BR112017008575B1 - Ligantes de peptídeos bicíclicos específicos a mt1-mmp, conjugado de fármaco, processo para preparação de um conjugado de fármaco e composição farmacêutica - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a, polipeptídios que são co-valentemente ligados a arcabouços (scaffolds) moleculares, de tal modo que dois ou mais laços de peptídeos são subtendidos entre pontos de ligação ao arcabouço. em particular, a invenção descreve peptídeos que são ligantes de alta afinidade de membrana metaloprotease tipo 1 (mt1-mmp). a invenção também descreve conjugados de fármaco que compreendem esses peptídeos, conjugados com um ou mais grupos efetores e/ou funcionais que apresentam utilidade na terapia de imagem e direcionada a câncer.
Description
[001] A presente invenção refere-se a polipeptídios que são covalentemente ligados a arcabouços (scaffolds) moleculares, de tal modo que dois ou mais laços peptídicos são subtendidos entre pontos de ligação com o arcabouço (scaffold). Em particular, a invenção descreve peptídeos que são ligantes de alta afinidade da membrana metaloprotease tipo 1 (MT1-MMP). A invenção também descreve conjugados de fármacos que compreendem esses peptídeos, conjugados com um ou mais grupos efetores e/ou grupos funcionais que apresentam utilidade na terapia de imagem e direcionada a câncer.
[002] Peptídeos cíclicos são capazes de ligarem com alta afinidade e especificidade-alvo a proteína-alvo e, portanto, é uma classe de molécula atrativa para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. De fato, diversos peptídeos cíclicos são já utilizados com êxito na clínica, como, por exemplo, o peptídeo antibacteriano vancomicina, o fármaco imunossupressor ciclosporina ou o fármaco anticancerígeno octreotídeo (Driggers e outros, (2008), Nat. Rev. Drug Discov. 7(7), 608 24). Boas propriedades de ligação resultam de uma superfície de interação relativamente grande formada entre o peptídeo e o alvo, bem como, a flexibilidade conformacional reduzida das estruturas cíclicas. Tipicamente, macrociclos ligam-se às superfícies de diversas centenas de angstrons quadrados, como, por exemplo, o antagonista CXCR4 de peptídeo cíclico CVX15 (400 Â2, Wu e outros (2007), Science 330, 1066 71), um peptídeo cíclico com o motivo Arg-Gli-Asp que se liga a integrina αVb3 (355 A2) (Xiong e outros (2002), Science 296 (5565), 151-5) ou o inibidor de peptídeo cíclico upain-1 que se liga ao ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (603 A2; Zhao e outros (2007), J. Struct. Biol. 160 (1), 1-10).
[003] Devido à sua configuração cíclica, macrociclos peptídicos são menos flexíveis que os peptídeos lineares, levando a uma menor perda de entropia sob ligação a alvos e resultando em uma afinidade de ligação superior. A flexibilidade reduzida também leva a bloqueio de conformações específicas a alvo, aumentando especificidade de ligação comparada com peptídeos lineares. Esse efeito foi exemplificado por um inibidor potente e seletivo de matriz metaloproteinase 8, (MMP-8), o qual perde sua seletividade sobre outras MMPs quando seu anel foi aberto (Cherney e outros (1998), J. Med. Chem. 41 (11), 1749-51). As propriedades de ligação favoráveis obtidas por meio de macrociclização são ainda mais pronunciadas em peptídeos multicíclicos que apresentam mais de um anel de peptídeo como, por exemplo, em vancomicina, nisina e actinomicina.
[004] Diferentes grupos de pesquisa apresentam polipeptídios previamente amarrados com resíduos de cisteína com uma estrutura molecular sintética (Kemp e McNamara (1985), J. Org. Chem., Timmerman e outros (2005), ChemBioChem). Meloen e co colaboradores tinham usado tris(bromometil)benzeno e moléculas correlatas para ciclização rápida e quantitativa de laços múltiplos de peptídeos em arcabouços sintéticos para mimetismo estrutural de superfícies da proteína (Timmerman e outros, (2005), ChemBioChem). Métodos para a geração de compostos de fármaco candidato em que os compostos são gerados por meio de ligação de polipeptídios contendo cisteína com um arcabouço molecular, por exemplo, tris(bromometil)benzeno são descritos nos WO 2004/077062 e WO 2006/078161.
[005] Abordagens combinatórias baseadas em exibição de fagos são desenvolvidas para gerar e selecionar grandes bibliotecas de peptídeos bicíclicos para alvos de interesse (Heinis e outros (2009), Nat. Chem. Biol. 5(7), 502-7 e WO2009/098450). Resumidamente, as bibliotecas combinatórias de peptídeos lineares que contêm três resíduos de cisteína e duas regiões de seis aminoácidos aleatórios (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys) foram exibidas em fago e ciclizadas por meio de ligação covalente das cadeias laterais de cisteína com uma molécula pequena (tris-(bromometil)benzeno).
[006] De acordo com um primeiro aspecto da invenção é proporcionado um ligante peptídico específico a MT1 -MMP compreendendo um polipeptídio que compreende pelo menos três resíduos de cisteína, separados por, pelo menos, duas sequências de laço, e um arcabouço molecular que forma ligações covalentes com os resíduos de cisteína do polipeptídio tal que, pelo menos, dois laçosde polipeptídios são formados no arcabouço molecular, em que o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos de fórmula (I):
ou um derivado modificado, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: Ci, Cii e Ciii representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente; X representa qualquer resíduo de aminoácido; U representa um resíduo de aminoácido polar, não carregado selecionado de N, C, Q, M, S e T; e O representa um resíduo de aminoácido alifático não polar selecionado de G, A, I, L, P e V.
[007] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionado um conjugado de fármaco que compreende um ligante de peptídeo conforme definido neste relatório, conjugado com um ou mais grupos efetores e/ou grupos funcionais, tal como um agente citotóxico, em particular, DM1 e MMAE.
[008] De acordo com um aspecto adicional da invenção é proporcionado um conjugado que compreende um ligante de peptídeo conforme definido neste relatório conjugado com um ou mais grupos efetores e/ou grupos funcionais, tal como um grupo quelante que transporta radionuclídeo, em particular, DOTA.
[009] De acordo com um aspecto adicional da invenção é proporcionado uma combinação farmacêutica compreendendo um ligante peptídico ou um conjugado de fármaco, conforme definido neste relatório em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0010] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionado um ligante peptídico, conforme definido neste relatório para uso na prevenção, supressão ou tratamento de câncer, em particular, tumores sólidos, tais como carcinomas pulmonares de células não pequenas.
[0011] Figura 1: Estabilidade de plasma de camundongo de 17-69- 07-N219. Vários íons foram monitorados conforme indicados na legenda, bem como, duas transições em modo MRM. Há uma correlação excelente entre os íons. A meia-vida do peptídeo no plasma de camundongo a 37°C é de 6 horas.
[0012] Figura 2: Perfil PK de Peptídeo Bicíclico 17-69-07-N004 em camundongo. 2 (dois) animais por ponto de tempo.
[0013] Figura 3: Camundongo (A) e Estabilidade Plasmática Humana (B) de duas moléculas estabilizadas 17-69-07 (com 4- bromofenilalanina na posição 9: 17-69-07-N244, sem 4- bromofenilalanina na posição 9: 17-69-07-N231) comparado com o 17- 69-07-N219 não estabilizado. Diversas transições de MRM para um dado analito foram monitoradas, as quais se correlacionaram bem entre si. Para o propósito desse gráfico, apenas uma transição é exibida.
[0014] Figura 4: Biodistribuição de 177Lu 17-69-07-N144 em camundongos de xenoenxerto de HT-1080.
[0015] Figura 5: Biodistribuição de 177Lu 17-69-07-N246 em camundongos de xenoenxerto de HT-1080.
[0016] Figura 6: Biodistribuição de 177Lu 17-69-07-N248 em camundongos de xenoenxerto de HT-1080.
[0017] Figura 7: (A): Gráfico de volume do tumor médio versus tempo para BT17BDC-1 e 9. Doses foram administradas nos dias 0, 2, 4, 7, 9 e 11. (B): peso corporal durante tratamento, o qual é indicativo de toxicologia associada ao fármaco e saúde geral do animal.
[0018] Figura 8: Lista de saídas de sequências derivadas de maturações de afinidade utilizando bibliotecas com resíduos de 17-69 de 2 laçosfixos. O gráfico logo de sequência à direita mostra a preferência total dos resíduos nos resíduos, 1, 2, 3, 4 e 5 de laço1.
[0019] Figura 9: Parte superior: gráfico de volume tumoral médio versus tempo para BT17BDC-17 em camundongos de xenoenxerto EBC-1. Doses foram administradas nos dias 0, 2, 4, 7, 9, 11 e 14. Parte inferior: Peso corporal durante tratamento, o qual é indicativo de toxicologia associada ao fármaco e saúde geral do animal.
[0020] Figura 10: Parte superior: gráfico de volume tumoral médio versus tempo para BT17BDC-18 em camundongos de xenoenxerto EBC-1. Doses foram administradas nos dias 0, 2, 4, 7, 9, 11 e 14. Parte inferior: Peso corporal durante tratamento, o qual é indicativo de toxicologia associada ao fármaco e saúde geral do animal.
[0021] Figura 11: Parte superior: gráfico de volume tumoral médio versus tempo para BT17BDC-19 em camundongos de xenoenxerto com EBC-1. Doses foram administradas nos dias 0, 2, 4, 7, 9, 11 e 14. Parte inferior: Peso corporal durante tratamento, o qual é indicativo de toxicologia associada ao fármaco e saúde geral do animal.
[0022] Figura 12: Parte superior: gráfico de volume tumoral médio versus tempo para BT17BDC-20 em camundongos de xenoenxerto com EBC-1. Doses foram administradas nos dias 0, 2, 4, 7, 9, 11 e 14. Parte inferior: Peso corporal durante tratamento, o qual é indicativo de toxicologia associada ao fármaco e saúde geral do animal.
[0023] Figura 13: Gráfico da área sob curva (AUC) de volume tumoral ao longo do tempo associado a um BDC particular contra o grupo de dose correspondente. Ajustes de curvas são realizados usando todos os pontos de dados disponíveis normalizados para volume tumoral em tempo zero, usando equações-padrão de CI 50.
[0024] A não ser que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como normalmente entendido por aqueles versados no estado da técnica, tais como no estado da técnica de química dos peptídeos, cultura de células e exibição de fagos, química e bioquímica de ácidos nucleicos. Técnicas-padrão são utilizadas para métodos de biologia molecular, genética e bioquímica (ver Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3a. Ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a. Ed., John Wiley & Sons, Inc.), os quais são incorporados neste relatório como referência.
[0025] Quando se refere às posições dos resíduos de aminoácidos em compostos de fórmula (I), resíduos de cisteína (Ci, Cii e Ciii) são omitidos na numeração quando estes são invariantes, por conseguinte, a numeração de resíduos de aminoácidos no composto de fórmula (I) é referido como abaixo:
[0026] Para a finalidade desta descrição, todos os peptídeos bicíclicos assumem-se ser ciclizados com TBMB (1,3,5-tris(bromometil) benzeno), produzindo uma estrutura de 1,3,5-trismetilbenzeno tri- substituído. Ciclização com TBMB ocorre em Ci, Cii e Ciii.
[0027] Cada peptídeo bicíclico descrito neste relatório foi atribuído um único número de sequência de núcleo, a qual é definida como a sequência de aminoácidos entre a primeira cisteína de término N (Ci) e a última cisteína de término C (Ciii). No exemplo do identificador 17-69 07, a sequência de núcleo é CiYNEFGCiiEDFYDICiii (ID SEQ NO: 2), e é referida como "17-69-07" ou "(17-69-07)".
[0028] Certos peptídeos bicíclicos descritos neste relatório foram atribuídos também um único identificador utilizando um código de peptídeo, tal como 17-69-07-N241, em que N241 denota um derivado particular da sequência de núcleo bicíclico 17-69-07. Derivados diferentes de 17-69-07 apresentam diferentes números N, isto é, N001, N002 e Nxxx.
[0029] Extensões de términos N ou C para a sequência de núcleo bicíclico são adicionadas do lado esquerdo ou direito da sequência de núcleo, separadas por um hífen. Por exemplo, uma cauda βAla-Sar10- Ala de término N poderia ser denotada como: βAla-Sar10-A-(17-69-07) e apresenta a sequência total de βAla-Sar10-A-CYNEFGCEDFYDIC (ID SEQ NO: 3).
[0030] Substituições de aminoácidos não naturais dentro da sequência de núcleo bicíclico são indicadas após a descrição de formato molecular. Por exemplo, se tirosina 1 em 17-69-07 é substituída com D- alanina, a descrição é (17-69-07) D-Ala1, e a sequência completa seria descrita como C(D-Ala1)NEFGCEDFYDIC (ID SEQ NO: 4).
[0031] Se uma cauda de término N ou término C é ligada com um peptídeo bicíclico que também contém modificações para a sequência de núcleo, em seguida, utilizando 17-69-07 N241 como um exemplo, a descrição de formato molecular é: βAla-Sar10-A-(17-69-07) DAla1 1NAI4 DAla5 tBuGly11.
[0032] A sequência completa de aminoácidos de 17-69-07-N241 é, portanto: βAla-Sar10-A-C(D-Ala)NE(1NaI)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C (ID SEQ NO: 5).
[0033] Um ligante de peptídeo, conforme referido neste relatório refere-se a um peptídeo covalentemente ligado a um arcabouço molecular. Tipicamente, tais peptídeos compreendem dois ou mais grupos reativos (isto é, resíduos de cisteína), que são capazes de formar ligações covalentes com o arcabouço, e uma sequência subtendida entre esses grupos reativos que se refere como a sequência de laço, uma vez que forma um laçoquando o peptídeo é ligado ao arcabouço. No presente caso, os peptídeos compreendem pelo menos três resíduos de cisteína (referidos neste relatório como Ci, Cii, e Ciii) e formam pelo menos dois laçossobre o arcabouço.
[0034] Será avaliado por aquele versado no estado da técnica que o X nas posições 1, 3, 4, 10 e 11 de fórmula (I), pode representar qualquer aminoácido seguindo os resultados da varredura de alanina (ver Tabela 5) e de saídas da seleção (Figura 8), que permite substituições bem toleradas nessas posições.
[0035] Em uma modalidade, o X na posição 1 de fórmula (I) é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes aminoácidos: Y, M, F ou V. Em uma modalidade, o X na posição 1 de fórmula (I) é selecionado de Y, M ou F. Em uma modalidade ainda adicional, o X na posição 1 de fórmula (I) é selecionado de Y ou M. Em uma modalidade ainda adicional, o X na posição 1 de fórmula (I) é selecionado de Y.
[0036] Em uma modalidade, o U/O na posição 2 de fórmula (I) é selecionado de um U, tal como um N. Em uma modalidade alternativa, o U/O na posição 2 de fórmula (I) é selecionado de um grupo O tal como G.
[0037] Em uma modalidade, o X na posição 3 da fórmula (I) é selecionado de U ou Z, em que U representa um resíduo de aminoácido polar não carregado selecionado de N, C, Q, M, S e T e Z representa um resíduo de aminoácido polar negativamente carregado selecionado de D ou E. Em uma modalidade adicional, o U na posição 3 da fórmula (I) é selecionado de Q. Em uma modalidade alternativa, o Z na posição 3 da fórmula (I) é selecionado de E.
[0038] Em uma modalidade, o X na posição 4 da fórmula (I) é selecionado de J, em que J representa um resíduo aminoácido aromático não polar selecionado de F, W e Y. Em uma modalidade adicional, o J na posição 4 da fórmula (I) é selecionado de F. Em uma modalidade alternativa, o J na posição 4 da fórmula (I) é selecionado de Y. Em modalidade alternativa, o J na posição 4 da fórmula (I) é selecionado de W.
[0039] Em uma modalidade, o X na posição 10 de fórmula (I) é selecionado de Z, em que Z representa um resíduo de aminoácido polar, negativamente carregado selecionado de D ou E. Em uma modalidade, o Z na posição 10 de fórmula (I) é selecionado de D.
[0040] Em uma modalidade, o X na posição 11 de fórmula (I) é selecionado de O, em que O representa um resíduo de aminoácido alifático não polar selecionado de G, A, I, L, P e V. Em uma modalidade, o O na posição 11 de fórmula (I) é selecionado de I.
[0041] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (Ia):
em que U, O, J e Z são como definidos acima.
[0042] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (Ib):
[0043] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (Ic):
[0044] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (Id):
[0045] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (Ie):
[0046] Em uma modalidade ainda adicional, o peptídeo de fórmula (1) compreende uma sequência selecionada de:
[0047] Os peptídeos dessa modalidade foram identificados ser candidatos potentes após maturação de afinidade contra o domínio hemopexina de MT1-MMP (ver, Exemplo 1 e Tabelas 1 e 8).
[0048] Em uma modalidade ainda adicional, o peptídeo de fórmula (1) compreende uma sequência selecionada de:
[0049] Os peptídeos dessa modalidade foram identificados ser os candidatos de afinidade mais alta após maturação de afinidade contra o domínio hemopexina de MT1-MMP, síntese das sequências bicíclicas do núcleo, e medição quantitativa de afinidades usando experimentos de competição (ver, Exemplo 1 e Tabelas 1-3).
[0050] Em uma modalidade ainda adicional, o peptídeo de fórmula (I) compreende uma sequência selecionada de -Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D- F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07) (ID SEQ NO: 2). O peptídeo dessa modalidade foi identificado ser o membro mais potente, e estável da família de ligantes de peptídeo na fórmula (I) (ver, Exemplos 1 a 4).
[0051] Em uma modalidade, certos ligantes de peptídeo da invenção são totalmente de reação cruzada com MT1 -MMP de murino, cão, cinomolgo e ser humano. Em uma modalidade adicional, os ligantes peptídicos especificamente exemplificados da invenção são totalmente de reação cruzada com MT1 -MMP de murino, cão, cinomolgo e humano. Por exemplo, dados são apresentados neste relatório, os quais demonstram que tanto os derivados não estabilizados quanto os estabilizados de 17-69-07 (isto é, 17-69-07-N219 e 17-69-07- N241) são totalmente de reação cruzada (ver Tabela 13).
[0052] Em uma modalidade ainda adicional, o ligante peptídico da invenção é seletivo para MT1 -MMP, mas não reagem de forma cruzada com MMP-1, MMP-2, MMP-15 e MMP-16. Dados são apresentados neste relatório, os quais demonstram que a sequência de núcleo 17-69 07, e a variante estabilizada 17-69-07-N258, são unicamente seletivas a MT1 -MMP (ver Tabela 14).
[0053] Certos peptídeos bicíclicos da presente invenção apresentam várias propriedades vantajosas, as quais os permitem ser considerados como moléculas semelhantes a fármaco adequado para administração de injeção, inalação, nasal, ocular, oral ou tópica. Tais propriedades vantajosas incluem: - Reatividade cruzada de espécies. Essa é uma exigência típica de avaliação pré-clínica farmacodinâmica e farmacocinética; - Estabilidade de protease. Ligantes de peptídeo bicíclico devem demonstrar idealmente estabilidade para proteases do plasma, proteases epiteliais ("ancorada por membrana"), proteases gástricas e intestinais, proteases da superfície pulmonar, proteases intracelulares, e similares. Estabilidade de protease deve ser mantida entre diferentes espécies, de tal modo que um candidato condutor bicíclico pode ser desenvolvido em modelos animais, bem como, administrados com confiança a seres humanos; - perfil de solubilidade desejável. Esta é uma função da proporção de resíduos carregados e hidrofílicos versus hidrofóbicos e ligações de H intra/intermolecular, o que é importante para propósitos de formulação e absorção; e - uma meia-vida plasmática ótima na circulação. Dependendo da indicação clínica e regime de tratamento, pode ser necessário desenvolver um peptídeo bicíclico de exposição curta em um ajuste de controle de doença aguda, ou desenvolver um peptídeo bicíclico com retenção acentuada na circulação, e é, portanto, ideal para o controle de estado da doença crônica. Outros fatores que conduzem à meia-vida plasmática desejável são exigências de exposição sustentada para eficiência terapêutica máxima versus a toxicologia de acompanhamento devido à exposição sustentada do agente.
[0054] Será avaliado que formas salinas estão dentro do escopo desta invenção, e referências a, compostos de fórmula (I) incluem as formas salinas desses compostos.
[0055] Os sais da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto de origem que contém uma porção básica ou ácida por meio de métodos químicos convencionais, tais como métodos descritos em Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Sais Farmacêuticos: Propriedades, Seleção e Utilização), P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 páginas, agosto de 2002. Geralmente, esses sais podem ser preparados por meio de reação das formas de ácido ou base livre desses compostos com a base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois.
[0056] Sais de adição ácidos (sais mono- ou di-) podem ser formados com uma ampla variedade de ácidos, tanto inorgânicos quanto orgânicos. Exemplos de sais de adição ácidos incluem sais mono- ou diformados com um ácido selecionado do grupo que consiste de ácidos acéticos, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico, ascórbico (por exemplo, L-ascórbico), L-aspártico, benzenossulfônico, benzoico, 4- acetamidobenzoico, butanoico, (+) canfórico, canforssulfônico, (+)-(1S) -canfor-10-sulfônico, cáprico, caproico, caprílico, cinâmico, cítrico, ciclâmico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-dissulfônico, etanossulfônico, 2- hidroxietanossulfônico, fórmico, fumárico, galactárico, gentísico, glicoeptônico, D-glicônico, glicurônico (por exemplo, D-glicurônico), glutâmico (por exemplo, L-glutâmico), a-oxoglutárico, glicólico, ácidos hipúricos, ácidos hidroálicos (por exemplo, bromídrico, clorídrico, iodídrico), isetiônico, láctico (por exemplo, (+)-L-láctico, (±)-DL-lático), lactobiônico, maleico, málico, (-)-L-málico, malônico, ácido (±)-DL- mandélico, metanossulfônico, naftaleno-2-sulfônico, naftaleno-1,5- dissulfônico, 1-hidroxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiônico, pirúvico, L- piroglutâmico, salicílico, 4-amino-salicílico, sebácico, esteárico, succínico, sulfúrico, tânico, (+)-L-tartárico, tiociânico, p- toluenossulfônico, ácidos undecilênico e valérico, bem como, aminoácidos acilados e resinas de troca catiônica.
[0057] Um grupo particular de sais consiste de sais formados a partir de ácido acético, clorídrico, iodídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, cítrico, láctico, succínico, maleico, málico, isetiônico, fumárico, benzenossulfônico, toluenossulfônico, sulfúrico, metanossulfônico (mesilato), etanossulfônico, naftalenossulfônico, valérico, propanoico, butanoico, malônico, glicurônico e lactobiônico. Um sal particular é o sal de cloridrato. Outro sal particular é o sal de acetato.
[0058] Se o composto é aniônico, ou apresentar um grupo funcional que pode ser aniônico (por exemplo, -COOH pode ser -COO-), em seguida, um sal pode ser formado com uma base orgânica ou inorgânica, gerando um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados incluem, mas não se limitam aos mesmos, íons de metais alcalinos, tais como Li+, Na+ e K+, cátions de metais alcalinoterrosos, tais como Ca2+ e Mg2+, e outros cátions tais como Al3+ ou Zn+. Exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, mas não se limitam aos mesmos, íon de amônio (isto é, NH4+) e íons de amônio substituídos (por exemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Exemplos de alguns íons de amônio substituídos adequados são aqueles derivados de: metilamina, etilamina, dietilamina, propilamina, diciclo-hexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina, e trometamina, bem como, aminoácidos, tais como lisina e arginina. Um exemplo de um íon de amônio quaternário comum é N(CH3)4+.
[0059] Quando os compostos de fórmula (I) contêm uma função amina, esses podem formar sais de amônio quaternário, por exemplo, por meio de reação com um agente de alquilação de acordo com métodos bem conhecidos por aqueles versados no estado da técnica. Tais compostos de amônio quaternário estão dentro do âmbito da fórmula (I).
[0060] Será avaliado que derivados modificados dos ligantes peptídicos conforme definidos neste relatório estão dentro do escopo da presente invenção. Exemplos de tais derivados modificados adequados incluem uma ou mais modificações selecionadas de: modificações de término N e/ou término C; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos com um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais (tais como, substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos polares com um ou mais aminoácidos isoestéricos ou isoeletrônicos; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos não polares com outros aminoácidos isoestéricos ou isoeletrônicos não naturais); adição de um grupo espaçador; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxidação com um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxidação; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos com uma alanina; substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos com um ou mais resíduos de D- aminoácidos; N-alquilação de uma ou mais ligações amida no ligante peptídico bicíclico; substituição de uma ou mais ligações peptídicas com uma ligação substituta; modificação do comprimento da estrutura de peptídeos; substituição do hidrogênio e do carbono alfa de um ou mais resíduos de aminoácidos com outro grupo químico; modificação de aminoácidos tais como cisteína, lisina, glutamato/aspartato e tirosina com amina adequada, tiol, ácido carboxílico e reagentes reativos com fenol a fim de funcionalizar esses aminoácidos, e introdução ou substituição de aminoácidos que introduzem reatividades ortogonais que são adequadas para funcionalização, por exemplo, grupo azida ou alquina que transportam aminoácidos que permitem a funcionalização com porções transportando alquina ou azida, respectivamente.
[0061] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação em posição 1 e/ou 9 do aminoácido. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram que essas posições, especialmente, onde tirosina está presente, são mais suscetíveis à degradação proteolítica.
[0062] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação de término N e/ou de término C. Em uma modalidade adicional, em que o derivado modificado compreende uma modificação de término N utilizando química reativa ao amino adequado, e/ou modificação de término C utilizando química reativa a carbóxi adequado. Em uma modalidade adicional, a modificação de término N ou de término C compreende adição de um grupo efetor, incluindo, mas não se limitam aos mesmos, um agente citotóxico, um radioquelante ou um cromóforo.
[0063] Em uma modalidade adicional, o derivado modificado compreende uma modificação de término N. Em uma modalidade adicional, a modificação de término N compreende um grupo acetila de término N, tal como 17-69-07-N004 descrito neste relatório. Nessa modalidade, o grupo cisteína de término N (o grupo referido aqui como Ci) é capeado com anidrido acético ou outros reagentes apropriados durante síntese de peptídeos que leva a uma molécula que é acetilada terminalmente em N. Essa modalidade proporciona a vantagem de remover um ponto de reconhecimento potencial para aminopeptidases e evita o potencial de degradação do peptídeo bicíclico.
[0064] Em uma modalidade alternativa, a modificação de término N compreende a adição de um grupo espaçador molecular que facilita a conjugação de grupos efetores e retenção de potência do peptídeo bicíclico a seu alvo, tal como um grupo Ala, G-Sar10-A ou bAla-Sar10A. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram que adição desses grupos ao peptídeo bicíclico 17-69-07 não altera potência para a proteína-alvo (Tabelas 11-12).
[0065] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação de término C. Em uma modalidade adicional, a modificação de término C compreende um grupo amida. Nessa modalidade, o grupo cisteína de término C (o grupo referido aqui, como Ciii) é sintetizado como uma amida durante síntese de peptídeos levando a uma molécula que é amidada terminalmente em C. Essa modalidade proporciona a vantagem de remoção de um ponto de reconhecimento potencial para carboxipeptidase e reduz o potencial de degradação proteolítica do peptídeo bicíclico.
[0066] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos com um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais. Nessa modalidade, aminoácidos não naturais podem ser selecionados apresentando cadeias laterais isoestéricas/isoeletrônicas que são reconhecidas por proteases degradativas ou apresentam qualquer efeito adverso sob potência-alvo.
[0067] Alternativamente, aminoácidos não naturais podem ser usados apresentando cadeias laterais de aminoácidos limitados, de tal modo que hidrólise proteolítica da ligação peptídica próxima é conformacional e estericamente impedida. Em particular, esses preocupam análogos de prolina, cadeias laterais volumosas, derivados de Cα-di-substituidos (por exemplo, ácido aminoisobutírico, Aib), e aminoácidos ciclo, um derivado simples que é ácido amino- ciclopropilcarboxilico.
[0068] Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido não natural é substituído na posição 4. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram que vários resíduos de aminoácidos não naturais são bem tolerados nessa posição (ver Tabela 8). Em uma modalidade adicional, os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes na posição 4, são selecionados de: 1-naftilalanina; 2- naftilalanina; ciclo-hexilglicina, fenilglicina; terc-butilglicina; 3,4- diclorofenilalanina; ciclo-hexilalanina; e homofenilalanina.
[0069] Em uma modalidade ainda adicional, os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes na posição 4, são selecionados de: 1-naftilalanina; 2-naftilalanina; e 3,4- diclorofenilalanina. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram que essas substituições intensificaram a afinidade comparada com a sequência de tipo selvagem não modificada (ver Tabela 8).
[0070] Em uma modalidade ainda adicional, os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes na posição 4, são selecionados de: 1-naftilalanina. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram que essa substituição proporcionou o nível maior de intensificação de afinidade (maior que 7 vezes) comparado com tipo selvagem (ver Tabela 8).
[0071] Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido não natural é introduzido na posição 9 e/ou 11. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram que vários resíduos de aminoácidos não naturais são bem tolerados nessas posições (ver, Tabela 9).
[0072] Em uma modalidade adicional, os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes nas posições 9, são selecionados de: 4-bromofenilalanina, pentafluorfenilalanina.
[0073] Em uma modalidade adicional, os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes nas posições 11, são selecionados de: terc-butilglicina.
[0074] Em uma modalidade ainda adicional, os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes na posição 9 são selecionados de: 4-bromofenilalanina. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram alteração do ponto de reconhecimento proteolítico Tyr 9 (ver Tabela 9).
[0075] Em uma modalidade ainda adicional, os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes na posição 11, são selecionados de: terc-butilglicina. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram acentuação de atividade e protege fortemente a estrutura vicinal de aminoácidos a partir de hidrólise proteolítica por meio de obstrução estérica (ver Tabela 9).
[0076] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende uma pluralidade das modificações acima mencionadas, tais como 2, 3, 4 ou 5 ou mais modificações. Em uma modalidade adicional, o derivado modificado compreende 2, 3, 4 ou 5, ou mais das seguintes modificações, tais como todas as 5 modificações seguintes: D-alanina na posição 1 e 5, uma 1-naftilalanina na posição 4, 4-bromofenilalanina na posição 9 e uma terc-butilglicina na posição 11. Dados são aqui apresentados, os quais mostram que essas substituições múltiplas (17- 69-07-N252; 17-69-07-N244 e 17-69-07-N255) são toleradas em relação à potência que é superior ao tipo selvagem (ver Tabelas 10-12). Em uma modalidade ainda adicional, o derivado modificado compreende as seguintes modificações: D-alanina na posição 1 e 5, uma 1-naftilalanina na posição 4 e uma terc-butilglicina na posição 11. Dados são apresentados neste relatório, os quais mostram que essa substituição múltipla (17-69-07-N239) é tolerada em relação à potência que é superior ao tipo selvagem (ver Tabela 11).
[0077] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador. Em uma modalidade adicional, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador à cisteína de término N (Ci) e/ou a cisteína de término C (Ciii).
[0078] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxidação com um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxidação. Em uma modalidade adicional, o derivado modificado compreende substituição de um resíduo de triptofano com um resíduo de naftilalanina ou alanina. Essa modalidade proporciona a vantagem de aperfeiçoar o perfil de estabilidade farmacêutica do ligante de peptídeo bicíclico resultante.
[0079] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos carregados com um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Em uma modalidade alternativa, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos com um ou mais resíduos de aminoácidos carregados. O equilíbrio correto de resíduos de aminoácidos carregados versus hidrofóbicos é uma característica importante dos ligantes de peptídeo bicíclico. Por exemplo, resíduos de aminoácidos hidrofóbicos influenciam o grau de ligação de proteína plasmática e, assim, a concentração da fração livre disponível no plasma, enquanto resíduos de aminoácidos carregados (em particular, arginina) podem influenciar a interação do peptídeo com as membranas de fosfolipídeos nas superfícies celulares. Os dois, em combinação podem influenciar meia-vida, volume de distribuição e exposição do fármaco de peptídeo, e podem ser adaptados de acordo com o ponto final clínico. Além disso, a combinação correta e número de resíduos de aminoácidos carregados versus hidrofóbicos podem reduzir irritação no sítio de injeção (se o fármaco de peptídeo foi administrado subcutaneamente).
[0080] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos com um ou mais resíduos de D-aminoácidos. Acredita-se que essa modalidade aumenta estabilidade proteolítica por meio de impedimento estérico e por uma propensão de D-aminoácidos estabilizar conformações de retorno β (Tugyi e outros (2005) PNAS, 102(2), 413-418).
[0081] Em uma modalidade adicional, o resíduo de aminoácido na posição 1 é substituído por um D-aminoácido, tal como D-alanina. Dados são apresentados neste relatório, os quais demonstram retenção de potência sem a degradação consequente (ver Tabela 6).
[0082] Em uma modalidade adicional, o resíduo de aminoácido na posição 5 é substituído por um D-aminoácido, tal como D-alanina ou D- arginina. Dados são apresentados neste relatório, os quais demonstram retenção de potência sem a degradação consequente (ver Tabela 7).
[0083] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende remoção de qualquer resíduo de aminoácido e substituição com alaninas. Essa modalidade proporciona a vantagem de remoção de sítio(s) potencial(is) de ataque proteolítico.
[0084] Deve-se observar que cada uma das modificações acima mencionadas serve para aperfeiçoar deliberadamente a potência ou estabilidade do peptídeo. Aperfeiçoamentos de potência adicionais baseados em modificações podem ser obtidos através dos seguintes mecanismos: - Incorporação de porções hidrofóbicas que exploram o efeito hidrofóbico e levam a reduzir taxas de dissociação (off rates), de tal modo que afinidades mais elevadas são alcançadas; - Incorporação de grupos carregados que exploram interações iônicas de longo alcance, levando às taxas mais rápidas e afinidades superiores (ver, por exemplo, Schreiber e outros, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); e - Incorporação de restrição adicional para o peptídeo, mediante, por exemplo, restringindo cadeias laterais de aminoácidos corretamente, de tal modo que perda na entropia é mínima sob ligação-alvo, restringindo os ângulos torsionais da cadeia principal, de tal modo que perda na entropia é mínima sob ligação-alvo e introdução de ciclizações adicionais na molécula, por razões idênticas. (Para revisões ver Gentilucci e outros, Curr. Pharmaceutical Design (2010), 16, 3185-203, e Nestor e outros, Curr. Medicinal Chem. (2009), 16, 4399-418).
[0085] A presente invenção inclui todos os compostos marcados por (rádio)isótopos farmaceuticamente aceitáveis da invenção, isto é, compostos de fórmula (I), em que um ou mais átomos são substituídos por átomos que apresentam o mesmo número atômico, mas uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa usualmente encontrado na natureza, e compostos de fórmula (I), em que grupos quelantes de metais são ligados (denominado "efetores") que são capazes de manter (radio)isótopos relevantes, e compostos de fórmula (I), em que certos grupos funcionais são covalentemente substituídos com (rádio)isótopos relevantes ou grupos funcionais marcados isotopicamente.
[0086] Exemplos de isótopos adequados para inclusão nos compostos da invenção compreendem isótopos de hidrogênio, tais como 2H (D) e 3H (T), carbono, tais como 11C, 13C e 14C, cloro, tal como 36Cl, flúor, tal como 18F, iodo, tais como 123I, 125l e 131l, nitrogênio, tal como 13N e 15N, oxigênio, tais como 15O, 17O e 18O, fósforo, tal como 32P, enxofre, tal como 35S, cobre, tal como 64Cu, gálio, tal como 67Ga ou 68Ga, ítrio, tal como 90Y e lutécio, tal como 177Lu, e bismuto, tal como 213Bi.
[0087] Certos compostos marcados isotopicamente de fórmula (I), por exemplo, aqueles que incorporam um isótopo radioativo são úteis em estudos de distribuição de tecidos em fármacos e/ou substrato, e avaliar clinicamente a presença e/ou ausência de MT1-MMP alvo em tecidos doentes, tais como tumores e em outro local. Os compostos de fórmula (I) podem adicionalmente apresentar propriedades valiosas de diagnóstico em que os compostos podem ser utilizados para detectar ou identificar a formação de um complexo entre um composto marcado e outras moléculas, peptídeos, proteínas, enzimas ou receptores. Os métodos de detecção ou identificação podem utilizar compostos que são marcados com agentes de marcação, tais como radioisótopos, enzimas, substâncias fluorescentes, substâncias luminosas (por exemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, aquorina e luciferase), etc. Os isótopos radioativos trítio, isto é, 3H(T), e carbono-14, isto é, 14C, são particularmente úteis para essa finalidade, em vista de sua facilidade de incorporação e meios prontos de detecção.
[0088] Substituição com isótopos mais pesados tal como deutério, isto é, 2H (D), pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento na meia-vida in vivo ou exigências de dosagem reduzida e, portanto, podem ser preferidos em algumas circunstâncias.
[0089] Substituição com isótopos emissores de pósitrons tais como 11C, 18F, 15O e 13N, pode ser útil em estudos de Topografia por Emissão de Pósitrons (TEP), Positron Emission Topography (PET) para examinar ocupação-alvo.
[0090] Incorporação de isótopos em grupos efetores quelantes metálicos, tais como 64Cu, 67Ga, 68Ga, e 177Lu pode ser útil para visualização de antígenos específicos a tumores empregando PET ou imagem SPECT. Em particular, tais dados de biodistribuição são apresentados neste relatório no Exemplo 3.
[0091] Incorporação de isótopos em grupos efetores quelantes metálicos, tais como, mas não se limitam aos mesmos 90Y, 177Lu, e 213Bi, pode apresentar a opção de radioterapia direcionada, por meio do que compostos que suportam quelante metálico de fórmula (I) carregam o radionuclídeo terapêutico no sentido da proteína-alvo e sítio de ação.
[0092] Os compostos marcados isotopicamente de fórmula (I) podem geralmente ser preparados por meio de técnicas convencionais conhecidas daqueles versados no estado da técnica ou por processos análogos àqueles descritos nos Exemplos anexos, utilizando um reagente isotopicamente marcado apropriado em lugar do reagente não marcado previamente empregado.
[0093] Especificidade, no contexto neste relatório, refere-se à capacidade de um ligante ligar ou de outra forma interagir com seu alvo cognato para a exclusão de entidades que são similares ao alvo. Por exemplo, especificidade pode referir-se à capacidade de um ligante inibir a interação de uma enzima humana, mas não uma enzima homóloga de uma espécie diferente. Utilizando a abordagem aqui descrita, especificidade pode ser modulada, esta é aumentada ou diminuída, de modo a tornar os ligantes mais ou menos capazes de interagir com homólogos ou paralogos do alvo pretendido. Especificidade não se destina a ser sinônimo com atividade, afinidade ou avidez, e a potência da ação de um ligante em seu alvo (tal como, por exemplo, afinidade de ligação ou nível de inibição) não está necessariamente relacionada com sua especificidade.
[0094] Atividade de ligação, conforme utilizado neste relatório refere-se às medições quantitativas de ligação tomadas a partir de ensaios de ligação, por exemplo, como descritos neste relatório. Portanto, atividade de ligação refere-se à quantidade de ligante peptídico que se liga a uma dada concentração-alvo.
[0095] Multiespecificidade é a capacidade de se ligar a dois ou mais alvos. Tipicamente, os peptídeos de ligação são capazes de se ligar a um único alvo, tal como um epítopo no caso de um anticorpo, devido às suas propriedades conformacionais. Entretanto, peptídeos podem ser desenvolvidos, os quais podem se ligar a dois ou mais alvos; anticorpos duplos específicos, por exemplo, como é conhecido no estado da técnica como referido acima. Na presente invenção, os ligantes peptídicos podem ser capazes de se ligar a dois ou mais alvos e são, portanto, multiespecíficos. Adequadamente, estes se ligam a dois alvos, e são duplos específicos. A ligação pode ser independente, o que significa que os sítios de ligação para os alvos no peptídeo não são estruturalmente impedidos pela ligação de um ou outro dos alvos. Neste caso, ambos os alvos podem ser ligados de forma independente. Mais geralmente, espera-se que a ligação de um alvo impedirá, pelo menos parcialmente a ligação do outro.
[0096] Há uma diferença fundamental entre um ligante duplo específico e um ligante com especificidade que abrange dois alvos correlatos. No primeiro caso, o ligante é específico para ambos os alvos individualmente, e interage com cada um de uma maneira específica. Por exemplo, um primeiro laçoem que o ligante pode ligar-se a um primeiro alvo, e um segundo laçopara um segundo alvo. No segundo caso, o ligante não é específico porque não faz distinção entre os dois alvos, por exemplo, interagindo com um epítopo dos alvos que é comum a ambos.
[0097] No contexto da presente invenção, é possível que um ligante que apresenta atividade em relação a, por exemplo, um alvo e um ortólogo, pode ser um ligante biespecífico. Contudo, em uma modalidade, o ligante não é biespecífico, mas apresenta uma especificidade menos precisa de tal modo que se liga tanto o alvo quanto um ou mais ortólogos. Em geral, um ligante que não foi selecionado contra tanto um alvo quanto seu ortólogo é menos provável de ser biespecífico, devido à ausência de pressão seletiva no sentido de biespecificidade. O comprimento do laçono peptídeo bicíclico pode ser decisivo em proporcionar uma superfície de ligação adaptada de tal modo que se possa obter boa reatividade cruzada do alvo e ortólogo, enquanto se mantém alta seletividade no sentido de homólogo menos relacionado.
[0098] Se os ligantes são verdadeiramente biespecíficos, em uma modalidade, pelo menos uma das especificidades-alvo dos ligantes será comum entre os ligantes selecionados, e o nível dessa especificidade pode ser modulado pelos métodos descritos neste relatório. Segunda ou especificidades adicionais não necessitam de ser partilhadas, e não necessitam de ser o assunto dos procedimentos apresentados neste relatório.
[0099] Um alvo é uma molécula ou parte da mesma, aos quais os ligantes de peptídeos se ligam ou de outra forma interagem-se. Embora ligação seja vista como um pré-requisito para atividade da maioria de tipos, e pode ser ela própria uma atividade, outras atividades são consideradas. Desse modo, a presente invenção não requer a medição de ligação direta ou indiretamente.
[00100] O arcabouço (scaffold) molecular é qualquer molécula que é capaz de ligar o peptídeo em vários pontos para transmitir uma ou mais características estruturais ao peptídeo. Preferencialmente, o arcabouço molecular compreende pelo menos três pontos de fixação para o peptídeo, referidos como grupos reativos de arcabouço. Esses grupos são capazes de reagir com os resíduos de cisteína (Ci, Cii e Ciii) no peptídeo para formar uma ligação covalente. Estes não meramente formam uma ligação dissulfeto, os quais são submetidos à clivagem redutora e desintegração concomitante da molécula, mas formam ligações tioéteres estáveis, covalentes. Estruturas preferidas para arcabouços moleculares são descritas abaixo.
[00101] Arcabouços (scaffolds) moleculares são descritos em, por exemplo, WO 2009/098450 e referências citadas aqui, particularmente, WO 2004/077062 e WO 2006/078161.
[00102] Conforme observado nos documentos precedentes, o arcabouço molecular pode ser uma molécula pequena, tal como uma molécula orgânica pequena.
[00103] Em uma modalidade, o arcabouço molecular pode ser, ou pode ser baseado em monômeros naturais, tais como nucleosídeos, açúcares ou oideesteroides. Por exemplo, a estrutura molecular pode compreender um polímero curto de tais entidades, tal como um dímero ou um trímero.
[00104] Em uma modalidade, o arcabouço molecular é um composto de toxicidade conhecida, por exemplo, de baixa toxicidade. Exemplos de compostos adequados incluem colesteróis, nucleotídeos, esteroides, ou fármacos existentes tal como tamazepam.
[00105] Em uma modalidade, o arcabouço molecular pode ser uma macromolécula. Em uma modalidade, a estrutura molecular é uma macromolécula composta de aminoácidos, nucleotídeos ou carboidratos.
[00106] Em uma modalidade, o arcabouço molecular compreende grupos reativos que são capazes de reagir com grupo(s) funcional (funcionais) do polipeptídio para formar ligações covalentes.
[00107] O arcabouço molecular pode compreender grupos químicos que formam a ligação com um peptídeo, tais como aminas, tióis, alcoóis, cetonas, aldeídos, nitrilas, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, azidas, anidridos, succinimidas, maleimidas, haletos de alquila e haletos de acila.
[00108] Em uma modalidade, o arcabouço molecular pode compreender ou pode consistir em tris(bromometil)benzeno, especialmente, 1,3,5-tris(bromometil)benzeno ("TBMB"), ou um derivado do mesmo.
[00109] Em uma modalidade, o arcabouço molecular é 2,4,6- tris(bromometil)mesitileno. Essa molécula é similar a 1,3,5- tris(bromometil)benzeno, mas contém três grupos metila adicionais ligados ao anel benzeno. Esta apresenta a vantagem de que os grupos metila adicionais podem formar contatos adicionais com o polipeptídio e, portanto, adicionar restrição estrutural adicional.
[00110] O arcabouço molecular da invenção contém grupos químicos que permitem grupos funcionais do polipeptídio da biblioteca codificada da invenção formar ligações covalentes com o arcabouço molecular. Esses grupos químicos são selecionados a partir de uma ampla faixa de funcionalidades, incluindo, aminas, tióis, alcoóis, cetonas, aldeídos, nitrilas, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, anidridos, succinimidas, maleimidas, azidas, haletos de alquila e haletos de acila.
[00111] Grupos reativos de arcabouço que podem ser utilizados no arcabouço molecular para reagir com grupos tióis de cisteínas são haletos de alquila (ou também denominados halogenoalcanos ou haloalcanos).
[00112] Exemplos incluem bromometilbenzeno (o grupo reativo de arcabouço exemplificado por TBMB) ou iodoacetamida. Outros grupos reativos de arcabouço que são utilizados para seletivamente acoplar compostos com cisteínas em proteínas são maleimidas. Exemplos de maleimidas que podem ser utilizadas como arcabouços moleculares na invenção incluem: tris-(2-maleimidoetil)amina, tris-(2- maleimidoetil)benzeno, tris-(maleimido)benzeno. Selenocisteína é também um aminoácido natural que apresenta uma reatividade similar à cisteína e pode ser utilizada para as mesmas reações. Desse modo, sempre que a cisteína é mencionada, é tipicamente aceitável substituir selenocisteína, a menos que o contexto sugere de outro modo.
[00113] De acordo com um aspecto adicional da invenção, proporciona-se um conjugado de fármaco que compreende um ligante peptídico conforme definido neste relatório, conjugado com um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
[00114] Grupos efetores e/ou funcionais podem ser ligados, por exemplo, aos términos N e/ou C do polipeptídio, a um aminoácido no polipeptídio, ou ao arcabouço molecular.
[00115] Grupos efetores adequados incluem anticorpos e partes ou fragmentos dos mesmos. Por exemplo, um grupo efetor pode incluir uma região constante de cadeia leve (CL) do anticorpo, um domínio de cadeia pesada do anticorpo CH1, um domínio de cadeia pesada do anticorpo CH2, um domínio de cadeia pesada do anticorpo CH3, ou qualquer combinação dos mesmos, além de um ou mais domínios da região constante. Um grupo efetor pode também compreender uma região de articulação de um anticorpo (tal região normalmente sendo encontrada entre os domínios CH1 e CH2 de uma molécula de IgG).
[00116] Em uma modalidade adicional desse aspecto da invenção, um grupo efetor de acordo com a presente invenção é uma região Fc de uma molécula de IgG. Vantajosamente, um grupo efetor de ligante peptídico de acordo com a presente invenção compreende ou consiste de uma fusão Fc de ligante peptídico apresentando uma meia-vida tβ de um dia ou mais, dois dias ou mais, três dias ou mais, quatro dias ou mais, cinco dias ou mais, seis dias ou mais, ou sete dias ou mais. Mais vantajosamente, o ligante peptídico de acordo com a presente invenção compreende ou consiste de uma fusão Fc de ligante peptídico apresentando uma meia-vida tβ de um dia ou mais.
[00117] Grupos funcionais incluem, em geral, grupos de ligação, fármacos, grupos reativos para a ligação de outras entidades, grupos funcionais que ajudam captação dos peptídeos macrocíclicos nas células, e similares.
[00118] A capacidade de peptídeos penetrarem em células permitirá que os peptídeos contra os alvos intracelulares sejam eficazes. Alvos que podem ser acessados por peptídeos com a capacidade de penetrar em células incluem fatores de transcrição, moléculas de sinalização intracelular, tais como tirosino-quinases e moléculas envolvidas na via apoptótica. Grupos funcionais que permitem a penetração de células incluem peptídeos ou grupos químicos que foram adicionados ao peptídeo ou ao arcabouço molecular. Peptídeos, tais como aqueles derivados de: tais como VP22, HIV-Tat, uma proteína homeobox de Drosophila (Antennapedia), por exemplo, como descrito em Chen e Harrison, Biochemical Society Transactions (2007), Volume 35, parte 4, p.821; Gupta e outros; em Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57, 9637. Exemplos de peptídeos curtos que foram mostrados ser eficientes na translocação através das membranas do plasma incluem o peptídeo penetratina de aminoácido 16 de proteína de Drosophila (Antennapedia) (Derossi e outros (1994) J. Biol. Chem. Volume 269, p.10444), o 'peptídeo modelo anfipático'de aminoácido 18 (Oehlke e outros (1998) Biochim. Biophys. Acts volume 1414, p.127) e regiões ricas em arginina da proteína TAT de HIV. Abordagens não peptídicas incluem o uso de imitações de pequenas moléculas ou SMOCs que podem ser facilmente ligados a biomoléculas (Okuyama e outros (2007) Nature Methods Volume 4, p.153). Outras estratégias químicas para adicionar grupos guanidínio a moléculas também acentuam penetração celular (Elson-Scwab e outros (2007) J. Biol. Chem. Volume 282, p. 13585). Moléculas de peso molecular pequeno, tais como esteroides podem ser adicionados ao arcabouço molecular para acentuar captação nas células.
[00119] Uma classe de grupos funcionais que pode ser ligada com ligantes peptídicos inclui anticorpos e fragmentos de ligação dos mesmos, tais como Fab, Fv ou fragmentos de domínio único. Em particular, anticorpos que se ligam a proteínas capazes de aumentar à meia-vida do ligante peptídico in vivo podem ser utilizados.
[00120] Peptídeos RGD que se ligam a integrinas que estão presentes em muitas células podem também ser incorporados.
[00121] Em uma modalidade, um grupo efetor de ligante peptídico de acordo com a invenção apresenta uma meia-vida tβ selecionada do grupo que consiste de: 12 horas ou mais, 24 horas ou mais, 2 dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais, 7 dias ou mais, 8 dias ou mais, 9 dias ou mais, 10 dias ou mais, 11 dias ou mais, 12 dias ou mais, 13 dias ou mais, 14 dias ou mais, 15 dias ou mais ou 20 dias ou mais. Vantajosamente, um grupo efetor ligante de peptídeo ou composição de acordo com a invenção apresentará uma meia vida tβ na faixa de 12 a 60 horas. Em uma modalidade adicional, apresentará uma meia-vida tβ de um dia ou mais. Em uma modalidade ainda adicional, será na faixa de 12 a 26 horas.
[00122] Em uma modalidade particular da invenção, o grupo funcional é selecionado de um quelante metálico, o qual é adequado para a complexação de radioisótopos metálicos de relevância medicinal. Tais efetores, quando complexados com esses radioisótopos, podem apresentar agentes úteis para terapia de câncer. Exemplos adequados incluem DOTA, NOTA, EDTA, DTPA, HEHA, SarAr e outros (Targeted Radionuclide Therapy, Tod Speer, Wolters/Kluver Lippincott Williams & Wilkins, 2011).
[00123] Grupos efetores possíveis também incluem enzimas, por exemplo, tal como carboxipeptidase G2 para uso em terapia de enzima/profármaco, em que o ligante peptídico substitui anticorpos em ADEPT.
[00124] Em uma modalidade particular da invenção, o grupo funcional é selecionado de um fármaco, tal como um agente citotóxico para terapia de câncer. Exemplos adequados incluem: agentes de alquilação tais como cisplatina e carboplatina, bem como, oxaliplatina, mecloroetamina, ciclofosfamida, clorambucila, ifosfamida; antimetabólitos, incluindo, análogos de purina; análogos de azatioprina e mercaptopurina ou pirimidina; alcaloides vegetais e terpenoides, incluindo, alcaloides de vinca, tais como Vincristina, Vimblastina, Vinorelbina e Vindesina; Podofilotoxina e seus derivados de etoposídeo e teniposídeo; Taxanos, incluindo, paclitaxel, originalmente conhecido como Taxol; inibidores de topoisomerase, incluindo, camptotecinas: irinotecano e topotecano, e inibidores tipo II, incluindo, ansacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo e teniposídeo. Agentes adicionais podem incluir antibióticos antitumorais que incluem a dactinomicina imunossupressora (que é utilizada em transplantes renais), doxorrubicina, epirubicina, bleomicina, caliqueamicinas, e outros.
[00125] Em uma modalidade adicional particular da invenção, o agente citotóxico é selecionado de maitansinoides (tal como DM1) ou auristatinas monometila (tal como MMAE).
[00126] DM1 é um agente citotóxico que é um derivado contendo tiol de maitansina e apresenta a seguinte estrutura:
[00127] Auristatina monometila E (MMAE) é um agente antineoplásico sintético e apresenta a seguinte estrutura:
[00128] Dados são apresentados neste relatório nos Exemplos 4 e 5 que demonstram os efeitos de ligantes peptídicos conjugados com DM1 ou MMAE contendo toxinas.
[00129] Em uma modalidade, o agente citotóxico é ligado com o peptídeo bicíclico por meio de uma ligação de clivagem, tal como uma ligação dissulfeto ou uma ligação sensível a proteases. Em uma modalidade adicional, os grupos adjacentes para a ligação dissulfeto são modificados para controlar o impedimento da ligação dissulfeto, e por isso a taxa de clivagem e liberação concomitante de agente citotóxico.
[00130] Trabalho publicado estabeleceu o potencial de modificação a suscetibilidade da ligação dissulfeto para redução através da introdução de impedimento estérico em ambos os lados da ligação dissulfeto (Kellogg e outros (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). Um maior grau de impedimento estérico reduz a taxa de redução por meio de glutationa intracelular e também agentes redutores extracelulares (sistêmicos), reduzindo consequentemente a facilidade com que a toxina é liberada, tanto no interior quanto no exterior da célula. Desse modo, seleção do ótimo na estabilidade de dissulfeto na circulação (que minimiza efeitos colaterais indesejáveis da toxina) versus liberação eficiente no meio intracelular (que maximiza o efeito terapêutico) pode ser alcançada através da seleção cuidadosa do grau de impedimento de ambos os lados da ligação dissulfeto.
[00131] O impedimento de cada lado da ligação dissulfeto é modulado através de introdução de um ou mais grupos metila na entidade de direcionamento (aqui, o peptídeo bicíclico) ou lado da toxina do constructo molecular.
[00132] Desse modo, em uma modalidade, o agente citotóxico é um maitansinoide selecionado de um composto de fórmula (II):
em que n representa um número inteiro selecionado de 1 a 10; e R1 e R2 independentemente representam hidrogênio, C1-6 alquila ou um grupo carbociclila ou heterociclila.
[00133] O termo C1-6alquila conforme usado neste relatório refere-se a um grupo hidrocarboneto linear ou ramificado saturado contendo de 1 a 6 átomos de carbono, respectivamente. Exemplos de tais grupos incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, neopentila ou hexila e similares.
[00134] O termo "heterociclila" e "carbociclila" conforme utilizado neste relatório deve, a não ser que o contexto indique de outro modo, incluir tanto sistemas de anel aromático quanto não aromático. Desse modo, por exemplo, o termo "grupo heterociclila" e "grupo carbociclila" incluem dentro de seu escopo sistemas de anel carbociclila ou heterociclila aromático, não aromático, insaturado, parcialmente saturado e totalmente saturado. Em geral, a não ser que o contexto indique de outro modo, tais grupos podem ser monocíclicos ou bicíclicos (incluindo, grupos bicíclicos fundidos e em pontes) e podem conter, por exemplo, de 3 a 12 membros no anel, mais usualmente, de 5 a 10 membros no anel.
[00135] Em uma modalidade do composto de fórmula (II), R1 e R2, independentemente, representam hidrogênio ou metila.
[00136] Em uma modalidade do composto de fórmula (II), n representa 1 e R1 e R2 ambos representam hidrogênio (isto é, o derivado de maitansina DM1).
[00137] Em uma modalidade alternativa do composto de fórmula (II), n representa 2, R1 representa hidrogênio e R2 representa um grupo metila (isto é, o derivado de maitansina DM3).
[00138] Em uma modalidade do composto de fórmula (II), n representa 2 e R1 e R2 ambos representam grupos metila (isto é, o derivado de maitansina DM4).
[00139] Será avaliado que o agente citotóxico de fórmula (II) pode formar uma ligação dissulfeto, e em uma estrutura conjugada com um peptídeo bicíclico de fórmula (I), a conectividade de dissulfeto entre o peptídeo de tiol-toxina (II) e tiol-biciclo (III) é introduzida por meio de diversos esquemas sintéticos possíveis, dois sendo descritos no Esquema II ou Esquema III.
[00140] Em uma modalidade, o componente de peptídeo bicíclico do conjugado apresenta a estrutura mostrada na fórmula (III):
em que m representa um número inteiro selecionado de 0 a 10, e R3 e R4, independentemente, representam hidrogênio, C1-6 alquila ou um grupo carbociclila ou heterociclila.
[00141] Em uma modalidade do composto de fórmula (III), R3 e R4, independentemente, representam hidrogênio ou metila.
[00142] Compostos de fórmula (III), em que R3 e R4 são ambos hidrogênio são considerados não impedidos e compostos de fórmula (III) em que um ou todos de R3 e R4 representam, metila são considerados impedidos.
[00143] Será avaliado que o peptídeo bicíclico de fórmula (III) pode formar uma ligação dissulfeto, e em uma estrutura conjugada com um agente citotóxico de fórmula (II), a conectividade de dissulfeto entre o peptídeo de tiol-toxina (II) e tiol-biciclo (III) é introduzida por meio de diversos esquemas sintéticos possíveis, um sendo descrito no Esquema II.
[00144] Em uma modalidade, o agente citotóxico é ligado ao peptídeo bicíclico por meio de um ligante definido na fórmula (IV):
em que R1, R2, R3 e R4 representam hidrogênio, C1-6 alquila ou um grupo carbociclila ou heterociclila; Toxina refere-se a qualquer agente citotóxico adequado definido neste relatório; Biciclo representa qualquer peptídeo bicíclico adequado definido neste relatório; n representa um número inteiro selecionado de 1 a 10; e m representa um número inteiro selecionado de 0 a 10;
[00145] Em uma modalidade, R1, R2, R3 e R4 representam hidrogênio ou metila.
[00146] Quando R1, R2, R3 e R4 são, cada um, hidrogênio, a ligação dissulfeto é menos impedida e mais suscetível à redução. Quando R1, R2, R3 e R4 são, cada um, metila, a ligação dissulfeto é mais impedida e menos suscetível à redução. Substituições parciais de hidrogênio e metila produzem um aumento gradual na resistência à redução e clivagem concomitante e liberação de toxina.
[00147] Em uma modalidade, a toxina de composto (IV) é uma maitansina e o conjugado compreende um composto de fórmula (V):
em que R1, R2, R3 e R4 representam hidrogênio, C1-6 alquila ou um grupo carbociclila ou heterociclila; Biciclo representa qualquer peptídeo bicíclico adequado conforme definido neste relatório; n representa um número inteiro selecionado de 1 a 10; e m representa um número inteiro selecionado de 0 a 10.
[00148] Em uma modalidade adicional do composto de fórmula (V), n representa 1 e R1, R2, R3 e R4 cada um, representa hidrogênio, isto é, um composto de fórmula (V)a:
[00149] O BDC de fórmula (V)aé conhecido como BT17BDC-17. O dissulfeto não impedido no BDC BT17BDC-17 é o equivalente de BT17BDC-9, por meio do qual a diferença reside na porção de peptídeo bicíclico: BT17BDC-9 emprega a sequência não estabilizada (17-69-07- N219), enquanto BT17BDC-17 emprega a contraparte de peptídeo bicíclico estabilizado (17-69-07-N241) que é ligada a amida ao constructo de dissulfeto toxina. Este derivado da maitansina não impedida com n = 1 é denominado DM1.
[00150] Em uma modalidade adicional do composto de fórmula (V), n representa 1, R1 representa metila e R2, R3 e R4 cada um representa hidrogênio, isto é, um composto de fórmula (V)b:
(V)b
[00151] O BDC de fórmula (V)bé conhecido como BT17BDC-18 e contém um único grupo metila de impedimento no lado do peptídeo bicíclico, e no contexto de conjugado de fármaco de anticorpos produz uma redução de 7 vezes em sua sensibilidade a um agente redutor, tal como ditiotreitol (comparado com o dissulfeto não impedido) (Kellogg e outros (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). A sensibilidade reduzida para redução está correlacionada com um taxa inferior de liberação de toxina. Esse derivado da maitansina não impedida com n = 1 é denominado DM1. BT17BDC-18 emprega a contraparte de peptídeo bicíclico estabilizado (17-69-07-N241) que é ligada a amida com o constructo de dissulfeto toxina.
[00152] Em uma modalidade adicional do composto de fórmula (V), n representa 2, R1 e R2 ambos representam hidrogênio e R3 e R4 ambos representam metila, isto é, um composto de fórmula (V)c: (V)c
[00153] O BDC de fórmula (V)cé conhecido como BT17BDC-19 e contém dois grupos metila de impedimento no lado da maitansina, e no contexto de conjugado de fármaco de anticorpos produz uma redução de 14 vezes em sua sensibilidade a um agente redutor, tal como ditiotreitol. A sensibilidade reduzida para redução está correlacionada com uma taxa inferior de liberação de toxina. Esse derivado de maitansina impedida com n = 2 é denominado DM4. BT17BDC-19 emprega a contraparte de peptídeo bicíclico estabilizado (17-69-07- N241) que é ligada a amida com o constructo de dissulfeto toxina.
[00154] Em uma modalidade adicional do composto de fórmula (V), n representa 2, R1 e R3 ambos representam metila e R2 e R4 ambos representam hidrogênio, isto é, um composto de fórmula (V)d:
[00155] O BDC de fórmula (V)dé conhecido como BT17BDC-20 e contém um grupo metila de impedimento no lado da maitansina, e um grupo metila de impedimento no lado do peptídeo bicíclico, e no contexto de conjugado de fármaco de anticorpos produz uma redução de 170 vezes em sua sensibilidade a um agente redutor, tal como ditiotreitol. A sensibilidade reduzida para redução está correlacionada com uma taxa inferior de liberação de toxina. Esse derivado da maitansina impedida com n = 2 é denominado DM3. BT17BDC-20 emprega a contraparte do peptídeo bicíclico estabilizado (17-69-07- N241) que é ligada a amida com o constructo de dissulfeto toxina.
[00156] De fato, no contexto de conjugados de fármaco de anticorpos, o equilíbrio de eficácia versus tolerabilidade no modelo animal mostraram que seu máximo é associado a algum nível de impedimento, isto é, aquele de DM4 (Kellogg e outros (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717) que está presente, como tal, também em BT17BDC-19.
[00157] Em uma modalidade, o conjugado é selecionado de BT17BDC-9, BT17BDC-17 (Composto de fórmula (V)a), BT17BDC-18 (Composto de fórmula (V)b), BT17BDC-19 (Composto de fórmula (V)c) e BT17BDC-20 (Composto de fórmula Vd). Dados são apresentados no Exemplo 5 e nas Tabelas 16 e 17, os quais demonstram as propriedades benéficas de BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 e BT17BDC-20.
[00158] Em uma modalidade adicional, o conjugado é selecionado de BT17BDC-9, BT17BDC-17 (Composto de fórmula (V)a), BT17BDC- 18 (Composto de fórmula (V)b) e BT17BDC-19 (Composto de fórmula (V)c). Dados são apresentados no Exemplo 5 e nas Tabelas 16 e 17, os quais demonstram que esses conjugados foram considerados moléculas adequadas para uso na terapia direcionada a câncer.
[00159] Em uma modalidade adicional, o conjugado é selecionado de BT17BDC-17 (Composto de fórmula (V)a), BT17BDC-18 (Composto de fórmula (V)b) e BT17BDC-19 (Composto de fórmula (V)c). Dados são apresentados no Exemplo 5 e nas Tabelas 16 e 17, os quais demonstram que esses conjugados são considerados moléculas adequadas para uso na terapia direcionada a câncer e são bem tolerados sob doses eficazes.
[00160] Os peptídeos da presente invenção podem ser produzidos sinteticamente por meio de técnicas convencionais seguido por reação com um arcabouço molecular in vitro. Quando isso é realizado pode-se utilizar química-padrão. Isso permite a preparação rápida em grande escala de material solúvel para experimentos ou validação a jusante, adicionais. Tais métodos poderiam ser realizados utilizando química convencional, tal como aquela descrita em Timmerman e outros (supra).
[00161] Desse modo, a invenção também se refere à produção de polipeptídios ou conjugados selecionados como descritos neste relatório, em que a produção compreende etapas opcionais adicionais conforme explicadas abaixo. Em uma modalidade, essas etapas são realizadas no produto final de polipeptídio/conjugado produzido por meio de síntese de química.
[00162] Opcionalmente, resíduos de aminoácidos no polipeptídio de interesse podem ser substituídos quando se produz um conjugado ou complexo.
[00163] Peptídeos podem também ser prolongados, para incorporar, por exemplo, outro laçoe, portanto, introduzir especificidades múltiplas.
[00164] Para prolongar o peptídeo, este pode ser simplesmente estendido quimicamente no término N ou término C ou nos laçosusando lisinas ortogonalmente protegidas (e análogos) utilizando química- padrão de fase sólida ou fase solução. Técnicas de (bio) conjugação padrão podem ser utilizadas para introduzir um término N ou término C ativado ou ativáveis. Alternativamente, adições podem ser feitas por meio de condensação de fragmentos ou ligação química nativa, por exemplo, como descrito em (Dawson e outros 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation(Síntese de Proteínas por Ligação Química Nativa), Science, 266:776-779), ou por enzimas, por exemplo, utilizando subtiligase como descrito em (Chang e outros Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 20 de dezembro de 1994; 91(26):12544-8 ou em Hikari e outros, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Edição 22, 15 de novembro de 2008, páginas 6.000-6.003).
[00165] Alternativamente, os peptídeos podem ser prolongados ou modificados por meio de conjugação adicional através de ligações dissulfetos. Isso tem a vantagem adicional de permitir que o primeiro e segundo peptídeos dissociam-se uns com os outros uma vez dentro do ambiente redutor da célula. Nesse caso, o arcabouço molecular (por exemplo, TBMB) pode ser adicionado durante a síntese química do primeiro peptídeo de modo a reagir com os três grupos de cisteína; uma cisteína ou tiol adicional pode então ser anexado ao término N ou C do primeiro peptídeo, de modo que essa cisteína ou tiol apenas reagisse com uma cisteína ou tiol livre do segundo peptídeo, formando um conjugado de peptídeo-peptídeo bicíclico ligado a dissulfeto.
[00166] Técnicas similares aplicam-se igualmente para a síntese/acoplamento de dois macrociclos bicíclicos e biespecíficos, potencialmente, criando uma molécula tetraespecífica.
[00167] Além disso, adição de outros grupos funcionais ou grupos efetores pode ser realizada da mesma maneira, utilizando química apropriada, acoplamento no término N ou término C, ou via cadeias laterais. Em uma modalidade, o acoplamento é conduzido de tal modo que não bloqueia a atividade de cada identidade.
[00168] De acordo com um aspecto adicional da invenção é proporcionado um processo para preparação de um conjugado de fármaco, conforme definido neste relatório, o qual compreende a via sintética que é descrita em qualquer um dos Esquemas I, II ou III.
[00169] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica que compreende um ligante de peptídeo ou um conjugado de fármaco conforme definido neste relatório em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00170] Geralmente, os ligantes peptídicos presentes serão utilizados em forma purificada juntamente com excipientes ou veículos farmacologicamente apropriados. Tipicamente, esses excipientes ou veículos incluem soluções aquosas ou alcoólico/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo, meios salinos e/ou tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e lactato de Ringer. Adjuvantes aceitáveis fisiologicamente adequados, se necessários, para manter um complexo de polipeptídio em suspensão, podem ser escolhidos a partir de espessantes, tais como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos.
[00171] Veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes e reabastecedores de eletrólitos, tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer. Conservantes e outros aditivos, tais como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes, podem também estar presentes (Mack (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16aEdição).
[00172] Os ligantes peptídicos da presente invenção podem ser utilizados como composições administradas separadamente ou em conjunto com outros agentes. Esses podem incluir anticorpos, fragmentos de anticorpos e vários fármacos imunoterapêuticos, tais como ciclosporina, metotrexato, adriamicina ou cisplatina e imunotoxinas. Composições farmacêuticas podem incluir "coquetéis"de vários agentes citotóxicos ou outros, em conjunto com os ligantes de proteína da presente invenção, ou mesmo combinações de polipeptídios selecionados de acordo com a presente invenção apresentando diferentes especificidades, tais como polipeptídios selecionados utilizando diferentes ligantes-alvo, quer ou não sejam reunidos antes de administração.
[00173] A via de administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser qualquer uma dessas comumente conhecidas daqueles versados no estado da técnica. Para terapia, incluindo, sem limitação, imunoterapia, os ligantes peptídicos da invenção podem ser administrados a qualquer paciente de acordo com técnicas-padrão. A administração pode ser por qualquer modo apropriado, incluindo, via parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, pulmonar, ou também, apropriadamente, por infusão direta com um cateter. A dosagem e frequência de administração dependerão da idade, sexo e estado do paciente, administração concorrente de outros fármacos, contraindicações e outros parâmetros que devem ser levados em conta pelo clínico.
[00174] Os ligantes peptídicos desta invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes de utilização. Essa técnica mostrou ser eficaz e técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas no estado da técnica podem ser empregadas. Será avaliado por aqueles versados no estado da técnica que liofilização e reconstituição podem levar a graus variáveis de perda de atividade e que níveis podem ser ajustados ascendentemente para compensar.
[00175] As composições contendo os ligantes peptídicos presentes ou um coquetel dos mesmos podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em certas aplicações terapêuticas, uma quantidade adequada para realizar pelo menos inibição parcial, supressão, modulação, morte, ou algum outro parâmetro mensurável, de uma população de células selecionadas é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". Quantidades necessárias para atingir essa dosagem dependerão da gravidade da doença e do estado geral do próprio sistema imune do paciente, mas geralmente variam de 0,005 e 5,0 mg de ligante peptídico selecionado por quilograma de peso corporal, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose, sendo mais comumente utilizadas. Para aplicações profiláticas, composições contendo os presentes ligantes peptídicos ou coquetéis dos mesmos, podem também ser administradas em dosagens similares ou ligeiramente inferiores.
[00176] Uma composição contendo um ligante peptídico de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em condições profiláticas e terapêuticas para auxiliar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de células-alvo selecionadas em um mamífero. Além disso, os ligantes peptídicos descritos neste relatório podem ser utilizados extracorporeamente ou in vitro seletivamente para matar, depauperar ou de outra maneira remover eficazmente uma população de células-alvo a partir de uma coleção heterogênea de células. Sangue de um mamífero pode ser combinado extracorporeamente com os ligantes peptídicos selecionados, por meio dos quais as células indesejáveis são mortas ou de outra forma removidas do sangue para retornar ao mamífero, de acordo com técnicas convencionais.
[00177] Os peptídeos bicíclicos da invenção apresentam utilidade específica como ligantes de alta afinidade de membrana tipo metaloprotease (MT1-MMP, também conhecida como MMP14). MT1- MMP é uma metaloprotease transmembrana que desempenha um papel importante na remodelação da matriz extracelular, diretamente através de degradação de diversos de seus componentes e indiretamente através da ativação pró-MPM-2. MT1-MMP é crucial para angiogênese de tumor (Sounni e outros (2002) FASEB J. 16(6), 555 564) e é superexpresso em uma variedade de tumores sólidos, portanto, os peptídeos bicíclicos de ligação a MT1-MMP da presente invenção apresentam utilidade particular no tratamento direcionado a câncer, em particular, tumores sólidos tais como carcinomas do pulmão de células não pequenas. Em uma modalidade, o peptídeo bicíclico da invenção é específico a MT1-MMP humana. Em uma modalidade adicional, o peptídeo bicíclico da invenção é específico a MT1-MMP de camundongo. Em uma modalidade ainda adicional, o peptídeo bicíclico da invenção é específico a MT1-MMP de humano e camundongo. Em uma modalidade ainda adicional, o peptídeo bicíclico da invenção é específico a MT1-MMP humano, camundongo e cão.
[00178] Ligantes de polipeptídios selecionados de acordo com o método da presente invenção podem ser empregados em aplicações terapêuticas e profiláticas in vivo, aplicações de diagnóstico in vitro e in vivo, aplicações de ensaio in vitro e reagentes, e similares. Ligantes que apresentam níveis selecionados de especificidade são úteis em aplicações que envolvem testes em animais não humanos, em que a reatividade cruzada é desejável, ou em aplicações de diagnóstico, em que reatividade cruzada com homólogos ou parálogos necessita de ser cuidadosamente controlada. Em algumas aplicações, tais como aplicações de vacina, a capacidade de induzir uma resposta imune a faixas predeterminadas de antígenos pode ser explorada para adaptar uma vacina para doenças e agentes patogênicos específicos.
[00179] Ligantes peptídicos substancialmente puros de pelo menos 90 a 95% de homogeneidade são preferidos para administração a um mamífero, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são mais preferidos para utilizações farmacêuticas, especialmente, quando o mamífero é um humano. Uma vez purificado, parcialmente ou até homogeneidade como desejada, os polipeptídios selecionados podem ser utilizados diagnostica ou terapeuticamente (incluindo, extracorporeamente) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaio, colorações imunofluorescentes e similares (Lefkovite e Pernis, (1979 e 1981) Métodos Imunológicos, Volumes I e II, Academic Press, NI).
[00180] Os grupos efetores e conjugados dos ligantes peptídicos da presente invenção encontrarão tipicamente uso na prevenção, supressão ou tratamento de câncer, em particular, tumores sólidos, tais como carcinomas do pulmão de células não pequenas.
[00181] Desse modo, de acordo com um aspecto adicional da invenção, proporcionam-se grupos efetores e conjugados de fármacos do ligante peptídico conforme definido neste relatório para utilização na prevenção, supressão ou tratamento de câncer, em particular, tumores sólidos tais como carcinomas pulmonares de células não pequenas.
[00182] De acordo com um aspecto adicional da invenção é proporcionado um método de prevenção, supressão ou tratamento de câncer, em particular, tumores sólidos tais como carcinomas do pulmão de células não pequenas que compreende administração a um paciente com necessidade do mesmo, um grupo efetor e conjugado de fármaco do ligante peptídico, conforme definido neste relatório.
[00183] Exemplos de cânceres (e suas contrapartes benignas) que podem ser tratadas (ou inibidas) incluem, mas não se limitam aos mesmos, tumores de origem epitelial (adenomas e carcinomas de vários tipos, incluindo, adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas de células de transição e outros carcinomas), tais como carcinomas da bexiga e do trato urinário, mama, trato gastrintestinal (incluindo, o esôfago, estômago (gástrico), intestino delgado, cólon, reto e ânus), fígado (carcinoma hepatocelular), vesícula biliar e sistema biliar, pâncreas exócrino, rim, pulmão (por exemplo, adenocarcinomas, carcinomas pulmonares de células pequenas, carcinomas pulmonar de células não pequenas, carcinomas bronquioalveolares e mesoteliomas), cabeça e pescoço (por exemplo, cânceres da língua, cavidade bucal, laringe, faringe, nasofaringe, amígdalas, glândulas salivares, cavidade nasal e seios paranasais), ovário, trompas de falópio, peritônio, vagina, vulva, pênis, colo do útero, miométrio, endométrio, tiroide (por exemplo, carcinoma da tiroide folicular), adrenal, próstata, pele e anexial (por exemplo, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas, queratoacantoma, nevo displásico); malignidades hematológicas (isto é, leucemias, linfomas) e distúrbios hematológicos pré-malignos e distúrbios de malignidade limítrofe, incluindo, malignidades hematológicas e condições correlatas de linhagem linfoide (por exemplo, leucemia linfocítica aguda [LLA], leucemia linfocítica crônica [LLC], linfomas de células B tais como linfoma de células B difuso grande [LCBDG], linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células do manto, linfomas de células T e leucemias, linfomas de células assassinas naturais [NK], linfomas de Hodgkin, leucemia de células pilosas, gamopatia monoclonal de significado incerto, plasmacitoma, mieloma múltiplo, e transtornos linfoproliferativos pós-transplante), e doenças malignas hematológicas e condições relacionadas de linhagem mieloide (por exemplo, mielogenoleucemia aguda [ALL], mielogenoleucemia crônica [CLL], mielomonociticleucemia crônica [DLBCL], síndrome hipereosinofilia, transtornos mieloproliferativos, tais como policitemia vera, trombocitemia essencial e mielofibrose primária, síndrome mieloproliferativa, síndrome mielodisplásica, e promielociticleucemia); tumores de origem mesenquimatosa, por exemplo, sarcomas de tecidos moles, osso ou cartilagem, tais como osteossarcoma, fibrossarcomas, condrossarcomas, rabdomiossarcomas, leiomiossarcoma, lipossarcoma, angiossarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, sarcoma sinovial, sarcomas epitelioides, tumores gastrintestinais estromais, histiocitomas benignas e malignas, e dermatofibrossarcoma protuberante; tumores do sistema nervoso central ou periférico (por exemplo, astrocitomas, gliomas e glioblastomas, meningiomas, ependimomas, tumores pineais e schwannomas); tumores endócrinos (por exemplo, tumores da pituitária, tumores supra-renais, tumores de células das ilhotas pancreáticas, tumores da paratiroide, tumores carcinoides e carcinoma medular da tiroide); tumores oculares e anexiais (por exemplo, retinoblastoma); tumores de células germinativas e trofoblásticos (por exemplo, teratomas, seminomas, disgerminomas, molas hidatiforme e coriocarcinomas); e tumores pediátricos e embrionários (por exemplo, meduloblastoma, neuroblastoma, tumor de Wilms, e tumores neuroectodérmicos primitivos); ou síndromes, congênitas ou de outro modo, os quais deixa o paciente suscetível a malignidade (por exemplo, xerodermia pigmentosa).
[00184] Referências neste relatório ao termo "prevenção"envolve administração da composição protetora antes da indução da doença. "Supressão"refere-se à administração da composição após um evento indutor, mas antes do aspecto clínico da doença. "Tratamento" envolve administração da composição protetora após sintomas da doença se manifestar.
[00185] Sistemas de modelo animal que podem ser utilizados para rastrear a eficácia dos ligantes peptídicos na proteção contra ou tratamento da doença são disponíveis. O uso de sistemas de modelos animais é facilitado pela presente invenção, o que permite o desenvolvimento de ligantes de polipeptídio, que podem reagir de forma cruzada com alvos humanos e animais, para permitir a utilização de modelos animais.
[00186] A invenção é adicionalmente descrita abaixo com referência aos seguintes exemplos.
[00187] Bibliotecas de fago bicíclico 6x6 foram geradas conforme descritas em Heinis e outros (2009), Nat. Chem. Biol. 5(7), 502-507, WO 2009/098450, WO 2013/050615 e WO 2013/050616. Seleções de exibição de fagos foram realizadas utilizando essa biblioteca de fagos 6x6 contra o domínio hemopexina de MT1-MMP humano biotinilado.
[00188] Repetições tal como hemopexina de MT1-MMP (também conhecida como o domínio hemopexina de MT1-MMP), resíduos Cys319-Gly511 do gene humano, foram expressas transitoriamente em células HEK293 como proteína solúvel secretada com cauda His6 terminalmente em N, utilizando o vetor de expressão pEXPR-IBA42 (IBA). Após expressão, a proteína foi purificada por meio de cromatografia de afinidade de níquel-NTA, seguido por filtração em gel, e pureza foi verificada por SDS-PAGE. Variabilidade de lote para lote também foi monitorada por meio de experimentos de deslocamento térmico de fluorescência na presença/ausência de um biciclo de ligação de domínio da hemopexina.
[00189] A síntese de peptídeos foi baseado em química de Fmoc, utilizando um sintetizador de peptídeos Symphony fabricado por Peptide Instruments e um sintetizador Syro II por MultiSynTech. Aminoácidos Fmoc padrão foram empregados (Sigma, Merck), com os seguintes grupos protetores de cadeia lateral: Arg(Pbf); Asn(Trt); Asp(OtBu); Cys(Trt); Glu(OtBu); Gln(Trt); His(Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu); Trp(Boc); e Tyr(tBu) (Sigma). O reagente de acoplamento foi HCTU (Pepceuticals), empregou-se diisopropiletilamina (DIPEA, Sigma) como uma base, e se obteve desproteção com piperidina a 20% em DMF (AGTC). Sínteses foram realizadas usando 0,37 mmol/g de resina AM de amida Fmoc-Rink (AGTC), aminoácidos Fmoc foram utilizados em um excesso de quatro vezes, e base foi em um excesso de quatro vezes em relação aos aminoácidos. Os aminoácidos foram dissolvidos a 0,2 M em DMSO, HCTU a 0,4 M em DMF e DIPEA a 1,6 M em N- metilpirrolidona (Alfa Aesar). Condições foram de tal modo que reações de acoplamento continham entre DMSO a 20 a 50% em DMF, o que reduziu agregação e deleções durante a síntese em fase sólida e acentuou os rendimentos. Tempos de acoplamento foram geralmente de 30 minutos, e tempos de desproteção de 2 x 5 minutos. Fmoc-N- metilglicina (Fmoc-Sar-OH, Merck) foi acoplada durante 1 hora, e desproteção e tempos de acoplamento para o resíduo seguinte foram de 20 minutos e 1 hora, respectivamente. Após síntese, a resina foi lavada com diclorometano, e seca. Clivagem de grupos protetores de cadeia lateral e do arcabouço foi efetuada utilizando 10 mL de 95:2,5: 2,5:2,5 v/v/v/p de TFA/H2O/iPr3SiH/ditiotreitol durante 3 horas. Após clivagem, a resina gasta foi removida por meio de filtração, e o filtrado foi adicionado a 35 mL de éter dietílico que foi arrefecido a -80°C. Pellet de peptídeo foi centrifugado, o sobrenadante etérico descartado, e o pellet de peptídeo lavado com éter frio duas vezes mais. Os peptídeos foram então ressolubilizados em 5-10 mL de acetonitrila-água e liofilizados. Uma pequena amostra foi removida para análise de pureza do produto bruto por meio de espectrometria de massa (MALDI-TOF, Voyager DE de Applied Biosystems). Após liofilização, pós de peptídeos foram tomados em 10 mL de cloridrato de guanidínio 6 M em H2O, suplementados com 0,5 mL de ditiotreitol 1 M, e carregados para uma coluna de HPLC preparativa C8 Luna (Phenomenex). Solventes (H2O, acetonitrila) foram acidificados com ácido heptafluorbutírico a 0,1%. O gradiente variou de acetonitrila a 30-70% em 15 minutos, sob uma vazão de 15-20 mL/minuto, utilizando um sistema de HPLC preparativa de Gilson. Frações contendo material de peptídeo puro linear (como identificado por MALDI) foram combinadas, e modificadas com 1,3,5- tris(bromometil)benzeno (TBMB, Sigma). Para isso, peptídeo linear foi diluído com H2O até ~35 mL, adicionou-se ~500 μL de TBMB 100 mM em acetonitrila, e a reação foi iniciada com 5 mL de NH4HCO3 1 M em H2O. A reação foi deixada prosseguir durante ~30 -60 minutos sob temperatura ambiente, e uma vez liofilizada a reação foi concluída (avaliada por MALDI). Após liofilização, o peptídeo modificado foi purificado como acima, enquanto se substitui a Luna C8 com uma coluna Gemini C18 (Phenomenex), e alterando o ácido para ácido trifluoracético a 0,1%. Frações puras contendo o material modificado TMB correto foram reunidas, liofilizadas e mantidas a -20°C para armazenagem.
[00190] Todos os aminoácidos, a não ser que observados de outro modo, foram utilizados nas configurações L.
[00191] DOTA foi acoplado com a cadeia de peptídeo durante síntese de peptídeo em fase sólida usando o precursor protegido DOTA(tBu)3 (TCI, CAS 137076-54-1).
[00192] Aminoácidos não naturais foram incorporados na sequência de peptídeos utilizando os métodos gerais descritos acima.
[00193] A lista de precursores de aminoácidos não naturais empregados neste relatório é resumida na Tabela abaixo:
[00194] Peptídeos utilizados para os estudos farmacocinéticos foram liofilizados a partir de TFA a 0,1% em água para produzir os sais de TFA ou ácidos livres dos compostos.
[00195] Dois conjugados bicíclicos de fármaco (BDC) foram sintetizados, utilizando 17-69-07-N219 como um peptídeo precursor. Os constructos de vcMMAE ativado ou dissulfeto-DM1 (dissolvidos em DMSO) foram diretamente conjugados em excesso de 1,4 x com 17-69- 07-N219 em condições aquosas (fosfato de sódio 100, pH 8) (ver Esquemas I e II). Concentrações foram em 9 mg/mL de peptídeo ou superiores. A reação foi seguida por CL/EM e avaliada completa após 3,5 horas. Esta foi seguida por purificação padrão de fase reversa, utilizando uma coluna semipreparativa C18. Frações em pureza superior a 95% foram isoladas e liofilizadas. Os materiais não continham quantidades mensuráveis de toxina livre. Para os estudos in vitro e in vivo, pós liofilizados foram tomados como materiais de estoque de DMSO concentrado (100 mg/mL), e diluídos no tampão apropriado para utilização adicional. Síntese de conjugados bicíclicos de fármaco (BDCs) utilizando 17-69- 07-N241 como um Peptídeo Bicíclico Precursor
[00196] Para síntese de BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 e BT17BDC-20, os ésteres de N-hidroxi-succinimida seguintes (ésteres de NHS) de maitansinoides dissulfeto foram utilizados:
em que R1, R2, R3, R4, m e n são como descritos acima para compostos de fórmula (V)a, (V)b, (V)c, (V)d para BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 e BT17BDC-20, respectivamente.
[00197] BT17BDC-18 foi adicionalmente sintetizado por meio de uma via alternativa, conforme descrita abaixo e no Esquema III. Aqui, 17-69- 07-N277 foi sintetizado por meio de reação de 17-69-07-N241 com SPP (4-(2-piridilditio)pentanoato de N-sucinimidila) em DMSO. Concentrações de 17-69-07-N241 foram 10 mM ou superiores, com um excesso de 1,3 vezes de SPP, e um excesso de 20 vezes de di- isopropiletilamina, sob temperatura ambiente. A reação foi avaliada completa após 1 hora, como determinada por CL/EM. Purificação foi realizada por fase reversa, como descrita acima. Frações apropriadas foram liofilizadas.
[00198] 17-69-07-N277 foi dissulfeto trocado com 1,15 equivalentes de DM1 (como o tiol livre), em condições semi-aquosas (dimetilacetamida a 50% e acetato de sódio a 50% 100 mM, pH 5,0, suplementado com EDTA 2 mM) durante 21 horas a temperatura ambiente sob uma manta de gás nitrogênio. Concentrações de 17-69- 07-N277 na reação foram a 10 mM ou superiores. Essa foi seguida por purificação padrão de fase reversa utilizando uma coluna semipreparativa C18. Frações em pureza maior que 95% foram isoladas e liofilizadas. Os materiais não continham quantidades mensuráveis de toxina livre. Para os estudos in vitro e in vivo, pós de liofilização foram solubilizados em formulação aquosa, conforme descrita acima, ou tomados diretamente no tampão apropriado.
[00199] Ensaios de Polarização de Fluorescência de ligação direta ou anisotropia são realizados por meio de titulação de uma concentração constante de marcador fluorescente (aqui, o peptídeo bicíclico de fluorescência que deve ser estudado) com o seu parceiro de ligação (aqui, o domínio hemopexina de MT1-MMP). À medida que a concentração de parceiro de ligação aumenta durante a titulação, o sinal de polarização se altera na proporção à fração de material ligado e não ligado. Isso permite determinação de taxas de dissociação (Kd) quantitativamente. Os dados do ensaio podem ser ajustados utilizando equações-padrão de ligação com ligante.
[00200] Tipicamente, as concentrações do marcador são idealmente bem abaixo da Kd do marcador: par titulante, e concentrações escolhidas são geralmente em ~1 nM ou menos. A concentração de titulante (parceiro de ligação) variou de 0,1 nM até tipicamente 5 μM. A faixa é escolhida de tal modo que a alteração máxima na polarização fluorescente pode ser observada. Os tampões empregados são solução salina de tampão fosfato, na presença de Tween a 0,01%. Experimentos foram processados em placas pretas de 384 poços de ligação baixa/volume baixo (Corning 3820), e o sinal de polarização de fluorescência foi medido utilizando um leitor de placas BMG Pherastar FS.
[00201] Marcadores fluorescentes referidos no texto são peptídeos bicíclicos que foram submetidos à fluorescência usando 5,6- carboxifluoresceína. Fluorescência pode ser realizada no grupo amino de término N do peptídeo que é separado a partir da sequência de núcleo bicíclico por um espaçador de sarcosina (geralmente, Sar5). Isso pode ser feito durante a síntese em fase sólida de Fmoc ou pós- sinteticamente (após ciclização com TBMB e purificação), se o grupo amino de término N é único para o peptídeo. Fluorescência pode também ser realizada no término C, geralmente, em uma lisina introduzida como o primeiro resíduo de término C, a qual é então separada a partir da sequência de núcleo bicíclico por um espaçador de sarcosina (geralmente, Sar6). Desse modo, marcadores de término N podem apresentar um formato molecular descrito como Fluo-Gly-Sar5- A (BicycleCoreSequence), e (BicycleCoreSequence)-A-Sar6-K(Fluo) para um constructo de fluorescência terminalmente em C. Marcadores fluorescentes utilizados nos Exemplos são A-(17-69)-A-Sar6-K(Fluo), A- (17-69-07)-A-Sar6-K(Fluo), e A-(17-69-12)-A-Sar6-K(Fluo). Devido à natureza ácida dos 17-69 peptídeos fluorescentes, estes foram tipicamente preparados como materiais de estoque de DMSO concentrado, a partir do qual foram preparadas diluições em tampão Tris 100 mM, pH 8.
[00202] Devido às suas afinidades elevadas para o domínio hemopexina de MT1-MMP (PEX), os derivados de fluorescência 17-69 07 e 17-69-12 (denotados como 17-69-07-N040 e 17-69-12-N005, respectivamente) podem ser utilizados para experimentos de competição (utilizando FP para detecção). Aqui, um complexo pré- formado de PEX com o marcador de ligação PEX fluorescente é titulado com peptídeo bicíclico livre, não marcado com fluoresceína. Desde que todos os peptídeos baseados em 17-69 sejam esperados ligar-se ao mesmo sítio, o titulante deslocará o marcador fluorescente de PEX. Dissociação do complexo pode ser medida quantitativamente, e a Kd do competidor (titulante) para a proteína-alvo determinada. A vantagem do método de competição é que as afinidades de peptídeos bicíclicos não marcados com fluoresceína podem ser determinadas com precisão e rapidez.
[00203] Concentrações de marcador são geralmente na Kd ou abaixo (aqui, 1 nM), e a proteína de ligação (aqui, hemopexina de MT1- MMP) está sob um excesso de 15 vezes, de tal modo que >90% do marcador são ligados. Subsequentemente, o peptídeo bicíclico competidor não fluorescente (geralmente, apenas a sequência de núcleo bicíclico) é titulado, de tal modo que este desloca o marcador fluorescente a partir da proteína-alvo. O deslocamento do marcador é medido e associado a uma queda na polarização de fluorescência. A queda na polarização de fluorescência é proporcional à fração de proteína-alvo ligada com o titulante não fluorescente, e assim, é uma medida da afinidade de titulante para a proteína-alvo.
[00204] Os dados brutos são ajustados para a solução analítica da equação cúbica que descreve os equilíbrios entre o marcador fluorescente, titulante, e proteína de ligação. O ajuste exige o valor da afinidade de marcador fluorescente para a proteína-alvo, o qual pode ser determinado separadamente por meio de experimentos de FP de ligação direta (ver, seção anterior). O ajuste da curva foi realizada utilizando SigmaPlot 12,0 e utilizada uma versão adaptada da equação descrita por Zhi-Xin Wang (FEBS Letters 360 (1995) 111-114).
[00205] Desenvolveu-se um ensaio rápido do perfil de estabilidade plasmática que empregou detecção espectrométrica de massa (MALDI- TOF, Voyager DE, Applied Biosystems) da massa de origem, bem como, fragmentos induzidos por protease de plasma da mesma. Ao avaliar a natureza dos fragmentos, sítios de clivagem preferidos podem ser determinados. Aqui, um material de estoque peptídeo 1 - 1,5 mM (em DMSO) foi diretamente diluído em plasma de camundongo/rato/humano (laboratórios de soros, utilizando citrato como anticoagulante), fornecendo uma concentração final de 50 μM de peptídeo, e incubado por até 48 horas a 37°C. Amostras de 5 μL foram tomadas em pontos de tempo apropriados e congeladas a -80°C. Para análise, as amostras foram descongeladas, misturadas com 25 μL de acetonitrila:metanol:água 3:3:1 e centrifugadas em 13K durante 5 minutos. 5 μL do sobrenadante contendo peptídeo foram aspirados e misturados com bicarbonato de amônio 30 mM em uma mistura 1:1 de acetonitrila: H2O. 1 μL dessa mistura foi, em seguida, manchado na placa de MALDI, secado, e Matrix(ácido alfa-cianocinâmico, Sigma, preparado como uma solução saturada em acetonitrila:água 1:1 contendo ácido trifluoracético a 0,1%) foi colocado em camadas sobre a amostra (1 μL), seco e analisado utilizando o MALDI TOF. Deve-se observar que esse é um ensaio qualitativo serve para detectar alterações comparativas na estabilidade do plasma entre sequências de peptídeos bicíclicos diferentes, e funciona como uma excelente ferramenta para determinar sítios de clivagem preferidos.
[00206] Para obter estabilidade plasmática de peptídeos bicíclicos quantitativamente, soluções de estoque de peptídeos (200 μM em DMSO) foram misturadas com plasma (humano ou de camundongo), de tal modo que concentrações finais foram de 10 μM. Amostras de 40 μL foram tomadas periodicamente até 8 horas e congeladas a -80°C. Antes de análise de CL-EM, as amostras foram descongeladas, e misturadas com 3 volumes (aqui, 120 μL) de acetonitrila/MeOH/água 1:1. As suspensões leitosas foram centrifugadas durante 30 minutos a 13.000 rpm, e os sobrenadantes contendo peptídeos foram quantificados para espécies dupla/triplamente carregadas e fragmentos de EM/EM das mesmas, utilizando um instrumento Waters Xevo TQ-D, enquanto se utiliza uma curva-padrão extraída do plasma dos mesmos peptídeos como uma referência. Utilizou-se a meia-vida de degradação no plasma para avaliar a estabilidade comparativa das moléculas.
[00207] Farmacocinéticas de camundongo foram adquiridas utilizando peptídeo bicíclico 17-69-04-N004, o qual foi dosado com um grupo de 12 camundongos machos CD1 como uma única dose intravenosa, doses de 5,925 mg/kg como um bolo de 5 mL/kg de uma solução de 1,19 mg/mL. Soluções formuladas foram preparadas a partir de 100 μL de um material de estoque de 23,7 mg/mL de DMSO, o qual foi diluído com 1,9 mL de solução salina tamponada fosfato antes de dosagem, resultando em um veículo consistindo em DMSO a 5% em PBS sob pH 7,4. Amostras de sangue foram tomadas de dois animais por ponto de tempo, através de punção cardíaca sob anestesia terminal, em 0,08, 0,5, 1, 2 e 4 horas pós-dose, e transferidas para tubos de EDTA para geração de plasma. Amostras de plasma foram congeladas a - 20oC.
[00208] Para análise, as amostras foram rapidamente descongeladas e alíquotas de 50 μL foram tratadas com 3 volumes de solvente de extração (mistura 2:9:9 de bicarbonato de amônio 10 mM, pH 8, acetonitrila e metanol, contendo um padrão interno analítico). Proteínas precipitadas foram removidas por meio de centrifugação e o sobrenadante foi analisado por CL-EM/EM. Quantificação das amostras foi por referência a uma linha de calibração preparada no plasma de camundongo de controle. Parâmetros farmacocinéticos foram determinados por meio de análise não compartimental usando o pacote de software PK Solutions 2.0 de Summit Research Services. Definição de termos: Cmáx : Concentração máxima medida; Tmáx.: Tempo em que concentração máxima foi medida; AUC 0-t: Área sob a curva de concentração/tempo de fármaco no plasma de 0 minuto para último ponto de dados quantificáveis; e AUC 0-«: Área sob a curva de concentração/tempo de fármaco no plasma de 0 minuto extrapolado, além do ponto de dados finais com base na meia-vida terminal.
[00209] Três amostras de plasma estavam disponíveis para serem utilizadas (0,5, 1 e 2 horas) para análise de potencial de metabólitos de 17-69-07-N004 in vivo de camundongo. Análise foi realizada por meio de HPLC-EM e HPLC-EM/EM com um Espectrômetro de Massa LTQ Orbitrap XL. A abordagem para observar os metabólitos peptídicos na circulação sanguínea foi calcular a massa exata (janela 10 ppm) de metabolitos assumidos (adição de 1 ou 2 de água (+18, +36) para clivagem de laço1 e/ou laço2, respectivamente; por conseguinte, perda de aminoácidos únicos ou perda de aminoácidos estirados a partir de laço1 e/ou laço2). Em segundo lugar, uma pesquisa manual foi realizada comparando os cromatogramas de íons totais com plasma em branco de camundongo.
[00210] Camundongos nus Balb/c carregando tumores de xenoenxerto de HT-1080 subcutâneos foram tratados com BDCs ou veículo (PBS). BDCs foram dosados 3 vezes semanalmente durante 2 semanas, dosagem iniciada quando os tumores mediram aproximadamente 150-200 mm3. Os camundongos foram monitorados, e medições de volume do tumor e peso corporal registrados 3 vezes por semana.
[00211] Empregando métodos previamente estabelecidos para geração de bibliotecas de fagos de peptídeos bicíclicos, seleções foram realizadas contra o domínio hemopexina de MT1-MMP humana. Após três ciclos de seleções a partir de uma biblioteca singela empregando concentrações sucessivamente reduzidas de alvo, sequenciamento foi realizado nas saídas. Peptídeo bicíclico 17-69 (CKNRGFGCEDFYDIC) (ID SEQ NO: 16) foi identificado como uma das saídas de sequências mais abundantes, e ligação qualitativa para o alvo foi verificada por Alphascreen.
[00212] Três pequenas bibliotecas de fagos foram geradas proporcionando cobertura de sequência completa de cada uma das 3 porções da sequência de 17-69. Essas três bibliotecas foram submetidas a dois ciclos de seleções contra proteína hemopexina. De modo interessante, os produtos de saída de sequenciamento mais promissores foram 5 x 6 peptídeos bicíclicos, enquanto as bibliotecas de partida eram do formato 6 x 6. É provável que o comprimento mais curto do laçofoi selecionado devido a uma maior afinidade do peptídeo bicíclico com a proteína-alvo. Comprimentos mais curtos do laço resultam de iniciadores incorretamente sintetizados que são incorporados durante a construção das bibliotecas de fagos.
[00213] O produto de saída principal de sequenciamento foi o peptídeo 17-69-07, o qual apresenta a sequência CYNEFGCEDFYDIC (ID SEQ NO: 2).
[00214] Com base na observação de que um formato 5x6 pareceu mais proveitoso, e que distinção entre os ligantes 5x6 foi necessária, mais duas bibliotecas foram geradas testando truncamentos deliberados do primeiro laço que gerou peptídeos bicíclicos 17-69-02, 17-69-03, 17-69-04 e 17-69-12. Esses estão contidos nas sequências descritas na Figura 8.
[00215] A tendência de certos resíduos foi visível, embora o ensaio de ligação não fosse capaz de distinguir entre os melhores ligantes quando atingiram o limite do ensaio.
[00216] As sequências que ocorrem mais frequentemente foram ensaiadas para ligação de hemopexina usando a seleção alfa, em que todos os sinais foram elevados em comparação com a sequência original de 17-69 (ver Tabela 1): Em que: Tabela 1: Ensaio de ligação de hemopexina usando os peptídeos bicíclicos da invenção
[00217] Como todos os clones maduros de afinidade com base em 17-69 produziram sinais que foram próximos ao limite do ensaio, o gráfico mostrado na Tabela 1 não permite identificação inequívoca dos melhores clones. Alguns dos peptídeos foram, portanto, sintetizados como os derivados marcados com fluorescência (17-69, 17-69-07 e 17 69-12), e utilizados para experimentos de polarização fluorescente (PF) de ligação direta. Aqui, a fluoresceína é separada por um ligante (geralmente, Sar6) a partir da sequência de bicíclico, cada término N ou C para a sequência de núcleo (Tabela 2). Tabela 2: Resultados de Experimentos de Polarização Fluorescente (PF) de Ligação Direta
[00218] Os derivados marcados com fluorescência de 17-69-07 e 17 69-12 (denotados como 17-69-07-N040 e 17-69-12-N005) mostraram uma forte ligação com taxas de dissociação de 0,52 e 3,1 nM, respectivamente. Esses são notadamente aperfeiçoados sobre a sequência original 17-69 não maturada (17-69-N004). Parece que as sequências que contêm o formato 5x6 induzem altas afinidades dentro do contexto da biblioteca de maturação de afinidade.
[00219] Devido às suas elevadas afinidades para o domínio hemopexina de MT1-MMP (PEX), os derivados marcados com fluorescência 17-69-07 e 17-69-12 (designados como 17-69-07-N040 e 17-69-12-N005, respectivamente) foram usados para experimentos de competição subsequentes (usando PF para detecção). Aqui, um complexo de PEX pré-formado com o marcador de ligação a PEX fluorescente é titulado com peptídeo bicíclico livre, não marcado com fluoresceína. Uma vez que todos os peptídeos com base em 17-69 (contendo o motivo de segundo laço conservado CEDFYDIC; ID SEQ NO: 17) são esperados ligar-se ao mesmo sítio, o titulante deslocará o marcador fluorescente de PEX. A dissociação do complexo pode ser medida quantitativamente, e a Kd do competidor (titulante) determinada. A vantagem do método de competição é que as afinidades de peptídeos bicíclicos não marcados com fluorescência podem ser determinadas com precisão e rapidez.
[00220] Neste contexto, é importante verificar que as sequências de núcleo 17-69-07 e 17-69-12 são unicamente responsáveis por elevada afinidade a PEX. Peptídeos foram assim sintetizados como variantes com alaninas de término N e C, desse modo, mimetizando estritamente a sequência expressa na partícula de fago, mas faltando o espaçador molecular Sar5/6 que foi utilizado com os constructos marcados com fluorescência.
[00221] Afinidades conforme determinadas por experimentos de competição foram quase idênticas àquelas obtidas com os derivados marcados com fluorescência, demonstrando de forma inequívoca que as sequências bicíclicas do núcleo são responsáveis por elevada afinidade de ligação a PEX (Tabela 3). Além disso, os constructos marcados com fluorescência mostram que ligações de término C de espaçadores moleculares e grupos efetores (aqui, como, -A-Sar6- K(Fluoresceína)) são toleradas. Tabela 3: Resultados de Experimentos de Polarização Fluorescente (PF) de ligação direta
Exemplo 2: Estabilização Proteolítica da sequência de núcleo 17 69-07 Estabilidade Plasmática de 17-69-07 de camundongo
[00222] Para aplicações terapêuticas em humanos, e para avaliação pré-clínica em espécies animais, é pertinente que um peptídeo bicíclico principal seja suficientemente estável na circulação após administração intravenosa. Estabilidade adequada é necessária de modo que níveis suficientes de peptídeo bicíclico podem se ligar a seu alvo e exercer sua função biológica.
[00223] Modelos pré-clínicos muitas vezes empregam espécies tais como camundongo, rato, coelho e macaco cinomolgo. No primeiro exemplo, avaliou-se o peptídeo bicíclico 17-69-07-N219 em relação à estabilidade na presença de plasma de camundongo utilizando métodos descritos anteriormente (Método no. 2). A sequência de núcleo bicíclico retém os aminoácidos proteinogênicos naturais originais da sequência de 17-69-07, e adicionalmente, contém um espaçador molecular de término N que é utilizado para conjugação de grupos efetores (sequência: G-Sar10-ACYNEFGCEDFYDIC; ID SEQ NO: 20). A afinidade de 17-69-07-N219 para PEX foi retida apesar da presença do espaçador molecular (Kd = 0,82 nM).
[00224] Esse composto exibiu uma estabilidade modesta no plasma de camundongo ex vivo, com uma meia-vida de 6 horas (ver Figura 1).
[00225] Em um esforço para entender a natureza química da degradação de 17-69-07-N219 em plasma de camundongo, amostras foram analisadas usando MALDI-TOF para quaisquer produtos potenciais de degradação. Espectros de massa indicaram uma possível perda de tirosina, o que implica na abertura de laço (hidrólise) e remoção de Tyr1 no laço1 e/ou Tyr9 no laço2.
[00226] Conduziu-se um estudo farmacocinético (FC) em camundongo utilizando o peptídeo bicíclico mínimo 17-69-07-N004 (Ac- CYNEFGCEDFYDIC (ID SEQ NO: 2), que constitui o peptídeo bicíclico de núcleo mínimo de 17-69-07), a fim de estabelecer taxas de depuração e eliminação a partir da circulação in vivo. Amostras de sangue resultantes foram adicionalmente analisadas, e para analisar amostras de plasma em relação a quaisquer produtos potenciais de degradação proteolítica de 17-69-07-N004.
[00227] O perfil de FC é indicado na Figura 2: Tabela 4: Parâmetros Farmacocinéticos de 17-69-07-N004
NC: não calculado devido a dados limitados
[00228] Tabela 4 mostra que o peptídeo apresenta uma meia-vida de eliminação de 14 minutos, e é clarificado a 20,7 mL/minuto/kg. A taxa de depuração é maior que a taxa de filtração glomerular observados em camundongos (resumida em Qi e outros, American Journal of Physiology - Renal Physiology (2004) Vol. 286 No. 3; F590-F596), indicando que o peptídeo é clarificado por meios adicionais, por exemplo, proteólise orientada por plasma e proteases endoteliais.
[00229] Para abordar se a proteólise in vivo contribua significativamente para depuração, amostras de plasma tomadas em t = 0,5, 1 e 2 horas foram submetidas à análise direcionada a fragmentos bicíclicos utilizando técnicas de CL-EM/EM.
[00230] Metabólitos proteolíticos múltiplos podem ser identificados, e fragmentos com os sinais mais intensos são listados abaixo na ordem descendente: Ac-CiYNEFGCiiEDFYDICiii (ID SEQ NO: 2): Excisão de YNE no laço1; Excisão de YNEF no laço1 (ID SEQ NO: 21); Excisão de YNEFG (ID SEQ NO: 22) no laço1 (o ciclo inteiro é removido); Excisão de Y no laço1 e/ou 2; Excisão de YD no laço2; Excisão de FYD no laço2; Excisão de YDI no laço2; e Excisão de EDFYDI (ID SEQ NO: 23) no laço2 (o ciclo inteiro é removido).
[00231] Os três principais metabólitos estavam presentes no nível médio de sinal, enquanto os fragmentos restantes foram apenas detectáveis em quantidades vestigiais.
[00232] Tomados em conjunto, tanto metabólitos ex vivo quanto in vivo parecem centralizar-se em clivagem inicial em ou próximo a Tyr 1/9, seguido por remoção sucessiva de resíduos na proximidade. Isso leva finalmente à remoção de um ou ambos os laçosem sua totalidade.
[00233] Abordagens para estabilização de sequências peptídicas de degradação proteolítica são numerosas (para revisões, ver Gentilucci e outros, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, e Nestor e outros, Curr. Medicinal Chem. (2009) 16, 4399-418), e WO 2009/098450, WO 2013/050615 e WO 2013/050616). Resumidamente, compreendem substituição do aminoácido que proporciona um ponto de reconhecimento para a(s) protease(s), alteração de estrutura principal dos aminoácidos no sítio de clivagem, (isto é, N-metilação, ligações pseudopeptídeos, etc.), obstrução estérica de ligações próximas (isto é, aminoácidos β substituídos), e inclusão de aminoácidos D- enantioméricos. Algumas dessas modificações (isto é, N-metilação, D- aminoácidos) podem proteger/cobrir um sítio de clivagem proteolítica a partir da hidrólise, mesmo que sejam localizados até dois resíduos longe do sítio de clivagem. Embora seja relativamente direto/avançado proteger uma sequência de ataque proteolítico, é muito mais desafiante incorporar alterações de estabilização que não alterem dramaticamente a potência (e especificidade) para a proteína-alvo.
[00234] A partir dos dados de degradação proteolítica ex/in vivo de 17-69-07 mostrada na seção anterior, é evidente que Tyr1/9 e resíduos na proximidade são sítios potenciais para estabilização do peptídeo bicíclico. Um meio quantitativo para avaliar estabilização com êxito do peptídeo é através de um aumento de sua meia-vida no plasma de camundongo e humano.
[00235] No primeiro exemplo, onze derivados de 17-69-07 foram gerados, em que cada posição foi substituída por uma alanina (denominada "varredura de alanina"). Esse tipo de informação adverte sobre a contribuição energética e o papel de certos resíduos, e potencialmente remove pontos de reconhecimento proteolítico. Tabela 5: Resultados de Varredura de Alanina
[00236] 17-69-07-N004 é o peptídeo não modificado do tipo selvagem contendo um término N capeado (acetilação, terminalmente em N, denominada "Ac"). Algumas das substituições Ala são bem toleradas, especialmente, nas posições 1, 3, 4, 10 e 11 na sequência. Como as cadeias laterais desses resíduos não são exigidas para ligação de alta afinidade ao alvo, compostos de fórmula (I) nessas posições particulares de sequência são definidos amplamente.
[00237] Isso torna substituição no resíduo 1 (Tyr1) uma possibilidade muito atrativa, à medida que este pode remover um dos pontos de reconhecimento proteolítico. A substituição de Gly5 com Ala5 é de interesse quando a alteração química é menor (adição de grupo metila), ainda produz uma redução dramática na potência. É possível que Gly5 adota ângulos incomuns phi/psi fora do gráfico geral de Ramachandron, e esses ângulos podem ser potencialmente induzidos por D- aminoácidos. O benefício adicional seria estabilização das ligações peptídicas adjacentes a este sítio.
[00238] Por esta razão, realizou-se uma varredura parcial de D- alanina para avaliar se estas são toleradas em relação à manutenção de potência: inclusão de D-aminoácidos na sequência é altamente desejável, devido ao seu efeito proteoliticamente estabilizante. Tabela 6: Efeito de resíduos de substituição no primeiro laçocom D-Alaninas
[00239] D-Ala1 no lugar de Tyr1 liga-se a uma afinidade 10 vezes inferior ao do tipo selvagem. Entretanto, é de interesse quando o ponto de reconhecimento proteolítico Tyr1 é removido e substituído por um aminoácido de estabilização, sem induzir uma grande perda na potência.
[00240] Notavelmente, substituição de Gly5 com D-Ala5 é bem tolerada, quando a afinidade comparada com tipo selvagem permanece inalterada.
[00241] Neste contexto, D-Arg5 também é tolerado (e provável, portanto, todos os D-aminoácidos, exceto D-Pro, ver Tabela 6), que pode ser de interesse se as propriedades físico-químicas precisam alterar-se durante desenvolvimento adicional da molécula (Tabela 7). Tabela 7: Efeito de resíduos de substituição na posição 5
[00242] Em seguida, devido aos produtos de saída de seleção de fagos, indicando certa preferência por aminoácidos hidrofóbicos e aromáticos na posição 4 da sequência, uma série de derivados foi sintetizada incorporando seleção de aminoácidos aromáticos, incluindo, a tirosina natural e triptofano (Tabela 8). Tabela 8: Efeito de resíduos de substituição na posição 4
[00243] 1Nal: 1-naftilalanina; 2NAI: 2-naftilalanina; Chg: ciclo- hexilglicina; Phg: fenilglicina; tBuGly: terc-butilglicina; 3,4-DCPhe4: 3,4- diclorofenilalanina; Cha: ciclo-hexilalanina; e HPhe: homofenilalanina.
[00244] Diversas substituições na posição 4 intensificam a afinidade comparada com tipo selvagem, essas incluem tirosina, trifofano, 1 e 2- naftilalanina (1/2 Nal) e 3,4 diclorofenilalanina (3,4-DCPhe). A substituição mais potente é 1-naftilalanina, a qual intensifica a afinidade 7 vezes.
[00245] Certos resíduos no laço2 de 17-69-07 foram examinados para o propósito de intensificar estabilidade da molécula. Esses incluem o resíduo 9, que contém o ponto de reconhecimento potencial de Tyr9. Resíduo 11 também é atrativo, à medida que é permissivo a substituição (Tabela 5) e vicinal ao ponto de reconhecimento de Tyr9. Tabela 9: Resumo das substituições de aminoácidos tolerados
[00246] De interesse é 4-bromofenilalanina (4BrPhe), a qual altera o ponto de reconhecimento proteolítico de Tyr9, e terc-butilglicina (tBuGly), que intensifica ligeiramente a afinidade e de modo importante e fortemente, protege a estrutura principal vicinal de aminoácidos a partir de hidrólise proteolítica por meio de obstrução estérica.
[00247] A seção anterior descreveu posições múltiplas na sequência 17-69-07 que permite inclusão de estabilização proteoliticamente e/ou afinidade que intensificam aminoácidos.
[00248] Em um esforço para combinar essas modificações em uma única molécula, sintetizou-se uma molécula que incorporou uma substituição Tyr1^D-Ala1, Phe4^1-Naftilalanina 4, Gly5^D-Ala5, Tyr9^ 4BrPhe9 e Ile11^tBuGly11. Notavelmente, todas as modificações são toleradas em conjunto, e a potência é superior àquela da molécula do tipo selvagem (Tabelas 10 e 11). Tabela 10: Resultados de uma substituição múltipla específica
[00249] Na antecipação de ligar grupos efetores a tal peptídeo bicíclico durante o desenvolvimento adicional da molécula, versões foram geradas com um espaçador molecular de sarcosina de término N (Sar 10 consecutivo, denotado como Sar10) iniciado com uma glicina de término N e terminado com uma alanina de término C. Para a finalidade desse experimento, a glicina (Gly) de término N foi capeada com um grupo acetila, de modo a remover a carga positiva. Tabela 11: Dados comparativos após adição de G-Sar10-A
[00250] Os dados indicam que tanto espaçador molecular (ligado ao término N conforme indicado) quanto as substituições de aminoácidos na sequência de núcleo bicíclico são bem tolerados quando potências são retidas ou aperfeiçoadas.
[00251] Tabela 12 mostra os derivados não acetilados, não estabilizados das moléculas mostradas na Tabela 11. Suas estabilidades foram avaliadas quantitativamente em plasma de camundongo e humano a fim de demonstrar um aperfeiçoamento comparado com o não estabilizado 17-69-07-N219 (Figura 1). Tabela 12: Moléculas selecionadas de avaliação de estabilidade plasmática, potências associadas
[00252] Figura 3A mostra a estabilidade plasmática de camundongo das moléculas penta e tetrassubstituídas 17-69-07-N244 e 17-69-07- N231, respectivamente, em comparação com a molécula original do tipo selvagem não estabilizada 17-69-07-N219. A meia-vida do peptídeo no plasma de camundongo a 37°C é » 20 horas, comparada com 6 horas para a molécula do tipo selvagem não intensificada.
[00253] Figura 3B mostra a estabilidade plasmática de humano das moléculas penta e tetrassubstituídas 17-69-07-N244 e 17-69-07-N231, respectivamente, em comparação com a molécula original do tipo selvagem não estabilizada 17-69-07-N219. A meia-vida do peptídeo no plasma de camundongo a 37°C é » 20 horas, comparada com 6 horas para a molécula do tipo selvagem não intensificada.
[00254] Em resumo, substituições direcionadas em até 5 posições na sequência de núcleo bicíclico 17-69-07 (Tyr1 >D-Ala1, Phe4>1 Naftilalanina4, Gly5 >D-Ala5, Tyr9 >4BrPhe9 e Ile11>tBuGly11) geraram moléculas superiores com potência intensificada e aperfeiçoamento significativo na estabilidade plasmática.
[00255] O espaçador molecular estabilizado contendo derivado 17- 69-07-N241 foi testado por meio de competição de FP para afinidade ao domínio hemopexina de MT1-MMP derivado de outras espécies. Os dados são resumidos na Tabela 13: Tabela 13: Espécies de reatividade cruzada de 17-69-07 e derivados
[00256] Derivados tanto não estabilizados quanto estabilizados de 17-69-07 são totalmente de reação cruzada.
[00257] O derivado marcado com fluorescência terminalmente em N de 17-69-07-N241 (denominado 17-69-07-N258, da sequência: fluoresceína (bAla)-Sar10-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 tBuGly11) foi testado contra metaloproteinase humana correlata. Os dados demonstram que a sequência de núcleo 17-69-07, e essa variante estabilizada, são unicamente seletivas a MT1-MMP (Tabela 14). Tabela 14: Seletividade de 17-69-07 e derivados para metaloproteinase relacionada
Exemplo 3: Análise in vivo de variantes de 17-69-07 proteoliticamente estabilizadas conjugadas com um quelante
[00258] Peptídeos ligados a quelantes metálicos apresentam múltiplas aplicações em diagnóstico e terapêutico. Certos radioisótopos de imagem ou terapêutico podem ser "carregados" para o quelante enquanto o peptídeo transporta esses isótopos para o alvo. Dessa maneira, antígenos específicos a tumor podem ser visualizados utilizando, por exemplo, scanners PET e SPECT. Para radioterapia direcionada, radionuclídeos terapêuticos (tais como 90Y e 177Lu) são carregados para o peptídeo quelante e seletivamente transportados para o tumor através de ligação ao antígeno associado a tumor. Estes exercem sua atividade antitumoral pela radiação de alta energia que os mesmos emitem.
[00259] Cinco derivados foram sintetizados em que o quelante metálico DOTA (ácido 1,4,7,10-tetrazaciclododecano-1,4,7,10- tetracético) foi ligado com a alanina de término N do peptídeo bicíclico 17-69-07. Tabela 15: Sumário das moléculas e estrutura
[00260] 17-69-07-N144 é a sequência do tipo selvagem de 17-69-07 em que DOTA é diretamente ligado com uma alanina de término N que funciona como um espaçador de um aminoácido. Essa molécula retém potência total para MT1-MMP. Para demonstrar que a potência é retida quando carregada com um radionuclídeo terapêutico/de imagem, o quelante foi carregado com o 175Lutécio natural (frio) como um substituto seguro. Potência foi retida. A variante totalmente estabilizada, 17-69-07- N248, também retinha potência no contexto do conjugado DOTA.
[00261] Preparou-se uma molécula de controle, 17-69-07-N246, a qual é o equivalente total de aminoácido D de 17-69-07-N144. Essa molécula é completamente resistente à degradação proteolítica quando ligações amida adjacentes a aminoácidos D são protegidas de proteases, e falta qualquer atividade no sentido de MT1-MMP. De modo importante, esse peptídeo retém a mesma sequência exata e composição química.
[00262] Células HT-1080 (que são sabidas expressar abundantemente MT1-MMP) foram inoculadas subcutaneamente no tronco direito de camundongos machos com 6 semanas de idade BALB/c nu/nu. Os tumores foram deixados crescer por aproximadamente 1 semana.
[00263] 150 pmoles de peptídeo 17-69-07-N144 foram carregados com 1 MBq do emissor Y e β 177Lu usando técnicas-padrão de complexação. Por camundongo portador de tumor, 150 pmoles do 17- 69-07-N144 carregados foram então injetados (o equivalente de 17 μg/kg). 3 (três) animais foram submetidos à eutanásia por ponto de tempo, vários órgãos e tumores excisados e pesados, e seguido por determinação da contagem de radiação gama por grama de tecido de tumor/órgão. O gráfico resultante fornece uma indicação quantitativa da localização do peptídeo no camundongo in vivo. Em particular, acumulação seletiva no tumor de HT1080 indica ligação a MT1-MMP in vivo.
[00264] Figura 4 resume os dados de distribuição. Notavelmente, o peptídeo bicíclico é específico ao tumor e parece persistir até 24 horas, apesar de uma meia-vida estimada na circulação de 14 minutos. Isso provavelmente indica absorção nas células tumorais. Localização significativa é visível nos rins, e é provável que isso seja devido aos transportadores de aminoácidos para os rins transitoriamente de ligação a peptídeo. Todos os outros órgãos não mostram absorção significativa da molécula. De nota, o domínio de hemopexina de camundongo compartilha homologia completa com a contraparte humana, indicando que se PEX de camundongo foi expresso em outro lugar, os sinais correspondentes seriam observados.
[00265] Para avaliar se a absorção de tumor no modelo de xenoenxerto é seletiva e devido à ligação de PEX, um estudo adicional foi realizado utilizando o peptídeo 17-69-07-N246, que é a contraparte do aminoácido D de 17-69-07-N144 (Figura 5).
[00266] Comparando o padrão de biodistribuição àquele obtido com o peptídeo bicíclico ativo 17-69-07-N144, é evidente que o peptídeo bicíclico 17-69-07-N246 de ligação não a MT1-MMP não direcionou o tumor, o que confirma que o sinal de tumor de 17-69-07-N144 é orientado por ligação in vivo direcionada a MT1-MMP.
[00267] Finalmente, para avaliar o efeito de estabilização proteolítico da sequência de 17-69-07 em biodistribuição, peptídeo bicíclico 17-69- 07-N248 (DOTA-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 4BrPhe9 tBuGly11) foi empregado em um estudo de biodistribuição idêntica (Figura 6).
[00268] Surpreendentemente, a estabilidade proteolítica intensificada do peptídeo leva a uma duplicação global da absorção do tumor em qualquer ponto de tempo determinado comparada com 17-69- 07-N144, exemplificando as propriedades superiores da molécula comparadas com a sequência de 17-69-07 original não estabilizada.
[00269] Antecipa-se que esse efeito pode resultar em um índice terapêutico vantajoso, tanto para terapia direcionada a radionuclídeo utilizando os conjugados descritos neste exemplo quanto no contexto de peptídeos bicíclicos conjugados a toxina (Exemplo 4).
[00270] Para terapia direcionada a câncer, fármacos citotóxicos altamente potentes são ligados através de um ligante de clivagem a uma entidade de direcionamento (aqui, um peptídeo bicíclico), o qual se liga às proteínas expressas na superfície de células associadas ao tumor. A proteína-alvo da superfície celular associada ao tumor superexpresso é selecionada por sua capacidade de internalizar-se no interior da célula. Após ligação da entidade de direcionamento conjugado com agente citotóxico com a proteína da superfície celular associada ao tumor, o complexo molecular completo internaliza-se no interior da célula. Após a transição a partir da circulação sistêmica para o ambiente intracelular distinto, o fármaco citotóxico é clivado a partir da entidade de direcionamento por meio de condições intracelulares, e o fármaco clivado então exerce sua atividade antitumoral através de indução de morte celular direcionada por meio de detenção do ciclo celular, seguida por apoptose.
[00271] Peptídeo bicíclico 17-69-07-N219 (ver, Exemplos 2 e 3) é composto da sequência de núcleo bicíclico do tipo selvagem ligada no lado de término N com um espaçador molecular Gly-Sar10-Ala (G- Sar10-A-(17-69-07), em que a descrição de sequência completa é G- Sar10-A-CYNEFGCEDFYDIC; ID SEQ NO: 20). Esse derivado de (17 69-07) retém potência total (Tabela 12) para MT1-MMP sob uma Kd de 0,8 nM. O único grupo amino livre no lado de término N do espaçador molecular é idealmente colocado para conjugação com grupos efetores, tais como substâncias citotóxicas altamente potentes. A longa distância intramolecular transmitida pelo ligante Sar10 entre o sítio de conjugação na glicina (Gly) de término N e a sequência de núcleo bicíclico é empregada, de modo a garantir retenção total de potência de ligação ao alvo seguindo conjugação com grupos efetores de tamanho molecular significativo. Espaçadores moleculares mais curtos podem ser selecionados arbitrariamente, desde que a potência da sequência de núcleo bicíclico para a proteína-alvo seja mantida.
[00272] Para gerar uma prova de dados de conceito com um conjugado de peptídeo bicíclico de fármaco (denominado BDC) direcionando MT1-MMP, foram preparados dois conjugados de 17-69- 07-N219, os quais empregaram toxinas DM1 inibidoras de polimerização de microtúbulos (uma maitansina, também conhecida como N2'-desacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina) ou MMAE (Monometilauristatina E, também conhecida como (S)-N-((3R,4S,5S)-1- ((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1- metoxi-2-metil-3-oxo-propil)pirrolidin-1-il)-3-metóxi-5-metil-1-oxoeptan- 4-il)-N,3-dimetil-2-((S) -3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamida).
[00273] O conjugado MMAE é denominado BT17BDC-1 e é separado do precursor 17-69-07-N219 por um ligante de valina-citrulina (Val-Cit), incluindo, o grupo de autoimolação para-aminobenzil- carbonila (PABC). O ligante de Val-Cit é clivado seletivamente (hidrolisado) pelo ambiente rico em catepsina B encontrado nos lisossomos intracelulares, e após hidrólise, imolação de PABC para liberar MMAE como as espécies tóxicas ativas. O ligante de Val-Cit- PABC é estável na circulação, e desse modo, libera a toxina apenas após internalização celular.
[00274] A estrutura do conjugado, e o esquema sintético para a preparação de BT17BDC-1, são mostrados no Esquema I: Esquema I Estrutura de BT17BDC-1
Esquema de Reação:
Estratégia sintética para preparação de BDC17BDC-1: O precursor bicíclico 17-69-07-N219 ciclizado com TMB totalmente purificado é reagido com o éster de succinimida de glutaril-valina-citrulina-p- aminobenzilcarbonil-MMAE (comumente abreviado como vc-MMAE ou Val-Cit-PABC-MMAE), produzindo o conjugado de BDC17BDC-1.
[00275] O conjugado DM1 de 17-69-07-N219 é denominado BT17BDC-9 e é separado do precursor 17-69-07-N219 por meio de uma ligação dissulfeto, o qual pode ser clivado pelo ambiente redutor encontrado no meio intracelular. Acredita-se que a redução ocorra através de glutationa intracelular, a qual está presente em concentrações de ~ 10 mM no interior da célula. Em contraste, a concentração de glutationa e agentes redutores livres na circulação sanguínea é muito menor (<10 μM); desse modo, a toxina é liberada predominantemente no ambiente intracelular, onde se pode desdobrar sua atividade de morte celular.
[00276] A estrutura do conjugado, e o esquema sintético para preparação de BT17BDC-9 são mostrados no Esquema II: Esquema II Estrutura de BT17BDC-9
Esquema de Reação:
Estratégia sintética para preparação de BDC17BDC-9: O precursor bicíclico 17-69-07-N219 ciclizado com TMB totalmente purificado contendo a amina livre de término N é reagido com o éster de succinimida de DM1 dissulfeto (estrutura conforme mostrada), produzindo o conjugado BDC17BDC-9.
[00277] A liberação das toxinas em BDC17BDC-1 e BDC17BDC-9 é, portanto, mecanisticamente distinta, isto é, o primeiro por meio de condições proteolíticas intracelulares, e o último por condições redutoras intracelulares.
[00278] Os dois BDCs foram empregados em estudos de citotoxicidade in vitro e mostrou baixa potência nanomolar/picomolar em culturas de células, tais como HT1080 (dados não mostrados).
[00279] Em um modelo de xenoenxerto em camundongo in vivo (abrigando tumores HT1080), ambos os BDCs causaram redução significativa no volume do tumor após 9 dias pós-injeção comparado com controle de veículo. O regime de dosagem é indicado na Figura 7 (setas). Os tumores foram completamente clarificados por 14 dias para ambos os BDCs, como avaliados por palpação (Figura 7). Notavelmente, o peso dos animais tanto para BDC17BDC-1 quanto para BDC17BDC-9 foi grandemente estável, indicando uma janela terapêutica que pode ser suficiente para fins terapêuticos.
[00280] A sequência de núcleo bicíclico 17-69-07 contendo as modificações de D-alanina na posição 1,1-naftilalanina na posição 4, D- alanina na posição 5, e α-terc-butilglicina na posição 11, com ou sem 4- bromofenilalanina na posição 9, apresentava estabilidade proteolítica intensificada no plasma ex vivo e in vivo (Exemplos 2, 3).
[00281] No contexto de conjugados bicíclicos de fármaco, é provável que uma sequência de núcleo bicíclico mais estável pode levar a maior exposição do tumor devido à depuração sistêmica reduzida e maior estabilidade no microambiente tumoral proteoliticamente agressivo. Ambos podem resultar em aumento da absorção de BDC induzida por MT1-MMP no interior da célula, levando a um aumento na eficácia terapêutica.
[00282] O peptídeo bicíclico estabilizado 17-69-07-N241 foi projetado com uma disposição molecular total similar ao 17-69-07-N219 não estabilizado (descrito nos Exemplos 3 e 4). Este apresenta a sequência seguinte: (B-Ala)-Sar10-AC(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C(ID SEQ NO: 5) o qual é ciclizado com TBMB como anteriormente.
[00283] A beta-alanina de término N foi selecionada, em vez da glicina anteriormente empregada como em 17-69-07-N219, de modo a minimizar formação do produto lateral dicetopiperazina durante o acoplamento com ésteres de N-hidroxissuccinimida (NHS) (Purdie e outros (1973), J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1845), especificamente nesse exemplo, com ésteres de NHS de agentes citotóxicos (Esquema I, II).
[00284] O espaçador decâmero de sarcosina é retido como em 17- 69-07-N219, de modo a assegurar retenção total de ligação do peptídeo bicíclico para o domínio hemopexina de MT1-MMP.
[00285] A classe de toxina de maitansina foi selecionada para conjugação com 17-69-07-N241 com base na eficácia e tolerabilidade no modelo de xenoenxerto de camundongo descrito no Exemplo 4, e o ligante clivável dissulfeto foi novamente selecionado.
[00286] Quatro BDCs foram preparados (referidos anteriormente como BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 e BT17BDC-20), por meio do que, tanto toxina quanto 17-69-07-N241 eram invariantes, enquanto que a suscetibilidade à ligação dissulfeto para redução/clivagem foi alterada por meio de modulação do grau de impedimento adjacente aos átomos de enxofre.
[00287] A via sintética para os conjugados é como descrita no Esquema II, em que 17-69-07-N219 é substituído com 17-69-07-N241.
[00288] Em relação a BT17BDC-18, uma via adicional para síntese envolveu geração de um precursor bicíclico dissulfeto de piridila (denominado 17-69-07-N277), o qual é reagido com DM1 para formar o conjugado total. A via sintética é descrita no Esquema III. Esquema III Estrutura de BT17BDC-18
Esquema de Reação
Estratégia sintética para preparação de BDC17BDC-18: o precursor bicíclico 17-69-07-N241 ciclizado com TMB totalmente purificado contendo a amina livre de término N, é reagido com o SPP 4-(2- piridilditio)pentanoato de (N-succinimidila), produzindo o intermediário 17-69-07-N277. Este é em seguida reagido com DM1 como o tiol livre, produzindo o conjugado desejado BT17BDC-18.
[00289] Os quatro BDCs foram avaliados em relação aos diversos parâmetros in vitro tal como retenção de potência para o domínio hemopexina de MT1-MMP humano, estabilidade em camundongo ex vivo, plasma de murídeo e humano, e estabilidade para agentes redutores tal como ditiotreitol.
[00290] Os dados são resumidos na Tabela 16 abaixo: Tabela 16: Propriedades in vitro de BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 e BT17BDC-20
em que n/a: não aplicável, e em que: n = números de repetições a: determinado por experimentos de competição de polarização de fluorescência utilizando 17-69-07-N040 como um marcador b: determinado usando CL-EM quantitativa. Tempo de incubação até 24 horas no plasma, contendo 4 μM de BDC. c: de Kellogg e outros (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717. Nota-se que esses valores referem-se aos conjugados de anticorpos de fármaco contendo o ligante dissulfeto descrito no texto. d: determinado por CL-EM quantitativa. Nota-se que esses valores referem-se aos conjugados bicíclicos de fármaco contendo o ligante dissulfeto descrito no texto. Métodos foram adaptados de Kellogg e outros (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717. e: Uso de 17-69-07-N004 como marcador na competição PF. f: Uso de 17-69-07-N040 como marcador na competição PF.
[00291] Todos os constructos moleculares retêm sua afinidade à hemopexina-alvo. (segunda coluna).
[00292] Os dados indicam que estabilidade plasmática é governada pela natureza da ligação dissulfeto (conforme modulada por suscetibilidade à redução), e não na natureza do peptídeo bicíclico, uma vez que todos os BDCs contêm o mesmo peptídeo bicíclico (17-69-07- N241) que é estável no plasma das três espécies testadas.
[00293] Além disso, BT17BDC-18, BT17BDC-19 e BT17BDC-20 mostram estabilidades em plasma humano adequadas para uso terapêutico, uma vez que a filtração renal antecipada induziu depuração dos peptídeos desse tamanho molecular no homem apresenta uma meia-vida estimada de 2 a 4 horas, a qual é diversas vezes mais rápida do que a meia-vida de degradação dos BDCs no plasma humano (>14 horas de BT17BDC-18/19/20, ver Tabela 16). Desse modo, espera-se que o volume do BDC clarifique por via renal, com apenas uma fração que é degradada na circulação, tornando esses BDCs potencialmente adequados para fins terapêuticos.
[00294] Todos os BDCs contendo a sequência de núcleo bicíclico estabilizado foram testados em relação às suas eficácias em modelos de xenoenxerto em camundongo in vivo, utilizando a linhagem de carcinoma pulmonar de células escamosas EBC-1.
[00295] BT17BDC-17, BT17BDC-18 e BT17BDC-19 foram eficazes e clarificou tumores em 9 dias (Figuras 9, 10 e 11). BT17BDC-17 mostrou boa eficácia, mas alguma redução de peso sob doses elevadas. BT17BDC-20 foi enquanto tolerado com base no peso constante, não eficaz e apenas causou uma redução marginal nos tamanhos dos tumores (Figura 12).
[00296] A área sob curva (AUC) de volume do tumor ao longo do tempo e BDC foi tomada e representada graficamente contra o grupo de dose correspondente (Figura 13). A partir disso, a dose eficaz necessária para alcançar 50% de redução da AUC do tumor (ED50) pode ser determinada, a qual é resumida na Tabela 17. Tabela 17: Dose eficaz para alcançar 50% de redução da AUC do tumor para BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 e BT17BDC-20
aED50 ± 95% de limite de confidência bunidades em mg/kg, em camundongo transportando tumores EBC-1
[00297] Desse modo, BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18 e BT17BDC-19 são moléculas adequadas para uso em terapia direcionada a câncer com base na eficácia, e BT17BDC-17, BT17BDC- 18 e BT17BDC-19 são bem tolerados em doses eficazes.
Claims (43)
1. Ligante de peptídeo específico a MT1-MMP, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídio compreendendo pelo menos três resíduos de cisteína, separado pelo menos por duas sequências em laço, e um arcabouço molecular que forma ligações covalentes com os resíduos de cisteína do polipeptídio, de tal modo que pelo menos dois laçosde polipeptídios são formados no arcabouço molecular, em que o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos de fórmula (I):
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que: Ci, Cii e Ciii representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente; X representa qualquer resíduo de aminoácido; U representa um resíduo de aminoácido polar, não carregado selecionado de N, C, Q, M, S e T; e O representa um resíduo de aminoácido alifático não polar selecionado de G, A, I, L, P e V.
2. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X1 é selecionado de qualquer um dos seguintes aminoácidos: Y, M, F ou V, tal como Y, M ou F, em particular, Y ou M, mais particularmente, Y.
3. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que U/O2 é selecionado de U, tal como um N, ou O, tal como um G.
4. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que X3 é selecionado de U ou Z, em que U representa um resíduo de aminoácido polar não carregado selecionado de N, C, Q, M, S e T, e Z, representa um resíduo de aminoácido polar negativamente carregado selecionado de D ou E, em particular, o U na posição 3 é selecionado de Q ou o Z na posição 3 é selecionado de E.
5. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que X4 é selecionado de J, em que J representa um resíduo de aminoácido aromático não polar selecionado de F, W e Y.
6. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que X10 é selecionado de Z, em que Z representa um resíduo de aminoácido polar negativamente carregado selecionado de D ou E, tal como D.
7. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que X11 é selecionado de O, em que O representa um resíduo de aminoácido alifático não polar selecionado de G, A, I, L, P e V, tal como I.
8. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (Ia):
em que U, O, J e Z são como definidos acima; ou um composto de fórmula (Ib): 
ou um composto de fórmula (Ic): 
ou um composto de fórmula (Id): 
ou um composto de fórmula (Ie): 
9. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de fórmula (I) compreende uma sequência selecionada de
tais como: 
em particular
10. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que inclui uma ou mais modificações selecionadas de: modificações de término N e/ou término C; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos com um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais (tais como, substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos polares com um ou mais aminoácidos isoestéricos ou isoeletrônicos; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos com outros aminoácidos isoestéricos ou isoeletrônicos não naturais); adição de um grupo espaçador; substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos com um ou mais resíduos de D-aminoácidos; N-alquilação de uma ou mais ligações amida no ligante peptídico bicíclico; substituição de uma ou mais ligações peptídicas com uma ligação substituta; modificação do comprimento da estrutura principal de peptídeos; substituição do hidrogênio no carbono alfa de um ou mais resíduos de aminoácidos com outro grupo químico; e modificação biortogonal pós-sintética de aminoácidos tais como cisteína, lisina, glutamato e tirosina com amina adequada, tiol, ácido carboxílico e reagentes reativos com fenol.
11. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende a modificação de término N utilizando química reativa a amino adequado, e/ou modificação de término C utilizando química reativa a carbóxi adequado.
12. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a modificação de término N compreende a adição de um grupo espaçador molecular que facilita a conjugação de grupos efetores e retenção de potência do peptídeo bicíclico a seu alvo, tais como um grupo Ala, G-Sar10-A ou grupo bAla- Sar10-A.
13. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a modificação de término N e/ou de término C compreende adição de um agente citotóxico.
14. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação na posição aminoácido 1 e/ou 9.
15. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos com um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais.
16. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido não natural é substituído na posição 4 e é selecionado de: 1-naftilalanina; 2- naftilalanina; 3,4-diclorofenilalanina; e homofenilalanina, tais como 1- naftilalanina; 2-naftilalanina; e 3,4-diclorofenilalanina, em particular, 1- naftilalanina.
17. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 15 ou reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido não natural é substituído na posição 9 e/ou 11, e é selecionado de: 4-bromofenilalanina ou pentaflúor-fenilalanina para posição 9 e/ou terc-butilglicina para posição 11.
18. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes na posição 9, é selecionado de: 4- bromofenilalanina.
19. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácidos não naturais, tais como aqueles presentes na posição 11, é selecionado de: terc- butilglicina.
20. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de modificações, tais como 2, 3, 4 ou 5, ou mais das seguintes modificações, em particular, todas das seguintes 5 modificações: D- alanina na posição 1 e/ou 5, uma 1-naftilalanina na posição 4, uma 4- bromofenilalanina na posição 9 e uma terc-butilglicina na posição 11.
21. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido na posição 1 é substituído por um D-aminoácido, tal como D-alanina.
22. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido na posição 5 é substituído por um D-aminoácido, tal como D-alanina ou D-arginina.
23. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é selecionado do ácido livre ou o sal de sódio, potássio, cálcio e amônio.
24. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que é um ligante de alta afinidade do domínio hemopexina de MT1-MMP de humano, camundongo e cão.
25. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é seletivo a MT1- MMP, mas não reage cruzado com MMP-1, MMP-2, MMP-15 e MMP- 16.
26. Conjugado de fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende um ligante peptídico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, o qual é conjugado com um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
27. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que os grupos efetores e/ou funcionais compreendem um agente citotóxico ou um quelante metálico.
28. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é ligado ao peptídeo bicíclico por meio de uma ligação clivável, tal como uma ligação dissulfeto ou uma ligação sensível à protease.
29. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 27 ou reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado de DM1 que apresenta a seguinte estrutura:
ou MMAE que apresenta a seguinte estrutura:
30. Conjugado de fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de que é um composto que apresenta a seguinte estrutura:
31. Conjugado de fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de que é um composto que apresenta a seguinte estrutura:
32. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 27 ou reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é um maitansinoide e selecionado de um composto de fórmula (II):
em que n representa um número inteiro selecionado de 1 a 10; e R1 e R2, independentemente, representam hidrogênio, C1-6 alquila ou um grupo carbociclila ou heterociclila, tal como hidrogênio ou metila.
33. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que: n representa 1 e R1 e R2 ambos representam hidrogênio (isto é, o derivado de maitansina DM1); ou n representa 2, R1 representa hidrogênio e R2 representa um grupo metila (isto é, o derivado de maitansina DM3); ou n representa 2 e R1 e R2 ambos representam grupos metila (isto é, o derivado de maitansina DM4).
34. Conjugado de fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 33, caracterizado pelo fato de que o componente peptídeo bicíclico do conjugado apresenta a estrutura mostrada na fórmula (III):
em que m representa um número inteiro selecionado de 0 a 10, e R3 e R4, independentemente, representam hidrogênio, C1-6 alquila ou um grupo carbociclila ou heterociclila, tal como hidrogênio ou metila.
35. Conjugado de fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 34, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é ligado ao peptídeo bicíclico por um ligante definido na fórmula (IV):
em que R1, R2, R3 e R4 representam hidrogênio, C1-6 alquila ou um grupo carbociclila ou heterociclila, tal como hidrogênio ou metila; Toxina refere-se a qualquer agente citotóxico adequado; Biciclo representa um ligante peptídico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24; n representa um número inteiro selecionado de 1 a 10; e m representa um número inteiro selecionado de 0 a 10.
36. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a toxina de composto (IV) é uma maitansina e o conjugado compreende um composto de fórmula (V):
(V) em que R1, R2, R3 e R4 representam hidrogênio, C1-6 alquila ou um grupo carbociclila ou heterociclila; Biciclo representa um ligante peptídico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24; n representa um número inteiro selecionado de 1 a 10; e m representa um número inteiro selecionado de 0 a 10.
37. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que: n representa 1 e R1, R2, R3 e R4 cada um, representa hidrogênio, isto é, um composto de fórmula (V)a:
(V)a; ou n representa 1, R1 representa metila e R2, R3 e R4 cada um, representa hidrogênio, isto é, um composto de fórmula (V)b:
(V)b; ou n representa 2, R1 e R2 ambos representam hidrogênio e R3 e R4 ambos representam metila, isto é, um composto de fórmula (V)c: (V)c; ou
n representa 2, R1 e R3 ambos representam metila e R2 e R4 ambos representam hidrogênio, isto é, um composto de fórmula (V)d:
38. Conjugado de fármaco, de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é selecionado de BT17BDC-9:
tais como BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18 e BT17BDC-19, em particular, BT17BDC-17, BT17BDC-18 e BT17BDC-19.
39. Processo para preparação de um conjugado de fármaco, conforme definido na reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que compreende a via sintética descrita no Esquema III Esquema de reação
40. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o ligante peptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, ou o conjugado de fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 38, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
41. Conjugado de fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 38, caracterizada pelo fato de que é para utilização na prevenção, supressão ou tratamento de câncer, em particular, tumores sólidos tais como carcinomas pulmonares de células não pequenas.
42. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é: (β-Ala)-Sar10-AC(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C (SEQ ID NO: 5), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
43. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o arcabouço molecular é TBMB (1,3,5-tris(bromometil) benzeno).
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