ES2926195T3 - Ligandos peptídicos bicíclicos específicos de CD137 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos que se unen covalentemente a armazones moleculares de manera que dos o más bucles peptídicos se subtienden entre los puntos de unión al armazón. En particular, la invención describe péptidos que son ligantes de alta afinidad de CD137. La invención también incluye conjugados de fármacos que comprenden dichos péptidos, conjugados con uno o más grupos efectores y/o funcionales, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos ligandos peptídicos y conjugados de fármacos y al uso de dichos ligandos peptídicos y conjugados de fármacos para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad o trastorno mediado por CD137. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ligandos peptídicos bicíclicos específicos de CD137

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a polipéptidos que se unen covalentemente a armazones moleculares tal que dos o más bucles peptídicos están subtendidos entre puntos de fijación al armazón. En particular, la invención describe péptidos que son moléculas de unión de alta afinidad a CD137. La invención también incluye conjugados de fármacos que comprenden dichos péptidos, conjugados de uno o más efectores y/o grupos funcionales, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos ligandos peptídicos y conjugados de fármacos y al uso de dichos ligandos peptídicos y conjugados de fármacos para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad o trastorno mediado por CD137.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los péptidos cíclicos son capaces de enlazarse con elevada afinidad y especificidad de diana a las dianas proteicas y, por ello, son una clase de molécula atractiva para el desarrollo de productos terapéuticos. De hecho, varios péptidos cíclicos ya se han usado con éxito en clínica, como por ejemplo el péptido antibacteriano vancomicina, el fármaco inmunosupresor ciclosporina o el fármaco contra el cáncer octreotida (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). Las buenas propiedades de unión son el resultado de una superficie de interacción relativamente grande formada entre el péptido y la diana, así como la flexibilidad conformacional reducida de las estructuras cíclicas. Típicamente, los macrociclos se enlazan a superficies de varios cientos de angstrom cuadrados, como por ejemplo el péptido cíclico CVX15 antagonista de CXCR4 (400 A2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), un péptido cíclico con el motivo Arg-Gly-Asp que se une a la integrina aVb3 (355 A2) (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5) o el inhibidor peptídico cíclico upaína-1 que se une al activador del plasminógeno de tipo urocinasa (603 A2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).

Debido a su configuración cíclica, los macrociclos peptídicos son menos flexibles que los péptidos lineales, lo que conduce a una menor pérdida de entropía al unirse a las dianas y da como resultado una mayor afinidad de enlace. La flexibilidad reducida también conduce a conformaciones específicas de la diana bloqueadas, aumentando la especificidad de enlace en comparación con los péptidos lineales. Este efecto ha sido ejemplificado por un inhibidor potente y selectivo de la metaloproteinasa de matriz 8, (MMP-8), que perdía su selectividad frente a otras MMP cuando se abría su anillo (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749­ 51). Las propiedades de enlace favorables logradas a través de la macrociclación son incluso más pronunciadas en péptidos multicíclicos que tienen más de un anillo peptídico como, por ejemplo, en vancomicina, nisina y actinomicina.

Diferentes equipos de investigación han fijado previamente polipéptidos con residuos de cisteína a una estructura molecular sintética (Kemp y McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen y colaboradores habían usado tris (bromometil)benceno y moléculas relacionadas para la ciclación rápida y cuantitativa de múltiples bucles peptídicos en armazones sintéticos para la mímesis estructural de superficies de proteínas (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Se describen procedimientos para la generación de compuestos farmacológicos candidatos en donde dichos compuestos se generan ligando polipéptidos que contienen cisteína a un armazón molecular como por ejemplo tris (bromometil)benceno en los documentos WO 2004/077062 y WO 2006/078161.

Se han desarrollado enfoques combinatorios basados en la presentación en fagos para generar y cribar en grandes colecciones de péptidos bicíclicos dianas de interés (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 y el documento WO2009/098450). Brevemente, se presentaron en fagos colecciones combinatorias de péptidos lineales que contenían tres residuos de cisteína y dos regiones de seis aminoácidos aleatorios (Cys-(Xaa)6-Cys- (Xaa)6-Cys) y se ciclaron ligando covalentemente las cadenas laterales de cisteína con una molécula pequeña (tris (bromometil)benceno).Chen et al (2014) Angewandte Chemie International Edition 53 (6), 1602-1606 describen ligandos peptídicos estabilizados por moléculas pequeñas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un ligando peptídico específico para la CD137 que comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un armazón molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido de modo que al menos dos bucles polipeptídicos se forman en el armazón molecular, caracterizado por que el ligando peptídico comprende una secuencia peptídica seleccionada de:

CilEPGPFCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 19);

Ci-I-E-E-G-Q-Y-Cii-X1-X2-D-Xa-Y/Q/M-X4-Ciii (SEQ ID NO: 20);

Ci-I-G-P-P-Y-Cii-Y-R/A-D-M/P-Y-M-Ciii (SEQ ID NO: 21);

Ci-D-E-W-G-L-F/Y-Cii-I/F-P/A-H-S/P-D-Ciii (SEQ ID NO: 22);

CiIEEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 23);

CiIKEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 24);

CiIEKGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 25);

CiIEE(D-K)QYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 26);

CiIEEGKYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 27);

CiIEEGQYCiiKADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 28);

CiIEEGQYCiiFADKY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 29);

CiIEEGQYCiiFADPYKCiii (SEQ ID NO: 30);

Ci-I/L/M/V-E/D/P/S-P/E/A-G-P/Q-Y/F-Cii-Y-A-D-P-Y/M-M/UY-CiN (SEQ ID NO: 41); y

Ci-X5-X6,-X7-Xa-X9-X10-Cii-X11-X12-D-X13-X14-X15-CiN (SEQ ID NO: 266);

en donde Ci, Cii y Cm representan los primero, el segundo y el tercer residuos de cisteína, respectivamente;

X¹-X⁴ representa cualquier residuo de aminoácido;

X⁵ representa Ile, tBuAla o Chg;

X6 representa Glu, Pro, Asp, Lys, Aad, HyP u Oxa;

X⁷ representa Glu, Lys o Aad;

X8 representa Gly, D-Lys, D-Ala, L-Ala, D-Phe, D-Glu, D-Gln, D-Leu, D-Ser o D-Trp;

X⁹ representa Gln, Lys, Ala, Pro, 5,5-dmP, Oic, Oxa, HyP, Aib o Ac5c;

X¹⁰ representa Tyr, Phe, 3MePhe, 4MePhe, 4FPhe, 2Nal, 4MeOPhe o 4,4-BPA;

X¹¹ representa Phe, Lys, 4MePhe, 2FPhe, 4FPhe, 4Pal, 4,4-BPA, 4tBuPhe, NO2Phe o 4BrPhe; X¹² representa Ala o Lys;

X13 representa Pro o Lys;

X¹⁴ representa Tyr o Lys; y

X¹⁵ representa Met, Lys, Nle, HLeu o Ahp, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un fármaco conjugado que comprende un ligando peptídico como se define en el presente documento conjugado con uno o más grupos efectores y/o funcionales.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un ligando peptídico o un conjugado de fármaco como se define en el presente documento en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un ligando peptídico o conjugado de fármaco como se define en el presente documento para uso en la prevención, supresión o tratamiento mediado por CD137.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1:Resultados del ensayo de actividad celular de CD137 utilizando el péptido bicíclico BCY592.

Figura 2:Competencia de CD137L o el anticuerpo monoclonal Utomilumab con un péptido BCY640 marcado con fluorescencia para unirse a CD137 según lo medido por polarización de fluorescencia.

Figura 3: Competencia de los anticuerpos monoclonales Utomilumab o Urelumab con un péptido BCY640 marcado con fluorescencia para unirse a CD137 según lo medido por polarización de fluorescencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En una realización, dichas secuencias de bucle comprenden 5 o 6 aminoácidos.

En otra realización, dicho ligando peptídico comprende tres residuos de cisteína separados por dos secuencias de bucle, ambas de los cuales consisten en 6 aminoácidos.

En otra realización, dicho ligando peptídico comprende tres residuos de cisteína separados por dos secuencias de bucle, una de las cuales consiste en 5 aminoácidos y la otra de las cuales consiste en 6 aminoácidos.

Se llevó a cabo un experimento de escaneo de alanina en péptidos seleccionados de la invención. Se utiliza un escaneo de alanina para predecir qué posiciones de aminoácidos son más susceptibles a sustituciones y una mayor optimización de la afinidad y/o otras propiedades deseables. Los péptidos de escaneo de alanina se caracterizaron en tres categorías en función de la afinidad relativa a la secuencia peptídica original (BCY7151; SEQ ID NO: 92): 1. sin pérdida de afinidad 2. afinidad de 2-10 veces más débil y 3. > afinidad 10 veces más débil. Los péptidos de la categoría 1 y la categoría 2 pueden someterse a extensas pruebas de SAR con sustituciones alternativas de aminoácidos. Los péptidos de la categoría 3 se mantuvieron fijos o solo se sustituyeron con aminoácidos muy similares. Los resultados de la exploración de alanina se muestran en la Tabla 2, en donde se puede ver que el residuo de aminoácido del ácido aspártico (D) en la posición 9 es el más importante para la unión porque la sustitución de este residuo de aminoácido con un residuo de alanina eliminó la actividad de unión.

Se llevó a cabo un experimento de escaneo de alanina en péptidos seleccionados de la invención. La preparación predeterminada de todos los péptidos bicíclicos está en la configuración L, por lo tanto, la exploración de D-alanina muestra qué posiciones de aminoácidos son susceptibles de sustituciones de D-aminoácidos. Los resultados de la exploración con D-alanina se muestran en la Tabla 2, en donde se puede observar que la sustitución de la posición 4 Glicina (G) por D-Ala mejoró la afinidad en relación con el péptido de referencia. Esto implica que el péptido D-Ala4 (BCY7297; s Eq ID NO: 106) es importante, ya que proporciona una afinidad mejorada, así como otras ventajas asociadas con los aminoácidos del isómero D no natural.

En una realización, dicho ligando peptídico comprende tres residuos de cisteína separados por dos secuencias de bucle, ambas compuestas por 6 aminoácidos, y dicho ligando peptídico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

Ci-I-E-E-G-Q-Y-Cii-X1-X2-D-Xa-Y/Q/M-X4-Ciii (SEQ ID NO: 20);

Ci-D-I-G-P-P-Y-Cii-Y-R/A-D-M/P-Y-M-Ciii (SEQ ID NO: 21); y

CiIEPGPFCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 19);

en donde X ¹-X⁴ representan cualquier residuo de aminoácido y Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.

En una realización, X¹ se selecciona de Y, F y H.

En una realización, X² se selecciona de R, A y S.

En una realización, X³ se selecciona de M, P y H.

En una realización, X⁴ se selecciona de M, Y, L y F.

En una realización, dicho ligando peptídico comprende tres residuos de cisteína separados por dos secuencias de bucle, la primera de las cuales consiste en 6 aminoácidos y la segunda de las cuales consiste en 5 aminoácidos, y dicho ligando peptídico comprende una secuencia de aminoácidos que es: C¡-D-E-W-G-L-F/Y-Cii-I/F-P/A-H-S/P-D-Ciii (SEQ ID NO: 22); en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, el ligando peptídico de C¡-I-E-E-G-Q-Y-Cii-X1-X2-D-X3-Y/Q/M-X4-Ciii (SEQ ID NO: 20) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de SEQ ID NOS: 1-14:

CiIEEGQYCiiYRDMYMCiii (SEQ ID NO: 1);

CiIEEGQYCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 2);

CiIEEGQYCiiYADPYYCiii (SEQ ID NO: 3);

CiIEEGQYCiiYSDPYYCiii (SEQ ID NO: 4);

CiIEEGQYCiiFADPYMCiii (SEQ ID NO: 5);

CiIEEGQYCiiYADHQLCiii (SEQ ID NO: 6);

CiIEEGQYCiiHADPYYCiii (SEQ ID NO: 7);

CiIEEGQYCiiHADPYFCiii (SEQ ID NO: 8);

CiIEEGQYCiiYADHYMCiii (SEQ ID NO: 9);

CiIEEGQYCiiYADPYLCiii (SEQ ID NO: 10);

CiIEEGQYCiiYSDPYLCiii (SEQ ID NO: 11);

CiIEEGQYCiiFADPYLCiii (SEQ ID NO: 12);

CiIEEGQYCiiHADPYMCiii (SEQ ID NO: 13); y

CiIEEGQYCiiHADPQMCiii (SEQ ID NO: 14);

en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercer residuos de cisteína, respectivamente;

En otra realización, el ligando peptídico de C¡-I-E-E-G-Q-Y-Cii-X1-X2-D-X3-Y/Q/M-X4-Ciii (SEQ ID NO: 20) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

A- (SEQ ID NO: 1)-A (referido en el presente documento como 74-01-00-N004);

A- (SEQ ID NO: 2)-A (referido en el presente documento como 74-01-01-N001);

A- (SEQ ID NO: 3)-A (referido en el presente documento como 74-01-02-N001);

A- (SEQ ID NO: 4)-A (referido en el presente documento como 74-01-03-N001);

A- (SEQ ID NO: 5)-A (referido en el presente documento como 74-01-04-N001);

A-(SEQ ID NO: 6)-A (referido en el presente documento como 74-01-05-N001);

A-(SEQ ID NO: 7)-A (referido en el presente documento como 74-01-06-N001);

A-(SEQ ID NO: 8)-A (referido en el presente documento como 74-01-07-N001);

A-(SEQ ID NO: 9)-A (referido en el presente documento como 74-01-08-N001);

A-(SEQ ID NO: 10)-A (referido en el presente documento como 74-01-09-N001);

A-(SEQ ID NO: 10)-SVG (referido en el presente documento como 74-01-09-T03-N002);

A-(SEQ ID NO: 11)-A (referido en el presente documento como 74-01-10-N001);

A-(SEQ ID NO: 12)-A (referido en el presente documento como 74-01-11-N001);

A-(SEQ ID NO: 13)-A (referido en el presente documento como 74-01-13-N001); y

A-(SEQ ID NO: 14)-A (referido en el presente documento como 74-01-14-N001);

En otra realización adicional, el ligando peptídico de Ci-D-I-G-P-P-Y-Cii-Y-R/A-D-M/P-Y-M-Ciii (SEQ ID NO: 21) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

CiDIGPPYCiYRDMYMCiii (SEQ ID NO: 15); y

CiDIGPPYCiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 16);

en donde Ci, Cu y Ciii representan los primero, segundo y tercer residuos de cisteína, respectivamente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra realización, el ligando peptídico de Ci-D-I-G-P-P-Y-Cii-Y-R/A-D-M/P-Y-M-Ciii (SEQ ID NO: 21) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

A-(SEQ ID NO: 15)-A (referido en el presente documento como 74-01-16-N001); y

A- (SEQ ID NO: 16)-A (referido en el presente documento como 74-01-17-N001).

En una realización adicional, el ligando peptídico de C¡-D-E-W-G-L-F/Y-Cii-I/F-P/A-H-S/P-D-Ciii (SEQ ID NO: 22) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

CiDEWGLFCiiIPHSDCiii (SEQ ID NO: 17); y

CiDEWGLYCiiFAHPDCiii (SEQ ID NO: 18);

en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercer residuos de cisteína, respectivamente;

En otra realización, el ligando peptídico de C¡-D-E-W-G-L-F/Y-Cii-I/F-P/A-H-S/P-D-Ciii (SEQ ID NO: 22) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

Ac-A-(SEQ ID NO: 17)-A (referido en el presente documento como 74-02-00-N004); y

A-(SEQ ID NO: 18)-A (referido en el presente documento como 74-02-01-N001).

En una realización, el ligando peptídico de C¡IEPGPFCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 19) comprende una secuencia de aminoácidos de: A- (SEQ ID NO: 19)-NRV (en el presente documento denominado 74-19-00-T01-N002).

En una realización, el armazón molecular se selecciona de 1,1',1"-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) y el ligando peptídico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

A-(SEQ ID NO: 1)-A (referido en el presente documento como 74-01-00-N004);

A-(SEQ ID NO: 2)-A (referido en el presente documento como 74-01-01-N001);

(referido en el presente documento como 74-01-02-N001); (referido en el presente documento como 74-01-03-N001); (referido en el presente documento como 74-01-04-N001); (referido en el presente documento como 74-01-05-N001); (referido en el presente documento como 74-01-06-N001); (referido en el presente documento como 74-01-07-N001);

(referido en el presente documento como 74-01-08-N001);

A-(SEQ ID NO: 10)-A (referido en el presente documento como 74-01-09-N001);

A-(SEQ ID NO: 10)-SVG (referido en el presente documento como 74-01-09-T03-N002);

A-(SEQ ID NO: 11)-A (referido en el presente documento como 74-01-10-N001);

A-(SEQ ID NO: 12)-A (referido en el presente documento como 74-01-11-N001);

A-(SEQ ID NO: 13)-A (referido en el presente documento como 74-01-13-N001);

A-(SEQ ID NO: 14)-A (referido en el presente documento como 74-01-14-N001);

A-(SEQ ID NO: 15)-A (referido en el presente documento como 74-01-16-N001);

A-(SEQ ID NO: 16)-A (referido en el presente documento como 74-01-17-N001).

Ac-A-(SEQ ID NO: 17)-A (referido en el presente documento como 74-02-00-N004); y

A-(SEQ ID NO: 18)-A (referido en el presente documento como 74-02-01-N001).

Los ligandos armazón/peptídico de esta realización demostraron una unión competitiva superior a CD137 como se muestra en la Tabla 1.

En aún otra realización adicional, dicho ligando peptídico se selecciona de:

CiIEEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 23);

CiIKEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 24);

CiIEKGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 25);

CiIEE(D-K)QYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 26);

CiIEEGKYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 27);

CiIEEGQYCiiKADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 28);

CiIEEGQYCiiFADKY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 29); y

CiIEEGQYCiiFADPYKCiii (SEQ ID NO: 30);

en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercer residuos de cisteína, respectivamente, y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo

En otra realización adicional, dicho ligando peptídico comprende modificaciones N y C terminales y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

A-CiIEEGQYCiiFADPY (Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 31; BCY3814);

Ac-A-CiIEEGQYCiiFADPY (Nle)Ciii-Dap (SEQ ID NO: 32; BCY7732);

Ac-A-CiIKEGQYCiiFADPY (Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 33; BCY7733);

Ac-A-CiIEKGQYCiiFADPY (Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 34; BCY7734);

Ac-A-CiIEE (D-K)QYCiiFADPY (Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 35; BCY7735);

Ac-A-CiIEEGKYCiiFADPY (Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 36; BCY7736);

Ac-A-CiIEEGQYCiiKADPY (Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 37; BCY7737);

Ac-A-CiIEEGQYCiiFADKY (Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 38; BCY7738); y

Ac-A-CiIEEGQYCiiFADPYKCiii-A (SEQ ID NO: 39; BCY7739);

en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente, Ac representa un grupo acetilo N-terminal y Dap representa ácido diaminopropiónico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización alternativa, dicho ligando peptídico comprende una secuencia de aminoácidos que es: CiLPPGQYCiiFPDLLLCiii (SEQ ID NO: 40; 74-22-00) en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercer residuo de cisteína, respectivamente.

En una realización alternativa, dicho ligando peptídico comprende tres residuos de cisteína separados por dos secuencias de bucle, ambas compuestas por 6 aminoácidos, y dicho ligando peptídico comprende una secuencia de aminoácidos que es: C¡-I/L/M/V-E/D/P/S-P/E/A-G-P/Q-Y/F-Cii-Y-A-D-P-Y/M-M/L/Y-Ciii (SEQ ID NO: 41); en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente.

En otra realización, dicha secuencia de aminoácidos se selecciona de las secuencias peptídicas enumeradas en la Tabla 1. En una realización adicional, dicha secuencia de aminoácidos se selecciona de las secuencias peptídicas enumeradas en la Tabla 1, excluyendo los péptidos de BCY7238, BCY7241, BCY7243 y BCY7246. Los péptidos de esta realización se probaron en el ensayo de unión directa de CD137 y demostraron buenos niveles de unión.

En otra realización, dicha secuencia de aminoácidos se selecciona de las secuencias peptídicas enumeradas en la Tabla 3. Los péptidos de esta realización se probaron en el ensayo de unión directa de CD137 y demostraron buenos niveles de unión.

En otra realización, dicha secuencia de aminoácidos se selecciona de las secuencias peptídicas enumeradas en las Tablas 4 y 5. Los péptidos de esta realización se probaron en el ensayo de unión directa de CD137 SPR y demostraron buenos niveles de unión.

En otra realización, dicha secuencia de aminoácidos se selecciona de BCY592. Los datos se presentan aquí en la Figura 1 que muestra que el péptido bicíclico BCY592 inhibió la actividad de CD137L en un ensayo basado en células.

En una realización alternativa, dicho ligando peptídico comprende tres residuos de cisteína separados por dos secuencias de bucle, ambas compuestas por 6 aminoácidos, y dicho ligando peptídico comprende una secuencia de aminoácidos que es: CÍ-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-CM-X¹¹-X¹²-D-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-CNÍ (SEQ ID NO: 266); en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente.

X⁵ representa Ile, tBuAla o Chg;

X6 representa Glu, Pro, Asp, Lys, Aad, HyP u Oxa;

X⁷ representa Glu, Lys o Aad;

X8 representa Gly, D-Lys, D-Ala, L-Ala, D-Phe, D-Glu, D-Gln, D-Leu, D-Ser o D-Trp;

X⁹ representa Gln, Lys, Ala, Pro, 5,5-dmP, Oic, Oxa, HyP, Aib o Ac5c;

X¹⁰ representa Tyr, Phe, 3MePhe, 4MePhe, 4FPhe, 2Nal, 4MeOPhe o 4,4-BPA;

X¹¹ representa Phe, Lys, 4MePhe, 2FPhe, 4FPhe, 4Pal, 4,4-BPA, 4tBuPhe, NO2Phe o 4BrPhe;

X¹² representa Ala o Lys;

X¹³ representa Pro o Lys;

X¹⁴ representa Tyr o Lys; y

X¹⁵ representa Met, Lys, Nle, HLeu o Ahp.

En una realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 266 se selecciona de las secuencias C¡ a Ciii de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de cualquier adición N-terminal y C-terminal): BCY7239, BCY7240, BCY7242, BCY7244, BCY7245, BCY7247, BCY7248, BCY7249, BCY7416, BCY7287, BCY7297, BCY7154,

170, 211, 798, 959,

675,

En una realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 266 se selecciona de las secuencias completas de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de cualquier adición N-terminal y C-terminal): BCY7239, BCY7240, BCY7242, BCY7244, BCY7245, BCY7247, BCY7248, BCY7249, BCY7416, BCY7287, BCY7297, BCY7154,

170, 211, 798, 959,

675,

Todos estos péptidos demostraron buenos niveles de unión en los ensayos de unión directa o SPR descritos en el presente documento o representaron péptidos que son tolerantes a la sustitución con un residuo de Lys.

En una realización, X⁵ representa Ile o tBuAla .

En una realización, X6 representa Lys, Glu o Pro.

En una realización, X⁷ representa Glu o D-Lys.

En una realización, Xs representa Gly, D-Lys, D-Phe o D-Ala.

En una realización, X⁹ representa Gln, Lys o Pro.

En una realización, X¹⁰ representa Tyr o 4MePhe.

En una realización, X¹¹ representa Phe o 4FPhe.

En una realización, X¹² representa Ala.

En una realización, X¹³ representa Pro.

En una realización, X¹⁴ representa Tyr.

En una realización, X¹⁵ representa Met o Nle.

En otra realización, dicho ligando peptídico comprende tres residuos de cisteína separados por dos secuencias de bucle, ambas compuestas por 6 aminoácidos, y dicho ligando peptídico comprende una secuencia de aminoácidos que es: C ^í-X5-X6-X7-X^s-X9-X10-C^íí-X11-A-D-P-Y-X15-C^ín (S^e Q ID NO: 267); en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente.

X⁵ representa Ile o tBuAla;

X6 representa Lys, Glu o Pro;

X⁷ representa Glu o D-Lys;

X8 representa Gly, D-Lys, D-Phe o D-Ala;

X⁹ representa Gln, Lys o Pro;

X¹⁰ representa Tyr o 4MePhe;

X¹¹ representa Phe o 4FPhe; y

X¹⁵ representa Met o Nle.

En una realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias C¡ a C^ím de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de cualquier adición N-terminal y C-terminal): BCY7239, BCY7240, BCY7242, BCY7416, BCY7156, BCY7166, BCY7174, BCY7774, BCY9273, BCY3814, BCY7527 y BCY7965.

En otra realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias completas de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de cualquier adición N-terminal y C-terminal): BCY7239, BCY7240, BCY7242, BCY7416, BCY7156, BCY7166, BCY7174, BCY7774, BCY9273, BCY3814, BCY7527 y BCY7965.

Todos estos péptidos demostraron buenos niveles de unión en los ensayos de unión directa o SPR descritos en el presente documento o representaron péptidos que son tolerantes a la sustitución con un residuo de Lys.

En una realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias C¡ a Ciii de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de cualquier adición N-terminal y C-terminal): BCY7239, BCY7240, BCY7242 y BCY7416.

En otra realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias completas de los siguientes péptidos (es decir, incluyendo todas las adiciones N-terminal y C-terminal): BCY7239, BCY7240, BCY7242 y BCY7416.

Estos péptidos representaban péptidos que son tolerantes a la sustitución con un residuo de Lys.

En una realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias C¡ a Ciii de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de cualquier adición N-terminal y C-terminal): BCY9273, BCY3814, BCY7527 y BCY7965.

En otra realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias completas de los siguientes péptidos (es decir, incluyendo todas las adiciones N-terminal y C-terminal): BCY9273, BCY3814, BCY7527 and BCY7965.

Todos estos péptidos demostraron buenos niveles de unión en los ensayos de unión directa o SPR descritos en el presente documento.

En una realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias C¡ a Ciii de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de cualquier adición N-terminal y C-terminal): BCY7156, BCY7166, BCY7174 and BCY7774.

En otra realización, el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias completas de los siguientes péptidos (es decir, incluyendo todas las adiciones N-terminal y C-terminal): BCY7156, BCY7166, BCY7174 and BCY7774.

Todos estos péptidos demostraron buenos niveles de unión en los ensayos de unión directa o SPR descritos en el presente documento.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la materia, tales como en las técnicas de la química de péptidos, el cultivo de células y la presentación en fagos, la química de ácidos nucleicos y la bioquímica. Se usan las técnicas estándar para biología molecular, métodos genéticos y bioquímicos (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) ⁴ a ed., John Wiley & Sons, Inc..).

Nomenclatura

Numeración

Cuando se hace referencia a las posiciones de los residuos de aminoácidos dentro de los compuestos de fórmula (I), los residuos de cisteína (Ci, Cii y Ciii) se omiten de la numeración ya que son invariables, por lo tanto, la numeración de los residuos de aminoácidos dentro del compuesto de fórmula (I) se hace referencia como a contmuación:-Crh-E2-E3-G4-Q5-Y6-CirY7-R8-D9-M10-Y11-M12-Ciii-(SEQ ID NO: 1)

A los efectos de esta descripción, se supone que todos los péptidos bicíclicos están ciclados con TBMB (1,3,5-tris (bromometil)benceno) o 1,1',1"- (1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) que produce una estructura trisustituida. La ciclación con TATA ocurre en Ci, Cii, y Ciii.

Formato molecular

Las extensiones N- o C-terminales a la secuencia del núcleo bicíclico se añaden al lado izquierdo o derecho de la secuencia del núcleo, separadas por un guion. Por ejemplo, una cola N-terminal pAla-Sar10-Ala se indicaría como: pAla-Sar10-A-(S^e Q ID NO: X).

Ligandos peptídicos

Un ligando peptídico, como se hace referencia en el presente documento, hace referencia a un péptido unido covalentemente a un armazón molecular. Típicamente, tales péptidos comprenden dos o más grupos reactivos (es decir, residuos de cisteína) que son capaces de formar enlaces covalentes al armazón, y una secuencia subtendida entre dichos grupos reactivos a la que se hace referencia como la secuencia de bucle, ya que forma un bucle cuando el péptido está unido al armazón. En el presente caso, los péptidos comprenden al menos tres residuos de cisteína (a los que se hace referencia en el presente documento como Ci, Cii y Ciii), y forman al menos dos bucles en el armazón.

Ventajas de los ligandos peptídicos

Algunos péptidos bicíclicos de la presente invención tienen una serie de propiedades ventajosas que les permiten ser considerados como moléculas de tipo fármaco adecuadas para la administración por inyección, inhalación, nasal, ocular, oral o tópica. Tales propiedades ventajosas incluyen:

- Reactividad cruzada de especies. Este es un requisito típico para la farmacodinámica preclínica y la evaluación farmacocinética;

- Estabilidad a proteasa. Los ligandos peptídicos bicíclicos deberían demostrar idealmente estabilidad frente a las proteasas plasmáticas, proteasas epiteliales ("ancladas a la membrana"), proteasas gástricas e intestinales, proteasas de la superficie pulmonar, proteasas intracelulares y similares. La estabilidad a proteasa se debe mantener entre diferentes especies, tal que un candidato a compuesto líder bicíclico pueda desarrollarse en modelos animales, así como administrarse con confianza a seres humanos; - Perfil de solubilidad deseable. Esta es una función de la proporción de residuos cargados e hidrófilos frente a hidrófobos y enlaces de H intra/intermoleculares, que es importante con fines de formulación y absorción; y

- Una vida media plasmática óptima en la circulación. Dependiendo de la indicación clínica y el régimen de tratamiento, puede requerirse desarrollar un péptido bicíclico para una exposición corta en un entorno de gestión de enfermedades agudas, o desarrollar un péptido bicíclico con retención potenciada en la circulación, y por lo tanto sea óptimo para la gestión de patologías más crónicas. Otros factores que impulsan la vida media plasmática deseable son los requisitos de exposición sostenida para una eficacia terapéutica máxima frente a la toxicología que la acompaña debido a la exposición sostenida del agente. - Selectividad. Ciertos ligandos peptídicos de la invención demuestran una buena selectividad sobre otras CD.

Sales farmacéuticamente aceptables

Se apreciará que las formas de sal están dentro del alcance de esta invención, y las referencias a ligandos peptídicos incluyen las formas de sal de dichos ligandos.

Las sales de la presente invención se pueden sintetizar a partir del compuesto original que contiene un residuo básico o ácido mediante métodos químicos convencionales, tales como los métodos descritos en Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 páginas, agosto de 2002. Generalmente, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de base o ácido libre de estos compuestos con la base o el ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos.

Las sales de adición de ácido (mono- o disales) se pueden formar con un amplia variedad de ácidos, tanto inorgánicos como orgánicos. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen mono- o disales formadas con un ácido seleccionado del grupo que consiste en acético, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico, ascórbico (por ejemplo, L-ascórbico), L-aspártico, bencenosulfónico, benzoico, 4-acetamidobenzoico, butanoico, (+)alcanfórico, alcanforsulfónico, (+)-(1S)-camfor-10-sulfónico, cáprico, caproico, caprílico, cinámico, cítrico, adámico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-disulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, fórmico, fumárico, galacárico, gentísico, glucoheptónico, D-glucónico, glucurónico (por ejemplo, D-glucurónico), glutámico (por ejemplo, L-glutámico), a-oxoglutárico, glicólico, hipúrico, ácidos hidrohálicos (por ejemplo, bromhídrico, clorhídrico, hidriódico), isetiónico, láctico (por ejemplo, (+)-L-láctico, (±)-DL-láctico), lactobiónico, maleico, málico, (-)-L-málico, malónico, (±)-DL-mandélico, metanosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, naftaleno-1,5-disulfónico, 1-hidroxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiónico, pirúvico, L-piroglutámico, salicílico, 4-amino-salicílico, sebácico, esteárico, succínico, sulfúrico, tánico, (+)-L-tartárico, tiociánico, p-toluenosulfónico, undecilénico y ácidos valéricos, así como aminoácidos acilados y resinas de intercambio catiónico.

Un grupo particular de sales consiste en las sales formadas a partir de ácido acético, clorhídrico, yodhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, cítrico, láctico, succínico, maleico, málico, isetiónico, fumárico, bencenosulfónico, toluenosulfónico, sulfúrico, metanosulfónico (mesilato), etanosulfónico, naftalenosulfónico, valérico, propanoico, butanoico, malónico, glucurónico y lactobiónico. Una sal particular es la sal hidrocloruro. Otra sal particular es la sal acetato.

Si el compuesto es aniónico, o tiene un grupo funcional que puede ser aniónico (p. ej., -COOH puede ser -COO'), entonces se puede formar una sal con una base orgánica o inorgánica, lo que genera un catión adecuado. Los ejemplos de cationes inorgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, iones de metales alcalinos tales como Li+, Na+ y K+, cationes de metales alcalinotérreos tales como Ca2+ y Mg2+, y otros cationes tales como Al3+ o Zn+. Los ejemplos de cationes orgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, el ion amonio (es decir, NH⁴+) y los iones amonio sustituidos (p. ej., NH³R+, NH²R²+, NHR³+, NR⁴+). Los ejemplos de algunos iones de amonio sustituidos son los obtenidos a partir de: metilamina, etilamina, dietilamina, propilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, bencilamina, fenilbencilamina, colina, meglumina y trometamina, así como aminoácidos tales como lisina y arginina. Un ejemplo de un ion amonio cuaternario habitual es N (CH3)4+.

Cuando los compuestos de la fórmula (I) contienen una función amina, estos pueden formar sales de amonio cuaternario, por ejemplo, mediante reacción con un agente alquilante según procedimientos bien conocidos por el experto. Tales compuestos de amonio cuaternario se encuentran dentro del alcance de la fórmula (I).

Derivados modificados

Se apreciará que los derivados modificados de los ligandos peptídicos como se definen aquí están dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos de tales derivados modificados adecuados incluyen una o más modificaciones seleccionadas de: modificaciones N-terminal y/o C-terminal; reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos con uno o más residuos de aminoácidos no naturales (tal como el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos polares con uno o más aminoácidos isostéricos o isoelectrónicos; reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos no polares residuos con otros aminoácidos isotéricos o isoelectrónicos no naturales); adición de un grupo espaciador; reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos sensibles a la oxidación con uno o más residuos de aminoácidos resistentes a la oxidación; reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos con una alanina, reemplazo de uno o más residuos de L-aminoácidos con uno o más residuos de D-aminoácidos; N-alquilación de uno o más enlaces amida dentro del ligando peptídico bicíclico; reemplazo de uno o más enlaces peptídicos con un enlace sustituto; modificación de la longitud del esqueleto peptídico; sustitución del hidrógeno en el carbono alfa de uno o más residuos de aminoácidos con otro grupo químico, modificación de aminoácidos tales como cisteína, lisina, glutamato/aspartato y tirosina con reactivos de amina, tiol, ácido carboxílico y fenol adecuados para como para funcionalizar dichos aminoácidos, e introducción o reemplazo de aminoácidos que introducen reactividades ortogonales que son adecuadas para la funcionalización, por ejemplo, aminoácidos portadores de grupos azida o alquino que permiten la funcionalización con restos portadores de alquino o azida, respectivamente.

En una realización, el derivado modificado comprende una modificación N-terminal y/o C-terminal. En una realización adicional, en donde la modificación comprende una modificación N-terminal que usa una química reactiva con amino adecuada, y/o una modificación C-terminal que usa una química reactiva con carboxi adecuada. En una realización adicional, dicha modificación N-terminal o C-terminal comprende la adición de un grupo efector, que incluye, pero no se limitan a, un agente citotóxico, un radioquelador o un cromóforo.

En otra realización, el derivado modificado comprende una modificación N-terminal. En otra realización, la modificación N-terminal comprende un grupo acetilo N-terminal. En esta realización, el grupo cisteína N-terminal (el grupo denominado en este documento Ci) está cubierto con anhídrido acético u otros reactivos adecuados durante la síntesis de péptidos que conduce a una molécula que está acetilada en el extremo N-terminal. Esta realización proporciona la ventaja de eliminar un punto de reconocimiento potencial para la aminopeptidasa y evita el potencial de degradación del péptido bicíclico.

En una realización alternativa, la modificación N-terminal comprende la adición de un grupo espaciador molecular que facilita la conjugación de grupos efectores y la retención de la potencia del péptido bicíclico por su diana.

En otra realización, el derivado modificado comprende una modificación C-terminal. En otra realización, la modificación C-terminal comprende un grupo amida. En esta realización, el grupo cisteína C-terminal (el grupo denominado en este documento Cn¡) se sintetiza como una amida durante la síntesis de péptidos que conduce a una molécula que está amidada en el extremo C-terminal. Esta realización proporciona la ventaja de retirar un punto de reconocimiento potencial para la carboxipeptidasa y reduce el potencial de degradación proteolítica del péptido bicíclico.

En una realización, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos con uno o más residuos de aminoácidos no naturales. En esta realización, pueden seleccionarse aminoácidos no naturales que tienen cadenas laterales isostéricas/isoelectrónicas que ya no son reconocidas por las proteasas degradantes ni tienen ningún efecto sobre la potencia diana.

Como alternativa, se pueden usar aminoácidos no naturales que tienen cadenas laterales de aminoácidos restringidas, tal que la hidrólisis proteolítica del enlace peptídico cercano esté impedida conformacional y estéricamente. En particular, estos se refieren a análogos de prolina, cadenas laterales voluminosas, derivados disustituidos en Ca (por ejemplo, ácido aminoisobutírico, Aib) y cicloaminoácidos, siendo un derivado simple el ácido aminociclopropilcarboxílico.

En una realización, el derivado modificado comprende la adición de un grupo espaciador. En otra realización, el derivado modificado comprende la adición de un grupo espaciador a la cisteína N-terminal (Ci) y/o la cisteína C-terminal (C¡m).

En una realización, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos sensibles a la oxidación con uno o más residuos de aminoácidos resistentes a la oxidación. En otra realización adicional, el derivado modificado comprende el reemplazo de un residuo de triptófano con un residuo de fenilalanina. Esta realización proporciona la ventaja de mejorar el perfil de estabilidad farmacéutica del ligando peptídico bicíclico resultante.

En una realización, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos cargados con uno o más residuos de aminoácidos hidrófobos. En una realización alternativa, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos hidrófobos con uno o más residuos de aminoácidos cargados. El correcto equilibrio de los residuos de aminoácidos cargados frente a hidrófobos es una característica importante de los ligandos peptídicos bicíclicos. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos hidrófobos influyen en el grado de unión a proteínas plasmáticas y, por tanto, en la concentración de la fracción disponible libre en plasma, mientras que los residuos de aminoácidos cargados (en particular la arginina) pueden influir en la interacción del péptido con las membranas de fosfolípidos en las superficies celulares. Los dos en combinación pueden influir en la vida media, el volumen de distribución y la exposición del fármaco peptídico, y se pueden adaptar según el criterio de valoración clínico. Además, la combinación y el número correctos de residuos de aminoácidos cargados frente a los hidrófobos pueden reducir la irritación en el sitio de la inyección (si el fármaco peptídico se administra por vía subcutánea).

En una realización, el derivado modificado comprende el reemplazo de uno o más residuos de L-aminoácidos con uno o más residuos de D-aminoácidos. Se cree que esta realización aumenta la estabilidad proteolítica por el impedimento estérico y por la propensión de los D-aminoácidos a estabilizar las conformaciones de giro P (Tugyi et al (2005) PNAS, 102 (2), 413-418).

En una realización, el derivado modificado comprende la eliminación de cualquier residuo y sustituciones de aminoácido alanina. Esta realización proporciona la ventaja de eliminar el (los) sitio (s) de ataque proteolíticos potenciales.

Cabe señalar que cada una de las modificaciones mencionadas anteriormente sirve para mejorar deliberadamente la potencia o estabilidad del péptido. Se pueden lograr mejoras de potencia adicionales basadas en modificaciones a través de los siguientes mecanismos:

- la incorporación de residuos hidrófobos que aprovechan el efecto hidrófobo y conducen a menores constantes de disociación, tal que se logran afinidades más altas;

- la incorporación de grupos cargados que aprovechan las interacciones iónicas de largo alcance, conduciendo a constantes de asociación más rápidas y mayores afinidades (véase, por ejemplo, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427­ 31); y

- la incorporación de una restricción adicional en el péptido, por ejemplo, restringiendo correctamente las cadenas laterales de los aminoácidos tal que la pérdida de entropía sea mínima en la unión a la diana, restringiendo los ángulos torsionales de la cadena principal tal que la pérdida de entropía sea mínima en la unión a la diana e introduciendo ciclaciones adicionales en la molécula por razones idénticas.

(para revisiones véanse Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, y Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418) .

Variaciones isotópicas

La presente invención incluye todos los ligandos peptídicos marcados con (radio)isótopos farmacéuticamente aceptables que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones y por tanto no están incluidos en la invención en donde uno o más átomos se reemplazan con átomos que tienen el mismo número atómico, pero una masa atómica o un número másico diferente de la masa atómica o número másico que se encuentra normalmente en la naturaleza, y los ligandos peptídicos de la invención, en donde se fijan grupos quelantes de metales (denominados "efectores") que pueden contener (radio)isótopos relevantes y ligandos peptídicos de la invención, en donde algunos grupos funcionales se reemplazan covalentemente con (radio)isótopos relevantes o grupos funcionales marcados isotópicamente.

Los ejemplos de isótopos adecuados para su inclusión en los ligandos peptídicos de la invención comprenden isótopos de hidrógeno, tales como 2H (D) y 3H (T), carbono, tales como 11C, 13C y 14C, cloro, tales como 36Cl, flúor, tales como 18F, tales como 123I, 125I y 131I, nitrógeno, tal como 13N y 15N, oxígeno, tal como 15O, 17O, y 18O, fósforo, tal como 32P, azufre, tal como 35S, cobre, tal como 64Cu, galio, tal como 67Ga o 68Ga, itrio, tal como 90Y y lutecio, tal como 177Lu y bismuto, tal como 213Bi.

Algunos ligandos peptídicos marcados isotópicamente, por ejemplo, aquellos que incorporan un isótopo radiactivo, son útiles en estudios de distribución en tejido de sustrato y/o fármaco, y para valorar clínicamente la presencia y/o ausencia de la diana CD137 en tejidos enfermos. Los ligandos peptídicos de la invención pueden tener además propiedades de diagnóstico valiosas, ya que se pueden usar para detectar o identificar la formación de un complejo entre un compuesto marcado y otras moléculas, péptidos, proteínas, enzimas o receptores. Los métodos de detección o identificación pueden usar compuestos que están marcados con agentes marcadores tales como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas (por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, acuorina y luciferasa), etc. Los isótopos radiactivos tritio, es decir, 3H (T) y carbono-14, es decir 14C, son particularmente útiles para esta finalidad en vista de su facilidad de incorporación y medios rápidos de detección.

La sustitución por isótopos más pesados tales como deuterio, es decir 2H (D), puede ofrecer algunas ventajas terapéuticas resultantes de su mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, vida media in vivo aumentada o requisitos de dosificación reducidos y, por ello, pueden ser preferidos en algunas circunstancias.

La sustitución con isótopos emisores de positrones, tales como 11C, 18F, 15O y 13N, puede ser útil en estudios de tomografía de emisión de positrones (TEP) para examinar la ocupación de diana.

Los compuestos marcados isotópicamente de ligandos peptídicos generalmente se pueden preparar mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia o mediante procedimientos análogos a los descritos en los Ejemplos adjuntos usando un reactivo marcado isotópicamente apropiado en lugar del reactivo no marcado empleado anteriormente.

Armazón molecular

Se describen armazones moleculares en, por ejemplo, el documento WO 2009/098450 y referencias citadas en el mismo, particularmente los documentos WO 2004/077062 y WO 2006/078161.

Como se señala en los documentos anteriores, el armazón molecular puede ser una molécula pequeña, tal como una molécula orgánica pequeña.

En una realización, el armazón molecular puede ser una macromolécula. En una realización, el armazón molecular es una macromolécula compuesta por aminoácidos, nucleótidos o carbohidratos.

En una realización, el armazón molecular comprende grupos reactivos que son capaces de reaccionar con grupo (s) funcional (es) del polipéptido para formar enlaces covalentes.

El armazón molecular puede comprender grupos químicos que forman la unión con un péptido, tales como aminas, tioles, alcoholes, cetonas, aldehídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, azidas, anhídridos, succinimidas, maleimidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.

En una realización, el armazón molecular puede comprender o puede consistir en hexahidro-1,3,5-triazina, especialmente 1,3,5-triacriloilhexahidro-1,3,5-triazina ("TATA"), o un derivado de la misma.

En una realización, el armazón molecular es 2,4,6-tris (bromometil)mesitileno. Esta molécula es similar al 1,3,5-tris (bromometil)benceno (TBMB), pero contiene tres grupos metilo adicionales fijados al anillo de benceno. Esto tiene la ventaja de que los grupos metilo adicionales pueden formar contactos adicionales con el polipéptido y, por ello, añadir restricción estructural adicional.

El armazón molecular de la invención contiene grupos químicos que permiten a los grupos funcionales del polipéptido de la colección codificada de la invención formar enlaces covalentes con el armazón molecular. Dichos grupos químicos se seleccionan de un amplio intervalo de funcionalidades incluyendo aminas, tioles, alcoholes, cetonas, aldehídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, anhídridos, succinimidas, maleimidas, azidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.

Los grupos reactivos de armazón que podrían usarse en el armazón molecular para reaccionar con los grupos tiol de las cisteínas son haluros de alquilo (o también llamados halogenoalcanos o haloalcanos).

Los ejemplos incluyen bromometilbenceno o yodoacetamida. Otros grupos reactivos de armazón que se usan para acoplar selectivamente compuestos a cisteínas en proteínas son las maleimidas, compuestos que contienen carbonilo ap insaturado y compuestos que contienen a-halometilcarbonilo. Los ejemplos de maleimidas que puede usarse como armazones moleculares en la invención incluyen: tris- (2-maleimidoetil)amina, tris- (2-maleimidoetil)benceno y tris (maleimido)benceno. Un ejemplo de un compuesto que contiene carbonilo a insaturado es 1,1',1"-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53 (6), 1602-1606). Un ejemplo de un compuesto que contiene a-halometilcarbonilo es N,N',N”-(benceno-1,3,5-triil)tris (2-bromoacetamida). La selenocisteína es también un aminoácido natural que tiene una reactividad similar a la cisteína y puede usarse para las mismas reacciones. Por lo tanto, siempre que se mencione cisteína, es típicamente aceptable sustituir por selenocisteína a menos que el contexto sugiera otra cosa.

Grupos reactivos

El armazón molecular de la invención puede unirse al polipéptido (es decir, covalentemente) a través de grupos funcionales o reactivos en el polipéptido. Estos se forman típicamente a partir de las cadenas laterales de aminoácidos particulares encontrados en el polímero polipeptídico. Tales grupos reactivos pueden ser una cadena lateral de cisteína, una cadena lateral de lisina o un grupo amino N-terminal o cualquier otro grupo reactivo adecuado. Pueden encontrarse detalles en el documento WO 2009/098450.

Son ejemplos de grupos reactivos de aminoácidos naturales el grupo tiol de cisteína, el grupo amino de lisina, el grupo carboxilo de aspartato o glutamato, el grupo guanidinio de arginina, el grupo fenólico de tirosina o el grupo hidroxilo de serina. Los aminoácidos no naturales pueden proporcionar un amplio intervalo de grupos reactivos incluyendo una azida, un cetocarbonilo, un alquino, un vinilo o un grupo haluro de alquilo. El grupo amino y carboxilo de los extremos del polipéptido pueden servir también como grupos reactivos para formar enlaces covalentes con un armazón molecular/núcleo molecular.

En una realización, el grupo reactivo comprende un residuo de cisteína. En una realización alternativa, el grupo reactivo comprende penicilamina.

Los polipéptidos de la invención contienen al menos tres grupos reactivos. Dichos polipéptidos pueden contener también cuatro o más grupos reactivos. Cuantos más grupos reactivos se usen, más bucles pueden formarse en el armazón molecular.

En una realización preferida, se generan polipéptidos con tres grupos reactivos. La reacción de dichos polipéptidos con un armazón molecular/núcleo molecular que tiene una simetría rotacional triple genera un solo isómero de producto. La generación de un solo isómero de producto es favorable por varias razones. Los ácidos nucleicos de las colecciones de compuestos codifican solo las secuencias primarias del polipéptido, pero no el estado isomérico de las moléculas que se forman tras reacción del polipéptido con el núcleo molecular. Si solo puede formarse un isómero de producto, la asignación del ácido nucleico al isómero de producto está claramente definida. Si se forman múltiples isómeros de producto, el ácido nucleico no puede dar información sobre la naturaleza del isómero de producto que se aisló en un cribado o proceso de selección. La formación de un solo isómero de producto es también ventajosa si se sintetiza un miembro específico de una colección de la invención. En este caso, la reacción química del polipéptido con el armazón molecular produce un solo isómero de producto en lugar de mezclas de isómeros.

En otra realización de la invención, se generan polipéptidos con cuatro grupos reactivos. La reacción de dichos polipéptidos con un armazón molecular/núcleo molecular que tiene simetría tetraédrica genera dos isómeros de producto. Aunque los dos isómeros de producto diferentes están codificados por uno y el mismo ácido nucleico, la naturaleza isomérica del isómero aislado puede determinarse sintetizando químicamente ambos isómeros, separando los dos isómeros y sometiendo a ensayo ambos isómeros para la unión a un ligando diana.

En una realización de la invención, al menos uno de los grupos reactivos de los polipéptidos es ortogonal a los grupos reactivos restantes. El uso de grupos reactivos ortogonales permite dirigir tales grupos reactivos ortogonales a sitios específicos del núcleo molecular. Las estrategias de unión que implican grupos reactivos ortogonales pueden usarse para limitar el número de isómeros de producto formados. En otras palabras, al elegir grupos reactivos distintos o diferentes para uno o más de los al menos tres enlaces entre aquellos elegidos para el residuo de los al menos tres enlaces, puede conseguirse útilmente un orden particular de unión o dirección de los grupos reactivos específicos del polipéptido a posiciones específicas en el armazón molecular. En otra realización, los grupos reactivos del polipéptido de la invención se hacen reaccionar con conectores moleculares, en donde dichos conectores son capaces de reaccionar con un armazón molecular de modo que el conector se interponga entre el armazón molecular y el polipéptido en el estado unido final.

En algunas realizaciones, los aminoácidos de los miembros de las colecciones o conjuntos de polipéptidos pueden reemplazarse por cualquier aminoácido natural o no natural. Se excluyen de estos aminoácidos intercambiables aquellos que albergan grupos funcionales para reticular los polipéptidos con un núcleo molecular, tal que solo las secuencias de bucle son intercambiables. Las secuencias polipeptídicas intercambiables tienen secuencias aleatorias, secuencias constantes o secuencias con aminoácidos aleatorios y constantes. Los aminoácidos con grupos reactivos están localizados en posiciones definidas en el polipéptido, puesto que la posición de estos aminoácidos determina el tamaño de bucle.

Pueden usarse alternativas a las conjugaciones mediadas por tiol para unir el armazón molecular con el péptido a través de interacciones covalentes. Como alternativa, estas técnicas pueden usarse en la modificación o unión de residuos adicionales (tales como moléculas pequeñas de interés que son distintas del armazón molecular) con el polipéptido después de seleccionarse o aislarse de acuerdo con la presente invención- en esta realización entonces la unión claramente no tiene que ser covalente y puede abarcar unión no covalente. Estos procedimientos pueden usarse en lugar de (o en combinación con) los procedimientos mediados por tiol mediante producción de fago que presenta proteínas y péptidos portadores de aminoácidos no naturales con los grupos reactivos químicos necesarios, en combinación con moléculas pequeñas que llevan el grupo reactivo complementario, o mediante la incorporación de aminoácidos no naturales a un polipéptido sintetizado química o recombinantemente cuando la molécula se elabora después de la fase de selección/aislamiento. Pueden encontrarse detalles adicionales en el documento WO 2009/098450 o Heinis, et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7.

Grupos efectores y funcionales

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un conjugado de fármaco que comprende un ligando peptídico como se define en el presente documento conjugado con uno o más grupos efectores y/o funcionales.

Los grupos efectores y/o funcionales pueden fijarse, por ejemplo, a los extremos N y/o C del polipéptido, a un aminoácido dentro del polipéptido o al armazón molecular.

Los grupos efectores apropiados incluyen anticuerpos y partes o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, un grupo efector puede incluir una región constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, un dominio de cadena pesada CH1 de anticuerpo, un dominio de cadena pesada CH2 de anticuerpo, un dominio de cadena pesada CH3 de anticuerpo, o cualquier combinación de los mismos, además del uno o más dominios de región constante. Un grupo efector también puede comprender una región bisagra de un anticuerpo (tal región que normalmente se encuentra entre los dominios CH1 y CH2 de una molécula de IgG).

En una realización adicional de este aspecto de la invención, un grupo efector según la presente invención es una región Fc de una molécula de IgG. Ventajosamente, un grupo de ligando peptídico efector según la presente invención comprende o consiste en una fusión Fc de ligando peptídico que tiene una vida media tp de un día o más, dos días o más, 3 días o más, 4 días o más, 5 días o más, 6 días o más o 7 días o más. Lo más ventajosamente, el ligando peptídico según la presente invención comprende o consiste en una fusión Fc de ligando peptídico que tiene una vida media tp de un día o más.

Los grupos funcionales incluyen, en general, grupos de enlace, fármacos, grupos reactivos para la fijación de otras entidades, grupos funcionales que ayudan a la captación de los péptidos macrocíclicos en las células, y similares.

La capacidad de los péptidos para penetrar en las células permitirá que sean efectivos los péptidos frente a las dianas intracelulares. Las dianas a las que pueden acceder los péptidos con la capacidad de penetrar en las células incluyen factores de transcripción, moléculas de señalización intracelular tales como las tirosina cinasas y las moléculas implicadas en la ruta apoptótica. Los grupos funcionales que permiten la penetración de las células incluyen péptidos o grupos químicos que se han añadido al péptido o al armazón molecular. Péptidos tales como los derivados de VP22, HIV-Tat, una proteína homeobox de Drosophila (Antennapedia), p. ej., como se describe en Chen y Harrison, Biochemical Society Transactions (2007), volumen 35, parte 4, pág. 821; Gupta et al. en Advanced Drug Discovery Reviews (2004), volumen 579637. Los ejemplos de péptidos cortos que se ha mostrado que son eficientes en la translocación a través de membranas plasmáticas incluyen el péptido penetratina de 16 aminoácidos de la proteína de Drosophila Antennapedia (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. volumen 269 pág. 10444), el "péptido anfipático modelo" de 18 aminoácidos (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 pág. 127) y las regiones ricas en arginina de la proteína TAT de HIV. Los enfoques no peptídicos incluyen el uso de miméticos de moléculas pequeñas o SMOC que se pueden fijar fácilmente a biomoléculas (Okuyama et al (2007) Nature Methods volumen 4, pág. 153). Otras estrategias químicas para añadir grupos guanidinio a las moléculas también potencian la penetración celular (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem, volumen 282, pág. 13585). Las moléculas de pequeño peso molecular, tales como los esteroides, pueden añadirse al armazón molecular para potenciar la captación en las células.

Una clase de grupos funcionales que pueden fijarse a ligandos peptídicos incluye anticuerpos y fragmentos de enlace de los mismos, tales como Fab, Fv o fragmentos de dominio único. En particular, pueden usarse anticuerpos que se enlazan a proteínas capaces de aumentar la vida media del ligando peptídico in vivo.

En una realización, un grupo ligando peptídico-efector según la invención tiene una vida media tp seleccionada del grupo que consiste en: 12 horas o más, 24 horas o más, 2 días o más, 3 días o más, 4 días o más, 5 días o más, 6 días o más, 7 días o más, 8 días o más, 9 días o más, 10 días o más, 11 días o más, 12 días o más, 13 días o más, 14 días o más, 15 días o más o 20 días o más Ventajosamente, un grupo o composición de ligando peptídico efector según la invención tendrá una semivida tp en el intervalo de 12 a 60 horas. En otra realización, tendrá una vida media tp de un día o más. En aún otra realización, estará en el intervalo de 12 a 26 horas.

En una realización particular de la invención, el grupo funcional se selecciona de un quelante de metales, que es adecuado para complejar radioisótopos metálicos de relevancia medicinal.

Los posibles grupos efectores también incluyen enzimas, por ejemplo, tales como carboxipeptidasa G2 para uso en terapia de enzima/profármaco, donde el ligando peptídico reemplaza a anticuerpos en ADEPT.

En una realización particular de la invención, el grupo funcional se selecciona de un fármaco, tal como un agente citotóxico para la terapia del cáncer. Ejemplos adecuados incluyen: agentes alquilantes tales como cisplatino y carboplatino, así como oxalilplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida; antimetabolitos incluyendo los análogos de purina azatioprina y mercaptopurina o análogos de pirimidina; alcaloides y terpenoides vegetales incluyendo alcaloides de vinca tales como vincristina, vinblastina, vinorrelbina y vindesina; podofilotoxina y sus derivados etopósido y tenipósido; taxanos, incluyendo paclitaxel, originalmente conocido como Taxol; inhibidores de topoisomerasa incluyendo camptotecinas: irinotecán y topotecán, e inhibidores de tipo II incluyendo amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido. Otros agentes pueden incluir antibióticos antitumorales que incluyen el inmunosupresor dactinomicina (que se usa en trasplantes de riñón), doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina, caliqueamicinas y otros.

En una realización particular adicional de la invención, el agente citotóxico se selecciona entre maitansinoides (tales como DM1) o monometilauristatinas (tales como MMAE).

El DM1 es un agente citotóxico que es un derivado de maitansina que contiene tiol y tiene la siguiente estructura:

La monometilauristatina E (MMAE) es un agente antineoplásico sintético y tiene la siguiente estructura

En aún otra realización particular de la invención, el agente citotóxico se selecciona entre maitansinoides (tales como DM1).

En una realización, el agente citotóxico se une al péptido bicíclico mediante un enlace escindible, tal como un enlace disulfuro o un enlace sensible a proteasa. En otra realización, los grupos adyacentes al enlace disulfuro se modifican para controlar el impedimento del enlace disulfuro y, por tanto, la velocidad de escisión y la liberación concomitante del agente citotóxico.

El trabajo publicado establecía el potencial para modificar la susceptibilidad del enlace disulfuro a la reducción mediante la introducción de un impedimento estérico a ambos lados del enlace disulfuro (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). Un mayor grado de impedimento estérico reduce la tasa de reducción por glutatión intracelular y también los agentes reductores extracelulares (sistémicos), reduciendo consecuentemente la facilidad con la que se libera la toxina, tanto dentro como fuera de la célula. Por tanto, la selección de la estabilidad óptima del disulfuro en la circulación (que minimiza los efectos secundarios indeseables de la toxina) frente a la liberación eficiente en el medio intracelular (que maximiza el efecto terapéutico) se puede lograr mediante la selección cuidadosa del grado de impedimento en cada lado del enlace disulfuro.

El impedimento a cada lado del enlace disulfuro se modula mediante la introducción de uno o más grupos metilo en la entidad diana (en este caso, el péptido bicíclico) o en el lado de la toxina del constructo molecular.

En una realización, el agente citotóxico y el conector se seleccionan de cualquier combinación de las descritas en el documento WO 2016/067035.

Síntesis

Los péptidos de la presente invención pueden fabricarse sintéticamente mediante técnicas estándar seguidas de reacción con un armazón molecular in vitro. Cuando se realiza esto, se puede usar la química estándar. Esto permite la preparación rápida a gran escala de material soluble para experimentos posteriores adicionales o la validación. Tales procedimientos podrían lograrse usando una química convencional tal como la divulgada en Timmerman et al (mencionada anteriormente).

Por tanto, la invención también se refiere a la fabricación de polipéptidos o conjugados seleccionados como se establece en el presente documento, en donde la fabricación comprende etapas adicionales opcionales como se explica a continuación. En una realización, estas etapas se llevan a cabo en el producto final polipéptido/conjugado elaborado por síntesis química.

Opcionalmente, los residuos de aminoácidos en el polipéptido de interés pueden sustituirse cuando se fabrica un conjugado o complejo.

Los péptidos también pueden extenderse para incorporar, por ejemplo, otro bucle y, por lo tanto, introducir múltiples especificidades.

Para extender el péptido, simplemente puede extenderse químicamente en su extremo N o su extremo C o dentro de los bucles usando lisinas (y análogos) ortogonalmente protegidas usando química estándar en fase sólida o en fase de disolución. Pueden usarse técnicas de (bio)conjugación estándar para introducir un extremo N o C activado o activable. Como alternativa, se pueden hacer adiciones por condensación de fragmentos o ligadura química nativa, p. ej., como se describe en (Dawson et al. 1994. Síntesis de Proteínas por Ligación Química Nativa Science 266: 776-779), o mediante enzimas, por ejemplo usando subtiligasa como se describe en (Chang et al, Proc Natl Acad Sci, u Sa , 20 de diciembre de 1994, 91 (26):12544-8 o en Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, volumen 18, número 22, 15 de noviembre de 2008, páginas 6000-6003).

Alternativamente, los péptidos pueden extenderse o modificarse por conjugación adicional a través de enlaces disulfuro. Esto tiene la ventaja adicional de permitir que el primer y segundo péptido se disocien entre sí una vez dentro del entorno reductor de la célula. En este caso, el armazón molecular (p. ej., TATA) podría añadirse durante la síntesis química del primer péptido para reaccionar con los tres grupos cisteína; después podría añadirse una cisteína o tiol adicional al extremo N o C del primer péptido, tal que esta cisteína o tiol solo reaccionara con una cisteína o tiol libre del segundo péptido, formando un conjugado péptido-péptido bicíclico unido mediante disulfuro.

Se aplican igualmente técnicas similares a la síntesis/acoplamiento de dos macrociclos bicíclicos y biespecíficos, creando potencialmente una molécula tetraspecífica.

Además, la adición de otros grupos funcionales o grupos efectores se puede lograr de la misma manera, usando la química adecuada, acoplando en los extremos N o C o mediante cadenas laterales. En una realización, el acoplamiento se realiza de tal manera que no bloquee la actividad de ninguna de las entidades.

Composiciones Farmacéuticas

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un ligando peptídico o un conjugado de fármaco como se define en el presente documento en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

En general, los presentes ligandos peptídicos se utilizarán en forma purificada junto con excipientes o portadores farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos excipientes o portadores incluyen disoluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y/o tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y Ringer con lactato. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si son necesarios para mantener un complejo polipeptídico en suspensión, pueden elegirse entre espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.

Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes y reponedores de electrolitos, tales como los que se basan en la dextrosa de Ringer. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como agentes antimicrobianos, antioxidantes y quelantes y gases inertes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición).

Los ligandos peptídicos de la presente invención se pueden usar como composiciones administradas por separado o junto con otros agentes. Estos pueden incluir anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y diversos fármacos inmunoterapéuticos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de diversos agentes citotóxicos u otros agentes junto con los ligandos proteicos de la presente invención, o incluso combinaciones de polipéptidos seleccionados según la presente invención que tienen diferentes especificidades, tales como polipéptidos seleccionados usando diferentes ligandos diana, ya estén o no agrupados antes de la administración.

La vía de administración de las composiciones farmacéuticas según la invención puede ser cualquiera de las conocidas comúnmente por los expertos en la técnica. Para terapia, los ligandos peptídicos de la invención se pueden administrar a cualquier paciente de acuerdo con técnicas estándar. La administración puede ser de cualquier modo apropiado, incluyendo la vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, la vía pulmonar, o también, apropiadamente, por infusión directa con un catéter. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas según la invención se administrarán por inhalación. La dosificación y la frecuencia de administración dependerán de la edad, el sexo y el estado del paciente, la administración simultánea de otros fármacos, las contraindicaciones y otros parámetros que debe tener en cuenta el médico.

Los ligandos peptídicos de esta invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser efectiva y se pueden emplear técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Los expertos en la materia apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad y que los niveles pueden tener que ajustarse al alza para compensar.

Las composiciones que contienen los presentes ligandos peptídicos o un cóctel de los mismos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para lograr al menos una inhibición parcial, supresión, modulación, destrucción o algún otro parámetro medible de una población de células seleccionadas se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades necesarias para lograr esta dosificación dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmunitario del paciente, pero generalmente oscilan de 0,005 a 5,0 mg de ligando peptídico seleccionado por kilogramo de peso corporal, siendo las dosis de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis las más comúnmente usadas. Para aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los ligandos peptídicos presentes o cócteles de los mismos también pueden administrarse en dosificaciones similares o ligeramente inferiores.

Una composición que contiene un ligando peptídico según la presente invención puede utilizarse en entornos profilácticos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inactivación, destrucción o eliminación de una población de células diana seleccionada en un mamífero. Además, los ligandos peptídicos descritos en el presente documento se pueden usar de forma extracorpórea o in vitro de forma selectiva para destruir, agotar o eliminar de otro modo eficazmente una población de células diana de una colección heterogénea de células. La sangre de un mamífero se puede combinar de forma extracorpórea con los ligandos peptídicos seleccionados, por lo que las células no deseadas se destruyen o se eliminan de otro modo de la sangre para devolverlas al mamífero de acuerdo con técnicas estándar.

Usos Terapéuticos

Los péptidos bicíclicos de la invención tienen utilidad específica como agentes de enlace a CD137.

CD137 es un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). Sus nombres alternativos son miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF9), 4-IBB e inducido por activación de linfocitos (ILA). CD137 puede ser expresado por células T activadas, pero en mayor medida en células T CD8+ que en células T CD4+. Además, la expresión de CD137 se encuentra en células dendríticas, células dendríticas foliculares, células asesinas naturales, granulocitos y células de las paredes de los vasos sanguíneos en los sitios de inflamación. Una actividad caracterizada de CD137 es su actividad coestimuladora para células T activadas. La reticulación de CD137 mejora la proliferación de células T, la secreción de IL-2, la supervivencia y la actividad citolítica. Además, puede mejorar la actividad inmunológica para eliminar tumores en ratones.

CD137 es un receptor coestimulador de células T inducido por la activación de TCR (Nam et al., Curr. Cancer Drug Targets, 5:357-363 (2005); Waits et al., Annu. Rev, Inmunol., 23:23-68 (2005)). Además de su expresión en células T CD4+ y CD8+ activadas, CD137 también se expresa en CD4+CD25+ células T reguladoras, células asesinas naturales (NK) y NK-T, monocitos, neutrófilos y células dendríticas. Su ligando natural, CD137L, se ha descrito en células presentadoras de antígenos, incluyendo las células B, monocito/macrófagos, y células dendríticas (Watts et al. Annu. Rev. Immunol, 23:23-68 (2005)). Al interactuar con su ligando, CD137 conduce a una mayor proliferación de células T inducida por TCR, producción de citocinas, maduración funcional y supervivencia prolongada de células T CD8+ (Nam et al, Curr. Cancer Drug Targets, 5:357-363 (2005),Watts et al., Annu. Rev. Inmunol, 23:23-68 (2005)).

La señalización a través de CD137 por CD137L o anticuerpos monoclonales (mAb) agonistas contra CD137 conduce a una mayor proliferación de células T inducida por TCR, producción de citoquinas y maduración funcional, y prolonga la supervivencia de las células T CD8+. Estos efectos resultan de: (1) la activación del NF- kB, quinasa c-Jun NH2-terminal/ proteína quinasa activada por estrés (JNK/SAPK), y las vías de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK), y (2) el control de la expresión génica relacionada con el ciclo celular y antiapoptótica.

Los experimentos realizados tanto en ratones en CD137 como en CD137L deficientes han demostrado además la importancia de la coestimulación de CD137 en la generación de una respuesta de células T completamente competente.

Las células NK activadas con IL-2 e IL-15 expresan CD137, y la unión de CD137 por mAb agonistas estimula la proliferación de células NK y la secreción de IFN-^y, pero no su actividad citolítica.

Además, las células NK estimuladas con CD137 promueven la expansión de las células T activadas in vitro.

De acuerdo con su función coestimuladora, se ha demostrado que los mAbs agonistas contra CD137 promueven el rechazo de aloinjertos cardíacos y cutáneos, erradican tumores establecidos, amplían las respuestas antivirales primarias de células T CD8+ y aumentan el potencial citolítico de células T. Estos estudios respaldan la opinión de que la señalización de CD137 promueve la función de las células T, lo que puede mejorar la inmunidad contra los tumores y las infecciones.

Los ligandos polipeptídicos seleccionados según el método de la presente invención pueden emplearse en aplicaciones terapéuticas y profilácticas in vivo, aplicaciones de diagnóstico in vitro e in vivo, aplicaciones de ensayo y reactivos in vitro, y similares. Los ligandos que tienen niveles de especificidad seleccionados son útiles en aplicaciones que implican ensayos en animales no humanos, donde la reactividad cruzada es deseable, o en aplicaciones de diagnóstico, donde la reactividad cruzada con homólogos o parálogos necesita controlarse cuidadosamente. En algunas aplicaciones, tales como las aplicaciones de vacunas, la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria a intervalos predeterminados de antígenos puede ser aprovechada para adaptar una vacuna a enfermedades y patógenos específicos.

Se prefieren los ligandos peptídicos sustancialmente puros de al menos 90 a 95% de homogeneidad para administración a un mamífero, y es lo más preferido de 98 a 99% o más de homogeneidad para usos farmacéuticos, especialmente cuando el mamífero es un ser humano. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad como se desee, los polipéptidos seleccionados se pueden usar de forma diagnóstica o terapéutica (incluyendo la extracorpórea) o para desarrollar y realizar procedimientos de ensayo, tinciones de inmunofluorescencia y similares (Lefkovite y Pernis, (1979 y 1981) Immunological Methods, volúmenes I y II, Academic Press, NY).

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un ligando peptídico o conjugado de fármaco como se define en el presente documento para uso en la prevención, supresión o tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por CD137.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad o trastorno mediado por CD137, que comprende administrar a un paciente que lo necesita un grupo efector y un conjugado de fármaco del ligando peptídico como se define en el presente documento.

En una realización, el CD137 es un CD137 de mamífero. En otra realización, el CD137 de mamífero es CD137 humano (hCD137).

En una realización, la enfermedad o trastorno mediado por CD137 se selecciona de cáncer, infección e inflamación. En otra realización, el trastorno o enfermedad mediada por CD137 se selecciona de cáncer.

Los ejemplos de cánceres (y sus contrapartidas benignas) que se pueden tratar (o inhibir) incluyen, pero no se limitan a, tumores de origen epitelial (adenomas y carcinomas de diversos tipos, incluyendo adenocarcinomas, carcinomas escamosos, carcinomas de células transicionales y otros carcinomas) tales como carcinomas de la vejiga y el tracto urinario, mama, tracto gastrointestinal (incluyendo el esófago, estómago (gástrico), intestino delgado, colon, recto y ano), hígado (carcinoma hepatocelular), vesícula biliar y sistema biliar, páncreas exocrino, riñón, pulmón (por ejemplo, adenocarcinomas, carcinomas pulmonares microcíticos, carcinomas pulmonares no microcíticos, carcinomas broncoalveolares y mesoteliomas), cabeza y cuello (por ejemplo, cánceres de la lengua, cavidad bucal, laringe, faringe, nasofaringe, amígdala, glándulas salivares, cavidad nasal y senos paranasales), ovario, trompas de falopio, peritoneo, vagina, vulva, pene, cuello uterino, miometrio, endometrio, tiroides (por ejemplo, carcinoma folicular de tiroides), glándula suprarrenal, próstata, piel y anexos (por ejemplo, melanoma, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, queratoacantoma, nevo displásico); trastornos hematológicos malignos (es decir, leucemias, linfomas) y trastornos hematológicos premalignos y trastornos de malignidades de bajo potencial, incluyendo trastornos hematológicos malignos y afecciones del linaje linfoide relacionadas (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda [ALL], leucemia linfocítica crónica [CLL], linfomas de células p tales como linfoma difuso de células p grandes [DLBCL], linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células del manto, linfomas y leucemias de células T, linfomas de células T citolíticos naturales [NK], linfomas de Hodgkin, tricoleucemia, gamopatía monoclonal de significado incierto, plasmacitoma, mieloma múltiple y trastornos linfoproliferativos postrasplante), y trastornos hematológicos malignos y afecciones del linaje mieloide relacionadas (por ejemplo, leucemia mielógena aguda [AML], leucemia mielógena crónica [c Ml ], leucemia mielomonocítica crónica [CMML], síndrome hipereosinofílico, trastornos mieloproliferatrivos tales como policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria, síndrome mieloproliferativo, síndrome mielodisplásico y leucemia promielocítica); tumores de origen mesenquimal, por ejemplo, sarcomas del tejido blando, hueso o cartílago tales como osteosarcomas, fibrosarcomas, condrosarcomas, rabdomiosarcomas, leiomiosarcomas, liposarcomas, angiosarcomas, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, sarcomas sinoviales, sarcomas epitelioides, tumores estromales gastrointestinales, histiocitomas benignos y malignos y dermatofibrosarcoma protuberante; tumores del sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, astrocitomas, gliomas y glioblastomas, meningiomas, ependimomas, tumores pineales y neurinomas); tumores endocrinos (por ejemplo, tumores de la pituitaria, tumores de la glándula suprarrenal, tumores de células de los islotes, tumores paratiroideos, tumores carcinoides y carcinoma medular de la tiroides); tumores oculares y de los anexos (por ejemplo, retinoblastoma); tumores de las células germinales y trofoblásticos (por ejemplo, teratomas, seminomas, disgerminomas, molas hidatidiformes y coriocarcinomas); y tumores pediátricos y embrionarios (por ejemplo, meduloblastoma, neuroblastoma, tumor de Wilms y tumores neuroectodérmicos primitivos); o síndromes congénitos o de otro tipo, que dejan al paciente susceptible a un trastorno maligno (por ejemplo, xeroderma pigmentoso).

En otra realización, el cáncer se selecciona de neoplasias hematopoyéticas tales como: linfoma de no Hodgkin (NHL), linfoma de Burkitt (BL), mieloma múltiple (MM), leucemia linfocítica crónica B (B-CLL), leucemia linfocítica aguda B y T (ALL), linfoma de células T (TCL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma de Hodgkin (HL) y leucemia mieloide crónica (CML).

Las referencias en el presente documento al término "prevención" implican la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" hace referencia a la administración de la composición después de un evento inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" implica la administración de la composición protectora después de que los síntomas de la enfermedad se manifiesten.

Se dispone de sistemas de modelos animales que pueden usarse para cribar la efectividad de los ligandos peptídicos en la protección contra o el tratamiento de la enfermedad. El uso de sistemas de modelos animales se ve facilitado por la presente invención, que permite el desarrollo de ligandos polipeptídicos que pueden reaccionar de forma cruzada con dianas humanas y animales, para permitir el uso de modelos animales.

La invención se describe adicionalmente a continuación con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Materiales y Métodos

Síntesis de péptidos

La síntesis de péptidos se basó en la química de Fmoc, usando un sintetizador de péptidos Symphony fabricado por Peptide Instruments y un sintetizador Syro II de MultiSyn Tech. Se emplearon Fmoc-aminoácidos estándar (Sigma, Merck), con grupos protectores de cadena lateral apropiados: cuando correspondía, se usaron condiciones de acoplamiento estándar en cada caso, seguido de desprotección usando metodología estándar. Los péptidos se purificaron mediante HPLC y, tras el aislamiento, se modificaron con 1,3,5-triacriloilhexahidro-1,3,5-triazina (TATA, Sigma). Para esto, el péptido lineal se diluyó con 50:50 MeCN:H²O hasta ~35 ml, se añadieron ~500 pl de TATA 100 mM en acetonitrilo y la reacción se inició con 5 ml de NH⁴HCO³ 1 M en H²O. Se dejó proseguir la reacción durante 30-60 min a TA y se liofilizó una vez completada la reacción (considerado por MALDI). Una vez completada, se añadió 1 ml de monohidrato de clorhidrato de L-cisteína 1 M (Sigma) en H²O a la reacción durante -60 min a TA para extinguir cualquier exceso de TATA.

Después de la liofilización, el péptido modificado se purificó como anteriormente, reemplazando la columna Luna C8 por una Gemini C18 (Phenomenex) y cambiando el ácido a ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones puras que contenían el material correcto modificado con TMB se agruparon, se liofilizaron y se mantuvieron a -20 °C para su almacenamiento.

Todos los aminoácidos, a menos que se indique otra cosa, se usaron en las configuraciones-L.

En algunos casos, los péptidos se convierten en disulfuros activados antes del acoplamiento con el grupo tiol libre de una toxina utilizando el siguiente método; se añadió una disolución de 4-metil (succinimidil 4- (2-piridiltio)pentanoato) (100 mM) en DMSO seco (1,25 equiv. mol) a una disolución de péptido (20 mM) en DMSO seco (1 equiv. mol). La reacción se mezcló bien y se añadió DIPEA (20 equiv. mol). La reacción se monitorizó por LC/m S hasta que se cocmpletó.

Abreviaturas

Aad Ácido 2-aminoadípico

Abu Ácido 2-Aminobutyric

Ac5c Ácido aminociclopentanocarboxílico

Ahp Ácido aminoheptanoico

Aib Ácido aminoisobutírico

Me-Ala metil alanina

NMe-Ala N-metil alanina

TBuAla t-butil-alanina

Api Ácido aminopimélico

Aze Azetidina

4,4-BPA 4,4'-Bifenilalanina

CF3G Trifluorometil-alanina

Cha 3-ciclohexilalanina

Chg L-ciclohexil glicina

Cit citrulina

H-Cys Homocisteína

Dap ácido diaminopimélico

FI Fluoresceína

NMeGlu ácido N-metil glutámico

HGIn homoglutamina

HyP Hidroxiprolina

Hleu homoleucina

Nle norleucina

Nal naftilalanina

NMelle N-metil-isoleucina

Oic ácido octahidroindolcarboxílico

Oxa Ácido oxazolidina-4-carboxílico

Pal piridilalanina

Pen penicilamina

pCaPhe para-carbamoil-fenilalanina

pCoPhe para-carboxi-fenilalanina

Phg fenilglicina

HPhe homofenilalanina

FPhe fluorofenilalanina

MePhe metil fenilalanina

MeOPhe metoxi fenilalanina

tBuPhe t-butil fenilalanina

NO2Phe nitro fenilalanina

BrPhe bromo fenilalanina

Pip ácido pipecólico

5,5-dmP 5,5-Dimetil-L-Prolina

Sar Sarcosina

HSe (me) Homoserina (Me)

TetraZ tetrazol alanina

NMeTyr N-metil tirosina

DATOS BIOLÓGICOS

1. Ensayo de unión directa a CD137

La afinidad de los péptidos de la invención por CD137 humano (Ki) se determinó utilizando un ensayo de polarización de fluorescencia, de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 2016/067035 . Los péptidos de la invención se marcaron con una etiqueta fluorescente (fluoresceína, FI) y se diluyeron a 2,5 nM en HEPES 50 mM con NaCl 100 mM y tween al 0,05%, pH 7,5. La proteína CD137 se tituló a partir de 3 pM en el mismo tampón de ensayo que el péptido para ensayar el péptido 1 nM en un volumen total de 25 pL en placas de 384 pocillos de bajo volumen y paredes y fondo negros. El ensayo normalmente se configuró añadiendo 5 pL de tampón de ensayo, 10 pL de proteína CD137 y después 10 pL de péptido fluorescente. Las concentraciones de proteína CD137 fueron diluciones en serie de 1 en 2 para dar 12 concentraciones diferentes a partir de 3 pM. Las mediciones se realizaron en un BMG PHERAstar FS equipado con un módulo óptico FP 485 520 520 a 25 °C con 200 destellos por pozo y un retraso de posicionamiento de 0,1 segundos. Alternativamente, las mediciones se realizaron utilizando Envision (PerkinElmer) equipado con espejo FITC FP Dual Enh, configurado en 30 destellos. Cada pocillo se midió cada 5 minutos durante 60 minutos. La ganancia utilizada para el análisis se determinó para cada trazador al final de los 60 minutos en los que no había proteína en el pocillo. Los mP se ajustaron a un modelo vinculante 1:1 estándar con una ecuación cuadrática para generar un valor Kd. Los péptidos seleccionados de la invención se probaron en el ensayo mencionado anteriormente y los resultados se muestran en las Tablas 1 a 3:

Tabla 1: Resultados de unión directa con péptidos seleccionados

Tabla 2: Resultados del escaneo de alanina

T l : R l ni n ir n i l i n

2. Experimentos CD137 Biacore

(a) Descripción del ensayo de diana CD137 acoplada a amina

Se realizaron experimentos Biacore para determinar los valores de ka (M-1s-1 ), kd (s-1), K^d (nM) de los péptidos que se unen a la proteína CD137 humana (AcroBiosystems). La proteína CD137 se diluyó e inmovilizó utilizando el procedimiento de acoplamiento de amina estándar para chip CM5 (#BR-1005-30). La proteína CD137 se diluyó a 10 ug/ml en NaAc pH 5,5 y se usó para el acoplamiento. Después se inyectó etanolamina para desactivar los ésteres activos restantes.

La proteína CD137 se inmovilizó a 180 RU de proteína CD137 para generar la máxima respuesta de unión teórica con un péptido de 2500 MW será de -25 RU. Se realiza una inmovilización en blanco de la celda de flujo de referencia (Fc1 o Fc3) cuando se acopla la amina, siguiendo exactamente el mismo procedimiento, pero sin inyección de proteína diana. Los péptidos se ensayaron a concentraciones iniciales de 300-450 nM y se diluyeron en series de diluciones a la mitad. La concentración de DMSO se ajustó para que permaneciera constante.

El análisis cinético de unión de péptidos se realizó de la siguiente manera a un caudal de 50 pl/min, 200 s asociación, 600 s disociación y 60 s estabilización. Los péptidos bicíclicos se ajustaron usando el 1:1 modelo Biacore T200 Software de evaluación.

Los péptidos seleccionados de la invención se probaron en el ensayo mencionado anteriormente y los resultados se muestran en la Tabla 4:

T l 4: D PR r i l i n l inv n i n

(b) Descripción del ensayo de diana de CD137 biotinilado

Se realizaron experimentos Biacore para determinar los valores de ka (M 'V ) , kD (s-1), K^d (nM) de los péptidos que se unen a la proteína CD137 humana. Homotrímero de CD137 humano recombinante (R&D Systems) se resuspendió en PBS y se biotiniló usando el reactivo EZ-Link™Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Thermo Fisher) según el protocolo sugerido por el fabricante. La proteína se desalinizó para eliminar la biotina desacoplada utilizando columnas giratorias en PBS.

Para el análisis del enlace de péptidos, se utilizó un instrumento Biacore T200 utilizando un chip XanTec CMD500D. La estreptavidina se inmovilizó en el chip utilizando química de acoplamiento de amina estándar a 25 °C con HBS-N (HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4) como tampón de ejecución. Brevemente, la superficie de carboximetil dextrano se activó con una inyección de 7 min de una proporción 1:1 de hidrocloruro de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida 0,4 M (EDC)/W-hidroxisuccinimida 0,1 M (NHS) a un caudal de 10 pl/min. Para la captura de estreptavidina, la proteína se diluyó a 0,2 mg/ml en acetato de sodio 10 mM (pH 4,5) y capturado inyectando 120 |jl en la superficie del chip activado. Los grupos activados residuales se bloquearon con una inyección de 7 min de etanolamina 1 M (pH 8,5) y CD137 biotinilado capturado a un nivel de 800-1800 RU. El tampón se cambió a PBS/0,05% Tween 20 y se preparó una serie de diluciones de los péptidos en este tampón con una concentración final de DMSO de 0,5%. La concentración de péptido superior fue 500 nM o 10 jM con 6 diluciones adicionales de 3 veces (500 nm) o 2 veces (10 jM ) en PBS/0,05% Tween 20. El análisis SPR se realizó a 25°C a un caudal de 90jl/min con 60 segundos de asociación y 100-600 segundos de disociación. Después de cada ciclo, se empleó un paso de regeneración (10 j l de glicina 10 mM, pH 2) Los datos se corrigieron para los efectos de volumen excluidos del DMSO. Todos los datos fueron doblemente referenciados para inyecciones en blanco y superficie de referencia usando procedimientos de procesamiento estándar y el procesamiento de datos y el ajuste cinético se realizaron usando el programa infomático Scrubber, versión 2.0c (programa informático BioLogic). Los datos se ajustaron utilizando un modelo de transporte masivo que permitía efectos de transporte masivo cuando correspondía.

Los péptidos seleccionados de la invención se probaron en el ensayo mencionado anteriormente y los resultados se muestran en la Tabla 5:

T l : D PR r i l i n l inv n i n

. Actividad de las células CD137 La actividad biológica de los péptidos específicos de CD137 se probó utilizando el kit de ensayo de indicador de luciferasa CD137 celular (Promega). Las células en este kit comercialmente disponible expresan luciferasa que se activa aguas abajo de CD137. Este ensayo se puede utilizar para evaluar el agonismo (ejemplificado por el ligando CD137, CD137L) y el antagonismo (ejemplificado por el péptido bicíclico 74-01-04-N002).

El ensayo de actividad celular Promega CD137 utiliza la luminiscencia de luciferasa NF-^kB como una lectura de la activación de CD137 en células Jurkat. Brevemente, los experimentos se realizaron preparando medio descongelando FBS y añadiendo 1% FBS a RPMI-1640 (kit Promega CS196005). Diluir los agonistas a la concentración que da agonismo CD137L (R & D systems 2295-4L/CF) diluido a 100 nM en medio RPMI-1640 como concentración final en el ensayo. Diluir y después titular el péptido bicíclico en una placa estéril de 96 pocillos. La concentración de partida sugerida para el péptido bicíclico es 10 jM , un exceso de 100 veces sobre el agonista CD137L. Preparar suficiente reactivo para muestras duplicadas y después realizar serie de dilución 1/3. Incluir el control positivo CD137L y el péptido bicíclico solo. Descongelar las células Jurkat CD137 en el baño de agua y después añadir 500 j l de células a 9,5 ml precalentados de medio 1% FBS RPMI-1640. Añadir 50 j l células/pocillo a la placa de cultivo de glóbulos blancos. Añadir 12,5 j l de péptido bicíclico (a una concentración final de 6x) a las células. Después añadir 12,5 j l de agonista (a una concentración final de 6x) como muestras duplicadas o 1% FBS RPMI-1640 solo como control de fondo.

Co-incubar las células junto con el agonista de CD137L y el péptido bicíclico durante 6 h a 37 °C, 5% CO² Después de 6 horas, descongelar Bio-Glo™ y desarrollar el ensayo a temperatura ambiente. Añadir 75 j l de Bio-Glo™ por pocillo e incubar de 5-10 min. Leer la señal de luminiscencia en los modelos LUM plus de lectores de placas Pherastar, ganar 3600 utilizando el software MARS. Analizar los datos calculando el porcentaje de inhibición en comparación con CD137L solo. Transformar los datos a x=log (X), después graficar el registro (inhibidor) frente a la pendiente de la variable de respuesta (4 parámetros) para calcular el valor de IC⁵⁰.

Se utilizó el ensayo de indicador de células CD137 de Promega (número de producto CS196008) para determinar el efecto antagónico del péptido BCY592 (74-01-04-N002; SEQ ID NO: 189) en la inhibición de la inducción del ligando natural CD137L. Las células del ensayo CD137 se coincubaron con CD137L trimérico (R&D Systems) péptido BCY592. La actividad indicadora de CD137 se determinó como actividad de luciferasa impulsada por el promotor NF-kB. El efecto del péptido BCY592 se representó como % de inhibición relativa a la actividad de CD137L de referencia en el ensayo y se usó para determinar el valor IC50.

Los resultados se muestran en la Figura 1 donde se puede observar que el péptido bicíclico BCY592 específico para CD137 puede actuar como un antagonista que inhibe la actividad de CD137L. Este resultado indica que este péptido se puede usar en entornos en los que es deseable bloquear la actividad biológica de CD137. Se conoce que la actividad de CD137 puede causar daño hepático debido a la inflamación provocada por las células inmunitarias locales. Por lo tanto, se cree que el péptido bicíclico BCY592 (y por inferencia otros péptidos bicíclicos de CD137 de la invención) puede reducir la inflamación provocada por CD137-CD137L, lo que reduciría la hepatotoxicidad de los agonistas de CD137.

4. Ensayo de enlace de competencia de polarización de fluorescencia

El sitio de unión del péptido Bicycle específico de hCD137 se determinó mediante un experimento de competencia entre un péptido de unión a CD137 marcado con fluorescencia y el ligando natural CD137L, anticuerpos agonistas Urelumab y Utomilumab. El anticuerpo de urelumab se une a un sitio de unión distinto, mientras que CD137L y Utomilumab se unen al sitio denominado sitio de unión al ligando.

Los agonistas competidores CD137L (sistemas R&D), urelumab y utomilumab se diluyeron en tampón de ensayo HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, P20 al 0,05 %, pH 7,5 hasta una concentración máxima de 500-1000 nM. La proteína CD137 humana (AcroBiosystems) se diluyó a una concentración final de 500 nM en el ensayo. Finalmente, se añadió el péptido marcador fluorescente BCY640 (74-01-04-N001) a 1 nM. El ensayo normalmente se configuró añadiendo 5 jL de tampón de ensayo, 10 jL de proteína CD137 y después 10 jL de péptido fluorescente. El volumen total de 25 j l se preparó en placas de 384 pocillos de bajo volumen y paredes y fondo negros de baja unión. Las mediciones se realizaron en un BMG PHERAstar FS equipado con un módulo óptico FP 485520520 a 25 °C con 200 destellos por pozo y un retraso de posicionamiento de 0,1 segundos. Cada pocillo se midió cada 5 minutos durante 60 minutos. La ganancia se fijó en un pocillo que contenía trazador sin proteína diana. Los valores de mP al final de la lectura de 60 minutos se representaron frente a la concentración de los agonistas. La reducción de los valores de mP indica competición entre el agonista conocido y el péptido trazador.

Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3, donde se puede ver que el biciclo (BCY640) de unión a CD137 se une al epítopo fisiológicamente relevante que se comparte tanto con el ligando natural de CD137 (CD137L) y el anticuerpo CD137 (Utomilumab).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un ligando peptídico específico para CD137 que comprende un polipéptido que comprende al menos tres grupos reactivos, separados por al menos dos secuencias de bucle, y un armazón molecular que forma enlaces covalentes con los grupos reactivos del polipéptido tal que al menos dos bucles polipeptídicos se forman en el armazón molecular, caracterizado por que el ligando peptídico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados de:

CiIEPGPFCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 19);

Ci-I-E-E-G-Q-Y-Cii-Xi-X2-D-Xa-Y/Q/M-X4-Ciii (SEQ ID NO: 20);

Ci-D-I-G-P-P-Y-Cii-Y-R/A-D-M/P-Y-M-Ciii (SEQ ID NO: 21);

Ci-D-E-W-G-L-F/Y-Cii-I/F-P/A-H-S/P-D-Ciii (SEQ ID NO: 22);

CiIEEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 23);

CiIKEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 24);

CiIEKGQYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 25);

CiIEE(D-K)QYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 26);

CiIEEGKYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 27);

CiIEEGQYCiiKADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 28);

CiIEEGQYCiiFADKY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 29);

CiIEEGQYCiiFADPYKCiii (SEQ ID NO: 30);

Ci-I/L/M/V-E/O/P/S-P/E/A-G-P/Q-Y/F-Cii-Y-A-O-P-Y/M-M/L/Y-Ciii (SEQ ID NO: 41); y

Ci-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Cii-X11 -X12-D-X13-X14-X15-Ciii (SEQ ID NO: 266); en donde Ci, Cii y Ciii representa los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente;

X¹-X⁴ representa cualquier residuo de aminoácido;

X⁵ representa Ile, tBuAla o Chg;

X6 representa Glu, Pro, Asp, Lys, Aad, HyP o Oxa;

X⁷ representa Glu, Lys o Aad;

X8 representa Gly, D-Lys, D-Ala, L-Ala, D-Phe, D-Glu, D-Gln, D-Leu, D-Ser o D-Trp;

X⁹ representa Gln, Lys, Ala, Pro, 5,5-dmP, Oic, Oxa, HyP, Aib o Ac5c;

X¹⁰ representa Tyr, Phe, 3MePhe, 4MePhe, 4FPhe, 2Nal, 4MeOPhe o 4,4-BPA;

X¹¹ representa Phe, Lys, 4MePhe, 2FPhe, 4FPhe, 4Pal, 4,4-BPA, 4tBuPhe, NO2Phe o 4BrPhe; X¹² representa Ala o Lys;

X¹³ representa Pro o Lys;

X¹⁴ representa Tyr o Lys; y

X¹⁵ representa Met, Lys, Nle, HLeu o Ahp, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

Ci-I-E-E-G-Q-Y-Cii-Xi-X2-D-X3-Y/Q/M-X4-Ciii (SEQ ID NO: 20);

Ci-D-I-G-P-P-Y-Cii-Y-R/A-D-M/P-Y-M-Ciii (SEQ ID NO: 21); y

CiIEPGPFCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 19);

en donde X ¹-X⁴ representan cualquier residuo de aminoácido y en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente, o una de las sales farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que es:

Ci-D-E-W-G-L-FN-Cii-I/F-P/A-H-S/P-D-Ciii (SEQ ID NO: 22);

en donde X ¹-X⁴ representan cualquier residuo de aminoácido y en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, tal que en donde el ligando peptídico de Ci-D-E-W-G-L-FN-Cii-I/F-P/A-H-S/P-D-Ciii (SEQ ID NO: 22) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

CiDEWGLFCiiIPHSDCiii (SEQ ID NO: 17); y

CiDEWGLYCiiFAHPDCiii (SEQ ID NO: 18),

en particular:

una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

Ac-A-(SEQ ID NO: 17)-A (referido en el presente documento como 74-02-00-N004); y

A-(SEQ ID NO: 18)-A (referido en el presente documento como 74-02-01-N001).

4. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el ligando peptídico de Ci-I-E-E-G-Q-Y-Cii-X1-X2-D-X3-Y/Q-X4-Ciii (SEQ ID NO: 20) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de SEQ ID NOS: 1-14:

CiIEEGQYCiiYRDMYMCiii (SEQ ID NO: 1);

CiIEEGQYCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 2);

CiIEEGQYCiiYADPYYCiii (SEQ ID NO: 3);

CiIEEGQYCiiYSDPYYCiii (SEQ ID NO: 4);

CiIEEGQYCiiFADPYMCiii (SEQ ID NO: 5);

CilEEGQYCiiYADHQLCiii (SEQ ID NO: 6);

CilEEGQYCiiHADPYYCiii (SEQ ID NO: 7);

CilEEGQYCiiHADPYFCiii (SEQ ID NO: 8);

CíIEEGQYCnYADHYMCín (SEQ ID NO: 9);

CilEEGQYCiiYADPYLCiii (SEQ ID NO: 10);

CiIEEGQYCiiYSOPYLCiii (SEQ ID NO: 11);

CiIEEGQYCiiFADPYLCiii (SEQ ID NO: 12);

CiIEEGQYCiiHADPYMCiii (SEQ ID NO: 13); y

CíIEEGQYCnHADPQMCín (SEQ ID NO: 14),

tal que:

una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

A-(SEQ ID NO: 1)-A (referido en el presente documento como 74-01-00-N004);

A-(SEQ ID NO: 2)-A (referido en el presente documento como 74-01-01-N001);

A-(SEQ ID NO: 3)-A (referido en el presente documento como 74-01-02-N001);

A-(SEQ ID NO: 4)-A (referido en el presente documento como 74-01-03-N001);

A-(^s EQ ID NO: 5)-A (referido en el presente documento como 74-01-04-N001);

A-(SEQ ID NO: 6)-A (referido en el presente documento como 74-01-05-N001);

A-(SEQ ID NO: 7)-A (referido en el presente documento como 74-01-06-N001);

A-(SEQ ID NO: 8)-A (referido en el presente documento como 74-01-07-N001);

A-(SEQ ID NO: 9)-A (referido en el presente documento como 74-01-08-N001);

A-(SEQ ID NO: 10)-A (referido en el presente documento como 74-01-09-N001);

A-(SEQ ID NO: 10)-^s V^g (referido en adelante denominado como 74-01-09-T03-N002);

A-(SEQ ID NO: 11)-A (referido en el presente documento como 74-01-10-N001);

A-(SEQ ID NO: 12)-A (referido en el presente documento como 74-01-11-N001);

A-(s EQ ID NO: 13)-A (referido en el presente documento como 74-01-13-N001); y

A-(SEQ ID NO: 14)-A (referido en el presente documento como 74-01-14-N001);

5. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el ligando peptídico Ci-D-I-G-P-P-Y-Cii-Y-R/A-D-M/P-Y-M-Ciii (SEQ ID NO: 21) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

CiDIGPPYCiiYRDMYMCiii (SEQ ID NO: 15); y

CiDIGPPYCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 16),

tal que:

una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

A-(SEQ ID NO: 15)-A (referido en el presente documento como 74-01-16-N001); y

A-(SEQ ID NO: 16)-A (referido en el presente documento como 74-01-17-N001).

6. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el ligando peptídico de CiIEPGPFCiiYADPYMCiii (SEQ ID NO: 19) comprende una secuencia de aminoácidos de:

A-(SEQ ID NO: 19)-NRV (referido en el presente documento como 74-19-00-T01-N002), en donde Ci, Cu y Ciii representan el primero, el segundo y el tercer residuos de cisteína, respectivamente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

7. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1, que comprende modificaciones N y C terminales y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

A-CiIEEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 31; BCY3814);

Ac-A-CiIEEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii-Dap (SEQ ID NO: 32; BCY7732);

Ac-A-CilKEGQYCiiFADPY(Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 33; BCY7733);

Ac-A-CiIEKGQYCiiFADPY(Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 34; BCY7734);

Ac-A-CiIEE(D-K)QYCiiFADPY(Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 35; BCY7735);

Ac-A-CiIEEGKYCiiFADPY(Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 36; BCY7736);

Ac-A-CiIEEGQYCiiKADPY(Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 37; BCY7737);

Ac-A-CiIEEGQYCiiFADKY(Nle)Ciii-A (SEQ ID NO: 38; BCY7738); y

Ac-A-CiIEEGQYCiiFADPYKCiii-A (SEQ ID NO: 39; BCY7739), o

que comprende una secuencia de aminoácidos que es:

CiLPPGQYCiiFPDLLLCiii (SEQ ID NO: 40; 74-22-00)

en donde Ci, Cii y Ciii representan los primero, segundo y tercero residuos de cisteína, respectivamente, Ac representa un grupo acetilo N-terminal y Dap representa ácido diaminopropiónico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

Tabla 1:

Tabla 3:

Tabla 4:

Tabla 5:

9. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1, en donde el ligando peptídico de SEQ ID NO: 266 se selecciona de las secuencias Ci a Cmí de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de adiciones N-terminal y C-terminal):

Ac-CIK(Peg12)EGQYCFADPYMC (SEQ ID NO: 52; BCY7239),

Ac-CIEK(Peg12)GQYCFADPYMC (SEQ ID NO: 53; BCY7240),

Ac-CIEEGK(Peg12)YCFADPYMC (SEQ ID NO: 55; BCY7242),

Ac-CIEEGQYCK(Peg12)ADPYMC (SEQ ID NO: 57; BCY7244),

Ac-CIEEGQYCFK(Peg12)DPYMC (SEQ ID NO: 58; BCY7245),

Ac-CIEEGQYCFADK(Peg12)YMC (SEQ ID NO: 60; BCY7247),

Ac-CIEEGQYCFADPK(Peg12)MC (SEQ ID NO: 61; BCY7248),

Ac-CIEEGQYCFADPYK(Peg12)C (SEQ ID NO: 62; BCY7249), [Ac]CIEE[dK(PEG12FI)]QYCFADPY[Nle]C (SEQ ID NO: 63; BCY7416),

[PEG3]-ACIEEGAYCFADPY(Nle)CA (SEQ ID NO: 97; BCY7287),

[PEG3]-ACIEEaQYCFADPY(Nle)CA (SEQ ID NO: 106; BCY7297),

[PEG3]-AC-Chg-EEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 117; BCY7154),

[PEG3]-ACIPEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 119; BCY7156),

[PEG3]-ACIDEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 120; BCY7157),

[PEG3]-ACI-Aad-EGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 121; BCY7158),

[PEG3]-ACIE-Aad-GQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 125; BCY7162),

[PEG3]-ACIEE-DLys-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 128; BCY7165),

[PEG3]-ACIEE-DPhe-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 129; BCY7166),

[PEG3]-ACIEE-DGlu-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 130); BCY7167),

[PEG3]-ACIEE-DGln-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 131; BCY7168),

[PEG3]-ACIEE-DLeu-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 132; BCY7169),

[PEG3]-ACIEE-DSer-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 133; BCY7170),

[PEG3]-ACIEEGPYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 136; BCY7174),

[PEG3]-ACIEEGQFCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 137; BCY7175),

[PEG3]-ACIEEGQ-3MeF-CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 139; BCY7177),

[PEG3]-ACIEEGQ-4MeF-CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 140; BCY7178),

[PEG3]-ACIEEGQ-4FF-CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 141; BCY7179),

[PEG3]-ACIEEGQYC-4MeF-ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 145; BCY7183),

[PEG3]-ACIEEGQYC-4FF-ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 147; BCY7185), [PEG3]AC[tBuAla]EEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 156; BCY7195), [PEG3]ACIEEGQYC[2FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 159; BCY7198), [PEG3]ACIEEGQYCFADPY[HLeu]CA (SEQ ID NO: 170; BCY7211),

[PEG3]-ACIEEGQYCFADPY[Ahp]CA (SEQ ID NO: 188; BCY7311), [PEG3]ACIPE[dF]QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 195; BCY7768), [PEG3]ACIPE[dF]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 196; BCY7770), [PEG3]ACIEE[dF]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 197; BCY7772), PEG3]ACIPEGPYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 198; BCY7773), PEG3]AC[tBuAla]PE[dF]P[4MePhe]C[4FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 199; BCY7774), [PEG3]AC[tBuAla]PE[dF]Q[4MePhe]C[4FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 200; BCY7775), [PEG3]AC[tBuAla]EE[dF]P[4MePhe]C[4FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 201; BCY7776), [PEG3]ACI[HyP]EGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 203; BCY7796), [PEG3]ACIEE[dW]QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 204; BCY7798), PEG3]ACIEEGQ[2Nal]CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 207; BCY7801), PEG3]ACIEEGQ[4MeoPhe]CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 208; BCY7802), [Ac]ACIEEGQ[44BPA]CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 223; BCY7936), [Ac]ACIEEGQYC[4Pal]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 227; BCY7941), [Ac]ACIEEGQYC[44BPA]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 228; BCY7942), Ac]ACIEEGQYC[4tBuPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 230; BCY7944), [Ac]ACIEEG[55DMP]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 232; BCY7950), [Ac]ACIEEG[Oic]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 234; BCY7954), [Ac]ACI[Oxa]EGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 238; BCY7958),

[Ac]ACIEEG[Oxa]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 239; BCY7959), [Ac]ACIPEGPYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 240; BCY7960), [Ac]ACIEEG[HyP]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 241; BCY7952), [Ac]ACIPE[dA]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 242; BCY7961), [Ac]AC[tBuAla]EEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 245; BCY8656), [Ac]ACIPEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 248; BCY8659), [Ac]ACIEE[dF]QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 252; BCY8663), [Ac]ACIEEG[Aib]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 256; BCY8668), [Ac]ACIEEG[AC5C]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 257; BCY8669), [Ac]ACIEEGQYC[NO2Phe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 261; BCY8674), [Ac]ACIEEGQYC[4BrPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 262; BCY8675), [Ac]ACIEEGQYCFADPYMCA (SEQ ID NO: 265; BCY9273),

ACIEEGQYCFADPY(Nle)CA (SEQ ID NO: 31; BCY3814),

[Ac]CIEEGQYCFADPY[Nle]C[Dap] (SEQ ID NO: 194; BCY7527) y [Ac]AC[tBuAla]PE[dA]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 243; BCY7965); o

las secuencias completas de los siguientes péptidos (es decir, incluyendo todas las adiciones N-terminal y C-terminal):

Ac-CIK(Peg12)EGQYCFADPYMC (SEQ ID NO: 52; BCY7239),

Ac-CIEK(Peg12)GQYCFADPYMC (SEQ ID NO: 53; BCY7240),

Ac-CIEEGK(Peg12)YCFADPYMC (SEQ ID NO: 55; BCY7242),

Ac-CIEEGQYCK(Peg12)ADPYMC (SEQ ID NO: 57; BCY7244),

Ac-CIEEGQYCFK(Peg12)DPYMC (SEQ ID NO: 58; BCY7245),

Ac-CIEEGQYCFADK(Peg12)YMC (SEQ ID NO: 60; BCY7247),

Ac-CIEEGQYCFADPK(Peg12)MC (SEQ ID NO: 61; BCY7248),

Ac-CIEEGQYCFADPYK(Peg12)C (SEQ ID NO: 62; BCY7249), [Ac]CIEE[dK(PEG12FI)]QYCFADPY[Nle]C (SEQ ID NO: 63; BCY7416),

[PEG3]-ACIEEGAYCFADPY(Nle)CA (SEQ ID NO: 97; BCY7287),

[PEG3]-ACIEEaQYCFADPY(Nle)CA (SEQ ID NO: 106; BCY7297),

[PEG3]-AC-Chg-EEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 117; BCY7154),

[PEG3]-ACIPEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 119; BCY7156),

[PEG3]-ACIDEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 120; BCY7157),

[PEG3]-ACI-Aad-EGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 121; BCY7158),

[PEG3]-ACIE-Aad-GQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 125; BCY7162),

[PEG3]-ACIEE-DLys-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 128; BCY7165),

[PEG3]-ACIEE-DPhe-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 129; BCY7166),

[PEG3]-ACIEE-DGlu-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 130; BCY7167),

[PEG3]-ACIEE-DGln-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 131; BCY7168),

[PEG3]-ACIEE-DLeu-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 132; BCY7169),

[PEG3]-ACIEE-DSer-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 133; BCY7170),

[PEG3]-ACIEEGPYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 136; BCY7174),

[PEG3]-ACIEEGQFCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 137; BCY7175),

[PEG3]-ACIEEGQ-3MeF-CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 139; BCY7177),

[PEG3]-ACIEEGQ-4MeF-CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 140; BCY7178),

[PEG3]-ACIEEGQ-4FF-CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 141; BCY7179),

[PEG3]-ACIEEGQYC-4MeF-ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 145; BCY7183),

[PEG3]-ACIEEGQYC-4FF-ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 147; BCY7185), [PEG3]AC[tBuAla]EEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 156; BCY7195), [PEG3]ACIEEGQYC[2FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 159; BCY7198), [PEG3]ACIEEGQYCFADPY[HLeu]CA (SEQ ID NO: 170; BCY7211),

[PEG3]-ACIEEGQYCFADPY[Ahp]CA (SEQ ID NO: 188; BCY7311), [PEG3]ACIPE[dF]QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 195; BCY7768), [PEG3]ACIPE[dF]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 196; BCY7770), [PEG3]ACIEE[dF]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 197; BCY7772), PEG3]ACIPEGPYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 198; BCY7773), PEG3]AC[tBuAla]PE[dF]P[4MePhe]C[4FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 199; BCY7774), [PEG3]AC[tBuAla]PE[dF]Q[4MePhe]C[4FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 200; BCY7775), [PEG3]AC[tBuAla]EE[dF]P[4MePhe]C[4FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 201; BCY7776), [PEG3]ACI[HyP]EGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 203; BCY7796), [PEG3]ACIEE[dW]QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 204; BCY7798), PEG3]ACIEEGQ[2Nal]CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 207; BCY7801), PEG3]ACIEEGQ[4MeoPhe]CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 208; BCY7802), [Ac]ACIEEGQ[44BPA]CFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 223; BCY7936), [Ac]ACIEEGQYC[4Pal]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 227; BCY7941), [Ac]ACIEEGQYC[44BPA]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 228; BCY7942), Ac]ACIEEGQYC[4tBuPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 230; BCY7944), [Ac]ACIEEG[55DMP]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 232; BCY7950),

[Ac]ACIEEG[Oic]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 234; BCY7954), [Ac]ACI[Oxa]EGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 238; BCY7958), [Ac]ACIEEG[Oxa]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 239; BCY7959), [Ac]ACIPEGPYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 240; BCY7960), [Ac]ACIEEG[HyP]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 241; BCY7952), [Ac]ACIPE[dA]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 242; BCY7961), [Ac]AC[tBuAla]EEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 245; BCY8656), [Ac]ACIPEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 248; BCY8659), [Ac]ACIEE[dF]QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 252; BCY8663), [Ac]ACIEEG[Aib]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 256; BCY8668), [Ac]ACIEEG[AC5C]YCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 257; BCY8669), [Ac]ACIEEGQYC[NO2Phe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 261; BCY8674), [Ac]ACIEEGQYC[4BrPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 262; BCY8675), [Ac]ACIEEGQYCFADPYMCA (SEQ ID NO: 265; BCY9273),

ACIEEGQYCFADPY(Nle)CA (SEQ ID NO: 31; BCY3814),

[Ac]CIEEGQYCFADPY[Nle]C[Dap] (SEQ ID NO: 194; BCY7527) y [Ac]AC[tBuAla]PE[dA]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 243; BCY7965).

10. El ligando peptídico como se define en la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

Ci-X5-X6-X7-Xs-X9-X10-CirXii-A-D-P-Y-X15-Ciii (SEQ ID NO: 267);

Ci, Cii y Ciii representan los primero, el segundo y el tercer residuos de cisteína, respectivamente; X⁵ representa Ile o tBuAla;

X6 representa Lys, Glu o Pro;

X⁷ representa Glu o D-Lys;

X8 representa Gly, D-Lys, D-Phe o D-Ala;

X⁹ representa Gln, Lys o Pro;

X¹⁰ representa Tyr o 4MePhe;

X¹¹ representa Phe o 4FPhe; y

X¹⁵ representa Met o Nle,

tal en donde el ligando peptídico de SEQ ID NO: 267 se selecciona de las secuencias Ci a Ciii de los siguientes péptidos (es decir, en ausencia de adiciones N-terminal y C-terminal):

Ac-CIK(Peg12)EGQYCFADPYMC (SEQ ID NO: 52; BCY7239),

Ac-CIEK(Peg12)GQYCFADPYMC (SEQ ID NO: 53; BCY7240),

Ac-CIEEGK(Peg12)YCFADPYMC (SEQ ID NO: 55; BCY7242), [Ac]CIEE[dK(PEG12FI)]QYCFADPY[Nle]C (SEQ ID NO: 63; BCY7416),

[PEG3]-ACIPEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 119; BCY7156),

[PEG3]-ACIEE-DPhe-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 129; BCY7166),

[PEG3]-ACIEEGPYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 136; BCY7174), PEG3]AC[tBuAla]PE[dF]P[4MePhe]C[4FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 199; BCY7774), [Ac]ACIEEGQYCFADPYMCA (SEQ ID NO: 265; BCY9273),

ACIEEGQYCFADPY(Nle)CA (SEQ ID NO: 31; BCY3814),

[Ac]CIEEGQYCFADPY[Nle]C[Dap] (SEQ ID NO: 194; BCY7527) y [Ac]AC[tBuAla]PE[dA]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 243; BCY7965); o

las secuencias completas de los siguientes péptidos (es decir, incluyendo todas las adiciones N-terminal y C-terminal):

Ac-CIK(Peg12)EGQYCFADPYMC (SEQ ID NO: 52; BCY7239),

Ac-CIEK(Peg12)GQYCFADPYMC (SEQ ID NO: 53; BCY7240),

Ac-CIEEGK(Peg12)YCFADPYMC (SEQ ID NO: 55; BCY7242), [Ac]CIEE[dK(PEG12FI)]QYCFADPY[Nle]C (SEQ ID NO: 63; BCY7416),

[PEG3]-ACIPEGQYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 119; BCY7156),

[PEG3]-ACIEE-DPhe-QYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 129; BCY7166),

[PEG3]-ACIEEGPYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 136; BCY7174), PEG3]AC[tBuAla]PE[dF]P[4MePhe]C[4FPhe]ADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 199; BCY7774), [Ac]ACIEEGQYCFADPYMCA (SEQ ID NO: 265; BCY9273),

ACIEEGQYCFADPY(Nle)CA (SEQ ID NO: 31; BCY3814),

[Ac]CIEEGQYCFADPY[Nle]C[Dap] (SEQ ID NO: 194; BCY7527) y [Ac]AC[tBuAla]PE[dA]PYCFADPY[Nle]CA (SEQ ID NO: 243; BCY7965).

11. El ligando peptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el armazón molecular se selecciona de 1,1',1"-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA), y opcionalmente en donde la sal farmacéuticamente aceptable se selecciona del ácido libre o la sal de sodio, potasio, calcio, amonio.

12. El ligando peptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el CD137 es CD137 humano.

13. Un fármaco conjugado que comprende un ligando peptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, conjugado con uno o más grupos efectores y/o funcionales, o conjugados con uno más agentes citotóxicos.

14. Una composición farmacéutica que comprende el ligando peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o el conjugado de fármaco como se define en la reivindicación 13, en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

15. El ligando peptídico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o el conjugado de fármaco como se define en la reivindicación 13, para uso en la prevención, supresión o tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por CD137.