CN114933638A - 特异性靶向cd28的多元环肽配体框架 - Google Patents
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Abstract
特异性靶向CD28的多元环肽配体框架,涉及生物医药技术领域。该多元环肽配体框架由两个CPPC基序、确定的氨基酸(X1)‑(X11)以及部分随机氨基酸组成;多元环肽配体框架为:CPPCXXXXX(X11)XXXPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC。通过骨架设计、噬菌体展示骨架进行定向引导多元环肽进化,获得能与CD28高亲合力结合的一系列富含二硫键的多元环肽配体/配体框架,其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1~57所示,所述配体肽可在制备预防、抑制或治疗由CD28介导的相关疾病的药物中应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其是涉及基于噬菌体展示技术获得对CD28具有高亲合力的特异性靶向CD28的多元环肽配体框架。
背景技术
CD28是一种广泛分布于T细胞表面的共刺激受体,在调节T细胞的增殖和分化、体内的免疫反应途径中发挥重要作用。当T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞上的抗原肽-主要组织相容性复合物(MHC)结合时,就会产生T细胞激活信号(这种初始触发被称为“第一信号”),这种结合亲合力通常较低。因此,在激活T细胞过程中还需要共刺激信号(第二信号)以增强T细胞活化(Jenkins MK et al.J Immunol.1988.15;140(10):3324-30.)。CD28是最重要的共刺激受体蛋白之一,它通过与其天然配体B7(CD80或CD86)结合促进T细胞活化增强。CD28的缺失不仅是T细胞衰老的一个特征,也是人类免疫系统老化的重要生物指标(Abbe N Vallejo et al.2005.Immunol Rev.205(1):158-69)。
由CD28/B7介导的共刺激信号在引起异体抗原反应的免疫应答中起关键作用。阻断CD28/B7信号通路抑制T细胞活化,可以延缓或者减少异体移植排斥反应,进而诱导免疫耐受(Sijing Xia et al.2020.Curr Drug Targets.21(6):589-598.)。同时,自身免疫性疾病的发生也与B7/CD28信号通路的过度活化密切相关(Guo-Chung Dong etal.2009.Pharm Res.26(2):375-81.)。因此,CD28不仅是人类免疫反应的关键调节剂,也是自身免疫疾病和癌症免疫治疗干预的重要目标(Lieping Chen et al.2013.Nat RevImmunol.13(4):227-42.)。但目前大量的研究仍致力于以CD28作为靶点来设计抗体。然而,抗体作为大分子药物有一定局限性(给药方式、生产经费等问题)。多肽类药物分子能够弥补单克隆抗体和小分子药物之间的差距。一方面与单克隆抗体相比,它们具有良好的生物相容性、高稳定性、靶标选择性和较好的组织穿透性。另一方面与小分子药物相比,它们具有更高的的选择性、可设计性的优势,在靶向蛋白-蛋白相互作用方面有很大的潜力。
富含二硫键的多肽(DRP)是自然界中广泛分布的一类独特的限制性肽,由于其分子内含有一对或者多对用于约束多肽结构的二硫键,使这些多肽具有独特的结构和功能特征(Iman Azimi et al.2011.Antioxidants&Redox Signaling.14(1):113-126.)。相比“线性肽”,“环肽”能够高亲和力和高选择性地结合靶标蛋白,同时它们还具有低毒性、易于用标记或固定试剂修饰等优势。天然存在的DRP可以通过嫁接或序列进化产生新的生物活性。然而,天然支架种类有限,阻碍针对新靶点的DRP开发。因此,需要新的方法来设计具有不同三维结构的DRP(Shuaimin Lu et al.2020.J Am Chem Soc.142(38):16285-16291.),新设计的DRP通常在稳定性和生物活性方面具有其前体支架的优点。
噬菌体展示技术自问世以来成为许多蛋白靶标发现新配体的有力工具。但是噬菌体文库最高承载的生物丰度有限,无法全覆盖天然氨基酸和序列长度的多样性,所以很难从完全随机的序列中筛选出靶标的新配体。因此,将多肽骨架的设计以及多肽二级结构的保留应用于噬菌体筛选技术是不错的解决方法。
目前,针对一些细胞表面受体已经成功地发现或改造了天然富含二硫键多元环肽药物,但还没有开发出特异性靶向CD28的多肽。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述技术问题,提供具有刚性稳定的结构,单一的氧化产物,与靶标较高的亲合力,并且合成简单方便的特异性靶向CD28的多元环肽配体框架。
所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架,由两个CPPC基序、确定的氨基酸(X1)-(X11)以及部分随机氨基酸组成;
所述多元环肽配体框架为:
CPPCXXXXX(X11)XXXPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E;(X10)为任意氨基酸,优选R;(X11)为V、L或I,优选V;G为甘氨酸;P为脯氨酸;A为丙氨酸;V为缬氨酸;L为亮氨酸;I为异亮氨酸;M为甲硫氨酸;C为半胱氨酸;F为苯丙氨酸;Y为酪氨酸;W为色氨酸;H为组氨酸;K为赖氨酸;R为精氨酸;Q为谷氨酰胺;N为天冬酰胺;E为谷氨酸;D为天冬氨酸;S为丝氨酸;T为苏氨酸。
所述多元环肽配体框架如下:
CPPCPREHELVAVPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 1)
CPPCRAWRYC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 2)
CPPCGTATEWIVQPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 3)
CPPCHRWEYC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 4)
CPPCGSVGEFYVKEC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 5)
CPPCRFMVEPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 6)
CPPCPRAGFLFVKEC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 7)
CPPCHVLVREC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 8)
CPPCRFFLRPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 9)
CPPCPRGRVWVVWAC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 10)
CPPCXXXX(X10)(X11)XXXPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 11)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E;(X10)为任意氨基酸,优选R;(X11)为V、L或I,优选V。
所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架的构建方法,包括以下步骤:
1)基于富含二硫键噬菌体文库筛选CD28靶向特异性环肽配体,构建噬菌体文库library1;
2)将步骤1)构建的噬菌体文库library 1用于CD28蛋白配体的筛选,筛选后通过基因测序得到多肽的基因序列,并通过基因翻译软件得到多肽的氨基酸序列peptide 1~10,如序列表SEQ ID No.1~10所示;
3)根据噬菌体文库library 1测序结果,通过对peptide 1~10氨基酸的优化得到框架序列sequence 1~10;
4)根据步骤2)中多肽peptide 1构建噬菌体文库library 2,用于CD28蛋白筛选,筛选后通过基因测序得到多肽的基因序列,通过基因翻译软件得到多肽的氨基酸序列peptide11~20,如序列表SEQ ID No.11~20所示;
5)根据步骤4)中多肽peptide 11构建噬菌体文库library 3用于CD28蛋白配体的筛选,筛选后通过基因测序得到多肽的基因序列,通过基因翻译软件得到多肽的氨基酸序列,如序列表SEQ ID No.23~35所示,采用序列框架优化方法,分析并优化序列框架,得到优化后的框架序列sequence 11。
在步骤1)中,所述构建噬菌体文库library 1可通过序列设计构建,噬菌体文库展示基序包括CPPC基序、随机序列以及针对CD28靶点设计的序列,由N端到C端,噬菌体文库library 1表面展示多肽序列为:
CPPC(X)5CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)6CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)7CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)8CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)9CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)10CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸,下标代表含有(X)的数量。
在步骤2)中,所述多肽的氨基酸序列peptide 1~10,是将构建好的噬菌体文库library 1针对CD28靶点进行筛选,CD28蛋白经过生物素化后固定在磁珠上,经过3轮筛选后,选取筛选后得到的噬菌体进行测序,得到多肽包含但不限于以下序列:
CPPCPREHELVAVPCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 1)
CPPCRAWRYCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 2)
CPPCGTATEWIVQPCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 3)
CPPCHRWEYCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 4)
CPPCGSVGEFYVKECDSFTNCWELLTCPPC(peptide 5)
CPPCRFMVEPCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 6)
CPPCPRAGFLFVKECDSFTNCWELLTCPPC(peptide 7)
CPPCHVLVRECDSFTNCWELLTCPPC(peptide 8)
CPPCRFFLRPCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 9)
CPPCPRGRVWVVWACDSFTNCWELLTCPPC(peptide 10)。
在步骤3)中,所述框架序列sequence 1~10如下:
CPPCPREHELVAVPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 1)
CPPCRAWRYC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 2)
CPPCGTATEWIVQPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 3)
CPPCHRWEYC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 4)
CPPCGSVGEFYVKEC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 5)
CPPCRFMVEPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 6)
CPPCPRAGFLFVKEC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 7)
CPPCHVLVREC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 8)
CPPCRFFLRPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 9)
CPPCPRGRVWVVWAC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 10)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E。
在步骤4)中,所述根噬菌体文库library 2构建方法同步骤1),噬菌体文库library 2表面展示多肽序列为SEQ ID No.42:
CPPCPREHELVAVPC(X)5C(X)5CPPC(library 2);
library 2用于CD28蛋白筛选的具体方法同步骤2)。
经过筛选测序得到多肽的氨基酸序列peptide 11~20如下:
CPPCPREHELVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 11)
CPPCPREHELVAVPCAFESNCWEIKRCPPC(peptide 12)
CPPCPREHELVAVPCPTRPNCYVVERCPPC(peptide 13)
CPPCPREHELVAVPCAERSNCWIVRKCPPC(peptide 14)
CPPCPREHELVAVPCPEFRNCYIVKRCPPC(peptide 15)
CPPCPREHELVAVPCPARLNCWNVIECPPC(peptide 16)
CPPCPREHELVAVPCSKVQNCWELVACPPC(peptide 17)
CPPCPREHELVAVPCRARLNCWRVIECPPC(peptide 18)
CPPCPREHELVAVPCVGRVNCWFIQECPPC(peptide 19)
CPPCPREHELVAVPCDFSTNCWLLETCPPC(peptide 20)
在步骤5)中,所述序列框架优化方法,是通过序列比对及保守序列分析,对序列框架进行优化,具体可包括以下步骤:
1)以peptide 11为依据构建library 3混合文库:
CPPC(X)5LVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(library 3)
CPPCPREHE(X)5CEGLNNCWFVEACPPC(library 3)
CPPCPREHELVAVPC(X)5CWFVEACPPC(library 3)
CPPCPREHELVAVPCEGLNNC(X)5CPPC(library 3)
2)通过噬菌体展示library 3,针对CD28进行多肽配体筛选;经过筛选并进行测序,得到包含但不限于:
CPPCPRRADLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 23)
CPPCAEKRGLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 24)
CPPCPRMGKLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 25)
CPPCARPGKLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 26)
CPPCTTVHRLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 27)
CPPCPRTETLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 28)
CPPCPREHELVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 11)
CPPCTSRGSLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 29)
CPPCLSKTTLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 30)
CPPCSSKQRLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 31)
CPPCPREHEVKAYPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 32)
CPPCGSARSLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 33)
CPPCATSNGLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 34)
CPPCPRAKQLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 35)
通过序列比对获得,以peptide 1为例优化序列,得到:
CPPCXXXX(X10)(X11)XXXPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 11)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E;(X10)为任意氨基酸,优选R;(X11)为V、L或I,优选V。
选取部分多肽进行合成或表达,并表征亲合力(荧光偏振实验,表面等离子共振(SPR),phage ELISA,荧光标记细胞实验)。
本发明还提供特异性靶向CD28的配体肽/多元环肽配体框架,其氨基酸序列如序列表
SEQ ID No.1~57所示,所述特异性靶向CD28的配体肽/多元环肽配体框架可在制备预防、抑制或治疗由CD28介导的相关疾病的药物中应用。
所述由CD28介导的相关疾病包括:癌症、类风湿关节炎、红斑狼疮、移植排斥等自身免疫性疾病。
所述应用,配体肽的用量范围可为50nM~5μM。
本发明应用CPPC基序的正交配对优势,通过多肽骨架设计、噬菌体展示筛选,进行定向引导多元环肽进化,获得与CD28靶标具有高亲合力的一系列富含二硫键的多元环肽配体。该多元环肽配体具有刚性稳定的结构,单一的氧化产物,与靶标较高的亲合力,并且合成简单方便,是CD28靶点良好的候选药物。富含二硫键的环肽化合物作为药物分子,对受体具有高的选择性和亲合力、代谢稳定性强、口服利用度高。
与现有技术相比,本发明具有以下突出的技术效果:
a.本发明所述多肽通过利用CPPC正交配对性质,可以实现巯基的精准配对。使其结构刚性,产物单一。
b.本发明所述多肽合成方法简单且水溶性好,可以通过固相合成或者生物表达即可实现。
c.本发明通过噬菌体筛选技术,多轮优化多肽骨架,获得与CD28蛋白具有高特异性结合的多肽框架,如peptide 11,通过荧光偏振表征亲和力,KD值为117nM。
d.本发明通过噬菌体筛选技术,获得与CD28蛋白具有高特异性结合的多肽的确定氨基酸(X1)-(X11)。
e.本发明得到的是具有相似序列的多元环肽框架(sequence 1-11),这种框架内由CPPC基序、确定的氨基酸(X1)-(X11)以及部分随机氨基酸组成。通过固定部分序列(确定的氨基酸)引导多肽向贴合靶标的方向进化方法。该多元环肽框架由于CPPC和确定氨基酸(X1)-(X11)的介导而对CD28蛋白具有很高的亲和力,有望成为CD28蛋白引起的相关疾病的治疗药物。
附图说明
图1为peptide 1、peptide 11的氧化折叠色谱图。
图2为library 1文库筛选富集最高的前50条序列。
图3为library 2文库筛选富集最高的前50条序列。
图4为peptide 11氧化型与还原型的对CD28蛋白的荧光偏振饱和曲线。其中,标记■表示氧化型,标记●表示还原型。
图5为peptide 1氧化型与peptide 11氧化型对CD28蛋白的荧光偏振竞争曲线。
图6为peptide 21表面等离子共振(SPR)曲线。
图7为peptide 22表面等离子共振(SPR)曲线。
图8为peptide 11表面等离子共振(SPR)曲线。
图9为peptide 11细胞表面表达的CD28的特异性结合实验。
图10为library 3文库中随机13条序列对CD28蛋白结合能力的ELISA测定。
图11为library 3文库筛选所得序列图。
具体实施方式
以下实施将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明通过噬菌体展示设计多肽骨架library 1,并进行3轮优化获得与CD28有高亲合力的配体肽模板。本发明是基于噬菌体展示的方法来筛选和生成针对CD28的一些环肽配体。多肽特征主要包含两个CPPC基序(专利号:202010862365.0)、固定序列(针对CD28蛋白)以及部分随机序列组成的环肽。在对CD28蛋白的亲和选择中获得高亲和力骨架。
氨基酸包括所谓的标准或规范氨基酸。20种常见α-氨基酸直接由通用遗传密码的密码子编码。它们是真核生物中发现的蛋白质α-氨基酸。这些氨基酸在本发明中以单字母代码指代:G为甘氨酸;P为脯氨酸;A为丙氨酸;V为缬氨酸;L为亮氨酸;I为异亮氨酸;M为甲硫氨酸;C为半胱氨酸;F为苯丙氨酸;Y为酪氨酸;W为色氨酸;H为组氨酸;K为赖氨酸;R为精氨酸;Q为谷氨酰胺;N为天冬酰胺;E为谷氨酸;D为天冬氨酸;S为丝氨酸;T为苏氨酸。
本发明实施例包括以下步骤:
(1)设计富含二硫键的多肽骨架的模板。
(2)噬菌体展示多肽骨架及应用。
(3)多肽模板的优化。
以下给出具体实施例:
实施例1
建立优化peptide 1模板的方法。library 1文库对CD28蛋白进行3轮筛选富集。在两个1.5mL低吸附离心管中分别加入25μL的链霉亲和素包被磁珠(或者是中性亲和素包被磁珠,用于第二轮筛选),离心管置于磁力架上,用1mL结合缓冲液清洗两次。向其中一个离心管中加入5μg(第二轮是2μg,第三轮是2μg)CD28蛋白,向另外一个离心管中加入相同体积的结合缓冲液。室温下于3D摇床上孵育20min后,用1mL结合缓冲液洗涤磁珠3次以除去未结合的靶标蛋白,随后加入500μL的封闭缓冲液,室温摇床孵育2h进行封闭。同样地,用2mL封闭缓冲液封闭噬菌体文库(library 1)(滴度≈1013pfu/mL)。封闭完成后,将噬菌体文库分成两等份,作为实验组和对照组,实验组的磁珠(加入靶标蛋白CD28)和对照组磁珠分别加入噬菌体文库中,充分混合后在3D摇床上室温孵育30min。孵育完成后去除上清液,磁珠用洗涤缓冲液洗涤9次,再用结合缓冲液洗涤2次,清洗过程中,低吸附离心管至少更换3次,以减少非特异性吸附。最后一次洗涤后,磁珠在室温下用200μL的洗脱缓冲液重悬,孵育5min后,将上清液转移到加有20μL中和缓冲液的新离心管中进行中和,后续进行噬菌体滴度测定。经过3轮筛选后,提取筛选结果噬菌体DNA进行测序并分析多肽序列富集度。测序结果如图2。
选取富集最多的序列peptide 1构建文库library 2,使用如上的筛选方法获得富集序列(测序结果如图3),富集最多的序列peptide 11用于构建library 3。使用library 3对CD28进行两轮筛选,第三轮使用peptide 11与噬菌体展示的多肽进行竞争筛选(在封闭液中加入10μg peptide 1多肽先封闭CD28活性位点),经过测序获得序列(测序结果如图11)。
通过对序列表及图11中的序列进行比对及保守序列分析,以peptide 1为例的优化序列,可得多肽框架:
CPPCXXXX(X10)(X11)XXXPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 11)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E;(X10)为任意氨基酸,优选R;(X11)为V、L或I,优选V。
图1给出peptide 1、peptide 11的氧化折叠色谱图。
实施例2
Peptide 11的亲合力测试。Peptide 11与CD28的亲合力通过荧光偏振饱和/竞争实验测定。该方法使用荧光素修饰的peptide 11(FITC-peptide 1)与CD28做饱和实验得到Kd值。然后使用未被荧光素修饰的peptide 11与FITC-peptide 11竞争结合位点。在荧光偏振饱和实验中,将FITC-peptide 11用10mM PBS稀释至终浓度为25nM,CD28蛋白逐级稀释浓度范围为10-800nM。室温下共孵育10min后测量荧光各向异性(Eex=485nm,Eem=535nm)。使用公式(1)对蛋白质浓度与各向异性的非线性回归分析解离常数(KD=117nM),图4为peptide11氧化型和还原型对CD28的荧光偏振饱和曲线:
其中,X:蛋白质浓度,Y:测得的荧光各向异性,C:荧光肽浓度,A1:各向异性的底部平台,A2:存在饱和浓度CD28时的各向异性信号,KD:解离常数。
在荧光偏振竞争实验中,FITC-peptide 11用10mM PBS稀释至终浓度为25nM。将一系列逐级稀释的peptide 11(浓度范围为1nM-1.5μM)与FITC-peptide 11(25nM)和CD28(225nM)在室温下共孵育10min。每个样品通过Tecan 200PRO微板阅读器平行分析3次。偏振数据通过公式(2)进行拟合,抑制常数Ki通过公式(3)计算得到。通过计算得到peptide 11对CD28具有纳摩尔级别的亲合力(Ki=197nM),图5为peptide 1氧化型和peptide 11氧化型对CD28的荧光偏振竞争曲线。
X:氧化肽的对数摩尔浓度,Y:测得的荧光各向异性,A1:各向异性的顶部平台,A2:各向异性的底部平台,[EC]50:50%抑制时氧化肽的浓度,[L]50:50%抑制时FITC标记肽的浓度,[P]0:0%抑制时游离蛋白的浓度,KD:荧光肽与蛋白质的解离常数。
实施例3
考察peptide 11中6号脯氨酸(P)以及7号精氨酸(R)对多肽peptide 11亲合力的影响。构建多肽大肠杆菌表达载体生物表达多肽peptide 21、peptide 22;其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.21、22所示:
通过表面等离子共振实验(SPR)测试突变肽与CD28的亲合力。
CPPCAREHELVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 21)
CPPCPAEHELVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 22)
其中,突变点用下划线表示。
在SPR实验中,将生物素化的CD28蛋白稀释至1μM,通过Biacore T200仪器系统结合至芯片表面的链霉亲和素上。使用单循环/多循环模式将不同浓度的多肽(peptide 21:100~3200nM;peptide 22:50~800nM)与结合在芯片上的CD28蛋白结合得到相应曲线(图6和7),通过拟合得到亲合力peptide 21:KD=893nM;peptide 22:KD=233.2nM。与peptide11相比(KD=102nM)(图8)与CD28亲合力都有所下降。
实施例4
Peptide 11与细胞表面表达的CD28的特异性结合能。首先,实验转染表达CD28胞外结构域、胞外靶向信号序列、荧光mCherry标记和跨膜结构域融合的质粒于HEK293T细胞。将转染细胞与荧光素标记的peptide 11一起培养30min,然后用培养基洗涤以去除未结合的peptide 11。然后通过共聚焦荧光图像(图9),显示mCherry标签和标记肽的荧光共定位。结果清楚地表明,peptide 11可以与存在多种其他受体的活细胞表面上的CD28特异性结合。
实施例5
随机选取部分library 3筛选出的多肽序列(图11)进行ELISA实验。进行优化后的序列与peptide 11亲合力比较。随机选取13个序列,其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.23~35所示:
CPPCPRRADLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 23)
CPPCAEKRGLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 24)
CPPCPRMGKLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 25)
CPPCARPGKLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 26)
CPPCTTVHRLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 27)
CPPCPRTETLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 28)
CPPCPREHELVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 11)
CPPCTSRGSLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 29)
CPPCLSKTTLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 30)
CPPCSSKQRLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 31)
CPPCPREHEVKAYPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 32)
CPPCGSARSLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 33)
CPPCATSNGLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 34)
CPPCPRAKQLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 35)
(1)进行单克隆噬菌体扩增。-80℃冰箱中取出送测序后冻存的单克隆菌液,取少量母液接种到新的2×YT-A培养基(液体)中,放在37℃、转速220rpm摇床中,培养12h。培养后的每个单克隆菌液分别取5mL加到装有45mL 2×YT-A-G培养基(液体)的锥形瓶中,放在37℃、转速220rpm的摇床中,培养2h。分别往每个单克隆菌液中加入5×1011pfu的辅助噬菌体,37℃培养箱中静置30min,放在37℃、转速220rpm的摇床中,培养30min。后将菌液离心15min,弃上清,收集离心下沉淀。用50mL 2×YT-A-K培养基(液体)重悬菌体沉淀,放在30℃、转速220rpm的摇床中,培养12h。将菌液离心15min,将上清液小心倾倒到离心管中,然后加入上清液体积1/5的PEG/NaCl溶液,冰浴4h。将溶液离心25min,弃上清,收集离心下沉淀。用5mL 1×PBS重悬沉淀,再加入1mL的PEG/NaCl溶液,冰浴1h(为获得较纯的噬菌体,进行二次PEG/NaCl法沉降噬菌体)。最后弃上清,收集离心下沉淀,用1mL 1×PBS悬沉淀,每个单克隆噬菌体分别进行滴度测定,备用。
(2)酶联免疫吸附实验(ELISA实验)鉴定单克隆噬菌体结合性
包被:96孔酶标板(NUNC MaxiSorpTM)的一半孔中加入靶标蛋白液(用Bindingbuffer将靶标蛋白稀释至2μg/mL,100μL/孔)作为实验组,另一半孔中加入Binding buffer(100μL/孔)作为对照组。板子放在37℃摇床上包被2h。
封闭:除去孔内溶液,控干。用Washing buffer(200μL/孔)洗板3次后,加入Blocking buffer(200μL/孔),板子放在37℃摇床上封闭90min。同时,用1︰1(v/v)的Binding buffer和Blocking buffer将每个单克隆噬菌体稀释至同一滴度后放在摇床上封闭2h。
结合:除去孔内溶液,控干。用Washing buffer(200μL/孔)洗板3次后,加入上述步骤中的噬菌体溶液(100μL/孔),板子放在25℃摇床中孵育1h。
洗涤:除去孔内溶液,控干。用Washing buffer(200μL/孔)洗板5次。
二抗孵育:加入HRP-anti-M13抗体(1︰5000稀释,100μL/孔),放在25℃摇床中孵育30min。
显色:除去孔内溶液,控干。用Washing buffer(200μL/孔)洗板5次后,加入TMB显色液(100μL/孔),避光反应20min,立即加入2.5M H2SO4溶液(50μL/孔)终止反应。
读数:用酶标仪对酶标板各孔的吸光值(450nm处)进行测定。
根据酶标仪的读取结果,每个样品的实验孔读取值扣除自身对照孔的读取值以及空白实验的背景值后作图10。当噬菌体量一致时,响应值越高,表明该噬菌体与CD28蛋白结合能力越强。经过优化,大部分序列均比peptide 11的结合力强。
综上可见,CD28靶标系列的配体肽,相较于市面上单克隆抗体而言,其制备简单,成本低廉。富含二硫键使其结构刚性稳定,CPPC基序配对使其氧化产物单一。与CD28的亲合力测试显示peptide 11与靶蛋白有较高亲合力,并且可与活细胞表面的CD28靶点特异性结合。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 特异性靶向CD28的多元环肽配体框架
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 1
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ser Phe Thr Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 2
Cys Pro Pro Cys Arg Ala Trp Arg Tyr Cys Asp Ser Phe Thr Asn Cys
1 5 10 15
Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 3
Cys Pro Pro Cys Gly Thr Ala Thr Glu Trp Ile Val Gln Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ser Phe Thr Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 4
Cys Pro Pro Cys His Arg Trp Glu Tyr Cys Asp Ser Phe Thr Asn Cys
1 5 10 15
Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 5
Cys Pro Pro Cys Gly Ser Val Gly Glu Phe Tyr Val Lys Glu Cys Asp
1 5 10 15
Ser Phe Thr Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 6
Cys Pro Pro Cys Arg Phe Met Val Glu Pro Cys Asp Ser Phe Thr Asn
1 5 10 15
Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 7
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Ala Gly Phe Leu Phe Val Lys Glu Cys Asp
1 5 10 15
Ser Phe Thr Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 8
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 8
Cys Pro Pro Cys His Val Leu Val Arg Glu Cys Asp Ser Phe Thr Asn
1 5 10 15
Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 9
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 9
Cys Pro Pro Cys Arg Phe Phe Leu Arg Pro Cys Asp Ser Phe Thr Asn
1 5 10 15
Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 10
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Gly Arg Val Trp Val Val Trp Ala Cys Asp
1 5 10 15
Ser Phe Thr Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 11
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 12
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 12
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Ala
1 5 10 15
Phe Glu Ser Asn Cys Trp Glu Ile Lys Arg Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 13
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Pro
1 5 10 15
Thr Arg Pro Asn Cys Tyr Val Val Glu Arg Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 14
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ser Asn Cys Trp Ile Val Arg Lys Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 15
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Pro
1 5 10 15
Glu Phe Arg Asn Cys Tyr Ile Val Lys Arg Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 16
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Arg Leu Asn Cys Trp Asn Val Ile Glu Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 17
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 17
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Ser
1 5 10 15
Lys Val Gln Asn Cys Trp Glu Leu Val Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 18
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Arg
1 5 10 15
Ala Arg Leu Asn Cys Trp Arg Val Ile Glu Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 19
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 19
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Val
1 5 10 15
Gly Arg Val Asn Cys Trp Phe Ile Gln Glu Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 20
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Asp
1 5 10 15
Phe Ser Thr Asn Cys Trp Leu Leu Glu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 21
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 21
Cys Pro Pro Cys Ala Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 22
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 23
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Arg Ala Asp Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 24
Cys Pro Pro Cys Ala Glu Lys Arg Gly Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 25
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Met Gly Lys Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 26
Cys Pro Pro Cys Ala Arg Pro Gly Lys Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 27
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 27
Cys Pro Pro Cys Thr Thr Val His Arg Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 28
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Thr Glu Thr Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 29
Cys Pro Pro Cys Thr Ser Arg Gly Ser Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 30
Cys Pro Pro Cys Leu Ser Lys Thr Thr Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 31
Cys Pro Pro Cys Ser Ser Lys Gln Arg Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 32
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Val Lys Ala Tyr Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 33
Cys Pro Pro Cys Gly Ser Ala Arg Ser Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 34
Cys Pro Pro Cys Ala Thr Ser Asn Gly Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 35
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Ala Lys Gln Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 36
Cys Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Asp
1 5 10 15
Ser Phe Thr Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 37
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 37
Cys Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Asp Ser
1 5 10 15
Phe Thr Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 38
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 38
Cys Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Asp Ser Phe
1 5 10 15
Thr Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 39
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 39
Cys Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Asp Ser Phe Thr
1 5 10 15
Asn Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 40
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 40
Cys Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Asp Ser Phe Thr Asn
1 5 10 15
Cys Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 41
Cys Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Asp Ser Phe Thr Asn Cys
1 5 10 15
Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 42
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 43
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 43
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 44
Cys Pro Pro Cys Arg Ala Trp Arg Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 45
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 45
Cys Pro Pro Cys Gly Thr Ala Thr Glu Trp Ile Val Gln Pro Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 46
Cys Pro Pro Cys His Arg Trp Glu Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 47
Cys Pro Pro Cys Gly Ser Val Gly Glu Phe Tyr Val Lys Glu Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 48
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 48
Cys Pro Pro Cys Arg Phe Met Val Glu Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 49
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 49
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Ala Gly Phe Leu Phe Val Lys Glu Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 50
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 50
Cys Pro Pro Cys His Val Leu Val Arg Glu Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 51
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 51
Cys Pro Pro Cys Arg Phe Phe Leu Arg Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25
<210> 52
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 52
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Gly Arg Val Trp Val Val Trp Ala Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 53
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(未知Unknown)
<400> 53
Cys Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 54
Cys Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 55
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 55
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 56
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Trp Phe Val Glu Ala Cys Pro Pro Cys
20 25 30
<210> 57
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成(未知Unknown)
<400> 57
Cys Pro Pro Cys Pro Arg Glu His Glu Leu Val Ala Val Pro Cys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Asn Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys
20 25 30
Claims (10)
1.特异性靶向CD28的多元环肽配体框架,其特征在于由两个CPPC基序、确定的氨基酸(X1)-(X11)以及部分随机氨基酸组成;
所述多元环肽配体框架为:
CPPCXXXXX(X11)XXXPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E;(X10)为任意氨基酸,优选R;(X11)为V、L或I,优选V;
G为甘氨酸;P为脯氨酸;A为丙氨酸;V为缬氨酸;L为亮氨酸;I为异亮氨酸;M为甲硫氨酸;C为半胱氨酸;F为苯丙氨酸;Y为酪氨酸;W为色氨酸;H为组氨酸;K为赖氨酸;R为精氨酸;Q为谷氨酰胺;N为天冬酰胺;E为谷氨酸;D为天冬氨酸;S为丝氨酸;T为苏氨酸。
2.如权利要求1所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架,其特征在于所述多元环肽配体框架如下:
CPPCPREHELVAVPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 1)
CPPCRAWRYC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 2)
CPPCGTATEWIVQPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 3)
CPPCHRWEYC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 4)
CPPCGSVGEFYVKEC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 5)
CPPCRFMVEPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 6)
CPPCPRAGFLFVKEC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 7)
CPPCHVLVREC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 8)
CPPCRFFLRPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 9)
CPPCPRGRVWVVWAC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 10)
CPPCXXXX(X10)(X11)XXXPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 11)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E;(X10)为任意氨基酸,优选R;(X11)为V、L或I,优选V。
3.如权利要求3所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架的构建方法,其特征在于包括以下步骤:
1)基于富含二硫键噬菌体文库筛选CD28靶向特异性环肽配体,构建噬菌体文库library 1;
2)将步骤1)构建的噬菌体文库library 1用于CD28蛋白配体的筛选,筛选后通过基因测序得到多肽的基因序列,并通过基因翻译软件得到多肽的氨基酸序列peptide 1~10;
3)根据噬菌体文库library 1测序结果,通过对peptide 1~10氨基酸的优化得到框架序列sequence 1~10;
4)根据步骤2)中多肽peptide 1构建噬菌体文库library 2,用于CD28蛋白筛选,筛选后通过基因测序得到多肽的基因序列,通过基因翻译软件得到多肽的氨基酸序列peptide11~20;
5)根据步骤4)中多肽peptide 11构建噬菌体文库library 3用于CD28蛋白配体的筛选,筛选后通过基因测序得到多肽的基因序列,通过基因翻译软件得到多肽的氨基酸序列,采用序列框架优化方法,分析并优化序列框架,得到优化后的框架序列sequence 11。
4.如权利要求4所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架的构建方法,其特征在于在步骤1)中,所述构建噬菌体文库library 1可通过序列设计构建,噬菌体文库展示基序包括CPPC基序、随机序列以及针对CD28靶点设计的序列,由N端到C端,噬菌体文库library 1表面展示多肽序列为:
CPPC(X)5CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)6CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)7CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)8CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)9CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
CPPC(X)10CDSFTNCWELLTCPPC(library 1)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸,下标代表含有(X)的数量。
5.如权利要求4所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架的构建方法,其特征在于在步骤2)中,所述多肽的氨基酸序列peptide 1~10,是将构建好的噬菌体文库library 1针对CD28靶点进行筛选,CD28蛋白经过生物素化后固定在磁珠上,经过3轮筛选后,选取筛选后得到的噬菌体进行测序,得到多肽包含但不限于以下序列:
CPPCPREHELVAVPCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 1)
CPPCRAWRYCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 2)
CPPCGTATEWIVQPCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 3)
CPPCHRWEYCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 4)
CPPCGSVGEFYVKECDSFTNCWELLTCPPC(peptide 5)
CPPCRFMVEPCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 6)
CPPCPRAGFLFVKECDSFTNCWELLTCPPC(peptide 7)
CPPCHVLVRECDSFTNCWELLTCPPC(peptide 8)
CPPCRFFLRPCDSFTNCWELLTCPPC(peptide 9)
CPPCPRGRVWVVWACDSFTNCWELLTCPPC(peptide 10)。
6.如权利要求4所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架的构建方法,其特征在于在步骤3)中,所述框架序列sequence 1~10如下:
CPPCPREHELVAVPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 1)
CPPCRAWRYC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 2)
CPPCGTATEWIVQPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 3)
CPPCHRWEYC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 4)
CPPCGSVGEFYVKEC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 5)
CPPCRFMVEPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 6)
CPPCPRAGFLFVKEC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 7)
CPPCHVLVREC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 8)
CPPCRFFLRPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 9)
CPPCPRGRVWVVWAC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 10)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E。
7.如权利要求4所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架的构建方法,其特征在于在步骤4)中,所述根噬菌体文库library 2构建方法同步骤1),噬菌体文库library 2表面展示多肽序列为:
CPPCPREHELVAVPC(X)5C(X)5CPPC(library 2);
library 2用于CD28蛋白筛选的具体方法同步骤2);
经过筛选测序得到多肽的氨基酸序列peptide 11~20如下:
CPPCPREHELVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 11)
CPPCPREHELVAVPCAFESNCWEIKRCPPC(peptide 12)
CPPCPREHELVAVPCPTRPNCYVVERCPPC(peptide 13)
CPPCPREHELVAVPCAERSNCWIVRKCPPC(peptide 14)
CPPCPREHELVAVPCPEFRNCYIVKRCPPC(peptide 15)
CPPCPREHELVAVPCPARLNCWNVIECPPC(peptide 16)
CPPCPREHELVAVPCSKVQNCWELVACPPC(peptide 17)
CPPCPREHELVAVPCRARLNCWRVIECPPC(peptide 18)
CPPCPREHELVAVPCVGRVNCWFIQECPPC(peptide 19)
CPPCPREHELVAVPCDFSTNCWLLETCPPC(peptide 20)。
8.如权利要求4所述特异性靶向CD28的多元环肽配体框架的构建方法,其特征在于在步骤5)中,所述序列框架优化方法,是通过序列比对及保守序列分析,对序列框架进行优化,具体可包括以下步骤:
1)以peptide 11为依据构建library 3混合文库:
CPPC(X)5LVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(library 3)
CPPCPREHE(X)5CEGLNNCWFVEACPPC(library 3)
CPPCPREHELVAVPC(X)5CWFVEACPPC(library 3)
CPPCPREHELVAVPCEGLNNC(X)5CPPC(library 3)
2)通过噬菌体展示library 3,针对CD28进行多肽配体筛选;经过筛选并进行测序,得到包含但不限于:
CPPCPRRADLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 23)
CPPCAEKRGLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 24)
CPPCPRMGKLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 25)
CPPCARPGKLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 26)
CPPCTTVHRLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 27)
CPPCPRTETLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 28)
CPPCPREHELVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 11)
CPPCTSRGSLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 29)
CPPCLSKTTLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 30)
CPPCSSKQRLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 31)
CPPCPREHEVKAYPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 32)
CPPCGSARSLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 33)
CPPCATSNGLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 34)
CPPCPRAKQLVAVPCEGLNNCWFVEACPPC(peptide 35)
通过序列比对获得,以peptide 1为例优化序列,得到:
CPPCXXXX(X10)(X11)XXXPC(X4)(X5)(X6)X(X1)C(X2)(X7)(X3)(X8)(X9)CPPC(sequence 11)
其中,氨基酸均为L型氨基酸,X代表任意氨基酸;(X1)为N或E,优选N;(X2)为F、W或Y,优选W;(X3)为V、I或L,优选V;(X4)为任意氨基酸,优选E;(X5)为任意氨基酸,优选G;(X6)为R、F、A、G、Q、E、L、T、V或M,优选R;(X7)为任意氨基酸,优选F;(X8)为H、R、A、Q、E、K、L、M、S、T、I或V,优选E;(X9)为任意氨基酸,优选E;(X10)为任意氨基酸,优选R;(X11)为V、L或I,优选V。
9.特异性靶向CD28的配体肽在制备预防、抑制或治疗由CD28介导的相关疾病的药物中应用,所述特异性靶向CD28的配体肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1~57所示。
10.如权利要求9所述应用,其特征在于所述由CD28介导的相关疾病为自身免疫性疾病,包括:癌症、类风湿关节炎、红斑狼疮、移植排斥。
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- 2022-05-12 CN CN202210520286.0A patent/CN114933638A/zh active Pending
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