
尽管保护序列免受蛋白水解攻击是相对直接，但合并入不会显着改变对于靶蛋白的效力(和特异性)的稳定的变化更具挑战性。
从前面部分显示的17-69-07的离体/体内蛋白水解降解数据可以看出，Tyr1/9和邻近的残基是稳定双环肽的潜在位点。评估肽的成功稳定化的定量方法是通过增加其在小鼠和人血浆中的半衰期。
首先，产生17-69-07的11个衍生物，其中每个位置被丙氨酸替代(称为“丙氨酸扫描”)。这种类型的信息对某些残基的能量贡献和作用提出建议，并可能除去蛋白水解识别位点。
表5：丙氨酸扫描结果
17-69-07-N004是野生型，含有封端的N末端(N末端乙酰化，称为“Ac”)的未修饰的肽。一些Ala取代被良好耐受，特别是在序列中的第1、3、4、10和11位。由于这些残基的侧链对于与靶标的高亲和力结合不是必需的，所以在这些特定序列位置的式(I)的化合物被广泛地定义。
这使得残基1(Tyr 1)的取代是非常有吸引力的可能性，因为它可以去除蛋白水解识别位点之一。用Ala5取代Gly5是有意义的，因为化学变化较小(加入甲基)，但产生显着降低的效力。Gly5可能采用在普通拉氏图(Ramachandron chart)外的不寻常的phi/psi角度，这些角度可能是由D-氨基酸诱导。另外的益处是邻近该位点的肽键的稳定化。
为此，进行部分D-丙氨酸扫描以评估它们是否在效力维持方面是耐受的：由于它们的蛋白水解稳定作用，在序列中包含D-氨基酸是非常需要的。
表6：用D-丙氨酸取代第一环中的残基的作用
D-Ala1代替Tyr1以比野生型少10倍的亲和力结合。然而，令人感兴趣的是蛋白水解识别位点Tyr1被去除并被稳定的氨基酸替代，却不引起效力的重大损失。
值得注意的是，用D-Ala5取代Gly5是良好耐受的，因为与野生型相比的亲和力保持不变。
在此情况下，D-Arg5也被耐受(并且可能因此除了D-Pro之外的所有D-氨基酸，参见表6)，如果物理化学性质在分子的进一步开发期间需要改变，则这可能是有意义的(表7)。
表7：在5位取代残基的作用
肽编码 分子描述 Kd(nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07)(野生型) 2.47±0.25
17-69-07-N018 Ac-(17-69-07)Ala5 >5000
17-69-07-N058 Ac-(17-69-07)D-Ala5 2.37±0.86
17-69-07-N120 Ac-(17-69-07)D-Arg5 4.24±1.48
接下来，由于噬菌体选择输出显示对序列的4位处的疏水性和芳香族氨基酸的一定偏好，合成了一系列衍生物，其中合并入选择的芳香族氨基酸，包括天然酪氨酸和色氨酸(表8)。
表8：在4位取代残基的作用
肽编码 分子描述 Kd(nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07)(野生型) 2.47±0.25
17-69-07-N057 Ac-(17-69-07)Tyr4 1.78±0.45
17-69-44-N002 Ac-(17-69-07)Trp4 0.75±0.23
17-69-07-N067 Ac-(17-69-07)1NAl4 0.36±0.12
17-69-07-N068 Ac-(17-69-07)2NAl4 0.7±0.19
17-69-07-N065 Ac-(17-69-07)Chg4 >5000
17-69-07-N071 Ac-(17-69-07)Phg4 628
17-69-07-N072 Ac-(17-69-07)tBuGly4 >5000
17-69-07-N137 Ac-(17-69-07)3,4-DCPhe4 1.85±2.45
17-69-07-N139 Ac-(17-69-07)Cha4 362
17-69-07-N140 Ac-(17-69-07)HPhe4 43.3
1Nal：1-萘基丙氨酸；2NAl：2-萘基丙氨酸；Chg：环己基甘氨酸；Phg：苯基甘氨酸；tBuGly：叔丁基甘氨酸；3,4-DCPhe4：3,4-二氯苯丙氨酸；Cha：环己基丙氨酸；和HPhe：高苯丙氨酸。
与野生型相比，4位处的数个取代增加亲和力，这些包括酪氨酸、色氨酸、1和2-萘基丙氨酸(1/2Nal)和3,4-二氯苯丙酸(3,4-DCPhe)。最有效的取代是1-萘基丙氨酸，其增强7倍亲和力。
为了提高分子的稳定性，检查了17-69-07环2中的某些残基。这些包括残基9，其含有潜在的Tyr9识别位点。残基11也是有吸引力的，因为它允许取代(表5)并与Tyr9识别位点相邻。
表9：耐受的氨基酸取代的总结
肽编码 分子描述 Kd(nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07)(野生型) 2.47±0.25
17-69-07-N130 Ac-(17-69-07)4BrPhe9 2.45±1.08
17-69-07-N182 Ac-(17-69-07)5FPhe9 13.1
17-69-07-N100 Ac-(17-69-07)tBuGly11 1.56±1.14
感兴趣的是4-溴苯丙氨酸(4BrPhe)，其改变Tyr9蛋白水解识别位点，和叔丁基甘氨酸(tBuGly)，其略微增强亲和力和重要地，其通过空间位阻强烈保护邻近氨基酸骨架不被蛋白水解。
17-69-07的多位点取代实现总体蛋白水解保护
前面的部分公开了允许包含蛋白水解稳定和/或亲和力增强的氨基酸的17-69-07序列中的多个位置。
为了在单个分子中组合这些修饰，合成了一个分子，其中合并入Tyr1→D-Ala1、Phe4→1萘基丙氨酸4、Gly5→D-Ala5、Tyr9→4BrPhe9和Ile11→tBuGly11取代。值得注意的是，所有的修饰是一致耐受的，并且效力优于野生型分子的效力(表10和11)。
表10：特异性多取代的结果
预期在分子的进一步开发期间将效应子基团连接至这样的双环肽上，用N末端肌氨酸分子间隔子(10个连续的Sar，表示为Sar10)产生各版本，所述间隔子用N末端甘氨酸起始和用C末端丙氨酸终止。为了本实验的目的，将N末端Gly用乙酰基封端，以除去正电荷。
表11：G-Sar10-A加入后的对比数据
数据表明，分子间隔子(如所示与N末端连接)和双环核心序列内的氨基酸取代均被良好地耐受，因为效力被保留或改善。
表12显示了表11所示分子的非乙酰化(非)稳定化衍生物。在小鼠和人血浆中定量评估其稳定性，以证明与非稳定化的17-69-07-N219相比有改善(图1)。
表12：用于血浆稳定性评估所选择的分子，相关的效力
图3A显示与原始的非稳定的野生型分子17-69-07-N219相比，五取代和四取代分子17-69-07-N244和17-69-07-N231分别的小鼠血浆稳定性。于37℃，肽在小鼠血浆中的半衰期为>>20小时，而非增强型野生型分子为6小时。
图3B显示与原始的非稳定的野生型分子17-69-07-N219相比，五取代和四取代分子17-69-07-N244和17-69-07-N231分别的人血浆稳定性。于37℃，肽在小鼠血浆中的半衰期为>>20小时，而非增强型野生型分子为6小时。
总之，在17-69-07双环核心序列(Tyr1→D-Ala1、Phe4→1萘基丙氨酸4、Gly5→D-Ala5、Tyr9→4BrPhe9和Ile11→tBuGly11)中多达5个位置的靶向取代产生具有增强的效力和显着改善血浆稳定性的优异分子。
稳定的17-69-07衍生物(17-69-07-N241)的选择性
通过FP竞争测试了稳定的、含有衍生物17-69-07-N241的分子间隔子对于来源于其它物种的MT1-MMP血红素结合蛋白结构域的亲和力。数据总结在表13中：
表13：17-69-07和衍生物的物种交叉反应性
人/食蟹猴(Kd,nM) 狗(Kd,nM) 小鼠(Kd,nM)
17-69-07-N219 0.82 0.9 nd
17-69-07-N241 1.21 1.4 0.63
17-69-07的非稳定和稳定的衍生物均是完全交叉反应的。
针对相关的人金属蛋白酶测试17-69-07-N241的N末端荧光素化衍生物(称为17-69-07-N258，序列为：荧光素-(bAla)-Sar10-A-(17-69-07)D-Ala1 1Nal4 D-Ala5tBuGly11)。数据证明17-69-07核心序列和这种稳定的变体对于MT1-MMP是独特的选择性(表14)。
表14：17-69-07和衍生物对于相关金属蛋白酶的选择性
实施例3：与螯合剂缀合的17-69-07的蛋白水解稳定变体的体内分析
与金属螯合剂连接的肽在诊断和治疗中具有多种应用。某些成像或治疗放射性同位素可以“负载”到螯合剂上，而肽将所述同位素携带到靶标。以这种方式，可以使用例如PET和SPECT扫描仪来可视化肿瘤特异性抗原。对于靶向放射治疗，将治疗性放射性核素(如90Y和177Lu)加载到螯合剂-肽上，并通过结合肿瘤相关抗原选择性地携带到肿瘤中。在那里，他们通过发射的高能量辐射发挥其抗肿瘤活性。
螯合物连接的17-69-07双环肽的合成
合成了五种衍生物，其中金属螯合剂DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)与17-69-07双环肽的N-末端丙氨酸连接。
表15：分子和结构的总结
17-69-07-N144是17-69-07的野生型序列，其中DOTA直接连接到用作一个氨基酸间隔子的N-末端丙氨酸。该分子保持对MT1-MMP的完全效力。为了证明在负载治疗/成像放射性核素时保留效力，用天然(冷)175镥负载螯合剂作为安全取代物。保留效力。
完全稳定的变体，17-69-07-N248也在DOTA缀合物的情况中保留效力。
制备对照分子17-69-07-N246，其为17-69-07-N144的完全D-氨基酸等价物。该分子对蛋白水解降解完全耐受，因为与D氨基酸相邻的酰胺键被保护免受蛋白酶水解，并且其没有对MT1-MMP的任何活性。重要的是，该肽保留了完全相同的序列和化学成分。
177Lu负载的17-69-07-N144在HT1080异种移植小鼠中的生物分布
将HT-1080细胞(已知丰富表达MT1-MMP)皮下接种至雄性6周龄BALB/c nu/nu小鼠的右侧躯干中。使肿瘤生长约1周。
使用标准络合技术，用1MBq的γ-和β-发射体177Lu负载150皮摩尔的17-69-07-N144肽。每个荷瘤小鼠，然后注射150皮摩尔负载的17-69-07-N144(相当于17μg/kg)。每个时间点对3只动物进行安乐处死，各种器官和肿瘤切除并称重，随后确定每克肿瘤/器官组织的γ辐射计数。
得到的图给出了肽在体内小鼠中的定位的定量指征。特别地，HT1080肿瘤中的选择性积累表明体内MT1-MMP结合。
图4总结了生物分布数据。值得注意的是，双环肽对于肿瘤是特异性的，并且似乎持续长达24小时，尽管预测的循环半衰期为14分钟。这可能表明摄入肿瘤细胞。在肾脏中显着的定位是可见的，并且这可能是由于肾脏氨基酸转运体瞬时结合肽。所有其他器官未显示对分子的显着吸收。值得注意的是，小鼠血红素结合蛋白结构域与人类配对物具有完全同源性，表明如果小鼠PEX在其它地方表达，则会观察到相应的信号。
为了评估异种移植模型中的肿瘤摄取是否是选择性的并且由于PEX结合，使用肽17-69-07-N246进行另外的研究，该肽是17-69-07-N144的D-氨基酸配对物(图5)。
比较生物分布模式与用活性双环肽17-69-07-N144获得的生物分布模式，显然MT1-MMP非结合17-69-07-N246双环肽不靶向肿瘤，证实了17-69-07-N144的肿瘤信号由体内MT1-MMP靶标结合驱动。
最后，为了评估17-69-07序列的蛋白水解稳定对生物分布的影响，在相同的生物分布研究中采用双环肽17-69-07-N248(DOTA-A-(17-69-07)D-Ala1 1Nal4 D-Ala54BrPhe9 tBuGly11)(图6)。
令人惊奇的是，与17-69-07-N144相比，肽的增强的蛋白水解稳定性在任何给定时间点导致肿瘤摄取的整体倍增，例证与原始的、非稳定化17-69-07序列相比分子的优异性质。
预期这种效果可以产生有利的治疗指数，无论是使用本实施例中描述的缀合物的放射性核素靶向治疗，还是使用毒素-缀合的双环肽(实施例4)的情况中的放射性核素靶向治疗。
实施例4：非稳定化双环肽与细胞毒素的缀合
对于靶向癌症治疗，高度有效的细胞毒性药物通过可裂解的连接子连接到靶向实体(本文中为双环肽)，其结合肿瘤相关细胞表面表达的蛋白质。由于其内化到细胞内部的能力，选择过表达肿瘤相关的细胞表面蛋白靶标。当细胞毒性剂-缀合的靶向实体与肿瘤相关细胞表面蛋白结合时，整个分子复合体内化到细胞内部。在从全身循环过渡到不同的细胞内环境之后，细胞毒素药物通过细胞内条件从靶向实体裂解，然后裂解的药物通过细胞周期停止和其后的细胞凋亡诱导靶向细胞死亡，而发挥其抗肿瘤活性。
双环肽17-69-07-N219(参见实施例2和3)由在N-末端侧连接至Gly-Sar10-Ala分子间隔子(G-Sar10-A-(17-69-07),其中完整序列描述是G-Sar10-A-CYNEFGCEDFYDIC；SEQID NO：20)的野生型双环核心序列组成。(17-69-07)的该衍生物在0.8nM的Kd保持对MT1-MMP的完全效力(表12)。分子间隔子的N末端侧的游离的、独特的氨基被理想地放置以与效应子基团如高效细胞毒性物质缀合。采用在N末端Gly的缀合位点和双环核心序列上之间的Sar10连接子施加长的分子间距离，以保证与具有显着分子大小的效应子基团的缀合后的靶标结合效力的完全保留。只要保持双环核心序列对靶蛋白的效力，可以随意选择较短的分子间隔子。
为了用靶向MT1-MMP的双环肽药物缀合物(称为BDC)产生概念数据的证明，制备了17-69-07-N219的两种缀合物，其使用微管聚合抑制毒素DM1(美登素，也称为N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)或MMAE(单甲基奥里斯他汀E，也称为(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺基)丁酰胺)。
MMAE缀合物称为BT17BDC-1，并通过包含自我牺牲的对氨基苄基-羰基(PABC)基团的缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)连接子与17-69-07-N219前体分隔。Val-Cit连接子通过在细胞内溶酶体中遇见的富含组织蛋白酶B的环境选择性地裂解(水解)，并且在水解后，PABC牺牲释放作为活性毒性物质的MMAE。Val-Cit-PABC连接子在循环中是稳定的，并且因此仅在细胞内化时释放毒素。
缀合物的结构以及制备BT17BDC-1的合成方案如方案I所示：
方案I
BT17BDC-1的结构
反应方案：
用于制备BDC17BDC-1的合成策略：将完全纯化的、TMB环化的17-69-07-N219双环前体与戊二酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基羰基-MMAE(通常缩写为vc-MMAE或Val-Cit-PABC-MMAE)的琥珀酰亚胺酯反应，得到缀合物BDC17BDC-1。
17-69-07-N219的DM1缀合物称为BT17BDC-9，并通过二硫键与17-69-07-N219前体分隔，所述二硫键可以通过在细胞内环境中遇到的还原环境而被裂解。据信还原通过细胞内谷胱甘肽发生，细胞内存在～10mM浓度的谷胱甘肽。相比之下，血液循环中谷胱甘肽和游离还原剂的浓度要低得多(<10μM)；因此毒素主要在细胞内环境中释放，在此其可以展现其细胞杀伤活性。
缀合物的结构以及制备BT17BDC-9的合成方案如方案II所示：
方案II
BT17BDC-9的结构
反应方案：
用于制备BDC17BDC-9的合成策略：将含有游离的、N末端胺的完全纯化的、TMB环化的17-69-07-N219双环前体与二硫化物-DM1的琥珀酰亚胺酯(结构如所示)反应，得到缀合物BDC17BDC-9。
因此，BDC17BDC-1和BDC17BDC-9中的毒素的释放在机械上是不同的，即前者通过细胞内的蛋白水解条件，后者通过细胞内的还原条件。
两种BDC用于体外细胞毒性研究，并在细胞培养物如HT1080上显示低的纳摩尔/皮摩尔效力(数据未显示)。
在体内小鼠异种移植模型(携带HT1080肿瘤)中，与空白载体对照相比，两种BDC在注射后9天后引起肿瘤体积的显著降低。剂量方案如图7(箭头)所示。通过触诊判断，对于两个BDC在第14天完全清除肿瘤(图7)。值得注意的是，BDC17BDC-1和BDC17BDC-9的动物体重大部分是稳定的，表明能够足以用于治疗目的治疗窗口。
实施例5：蛋白水解稳定的双环肽与细胞毒性剂的缀合
含有1位的D-丙氨酸、4位的D-丙氨酸、5位的D-丙氨酸和11位的α-叔丁基甘氨酸修饰的，具有或不具有9位4-溴苯丙氨酸的双环核心序列17-69-07，可以增强离体血浆和体内的蛋白水解稳定性(实施例2、3)。
在双环药物缀合物的情况下，由于降低的全身清除率和在蛋白水解侵袭性肿瘤微环境中更大的稳定性，更稳定的双环核心序列可能导致更大的肿瘤暴露。两者均可以产生增加的MT1-MMP驱动的BDC向细胞内吸收，导致治疗效果的提高。
稳定的双环肽17-69-07-N241被设计为具有与非稳定化的17-69-07-N219(在实施例3和4中描述)整体相似的分子布局。其具有以下序列：
(B-Ala)-Sar10-AC(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C(SEQ ID NO：5)
其如前那样与TBMB环化。
选择N-末端β-丙氨酸而不是如先前在17-69-07-N219中使用的甘氨酸，以便在与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯偶联期间，具体地在本实施例中与细胞毒性剂的NHS酯偶联(方案I、II)期间最小化二酮哌嗪副产物形成(Purdie等人(1973),J.Chem.Soc.,PerkinTrans.2,1845)。
如在17-69-07-N219中一样保留肌氨酸十聚体间隔子，以确保双环肽与MT1-MMP的血红素结合蛋白结构域的结合的完全保留。
基于实施例4中所描述的小鼠异种移植模型中的功效和耐受性，选择美登素毒素类与17-69-07-N241缀合，并再次选择二硫键可裂解连接子。
制备了四种BDC(本文之前称为BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20)，其中毒素和17-69-07-N241都是不变的，而二硫键对还原/裂解的敏感性通过调节邻近硫原子的阻碍程度来改变。
缀合物的合成路线如方案II所述，其中17-69-07-N219被17-69-07-N241替换。
对于BT17BDC-18，另外的合成路线涉及产生吡啶基-二硫化物双环前体(称为17-69-07-N277)，其与DM1反应以形成全缀合物。合成路线描述于方案III中。
方案III
BT17BDC-18的结构
反应方案
用于制备BDC17BDC-18的合成策略：将含有游离的、N末端胺的完全纯化的、TMB环化的17-69-07-N241双环前体与SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯))，得到中间体17-69-07-N277。然后将其与作为游离巯基DM1反应，得到所需的缀合物BT17BDC-18。
BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20的体外表征
评估四种BDC的数种体外参数，例如对人类MT1-MMP血红素结合蛋白结构域的效力的保留，离体小鼠、大鼠和人血浆中的稳定性，以及对还原剂如二硫苏糖醇的稳定性。
数据总结在下表16中：
表16：BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20的体外性质
其中n/a：不适用(not applicable)，其中n＝重复次数
a：使用17-69-07-N040作为示踪剂，通过荧光偏振竞争实验确定
b：使用定量LC-MS测定。血浆中孵育时间长达24小时，含有4μM BDC。
c：来自Kellogg等人(2011)Bioconjugate Chemistry,22,717。请注意，这些值涉及本文中描述的包含二硫键连接子的抗体药物缀合物
d：通过定量LC-MS测定。请注意，这些值涉及本文中描述的含有二硫键连接子的双环药物缀合物。方法从Kellogg等(2011)Bioconjugate Chemistry,22,717修改。
e：在FP竞争中使用17-69-07-N004作为示踪剂
f：在FP竞争中使用17-69-07-N040作为示踪剂
所有分子构建体保留其对血红素结合蛋白靶标的亲和力(第二列)。
数据表明，血浆稳定性取决于二硫键的性质(如由对于还原的敏感性所调节)，而不是双环肽的性质，因为所有BDC均含有相同的双环肽(17-69-07-N241)，其在来自三种测试物种的血浆中是稳定的。
此外，BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20显示出足够治疗用途的人血浆中的稳定性，因为人类中该分子大小的肽的预期肾脏过滤驱动清除具有预估2至4小时的半衰期，其比人血浆中BDC的降解半衰期(>14小时BT17BDC-18/19/20，参见表16)快几倍。因此，预期BDC的大部分将在肾脏中清除，只有一部分在循环中降解，使得这些BDC可能适合于治疗目的。
BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20的体内功效
使用人肺鳞状细胞癌细胞系EBC-1，测试含有稳定的双环核心序列的所有BDC在体内小鼠异种移植模型中的功效。
BT17BDC-17、BT17BDC-18和BT17BDC-19在9天内有效并清除肿瘤(图9、10和11)。BT17BDC-17显示出良好的功效，但在高剂量下有一些重量减轻。BT17BDC-20虽然基于恒重而被耐受，但是不是有效的，并且仅导致肿瘤大小的边缘减少(图12)。
取肿瘤体积随着时间的曲线下面积(AUC)和BDC，并对于相应剂量组作图(图13)。由此，可以确定获得50％肿瘤AUC降低(ED 50)的有效剂量，其总结在表17中。
表17：BT17BDC-9、BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20获得50％肿瘤AUC降低的有效剂量
BDC BT17BDC-9 BT17BDC-17 BT17BDC-18 BT17BDC-19 BT17BDC-20
ED50a 2.1±1.1b 1.3±0.6b 2.1±0.8b 3.1±1.6b 22±13b
aED50±95％置信限
b单位为mg/kg，携带EBC-1肿瘤的小鼠
因此，BT17BDC-9、BT17BDC-17、BT17BDC-18和BT17BDC-19基于功效是用于靶向癌症治疗的合适分子，并且BT17BDC-17、BT17BDC-18和BT17BDC-19在有效剂量下具有良好的耐受性。
序列表
<110> 拜斯科医疗有限公司
<120> 对MT1-MMP特异性的双环肽配体
<130> BIC-C-P1803PCT
<150> GB1419237.1
<151> 2014-10-29
<150> GB1515245.7
<151> 2015-08-27
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa代表选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基或选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 1
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Xaa Xaa Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Cys Tyr Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
1 5 10
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
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<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Sar10
<400> 3
Xaa Xaa Ala Cys Tyr Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile
1 5 10 15
Cys
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为D-Ala
<400> 4
Cys Xaa Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为β Ala
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Sar10
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为D-Ala
<220>
<221> Xaa
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为NAl
<220>
<221> Xaa
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为D-Ala
<220>
<221> Xaa
<222> (16)..(16)
<223> Xaa为tBuGly
<400> 5
Xaa Xaa Ala Cys Xaa Asn Glu Xaa Xaa Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Xaa
1 5 10 15
Cys
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Y、M、F或V
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa代表选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基或选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基
<220>
<221> Xaa
<222> (4)..(4)
<223> Xaa代表选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基或选自D或E的极性、带负电荷的氨基酸残基
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa代表选自F、W和Y的非极性芳香族氨基酸残基
<220>
<221> Xaa
<222> (12)..(12)
<223> Xaa代表选自D或E的极性、带负电荷的氨基酸残基
<220>
<221> Xaa
<222> (13)..(13)
<223> Xaa代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基
<400> 6
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Xaa Xaa Cys
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Y、M、F或V
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为N或G
<220>
<221> Xaa
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为E或Q
<400> 7
Cys Xaa Xaa Xaa Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Y、M或F
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为N或G
<220>
<221> Xaa
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为E或Q
<400> 8
Cys Xaa Xaa Xaa Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> Xaa
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<223> Xaa为E或Q
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<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
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1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Cys Phe Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
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<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Cys Tyr Asn Glu Tyr Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Cys Tyr Asn Glu Trp Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
1 5 10
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Cys Lys Asn Arg Gly Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
1 5 10 15
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Ala Cys Tyr Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys Ala
1 5 10 15
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Ala Cys Met Asn Gln Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys Ala
1 5 10 15
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Sar10
<400> 20
Gly Xaa Ala Cys Tyr Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile
1 5 10 15
Cys
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Tyr Asn Glu Phe
1
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Tyr Asn Glu Phe Gly
1 5
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Glu Asp Phe Tyr Asp Ile
1 5
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种对MT1-MMP特异性的肽配体，其包含多肽和分子骨架，所述多肽含有至少三个半胱氨酸残基，并被至少两个环序列分隔；所述分子骨架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在所述分子骨架上形成至少两个多肽环，其中所述肽配体包含式(I)的氨基酸序列：
-Ci-X1-U/O2-X3-X4-G5-Cii-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-Ciii-(SEQ ID NO:1)
(I)
或其药学上可接受的盐；
其中：
Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X代表任何氨基酸残基；
U代表选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基；和
O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的肽配体，其中X1选自任何一种以下氨基酸：Y、M、F或V，如Y、M或F，特别是Y或M，更特别是Y。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的肽配体，其中U/O2选自U，如N，或O，如G。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽配体，其中X3选自U或Z，其中U表示选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基，并且Z代表选自D或E的极性、带负电荷的氨基酸残基，特别地3位的U选自Q或3位的Z选自E。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽配体，其中X4选自J，其中J代表选自F、W和Y的非极性芳香族氨基酸残基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽配体，其中X10选自Z，其中Z代表选自D或E的极性、带负电荷的氨基酸残基，如D。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肽配体，其中X11选自O，其中O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基，如I。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽配体，其中式(I)的化合物为式(Ia)的化合物：
-Ci-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-Cii-E-D-F-Y-Z-O-Ciii-(SEQ ID NO：6)
(Ia)；
其中，U、O、J和Z如本文之前所定义；或
为式(Ib)的化合物：
-Ci-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：7)
(Ib)；或
为式(Ic)的化合物：
-Ci-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：8)
(Ic)；或
为式(Id)的化合物：
-Ci-Y/M-N-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：9)
(Id)；或
为式(Ie)的化合物：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)
(Ie)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽配体，其中式(I)的肽包含选自以下的序列：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)；
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-12)(SEQ ID NO：10)；
-Ci-F-G-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-02)(SEQ ID NO：11)；
-Ci-V-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-03)(SEQ ID NO：12)；
-Ci-F-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-04)(SEQ ID NO：13)；
-Ci-Y-N-E-Y-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07-N057)(SEQ ID NO：14)；和
-Ci-Y-N-E-W-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-44-N002)(SEQ ID NO：15)；
如：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)；和
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-12)(SEQ ID NO：10)；
特别是：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的肽配体，其包括一个或多个选自以下的修饰：N-末端修饰和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基(例如用一个或多个等排或等电子氨基酸替换一个或多个极性氨基酸残基；用其它非天然的等排或等电子氨基酸替换一个或多个疏水性氨基酸残基)；加入间隔子基团；用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体中一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键替换一个或多个肽键；肽骨架长度修饰；用另一个化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，和用合适的胺、硫醇、羧酸和酚反应性试剂合成后生物正交修饰氨基酸如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和酪氨酸。
11.根据权利要求10所述的肽配体，其中所述修饰包含使用合适的氨基反应性化学的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应性化学的C-末端修饰。
12.根据权利要求10或11所述的肽配体，其中所述N-末端修饰包含加入有助于效应子基团缀合和保持双环肽对其靶标的效力的分子间隔子基团，例如Ala、G-Sar10-A或bAla-Sar10-A基团。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的肽配体，其中所述N-末端修饰和/或C-末端修饰包含加入细胞毒性剂。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的肽配体，其包含在1位和/或9位氨基酸处的修饰。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的肽配体，其包含用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。
16.根据权利要求15所述的肽配体，其中所述非天然氨基酸残基取代于4位并且选自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸和高苯丙氨酸，如1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯丙氨酸；特别是1-萘基丙氨酸。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的肽配体，其中所述非天然氨基酸残基取代于9位和/或11位并且选自：对于9位为4-溴苯丙氨酸或五氟-苯丙氨酸和/或对于11位为叔丁基甘氨酸。
18.根据权利要求17所述的肽配体，其中所述非天然氨基酸残基，如存在于9位的那些，选自：4-溴苯丙氨酸。
19.根据权利要求17所述的肽配体，其中所述非天然氨基酸残基，如存在于11位的那些，选自：叔丁基甘氨酸。
20.根据权利要求15所述的肽配体，其包含多个修饰，例如2、3、4或5个或更多个以下修饰，特别是所有以下5个修饰：1位和/或5位的D-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸，9位的4-溴苯丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。
21.根据权利要求10所述的肽配体，其中将1位的氨基酸残基取代为D-氨基酸，例如D-丙氨酸。
22.根据权利要求10所述的肽配体，其中将5位的氨基酸残基取代为D-氨基酸，例如D-丙氨酸或D-精氨酸。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的肽配体，其中所述药学上可接受的盐选自游离酸或钠、钾、钙、铵盐。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的肽配体，其为人、小鼠和狗的MT1-MMP血红素结合蛋白结构域的高亲和力结合剂。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的肽配体，其对于MT1-MMP是选择性的，但不与MMP-1、MMP-2、MMP-15和MMP-16交叉反应。
26.一种药物缀合物，其包含与一种或多种效应子和/或官能团缀合的根据权利要求1至25中任一项所述的肽配体。
27.根据权利要求26所述的药物缀合物，其中所述效应子和/或官能团包含细胞毒性剂或金属络合剂。
28.根据权利要求27所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂通过可裂解键如二硫键或蛋白酶敏感键与双环肽连接。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自具有以下结构的DM1：
或具有以下结构的MMAE：
30.根据权利要求26至29中任一项所述的药物缀合物，其为具有以下结构的化合物：
31.根据权利要求26至29中任一项所述的药物缀合物，其为具有以下结构的化合物：
32.根据权利要求27至权利要求28所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂为美登素并选自式(II)的化合物：
其中n代表选自1至10的整数；和
R1和R2独立地代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基，如氢或甲基。
33.根据权利要求32所述的药物缀合物，其中：
n代表1，并且R1和R2均代表氢(即美登素衍生物DM1)；或
n代表2，R1代表氢且R2代表甲基(即美登素衍生物DM3)；或
n代表2，并且R1和R2均代表甲基(即美登素衍生物DM4)。
34.根据权利要求26至33所述的药物缀合物，其中缀合物的双环肽组分具有式(III)所示的结构：
其中m代表选自0至10的整数，和
R3和R4独立地代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基，如氢或甲基。
35.根据权利要求27至34所述的药物缀合物，其中通过式(V)定义的连接子将细胞毒性剂与双环肽连接：
其中R1、R2、R3和R4代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基，如氢或甲基；
毒素指任何合适的细胞毒性剂；
双环代表根据权利要求1至24中任一项所述的肽配体；
n代表选自1至10的整数；和
m代表选自0至10的整数。
36.根据权利要求35所述的药物缀合物，其中化合物(IV)的毒素为美登素，并且缀合物包含式(V)的化合物：
其中R1、R2、R3和R4代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基；
双环代表根据权利要求1至24中任一项所述的肽配体；
n代表选自1至10的整数；和
m代表选自0至10的整数。
37.根据权利要求36所述的药物缀合物，其中：
n代表1并且R1、R2、R3和R4各自代表氢，即式(V)a的化合物：
n代表1，R1代表甲基，并且R2、R3和R4各自代表氢，即式(V)b的化合物：
n代表2，R1和R2均代表氢，并且R3和R4均代表甲基，即式(V)c的化合物：
n代表2，R1和R3均代表甲基，并且R2和R4均代表氢，即式(V)d的化合物：
38.根据权利要求26或权利要求27所述的药物缀合物，其选自：
BT17BDC-9：
BT17BDC-17：
BT17BDC-18：
BT17BDC-19：
和
BT17BDC-20：
如BT17BDC-9、BT17BDC-17、BT17BDC-18和BT17BDC-19，特别是BT17BDC-17、BT17BDC-18和BT17BDC-19。
39.一种制备根据权利要求38所述的药物缀合物的方法，其包括如方案I、II、III中任一项所描述的合成路径。
40.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至25中任一项所述的肽配体或根据权利要求26至38中任一项所述的药物缀合物，和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
41.根据权利要求26至38中任一项所述的药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗癌症，特别是实体瘤如非小细胞肺癌的用途。

Claims (41)

1.一种对MT1-MMP特异性的肽配体，其包含多肽和分子骨架，所述多肽含有至少三个半胱氨酸残基，并被至少两个环序列分隔；所述分子骨架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在所述分子骨架上形成至少两个多肽环，其中所述肽配体包含式(I)的氨基酸序列：
-Ci-X-U/O-X-X-G-Cii-E-D-F-Y-X-X-Ciii-(SEQ ID NO:1)
(I)
或其修饰的衍生物，或其药学上可接受的盐；
其中：
Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X代表任何氨基酸残基；
U代表选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基；和
O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的肽配体，其中1位的X选自任何一种以下氨基酸：Y、M、F或V，如Y、M或F，特别是Y或M，更特别是Y。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的肽配体，其中2位的U/O选自U，如N，或O，如G。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽配体，其中3位的X选自U或Z，其中U表示选自N、C、Q、M、S和T的极性、不带电荷的氨基酸残基，并且Z代表选自D或E的极性、带负电荷的氨基酸残基，特别地3位的U选自Q或3位的Z选自E。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽配体，其中4位的X选自J，其中J代表选自F、W和Y的非极性芳香族氨基酸残基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽配体，其中10位的X选自Z，其中Z代表选自D或E的极性、带负电荷的氨基酸残基，如D。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肽配体，其中11位的X选自O，其中O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基，如I。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽配体，其中式(I)的化合物为式(Ia)的化合物：
-Ci-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-Cii-E-D-F-Y-Z-O-Ciii-(SEQ ID NO：6)
(Ia)；
其中，U、O、J和Z如本文之前所定义；或
为式(Ib)的化合物：
-Ci-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：7)
(Ib)；或
为式(Ic)的化合物：
-Ci-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：8)
(Ic)；或
为式(Id)的化合物：
-Ci-Y/M-N-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(SEQ ID NO：9)
(Id)；或
为式(Ie)的化合物：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)
(Ie)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽配体，其中式(I)的肽包含选自以下的序列：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)；
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-12)(SEQ ID NO：10)；
-Ci-F-G-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-02)(SEQ ID NO：11)；
-Ci-V-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-03)(SEQ ID NO：12)；
-Ci-F-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-04)(SEQ ID NO：13)；
-Ci-Y-N-E-Y-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07-N057)(SEQ ID NO：14)；和
-Ci-Y-N-E-W-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-44-N002)(SEQ ID NO：15)；
如：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)；和
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-12)(SEQ ID NO：10)；
特别是：
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(SEQ ID NO：2)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的肽配体，其中所述修饰的衍生物包含一个或多个选自以下的修饰：N-末端修饰和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基(例如用一个或多个等排或等电子氨基酸替换一个或多个极性氨基酸残基；用其它非天然的等排或等电子氨基酸替换一个或多个疏水性氨基酸残基)；加入间隔子基团；用一个或多个抗氧化氨基酸残基替换一个或多个氧化敏感性氨基酸残基；用丙氨酸替换一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体中一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键替换一个或多个肽键；肽骨架长度修饰；用另一个化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，和用合适的胺、硫醇、羧酸和酚反应性试剂合成后生物正交修饰氨基酸如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和酪氨酸。
11.根据权利要求10所述的肽配体，其中所述修饰的衍生物包含使用合适的氨基反应性化学的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应性化学的C-末端修饰。
12.根据权利要求10或11所述的肽配体，其中所述N-末端修饰包含加入有助于效应子基团缀合和保持双环肽对其靶标的效力的分子间隔子基团，例如Ala、G-Sar10-A或bAla-Sar10-A基团。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的肽配体，其中所述N-末端修饰和/或C-末端修饰包含加入细胞毒性剂。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的肽配体，其中所述修饰的衍生物包含在1位和/或9位氨基酸处的修饰。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的肽配体，其中所述修饰的衍生物包含用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。
16.根据权利要求15所述的肽配体，其中所述非天然氨基酸残基取代于4位并且选自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸和高苯丙氨酸，如1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯丙氨酸；特别是1-萘基丙氨酸。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的肽配体，其中所述非天然氨基酸残基取代于9位和/或11位并且选自：对于9位为4-溴苯丙氨酸或五氟-苯丙氨酸和/或对于11位为叔丁基甘氨酸。
18.根据权利要求17所述的肽配体，其中所述非天然氨基酸残基，如存在于9位的那些，选自：4-溴苯丙氨酸。
19.根据权利要求17所述的肽配体，其中所述非天然氨基酸残基，如存在于11位的那些，选自：叔丁基甘氨酸。
20.根据权利要求15所述的肽配体，其中所述修饰的衍生物包含多个上面提及的修饰，例如2、3、4或5个或更多个以下修饰，例如所有以下5个修饰：1位和/或5位的D-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸，9位的4-溴苯丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。
21.根据权利要求10所述的肽配体，其中将1位的氨基酸残基取代为D-氨基酸，例如D-丙氨酸。
22.根据权利要求10所述的肽配体，其中将5位的氨基酸残基取代为D-氨基酸，例如D-丙氨酸或D-精氨酸。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的肽配体，其中所述药学上可接受的盐选自游离酸或钠、钾、钙、铵盐。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的肽配体，其为人、小鼠和狗的MT1-MMP血红素结合蛋白结构域的高亲和力结合剂。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的肽配体，其对于MT1-MMP是选择性的，但不与MMP-1、MMP-2、MMP-15和MMP-16交叉反应。
26.一种药物缀合物，其包含与一种或多种效应子和/或官能团缀合的根据权利要求1至25中任一项所述的肽配体。
27.根据权利要求26所述的药物缀合物，其中所述效应子和/或官能团包含细胞毒性剂或金属络合剂。
28.根据权利要求27所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂通过可裂解键如二硫键或蛋白酶敏感键与双环肽连接。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自具有以下结构的DM1：
或具有以下结构的MMAE：
30.根据权利要求26至29中任一项所述的药物缀合物，其为具有以下结构的化合物：
31.根据权利要求26至29中任一项所述的药物缀合物，其为具有以下结构的化合物：
32.根据权利要求27至权利要求28所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂为美登素并选自式(II)的化合物：
其中n代表选自1至10的整数；和
R1和R2独立地代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基，如氢或甲基。
33.根据权利要求32所述的药物缀合物，其中：
n代表1，并且R1和R2均代表氢(即美登素衍生物DM1)；或
n代表2，R1代表氢且R2代表甲基(即美登素衍生物DM3)；或
n代表2，并且R1和R2均代表甲基(即美登素衍生物DM4)。
34.根据权利要求26至33所述的药物缀合物，其中缀合物的双环肽组分具有式(III)所示的结构：
其中m代表选自0至10的整数，和
R3和R4独立地代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基，如氢或甲基。
35.根据权利要求27至34所述的药物缀合物，其中通过式(V)定义的连接子将细胞毒性剂与双环肽连接：
其中R1、R2、R3和R4代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基，如氢或甲基；
毒素指任何合适的细胞毒性剂；
双环代表根据权利要求1至24中任一项所述的肽配体；
n代表选自1至10的整数；和
m代表选自0至10的整数。
36.根据权利要求35所述的药物缀合物，其中化合物(IV)的毒素为美登素，并且缀合物包含式(V)的化合物：
其中R1、R2、R3和R4代表氢、C1-6烷基或碳环基或杂环基；
双环代表根据权利要求1至24中任一项所述的肽配体；
n代表选自1至10的整数；和
m代表选自0至10的整数。
37.根据权利要求36所述的药物缀合物，其中：
n代表1并且R1、R2、R3和R4各自代表氢，即式(V)a的化合物：
n代表1，R1代表甲基，并且R2、R3和R4各自代表氢，即式(V)b的化合物：
n代表2，R1和R2均代表氢，并且R3和R4均代表甲基，即式(V)c的化合物：
n代表2，R1和R3均代表甲基，并且R2和R4均代表氢，即式(V)d的化合物：
38.根据权利要求26或权利要求27所述的药物缀合物，其选自BT17BDC-9、BT17BDC-17、BT17BDC-18、BT17BDC-19和BT17BDC-20，如BT17BDC-9、BT17BDC-17、BT17BDC-18和BT17BDC-19，特别是BT17BDC-17、BT17BDC-18和BT17BDC-19。
39.一种制备根据权利要求38所述的药物缀合物的方法，其包括如方案I、II、III中任一项所描述的合成路径。
40.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至25中任一项所述的肽配体或根据权利要求26至38中任一项所述的药物缀合物，和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
41.根据权利要求1至25中任一项所述的肽配体或根据权利要求26至38中任一项所述的药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗癌症，特别是实体瘤如非小细胞肺癌的用途。
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