CN111945231A - 基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法 - Google Patents

Abstract

基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，涉及环肽类化合物。实现精准调控三元环肽分子内的二硫键配对方式，将三元环肽模板融合表达于噬菌体表面，构建噬菌体三元环肽文库。利用CPPC基序具有优先生成平行配对的二聚体的倾向性质，将两个CPPC基序和两个半胱氨酸插入多肽骨架中，实现有效调控二硫键的配对和多肽折叠，通过改变两个CPPC基序和两个半胱氨酸的排布位置，使具有不同多环拓扑结构的新型富二硫键环肽化合物得以从头设计。无需借助天然环肽骨架和非天然氨基酸的插入，可以作为多环肽库的模板，并利用该模板成功构建了噬菌体三元环肽文库，筛选出并不是来源于天然产物支架结构的具有新结构的功能性环肽配体。

Description

基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法

技术领域

本发明涉及环肽类化合物，尤其是涉及一种基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法。

背景技术

环肽类化合物是一类结构特殊、构象稳定、生物活性广泛、作用机理独特的环状化合物，对靶标受体具有高的结合亲和力和特异性、细胞毒性低、口服利用度高。因此，针对环肽类化合物进行配体药物的研发引起了人们越来越多的关注。比如用于细菌及真菌性感染的环肽药物Telavancin和Dalbavancin；抗肿瘤环肽药物Lanreotide和Romidepsin，这些药物都已经成功上市并发挥了重大的医用价值。但是这些药物中尤其是一些富含二硫键的环肽药物，主要是提取于自然界的动植物。比如环肽药物Linaclotide，由14个氨基酸组成，分子内含有三对二硫键构成三元环肽，衍生自多种可致腹泻的大肠杆菌菌株所产生的热稳定性肠毒素，用于治疗成人的便秘性肠易激综合征(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)。这些环肽经过数百万年的进化，不仅具有高度的结构刚性，而且具有结合包括细胞受体、离子通道蛋白等大量靶标的能力。但是这些进化后的环肽保留了很多保守氨基酸用于调控二硫键配对来稳定三级结构，因此在天然环肽基础上进行改造的工作很大程度上仅仅局限于那些保守度较低的残基部位，否则就会损害二硫键的配对和环肽结构。要想实现在不依赖于这些天然骨架的情况下，从头设计耐受序列修改的富二硫键环肽骨架，对我们来说都是一个巨大的挑战。

为了解决富二硫键环肽折叠过程中的复杂性和二硫键异构重排的问题，也已经发展出一些用于调控二硫键精准配对的工作，比如利用半胱氨酸类似物(Muttenthaler,M.etal.Solving the alpha-Conotoxin Folding Problem:Efficient Selenium-DirectedOn-Resin Generation of More Potent and Stable Nicotinic AcetylcholineReceptor Antagonists.J.Am.Chem.Soc.132,3514-3522(2010)；Zheng,Y.W.,Zhai,L.X.,Zhao,Y.B.&Wu,C.L.Orthogonal Cysteine-Penicillamine Disulfide Pairing forDirecting the Oxidative Folding of Peptides.J.Am.Chem.Soc.137,15094-15097(2015).)(硒代半胱氨酸或者青霉胺)替代多肽链中的半胱氨酸残基。虽然这些半胱氨酸类似物确实是有效调控了二硫键的配对方式，但是这些类似物都属于非天然氨基酸，所以若将这些非天然氨基酸应用于生物体内表达多肽，工作量和难度都是很大的，因此发展出一种不依赖于非天然氨基酸而有效指导多肽的氧化折叠的方法是很有必要的。2012年，C.L.Wu等(Wu,C.L.,Leroux,J.C.&Gauthier,M.A.Twin Disulfides for OrthogonalDisulfide Pairing and the Directed Folding of MulticyclicPeptides.Nat.Chem.4,1045-1050(2012))发现CXC基序和半胱氨酸间具有正交性配对的性质，因此设计合成了一系列含有CXC基序的多肽分子骨架，氧化折叠后获得了特定配对方式的多元环肽。但是目标产物的产率还是相对来说较低，仍然会有许多其他二硫键配对构型的产物。因此如何在不借助天然环肽骨架和非天然氨基酸的插入的前提下，发展出一种从头设计的耐受序列修改的多元环肽模板的新技术，从而实现三元环肽分子内更高精准程度的二硫键配对，用于噬菌体三元环肽文库的构建，从而有望筛选出具有新结构的功能性环肽配体和治疗性药物。

自20世纪80年代噬菌体展示技术问世以来，该技术已成为针对众多靶标去发现多肽配体的最流行和最有力的策略。利用多肽而非小分子或蛋白质可以成功地靶向具有挑战性的药物靶标，包括蛋白质-蛋白质相互作用表面，从而成功填补小分子与大蛋白药物之间的缺口。而且与线性多肽相比，具有分子内二硫键的环肽自身构象受限，从而提高了靶标结合亲和力和对蛋白水解酶的抗性。为了扩大噬菌体展示肽库的多样性和提高多肽配体的性能，大量噬菌体环肽文库被展示出来并成功应用于多种靶标的筛选。1992年，O’Neil(O’Neil,K.T.,Hoess,R.H.,Jackson,S.A.,Ramachandran,N.S.,Mousa,S.A.,&DeGrado,W.F.Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from aconformationally constrained phage peptide library.Proteins:Struct.,Funct.,Genet.14，509-515(1992))构建了第一个噬菌体环肽展示文库(CX₆C形式；C＝半胱氨酸；X＝任何随机氨基酸)，该文库由六个随机氨基酸和两侧的半胱氨酸组成，两个半胱氨酸氧化后生成环肽，最后针对血小板糖蛋白IIb/IIIa筛选出了高亲和力的环肽分子。由于该环肽的筛选性能良好和应用广泛，后续催生了商用的CX₇C形式的噬菌体环肽文库(Noren,K.A.；Noren,C.J.Construction of High-Complexity Combinatorial Phage Display PeptideLibraries.Methods 23,169-178(2001))。与分子量相当的单环肽相比，双环肽的构象受到更多的限制，降低的构象自由度可限制与靶标结合的熵损失，从而以更高的亲和力结合靶标，并且对蛋白酶水解有更高的抵抗力，因此人们又将注意力转移到噬菌体多元环肽的构建。2009年，Heinis等(Heinis,C.；Rutherford,T.；Freund,S.；Winter,G.Phage-EncodedCombinatorial Chemical Libraries Based on Bicyclic Peptides.Nat.Chem.Biol.5,502-507(2009))开发了一种通过化学翻译后修饰来构建噬菌体双环肽文库的方法。该文库(CX₆CX₆C形式)外源多肽包含三个半胱氨酸，与化合物三-(溴甲基)苯进行化学环化。后续针对包括蛋白酶血浆激肽释放酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)在内的一系列靶标进行了噬菌体筛选，可产生具有nM或pM级别亲和力的环肽配体，并表现出出色的靶标选择性。2013年，S.Y.Chen等(Chen,S.Y.；RenteroRebollo,I.；Buth,S.A.；Morales-Sanfrutos,J.；Touati,J.；Leiman,P.G.；Heinis,C.Bicyclic Peptide Ligands Pulled out ofCysteine-Rich Peptide Libraries.J.Am.Chem.Soc.135,6562-6569(2013))在不使用烷基化试剂进行环化的CX₆CX₆C形式或XCX₄CX₄CX形式的肽库进行噬菌体筛选中，观察到大多数富集的多肽均含有四个半胱氨酸，即三个半胱氨酸处于固定位置，第四个半胱氨酸处于随机位置，形成了两对二硫键。这种新型双环肽噬菌体文库，由于第四个半胱氨酸位置的随机性，可以轻松生成高度多样化的肽拓扑结构的双环肽文库。基于二硫键环化多肽的噬菌体环肽文库表现出了操作技术上简单且性能稳定的优势，半胱氨酸在细菌的周质空间就可以通过氧化生成二硫键，可直接将多肽环化在噬菌体表面，免去了化学翻译后修饰的繁琐操作。为了追求更加多元的环肽带来的更高亲和力，开发三元环肽是人们关注的方向，但是随着半胱氨酸数量的增多，二硫键配对方式复杂多样，大大影响了三元环肽的开发进展。如何在不借助非天然氨基酸和化学翻译后修饰方法的前提下，开发一种二硫键精准配对的三元环肽噬菌体文库，从而筛选出性能更加优异的功能性环肽配体。本发明致力于满足这些需求。

发明内容

本发明的目的在于针对现有天然富含二硫键环肽分子骨架氧化折叠过程复杂、耐受序列修改程度差等缺陷，提供一种基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法。本发明可实现精准调控三元环肽分子内的二硫键配对方式，将三元环肽模板融合表达于噬菌体表面，构建噬菌体三元环肽文库。

本发明包括以下步骤：

1)选取两种具有富含二硫键环肽分子骨架的模板，在碱性条件下于水相中发生氧化反应生成两种氧化产物，合成多肽；

2)选取步骤1)合成的多肽骨架为模板，将该多肽模板融合表达于噬菌体表面，构建噬菌体多元环肽库。

在步骤1)中，所述模板可为：

模板a：Y—aa_n—Y

其中，两个Y代表CPPC，aa代表任意一个氨基酸，n代表氨基酸的数目。

模板b：Y—aa_n—Y—aa_m—Y—aa_r—Y

其中，四个Y中有两个是CPPC，另两个Y是C，aa代表任意一个氨基酸，n、m、r代表氨基酸的数目；

所述合成的多肽包括但不限于：

H-WGCPPCGGKGGCPPCGW-NH₂(peptide 1)

H-WGCPPCSGGKGGSKGGSKGGSKGGCPPCGW-NH₂(peptide 2)

H-WGCPPCGGKGGCPPCGGKGGCGGKGGCGW-NH₂(peptide 3)

H-WGCGGKGGCPPCGGKGGCPPCGGKGGCGW-NH₂(peptide 4)

H-WGCPPCGGKGGCGGKGGCGWKGGCPPCGW-NH₂(peptide 5)

H-WGCPPCGGKGGCGGKGGCPPCGWKGGCGW-NH₂(peptide 6)

所述氨基酸为L-型氨基酸；

所述多肽中的CPPC和C的位置可以随意改变，多肽模板中的随意氨基酸的个数也可以根据需要减少或增加，改变后二硫键精准配对仍然适用。

在步骤2)中，所述展示在噬菌体表面的多肽序列为：

CPPCXXXXXCXXXXXCXXXXXCPPC(由N端到C端，X表示随机氨基酸,通过NNK方式，在指定的15个位点引入氨基酸随机突变)；

根据上述多肽序列设计对应的DNA序列为：

所述噬菌体多元环肽库可为CPPCX₅CX₅CX₅CPPC形式，库容量：≈1×10⁹；X＝任何随机氨基酸；

所述构建噬菌体多元环肽库的具体方法可为：

在噬菌粒载体pCantab 5E中，利用SfiI和NotI双酶切位点进行文库片段插入，该片段DNA序列中限制性内切酶SfiI剪切位点用小写和下划线表示，NotI的剪切位点用小写和粗体表示，多肽框架用粗体和大写表示；

使用T4DNA连接酶将经SfiI/NotI双酶切后的文库DNA片段和噬菌粒载体pCantab5E以1︰10的摩尔比例进行连接反应，并转化到化学感受态大肠杆菌，以进行连接和转化评估，得到了展示该多肽的M13噬菌体展示文库，文库多样性为1×10⁹。

构建好的噬菌体环肽文库可用于对靶标蛋白进行筛选，具体步骤为：

将构建好的噬菌体环肽文库针对MDM2靶点进行筛选，MDM2蛋白被生物素化固定在磁珠上，经过3轮和4轮筛选后，随机选取富集的噬菌体克隆进行测序；

根据测序后得到的富集多肽序列合成如下多肽：

合成的多肽包括:H-CPPCHGRPTCDSFTNCWELLTCPPC-NH₂(peptide 8)

H-CPPCSNSGGCFTEWWCALDGTCPPC-NH₂(peptide 9)

选取两条高富集度的多肽合成后进行氧化反应，将氧化产物进行MDM2的荧光偏振竞争实验，以测试筛选结果的有效性。

本发明中这一系列不同配对方式氧化主产物的多肽模板都可以应用于生物体内表达技术，可以实现多环肽文库的模板骨架构建，用于筛选功能性环肽配体。

本发明提供一种基于二硫键精准配对构建多元环肽骨架并用于噬菌体三元环肽文库构建的方法。富含二硫键的环肽化合物是肽类分子中构象稳定的一类化合物，作为药物分子，对受体具有高的选择性和亲和力、代谢稳定性强、口服利用度高。因此，针对富含二硫键的环肽类药物的研发正在受到人们越来越多的关注。但是目前研究的富含二硫键的环肽类药物大多都是从动植物中提取的天然环肽，由于环肽中二硫键配对情况的复杂多样性，所以若不借助这些天然环肽骨架很难开发出新型富二硫键环肽类药物。本发明利用CPPC基序(半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸)具有优先生成平行配对的二聚体的倾向性质，将两个CPPC基序和两个半胱氨酸插入多肽骨架中，实现了有效调控二硫键的配对和多肽折叠，通过改变两个CPPC基序和两个半胱氨酸的排布位置，使具有不同多环拓扑结构的新型富二硫键环肽化合物得以从头设计。该方法无需借助天然环肽骨架和非天然氨基酸的插入，因此可以作为多环肽库的模板，并利用该模板成功构建了噬菌体三元环肽文库，筛选出并不是来源于天然产物支架结构的具有新结构的功能性环肽配体。

本发明基于二硫键精准配对构建噬菌体富二硫键三元环肽文库的方法。本发明无需借助天然环肽骨架和非天然氨基酸的插入，因此可以作为多环肽文库的模板骨架，筛选出功能性环肽配体。与现有的专利技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果：

a.本发明所构建的环肽分子骨架合成方法简单，只需要常规的固相合成即可实现。

b.本发明解决了富含二硫键的多元环肽折叠过程中的产物复杂不可控的问题，通过引入CPPC基序，利用CPPC正交配对的性质，实现了对巯基配对的有效调控。

c.本发明与之前利用非天然氨基酸插入去调控巯基配对的技术相比，涉及到的都是天然氨基酸，适合生物体内合成的环肽文库设计。

d.本发明与之前利用天然环肽骨架改造去调控巯基配对的技术相比，不涉及任何一级序列的修改，提高了多肽文库的多样性，并且可以通过改变CPPC和C的位置得到我们需要的构型的环肽分子，大大增大了本发明的应用灵活性。

附图说明

图1为peptide 1的氧化折叠色谱图。

图2为peptide 2的氧化折叠色谱图。

图3为peptide 3的氧化折叠色谱图。

图4为peptide 4的氧化折叠色谱图。

图5为peptide 5的氧化折叠色谱图。

图6为peptide 6的氧化折叠色谱图。

图7为peptide 1的配对方式确定示意图。

图8为CPPCX₅CX₅CX₅CPPC形式的噬菌体三元环肽文库建库示意图。

图9为针对MDM2筛选后的富集多肽序列。

图10为peptide 8的氧化折叠色谱图。

图11为peptide 9的氧化折叠色谱图。

图12为peptide 8的氧化型三元环肽针对MDM2的荧光偏振竞争曲线。

图13为peptide 9的氧化型三元环肽针对MDM2的荧光偏振竞争曲线。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明包括以下步骤：

(1)两种具有以下富含二硫键环肽分子骨架的模板：

模板a：

Y—aa_n—Y

其中两个Y代表CPPC，aa代表任意一个氨基酸，n代表氨基酸的数目。

模板b：

Y—aa_n—Y—aa_m—Y—aa_r—Y

其中四个Y中有两个是CPPC，另两个Y是C，aa代表任意一个氨基酸，n、m、r代表氨基酸的数目。

根据上述的模板我们合成如下多肽：

合成的多肽包括:H-WGCPPCGGKGGCPPCGW-NH₂(peptide 1)

H-WGCPPCSGGKGGSKGGSKGGSKGGCPPCGW-NH₂(peptide 2)

H-WGCPPCGGKGGCPPCGGKGGCGGKGGCGW-NH₂(peptide 3)

H-WGCGGKGGCPPCGGKGGCPPCGGKGGCGW-NH₂(peptide 4)

H-WGCPPCGGKGGCGGKGGCGWKGGCPPCGW-NH₂(peptide 5)

H-WGCPPCGGKGGCGGKGGCPPCGWKGGCGW-NH₂(peptide 6)

上文所述的氨基酸都是L-型氨基酸。上述六条多肽只是为了阐明本技术的设计思路，而不应视为本专利的全部内容，为了得到最终我们所需要的二硫键配对方式，多肽中的CPPC和C的位置可以随意改变，多肽模板中的随意氨基酸的个数也可以根据需要减少或增加，改变后二硫键精准配对概念仍然适用。所以凡是在本发明基础上所做出的多肽构型变化及其他修饰方法，都应视为本专利的保护范围之内。

(2)噬菌体展示三元环肽库构建及应用：

展示在噬菌体表面的多肽序列为：

CPPCXXXXXCXXXXXCXXXXXCPPC(由N端到C端，X表示随机氨基酸,通过NNK方式，在指定的15个位点引入氨基酸随机突变)

根据上述多肽序列设计对应的DNA序列：

在噬菌粒载体pCantab 5E中，利用SfiI和NotI双酶切位点进行文库片段插入，该片段DNA序列中限制性内切酶SfiI剪切位点用小写和下划线表示，NotI的剪切位点用小写和粗体表示，多肽框架用粗体和大写表示。

使用T4DNA连接酶将经SfiI/NotI双酶切后的文库DNA片段和噬菌粒载体pCantab5E以1：10的摩尔比例进行连接反应，并转化到化学感受态大肠杆菌，以进行连接和转化评估，得到了展示该多肽的M13噬菌体展示文库，文库多样性为1.0×10⁹。

将构建好的噬菌体环肽文库针对MDM2靶点进行筛选，MDM2蛋白被生物素化固定在磁珠上，经过3轮和4轮筛选后，随机选取富集的噬菌体克隆进行测序。

根据测序后得到的富集多肽序列我们合成如下多肽：

合成的多肽包括:H-CPPCHGRPTCDSFTNCWELLTCPPC-NH₂(peptide 8)

H-CPPCSNSGGCFTEWWCALDGTCPPC-NH₂(peptide 9)

选取两条高富集度的多肽合成后进行氧化反应，将氧化产物进行MDM2的荧光偏振竞争实验，以测试筛选结果的有效性。

(3)本发明中这一系列不同配对方式氧化主产物的多肽模板都可以应用于生物体内表达技术，所以可以实现多环肽文库的模板骨架构建，用于筛选功能性环肽配体。

含有一个CPPC基序的多肽在碱性条件下于水相中发生氧化反应，生成主产物平行二聚体(并没有反平行二聚体的生成)。并且脯氨酸是天然氨基酸中结构最受约束的氨基酸，因此由于该基序很强的刚性导致含有一个CPPC基序的多肽很难生成环单体产物。所以CPPC基序是有调控二硫键配对的能力的，会驱动多肽的二硫键交换反应向平行二聚体方向进行。

含有两个CPPC基序的多肽骨架CPPC-aa_n-CPPC(aa＝任意氨基酸，n＝氨基酸的个数)在碱性条件下于水相中发生氧化反应，生成了两种氧化产物(即两个CPPC平行配对的氧化产物和反平行配对的氧化产物)。但是这两种氧化产物的产率不是一成不变的，而是随着两个CPPC基序中间随机氨基酸个数的改变而改变，当中间氨基酸个数从5个逐渐增加到18个后，氧化主产物从产率为86％的反平行配对产物转变为产率为82％的平行配对产物。所以我们想要的二硫键配对方式的产物是可以通过改变两个CPPC基序的间隔距离得以实现的。

含有两个CPPC基序和两个C的多肽骨架在碱性条件下于水相中发生氧化反应，主产物是两个CPPC正交性配对和两个C配对的产物，但是主产物究竟是两个CPPC平行配对方式产物还是反平行配对方式产物，这主要取决于两个CPPC基序间的距离。所以我们若想要得到特定配对方式的三元环肽，可以通过调节两个CPPC和两个C的位置以及两个CPPC间的距离得以实现。

选取CPPC-C-C-CPPC多肽骨架为模板，将该多肽模板融合表达于噬菌体表面，构建了CPPCX₅CX₅CX₅CPPC形式的噬菌体三元环肽文库(库容量：≈1×10⁹；X＝任何随机氨基酸)。选取MDM2作为筛选的模型靶点，经过3轮和4轮筛选后，随机选取富集的噬菌体克隆进行测序，测序结果发现富集的噬菌体克隆大多都具有F-X₃-W-X₂-L/I的特异性序列，该序列是结合MDM2的代表性序列。将富集量最大的多肽(序列：CPPCHGRPTCDSFTNCWELLTCPPC)合成后进行氧化，氧化主产物是我们预期的配对方式的三元环肽(配对方式：[1-5,2-6,3-4]；产率：≈55％)，通过与MDM2进行荧光偏振竞争实验测定，得到了具有纳摩尔级别的亲和力(K_i＝23.7nM)。将另一条富集多肽(序列：CPPCSNSGGCFTEWWCALDGTCPPC)合成后进行氧化，氧化主产物的配对方式是[1-6,2-5,3-4]，产率约78％，对MDM2的亲和力达到纳摩尔级别(K_i＝11.9nM)。这证实了CPPC基序的插入成功调控了噬菌体表面多肽的折叠方式，实现了从未有过的包括三对二硫键的噬菌体三元环肽的构建和对靶标蛋白的成功筛选。

以下给出具体实施例。

实施例1

以peptide 1的氧化折叠为例(peptide 2，peptide 3，peptide 4，peptide 5，peptide 6氧化折叠步骤与peptide 1相同，其色谱图如图2～6)，其具体的氧化方法为：

将peptide 1的固体粉末溶于水溶液中(含有0.1％三氟乙酸，用以防止多肽氧化)，进行多肽定量。将50uM的多肽置于含有0.5mM GSSG的磷酸盐缓冲溶液(100mM pH＝7.4)中，37℃摇床中反应4h。氧化产物的色谱图如图1所示，得到两种预期产物(分别命名为1a和1b)。

实施例2

为了确定氧化产物的配对方式，以peptide 1为例，展示了确定过程示意图(图7)。将peptide 1里的两个半胱氨酸(2位和3位)替换成Acm保护的半胱氨酸的peptide 7(序列：H-WGCPPC(Acm)GGKGGC(Acm)PPCGW-NH₂)，合成出来定量之后置于含有0.5mM GSSG的磷酸盐缓冲溶液(100mM pH＝7.4)中进行氧化反应。利用高效液相色谱将产物纯化分离冻干后，溶解于甲醇中(含有1％三氟乙酸)，再加入两倍当量或者十倍当量的碘进行脱Acm保护同时形成二硫键，得到的氧化产物就是(1-4,2-3)的配对方式，将该产物通过高效液相色谱确定色谱位置，与peptide 1的氧化产物对比色谱位置，位置相同的氧化产物就是(1-4,2-3)的配对方式。

实施例3

噬菌体展示三元环肽文库构建示意图如图8所示。首先将化学合成的文库DNA片段和延伸引物置于95℃的金属浴中反应3min，随后置于冰上速冷5min。之后，往上述的退货体系中加入Klenow酶在37℃金属浴中延伸反应4h，随后置于65℃金属浴中灭活酶活性。然后用SfiI(12h,50℃)和NotI(12h,37℃)酶解延伸产物和噬菌粒载体pCantab 5E。经SfiI/NotI双酶切后的延伸产物和噬菌粒载体分别经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和琼脂糖凝胶电泳纯化，纯化后，延伸产物和噬菌粒载体以1：10的摩尔比例在16℃的温度下进行过夜连接反应(16h)。第二天，连接产物纯化后通过电穿孔方法(200Ω,2.5kV)转染至化学感受态大肠杆菌，得到了展示该多肽的M13噬菌体展示文库，文库多样性为1.0×10⁹。

实施例4

首先从四环素琼脂平板中选取ER2738细胞单克隆，接种于5ml 2YT培养基中37℃培养至对数生长期，用于后续筛选后的滴度测定。在两个1.5mL低吸附离心管中分别加入50μL的链霉亲和素包被磁珠(或者是中性亲和素包被磁珠，用于第二轮筛选)，离心管置于磁力架上，用1mL结合缓冲液清洗两次。向其中一个离心管中加入10μg(第二轮是5μg，第三轮是2μg)MDM2蛋白，向另外一个离心管中加入相同体积的结合缓冲液。室温下于3D摇床上孵育10min后，用1mL结合缓冲液洗涤磁珠3次以除去未结合的靶标蛋白，随后加入300μL的结合缓冲液重悬磁珠，再补加150μL的封闭缓冲液，室温摇床孵育2h进行封闭。同样地，用3mL结合缓冲液和1.5mL封闭缓冲液封闭噬菌体文库(滴度≈10¹²)。封闭完成后，噬菌体文库被分成两等份，实验组的磁珠(加入了靶标蛋白MDM2)和对照组磁珠分别加入噬菌体文库中，充分混合后在3D摇床上室温孵育30min。孵育完成后去除上清液，磁珠用洗涤缓冲液洗涤8次，再用结合缓冲液洗涤2次，清洗过程中，低吸附离心管至少更换3次，以减少非特异性吸附。最后一次洗涤后，磁珠在室温下用200μL的洗脱缓冲液重悬，孵育5min后，将上清液转移到加有20μL中和缓冲液的新离心管中进行中和，后续进行噬菌体滴度测定。经过3轮和4轮筛选后，随机选取噬菌体克隆进行测序。测序结果展示在图9。

实施例5

以peptide 8的氧化折叠为例(peptide9氧化折叠步骤与peptide 8相同，其色谱图如图11)，其具体的氧化方法为：

将peptide 8的固体粉末溶于水溶液中(含有0.1％三氟乙酸，用以防止多肽氧化)，进行多肽定量。将50μM的多肽置于含有0.5mM GSSG的磷酸盐缓冲溶液(100mM pH＝7.4)中，37℃摇床中反应4h。氧化产物的色谱图如图10所示，得到一种主产物(命名为8a)，经碘脱Acm保护的方法确定了主产物的配对方式为[1-5，2-6，3-4]。Peptide 9的氧化产物色谱图如图11所示，同样得到一种主产物(命名为9a)，配对方式为[1-6，2-5，3-4]。

实施例6

三元环肽与MDM2的亲和力通过荧光偏振竞争实验测定，该方法以一种能够结合MDM2的p53结合口袋的荧光素修饰肽(FITC-PMI(FITC-KGTSFAEYWNLLSP))作为竞争对照多肽。首先将peptide 8和peptide 9的氧化产物8a和9a通过色谱纯化后进行定量。在荧光偏振竞争实验中，FITC-PMI用10mM PBS稀释至终浓度为20nM。将一系列逐级稀释的8a和9a(浓度范围为0-10μM)与FITC-PMI(20nM)和SUMO-MDM2(80nM)在室温下共孵育10min。每个样品通过Tecan

200PRO微板阅读器平行分析3次。偏振数据通过公式(1)进行拟合，抑制常数K_i通过公式(2)计算得到。通过计算得到8a对MDM2具有纳摩尔级别的亲和力(K_i＝23.7nM)，9a对MDM2的亲和力达到纳摩尔级别(K_i＝11.9nM)。

K_i＝[I]₅₀/([L]₅₀/K_d+[P]₀/K_d+1) (2)

其中，x是氧化肽的摩尔浓度的对数值,y是荧光各向异性，A₁是各向异性的最高值，A₂是各向异性的最低值，[I]₅₀表示抑制值在50％时的氧化肽浓度,[L]₅₀表示抑制值在50％时的FITC-PMI浓度,[P]₀是抑制值在0％时的多肽浓度，K_d为PMI对MDM2的解离常数。

图12为peptide 8的氧化型三元环肽针对MDM2的荧光偏振竞争曲线。图13为peptide9的氧化型三元环肽针对MDM2的荧光偏振竞争曲线。

富含二硫键的环肽化合物是肽类分子中构象稳定的一类化合物，作为药物分子，对受体具有高的选择性和亲和力、代谢稳定性强、口服利用度高。因此，针对富含二硫键的环肽类药物的研发正在受到人们越来越多的关注。但是目前研究的富含二硫键的环肽类药物大多都是从动植物中提取的天然环肽，由于环肽中二硫键配对情况的复杂多样性，所以若不借助这些天然环肽骨架很难开发出新型富二硫键环肽类药物。本发明利用CPPC基序(半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸)具有优先生成平行配对的二聚体的倾向性质，将两个CPPC基序和两个半胱氨酸插入多肽骨架中，实现了有效调控二硫键的配对和多肽折叠，通过改变两个CPPC基序和两个半胱氨酸的排布位置，使具有不同多环拓扑结构的新型富二硫键环肽化合物得以从头设计。本发明无需借助天然环肽骨架和非天然氨基酸的插入，因此可以作为多环肽库的模板，并利用该模板成功构建了噬菌体三元环肽文库，筛选出并不是来源于天然产物支架结构的具有新结构的功能性环肽配体。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 10

Trp Gly Cys Pro Pro Cys Gly Gly Lys Gly Gly Cys Pro Pro Cys Gly

1 5 10 15

Trp

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 11

Trp Gly Cys Pro Pro Cys Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Lys Gly Gly

1 5 10 15

Ser Lys Gly Gly Ser Lys Gly Gly Cys Pro Pro Cys Gly Trp

20 25 30

<210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 12

Trp Gly Cys Pro Pro Cys Gly Gly Lys Gly Gly Cys Pro Pro Cys Gly

1 5 10 15

Gly Lys Gly Gly Cys Gly Gly Lys Gly Gly Cys Gly Trp

20 25

<210> 13

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 13

Trp Gly Cys Gly Gly Lys Gly Gly Cys Pro Pro Cys Gly Gly Lys Gly

1 5 10 15

Gly Cys Pro Pro Cys Gly Gly Lys Gly Gly Cys Gly Trp

20 25

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 14

Trp Gly Cys Pro Pro Cys Gly Gly Lys Gly Gly Cys Gly Gly Lys Gly

1 5 10 15

Gly Cys Gly Trp Lys Gly Gly Cys Pro Pro Cys Gly Trp

20 25

<210> 15

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 15

Trp Gly Cys Pro Pro Cys Gly Gly Lys Gly Gly Cys Gly Gly Lys Gly

1 5 10 15

Gly Cys Pro Pro Cys Gly Trp Lys Gly Gly Cys Gly Trp

20 25

<210> 16

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 16

Cys Pro Pro Cys His Gly Arg Pro Thr Cys Asp Ser Phe Thr Asn Cys

1 5 10 15

Trp Glu Leu Leu Thr Cys Pro Pro Cys

20 25

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 17

Cys Pro Pro Cys Ser Asn Ser Gly Gly Cys Phe Thr Glu Trp Trp Cys

1 5 10 15

Ala Leu Asp Gly Thr Cys Pro Pro Cys

20 25

<210> 18

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 18

tcgcggccca gccggccatg gcctgcccgc cgtgcnnknn knnknnknnk tgcnnknnkn 60

nknnknnktg cnnknnknnk nnknnktgcc cgccgtgcgc ggccgcaagg tgcgccggtg 120

Claims (8)

1.基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选取两种具有富含二硫键环肽分子骨架的模板，在碱性条件下于水相中发生氧化反应生成两种氧化产物，合成多肽；

2)选取步骤1)合成的多肽骨架b为模板，将该多肽模板融合表达于噬菌体表面，构建噬菌体多元环肽库。

2.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述模板为：

模板a：Y—aa_n—Y

其中，两个Y代表CPPC，aa代表任意一个氨基酸，n代表氨基酸的数目；

模板b：Y—aa_n—Y—aa_m—Y—aa_r—Y

其中，四个Y中有两个是CPPC，另两个Y是C，aa代表任意一个氨基酸，n、m、r代表氨基酸的数目。

3.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述合成的多肽包括但不限于：

H-WGCPPCGGKGGCPPCGW-NH₂(peptide 1)

H-WGCPPCSGGKGGSKGGSKGGSKGGCPPCGW-NH₂(peptide 2)

H-WGCPPCGGKGGCPPCGGKGGCGGKGGCGW-NH₂(peptide 3)

H-WGCGGKGGCPPCGGKGGCPPCGGKGGCGW-NH₂(peptide 4)

H-WGCPPCGGKGGCGGKGGCGWKGGCPPCGW-NH₂(peptide 5)

H-WGCPPCGGKGGCGGKGGCPPCGWKGGCGW-NH₂(peptide 6)。

4.如权利要求2所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于所述氨基酸为L-型氨基酸；

所述多肽中的CPPC和C的位置可以随意改变，多肽模板中的随意氨基酸的个数也可以根据需要减少或增加，改变后二硫键精准配对仍然适用。

5.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤2)中，所述融合表达于噬菌体表面的多肽序列为：

CPPCXXXXXCXXXXXCXXXXXCPPC，由N端到C端，X表示随机氨基酸,通过NNK方式，在指定的15个位点引入氨基酸随机突变；

根据上述多肽序列设计对应的DNA序列为：

5’TCGCggcccagccggccATGGCCTGCCCGCCGTGCnnknnknnknnknnkTGCnnknnknnknnknnkTGCnnknnknnknnknnkTGCCCGCCGTGCgcggccgcAAGGTGCGCCGGTG3’。

6.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤2)中，所述噬菌体多元环肽库为CPPCX₅CX₅CX₅CPPC形式，库容量：≈1×10⁹；X＝任何随机氨基酸。

7.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤2)中，所述构建噬菌体多元环肽库的具体方法为：

在噬菌粒载体pCantab 5E中，利用SfiI和NotI双酶切位点进行文库片段插入，该片段DNA序列中限制性内切酶SfiI剪切位点用小写和下划线表示，NotI的剪切位点用小写和粗体表示，多肽框架用粗体和大写表示；

使用T4DNA连接酶将经SfiI/NotI双酶切后的文库DNA片段和噬菌粒载体pCantab 5E以1︰10的摩尔比例进行连接反应，并转化到化学感受态大肠杆菌，以进行连接和转化评估，得到了展示该多肽的M13噬菌体展示文库，文库多样性为1×10⁹。

8.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤2)中，构建好的噬菌体环肽文库用于对靶标蛋白进行筛选，具体步骤为：

将构建好的噬菌体环肽文库针对MDM2靶点进行筛选，MDM2蛋白被生物素化固定在磁珠上，经过3轮和4轮筛选后，随机选取富集的噬菌体克隆进行测序；

根据测序后得到的富集多肽序列合成如下多肽：

合成的多肽包括:H-CPPCHGRPTCDSFTNCWELLTCPPC-NH₂(peptide 8)

H-CPPCSNSGGCFTEWWCALDGTCPPC-NH₂(peptide 9)

选取两条高富集度的多肽合成后进行氧化反应，将氧化产物进行MDM2的荧光偏振竞争实验，以测试筛选结果的有效性。

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