KR20230133938A - Mt1-mmp에 특이적인 바이사이클릭 펩타이드 리간드 - Google Patents

Mt1-mmp에 특이적인 바이사이클릭 펩타이드 리간드 Download PDF

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KR20230133938A
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다니엘 폴 토이펠
캐서린 루시 스테이스
실비아 파반
에드워드 워커
레오나르도 발다사레
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바이시클러드 리미티드
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Abstract

본 발명은, 2개 이상의 펩타이드 루프가 스캐폴드에 대한 부착점 사이에 배열되도록 분자 스캐폴드에 공유 결합되는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 막 유형 1 메탈로프로테아제(MT1-MMP)의 높은 친화성 결합제인 펩타이드를 기재한다. 본 발명은 또한 영상화 및 표적화 암 요법에서 사용되는 하나 이상의 효과기 및/또는 관능기에 접합된 상기 펩타이드를 포함하는 약물 접합체를 기재한다.

Description

MT1-MMP에 특이적인 바이사이클릭 펩타이드 리간드{BICYCLIC PEPTIDE LIGANDS SPECIFIC FOR MT1-MMP}
본 발명은, 2개 이상의 펩타이드 루프가 스캐폴드 (scaffold)에 대한 부착점 사이에서 관여하도록 분자 스캐폴드에 공유 결합되는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 막 유형 1 메탈로프로테아제(MT1-MMP)의 높은 친화성 결합제인 펩타이드를 기재한다. 본 발명은 또한 영상화 및 표적화 암 요법에서 사용되는 하나 이상의 효과기 (effector) 및/또는 관능기에 접합된, 상기 펩타이드를 포함하는 약물 접합체를 기재한다.
사이클릭 펩타이드는 단백질 표적에 높은 친화성 및 표적 특이성으로 결합할 수 있고, 따라서 치료약의 개발을 위한 매력적 분자 부류이다. 실제로, 몇몇 사이클릭 펩타이드는, 예를 들면, 항균성 펩타이드 반코마이신, 면역억제 약물 사이클로스포린 또는 항암 약물 옥트레오티드와 같이 임상에서 이미 성공적으로 사용되고 있다[참조: Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24]. 양호한 결합 특성은, 사이클릭 구조의 감소된 형태학적 가요성 뿐만 아니라 펩타이드와 표적 사이에 형성된 비교적 거대한 상호작용 표면을 생성한다. 전형적으로, 마크로사이클은, 예를 들면, 사이클릭 펩타이드 CXCR4 길항제 CVX15[참조: 400Å2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71], 인테그린 αVb3(355Å2)에 결합하는 Arg-Gly-Asp 모티프를 갖는 사이클릭 펩타이드[참조: Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5] 또는 유로키나제-형 플라스미노겐 활성화인자에 결합하는 사이클릭 펩타이드 억제제 유파인-1 (upain-1)[참조: 603Å2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10]와 같이 수백 평방 Å의 표면에 결합한다.
이들의 사이클릭 구조에 기인하여, 펩타이드 마크로사이클은 선형 펩타이드보다 덜 가요성이고, 이는 표적에 결합시에 보다 적은 엔트로피 손실을 유도하고 보다 높은 결합 친화성을 제공하다. 감소된 가요성은 또한 표적-특이적 형태의 록킹(locking)을 유도하고 선형 펩타이드와 비교하여 결합 특이성을 증가시킨다. 이 효과는, 이의 고리가 개방되는 경우, 다른 MMP와 비교하여 이의 선택성을 상실하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 8(MMP-8)의 강력한 및 선택적 억제제에 의해 예시되어 있다[참조: Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51]. 마크로사이클화를 통해 달성된 양호한 결합 특성은, 예를 들면, 반코마이신, 니신 및 액티노마이신과 같이, 하나 이상의 펩타이드 고리를 갖는 멀티사이클릭 펩타이드에서 더욱 현저하다.
상이한 연구 팀들은 이전에 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 합성 분자 구조에 계류시켰다 (tethered)[참조: Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem]. 멜로엔 등은 단백질 표면의 구조적 모방을 위해 합성 스캐폴드 내로 복수의 펩타이드 루프의 신속한 및 정량적 고리화 (cyclisation)를 위해 트리스(브로모메틸)벤젠 및 관련 분자를 사용했다[참조: Timmerman et al. (2005), ChemBioChem]. 예를 들면, 트리스(브로모메틸)벤젠과 같이 시스테인 함유 폴리펩타이드를 분자 스캐폴드에 연결시킴으로써 상기 화합물이 생성되는 후보 약물 화합물을 생성하는 방법은 국제공개공보 제WO 2004/077062호 및 제WO 2006/078161호에 개시되어 있다.
파지 디스플레이-기반 조합 접근법은 목적하는 표적에 대해 바이사이클릭 펩타이드의 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위해 개발되었다[참조: Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 및 WO2009/098450]. 요약하면, 3개 시스테인 잔기 및 6개 랜덤 아미노산(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)의 2개 영역을 함유하는 선형 펩타이드의 조합 라이브러리는 파지 상에 표시되고, 시스테인 측쇄를 소분자 (트리스-(브로모메틸)벤젠)에 공유 연결시킴으로써 고리화되었다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된 적어도 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드, 및 적어도 2개의 폴리펩타이드 루프가 분자 스캐폴드 위에 형성되도록 폴리펩타이드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함하는, MT1-MMP에 특이적인 펩타이드 리간드 또는 변형된 유도체로서,
상기 펩타이드 리간드가 하기 화학식 I의 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 펩타이드 리간드가 제공된다:
[화학식 I]
-Ci-X-U/0-X-X-G-Cii-E-D-F-Y-X-X-Ciii- (서열번호 1)
상기 화학식 I에서,
Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고;
X는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고;
U는 N, C, Q, M, S 및 T로부터 선택된 비하전된 극성 아미노산 잔기를 나타내고;
O는 G, A, I, L, P 및 V로부터 선택된 비극성 지방족 아미노산 잔기를 나타낸다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 하나 이상의 효과기 및/또는 관능기, 예를 들면, 세포독성제, 특히 DM1 및 MMAE에 접합된 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 리간드를 포함하는 약물 접합체가 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 하나 이상의 효과기 및/또는 관능기, 예를 들면, 방사성핵종 보유 킬레이트 그룹, 특히 DOTA에 접합된 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 리간드를 포함하는 접합체가 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 리간드 또는 약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 암, 특히 고형 종양, 예를 들면, 비-소세포 폐암을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 리간드가 제공된다.
도 1: 17-69-07-N219의 마우스 혈장 안정성. 몇몇 이온을 MRM 모드에서 2개 전이 뿐만 아니라 범례에 나타낸 바와 같이 모니터링했다. 이온 사이에는 우수한 상관관계가 있다. 37℃에서 마우스 혈장 중의 펩타이드의 반감기는 6시간이다.
도 2: 마우스에서 바이사이클릭 펩타이드 17-69-07-N004의 PK 프로파일. 시점당 2마리 동물.
도 3: 비-안정화된 17-69-07-N219와 비교하여 2개의 안정화된 17-69-07 분자(위치 9에서 4-브로모페닐알라닌의 존재: 17-69-07-N244, 위치 9에서 4-브로모페닐알라닌의 부재: 17-69-07-N231)의 (A) 마우스 및 (B) 인간 혈장 안정성. 소정 분석물에 대한 몇몇 MRM 전이를 모니터링하고, 이는 서로 양호하게 상관했다. 이러한 그래프의 목적으로, 하나의 전이만이 표시된다.
도 4: HT-1080 이종이식 마우스 중의 177Lu 17-69-07-N144의 생체내분포 (biodistribution).
도 5: HT-1080 이종이식 마우스 중의 177Lu 17-69-07-N246의 생체내분포.
도 6: HT-1080 이종이식 마우스 중의 177Lu 17-69-07-N248의 생체내분포.
도 7: (A): BT17BDC-1 및 9에 대한 평균 종양 용적 대 시간의 플롯. 용량은 0, 2, 4, 7, 9 및 11일에 투여했다. (B): 약물-연관 독성 및 전체 동물 건강의 지표인 치료 동안의 체중.
도 8: 17 내지 69의 고정된 루프 2 잔기를 갖는 라이브러리를 사용하여 친화성 성숙체로부터 유래된 서열 결과의 목록. 우측 상의 서열 로고 플롯은 루프 잔기 1, 2, 3, 4 및 5에서 잔기의 전체 선호도를 나타낸다.
도 9: 상부: EBC-1 이종이식 마우스에서 BT17BDC-17에 대한 평균 종양 용적 대 시간의 플롯. 용량은 0, 2, 4, 7, 9, 11 및 14일에 투여했다. 하부: 약물-연관 독성 및 전체 동물 건강의 지표인 치료 동안의 체중.
도 10: 상부: EBC-1 이종이식 마우스에서 BT17BDC-18에 대한 평균 종양 용적 대 시간의 플롯. 용량은 0, 2, 4, 7, 9, 11 및 14일에 투여했다. 하부: 약물-연관 독성 및 전체 동물 건강의 지표인 치료 동안의 체중.
도 11: 상부: EBC-1 이종이식 마우스에서 BT17BDC-19에 대한 평균 종양 용적 대 시간의 플롯. 용량은 0, 2, 4, 7, 9, 11 및 14일에 투여했다. 하부: 약물-연관 독성 및 전체 동물 건강의 지표인 치료 동안의 체중.
도 12: 상부: EBC-1 이종이식 마우스에서 BT17BDC-20에 대한 평균 종양 용적 대 시간의 플롯. 용량은 0, 2, 4, 7, 9, 11 및 14일에 투여했다. 하부: 약물-연관 독성 및 전체 동물 건강의 지표인 치료 동안의 체중.
도 13: 상응하는 용량 그룹에 대한 특정 BDC와 연관된 시간 경과에 따른 종양 용적의 곡선하 면적(AUC)의 플롯. 곡선 적합은, 표준 IC50 방정식을 사용하여, 시간 0에서 종양 용적에 대해 정규화한 모든 이용가능한 데이터 점을 사용하여 수행된다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 기술분야, 예를 들면, 펩타이드 화학, 세포 배양 및 파지 디스플레이, 핵산 화학 및 생화학 분야에서 통상의 숙련가에 의해 통상 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 표준 기술은 분자 생물학, 유전학 및 생화학적 방법에 대해 사용된다[참조: Sam brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 이는 본원에서 참조로서 도입됨.]
명명법
넘버링
화학식 I의 화합물 내의 아미노산 잔기 위치를 지칭하는 경우, 시스테인 잔기(Ci, Cii 및 Ciii)는 이들이 불변이기 때문에 넘버링으로부터 생략되고, 따라서 화학식 I의 화합물 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 하기와 같이 지칭된다:
-Ci-X1-U/02-X3-X4-G5-Cii-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-Ciii- (서열번호 1).
설명의 목적을 위해, 모든 바이사이클릭 펩타이드는 TBMB(1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠)으로 고리화되어 삼치환된 1,3,5-트리스메틸벤젠 구조를 제공하는 것으로 가정된다. TBMB를 사용한 고리화는 Ci, Cii 및 Ciii 상에서 발생한다.
바이사이클릭 펩타이드 코어 서열
본원에 개시된 각각의 바이사이클릭 펩타이드는 최초 N-말단 시스테인(Ci)과 최후 C-말단 시스테인(Ciii) 사이의 아미노산 서열로서 정의되는 고유의 코어 서열 번호가 할당된다. 식별자 17-69-07의 예에서, 코어 서열은 CiYNEFGCiiEDFYDICiii (서열번호 2)이고, "17-69-07" 또는 "(17-69-07)"로서 지칭된다.
펩타이드 코드
본원에 개시된 특정 바이사이클릭 펩타이드는 또한 펩타이드 코드, 예를 들면, 17-69-07-N241을 사용하여 고유한 식별자가 할당되고, 여기서 N241은 17-69-07 바이사이클 코어 서열의 특정 유도체를 나타낸다. 17-69-07의 상이한 유도체는 상이한 N-번호, 즉 N001, N002, Nxxx를 갖는다.
분자 포맷
바이사이클 코어 서열에 대한 N- 또는 C-말단 신장은 하이폰에 의해 분리된, 코어 서열의 좌측 및 우측에 부가된다. 예를 들면, N-말단 βΑla-Sar10-Ala 테일은 βAla-Sar10-A-(17-69-07)로서 나타낼 수 있고, βAla-Sar10-A-CYNEFGCEDFYDIC(서열번호 3)의 완전한 서열을 갖는다.
변형
바이사이클 코어 서열 내의 비-천연 아미노산 치환은 분자 포맷 기재의 후에 나타낸다. 예를 들면, 17-69-07 내의 티로신 1이 D-알라닌으로 치환되는 경우, 기재는 (17-69-07) D-Ala1이고, 완전 서열은 C(D-Ala1)NEFGCEDFYDIC(서열번호 4)로서 기재될 것이다.
N-말단 또는 C-말단 테일이, 코어 서열에 대한 변형을 또한 함유하는 바이사이클릭 펩타이드에 부착되는 경우, 17-69-07-N241을 예로서 사용함으로써, 분자 포맷 기재는 βAla-Sar10-A-(17-69-07) DAla1 1NAl4 DAla5 tBuGly11이다.
따라서, 17-69-07-N241의 완전한 아미노산 서열은 βAla-Sar10-A-C(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C(서열번호 5)이다.
펩타이드 리간드
본원에서 지칭되는 펩타이드 리간드는 분자 스캐폴드에 공유 결합된 펩타이드를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 펩타이드는, 펩타이드가 스캐폴드에 결합될 때에 루프를 형성하기 때문에, 스캐폴드에 대해 공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 반응성 그룹(즉, 시스테인 잔기), 및 루프 서열로서 지칭되는 상기 반응성 그룹 사이에 배열된 서열을 포함한다. 본 발명의 경우, 펩타이드는 적어도 3개의 시스테인 잔기(본원에서 Ci, Cii 및 Ciii으로 지칭됨)를 포함하고, 스캐폴드 상에 적어도 2개의 루프를 형성한다.
화학식 I의 위치 1, 3, 4, 10 및 11에서 X는, 이들 위치에서의 치환을 허용가능하게 하는 알라닌 스캔(표 5 참조) 및 선택 결과(도 8)의 결과에 따르는 임의의 아미노산을 나타낼 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 위치 1에서 X는 하기 아미노산 중의 어느 하나: Y, M, F 또는 V로부터 선택된다. 추가의 실시형태에서, 화학식 I의 위치 1에서 X는 Y, M 또는 F로부터 선택된다. 여전히 추가의 실시형태에서, 화학식 I의 위치 1에서 X는 Y 또는 M으로부터 선택된다. 여전히 추가의 실시형태에서, 화학식 I의 위치 1에서 X는 Y로부터 선택된다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 위치 2에서 U/O는 U, 예를 들면, N으로부터 선택된다. 대체 실시형태에서, 화학식 I의 위치 2에서 U/O는 O, 예를 들면, G로부터 선택된다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 위치 3에서 X는 U 또는 Z로부터 선택되고, 여기서 U는 N, C, Q, M, S 및 T로부터 선택된 비하전된 극성 아미노산 잔기를 나타내고, Z는 D 또는 E로부터 선택된 음으로 하전된 극성 아미노산 잔기를 나타낸다. 추가의 실시형태에서, 화학식 I의 위치 3에서 U는 Q로부터 선택된다. 대체 실시형태에서, 화학식 I의 위치 3에서 Z는 E로부터 선택된다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 위치 4에서 X는 J로부터 선택되고, 여기서 J는 F, W 및 Y로부터 선택된 비극성 방향족 아미노산 잔기를 나타낸다. 추가의 실시형태에서, 화학식 I의 위치 4에서 J는 F로부터 선택된다. 대체 실시형태에서, 화학식 I의 위치 4에서 J는 Y로부터 선택된다. 대체 실시형태에서, 화학식 I의 위치 4에서 J는 W로부터 선택된다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 위치 10에서 X는 Z으로부터 선택되고, 여기서 Z는 D 또는 E로부터 선택된 음으로 하전된 극성 아미노산 잔기를 나타낸다. 한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 위치 10에서 Z는 D로부터 선택된다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 위치 11에서 X는 O로부터 선택되고, 여기서 O는 G, A, I, L, P 및 V로부터 선택된 비극성 지방족 아미노산 잔기를 나타낸다. 한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 위치 11에서 O는 I로부터 선택된다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 Ia의 화합물이다:
[화학식 Ia]
-Ci-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-Cii-E-D-F-Y-Z-O-Ciii-(서열번호 6)
상기 화학식 Ia에서,
U, O, J 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 Ib의 화합물이다:
[화학식 Ib]
-Ci-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(서열번호 7)
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 Ic의 화합물이다:
[화학식 Ic]
-Ci-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(서열번호 8)
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 Id의 화합물이다:
[화학식 Id]
-Ci-Y/M-N-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(서열번호 9)
한 가지 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 Ie의 화합물이다:
[화학식 Ie]
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07)(서열번호 2)
추가의 실시형태에서, 화학식 I의 펩타이드는
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (서열번호 2);
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-12) (서열번호 10);
-Ci-F-G-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-02) (서열번호 11);
-Ci-V-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-03) (서열번호 12);
-Ci-F-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-04) (서열번호 13);
-Ci-Y-N-E-Y-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07-N057) (서열번호 14); 및
-Ci-Y-N-E-W-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-44-N002) (서열번호 15)로부터 선택된 서열을 포함한다.
이러한 실시형태의 펩타이드는 MT1-MMP의 헤모펙신 도메인에 대한 친화성 성숙 후에 강력한 후보물질인 것으로 동정되었다(실시예 1 및 표 1 및 8 참조).
추가의 실시형태에서, 화학식 I의 펩타이드는
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (서열번호 2); 및
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-12) (서열번호 10)으로부터 선택된 서열을 포함한다.
이러한 실시형태의 펩타이드는 MT1-MMP의 헤모펙신 도메인에 대한 친화성 성숙, 코어 바이사이클 서열의 합성, 및 경쟁 실험을 사용한 친화성의 정량적 측정 후에 최고 친화성 후보물질인 것으로 동정되었다(실시예 1 및 표 1 내지 3 참조).
추가의 실시형태에서, 화학식 I의 펩타이드는 -Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii-(17-69-07)(서열번호 2)로부터 선택된 서열을 포함한다. 이러한 실시형태의 펩타이드는 화학식 I 내의 펩타이드 리간드 패밀리의 가장 강력하고 안정한 멤버인 것으로 동정되었다(실시예 1 내지 4 참조).
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 특정 펩타이드 리간드는 뮤린, 개, 시노몰구스 및 인간 MT1-MMP와 완전히 교차-반응성이다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 구체적으로 예시된 펩타이드 리간드는 뮤린, 개, 시노몰구스 및 인간 MT1-MMP와 완전히 교차-반응성이다. 예를 들면, 17-69-07(즉 17-69-07-N219 및 17-69-07-N241)의 비-안정화된 및 안정화된 유도체가 완전히 교차 반응성임을 입증하는 데이터가 본원에 제공된다(표 13 참조).
추가의 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 리간드는 MT1-MMP에 대해 선택성이지만, MMP-1, MMP-2, MMP-15 및 MMP-16과 교차 반응하지 않는다. 17-69-07 코어 서열, 및 안정화된 변이체 17-69-07-N258이 MT1-MMP에 대해 유일하게 선택성임을 입증하는 데이터가 본원에 제공된다(표 14 참조).
펩타이드 리간드의 잇점
본 발명의 특정 바이사이클릭 펩타이드는, 주사, 흡입, 비내, 안내, 경구 또는 국소 투여에 적합한 약물-유사 분자로서 이들을 고려할 수 있게 하는 다수의 유리한 특성을 갖는다. 이러한 유리한 특성은 다음을 포함한다:
- 종 교차-반응성. 이는 임상전 약력학 및 약물동태 평가를 위한 전형적 요건이다;
- 프로테아제 안정성. 바이사이클릭 펩타이드 리간드는 혈장 프로테아제, 상피("막-고정된") 프로테아제, 위 및 장 프로테아제, 폐 표면 프로테아제, 세포내 프로테아제 등에 대해 안정성을 이상적으로 입증해야 한다. 프로테아제 안정성은, 바이사이클 리드 후보가 인간에게 확신을 갖고서 투여될 뿐만 아니라 동물 모델에서 개발될 수 있도록 상이한 종 사이에서 유지되어야 한다;
- 바람직한 용해도 프로파일. 이는, 제형 및 흡수 목적에 중요한, 하전된 친수성 대 소수성 잔기 및 세포내/세포간 H-결합의 비율의 함수이다;
- 순환에서 최적 혈장 반감기. 임상 징후 및 치료 섭생에 따라, 급성 질병 관리 세팅에서 단시간 노출을 위한 바이사이클릭 펩타이드를 개발하거나, 순환에서 증강된 체류를 갖는 바이사이클릭 펩타이드를 개발하는 것이 요구될 수 있고, 따라서 보다 만성 질한 상태의 관리에 최적이다. 바람직한 혈장 반감기를 유도하는 다른 인자는 최대 치료학적 유효성에 대한 지속적 노출 대 약제의 지속적 노출에 기인하는 부수 독성의 요건이다.
약제학적으로 허용되는 염
염 형태는 본 발명의 범위 내에 포함되고, 화학식 I의 화합물에 대한 언급은 상기 화합물의 염 형태를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 염은, 문헌[참조: Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002]에 기재된 방법과 같은 통상의 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 잔기를 함유하는 모 화합물로부터 합성할 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매 또는 이들 둘의 혼합물 중에서 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
산 부가 염(모노- 또는 디-염)은 광범위한 산, 무기 및 유기 산 둘 다로 형성할 수 있다. 산 부가 염의 예는 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산(예: L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포르-설폰산, (+)-(1S)-캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프론산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실설푸르산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 젠티신산, 글루코헵톤산, D-글루콘산, 글루쿠론산(예: D-글루쿠론산), 글루탐산(예: L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 하이드로할산(예: 브롬화수소산, 염화수소산, 요오드화수소산), 이세티온산, 락트산(예: (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산, (-)-L-말산, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, 피루브산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세바스산, 스테아르산, 석신산, 황산, 탄닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산 운데실렌산 및 발레르산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산, 및 또한 아실화 아미노산 및 양이온 교환 수지로 형성된 모노- 또는 디-염을 포함한다.
염의 한 가지 특정 그룹은 아세트산, 염화수소산, 요오드화수소산, 인산, 질산, 황산, 시트르산, 락트산, 석신산, 말레산, 말산, 이세티온산, 푸마르산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산, 황산, 메탄설폰산(메실레이트), 에탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 발레르산, 프로피온산, 부탄산, 말론산, 글루쿠론산 및 락토비온산으로부터 형성된 염으로 이루어진다. 한 가지 특정 염은 염화수소 염이다. 또 다른 특정 염은 아세테이트 염이다.
화합물이 음이온성이거나, 음이온성일 수 있는 관능기(예: -COOH는 -COO-일 수 있다)를 갖는 경우, 염은 적합한 양이온을 형성하는 유기 또는 무기 염기로 형성될 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 알칼리 금속 양이온, 예를 들면, Li+, Na+ 및 K+, 알칼리 토금속 양이온, 예를 들면, Ca2+ 및 Mg2+, 및 기타 양이온, 예를 들면, Al3+ 또는 Zn+를 포함한다. 적합한 유기 양이온의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예: NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함한다. 일부 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민으로부터 유래된 것들, 및 또한 아미노산, 예를 들면, 리신 및 아르기닌이다. 통상의 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
화학식 I의 화합물이 아민 관능기를 함유하는 경우, 이들은, 예를 들면, 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 알킬화제와의 반응에 의해 4급 암모늄 염을 형성할 수 있다. 이러한 4급 암모늄 화합물은 화학식 I의 범위 내에 포함된다.
변형된 유도체
본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 리간드의 변형된 유도체는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 적합한 변형된 유도체의 예는 N-말단 및/또는 C-말단 변형; 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기로의 치환(예를 들면, 하나 이상의 극성 아미노산 잔기의 하나 이상의 등배전자 (isosteric) 또는 등전자 (isoelectronic) 아미노산으로의 치환; 하나 이상의 비극성 아미노산 잔기의 다른 비-천연 등배전자 또는 등전자 아미노산으로의 치환); 스페이서 그룹의 부가; 하나 이상의 산화 감수성 아미노산 잔기의 하나 이상의 산화 내성 아미노산 잔기로의 치환; 하나 이상의 아미노산 잔기의 알라닌으로의 치환; 하나 이상의 L-아미노산 잔기의 하나 이상의 D-아미노산 잔기로의 치환; 바이사이클릭 펩타이드 리간드 내에서 하나 이상의 아미드 결합의 N-알킬화; 하나 이상의 펩타이드 결합의 대리 결합 (surrogate bond)으로의 치환; 펩타이드 골격 (backbone) 길이 변형; 하나 이상의 아미노산 잔기의 α-탄소 상의 수소의 또 다른 화학 그룹으로의 치환; 및 상기 아미노산을 관능화하도록 적합한 아민, 티올, 카복실산 및 페놀-반응성 시약을 사용한 시스테인, 리신, 글루타메이트/아스파르테이트 및 티로신 등의 아미노산의 변형; 및 관능화에 적합한 직교 반응성을 도입하는 아미노산, 예를 들면, 각각 알킨 또는 아지드-함유 잔기를 사용한 관능화를 가능하게 하는 아지드 또는 알킨-그룹 함유 아미노산의 도입 또는 치환으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 아미노산 위치 1 및/또는 9에서 변형을 포함한다. 특히 티로신이 존재하는 경우, 이들 위치가 단백질 분해에 가장 감수성임을 나타내는 데이터가 본원에 제공된다.
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 변형된 유도체는 적합한 아미노-반응성 화학을 사용한 N-말단 변형 및/또는 적합한 카복시-반응성 화학을 사용한 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 N-말단 또는 C-말단 변형은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 세포독성제, 방사성킬레이트제 또는 발색단을 포함하는 효과기 그룹의 부가를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 변형된 유도체는 N-말단 변형을 포함한다. 추가의 실시형태에서, N-말단 변형은 N-말단 아세틸 그룹, 예를 들면, 본원에 개시된 17-69-07-N004를 포함한다. 이러한 실시형태에서, N-말단 시스테인 그룹(본원에서 Ci로서 지칭됨)은, N-말단 아세틸화되는 펩타이드 합성 동안 아세트산 무수물 또는 기타 적절한 시약으로 캡핑된다. 이러한 실시형태는 아미노펩티다제에 대한 잠재적 인식 지점을 제거하는 잇점을 제공하고 바이사이클릭 펩타이드의 분해 가능성을 회피한다.
대체 실시형태에서, N-말단 변형은 효과기 그룹의 접합 및 이의 표적에 대한 바이사이클릭 펩타이드의 효력의 유지를 촉진시키는 분자 스페이서 그룹, 예를 들면, Ala, G-Sar10-A 또는 bAla-Sar10-A 그룹의 부가를 포함한다. 바이사이클릭 펩타이드 17-69-07에 대한 이들 그룹의 부가가 표적 단백질에 대한 효력을 변경하지 않음을 나타내는 데이터가 본원에서 제공된다(표 11-12).
추가의 실시형태에서, 변형된 유도체는 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 실시형태에서, C-말단 변형은 아미드 그룹을 포함한다. 이러한 실시형태에서, C-말단 시스테인 그룹(이 그룹은 본원에서 Ciii으로서 지칭됨)은, C-말단 아미드화되는 분자를 유도하는 펩타이드 합성 동안 아미드로서 합성된다. 이러한 실시형태는 카복실 펩티다제에 대한 잠재적 인식 지점을 제거하는 잇점을 제공하고, 바이사이클릭 펩타이드의 단백질 분해에 대한 가능성을 감소시킨다.
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 분해 프로테아제에 의해 인식되지 않거나 표적 효력에 대해 어떠한 악영향도 갖지 않는 등배전자/등전자 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산이 선택될 수 있다.
대안적으로, 인접 펩타이드 결합의 단배질분해 가수분해가 형태적 및 입체학으로 저해되도록 구속된 (constrained) 아미노산 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산이 사용될 수 있다. 특히, 이들은 프롤린 유사체, 벌키한 측쇄, Cα-이치환된 유도체(예: 아미노이소부티르산, Aib) 및 사이클로 아미노산과 관련되고, 단일 유도체는 아미노-사이클로프로필카복실산이다.
한 가지 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기는 위치 4에서 치환된다. 다수의 비-천연 아미노산 잔기가 이 위치에서 허용되는 것을 나타내는 데이터가 본원에서 제공된다(표 8 참조). 추가의 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 4에 존재하는 것들은 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌; 사이클로헥실글리신, 페닐글리신; 3급-부틸글리신; 3,4-디클로로페닐알라닌; 사이클로헥실알라닌; 및 호모페닐알라닌으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 4에 존재하는 것들은 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌; 및 3,4-디클로로페닐알라닌으로부터 선택된다. 비변형된 야생형 서열과 비교하여 이들 치환이 친화성을 증강시켰음을 나타내는 데이터가 본원에서 제공된다(표 8 참조).
추가의 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 4에 존재하는 것들은 1-나프틸알라닌으로부터 선택된다. 이러한 치환이 야생형과 비교하여 친화성의 최대 증강 수준(7배 이상)을 나타내는 데이터가 본원에서 제공된다(표 8 참조).
한 가지 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기는 위치 9 및/또는 11에서 도입된다. 다수의 비-천연 아미노산 잔기가 이들 위치에서 허용되는 것을 나타내는 데이터가 본원에서 제공된다(표 9 참조).
추가의 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 9에 존재하는 것들은 4-브로모페닐알라닌, 펜타플루오로-페닐알라닌으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 11에 존재하는 것들은 3급-부틸글리신으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 9에 존재하는 것들은 4-브로모페닐알라닌으로부터 선택된다. Tyr9 단백질분해성 인식 지점의 변화를 나타내는 데이터가 본원에서 제공된다(표 9 참조).
추가의 실시형태에서, 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 11에 존재하는 것들은 3급-부틸글리신으로부터 선택된다. 활성의 증강을 나타내고 입체적 장해에 의해 단백질분해성 가수분해로부터 인접 아미노산 골격을 강력하게 보호하는 데이터가 본원에서 제공된다(표 9 참조).
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 복수의 전술된 변형, 예를 들면, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 변형된 유도체는 하기 변형 중의 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상, 예를 들면, 하기 5개 변형 모두: 위치 1 및 5에서 D-알라닌, 위치 4에서 1-나프틸알라닌, 위치 9에서 4-브로모페닐알라닌 및 위치 11에서 3급-부틸글리신을 포함한다. 이러한 다-치환(17-69-07-N252; 17-69-07-N244 및 17-69-07-N255)이 야생형보다 우수한 효력으로 허용된다는 것을 나타내는 데이터가 본원에서 제공된다(표 10 내지 12 참조). 추가의 실시형태에서, 변형된 유도체는 하기 변형: 위치 1 및 5에서 D-알라닌, 위치 4에서 1-나프틸알라닌 및 위치 11에서 3급-부틸글리신을 포함한다. 이러한 다-치환(17-69-07-N239)이 야생형보다 우수한 효력으로 허용된다는 것을 나타내는 데이터가 본원에서 제공된다(표 11 참조).
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 스페이서 그룹의 부가를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 변형된 유도체는 N-말단 시스테인(Ci) 및/또는 C-말단 시스테인(Ciii)에 대한 스페이서 그룹의 부가를 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 산화 감수성 아미노산 잔기의 하나 이상의 산화 내성 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 변형된 유도체는 트립토판 잔기의 나프틸알라닌 또는 알라닌 잔기로의 치환을 포함한다. 이러한 실시형태는 수득되는 바이사이클릭 펩타이드 리간드의 약제학적 안정성 프로파일을 개선시키는 잇점을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기의 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 대체 실시형태에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기의 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 하전된 아미노산 잔기 대 소수성 아미노산 잔기의 정확한 평형은 바이사이클릭 펩타이드 리간드의 중요한 특징이다. 예를 들면, 소수성 아미노산 잔기는 혈장 단백질 결합의 정도 및 따라서 혈장 중의 자유 이용가능한 분획의 농도에 영향을 미치는 반면, 하전된 아미노산 잔기(특히 아르기닌)은 세포 표면 상의 인지질 막과 펩타이드의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 2개는 조합하여 펩타이드 약물의 반감기, 분포 용적 및 노출에 영향을 미칠 수 있고, 임상 종점에 따라 조정할 수 있다. 또한, 하전된 아미노산 잔기 대 소수성 아미노산 잔기의 정확한 조합 및 수는 주입 부위에서 자극을 감소시킬 수 있다(펩타이드 약물이 피하 투여되는 경우).
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 L-아미노산 잔기의 하나 이상의 D-아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 이러한 실시형태는 β-턴 형태 (β-turn conformation)를 안정화시키기 위해 입체 장해 및 D-아미노산의 성향에 의해 단백질분해 안정성을 증가시키는 것으로 생각된다[참조: Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418].
추가의 실시형태에서, 위치 1에서 아미노산 잔기는 D-아미노산 잔기, 예를 들면, D-알라닌 대신 치환된다. 후속 분해 없이 효력의 유지를 입증하는 데이터가 본원에서 제공된다(표 6 참조).
추가의 실시형태에서, 위치 5에서 아미노산 잔기는 D-아미노산, 예를 들면, D-알라닌 또는 D-아르기닌 대신 치환된다. 후속 분해 없이 효력의 유지를 입증하는 데이터가 본원에서 제공된다(표 7 참조).
한 가지 실시형태에서, 변형된 유도체는 임의의 아미노산 잔기의 제거 및 알라닌으로의 치환을 포함한다. 이러한 실시형태는 잠재적 단백질분해 공격 부위(들)을 제거하는 잇점을 제공한다.
각각의 상술된 변형은 펩타이드의 효력 또는 안정성을 의도적으로 개선시키도록 작용한다. 변형에 기반한 추가의 효력 개선은 하기 메카니즘을 통해 달성될 수 있다:
- 보다 높은 친화성이 달성되도록, 소수성 효과를 이용하고 보다 낮은 오프(off) 속도를 유도하는 소수성 모이어티의 도입;
- 보다 빠른 속도 및 보다 높은 친화성을 유도하는 장거리 이온성 상호작용을 이용하는 하전된 그룹의 도입[참조: Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31]; 및
- 예를 들면, 엔트로피의 손실이 표적 결합시에 최소이도록 아미노산의 측쇄를 정확하게 구속함으로써, 엔트로피의 손실이 표적 결합시에 최소이도록 골격의 비틀림 각을 구속함으로써 및 동일한 이유로 분자 내에 추가 고리화를 도입함으로써 펩타이드 내로 추가 구속의 도입.
(검토를 위한 문헌[참조: Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, and Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418]).
동위체 변화
본 발명은 본 발명의 모든 약제학적으로 허용되는 (방사선) 동위체-표지된 화합물, 즉, 하나 이상의 원자는 동일한 원자 번호를 갖는 원자로 치환되지만, 원자량 또는 질량수가 통상 자연에서 발견되는 원자량 또는 질량수와 상이한 화학식 I의 화합물, 및 관련 (방사선) 동위체를 보유할 수 있는 금속 킬레이트 그룹("효과기"로서 지칭됨)이 부착되어 있는 화학식 I의 화합물, 및 특정 관능기가 관련 (방사선) 동위체 또는 동위체 표지된 관능기로 공유 치환되어 있는 화학식 I의 화합물을 포함한다.
본 발명의 화합물에 포함하기에 적합한 동위체의 예는 수소의 동위체, 예를 들면, 2H (D) 및 3H (T), 탄소, 예를 들면, 11C, 13C 및 14C, 염소, 예를 들면, 36Cl, 불소, 예를 들면, 18F, 요오드, 예를 들면, 123I, 125I 및 131I, 질소, 예를 들면, 13N 및 15N, 산소, 예를 들면, 150, 170 및 180, 인, 예를 들면, 32P, 황, 예를 들면, 35S, 구리, 예를 들면, 64Cu, 갈륨, 예를 들면, 67Ga 또는 68Ga, 이트륨, 예를 들면, 90Y 및 루테티움, 예를 들면, 177Lu, 및 비스무트, 예를 들면, 213Bi를 포함한다.
특정 동위체-표지된 화학식 I의 화합물, 예를 들면, 방사활성 동위체를 도입한 것들은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용하고, 종양 등의 발병 조직 상의 MT1-MMP 표적의 존재 및/또는 부재를 임상적으로 평가하는데 유용하다. 화학식 I의 화합물은, 이들이 표지된 화합물과 기타 분자, 펩타이드, 단백질 효소 또는 수용체와의 복합체의 형성을 검출 또는 동정하기 위해 사용될 수 있다는 점에서 유용한 진단적 특성을 추가로 가질 수 있다. 검출 또는 동정 방법은 방사성동위체, 효소, 형광 물질, 발광 물질(예: 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 아에쿠오린 및 루시퍼라제) 등의 표지제로 표지되는 화합물을 사용할 수 있다. 방사활성 동위체 트리티움, 즉 3H (T) 및 탄소-14, 즉 14C는 도입 용이성 및 용이한 검출 수단에 비추어 이러한 목적에 특히 유용하다.
중수소, 즉 2H(D)와 같은 보다 무거운 동위체에 의한 치환은, 보다 큰 대사 안정성으로부터 발생하는 특정한 치료 잇점, 예를 들면, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 용량 요건을 제공할 수 있고, 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다.
11C, 18F, 15O 및 13N 등의 양전자 방출 동위체에 의한 치환은 표적 점유율을 조사하기 위한 양전자 방출 토포그래피(PET) 연구에 유용할 수 있다.
64Cu, 67Ga, 68Ga 및 177Lu 등의 금속 킬레이트화 효과기 그룹 내로 동위체의 도입은 PET 또는 SPECT 영상화를 사용하여 종양 특이적 항원을 가시화하는데 유용할 수 있다. 특히, 이러한 생체내분포 데이터는 본원에서 실시예 3에 제공된다.
이로써 한정되는 것은 아니지만, 90Y, 177Lu 및 213Bi 등의 금속 킬레이트화 효과기 그룹 내로 동위체의 도입은 표적화 방사선요법의 옵션을 제공할 수 있고, 이에 의해 화학식 I의 금속-킬레이트-함유 화합물은 치료학적 방사성핵종을 표적 단백질 및 작용 부위로 운반한다.
화학식 I의 동위체-표지된 화합물은 일반적으로 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 통상의 기술 또는 이전에 사용된 비-표지된 시약 대신에 적절한 동위체-표지된 시약을 사용하는 첨부 실시예에 기재된 것들과 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다.
결합 활성
특이성은, 본원의 문맥에서, 표적과 유사한 속성을 제외하고 이의 동족 표적과 결합하거나 달리는 상호작용하는 리간드의 능력을 지칭한다. 예를 들면, 특이성은 인간 효소의 상호작용을 억제하지만 상이한 종의 상동성 효소의 상호작용을 억제하지 않는 리간드의 능력을 지칭할 수 있다. 본원에 기재된 접근법을 사용하여, 특이성은 조절, 즉 증가되거나 저하되어, 리간드가 의도된 표적의 상동체 또는 라파로그와 어느 정도 상호작용할 수 있게 한다. 특이성은 활성, 친화성 또는 결합활성과 동의어인 것으로 의도되지 않고, 이의 표적에 대한 리간드의 작용 효력(예를 들면, 결합 친화성 또는 억제 수준)은 이의 특이성과 반드시 관련되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 결합 활성은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 결합 검정으로부터 취한 정량적 결합 측정치를 지칭한다. 따라서, 결합 활성은 소정 표적 농도로 결합되는 펩타이드 리간드의 양을 지칭한다.
다중특이성은 2개 이상의 표적에 결합하는 능력이다. 전형적으로, 결합 펩타이드는, 이들의 형태학적 특성에 기인하여, 단일 표적, 예를 들면, 항체의 경우에 에피토프에 결합할 수 있다. 그러나, 예를 들면, 상기 언급된 바와 같이 당해 기술분야에 공지된 2개 이상의 표적; 이중 특이적 항체에 결합할 수 있는 펩타이드를 개발할 수 있다. 본 발명에서, 펩타이드 리간드는 2개 이상의 표적에 결합할 수 있고, 따라서 다중 특이적이다. 적합하게는, 이들은 결합은 2개의 표적에 결합하고, 이중 특이적이다. 결합은 독립적일 수 있고, 이는 펩타이드 상의 표적에 대한 결합 부위가 어느 하나 또는 다른 표적의 결합에 의해 구조적으로 방해되지 않는 것을 의미한다. 이 경우에, 두 표적은 독립적으로 결합할 수 있다. 보다 일반적으로, 어느 하나의 표적의 결합은 다른 표적의 결합을 적어도 부분적으로 저해할 것으로 예상된다.
이중 특이적 리간드와, 2개 관련된 표적을 포괄하는 특이성을 갖는 리간드 사이에는 기본적 차이가 있다. 첫번째 경우에, 리간드는 두 표적에 개별적으로 특이적이고, 특정 방식으로 각각과 상호작용한다. 예를 들면, 리간드 중의 제1 루프는 제1 표적에 결합할 수 있고, 제2 루프는 제2 표적에 결합할 수 있다. 두번째 경우에, 리간드는 비-특이적인데, 이는, 예를 들면, 양자에 공통적인 표적의 에피토프와 상호작용함으로써 2개 표적을 구별할 수 없기 때문이다.
본 발명의 문맥에서, 예를 들면, 표적 및 상동분자 (orthologue)와 관련하여 활성을 갖는 리간드는 이중특이적 리간드인 것이 가능하다. 그러나, 한 가지 실시형태에서, 리간드는 이중특이적이지 않지만, 이것이 표적 및 하나 이상의 상동분자 둘 다와 결합하도록 덜 정확한 특이성을 갖는다. 일반적으로, 표적 및 이의 상동분자 둘 다에 대해 선택되지 않은 리간드는 이중특이성에 대한 선택적 압력의 부재에 기인하여 이중특이성일 가능성이 낮다. 바이사이클릭 펩타이드에서 루프 길이는, 덜 관련된 상동체에 대해 높은 선택성을 유지하면서 양호한 표적 및 상동분자 교차-반응성이 수득될 수 있도록 조정된 결합 표면을 제공하는데 결정적일 수 있다.
리간드가 진정하게 이중특이성인 경우, 한 가지 실시형태에서, 리간드의 적어도 하나의 표적 특이성은 선택된 리간드 사이에서 일반적이고, 당해 특이성의 수준은 본원에 개시된 방법에 의해 조정될 수 있다. 제2 또는 추가의 특이성은 공유될 필요는 없고, 본원에 기재된 공정의 대상일 필요는 없다.
표적은, 펩타이드 리간드가 결합하거나 달리는 상호작용하는 분자 또는 이의 일부이다. 결합은 대부분 종류의 활성에 전제조건으로 보이고 자체로 활성일 수 있지만, 다른 활성도 상정된다. 따라서, 본 발명은 직접 또는 간접적으로 결합의 측정을 필요로 하지 않는다.
분자 스캐폴드는 하나 이상의 구조적 특징을 펩타이드에 부여하기 위해 복수의 점에서 펩타이드를 연결할 수 있는 임의의 분자이다. 바람직하게는, 분자 스캐폴드는, 스캐폴드 반응성 그룹으로서 지칭되는, 펩타이드에 대한 적어도 3개의 부착 점을 포함한다. 이들 그룹은 공유 결합을 형성하기 위해 펩타이드 상의 시스테인 잔기(Ci, Cii 및 Ciii)와 반응할 수 있다. 이들은 분자의 환원적 절단 및 동시 분해를 받는 디설파이드 결합을 단순히 형성하지 않고, 안정한 공유 티오에테르 결합을 형성한다. 분자 스캐폴드에 대한 바람직한 구조는 하기에 기재되어 있다.
분자 스캐폴드
분자 스캐폴드는, 예를 들면, 제WO 2009/098450호 및 본원에서 인용된 참조문헌, 특히 제WO 2004/077062호 및 제WO 2006/078161호에 기재되어 있다.
상기 문헌에 서술된 바와 같이, 분자 스캐폴드는 소분자, 예를 들면, 유기 소분자일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 분자 스캐폴드는 뉴클레오사이드, 당 또는 스테로이드 등의 천연 단량체일 수 있거나 이에 기반할 수 있다. 예를 들면, 분자 스캐폴드는 이량체 또는 삼량체 등의 이러한 속성의 짧은 중합체를 포함할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 분자 스캐폴드는 공지된 독성, 예를 들면, 낮은 독성의 화합물이다. 적합한 화합물의 예는 콜레스테롤, 뉴클레오티드, 스테로이드, 또는 타마제팜 등의 기존의 약물을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 분자 스캐폴드는 마크로분자일 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 분자 스캐폴드는 아미노산, 뉴클레오티드 또는 탄수화물로 이루어진 마크로분자이다.
한 가지 실시형태에서, 분자 스캐폴드는 공유 결합을 형성하기 위해 폴리펩타이드의 관능기(들)와 반응할 수 있는 반응성 그룹을 포함한다.
분자 스캐폴드는, 아민, 티올, 알콜, 케톤, 알데히드, 니트릴, 카복실산, 에스테르, 알켄, 알킨, 아지드, 무수물, 석신이미드, 말레이미드, 알킬 할라이드 및 아실 할라이드 등과 같이 펩타이드와의 결합을 형성하는 화학적 그룹을 포함할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 분자 스캐폴드는 트리스(브로모메틸)벤젠, 특히 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠("TBMB") 또는 이의 유도체를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 분자 스캐폴드는 2,4,6-트리스(브로모메틸)메시틸렌이다. 이 분자는 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠과 유사하지만, 벤젠 고리에 부착된 3개의 추가 메틸 그룹을 함유한다. 이는 추가의 메틸 그룹이 형성할 수 있는 잇점을 갖고, 폴리펩타이드와 추가로 접촉하고 따라서 추가의 구조적 구속을 부가한다.
본 발명의 분자 스캐폴드는 본 발명의 코딩된 라이브러리의 폴리펩타이드의 관능기가 분자 스캐폴드와의 공유 결합을 형성하게 하는 화학적 그룹을 함유한다. 상기 화학적 그룹은, 아민, 티올, 알콜, 케톤, 알데히드, 니트릴, 카복실산, 에스테르, 알켄, 알킨, 무수물, 석신이미드, 말레이미드, 아지드, 알킬 할라이드 및 아실 할라이드를 포함하는 광범위한 관능기로부터 선택된다.
시스테인의 티올 그룹과 반응하기 위해 분자 스캐폴드 상에 사용될 수 있는 스캐폴드 반응성 그룹은 알킬 할라이드(또는 할로게노알칸 또는 할로알칸으로 또한 명명됨)이다.
예는 브로모메틸벤젠(TBMB에 의해 예시된 스캐폴드 반응성 그룹) 또는 요오도아세트아미드를 포함한다. 화합물을 단백질 중의 시스테인에 선택적으로 커플링시키기 위해 사용되는 기타 스캐폴드 반응성 그룹은 말레이미드이다. 본 발명에서 분자 스캐폴드로서 사용될 수 있는 말레이미드의 예는 트리스-(2-말레이미도에틸)아민, 트리스-(2-말레이미도에틸)벤젠, 트리스-(말레이미도)벤젠을 포함한다. 셀레노시스테인은 또한 시스테인과 유사한 반응성을 갖고 동일한 반응을 위해 사용될 수 있는 천연 아미노산이다. 따라서, 시스테인이 언급되면, 문맥이 달리 시사하지 않는 한, 이는 셀레노시스테인을 치환하기 위해 전형적으로 허용된다.
효과기 및 관능기
본 발명의 추가의 양태에 따라, 하나 이상의 효과기 및/또는 관능기에 접합된 본원에 정의된 펩타이드 리간드를 포함하는 약물 접합체가 제공된다.
효과기 및/또는 관능기는, 예를 들면, 폴리펩타이드의 N 및/또는 C 말단, 폴리펩타이드 내의 아미노산, 또는 분자 스캐폴드에 부착할 수 있다.
적절한 효과기 그룹은 항체 및 이의 일부 또는 단편을 포함한다. 예를 들면, 효과기 그룹은, 하나 이상의 불변 영역 도메인에 추가하여, 항체 경쇄 불변 영역(CL), 항체 CH1 중쇄 도메인, 항체 CH2 중쇄 도메인, 항체 CH3 중쇄 도메인, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 효과기 그룹은 또한 항체의 힌지 영역을 포함할 수 있다(이러한 영역은 통상 IgG 분자의 CH1 및 CH2 도메인 사이에서 발견된다).
본 발명의 이러한 양태의 추가의 실시형태에서, 본 발명에 따르는 효과기 그룹은 IgG 분자의 Fc 영역이다. 유리하게는, 본 발명에 따르는 펩타이드 리간드-효과기 그룹은 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상 또는 7일 이상의 tβ 반감기를 갖는 펩타이드 리간드 Fc 융합체를 포함하거나 이들로 이루어진다. 보다 유리하게는, 본 발명에 따르는 펩타이드 리간드는 1일 이상의 tβ 반감기를 갖는 펩타이드 리간드 Fc 융합체를 포함하거나 이들로 이루어진다.
관능기는, 일반적으로, 결합 그룹, 다른 속성의 부착을 위한 반응성 그룹, 세포 내로 마크로사이클릭 펩타이드의 흡수를 보조하는 관능기 등을 포함한다.
세포 내로 투과하는 펩타이드의 능력은 세포내 표적에 대해 펩타이드를 효과적이도록 할 수 있다. 세포 내로 투과하는 능력을 갖는 펩타이드에 의해 접근될 수 있는 표적은 전사 인자, 세포내 신호전달 분자, 예를 들면, 티로신 키나제 및 아폽토시스 경로에 관여하는 분자를 포함한다. 세포의 투과를 가능하게 하는 관능기는 펩타이드 또는 분자 스캐폴드에 부가된 펩타이드 또는 화학적 그룹을 포함한다. 이들과 같은 펩타이드는, 예를 들면, 문헌[참조: Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, p821 ; Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637]에 기재된 바와 같이 VP22, HIV-Tat, 드로소필라(안테나페디아)의 호메오박스 단백질로부터 유래된다. 혈장 막을 통한 전좌에 효율적인 것으로 밝혀진 짧은 펩타이드의 예는 안테나페디아 단백질로부터의 16개 아미노산 페테트라틴 펩타이드[참조: Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444], 18개 아미노산 "모델 양친매성 펩타이드"[참조: Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127] 및 HIV TAT 단백질의 아르기닌 풍부 영역을 포함한다. 비-펩타이드 접근법은 생체분자에 용이하게 부착할 수 있는 소분자 유사체 또는 SMOC의 사용을 포함한다[참조: Okuyama et al (2007) Nature Methods Volume 4 p153]. 구아니디늄 그룹을 분자에 부가하는 기타 화학적 전략은 또한 세포 투과를 증강시킨다[참조: Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585]. 스테로이드 등의 소분자량 분자는 세포 내로의 흡수를 증강시키기 위해 분자 스캐폴드에 부가할 수 있다.
펩타이드 리간드에 부착될 수 있는 관능기의 한 부류는 항체 및 이의 결합 단편, 예를 들면, Fab, Fv 또는 단일 도메인 단편을 포함한다. 특히, 생체내에서 펩타이드 리간드의 반감기를 증가시킬 수 있는 단백질에 결합하는 항체가 사용될 수 있다.
다수의 세포 상에 존재하는 인테그린에 결합하는 RGD 펩타이드가 또한 도입될 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명에 따르는 펩타이드 리간드-효과기 그룹은 12시간 이상, 24시간 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상 또는 20일 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 tβ 반감기를 갖는다. 유리하게는, 본 발명에 따르는 펩타이드 리간드-효과기 그룹은 12 내지 60시간 범위의 tβ 반감기를 가질 것이다. 추가의 실시형태에서, 이는 1일 이상의 tβ 반감기를 가질 것이다. 추가의 실시형태에서, 이는 12 내지 26시간 범위일 것이다.
본 발명의 한 가지 특정 실시형태에서, 관능기는, 의학 관련의 금속 방사성동위체를 착화하기에 적합한 금속 킬레이트로부터 선택된다. 이러한 효과기는, 상기 방사성동위체와 착화되는 경우, 암 치료에 유용한 약제를 제공할 수 있다. 적합한 예는 DOTA, NOTA, EDTA, DTPA, HEHA, SarAr 등을 포함한다[참조: Targeted Radionuclide therapy, Tod Speer, Wolters/Kluver Lippincott Williams & Wilkins, 2011].
가능한 효과기 그룹은 또한 효소, 예를 들면, 펩타이드 리간드가 ADEPT에서 항체를 대체하는 경우, 효소/프로드럭 치료에서 사용하기 위한 카복시펩티다제 G2를 포함한다.
본 발명의 한 가지 특정 실시형태에서, 관능기는 약물, 예를 들면, 암 치료를 위한 세포독성제로부터 선택된다. 적합한 예는 옥살리플라틴, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로르암부실, 이포스파미드 뿐만 아니라 시스플라틴 및 카보플라티 등의 알킬화제; 퓨린 동족체 아자티오프린 및 머캅토퓨린 또는 피리미딘 동족체를 포함하는 항-대사산물; 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신 등의 빈카 알칼로이드를 포함하는 식물 알칼로이드 및 테르페노이드; 포도필로톡신 및 이의 유도체 에토포사이드 및 테니포사이드; 탁솔로서 최초 공개된 파클리탁셀을 포함하는 탁산; 캄프토테신을 포함하는 토포이소머라제 억제제; 이리노테칸 및 토포테칸, 및 암사크린, 에토포사이드, 에토포시드 포스페이트 및 테니포사이드를 포함하는 유형 II 억제제를 포함한다. 추가의 약제는 닥티노마이신(이는 신장 이식에 사용된다), 독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 칼리케아마이신 등을 포함하는 항종양 항생물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 가지 추가의 특정 실시형태에서, 세포독성제는 마이탄시노이드(예: DM1) 또는 모노메틸 오리스타틴(예: MMAE)으로부터 선택된다.
DM1은 마이탄신의 티올-함유 유도체이고 하기 구조를 갖는 세포독성제이다:
Figure pat00001
모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)는 합성 항신생물제이고, 하기 구조를 갖는다:
Figure pat00002
데이터는 DM1 또는 MMAE를 함유하는 독소에 접합된 펩타이드 리간드의 효과를 입증하는 실시예 4 및 5에서 본원에 제공된다.
한 가지 실시형태에서, 세포독성제는 절단가능한 결합, 예를 들면, 디설파이드 결합 또는 프로테아제 감수성 결합에 의해 바이사이클릭 펩타이드에 연결된다. 추가의 실시형태에서, 디설파이드 결합에 인접한 그룹은 디설파이드 결합의 장해, 및 이에 의해 세포독성제의 절단 및 동시 방출의 비율을 조절하기 위해 변형된다.
공개된 연구는 입체 장해를 디설파이드 결합의 어느 측면에 도입함으로써 환원에 대한 디설파이드 결합의 감수성을 변형시키기 위한 가능성을 확립했다[참조: Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717]. 보다 큰 입체 장해 정도는 세포내 글루타티온 및 또한 세포외 (전신적) 환원제에 의한 환원 속도를 감소시키고, 결과적으로 세포의 내부 및 외부 둘 다에서 독소가 방출되는 용이성을 감소시킨다. 따라서, 순환시에 디설파이드 안정성의 최적 선택(이는 독소의 바람직하지 않은 부작용을 최소화한다) 대 세포내 환경에서 효율적 방출(이는 치료 효과를 최대화한다)은 디설파이드 결합의 어느 측면에서 장해 정도를 신중하게 선택함으로써 달성할 수 있다.
디설파이드 결합의 어느 측면에서의 장해는 분자 작제물의 표적화 속성(여기서, 바이사이클릭 펩타이드) 또는 독소 측면 상에 하나 이상의 메틸 그룹을 도입함으로써 조절된다.
따라서, 한 가지 실시형태에서, 세포독성제는 화학식 II의 화합물로부터 선택된 마이탄시노이드이다:
[화학식 II]
Figure pat00003
상기 화학식 II에서,
n은 1 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1-6 알킬 또는 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 그룹을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 C1-6 알킬은 1 내지 6개의 탄소원자를 각각 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소 그룹을 지칭한다. 이러한 그룹의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸 또는 헥실 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로사이클릴" 및 "카보사이클릴"은, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 방향족 및 비-방향족 고리 시스템 둘 다를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 용어 "헤테로사이클릴 그룹" 및 "카보사이클릴 그룹"은 이들의 범위 내에 방향족, 비-방향족, 불포화, 부분 포화 및 완전 포화 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 고리 시스템을 포함한다. 일반적으로 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 이러한 그룹은 모노사이클릭 또는 바이사이클릭(융합된 및 브릿징된 바이사이클릭 그룹 포함)일 수 있고, 예를 들면, 3 내지 12개의 고리 원, 보다 통상적으로 5 내지 10개의 고리 원을 함유할 수 있다.
화학식 II의 화합물의 한 가지 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 메틸을 나타낸다.
화학식 II의 화합물의 한 가지 실시형태에서, n은 1을 나타내고, R1 및 R2는 둘 다 수소를 나타낸다(즉, 마이탄신 유도체 DM1).
화학식 II의 화합물의 대체 실시형태에서, n은 2를 나타내고, R1은 수소를 나타내고, R2는 메틸 그룹을 나타낸다(즉, 마이탄신 유도체 DM3).
화학식 II의 화합물의 한 가지 실시형태에서, n은 2를 나타내고, R1 및 R2는 둘 다 메틸 그룹을 나타낸다(즉, 마이탄신 유도체 DM4).
화학식 II의 세포독성제가 디설파이드 결합을 형성할 수 있고, 화학식 I의 바이사이클릭 펩타이드와의 접합체 구조에서, 티올-독소(II) 및 티올-바이사이클 펩타이드(III) 사이의 디설파이드 결합성이 몇몇 가능한 합성 반응식을 통해 도입된다는 것은 자명하고, 이중 2개는 반응식 II 또는 반응식 III에 기재된다.
한 가지 실시형태에서, 접합체의 바이사이클릭 펩타이드 성분은 화학식 III에 제시된 구조를 갖는다:
[화학식 III]
Figure pat00004
상기 화학식 III에서,
m은 0 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고,
R3 및 R4는 독립적으로 수소, C1-6 알킬 또는 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 그룹을 나타낸다.
화학식 III의 화합물의 한 가지 실시형태에서, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 메틸을 나타낸다.
R3 및 R4가 둘 다 수소인 화학식 III의 화합물은 비-장해된 것으로 간주되고, R3 및 R4 중의 하나 또는 전부가 메틸을 나타내는 화학식 III의 화합물은 장해된 것으로 간주된다.
화학식 III의 바이사이클릭 펩타이드가 디설파이드 결합을 형성할 수 있고, 화학식 II의 세포독성제와의 접합체 구조에서, 티올-독소(II)와 티올-바이사이클 펩타이드(III) 사이의 디설파이드 결합성이 몇몇 가능한 합성 반응식을 통해 도입된다는 것은 자명하고, 이중 하나는 반응식 II에 기재되어 있다.
한 가지 실시형태에서, 세포독성제는 화학식 IV에 정의된 링커에 의해 바이사이클릭 펩타이드에 연결된다:
[화학식 IV]
Figure pat00005
상기 화학식 IV에서,
R1, R2, R3 및 R4는 수소, C1-6 알킬 또는 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 그룹을 나타내고;
독소는 임의의 적합한 세포독성제를 나타내고;
바이사이클은 본원에 정의된 임의의 적합한 바이사이클릭 펩타이드를 나타내고;
n은 1 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고;
m은 0 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타낸다.
한 가지 실시형태에서, R1, R2, R3 및 R4는 수소 또는 메틸을 나타낸다.
R1, R2, R3 및 R4가 각각 수소인 경우, 디설파이드 결합은 최저로 장해되고, 환원에 대해 최대로 감수성이다. R1, R2, R3 및 R4가 각각 메틸인 경우, 디설파이드 결합은 최대로 장해되고 환원에 대해 최저로 감수성이다. 수소 및 메틸의 부분 치환은 환원에 대한 내성의 점증 및 독소의 동시 절단 및 방출을 가져온다.
한 가지 실시형태에서, 화학식 IV의 독소는 마이탄신이고, 접합체는 화학식 V의 화합물을 포함한다:
[화학식 V]
Figure pat00006
상기 화학식 V에서,
R1, R2, R3 및 R4는 수소, C1-6 알킬 또는 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 그룹을 나타내고;
바이사이클은 본원에 정의된 임의의 적합한 바이사이클릭 펩타이드를 나타내고;
n은 1 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고;
m은 0 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타낸다.
화학식 V의 추가의 실시형태에서, n은 1을 나타내고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 수소를 나타내는, 즉 화학식 Va의 화합물이다:
[화학식 Va]
Figure pat00007
화학식 Va의 BDC는 BT17BDC-17로서 공지되어 있다. BDC BT17BDC-17에서 비-장해된 디설파이드는 BT17BDC-9의 등가물이고, 이에 의해 차이는 바이사이클릭 펩타이드 부분에 존재하고: BT17BDC-9는 비-안정화된 서열(17-69-07-N219)을 사용하는 반면, BT17BDC-17은 독소-디설파이드 작제물에 아미드-결합되는 안정화된 바이사이클릭 펩타이드 대응물(17-69-07-N241)을 사용한다. n=1을 갖는 마이탄신의 이러한 비-장해된 유도체는 DM1로 지칭된다.
화학식 V의 화합물의 추가의 실시형태에서, n은 1을 나타내고, R1은 메틸을 나타내고, R2, R3 및 R4가 각각 수소를 나타내는, 즉 화학식 Vb의 화합물이다:
[화학식 Vb]
Figure pat00008
화학식 Va의 BDC는 BT17BDC-18로서 공지되어 있고, 바이사이클릭 펩타이드 측면에 단일 장해 메틸 그룹을 함유하고, 항체 약물 접합체 문맥에서 디티오트레이톨과 같은 환원제에 대한 이의 감수성의 7배 감소를 생성한다(비-장해된 디설파이드와 비교하여)[참조: Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717]. 환원에 대한 감소된 감수성은 보다 낮은 독소 방출 속도와 상관된다. n=1을 갖는 마이탄신의 이러한 비-장해된 유도체는 DM1로서 지칭된다. BT17BDC-18은 독소-디설파이드 작제물에 아미드-결합되는 안정화된 바이사이클릭 펩타이드 대응물(17-69-07-N241)을 사용한다.
화학식 V의 화합물의 추가의 실시형태에서, n은 2를 나타내고, R1 및 R2 둘 다는 수소를 나타내고, R3 및 R4 둘 다는 메틸을 나타내는, 즉 화학식 Vc의 화합물이다:
[화학식 Vc]
Figure pat00009
화학식 Vc의 BDC는 BT17BDC-19로서 공지되어 있고, 마이탄신 측면에 2개의 장해 메틸 그룹을 함유하고, 항체 약물 접합체 문맥에서 디티오트레이톨 등의 환원제에 대한 이의 감수성의 14배 감소를 생성한다. 환원에 대한 감소된 감수성은 보다 낮은 독소 방출 속도와 상관된다. n=2를 갖는 마이탄신의 이러한 장해된 유도체는 DM4로서 지칭된다. BT17BDC-19는 독소-디설파이드 작제물에 아미드-결합되는 안정화된 바이사이클릭 펩타이드 대응물(17-69-07-N241)을 사용한다.
화학식 V의 화합물의 추가의 실시형태에서, n은 2를 나타내고, R1 및 R3 둘 다는 메틸을 나타내고, R2 및 R4는 수소를 나타내는, 즉 화학식 Vd의 화합물이다:
[화학식 Vd]
Figure pat00010
화학식 Vd의 BDC는 BT17BDC-20로서 공지되어 있고, 마이탄신 측면에 하나의 장해 메틸 그룹 및 바이사이클 펩타이드 측면에 하나의 메틸 그룹을 함유하고, 항체 약물 접합체 문맥에서 디티오트레이톨 등의 환원제에 대한 이의 감수성의 170배 감소를 생성한다. 환원에 대한 감소된 감수성은 보다 낮은 독소 방출 속도와 상관된다. n=2를 갖는 마이탄신의 이러한 장해된 유도체는 DM3으로 지칭된다. BT17BDC-20은 독소-디설파이드 작제물에 아미드-결합되는 안정화된 바이사이클릭 펩타이드 대응물(17-69-07-N241)을 사용한다.
실제로, 항체 약물 접합체의 문맥에서, 동물 모델에서 효과 대 인용성 (tolerability)의 균형은 이의 최적이 장해의 일부 수준, 즉 BT17BDC-19에 또한 존재하는 DM4의 것과 연관됨을 나타냈다[참조: Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717].
한 가지 실시형태에서, 접합체는 BT17BDC-9, BT17BDC-17(화학식 Va의 화합물), BT17BDC-18(화학식 Vb의 화합물), BT17BDC-19(화학식 Vc의 화합물) 및 BT17BDC-20(화학식 Vd의 화합물)으로부터 선택된다. 데이터는 BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20의 유리한 특성을 입증하는 실시예 5 및 표 16 및 17에 제공된다.
추가의 실시형태에서, 접합체는 BT17BDC-9, BT17BDC-17(화힉식 Va의 화합물), BT17BDC-18(화학식 Vb의 화합물) 및 BT17BDC-19(화학식 Vc의 화합물)로부터 선택된다. 데이터는 이들 접합체가 표적화된 암 치료에서 사용하기 위한 적합한 분자로서 간주됨을 입증하는 실시예 5 및 표 16 및 17에 제공된다.
추가의 실시형태에서, 접합체는 BT17BDC-17(화학식 Va의 화합물), BT17BDC-18(화학식 Vb의 화합물) 및 BT17BDC-19(화학식 Vc의 화합물)로부터 선택된다. 데이터는 이들 접합체가 표적화된 암 치료에서 사용하기 위한 적합한 분자로서 간주되고 유효 효율적 용량에서 허용되는 것을 입증하는 실시예 5 및 표 16 및 17에 제공된다.
합성
본 발명의 펩타이드는 표준 기술에 의해, 이어서 시험관내에서 분자 스캐폴드와의 반응에 의해 합성적으로 제조할 수 있다. 이를 수행하는 경우, 표준 화학을 사용할 수 있다. 이는 추가의 하류 실험 또는 검증을 위한 가용성 물질의 신속한 대규모 제조를 가능하게 한다. 이러한 방법은 문헌[참조: Timmerman et al (supra)]에 개시된 것과 같은 통상의 화학을 사용하여 달성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같이 선택된 폴리펩타이드 또는 접합체의 제조에 관한 것이고, 여기서 제조는 하기 설명된 바와 같은 임의의 추가 단계를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 이들 단계는 화학적 합성에 의해 제조된 최종 생성물 폴리펩타이드/접합체에 대해 수행된다.
임의로, 목적하는 폴리펩타이드 중의 아미노산 잔기는 접합체 또는 복합체를 제조할 때에 치환될 수 있다.
펩타이드는 또한, 예를 들면, 또 다른 루프를 도입하고 따라서 다중 특이성을 도입하기 위해 확장할 수 있다.
펩타이드를 확장하기 위해, 이는 표준 고상 또는 액상 화학을 사용하는 직교적으로 보호된 리신(및 유사체)을 사용하여 이의 N-말단 또는 C-말단에서 또는 루프 내에서 화학적으로 간단히 확장할 수 있다. 표준 (생물) 접합 기술을 사용하여 활성화된 또는 활성화가능한 N- 또는 C-말다을 도입할 수 있다. 대안적으로, 부가는, 예를 들면, 문헌[참조: Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779]에 기재된 바와 같은 단편 축합 또는 천연 화학적 결찰에 의해, 또는 문헌[참조: Chang et al Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20; 91 (26): 12544-8 또는 Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003]에 기재된 바와 같은 서브틸리가제를 사용하는 효소에 의해 이루어질 수 있다.
대안적으로, 펩타이드는 디설파이드 결합을 통한 추가 접합에 의해 확장 또는 변형될 수 있다. 이는 제1 및 제2 펩타이드가 일단 세포의 환원 환경 내에서 서로로부터 해리하는 것을 가능하게 하는 추가 잇점을 갖는다. 이 경우에, 분자 스캐폴드(예: TBMB)은 3개 시스테인 그룹과 반응하도록 제1 펩타이드의 화학적 합성 동안 부가될 수 있고; 이어서 추가의 시스테인 또는 티올은, 이러한 시스테인 또는 티올이 제2 펩타이드의 유리 시스테인 또는 티올과 반응했을 때에만 디설파이드-연결된 바이사이클릭 펩타이드-펩타이드 접합체를 형성하도록 제1 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 부가될 수 있다.
유사한 기술을 2개 바이사이클릭 및 이중특이적 마크로사이클의 합성/커플링에 동등하게 적용하여 잠재적으로 사특이적 분자를 생성한다.
추가로, 기타 관능기 또는 효과기 그룹의 부가는 적절한 화학, N- 또는 C-말단에서 또는 측쇄를 통한 커플링을 사용하여 동일한 방식으로 달성할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 커플링은 어느 하나의 속성의 활성을 차단하지 않는 방식으로 수행된다.
본 발명의 추가 양태에 따라서, 반응식 I, II 또는 III 중의 어느 하나에 기재된 합성 경로를 포함하는 본원에 정의된 약물 접합체를 제조하는 방법이 제공된다.
약제학적 조성물
본 발명의 추가 양태에 따라서, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 리간드 또는 약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일반적으로, 본 발명의 펩타이드 리간드는 약리학적으로 적절한 부형제 또는 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 전형적으로, 이들 부형제 또는 담체는 염수 및/또는 완충된 매질을 포함하는 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨 및 락테이트화 링거액을 포함한다. 적합한 생리학적으로 허용되는 애주번트는, 필요한 경우, 현탁액에 폴리펩타이드 복합체를 유지하기 위해, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트 등의 증점제로부터 선택될 수 있다.
정맥내 비히클은 링거 덱스트로즈에 기반한 것들과 같이 유체 및 영양 보충제 및 전해질 보충제를 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 삽입 가스가 또한 존재할 수 있다[참조: Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition].
본 발명의 펩타이드 리간드는 별도로 투여되는 조성물로서 또는 기타 제제와 조합하여 사용할 수 있다. 이들은 항체, 항체 단편 및 다양한 면역치료 약물, 예를 들면, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티늄 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 리간드와 조합하여 다양한 세포독성제 또는 기타 약제의 "칵테일", 또는 상이한 특이성을 갖는 본 발명에 따르는 선택된 폴리펩타이드의 조합물, 예를 들면, 이들이 투여 전에 풀링되든 간에, 상이한 표적 리간드를 사용하여 선택된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물의 투여 경로는 당해 기술분야의 숙련가에게 통상 공지된 임의의 것들일 수 있다. 제한 없이, 면역요법을 포함하는 치료를 위해, 본 발명의 펩타이드 리간드는 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피내, 폐 경로를 통해, 또는 적절하게는, 카테터에 의한 직접 주입을 포함하는 임의의 적절한 방식으로 이루어질 수 있다. 투여 용량 및 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 주치의에 의해 고려되는 금지 및 기타 파라미터에 의존할 것이다.
본 발명의 펩타이드 리간드는 저장을 위해 동결건조시킬 수 있고, 사용 전에 적합한 담체에서 재구성할 수 있다. 이러한 기술은 효과적 및 공지된 동결건조인 것으로 밝혀졌고, 재구성 기술을 사용할 수 있다. 동결건조 및 재구성이 상이한 정도의 활성 손실을 유도하고 당해 수준이 보상을 위해 상향 조절될 수 있음은 당해 기술분야의 숙련가에게 자명할 것이다.
본 발명의 펩타이드 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 투여할 수 있다. 특정한 치료 용도에서, 선택된 세포 모집단의 적어도 부분적 저해, 억제, 조절, 사멸 또는 일부 기타 측정가능한 파라미터를 달성하기 위한 적절한 양은 "치료학적 유효량"으로 정의된다. 이러한 용량을 달성하는데 필요한 양은 질환의 중증도 및 환자 자신의 면역계의 일반 상태에 의존하지만, 일반적으로 체중 kg당 선택된 펩타이드 리간드 0.005 내지 5.0mg의 범위이고, 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량의 용량이 통상 사용된다. 예방적 용도를 위해, 본 발명의 펩타이드 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 또한 유사하거나 약간 낮은 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명에 따르는 펩타이드 리간드를 함유하는 조성물은 포유동물에서 선택 표적 세포 모집단의 변화, 불활성화, 사멸 또는 제거를 보조하기 위해 예방적 및 치료적 설정으로 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 펩타이드 리간드는 세포의 이종성 수집으로부터 표적 세포 모집단을 사멸, 고갈 또는 달리는 효과적으로 제거하기 위해 체외 또는 시험관내 선택적으로 사용할 수 있다. 포유동물의 혈액은 선택된 펩타이드 리간드와 함께 체외에서 조합될 수 있고, 이에 의해 바람직하지 않은 세포는 사멸되거나 표준 기술에 따라 포유동물로 반송하기 위해 혈액으로부터 제거된다.
치료학적 용도
본 발명의 바이사이클릭 펩타이드는 막 유형 1 메탈로프로테아제(MT1-MMP, 또한 MMP14로서 공지됨)의 높은 친화성 결합제로서 특정의 유용성을 갖는다. MT1-MMP는, 직접적으로 몇몇 이의 성분을 분해함으로써 및 간접적으로 프로-MMP2를 활성화시킴으로써 세포외 매트릭스 재모델링에서 중요한 역할을 담당하는 막관통 메탈로프로테아제이다. MT1-MMP는 종양 혈관신생에 중요하고[참조: Sounni et al (2002) FASEB J. 16(6), 555-564], 다양한 고형 종양에서 과발현되고, 따라서 본 발명의 MT1-MMP-결합 바이사이클 펩타이드는 암, 특히 비-소세포 폐암의 표적화 치료에서 특히 유용하다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 바이사이클릭 펩타이드는 인간 MT1-MMP에 특이적이다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 바이사이클릭 펩타이드는 마우스 MT1-MMP에 특이적이다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 바이사이클릭 펩타이드는 인간 및 마우스 MT1-MMP에 특이적이다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 바이사이클릭 펩타이드는 인간, 마우스 및 개 MT1-MMP에 특이적이다.
본 발명의 방법에 따라 선택된 폴리펩타이드 리간드는 생체내 치료학적 및 예방학적 용도, 시험관내 및 생체내 진단적 용도, 시험관내 검정 및 시약 용도 등에서 사용될 수 있다. 선택된 수준의 특이성을 갖는 리간드는 교차-반응성이 바람직한 비-인간 동물에서의 시험을 수반하는 용도, 또는 상동체 또는 상동분자와의 교차-반응성이 신중하게 조절될 필요가 있는 진단적 용도에 유용하다. 백신 용도 등의 일부 용도에서, 소정 범위의 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 능력은 특정의 질환 및 병원체에 대한 백신을 조정하기 위해 이용될 수 있다.
적어도 90 내지 95% 상동성의 실질적으로 순수한 펩타이드 리간드가 포유동물에의 투여에 바람직하고, 98 내지 99% 또는 그 이상의 상동성이, 특히 포유동물이 인간인 경우, 약제학적 용도에 가장 바람직하다. 필요에 따라, 부분적으로 또는 균질성으로 정제되면, 선택된 폴리펩타이드는 진단학적으로 또는 치료학적으로(체외를 포함) 사용되거나, 검정 절차, 면역형광 염색 등을 개발 및 수행하는데 사용될 수 있다[참조: Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY].
본 발명의 펩타이드 리간드의 효과기 그룹 및 접합체는 전형적으로 암, 특히 비-소세포 폐암 등의 고형 종양을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용될 것이다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태에 따라서, 암, 특히 비-소세포 폐암 등의 고형 종양을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 펩타이드 리간드의 효과기 그룹 및 약물 접합체가 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, 본원에 정의된 펩타이드 리간드의 효과기 그룹 및 약물 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암, 특히 비-소세포 폐암 등의 고형 종양을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다.
치료(또는 억제)될 수 있는 암(및 이들의 양성 대응물)의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 상피 기원의 종양(선암, 편평상피암, 전이성 세포암 및 기타 암종을 포함하는 다양한 유형의 선종 및 암종), 예를 들면, 방광 및 요로관, 위장관(식도, 위장(위), 소장, 결장, 직장 및 항문을 포함), 간장(간세포 암종), 담낭 및 담도계, 외분비 췌장, 신장, 폐(예를 들면, 선암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 세기관지암 및 중피종), 두경부(예를 들면, 혀, 구강, 후두, 인두, 비인두, 편도선, 타액선, 비강 및 부비강의 암), 난소, 팔로피안 관, 복막, 질, 음부, 음경, 자궁경부, 자궁근종, 자궁내막, 갑상선(예를 들면, 갑상선 여포암), 부신, 전립선, 피부 및 부속기(예를 들면, 흑색종, 기저 세포암, 편평상피암, 각화세포종, 형성이상 난소); 혈액학적 악성종양(즉, 백혈병, 림파종) 및 전악성 혈액학적 장애, 및 혈액학적 악성종양 및 림파계의 관련 상태를 포함하는 경계성 악성종양의 장애(예를 들면, 급성 림파구성 백혈병[ALL], 만성 림파구성 백혈병[CLL], B-세포 림파종, 예를 들면, 광범위 B-세포 림파종[DLBCL], 여포성 림파종, 버킷 림파종, 맨틀 세포 림파종, T-세포 림파종 및 백혈병, 천연 킬러[NK] 세포 림파종, 호지킨 림파종, 모상 세포 백혈병, 불확실성의 모노클로날 감마글로불린병, 형질세포종, 다발성 골수종 및 이식후 림프구증식성 장애), 및 혈액학적 악성종양 및 골수계의 관련 상태(예를 들면, 급성 골수성백혈병[AML], 만성 골수성백혈병[CML], 만성 골수단구증[CMML], 호산구증가 증후군, 골수증식성 질환, 예를 들면, 진성 적혈구증가증, 본태성 혈소판혈증 및 원발성 골수섬유증, 골수증식성 증후군, 골수이형성 증후군 및 전골수구성 백혈병); 간엽 기원의 종양, 예를 들면, 연 조직, 골 및 연골의 육종, 예를 들면, 골육종, 섬유육종, 연골육종, 횡문근육종, 평활근육종, 지방육종, 혈관내종, 카포시육종, 유잉 육종, 활막 육종, 상피 육종, 위장 간질 종양, 양성 및 악성 종양, 및 피부 섬유아세포 증식 항진증; 중추신경계 및 말초신경계의 종양(예를 들면, 성상세포종, 신경교종 및 신경교아세포종, 수막종, 상의종, 송과체 종양 및 신경초종); 내분비 종양(예를 들면, 하수체 종양, 부신 종양, 도세포 종양, 부갑상선 종양, 카르시노이드 종양 및 갑상선의 수질암); 안 및 항문 종양(예를 들면, 망막아세포종); 생식 세포 및 영양아종(예를 들면, 기형종, 세미노마, 배아종, 포상기형 및 융모암); 및 소아 및 배 종양(예를 들면, 수아종, 신경아세포종, 빌름 종양 및 원시 신경외배엽 종양); 또는 악성종양에 감수성인 환자를 잔류시키는 증후군, 선천적 또는 기타 질환(예: 색소성 건피증)을 포함한다.
용어 "예방"에 대한 본원에서의 언급은 질환의 유도 전에 보호적 조성물의 투여를 포함한다. "억제"는 유도 사상 후에, 그러나 질환의 임상적 출현 전에 조성물의 투여를 지칭한다. "치료"는 질환 증상이 명백해진 후에 보호 조성물의 투여를 포함한다.
질환을 보호하거나 질환을 치료하는데 있어서 펩타이드 리간드의 유효성을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용가능하다. 동물 모델 시스템의 사용은, 동물 모델의 사용을 가능하게 하기 위해, 인간 및 동물 표적과 교차 반응할 수 있는 폴리펩타이드 리간드의 개발을 가능하게 하는 본 발명에 의해 용이해진다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 설명된다.
실시예
재료 및 방법
파지 선택
6×6 바이사이클 파지 라이브러리는 문헌[참조: Heinis et al (2009), Nat Chem Biol 5(7), 502-507, WO 2009/098450, WO 2013/050615 및 WO 2013/050616]에 기재된 바와 같이 생성했다. 파지 디스플레이 선택은 비오티닐화된 인간 MT1-MMP 헤모펙신 도메인에 대한 상기 6×6 파지 라이브러리를 사용하여 수행했다.
단백질 발현
MT1-MMP 헤모펙신-유사 반복체(또한 MT1-MMP 헤모펙신 도메인으로 공지됨), 인간 유전자로부터의 잔기 Cys319-Gly511은 pEXPR-IBA42 (IBA) 발현 벡터를 사용하여 분비된 N-말단 His6-태그된 가용성 단백질로서 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 발현 후, 단백질은 니켈-NTA 친화성 크로마토그래피, 이어서 겔 여과에 의해 정제하고, 순도는 SDS-PAGE에 의해 조사했다. 배치 대 배치 변동성은 또한 헤모펙신 도메인 결합 바이사이클의 존재/부재하에 형광 열 이동 실험에 의해 모니터링했다.
펩타이드 합성
펩타이드 합성은 MultiSynTech에 의한 펩타이드 장치 및 사이로(Syro) II 합성기로 제조된 심포니(Symphony) 펩타이드 합성기를 사용하여 Fmoc 화학에 기반한다. 표준 Fmoc-아미노산을 하기 측쇄 보호 그룹: Arg(Pbf); Asn(Trt); Asp(OtBu); Cys(Trt); Glu(OtBu); Gln(Trt); His(Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu); Trp(Boc); 및 Tyr(tBu)(Sigma)와 함께 사용했다(Sigma, Merck). 커플링 시약은 HCTU(Pepceuticals)이었고, 디이소프로필에틸아민(DIPEA, Sigma)을 염기로서 사용했고, 보호는 DMF(AGTC)에서 20% 피페리딘으로 달성했다. 합성은 0.37mmol/gr Fmoc-Rink 아미드 AM 수지(AGTC)를 사용하여 수행했고, Fmoc-아미노산은 4배 과량으로 사용했고, 염기는 아미노산에 대해 4배 과량으로 존재했다. 아미노산을 DMSO 중의 0.2M로, DMF 중의 0.4M HCTU, 및 N-메틸피롤리돈(Alfa Aesar) 중의 1.6M DIPEA에 용해시켰다. 조건은 커플링 반응물이 DMF 중의 20 내지 50% DMSO 사이에 함유되도록 하는 것이었고, 이는 고상 합성 동안 응집 및 결실을 감소시키고 수율을 증가시켰다. 커플링 시간은 일반적으로 30분, 및 탈보호 시간 2×5분이었다. Fmoc-N-메틸글리신(Fmoc-Sar-OH, Merck)은 1시간 동안 커플링시켰고, 하기 잔사를 위한 탈보호 및 커플링 시간은 각각 20분 및 1시간이었다. 합성 후, 수지를 디클로로메탄으로 세척하고, 건조시켰다. 지지체로부터 측쇄 보호 그룹의 절단은 3시간 동안 10mL의 95:2.5:2.5:2.5 v/v/v/w TFA/H20/iPr3SiH/디티오트레이톨을 사용하여 수행했다. 절단 후, 소비된 수지는 여과에 의해 제거하고, 여액은 -80℃로 냉각시킨 35mL 디에틸에테르에 첨가했다. 펩타이드 펠렛을 원심분리하고, 에테르성 상청액을 버리고, 펩타이드 펠렛을 냉각 에테르로 2회 더 세척했다. 이어서, 펩타이드를 5 내지 10mL 아세토니트릴-물에 재용해시키고, 동결건조시켰다. 작은 샘플은 질량 분광분석에 의해 조 생성물의 순도 분석을 위해 제거했다(MALDI-TOF, 어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems)의 Voyager DE). 동결건조 후, 펩타이드 분말은, 0.5mL의 1M 디티오트레이톨이 보충된 H2O 중의 10mL의 6M 구아니디늄 하이드로클로라이드에 용해시키고, C8 루나 예비 HPLC 컬럼(Phenomenex)에 부하했다. 용매(H2O, 아세토니트릴)은 0.1% 헵타플루오로부티르산으로 산성화시켰다. 구배는 길슨 예비 HPLC 시스템을 사용하는 15 내지 20mL/분의 유속에서 30 내지 70% 아세토니트릴 범위였다. 순수한 선형 펩타이드 물질(MALDI에 의해 동정됨)을 함유하는 분획을 조합하고, 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠(TBMB, Sigma)으로 변형시켰다. 이를 위해, 선형 펩타이드는 최대 약 35mL까지 H2O로 희석하고, 아세토니트릴 중의 약 500㎕의 100mM TBMB를 첨가하고, 반응을 H2O 중의 5mL의 1M NH4HCO3로 개시했다. 반응은 실온에서 약 30 내지 60분 동안 진행시키고, 반응이 완결되면(MALDI에 의해 판단) 동결건조시켰다. 동결건조 후, 변형된 펩타이드를 상기와 같이 정제하고, 루나 C8을 게미니(Gemini) C18 컬럼(Phenomenex)으로 대체하고 산을 0.1% 트리플루오로아세트산으로 변경했다. 정확한 TMB-변형된 물질을 함유하는 순수한 분획을 풀링하고, 동결건조시키고, 저장을 위해 -20℃에서 유지했다.
아미노산은, 달리 명시하지 않는 한, L-배열로 사용되었다.
DOTA를 보호된 전구체 DOTA(tBu)3(TCI, CAS 137076-54-1)을 사용하여 고상 펩타이드 합성 동안 펩타이드 쇄에 커플링시켰다.
비-천연 아미노산을 상기 기재된 일반 방법을 사용하여 펩타이드 서열 내로 도입했다.
본원에 사용된 비-천연 아미노산 전구체의 목록은 하기 표에 요약되어 있다.
약물동태학적 연구에 사용된 펩타이드를 물 중의 0.1% TFA로부터 동결건조시켜 TFA 염 또는 화합물의 유리 산을 수득했다.
17-69-07-N219를 전구체 바이사이클릭 펩타이드로서 사용한 BDC의 합성
2개의 바이사이클릭 약물 접합체(BDC)는 17-69-07-N219를 전구체 펩타이드로서 사용하여 합성했다. 활성화된 vcMMAE 또는 디설파이드-DM1 작제물(DMSO에 용해시킴)은 수성 조건(100 인산나트륨, pH 8) 중의 17-69-07-N219로 1.4배 과량으로 직접 접합시켰다(참조: 반응식 I 및 II). 농도는 9mg/mL 펩타이드 또는 그 이상이었다. 반응은 LC/MS로 수행하고, 3.5시간 후에 완료된 것으로 판단했다. 이는 C18 세미-예비 컬럼을 사용하여 표준 역상 정제에 의해 수행했다. 95% 초과 순도의 분획을 단리하고, 동결건조시켰다. 물질은 유리 독소의 측정가능한 양을 함유하지 않았다. 시험관내 및 생체내 연구를 위해, 동결건조된 분말을 농축 DMSO 스톡(100mg/mL)으로 용해시키고, 추가 사용을 위해 적절한 완충제에서 희석시켰다.
17-69-07-N241을 전구체 바이사이클릭 펩타이드로서 사용한 BDC의 합성
BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20의 합성을 위해, 디설파이드 마이탄시노이드의 하기 N-하이드록시 석신이미드 에스테르(NHS 에스테르)를 사용했다:
Figure pat00012
상기 화학식에서,
R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20에 대한 화학식 Va, Vb, Vc 및 Vd의 화합물에 대해 상기 기재된 바와 같다.
BT17BDC-18은 하기 및 반응식 III에 기재된 바와 같이 대체 경로를 통해 추가로 합성했다. 여기서, 17-69-07-N277은 17-69-07-N241을 DMSO에서 SPP(N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트)와 반응시켜 합성했다. 17-69-07-N241의 농도는 실온에서, SPP의 1.3배 과량 및 디이소프로필에틸아민의 20배 과량으로, 10mM 이상이었다. 반응은 LCMS에 의해 판단하여 1시간 후에 완료된 것으로 판단했다. 정제는 상기 기재된 바와 같이 역상에 의해 수행했다. 적절한 분획을 동결건조시켰다.
17-69-07-N277은 질소 가스 블랭킷하에 실온에서 21시간 동안 세미 수성 조건(2mM EDTA가 보충된 50% 디메틸아세트아미드 및 50% 100mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0)에서 1.15당량의 DM1(유리 티올로서)으로 디설파이드 교환시켰다. 반응 중의 17-69-07-N277의 농도는 10mM 이상이었다.
이는 C18 세미-예비 컬럼을 사용하는 표준 역상 정제를 수행했다. 95% 초과 순도의 분획을 단리하고, 동결건조시켰다. 물질은 유리 독소의 측정가능한 양을 함유하지 않았다. 시험관내 및 생체내 연구를 위해, 동결건조된 분말을 상기 기재된 바와 같이 수성 제형에 용해시키거나 적절한 완충제에 직접 용해시켰다.
MT1-MMP에 대한 바이사이클릭 결합제의 해리 속도 상수 측정
직접 결합 형광 편광(이방성) 검정
직접 결합 형광 편광 또는 이방성 검정은 이의 결합 파트너(여기서, MT1-MMP 헤모펙신 도메인)로 일정 농도의 형광 트레이서(여기서, 연구되는 플루오레세인화 바이사이클릭)를 적정하여 수행한다. 결합 파트너의 농도가 적정 동안 증가함에 따라, 편광 신호는 결합된 및 비결합된 물질의 분획에 비례하여 변화한다. 이는 정량적으로 해리 속도(Kd)의 측정을 가능하게 한다. 검정 데이터는 표준 리간드 결합 방정식을 사용하여 적합시킬 수 있다.
전형적으로, 트레이서의 농도는 이상적으로 트레이서:적정제 쌍의 Kd 미만이고, 선택된 농도는 통상 약 1nM 이하이다. 적정제(결합 파트너) 농도는 0.1nM 내지 통상 5μM까지 변화한다. 그 범위는 형광 편광의 최대 변화가 관찰될 수 있도록 선택된다. 사용된 완충제는 0.01% 트윈의 존재하에 인산염 완충된 염수이다. 실험은 흑색 384 웰 저-결합/저 용적 플레이트(Corning 3820)에서 작동하고, 형광 편광 신호는 BMG Pherastar FS 플레이트 판독기를 사용하여 측정했다.
본 명세서에서 지칭되는 형광 트레이서는 5,6-카복시플루오레세인을 사용하여 플루오레세인화된 바이사이클릭 펩타이드이다. 플루오레세인화는 펩타이드의 N-말단 아미노 그룹 상에서 수행할 수 있고, 이는 사르코신 스페이서(통상 Sar5)에 의해 바이사이클 코어 서열로부터 분리된다. 이는, N-말단 아미노 그룹이 펩타이드에 특유한 경우, Fmoc 고상 합성 동안 또는 합성 후(TBMB를 사용한 고리화 및 정제 후)에 수행할 수 있다. 플루오레세인화는 또한 C-말단, 통상 최초 C-말단 잔기로서 도입된 리신 상에서 수행할 수 있고, 이어서 이는 사르코신 스페이서(통상 Sar6)에 의해 바이사이클 코어 서열로부터 분리된다. 따라서, N-말단 트레이서는, C-말단 플루오레세인화된 작제물에 있어서 Fluo-Gly-Sar5-A(BicycleCoreSequence) 및 (BicycleCoreSequence)-A-Sar6-K(Fluo)로서 기재된 분자 포맷을 가질 수 있다.
실시예에 사용된 형광 트레이서는 A-(17-69)-A-Sar6-K(Fluo), A-(17-69-07)-A-Sar6-K(Fluo) 및 A-(17-69-12)-A-Sar6-K(Fluo)이다. 17-69 형광 펩타이드의 산성 성질로 인해, 이들은 통상 농축된 DMSO로서 제조되었고, 이로부터 희석물이 100mM 트리스 pH 8 완충제에서 제조되었다.
형광 편광(이방성)을 사용한 경쟁 검정
MT1-MMP 헤모펙신 도메인(PEX)에 대한 이들의 높은 친화성에 기인하여, 17-69-07 및 17-69-12의 플루오레세인화 유도체(각각 17-69-07-N040 및 17-69-12-N005로서 명시됨)은 경쟁 실험(검출을 위해 FP 사용)을 위해 사용될 수 있다. 여기서, PEX와 형광 PEX-결합 트레이서와의 예비형성된 복합체를 유리 비-플루오레세인화된 바이사이클릭 펩타이드로 적정한다. 모든 17-69-기반 펩타이드는 동일한 부위에서 결합할 것으로 예상되기 때문에, 적정제는 PEX로부터의 형광 트레이서를 치환할 것이다. 복합체의 해리는 정량적으로 측정할 수 있고, 표적 단백질에 대한 경쟁인자(적정제)의 Kd를 측정했다. 경쟁 방법의 잇점은 비-플루오레세인화된 바이사이클릭 펩타이드의 친화성이 정확하고 신속하게 측정될 수 있다는 것이다.
트레이서의 농도는 통상 Kd 이하(여기서, 1nM)이고, 결합 단백질(여기서, MT1-MMP의 헤모펙신)은 90% 초과의 트레이서가 결합되도록 15배 과량으로 존재한다. 후속적으로, 비-형광 경쟁인자 바이사이클릭 펩타이드(통상 바이사이클 코어 서열)은, 이것이 표적 단백질의 형광 트레이서를 치환하도록 적정된다. 트레이서의 치환을 측정하고, 형광 편광의 저하와 연관시킨다. 형광 편광의 저하는 비-형광 적정제와 결합된 표적 단백질의 분획에 비례하고, 따라서 표적 단백질에 대한 적정제의 친화성의 척도이다.
생 데이터는 형광 트레이서, 적정제 및 결합 단백질 사이의 평형을 기재하는 입방 방적의 분석적 해석에 적합시킨다. 적합은 표적 단백질에 대한 형광 트레이서의 친화성의 값을 필요로 하고, 이는 직접 결합 FP 실험(상기 섹션 참조)에 의해 별도로 측정할 수 있다. 곡선 적합은 Sigmaplot 12.0을 사용하여 수행하고, 지-신 왕(Zhi-Xin Wang)에 의해 기재된 방정식의 적응 버젼을 사용했다[참조: FEBS Letters 360 (1995) 111-114].
혈장 안정성 프로파일링
방법 #1:
이의 혈장-프로테아제 유도된 단편 뿐만 아니라 모 질량의 질량 분광분석 검출(MALDI-TOF, Voyager DE, Applied Biosystems)을 사용한 신속한 혈장 안정성 프로파일링 검정을 개발했다. 단편의 성질을 평가함으로써, 바람직한 절단 부위를 측정할 수 있다. 여기서, 1 내지 1.5mM 펩타이드 스톡(DMSO 중)을 마우스/랫트/인간 혈장으로 직접 희석시켜(Sera 랩, 시트레이트를 항응고제로 사용) 50μM 펩타이드의 최종 농도를 수득하고, 최대 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 5μL 샘플을 적절한 시점에서 취하고, -80℃에서 동결시켰다. 분석을 위해, 샘플을 해동시키고, 25μL의 3:3:1 아세토니트릴:메탄올:물과 혼합하고, 5분 동안 13k에서 원심분리했다. 5μL의 펩타이드-함유 상청액을 흡인하고, 아세토니트릴:H2O의 1:1 혼합물에서 30mM 중탄산암모늄과 혼합했다. 이어서, 1μL의 혼합물을 MALDI 플레이트 상에서 스폿팅하고, 건조시키고, 매트릭스(알파-시아노신남산, Sigma, 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 1:1 아세토니트릴:물 중의 포화 용액으로 제조됨)를 샘플(1μL) 위에 층상화하고, 건조시키고, MALDI TOF를 사용하여 분석했다. 이는 상이한 바이사이클 펩타이드 서열 사이의 혈장 안정성의 경쟁적 변화를 검출하도록 작용하고 바람직한 절단 부위를 측정하는 우수한 도구로 기능하는 정량적 검정임에 주목해야 한다.
방법 #2:
바이사이클릭 펩타이드의 혈장 안정성을 정량적으로 수득하기 위해, 펩타이드 스톡 용액(DMSO 중의 200μM)를 최종 농도가 10μM로 되도록 혈장(인간 또는 마우스)와 혼합했다. 40μL 샘플을 최대 8시간 동안 주기적으로 취하고, -80℃에서 동결시켰다. LC-MS 분석 전에, 샘플을 해동시키고, 3용적(여기서, 120μL)의 1:1 아세토니트릴/MeOH 물과 혼합했다. 유백색 현탁액을 1300rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 펩타이드-함유 상청액은, 기준으로 동일한 펩타이드의 혈장 추출된 표준 곡선을 사용하면서, Waters Xevo TQ-D 장치를 사용하여 이중/삼중 하전된 종 및 이의 MS/MS 단편에 대해 정량화한다. 혈장에서 분해의 반감기를 사용하여 분자의 비교 안정성을 평가했다.
마우스에서 17-69-07의 약물동태, 대사물의 동정
17-69-07-N004의 약물동태
마우스 약물동태는 바이사이클릭 펩타이드 17-69-04-N004를 사용하여 수득하고, 이는 1.19mg/mL 용액의 5mL/kg 볼루스로서 단일 정맥내로 5.925mg/kg 용량으로 12마리 수컷 CD1 마우스의 한 그룹에게 복용시켰다. 제형화된 용액은 100μL의 23.7mg/mL DMSO 스톡으로부터 제조했고, 이는 복용 직전에 1.9mL의 인산염 완충된 염수로 희석시켜, pH 7.4에서 PBS 중에 5% DMSO로 이루어진 비히클을 제공한다. 혈액 샘플은 복용후 0.08, 0.5, 1, 2 및 4시간에서 말단 마취 (terminal anaesthesia)하에 심장 천공을 통해 시점당 2마리 동물로부터 취하고, 혈장 생성을 위해 EDTA 튜브로 옮겼다. 혈장 샘플은 -20℃에서 즉시 동결시켰다. 분석을 위해, 샘플을 신속하게 해동시키고, 50μL 분취량을 3용적의 추출 용매(분석 내부 표준을 함유하는, 10mM 중탄산암모늄(pH 8), 아세토니트릴 및 메탄올의 2:9:9 혼합물)로 처리했다. 침전된 단백질은 원심분리에 의해 제거하고, 상청액은 LC-MS/MS에 의해 분석했다. 샘플의 정량화는 대조군 마우스 혈장에서 제조한 검량선을 참조하여 수행했다.
약물동태 파라미터는 슈미트 리서치 서비스(Summit Research Services)의 소프트웨어 팩키지 PK 솔루션 2.0을 사용하여 비-구분 분석에 의해 측정했다.
용어의 정의:
Cmax: 최대 측정 농도;
Tmax: 최대 농도가 측정된 시간;
AUC 0-t: 0분으로부터 최종 정량화가능한 데이터 점까지 혈장 약물 농도/시간 곡선하 면적; 및
AUC 0-∞: 종점 반감기에 기초하여 0분으로부터 최종 데이터 점을 초과하여 외삽한 혈장 약물 농도/시간 곡선하 면적.
마우스 혈장에서 바이사이클릭 펩타이드 대사산물의 동정
3개 혈장 샘플은 17-69-07-N004의 잠재적 마우스 생체내 대사산물의 분석을 위해 사용(0.5, 1 및 2시간)하는 것이 가능했다. 분석은 LTQ Orbitrap XL 질량 분광분석기로 HPLC-MS 및 HPLC-MS/MS에 의해 수행했다. 혈액 순환에서 펩타이드 대사산물을 탐색하는 접근법은 추정된 대사산물의 정확한 질량(10ppm 윈도우)을 계산하기 위한 것이었다(각각 루프 1 및/또는 루프 2의 절단을 위해 1 또는 2 물(+18, +36)의 첨가; 이어서 단일 아미노산의 손실 또는 루프 1 및/또는 루프 2로부터 아미노산 스트레치의 손실). 둘째, 수동 탐색은 전체 이온 크로마토그램을 블랭크 마우스 혈장과 비교하여 수행했다.
HT-1080 이종이식 마우스에서 BT17BDC-1 및 BT17BDC-9의 효과
피하 HT-1080 이종이식 종양을 보유하는 Balb/c 누드 마우스를 BDC 또는 비히클(PBS)로 처리했다. BDC는 2주 동안 매주 3회 복용시키고, 복용은 종양이 약 150 내지 200mm3으로 측정될 때에 개시했다. 마우스를 모니터링하고, 종양 용적 및 체중의 측정을 매주 3회 기록했다.
실시예 1: MT1-MMP 헤모펙신 도메인을 사용하여 높은 친화성을 갖는 바이사이클릭 펩타이드의 동정
바이사이클릭 펩타이드 파지 라이브러리를 생성하는 이미 확립된 방법을 사용하여, MT1-MMP의 인간 헤모펙신 도메인에 대해 선택을 수행했다. 연속 감소된 농도의 표적을 사용하여 천연 (naive) 라이브러리로부터 3회 선택 후, 서열분석을 결과물에 대해 수행했다. 바이사이클릭 펩타이드 17-69(CKNRGFGCEDFYDIC)(서열번호 16)은 가장 풍부한 서열 결과 중의 하나로서 동정되었고, 표적에 대한 정성적 결합은 알파스크린(Alphascreen)에 의해 확인했다.
3개의 작은 파지 라이브러리는 17 내지 69 서열의 3개 부분 각각의 전체 서열 범위를 제공하도록 생성했다. 이들 3개 라이브러리를 헤모펙신 단백질에 대해 2회 선택에 제공했다. 흥미롭게도, 가장 유망한 서열분석 결과는 5×6 바이사이클릭 펩타이드였고, 출발 라이브러리는 6×6 포맷의 것이었다. 표적 단백질에 대한 바이사이클릭 펩타이드의 보다 높은 친화성에 기인하여 보다 짧은 루프 길이가 선택될 가능성이 있다. 보다 짧은 루프 길이는 파지 라이브러리의 작제 동안 도입되는 부정확하게 합성된 프라이머로부터 발생한다.
주요 서열분석 결과는 펩타이드 17-69-07이었고, 이는 서열 CYNEFGCEDFYDIC (서열번호 2)를 갖는다.
5×6 포맷이 가장 실현적이고 5×6 결합제 사이의 구별이 필요했다는 관찰에 기반하여, 2개 이상의 라이브러리는 바이사이클릭 펩타이드 17-69-02, 17-69-03, 17-69-04 및 17-69-12를 생성한 제1 루프의 의도적 절단 (deliberate truncation)을 시험 생성했다. 이들은 도 8에 개시된 서열 내에 함유된다.
이들이 검정 상한에 도달함에 따라 결합 검정은 최상 결합제를 구별할 수 없지만, 특정 잔기의 경향이 관찰되었다.
가장 빈번하게 발생하는 서열은 알파 스크린을 사용한 헤모펙신 결합을 위해 검정했고, 모든 신호는 본래 17 내지 69 서열과 비교하여 높았다(표 1 참조):
모든 17-69-기반 친화성-성숙 클론이 검정 상한 (assay ceiling) 부근에 존재하는 신호를 생성했기 때문에, 표 1에 제시된 플롯은 최상 클론의 명백한 동정을 가능하게 하지 않는다. 따라서, 일부 펩타이드는 플루오레세인화 유도체(17-69, 17-69-07 및 17-69-12)로서 합성되었고, 직접 결합 형광 편광(FP) 실험을 위해 사용되었다. 여기서, 플루오레세인은 코어 서열의 N 또는 C-말단에서 바이사이클릭 서열로부터 링커(통상 Sar6)에 의해 분리된다(표 2).
직접 결합 형광 편광(FP) 실험의 결과
펩타이드 코드 분자 형태 FP 방법 트레이서 Kd (nM)
17-69-N004 A-(17-69)-A-Sar6-K(Fl) 직접
결합		 A-(17-69)-A-Sar6-K(플루오레세인) 692
17-69-02-N001 A-(17-69-02)-A 경쟁 A-(17-69-07)-A-Sar6-K(플루오레세인) 191
17-69-03-N001 A-(17-69-03)-A 경쟁 A-(17-69-07)-A-Sar6-K(플루오레세인) 16.7
17-69-12-N005 A-(17-69-12)-A-Sar6-K(Fl) 직접
결합		 A-(17-69-07)-A-Sar6-K(플루오레세인) 3.1
17-69-07-N040 A-(17-69-07)-A-Sar6-K(Fl) 직접
결합		 A-(17-69-07)-A-Sar6-K(플루오레세인) 0.52
17-69-07 및 17-69-12(17-69-07-N040 및 17-69-12-N005로서 표시됨)의 플루오레세인화 유도체는 각각 0.52 및 3.1nM 해리 속도로 강력한 결합을 나타냈다. 이들은 본래 비-성숙 17-69 서열(17-69-N004)과 비교하여 현저히 개선된다. 5×6 포맷을 함유하는 서열은 친화성 성숙 라이브러리의 문맥 내에서 높은 친화성을 유도한다.
MT1-MMP 헤모펙신 도메인(PEX)에 대한 이들의 높은 친화성에 기인하여, 17-69-07 및 17-69-12(각각 17-69-07-N040 및 17-69-12-N005으로 표시됨)의 플루오레세인화 유도체를 후속 경쟁 실험에 사용했다(검출을 위해 FP 사용). 여기서, PEX와 형광 PEX-결합 트레이서와의 예비-형성된 복합체를 유리 비-플루오레세인화 바이사이클릭 펩타이드로 적정한다. 모든 17-69-기반 펩타이드(보존된 제2 루프 모티프 CEDFYDIC 함유; 서열번호 17)가 동일한 부위에서 결합할 것으로 예상되기 때문에, 적정제는 PEX로부터 형광 트레이서를 치환할 것이다. 복합체의 해리는 정량적으로 측정할 수 있고, 경쟁인자(적정제)의 Kd를 측정했다. 경쟁 방법의 잇점은 비-플루오레세인화 바이사이클릭 펩타이드의 친화성을 정확하고 신속하게 측정할 수 있다는 것이다.
이러한 문맥에서, 17-69-07 및 17-69-12 코어 서열이 PEX에 대한 높은 친화성을 위해서만 기여한다는 것을 입증하는 것이 중요하다. 따라서, 펩타이드를 N 및 C-말단 알라닌을 갖는 변이체로서 합성했고, 이에 의해 파지 입자 상에 발현된 서열을 밀접하게 모방하지만, 플루오레세인화 작제물과 함께 사용된 Sar5/6 분자 스페이서를 결여한다.
경쟁 실험에 의해 측정된 친화성은 플루오레세인화 유도체로 수득한 것들과 거의 동일하고, 이는 코어 바이사이클릭 서열이 PEX에 대한 높은 친화성 결합에 관여하는 것을 명확하게 입증한다(표 3). 추가로, 플루오레세인화 작제물은 분자 스페이서 및 효과기 그룹(여기서, -A-Sar6-K(플루오레세인)로서)의 C-말단 연결이 허용되는 것을 나타낸다.
직접 결합 형광 편광(FP) 실험의 결과
펩타이드 코드 분자 포맷 서열 FP 방법 트레이서 Kd (nM)
17-69-07-N001 A-(17-69-07)-A ACYNEFGCEDFYDICA (서열번호 18) 경쟁 A-(17-69-12)-A-Sar6-K(플루오레세인) 1.65±0.29
17-69-12-N003 A-(17-69-12)-A ACMNQFGCEDFYDICA (서열번호 19) 경쟁 A-(17-69-07)-A-Sar6-K(플루오레세인) 3.7±2.52
실시예 2: 17-69-07 코어 서열의 단백질분해 안정화
17-69-07의 마우스 혈장 안정성
인간에서 치료학적 용도를 위해 및 동물 종에서 임상전 평가를 위해, 리드 바이사이클 펩타이드가 정맥내 투여 후의 순환에서 충분히 안정하다는 것은 적절하다. 적절한 안정성은 충분한 수준의 바이사이클 펩타이드가 이의 표적에 결합하고 이의 생물학적 기능을 발휘할 수 있도록 요구된다.
임상전 모델은 종종 마우스, 랫트, 래빗 및 시노몰구스 원숭이 등의 종을 사용한다. 최초의 예에서, 바이사이클릭 펩타이드 17-69-07-N219은 상기 기재된 방법(방법 #2)을 사용하여 마우스 혈장의 존재하에 안정성에 대해 평가했다. 바이사이클 코어 서열은 17-69-07 서열의 본래 천연 단백질원성 아미노산을 보유하고, 효과기 그룹의 접합에 사용되는 N-말단 분자 스페이서를 추가로 함유한다(서열: G-Sar10-ACYNEFGCEDFYDIC; 서열번호 20). PEX에 대한 17-69-07-N219의 친화성은 분자 스페이서의 존재에도 불구하고 보유되었다(Kd = 0.82nM).
이 화합물은 6시간의 반감기와 함께 생체외 마우스 혈장에서 적당한 안정성을 나타냈다(도 1 참조).
17-69-07에서 생체외/생체내 단백질분해 절단 부위의 동정
마우스 혈장에서 17-69-07-N219의 분해의 화학적 성질을 이해하기 위한 노력으로, 샘플을 임의의 잠재적 분해 생성물에 대한 MALDI-TOF를 사용하여 분석했다. 질량 스펙트럼은 티로신의 가능한 손실을 나타냈고, 이는 루프 1에서 Tyr1 및/또는 루프 2에서 Tyr9의 루프 개방(가수분해) 및 제거를 시사한다.
최소 바이사이클릭 펩타이드 17-69-07-N004(17-69-07의 최소 코어 바이사이클릭 펩타이드를 구성하는 Ac-CYNEFGCEDFYDIC(서열번호 2))를 사용한 마우스 약물동태(PK) 연구는 생체내 순환으로부터 클리어런스 (clearance) 및 제거 속도를 확립하기 위해 수행되었다. 수득되는 혈액 샘플은 17-69-07-N004의 임의의 잠재적 단백질분해 분해 생성물에 대해 혈장 샘플을 분석하기 위해 추가로 분석했다.
PK 프로파일은 도 2에 제시되어 있다.
17-69-07-N004의 약물동태 파라미터
PK 파라미터 평균
Cmax (ng/ml) 15789
Tmax (min) 5.0
분포 반감기(min) NC
제거 반감기(min) 14
AUC 0-t (μg/ml.min) 286
AUC 0-∞ (μg/ml.min) 286
AUC 0-∞에 기반한 분포 용적(L/kg) 0.4
AUC 0-∞에 기반한 클리어런스(ml/min/kg) 20.7
제거 반감기 회귀에 대한 시점(min) 5-60
NC: 한정된 데이터에 기인하여 계산되지 않음
표 4는 펩타이드가 14분의 제거 반감기를 갖고 20.7mL/min/kg에서 제거되는 것을 나타낸다. 클리어런스 속도는 마우스에서 관찰된 사구체 여과 속도보다 더 크고[요약: Qi et al, American Journal of Physiology - Renal Physiology (2004) Vol. 286 no. 3, F590-F596], 이는 상기 펩타이드가 추가의 수단, 예를 들면, 혈장 및 내피 프로테아제에 의해 유래된 단백질분해에 의해 정화되는 (is cleared) 것을 시사한다.
생체내 단백질분해가 클리어런스에 유의미하게 기여하는지를 대처하기 위해, t=0.5, 1 및 2시간에서 취한 혈장 샘플은 LC-MS/MS 기술을 사용하여 바이사이클 단편에 대한 표적화 분석에 제공했다.
다중 단백질분해 대사산물을 동정할 수 있고, 가장 강력한 신호를 갖는 단편은 내림 차순으로 하기에 수록되어 있다:
Ac-C i YNEFGC ii EDFYDIC iii (서열번호 2):
루프 1에서 YNE의 절제;
루프 1에서 YNEF의 절제(서열번호 21);
루프 1에서 YNEFG(서열번호 22)의 절제(전체 루프가 제거됨);
루프 1 및/또는 2에서 Y의 절제;
루프 2에서 YD의 절제;
루프 2에서 FYD의 절제;
루프 2에서 YDI의 절제; 및
루프 2에서 EDFYDI(서열번호 23)의 절제(전체 루프가 제거됨).
상부 3개 대사산물은 중간 신호 수준으로 존재하고, 나머지 단편은 미량에서만 검출가능하다.
종합하면, 생체외 및 생체내 대사산물 둘 다는 Tyr 1/9에서 또는 부근에서 최초의 절단에 집중하는 것으로 나타나고, 이어서 근방의 잔기의 연속적 제거를 수행한다. 이는 이의 전체에서 어느 하나의 루프 또는 두 루프의 제거를 궁극적으로 유도한다.
17-69-07 서열의 단백질분해 안정성 및 효력 증강
단백질분해 분해로부터 펩타이드 서열을 안정화하는 접근법은 다수 존재한다[참조: Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, and Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418, 및 WO 2009/098450, WO 2013/050615 및 WO 2013/050616]. 요약하면, 이들은, 프로테아제(들)에 대한 인식 지점, 절단 부위에서 아미노산 골격의 변화(즉, N-메틸화, 슈도 펩타이드 결합 등), 인접 결합의 입체 장애(즉, β-치환된 아미노산) 및 D-에난티오머 아미노산의 포함을 제공하는 아미노산의 치환을 포함한다. 이들 변형 중의 일부(즉, N-메틸화, D-아미노산)는, 이들이 절단 부위로부터 2개 잔기까지 배치되어 있는 경우에도, 가수분해로부터 단백질분해 절단 부위를 보호/차폐할 수 있다. 단백질분해 공격으로부터 서열을 보호하는 것은 비교적 단순 명쾌하지만, 표적 단백질에 대한 효력(및 특이성)을 현저히 변화시키지 않는 안정화 변화를 도입하는 것은 훨씬 더 곤란하다.
이전 섹션에 제시된 17-69-07의 생체외/생체내 단백질분해 분해 데이터로부터, Tyr1/9 및 인접한 잔기가 바이사이클릭 펩타이드의 안정화를 위한 잠재적 부위인 것은 명백하다. 펩타이드의 성공적 안정화를 평가하는 정량적 수단은 마우스 및 인간 혈장에서 이의 반감기의 증가에 의한 것이다.
최초의 예에서, 각각의 위치가 알라닌("알라닌 스캔"으로 명명됨)으로 치환된 17-69-07의 11개 유도체가 생성되었다. 이러한 유형의 정보는 특정 잔기의 효과적 기여 및 역할에 조언하고, 단백질분해 인식 지점을 잠재적으로 제거한다.
알라닌 스캔 결과
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N004
 Ac-(17-69-07) (야생형) C i YNEFGC ii EDFYDIC iii
(서열번호 2)		 2.47 ± 0.25
17-69-07-N014 Ac-(17-69-07) Ala1 3.8
17-69-07-N015 Ac-(17-69-07) Ala2 > 5000
17-69-07-N016 Ac-(17-69-07) Ala3 5.1
17-69-07-N017 Ac-(17-69-07) Ala4 34
17-69-07-N018 Ac-(17-69-07) Ala5 > 5000
17-69-07-N019 Ac-(17-69-07) Ala6 > 5000
17-69-07-N020 Ac-(17-69-07) Ala7 > 5000
17-69-07-N021 Ac-(17-69-07) Ala8 > 5000
17-69-07-N022 Ac-(17-69-07) Ala9 > 5000
17-69-07-N023 Ac-(17-69-07) Ala10 11.1
17-69-07-N024 Ac-(17-69-07) Ala11 8
17-69-07-N004는 캡핑된 N-말단(N-말단 아세틸화, "Ac"로 명명됨)을 함유하는 야생형 비변형된 펩타이드이다. 일부 Ala 치환체는 특히 서열 내의 위치 1, 3, 4, 10 및 11에서 충분히 허용된다. 이들 잔기의 측쇄는 표적에 대한 높은 친화성 결합에 요구되지 않기 때문에, 이들 특정 서열 위치에서 화학식 I의 화합물은 광범위하게 정의된다.
이는 잔기 1(Tyr 1)에서의 치환을 매우 매력적 가능성으로 되게 하는데, 이는 단백질분해 인식 지점 중의 하나를 제거할 수 있기 때문이다. Gly5의 Ala5로의 치환은, 화학적 변화가 마이너(메틸 그룹의 부가)이지만 효력의 현저한 감소를 생성하기 때문에 주된 관심사이다. Gly5는 일반 라마찬드론(Ramachandron) 챠트 외부의 특이한 phi/psi 각도를 채택하는 것이 가능하고, 이들 각도는 D-아미노산에 의해 잠재적으로 유도될 수 있다. 추가의 잇점은 이 부위에 인접하는 펩타이드 결합의 안정화일 수 있다.
이러한 이유로 인해, 부분적인 D-알라닌 스캔은 효력의 유지와 관련하여 이들이 허용되는지의 여부를 평가하기 위해 수행되었고, 서열 내의 D-아미노산의 포함은 이들의 단백질분해 안정화 효과에 기인하여 매우 바람직하다.
제1 루프 내의 잔기를 D-알라닌으로 치환하는 효과
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07) (야생형) 2.47 ± 0.25
17-69-07-N061 Ac-(17-69-07) D-Ala1 23.6
17-69-07-N062 Ac-(17-69-07) D-Ala2 > 5000
17-69-07-N063 Ac-(17-69-07) D-Ala3 105 n=1
17-69-07-N056 Ac-(17-69-07) D-Ala4 > 5000
17-69-07-N058 Ac-(17-69-07) D-Ala5 2.37 ± 0.86
17-69-07-N059 Ac-(17-69-07) D-Pro5 > 5000
Tyr1 대신에 D-Ala1은 야생형보다 10배 적은 친화성으로 결합한다. 그럼에도 불구하고, 단백질분해 인식 지점 Tyr1이 제거되고, 효력의 주요 손실을 유도하지 않고서, 안정화 아미노산에 의해 치환되기 때문에 주된 관심사이다.
현저하게는, Gly5의 D-Ala5로의 치환은, 야생형과 비교하여 친화성이 변하지 않은 상태로 유지되기 때문에, 충분히 허용된다.
이 문맥에서, D-Arg5는 또한 허용되고(및 가능하게는, 따라서, D-Pro를 제외한 모든 D-아미노산, 표 6 참조), 이는 물리-화학적 특성이 분자의 추가 개발 동안 변경할 필요가 있는 경우에 관심의 대상이 될 수 있다(표 7).
위치 5에서 치환 잔기의 효과
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07) (야생형) 2.47 ± 0.25
17-69-07-N018 Ac-(17-69-07) Ala5 > 5000
17-69-07-N058 Ac-(17-69-07) D-Ala5 2.37 ± 0.86
17-69-07-N120 Ac-(17-69-07) D-Arg5 4.24 ± 1.48
이어서, 서열의 위치 4에서 소수성 및 방향족 아미노산에 대한 특정 선호도를 나타내는 파지 선택 결과에 기인하여, 천연 티로신 및 트립토판을 포함하는 방향족 아미노산을 선택 도입하는 일련의 유도체를 합성했다(표 8).
위치 4에서 치환 잔기의 효과
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07) (야생형) 2.47 ± 0.25
17-69-07-N057 Ac-(17-69-07) Tyr4 1.78 ± 0.45
17-69-44-N002 Ac-(17-69-07) Trp4 0.75 ± 0.23
17-69-07-N067 Ac-(17-69-07) 1NAl4 0.36 ± 0.12
17-69-07-N068 Ac-(17-69-07) 2NAl4 0.7 ± 0.19
17-69-07-N065 Ac-(17-69-07) Chg4 > 5000
17-69-07-N071 Ac-(17-69-07) Phg4 628
17-69-07-N072 Ac-(17-69-07) tBuGly4 > 5000
17-69-07-N137 Ac-(17-69-07) 3,4-DCPhe4 1.85 ± 2.45
17-69-07-N139 Ac-(17-69-07) Cha4 362
17-69-07-N140 Ac-(17-69-07) HPhe4 43.3
1Nal: 1-나프틸알라닌; 2NAI: 2-나프틸알라닌; Chg: 사이클로헥실글리신, Phg: 페닐글리신; tBuGly: 3급-부틸글리신; 3,4-DCPhe4: 3,4-디클로로페닐알라닌; Cha: 사이클로헥실알라닌; 및 HPhe: 호모페닐알라닌.
위치 4에서의 몇몇 치환은 야생형과 비교하여 친화성을 증강시키고, 이들은 티로신, 트립토판, 1 및 2-나프틸알라닌(1/2 Nal) 및 3,4 디클로로페닐알라닌 (3,4-DCPhe)을 포함한다. 가장 강력한 치환은 1-나프틸알라닌이고, 이는 친화성을 7배 증강시킨다.
17-69-07의 루프 2에서 특정 잔기를 분자의 안정성을 증강시킬 목적으로 검사했다. 이들은 잔기 9를 포함하고, 이는 잠재적 Tyr9 인식 지점을 함유한다. 잔기 11은 또한, 치환을 허용하고(표 5) Tyr9 인식 지점에 인접하기 때문에 매력적이다.
허용되는 아미노산 치환의 요약
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07) (야생형) 2.47 ± 0.25
17-69-07-N130 Ac-(17-69-07) 4BrPhe9 2.45 ± 1.08
17-69-07-N182 Ac-(17-69-07) 5FPhe9 13.1
17-69-07-N100 Ac-(17-69-07) tBuGly11 1.56 ± 1.14
관심있는 것은 Tyr9 단백질분해 인식 지점을 변화시키는 4-브로모페닐알라닌(4BrPhe), 및 친화성을 약간 증강시키고 중요하게는 입체 장해에 의해 단백질분해 가수분해로부터 인접 아미노산 골격을 강력하게 보호하는 3급-부틸글리신(tBuGly)이다.
17-69-07의 전반적 단백질분해 보호를 달성하기 위한 다중-부위 치환
이전 섹션은, 단백질분해 안정화 및/또는 친화성 증강 아미노산의 포함을 가능하게 하는 17-69-07 서열 내의 다중 위치를 개시했다.
단일 분자에서 이들 조합을 조합해보려는 노력으로, Tyr1→D-Ala1, Phe4→1나프틸알라닌4, Gly5→D-Ala5, Tyr9→4BrPhe9 및 Ile11→tBuGly11 치환을 도입한 분자를 합성했다. 현저하게는, 모든 변형은 일제히 허용되고, 효력은 야생형 분자의 것보다 우수하다(표 10 및 11).
특이적 다중-치환으로부터의 결과
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07) (야생형) 2.47 ± 0.25
17-69-07-N252 Ac-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 4BrPhe9 tBuGly11 0.8 ± 0.39
효과기 그룹을 분자의 추가 개발 동안 이러한 바이사이클릭 펩타이드에 부착하는 것을 기대하여, N-말단 글리신으로 개시되고 C-말단 알라닌으로 종결되는 N-말단 사르코신 분자 스페이서(10개 연속 Sar, Sar10으로 표시됨)로 버젼을 생성했다. 이 실험을 목적으로, N-말단 Gly를 아세틸 그룹으로 캡핑시켜 양성 전하를 제거했다.
G-Sar10-A 부가 후의 비교 데이터
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N004 Ac-(17-69-07) (야생형) 2.47 ± 0.25
17-69-07-N225 Ac-G-Sar10-A-(17-69-07 ) 0.95 ± 0.1
17-69-07-N239 Ac-G-Sar10-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 tBuGly11 0.94 ± 0.08
17-69-07-N255 Ac-G-Sar10-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 4BrPhe9 tBuGly11 0.3
상기 데이터는, 바이사이클 코어 서열 내의 분자 스페이서(지시된 바와 같이 N-말단에 부착됨) 및 아미노산 치환 둘 다가 충분히 허용되는 것을 나타내고, 이는 효력이 보유되거나 개선되기 때문이다.
표 12는 표 11에 제시된 분자의 비-아세틸화 (비-) 안정화된 유도체를 나타낸다. 이들의 안정성은 비-안정화된 17-69-07-N219와 비교하여 개선을 입증하기 위해 마우스 및 인간 혈장에서 정량적으로 평가했다(도 1).
혈장 안정성 평가를 위해 선택된 분자, 연관 효력
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N219 G-Sar10-A-(17-69-07 ) (스페이서로 비-안정화됨) 0.82 ± 0.09
17-69-07-N244 G-Sar10-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 4BrPhe9 tBuGly11 0.45 ± 0.19
17-69-07-N231 G-Sar10-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 tBuGly11 1.07 ± 0.28
17-69-07-N241 bAla-Sar10-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 tBuGly11 1.21 ± 0.24
도 3A는, 본래 비-안정화된 야생형 분자 17-69-07-N219와 비교하여, 각각 오-치환된 및 사-치환된 분자 17-69-07-N244 및 17-69-07-N231의 마우스 혈장 안정성을 나타낸다. 37℃에서 마우스 혈장에서 펩타이드의 반감기는, 비-증강된 야생형 분자의 6시간과 비교하여, >> 20시간이다.
도 3B는, 본래 비-안정화된 야생형 분자 17-69-07-N219와 비교하여, 각각 오-치환된 및 사-치환된 17-69-07-N244 및 17-69-07-N231의 인간 혈장 안정성을 나타낸다. 37℃에서 마우스 혈장에서 펩타이드의 반감기는, 비-증강된 야생형 분자의 6시간과 비교하여, >> 20시간이다.
요약하면, 17-69-07 바이사이클릭 코어 서열(Tyr1→D-Ala1, Phe4→1나프틸알라닌4, Gly5→D-Ala5, Tyr9→4BrPhe9 및 Ile11→tBuGly11)에서 최대 5개 위치에서 표적화 치환은 증강된 효력 및 혈장 안정성의 충분한 개선을 갖는 우수한 분자를 생성했다.
안정화된 17-69-07 유도체(17-69-07-N241)의 선택성
유도체 17-69-07-N241을 함유하는 안정화된 분자 스페이서는 다른 종으로부터 유래된 MT1-MMP 헤모펙신 도메인에 대한 친화성에 대해 FP 경쟁에 의해 시험했다. 데이터는 표 13에 요약되어 있다:
17-69-07와 유도체의 종 교차-반응성
인간/시노몰구스
(Kd, nM)		 개 (Kd, nM) 마우스 (Kd, nM)
17-69-07-N219 0.82 0.9 nd
17-69-07-N241 1.21 1.4 0.63
17-69-07의 비-안정화된 및 안정화된 유도체 둘 다는 완전히 교차 반응성이다.
17-69-07-N241의 N-말단 플루오레세인화 유도체(서열의 17-69-07-N258로 명명됨: 플루오레세인-(bAla)-Sar10-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 tBuGly11)는 관련된 인간 메탈로프로테이나제에 대해 시험했다. 데이터는 17-69-07 코어 서열 및 이러한 안정화된 변이체가 MT1-MMP에 대해 특유하게 선택적임을 입증한다(표 14).
관련 메탈로프로테이나제에 대한 17-69-07 및 유도체의 선택성
MT1-MMP
(= MMP-14)
(Kd, nM)		 MMP-1
(Kd, nM)		 MMP-2
(Kd, nM)		 MMP-15
(Kd, nM)		 MMP-16
(Kd, nM)
17-69-07-N258 2.2 >1000 >1000 >1000 >1000
실시예 3: 킬레이트제에 접합된 17-69-07의 단백질분해 안정화된 변이체의 생체내 분석
금속 킬레이트제에 연결된 펩타이드는 진단 및 치료에서 복수의 용도를 갖는다. 특정의 영상화 또는 치료학적 방사선동위체를 킬레이트제에 "부하"할 수 있고, 펩타이드는 상기 동위체를 표적으로 운반한다. 이러한 방식에서, 종양 특이적 항원은, 예를 들면, PET 및 SPECT 스캐너를 사용하여 가시화할 수 있다. 표적화된 방사선요법에 있어서, 치료학적 방사선핵종(예를 들면, 90Y 및 177Lu)은 킬레이트제-펩타이드 상에 부하되고, 종양-연관 항원을 결합함으로써 종양으로 선택적으로 운반된다. 이들은, 이들이 방사하는 높은 에너지에 의해 이들의 항-종양 활성을 발휘한다.
킬레이트제-연결된 17-69-07 바이사이클릭 펩타이드의 합성
5개 유도체는 금속 킬레이트 DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)이 17-69-07 바이사이클릭 펩타이드의 N-말단 알라닌에 연결된 경우에 합성되었다.
분자 및 구조의 요약
펩타이드 코드 분자 기재 Kd (nM)
17-69-07-N144 DOTA-A-(17-69-07) 0.5
17-69-07-N147 DOTA[Lu]-A-(17-69-07) 0.95 ± 0.5
17-69-07-N248 DOTA-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 4BrPhe9 tBuGly11 0.5
17-69-07-N246 DOTA-A-(17-69-07) 모두 D 아미노산 > 5000
17-69-07-N144은, 하나의 아미노산 스페이서로 작용하는 N-말단 알라닌에 DOTA가 직접 연결되는 17-69-07의 야생형 서열이다. 이 분자는 MT1-MMP에 대한 충분한 효력을 보유한다. 효력이 치료학적/영상화 방사선핵종으로 부하된 경우에 보유되는 것을 입증하기 위해, 킬레이트제는 안전한 치환체로서 천연(냉각) 175루테티움으로 부하했다. 효력은 보유되었다.
충분히 안정화된 변이체, 17-69-07-N248은 DOTA 접합체의 문맥에서 또한 효력을 보유했다.
17-69-07-N144의 완전한 D-아미노산 등가물인 대조군 분자, 17-69-07-N246을 제조했다. 이 분자는 D 아미노산에 인접한 아미드 결합이 프로테아제로부터 보호되기 때문에 단백질분해 분해에 대해 완전히 내성이 있고, MT1-MMP에 대한 임의의 활성을 결여한다. 중요하게는, 이 펩타이드는 정확히 동일한 서열 및 화학적 조성을 보유한다.
HT1080 이종이식 마우스에서 177 Lu-부하된 17-69-07-N144의 생체내분포
HT-1080 세포(이는 MT1-MMP를 풍부하게 발현하는 것으로 공지됨)를 6주령 BALB/c nu/nu 마우스의 우측 몸통에 피하 접종했다. 종양은 대략 1주 동안 성장하게 했다.
150 pmol의 17-69-07-N144 펩타이드는 표준 복합체화 기술을 사용하여 1MBq의 γ- 및 β-방사체 177Lu로 부하했다. 종양-보유 마우스에 대해, 150 pmol의 부하된 17-69-07-N144를 이어서 주사했다(17 ㎍/kg의 당량). 3마리 동물을 시점에 대해 안락사시키고, 다양한 기관 및 종양을 절제하고 칭량한 다음, 종양/기관 조직의 그램당 감마-방사선 수치를 측정했다.
수득되는 플롯은 생체내 마우스에서 펩타이드의 국지화의 정량적 지표를 제공한다. 특히, HT1080 종양에서 선택적 축적은 생체내에서 MT1-MMP 결합을 나타낸다.
도 4는 생체내분포 데이터를 요약한 것이다. 놀랍게도, 바이사이클릭 펩타이드는 종양에 특이적이고, 14분의 순환에서 평가된 반감기에도 불구하고, 최대 24시간 지속하는 것으로 나타난다. 이는 종양 세포 내로의 흡수를 나타낸다. 현저한 국지화는 신장에서 가시성이고, 이는 펩타이드에 일시적으로 결합하는 신장 아미노산 운송체에 기인할 가능성이 있다. 모든 기타 기관은 분자의 현저한 흡수를 나타내지 않는다. 흥미롭게는, 마우스 헤모펙신 도메인은 인간 대응물과 완전한 상동성을 공유하고, 이는 마우스 PEX가 다른 장소에서 발현되는 경우 상응하는 신호가 관찰되는 것을 나타낸다.
이종이식 모델에서 종양 흡수가 선택성인지를 평가하기 위해 및 PEX 결합에 기인하여, 17-69-07-N144의 D-아미노산 대응물인 펩타이드 17-69-07-N246를 사용하여 추가의 연구를 수행했다(도 5).
생체내분포 패턴을 활성 바이사이클릭 펩타이드 17-69-07-N144로 수득된 패턴과 비교하면, MT1-MMP 비-결합 17-69-07-N246 바이사이클릭 펩타이드가 종양을 표적화하지 않음이 명백하고, 이는 17-69-07-N144의 종양 신호가 생체내에서 MT1-MMP 표적 결합에 의해 유도됨을 확인시켜 준다.
마지막으로, 생체내분포에 대한 17-69-07 서열의 단백질분해 안정화의 효과를 평가하기 위해, 바이사이클릭 펩타이드 17-69-07-N248(DOTA-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 4BrPhe9 tBuGly11)을 동일한 생체내분포 연구에 사용했다(도 6).
놀랍게도, 펩타이드의 증강된 단백질분해 안정성은, 17-69-07-N144와 비교하여, 임의의 소정 시점에서 종양 흡수의 전반적 배가를 유도하고, 이는, 본래의 비-안정화된 17-69-07 서열과 비교하여, 분자의 우수한 특성을 예시한다.
이러한 효과는, 본 실시예에 기재된 접합체를 사용하는 방사선핵종 표적화 요법 및 독소-접합된 바이사이클릭 펩타이드의 문맥에서 유리한 치료학적 지수를 제공할 수 있을 것으로 예상된다(실시예 4).
실시예 4: 비-안정화된 바이사이클릭 펩타이드와 세포독성제와의 접합
표적화된 암 치료를 위해, 매우 강력한 세포독성 약물을, 절단가능한 링커를 통해, 종양-연관된 세포 표면-발현된 단백질에 결합하는 표적화 속성(여기서, 바이사이클릭 펩타이드)에 부착시킨다. 과발현된 종양 연관된 세포 표면 단백질 표적은 세포의 내부에 내재하는 이의 능력에 대해 선택된다. 종양-연관된 세포 표면 단백질에 대한 세포독성제-접합된 표적화 속성의 결합시, 전체 분자 복합체는 세포의 내부에 내재화한다. 명확한 세포내 환경으로 전신 순환으로부터 전이 후에, 세포독성 약물은 세포내 조건에 의해 표적화 속성으로부터 절단되고, 이어서 절단된 약물은 세포-사이클 정지를 통해 표적화된 세포-사멸, 이어서 아폽토시스를 유도함으로써 이의 항-종양 활성을 발휘한다.
바이사이클릭 펩타이드 17-69-07-N219(실시예 2 및 3 참조)는 N-말단 측면 상에서 Gly-Sar10-Ala 분자 스페이서(G-Sar10-A-(17-69-07)에 연결된 야생형 바이사이클릭 코어 서열로 구성되고, 여기서 전체 서열 기재는 G-Sar10-A-CYNEFGCEDFYDIC이다; 서열번호 20)이다. (17-69-07)의 이러한 유도체는 0.8nM의 Kd에서 MT1-MMP에 대해 완전한 효력(표 12)을 보유한다. 분자 스페이서의 N-말단 측면에서 유리, 특유한 아미노 그룹은 매우 강력한 세포독성 물질 등의 효과기 그룹과의 접합을 위해 이상적으로 위치된다. N-말단 Gly 상의 접합 부위와 바이사이클릭 코어 서열 사이에서 Sar10 링커에 의해 부여된 긴 분자내 거리는 현저한 분자 크기의 효과기 그룹과의 접합 후에 표적 결합 효력의 완전한 보유를 보장하도록 사용된다. 보다 짧은 분자 스페이서는, 표적 단백질에 대한 바이사이클릭 코어 서열의 효력이 보유되는 한, 임의로 선택할 수 있다.
바이사이클릭 펩타이드 약물 접합체(BDC로 명명됨) 표적화 MT1-MMP를 사용한 개념 데이터의 증명을 생성하기 위해, 17-69-07-N219의 2개 접합체를 제조했고, 이는 미소관 중합화-억제 독소 DM1(마이탄신, 또한 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신으로 공지됨) 또는 MMAE(모노메틸오리스타틴 E, 또한 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드로서 공지됨)를 사용했다.
MMAE 접합체는 BT17BDC-1로 명명되고, 자기-희생 (self-immolating) 파라-아미노벤질-카보닐 그룹(PABC)을 포함하는 발린-시트룰린(Val-Cit) 링커에 의해 17-69-07-N219 전구체로부터 분리된다. Val-Cit 링커는 세포내 리소좀에서 마주하는 카텝신 B-풍부 환경에 의해 선택적으로 절단(가수분해)되고, 가수분해 후, PABC는 활성 독성 종으로서 MMAE를 방출하도록 제공된다. Val-Cit-PABC 링커는 순환시에 안정하고, 따라서 세포 내재화시에만 독소를 방출한다.
접합체의 구조, 및 BT17BDC-1의 제조를 위한 합성 반응식은 반응식 I에 제시되어 있다:
[반응식 I]
Figure pat00015
BDC17BDC-1의 제조를 위한 합성 전략: 완전히 정제된, TMB 고리화된 17-69-07-N219 바이사이클 전구체를 글루타릴-발린-시트룰린-p-아미노벤질카보닐-MMAE(통상 vc-MMAE 또는 Val-Cit-PABC-MMAE로 약칭됨)의 석신이미드 에스테르와 반응시켜, 접합체 BDC17BDC-1을 수득했다.
17-69-07-N219의 DM1 접합체는 BT17BDC-9로 명명되고, 세포내 환경에서 마주하는 환원 환경에 의해 절단될 수 있는 디설파이드 결합에 의해 17-69-07-N219 전구체로부터 분리된다. 환원은, 세포 내부에 약 10mM 농도로 존재하는 세포내 글루타티온을 통해 발생하는 것으로 생각된다. 대조적으로, 혈액 순환에서 글루타티온 및 유리 환원제의 농도는 훨씬 낮고(<10μΜ); 따라서 독소는, 이의 세포 사멸 활성을 전개할 수 있는 세포내 환경에서 주로 방출된다.
접합체의 구조, 및 BT17BDC-9의 제조를 위한 합성 반응식은 반응식 2에 제시되어 있다:
[반응식 II]
Figure pat00016
BDC17BDC-9의 제조를 위한 합성 전략: 유리 N-말단 아민을 함유하는 완전히 정제된, TMB 고리화된 17-69-07-N219 바이사이클 전구체를 디설파이드-DM1(제시된 바와 같은 구조)의 석신이미드 에스테르와 반응시켜 접합체 BDC17BDC-9를 수득한다.
따라서, BDC17BDC-1 및 BDC17BDC-9에서 독소의 방출은 기계적으로 구별되고, 즉 전자는 세포내 단백질분해 조건을 통한 것이고, 후자는 세포내 환원 조건에 의한 것이다.
2개의 BDC는 시험관내 세포독성 연구에 사용되었고, HT1080 등의 세포 배양물에 대해 낮은 나노몰/피코몰 효력을 나타냈다(데이터는 제시하지 않음).
생체내 마우스 이종이식 모델(HT1080 종양을 보유함)에서, BDC 둘 다는, 비히클 대조군과 비교하여, 주사 9일 후에 종양 용적의 현저한 감소를 유발했다. 용량 섭생은 도 7에 제시되어 있다(화살표). 종양은, 촉진 (palpation)에 의해 판단된 바와 같이, BDC 둘 다에 대해 14일까지 완전히 정화되었다(도 7). 특히, BDC17BDC-1 및 BDC17BDC-9 둘 다에 대한 동물의 체중은 주로 안정하였고, 이는 치료 목적을 위해 충분할 수 있는 치료학적 윈도우를 나타낸다.
실시예 5: 단백질분해 안정화된 바이사이클릭 펩타이드와 세포독성제와의 접합
위치 9에서 4-브로모페닐알라닌의 존재 또는 부재하에, 위치 1에서 D-알라닌, 위치 4에서 1-나프틸알라닌, 위치 5에서 D-알라닌 및 위치 11에서 α-3급-부틸글리신의 변형을 함유하는 바이사이클릭 코어 서열 17-69-07은 생체외 혈장 및 생체내에서 증강된 단백질분해 안정성을 가졌다(실시예 2, 3).
바이사이클 약물 접합체의 문맥에서, 보다 많은 안정한 바이사이클 코어 서열은 단백질분해적으로 적극적 종양 미소환경에서 감소된 전신 클리어런스 및 보다 큰 안정성에 기인하여 보다 큰 종양 노출을 유도할 가능성이 있다. 둘 다는 BDC의 증가된 MT1-MMP 유도된 흡수를 세포 내부로 제공하여 치료 효과의 증가를 유도할 수 있다.
안정화된 바이사이클릭 펩타이드 17-69-07-N241은 비-안정화된 17-69-07-N219와 전반적으로 유사한 분자 레이아웃으로 설계되었다(실시예 3 및 4에 기재됨). 이는 하기 서열을 갖는다:
(B-Ala)-Sar10-AC(D-Ala)NE(1 Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C (서열번호 5)
이는 전과 같이 TBMB로 고리화된다.
N-말단 베타-알라닌은, 이전에 사용된 글리신이 아니라, N-하이드록시석신이미드(NHS) 에스테르[참조: Purdie et al (1973), J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2, 1845], 특히 본 실시예에서 세포독성제의 NHS 에스테르(반응식 I, II)와의 커플링 동안 디케토피페라진 부 생성물을 최소화하도록 17-69-07-N219에서와 같이 선택되었다.
사르코신 데카머 스페이서는 MT1-MMP의 헤모펙신 도메인에 대한 바이사이클 펩타이드의 결합의 완전한 보유를 보장하도록 17-69-07-N219와 같이 보유된다.
마이탄신 독소 부류는 실시예 4에 기재된 마우스 이종이식 모델에서 유효성 및 인용성에 기초하여 17-69-07-N241에 대한 접합을 위해 선택되었고, 디설파이드 절단가능한 링커가 또한 선택되었다.
4개 BDC를 제조하였고(본원에서 BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20로서 지칭됨), 독소 및 17-69-07-N241 둘 다는 불변이었고, 환원/절단에 대한 디설파이드 결합 감수성은 황 원자에 인접한 장해 정도를 조절함으로써 변경되었다.
접합체에 대한 합성 경로는 반응식 II에 기재된 바와 같고, 여기서 17-69-07-N219는 17-69-07-N241로 치환된다.
BT17BDC-18에 있어서, 합성에 대한 추가 경로는, DM1과 반응하여 완전한 접합체를 형성하는 피리딜-디설파이드 바이사이클 전구체(17-69-07-N277로 명명됨)의 형성을 수반했다. 합성 경로는 반응식 III에 기재되어 있다.
[반응식 III]
Figure pat00017
BDC 17BDC-18의 제조를 위한 합성 전략: 유리 N-말단 아민을 함유하는 완전히 정제된 TMB 고리화된 17-69-07-N241 바이사이클 전구체를 SPP(N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트)와 반응시켜 중간체 17-69-07-N277를 수득한다. 이어서, 이를 유리 티올로서 DM1과 반응시켜 목적하는 접합체 BT17BDC-18을 수득한다.
BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20의 시험관내 특성화
4개 BDC는 인간 MT1-MMP 헤모펙신 도메인에 대한 효력의 보유, 생체외 마우스, 랫트 및 인간 혈장에서의 안정성, 및 디티오트레이톨 등의 환원제에 대한 안정성 등의 몇몇 시험관내 파라미터에 대해 평가했다.
데이터는 하기 표 16에 요약되어 있다:
BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20의 시험관내 특성
바이사이클
약물 접합체 		Kd (nM)
(헤모펙신
도메인) a 		t 1/2 (hrs)
(인간 혈장) b 		t 1/2 (hrs)
(마우스 혈장) b 		t 1/2 (hrs)
(랫트 혈장) b 		DTT에 대한 상대
안정성
(ADC) c 		DTT에 대한 상대
안정성
(BDC) d
17-69-07-N219 0.82 ± 0.09
(n=3)e 		30.3 ± 4.7
(n=1)		 3.9 ± 0.3
(n=1)		 3.7 ± 0
(n=1)		 n/a n/a
17-69-07-N241 1.4 ± 0.3
(n=10)e 		> 36
(n=2)		 > 36
(n=2)		 > 36
(n=1)		 n/a n/a
BT17BDC-17 0.7
(n=1)e 		4.2 ± 0
(n=2)		 5.5 ± 0.7
(n=1)		 1.2 ± 0.1
(n=1)		 1 1
BT17BDC-18 0.99 ± 0.17
(n=6) e 		12.7 ± 2.2
(n=2)		 14.3 ± 1
(n=2)		 4.3 ± 0.6
(n=2)		 7 5
BT17BDC-19 0.5
(n=1)e 		23.5 ± 4.1
(n=2)		 > 36
(n=1)		 > 36
(n=1)		 14 30
BT17BDC-20 2.95 ± 1.3
(n=4)f 		32 ± 1
(n=1)		 > 36
(n=1)		 34 ± 4
(n=1)		 170 93
여기서, n/a: 해당 없음, n = 반복체 수
a: 17-69-07-N040을 트레이서로 사용하여 형광 편광 경쟁 실험에 의해 측정
b: 정량적 LC-MS를 사용하여 측정. 4μM BDC를 함유하는, 혈장에서 최대 24시간의 인큐베이션 시간.
c: 문헌[참조: Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717]으로부터. 이들 값은 텍스트에 기재된 디설파이드 링커를 함유하는 항체 약물 접합체에 관한 것임에 유의한다.
d: 정량적 LC-MS에 의해 측정. 이들 값은 텍스트에 기재된 디설파이드 링커를 함유하는 바이사이클 약물 접합체에 관한 것임에 유의한다. 방법은 문헌[참조: Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717]으로부터 적용되었다.
e: FP 경쟁에서 트레이서로서 17-69-07-N004 사용
f: FP 경쟁에서 트레이서로서 17-69-07-N040 사용
모든 분자 작제물은 헤모펙신 표적에 대한 이들의 친화성을 보유한다(2번째 컬럼).
데이터는, 혈장 안정성이 디설파이드 결합의 성질에 의해 지배되지만(환원에 대한 감수성에 의해 조절된 바와 같음), 바이사이클릭 펩타이드의 성질에 의해 지배되지 않음을 나타내는데, 이는 모든 BDC가 시험된 3개 종의 혈장에서 안정한 동일한 바이사이클릭 펩타이드(17-69-07-N241)를 함유하기 때문이다.
추가로, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20은 치료학적 용도에 적절한 인간 혈장에서 안정성을 나타내는데, 이는 인간에서 이러한 분자 크기의 펩타이드의 예상된 신장 여과 유도 클리어런스가 인간 혈장에서 BDC의 분해 반감기보다 7배 빠른 2 내지 4시간의 평가된 반감기를 갖기 때문이다(>14시간 BT17BDC-18/19/20, 표 16 참조). 따라서, 대부분의 BDC는, 분획이 순환 중 분해됨에 따라, 신장에서 정화될 것으로 예상되고, 이는 이들 BDC를 치료학적 목적에 잠재적으로 적합하게 한다.
BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20의 생체내 유효성
안정화된 바이사이클 코어 서열을 함유하는 모든 BDC는, 인간 폐 편평상피 세포암 라인 EBC-1을 사용하여 생체내 마우스 이종이식 모델에서 이들의 유효성에 대해 시험했다.
BT17BDC-17, BT17BDC-18 및 BT17BDC-19은 효율적이고 9일 내에 종양을 정화시켰다(도 9, 10 및 11). BT17BDC-17은 양호한 효과를 나타냈지만, 높은 용량에서 일부 체중 감소를 나타냈다. BT17BDC-20은, 일정한 체중에 기초하여 허용되었지만, 효율적이지 않았고 종양 크기의 미미한 감소만을 유발했다(도 12).
시간 및 BDC에 따른 종양 용적의 곡선하 면적(AUC)을 취하고, 상응하는 용량 그룹에 대해 플롯팅했다(도 13). 이로부터, 50% 종양 AUC 감소(ED50)를 달성하기 위한 유효 용량을 측정할 수 있고, 이는 표 17에 요약되어 있다.
BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20에 대해 50% 종양 AUC 감소를 달성하기 위한 유효 용량
BDC BT17BDC-9 BT17BDC-17 BT17BDC-18 BT17BDC-19 BT17BDC-20
ED50 a 2.1 ± 1.1b 1.3 ± 0.6 b 2.1 ± 0.8 b 3.1 ± 1.6 b 22 ± 13 b
a ED50 ± 95%의 신뢰 한계b 단위(mg/kg), EBC-1 종양을 보유하는 마우스에서
따라서, BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18 및 BT17BDC-19는 유효성에 기반하여 표적화 암 치료에 사용하기 위한 적합한 분자이고, BT17BDC-17, BT17BDC-18 및 BT17BDC-19는 유효 용량에서 충분히 허용된다.
본 발명은 다음 양태를 포함할 수 있다.
[1]
적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된 적어도 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드, 및 적어도 2개의 폴리펩타이드 루프가 분자 스캐폴드 위에 형성되도록 상기 폴리펩타이드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함하는, MT1-MMP에 특이적인 펩타이드 리간드로서,
상기 펩타이드 리간드가 하기 화학식 I의 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 펩타이드 리간드:
[화학식 I]
-Ci-X1-U/02-X3-X4-G5-Cii-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-Ciii- (서열번호 1)
상기 화학식 I에서,
Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고;
X는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고;
U는 N, C, Q, M, S 및 T로부터 선택된 비하전된 극성 아미노산 잔기를 나타내고;
O는 G, A, I, L, P 및 V로부터 선택된 비극성 지방족 아미노산 잔기를 나타낸다.
[2]
제1항에 있어서, Xi가 하기 아미노산: Y, M, F 또는 V, 예를 들면, Y, M 또는 F, 특히 Y 또는 M, 보다 특히 Y 중의 어느 하나로부터 선택되는, 펩타이드 리간드.
[3]
제1항 또는 제2항에 있어서, U/O2가 U, 예를 들면, N 또는 O, 예를 들면, G로부터 선택되는, 펩타이드 리간드.
[4]
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, X3가 U 또는 Z로부터 선택되고, 여기서 U는 N, C, Q, M, S 및 T로부터 선택된 비하전된 극성 아미노산 잔기를 나타내고, Z는 D 또는 E로부터 선택된 음으로 하전된 극성 아미노산 잔기를 나타내고, 특히 위치 3에서의 U는 Q로부터 선택되거나 위치 3에서의 Z는 E로부터 선택되는, 펩타이드 리간드.
[5]
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, X4가 J로부터 선택되고, 여기서 J는 F, W 및 Y로부터 선택된 비극성 방향족 아미노산 잔기를 나타내는, 펩타이드 리간드.
[6]
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, X10이 Z로부터 선택되고, 여기서 Z는 D 또는 E, 예를 들면, D로부터 선택된 음으로 하전된 극성 아미노산 잔기를 나타내는, 펩타이드 리간드.
[7]
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, X11이 O로부터 선택되고, 여기서 O는 G, A, I, L, P 및 V, 예를 들면, I로부터 선택된 비극성 지방족 아미노산 잔기를 나타내는, 펩타이드 리간드.
[8]
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Ia의 화합물, 화학식 Ib의 화합물, 화학식 Ic의 화합물, 화학식 Id의 화합물 또는 화학식 Ie의 화합물인, 펩타이드 리간드:
[화학식 Ia]
-Ci-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-Cii-E-D-F-Y-Z-O-Ciii- (서열번호 6)
[화학식 Ib]
-Ci-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (서열번호 7)
[화학식 Ic]
-Ci-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (서열번호 8)
[화학식 Id]
-Ci-Y/M-N-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (서열번호 9)
[화학식 Ie]
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (서열번호 2)
상기 화학식 Ia에서,
U, O, J 및 Z는 제1항에 정의된 바와 같다.
[9]
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 펩타이드가
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (서열번호 2);
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-12) (서열번호 10);
-Ci-F-G-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-02) (서열번호 11);
-Ci-V-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-03) (서열번호 12);
-Ci-F-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-04) (서열번호 13);
-Ci-Y-N-E-Y-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07-N057) (서열번호 14); 및
-Ci-Y-N-E-W-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-44-N002) (서열번호 15),
예를 들면:
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (서열번호 2); 및
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-12) (서열번호 10),
특히:
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (서열번호 2)로부터 선택된 서열을 포함하는, 펩타이드 리간드.
[10]
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서,
N-말단 및/또는 C-말단 변형; 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기로의 치환(예를 들면, 하나 이상의 극성 아미노산 잔기의 하나 이상의 등배전자 또는 등전자 아미노산으로의 치환; 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기의 다른 비-천연 등배전자 또는 등전자 아미노산으로의 치환); 스페이서 그룹의 부가; 하나 이상의 L-아미노산 잔기의 하나 이상의 D-아미노산 잔기로의 치환; 바이사이클릭 펩타이드 리간드 내에서 하나 이상의 아미드 결합의 N-알킬화; 하나 이상의 펩타이드 결합의 대리 결합으로의 치환; 펩타이드 골격 길이 변형; 하나 이상의 아미노산 잔기의 α-탄소 상의 수소의 또 다른 화학 그룹으로의 치환; 및 적합한 아민, 티올, 카복실산 및 페놀-반응성 시약을 사용한 아미노산, 예를 들면, 시스테인, 리신, 글루타메이트 및 티로신의 합성후 바이오직교성 (bioorthogonal) 변형으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는, 펩타이드 리간드.
[11]
제10항에 있어서, 상기 변형이 적합한 아미노-반응성 화학을 사용한 N-말단 변형 및/또는 적합한 카복시-반응성 화학을 사용한 C-말단 변형을 포함하는, 펩타이드 리간드.
[12]
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 N-말단 변형이 이의 표적, 예를 들면, Ala, G-Sar10-A 그룹 또는 bAla-Sar10-A 그룹에 대한 효과기 그룹의 접합 및 바이사이클릭 펩타이드의 효력의 유지를 촉진시키는 분자 스페이서 그룹의 부가를 포함하는, 펩타이드 리간드.
[13]
제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 N-말단 및/또는 C-말단 변형이 세포독성제의 부가를 포함하는, 펩타이드 리간드.
[14]
제10항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 아미노산 위치 1 및/또는 9에 변형을 포함하는, 펩타이드 리간드.
[15]
제10항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기로의 치환을 포함하는, 펩타이드 리간드.
[16]
제15항에 있어서, 상기 비-천연 아미노산 잔기가 위치 4에서 치환되고, 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌; 3,4-디클로로페닐알라닌; 및 호모페닐알라닌, 예를 들면, 1-나프틸알라닌; 2-나프틸알라닌; 및 3,4-디클로로페닐알라닌, 특히 1-나프틸알라닌으로부터 선택되는, 펩타이드 리간드.
[17]
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 비-천연 아미노산 잔기가 위치 9 및/또는 11에서 치환되고, 위치 9를 위해 4-브로모페닐알라닌 또는 펜타플루오로-페닐알라닌 및/또는 위치 11을 위해 3급-부틸글리신으로부터 선택되는, 펩타이드 리간드.
[18]
제17항에 있어서, 상기 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 9에 존재하는 잔기가 4-브로모페닐알라닌으로부터 선택되는, 펩타이드 리간드.
[19]
제17항에 있어서, 상기 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들면, 위치 11에 존재하는 잔기가 3급-부틸글리신으로부터 선택되는, 펩타이드 리간드.
[20]
제15항에 있어서, 복수의 변형, 예를 들면, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상의 하기 변형, 특히 하기 5개 변형 모두: 위치 1 및/또는 5에서 D-알라닌, 위치 4에서 1-나프틸알라닌, 위치 9에서 4-브로모페닐알라닌 및 위치 11에서 3급-부틸글리신을 포함하는, 펩타이드 리간드.
[21]
제10항에 있어서, 위치 1에서 상기 아미노산 잔기가 D-아미노산, 예를 들면, D-알라닌 대신 치환되는, 펩타이드 리간드.
[22]
제10항에 있어서, 위치 5에서 상기 아미노산 잔기가 D-아미노산, 예를 들면, D-알라닌 또는 D-아르기닌 대신 치환되는, 펩타이드 리간드.
[23]
제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 염이 유리 산 또는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄 염으로부터 선택되는, 펩타이드 리간드.
[24]
제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간, 마우스 및 개 MT1-MMP 헤모펙신 도메인의 높은 친화성 결합제인, 펩타이드 리간드.
[25]
제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, MT1-MMP에 대해 선택적이지만, MMP-1, MMP-2, MMP-15 및 MMP-16과 교차 반응하지 않는, 펩타이드 리간드.
[26]
하나 이상의 효과기 및/또는 관능기에 접합된, 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따르는 펩타이드 리간드를 포함하는 약물 접합체.
[27]
제26항에 있어서, 상기 효과기 및/또는 관능기가 세포독성제 또는 금속 킬레이트제를 포함하는, 약물 접합체.
[28]
제27항에 있어서, 상기 세포독성제가 절단가능한 결합, 예를 들면, 디설파이드 결합 또는 프로테아제 감수성 결합에 의해 바이사이클릭 펩타이드에 연결되는, 약물 접합체.
[29]
제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 세포독성제가 하기 구조:
를 갖는 DM1 또는
하기 구조:
를 갖는 MMAE로부터 선택되는, 약물 접합체.
[30]
제26항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 하기 구조:
를 갖는 화합물인, 약물 접합체.
[31]
제26항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 하기 구조:
를 갖는 화합물인, 약물 접합체.
[32]
제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 세포독성제가 마이탄시노이드이고 화학식 II의 화합물로부터 선택되는, 약물 접합체:
[화학식 II]
상기 화학식 II에서,
n은 1 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1-6 알킬 또는 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 그룹, 예를 들면, 수소 또는 메틸을 나타낸다.
[33]
제32항에 있어서,
n이 1을 나타내고, R1 및 R2 둘 다가 수소(즉, 마이탄신 유도체 DM1)를 나타내거나;
n이 2를 나타내고, R1이 수소를 나타내고, R2가 메틸 그룹(즉, 마이탄신 유도체 DM3)을 나타내거나;
n이 2를 나타내고, R1 및 R2 둘 다가 메틸 그룹(즉, 마이탄신 유도체 DM4)을 나타내는, 약물 접합체.
[34]
제26항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 접합체의 바이사이클릭 펩타이드 성분이 화학식 III에 제시된 구조를 갖는, 약물 접합체:
[화학식 III]
상기 화학식 III에서,
m은 0 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고,
R3 및 R4는 독립적으로 수소, C1-6 알킬 또는 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 그룹, 예를 들면, 수소 또는 메틸을 나타낸다.
[35]
제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제가 화학식 IV에 정의된 링커에 의해 바이사이클릭 펩타이드에 연결되는, 약물 접합체:
[화학식 IV]
상기 화학식 IV에서,
R1, R2, R3 및 R4는 수소, C1-6 알킬 또는 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 그룹, 예를 들면, 수소 또는 메틸을 나타내고;
독소는 임의의 적합한 세포독성제를 나타내고;
바이사이클은 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 정의된 펩타이드 리간드를 나타내고;
n은 1 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고;
m은 0 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타낸다.
[36]
제35항에 있어서, 화합물 IV의 독소가 마이탄신이고, 상기 접합체가 화학식 V의 화합물을 포함하는, 약물 접합체:
[화학식 V]
상기 화학식 V에서,
R1, R2, R3 및 R4는 수소, C1-6 알킬 또는 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 그룹을 나타내고;
바이사이클은 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 정의된 펩타이드 리간드를 나타내고;
n은 1 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타내고;
m은 0 내지 10으로부터 선택된 정수를 나타낸다.
[37]
제36항에 있어서, n은 1이고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 수소를 나타내는, 즉 화학식 Va의 화합물:
[화학식 Va]
을 나타내거나;
n이 1이고, R1이 메틸을 나타내고, R2, R3 및 R4가 각각 수소를 나타내는, 즉 화학식 Vb의 화합물:
[화학식 Vb]
을 나타내거나;
n이 2를 나타내고, R1 및 R2 둘 다가 수소를 나타내고, R3 및 R4 둘 다가 메틸을 나타내는, 즉 화학식 Vc의 화합물:
[화학식 Vc]
을 나타내거나;
n이 2를 나타내고, R1 및 R3 둘 다가 메틸을 나타내고, R2 및 R4가 수소를 나타내는, 즉 화학식 Vd의 화합물:
[화학식 Vd]
을 나타내는, 약물 접합체.
[38]
제26항 또는 제27항에 있어서, BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 및 BT17BDC-20, 예를 들면, BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18 및 BT17BDC-19, 특히 BT17BDC-17, BT17BDC-18 및 BT17BDC-19로부터 선택되는, 약물 접합체:
[화학식 BT17BDC-9]
Figure pat00030
[화학식 BT17BDC-17]
[화학식 BT17BDC-18]
[화학식 BT17BDC-19]
[화학식 BT17BDC-20]
[39]
반응식 I, II 또는 III 중의 어느 하나에 기재된 합성 경로를 포함하는, 제38항에 정의된 약물 접합체를 제조하는 방법.
[40]
제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항의 펩타이드 리간드 또는 제26항 내지 제38항 중의 어느 한 항의 약물 접합체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는, 약제학적 조성물.
[41]
제26항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 암, 특히 고형 종양, 예를 들면, 비-소세포 폐암을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한, 약물 접합체.
SEQUENCE LISTING <110> Bicycle Therapeutics Limited <120> BICYCLIC PEPTIDE LIGANDS SPECIFIC FOR MT1-MMP <130> IPA170364-GB <150> GB1419237.1 <151> 2014-10-29 <150> GB1515245.7 <151> 2015-08-27 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa represents either a polar, uncharged amino acid residue selected from N, C, Q, M, S and T or a non-polar aliphatic amino acid residue selected from G, A, I, L, P and V <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Cys Tyr Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is beta Ala <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is Sar10 <400> 3 Xaa Xaa Ala Cys Tyr Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile 1 5 10 15 Cys <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is D-Ala <400> 4 Cys Xaa Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Beta Ala <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is Sar10 <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is NAl <220> <221> Xaa <222> (9)..(9) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> Xaa <222> (16)..(16) <223> Xaa is tBuGly <400> 5 Xaa Xaa Ala Cys Xaa Asn Glu Xaa Xaa Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Xaa 1 5 10 15 Cys <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is Y, M, F or V <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa represents a polar, uncharged amino acid residue selected from N, C, Q, M, S and T or a non-polar aliphatic amino acid residue selected from G, A, I, L, P and V <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa represents a polar, uncharged amino acid residue selected from N, C, Q, M, S and T or a polar, negatively charged amino acid residue selected from D or E <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa represents a non-polar aromatic amino acid residue selected from F, W and Y <220> <221> Xaa <222> (12)..(12) <223> Xaa represents a polar, negatively charged amino acid residue selected from D or E <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa represents a non-polar aliphatic amino acid residue selected from G, A, I, L, P and V <400> 6 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is Y, M, F or V <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is N or G <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is E or Q <400> 7 Cys Xaa Xaa Xaa Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is Y, M or F <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is N or G <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is E or Q <400> 8 Cys Xaa Xaa Xaa Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is Y or M <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is E or Q <400> 9 Cys Xaa Asn Xaa Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 Cys Met Asn Gln Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 11 Cys Phe Gly Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 12 Cys Val Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 13 Cys Phe Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 Cys Tyr Asn Glu Tyr Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 Cys Tyr Asn Glu Trp Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 16 Cys Lys Asn Arg Gly Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 17 Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys 1 5 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 18 Ala Cys Tyr Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys Ala 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 19 Ala Cys Met Asn Gln Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile Cys Ala 1 5 10 15 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is Sar10 <400> 20 Gly Xaa Ala Cys Tyr Asn Glu Phe Gly Cys Glu Asp Phe Tyr Asp Ile 1 5 10 15 Cys <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 21 Tyr Asn Glu Phe 1 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 22 Tyr Asn Glu Phe Gly 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 23 Glu Asp Phe Tyr Asp Ile 1 5

Claims (1)

  1. 적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된 적어도 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드, 및 적어도 2개의 폴리펩타이드 루프가 분자 스캐폴드 위에 형성되도록 상기 폴리펩타이드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함하는, MT1-MMP에 특이적인 펩타이드 리간드로서,
    상기 펩타이드 리간드가 하기 화학식 I의 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 펩타이드 리간드:
    [화학식 I]
    -Ci-X1-U/02-X3-X4-G5-Cii-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-Ciii- (서열번호 1)
    상기 화학식 I에서,
    Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고;
    X는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고;
    U는 N, C, Q, M, S 및 T로부터 선택된 비하전된 극성 아미노산 잔기를 나타내고;
    O는 G, A, I, L, P 및 V로부터 선택된 비극성 지방족 아미노산 잔기를 나타낸다.
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