JP2023551353A - 3へリックスバンドルタンパク質の親和性リガンドライブラリー及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、親和性クロマトグラフィーの分野に関し、より具体的には、目的の標的分子に特異的に結合する親和性リガンドを選択するのに適した3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインをコードする核酸及びポリペプチドライブラリーの提供に関する。本開示はまた、それらのライブラリーを使用して、標的分子に対する係る親和性リガンドを同定及び単離する方法にも関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年10月13日に出願された米国仮出願番号63/091,201及び2021年5月13日に出願された米国出願番号63/188,229の利益を主張し、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年10月13日に出願された米国仮出願番号63/091,201及び2021年5月13日に出願された米国出願番号63/188,229の利益を主張し、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、親和性クロマトグラフィーの分野に関し、より具体的には、目的の標的分子に特異的に結合する親和性リガンドを選択するのに適した3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインをコードする核酸及びポリペプチドライブラリーの提供に関する。本開示はまた、それらのライブラリーを使用して、標的分子に対するそのような親和性リガンドを同定及び単離する方法にも関する。
生物学的に生成された治療薬の純度は、安全性と有効性を確保するために、当局によって厳しく精査され、規制されている。したがって、生物学的に生成された治療薬を高純度まで効率的に精製する手段が依然として必要とされている。
バイオプロセス親和性クロマトグラフィーは、数工程または単一工程でタンパク質を単離及び精製する手段を提供する。しかしながら、親和性リガンドの開発には、多くのリソースと時間を要する。
親和性リガンドの発見を容易にするために、目的の標的に対するリガンドを同定するために迅速かつ効率的にスクリーニングできる親和性ライブラリーが開発された。このようなライブラリーには、免疫グロブリンの精製に有用なプロテインAドメインまたはZドメインに基づくライブラリー、及び精製プロセスで特定の抗原-抗体相互作用を利用するための抗体に基づくライブラリーが含まれる。さらに、高親和性リガンドを生成できることは、バイオプロセス精製用の親和性試薬を生成する際のもう1つの重要な工程である。リガンドは、バイオプロセスの厳しさ、特にNaOHを組み込んだクリーンインプレース(CIP)レジームに耐える高い安定性も備えているべきである。多くの精製サイクルで樹脂を再利用できることは、精製プロセスの経済性に大きな影響を与える。タンパク質Aに基づくIgG結合樹脂の進化はこれを実証しており、最新の変異体は0.5MNaOHCIPサイクルの繰り返しに耐えることができる。これらのIgG結合ドメインは、Fc領域のCH2及びCH3ドメインの界面に対する高い結合親和性、典型的には50nM未満を特徴とする(Graille et al(2000)Proc Natl Acad Sci USA.97:5399-5404)。さらに、IgG結合を欠いているが、高い安定性も有する他のモダリティへの結合を操作する能力を有する親和性リガンドに対する必要性も存在する。本開示は、その必要性に対処する。IgG以外のモダリティまたは分子に対する高親和性リガンドとして使用できる一連のポリペプチドを企図している。
しかし、タンパク質-リガンド相互作用の根底にある多様なメカニズムを持つ多様な構造の他の多くの生体高分子が知られており、バイオプロセス親和性クロマトグラフィーによってもたらされる合理化を利用するために、これらの高分子の親和性リガンドを見つける必要性が残されている。
分子相互作用の多様性とメカニズムはよく知られている(例えば、Du et al.(2016)Int.J.Mol.Sci.17.doi:10.3390/ijms17020144を参照)。生体高分子で見られるタンパク質-リガンド相互作用の構造的多様性のいくつかの例を図1に示しており、これらのモデルは、様々なリガンドアーキテクチャを持つ幅広い親和性ライブラリーの必要性と利点を強調している。
さらに、既知の足場ライブラリーの中でも、多くの異なるライブラリーを持つ必要性が残されている。例えば、ある研究では、48の異なる足場ファミリーがリガンド発見のために調べられ、62の最良のリガンドはすべて単一の足場ライブラリーから引き出されました(48の足場ライブラリーから45の足場)。この並外れた発見は、特定のリガンドアーキテクチャ内の高度な配列多様性だけでなく、リガンドアーキテクチャの多様性の必要性を強調している。足場ファミリー間及び足場ファミリー中でリガンドの多様性を効率的に処理することは、リガンド発見の取り組みにおける主要な技術的課題である。さらなる研究では、62のリガンド間の配列の類似性により、これらのリガンドを5つのクレードに分類することができた。他のファミリーは中程度の親和性を持つ約900のリガンドを生成したが、それらのリガンドは62の最良のリガンドに関連する選択性に欠けていた。興味深いことに、62の最良のリガンドに使用される足場は、生物学的な「ロックアンドキー」親和性リガンドに対応するために開発された。他の足場タイプからの選択的リガンドの不足は、この特定の足場ファミリーが同族受容体を模倣するために必要な分子構築を有することのみを示した(Coyle et al.in Approaches to the Purification,Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics,(ed.,Matte)Elsevier,2020,p.55-79(at p.65)。
したがって、親和性リガンドの不足とライブラリー間の様々な有用性により、複数のリガンド標的アーキテクチャを表す多くの異なるタイプの構造と相互作用できるリガンドライブラリーの必要性が生まれた。ここで説明するライブラリーは、これらのニーズに対応するための戦略の一部である。
Graille et al(2000)Proc Natl Acad Sci USA.97:5399-5404
Du et al.(2016)Int.J.Mol.Sci.17.doi:10.3390/ijms17020144
Coyle et al.in Approaches to the Purification,Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics,(ed.,Matte)Elsevier,2020,p.55-79(at p.65)
親和性リガンドライブラリーは、標的分子に対する新しい親和性リガンドのソースとして有用であり、バイオプロセス親和性クロマトグラフィーを使用して標的を精製するための簡単で経済的な方法の必要性を満たす。
一態様では、本開示は、N末端からC末端までの式によって表されるアミノ酸配列を含む親和性リガンドをメンバーがコードする核酸ライブラリーを提供し、
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS-[X6]n-SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12QAPX13-[B]
(配列番号1)
式中、
(a)[A]は、αヘリックス形成ペプチドドメインを含み、
(b)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X10、X11、及びX12のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸であり、
(c)nは、存在するX6残基の数を表し、1~10までの整数であり、
(d)X9及びX13はそれぞれ独立してA、KまたはRであり、及び、
(e)[B]が、存在しないか、VDであるか、または以下のアミノ酸配列を含むペプチドドメインである
VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号9)、GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号10)、
VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号11)または
GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号12)。
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS-[X6]n-SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12QAPX13-[B]
(配列番号1)
式中、
(a)[A]は、αヘリックス形成ペプチドドメインを含み、
(b)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X10、X11、及びX12のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸であり、
(c)nは、存在するX6残基の数を表し、1~10までの整数であり、
(d)X9及びX13はそれぞれ独立してA、KまたはRであり、及び、
(e)[B]が、存在しないか、VDであるか、または以下のアミノ酸配列を含むペプチドドメインである
VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号9)、GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号10)、
VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号11)または
GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号12)。
特定の実施形態では、[A]のαヘリックス形成ペプチドドメインは、Zドメイン、Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、DドメインまたはEドメインなどのブドウ球菌プロテインA(SPA)ドメインのアルカリ安定ヘリックス1を含み、いくつかの実施形態では、好ましくはZドメインである。いくつかの実施形態では、[A]は、VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号2)、VDAKFDKELEEARAKIERLPNLTE(配列番号3)、VDAKFDKELEEVRAEIERLPNLTE(配列番号4)、VDAKFEKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号5)、VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE(配列番号6)またはVDAKFDKELEEARAEIERLPALTE(配列番号7)のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、[A]のN末端は、MまたはMAQGT(配列番号8)によって先行され得る。
特定の実施形態では、核酸ライブラリーは、表1の配列番号13~18のライブラリーのうちのいずれか1つである。他の実施形態では、本開示の核酸ライブラリーは、[A]をVDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号2)として、nを1として、X13をKとして有する。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸ライブラリーのいずれもペプチドタグを含むことができ、場合により、ペプチドタグは、ヘマグルチニン、c-myc、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D、T7、GST、GFP、MBP、strepタグ、Hisタグ、Mycタグ、TAPタグ、またはFLAGタグである。
特定の実施形態では、親和性リガンドは、C末端リジンまたはシステインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、RNAディスプレイライブラリーまたはDNAディスプレイライブラリーである。ファージディスプレイライブラリーは特に有用であり、およそ106~109の理論的に異なる核酸配列を含み得る。
さらなる態様では、本開示は、目的の標的分子と選択的に相互作用するポリペプチドを同定する方法を提供し、本方法は、(a)目的の標的分子を本開示の核酸ライブラリーの発現により生成されたポリペプチドに暴露すること、及び、(b)標的分子と選択的に相互作用しないポリペプチドから選択的に相互作用するポリペプチドを分離すること、を含む。そのような方法において、実施形態は、目的の標的分子をファージ、細菌または細胞の表面に発現させるか、または固相支持体に付着させる、繋留する、または他の方法で会合させることを含む。
本開示はさらに、目的の標的分子に高い親和性で特異的に結合するポリペプチド(すなわち、親和性リガンド)についてライブラリーをスクリーニングする方法を提供し、ライブラリーは、(a)ポリペプチドの分子への特異的結合に適した条件下で、ある濃度の標的分子と共にライブラリーのサンプルをインキュベートすること、(b)ライブラリーの第2のサンプルを同じ条件下で、ただし標的分子なしでインキュベートすること、(c)ポリペプチドの固定化標的分子への結合に適した条件下で、第1及び第2のサンプルのそれぞれを固定化標的分子と接触させること、(d)各サンプルについて、固定化された標的分子に結合したポリペプチドを検出すること、及び、(e)第2のサンプルから結合したポリペプチドの量に対する第1のサンプルから結合したポリペプチドの量の比を計算することにより標的分子に対するポリペプチドの親和性を決定すること、により本開示の核酸ライブラリーの発現により生成された複数のポリペプチドを含む。
本開示のさらなる態様は、目的の標的分子に特異的に結合する1つまたは複数の親和性リガンドを同定する方法に関し、本方法は、(a)標的分子をファージディスプレイライブラリーと接触させること、(b)標的分子と(または標的分子に)特異的に結合するファージを、標的分子と選択的に結合しないファージから分離して、濃縮されたファージライブラリーを生成すること、(c)濃縮されたファージライブラリーを使用して、工程a)及びb)を繰り返して、さらに濃縮されたファージライブラリーを生成すること、(d)さらに濃縮されたファージライブラリーが元のファージライブラリーと比較して少なくとも約10倍~約106倍またはそれ以上濃縮されるまで工程c)を繰り返すこと、及び、(e)さらに濃縮されたファージライブラリーをプレーティングし、そこから個々のクローンを単離及び特徴付け、それにより目的の標的分子に特異的に結合する1つまたは複数の親和性リガンドを同定すること、を含む。
前述の方法のいくつかの実施形態では、標的分子は固体支持体に結合または付着している。他の実施形態では、ファージディスプレイライブラリーは、固体支持体に結合または付着している。いずれの場合も、標的分子はアデノ随伴ウイルス(AAV)またはAAVキャプシドであり得、より具体的には、AAVはAAV8またはAAV8血清型変異体である。
さらなる態様では、本開示は、複数の合成または組換えポリペプチドを含むポリペプチドライブラリー組成物を提供し、各ポリペプチドは、本明細書に記載の核酸ライブラリーの親和性リガンドを含む。
別の態様では、本開示は、目的の標的分子に特異的に結合するポリペプチドを同定する方法に関し、本方法は、(a)目的の標的分子を本開示のポリペプチドライブラリー組成物に暴露すること、(b)標的分子に特異的に結合するポリペプチドを、標的分子に選択的に結合しないポリペプチドから分離すること、及び、(c)標的分子によって結合された1つまたは複数のポリペプチドを同定すること、を含む。
定義
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を以下に定義する。本明細書で他に定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を以下に定義する。本明細書で他に定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
単位、接頭辞、及び記号は、Systeme International de Unites(SI)で承認された形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含むものとする。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれている。本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる、本開示の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
「a」または「an」という用語の本質は、その本質の1つまたは複数を指すことに注意されたく、例えば、「親和性リガンド」は、1つまたは複数の親和性リガンドを表すと理解される。したがって、「a」(または「an」)、「1つまたは複数」、及び「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
およそまたは約:本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の1つ以上の値に適用される場合、記載された基準値に類似した値を表す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または特に文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの方向(上回るまたは下回る)で、25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%以内に収まる値の範囲を指す(ただし、そのような数値が、取り得る値の100%を超える場合を除く)。
本明細書で使用される「複数」という用語は、コレクションのメンバーの数を指し、その最小数は少なくとも10、20、30、50、75、100、1000、またはそれ以上であり、その最小数または最大数は容易に確認できない場合があるが、ただし、コレクションのタイプまたはその使用のコンテキストによって示される場合がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、その力価に等しい複数のファージ(同じでも異なっていてもよい)を含み、拡張により、対応する複数のポリペプチドをコードする。
「含む」という用語は、「含むがこれに限定されない」という意味で使用される。「含む」及び「含むがこれに限定されない」は、同義に使用される。
生物活性:本明細書で使用される「生物活性」という用語は、生物系、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与されると、その生物に対して生物学的または生理学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。
変異体と突然変異体:「変異体」という用語は、通常、科学文献で定義されており、本明細書では、受け入れられている基準とは何らかの形で遺伝的に異なる生物を参照して本明細書で使用される。「変異体」は、遺伝的ではない表現型の違いを記述するためにも使用することができる(King and Stansfield,2002,A dictionary of genetics,6th ed.,New York,New York,Oxford University Press。
「突然変異」という用語は、ほとんどの辞書で定義されており、遺伝子の構造に遺伝的変化を導入するプロセスを参照して本明細書で使用され(King&Stansfield,2002)、それによって「突然変異体」を生成する。「変異体」という用語は、科学的及び非科学的な文献で「変異」という用語の代わりにだんだん使用されている。本用語は、本明細書において同義に使用される。
保存的及び非保存的:「保存的」アミノ酸置換とは、1つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H))、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E))、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン(G)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、チロシン(Y)、システイン(C))、非極性側鎖(例えば、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、プロリン(P)、フェニルアラニン(F)、メチオニン(M)、トリプトファン(W))、ベータ分岐側鎖(例えば、トレオニン(T)、バリン(V)、イソロイシン(I))及び芳香族側鎖(例えば、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、ヒスチジン(H))を含む。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は保存的置換である。いくつかの実施形態では、リガンドの配列における保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの特異的結合を付与または改善する。いくつかの実施形態では、リガンドの配列における保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの結合を減少または無効にしない。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの特異的結合に有意な影響を及ぼさない。選択的結合親和性を与える、変更する、または維持するヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換及び非保存的置換を同定する方法は、当技術分野で知られている(例えば、Brummell、Biochem.32:1180-1187(1993)、Kobayashi,Protein Eng.12(10):879-884(1999)、及びBurks,PNAS94:412-417(1997)を参照)。いくつかの実施形態では、リガンドの配列における非保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの特異的結合を付与または改善する。いくつかの実施形態では、リガンドの配列における非保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの結合を減少または無効にしない。いくつかの実施形態では、非保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの特異的結合に有意な影響を及ぼさない。
親和性クロマトグラフィー:本明細書で使用される「親和性クロマトグラフィー」という用語は、親和性リガンドが「ロックキー」方式で生物学的親和性を介して標的と相互作用する特定のモードのクロマトグラフィーを指す。親和性クロマトグラフィーにおける有用な相互作用の例には、例えば、酵素-基質相互作用、ビオチンーアビジン相互作用、抗体-抗原相互作用などが挙げられる。
親和性リガンド及びリガンド:「親和性リガンド」及び「リガンド」という用語は、本明細書では同義に使用される。これらの用語は、本明細書では、それに特異的な部分、例えばポリペプチドまたはタンパク質に高親和性で可逆的に結合することができる分子を指すために使用される。
タンパク質ベースのリガンド:本明細書で使用される「タンパク質ベースのリガンド」という用語は、標的ポリペプチドまたはタンパク質に可逆的に結合するペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質の一部を含むリガンドを意味する。本開示の「リガンド」はタンパク質ベースのリガンドであることが理解される。
親和性剤:本明細書で使用される「親和性剤」という用語は、生物特異的親和性リガンドが共有結合している固体支持体またはマトリックスを指す。通常、固体支持体またはマトリックスは、標的分子が精製される系に不溶性である。「親和性剤」及び「親和性分離マトリックス(ces)」及び「分離マトリックス(ces)」という用語は、本明細書では同義に使用される。
リンカー:本明細書で使用される場合、「リンカー」は、そうでなければ独立した機能ドメインを連結するように機能するペプチドまたは他の化学結合を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、リガンドと、そうでなければ独立した機能ドメインまたは構造ドメインを含む別のポリペプチド成分との間に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーは、リガンドと表面との間に位置するペプチドまたは他の化学結合である。
天然に存在する:核酸分子、ポリペプチド、及び宿主細胞などの生体物質に関連して使用される場合の「天然に存在する」という用語は、自然界に存在し、人間によって改変されていないものを指す。逆に、「非天然」または「合成」は、生物材料に関連して使用される場合、自然界には見られない、及び/または人間によって改変されたものを指す。
「非天然アミノ酸」、「アミノ酸類似体」、及び「非標準アミノ酸残基」は、本明細書では同義に使用される。本明細書で提供されるリガンドにおいて置換され得る非天然アミノ酸は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、プロリンの代わりに使用できる4-ヒドロキシプロリン、リジンの代わりに使用できる5-ヒドロキシリジン、ヒスチジンの代わりに使用できる3-メチルヒスチジン、セリンの代わりに使用できるホモセリン、及び、リジンの代わりに使用できるオルニチンである。ポリペプチドリガンドで置換できる非天然アミノ酸の追加の例には、これらに限定されないが、一般的なアミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸、アルフーアミノイソ酪酸、Aーアミノ酪酸、Abu、2ーアミノ酪酸、γーAbu、ε-Ahx、6ーアミノヘキサン酸、Aib、2ーアミノイソ酪酸、3ーアミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、tーブチルグリシン、tーブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ベーターアラニン、ランチオニン、デヒドロアラニン、γーアミノ酪酸、セレノシステイン、ピロリジンフルオロアミノ酸、ベーターメチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、Cアルファーメチルアミノ酸、及びNアルファーメチルアミノ酸が挙げられる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」:本明細書で同義に使用される場合、ポリヌクレオチド及び核酸分子は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語には、DNA、RNA、cDNA(相補的DNA)、mRNA(メッセンジャーRNA)、rRNA(リボソームRNA)、shRNA(小型ヘアピンRNA)、snRNA(小型核RNA)、snoRNA(短核小体RNA)、miRNA(マイクロRNA)、ゲノムDNA、合成DNA、合成RNA、及び/またはtRNA(トランスファーRNA)が含まれるが、これらに限定されない。
「作動可能に連結した」:本明細書で使用される「作動可能に連結した」という用語は、構成要素が正常に機能し、これらの構成要素のうちの少なくとも1つが他の構成要素のうちの少なくとも1つに与えられる機能を媒介し得る可能性を許容するように配置されるように、2つ以上の構成要素が配置されていることを示す。2つの分子は、直接的または間接的に結合されているかどうかにかかわらず、「作動可能に結合」している。
ペプチドタグ:本明細書で使用される「ペプチドタグ」という用語は、得られる融合物に機能を提供するために、別のタンパク質の一部であるか、別のタンパク質に(例えば、遺伝子工学によって)付着しているペプチド配列を指す。ペプチドタグは通常、それらが融合しているタンパク質と比較して比較的短い。いくつかの実施形態では、ペプチドタグは、5、6、7、8、9、10、15、20、または25以上のアミノ酸など、長さが4以上のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ペプチドタグを含むタンパク質である。本明細書で提供される用途を有する多数のペプチドタグが当技術分野で知られている。リガンド融合タンパク質の成分またはリガンドによって結合された標的(例えば、リガンド融合タンパク質)であり得るペプチドタグの例には、HA(ヘマグルチニン)、c-myc、ヘルペスシンプレックスウイルス糖タンパク質D(gD)、T7、GST、GFP、MBP、Strepタグ、Hisタグ、Mycタグ、TAPタグ、及びFLAGタグ(EastmanKodak,Rochester,N.Y.)が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、タグに対する抗体エピトープは、例えば親和性精製、ウエスタンブロット、ELISAアッセイ、及び細胞の免疫染色における融合タンパク質の検出及び局在化を可能にする。
ポリペプチド:本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して互いに連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者は、この用語が長い鎖に限定されず、ペプチドを介して互いに連結された2つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するであろう。当業者に知られているように、ポリペプチドはプロセシング及び/または改変され得る。
タンパク質:本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、別個の単位として機能する1つまたは複数のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個の機能単位であり、別個の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的または一時的な物理的会合を必要としない場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同義に使用され得る。別個の機能単位が互いに物理的に会合する複数のポリペプチドから構成される場合、「タンパク質」という用語は、物理的に結合され、別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
特異的に結合する:リガンドに関して本明細書で使用される「特異的に結合する」または「選択的親和性を有する」という用語は、リガンドがより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、より大きな親和性で、またはそれらの組み合わせで、関係のないタンパク質を含む代替物質とよりも、特定のエピトープ、タンパク質、または標的分子に対して反応または会合することを意味する。異なる種の相同タンパク質間の配列同一性のため、特異的結合は、複数の種のタンパク質または標的を認識する、例えば、二重特異性または三重特異性である結合剤を含み得る。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列のある領域内の相同性のため、特異的結合は、複数のタンパク質または標的を認識する結合剤を含み得る。特定の実施形態では、第1の標的に特異的に結合する結合剤は、第2の標的に特異的に結合してもしなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的結合」は、排他的結合、すなわち、単一の標的への結合を必ずしも必要としない(含めることはできるが)。したがって、リガンドまたは親和剤は、特定の実施形態では、複数の標的に特異的に結合し得る。特定の実施形態では、複数の標的が、親和剤上の同じ結合部位によって結合され得る。「選択的に結合する」または「選択的に相互作用する」は、本明細書では「特異的に結合する」と同義に使用される。
実質的に:本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴または属性の全または近完全(near-total)程度または度合いを示すという定量的状態を指す。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が、もし存在する場合、めったに完了しないこと、及び/またはめったに完全に進まないこと、または絶対的な結果を達成または回避することはめったにないことを理解するであろう。従って「実質的に」という用語は、多くの生物学的現象及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
本開示は、とりわけ、1つまたは複数の目的の標的、例えば、いくつかの実施形態ではウイルス粒子に特異的な親和性リガンドを選択するための核酸及びポリペプチドライブラリーを包含する。
親和性リガンドライブラリー、その構築及び使用方法
本開示のライブラリーは、特定の三束ヘリックスタンパク質をコードするポリペプチド組成物及び/または核酸分子を含み(図2及び3)、それらのライブラリー内の配列を同定及び選択するために使用することができ、これらのライブラリーは、目的の1つまたは複数の標的分子に選択的に結合し、それにより、標的分子のバイオプロセシングに使用するための、または他の用途のための親和性リガンドが得られる。本開示のライブラリーは、いくつかの実施形態においてアルカリ安定性であり、目的の選択された標的に高い親和性で選択的に結合する、新規の親和性リガンドの生成を可能にする。
本開示のライブラリーは、特定の三束ヘリックスタンパク質をコードするポリペプチド組成物及び/または核酸分子を含み(図2及び3)、それらのライブラリー内の配列を同定及び選択するために使用することができ、これらのライブラリーは、目的の1つまたは複数の標的分子に選択的に結合し、それにより、標的分子のバイオプロセシングに使用するための、または他の用途のための親和性リガンドが得られる。本開示のライブラリーは、いくつかの実施形態においてアルカリ安定性であり、目的の選択された標的に高い親和性で選択的に結合する、新規の親和性リガンドの生成を可能にする。
本明細書に開示されるライブラリーを作製する方法には、核酸ライブラリーについて、及び、ペプチドライブラリー、直接化学合成については直接合成、組換え生産、二量体-三量体またはコドン突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発など、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。かかる方法は、当業者に周知である。
したがって、本開示の核酸ライブラリーは、親和性リガンドをコードするメンバーを含み、メンバーは、N末端からC末端の、次の式によって表されるアミノ酸配列を含み、
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS-[X6]n-SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12QAPX13-[B]
(配列番号1)
式中、
(a)[A]は、αヘリックス形成ペプチドドメインを含み、
(b)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X10、X11、及びX12のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸であり、
(c)nは、存在するX6残基の数を表し、1~10の整数であり、
(d)X9及びX13はそれぞれ独立してA、KまたはRであり、
(e)[B]が存在しないか、VDであるか、または以下のアミノ酸配列を含むペプチドドメインである
VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号9)、GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号10)、
VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号11)、または、
GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号12)。
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS-[X6]n-SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12QAPX13-[B]
(配列番号1)
式中、
(a)[A]は、αヘリックス形成ペプチドドメインを含み、
(b)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X10、X11、及びX12のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸であり、
(c)nは、存在するX6残基の数を表し、1~10の整数であり、
(d)X9及びX13はそれぞれ独立してA、KまたはRであり、
(e)[B]が存在しないか、VDであるか、または以下のアミノ酸配列を含むペプチドドメインである
VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号9)、GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号10)、
VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号11)、または、
GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号12)。
式の部分[A]は、αヘリックス形成ペプチドドメインを含み、好ましくはアルカリ安定性である。そのようなペプチドドメインは、様々なソースから当技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態では、αヘリックス形成ペプチドドメインはブドウ球菌プロテインA(SPA)ドメインである。特定の実施形態では、SPAドメインは、SPAZドメイン、Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、Dドメイン、または、Eドメインのいずれか1つの残基5~19で見出されるSPAドメインのアルカリ安定ヘリックス1を含み、好ましくは、Zドメインのものである(例えば、Nilsson et al.(1987)Prot.Eng.1:107-113)、及び米国特許第6534628号、同第6831161号、同第7834158号、同第9187555号、同第9663558号、同第9683013号、同第10308690号、同第10501557号、及び同第10703774号を参照されたい)。
いくつかの実施形態では、本開示のライブラリー[A]は、VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号2)、VDAKFDKELEEARAKIERLPNLTE(配列番号3)、VDAKFDKELEEVRAEIERLPNLTE(配列番号4)、VDAKFEKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号5)、VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE(配列番号6)またはVDAKFDKELEEARAEIERLPALTE(配列番号7)のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。ライブラリー中の親和性リガンドのN末端(すなわち、[A]のN末端)は、メチオニンであってもよく、またはMAQGT(配列番号8)の追加のアミノ酸配列を含んでもよい。
[B]が存在しない、またはVDである本開示の核酸ライブラリーの実施形態では、追加のアミノ酸が[B]のC末端に存在し得る。このような追加のアミノ酸には、親和性リガンドの支持マトリックスへの結合を容易にするためのペプチドタグ及びアミノ酸が含まれる。
したがって、本開示の核酸ライブラリーのいずれも、ヘマグルチニン、c-myc、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D、T7、GST、GFP、MBP、Strepタグ、Hisタグ、Mycタグ、TAPタグ、またはFLAGタグであるペプチドタグを含むが、これらに限定されないペプチドタグをさらに含むことができる。
特定の実施形態において、核酸ライブラリーは、表1に提供されるライブラリーのいずれか1つであり、すなわち、ライブラリーは、表1に示されるアミノ酸配列を含む親和性リガンドをコードするメンバーを含み、X、[A]、n及び[B]は上記で定義したとおりである。ライブラリーのいくつかの実施形態では、nは1である。X6はループ構造の一部を形成する可能性があるため、X6はPまたはHでないことが好ましい。一実施形態では、本開示の核酸ライブラリーは、[A]がVDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号2)であり、nが1であり、X13がKである上記の式を有する。
ライブラリーの例示的な実施形態では、[A]はVDAKFDKELEEARAEIERLPNLTEであり、X9以外の各X位置は任意のアミノ酸であり、X9はA、RまたはKであるが、但し、以下の基準の少なくとも2つを満たすことを条件とする:X2がアラニン(A)でない、X4がセリン(S)でない、X5がアスパラギン酸(D)でない、X6がグルタミンまたはセリン(QまたはS)でない、X8がグルタミン酸(E)でない、X10がリジン(L)でない、かつX11がロイシン(L)ではない。
別のライブラリーの例示的な実施形態では、[A]はVDAKFDKELEEARAEIERLPNLTEであり、X9及びX12以外の各X位置は任意のアミノ酸であり、X9及びX12のそれぞれはA、RまたはKであるが、但し、以下の基準の少なくとも2つを満たすことを条件とする:X2がアラニン(A)でない、X4がセリン(S)でない、X5がアスパラギン酸(D)でない、X6がグルタミンまたはセリン(QまたはS)でない、X8がグルタミン酸(E)でない、X10がリジン(L)でない、かつX11がロイシン(L)ではない。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸ライブラリーのいずれも、ヘマグルチニン、c-myc、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D、T7、GST、GFP、MBP、Strepタグ、Hisタグ、Mycタグ、TAPタグ、またはFLAGタグであるペプチドタグを含むが、これらに限定されないペプチドタグをさらに含むことができる。他の実施形態では、ペプチドタグと組み合わせて、または組み合わせずに、ライブラリー中の親和性リガンドはC末端リジンまたはシステインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、RNAディスプレイライブラリーまたはDNAディスプレイライブラリーである。ファージディスプレイライブラリーでは、106~109の理論的に異なる核酸配列を持つことが可能である。
本開示の別の態様によれば、本明細書の核酸ライブラリーは、目的の標的分子に選択的に結合するポリペプチドを同定するための様々な方法で使用される。一実施形態では、目的の標的分子に選択的に結合するポリペプチドを同定する方法を提供し、本方法は、(a)目的の標的分子を本開示の核酸ライブラリーの発現により生成されたポリペプチドに暴露すること、及び、(b)標的分子に選択的に結合しないポリペプチドから選択的に結合するポリペプチドを分離すること、を含む。一実施形態では、目的の標的分子を、ファージ、細菌または細胞の表面に発現させるか、または固相支持体に付着させる、繋留する、または他の方法で会合させることを含む。
別の実施形態では、目的の標的分子に高い親和性で選択的に結合するポリペプチドについてライブラリーをスクリーニングする方法を提供し、ライブラリーは、本開示の核酸ライブラリーの発現により生成された複数のポリペプチドを含み、方法は、(a)ポリペプチドの分子への特異的結合に適した条件下で、ある濃度の標的分子と共にライブラリーのサンプルをインキュベートすること、(b)ライブラリーの第2のサンプルを同じ条件下で、ただし標的分子なしでインキュベートすること、(c)ポリペプチドの固定化標的分子への結合に適した条件下で、第1及び第2のサンプルのそれぞれを固定化標的分子と接触させること、(d)各サンプルについて、固定化された標的分子に結合したポリペプチドを検出すること、及び、(e)第2のサンプルから結合したポリペプチドの量に対する第1のサンプルから結合したポリペプチドの量の比を計算することにより標的分子に対するポリペプチドの親和性を決定することを含む。
さらに別の実施形態では、目的の標的分子に選択的に結合する1つまたは複数の親和性リガンドを同定する方法を提供し、本方法は、(a)前記標的分子を本開示のファージディスプレイライブラリーと接触させること、(b)標的分子を選択的に結合するファージを、標的分子を選択的に結合しないファージから分離して、濃縮されたファージライブラリーを生成すること、(c)濃縮されたファージライブラリーを使用して、工程(a)及び(b)を繰り返して、さらに濃縮されたファージライブラリーを生成すること、(d)さらに濃縮されたファージライブラリーが元のファージライブラリーと比較して少なくとも約10倍~約106倍またはそれ以上濃縮されるまで工程(c)を繰り返すこと、及び、(e)さらに濃縮されたファージライブラリーをプレーティングし、そこから個々のクローンを単離及び特徴付け、それにより目的の標的分子に選択的に結合する1つまたは複数の親和性リガンドを同定すること、を含む。所望の個々のクローンを容易に単離するために十分にさらに濃縮されたファージライブラリーを取得するために必要なサイクル数は、通常、3~8ラウンドの選択の範囲であり、より一般的には3~4ラウンドの選択で行うことができる。この方法では、標的分子またはファージディスプレイライブラリーのいずれかを固体支持体に結合または付着させて、選択的結合を容易にする(及び洗浄条件を簡素化する、この方法は連続するラウンドで変化させることができる(実施例を参照))。結合したファージを溶出及び回収するための当技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。
これらの方法のいずれかの好ましい実施形態では、標的分子はAAVウイルスまたはキャプシドであり、好ましくはAAV8ウイルスまたはその血清型変異体である。
さらなる態様は、複数の合成または組換えポリペプチドを含むポリペプチドライブラリー組成物に関し、各ポリペプチドは、本開示の核酸ライブラリーのいずれかについて上記で定義した親和性リガンドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、50以上であるか、または本明細書で定義されている通りである(上記参照)。ファージディスプレイライブラリーによって生成されるポリペプチド組成物のそれらの実施形態では、組成物は、ファージ力価によって決定される、100~1010個のポリペプチドを有することができる。
なおさらなる態様は、目的の標的分子に選択的に結合するポリペプチド(親和性リガンド)を同定する方法に関し、本方法は、(a)目的の標的分子を本開示のポリペプチドライブラリー組成物に暴露すること、及び、(b)前記標的分子を選択的に結合しないポリペプチドから前記標的分子に選択的に結合するポリペプチドを分離すること、を含む。
したがって、本開示は、任意の数の所望の分子標的分子のうちの1つまたは複数に向けられた結合特異性を有する親和性リガンドをスクリーニング及び選択するための強力な方法を提供する。本開示のライブラリーをスクリーニングし、推定結合部分配列(ポリペプチド及び/または核酸)を含むクローンを濃縮し、精製し、特定の目的の分子標的分子について、当技術分野で既知かつ利用可能な任意のインビトロまたはインビボ生物学的アッセイで試験することができる。分子標的結合クローンが単離されると、親和性リガンドをコードするポリペプチド及び/または核酸分子が同定され、場合により単離され得る。当業者は、標準的な遺伝子工学及び分子工学、例えば、親和性成熟及び他の周知の技術を使用して、意図した目的のために結合部分の特性を最適化し、例えば、標的の精製とバイオプロセスの製造を容易にするために、高親和性で目的の標的に相互作用し、可逆的に結合する親和性リガンドを生成することができる。一般に、本開示の親和性リガンドはアルカリ安定性である。
したがって、本開示は、任意の数の所望の分子標的分子のうちの1つまたは複数に向けられた結合特異性を有する親和性リガンドをスクリーニング及び選択するための強力な方法を提供する。本開示のライブラリーをスクリーニングし、推定結合部分配列(ポリペプチド及び/または核酸)を含むクローンを濃縮し、精製し、特定の目的の分子標的分子について、当技術分野で既知かつ利用可能な任意のインビトロまたはインビボ生物学的アッセイで試験することができる。分子標的結合クローンが単離されると、親和性リガンドをコードするポリペプチド及び/または核酸分子が同定され、場合により単離され得る。当業者は、標準的な遺伝子工学及び分子工学、例えば、親和性成熟及び他の周知の技術を使用して、意図した目的のために結合部分の特性を最適化し、例えば、標的の精製とバイオプロセスの製造を容易にするために、高親和性で目的の標的に相互作用し、可逆的に結合する親和性リガンドを生成することができる。一般に、本開示の親和性リガンドはアルカリ安定性である。
親和性剤で使用するための目的の標的に結合するリガンド
標的に結合するリガンドの特徴は、そのような活性を評価するための当技術分野で知られている既知のまたは改変されたアッセイ、バイオアッセイ、及び/または動物モデルを使用して決定することができる。
標的に結合するリガンドの特徴は、そのような活性を評価するための当技術分野で知られている既知のまたは改変されたアッセイ、バイオアッセイ、及び/または動物モデルを使用して決定することができる。
本明細書で使用される場合、「標的に対する結合親和性」、「標的に結合する」などの用語は、例えば、親和定数(例えば、所定の抗原濃度で結合及び解離するリガンドの量)の決定を通じて直接測定され得るリガンドの特性を示す。このような分子相互作用を特徴付けるために、例えば、競合分析、平衡分析及び微量熱量分析、並びに表面プラズモン共鳴相互作用に基づくリアルタイム相互作用分析(BIACORE装置などを使用)など、いくつかの方法を利用することができる。これらの方法は当業者に周知であり、NeriD et al.(1996)Tibtech14:465-470 and JanssonM et al.(1997)JBiolChem272:8189-8197などの刊行物で論じられている。
特定のリガンド結合イベントの親和性要件は、結合マトリックスの組成と複雑さ、リガンドと標的分子の両方の原子価と密度、及びリガンドの機能的適用を含むがこれらに限定されない様々な要因に左右される。いくつかの実施形態では、リガンドは、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、または10-5M以下の解離定数(KD)で目的の標的に結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M,または10-8M以下のKDで目的の標的に結合する。5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M,5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、または10-15M以下のKDで目的の標的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法により生成されたリガンドは、約10-4M~約10-5M,約10-5M~約10-6M、約10-6M~約10-7M、約10-7M~約10-8M、約10-8M~約10-9M、約10-9M~約10-10M、約10-10M~約10-11M、または約10-11M~約10-12Mの解離定数を有する。
KD及び解離速度を決定するための結合実験は、多くの条件で行うことができる。これらの溶液を作るための緩衝液は、当業者によって容易に決定することができ、最終溶液の所望のpHに大きく依存する。低pH溶液(<pH5.5)は、例えば、クエン酸緩衝液、グリシン-HCl緩衝液、またはコハク酸緩衝液で作成できる。高pH溶液は、例えば、Tris-HCl、リン酸緩衝液、または重炭酸ナトリウム緩衝液で作成できる。例えば、最適なpH及び/または塩濃度を決定する目的で、KD及び解離速度を決定するために、多くの条件を使用することができる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、0.1~10-7秒-1、10-2~10-7秒-1、または0.5×10-2~10-7秒-1の範囲のkoffで目的の標的を特異的に結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1、または10-3秒-1未満のオフ速度(koff)で目的の標的を結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1、または10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1、または10-7秒-1未満のオフ速度(koff)で目的の標的を結合する。
いくつかの実施形態では、リガンドは、約103~107M-1秒-1、103~106M-1秒-1、または103~105M-1秒-1の範囲のkonで目的の標的に特異的を結合する。いくつかの実施形態では、リガンド(例えば、リガンド融合タンパク質)は、103M-1秒-1、5×103M-1秒-1104M-1秒-1、または5×104M-1秒-1超のオン速度(kon)で目的の標的を結合する。追加の実施形態では、リガンドは、105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1、5×106M-1秒-1、または107M-1秒-1超のkonで目的の標的を結合する。
目的の標的
様々な実施形態によれば、リガンドによって特異的に結合される目的の標的は、親和剤のリガンドが結合することが望ましい任意の分子であり得る。例えば、リガンドによって特異的に結合される標的は、精製、製造、処方、治療、診断、または予後に関する関連性または価値のある任意の標的であり得る。非限定的な用途には、治療及び診断用途が含まれる。本明細書では、例としていくつかの例示的な標的を提供するが、これらは例示を目的としており、限定するものではない。目的の標的は、天然または合成であり得る。いくつかの実施形態では、標的は生物学的に活性なタンパク質である。いくつかの実施形態では、目的の標的は、細胞外成分または細胞内成分、可溶性因子(例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、成長因子、抗体など)、または膜貫通タンパク質(例えば、細胞表面受容体)である。いくつかの実施形態では、リガンドによって特異的に結合される目的の標的は、異なる配列を有するリガンド自体である。
様々な実施形態によれば、リガンドによって特異的に結合される目的の標的は、親和剤のリガンドが結合することが望ましい任意の分子であり得る。例えば、リガンドによって特異的に結合される標的は、精製、製造、処方、治療、診断、または予後に関する関連性または価値のある任意の標的であり得る。非限定的な用途には、治療及び診断用途が含まれる。本明細書では、例としていくつかの例示的な標的を提供するが、これらは例示を目的としており、限定するものではない。目的の標的は、天然または合成であり得る。いくつかの実施形態では、標的は生物学的に活性なタンパク質である。いくつかの実施形態では、目的の標的は、細胞外成分または細胞内成分、可溶性因子(例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、成長因子、抗体など)、または膜貫通タンパク質(例えば、細胞表面受容体)である。いくつかの実施形態では、リガンドによって特異的に結合される目的の標的は、異なる配列を有するリガンド自体である。
リンカー
「リンカー」及び「スペーサー」という用語は、本明細書では同義に使用され、そうでなければ独立した機能ドメインを連結するように機能するペプチドまたは他の化学結合を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、リガンドと、そうでなければ独立した機能ドメインまたは構造ドメインを含む別のポリペプチド成分との間に位置する。2つ以上の連結したリガンドを連結するのに適したリンカーは、一般に、ペプチド、タンパク質または他の有機分子を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、薬学的使用を目的とするタンパク質またはポリペプチドを構築するのに適している。
「リンカー」及び「スペーサー」という用語は、本明細書では同義に使用され、そうでなければ独立した機能ドメインを連結するように機能するペプチドまたは他の化学結合を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、リガンドと、そうでなければ独立した機能ドメインまたは構造ドメインを含む別のポリペプチド成分との間に位置する。2つ以上の連結したリガンドを連結するのに適したリンカーは、一般に、ペプチド、タンパク質または他の有機分子を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、薬学的使用を目的とするタンパク質またはポリペプチドを構築するのに適している。
リガンドとリガンド融合タンパク質の追加成分を単鎖アミノ酸配列で作動可能に連結するのに適したリンカーには、グリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン/セリンリンカー、グリシン及びセリンに富むリンカー、または大部分が極性のポリペプチドフラグメントで構成されるリンカーが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択されるアミノ酸の大部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、グルタミン、及びリジンから選択されるアミノ酸の大部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンドリンカーは、立体的に妨げられていない大部分のアミノ酸から構成される。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、セリン、及び/またはアラニンから選択されるアミノ酸の大部分を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ポリグリシン((Gly)5及び(Gly)8など、ポリ(Gly-Ala)、及びポリアラニンから選択される。
リンカーは、リガンドが目的の標的に結合することを可能にする方法でリガンドを作動可能に連結できる限り、任意のサイズまたは組成のものであってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、約1~50個のアミノ酸、約1~20個のアミノ酸、約1~15個のアミノ酸、約1~10個のアミノ酸、約1~5個のアミノ酸、約2~20個のアミノ酸、約2~15個のアミノ酸、約2~10個のアミノ酸、または約2~5個のアミノ酸である。リンカーの長さ、柔軟性の程度、及び/または他の特性が、目的の標的、または、目的の1つ、または、複数の他の標的タンパク質、または目的ではないタンパク質(つまり、非標的タンパク質)に対する親和性、特異性、または結合力など、親和性剤で使用するためのリガンドの特定の特性に影響を与え得ることは明らかなはずである。いくつかの実施形態では、2つ以上のリンカーが利用される。いくつかの実施形態では、2つ以上のリンカーが同じである。いくつかの実施形態では、2つ以上のリンカーが異なる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、アルキルリンカーまたはPEGリンカーなどの非ペプチドリンカーである。例えば、-NH-(CH2)s-C(O)-(式中、s=2~20)などのアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル、例えば、C1C6)低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、フェニルなどの任意の非立体障害基によってさらに置換されていてもよい。代表的な非ペプチドリンカーはPEGリンカーである。いくつかの実施形態では、PEGリンカーは、約100~5000kDa、または約100~500kDaの分子量を有する。
リンカーは、本明細書に記載の技術及び/または当技術分野で知られている技術を使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、標的分子に結合するリガンドの能力を変更しない(例えば、破壊しない)。
共役リガンドを含む親和性剤:親和性分離マトリックス
親和性剤を調製するために、リガンドまたは目的の標的への特異的結合を促進するリガンドを、クロマトグラフィーで使用される様々な表面、例えばビーズ、樹脂、ゲル、膜、モノリスなどに化学的に結合させることができる。目的の標的に対するリガンドを含む親和性薬剤は、精製及び製造用途に有用である。
親和性剤を調製するために、リガンドまたは目的の標的への特異的結合を促進するリガンドを、クロマトグラフィーで使用される様々な表面、例えばビーズ、樹脂、ゲル、膜、モノリスなどに化学的に結合させることができる。目的の標的に対するリガンドを含む親和性薬剤は、精製及び製造用途に有用である。
いくつかの実施形態では、リガンド(例えば、リガンド融合タンパク質)は、少なくとも1つの反応性残基を含む。反応性残基は、例えば、化学療法薬または診断薬などのコンジュゲートの結合部位として有用である。例示的な反応性アミノ酸残基には、例えば、リジン及びシステインが挙げられる。反応性残基は、いずれかの末端で、またはリガンド配列内でリガンドに付加することができ、及び/またはリガンドの配列中の別のアミノ酸と置換することができる。適切な反応性残基(例えば、リジン、システインなど)は、付加または置換を必要とせずに、同定されたリガンドの配列内に位置することもできる。
固体表面への結合
「固体表面」、「支持体」、または「マトリックス」は、本明細書では同義に使用され、制限なく、直接的または間接的に(例えば、リンカーなどの他の結合パートナー中間体を介して)リガンドまたは他のタンパク質が結合し得る(すなわち、カップリング、連結、接着)、またはリガンドが埋め込まれている可能性がある(例えば、受容体またはチャネルを介して)、任意のカラム(またはカラム材料)、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子(例えば、アガロースまたはセファロース)、マイクロチップ(例えば、シリコン、シリコンガラス、または金チップ)、または膜(合成(例えば、フィルター)または生物学的(例えば、リポソームまたはベシクル))を指す。ポリペプチドを固体支持体に結合させるための試薬及び技術は、当技術分野で周知であり、例えば、カルバメートまたはチオエーテルカップリングである。適切な固体支持体には、クロマトグラフィー樹脂またはマトリックス(例えば、セファロース-4FFアガロースビーズなどのアガロースビーズ)、プラスチック製マイクロタイターディッシュのウェルの壁または床、シリカベースのバイオチップ、ポリアクリルアミド、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、紙、プラスチック、ナイロン、金属、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。リガンド及び他の組成物は、当技術分野で知られている試薬及び技術を使用して、非共有結合または共有結合によって支持体材料に結合することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、リンカーを使用してクロマトグラフィー材料に結合される。
「固体表面」、「支持体」、または「マトリックス」は、本明細書では同義に使用され、制限なく、直接的または間接的に(例えば、リンカーなどの他の結合パートナー中間体を介して)リガンドまたは他のタンパク質が結合し得る(すなわち、カップリング、連結、接着)、またはリガンドが埋め込まれている可能性がある(例えば、受容体またはチャネルを介して)、任意のカラム(またはカラム材料)、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子(例えば、アガロースまたはセファロース)、マイクロチップ(例えば、シリコン、シリコンガラス、または金チップ)、または膜(合成(例えば、フィルター)または生物学的(例えば、リポソームまたはベシクル))を指す。ポリペプチドを固体支持体に結合させるための試薬及び技術は、当技術分野で周知であり、例えば、カルバメートまたはチオエーテルカップリングである。適切な固体支持体には、クロマトグラフィー樹脂またはマトリックス(例えば、セファロース-4FFアガロースビーズなどのアガロースビーズ)、プラスチック製マイクロタイターディッシュのウェルの壁または床、シリカベースのバイオチップ、ポリアクリルアミド、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、紙、プラスチック、ナイロン、金属、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。リガンド及び他の組成物は、当技術分野で知られている試薬及び技術を使用して、非共有結合または共有結合によって支持体材料に結合することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、リンカーを使用してクロマトグラフィー材料に結合される。
一態様では、本開示は、本開示のライブラリー、不溶性支持体に結合したリガンドまたは多量体から構成される親和性剤(親和性分離マトリックス)を提供する。そのような支持体は、ビーズ、膜、フィルター、毛細血管、モノリス、及びクロマトグラフィーで一般的に使用されるその他の形式などの1つまたは複数の粒子であり得る。親和性分離マトリックスの有利な実施形態では、支持体は、ビーズとしても知られる実質的に球状の粒子から構成される。適切な粒子サイズは、10~100μm、例えば20~80μmなどの5~500μmの直径範囲であり得る。別の実施形態では、支持体は膜である。高い吸着能力を得るために、支持体は多孔質であることが好ましく、配位子は外面だけでなく細孔面にも結合することができる。この態様の有利な実施形態では、支持体は多孔質である。
別の態様では、本開示は、クロマトグラフィー親和性剤を調製する方法に関し、この方法は、上記のリガンドを提供すること、及びリガンドを支持体にカップリングすることを含む。カップリングは、例えば、リガンドの窒素または硫黄原子を介して行うことができる。リガンドは、支持体表面とリガンドとの間に適切な距離を提供するために、スペーサー要素を介して直接的または間接的に支持体に結合され得る。タンパク質リガンドを多孔質または非多孔質表面に固定化する方法は、この分野でよく知られている。
リガンドの生成
提供される方法を実施するのに有用なリガンドの生成は、当技術分野で知られている化学合成、半合成法、及び組換えDNA方法論のための様々な標準技術を使用して行うことができる。また、リガンドを個別にまたはマルチドメイン融合タンパク質の一部として、可溶性薬剤及び細胞関連タンパク質として生成する方法も提供される。いくつかの実施形態では、リガンドの全体的な生成スキームは、基準タンパク質足場を取得すること、及び改変のために足場内の複数の残基を同定することを含む。実施形態に応じて、基準足場は、1つまたは複数のアルファヘリックス領域を有するタンパク質構造、または他の三次構造を含み得る。いったん同定されると、複数の残基のいずれかを、例えば、1つまたは複数のアミノ酸の置換によって改変することができる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の非保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、自然アミノ酸(例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンの1つ)は改変のために標的位置において基準足場に置換される。いくつかの実施形態において、改変は、システインまたはプロリンのいずれかにおける置換を含まない。特定の実施形態において所望される同定された位置で改変が行われた後、得られた改変ポリペプチド(例えば、候補リガンド)は、例えば、プラスミド、細菌、ファージ、または他のベクターにおいて組換え発現され得る(例えば、改変ポリペプチドのそれぞれの数を増加させるために)。次いで、改変ポリペプチドを精製し、スクリーニングして、目的の特定の標的に特異的に結合する改変ポリペプチドを同定することができる。改変ポリペプチドは、基準足場と比較して目的の標的に対して増強された結合特異性を示し得るか、または所定の目的の標的(または非標的タンパク質)に対してほとんど、または、全く結合を示さない可能性がある。いくつかの実施形態では、目的の標的に応じて、基準足場は、目的の標的との何らかの相互作用(例えば、非特異的相互作用)を示し得るが、特定の改変ポリペプチドは、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍(またはそれ以上)増加した目的の標的に対する結合特異性を示すであろう。リガンドの生成、選択、及び単離に関する追加の詳細は、以下でより詳細に提供される。
提供される方法を実施するのに有用なリガンドの生成は、当技術分野で知られている化学合成、半合成法、及び組換えDNA方法論のための様々な標準技術を使用して行うことができる。また、リガンドを個別にまたはマルチドメイン融合タンパク質の一部として、可溶性薬剤及び細胞関連タンパク質として生成する方法も提供される。いくつかの実施形態では、リガンドの全体的な生成スキームは、基準タンパク質足場を取得すること、及び改変のために足場内の複数の残基を同定することを含む。実施形態に応じて、基準足場は、1つまたは複数のアルファヘリックス領域を有するタンパク質構造、または他の三次構造を含み得る。いったん同定されると、複数の残基のいずれかを、例えば、1つまたは複数のアミノ酸の置換によって改変することができる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の非保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、自然アミノ酸(例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンの1つ)は改変のために標的位置において基準足場に置換される。いくつかの実施形態において、改変は、システインまたはプロリンのいずれかにおける置換を含まない。特定の実施形態において所望される同定された位置で改変が行われた後、得られた改変ポリペプチド(例えば、候補リガンド)は、例えば、プラスミド、細菌、ファージ、または他のベクターにおいて組換え発現され得る(例えば、改変ポリペプチドのそれぞれの数を増加させるために)。次いで、改変ポリペプチドを精製し、スクリーニングして、目的の特定の標的に特異的に結合する改変ポリペプチドを同定することができる。改変ポリペプチドは、基準足場と比較して目的の標的に対して増強された結合特異性を示し得るか、または所定の目的の標的(または非標的タンパク質)に対してほとんど、または、全く結合を示さない可能性がある。いくつかの実施形態では、目的の標的に応じて、基準足場は、目的の標的との何らかの相互作用(例えば、非特異的相互作用)を示し得るが、特定の改変ポリペプチドは、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍(またはそれ以上)増加した目的の標的に対する結合特異性を示すであろう。リガンドの生成、選択、及び単離に関する追加の詳細は、以下でより詳細に提供される。
リガンドの組換え発現
いくつかの実施形態では、リガンド融合タンパク質などのリガンドは、「組換えにより生成される」(すなわち、組換えDNA技術を使用して生成される)。リガンド融合タンパク質を合成するために利用可能な例示的な組換え法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの合成、コンカテマー化、シームレスクローニング、及び再帰的方向性ライゲーション(RDL)が含まれるが、これらに限定されない(例えば、Meyer et al.,Biomacromolecules3:357-367(2002),Kurihara et al.,Biotechnol.Lett.27:665-670(2005),Haider et al.,Mol.Pharm.2:139-150(2005);及び、McMillan et al.,Macromolecules32(11):3643-3646(1999)を参照)。
いくつかの実施形態では、リガンド融合タンパク質などのリガンドは、「組換えにより生成される」(すなわち、組換えDNA技術を使用して生成される)。リガンド融合タンパク質を合成するために利用可能な例示的な組換え法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの合成、コンカテマー化、シームレスクローニング、及び再帰的方向性ライゲーション(RDL)が含まれるが、これらに限定されない(例えば、Meyer et al.,Biomacromolecules3:357-367(2002),Kurihara et al.,Biotechnol.Lett.27:665-670(2005),Haider et al.,Mol.Pharm.2:139-150(2005);及び、McMillan et al.,Macromolecules32(11):3643-3646(1999)を参照)。
別の態様では、上記で開示した実施形態によるリガンドまたは多量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。したがって、本開示は、ポリペプチド(リガンド)をコードするRNA及びDNAなどの本発明の核酸配列のすべての形態を包含する。本開示は、コード配列に加えて、本開示によるポリペプチドまたは多量体の発現に必要なシグナル配列を含む、プラスミドなどのベクターを提供する。そのようなポリヌクレオチドは、場合により、1つまたは複数の発現制御エレメントをさらに含む。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントとして、1つまたは複数のプロモーターまたは転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及びポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリヌクレオチドは、発現のために任意の適切な宿主細胞内に含めることができる任意の適切なベクター内に挿入することができる。
リガンドをコードする核酸の発現は、典型的には、リガンドをコードする核酸を発現ベクター内のプロモーターに作動可能に連結することによって達成される。典型的な発現ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び所望の核酸配列の発現の制御に有用なプロモーターを含有し得る。E.coliでの発現に有用なプロモーターの例には、例えば、T7プロモーターが挙げられる。
適切な転写/翻訳制御シグナルと一緒にリガンドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法は、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、及び、インビボ遺伝子組換え/遺伝的組換えが含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの発現は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている任意の適切な発現宿主で行うことができる。いくつかの実施形態では、リガンドをコードする核酸配列は、核酸配列が宿主においてリガンドに転写及び/または翻訳されるように、適切なプロモーター配列に作動可能に連結される。
様々な宿主発現ベクター系を利用して、リガンドをコードする核酸を発現させることができる。リガンドをコードする核酸(例えば、個々のリガンドサブユニットまたはリガンド融合体)またはその一部もしくは断片を含むベクターには、プラスミドベクター、一本鎖及び二本鎖ファージベクター、ならびに一本鎖及び二本鎖RNAまたはDNAウイルスベクターが含まれる。ファージ及びウイルスベクターは、感染及び形質導入のための既知の技術を使用して、パッケージ化またはカプセル化されたウイルスの形態で宿主細胞に導入することもできる。さらに、ウイルスベクターは、複製可能であるか、または代替的に複製欠陥であり得る。あるいは、無細胞翻訳系を用いて、DNA発現構築物由来のRNAを用いてタンパク質を生成することもできる(例えば、WO86/05807及びWO89/01036、ならびに米国特許第5,122,464号を参照)。
一般に、任意のタイプの細胞または培養細胞株を使用して、本明細書で提供されるリガンドを発現させることができる。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞を生成するために使用されるバックグラウンド細胞株は、ファージ、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞である。リガンド融合タンパク質のコード配列を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系を使用することができる。哺乳動物細胞を、目的の標的のコード配列及び融合ポリペプチドのコード配列を含む組換えプラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞系として使用することができる。細胞は、形質転換またはトランスジェニック性質の生物、培養物、または細胞株からの一次分離株であり得る。
好適な宿主細胞には、微生物、例えば、リガンドコード配列を含む、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、E.coli、B.subtilis);リガンドコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces、Pichia);リガンドコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、Baculovirus)に感染した昆虫細胞系;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染するか、またはリガンドコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
リガンドを生成する際の宿主細胞として有用な原核生物には、E.coli及びB.subtilisなどのグラム陰性生物またはグラム陽性生物が含まれる。原核宿主細胞で使用するための発現ベクターは、一般に、1つまたは複数の表現型選択マーカー遺伝子(例えば、抗生物質耐性を付与するタンパク質または独立栄養要求を供給するタンパク質をコードする遺伝子)を含む。有用な原核宿主発現ベクターの例としては、pKK223-3(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pGEM1(Promega,Wis.,USA)、pET(Novagen,Wis.,USA)及びpRSET(Invitrogen,Calif.,USA)のベクラーシリーズが挙げられる(例えば、Studier,J.Mol.Biol.219:37(1991)及びSchoepfer,Gene124:83(1993)を参照)。原核宿主細胞発現ベクターで頻繁に使用される例示的なプロモーター配列には、T7(Rosenberget al.,Gene56:125-135(1987)),beta-lactamase(penicillinase)、lactosepromotersystem(Changet al.,Nature275:615(1978))、及び、Goeddelet al.,Nature281:544(1979)),tryptophan(trp)promotersystem(Goeddelet al.,Nucl.AcidsRes.8:4057,(1980))、及び、tacpromoter(Sambrooket al.,1990,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、リガンドのコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞を含む、真核宿主細胞系が使用される。本開示の組成物を生成するために使用できる例示的な酵母には、サッカロミセス属、ピキア属、アクチノミセス属、及びクルイベロミセス属由来の酵母が含まれる。酵母ベクターは通常、2mu酵母プラスミド由来の複製開始配列、自律複製配列(ARS)、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択マーカー遺伝子を含む。酵母発現構築物におけるプロモーター配列の例としては、メタロチオネイン、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman,J.Biol.Chem.255:2073(1980))、及び、他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。酵母発現及び酵母形質転換プロトコルで使用するための追加の適切なベクター及びプロモーターは、当技術分野で知られている。例えば、Fleer,Gene 107:285-195(1991)及びHinnen,PNAS75:1929(1978)を参照。
昆虫及び植物宿主細胞培養系もまた、本開示の組成物を生成するために有用である。このような宿主細胞系には、例えば、リガンドのコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染した、またはリガンドのコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系が挙げられ、限定されないが、米国特許第6,815,184号、米国特許第60/365,769号、及び同第60/368,047号、並びにWO2004/057002、WO2004/024927、及びWO2003/078614を含む。
いくつかの実施形態では、組換えウイルス発現ベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス)に感染した動物細胞系を含む宿主細胞系を使用することができ、これには、2分染色体で安定して増幅されたリガンド(CHO/dhfr)、または不安定に増幅されたリガンド(例:マウス細胞株)のいずれかをコードするDNAの複数のコピーを含むように操作された細胞株を含む。いくつかの実施形態では、リガンドをコードするポリヌクレオチド(複数可)を含むベクターは多シストロン性である。これらの組成物を生成するのに有用な例示的な哺乳動物細胞には、293細胞(例えば、293T及び293F)、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YOミエローマ細胞、P3X63マウスミエローマ細胞、PER細胞、PER.C6(Crucell、Netherlands)細胞VERY、Hela細胞、COS細胞、MDCK細胞、3T3細胞、W138細胞、BT483細胞、Hs578T細胞、HTB2細胞、BT20細胞、T47D細胞、CRL7O30細胞、HsS78Bst細胞、ハイブリドーマ細胞、及びその他の哺乳類細胞が挙げられる。本開示を実施するのに有用なさらなる例示的な哺乳動物宿主細胞には、T細胞が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な発現系及び選択方法は当技術分野で知られており、以下の参考文献及びそこで引用されている参考文献に記載されているものを含む:Borth et al.,Biotechnol.Bioen.71(4):266-73(2000),in Werneret al.,Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8):870-80(1998),Andersen et al.,Curr.Op.Biotechnol.13:117-123(2002),Chaddet al.,Curr.Op,Biotechnol.12:188-194(2001)、及び、Giddings,Curr.Op.Biotechnol.12:450-454(2001)。発現系及び選択方法のさらなる例は、Logan et al.,PNAS81:355-359(1984),Birtneret al.MethodsEnzymol.153:51-544(1987))に記載されている。哺乳類宿主細胞発現ベクターの転写及び翻訳制御配列は、ウイルスゲノムに由来することが多い。哺乳動物発現ベクターで一般的に使用されるプロモーター配列及びエンハンサー配列には、ポリオーマウイルス、アデノウイルス2、シミアンウイルス40(SV40)、及びヒトサイトメガロウイルス(CMV)由来の配列が含まれる。哺乳動物宿主細胞で使用するための例示的な市販の発現ベクターには、pCEP4(Invitrogen)及びpcDNA3(Invitrogen)が含まれる。
核酸を宿主細胞(例えば、哺乳動物宿主細胞)に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、微量注入法、電気穿孔法等が含まれる。ベクター及び/または外因性核酸を含む細胞を生成する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrooket al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)を参照されたい。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、DNA及びRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第5,350,674号及び同第5,585,362号を参照されたい。
目的のDNA及びRNAポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する方法には、細胞のエレクトロポレーションが含まれ、このエレクトロポレーションでは、細胞膜の透過性を高めるために細胞に電場を印加し、化学物質、薬物、またはポリヌクレオチドを宿主細胞に導入できるようにする。DNAまたはRNA構築物を含むリガンドは、エレクトロポレーションを使用して哺乳動物細胞または原核細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、細胞のエレクトロポレーションは、T細胞、NK細胞、NKT細胞の表面上でリガンド-CARの発現をもたらす。そのような発現は、細胞の寿命にわたって一過性または安定であり得る。エレクトロポレーションは、MaxCyteGT(登録商標)及びSTX(登録商標)Transfection Systems(MaxCyte,Gaithersburg,MD,USA)を含む当技術分野で知られている方法で達成することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入(インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)のために企図される。いくつかの実施形態において、核酸は、脂質と関連する。脂質と関連する核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに付着し、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体を形成し、脂質を含む溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質中に懸濁液として含まれ、ミセルを含むかミセルと複合体を形成し、またはそうでなければ脂質と会合されてもよい。脂質、脂質/DNAまたは脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、ミセルとして、または「崩壊した」構造で、二重層構造に存在することができる。また、単に溶液中に点在している可能性があり、サイズや形状が均一でない凝集体を形成する可能性がある。脂質は、天然脂質または合成脂質である脂肪物質である。例えば、脂質には、細胞質で自然に発生する脂肪滴、及び、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
使用に好適な脂質は商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma,St.Louis,MOから入手することができ、ジセチルホスフェート(「DCP」)は、K&KLaboratories(Plainview,NY)から入手することができ、コレステロール(「Choi」)はCalbiochem-Behringから入手することができ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)、及びその他の脂質は、AvantiPolarLipids,Inc.(Birmingham,AL)から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質の原液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用することができる。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、様々な単層及び多層の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部の水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁すると自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再編成を受け、脂質二重層の間に水と溶解した溶質を閉じ込める(Ghosh et al.,Glycobiology 5:505-510(1991))。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も含まれる。例えば、脂質はミセル構造をとるか、単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する可能性がある。また、リポフェクタミン-核酸複合体も企図される。
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組換え核酸配列の存在は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって日常的に確認することができる。そのようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、RT-PCR及びPCRなど、当技術分野で知られている「分子生物学的」アッセイ;例えば、免疫学的手段(ELISA及びウエスタンブロット)または本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在または非存在を検出して、本開示の範囲内に入る薬剤を同定するような「生化学的」アッセイが含まれる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物、組織もしくは細胞に存在せず、またはそれによって発現されず、発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明らかになるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリ性ホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない(例えば、Ui-Teiet al.,FEBS Lett.479:79-82(2000))。好適な発現系は当該技術分野において周知であり、既知の技法を使用して調製されるか、または商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の5’フランキング領域を持つ構築物がプロモーターとして識別される。このようなプロモーター領域は、通常、レポーター遺伝子に連結することができ、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用することができる。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al.,Cell 22:817(1980))遺伝子を含むがこれらに限定されない多数の選択系を哺乳動物宿主-ベクター発現系で使用することができる。さらに、代謝拮抗剤耐性は、例えば、dhfr、gpt、neo、hygro、trpB、hisD、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)、及びグルタミンシンターゼ系の選択の基礎として使用することができる。
いくつかの実施形態では、イニシエーターのN末端メチオニンは、リガンドまたは本開示のライブラリーのリガンドのNH末端に含まれる。多くの場合、リガンドは、発現中に切断されると推定されるN末端メチオニン残基なしで単離される。多くの場合、N末端メチオニンを含有する精製されたリガンドの一部のみを含む混合物が得られる。N末端メチオニンの存在または非存在が、本明細書に記載のライブラリー、リガンド及び親和剤の機能性に影響を及ぼさないことは、当業者には明らかである。
リガンド精製
リガンドまたはリガンド融合タンパク質が組換え発現によって生成されると、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、及びサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他の標準的な技術による、組換えタンパク質の精製のための当技術分野で公知の方法によって精製することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、精製を容易にするために、本明細書に具体的に開示されているか、または当技術分野で知られている異種ポリペプチド配列に場合によって融合される。いくつかの実施形態において、親和性精製のためのリガンド親和性カラムのためのリガンド(例えば、抗体及び他の親和性マトリックス)、及び場合により、これらのリガンドによって結合されるリガンドまたはリガンド融合組成物の他の成分は、当技術分野で知られている技術を使用して、リガンドの最終調製の前に組成物から除去される。
リガンドまたはリガンド融合タンパク質が組換え発現によって生成されると、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、及びサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他の標準的な技術による、組換えタンパク質の精製のための当技術分野で公知の方法によって精製することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、精製を容易にするために、本明細書に具体的に開示されているか、または当技術分野で知られている異種ポリペプチド配列に場合によって融合される。いくつかの実施形態において、親和性精製のためのリガンド親和性カラムのためのリガンド(例えば、抗体及び他の親和性マトリックス)、及び場合により、これらのリガンドによって結合されるリガンドまたはリガンド融合組成物の他の成分は、当技術分野で知られている技術を使用して、リガンドの最終調製の前に組成物から除去される。
配位子の化学合成
組換え法に加えて、当技術分野で知られている様々な液相及び固相化学プロセスを使用して、所望のポリペプチドの有機化学合成を使用してリガンド生成を行うこともできる。様々な自動合成装置が市販されており、既知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、Tam et al.,J.Am.Chem.Soc.,105:6442(1983);Merrifield,Science,232:341-347(1986);Barany and Merrifield,The Peptides,Gross and Meienhofer,eds,Academic Press,New York,1-284;Barany et al.,Int.J.Pep.Protein Res.,30:705739(1987);Kelley et al.in Genetic Engineering Principles and Methods,Setlow,J.K.,ed.Plenum Press,NY.1990,vol.12,pp.1-19;Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,1989を参照されたい。これらの方法論の1つの利点は、リガンドの配列への非天然アミノ酸残基の組み込みを可能にすることである。
組換え法に加えて、当技術分野で知られている様々な液相及び固相化学プロセスを使用して、所望のポリペプチドの有機化学合成を使用してリガンド生成を行うこともできる。様々な自動合成装置が市販されており、既知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、Tam et al.,J.Am.Chem.Soc.,105:6442(1983);Merrifield,Science,232:341-347(1986);Barany and Merrifield,The Peptides,Gross and Meienhofer,eds,Academic Press,New York,1-284;Barany et al.,Int.J.Pep.Protein Res.,30:705739(1987);Kelley et al.in Genetic Engineering Principles and Methods,Setlow,J.K.,ed.Plenum Press,NY.1990,vol.12,pp.1-19;Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,1989を参照されたい。これらの方法論の1つの利点は、リガンドの配列への非天然アミノ酸残基の組み込みを可能にすることである。
本開示の方法で使用されるリガンドは、合成または翻訳の間または後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、ベンジル化、リン酸化、アミド化、ペグ化、ホルミル化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子への結合、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化などによって、改変され得る。(例えば、Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties,2d Ed.(W.H.Freeman and Co.,N.Y.,1992);Postranslational Covalent Modification of Proteins,Johnson,ed.(Academic Press,New York,1983),pp.1-12;Seifter,Meth.Enzymol.,182:626-646(1990);Rattan,Ann.NYAcad.Sci.,663:48-62(1992)を参照のこと)。いくつかの実施形態において、ペプチドは、N末端でアセチル化され、及び/またはC末端でアミド化される。
多数の化学修飾のいずれも、アセチル化、ホルミル化などを含むがこれらに限定されない既知の技術によって行うことができる。さらに、誘導体は、1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチド主鎖の環化または大環状化は、側鎖から側鎖への結合形成によって達成される。これを達成するための方法は当技術分野で周知であり、天然及び非天然のアミノ酸を必要とし得る。アプローチには、ジスルフィド形成、ランチオニン形成またはチオールアルキル化(例えば、マイケル付加)、アミノ側鎖とカルボキシレート側鎖間のアミド化、クリックケミストリー(例えば、アジド-アルキン縮合)、ペプチドステープル、閉環メタセシス、及び酵素の使用が含まれる。
精製用親和性剤
親和性クロマトグラフィーに基づく精製では、目的の標的(例えば、タンパク質または分子)は、典型的にはクロマトグラフィーマトリックスに共有結合されているリガンドに特異的かつ可逆的に結合する能力に従って選択的に単離される。いくつかの実施形態では、本開示のライブラリーから同定されたリガンドは、組換え源または生体試料(例えば、血清)などの天然源からの目的の標的の親和性精製のための試薬として使用することができる。
親和性クロマトグラフィーに基づく精製では、目的の標的(例えば、タンパク質または分子)は、典型的にはクロマトグラフィーマトリックスに共有結合されているリガンドに特異的かつ可逆的に結合する能力に従って選択的に単離される。いくつかの実施形態では、本開示のライブラリーから同定されたリガンドは、組換え源または生体試料(例えば、血清)などの天然源からの目的の標的の親和性精製のための試薬として使用することができる。
いくつかの実施形態では、目的の標的に特異的に結合するリガンドをビーズに固定し、次いで標的を親和性精製するために使用する。
タンパク質を表面に共有結合させる方法は当業者に知られており、リガンドを固体表面に結合させるために使用できるペプチドタグは当業者に知られている。さらに、リガンドは、当技術分野で知られている任意の試薬または技術を使用して、固体表面に結合(すなわち、カップリング、連結、または付着)することができる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、及び/またはゼラチンを含む。したがって、当技術分野で知られている技術を使用して、一連のリガンドを使用して固体表面上にアレイを作成することができる。例えば、米国出願公開第2004/0009530号は、アレイを調製する方法を開示している。
いくつかの実施形態では、本開示のライブラリーに由来するリガンドを使用して、親和性クロマトグラフィーによって目的の同族標的を単離する。いくつかの実施形態では、そのようなリガンドは固体支持体上に固定化される。リガンドは、本明細書に記載、そうでなければ当技術分野で周知の技術及び試薬を使用して固体支持体上に固定化することができる。適切な固体支持体は、本明細書に記載されているか、そうでなければ当技術分野で周知であり、特定の実施形態では、クロマトグラフィーカラムを充填するのに適している。親和性剤は、様々なサイズのカラムに充填し、様々な線速度で操作することができ、または、固定化された親和性リガンドを、リガンドと目的の標的との間で複合体を形成するのに適した条件下で溶液を充填または溶液と接触させることができる。非結合素材は洗い流すことができる。当業者は、適切な洗浄条件を容易に決定することができる。適切な洗浄条件の例は、Shukla and Hinckley,Biotechnol Prog.2008 Sep-Oct;24(5):1115-21.doi:10.1002/btpr.50に記載されている。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーは、目的の標的及びリガンドを含有する溶液を混合し、次いで目的の標的及びリガンドの複合体を単離することによって実施される。例えば、リガンドは、ビーズなどの固体支持体に固定され、次いで濾過によって目的の標的とともに溶液から分離される。いくつかの実施形態では、リガンドは、固定化金属親和性クロマトグラフィー樹脂またはストレプトアビジンコーティング基材を使用して複合体が形成された後、リガンドを単離するために使用できる、ポリ-Hisテールまたはストレプトアビジン結合領域などのペプチドタグを含む融合タンパク質である。分離されると、目的の標的は、溶出条件下でリガンドから放出され、精製された形で回収される。
目的の標的の溶出は、pHを下げて塩濃度を増加させるか、そうでなければ塩条件を変更することを含む、当技術分野で一般的に知られている技術によって達成することができる。例えば、ウイルス粒子の溶出は、通常pHを、例えば2.0~3.0下げることにより達成されるが、より高いpHを使用することもできる。AAV8ならびにその変異体及び突然変異体の溶出のための最適条件は、当業者によって容易に決定され得る。
本開示の親和剤は耐アルカリ性であり、洗浄のために最大0.5Mの濃度のNaOHの使用を可能にする。特定の実施形態では、例えば、1サイクル当たり最大30~60分の0.5MNaOH曝露のCIPレジメンは、例えば、15~30サイクルなどのいくつかのサイクルで一貫したクロマトグラフィー性能を保証し、70%~90%の初期のAAV8結合能力と低い残留DNA及びHCPレベル、ならびに流動能力の実質的な変化がないことを含む。
本開示のいくつかの実施形態を例示として説明してきたが、本明細書の発明(複数可)は、多くの修正、変形、及び適合により、また、当業者の範囲内で、本発明の精神から逸脱することなく、または特許請求の範囲を超えることなく、多数の均等物または代替解決策を使用して実施できることは明らかであろう。
全ての出版物、特許、及び特許出願は、各個別出版物、特許、または特許出願が、その全体で参照することにより組み込まれるように特異的かつ個別に示された場合と同一の程度に、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。
実施例1:ライブラリーの構築とスクリーニング
ファージディスプレイライブラリーを、足場を使用して、Zドメインのヘリックス2及び3(図2及び3を参照)の顔変異体の位置に基づいて設計した。
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPSX6SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12-[B]
ファージライブラリーの足場を、三量体コドンホスホラミダイト突然変異誘発を使用して構築した。
ファージディスプレイライブラリーを、足場を使用して、Zドメインのヘリックス2及び3(図2及び3を参照)の顔変異体の位置に基づいて設計した。
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPSX6SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12-[B]
ファージライブラリーの足場を、三量体コドンホスホラミダイト突然変異誘発を使用して構築した。
1つのライブラリーでは、[A]はVDAKFDKELEEARAEIERLPNLTEであり、式中、X9以外の各X位置は任意のアミノ酸であり、X9はA、RまたはKであるが、但し、以下の基準の少なくとも2つを満たすことを条件とし:X2がアラニン(A)でない、X4がセリン(S)でない、X5がアスパラギン酸(D)でない、X6がグルタミンまたはセリン(QまたはS)でない、X8がグルタミン酸(E)でない、X10がリジン(L)でない、かつX11がロイシン(L)ではない、
かつ、以下のうち少なくとも2つがtrueであり、満たされていることを条件とする。
かつ、以下のうち少なくとも2つがtrueであり、満たされていることを条件とする。
別のライブラリーでは、[A]はVDAKFDKELEEARAEIERLPNLTEであり、X9及びX12以外の各X位置は任意のアミノ酸であり、X9及びX12のそれぞれはA、RまたはKであるが、但し、以下の基準の少なくとも2つを満たすことを条件とする:X2がアラニン(A)でない、X4がセリン(S)でない、X5がアスパラギン酸(D)でない、X6がグルタミンまたはセリン(QまたはS)でない、X8がグルタミン酸(E)でない、X10がリジン(L)でない、かつX11がロイシン(L)ではない。
ファージライブラリーのパニングは、(Griffiths et al.1994,EMBOJ.,13:3245-3260)に一般的に記載されているように実行される。必要に応じて、AAV8キャプシドなどの目的の標的に対して、複数回のパニングを実行する。
個々のファージクローンは、ファージELISAで目的の標的への結合について試験することができる。簡単に言うと、1×1012個のファージを、目的の標的及びネガティブ対照を1μg/mLでコーティングした96ウェルプレートでインキュベートする。室温で1時間インキュベートした後、PBS-0.1%Tween-20でウェルを3回洗浄することにより結合していない粒子を除去する。結合したバクテリオファージを、特定の抗M13抗体を使用して検出し、単離及び配列決定し、目的のターゲットに結合する親和性リガンドを同定する。同定後、親和性リガンドはペプチドとして調製するか、または組み換えで生成することができる。
ペプチドを、標準的なFmoc固相ペプチド合成技術によって合成し、分取逆相HPLCによって精製する。ペプチドの純度は、UV及び四重極飛行時間型質量分析検出の両方を備えたRP-UPLCによって評価する。
組換え親和性リガンドは、標準的な技術を使用してE.coliまたはE.coliで発現される。リガンドは、マルチカラムクロマトグラフィーを使用して精製することができる。Hisタグ付きリガンドの場合、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)を一次捕捉工程として使用する。ビオチン化リガンドを、AviTag(商標)システム(Avidity,Aurora,CO)で生成する。AviTag(商標)配列を持つ非ビオチン化リガンドは、外因性ビオチンを省略して調製される。組換えタンパク質リガンドの純度と同一性を、SDS-PAGE、RPUPLC、四重極飛行時間型質量分析、及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC);SephadexS75、Cytiva、Marlborough、MA)の組み合わせによって評価する。多くの場合、リガンドは、発現中に切断されると推定されるN末端メチオニン残基なしで単離される。
実施例2.例示的なAAV8親和性リガンド
この実施例は、バイオレイヤー干渉法(ForteBio,MenloPark,CA)を使用して、実施例1に記載のライブラリーから得られた親和性リガンドに基づく、AAV8キャプシドへのビオチン化リガンドの結合を示す。ビオチン化リガンドをセンサーに固定し、100mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、0.01%(w/v)ウシ血清アルブミン、及び0.1%(v/v)TritonX-100、pH7.0に5×1011粒子/mLを含む溶液でインキュベートした。ブランクセンサーと非結合リガンドを対照として含めた。関連付けフェーズは、AAVでは典型的な応答の最初の直線的な増加を示した。センサーが飽和するにつれて、センサーグラムはより大きな曲率を示した(図4、リガンド1)。反応を、4000秒のインキュベーション時間後に測定し、例示的なAAV8リガンドについて以下の表2に示す。
この実施例は、バイオレイヤー干渉法(ForteBio,MenloPark,CA)を使用して、実施例1に記載のライブラリーから得られた親和性リガンドに基づく、AAV8キャプシドへのビオチン化リガンドの結合を示す。ビオチン化リガンドをセンサーに固定し、100mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、0.01%(w/v)ウシ血清アルブミン、及び0.1%(v/v)TritonX-100、pH7.0に5×1011粒子/mLを含む溶液でインキュベートした。ブランクセンサーと非結合リガンドを対照として含めた。関連付けフェーズは、AAVでは典型的な応答の最初の直線的な増加を示した。センサーが飽和するにつれて、センサーグラムはより大きな曲率を示した(図4、リガンド1)。反応を、4000秒のインキュベーション時間後に測定し、例示的なAAV8リガンドについて以下の表2に示す。
実施例3.ライブラリードのアルカリ安定性
この実施例は、親和性リガンドの水酸化ナトリウム安定性を実証する。リガンドを0.5MNaOHで16時間インキュベートした後、中和した。NaOH処理リガンドの結合を実施例2に記載のように測定し、未処理リガンドと比較した。保持された結合は、次の式に従って計算した。
%結合保持=(NaOH処理後に測定された反応)÷(未処理の測定された反応)×100
このデータは、ライブラリーの親和性リガンドが高いアルカリ安定性を備えていることを実証している(図5)。
この実施例は、親和性リガンドの水酸化ナトリウム安定性を実証する。リガンドを0.5MNaOHで16時間インキュベートした後、中和した。NaOH処理リガンドの結合を実施例2に記載のように測定し、未処理リガンドと比較した。保持された結合は、次の式に従って計算した。
%結合保持=(NaOH処理後に測定された反応)÷(未処理の測定された反応)×100
このデータは、ライブラリーの親和性リガンドが高いアルカリ安定性を備えていることを実証している(図5)。
実施例4.例示的な親和性樹脂の構築
この実施例は、本明細書で同定及び記載されたリガンドを含む親和性剤の生成及び特徴付けを実証する。親和性樹脂は、リガンドをアガロースビーズに共役させることによって調製されました。RAPID RUN6%アガロースビーズ(ABT,Madrid,Spain)及びPraesto(登録商標)Jetted A50 ビーズ(Purolite,KingofPrussia,PA)を炭酸ジスクシンイミジルで活性化し、リガンド密度1~8mg/mL樹脂でペプチドリガンドと結合させた。すべての樹脂の実際のリガンド密度は、次の式に従ってサブトラクティブRP-HPLC法を使用して測定した。
実際のリガンド密度=(材料中のリガンド量-排水中のリガンド量)/樹脂の量。
この実施例は、本明細書で同定及び記載されたリガンドを含む親和性剤の生成及び特徴付けを実証する。親和性樹脂は、リガンドをアガロースビーズに共役させることによって調製されました。RAPID RUN6%アガロースビーズ(ABT,Madrid,Spain)及びPraesto(登録商標)Jetted A50 ビーズ(Purolite,KingofPrussia,PA)を炭酸ジスクシンイミジルで活性化し、リガンド密度1~8mg/mL樹脂でペプチドリガンドと結合させた。すべての樹脂の実際のリガンド密度は、次の式に従ってサブトラクティブRP-HPLC法を使用して測定した。
実際のリガンド密度=(材料中のリガンド量-排水中のリガンド量)/樹脂の量。
本明細書に記載された本開示の多くの修正及び他の実施形態は、前述の説明及び関連する図面に提示された教示の恩恵を受けて、本開示が関係する当業者に思い浮かぶ。したがって、本開示は開示された特定の実施形態に限定されるべきではなく、修正及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲、及び、本明細書に開示される実施形態の一覧内に含まれることが意図されていることを理解されたい。本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用されており、限定の目的では使用されていない。
本明細書に開示される方法は、列挙された順序で実行される必要はない。本明細書で開示される方法は、開業医によって行われる特定の行動を含むが、ただし、明示的または暗示的に、これらの行動に関する第三者の指示を含めることもできる。
Claims (18)
- N末端からC末端へ、以下の式によって表されるアミノ酸配列を含む親和性リガンドをメンバーがコードする核酸ライブラリーであって、
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS-[X6]n-SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12QAPX13-[B]
(配列番号1)
式中、
(a)[A]は、αヘリックス形成ペプチドドメインを含み、
(b)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X10、X11、及びX12のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸であり、
(c)nは、存在するX6残基の数を表し、1~10の整数であり、
(d)X9及びX13はそれぞれ独立してA、KまたはRであり、
(e)[B]は、存在しないか、VDであるか、または以下のアミノ酸配列を含むペプチドドメインである、
VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号9)、
GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号10)、
VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号11)または
GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(配列番号12)、
である前記核酸ライブラリー。 - 前記αヘリックス形成ペプチドドメインが、SPA Zドメイン、Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、Dドメイン及びEドメインのうちの1つ、好ましくはZドメインの残基5~19に見られるブドウ球菌プロテインA(SPA)ドメインのアルカリ安定ヘリックス1を含む、請求項1に記載の核酸ライブラリー。
- [A]が、
VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号2)、
VDAKFDKELEEARAKIERLPNLTE(配列番号3)、
VDAKFDKELEEVRAEIERLPNLTE(配列番号4)、
VDAKFEKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号5)、
VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE(配列番号6)、または、
VDAKFDKELEEARAEIERLPALTE(配列番号7)のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項1または2に記載の核酸ライブラリー。 - 前記[A]のN末端がMまたはMAQGT(配列番号8)に先行される、請求項3に記載の核酸ライブラリー。
- ペプチドタグを含み、任意に、前記タグがヘマグルチニン、c-myc、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D、T7、GST、GFP、MBP、strepタグ、Hisタグ、Mycタグ、TAPタグ、またはFLAGタグである、請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸ライブラリー。
- 前記リガンドがC末端リジンまたはシステインを含む、請求項1~5に記載の核酸ライブラリー。
- [A]がVDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(配列番号2)であり、nが1であり、X13がKである、請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸ライブラリー。
- 前記ライブラリーが、配列番号13~18のいずれか1つを含む、請求項1に記載の核酸ライブラリー。
- 前記ライブラリーが、ファージディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、RNAディスプレイライブラリー、またはDNAディスプレイライブラリーである、請求項1~8のいずれか一項に記載の核酸ライブラリー。
- 目的の標的分子と選択的に相互作用するポリペプチドを同定する方法であって、
a)目的の標的分子を、1~9のいずれか1つの核酸ライブラリーの発現によって生成されたポリペプチドに曝露すること、及び、
b)前記標的分子と選択的に相互作用しないポリペプチドから選択的に相互作用するポリペプチドを分離すること、を含む、前記方法。 - 前記目的の標的分子を、ファージ、細菌または細胞の表面に発現させるか、または、固相支持体に付着させるか、繋留するか、または他の方法で会合させることを含む、請求項10に記載の方法。
- 目的の標的分子に高親和性で特異的に結合するポリペプチドについてライブラリーをスクリーニングする方法であって、前記ライブラリーが、請求項1~9のいずれか一項に記載の核酸ライブラリーの発現によって生成される複数のポリペプチドを含み、
(a)前記ポリペプチドの前記分子への特異的結合に適した条件下で、ある濃度の標的分子と共にライブラリーのサンプルをインキュベートすること、
(b)前記ライブラリーの第2のサンプルを、同じ条件下であるが、ただし標的分子なしでインキュベートすること、
(c)前記第1及び第2のサンプルのそれぞれを、固定化標的分子と、前記ポリペプチドを前記固定化標的分子に結合させるのに適した条件下で接触させること、
(d)各サンプルについて、固定化標的分子に結合した前記ポリペプチドを検出すること、及び、
(e)前記第2のサンプルから結合したポリペプチドの量に対する、前記第1のサンプルから結合したポリペプチドの量の比を計算することにより、前記標的分子に対する前記ポリペプチドの親和性を決定すること、を含む、前記方法。 - 目的の標的分子と特異的に結合する1つまたは複数の親和性リガンドを同定する方法であって、
(a)前記標的分子を請求項9に記載のファージディスプレイライブラリーと接触させること、
(b)前記標的分子と特異的に結合するファージを、前記標的分子と選択的に相互作用しないファージから分離して、濃縮されたファージライブラリーを生成すること、
(c)前記濃縮されたファージライブラリーを用いて工程a)及びb)を繰り返して、さらに濃縮されたファージライブラリーを生成すること、
(d)前記さらに濃縮されたファージライブラリーが、元のファージライブラリーに対して少なくとも約10倍~約106倍以上濃縮されるまで工程c)を繰り返すこと、及び、
(e)前記さらに濃縮されたファージライブラリーをプレーティングし、そこから個々のクローンを単離及び特徴付け、それにより、前記目的の標的分子に特異的に結合する1つまたは複数の親和性リガンドを同定すること、を含む、前記方法。 - 前記標的分子または前記ファージディスプレイライブラリーが固体支持体に結合または付着している、請求項13に記載の方法。
- 前記標的分子がアデノ随伴ウイルス(AAV)またはAAVキャプシドである、請求項13または14に記載の方法。
- 前記AAVがAAV8またはAAV8血清型変異体である、請求項15に記載の方法。
- 複数の合成または組換えポリペプチドを含む組成物であって、各ポリペプチドが請求項1~8のいずれか一項に記載の親和性リガンドを含む、前記組成物。
- 目的の標的分子に特異的に結合するポリペプチドを同定する方法であって、
(a)目的の標的分子を請求項17に記載の組成物に曝露すること、
(b)前記標的分子に特異的に結合するポリペプチドを、前記標的分子に選択的に結合しないポリペプチドから分離すること、及び、
(c)前記標的分子によって結合された1つまたは複数のポリペプチドを同定すること、を含む、前記方法。
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