RS61853B1 - Biciklični peptidni ligandi specifični za mt1-mmp - Google Patents
Biciklični peptidni ligandi specifični za mt1-mmpInfo
- Publication number
- RS61853B1 RS61853B1 RS20210611A RSP20210611A RS61853B1 RS 61853 B1 RS61853 B1 RS 61853B1 RS 20210611 A RS20210611 A RS 20210611A RS P20210611 A RSP20210611 A RS P20210611A RS 61853 B1 RS61853 B1 RS 61853B1
- Authority
- RS
- Serbia
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- formula
- ciii
- seq
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/0474—Organic compounds complexes or complex-forming compounds, i.e. wherein a radioactive metal (e.g. 111In3+) is complexed or chelated by, e.g. a N2S2, N3S, NS3, N4 chelating group
- A61K51/0482—Organic compounds complexes or complex-forming compounds, i.e. wherein a radioactive metal (e.g. 111In3+) is complexed or chelated by, e.g. a N2S2, N3S, NS3, N4 chelating group chelates from cyclic ligands, e.g. DOTA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Opis
POLJE PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptide koji su kovalentno povezani sa molekulskom skelom, tako da je dve ili više peptidnih petlji naspramno povezano sa spojnim tačkama skele. Konkretno, pronalazak opisuje peptide koji se sa visokim afinitetom vezuju za membranske metaloproteinaze tipa 1 (MT1-MMP). Pronalazak takođe opisuje lekove koji sadrže navedene peptide, konjugovane za jednu ili više efektorskih i/ili funkcionalnih grupa čija je uloga u odslikavanju ili ciljanoj terapiji kancera.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Ciklični peptidi imaju sposobnost da se sa visokim afinitetom vežu za specifične proteinske ciljne molekule, što ih čini perspektivnom klasom molekula za razvoj lekova. Nekoliko cikličnih peptida već je u uspešnoj kliničkoj primeni, na primer, antibakterijski peptid vankomicin, imunosupresivni lek ciklosporin ili anti-kancerski lek oktreotid (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). Visok afinitet vezivanja ovakvih molekula nastaje usled uspostavljanja znatne interaktivne površine između peptida i ciljnog molekula, kao i usled smanjenja konformacione fleksibilnosti cikličnih struktura. Tipično, makrociklični molekuli se vezuju za površine od nekoliko stotina kvadratnih angstrema, kao što je na primer, ciklični peptid CVX15 antagonist CXCR4 (400 Å<2>; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), ciklični peptid sa Arg-Gly-Asp vezujućim motivom za integrin aVb3 (355 Å<2>) (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5) ili ciklični peptidni inhibitor upain-1, koji vezuje aktivator plazminogena tipa urokinaze (603 Å<2>; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).
[0003] Ciklična konfiguracija uslovljava manju fleksibilnost makrocikličnih peptida u poređenju sa linearnim peptidima, što uzrokuje manji gubitak entropije nakon vezivanja za ciljne molekule i rezultira većim afinitetom vezivanja. Smanjena fleksibilnost rezultira i zaključavanjem konformacije specifične za ciljni molekul, što povećava afinitet vezivanja u poređenju sa linearnim peptidima. Ovo se može ilustrovati potentnim i selektivnim inhibitorom matriksne metaloproteinaze 8, (MMP-8), koji gubi selektivnost prema drugim tipovima MMP kada mu se prsten nađe u otvorenoj konformaciji (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51). Poželjna svojstva vezivanja koja se postižu makrociklizacijom još su više naglašena kod multicikličnih peptida, kao što su, na primer, vankomicin, nizin i aktinomicin.
[0004] Nekoliko istraživačkih timova povezalo je cisteinske ostatke polipeptida sa sintetičkim molekulskim strukturama (Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen i saradnici su primenili tris(bromometil)benzen i slične molekule, da efikasno vežu peptidne petlje za sintetičke skele, sa ciljem replikovanja određene proteinske površine (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Postupci razvijanja potencijalnih lekovitih jedinjenja, u kojima su jedinjenja dobijena vezivanjem cisteina u polipeptidu za molekulsku skelu, na primer, tris(bromometil)benzen, obelodanjeni su u WO 2004/077062 i WO 2006/078161.
[0005] Razvijeni je kombinatorijalni pristupi bazirani na bakteriofagnom prikazu (Phage displaybased combinatorial approaches), sa ciljem razvijanja i pretraživanja velikih biblioteka bicikličnih peptida prema ciljnim molekulima od interesa (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 i WO2009/098450). Ukratko, kombinatorijalne biblioteke linearnih peptida koji sadrže tri cisteinska ostatka i dva regiona sa 6 nasumično poređanih aminokiselina (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys) eksprimirane su u bakteriofagu i ciklizovane kovalentnim vezivanjem bočnih lanaca cisteina za mali molekul (tris-(bromometil)benzen). WO 2010/089117 opisuje peptidne ligande koji sadrže polipeptid vezan za molekulsku skelu preko jedne ili više veznih tačaka, gde je navedeni polipeptid ciklizovan i da formira jednu ili više odvojenih petlji. WO 2013/050615 opisuje postupak izbora polipeptidnog liganda koji ima potreban nivo specifičnosti prema ciljnom molekulu.
SAŽETAK PRONALASKA
[0006] Prema prvom aspektu pronalaska, obezbeđen je peptidni ligand specifičan za MT1-MMP, koji obuhvata polipeptid sa najmanje tri cisteinska ostatka, razdvojena najmanje dvema sekvencama petlji, i molekulsku skelu, koja formira kovalentne veze sa cisteinskim ostacima polipeptida, tako da su najmanje dve polipeptidne petlje formirane na molekulskoj skeli, gde peptidni ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):
-Ci-X1-U/O2-X3-X4-G5-Cii-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-Ciii- (SEQ ID NO: 1) (I) ili njenu farmaceutski prihvatljivu so,
gde:
Ci, Ciii Ciiipredstavljaju prvi, drugi, odnosno, treći cisteinski ostatak;
X predstavlja neki aminokiselinski ostatak;
U predstavlja neki polarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak, izabran između N, C, Q, M, S i T; i
O predstavlja neki ne-polarni alifatični aminokiselinski ostatak, izabran između G, A, I, L, P i V.
[0007] Prema drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je konjugat leka, koji sadrži peptidni ligand, kao što je prethodno opisano, konjugovan za jednu ili više efektorskih i/ili funkcionalnih grupa, kao što je citotoksični agens, konkretno, DM1 i MMAE.
[0008] Prema narednom aspektu pronalaska, obezbeđen je konjugat, koji sadrži peptidni ligand, kao što je opisano, i jednu ili više efektorskih i/ili funkcionalnih grupa, kao što je radionuklid koji nosi helatorsku grupu, konkretno DOTA.
[0009] Prema narednom aspektu pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži peptidni ligand ili konjugat, kao što je opisano, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
[0010] Naredni aspekt pronalaska obezbeđuje peptidni ligand, kao što je prethodno opisano, za primenu u prevenciji, supresiji i lečenju kancera, konkretno, solidnih tumora, kao što su nesitnoćelijski plućni karcinomi.
KRATAK OPIS SLIKA
[0011]
Slika 1: Stabilnost 17-69-07-N219 u plazmi miša. Praćeno je nekoliko jona, kao što je navedeno u legendi, kao i dve tranzicije u MRM modusu. Uočena je odlična korelacija između jona. Polu-život peptida u mišjoj plazmi na 37°C je 6 sati.
Slika 2: PK profil bicikličnog peptida 17-69-07-N004 u plazmi miša. Dve životinje po vremenskoj tački.
Slika 3: Stabilnost u plazmi miša (A) i čoveka (B) dva stabilizovana 17-69-07 molekula (sa 4-bromofenilalaninom na poziciji 9: 17-69-07-N244, bez 4-bromofenilalanina na pozicija 9: 17-69-07-N231) u poređenju sa nestabilisanim 17-69-07-N219 molekulom. Za svaki analit praćeno je nekoliko MRM tranzicija, koji su međusobno dobro korelirale. Na grafiku je prikazana samo jedna tranzicija.
Slika 4: Biodistribucija<177>Lu 17-69-07-N144 u HT-1080 ksenograftu miša.
Slika 5: Biodistribucija<177>Lu 17-69-07-N246 u HT-1080 ksenograftu miša.
Slika 6: Biodistribucija<177>Lu 17-69-07-N248 u HT-1080 ksenograftu miša.
Slika 7: (A): Grafik zavisnosti srednje vrednosti zapremine tumora od vremena za BT17BDC-1 i 9. Doze su primenjene u vremenskim tačkama 0, 2, 4, 7, 9, i 11 dana. (B): Promena telesne mase tokom tretmana, ukazuje na toksikološke efekte povezane sa tretmanom i na ukupno zdravlje životinje.
Slika 8: Lista izlaznih sekvenci dobijenih pristupom sazrevanja afiniteta, primenom biblioteka sa fiksiranim pozicijama 17-69 u petlji 2. Logo plot sekvence na desnoj strani prikazuje ukupnu preferenciju ostataka na pozicijama 1, 2, 3, 4, i 5 u petlji 1.
Slika 9: Gore: Grafik zavisnosti prosečne zapremine tumora od vremena za BT17BDC-17 u EBC-1 ksenograftu miša. Doze su primenjene u vremenskim tačkama 0, 2, 4, 7, 9, 11 i 14 dana. Dole: Promene telesne mase tokom tretmana, koje ukazuju na toksikološke efekte povezane sa tretmanom i na ukupno zdravstveno stanje životinje.
Slika 10: Gore: Grafik zavisnosti presečne zapremine tumora od vremena za BT17BDC18 u EBC-1 ksenograftu miša. Doze su primenjene u vremenskim tačkama 0, 2, 4, 7, 9, 11 i 14 dana. Dole: Promene telesne mase tokom tretmana, ukazuju na toksikološke efekte povezane sa tretmanom i na ukupno zdravstveno stanje životinja.
Slika 11: Gore: Grafik zavisnosti presečne zapremine tumora od vremena za BT17BDC-19 u EBC-1 ksenograftu miša. Doze su primenjene u vremenskim tačkama 0, 2, 4, 7, 9, 11 i 14 dana. Dole: Promene telesne mase tokom tretmana, ukazuju na toksikološke efekte povezane sa tretmanom i na ukupno zdravstveno stanje životinja.
Slika 12: Gore: Grafik zavisnosti presečne zapremine tumora od vremena za BT17BDC-20 u EBC-1 ksenograftu miša. Doze su primenjene u vremenskim tačkama 0, 2, 4, 7, 9, 11 i 14 dana. Dole: Promene telesne mase tokom tretmana, ukazuju na toksikološke efekte povezane sa tretmanom i na ukupno zdravstveno stanje životinja
Slika 13: Zavisnost površine ispod krive (AUC) zapremine tumora od primenjene doze, za svaki BDC. Krive su dobijene fitovanjem eksperimentalnih tačaka normalizovanih u odnosu na zapreminu tumora u tački 0, primenom standardnih IC50 jednačina.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0012] Osim ako nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni termini upotrebljeni u opisu imaju stručna značenja uobičajena u stanju tehnike, kao što je stanje tehnike oblasti hemije peptida, ćelijske kulture i fagnog prikaza, hemije nukleinskih kiselina i u biohemiji. Standardne tehnike primenjene su za molekularno-biološke, genetičke i biohemijske postupke (videti, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.).
Nomenklatura
Numerisanje
[0013] Kada se opis poziva na pozicije aminokiselinskih ostataka u jedinjenjima formule (I), cisteinski ostaci (Ci, Ciii Ciii) se izostavljaju iz numerisanja, budući da su oni nepromenljivi, pa je zato, numerisanje aminokiselinskih ostataka unutar jedinjenja formule (I) onako kako je navedeno u nastavku:
-Ci-X1-U/O2-X3-X4-G5-Cii-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-Ciii- (SEQ ID NO: 1).
[0014] U ovom opisu su svi biciklični peptidi ciklizovani primenom TBMB (1,3,5-tris(bromometil)benzena), što proizvodi tri-supstituisanu strukturu 1,3,5-trismetil-benzena. Zatvaranje prstena pomoću TBMB odvija se na Ci, Ciii Ciii.
Središnja sekvenca bicikličnog peptida
[0015] Svim obelodanjenim bicikličnim peptidima dodeljen je jedinstveni broj središnje sekvence, koja se definiše kao redosled aminokiselina između prvog cisteinskog ostatka sa Nterminusne strane (Ci) i poslednjeg cisteinskog ostatka sa C-terminusne strane peptida (Ciii). U primeru identifikatora 17-69-07, središnja sekvenca je CiYNEFGCiiEDFYDICiii(SEQ ID NO: 2), i na nju se referiše kao "17-69-07" ili "(17-69-07)".
Peptidni kod
[0016] Nekim ovde obelodanjenim bicikličnim peptidima dodeljen je jedinstveni identifikator na osnovu proteinskog koda, kao što je 17-69-07-N241, gde N241 označava konkretni derivat središnje sekvence bicikličnog peptida sa oznakom 17-69-07. Različiti derivati 17-69-07 imaju različite N brojeve, na primer, N001, N002, Nxxx.
Molekulski format
[0017] Ekstenzije središnje sekvence sa N- ili C-terminuse strane bicikličnog peptida dodavanjem aminokiselina sa leve stranu ili desne stranu središnje sekvence, označava se crticom. Na primer, ekstenzija na N-terminusu βAla-Sar10-Ala bila bi označena na sledeći način: βAla-Sar10-A-(17-69-07)
a puna sekvenca bi bila βAla-Sar10-A-CYNEFGCEDFYDIC (SEQ ID NO: 3).
Modifikacije
[0018] Supstitucije prirodno-nepostojećim aminokiselinama unutar središnje sekvence označene su prema opisu u odeljku molekulski format. Na primer, ako je tirozin na poziciji 1 u 17-69-07 supstituisan D-Alaninom, opis je (17-69-07) D-Ala1, a puna sekvenca je C(D-Ala1)NEFGCEDFYDIC (SEQ ID NO: 4).
[0019] Ako je za biciklični peptid, sa modifikovanom središnjom sekvencom, prikačen rep na N-terminusu ili C-terminusu, onda će, u primeru 17-69-07-N241, opis prema molekulskom formatu biti:
βAla-Sar10-A-(17-69-07) DAla1 1NAl4 DAla5 tBuGly11.
[0020] Puna aminokiselinska sekvenca 17-69-07-N241 je shodno tome:
βAla-Sar10-A- C(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C (SEQ ID NO: 5).
Peptidni ligandi
[0021] Peptidni ligand, kako je ovde navedeno, označava peptid kovalentno vezan za molekulsku skelu. Tipično, ovakvi peptidi sadrže dve ili više reaktivnih grupa (odnosno, cisteinskih ostataka), koje su sposobne da formiraju kovalentne veze sa skelom, i sekvencu umetnutu između navedenih reaktivnih grupa, koja se označava kao sekvenca petlje, jer formira petlju kada se peptid veže za skelu. U konkretnom slučaju, peptid sadrži najmanje tri cisteinska ostatka (ovde navedena kao Ci, Ciii Ciii), i formira najmanje dve petlje na skeli.
[0022] Stručna osoba će lako oceniti da X na pozicijama 1, 3, 4, 10 i 11 formule (I) može biti bilo koje aminokiselina, koja odgovara rezultatima skeniranja alanina (videti Tabelu 5) i izlaznim sekvencama (Slika 8), a koja omogućava supstitucije na ovim pozicijama koje će biti tolerabilne.
[0023] U jednom obliku izvođenja, X na poziciji 1 formule (I) je izabran iz grupe sledećih aminokiselina: Y, M, F ili V. U narednom obliku izvođenja, X na poziciji 1 formule (I) izabran je između Y, M ili F. U narednom obliku izvođenja, X na poziciji 1 formule (I) izabran je između Y ili M. U još jednom obliku izvođenja, X na poziciji 1 formule (I) izabran je od Y.
[0024] U jednom obliku izvođenja, U/O na poziciji 2 formule (I) je izabran od U, kao što je na primer, N. U alternativnom obliku izvođenja, U/O na poziciji 2 formule (I), izabran je između O, kao što je na primer, G.
[0025] U jednom obliku izvođenja, X na poziciji 3 formule (I) izabran je između U ili Z, gde U predstavlja neku polarnu, nenaelektrisanu aminokiselinu izabranu između N, C, Q, M, S i T, dok Z predstavlja neku polarnu, negativno naelektrisanu aminokiselinu, izabranu između D ili E. U narednom obliku izvođenja, U na poziciji 3 formule (I), izabran je iz Q. U alternativnom obliku izvođenja, Z na poziciji 3 formule (I), izabran je iz E.
[0026] U jednom obliku izvođenja, X na poziciji 4 formule (I), izabran je iz J, gde J predstavlja neku ne-polarnu aromatičnu aminokiselinu izabranu između F, W i Y. U narednom obliku izvođenja, J na poziciji 4 formule (I), izabrano je iz F. U alternativnom obliku izvođenja, J na poziciji 4 formule (I) izabrano je iz Y. U alternativnom obliku izvođenja, J na poziciji 4 formule (I) izabran je iz W.
[0027] U jednom obliku izvođenja, X na poziciji 10 formule (I), izabran je iz Z, gde Z predstavlja neku polarnu, negativno naelektrisanu aminokiselinu, izabranu između D ili E. U jednom obliku izvođenja, Z na poziciji 10 formule (I), izabran je iz D.
[0028] U jednom obliku izvođenja, X na poziciji 11 formule (I), izabrano je iz O, gde O predstavlja neku nepolarnu, alifatičnu aminokiselinu odabranu između G, A, I, L, P i V. U jednom obliku izvođenja, O na poziciji 11 formule (I) odabrano je iz I.
[0029] U jednom obliku izvođenja, jedinjenje formule (I) je jedinjenje formule (Ia):
-Ci-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-Cii-E-D-F-Y-Z-O-Ciii- (SEQ ID NO: 6) (Ia); gde U, O, J i Z imaju prethodno definisana značenja.
[0030] U jednom obliku izvođenja, jedinjenje formule (I) je jedinjenje formule (Ib):
-Ci-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (SEQ ID NO: 7) (Ib).
[0031] U jednom obliku izvođenja, jedinjenje formule (I) je jedinjenje formule (Ic):
-Ci-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (SEQ ID NO: 8) (Ic).
[0032] U jednom obliku izvođenja, jedinjenje formule (I) je jedinjenje formule (Id):
-Ci-Y/M-N-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (SEQ ID NO: 9) (Id).
[0033] U jednom obliku izvođenja, jedinjenje formule (I) je jedinjenje formule (Ie):
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (SEQ ID NO: 2) (Ie).
[0034] U još jednom dodatnom obliku izvođenja, peptid formule (I) sadrži sekvencu odabranu između:
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (SEQ ID NO: 2);
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-12) (SEQ ID NO: 10);
-Ci-F-G-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-02) (SEQ ID NO: 11);
-Ci-V-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-03) (SEQ ID NO: 12);
-Ci-F-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-04) (SEQ ID NO: 13);
-Ci-Y-N-E-Y-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07-N057) (SEQ ID NO: 14); i
-Ci-Y-N-E-W-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-44-N002) (SEQ ID NO: 15).
[0035] Utvrđeno je da su peptidi prema ovom obliku izvođenja potentni kandidati koji bi nakon sazrevanja afiniteta, ispoljili visoku specifičnost prema hemopeksinskom domenu MT1-MMP (videti Primer 1 i Tabele 1 i 8).
[0036] U još jednom obliku izvođenja, peptid formule (I) sadrži sekvencu odabranu između:
-Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (SEQ ID NO: 2); i
-Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-12) (SEQ ID NO: 10).
[0037] Peptidi prema ovom obliku izvođenja identifikovani su kao kandidati koji bi ispoljili najveći afinitet prema hemopeksinskom domenu MT1-MMP, nakon sazrevanja afiniteta, sinteze središnje bicklične sekvence i kvantitativnih merenja afiniteta, primenom postupaka kompetitivnih merenja (videti Primer 1 i Tabele 1-3).
[0038] U još jednom narednom obliku izvođenja, peptid formule (I), uključuje sekvencu izabranu iz -Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (SEQ ID NO: 2). Peptid prema ovom obliku izvođenja, identifikovan je kao najpotentniji i najstabilniji član porodice peptidnih liganada formule (I) (videti Primere 1 do 4).
[0039] U jednom obliku izvođenja, neki peptidni ligandi prema pronalasku ispoljavaju punu unakrsnu reaktivnost prema MT1-MMP iz miša, psa, makaki majmuna i čoveka. U narednom obliku izvođenja, posebno su reprezentativni peptidni ligandi koji ispoljavaju punu unakrsnu reaktivnost sa MT-1-MMP iz miša, psa, makaki majmuna i čoveka. Na primer, prezentovani su podaci koji pokazuju da su i stabilisani i nestabilisani derivati 17-69-07 (odnosno, 17-69-07-N219 i 17-69-07-N241) potpuno unakrsno reaktivni (videti Tabelu 13).
[0040] U narednom obliku izvođenja, peptidni ligand prema pronalasku ispoljava selektivnost prema MT1-MMP, ali u isto vreme ne reaguje unakrsno sa MMP-1, MMP-2, MMP-15 i MMP-16. Prezentovani su podaci koji pokazuju da središnja sekvenca 17-69-07 i stabilisana varijanta 17-69-07-N258, ispoljavaju isključivu selektivnost prema MT1-MMP (videti Tabelu 14).
Prednosti peptidnih liganada
[0041] Ciklični peptidi prema predmetnom pronalasku ispoljavaju brojna povoljna svojstva, usled čega se mogu dalje razmatrati kao potencijalni lekovima–slični molekuli pogodni za injektovanje, inhalaciju, nazalnu, okularnu, oralnu ili površinsku primenu. Ova povoljna svojstva obuhvataju:
- Unakrsna reaktivnost među vrstama. Ovo je uobičajeni zahtev za prekliničku farmakodinamičku i farmakokinetičku evaluaciju;
- Proteazna stabilnost. Idealno je da biciklični peptidni ligandi ispoljavaju stabilnost na proteaze prisutne u plazmi, proteaze u epitelu (“vezane za membranu”), gastrične i intenstinalne proteaze, proteaze na plućnoj površini, unutarćelijske proteaze i slično. Proteazna stabilnost treba da se održava između različitih vrsta, tako da se biciklični vodeći kandidat može razviti u životinjskim modelima, i bezbedno se primenjivati kod ljudi;
- Poželjan profil rastvorljivosti. Ova osobina zavisi od relativne zastupljenosti naelektrisanih i hidrofilnih prema hidrofobnim aminokiselinskim ostacima, kao i broja intra/inter međumolekulskih vodoničnih veza, što je od značaja za formulisanje i apsorpciju; i
- Optimalnog polu-života u cirkulaciji. Zavisno od kliničke indikacije i terapijskog režima, biće potrebno da se razvije biciklični peptid za kratko eksponiranje u toku lečenja akutne bolesti, ili će biti potrebno da se razvije biciklični peptid sa produženim zadržavanjem u cirkulaciji, pogodan za lečenje hroničnih stanja bolesti. Od ostalih faktora od kojih zavisi poželjan polu-život u plazmi, treba navesti zahtev za produženim eksponiranjem, kako bi se postigao maksimalan terapeutski učinak, uz prihvatljivu toksikologiju usled produženog izlaganja ovom agensu.
Farmaceutski prihvatljive soli
[0042] Smatraće se da su soli obuhvaćene domenom predmetnog pronalaska, pa pozivanje na jedinjenja formule (I) obuhvataju soli navedenih jedinjenja.
[0043] Soli prema predmetnom pronalasku mogu se sintetisati iz polaznog jedinjenja koja sadrži bazne ili kisele komponente, primenom konvencionalnih hemijskih postupaka, koji su opisani, na primer, u izdanju Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, tvrdi povez, 388 strana, August 2002. Načelno, ove soli mogu se dobiti reakcijom slobodne kisele ili bazne forme ovih jedinjenja sa odgovarajućim bazama ili kiselinama u vodi, ili u nekom organskom rastvaraču, ili u smeši prethodna dva.
[0044] Kisele adicione soli (mono- ili di-soli) mogu se dobiti primenom različitih kiselina, bilo neorganskih ili organskih. Primeri kiselih adicionih soli obuhvataju mono- i di-soli formirane sa kiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od sirćetne, 2,2-dihlor-sirćetne, adipinske, algininske, askorbinske (na primer, L-askorbinska), L-aspartatne, benzene-sulfonske, benzojeve, 4-acetamido-benzojeve, buterne, (+) kamforne, kamfor-sulfonske, (+)-(1S)-kamfor-10-sulfonske, kaprinske, kaproinske, kaprilne, cimetne, limunske, ciklaminske, dodecil-sumporne, etan-1,2-disulfonske, etansulfonske, 2-hidroksietansulfonske, mravlje, fumarne, galaktarinske, gentizinske, glukoheptonske, D-glukonske, glukuronske (na primer, D-glukuronske), glutaminske (na primer, L-glutaminske), α-oksoglutaratne, glikolne, hipurinske, vodonik-halidne kiseline (na primer, bromovodonične, hlorovodonične, jodovodonične), isetionske, mlečne (na primer, (+)-L-mlečna, (±)-DL-mlečna), laktobionske, maleinske, jabučne, (-)-L-jabučne, malonske, (±)-DL-bademove, metansulfonske, naftalen-2-sulfonske, naftalen-1,5-disulfonske, 1-hidroksi-2-naftojeve, nikotinske, azotne, oleinske, orotične, oksalne, palmitinske, pamoinske, fosforne, propionske, pirogrožđane, L-piroglutaminske, salicilne, 4-amino-salicilne, sebacinske, stearinske, ćilibarne, sumporaste, taninske, vinske, (+)-L-vinske, tiocijaninske, ptoluenesulfonske, undecilenske i valerijalnske kiseline, kao i acilovane aminokiseline i katjonizmenjivačke smole.
[0045] Konkretna grupa soli sačinjena je od soli formiranih pomoću sirćetne, hlorovodonične, jodovodonične, fosforne, azotne, sumporne, limunske, mlečne, ćilibarne, maleinske, jabučne, isetionske, fumarne, benzen-sulfonske, toluene-sulfonske, sumporne, metan-sulfonske (mezilat), etansulfonske, naftalen-sulfonske, valerijanske, propionske, butanske, malonske, glukuronske i laktobionske kiseline. Jedna konkretna so je hidrohloridna so. Sledeća konkretna so je so sirćetne kiseline.
[0046] Ako je jedinjenje anjonsko, ili ima neku funkcionalnu grupu koja može biti u formi anjona (na primer, -COOH može biti -COO-), onda se soli mogu formirati pomoću organske ili neorganske baze, uz nastanak pogodnog katjona. Primeri pogodnih neorganskih katjona obuhvataju, bez ograničenja, jone alkalnih metala, na primer, Li<+>, Na<+>i K<+>, katjone alkalnih zemljanih metala, kao što su Ca<2+>i Mg<2+>, i druge katjone, kao što su Al<3+>ili Zn<2+>. Primeri pogodnih organskih katjona obuhvataju, bez ograničenja, amonijum jon (to jest, NH4<+>) i supstituisane amonijum jone (na primer, NH3R<+>, NH2R2<+>, NHR3<+>, NR4<+>). Primeri nekih pogodno supstituisanih amonijum jona su oni dobijeni od: metilamina, etilamina, dietilamina, propilamina, dicikloheksilamina, trietilamina, butilamina, etilenediamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, holina, meglumina, i trometamina, kao i aminokiselina, kao što su lizin i arginin. Primer tipičnog kvaternernog amonijum jona je N(CH3)4<+>.
[0047] Kada jedinjenja formule (I) sadrže amino grupu, onda ona mogu formirati kvaternerne amonijumove soli, na primer, u reakciji sa alkilirajućim agensom, prema postupcima dobro poznatim u stanju tehnike. Ovakva kvaternerna amonijumska jedinjenja obuhvaćena su domenom formule (I).
Modifikacije
[0048] U jednom obliku izvođenja pronalaska, peptidni ligand obuhvata jednu ili više modifikacija izabranih između; N-teminusnih i C-terminusnih modifikacija; zamene jedne ili više aminokiselina, jednom ili više prirodno nepostojećih aminokiselina (kao što su zamene jedne ili više polarnih aminokiselina, jednom ili više izosteričnih ili izoelektričnih aminokiselina); zamena jedne ili više ne-polarnih aminokiselina drugim prirodno nepostojećim izosteričnim ili izoelektričnim aminokiselinama); dodavanje razdelne grupe; zamena jedne ili više oksidaciono osetljivih aminokiselina jednom ili više oksidativno rezistentnih aminokiselina; zamena jedne ili više aminokiselina alaninom, zamena jedne ili više L-aminokiselina jednom ili više D-aminokiselina; N-alkilacija jedne ili više amidnih veza unutar bicikličnog peptidnog liganda; zamena jedne ili više peptidnih veza surogat vezama; modifikacija dužine peptidnog skeleta; zamena vodonika na alfa-ugljenikovom atomu jedne ili više aminokiselina drugom hemijskom grupom, modifikacija aminokiselina, kao što su cistein, lizin, glutamat/aspartat i tirozin, pogodnim amin, tiol, karboksilnim ili fenol-reaktivnim reagensom, i funkcionalizovanjem navedenih aminokiselina, uvođenje ili zamena aminokiselina koje unose ortogonalne reaktivnosti koje su pogodne za zamenu funkcionalne grupe, na primer, aminokiseline koje nose azid ili alkin-grupu koje omogućavaju funckionalizaciju alkinskom, odnosno, azidnom komponentom.
[0049] U jednom obliku izvođenja, modifikacija obuhvata modifikaciju aminokiseline na poziciji 1 i/ili 9. Prikazani su rezultati koji pokazuju da su ove pozicije, naročito kada je prisutan tirozin, najpodložnije proteolitičkoj degradaciji.
[0050] U jednom obliku izvođenja, modifikacija obuhvata N-terminsnu i/ili C-terminusnu modifikaciju. U narednom obliku izvođenja, modifikacija obuhvata N-terminusnu modifikaciju primenom pogodne amino-reaktivne reakcije i/ili C-terminusnu modifikaciju primenom pogodne karboksi-reaktivne reakcije. U narednom obliku izvođenja, naznačene N-terminusna ili C-terminusna modifikacija obuhvataju dodatni citotoksični agens.
[0051] U narednom obliku izvođenja, modifikacija obuhvata N-terminusnu modifikaciju. U narednom obliku izvođenja, navedena N-terminusna modifikacija obuhvata N-terminusnu acetil grupu, kao što je ovde obelodanjen peptidni ligand 17-69-07-N004. U ovom obliku izvođenja, N-terminusna grupa cisteina (grupa na koju se ovde referiše je Ci), zaštićena je acetatnim anhidridom ili drugim odgovarajućim reagensom tokom sinteze peptida, čime nastaje molekul koje je acetilovan na N-terminusu. Ovaj oblik izvođenja pronalaska obezbeđuje povoljnu mogućnost uklanjanja potencijalnih tačaka prepoznavanja od strane aminopeptidaza, i sprečavanje potencijalne degradacije takvog bicikličnog peptida.
[0052] U alternativnom obliku izvođenja, modifikacija na N-terminusu obuhvata adiciju molekulskog razdelnika, koji omogućava konjugaciju efektorskih grupa i zadržavanje preferencije bicikličnog peptida prema njegovoj molekulskoj meti, kao što je Ala, G-Sar10-A ili bAla-Sar10-A grupa. Prikazani podaci pokazuju da adicija ovih grupa bicikličnom peptidu 17-69-07 ne menja njegov afinitet prema ciljnom proteinu (Tabele 11-12).
[0053] U narednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija obuhvata modifikaciju na C-terminusu. U narednom obliku izvođenja pronalaska, ova modifikacija na C-terminusu obuhvata amidnu grupu. U ovom obliku izvođenja, C-terminusna grupa cisteina (koja se označava kao Ciii), sintetiše se u vidu amida tokom peptidne sinteze, što dovodi do nastanka molekula koji nosi amidnu grupu na C-terminusu. Ovaj oblik izvođenja obezbeđuje povoljnu mogućnost uklanjanja potencijalnog mesta prepoznavanja od strane enzima karboksipeptidaza i smanjuje mogućnost proteolitičke degradacije takvog bicikličnog peptida.
[0054] U jednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija obuhvata zamenu jedne ili više aminokiselina jednom ili više prirodno nepostojećih aminokiselina. U ovom obliku izvođenja, prirodno ne-postojeće aminokiseline mogu se izabrati tako da imaju izosterične/izoelektrične bočne lance, koje ne mogu biti prepoznate od degradacionih proteaza, a nemaju ni nepovoljan uticaj na afinitet prema ciljnoj molekulu.
[0055] Alternativno, mogu se primeniti prirodno nepostojeće aminokiseline sa ograničenim bočnim lancem, koji umanjuje mogućnosti proteolitičke degradacije obližnjih peptidnih veza. Konkretno, ovo se odnosi na analoge prolina, glomazne bočne lance, Cα-disupstituisane derivate (na primer, aminoizobuternu kiselinu, Aib), i ciklične aminokiseline, čiji je jednostavni derivat amino-ciklopropil-karboksilna kiselina.
[0056] U jednom obliku izvođenja pronalaska, prirodno nepostojeća aminokiselina se uvodi na poziciji 4. Prikazani podaci pokazuju da su na ovoj poziciji dobro tolerišu i druge brojne prirodno nepostojećih aminokiseline (videti Tabelu 8). U narednom obliku izvođenja pronalaska, prirodno nepostojeća aminokiselina na poziciji 4 izabrana je između: 1-naftil-alanina; 2-naftilalanina; cikloheksil-glicina, fenil-glicina; terc-butilglicina; 3,4-dihlorofenilalanina; cikloheksilalanina; i homofenil-alanina.
[0057] U još jednom obliku izvođenja pronalaska, prirodno nepostojeća aminokiselina prisutna na poziciji 4 izabrana je između: 1-naftil-alanina; 2-naftil-alanina; i 3,4-dihlorofenil-alanina. Prezentovani podaci pokazuju da ove supstitucije povećavaju afinitet prema ciljnom molekulu u odnosu na nemodifikovane originalne sekvence (videti Tabelu 8).
[0058] U još jednom obliku izvođenja pronalaska, prirodno nepostojeća aminokiselina na poziciji 4 izabrana je od: 1-naftil-alanina. Prikazani podaci pokazuju da ova supstitucija obezbeđuje najveće povećanje afiniteta (više od 7 puta) u odnosu na neizmenjenu sekvencu (videti Tabelu 8).
[0059] U jednom obliku izvođenja pronalaska, prirodno nepostojeća aminokiselina uvodi se na poziciji 9 i/ili 11. Prikazani podaci pokazuju da se na ovim pozicijama dobro tolerišu brojne prirodno nepostojeće aminokiseline (videti Tabelu 9).
[0060] U narednom obliku izvođenja pronalaska, prirodno nepostojeća aminokiselina prisutna na poziciji 9 je 4-bromofenil-alanin ili pentafluoro-fenilalanin.
[0061] U narednom obliku izvođenja pronalaska, prirodno nepostojeća aminokiselina na poziciji 11 je terc-butilglicin.
[0062] U još jednom obliku izvođenja, prirodno nepostojeća aminokiselina prisutna na poziciji 9 je 4-bromofenilalanin. Prikazani podaci pokazuju promenu Tyr9 proteolitičke tačke prepoznavanja (videti Tabelu 9).
[0063] U još jednom obliku izvođenja pronalaska, prirodno nepostojeća aminokiselina prisutna na poziciji 11 je terc-butil-glicin. Prikazani podaci pokazuju da ova izmena dovodi do pojačavanja aktivnosti i snažno štiti osnovu susednih aminokiselina od proteolitičke hidrolize, svojim steričnim ometanjem (videti Tabelu 9).
[0064] U jednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija obuhvata više prethodno opisanih modifikacija, na primer, 2, 3, 4 ili 5 ili više modifikacija. U narednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacije obuhvataju 2, 3, 4 ili 5 narednih modifikacija, kao što je pet narednih modifikacija: D-alanin na pozicijama 1 i 5, 1-naftil-alanin na poziciji 4, 4-bromofenil-alanin na poziciji 9 i terc-butilglicin na poziciji 11. Predstavljeni podaci pokazuju da se navedene višestruke supstitucije (17-69-07-N252; 17-69-07-N244 i 17-69-07-N255) dobro tolerišu uz afinitet koji je veći nego kod neizmenjene sekvence (videti Tabele 10-12). U još jednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija obuhvata naredne modifikacije: D-alanin na pozicijama 1 i 5, 1-naftil-alanin na poziciji 4 i terc-butilglicin na poziciji 11. Predstavljeni podaci pokazuju da se ove višestruke supstitucije (17-69-07-N239) dobro tolerišu, a da je afinitet veći nego kod neizmenjene sekvence (videti Tabelu 11).
[0065] U jednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija obuhvata dodavanje razdelne grupe. U narednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija obuhvata dodavanje razdelne grupe na N-terminusni cistein (Ci) i/ili C-terminusni cistein (Ciii).
[0066] U jednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija obuhvata zamenu jedne ili više oksidaciono osetljivih aminokiselina jednom ili više oksidaciono rezistentnih aminokiselina. U narednom obliku izvođenja pronalaska, ova modifikacija obuhvata zamenu aminokiseline triptofan, naftil-alaninom ili alaninom. Ovaj oblik izvođenja pronalaska ima povoljne osobine, jer povećava profil farmaceutske stabilnosti rezultujućeg bicikličnog peptidnog liganda.
[0067] U jednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija obuhvata zamenu jedne ili više naelektrisanih aminokiselina, jednom ili više hidrofobnih aminokiselina. U alternativnom obliku izvođenja pronalaska, navedena modifikacija obuhvata zamenu jedne ili više hidrofobnih aminokiselina, jednom ili više naelektrisanih aminokiselina. Pravi balans naelektrisanih i hidrofobnih aminokiselina je važno svojstvo bicikličnih peptidnih liganada. Primera radi, hidrofobne aminokiseline utiču na stepen vezivanja proteina u plazmi, pa time i na koncentraciju slobodne dostupne frakcije u plazmi, dok naelektrisane aminokiseline (naročito arginin), mogu da utiču na interakciju peptida sa fosfolipidnom slojem ćelijske membrane. Oba tipa aminokiselina utiču na polu-život, zapreminsku distribuciju, eksponiranost peptidnog leka, i mogu se podešavati prema zahtevima kliničke primene. Takođe, specifična kombinacija i broj naelektrisanih aminokiselina mogu smanjiti iritaciju na mestu injektiranja (ukoliko se peptidni lek primenjuje potkožno).
[0068] U jednom obliku izvođenja pronalaska, modifikacija sadrži zamenu jedne ili više L-aminokiselina, jednom ili više D-aminokiselina. Smatra se da ovaj oblik izvođenja povećava proteolitičku stabilnost, uvođenjem steričnih prepreka i sklonošću D-aminokiselina da konformaciju β-ploče (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).
[0069] U narednom obliku izvođenja pronalaska, aminokiselina na poziciji 1 je supstituisana D-aminokiselinom, kao što je D-alanin. Prikazani podaci pokazuju zadržavanje afiniteta bez uticaja na degradaciju (videti Tabelu 6).
[0070] U narednom obliku izvođenja pronalaska, aminokiselina na poziciji 5 je supstituisana D-aminokiselinom, na primer, D-alaninom ili D-argininom. Prikazani podaci demonstriraju zadržavanje afiniteta bez posledične degradacije (videti Tabelu 7).
[0071] U jednom obliku izvođenja pronalaska, ova modifikacija obuhvata uklanjanje neke aminokiseline i njenu supstituciju alaninom. Ovaj oblik izvođenja pronalaska obezbeđuje povoljnu osobinu uklanjanja mesta potencijalnog proteolitičkog napada.
[0072] Treba naglasiti da je smisao svake od prethodno pomenutih modifikacija da poboljša afinitet ili stabilnost peptida. Dalja poboljšanja zasnovana na modifikacijama mogu se postići na sledeći način:
- Uvođenjem hidrofobnih komponenti pojačavaju se hidrofobni efekti i smanjuje se stopa disocijacije, odnosno, postiže se veći afinitet;
- Uvođenjem naelektrisanih grupa koje uspostavljaju dalekometne jonske interakcije, povećava se stopa vezivanja, što rezultira većim afinitetom (videti, na primer, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol.
3, 427-31); i
- Uvođenjem dodatnih ograničenja u peptid, na primer, ograničenjem bočnih lanaca aminokiselina koji dovode do minimalnog gubitka entropije nakon vezivanja za ciljni molekul i uvođenjem dodatne ciklizacije u molekul iz istih razloga (videti pregledni članak, Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, and Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).
Izotopske varijacije
[0073] Predmetni pronalazak obuhvata sva farmaceutski prihvatljiva (radio)izotopski-obeležena jedinjenja prema pronalasku, odnosno, jedinjenja formule (I), pri čemu je jedan ili više atoma zamenjeno atomima sa istim atomskim brojem, ali sa atomskom masom i masenim brojem koji se razlikuju od atomske mase i masenog broja obično prisutnih u prirodi, i jedinjenja formule (I), naznačena time da su prikačene metal-helirajuće grupe (nazvane “efektor”), sposobne da drže vezane relevantne (radio)izotope i jedinjenja formule (I), gde su neke funkcionalne grupe kovalentno zamenjene relevantnim radio(izotopima) ili izotopski obeleženim funkcionalnim grupama.
[0074] Primeri izotopa pogodnih za uključivanje u jedinjenje prema pronalasku obuhvataju izotope vodonika, kao što su<2>H (D) i<3>H (T), ugljenika, kao što su<11>C,<13>C i<14>C, hlora, kao što je<36>Cl, fluora, kao što je<18>F, joda, kao što su<123>I,<125>I i<131>I, azota, kao što su<13>N i<15>N, kiseonika, kao što su<15>O,<17>O i<18>O, fosfora, kao što su<32>P, sumpora, kao što su<35>S, bakra, kao što su<64>Cu, galijuma, kao što su<67>Ga ili<68>Ga, itrijuma, kao što je<90>Y i lutecijuma, kao što je<177>Lu, i bizmuta, kao što je<213>Bi.
[0075] Neka izotopski-obeležena jedinjenja formule (I), na primer, ona sa ugrađenim radioaktivnim izotopom, korisna su u studijama distribucije leka ili supstrata u tkiva, kao i kod kliničke procene prisustva i/ili odsustva MT1-PPM u obolelom tkivu, kao što je tumor ili u drugim tkivima. Jedinjenja formule (I) mogu dalje da imaju značajna dijagnostička svojstva, u tom smislu što se mogu koristiti za detekciju ili identifikaciju formiranja kompleksa između obeleženog jedinjenja i drugih molekula, peptida, proteina, enzima ili receptora. Ova jedinjenja obeležena agensima, kao što su radioizotopi, enzimi, fluorescentne supstance, luminozne supstance (na primer, luminol, derivati luminola, luciferin, ekvorin i luciferaza), i slično, mogu se koristiti u postupcima detekcije ili identifikacije. Radioaktivni izotopi tricijum, odnosno,<3>H (T), i ugljenik-14, to jest,<14>C, posebno su korisna za ove svrhe, u svetlu njihovog lakog ugrađivanja i jednostavne detekcije.
[0076] Supstitucije težim izotopima, kao što je deuterijum, odnosno,<2>H (D), mogu doneti neke terapeutske prednosti usled povećane metaboličke stabilnosti, produženog polu-života in vivo i smanjenog režima doziranja, pa stoga u nekim slučajevima mogu biti pogodan tip modifikacije.
[0077] Supstitucije izotopima koji emituju pozitrone, kao što su<11>C,<18>F,<15>O i<13>N, može biti primenjeno u studijama pozitron emisione tomografije (PET), za izučavanje stepena vezanosti za ciljne molekule.
[0078] Ugrađivanje izotopa metal-helirajućih efektorsih grupa, kao što su<64>Cu,<67>Ga,<68>Ga, i<177>Lu može biti od koristi u postupcima vizuelizacije tumora specifičnih antigena, posredstvom PET ili SPECT odslikavanja. Konkretno, ovakvi podaci biološke distribucije prikazani su u Primeru 3.
[0079] Ugrađivanje izotopa u metal-helirajuće efektorske grupe, kao što su, bez ograničenja,<90>Y,<177>Lu, i<213>Bi, može biti jedna od opcija ciljane radioterapije, u kojoj jedinjenje formule (I) sa vezanim metal-helatorom, nosi i terapeutski radionuklid prema ciljnom proteinu na mestu delovanja.
[0080] Izotopski obeležena jedinjenja formule (I) načelno se mogu dobiti konvencionalnim postupcima, poznatim u stanju tehnike, ili postupcima koji su analogni onima koji su opisani u pratećim Primerima, uz korišćenje odgovarajućeg izotopski-obeleženog, umesto neobeleženog reagensa koji je prethodno primenjen.
Vezujuća aktivnost
[0081] Specifičnost se, u predmetnom kontekstu, odnosi na sposobnost liganda da se veže za ili da na drugi način stupi u interakciju sa poznatom ciljnim molekulom, a da izbegne reakciju sa entitetima koji su slični ciljnom molekulu. Na primer, specifičnost može da se odnosi na sposobnost liganda da inhibira interakciju nekog humanog enzima, ali ne i homologog enzima druge vrste. Primenom postupaka koji su ovde opisani, moguće je modulisati specifičnost, odnosno, moguće ju je povećati ili smanjiti, tako da se ligandi učine više ili manje sposobnima da stupe u interakciju sa homologim ili paralogim ciljnim molekulima. Značenje termina specifičnost nije isto kao značenje kao termina aktivnost, afinitet ili aviditet, a potentnost reagovanja liganda sa svojom metom (na primer, vezujući afinitet ili nivo inhibicije) nije nužno povezana sa njegovom specifičnošću.
[0082] Vezujuća aktivnost, kao što je ove primenjeno, odnosi se na kvantitativna vezujuća merenja, koja se sprovode u esejima vezivanja, kao što je ovde opisano. Stoga se afinitet vezivanja iskazuje kao količina peptidnog liganda vezanog pri određenoj koncentraciji ciljnog molekula.
[0083] Multispecifičnost je sposobnost da se vežu dva ili više ciljnih molekula. Tipično, vezujući peptidi su sposobni da se vežu za jedan ciljni molekul, kao što je epitop u slučaju antitela, usled njihovih obostranih konformacionih svojstava. Međutim, moguće je razviti peptide koji vezuju dva ili više ciljnih molekula; na primer, u stanju tehnike su poznata dualno specifična antitela. U predmetnom pronalasku, peptidni ligandi mogu biti sposobni da se vežu za dva ili više ciljnih molekula, pa su stoga, multispecifični. Pogodno, oni se mogu vezati za dva ciljna molekula i onda su dualno specifični. Vezivanje može biti nezavisno, što bi značilo da vezujuća mesta za ciljne molekule na peptidu nisu povezana tako da vezivanje jednog ciljnog molekula otežava vezivanje drugog. U tom slučaju, oba ciljna molekula se mogu vezati nezavisno. Načelno, očekuje se da će vezivanje jednog ciljnog molekula makar delimično ometati vezivanje drugog.
[0084] Postoji suštinska razlika između dulano specifičnih liganada i liganada čija specifičnost obuhvata dve slične mete. U prvom slučaju, ligand je specifičan za oba ciljna molekula pojedinačno, i sa njima stupa u interakciju na specifičan način. Na primer, prva petlja liganda može da veže prvi ciljni molekul, a druga petlja drugi ciljni molekul. U drugom slučaju, ligand nije specifičan, jer ne razlikuje dva ciljna molekula, na primer, time što stupa u interakciju sa epitopom koji je zajednički za oba ciljna molekula.
[0085] U kontekstu predmetnog pronalaska, moguće je da ligand, koji ima aktivnost prema ciljnom i ortolognom molekulu, bude bispecifičan ligand. Međutim, u jednom obliku izvođenja, ligand nije bispecifičan, već ima manju specifičnost, tako da vezuje i ciljni molekul i jedan ili više ortolognih molekula. Uopšteno, manje je verovatno da će ligand, koji nije selektovan prema ciljnom molekulu i ortologu, biti bispecifičan, zbog odsustva selektivnog pritiska prema bispecifičnosti. Dužina petlje u bicikličnom peptidu može da igra presudnu ulogu u kreiranju vezujuće površine, koja će obezbediti unakrsnu reaktivnost prave mete i ortolognog molekula, uz održavanje visoke selektivnosti prema manje sličnim homolozima.
[0086] Kada su ligandi stvarno bispecifični, u jednom obliku izvođenja, najmanje jedna ciljna specifičnost liganda biće zajednička za sve izabrane ligande, a nivo te specifičnosti moći će se modulisati opisanim postupcima. Druge i dodatne specifičnosti ne moraju biti zajedničke, i ne moraju biti predmet iznetih postupaka.
[0087] Ciljni molekul je molekul ili njegov deo za koji se peptidni ligand vezuje ili sa njim stupa u interakciju. Iako se vezivanje smatra preduslovom za većinu aktivnosti i može biti aktivnost po sebi, takođe su predviđene i neke druge aktivnosti. Stoga, predmetni pronalazak ne zahteva merenje vezivanja, bilo direktno ili indirektno.
[0088] Molekulska skela je molekul sposoban da poveže peptid na većem broj mesta i da to rezultira jednom ili više strukturnih karakteristika peptida. Poželjno je da molekulska skela sadrži najmanje tri vezne tačke za peptid, koje se ovde pominju pod imenom reaktivne grupe skele. Ove grupe su sposobne da reaguju sa cisteinskim ostacima (Ci, Ciii Ciii) peptida i da formiraju kovalentne veze. One ne formiraju nužno disulfidne veze, koje su predmet reduktivne razgradnje, i posledične dezintegracije molekula, već formiraju stabilne kovalentne tioetarske veze. Poželjne strukture molekulske skele su kasnije opisane.
Molekulska skela
[0089] Molekulske skele su opisane u WO 2009/098450 i u citiranim referencama, posebno, WO 2004/077062 i WO 2006/078161.
[0090] Kao što je rečeno u prethodnim dokumentima, molekulska skela može biti mali molekul, kao što je mali organski molekul.
[0091] U jednom obliku izvođenja, molekulska skela može biti ili se može zasnivati na prirodnim monomerima, kao što su nukleozidi, šećeri ili steroidi. Na primer, molekulska skela može sadržati kratak polimer takvih entiteta, kao što je dimer ili trimer.
[0092] U jednom obliku izvođenja, molekulska skela je jedinjenje poznate toksičnosti, na primer, niske toksičnosti. Primeri pogodnih jedinjenja obuhvataju holesterol, nukleotide, steroide i postojeće lekove, kao što je tamazepam.
[0093] U jednom obliku izvođenja, molekulska skela može biti makromolekul. U jednom obliku izvođenja, molekulska skela može biti makromolekul, sačinjen od aminokiselina, nukleotida i ugljenih hidrata.
[0094] U jednom obliku izvođenja, molekulska skela sadrži reaktivne grupe sposobne da reaguju sa funkcionalnom(im) grupom(ama) polipeptida i da formiraju kovalentne veze.
[0095] Molekulska skela može da sadrži hemijske grupe koje formiraju vezu sa peptidom, kao što su amino, tiolni, alkoholi, ketoni, aldehidi, nitrili, karboksilne kiseline, estri, alkeni, alkini, azidi, anhidridi, sukcinimi, maleimid, alkil-halidi i acil-halidi.
[0096] U jednom obliku izvođenja, molekulska skela može sadržati ili se može sastojati od tris(bromometil)benzena, naročito, 1,3,5-tris(bromometil)benzena ('TBMB'), ili njegovog derivata.
[0097] U jednom obliku izvođenja, molekulska skela je 2,4,6-tris(bromometil)mezitilen. Ovaj molekul sličan je 1,3,5-tris(bromometil)benzenu, ali ne sadrži tri dodatne metil grupe vezane za benzenski prsten. Ovo pruža prednost jer dodatne metil grupe mogu formirati dodatne kontakte sa polipeptidom i time uneti dodatna strukturna ograničenja.
[0098] Molekulska skela prema pronalasku sadrži hemijske grupe koje dozvoljavaju funkcionalnim grupama polipeptida, kodiranim bibliotekom prema pronalasku, da formiraju kovalentne veze sa tom molekulskom skelom. Navedene funkcionalne grupe izabrane su iz širokog opsega funkcionalnih grupa, uključujući amine, tiole, ketone, aldehide, nitrile, karboksilne kiseline, estre, alkene, alkine, anhidride, sukcinimide, maleimide, azide, alkil-halide i acil-halide.
[0099] Reaktivne grupe koje se mogu iskoristiti na molekulskoj skeli, u reakciji sa tiolnim grupama cisteina, su alkil-halidi (poznati pod nazivom halogenoalkeni ili haloalkani).
[0100] Primeri uključuju bromometil-benzen (reaktivna grupa skele reprezentovana TBMB-om) ili jodoacetamid. Ostale reaktivne grupe skele koje se mogu iskoristiti za selektivno vezivanje jedinjenja za cistein proteina su maleimidi. Primeri maleimida koji se mogu koristiti kao molekulska skela u pronalasu obuhvataju: tris-(2-maleimidetil)amin, tris-(2-maleimidoetil)benzen, tris-(maleimid)benzen. Selenocistein je takođe prirodna aminokiselina koja ima sličnu reaktivnost prema cisteinu i može se primeniti u istim reakcijama. Stoga, kad god je cistein u pitanju, prihvatljivo je supstituisati selenocistein, osim ukoliko kontekst je sugeriše drugačije.
Efektorske i funkcionalne grupe
[0101] Prema sledećem aspektu pronalaska, obezbeđen je konjugat leka, koji sadrži peptidni ligand, kao što je opisano, konjugovan sa jednim ili više efektorskih i/ili funkcionalnih grupa.
[0102] Efektorske i/ili funkcionalne grupe mogu biti prikačene za N- ili C-terminus polipeptida, za aminokiselinu u sastavu polipeptida ili za molekulsku skelu.
[0103] Odgovarajuće efektorske grupe obuhvataju antitela i njihove delove ili fragmente. Na primer, efektorska grupa može da sadrži konstantan region (CL) lakog lanca antitela, CH1 domen teškog lanca antitela, CH2 domen teškog lanca antitela, CH3 domen teškog lanca antitela, ili njihove kombinacije, uz jedan ili više domena konstantnih regiona. Efektorska grupa može da sadrži region zgloba antitela (ovaj region se nalazi između CH1 i CH2 domena IgG molekula).
[0104] U narednom obliku izvođenja ovog aspekta pronalaska, efektorska grupa prema predmetnom pronalasku je Fc region IgG molekula. Poželjno je da peptid-ligand efektorska grupa prema predmetnom pronalasku, sadrži ili se sastoji od fuzionisanog peptidnog liganda i Fc fragmenta, sa tβ polu-životom od jednog dana ili više, dva dana ili više, 3 dana ili više, 4 dana ili više, 5 dana ili više, 6 dana ili više, 7 dana ili više. Najpovoljnije je da peptidni ligand prema pronalasku, sadrži ili se sastoji od fuzionisanog peptidnog liganda i Fc fragmenta, čiji je tβ poluživot jedan ili više dana.
[0105] Funkcionalne grupe obuhvataju, načelno, vezujuće grupe, lekove, reaktivne grupe za vezivanje drugih entiteta, funkcionalne grupe koje potpomažu preuzimanje makrocikličnih peptida u ćelije i slično.
[0106] Efikasnost peptida protiv unutarćelijskih molekulskih meta zavisi od njihove sposobnosti da uđu ćeliju. Unutarćelijske mete na koje mogu delovati peptidni ligandi sposobni da uđu u ćelije obuhvataju transkripcione faktore, unutarćelijske signalne molekule, kao što su tirozin kinaze, kao i molekule koji su uključeni u apoptotske puteve. Funkcionalne grupe koje omogućavaju ulazak u ćeliju obuhvataju peptide ili hemijske grupe dodate ili na peptide ili na molekulsku skelu. Peptidi, kao što su derivati VP22, HIV-Tat, homeoboks protein drozofila (Antennapedia), na primer, opisani su u Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, p821; Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637. Primeri kratkih peptida, koji se efikasno translociraju kroz ćelijsku membranu obuhvataju 16-aminokiselinski peptid penetratin iz Drosophila Antennapedia (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444), 18-aminokiselinski 'model amfipatičnog peptida' (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127) i arginin-bogate regione HIVTAT proteina. Ne-peptidni pristupi obuhvataju primenu molekularne mimikrije ili SMOC, koji se lako mogu vezati za biomolekule (Okuyama et al (2007) Nature Methods Volume 4 p153). Mogu se primeniti druge hemijske strategije dodavanja guanidijumskih grupa na molekule, koje takođe pojačavaju prodor u ćelije (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585). Na molekulsku skelu se mogu dodati molekuli male molekulske težine, kao što su steroidi, kako bi se poboljšao prodor u ćelije.
[0107] Jedna klasa funkcionalnih grupa koja se može prikačiti za peptidne ligande, obuhvata antitela i njihove vezujuće fragmente, kao što su Fab, Fv ili jednodomenski fragment. Konkretno, moguće je primeniti antitela koja se vezuju za proteine sposobne da povećaju polu-život peptidnih liganada in vivo.
[0108] Moguće je ugraditi RGD peptide, koji se vezuju za integrine prisutne na površini mnogih ćelija.
[0109] U jednom obliku izvođenja, konjugat peptidnog liganda-efektorske grupe prema pronalasku ima tβ polu-život koji iznosi oko: 12 sati ili više, 24 sata ili više, 2 dana ili više, 3 dana ili više, 4 dana ili više, 5 dana ili više, 6 dana ili više, 7 dana ili više, 8 dana ili više, 9 dana ili više, 10 dana ili više, 11 dana ili više, 12 dana ili više, 13 dana ili više, 14 dana ili više, 15 dana ili više ili 20 dana ili više. Povoljno je da konjugat peptidnog liganda-efektorske grupe ili kompozicija prema pronalasku imaju tβ polu-život u opsegu od 12 do 60 sati. U narednom obliku izvođenja, konjugat ima tβ polu-život od jednog ili više dana. U narednom obliku izvođenja, opseg polu-života je 12 do 26 sati.
[0110] U konkretnom obliku izvođenja pronalaska, funkcionalna grupa je izabrana među metalhelatorima, pogodnim za stvaranje kompleksa sa radioizotopom metala od medicinskog značaja. Kompleks ovakvih efektora sa navedenim radioizotopima daje korisne agense u terapiji kancera. Pogodni primeri obuhvataju DOTA, NOTA, EDTA, DTPA, HEHA, SarAr i druge (Targeted Radionuclide therapy, Tod Speer, Wolters/Kluver Lippincott Williams & Wilkins, 2011).
[0111] Moguće efektorske grupe mogu biti enzimi, na primer, karboksipeptidaza G2 za primenu u enzim/prolek terapiji, gde peptidni ligand zamenjuje antitelo u ADEPT.
[0112] U jednom konkretnom obliku izvođenja, funkcionalna grupa je izabrana iz grupe lekova, kao što su citotoksični agensi za terapiju kancera. Pogodni primeri obuhvataju alkilirajuće agense, kao što su cisplatin i karboplatin, kao i oksaliplatin, mehloretamin, ciklofosfamid, hlorambucil, ifosfamid; Anti-metabolite, uključujući purinski analog azatioprin i merkaptopurin ili pirimidinske analoge; biljne alkaloide i terpenoide, uključujući vinka alkaloide, kao što su Vinkristin, Vinblastin, Vinorelbin i Vindesin; Podofilotoksin i njegove derivate etoposid i teniposid; Taksane, uključujući paklitaksel, originalno poznat kao Taksol; inhibitore topoizomeraza, uključujući kamptotecine: irinotekan i topotekan, i inhibitore tipa II, uključujući amsakrin, etopozid, etopozid fosfat i tenipozid. Ostali agensi mogu da obuhvate antitumorske antibiotike, koji uključuju imunosupresivni daktinomicin (koji se koristi kod transplantacije bubrega), doksorubicin, epirubicin, bleomicin, kalihemcine, i ostale.
[0113] U jednom dodatnom obliku izvođenja pronalaska, citotoksični agens je izabran između majtanzinoida (kao što je DM1) ili monometil auristatina (kao što je MMAE).
[0114] DM1 je citotoksični agens, tiolski derivat majtanzina, naredne strukture:
[0115] Monometil auristatin E (MMAE) je sintetički anti-neoplastični agens, sledeće strukture:
[0116] Efekti peptidnih liganada konjugovanih sa toksinima koji sadrže DM1 ili MMAE predstavljeni su u Primerima 4 i 5.
[0117] U jednom obliku izvođenja, citotoksični agens je nekom razgradivom vezom povezan sa bicikličnim peptidom, pri čemu je veza disulfidna veza ili veza koja se razgrađuje delovanjem enzima proteaza. U narednom obliku izvođenja, funkcionalne grupe pored disulfidne veze su modifikovane tako da kontrolišu razgradnju dislufidne veze, a time i brzinu razgradnje, odnosno, oslobađanje citotoksičnog agensa.
[0118] Rad objavljen u literaturi ustanovio je mogućnost modifikacije razgradnje disulfidne veze, posredstvom steričnih ometača ubačenih sa obe strane disulfidne veze (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). Znatno sterično ometanje disulfidne veze smanjuje mogućnost njene redukcije posredstvom unutarćelijskog glutationa i vanćelijskog (sistemskog) redukujućeg agensa, što za posledicu ima sporije oslobađanje toksina, kako unutar, tako i van ćelije. Stoga je optimalan odnos između stabilnosti disulfidne veze u cirkulaciji (čime se smanjuju neželjeni nus-efekti toksina) i lakog oslobađanja toksina u unutarćelijskoj sredini (što povećava terapeutski efekat), moguće postići pažljivim izborom steričnog ometanja sa obe strane disulfidne veze.
[0119] Ometanje sa obe strane disulfidne veze moduliše se uvođenjem jedne ili više metil grupa, koje se vezuju ili na ciljni molekul (u ovom slučaju biciklični peptid), ili na toksinski deo ove molekularne konstrukcije.
[0120] Stoga, u jednom obliku izvođenja pronalaska, citotoksični agens je majtanzinoid izabran između molekula jedinjenja formule (II):
u kojoj je n ceo broj, izabran između 1 do 10; i
R1i R2nezavisno predstavljaju vodonik, C1-6alkil ili karbocikličnu ili heterocikličnu grupu.
[0121] Termin C1-6alkil, u predmetnom kontekstu označava linearnu ili razgranatu zasićenu ugljovodoničnu grupu sa 1 do 6 atoma ugljenika. Primeri ovakvih grupa uključuju metil, etil, npropil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil, terc-butil, n-pentil, izopentil, neopentil ili heksil i slične.
[0122] Termin "heterociklična" i "karbociklična" grupa, u predmetnom kontekstu, obuhvata, osim ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije, aromatične i ne-aromatične prstenove. Stoga, na primer, termin “heterociklični prsten” i “karbociklična grupa” obuhvataju unutar svog domena, aromatične, ne-aromatične, nezasićene, delimično zasićene i potpuno zasićene karbociklične ili heterociklične prstenove. Načelno, osim ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije, ove grupe mogu biti monociklične ili biciklične (uključujući fuzionisane ili premošćene biciklične grupe) i mogu sadržati, na primer, 3 do 12 članova u prstenu, češće 5 do 10 članova u prstenu.
[0123] U jednom obliku izvođenja jedinjenja formule (II), R1i R2nezavisno predstavljaju vodonik ili metil grupu.
[0124] U jednom obliku izvođenja jedinjenja formule (II), n ima vrednost 1, a R1i R2predstavljaju vodonik (na primer, majtanzinski derivat DM1).
[0125] U jednom alternativnom obliku izvođenja jedinjenja formule (II), n ima vrednost 2, R1predstavlja vodonik, a R2predstavlja metil grupu (odnosno, majtanzinski derivat DM3).
[0126] U jednom obliku izvođenja jedinjenja formule (II), n ima vrednost 2, a R1i R2predstavljaju metil grupe (odnosno, majtanzinski derivat DM4).
[0127] Smatraće se da citotoksični agens formule (II) može da formira disulfidnu vezu i da se u konjugovanoj strukturi sa bicikličnim peptidom formule (I), disulfidna veza između tiol-toksina (II) i tiol-bicikličnog peptida (III) uvodi putem nekoliko mogućih sintetskih shema, od kojih su dve opisane na Shemama II ili III.
[0128] U jednom obliku izvođenja, biciklični peptid kao komponenta konjugata ima strukturu prikazanu formulom (III):
(III)
gde m ima vrednost celog broja od 0 do 10, i
R3i R4nezavisno predstavljaju vodonik, C1-6alkil ili karbocikličnu ili heterocikličnu grupu.
[0129] U jednom obliku izvođenja jedinjenja formule (III), R3i R4nezavisno predstavljaju vodonik ili metil grupu.
[0130] Jedinjenja formule (III) u kojima su R3i R4vodonici, smatraju se prostorno neometenima, dok se jedinjenja formule (III) u kojima jedan ili oba radikala R3i R4imaju značenje metil grupe smatraju prostorno ometenima.
[0131] Smatraće se da biciklični peptid formule (III) može da formira disulfidnu vezu, i u konjugovanoj strukturi sa citotoksičnim agensom formule (II), disulfidna veza između tioltoksina (II) i tiol-bicikličnog peptida (III) se uvodi posredstvom nekoliko mogućih sintetskih shema, od kojih je jedna opisana na Shemi II.
[0132] U jednom obliku izvođenja, citotoksični agens je vezan za biciklični peptid posredstvom veznika formule (IV):
u kojoj R1, R2, R3i R4predstavljaju vodonik, C1-6alkil ili karbocikličnu ili heterocikličnu grupu;
Toksin može biti svaki pogodni citotoksični agens;
Biciklični peptid je svaki pogodan biciklični peptid, prema pronalasku;
n je ceo broj od 1 do 10; i
m je ceo broj od 0 do 10.
[0133] U jednom obliku izvođenja, R1, R2, R3i R4predstavljaju vodonik ili metal grupu.
[0134] Kada su R1, R2, R3i R4atomi vodonika, disulfidna veza je najmanje prostorno ometena, pa time i najpodložnija redukciji. Kada su R1, R2, R3i R4metil grupe, disulfidna veza je najviše prostorno ometena i time najmanje podložna redukciji. Delimična supstitucija vodonika i metil grupa dovodi do postepenog povećanja otpornosti na redukciju, i posledično na razgradnju veze i oslobađanje toksina.
[0135] U jednom obliku izvođenja, toksin formule (IV) je majtanzin, a konjugat sadrži jedinjenje formule (V):
u kojoj R1, R2, R3i R4predstavljaju vodonik, C1-6alkil ili karbocikličnu ili heterocikličnu grupu;
Biciklični peptid je neki pogodan biciklični peptid, kao što je opisano;
n je ceo broj od 1 do 10; i
m je ceo broj od 0 do 10.
[0136] U narednom obliku izvođenja jedinjenja formule (V), n je 1, a R1, R2, R3i R4predstavljaju vodonik, odnosno, jedinjenje formule (V)<a>:
[0137] BDC formule (V)<a>nosi i oznaku BT17BDC-17. Prostorno neometena disulfidna veza u BDC BT17BDC-17 ekvivalentna je BT17BDC-9, pri čemu je razlika između njih u delu bicikličnog peptida: BT17BDC-9 ima nestabilisanu sekvencu (17-69-07-N219), dok BT17BDC-17 ima stabilisani biciklični peptidni pandan (17-69-07-N241), koji je vezan amidnom vezom za toksin-disulfidnu konstrukciju. Ovaj neometeni derivat majtanzina, sa n = 1, nosi oznaku DM1.
[0138] U narednom obliku izvođenja jedinjenja formule (V), n ima vrednost 1, R1predstavlja metil grupu i R2, R3i R4predstavljaju vodonik, odnosno, jedinjenje formule (V)<b>:
[0139] BDC formule (V)<b>, koje nosi oznaku BT17BDC-18, sadrži jednu ometajuću metil grupu na strani bicikličnog peptida, i u kontekstu konjugata sa antitelom, odlikuje se 7-puta manjom osetljivošću prema redukujućem agensu, na primer, ditiotritolu (u poređenju sa ne-ometenom disulfidnom vezom) (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). Smanjenja osetljivost na redukciju uslovljava smanjenje brzine otpuštanja toksina. Neometeni derivat majtanzina sa n = 1 nosi oznaku DM1. BT17BDC-18 sadrži stabilizovani biciklični peptidni pandan (17-69-07-N241), koji je amidnom vezom vezan za toksin-disulfidnu konstrukciju.
[0140] U narednom obliku izvođenja jedinjenja formule (V), n ima vrednost 2, R1i R2su vodonik, i R3i R4predstavljaju metal grupu, odnosno, jedinjenje formule (V)<c>:
[0141] BDC formule (V)<c>nosi oznaku BT17BDC-19 i sadrži dve prostorno ometajuće metilgrupe na majtazinskom delu konstrukcije, što u kontekstu konjugata između antitela i leka, dovodi do četrnaestostrukog smanjenja osetljivosti na redukujući agens, kao što je ditiotritol. Smanjena senzitivnost prema redukciji u korelaciji je manjom brzinom oslobađanja toksina. Ovaj ometeni derivat majtanzina sa n = 2 nosi oznaku DM4. BT17BDC-19 sadrži stabilisani biciklični peptidni pandan (17-69-07-N241), koji je amidnom vezom vezan za toksin-disulfidnu konstrukciju.
[0142] U narednom obliku izvođenja jedinjenja formule (V), n ima vrednost 2, R1i R3označavaju metal grupu, R2i R4predstavljaju vodonik, odnosno, jedinjenje formule (V)<d>:
[0143] BDC formule (V)<d>nosi oznaku BT17BDC-20 i sadrži jednu ometajuću metil-grupu na majtazinskom delu molekula, i jednu prostorno ometajuću metil-grupu na delu molekula sa bicikličnim peptidom, a u kontekstu konjugata između antitela i leka, rezultuje 170-tostrukim smanjenjem osetljivosti na redukujući agens, kao što je ditiotritol. Smanjena senzitivnost na redukciju je u korelaciji sa smanjenom brzinom oslobađanja toksina. Prostorno ometeni derivat majtanzina sa vrednošću n = 2 nosi oznaku DM3. BT17BDC-20 sadrži stabilisani biciklični peptidni pandan (17-69-07-N241), koji je amidnom vezom vezan za toksin-disulfidnu konstrukciju.
[0144] U kontekstu konjugata sa antitelom, istraživanje u životinjskim modelima je pokazalo da je optimum balansa efikasnosti i tolerabilnosti uslovljen nekim nivoom prostornog ometanja disulfidne veze, kao kod DM4, na primer (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717), koji je kao takav takođe prisutan u BT17BDC-19.
[0145] U jednom obliku izvođenja, konjugat je izabran između BT17BDC-9, BT17BDC-17 (Jedinjenje formule (V)<a>), BT17BDC-18 (Jedinjenje formule (V)<b>), BT17BDC-19 (Jedinjenje formule (V)<c>) i BT17BDC-20 (Jedinjenje formule (V)<d>). Povoljna svojstva BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 i BT17BDC-20 prikazana su u Primeru 5 i u Tabelama 16 i 17.
[0146] U narednom obliku izvođenja, konjugat je izabran između BT17BDC-9, BT17BDC-17 (Jedinjenje formule (V)<a>), BT17BDC-18 (Jedinjenje formule (V)<b>) i BT17BDC-19 (Jedinjenje formule (V)<c>). Podaci su prikazani u Primeru 5 i u Tabelama 16 i 17 pokazuju da se ovi konjugati mogu smatrati pogodnim molekulima za primenu i ciljanoj terapiji kancera.
[0147] U narednom obliku izvođenja, konjugat je izabran između BT17BDC-17 (Jedinjenje formule (V)<a>), BT17BDC-18 (Jedinjenje formule (V)<b>) i BT17BDC-19 (Jedinjenje formule (V)<c>). Podaci prikazani u Primeru 5 i u Tabelama 16 i 17 pokazuju da se ovi konjugati mogu smatrati pogodnim molekulima za primenu i ciljanoj terapiji kancera i da se dobro tolerišu pri klinički efikasnim dozama.
Sinteza
[0148] Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu se sintetisati primenom standardnih postupaka, praćenih reakcijama sa molekulskom skelom in vitro. U procesu sinteze primenjuju se postupci standardne hemije. To omogućava proizvodnju na veliko solubilnih materijala za dalje nishodne eksperimente i validaciju. Ovi postupci mogu se postići primenom konvencionalne hemije, kao što je ona opisana kod Timmerman et al (iznad).
[0149] Stoga se pronalazak odnosi i na proizvodnju opisanih polipeptida ili izabranih konjugata, gde postupak proizvodnje obuhvata prema potrebi i druge korake, koji će biti opisani. U jednom obliku izvođenja, ovi koraci se izvode na krajnjem proizvodu polipeptidu/konjugatu koji je dobijen hemijskom sintezom.
[0150] Opciono, aminokiselinski ostaci unutar polipeptida od interesa mogu se supstituisati tokom proizvodnje konjugata ili kompleksa.
[0151] Peptide je moguće produžiti, kako bi se ugradila, na primer, još jedna petlja i time uvela nova funkcionalna specifičnost.
[0152] Peptide je moguće jednostavno produžiti hemijskim putem, dodavanjem aminokiselina na N-terminusu ili C-terminusu ili unutar petlje, pomoću ortogonalno zaštićenog lizina (ili analoga), primenom standardnih hemijskih postupaka čvrste ili tečne faze. Moguće je primeniti standardne (bio)konjugacione tehnike kojima bi se ugradili aktivirani ili potencijalno aktivirani N- ili C-terminusi. Alternativno, dodatne aminokiseline je moguće uvesti fragmentnom kondenzacijom ili nativnom hemijskom ligacijom, kao što je opisano, na primer, u (Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779), ili posredstvom enzima, na primer, pomoću subtiligaze, kao što je opisano u (Chang et al Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20; 91(26): 12544-8 ili u Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003).
[0153] Alternativno, peptidi se mogu produžiti ili modifikovati dodatnom konjugacijom preko disulfidnih veza. Ovaj postupak može doneti dodatne prednosti, usled disocijacije prvog od drugog peptida, kada se nađu u redukujućim uslovima koji vladaju u ćeliji. U ovom slučaju, molekulsku skelu (na primer, TBMB) moguće je dodati tokom hemijske sinteze prvog peptida, tako da on reaguje sa tri cisteinske grupe; zatim se na N- ili C-terminus prvog peptida može prikačiti dodatni cistein ili tiol, tako da ovaj cistein ili tiol reaguju samo sa slobodnim cisteinom ili tiolom drugog polipeptida, formirajući biciklični peptid-peptid konjugat povezan disulfidnom vezom.
[0154] Moguće je primeniti slične tehnike u sintezi/kuplovanju dva biciklična ili bispecifična makrociklična molekula, što potencijalno može dovesti do nastanka tetraspecifičnog molekula.
[0155] Na isti način se mogu dodati druge funkcionalne grupe ili efektorske grupe, primenom odgovarajućih hemijskih postupaka vezivanja na N- ili C-terminus ili vezivanjem za bočne lance. U jednom obliku izvođenja, vezivanje drugih grupa se sprovodi tako da se ne blokira aktivnost ni jednog postojećeg entiteta.
[0156] Prema narednom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak za dobijanje opisanog konjugata leka, koji obuhvata puteve sinteze opisane na Shemama I, II ili III.
Farmaceutske kompozicije
[0157] Prema narednom aspektu pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži opisani peptidni ligand ili konjugat leka, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
[0158] Predmetni peptidni ligandi će načelno biti korišćeni koristiti u prečišćenoj formi, zajedno sa farmakološki odgovarajućim ekscipijensima ili nosačima. Tipično, ekscipijensi ili nosači obuhvataju vodene ili alkoholno/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološke i/ili puferske rastvore. Parenteralni nosači obuhvataju fiziološki rastvor, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, i Ringerov mlečni rastvor. Pogodni fiziološki prihvatljivi adjuvansi, kada je neophodno da se polipeptidni kompleks održi u suspenziji, mogu se izabrati iz grupe zgušnjivača, na primer, karboksimetil-celuloza, polivini-pirolidon, želatin i alginat.
[0159] Nosači za intravenske formulacije obuhvataju tečnosti i dijetetske suplemente, elektrolite, kao što su oni na bazi Ringerove dekstroze. Mogu takođe biti prisutni konzervansi i drugi aditivi, kao što su antimikrobni agensi, antioksidansi, agensi za heliranje i inertni gasovi, (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
[0160] Peptidni ligandi prema pronalasku mogu se kao kompozicije za nezavisnu aplikaciju ili se mogu primeniti u kombinaciji sa drugim agensima. Kombinacija može uključiti antitela, fragmente antitela i druge imunoterapijske lekove, kao što su ciklosporin, metotreksat, adriamicin ili cisplatina i imunotoksine. Farmaceutske kompozicije mogu da obuhvate “koktele” različitih citotoksičnih ili drugih agenasa, zajedno sa izabranim polipeptidima različitih specifičnosti, prema pronalasku, kao što su polipeptidi izabrani primenom različitih ciljnih liganada, nezavisno od toga da li spojeni pre administracije.
[0161] Put administracije farmaceutske kompozicije prema pronalasku može biti bilo koji put poznat u stanju tehnike. Za terapiju, uključujući bez ograničenja, imunoterapiju, peptidni ligandi prema pronalasku mogu se administrirati na uobičajeni način kod pacijenata. Moguće je sprovesti svaki mogući put administracije, uključujući parenteralnu, intravensku, intramuskularnu, intraperitonealnu, transdermalnu, plućnu i takođe, ako je pogodno, posredstvom direktne infuzije preko katetera. Doziranje i učestalost administracije zavisiće od uzrasta, pola i stanja pacijenta, istovremene primene drugih lekova, kontraindikacija i drugih parametara koje ordinirajući lekar uzima u obzir.
[0162] Peptidni ligandi prema pronalasku mogu biti liofilizovani za čuvanje i rekonstituisani u pogodnom nosaču pre primene. Liofilizacija je efikasan postupak, pa se mogu primeniti poznati postupci liofilizacije i rekonstitucije. Poznavaocu stanja tehnike je lako shvatljivo da liofilizacija i rekonstitucija mogu dovesti do gubitka aktivnosti različitog nivoa, pa se koncentracije možda moraju korigovati kako bi se taj gubitak kompenzovao.
[0163] Kompozicija koja sadrži peptidne ligande prema pronalasku ili njihov koktel, može se administrirati u profilaktičkoj i/ili terapeutskoj primeni. U nekim terapeutskim primenama, “terapeutski efektivna doza” definiše se kao potrebna količina kojom se postiže makar delimična inhibicija, supresija, modulacija, ubijanje ili neki drugi merljivi efekat u populaciji izabranih ćelija. Količine potrebne da se ova doza ostvari zavise od ozbiljnosti bolesti i opšteg stanja pacijenta i njegovog imunskog sistema, ali se načelno kreću u rasponu od 0.005 do 5.0 mg izabranog peptida po kilogramu telesne težine, pri čemu se doze od 0.05 do 2.0 mg/kg/dozi češće koriste. Za profilaktičku primenu, kompozicije koje sadrže peptidne ligande prema pronalasku ili njihov koktel, mogu se administrirati u sličnim ili nešto nižim dozama.
[0164] Kompozicija koja sadrži peptidni ligand prema pronalasku može se primeniti u profilaktičkoj i terapeutskoj primeni, kako bi se pomogle promene, inaktivacija, ubijanje ili uklanjanje izabrane ciljne populacije ćelija u organizmu sisara. Uz to, opisani peptidni ligandi mogu se primeniti ekstrakorporealno ili in vitro, sa ciljem da se ubiju, smanje ili na drugi efikasan način ukloni ciljna populaciju ćelija iz heterogene kolekcije ćelija. Krv sisara može se ekstrakorporealno kombinovati sa izabranim peptidnim ligandima, čime bi se ubile ili na drugi način uklonile neželjene ćelije iz krvi, a zatim se krv vratila u organizam sisara, primenom standardnih postupaka.
Terapeutske primene
[0165] Biciklični peptidi prema pronalasku imaju posebnu primenu, kao visoko afinitetni veznici metaloproteinaza membranskog tipa 1 (MT1-MMP, takođe poznatih kao MMP14). MT1-MMP je transmembranska metaloproteinaza sa ključnom ulogom u remodelovanju vanćelijskog matriksa, zahvaljujući svojoj sposobnosti da direktno razgradi nekoliko komponenti matriksa i posredno, da aktivira pro-MMP2. MT1-MMP ima ključnu ulogu u angiogenezi u tumoru (Sounni et al (2002) FASEB J. 16(6), 555-564) i pojačano se eksprimira u brojnim solidnim tumorima, pa zato MT1-MMP – vezujući biciklični peptid prema pronalasku ima posebno značajnu primenu u ciljanoj terapiji kancera, naročito solidnih tumora, kao što su nesitnoćelijski karcinomi pluća. U jednom obliku izvođenja, biciklični peptidi prema pronalasku specifični su prema MT1-MMP iz čoveka. U narednom obliku izvođenja, biciklični peptidi prema pronalasku specifični su prema MT1-MMP miša. U još jednom obliku izvođenja, biciklični peptidi prema pronalasku su specifični za MT1-MMP iz čoveka i miša. U još jednom obliku izvođenja, biciklični peptidi prema pronalasku specifični su za MT1-MMP iz čoveka, miša i psa.
[0166] Polipeptidni ligandi izabrani prema postupku predmetnog pronalaska mogu se primeniti in vivo u terapeutskim i profilaktičkim primenama, in vitro i u in vivo dijagnostičkim primenama, in vitro esejima, i reagens aplikacijama i slično. Ligandi sa izabranim nivoima specifičnosti mogu biti korisni u primenama koje obuhvataju testiranje životinja u kojima je poželjna unakrsna reaktivnost, ili u dijagnostičkim primenama, gde je unakrsnu reaktivnost sa homologim i paralogim molekulima potrebno pažljivo kontrolisati. U nekim primenama, kao što su vakcine, može se iskoristiti sposobnost da se aktivira imunski odgovor na prethodno izabrani opseg antigena, kako bi se vakcina oblikovala prema specifičnim bolestima i patogenima.
[0167] Za primenu kod sisara poželjno je da su peptidni ligandi suštinski prečišćeni, sa najmanje 90 do 95% homogenosti, a za farmaceutsku primenu je najpoželjnije 98 do 99% ili više procenata homogenosti, naročito ako je sisar čovek. Kada se prečiste, delimično ili do željene homogenosti, izabrani polipeptidi mogu se koristiti u dijagnostičke ili terapeutske svrhe (uključujući ekstrakorporealno), ili se mogu koristiti u cilju u razvoja ili izvođenju eseja, imunofluorescentnog bojenja i slično (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
[0168] Efektorska grupa i konjugati peptidnih liganada prema pronalasku tipično će se koristiti u prevenciji, supresiji i terapiji kancera, konkretno, solidnih tumora, kao što su nesitnoćelijski karcinomi pluća.
[0169] Stoga su prema narednom aspektu pronalaska obezbeđene efektorske grupe i lekoviti konjugati peptidnih liganada, kao što je opisano, za primenu u prevenciji, supresiji ili terapiji kancera, konkretno, solidnih tumora, kao što su nesitnoćelijski karcinomi pluća.
[0170] Prema narednom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak prevencije, supresije ili terapije kancera, konkretno, solidnih tumora, kao što su nesitnoćelijski karcinomi pluća, gde postupak obuhvata administraciju efektorske grupe ili konjugata leka i peptidnog liganda bolesnom pacijentu, kao što je opisano.
[0171] Primeri kancera (i njihovih benignih pandana) koji se mogu tretirati (ili inhibirati) obuhvataju, bez ograničenja, tumore epitelnih organa (adenome i karcinome različitih tipova, uključujući adenokarcinome, skvamozne karcinome, karcinome tranzicionih ćelija i druge karcinome), kao što su karcinomi mokraćne bešike i urogenitalnog trakta, dojke, gastrointestinalnog trakta (uključujući jednjak, želudac, tanko crevo, debelo crevo, rektum i anus), jetre (hepatocelularni karcinom), žučne kese i žučnog sistema, egzokrinog pankreasa, bubrega, pluća (na primer, adenokarcinom, karcinom sitnih ćelija pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, bronho-alveolarni karcinom i mezoteliom), karcinom glave i vrata (na primer, kancer jezika, usne duplje, larinksa, ždrela, nazofarinksa, krajnika, pljuvačnih žlezda, nazalne šupljine i paranazalnih sinusa), jajnika, jajovoda; peritoneuma, vagine, vulve, penisa, grlića materice, miometrijuma, endometrijuma, tiroidne žlezde (na primer, tiroidni folikularni karcinom), adrenalne žlezde, prostate, kože i pripoja (na primer, melanom, karcinom bazalnih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija, keratoakantom, displastičnu nevus), hematološke malignitete (na primer, leukemije, limfomi) i premaligne hematološke poremećaje i granične malignitete, uključujući hematološke malignitete i slična stanja limfoidne loze (na primer, akutna limfoblastna leukemija [ALL], hronična limfoblasna leukemija [CLL], limfom β-ćelija, kao što je difuzni limfom krupnih β-ćelija [DLBCL], folikularni limfom, Burkitov limfom, limfom plaštanih ćelija, limfom T ćelija i leukemije, limfomi ćelija prirodnih ubica [NK], Hodžkinov limfom, limfom vlasastih ćelija, monoklonska gamopatija neizvesnog značaja, plazmocitom, multipni mijelom, i post-transplantacioni limfoproliferativni poremećaji), i hematološke malignitete i slična stanja mijeloidne loze (na primer, akutna mijeloidna leukemija [AML], hronična mijeloidna leukemija [CML], hronična mijelomonocitna leukemija [CMML], hipereozinofilni sindrom, mijeloproliferativni poremećaji, kao što su policitemija vera, esencijalna trombicitopenija, i primarna mijelofibroza, mijeloproliferativni sindrom, mijelodisplastični sindrom i promijelocitna leukemija); tumore mezenhimskog porekla, na primer, sarkomi mekih tkiva, kostiju i hrskavice, kao što su osteosarkomi, fibrosarkomi, hondrosarkomi, rabdomiosarkomi, lemiosarkomi, liposarkomi, angiosarkomi, Kapošijev sindrom, Juingov sarkom, sinovijalni sarkomi, epiteloidni sarkomi, gastrointestinalni stromalni tumori, beningi i maligni histiocitom, i dermatofibrosarkomaprotuberans; tumore centralnog ili perifernog nervnog sistema (na primer, astrocitom, gliom i glioblastom, meningiom, ependiom, pinealni tumor i švanomi); endokrine tumore (na primer, tumor hipofize, adrenalni tumor, tumor ćelija ostrvaca, paratiroidni tumor, karcinoidni tumor i modularni karcinom štitne žlezde); okularne i adneksalne tumore (na primer, retinoblastom); tumore germinatnivnih i trofoblasnih ćelija (na primer, teratom, seminom, disgerminom, hidatidiformna mola i horiokarcinomi); i pedijatrijske i embrionalne tumore (na primer, meduloblastom, neuroblastom, Vilmsov tumor, i tumore primitivnog neuroektroderma); ili sindrome, kongenitalne ili druge, koji kod pacijenta povećavaju sklonost ka malignitetima (na primer, kseroderma pigmentoza).
[0172] Upućivanje na termin "prevencija", obuhvata primenu zaštitne kompozicije, pre nego što je bolest započela. “Supresija” se odnosi na administraciju kompozicije nakon indukcije bolesti, ali pre pojave kliničke slike bolesti. “Tretman” obuhvata administraciju protektivne kompozicije nakon početka manifestacije simptoma bolesti.
[0173] Postoje životinjski model sistemi, koji se koriste za izučavanje efikasnosti peptidnih liganada u prevenciji ili terapiji bolesti. U predmetnom pronalasku upotrebu životinjskih modela bila je moguća zahvaljujući razvijanju polipeptidnih liganda na koji ispoljavaju unakrsnu reakciju sa ciljnim molekulima čoveka i životinja.
[0174] Pronalazak je dalje opisan pozivanjem na naredne primere.
Primeri
Materijali i postupci
Fagna selekcija
[0175] Konstruisane su fagne biblioteke 6×6 bicikličnih peptida, kao što je opisano kod Heinis et al (2009), Nat Chem Biol 5(7), 502-507, WO 2009/098450, WO 2013/050615 i WO 2013/050616. Selekcija fagnih prikaza izvršena je pomoću pomenute 6×6 fagne biblioteke u odnosu na biotinilizovani hemopeksinski domen humanog MT1-MMP.
Ekspresija proteina
[0176] MT1-MMP hemopeksinu slični ponovci (poznati kao MT1-MMP hemopeksinski domen), aminokiselinski ostaci Cys319-Gly511 gena čoveka, prolazno su eksprimirani u HEK293 ćelijama primenom pEXPR-IBA42 (IBA) ekspresionog vektora, kao sekretorni N-terminusno His6-obeleženi solubilni protein. Nakon ekspresije, protein je prečišćen primenom afinitetne hromatografije sa imobilisanim Nickel-NTA, iza koje je sledila gel filtracija, a stepen prečišćenosti proizvoda proveren je SDS-PAGE elektroforezom. Varijabilnost između serija prečišćavanja praćena pomoću fluorescentnog testa toplotnog pomaka, u prisustvu/odsustvu hemopeksin-vezujućeg bicikličnog peptida.
Sinteza peptida
[0177] Sinteza peptida zasnivala se na Fmoc hemiji, primenom sintetizera Symphony peptide synthesizer, proizvedenog kod Peptide Instruments, i Syro II sintetizera, proizvedenog kod MultiSynTech. Primenjene su standardne Fmoc-aminokiseline (Sigma, Merck), sa sledećim protektivnim grupama bočnih lanaca: Arg(Pbf); Asn(Trt); Asp(OtBu); Cys(Trt); Glu(OtBu); Gln(Trt); His(Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu); Trp(Boc); i Tyr(tBu) (Sigma). Kao reagens za vezivanje korišćen je HCTU (Pepceuticals), diizopropiletilamin (DIPEA, Sigma) je primenjen kao baza, a deprotekcija je izvršena 20% rastvorom piperidina u DMF (AGTC). Sinteze su sprovedene primenom 0.37 mmol/gr Fmoc-Rink amidne AM smole (AGTC), Fmocaminokiseline su korišćene u četvorostrukom suvišku, a baza u četvorstrukom suvišku u odnosu na aminokiseline. Aminokiseline su razblažene do koncentracije od 0.2M u DMSO, HCTU u koncentraciji od 0.4M u DMF, i DIPEA u koncetraciji od 1.6M u N-metilpirolidonu (Alfa Aesar). Uslovi su bili takvi da su reakcije vezivanja sadržale između 20 i 50% DMSO u DMF, što je smanjilo agregacije i delecije tokom sinteze u čvrstoj fazi, a povećalo prinos. Reakcija vezivanja načelno je trajala 30 minuta, a vreme deprotekcije 2× 5 minuta. Fmoc-N-metilglicin (Fmoc-Sar-OH, Merck) kuplovan je tokom 1 sata, dok su deprotekcija i vezivanje svakog narednog ostatka trajali 20 minuta, odnosno, 1 sat. Nakon sinteze, smola je isprana dihlorometanom i osušena je. Razdvajanje protektivnih grupa bočnih lanaca i podloge obavljeno je primenom 10 mL rastvora TFA/H2O/iPr3SiH/ditiotritola (u odnosu 95 : 2.5 : 2.5 : 2.5 zapr./ zapr./ zapr./tež.) tokom 3 sata. Nakon razdvajanja, utrošena smola je uklonjena filtracijom, a filtrat je dodat u 35 mL dietiletra koji je bio ohlađen na -80°C. Peptidi su centrifugirani, etarski supernatant je odbačen, a peptidni talog je dva puta ispran hladnim etrom. Peptidi su zatim resolubilisani u 5-10 mL rastvora acetonitrila u vodi i liofilizovani. Uzeta mala količina uzorka za analizu prečišćenosti sirovog proizvoda masenom spektrometrijom (MALDI-TOF, Voyager DE od Applied Biosystems). Nakon liofilizacije, peptidni prašak je stavljen u 10 mL 6M guanidinijum hlorovodnika u H2O, obogaćenog 0.5 mL 1 M ditiotritola, i nanet je na C8 Luna preparativnu HPLC kolonu (Phenomenex). Rastvori (H2O, acetonitril) su zakišeljeni dodavanjem 0.1 % hepta-fluorobuterne kiseline. Primenjen je gradijent rastućih koncentracija acetonitrila od 30-70 % tokom 15 minuta, pri brzini protoka od 15-20 mL /min, primenom Gilson preparativnog HPLC sistema. Frakcije sa prečišćenim linearnim peptidima (identifikovane MALDI postupkom) spojene su i modifikovane u prisustvu 1,3,5-tris(bromometil)benzena (TBMB, Sigma). Za ove potrebe, linearni peptidi su razblaženi dodavanjem ~35 mL vode, zatim je dodato ~500 µL 100 mM TBMB u acetonitrilu, i reakcija je započeta dodavanjem 5 mL 1 M NH4HCO3u H2O. Reakcija se odvijala ~30-60 min na RT, a nakon završetka (procenjen MALDI postupkom), proizvod je liofilizovan. Nakon liofilizacija, modifikovani peptid je prečišćen, kao što je opisano, zamenom Luna C8 kolone Gemini C18 kolonom (Phenomenex) i zamenom kiseline, rastvorom 0.1% trifluoro-sirćetne kiseline. Čiste frakcije, sa odgovarajuće TMB-modifikovanim materijalom, spojene su, liofilizovane i čuvane na -20°C.
[0178] Sve aminokiseline bile su u L-konfiguraciji, osim ako nije drugačije naglašeno.
[0179] DOTA je vezan za peptidni lanac tokom čvrste faze peptidne sinteze, uz primenu zaštićenog prekursora DOTA(tBu)3(TCI, CAS 137076-54-1).
[0180] Prirodno nepostojeće aminokiseline su ugrađene u peptidnu sekvencu primenom prethodno opisanih postupaka.
[0181] Lista prekursora prirodno nepostojećih aminokiselina, koji su primenjeni prema pronalasku sažeto je prikazana u tabeli koja sledi:
[0182] Peptidi korišćeni u farmakokinetičkim istraživanjima su liofilizovani u 0.1 % TFA u vodi, kako bi se dobile TFA soli ili slobodne kiseline navedenih jedinjenja.
Sinteza BDC primenom 17-69-07-N219 kao prekursora bicikličnog peptida
[0183] Dva biciklična konjugata (BDC) sintetisana iz 17-69-07-N219, koji je poslužio kao prekursorski peptid. Aktivirani vcMMAE ili disulfid-DM1 konstrukcije (rastvorene u DMSO), direktno su konjugovani u uslovima 1.4× viška 17-69-07-N219 u vodi (100 natrijum fosfat, pH8) (vidi Sheme I i II). Koncentracija peptida bila je 9 mg/mL ili više. Nakon ove reakcije usledila je tečna hromatografija/masena sprektormetrija (LC/MS) i procena nakon 3.5 sati. Nakon toga je izveden standardni postupak reverzno-faznog prečišćavanja, primenom C18 semi-preparativne kolone. Izolovane su i liofilizovane frakcije čija je prečišćenost bila veća od 95%. Ovaj materijal nije sadržao merljive količine slobodnih toksina. Za potrebe in vitro i in vivo istraživanja, liofilizovani prašak je rastvoren u štokove visoke koncentracije u DMSO (100 mg/mL), i razblažen u odgovarajućem puferu za upotrebu.
Sinteza BDC primenom 17-69-07-N241 kao prekursora biciličnog peptida
[0184] U sintezi BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 i BT17BDC-20, korišćeni su naredni N-hidroksi-sukcinimid estri (NHS estri) disulfidnih majtanzinoida:
u kojoj R1, R2, R3, R4, m i n imaju značenja koja su ranije opisana za jedinjenja formule (V)<a>, (V)<b>, (V)<c>, (V)<d>za BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19, odnosno, BT17BDC-20.
[0185] BT17BDC-18 je sintetisan i alternativnim postupkom, kao će biti opisano i prikazano na Shemi III. U ovom slučaju 17-69-07-N277 je sintetisan reakcijom 17-69-07-N241 sa SPP (N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoat) u DMSO. Koncentracije 17-69-07-N241 bile su 10 mM i više, sa 1.3× većom količinom SPP, i 20× većom količinom diizopropiletilamina, na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena nakon jednog sata, na osnovu LCMS. Prečišćavanje je obavljeno reverzno-faznim postupkom, kao što je opisano. Odgovarajuće frakcije su liofilizovane.
[0186] 17-69-07-N277 je disulfidno izmenjen pomoću 1.15 ekvivalenata DM1 (u vidu slobodnog tiola), u semi-vodenim uslovima (50 % dimetilacetamid i 50% 100 mM natrijum acetat pH 5.0, obogaćen rastvorom 2 mM EDTA), tokom 21 sata na sobnoj temperaturi, u atmosferi azota. Koncentracije 17-69-07-N277 u reakciji bile su 10 mM i više. Nakon toga sledilo je reverzno-fazno prečišćavanje, na C18 semi-preparativnoj koloni. Frakcije čija je prečišćenost bila veća od 95% su izolovane i liofilizovane. Materijali nisu sadržali merljive količine slobodnih toksina. Za potrebe in vitro i in vivo istraživanja, liofilizovani praškovi su solubilisani u vodenim rastvorima, kao što je opisano, ili su direktno dodati u pufer.
Određivanje konstante disocijacije vezivanja bicikličnih peptida za MT1-MMP
Fluorescentno polarizacioni testovi direktnog vezivanja (anizotropija)
[0187] Fluorescentno polarizacioni testovi direktnog vezivanja ili testovi anizotropije izvršeni su titracijom konstantne koncentracije fluorescentnog markera (ovde je to fluorescirajući biciklični peptid koji se izučava), i vezujućeg partnera (u ovom slučaju, hemopeksinski domen MT1-MMP). Kako koncentracija vezujućeg partnera raste tokom titracije, polarizacioni signal se menja proporcionalno odnosu vezanog i nevezanog materijala. Ovo omogućava kvantitativno određivanje brzine disocijacije (Kd). Podaci dobijeni testom fituju se primenom standardnih ligand-vezujućih jednačina.
[0188] Tipično, koncentracije markera značajno su manje od Kd u konkretnom paru marker:titrant, i one su izabrane da tipično budu ~1 nM ili manje. Koncentracija titranta (vezujući partner) varirala je od 0.1 nM do uobičajenih 5 µM. Opseg je izabran tako da se uoči maksimum promene fluorescentne polarizacije. Primenjen su fosfatni puferi sa dodatim 0.01 % Tween-om. Eksperimenti su izvedeni na crnim mikro-titar pločama sa 384 bunarića, malim vezivanjem i malim volumenom (Corning 3820), dok je polarizacioni signal meren BMG Pherastar FS čitača.
[0189] Fluorescentni markeri koji se ovde pominje su biciklični peptide, fluorescentno obeleženi pomoću 5,6-karboksifluoresceina. Fluorescentno se može obeležiti amino grupa na N-terminusu peptida, koja je od središnje sekvence bicikličnog peptida odvojena sarkozinskim razdelnikom (tipično Sar5). Obeležavanje se može izvesti tokom Fmoc sinteze u čvrstoj fazi ili nakon sinteze (nakon ciklizovanja sa TBMB i prečišćavanja), ukoliko je N-terminusna amino grupa jedinstvena u peptidu. Fluorescentno obeležavanje se može obaviti i na C-terminusu, najčešće na lizinu koji je ugrađen kao prva C-terminusna aminokiselina, koji je onda udaljen od središnje sekvence bicikličnog peptida sarkozinskim razdelnikom (uobičajeno Sar6). Dakle, N-terminusni marker može imati molekulski format opisan sa Fluo-Gly-Sar5-A(središnja sekvenca bicikličnog peptida), dok C-terminusna fluorescentna konstrukcija ima format (središnja sekvenca bicikličnog peptida)-A-Sar6-K(Fluo). Fluorescentni marker korišćeni u Primerima su A-(17-69)-A-Sar6-K(Fluo), A-(17-69-07)-A-Sar6-K(Fluo), i A-(17-69-12)-A-Sar6-K(Fluo). Zbog kisele prirode 17-69 fluorescentno obeleženih peptida, oni su najčešće pripremani u vidu koncentrovanih DMSO štokova, iz kojeg su pripremana i razblaženja u 100 mM Tris pH 8 puferu.
Fluorescentno polarizacioni testovi kompetitivnog vezivanja (Anizotropija)
[0190] Zbog svojih visokih afiniteta prema hemopeksinskom domenu MT1-MMP (PEX), fluorescentno obeleženi derivati 17-69-07 i 17-69-12 (označeni kao 17-69-07-N040 i 17-69-12-N005) mogu se testirati testovima kompetitivnog vezivanja (uz FP detekciju). Prethodno formirani kompleks PEX sa fluorescetnim PEX-vezujućim markerom titrira se rastvorom neobeleženog bicikličnog peptida (neobeleženog). S obzirom na to da se očekuje da se svi peptidi na bazi 17-69 vezuju za isto vezujuće mesto, titrant će zameniti fluorescentni marker sa PEX. Disocijacija kompleksa može se kvantitativno meriti, na osnovu čega se može odrediti Kd kompetitora (titranta) prema ciljnom proteinu. Prednost kompetitivnog testa je to što omogućava precizno i brzo određivanje afiniteta ne-fluorescentnih bicikličnih peptida.
[0191] Koncentracije markera su obično oko vrednosti Kd ili niže (u ovom slučaju 1 nM), a vezujući protein (ovde, hemopeksinski domen MT1-MMP) prisutan je u 15× većoj koncentraciji, tako da je >90% markera vezano. Neposredno nakon toga, titrira se ne-fluorescentni kompetitivni biciklični peptid (uobičajeno samo središnja sekvenca), dok se fluorescentni marker ne istisne sa ciljnog proteina. Zamena markera se meri na osnovu pada fluorescentne polarizacije. Pad fluorescentne polarizacije je proporcionalan frakciji vezanog ciljnog proteina i nefluorescentno obeleženog titranta, pa je merilo afiniteta titranta prema ciljnom protein.
[0192] Sirovi podaci se fituju do analitičkog rešenja kubne jednačine, koja opisuje ravnotežu između fluorescentnog markera, titranta i vezujućeg proteina. Fitovanje zahteva poznavanje vrednosti afiniteta fluorescentnog markera prema ciljnom proteinu, što se može odrediti nezavisnim FP merenjima direktnog vezivanja (videti prethodni odeljak). Kriva se fituje pomoću softverskog paketa Sigmaplot 12.0 i adaptirane verzije jednačine opisane kod Zhi-Xin Wang (FEBS Letters 360 (1995) 111-114).
Određivanje profila stabilnosti u plazmi
Postupak br. 1:
[0193] Razvijen je brzi esej za procenu stabilnosti, koji se zasniva ma masenoj spektrometrijskoj detekciji (MALDI-TOF, Voyager DE, Applied Biosystems) molekula polazne mase, i fragmenata dobijenih aktivnošću proteaza u plazmi. Na osnovu prirode nastalih fragmenata moguće je identifikovati najčešća mesta proteaznog isecanja. Peptidni štok koncentracije 1 - 1.5 mM (u DMSO) direktno je razblažen serumom miša/pacova/čoveka (Sera labs, uz korišćenje citratnog pufera, kao antikoagulansa), do finalne koncentracije od 50 µM peptida, i inkubiran je tokom 48 sati na 37°C. U odgovarajućim vremenski tačkama, po 5 µL uzoraka je zamrznuto na -80°C. Za potrebe analize, uzorci su odmrznuti, izmešani sa 25 µL rastvora acetonitrila:metanola:vode u odnosu 3:3:1, i centrifugirani na 13k tokom 5 min. Aspirirano je 5 µL supernatanta u kome su se nalazili peptidi i pomešano je sa 30 mM amonijum-bikarbonatom u smeši acetonitrola:H2O u odnosu 1:1. Jedan mikrolitar ovog rastvora nanet je na ploču za MALDI, osušen je, i matriks je (alfa-cijanocimetna kiselina, Sigma, pripremljena kao zasićeni rastvor u 1:1 acetonitrilu:vodi, sa dodatnom 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom) položen na uzorak (1µL), osušen i analiziran MALDI TOF postupkom. Treba naglasiti da ovaj kvantitativni esej služi za detekciju uporednih promena stabilnosti u plazmi različitih bicikličnih peptidnih sekvenci, i funkcioniše kao izvrsno oruđe u identifikaciji najčešćih mesta isecanja.
Postupak br. 2
[0194] Za kvantitativno određivanje profila stabilnosti bicikličnih peptida u plazmi, štok rastvor peptida (200 µM u DMSO) pomešan je sa plazmom (čoveka ili miša), do finalne koncentracije od 10 µM. Alikvoti od 40 µL uzorka periodično su uzimani na svakih 8 sati i smrzavani na -80°C. Pre LC-MS analize, uzorci su odmrznuti, i pomešani u 3 zapremine (u ovom slučaju, 120 µL) rastvora acetonitrila/MeOH vode u odnosu 1:1. Mlečne suspenzije su centrifugirane 30 min na 13000 o/m, i supernatant sa peptidima je kvantifikovan u pogledu dvostruko/trostruko naeletrisanih vrsta i MS/MS fragmenata, na instrumentu Waters Xevo TQ-D, uz korišćenje standardne krive dobijene sa istim peptidima u plazmi. Stabilnost molekula procenjena je na osnovu određenih vrednosti polu-života u plazmi.
Farmakokinetika 17-69-07 u mišu, identifikacija metabolita
Farmakokinetika 17-69-07-N004
[0195] Farmakokinetika je istražena u mišu, primenom bicikličnog peptida 17-69-04-N004, koji je dat jednoj grupi od 12 mužjaka CD1 miša, u vidu jedne intravenske doze od 5.925 mg/kg, u vidu 5 mL/kg bolusa rastvora koncentracije 1.19 mg/mL. Formulisani rastvori su pripremljeni od 100 µL 23.7 mg/mL DMSO štoka, koji je razblažen rastvorom 1.9 mL PBS, neposredno pre primene, što je rezultovalo nosačem koji se sastojao od 5% DMSO in PBS na pH 7.4. ZA svaku vremensku tačku uzeti su uzorci krvi dve životinje, kardijačnom punkcijom terminalno anesteziranih životinja, 0.08, 0.5, 1, 2 i 4 sata posle davanja doze, i uzorci krvi su stavljeni u epruvete sa EDTA radi izolovanja plazme. Uzorci plazme su odmah smrznuti na -20° C.
[0196] Za potrebe analize, uzorci su odmrznuti, a alikvoti od 50 µL tretirani su sa 3 zapremine ekstrakcionog rastvarača (smeša 2:9:9 sledećih rastvora: 10 mM amonijum bikarbonata, pH 8, acetonitrila i metanola, koja sadrži analitički interni standard). Staloženi proteini su uklonjeni centrifugiranjem, a supernatant je analiziran pomoću LC-MS/MS. Kvantifikacija uzoraka izvršena je na osnovu kalibracione krive pripremljene u plazmi kontrolnih miševa. Farmakokinetički parametri određeni su primenom ne-kompartmentalne analize, u softverskom paketu PK Solutions 2.0 od Summit Research Services.
Opis termina
[0197]
Cmax: Maksimalna izmerena koncentracija;
Tmax: Vreme u kojem je izmerena maksimalna koncentracija;
AUC 0-t: Površina ispod krive odnosa koncentracije leka u plazmi/tokom vremena, počev od 0 minuta do krajnje merene tačke; i
AUC 0-∞: Površina ispod krive odnosa koncentracije leka u plazmi/tokom vremena, od 0 minuta ekstrapolisano iza finalne vremenske tačke, na osnovu vremena polu-života.
Identifikacija metabolita bicikličnog peptida u mišjoj plazmi
[0198] Tri uzorka plazme (0.5, 1 i 2 časa) uzeta su za in vivo analizu potencijalnih metabolita 17-69-07-N004 u plazmi miša. Analiza je izvršena primenom HPLC-MS i HPLC-MS/MS, na uređaju LTQ Orbitrap XL Mass Spectrometer. Cilj ispitivanja peptidnih metabolita u cirkulaciji bio je da se izračuna tačna masa (10 ppm osetljivosti) pretpostavljenih metabolita (adicija 1 ili 2 vode (+18, 36) za oslobađanje petlje 1 i/ili petlje 2; gubitak jedne aminokiseline ili gubitak niza aminokiselina iz petlje 1 i/ili petlje 2). Drugo, izvedeno je manuelno pretraživanje, poređenjem ukupnih jon-hromatografa sa blankom plazme miša.
Efikasnost BT17BDC-1 i BT17BDC-9 u HT-1080 ksenograftu miša.
[0199] Miševi soja Balb/c nude, sa transplantiranim potkožnim HT-1080 ksenograftom tumora, tretirani su BDC-om ili nosačem (PBS). BDC su aplicirane 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje, a tretiranje je započelo nakon postizanja približne veličine tumora od 150-200 mm<3>. Praćeno je ponašanje miševa, a tri puta nedeljno merena je zapremina tumora i telesna masa.
Primer 1: Identifikacija bicikličnih peptida sa visokim afinitetom prema hemopeksinskom domenu MT1-MMP
[0200] Primenjujući prethodno ustanovljene postupke dobijanja fagnih biblioteka bicikličnih peptida, selekcija kandidata obavljena je u odnosu na hemopeksinski domen humanog MT1-MMP. Nakon tri runde selekcije iz intaktnih biblioteka primenom sukcesivno manjih koncentracija ciljnog molekula, određena je sekvenca izlaznih kandidata. Utvrđeno je da je biciklični peptid 17-69 (CKNRGFGCEDFYDIC) (SEQ ID NO: 16) najzastupljenija izlazna sekvenca, a njegovo kvalitativno vezivanje za ciljnu sekvencu potvrđeno je u Alphascreen-u.
[0201] Generisane su tri male fagne biblioteke, koje su obezbedile punu pokrivenost sva 3 dela sekvence 17-69. Ove tri biblioteke su tokom dve runde selekcionisane nasuprot hemopeksinskom proteinu. Zanimljivo, najperspektivnije izlazne sekvence bile su sekvence bicikličnih peptide formata 5×6, iako su polazne biblioteke bile konstruisane u 6×6 formatu. Verovatno je da je petlja manje dužine selektovana zbog višeg afiniteta bicikličnog peptida prema ciljnom molekulu. Petlje kraće dužine nastale su na osnovu pogrešno sintetisanih prajmera koji su inkorporirani tokom konstrukcije fagnih biblioteka.
[0202] Glavna izlazna sekvenca je peptid 17-69-07, sa redosledom aminokiselina CYNEFGCEDFYDIC (SEQ ID NO: 2).
[0203] Na osnovu zapažanja da se 5×6 format pokazao najperspektivnijim, i da je bila potrebna distinkcija između 5×6 veznika, generisane su još dve biblioteke za testiranje namernih skraćenja prve petlje generisanih bicikličnih peptida 17-69-02, 17-69-03, 17-69-04 i 17-69-12. One se nalaze u sekvencama prikazanim na Slici 8.
[0204] Uočen je trend na određenim pozicijama, iako test vezivanja nije uspeo da napravi razliku između afinitetnih veznika, jer je test dostigao zasićenje.
[0205] Najučestalije sekvence testirane su u hemopeksin-vezujućem testu, korišćenjem alfa skrina, u kojem su svi signali upoređeni sa originalnom 17-69 sekvencom (videti Tabelu 1):
[0206] S obzirom na to da svi afinitetni klonovi na bazi 17-69 proizvode signal u maksimumu detekcije testa, grafik prikazan u Tabeli 1 ne dozvoljava pouzdanu identifikaciju najboljeg klona. Stoga su sintetisani fluorescentni derivati nekoliko bicikličnih peptida (17-69, 17-69-07 i 17-69-12), i testirani esejima direktnog vezivanja praćenjem fluorescentne polarizacije (FP). U ovom slučaju, fluorescein je odvojen od biciklične sekvence veznikom (najčešće Sar6), bilo na N- ili C-terminusu središnje sekvence (Tabela 2).
Tabela 2: Rezultati testa direktnog vezivanja praćenjem fluorescentne polarizacije (FP)
[0207] Fluorescentno obeleženi derivati 17-69-07 i 17-69-12 (označeni kao 17-69-07-N040 i 17-69-12-N005) ispoljili su snažno vezivanje, sa konstantom disocijacije od 0.52, odnosno, 3.1 nM. Njihov afinitet je značajno poboljšan u odnosu na originalnu ne-izmenjenu 17-69 sekvencu (17-69-N004). Izgleda da sekvence koje sadrže format 5×6 imaju veći afinitet u konkurenciji biblioteka selektovanih na bazi afiniteta.
[0208] Zbog većeg afiniteta prema hemoksinskom domenu MT1-MMP (PEX), fluorescirajući derivati 17-69-07 i 17-69-12 (označeni kao 17-69-07-N040 i 17-69-12-N005) primenjeni su za sledeće kompeticione eksperimente (korišćenjem FP u detekciji). U ovom slučaju, prethodno formirani kompleks PEX sa fluorescentnim PEX-markerom titriran je rastvorom nefluorescentnog bicikličnog peptida. S obzirom na to da se očekuje da se svi peptidi nastali na bazi 17-69 peptida (koji sadrže konzervirani motiv druge petlje CEDFYDIC; SEQ ID NO: 17) vezuju za isto mesto, titrant će izmestiti fluorescentni marker sa PEX. Disocijacija kompleksa može se izmeriti kvantitativno, i moguće je odrediti Kd kompetitora (titranta). Prednost kompetitivnog postupka je što je moguće precizno i brzo određivanje afiniteta ne-fluorescentnih bicikličnih peptida.
[0209] U ovom kontekstu, važno da se potvrdi da su za visok afinitet prema PEX odgovorne središnje sekvence 17-69-07 i 17-69-12. Stoga su sintetisani peptidi, kao varijante na N- i C-terminusnog alanina, što imitira sekvence eksprimirane na fagnoj čestici, ali bez Sar5/6 molekulskog razdelnika, koji je korišćen kod fluorescentnih konstrukata.
[0210] Konstante afiniteta određene u kompetitivnim eksperimentima bile su gotovo identične onima koje su dobijene sa fluorescentnim derivatima, što nedvosmisleno ukazuje da su središnje sekvence bicikličnih peptida odgovorne za visok afinitet prema PEX (Tabela 3). Dalje, fluorescentno obeleženi konstrukti pokazuju da se dobro tolerišu C-terminusne veze između molekulskih razdelnika i efektorskih grupa (u ovom slučaju, -A-Sar6-K(Fluorescein).
Tabela 3: Rezultati fluorescentno polarizacionog testa direktnog vezivanja (FP)
Primer 2: Proteolitička stabilizacija središnje sekvence 17-69-07
Stabilnost 17-69-07 u plazmi miša
[0211] Za terapeutsku primenu kod čoveka, i za prekliničku procenu u životinjskim modelima, potrebno je da vodeći kandidat bicikličnog peptida bude dovoljno stabilan u cirkulaciji nakon intravenske primene. Odgovarajući stepen stabilnosti neophodan je kako bi se dovoljan količina bicikličnog peptida vezala za ciljni molekul i ostvarila svoju biološku funkciju.
[0212] U prekliničkim modelima često se koriste vrste, kao što je miš, pacov, zec i makaki majmun. U prvoj instanci, stabilnost bicikličnog peptida 17-69-07-N219 procenjena je u plazmi miša, primenom ranije opisanih postupaka (Postupak br. 2). Središnja sekvenca bicikličnog peptida zadržava originalnu proteinogenomiku aminokiselina sekvence 17-69-07, i dodatno sadrži razdelnik na N-terminusu, koji se koristi za konjugaciju sa efektorskim grupama (sekvenca: G-Sar10-ACYNEFGCEDFYDIC; SEQ ID NO: 20). Sačuvan je afinitet 17-69-07-N219 prema PEX, uprkos prisustvu molekulskog razdelnika (Kd = 0.82 nM).
[0213] Ovo jedinjenje ispoljava srednji nivo stabilnosti ex vivo u mišjoj plazmi, sa polu-životom koji iznosi 6 časova (videti Sliku 1).
Identifikacija mesta ex/in vivo proteolitičke degradacije u 17-69-07
[0214] U naporu da se objasni hemijska priroda degradacije 17-69-07-N219 u plazmi miša, uzorci su analizirani primenom MALDI-TOF postupka u detekciji potencijalni degradacionih proizvoda. Masena spektrometrija je ukazala na mogući gubitak tirozina, odnosno na otvaranje petlje (hidrolizu) i uklanjanje Tyr1 u petlji 1 i/ili Tyr9 u petlji 2.
[0215] Farmakokinetička studija (PK) minimalnog bicikličnog peptida 17-69-07-N004 (Ac-CYNEFGCEDFYDIC (SEQ ID NO: 2), koji predstavlja minimalnu središnju sekvencu bicikličnog peptida 17-69-07), sprovedena je u mišu, kako bi se ustanovila brzina razgradnje i uklanjanja u cirkulaciji in vivo. Isti uzorci krvi dalje su analizirani u cilju detekcije potencijalnih proteolitičkih degradacionih proizvoda 17-69-07-N004.
[0216] Dobijeni profil PK je prikazan na Slici 2.
Tabela 4: Farmakokinetički parametri 17-69-07-N004 PK parametar Srednja vrednost
[0217] Tabela 4 prikazuje da peptid ima eliminacioni polu-život od 14 minuta, i da se eliminiše brzinom od 20.7 mL/min/kg. Brzina eliminacije veća je od brzine glomeluralne filtracije kod miša (sumarno prikazano u Qi et a/, American Journal of Physiology - Renal Physiology (2004) Vol. 286 no. 3, F590-F596), što ukazuje da se peptid eliminiše na još neki način, recimo, proteolitički katalizom, koji katalizuju proteaze u plazmi i u endotelu.
[0218] Da bi se utvrdilo da li proteoliza značajno doprinosi eliminaciji in vivo, uzorci plazme uzeti u vremenskim tačkama t = 0.5, 1 i 2 h, podvrgnuti su ciljanoj analizu detekcije fragmenata bicikličnog peptida, primenom LC-MS/MS postupaka.
[0219] Bilo je moguće identifikovati višestruke metabolite i fragmente, pri čemu je najjači signal dobijen za sekvence koje su izlistane redosledom prema opadajućoj vrednosti:
Ac-CiYNEFGCiiEDFYDICiii(SEQ ID NO: 2):
isečak YNE u petlji 1;
isečak YNEF u petlji 1 (SEQ ID NO: 21);
isečak YNEFG (SEQ ID NO: 22) u petlji 1 (celokupna petlja uklonjena);
isečak Y u petlji 1 i/ili 2;
isečak YD u petlji 2;
isečak FYD u petlji 2;
isečak YDI u petlji 2; i
isečak EDFYDI (SEQ ID NO: 23) u petlji 2 (celokupna petlja uklonjena).
[0220] Prva tri metabolita bila su prisutna pri srednjem intenzitetu signala, dok su preostali fragmenti mogli biti detektovani samo u tragovima.
[0221] Uzevši sve u obzir, i ex i in vivo metaboliti grupišu se oko inicijalno utvrđenog mesta isecanja u okolini Tyr 1/9, uz efikasno isecanje aminokiselinskih ostataka u blizini. To konačno rezultira uklanjanjem jedne ili obe petlje u celini.
Proteolitička stabilnost i pojačavanje potentnosti sekvence 17-69-07
[0222] Brojni su pristupi u zaštiti peptidne sekvence od proteolitičke degradacije (videti pregledne članke, Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, i Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418), i WO 2009/098450, WO 2013/050615 i WO 2013/050616). Ukratko, oni obuhvataju supstitucije aminokiselina koje predstavljaju mesta prepoznavanja peptida od strane proteze(a), izmene aminokiselinske osovine na mestu isecanja (na primer, N-metilacija, pseudo-peptidne veze, i td), sterična ometanja obližnje veze (na primer, β-supstituisane aminokiseline) i ugrađivanje D-enantiomernih aminokiselina. Neke od ovih modifikacija (na primer, N-metilacija, D-aminokiseline) mogu da štite/pokrivaju proteolitičko mesto isecanja od hidrolize, čak i kada su na dve ili više pozicija udaljene od mesta isecanja. Iako je zaštita sekvence od proteolitičkog napada relativno rutinski postupak u stanju tehnike, izazovan je postupak ugrađivanja promena koje će doprineti stabilizaciji i koje neće značajno promeniti potentnost (i specifičnost) ciljnog proteina.
[0223] Na osnovu podataka ex/in vivo proteolitičke degradacije 17-69-07, koji su prikazani u prethodnom odeljku, bilo je jasno da su Tyr1/9 i obližnje aminokiseline potencijalna mesta stabilizacije bicikličnog peptida. Kvantitativnu procenu uspešne stabilizacije peptida moguće je dobiti praćenjem povećanja polu-života u plazmi miša i čoveka.
[0224] U prvoj instanci generisano je jedanaest derivata 17-69-07, kod kojih je svaka pozicija zamenjena alaninom (postupak "alaninskog skeniranja"). Ovaj postupak daje informacije o energetskom doprinosu i ulozi pojedinačnih aminokiselina i potencijalnom uklanjanju tačaka proteolitičkog prepoznavanja.
Tabela 5: Rezultati alaninskog skeniranja
[0225] Sekvenca 17-69-07-N004 je divlji tip, nemodifikovani peptid koji sadrži pokriveni N-terminus (N-terminusna acetilacija, koja nosi oznaku “Ac"). Neke od uvedenih supstitucija Ala se dobro tolerišu, naročito one na pozicijama 1, 3, 4, 10 i 11 unutar sekvence. S obzirom na to da bočni lanci ovih aminokiselina nisu potrebni za visoko-afinitetno vezivanje za ciljni molekul, jedinjenja formule (I) sa ovim konkretnim sekvencama su samo najšire opisana.
[0226] Rezultati su ukazali da je supstitucija na poziciji 1 (Tyr 1) veoma atraktivnu mogućnost, kojom se uklanja jedna od tačaka proteolitičkog prepoznavanja. Zamena Gly5 alaninom, Ala5, takođe može biti od interesa, jer iako je hemijska promena mala (adicija metal grupe), ona proizvodi dramatično smanjenje afiniteta. Moguće je da Gly5 zadobija neobične fi/psi uglove van generalnog Ramačandrovog dijagrama, a ovi uglovi mogli bi se potencijalno izazvati uvođenjem D-aminokiselina. Dodatan povoljan efekat bila bi stabilizacija peptidnih veza pored ovog mesta.
[0227] Iz ovih razloga izvršeno je delimično skeniranje D-alanina, kako bi se utvrdilo da li se oni dobro podnose u kontekstu očuvanja visokog afiniteta. Ugrađivanje D-aminokiselina u sekvencu veoma je poželjno zbog njihovih proteolitički stabilišućih uticaja.
Tabela 6: Efekti supstitucije aminokiselinskih ostataka u prvoj petlji D-Alaninom
[0228] D-Ala1 na mestu Tyr1 vezuje se sa 10 puta manjim afinitetom od divljeg tipa. Ipak, ova supstitucija je od interesa, jer iako je mesto proteolitičkog prepoznavanja Tyr1 uklonjeno i zamenjeno stabilišućom aminokiselinom, to nije dovelo do značajnog smanjenja potentnosti.
[0229] Neočekivano, supstitucija Gly5 u D-Ala5 dobro se podnosi, budući da afinitet u poređenju sa divljim tipom, ostaje nepromenjen.
[0230] U ovom kontekstu, D-Arg5 se takođe dobro podnosi (i stoga, sve D-aminokiseline izuzev D-Pro, videti Tabelu 6), što je od interesa, kada je potrebno promeniti fizičko-hemijska svojstva tokom daljeg razvoja ovog molekula (Tabela 7).
Tabela 7: Efekti supstitucionih ostataka na poziciji 5
[0231] Dalje, zbog fagne selekcije izlaznih sekvenci koja ukazuje na izvesnu preferenciju prema hidrofobnim i aromatičnim aminokiselinama na poziciji 4, sintetisana je serija derivata u koje su ugrađene izabrane aromatične aminokiseline, uključujući, prirodno postojeće aminokiseline, tirozin i triptofan (Tabela 8).
Tabela 8: Efekat supstitucionih ostataka na poziciji 4
[0232] 1Nal: 1-naftilalanin; 2NAl: 2-naftilalanin; Chg: cikloheksil-glicin, Phg: fenil-glicin; tBuGly: terc-butil-glicin; 3,4-DCPhe4: 3,4-dihloro-fenilalanin; Cha: cikloheksil-alanin; i HPhe: homo-fenilalanin.
[0233] Nekoliko supstitucija na poziciji 4 pojačava afinitet u odnosu na divlji tip, i one obuhvataju Tirozin, Triptofan, 1- i 2-naftil-alanin (1/2 Nal) i 3,4 dihlorofenil-alanin (3,4-DCPhe). Najpotentnija supstitucija je 1-naftil-alanin, koji pojačava afinitet 7 puta.
[0234] Neki ostaci u petlji 2 sekvence 17-69-07 ispitani su sa ciljem pojačanja stabilnosti molekula. Među njima je ostatak 9, na kome se nalazi potencijalno Tyr9 tačka prepoznavanja. Takođe je atraktivan ostatak 11, jer se može lako zameniti (Tabela 5), a blizu je Tyr9 mesta prepoznavanja.
Tabela 9: Sažetak tolerabilnih aminokiselinskih supstitucija
[0235] Od interesa je 4-bromo-fenilalanin (4BrPhe), koji menja Tyr9 mesto proteolitičkog prepoznavanja, i terc-butilglicin (tBuGly), koji neznatno povećava afinitet i, još važnije, značajno štiti susedne aminokiseline od proteolitičke hidrolize, steričnim ometanjem.
Višestruke supstitucije kako bi se postigla potpuna proteolitička zaštita 17-69-07
[0236] U prethodnom odeljku je obelodanjeno nekoliko pozicija u sekvenci 17-69-07, koje omogućavaju uvođenje aminokiselina koje dovode do povećanja stabilnosti prema proteolitičkoj razgradnji i/ili pojačavaju afinitet.
[0237] S ciljem da se ove modifikacije kombinuju u istom molekulu, sintetisan je molekul u koji su ugrađene supstitucije Tyr1→D-Ala1, Phe4→1Naftilalanin4, Gly5→D-Ala5, Tyr9→4BrPhe9 i Ile11→tBuGly11. Zapanjujuće, istovremene modifikacije se dobro podnose, a rezultujuća peptid ima potentnost veću od molekula divljeg tipa (Tabele 10 i 11).
Tabela 10: Rezultati specifičnih višestrukih supstitucija
[0238] Sa ciljem razvijanja pripajajućih efektorskih grupa za ove biciklične peptide tokom daljeg razvoja molekula, generisane su verzije molekula sa ugrađenim razdelnikom sarkozinom na N-terminusu (10 uzastopnih Sar, koji nosi oznaku Sar10), koje započinju glicinom na N-terminusu i završavaju se alaninom na C-terminusu. Za potrebe ovog testiranja, Gly na N-terminusu je zaštićen acetil grupom, kako bi se uklonilo pozitivno naelektrisanje.
Tabela 11: Uporedni podaci nakon adicije G-Sar10-A
[0239] Podaci ukazuju da se oba molekulska razdelnika (vezana za N-terminus, kao što je prikazano) i aminokiselinske supstitucije unutar središne sekvence bicikličnog peptida dobro podnose, uz održavanje i poboljšavanje potentnosti.
[0240] Tabela 12 prikazuje ne-acilovane (ne-)stabilisane derivative molekula koji su prikazani u Tabeli 11. Njihove stabilnosti su procenjene kvantitativno u plazmi miša i čoveka, kako bi se pokazalo poboljšanje u odnosu na nestabilisanu sekvencu 17-69-07-N219 (Slika 1).
Tabela 12: Molekuli izabrani za procenu stabilnosti u plazmi, i vrednosti potencije
[0241] Slika 3A prikazuje stabilnost penta i tetra-supstituisanih molekula 17-69-07-N244, odnosno, 17-69-07-N231, u plazmi miša u poređenju sa originalnim, nestabilisanim molekulom divljeg tipa 17-69-07-N219. Polu-život peptida u plazmi miša na 37°C je >> 20 sati, u poređenju sa 6 sati za molekul divljeg tipa.
[0242] Slika 3B prikazuje stabilnost penta- i tetra-supstituisanih molekula 17-69-07-N244, odnosno, 17-69-07-N231, u plazmi čoveka, u poređenju sa originalnim, nestabilisanim molekulom divljeg tipa 17-69-07-N219. Polu-život peptida u plazmi miša na 37°C je >> 20 sati, u odnosu na 6 sati za molekul divljeg tipa.
[0243] Ukratko, ciljane supstitucije na 5 pozicija u središnjoj sekvenci 17-69-07 bicikličnog peptide (Tyr1→D-Ala1, Phe4→1Naftil-alanin4, Gly5→D-Ala5, Tyr9→4BrPhe9 i Ile11→tBuGly11) proizvode superiorne molekule, koji ispoljavaju veću potentnost i značajno povećanu stabilnost u plazmi.
Selektivnost stabilisanog derivata 17-69-07 (17-69-07-N241)
[0244] Stabilisani derivat sa ugrađenim molekulskim razdelnikom 17-69-07-N241, testiran je u FP testu kompeticije u pogledu afiniteta prema hemopeksinskom domenu MT1-MMP dobijenom iz druge vrste. Podaci su sumarno prikazani u Tabeli 13:
Tabela 13: Unakrsna reaktivnost derivata 17-69-07 kod različitih vrsta
[0245] I nestabilisani i stabilisani derivati 17-69-07 potpuno su unakrsno reaktivni.
[0246] N-fluorescentno obeleženi derivat 17-69-07-N241 (sa oznakom 17-69-07-N258, i sekvencom: Fluorescein-(bAla)-Sar10-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 tBuGly11), testiran je u odnosu na metaloproteinaze čoveka. Podaci pokazuju da su središnja sekvenca 17-69-07 i ova stabilisana varijanta jedinstveno selektivne za MT1-MMP (Tabela 14).
Tabela 14: Selektivnost 17-69-07 i derivata prema srodnim metaloproteinazama
Primer 3: In vivo analiza proteolitički stabilisanih varijanti 17-69-07 konjugovanih sa helatorom
[0247] Peptidi konjugovani sa metalnim helatorima imaju brojne primene u dijagnostici i lečenju. Na helator se mogu naneti specifični imidžing ili terapeutski radioizotopi, koje peptid raznosi do ciljnog mesta. Na ovaj način se mogu, na primer, vizuelizovati tumor-specifični antigeni primenom PET ili SPECT skenera. Za ciljanu radioterapiju, terapeutski radionukleidi (kao što su<90>Y i<177>Lu) nanose se na helator-peptid konjugat, koji ih selektivno raznosi do tumora, vezivanjem za tumor-asocirane antigene. Tamo ovi izotopi ostvaruju anti-tumorsku aktivnost, emisijom visoko-energetskog zračenja.
Sinteza helator-vezanih 17-69-07 bicikličnih peptida
[0248] Sintetisano je pet derivata u kojima je metal-helator DOTA (1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1,4,7,10-tetrasirćetna kiselina) vezan za alanin na N-terminusu 17-69-07 bicikličnog peptida.
Tabela 15: Sažetak molekula i struktura
[0249] 17-69-07-N144 je originalna sekvenca 17-69-07, u kojoj je DOTA direktno vezan za alanin na N-terminusu, čija je uloga aminokiselinski razdelnik. Ovaj molekul zadržava svoju punu potentnost prema MT1-MMP. Da bi se dokazalo zadržavanje aktivnosti kada se veže za terapeutski/imidžing radionuklid, helator je nanesen sa prirodnim (hladnim)<175>Lutecijumom, koji predstavlja sigurnu supstituciju. Ovakav molekul je sačuvao potentnost. Potpuno uspostavljena varijanta, 17-69-07-N248, takođe zadržava potentnost u kontekstu ovog DOTA konjugata.
[0250] Pripremljen je kontrolni molekul, 17-69-07-N246, koji predstavlja potpuni D-aminokiselinski ekvivalent 17-69-07-N144. Ovaj molekul je u potpunosti rezistentan na proteolitičku degradaciju, jer su amidne veze pored D-aminokiseline rezistentne na delovanje proteaza, i ne pokazuju nikakvu aktivnost prema MT1-MMP. Važno je naglasiti da ovaj peptid zadržava istovetnu sekvencu i hemijski sastav.
Biodistribucija<177>Lu-obeleženog 17-69-07-N144 u HT1080 ksenograftu miša
[0251] HT-1080 ćelije (za koje je poznato da visoko eksprimiraju MT1-MMP), inokulirane su subkutano na desnoj strani trupa mužjaka miša BALB/c nu/nu soja, starih šest nedelja. Životinje su ostavljene oko 1 nedelje, da tumor poraste.
[0252] Količina od 150 pmol 17-69-07-N144 peptida obeležena je dodavanjem 1 MBq γ- i βemitera<177>Lu, primenom standardnih postupaka kompleksovanja. Po svakom mišu sa tumorom, injektovano je 150 pmol obeleženog 17-69-07-N144 (ekvivalent od 17 µg/kg). Za svaku vremensku tačku eutanazirane su tri životinje, izolovani su unutrašnji organi i tumor je izolovan i izmeren, a zatim je izmerena gama-radijacija po gramu tumorskog tkiva. Rezultujući dijagram daje kvantitativnu procenu lokalizacije peptida in vivo u mišu. Konkretno, selektivna akumulacija u HT1080 tumoru ukazuje na vezujuću aktivnost prema MT1-MMP in vivo.
[0253] Slika 4 sažeto prikazuje podatke vezane za biodistribuciju. Zapanjujuće, biciklični peptid je specifičan za tumor i istrajava 24 sata, uprkos procenjenom polu-životu u cirkulaciji od 14 min. Ovo ukazuje da se peptid preuzima u tumorske ćelije i tako štiti od degradacije. Upadljiva je prisutnost u bubrezima, što je najverovatnije uslovljeno transporterima aminokiselina bubrežnim ćelijama, koji prolazno vezuju peptid. Ostali organi ne pokazuju značajno preuzimanje molekula. Treba naglasiti, da hemopeksinski domen miša ima punu homologiju sa čovečjim pandanom, što ukazuje da bi se u slučaju da se PEX eksprimira u drugim tkivima miša, i tamo detektovao odgovarajući signal.
[0254] Da bi se ustanovilo da li je preuzimanje peptida u tumorske ćelije u modelu ksenografta selektivno, i uzrokovano vezivanjem za PEX, izvršena su dodatna ispitivanja, primenom peptida 17-69-07-N246, koji je D-aminokiselinski pandan 17-69-07-N144 (Slika 5).
[0255] Upoređivanjem profila biodistribucije sa onim koji je dobijen sa aktivnim bicikličnim peptidom 17-69-07-N144, jasno je da MT1-MMP ne-vezujući biciklični peptid 17-69-07-N246 ne dospeva do tumora, što potvrđuje da je signal koji potiče od 17-69-07-N144 u tumoru, posledica vezivanja za MT1-MMP in vivo.
[0256] Konačno, da bi se procenio efekat proteolitičke stabilizacije sekvence 17-69-07 na biodistribuciju, biciklični peptid 17-69-07-N248 (DOTA-A-(17-69-07) D-Ala1 1Nal4 D-Ala5 4BrPhe9 tBuGly11) primenjen je u identičnom ispitivanju biodistribucije (Slika 6).
[0257] Zapanjujuće, pojačana proteolitička stabilnost peptide dovodi u svim vremenskim tačkama do dva puta većeg preuzimanja u tumorsko tkivo, u odnosu na 17-69-07-N144, što ukazuje na veoma unapređena svojstva molekula u odnosu na originalnu, nestabilisanu sekvencu 17-69-07.
[0258] Pretpostavlja se da ovaj efekat može rezultirati povoljnim terapeutskim indeksom, kako u pogledu ciljane terapije radionuklidima, primenom konjugata opisanih u primeru, tako i u kontekstu bicikličnih peptida konjugovanih sa toksinom (Primer 4).
Primer 4: Konjugacija nestabilisanih bicikličnih peptida sa citotoksičnim agensima [0259] U terapiji kancera, visoko potentni citotoksični agensi vezuju se posredstvom razgradive veze sa ciljnim entitetom (u ovom slučaju sa bicikličnim peptidom), koji se vezuje za proteine asocirane sa površinom tumora. Visoko-eksprimirani protein na površini tumora selektuje se na osnovu svoje sposobnosti da uđe u ćelije. Nakon vezivanja konjugata citotoksičnog agensaciljnog entiteta za tumor-asocirani površinski protein, celokupan molekulski kompleks ulazi u ćeliju. Nakon prelaza iz sistemske cirkulacije u specifičan intracelularni milje, citotoksični agens se u uslovima koji vladaju u unutrašnjosti ćelije, iseca sa ciljnog entiteta i zatim ispoljava antitumorsku aktivnost, indukujući smrt ciljne ćelije, zaustavljanjem ćelijskog ciklusa i rezultujućom apoptozom.
[0260] Biciklični peptid 17-69-07-N219 (videti primere 2 i 3) sačinjen je od neizrođene središnje sekvence bicikličnog peptida, povezanog na N-terminusu za Gly-Sar10-Ala molekulskim razdelnikom (G-Sar10-A-(17-69-07), pri čemu je pun opis sekvence G-Sar10-A-CYNEFGCEDFYDIC; SEQ ID NO: 20). Ovaj derivat sekvence (17-69-07) zadržava punu potentnost (Tabela 12) prema MT1-MMP, sa Kd od 0.8 nM. Slobodna, jedinstvena amino grupa na N-terminusnoj strani molekulskog razdelnika idealno je postavljena za konjugaciju sa efektorskim grupama, kao što su potentne citotoksične supstance. Sar10 veznik formira znatan intramolekulski razmak između konjugacionog mesta na N-terminusnom Gly i središnje sekvence bicikličnog peptida, što omogućava zadržavanje punog vezujućeg potencijala u slučaju konjugacije sa efektorskim grupama velike molekulske težine. Moguće je primeniti kraće molekulske razdelnike, sve dok se održava potentnost središnje sekvence bicikličnog peptida prema ciljnom proteinu.
[0261] Da bi se obezbedio dokaz koncepta za konjugat bicikličnog peptida (označen BDC) sa afinitetom prema MT1-MMP, pripremljena su dva konjugata 17-69-07-N219, koji se zasnivaju na toksinu koji inhibira polimerizaciju mikrotubula DM1 (majtanzin, takođe poznat kao N2'-deacetil-N2'-(3-Mekrkapto-1-Oksopropil)-Majtanzin) ili MMAE (Monometilauristatin E, takođe poznat kao (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-il)-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamid).
[0262] Konjugat MMAE nosi oznaku BT17BDC-1 i razdvojen je od prekursora 17-69-07-N219, Valin-Citrulin (Val-Cit) veznikom koji obuhvata samorazgrađujuću para-aminobenzil-karbonil grupu (PABC). Ovaj Val-Cit veznik se selektivno iseca (hidrolizuje) u prisustvu katepsina B, koji se u visokoj koncentraciji nalazi u unutarćelijskim lizozimima, a nakon hidrolize, PABC se razlaže, oslobađajući MMAE, kao aktivni toksični agens. Ovaj Val-Cit-PABC veznik je stabilan u cirkulaciji, pa se toksin oslobađa tek nakon njegovog ulaska u ćeliju.
[0263] Struktura konjugata, i pregled sintetskog postupka za dobijanja BT17BDC-1, prikazan je na Shemi I:
Shema I
[0264] Strategija sinteze BDC17BDC-1: Potpuno prečišćen, TMB-ciklizovan 17-69-07-N219 biciklični prekursor reagovao je sa sukcinimid-estrom glutaril-valin-citrulin-p-aminobenzilkarbonil-MMAE (uobičajena skraćenica vc-MMAE ili Val-Cit-PABC-MMAE), što je dovelo do nastanka konjugata BDC17BDC-1.
[0265] Konjugat DM1 i 17-69-07-N219, koji nosi oznaku BT17BDC-9, razdvojen je od 17-69-07-N219 prekursora disulfidnom vezom, koja se može razgraditi pod redukujućim uslovima koji vladaju u untarćelijskoj sredini. Smatra se da do redukcije dolazi uz pomoć unutarćelijskog glutationa, čija je koncentracija u ćeliji oko ~ 10 mM. Suprotno tome, koncentracija glutationa i slobodnih redukujućih agenasa u cirkulaciji je znatno niža (<10 µM); stoga se toksin prevashodno oslobađa u unutarćelijskoj sredini, gde treba da ispolji svoju citotokičnu aktivnost.
[0266] Struktura konjugata, kao i pregled sintetskog postupka u pripremi BT17BDC-9, prikazan je na Shemi II:
[0267] Strategija sinteze BDC17BDC-9: Potpuno prečišćen, TMB-ciklizovan 17-69-07-N219 biciklični prekursor, koji sadrži slobodnu amino grupu na N-terminusu, stavljen je u reakciju sa sukcinimid-estar disulfidom DM1 (strukture kao što je prikazano), čime je nastao konjugat BDC17BDC-9.
[0268] Kod BDC17BDC-1 i BDC17BDC-9 oslobađanje toksina je mehanicistički drugačije, odnosno, kod prvog putem proteolitičke razgradnje u uslovima koji vladaju unutar ćelije, a kod drugog, pod redukujućim uslovima koji vladaju u ćeliji.
[0269] Dva BDC primenjena u in vitro studijama citotoksičnosti, pokazala su efikasnost u nanomolarnom/pikomolarnom opsegu koncentracija u ćelijskim kulturama, kao što je HT1080 (podaci nisu prikazani).
[0270] U in vivo modelu mišjeg ksenografta (koji nosi HT1080 tumor), oba BDC izazvala su značajno smanjenje zapremine tumora, 9 dana nakon injekcije, u poređenju sa kontrolom. Režim doziranja prikazan je na Slici 7 (strelice). Palpacijom je utvrđeno da su tumori potpuno nestali nakon 14 dana u prisustvu oba BDC (Slika 7). Treba naglasiti da je masa životinja pod režimom tretmana BDC17BDC-1 i BDC17BDC-9 bila stabilna, što ukazuje na vremenski prozor koji bi mogao da bude dovoljan za terapeutske svrhe.
Primer 5: Konjugacija proteolitički stabilizovanih bicikličnih peptida sa citotoksičnim agensima
[0271] Središnja sekvenca bicikličnog peptida 17-69-07 koji sadrži D-alanin na poziciji 1,1-naftil-alanin na poziciji 4, D-alanin na poziciji 5, i α-terc-butilglicin na poziciji 11, sa ili bez 4-bromofenilalanina na poziciji 9, ima pospešenu proteolitičku stabilnost u ex vivo plazmi i in vivo (Primeri 2, 3).
[0272] U kontekstu bicikličnih konjugata leka, veća stabilnost središnje sekvence bicikličnog peptida uslovljava veću izloženost tumora, kako zbog usporene eliminacije, tako i zbog veće stabilnosti u proteolitički agresivnom mikrookruženju tumora. Sve to dovodi do povećanja MT1-MMP-zavisnog preuzimanja BDC u ćeliju, i posledičnog povećanja terapeutske efikasnosti.
[0273] Stabilisani biciklični peptid 17-69-07-N241 ima istu osnovu kao nestabilisani 17-69-07-N219 (opisan u Primerima 3 i 4). On ima narednu sekvencu:
(B-Ala)-Sar10-AC(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C (SEQ ID NO: 5)
koja je ciklizovana pomoću TBMB, kao ranije.
[0274] Umesto prvobitno korišćenog glicina, izabran je beta-alanin na N-terminusu 17-69-07-N219, kako bi se umanjilo formiranje diketo-piperazina tokom vezivanja N-hidroksisukcinimid (NHS) estra (Purdie et al (1973), J. Chem. Soc., Perkin Trans.2, 1845), posebno u ovom primeru sa NHS estrima citotoksičnih agenasa (Sheme I, II).
[0275] Sarkozinski dekamerni razdelnik zadržan je u 17-69-07-N219, kako bi zadržala sposobnost vezivanja bicikličnog peptida za hemopeksinski domen MT1-MMP.
[0276] Klasa majtanzinskog toksina izabrana je za konjugaciju sa 17-69-07-N241, na osnovu efikasnosti i tolerabilnosti u modelu mišjeg ksenografta u Primeru 4, a takođe je izabran disulfidni razgradivi veznik, kao u Primeru 4.
[0277] Pripremljena su četiri BDC (ovde pod oznakom BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 i BT17BDC-20), pri čemu su toksin i 17-69-07-N241 ostali isti, dok je disulfidna veza, podložna redukciji/razgradnji, izmenjena modulacijom ometanja susednih atoma sumpora.
[0278] Put sinteze konjugata predstavljen je na Shemi II, naznačenoj time da je 17-69-07-N219 zamenjen za 17-69-07-N241.
[0279] Za sintezu BT17BDC-18, dodatni put sinteze obuhvata dobijanje piridil-disulfid bicikličnog prekursora (nosi oznaku 17-69-07-N277), koji u reakciji sa DM1 daje pun konjugat.
Sintetski put je opisan na Shemi III.
[0280] Strategija sinteze BDC 17BDC-18: Potpuno prečišćen, TMB-ciklizovan 17-69-07-N241 biciklični prekursor, koji sadrži slobodnu amino grupu na N-terminusu, stavljen je u reakciju sa SPP (N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoat)), što je dovelo do nastanka intermedijarnog 17-69-07-N277. Ovaj molekul zatim je reagovao sa DM1 kao slobodan tiol, nakon čega je nastao željeni konjugat BT17BDC-18.
[0281] In vitro karakterizacija BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 i BT17BDC-20 Četiri BDC je testirana su u vezi sa nekoliko in vitro parametara, kao što su zadržavanje potentnosti prema hemopeksinskom domenu humanog MT1-MMP, stabilnost ex vivo, u plazmi miša, pacova i čoveka i stabilnost prema redukujućim agensima, kao što je ditiotritol.
[0282] Podaci su sumarno prikazani u Tabeli 16:
Tabela 16: In vitro svojstva BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 i BT17BDC-20
[0283] Svi molekulski konstrukti zadržavaju svoj afinitet prema hemopeksinkom ciljnom domenu (druga kolona).
[0284] Podaci ukazuju da je stabilnost u plazmi određena prirodom disulfidne veze (kod koje može da se moduliše podložnost na redukciju), a ne prirodom bicikličnog peptida, budući da sve BDC sadrže isti biciklični peptid (17-69-07-N241), koji je stabilan u plazmi tri životinjske vrste u kojima je testiran.
[0285] Dalje, BT17BDC-18, BT17BDC-19 i BT17BDC-20 pokazuju stabilnost u plazmi čoveka, koja je dovoljna za terapeutsku primenu, jer je polu-život eliminacije peptida ove molekulske težine bubrežnom filtracijom kod čoveka procenjen na 2-4 h, što je nekoliko puta brže od degradacionog polu-života BDC u plazmi čoveka (> 14 h BT17BDC-18/19/20, videti Tabelu 16). Očekuje se da se najveći deo BDC eliminiše putem bubrega, dok se samo frakcija razgrađuje u cirkulaciji, što ove BDC čini potencijalno pogodnim za terapeutske svrhe.
Efikasnost BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 i BT17BDC-20 in vivo
[0286] Sve BDC koje sadrže stabilisanu središnju sekvencu bicikličnog peptida, testirane su u pogledu efikasnosti u modelima mišjeg kesongrafta in vivo, korišćenjem EBC-1 ćelijske linije humanog karcinoma plućnih skvamoznih ćelija.
[0287] BT17BDC-17, BT17BDC-18 i BT17BDC-19 bili su efikasni i uklonili su tumor za 9 dana (Slike 9, 10 i 11). BT17BDC-17 je pokazao odličnu efikasnost, ali je izazvao izvestan gubitak telesne mase pri višim dozama. BT17BDC-20, iako dobro tolerisan u pogledu gubitka telesne mase, nije ispoljio efikasnost i izazvao je marginalno smanjenje veličine tumora (Slika 12).
[0288] Napravljeni su grafici zavisnosti površine ispod krive (AUC) zapremine tumora tokom vremena i BDC za odgovarajuće dozne grupe (Slika 13). Na osnovu ovih grafika, određene su efektivne doze pri kojima se postiže 50% redukcije AUC tumora (ED50), a vrednosti su prikazane u Tabeli 17.
Tabela 17: Efektivne doze pri kojima se postiže 50% smanjenja AUC za BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18, BT17BDC-19 i BT17BDC-20
[0289] Dakle, BT17BDC-9, BT17BDC-17, BT17BDC-18 i BT17BDC-19 su na osnovu svoje efikasnosti, pogodni za primenu u ciljanoj terapiji kancera, i BT17BDC-17, BT17BDC-18 i BT17BDC-19 se dobro podnose pri efikasnim dozama.
Claims (22)
- Patentni zahtevi 1. Peptidni ligand specifičan za MT1-MMP, koji sadrži polipeptid koji sadrži najmanje tri cisteinska ostatka, razdvojena najmanje dvema sekvencama petlji, i molekulsku skelu, koja formira kovalentne veze sa cisteinskim ostacima polipeptida, tako da su najmanje dve polipeptidne petlje formirane na molekulskoj skeli, naznačen time što peptidni ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I): -Ci-X1-U/O2-X3-X4-G5-Cii-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-Ciii- (SEQ ID NO: 1) (I) ili njenu farmaceutski prihvatljivu so; gde: Ci, Ciii Ciiipredstavljaju prvi, drugi, odnosno, treći cisteinski ostatak; X predstavlja bilo koji aminokiselinski ostatak; U predstavlja polarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak, izabran između N, C, Q, M, S i T; i O predstavlja nepolarni alifatični aminokiselinski ostatak, izabran između G, A, I, L, P i V.
- 2. Peptidni ligand, prema zahtevu 1, naznačen time što je: (i) X1izabran između bilo koje od narednih aminokiselina: Y, M, F ili V, kao što su Y, M ili F, konkretno Y ili M, konkretnije Y; i/ili (ii) U/O2izabrano od U, kao što je N, ili O, kao što je G; i/ili (iii) X3izabran između U ili Z, gde U predstavlja polarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak, izabran između N, C, Q, M, S i T, a Z predstavlja polarni, negativno naelektrisani aminokiselinski ostatak, izabran između D ili E, konkretno U na poziciji 3 je izabran iz Q ili je Z na poziciji 3 izabran iz E; i/ili (iv) X4izabran od J, gde J predstavlja nepolarni aromatični aminokiselinski ostatak izabran između F, W i Y; i/ili (v) X10izabran od Z, gde Z predstavlja polarni, negativno naelektrisani aminokiselinski ostatak izabran između D ili E, kao što je D; i/ili (vi) X11izabran od O, gde O predstavlja nepolarni alifatični aminokiselinski ostatak, izabran između G, A, I, L, P i V, kao što je I.
- 3. Peptidni ligand, prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time što je jedinjenje formule (I) jedinjenje formule (Ia): -Ci-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-Cii-E-D-F-Y-Z-O-Ciii- (SEQ ID NO: 6) (Ia) gde U, O, J i Z imaju prethodno definisana značenja; ili jedinjenje formule (Ib): -Ci-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (SEQ ID NO: 7) (Ib); ili jedinjenje formule (Ic): -Ci-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (SEQ ID NO: 8) (Ic); ili jedinjenje formule (Id): -Ci-Y/M-N-E/Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (SEQ ID NO: 9) (Id); ili jedinjenje formule (Ie): -Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (SEQ ID NO: 2) (Ie).
- 4. Peptidni ligand, prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačen time što peptid formule (I) sadrži sekvencu izabranu između: -Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (SEQ ID NO: 2); -Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-12) (SEQ ID NO: 10); -Ci-F-G-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-02) (SEQ ID NO: 11); -Ci-V-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-03) (SEQ ID NO: 12); -Ci-F-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-04) (SEQ ID NO: 13); -Ci-Y-N-E-Y-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07-N057) (SEQ ID NO: 14); i -Ci-Y-N-E-W-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-44-N002) (SEQ ID NO: 15), kao što je: -Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (SEQ ID NO: 2); i -Ci-M-N-Q-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-12) (SEQ ID NO: 10), konkretno: -Ci-Y-N-E-F-G-Cii-E-D-F-Y-D-I-Ciii- (17-69-07) (SEQ ID NO: 2).
- 5. Peptidni ligand, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji uključuje jednu ili više modifikacija izabranih između: (i) modifikacije na N-terminusu, primenom pogodne amino-reaktivne reakcije, i/ili modifikacije na C-terminusu, primenom karboksi-reaktivne reakcije; (ii) modifikacije na N-terminusu koja uključuje adiciju molekulske razdelne grupe, koja olakšava konjugaciju efektorskih grupa i zadržavanje potentnosti bicikličnog peptida prema ciljnom molekulu, kao što su Ala, G-Sar10-A grupa ili bAla-Sar10-A grupa; (iii) modifikacije na N-terminusu i/ili C-terminusu, koja uključuje dodavanje citotoksičnog agensa; (iv) zamene aminokiselinskog ostataka na poziciji 4 nekim prirodno nepostojećim aminokiselinskim ostatkom, izabranim između: 1-naftilalanina; 2-naftilalanina; 3,4-dihlorofenilalanina; i homofenilalanina, kao što je 1-naftilalanin; 2-naftilalanin; i 3,4-dihlorofenilalanin, konkretno, 1-naftilalanin; (v) zamene aminokiselinskog ostatka na poziciji 9 i/ili 11 nekim prirodno nepostojećim aminokiselinskim ostatkom, izabranim između: 4-bromofenilalanina ili pentafluorofenilalanina za poziciju 9 i/ili terc-butilglicina za poziciju 11; (vi) zamene aminokiselinskog ostatka na poziciji 9 prirodno nepostojećim aminokiselinskim ostatkom, koji je 4-bromofenilalanin; (vii) zamene aminokiselinskog ostatka na poziciji 11 prirodno nepostojećim aminokiselinskim ostatkom, koji je terc-butilglicin; (viii) 2, 3, 4 ili 5 narednih modifikacija, konkretno svih 5 narednih modifikacija: D-alanin na poziciji 1 i/ili 5, 1-naftilalanin na poziciji 4, 4-bromofenilalanin na poziciji 9 i tercbutilglicin na poziciji 11; (ix) gde je aminokiselinski ostatak na poziciji 1 supstituisan za D-alanin; ili (x) gde je aminokiselinski ostatak na poziciji 5 supstituisan za D-alanin ili D-arginin.
- 6. Peptidni ligand, prema zahtevu 5, koji je: (β-Ala)-Sar10-AC(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)C (SEQ ID NO: 5), ili njena farmaceutski prihvatljiva so.
- 7. Peptidni ligand prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačen time što je molekulska skela TBMB, odnosno, 1,3,5-tris(bromometil)benzen.
- 8. Konjugat leka koji sadrži peptidni ligand, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, konjugovan za jednu ili više efektorskih i/ili funkcionalnih grupa, kao što je citotoksični agens ili helator metala.
- 9. Konjugat leka, prema zahtevu 8, naznačen time što je citotoksični agens vezan razgradivom vezom za biciklični peptid, gde je veza disulfidna veza ili veza osetljiva na delovanje proteaza.
- 10. Konjugat leka, prema zahtevu 8 ili zahtevu 9, naznačen time što je citotoksični agens izabran od DM1, sa sledećom strukturom:ili MMAE, sa sledećom strukturom:
- 11. Konjugat leka, prema bilo kom od zahteva 8 do 10, koji je jedinjenje sa sledećom strukturom:ili
- 12. Konjugat leka, prema zahtevu 8 ili zahtevu 9, naznačen time što je citotoksični agens majtanzinoid i izabran je od jedinjenja formule (II):gde n predstavlja ceo broj odabran od 1 do 10; i R1i R2nezavisno predstavljaju vodonik, C1-6alkil ili karbocikličnu ili heterocikličnu grupu, kao što je vodonik ili metil grupa.
- 13. Konjugat leka, prema zahtevu 12, naznačen time što: n predstavlja 1, a R1i R2oba predstavljaju vodonik (odnosno, majtanzinski derivat DM1); ili n predstavlja 2, R1predstavlja vodonik i R2predstavlja metil grupu (odnosno, majtanzinski derivat DM3); ili n predstavlja 2, a R1i R2oba predstavljaju metil grupe (odnosno, majtanzinski derivat DM4).
- 14. Konjugat leka, prema bilo kom od zahteva 8 do 13, naznačen time što biciklična peptidna komponenta konjugata ima strukturu prikazanu formulom (III):gde m predstavlja ceo broj odabran od 0 do 10, i R3i R4nezavisno predstavljaju vodonik, C1-6alkil ili karbocikličnu ili heterocikličnu grupu, kao što je vodonik ili metil grupa.
- 15. Konjugat leka, prema bilo kom od zahteva 8 do 14, naznačen time što je citotoksični agens vezan za biciklični peptid preko veznika definisanog formulom (IV):gde R1, R2, R3i R4predstavljaju vodonik, C1-6alkil ili karbocikličnu ili heterocikličnu grupu, kao što je vodonik ili metil grupa; Toksin se odnosi na svaki pogodni citotoksični agens; Biciklična komponenta je peptidni ligand, prema bilo kom od zahteva 1 do 7; n je ceo broj odabran od 1 do 10; i m je ceo broj odabran od 0 do 10.
- 16. Konjugat leka prema zahtevu 15, naznačen time što je toksin jedinjenja (IV) majtanzin i konjugat sadrži jedinjenje formule (V):gde R1, R2, R3i R4predstavljaju vodonik, C1-6alkil ili karbocikličnu ili heterocikličnu grupu; Biciklična komponenta predstavlja peptidni ligand, prema bilo kom od zahteva 1 do 7; n je ceo broj odabran od 1 do 10; i m je ceo broj odabran od 0 do 10.
- 17. Konjugat leka, prema zahtevu 16, naznačen time što: n predstavlja 1, a R1, R2, R3i R4svaki predstavlja vodonik, odnosno jedinjenje formule (V)<a>:ili n predstavlja 1, R1predstavlja metil, a R2, R3i R4svaki predstavlja vodonik, odnosno, jedinjenje formule (V)<b>:ili n predstavlja 2, R1i R2oba predstavljaju vodonik, a R3i R4oba predstavljaju metil, odnosno, jedinjenje formule (V)<c>:ili n predstavlja 2, R1i R3oba predstavljaju metil, a R2i R4oba predstavljaju vodonik, odnosno, jedinjenje formule (V)<d>:
- 18. Konjugat leka prema zahtevu 8, naznačen time što je izabran od BT17BDC-9:BT17BDC-17:BT17BDC-18:BT17BDC-19:BT17BDC-20:
- 19. Konjugat leka, prema zahtevu 18, koji je BT17BDC-18:
- 20. Postupak pripreme konjugata leka prema zahtevu 19, koji obuhvata put sinteze prikazan na Shemi III:
- 21. Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptidni ligand prema bilo kom od zahteva 1 do 7, ili konjugat leka prema bilo kom od zahteva 8 do 19, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
- 22. Konjugat leka, prema bilo kom od zahteva 8 do 19, za primenu u prevenciji, supresiji ili terapiji kancera, konkretno solidnih tumora, kao što su nesitnoćelijski karcinomi pluća.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1419237.1A GB201419237D0 (en) | 2014-10-29 | 2014-10-29 | Novel polypeptides |
| GBGB1515245.7A GB201515245D0 (en) | 2015-08-27 | 2015-08-27 | Novel polypeptides |
| EP15790220.6A EP3215518B1 (en) | 2014-10-29 | 2015-10-29 | Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp |
| PCT/GB2015/053247 WO2016067035A1 (en) | 2014-10-29 | 2015-10-29 | Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RS61853B1 true RS61853B1 (sr) | 2021-06-30 |
Family
ID=54427796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20210611A RS61853B1 (sr) | 2014-10-29 | 2015-10-29 | Biciklični peptidni ligandi specifični za mt1-mmp |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US10532106B2 (sr) |
| EP (2) | EP3215518B1 (sr) |
| JP (2) | JP6882978B2 (sr) |
| KR (3) | KR102746415B1 (sr) |
| CN (1) | CN107148425B (sr) |
| AU (1) | AU2015340300B2 (sr) |
| BR (1) | BR112017008575B1 (sr) |
| CA (2) | CA3220466A1 (sr) |
| CY (1) | CY1124157T1 (sr) |
| DK (1) | DK3215518T3 (sr) |
| ES (1) | ES2870449T3 (sr) |
| HR (1) | HRP20210809T8 (sr) |
| HU (1) | HUE054526T2 (sr) |
| LT (1) | LT3215518T (sr) |
| NZ (1) | NZ731185A (sr) |
| PL (1) | PL3215518T3 (sr) |
| PT (1) | PT3215518T (sr) |
| RS (1) | RS61853B1 (sr) |
| RU (1) | RU2708459C2 (sr) |
| SG (1) | SG11201702845QA (sr) |
| SI (1) | SI3215518T1 (sr) |
| SM (1) | SMT202100301T1 (sr) |
| WO (1) | WO2016067035A1 (sr) |
Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RS61853B1 (sr) | 2014-10-29 | 2021-06-30 | Bicyclerd Ltd | Biciklični peptidni ligandi specifični za mt1-mmp |
| GB201600911D0 (en) * | 2016-01-18 | 2016-03-02 | Bicycle Therapeutics Ltd | Stabilized peptide derivatives |
| GB201607827D0 (en) * | 2016-05-04 | 2016-06-15 | Bicycle Therapeutics Ltd | Bicyclic peptide-toxin conjugates specific for MT1-MMP |
| WO2018096365A1 (en) | 2016-11-27 | 2018-05-31 | Bicyclerd Limited | Methods for treating cancer |
| US11730819B2 (en) | 2016-12-23 | 2023-08-22 | Bicycletx Limited | Peptide derivatives having novel linkage structures |
| CN110506049B (zh) * | 2016-12-23 | 2024-08-16 | 拜斯科技术开发有限公司 | 用于结合mt1-mmp的肽配体 |
| WO2018127699A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Bicyclerd Limited | Compounds for treating cancer |
| US12410143B2 (en) | 2017-01-17 | 2025-09-09 | Michael David FORREST | Therapeutic inhibitors of the reverse mode of ATP synthase |
| GB201706477D0 (en) * | 2017-04-24 | 2017-06-07 | Bicycle Therapeutics Ltd | Modification of polypeptides |
| EP3615550A1 (en) | 2017-04-27 | 2020-03-04 | BicycleTx Limited | Bicyclic peptide ligands and uses thereof |
| EP3645549A1 (en) | 2017-06-26 | 2020-05-06 | BicycleRD Limited | Bicyclic peptide ligands with detectable moieties and uses thereof |
| BR112019028172A2 (pt) | 2017-07-13 | 2020-10-06 | Michael David Forrest | moduladores terapêuticos do modo reverso da atp sintase |
| JP7670481B2 (ja) | 2017-08-04 | 2025-04-30 | バイスクルテクス・リミテッド | Ｃｄ１３７に対して特異的な二環式ペプチドリガンド |
| US20200291096A1 (en) | 2017-08-14 | 2020-09-17 | Bicyclerd Limited | Bicyclic peptide ligand sting conjugates and uses thereof |
| US20200283482A1 (en) | 2017-08-14 | 2020-09-10 | Bicyclerd Limited | Bicyclic peptide ligand prr-a conjugates and uses thereof |
| TWI825046B (zh) | 2017-12-19 | 2023-12-11 | 英商拜西可泰克斯有限公司 | Epha2特用之雙環胜肽配位基 |
| GB201721265D0 (en) | 2017-12-19 | 2018-01-31 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for EphA2 |
| KR20200128518A (ko) | 2018-02-23 | 2020-11-13 | 바이사이클티엑스 리미티드 | 다량체성 비사이클릭 펩타이드 리간드 |
| KR20200139236A (ko) | 2018-04-04 | 2020-12-11 | 바이사이클티엑스 리미티드 | 헤테로탠덤 비사이클릭 펩티드 복합체 |
| US11180531B2 (en) * | 2018-06-22 | 2021-11-23 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for Nectin-4 |
| GB201810325D0 (en) * | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicycletx Ltd | Peptide ligands for binding to PSMA |
| GB201810320D0 (en) * | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicycletx Ltd | Peptide ligands for binding to CD38 |
| GB201810329D0 (en) * | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicycletx Ltd | Peptide ligands for binding to integrin avB3 |
| GB201810327D0 (en) | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicycletx Ltd | Peptide ligands for binding to IL-17 |
| GB201810316D0 (en) * | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicyclerd Ltd | Peptide ligands for binding to EphA2 |
| CN112955459A (zh) | 2018-10-23 | 2021-06-11 | 拜斯科技术开发有限公司 | 双环肽配体和其用途 |
| SG11202104356VA (en) * | 2018-10-30 | 2021-05-28 | Bicyclerd Ltd | Bt1718 for use in treating cancer |
| GB201820316D0 (en) * | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for IL-17 |
| GB201820295D0 (en) * | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for MT1-MMP |
| GB201820320D0 (en) * | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for FAPalpha |
| GB201820325D0 (en) * | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for psma |
| US20220024982A1 (en) | 2018-12-13 | 2022-01-27 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp |
| GB201820288D0 (en) * | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicycle Tx Ltd | Bicycle peptide ligaands specific for MT1-MMP |
| WO2020128527A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Bicyclerd Limited | Bicyclic peptide ligands specific for pd-l1 |
| CN113474045A (zh) | 2018-12-21 | 2021-10-01 | 拜斯科技术开发有限公司 | Pd-l1特异性的双环肽配体 |
| GB201900530D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for CD38 |
| GB201900528D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for integrin AVB3 |
| GB201900529D0 (en) * | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for CD38 |
| GB201900526D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for caix |
| GB201900527D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for integrin avb3 |
| GB201900525D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for caix |
| WO2020165600A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-08-20 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligand sting conjugates and uses thereof |
| US20220135614A1 (en) | 2019-03-04 | 2022-05-05 | Bicyclerd Limited | Synthesis of bicycle toxin conjugates, and intermediates thereof |
| WO2020225577A1 (en) * | 2019-05-09 | 2020-11-12 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for ox40 |
| TWI869398B (zh) | 2019-05-10 | 2025-01-11 | 英商拜西克爾德有限公司 | 治療癌症之方法 |
| TWI862640B (zh) | 2019-07-30 | 2024-11-21 | 英商拜西可泰克斯有限公司 | 異質雙環肽複合物 |
| GB201912320D0 (en) * | 2019-08-28 | 2019-10-09 | Bicycletx Ltd | PBP Binding Bicyclic Peptide Ligands |
| PT4464721T (pt) | 2019-10-03 | 2025-06-24 | Bicycletx Ltd | Complexos peptídicos bicíclicos heterotandem |
| GB201914872D0 (en) | 2019-10-15 | 2019-11-27 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligand drug conjugates |
| US20220387611A1 (en) | 2019-10-16 | 2022-12-08 | Bicyclerd Limited | Methods for treating cancer |
| GB201918559D0 (en) * | 2019-12-16 | 2020-01-29 | Bicycle Tx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for IL-17 |
| GB201918558D0 (en) | 2019-12-16 | 2020-01-29 | Bicycle Tx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for IL-17 |
| US20230021419A1 (en) | 2019-12-16 | 2023-01-26 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for il-17 |
| GB201918557D0 (en) | 2019-12-16 | 2020-01-29 | Bicycle Tx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for IL-17 |
| GB202002705D0 (en) * | 2020-02-26 | 2020-04-08 | Bicycletx Ltd | Anti-infective bicyclic peptide conjugates |
| EP4149954A1 (en) * | 2020-05-15 | 2023-03-22 | BicycleTX Limited | Anti-infective bicyclic peptide ligands |
| KR20230074119A (ko) | 2020-08-03 | 2023-05-26 | 바이사이클티엑스 리미티드 | 펩타이드 기반 링커 |
| GB202016331D0 (en) | 2020-10-15 | 2020-12-02 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligand drug conjugates |
| CA3206529A1 (en) | 2021-01-08 | 2022-07-14 | Bicycletx Limited | Heterotandem bicyclic peptide complexes |
| US20250186539A2 (en) | 2021-01-11 | 2025-06-12 | Bicycletx Limited | Methods for treating cancer |
| CN112852378B (zh) * | 2021-01-13 | 2022-11-18 | 广东省京极盛新材料科技有限公司 | 一种反应型聚氨酯热熔胶 |
| WO2022157548A1 (en) | 2021-01-24 | 2022-07-28 | Forrest Michael David | Inhibitors of atp synthase - cosmetic and therapeutic uses |
| CN118055772A (zh) * | 2021-09-29 | 2024-05-17 | 星联肽(珠海)生物科技有限公司 | 三环多肽偶联药物及其应用 |
| GB202114279D0 (en) | 2021-10-06 | 2021-11-17 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligand drug conjugates |
| GB202114282D0 (en) | 2021-10-06 | 2021-11-17 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligand drug conjugates |
| WO2023088236A1 (zh) * | 2021-11-16 | 2023-05-25 | 海思科医药集团股份有限公司 | Mt1-mmp的双环肽配体及其缀合物 |
| CN114656525B (zh) * | 2022-04-25 | 2024-02-02 | 合肥师范学院 | 用于癌细胞整合素的rgd环肽及其在制备肿瘤药物中的应用 |
| CN115028685B (zh) * | 2022-06-24 | 2023-10-20 | 张金强 | 一种阳离子双环抗菌肽及其应用 |
| IL325021A (en) | 2023-06-07 | 2026-01-01 | Peptidream Inc | Glypican-3-targeting peptide compositions and uses thereof |
| CN121532408A (zh) | 2023-06-23 | 2026-02-13 | 拜斯科技术开发有限公司 | 对nk细胞具有特异性的双环肽配体 |
| GB202312685D0 (en) | 2023-08-18 | 2023-10-04 | Bicycletx Ltd | Computer implemented method |
| GB202410566D0 (en) | 2024-07-19 | 2024-09-04 | Bicycletx Ltd | Computer implemented method |
| WO2026050075A1 (en) | 2024-08-24 | 2026-03-05 | Noctrix Health, Inc. | Wearable device for producing high frequency electrostimulation |
Family Cites Families (204)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2642514A (en) | 1946-08-10 | 1953-06-16 | American Cyanamid Co | Ion exchange process with magnetic ion exchange resins |
| GB1239978A (en) | 1968-07-15 | 1971-07-21 | Permutt Company Ltd | Ion-exchange processes |
| US4709016A (en) | 1982-02-01 | 1987-11-24 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| US5650270A (en) | 1982-02-01 | 1997-07-22 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| US4650750A (en) | 1982-02-01 | 1987-03-17 | Giese Roger W | Method of chemical analysis employing molecular release tag compounds |
| US5516931A (en) | 1982-02-01 | 1996-05-14 | Northeastern University | Release tag compounds producing ketone signal groups |
| US5595756A (en) | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
| US20020164788A1 (en) | 1994-12-02 | 2002-11-07 | The Wellcome Foundation Limited | Humanized antibodies to CD38 |
| WO1997008320A1 (en) | 1995-08-18 | 1997-03-06 | Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh | Protein/(poly)peptide libraries |
| EP0941120A4 (en) | 1996-11-05 | 2004-08-18 | Bristol Myers Squibb Co | BRANCHED PEPTIDLINKERS |
| US6410275B1 (en) | 1997-05-02 | 2002-06-25 | Biomerieux, Inc. | Disposable test devices for performing nucleic acid amplification reactions |
| US6326144B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-12-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Biological applications of quantum dots |
| JP4630459B2 (ja) | 1998-09-24 | 2011-02-09 | インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション | 水溶性発光量子ドットおよびその生体分子コンジュゲート |
| US6927203B1 (en) | 1999-08-17 | 2005-08-09 | Purdue Research Foundation | Treatment of metastatic disease |
| PT1382339E (pt) | 1999-12-10 | 2008-02-06 | Pfizer Prod Inc | Composições que contêm derivados de pirrolo[2,3-d]- pirimidina |
| PE20020354A1 (es) | 2000-09-01 | 2002-06-12 | Novartis Ag | Compuestos de hidroxamato como inhibidores de histona-desacetilasa (hda) |
| GB0105929D0 (en) * | 2001-03-09 | 2001-04-25 | Btg Int Ltd | Physiologically activated prodrugs |
| JP3836436B2 (ja) | 2001-04-27 | 2006-10-25 | 全薬工業株式会社 | 複素環式化合物及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤 |
| TWI329105B (en) | 2002-02-01 | 2010-08-21 | Rigel Pharmaceuticals Inc | 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses |
| AU2003217606C1 (en) | 2002-02-21 | 2008-07-17 | Institute Of Virology | Soluble Form of Carbonic Anhydrase IX (s-CA IX), Assays to Detect s-CA IX, CA IXs Coexpression with HER-2/neu/c-erbB-2 and CA IX-Specific Monoclonal Antibodies to Non-Immunodominant Epitopes |
| US20050276812A1 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Genentech, Inc. | Antibody-drug conjugates and methods |
| DK1536827T3 (da) | 2002-08-14 | 2009-04-20 | Silence Therapeutics Ag | Anvendelse af proteinkinase N-beta |
| SI1549333T1 (sl) | 2002-09-20 | 2012-02-29 | Univ Pennsylvania | Analogi kompstatina z izboljĺ ano aktivnostjo |
| AU2003286411A1 (en) | 2002-12-12 | 2004-06-30 | Tel Aviv University Future Technology Development L.P. | Glycogen synthase kinase-3 inhibitors |
| EP1452868A2 (en) | 2003-02-27 | 2004-09-01 | Pepscan Systems B.V. | Method for selecting a candidate drug compound |
| JP2006523237A (ja) | 2003-04-03 | 2006-10-12 | セマフォア ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | Ｐｉ−３キナーゼインヒビタープロドラッグ |
| JP4980715B2 (ja) | 2003-05-30 | 2012-07-18 | ジェミン エックス ファーマシューティカルズ カナダ インコーポレイテッド | がんまたはウイルス疾患を治療するための三環性複素環化合物、組成物および方法 |
| JP2007524397A (ja) | 2003-07-03 | 2007-08-30 | ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア | Ｓｙｋキナーゼ発現の阻害 |
| NZ548990A (en) | 2004-02-06 | 2009-06-26 | Morphosys Ag | Anti-CD38 human antibodies and uses therefor |
| CA2505655C (en) | 2004-04-28 | 2013-07-09 | Warren Chan | Stable, water-soluble quantum dot, method of preparation and conjugates thereof |
| PL1761540T3 (pl) | 2004-05-13 | 2017-06-30 | Icos Corporation | Chinazolinony jako inhibitory ludzkiej kinazy 3-fosfatydyloinozytolu delta |
| TWI309240B (en) | 2004-09-17 | 2009-05-01 | Hoffmann La Roche | Anti-ox40l antibodies |
| CN101115761B (zh) | 2005-01-19 | 2012-07-18 | 里格尔药品股份有限公司 | 2,4-嘧啶二胺化合物的前药及其应用 |
| WO2006078161A1 (en) | 2005-01-24 | 2006-07-27 | Pepscan Systems B.V. | Binding compounds, immunogenic compounds and peptidomimetics |
| PL1866328T3 (pl) | 2005-03-22 | 2011-05-31 | Rohto Pharma | Peptydy zwiększające wytwarzanie kolagenu lub kwasu hialuronowego |
| WO2006105021A2 (en) | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Tolerrx, Inc. | Gitr binding molecules and uses therefor |
| PT1888550E (pt) | 2005-05-12 | 2014-09-03 | Abbvie Bahamas Ltd | Promotores de apoptose |
| GB0510390D0 (en) | 2005-05-20 | 2005-06-29 | Novartis Ag | Organic compounds |
| EA019344B1 (ru) | 2005-07-01 | 2014-03-31 | МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си. | Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения |
| US7402325B2 (en) | 2005-07-28 | 2008-07-22 | Phoenix Biotechnology, Inc. | Supercritical carbon dioxide extract of pharmacologically active components from Nerium oleander |
| AU2006287416A1 (en) | 2005-09-07 | 2007-03-15 | Medimmune, Llc | Toxin conjugated Eph receptor antibodies |
| ES2513165T3 (es) | 2005-10-07 | 2014-10-24 | Exelixis, Inc. | Derivados de N-(3-amino-quinoxalin-2-il)-sulfonamida y su uso como inhibidores de la fosfatidilinositol-3-quinasa |
| NZ567851A (en) | 2005-11-01 | 2011-09-30 | Targegen Inc | Bi-aryl meta-pyrimidine inhibitors of kinases |
| TWI630207B (zh) | 2005-12-13 | 2018-07-21 | 英塞特控股公司 | 作為傑納斯激酶（ＪＡＮＵＳ ＫＩＮＡＳＥ）抑制劑之經雜芳基取代之吡咯并〔２，３-ｂ〕吡啶及吡咯并〔２，３-ｂ〕嘧啶 |
| JO2660B1 (en) | 2006-01-20 | 2012-06-17 | نوفارتيس ايه جي | Pi-3 inhibitors and methods of use |
| WO2007093836A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-08-23 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a xp gene and uses thereof |
| KR101533461B1 (ko) | 2006-04-26 | 2015-07-02 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | Ｐｉ３ｋ저해제로 유용한 티에노［3,2-ｄ］피리미딘 유도체 |
| WO2008033561A2 (en) | 2006-09-15 | 2008-03-20 | Siemens Medical Solutions Usa, Inc. | Click chemistry-derived cyclopeptide derivatives as imaging agents for integrins |
| EA018573B1 (ru) | 2006-09-22 | 2013-09-30 | Фармасайкликс, Инк. | Ингибиторы тирозинкиназы брутона |
| CN101232326B (zh) | 2007-01-22 | 2012-01-11 | 中兴通讯股份有限公司 | 用于无源光网络系统的动态带宽分配装置及其实现方法 |
| KR101737753B1 (ko) | 2007-03-12 | 2017-05-18 | 와이엠 바이오사이언시즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 | 페닐 아미노 피리미딘 화합물 및 이의 용도 |
| WO2008118802A1 (en) | 2007-03-23 | 2008-10-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Therapeutic compounds |
| GB0707034D0 (en) | 2007-04-12 | 2007-05-23 | St Andrews The | Compounds |
| WO2008134761A2 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-06 | Intezyne Technologies, Inc. | Modification of biological targeting groups for the treatment of cancer |
| EP1987839A1 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-05 | I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale | Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease |
| PE20090717A1 (es) | 2007-05-18 | 2009-07-18 | Smithkline Beecham Corp | Derivados de quinolina como inhibidores de la pi3 quinasa |
| CN101918844A (zh) | 2007-06-18 | 2010-12-15 | 米迪缪尼有限公司 | 表达epha2和erbb2的细胞的协同治疗 |
| CA2693677C (en) | 2007-07-12 | 2018-02-13 | Tolerx, Inc. | Combination therapies employing gitr binding molecules |
| EP2044949A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Immutep | Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response |
| EP2227233B1 (en) | 2007-11-30 | 2013-02-13 | Newlink Genetics | Ido inhibitors |
| CN101497878B (zh) * | 2008-01-30 | 2012-11-07 | 房学迅 | 特异性高效亲和膜ⅰ型基质金属蛋白酶(mt1-mmp)的多肽、蛋白及其应用 |
| WO2009097397A2 (en) * | 2008-01-30 | 2009-08-06 | Dyax Corp. | Metalloproteinase binding proteins |
| DK2257624T5 (da) | 2008-02-05 | 2012-09-10 | Medical Res Council | Fremgangsmåder og sammensætninger |
| DK2257309T3 (da) | 2008-02-27 | 2020-01-20 | Yeda Res And Development Company Ltd | Rgd-(bakterie)chlorophyl-konjugater til anvendelse ved diagnose af tumorer, der omfatter nekrotiske domæner |
| PL2288610T3 (pl) | 2008-03-11 | 2017-12-29 | Incyte Holdings Corporation | Azetydynowe i cyklobutanowe pochodne jako inhibitory jak |
| US8293714B2 (en) | 2008-05-05 | 2012-10-23 | Covx Technology Ireland, Ltd. | Anti-angiogenic compounds |
| FR2932189A1 (fr) | 2008-06-10 | 2009-12-11 | Commissariat Energie Atomique | Biopuces pour la detection de l'activite enzymatique d'une enzyme protease |
| US8338439B2 (en) | 2008-06-27 | 2012-12-25 | Celgene Avilomics Research, Inc. | 2,4-disubstituted pyrimidines useful as kinase inhibitors |
| AR072999A1 (es) | 2008-08-11 | 2010-10-06 | Medarex Inc | Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos |
| HUE065752T2 (hu) | 2008-12-09 | 2024-06-28 | Hoffmann La Roche | Anti-PD-L1 antitestek és felhasználásuk T-sejt funkció elõsegítésére |
| GB0913775D0 (en) * | 2009-08-06 | 2009-09-16 | Medical Res Council | Multispecific peptides |
| US20120183847A1 (en) | 2009-05-19 | 2012-07-19 | Aic Blab | Composite current collector and methods therefor |
| GB0914110D0 (en) | 2009-08-12 | 2009-09-16 | Medical Res Council | Peptide libraries |
| RU2595409C2 (ru) | 2009-09-03 | 2016-08-27 | Мерк Шарп И Доум Корп., | Анти-gitr-антитела |
| WO2011056652A1 (en) | 2009-10-28 | 2011-05-12 | Newlink Genetics | Imidazole derivatives as ido inhibitors |
| AU2010321738B2 (en) | 2009-11-23 | 2016-07-14 | Palatin Technologies, Inc. | Melanocortin-1 receptor-specific cyclic peptides |
| AU2010329934B2 (en) | 2009-12-10 | 2015-05-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies binding preferentially human CSF1R extracellular domain 4 and their use |
| US9073974B2 (en) | 2009-12-21 | 2015-07-07 | The Regents Of The University Of California | RGD-containing cyclic peptides |
| EP2343081A1 (en) | 2009-12-31 | 2011-07-13 | Rijksuniversiteit Groningen | Interferon analogs |
| JP2013518558A (ja) * | 2010-02-04 | 2013-05-23 | メディカル リサーチ カウンシル | 構造化されたペプチドプロセシング |
| JP2013518807A (ja) * | 2010-02-04 | 2013-05-23 | メディカル リサーチ カウンシル | 多重特異性ペプチド |
| DK2542256T3 (da) | 2010-03-04 | 2019-08-26 | Macrogenics Inc | Antistoffer reagerende med b7-h3, immunologisk aktive fragmenter deraf og anvendelser deraf |
| CA2789071C (en) | 2010-03-05 | 2018-03-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies against human csf-1r and uses thereof |
| MX2012010014A (es) | 2010-03-05 | 2012-09-21 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos contra csf-1r humano y sus usos. |
| MX355418B (es) | 2010-05-04 | 2018-04-18 | Five Prime Therapeutics Inc | Anticuerpos que se unen a factor estimulante de colonias 1 (csf1r). |
| CN103221428B (zh) | 2010-09-09 | 2016-02-10 | 辉瑞公司 | 4-1bb结合分子 |
| WO2012057624A1 (en) | 2010-10-25 | 2012-05-03 | Pepscan Systems B.V. | Novel bicyclic peptide mimetics |
| PH12013501201A1 (en) | 2010-12-09 | 2013-07-29 | Univ Pennsylvania | Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer |
| JP6486004B2 (ja) | 2011-02-10 | 2019-03-20 | ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルクＲｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ | 疎水性修飾ペプチドおよび肝臓特異的標的化のためのその使用 |
| US20130072598A1 (en) | 2011-03-18 | 2013-03-21 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Thermoplastics from Distillers Dried Grains and Feathers |
| NO2694640T3 (sr) | 2011-04-15 | 2018-03-17 | ||
| JP6072771B2 (ja) | 2011-04-20 | 2017-02-01 | メディミューン，エルエルシー | Ｂ７−ｈ１およびｐｄ−１に結合する抗体およびその他の分子 |
| US10800813B2 (en) * | 2011-10-07 | 2020-10-13 | Bicyclerd Limited | Modulation of structured polypeptide specificity |
| GB201117428D0 (en) | 2011-10-07 | 2011-11-23 | Bicycle Therapeutics Ltd | Structured polypeptides with sarcosine linkers |
| KR101981873B1 (ko) | 2011-11-28 | 2019-05-23 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 항-ｐｄ-ｌ1 항체 및 그의 용도 |
| US10023643B2 (en) | 2011-12-15 | 2018-07-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| EP2812355A4 (en) | 2012-02-06 | 2016-03-02 | Hoffmann La Roche | COMPOSITIONS AND METHODS OF USE OF CSF1R INHIBITORS |
| AR090263A1 (es) | 2012-03-08 | 2014-10-29 | Hoffmann La Roche | Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma |
| JP2015517490A (ja) | 2012-05-11 | 2015-06-22 | ファイブ プライム セラピューティックス インコーポレイテッド | コロニー刺激因子１受容体（ｃｓｆ１ｒ）を結合させる抗体を用いて状態を治療する方法 |
| US9556229B2 (en) * | 2012-05-18 | 2017-01-31 | The Regents Of The University Of California | Modification of peptides using a bis(thioether)arylbridge approach |
| UY34887A (es) | 2012-07-02 | 2013-12-31 | Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware | Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos |
| SG10201906328RA (en) | 2012-08-31 | 2019-08-27 | Five Prime Therapeutics Inc | Methods of treating conditions with antibodies that bind colony stimulating factor 1 receptor (csf1r) |
| WO2014044873A1 (en) | 2012-09-24 | 2014-03-27 | Allozyne, Inc | Amino acid derivatives |
| WO2014063012A1 (en) | 2012-10-19 | 2014-04-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Conjugated knottin mini-proteins containing non-natural amino acids |
| EP2970487B1 (en) | 2013-03-12 | 2020-03-11 | Molecular Templates, Inc. | Cytotoxic proteins comprising cell-targeting binding regions and shiga toxin a subunit regions for selective killing of specific cell types |
| US20140274759A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Bicycle Therapeutics Limited | Modification of polypeptides |
| WO2014142237A1 (ja) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | 日本ゼオン株式会社 | 中空重合体粒子の水性分散液およびその製造方法 |
| EP2976362B1 (en) | 2013-03-19 | 2019-10-23 | Beijing Shenogen Pharma Group Ltd. | Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases |
| GB201306623D0 (en) * | 2013-04-11 | 2013-05-29 | Bicycle Therapeutics Ltd | Modulation of structured polypeptide specificity |
| ES2705068T3 (es) | 2013-05-23 | 2019-03-21 | Ohio State Innovation Foundation | Síntesis química y cribado de bibliotecas de péptidos bicíclicos |
| RU2715232C2 (ru) | 2013-09-25 | 2020-02-26 | Сайтомкс Терапьютикс, Инк. | Субстраты матриксной металлопротеиназы и другие расщипляемые фрагменты и способы их использования |
| EP3062823B1 (en) | 2013-10-28 | 2018-12-12 | BicycleRD Limited | Novel polypeptides |
| SI3102576T1 (sl) | 2014-02-03 | 2019-08-30 | Vitae Pharmaceuticals, Llc | Inhibitorji dihidropirolopiridina ROR-gama |
| JP6875129B2 (ja) | 2014-05-08 | 2021-05-19 | ノボダイアックス， インコーポレイテッド | 直接的な免疫組織化学アッセイ |
| RS59119B1 (sr) | 2014-05-21 | 2019-09-30 | Entrada Therapeutics Inc | Peptidi koji prodiru u ćelije i postupci za njihovo pravljenje i upotrebu |
| GB201416960D0 (en) | 2014-09-25 | 2014-11-12 | Antikor Biopharma Ltd | Biological materials and uses thereof |
| JP6917887B2 (ja) | 2014-09-30 | 2021-08-11 | ポリフォー・アクチェンゲゼルシャフトＰｏｌｙｐｈｏｒ Ａｇ | ベータ−ヘアピンペプチド模倣体 |
| CA2963556C (en) | 2014-10-24 | 2023-03-14 | Research Corporation Technologies, Inc. | Small antibody-like polypeptides that bind to epha2 receptor |
| RS61853B1 (sr) | 2014-10-29 | 2021-06-30 | Bicyclerd Ltd | Biciklični peptidni ligandi specifični za mt1-mmp |
| JP2017537893A (ja) | 2014-10-31 | 2017-12-21 | アッヴィ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド | 抗ｃｓ１抗体および抗体薬結合体 |
| ES2986970T3 (es) | 2014-12-04 | 2024-11-13 | Celgene Corp | Conjugados de biomoléculas |
| IL237525A (en) | 2015-03-03 | 2017-05-29 | Shalom Eli | Method for labeling a prostate-specific membrane antigen with a radioactive isotope |
| US10864101B2 (en) | 2015-04-22 | 2020-12-15 | Mitsui Chemicals, Inc. | Garment provided with joint supporter section, and knee supporter |
| WO2016171242A1 (ja) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | 第一三共株式会社 | Ｅｐｈａ２の検出 |
| JP2018521960A (ja) | 2015-04-28 | 2018-08-09 | エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ（ウペエフエル）Ｅｃｏｌｅ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｆｅｄｅｒａｌｅ ｄｅ Ｌａｕｓａｎｎｅ （ＥＰＦＬ） | 酵素で活性化された第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）の新規阻害剤 |
| WO2016179534A2 (en) | 2015-05-06 | 2016-11-10 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate specific membrane antigen binding fibronectin type iii domains |
| EP3115066A1 (en) | 2015-07-07 | 2017-01-11 | Technische Universität München | Novel psma-specific binding proteins |
| US9963495B2 (en) | 2015-10-27 | 2018-05-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Polypeptides targeting vascular endothelial growth factor receptor and prostate specific membrane antigen |
| EP3181146A1 (en) | 2015-12-16 | 2017-06-21 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Cyclic ntcp-targeting peptides and their uses as entry inhibitors |
| GB201600911D0 (en) | 2016-01-18 | 2016-03-02 | Bicycle Therapeutics Ltd | Stabilized peptide derivatives |
| US10765625B2 (en) | 2016-03-15 | 2020-09-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Knottin-drug conjugates and methods of using the same |
| KR20180121905A (ko) | 2016-03-16 | 2018-11-09 | 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. | 에프린 수용체 a2(epha2)의 나노리포솜 표적화 및 관련된 진단 |
| KR102775461B1 (ko) | 2016-04-01 | 2025-02-28 | 어비디티 바이오사이언시스 인크. | 핵산-폴리펩타이드 조성물 및 이의 용도 |
| US10836796B2 (en) | 2016-04-20 | 2020-11-17 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. | Derivatives of amanita toxins and their conjugation to a cell binding molecule |
| RU2018139339A (ru) | 2016-04-22 | 2020-05-22 | Эллигейтор Биосайенс Аб | Новые биспецифические полипептиды против cd137 |
| GB201607827D0 (en) | 2016-05-04 | 2016-06-15 | Bicycle Therapeutics Ltd | Bicyclic peptide-toxin conjugates specific for MT1-MMP |
| SG11201810591VA (en) | 2016-05-27 | 2018-12-28 | Abbvie Biotherapeutics Inc | Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen |
| WO2018096365A1 (en) | 2016-11-27 | 2018-05-31 | Bicyclerd Limited | Methods for treating cancer |
| US11730819B2 (en) | 2016-12-23 | 2023-08-22 | Bicycletx Limited | Peptide derivatives having novel linkage structures |
| CN110506049B (zh) | 2016-12-23 | 2024-08-16 | 拜斯科技术开发有限公司 | 用于结合mt1-mmp的肽配体 |
| WO2018127699A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Bicyclerd Limited | Compounds for treating cancer |
| SG11201907753TA (en) | 2017-02-24 | 2019-09-27 | Macrogenics Inc | Bispecific binding molecules that are capable of binding cd137 and tumor antigens, and uses thereof |
| GB201706477D0 (en) | 2017-04-24 | 2017-06-07 | Bicycle Therapeutics Ltd | Modification of polypeptides |
| EP3615550A1 (en) | 2017-04-27 | 2020-03-04 | BicycleTx Limited | Bicyclic peptide ligands and uses thereof |
| WO2018222987A1 (en) | 2017-06-01 | 2018-12-06 | Tarveda Therapeutics, Inc. | Targeted constructs |
| EP3645549A1 (en) | 2017-06-26 | 2020-05-06 | BicycleRD Limited | Bicyclic peptide ligands with detectable moieties and uses thereof |
| JP7670481B2 (ja) | 2017-08-04 | 2025-04-30 | バイスクルテクス・リミテッド | Ｃｄ１３７に対して特異的な二環式ペプチドリガンド |
| US20200283482A1 (en) | 2017-08-14 | 2020-09-10 | Bicyclerd Limited | Bicyclic peptide ligand prr-a conjugates and uses thereof |
| US20200291096A1 (en) | 2017-08-14 | 2020-09-17 | Bicyclerd Limited | Bicyclic peptide ligand sting conjugates and uses thereof |
| WO2019084060A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Silverback Therapeutics, Inc. | CONJUGATES AND METHODS OF USE FOR THE SELECTIVE DELIVERY OF IMMUNOMODULATORY AGENTS |
| JP7426931B2 (ja) | 2017-11-07 | 2024-02-02 | レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド | 抗体薬物コンジュゲートのための親水性リンカー |
| TWI825046B (zh) | 2017-12-19 | 2023-12-11 | 英商拜西可泰克斯有限公司 | Epha2特用之雙環胜肽配位基 |
| GB201721265D0 (en) | 2017-12-19 | 2018-01-31 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for EphA2 |
| WO2019136442A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Kleo Pharmaceuticals, Inc. | Cd16a binding agents and uses thereof |
| KR20200128518A (ko) | 2018-02-23 | 2020-11-13 | 바이사이클티엑스 리미티드 | 다량체성 비사이클릭 펩타이드 리간드 |
| KR20200139236A (ko) | 2018-04-04 | 2020-12-11 | 바이사이클티엑스 리미티드 | 헤테로탠덤 비사이클릭 펩티드 복합체 |
| EP3797120A1 (en) | 2018-05-21 | 2021-03-31 | Compass Therapeutics LLC | Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells |
| GB201810316D0 (en) | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicyclerd Ltd | Peptide ligands for binding to EphA2 |
| GB201810320D0 (en) | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicycletx Ltd | Peptide ligands for binding to CD38 |
| GB201810327D0 (en) | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicycletx Ltd | Peptide ligands for binding to IL-17 |
| US11180531B2 (en) | 2018-06-22 | 2021-11-23 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for Nectin-4 |
| GB201810325D0 (en) | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicycletx Ltd | Peptide ligands for binding to PSMA |
| GB201810329D0 (en) | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicycletx Ltd | Peptide ligands for binding to integrin avB3 |
| CN112955459A (zh) | 2018-10-23 | 2021-06-11 | 拜斯科技术开发有限公司 | 双环肽配体和其用途 |
| SG11202104356VA (en) | 2018-10-30 | 2021-05-28 | Bicyclerd Ltd | Bt1718 for use in treating cancer |
| GB201820325D0 (en) | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for psma |
| GB201820288D0 (en) | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicycle Tx Ltd | Bicycle peptide ligaands specific for MT1-MMP |
| GB201820295D0 (en) | 2018-12-13 | 2019-01-30 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for MT1-MMP |
| US20220024982A1 (en) | 2018-12-13 | 2022-01-27 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp |
| CA3120800A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | Revitope Limited | Twin immune cell engager |
| CN113474045A (zh) | 2018-12-21 | 2021-10-01 | 拜斯科技术开发有限公司 | Pd-l1特异性的双环肽配体 |
| WO2020128527A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Bicyclerd Limited | Bicyclic peptide ligands specific for pd-l1 |
| US10882987B2 (en) | 2019-01-09 | 2021-01-05 | Nova Chemicals (International) S.A. | Ethylene interpolymer products having intermediate branching |
| GB201900529D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for CD38 |
| GB201900526D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for caix |
| GB201900527D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for integrin avb3 |
| GB201900530D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for CD38 |
| GB201900528D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicyclerd Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for integrin AVB3 |
| GB201900525D0 (en) | 2019-01-15 | 2019-03-06 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligands specific for caix |
| WO2020165600A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-08-20 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligand sting conjugates and uses thereof |
| US20220135614A1 (en) | 2019-03-04 | 2022-05-05 | Bicyclerd Limited | Synthesis of bicycle toxin conjugates, and intermediates thereof |
| AU2020253990A1 (en) | 2019-04-02 | 2021-10-28 | Bicycletx Limited | Bicycle toxin conjugates and uses thereof |
| WO2020225577A1 (en) | 2019-05-09 | 2020-11-12 | Bicycletx Limited | Bicyclic peptide ligands specific for ox40 |
| TWI869398B (zh) | 2019-05-10 | 2025-01-11 | 英商拜西克爾德有限公司 | 治療癌症之方法 |
| TWI862640B (zh) | 2019-07-30 | 2024-11-21 | 英商拜西可泰克斯有限公司 | 異質雙環肽複合物 |
| WO2021028686A1 (en) | 2019-08-13 | 2021-02-18 | Bicycletx Limited | Modified multimeric bicyclic peptide ligands |
| GB201912320D0 (en) | 2019-08-28 | 2019-10-09 | Bicycletx Ltd | PBP Binding Bicyclic Peptide Ligands |
| PT4464721T (pt) | 2019-10-03 | 2025-06-24 | Bicycletx Ltd | Complexos peptídicos bicíclicos heterotandem |
| GB201914872D0 (en) | 2019-10-15 | 2019-11-27 | Bicycletx Ltd | Bicyclic peptide ligand drug conjugates |
| US20220387611A1 (en) | 2019-10-16 | 2022-12-08 | Bicyclerd Limited | Methods for treating cancer |
| CA3158741A1 (en) | 2019-11-27 | 2021-06-03 | Gavin Bennett | Bicyclic peptide ligands specific for epha2 and uses thereof |
| IT202000001231A1 (it) | 2020-01-22 | 2021-07-22 | Celery S R L | Nuovi ceppi di batteri lattici, composizione alimentare che li comprende, preparazione di tale composizione |
| GB202002705D0 (en) | 2020-02-26 | 2020-04-08 | Bicycletx Ltd | Anti-infective bicyclic peptide conjugates |
| GB202002706D0 (en) | 2020-02-26 | 2020-04-08 | Bicycletx Ltd | Pbp3 binding bicyclic peptide ligands |
| KR20230037502A (ko) | 2020-05-20 | 2023-03-16 | 바이사이클티엑스 리미티드 | 넥틴-4에 특이적인 바이사이클릭 펩티드 리간드 및 이의 용도 |
| IL298868A (en) | 2020-06-12 | 2023-02-01 | Bicycletx Ltd | Treatment of diseases characterized by overexpression of hepatocyte receptor A2 that produces erythropoietin (EPHA2) |
| KR20230074119A (ko) | 2020-08-03 | 2023-05-26 | 바이사이클티엑스 리미티드 | 펩타이드 기반 링커 |
| EP4196792A1 (en) | 2020-08-17 | 2023-06-21 | BicycleTX Limited | Bicycle conjugates specific for nectin-4 and uses thereof |
| CA3206529A1 (en) | 2021-01-08 | 2022-07-14 | Bicycletx Limited | Heterotandem bicyclic peptide complexes |
| CN117157305A (zh) | 2021-01-08 | 2023-12-01 | 拜斯科技术开发有限公司 | 抗感染的双环肽配体 |
| ES2992468T3 (es) | 2021-01-08 | 2024-12-12 | Bicycletx Ltd | Ligandos peptídicos bicíclicos específicos para linfocitos NK |
| US20250186539A2 (en) | 2021-01-11 | 2025-06-12 | Bicycletx Limited | Methods for treating cancer |
| AU2022340959A1 (en) | 2021-09-03 | 2024-03-07 | Bicycletx Limited | Synthesis of bicycle toxin conjugates, and intermediates thereof |
| KR20240100420A (ko) | 2021-11-16 | 2024-07-01 | 바이사이클티엑스 리미티드 | 암을 치료하기 위한 방법 |
-
2015
- 2015-10-29 RS RS20210611A patent/RS61853B1/sr unknown
- 2015-10-29 BR BR112017008575-5A patent/BR112017008575B1/pt active IP Right Grant
- 2015-10-29 SG SG11201702845QA patent/SG11201702845QA/en unknown
- 2015-10-29 SI SI201531609T patent/SI3215518T1/sl unknown
- 2015-10-29 DK DK15790220.6T patent/DK3215518T3/da active
- 2015-10-29 EP EP15790220.6A patent/EP3215518B1/en active Active
- 2015-10-29 US US15/523,266 patent/US10532106B2/en active Active
- 2015-10-29 LT LTEP15790220.6T patent/LT3215518T/lt unknown
- 2015-10-29 HU HUE15790220A patent/HUE054526T2/hu unknown
- 2015-10-29 ES ES15790220T patent/ES2870449T3/es active Active
- 2015-10-29 NZ NZ731185A patent/NZ731185A/en unknown
- 2015-10-29 CN CN201580058618.6A patent/CN107148425B/zh active Active
- 2015-10-29 JP JP2017522660A patent/JP6882978B2/ja active Active
- 2015-10-29 CA CA3220466A patent/CA3220466A1/en active Pending
- 2015-10-29 CA CA2965754A patent/CA2965754C/en active Active
- 2015-10-29 EP EP21157735.8A patent/EP3882258A1/en active Pending
- 2015-10-29 SM SM20210301T patent/SMT202100301T1/it unknown
- 2015-10-29 RU RU2017118326A patent/RU2708459C2/ru active
- 2015-10-29 HR HRP20210809TT patent/HRP20210809T8/hr unknown
- 2015-10-29 KR KR1020177011671A patent/KR102746415B1/ko active Active
- 2015-10-29 PL PL15790220T patent/PL3215518T3/pl unknown
- 2015-10-29 AU AU2015340300A patent/AU2015340300B2/en active Active
- 2015-10-29 PT PT157902206T patent/PT3215518T/pt unknown
- 2015-10-29 KR KR1020237030419A patent/KR102754019B1/ko active Active
- 2015-10-29 WO PCT/GB2015/053247 patent/WO2016067035A1/en not_active Ceased
- 2015-10-29 KR KR1020257000673A patent/KR20250009586A/ko active Pending
-
2019
- 2019-12-06 US US16/705,446 patent/US11103591B2/en active Active
-
2020
- 2020-04-02 US US16/838,367 patent/US10792368B1/en active Active
-
2021
- 2021-05-07 JP JP2021079208A patent/JP7116217B2/ja active Active
- 2021-05-19 CY CY20211100433T patent/CY1124157T1/el unknown
- 2021-07-22 US US17/443,222 patent/US11672868B2/en active Active
-
2023
- 2023-05-11 US US18/315,869 patent/US12318454B2/en active Active
-
2025
- 2025-05-02 US US19/197,288 patent/US20250255975A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7116217B2 (ja) | Ｍｔ１－ｍｍｐに特異的な二環性ペプチドリガンド | |
| CN111183147B (zh) | Cd137特异性的双环肽配体 | |
| JP2025020121A (ja) | Ｐｄ－ｌ１に特異的な二環式ペプチドリガンド | |
| KR102755988B1 (ko) | Ｍｔ１－ｍｍｐ에 대한 결합용 펩티드 리간드 | |
| EP3452096B1 (en) | Bicyclic peptide-toxin conjugates specific for mt1-mmp | |
| JP2025011099A (ja) | Ｐｓｍａに特異的な二環式ペプチドリガンド | |
| CN113260420A (zh) | Pd-l1特异性的双环肽配体 | |
| RU2824959C2 (ru) | Бициклические пептидные лиганды, специфичные для mt1-mmp | |
| HK40058108A (en) | Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp | |
| HK1243438B (en) | Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp |