KR20230112616A - 3중-나선 번들 단백질들의 친화성 리간드 라이브러리 및 이의 용도 - Google Patents

3중-나선 번들 단백질들의 친화성 리간드 라이브러리 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230112616A
KR20230112616A KR1020237015988A KR20237015988A KR20230112616A KR 20230112616 A KR20230112616 A KR 20230112616A KR 1020237015988 A KR1020237015988 A KR 1020237015988A KR 20237015988 A KR20237015988 A KR 20237015988A KR 20230112616 A KR20230112616 A KR 20230112616A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
target molecule
library
ligand
affinity
seq
Prior art date
Application number
KR1020237015988A
Other languages
English (en)
Inventor
브랜던 키어
몰리 노쓰
사르미스타 바타차리아
토머스 스캔론
워런 케트
Original Assignee
아비타이드 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아비타이드 엘엘씨 filed Critical 아비타이드 엘엘씨
Publication of KR20230112616A publication Critical patent/KR20230112616A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

요약서
본 명세서는 친화성 크로마토그래피 분야에 관계하며, 더 구체적으로관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 리간드들을 선별하는데 적합한 3중-나선 번들 단백질 도메인들을 인코딩하는 핵산 및 폴리펩티드 라이브러리를 제공하는 것에 관계한다. 본 명세서는 표적 분자에 대한 이러한 친화성 리간드들을 식별해내고, 단리하기 위해, 이들 라이브러리를 이용하는 방법들에 또한 관계한다.

Description

3중-나선 번들 단백질들의 친화성 리간드 라이브러리 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 13일자로 제출된 U.S. 일련 번호 63/091,201, 그리고 2021년 5월 13일자로 제출된 U.S. 일련 번호 63/188,229에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원은 이들 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
명세서의 분야
본 명세서는 친화성 크로마토그래피 분야에 관계하며, 더 구체적으로관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 리간드들을 선별하는데 적합한 3중-나선 번들 단백질 도메인들을 인코딩하는 핵산 및 폴리펩티드 라이브러리를 제공하는 것에 관계한다. 본 명세서는 표적 분자에 대한 이러한 친화성 리간드들을 식별해내고, 단리하기 위해, 이들 라이브러리를 이용하는 방법들에 또한 관계한다.
본 명세서의 배경
생물학적으로-생산된 치료요법제들의 순도는 안전성과 효능을 보장하기 위해, 당국에 의해 면밀히 조사되고 규제된다. 따라서, 생물학적으로 생산된 치료요법제들을 고순도로 효율적으로 정제하기 위한 수단이 여전히 필요하다.
바이오프로세스 친화성 크로마토그래피는 몇 단계 또는 단일 단계로 단백질을 단리하고, 정제하는 수단을 제공한다. 그러나, 친화성 리간드들의 개발은 자원 집약적이고, 시간 소모적일 수 있다.
친화성 리간드의 발견을 용이하게 하기 위해, 관심 대상 표적에 대한 리간드들을 식별하기 위해 신속하고 효율적으로 스크리닝할 수 있는 친화성 라이브러리가 개발되었다. 이러한 라이브러리에는 면역글로불린 정제에 유용한 단백질 A 도메인 또는 Z 도메인을 기반으로 하는 라이브러리, 뿐만 아니라 정제 과정에서 특이적 항원-항체 상호작용을 활용하기 위한 항체를 기반으로 하는 라이브러리들이 내포된다. 더욱이, 고-친화성 리간드들을 생성할 수 있다는 것은 바이오프로세스 정제를 위한 친화성 제제를 생성하는 또 다른 중요한 단계다. 리간드들은 또한 엄격한 바이오프로세싱, 특히 NaOH를 포함하는 정치 세척(CIP) 방식을 견딜 수 있는 높은 안정성을 또한 가져야 한다. 많은 정제 주기 동안 수지를 재사용할 수 있는 능력은 정제 공정의 경제성에 광범위한 영향을 미친다. 단백질 A를 기반으로 한 IgG 결합 수지의 진화는 이를 잘 보여주고 있으며, 최신 변종은 반복되는 0.5M NaOH CIP 사이클을 견딜 수 있다. 이들 IgG 결합 도메인들은 Fc 영역에 있는 CH2 도메인과 CH3 도메인의 계면에 대해 전형적으로 50nM 미만의 높은 결합 친화성으로 특징화된다 (Graille et al (2000) Proc Natl Acad Sci USA. 97:5399-5404). 추가적으로, IgG 결합이 없지만, 그러나 높은 안정성을 또한 갖는 다른 형태를 지향하는 결합을 조작할 수 있는 능력을 갖고 있는 친화성 리간드에 대한 필요성이 존재한다. 본 명세서는 이러한 그 필요성을 해결한다. IgG 이외의 형태 또는 분자에 대하여 높은 친화성 리간드로 사용될 수 있는 일련의 폴리펩티드를 고려한다.
그러나, 다양한 구조의 다른 많은 생물학적 거대분자는 단백질-리간드 상호작용의 기본이 되는 다양한 메커니즘으로 알려져 있지만, 바이오프로세스 친화성 크로마토그래피에 의해 제공되는 능률화를 이용하기 위해 이러한 거대분자에 대한 친화성 리간드를 찾는 것은 여전히 필요하다.
분자 상호 작용의 다양성과 메커니즘은 잘 알려져 있다 (예를 들자면, Du et al. (2016) Int. J. Mol. Sci. 17. doi:10.3390/ijms17020144 참고). 생물학적 거대분자들에서 접할 수 있는 단백질-리간드 상호작용의 구조적 다양성의 일부 예시가 도 1에 나와 있고, 이러한 모델은 서로 다른 리간드 양식(architectures)를 갖는 광범위한 친화성 라이브러리의 필요성과 이점을 강조한다.
더욱이, 공지의 스캐폴드(scaffold) 라이브러리 내에서 조차도, 상이한 많은 라이브러리를 갖는 것들이 여전히 필요하다. 예를 들면, 한 연구에서, 리간드 발굴을 위해 48개의 상이한 스캐폴드 패밀리를 조사했으며, 단일 스캐폴드 라이브러리로부터 62개의 최고 리간드들을 모두 끌어내었다 (48개의 스캐폴드 라이브러리 중 스캐폴드 45개). 이 특별한 발견은 특정 리간드 구조 내의 높은 서열 다양성, 뿐만 아니라 리간드 구조의 다양성에 대한 필요성을 강조한다. 스캐폴드 패밀리들 간의 리간드 다양성을 효율적으로 처리하는 것이 리간드 발굴 시도에서 주요한 기술적 과제다. 추가 작업에서, 이들 62개 리간드 간의 서열 유사성으로 인해 해당 리간드들을 5개의 분기군(clades)으로 분류할 수 있었다. 이러한 리간드들은 이들 62개의 최상의 리간드와 관련된 선택성이 부족했지만, 한편 다른 계열은 중등도 친화력을 가진 ~900개의 리간드를 생성했다. 흥미롭게도, 이들 62개의 최고의 리간드에 사용된 스캐폴드는 생물학적 "자물쇠와 열쇠(lock and key)" 친화성 리간드를 제공하기 위해 개발되었다. 다른 스캐폴드 유형들로부터 선택적인 리간드의 결핍은 이러한 특정 스캐폴드 패밀리가 동족 수용체 모방에 필요한 분자 양식을 소유하고 있었음을 나타낸다(Coyle et al. in Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics, (ed., Matte) Elsevier, 2020, p. 55-79 (at p. 65).
따라서, 친화성 리간드의 부족, 뿐만 아니라 라이브러리 간의 유용성 가변로 인해, 여러 리간드-표적 양식을 나타내는 많은 상이한 유형의 구조와 상호 작용할 수 있는 리간드 라이브러리가 필요했다. 본원에 기술된 라이브러리는 이러한 요구를 해결하기 위한 전략의 일부다.
본 명세서의 요약
친화성 리간드 라이브러리는 표적 분자에 대한 새로운 친화성 리간드의 공급원으로 유용하며, 바이오프로세스 친화성 크로마토그래피를 사용하여 이들 표적을 정제하는 간단하고 경제적인 방법의 필요성을 충족시키킨다.
한 측면에서, 본 명세서는 N-말단으로부터 C-말단으로, 다음의 식으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 친화성 리간드를 인코드하는 핵산 라이브러리를 제공한다:
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS-[X6]n-SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12QAPX13-[B] (서열 식별 번호: 1),
이때
(a) [A]는 α-나선-형성하는 펩티드 도메인을 포함하며;
(b) X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, 및 X12 는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이며;
(c) n은 제시된 X6의 잔기 수를 나타내고, 1 내지 10의 정수이고,
(d) X9 및 X13은 각각 독립적으로 A, K 또는 R이며; 그리고
(e) [B]는 존재하지 않고, VD이거나, 또는 다음 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 도메인이며,
VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 9),
GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 10),
VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 11) 또는
GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 12).
특정 구체예들에 있어서, 상기 [A]의 α-나선-형성하는 펩티드 도메인은 스타필로코커스 단백질 A (SPA) 도메인, 이를 테면, Z-도메인, A-도메인, B-도메인, C-도메인, D-도메인 또는 E-도메인의 알칼리-안정적인 나선 1을 포함하며, 그리고 일부 구체예들에서 바람직하게는 Z-도메인이다. 일부 구체예들에서, [A]는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 2), VDAKFDKELEEARAKIERLPNLTE (서열 식별 번호: 3), VDAKFDKELEEVRAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 4), VDAKFEKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 5), VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 6) 또는 VDAKFDKELEEARAEIERLPALTE (서열 식별 번호: 7)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 이들 구체예들 중 임의의 구체예의 경우, [A]의 N-말단은 M 또는 MAQGT (서열 식별 번호: 8)가 앞에 선행될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 핵산 라이브러리는 표 1에서 서열 식별 번호: 13-18의 라이브러리들 중 임의의 하나다. 다른 구체예들에서, 본 명세서의 핵산 라이브러리는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 2)의 [A]를 갖고, n은 1이며, 그리고 X13은 K이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 핵산 라이브러리들 중 임의의 라이브러리는 펩티드 태그를 임의선택적으로 포함할 수 있고, 이때 이 펩티드 태그는 헤마토글루티닌, c-myc, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D, T7, GST, GFP, MBP, strep-태그, His-태그, Myc-태그들, TAP-태그 또는 FLAG 태그다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 친화성 리간드는 C-말단 리신 또는 시스테인을 더 포함한다.
일부 구체예들의 경우, 핵산 라이브러리는 파아지 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, RNA 디스플레이 라이브러리 또는 DNA 디스플레이 라이브러리다. 파아지 디스플레이 라이브러리가 특히 유용하며, 이론적으로 대략 106 ~ 109개의 별개의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
추가 측면에서 본 명세서는 관심대상의 표적 분자와 선택적으로 상호작용하는 폴리펩티드를 식별해내는 방법들을 제공하는데, 이 방법은 (a) 관심대상의 표적 분자를 본 명세서의 핵산 라이브러리의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드에 노출시키고; 그리고 (b) 이 표적 분자와 선택적으로 상호작용하지 않는 것들로부터 선택적으로 상호작용하는 폴리펩티드를 분리시키는 것을 포함한다. 이러한 방법에서, 이들 구체예에는 파아지, 박테리아 또는 세포의 표면에서 발현되는, 또는 이에 부착된, 또는 이에 테터링된 또는 그렇지 않으면 고형 지지체에 연합된 관심대상의 표적 분자를 갖는 것이 내포된다.
본 명세서는 관심대상의 표적 분자에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 (즉, 친화성 리간드)에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 방법들을 더 제공하며, 이때 상기 라이브러리는 본 명세서의 핵산 라이브러리의 발현에 의해 생성된 다수의 폴리펩티드를 포함하며, 상기 방법은 (a) 표적 분자에 이 폴리펩티드들의 특이적 결합에 적합한 조건 하에서 이 표적 분자 농도와 함께 항온처리하고; (b) 동일한 조건 하에서, 단 표적 분자 없이, 상기 라이브러리의 제2 샘플을 항온처리하고; (c) 고정된 표적 분자에 이 폴리펩티드가 결합함에 적합한 조건 하에서 이 고정된 표적 분자와 상기 제1 샘플과 제2 샘플 각각을 접촉시키고; (d) 각 샘플에 대해 고정된 표적 분자에 결합된 이 폴리펩티드를 검출하고; 그리고 (e) 상기 제2 샘플의 결합된 폴리펩티드 양에 비교하여, 상기 제1 샘플의 결합된 폴리펩티드의 양의 비율을 산출함으로써, 상기 표적 분자에 대한 이 폴리펩티드의 친화성을 결정하는 단계에 의해 스크리닝하는 것을 포함한다.
본 명세서의 여전한 추가 측면은 관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 친화성 리간드들을 식별해해는 방법들에 관계하며, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 상기 표적 분자를 파아지 디스플레이 라이브러리에 접촉시키고; (b) 상기 표적 분자와 특이적으로 결합하지 않는 것들로부터 상기 표적 분자와 (또는 이 분자에) 특이적으로 결합하는 파아지를 분리시킴으로써, 농축된(enriched) 파아지 라이브러리를 만들고; (c) 상기 농축된 파아지 라이브러리를 이용하여 a) 단계 및 b) 단계를 반복하여, 더 농축된 파아지 라이브러리를 만들고; (d) 추가 농축된 파아지 라이브러리가 원래 파아지 라이브러리와 비교하여 적어도 약 10- 내지 약 106-배 또는 그 이상으로 농축될 때 까지 단계 c)를 반복하고; 그리고 (e) 상기 추가 농축된 파아지 라이브러리를 플레이팅시키고, 이로부터 개별 클론을 단리시키고, 특징화시키고, 이로 인하여 상기 관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 친화성 리간드들이 식별된다.
전술한 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 표적 분자는 고형 지지체에 결합되거나, 또는 이 지지체에 부착된다. 다른 구체예들에서, 상기 파아지 디스플레이 라이브러리는 고형 지지체에 결합되거나, 또는 이 지지체에 부착된다. 어느 경우이든 간에, 상기 표적 분자는 아데노-연합된 바이러스 (AAV) 또는 AAV 캡시드이며, 더 구제척으로, AAV는 AAV8 또는 AAV8 혈청형 변이체다.
추가 측면에서, 본 명세서는 합성 또는 재조합 폴리펩티드들 다수를 포함하는 폴리펩티드 라이브러리 조성물을 제공하며, 각 폴리펩티드는 본원에 기술된 핵산 라이브러리의 친화성 리간드를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 식별해내는 방법들에 관계하며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 본 명세서의 폴리펩티드 라이브러리 조성물에 관심대상의 표적 분자를 노출시키고; (b) 상기 표적 분자에 특이적으로 결합하지 않는 것들로부터 상기 표적 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드들을 분리시키고; 그리고 (c) 상기 표적 분자에 결합된 이들 폴리펩티드 중 하나 또는 그 이상이 식별된다.
도면의 간단한 설명
도 1A 내지 도 1F는 상이한 표적-리간드 상호작용의 공간 채우기 및 리본 모델을 도시하는데, (A) 큰 홈(groove) 인터페이스, (B) 큰 평면 인터페이스, (C) 표면-표면 상보성, (D) 얕은 포켓 바인딩, (E) 볼록/오목(돌출 루프) 결합, 및 (F) 깊은 포켓 바인딩이 내포되어 있다.
도 2A 및 도 2B는 2중-나선 도메인(A)을 형성하는 능력을 갖는 서열의 N-말단에 대한 나선 형성 서열의 추가의 리본 표현을 보여준다. 이러한 추가에 의해 3중-나선 번들 단백질(B)이 생성된다. (A)에 나타낸 것에서, 3중-나선 번들 단백질의 나선 3과 2는 왼쪽에서 오른쪽으로 표시되어, 나선 2의 N-말단이 오른쪽에 나타난다. (B)에 나타낸 것에서, 나선은 나선 3, 나선 1 및 나선 2 순서로 나타나며, 나선 1의 N-말단은 이 다이어그램의 중앙 상단에 나타낸다.
도 3은 도 2B의 나선 3과 나선 2 사이에 긴 루프 (어두운 영역으로 강조 표시)를 추가한 리본 표현을 보여준다.
도 4는 예시적인 친화성 제제에 대한 센서그램을 나타낸다.
도 5는 0.5 M NaOH 존재 하에서 특정 친화성 제제에 대한 예시적인 안정성 데이터를 나타낸다.
본 명세서의 상세한 설명
정의
본 명세서가 보다 쉽게 이해되도록 하기 위해, 특정 용어들이 아래와 같이 우선적으로 정의된다. 본원에서 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 기술적 그리고 과학적 용어는 본 명세서가 관련된 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
단위, 접두사 및 기호는 International de Unites (SI) 승인 양식에 표시되어 있다. 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 서열은 좌측에서 우측 아미노에서 카르복시 방향으로 기록된다. 본 명세서에 제공된 표제는 본 명세서의 다양한 측면 또는 구체예들을 제한하는 것이 아니라, 이는 명세서 전체를 참조할 수 있을 것이다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 이들 모두 명세서를 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
단수 부정관사("a" 또는 "an")가 붙은 용어는 그 대상 중 하나 이상을 지칭하고; 예를 들어, "친화성 리간드"는 하나 또는 그 이상의 친화성 리간드들을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 단수 부정관사("a", "an"), "하나 또는 그 이상의" 및 "적어도 하나"는 상호 교환적으로 사용된다.
대략적으로 또는 약(about): 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략적으로" 또는 "약(about)"이란 명시된 기준 값과 유사한 값을 나타낸다. 특정 구체예들에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"이란 달리 언급되지 않거나 또는 문맥상 명백하지 않은 한, 언급된 기준 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 미만의 상위 또는 하위 값 (더 크거나 또는 더 작은) (그러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고) 범위 안에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
본원에서 사용된 "복수"라는 용어는 최소 10, 20, 30, 50, 75, 100, 1000 또는 그 이상이며, 최소 또는 최대 수를 쉽게 확인할 수 없는 컬렉션의 구성원 수를 나타지만, 그러나 수집 유형이나 사용 맥락에 따라 표시될 수 있다. 예를 들면, 파아지 디스플레이 라이브러리는 그것의 역가(동일하거나 상이할 수 있음)와 동일한 복수의 파아지를 함유하고, 확장에 의해 상응하는 복수의 폴리펩티드를 인코드한다.
용어 "내포하는"이란 "~를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않음"을 의미하는 데 사용된다. "내포하는" 및 "~를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않음"은 같은 의미로 사용된다.
생물학적 활성: 본원에서 사용된 바와 같이, "생물학적 활성"이라는 용어는 생물학적 시스템, 특히 유기체에서 활성을 갖는 임의의 제제의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에 투여될 때, 그 유기체에 생물학적 또는 생리학적 영향을 미치는 제제는 생물학적으로 활성으로 간주된다.
변이체 및 돌연변이체: 용어 "변이체"는 일반적으로 과학 문헌에서 정의되며 허용된 표준과 비교하여 유전적으로 어떤 방식으로든 상이한 유기체를 지칭하여 본원에서 사용되며, "변이체"는 또한 유전자형이 아닌 표현형 차이를 설명하는 데 사용될 수 있다 (King and Stansfield, 2002, A dictionary of genetics, 6th ed., New York, New York, Oxford University Press.
"돌연변이"라는 용어는 대부분의 사전에서 정의되며, 유전자 구조에 유전될 수 있는 변화를 도입하고, 이로 인하여 "돌연변이체"를 생성하는 과정과 관련하여 본원에서 사용된다(King & Stansfield, 2002). "변이체"라는 용어는 과학 및 비-과학적 문헌에서 "돌연변이"라는 용어 대신 점점 더 많이 사용되고 있다. 이들 용어는 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
보존적 치환 및 비-보존적 치환: "보존적 아미노산 치환"이란 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에 정의되어 있으며, 여기에는 다음의 것들이 내포된다: 염기성 측쇄 (예를 들자면, 리신 (K), 아르기닌 (R), 히스티딘 (H)); 산성 측쇄 (예를 들자면, 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E)); 하전되지 않은 극성 측쇄 (예를 들자면, 글리신 (G); 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), 시스테인 (C)); 비극성 측쇄 (예를 들자면, 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L), 이소류신 (I), 프롤린 (P), 페닐알라닌 (F), 메티오닌 (M), 트립토판 (W), 베타-분기된 측쇄 (예를 들자면, 트레오닌 (T), 발린 (V), 이소류신 (I)); 그리고 방향족 측쇄 (예를 들자면, 티로신 (Y), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 히스티딘 (H)). 예를 들면, 티로신을 페닐알라닌으로의 치환은 보존적 치환이다. 일부 구체예들에서, 리간드의 서열에서 보존적 아미노산 치환은 관심대상 표적에 대한 리간드의 특이적 결합을 부여하거나 또는 개선한다. 일부 구체예들에서, 리간드 서열의 보존적 아미노산 치환은 관심대상 표적에 대한 리간드의 결합을 감소시키거나 또는 폐기하지 않는다. 일부 구체예들에서, 보존적 아미노산 치환은 관심대상 표적에 대한 리간드의 특이적 결합에 크게 영향을 미치지 않는다. 선택적 결합 친화성을 부여, 변경 또는 유지하는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환 및 비-보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들자면, Brummell, Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi, Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 그리고 Burks, PNAS 94:412-417 (1997) 참고). 일부 구체예들에서, 리간드의 서열에서 비-보존적 아미노산 치환은 관심대상 표적에 대한 리간드의 특이적 결합을 부여하거나 또는 개선한다. 일부 구체예들에서, 리간드 서열의 비-보존적 아미노산 치환은 관심대상 표적에 대한 리간드의 결합을 감소시키거나 또는 폐기하지 않는다. 일부 구체예들에서, 비-보존적 아미노산 치환은 관심대상 표적에 대한 리간드의 특이적 결합에 크게 영향을 미치지 않는다.
친화성 크로마토그래피: 본원에 사용된 용어 "친화성 크로마토그래피"는 친화성 리간드가 생물학적 친화성을 통해 "자물쇠-열쇠" 방식으로 표적과 상호작용하는 크로마토그래피의 특정 방식을 의미한다. 친화성 크로마토그래피에서 유용한 상호작용의 예로는 효소-기질 상호작용, 바이오틴-아비딘 상호작용, 항체-항원 상호작용, 등이 있다.
친화성 리간드 및 리간드: "친화성 리간드" 및 "리간드" 용어는 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 이들 용어는 여기에 특이적인 모이어티, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질에 높은 친화도를 갖고 가역적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
단백질-기반 리간드: 본원에서 사용되는 용어 "단백질-기반 리간드"란 표적 폴리펩티드 또는 단백질에 가역적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질 또는 펩티드의 일부 또는 단백질의 일부를 포함하는 리간드를 의미한다. 본 명세서의 "리간드들"은 단백질-기반 리간드라고 이해하면 된다.
친화성 제제: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화성 제제"는 생물특이적 친화성 리간드가 공유 부착된 고체 지지체 또는 매트릭스에 관한 것이다. 전형적으로, 고형 지지체 또는 매트릭스는 표적 분자가 정제되는 시스템 내에서 불용성이다. 용어 "친화성 제제" 및 "친화성 분리 매트릭스(들)" 및 "분리 매트릭스(들)"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
링커: 본원에 사용된 바와 같이 "링커"는 독립적인 기능적 도메인을 다른 방식으로 연결하는 기능을 하는 펩티드 또는 다른 화학적 연결을 의미한다. 일부 구체예들에서, 링커는 리간드와 독립적인 기능적 도메인 또는 구조적 도메인을 함유하는 또 다른 폴리펩티드 성분 사이에 위치한다. 일부 구체예들에서, 링커는 리간드와 표면 사이에 위치한 펩타이드 또는 기타 화학적 링키지다.
자연적으로 발생: 핵산 분자, 폴리펩타이드 및 숙주 세포와 같은 생물학적 물질과 관련하여 사용될 때, "자연적으로 발생"이라는 용어는 자연에서 발견되고, 인간에 의해 변형되지 않은 것을 의미한다. 역으로, 생물학적 물질과 관련하여 사용되는 "비-천연" 또는 "합성"은 자연에서 발견되지 않거나 또는 인간에 의해 변형된 것을 의미한다.
"비-천연 아미노산", "아미노산 유사체" 및 "비-표준 아미노산 잔기"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에 제공된 바와 같이, 리간드에서 치환될 수 있는 비-천연 아미노산은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 비-천연 아미노산은 프롤린을 대체할 수 있는 4-히드록시프롤린; 리신을 대체할 수 있는 5-히드록시리신; 히스티딘을 대체할 수 있는 3-메틸히스티딘; 세린을 대체할 수 있는 호모세린; 그리고 리신을 대체할 수 있는 오르니틴이다. 폴리펩티드 리간드에서 치환될 수 있는 비-천연 아미노산의 추가 예시에는 다음과 같은 분자들이 내포되지만, 이에 국한되지 않는다: 일반적인 아미노산의 D-이성체, 2,4-디아미노부티르산, 알파-아미노 이소부티르산, A-아미노부티르산, Abu, 2-아미노부티르산, 감마-Abu, 엡실론-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 베타-알라닌, 란티오닌, 데히드로알라닌, γ-아미노부티르산, 셀레노시스테인 및 피롤리신 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 이를 테면, 베타-메틸 아미노산, C 알파-메틸 아미노산 및 N 알파-메틸 아미노산.
"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자": 본원에서 상호교환적으로 사용되는 폴리뉴클레오티드 및 핵산 분자란 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드와 같은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 이러한 용어에는 DNA, RNA, cDNA(상보적 DNA), mRNA(메신저 RNA), rRNA(리보솜 RNA), shRNA(작은 머리핀 RNA), snRNA(작은 핵 RNA), snoRNA(짧은 핵소체 RNA), miRNA(마이크로RNA), 게놈 DNA, 합성 DNA, 합성 RNA 및/또는 tRNA(전이 RNA)가 내포되지만, 이에 국한되지 않는다.
작동가능하게 연계된(Operably linked): 본 명세서에서 "작동가능하게 연계된"이라는 용어는 2개 또는 그 이상의 구성요소들이 이 해당 구성요소가 정상적으로 기능하고, 이들 요소 중 적어도 하나의 구성요소가 다른 구성요소 중 적어도 하나에 대해 발휘하는 기능을 중재할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된 것을 나타낸다. 2개의 분자는 직접적이든 또는 간접적이든 "작동 가능하게 연계"되어 있다.
펩티드 태그: 본원에서 사용되는 용어 "펩티드 태그"는 생성된 융합체에 기능을 제공하기 위해, 또다른 단백질의 일부이거나 또는 이 단백질에 부착된(예를 들어 유전 공학을 통해) 펩티드 서열을 의미한다. 펩티드 태그는 일반적으로 융합되는 단백질에 비해 상대적으로 짧다. 일부 구체예들에서, 펩티드 태그의 길이는 4개 또는 그 이상의 아미노산, 예컨대, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개 또는 25개 또는 그 이상의 아미노산이다. 일부 구체예들에서, 리간드는 펩티드 태그를 함유하는 단백질이다. 본원에서 제공된 바와 같은 용도를 갖는 수많은 펩티드 태그가 당업계에 공지되어 있다. 리간드 융합 단백질의 구성요소 또는 리간드가 결합된 표적 (예를 들면, 리간드 융합 단백질)의 구성 요소일 수 있는 펩티드 태그의 예시에는 다음의 것들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: HA (헤마토글루티닌), c-myc, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD), T7, GST, GFP, MBP, Strep-태그들, His-태그들, Myc-태그들, TAP-태그들 및 FLAG 태그 (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.). 마찬가지로, 태그 에피토프에 대한 항체는 예를 들어, 친화성 정제, Western 블롯, ELISA 분석 및 세포의 면역착색에서 융합 단백질의 검출 및 국소화를 가능하게 한다.
폴리펩티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"란 펩티드 결합에 의해 서로 연계된 아미노산의 순차적인 쇄를 지칭한다. 이 용어는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 나타내기 위해 사용되지만, 당업자는 이 용어가 긴 쇄에 국한되지 않고, 펩티드를 통해 함께 연계된 2개의 아미노산을 포함하는 최소 쇄를 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 폴리펩티드는 가공 및/또는 변형될 수 있다.
단백질: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"은 별개의 단위로 기능하는 하나 또는 그 이상 폴리펩티드를 지칭한다. 단일 폴리펩티드가 별개의 기능 단위이고, 별개의 기능 단위를 형성하기 위해 다른 폴리펩티드와 영구적 또는 일시적인 물리적 결합을 필요로 하지 않는 경우, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 호환적으로 사용될 수 있다. 별개 기능 단위가 서로 물리적으로 연합하는 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 경우, 용어 "단백질"은 물리적으로 커플링되고, 별개의 단위로서 함께 기능하는 다중 폴리펩티드를 지칭한다.
특이적으로 결합하다: 리간드와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "선택적 친화성을 갖는다"란 리간드가 특정 에피토프에 대해 관련없는 단백질을 비롯한 대체 물질과 비교하여, 더 빈번하게, 더 빠르게, 더 긴 기간 동안, 더 큰 친화성으로, 또는 상기의 조합으로 반응하거나 회합함을 의미한다. 상이한 종에서 상동성 단백질 사이의 서열 동일성 때문에, 특이적 결합에는 하나 이상의 종에서 단백질 또는 표적을 인지하는 결합제가 내포될 수 있으며, 예를 들어, 이중-특이적 또는 삼중-특이적이다. 마찬가지로, 상이한 단백질들의 폴리펩티드 서열의 특정 영역 내 상동성으로 인하여, 특이적 결합에는 하나 이상의 단백질 또는 표적을 인지하는 결합제가 내포될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 결합제는 제 2 표적에 특이적으로 결합하거나 또는 결합하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 이와 같이, "특이적 결합"은 배타적인 결합, 즉, 단일 표적에 결합을 반드시 요구하는 것은 아니다(비록 이러한 것이 내포될 지라도). 따라서, 특정 구체예들에 있어서, 리간드 또는 친화성 제제는 하나를 초과하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 다수의 표적은 친화성 제제 상의 동일한 결합 부위에 결합할 수 있다. "선택적으로 결합하다" 또는 "선택적으로 상호작용하다"는 본원에서 "최종적으로 결합하다"와 상호교환적으로 사용된다.
실질적으로: 본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로(substantially)"라는 용어는 관심대상의 특성 또는 속성의 전체 또는 거의-전체 범위 또는 정도를 나타내는 질적 조건을 나타낸다. 생물학 분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상이 거의 완료되지 않거나 또는 완전하게 진행되거나 완전한 결과를 달성하거나 또는 회피하는 경우가 거의 없다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전성의 잠재적인 결여를 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
본 명세서는 하나 또는 그 이상의 관심대상 표적, 예를 들면, 일부 구체예들에서, 바이러스 입자들에 특이적인 친화성 리간드의 선별용으로 핵산 및 폴리펩티드 라이브러리를 포괄한다.
친화성 리간드 라이브러리, 이의 구축 및 사용 방법
본 명세서의 라이브러리는 특정 3중-번들 나선 단백질들을 인코딩하는 폴리펩티드 조성물 및/또는 핵산 분자들을 포함하며 (도 2 및 도 3), 그리고 하나 또는 그 이상의 관심대상 표적 분자에 선택적으로 결합하는 서열을 이들 라이브러리 내에서 식별해내고 이를 선별할 수 있으며, 그리고 이로 인하여 표적 분자의 바이오프로세스 또는 다른 용도에 사용하기 위한 친화성 리간드를 생성할 수 있다. 본 개시내용의 라이브러리는 일부 구체예들에서에서 알칼리 안정적이고, 관심대상 표적을 선별하도록 높은 친화성으로 이에 선택적으로 결합하는 신규한 친화성 리간드의 생성을 가능하게 한다.
본원에 개시된 라이브러리를 만드는 방법에는 핵산 라이브러리의 경우 직접 합성, 재조합 생산, 이량체-삼량체 또는 코돈 돌연변이유발, 부위-지향된 돌연변이유발 및 이와 유사한 것들, 및 이의 조합, 그리고 펩티드 라이브러리의 경우 직접 화학적 합성 방법이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 이러한 모든 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다.
따라서, 본 명세서의 핵산 라이브러리는 구성부는 N-말단으로부터 C-말단으로, 다음 식으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 친화성 리간드를 인코드하는 구성부를 포함한다:
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS-[X6]n-SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12QAPX13-[B](서열 식별 번호: 1),
이때
(a) [A]는 α-나선-형성하는 펩티드 도메인을 포함하며;
(b) X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, 및 X12 는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이며;
(c) n은 제시된 X6의 잔기 수를 나타내고, 1 내지 10의 정수이고,
(d) X9 및 X13은 각각 독립적으로 A, K 또는 R이며; 그리고
(e) [B]는 존재하지 않고, VD이거나, 또는 다음 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 도메인이며,
VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 9),
GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 10),
VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 11) 또는
GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 12),
상기 식의 모이어티 [A]는 α-나선-형성하는 펩티드 도메인을 포함하고, 바람직하게는 알칼리에 안정적이다. 이러한 펩티드 도메인들은 다양한 공급원으로부터 당분야에 잘 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, α-나선-형성하는 펩티드 도메인들 스타필로코커스 단백질 A (SPA) 도메인들. 특정 구체예들에 있어서, SPA 도메인은 SPA Z-도메인, A-도메인, B-도메인, C-도메인, D-도메인 또는 E-도메인 중 임의의 하나의 도메인의 잔기 5-19에서 발견되는 SPA 도메인의 알칼리-안정적인 나선 1을 포함하며, 바람직하게는 Z-도메인의 것을 포함한다 (예를 들자면, Nilsson et al. (1987) Prot. Eng. 1:107-113), 그리고 U.S. 특허 번호. 6534628, 6831161, 7834158, 9187555, 9663558, 9683013, 10308690, 10501557, 및 10703774).
일부 구체예들에서, 본 명세서의 라이브러리에서, [A]는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 2), VDAKFDKELEEARAKIERLPNLTE (서열 식별 번호: 3), VDAKFDKELEEVRAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 4), VDAKFEKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 5), VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 6) 또는 VDAKFDKELEEARAEIERLPALTE (서열 식별 번호: 7)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 상기 라이브러리에서 친화성 리간드들의 N-말단 (즉, [A]의 N-말단)은 메티오닌일 수 있거나, 또는 MAQGT의 추가 아미노산 서열 (서열 식별 번호: 8)이 내포될 수 있다.
본 명세서의 핵산 라이브러리(이때 [B]는 없거나, 또는 VD인 경우) 구체예들에서, 추가 아미노산들이 [B]의 C-말단에 존재할 수 있다. 이러한 추가 아미노산들에는 지지 매트릭스에 대한 친화성 리간드의 커플링을 용이하게 하는 펩티드 태그 및 아미노산들이 내포된다.
이런 이유로, 본 명세서의 핵산 라이브러리들 중 임의의 라이브러리는 다음을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 펩티드 태그를 더 포함할 수 있다: 헤마토글루티닌, c-myc, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D, T7, GST, GFP, MBP, strep-태그, His-태그, Myc-태그들, TAP-태그 또는 FLAG 태그.
특정 구체예들에 있어서, 상기 핵산 라이브러리는 표 1에서 제공된 라이브러리들 중 임의의 하나이며, 즉, 상기 라이브러리는 표 1에서 제시된 아미노산 서열 세트를 포함하는 친화성 리간드를 인코드하는 구성부를 포함하고, 이때 X's, [A], n 및 [B]는 상기에서 정의된 바와 같다. 이들 라이브러리의 일부 구체예들에서, n은 1이다. X6은 루프 구조의 일부를 형성할 수 있기 때문에, X6 은 P 또는 H가 아닌 것이 바람직하다. 한 구체예에서, 본 명세서의 핵산 라이브러리는 상기 식을 보유하며, 이때 [A]는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 2)이며, n은 1이고, X13은 K이다.
표 1
이들 라이브러리의 예시적인 구체예에서, [A]는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE이며; 다음 기준 [X2는 알라닌 (A)이 아니며, X4는 세린 (S)이 아니며, X5는 아스파르트산 (D)이 아니며, X6 은 글루타민 또는 세린 (Q 또는 S)이 아니며, X8은 글루탐산 (E)이 아니며, X10은 리신 (L)이 아니며, 그리고 X11은 류신 (L)이 아니다] 중 적어도 두 가지를 충족하는 경우, X9를 제외한 각 X 위치는 임의의 아미노산이며; 그리고 X9는 A, R 또는 K이다.
이들 라이브러리의 예시적인 구체예에서, [A]는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE이며; 다음 기준 [X2는 알라닌 (A)이 아니며, X4는 세린 (S)이 아니며, X5는 아스파르트산 (D)이 아니며, X6 은 글루타민 또는 세린 (Q 또는 S)이 아니며, X8은 글루탐산 (E)이 아니며, X10은 리신 (L)이 아니며, 그리고 X11은 류신 (L)이 아니다] 중 적어도 두 가지를 충족하는 경우, X9 및 X12를 제외한 각 X 위치는 임의의 아미노산이며; 그리고 X9 및 X12는 A, R 또는 K이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 핵산 라이브러리들 중 임의의 라이브러리는 다음을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 펩티드 태그를 더 포함할 수 있다: 헤마토글루티닌, c-myc, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D, T7, GST, GFP, MBP, strep-태그, His-태그, Myc-태그들, TAP-태그 또는 FLAG 태그. 다른 구체예들에서, 펩티드 태그와 결합되든 또는 아니던 간에, 해당 라이브러리 내 상기 친화성 리간드는 C-말단 리신 또는 시스테인을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 핵산 라이브러리는 파아지 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, RNA 디스플레이 라이브러리 또는 DNA 디스플레이 라이브러리다. 파아지 디스플레이 라이브러리에서, 이론적으로 대략 106 ~ 109개의 별개의 핵산 서열을 갖는 것이 가능하다.
본 명세서의 또다른 측면에 따르면, 이의 핵산 라이브러리는 관심대상 표적 분자에 선택적으로 결합하는 폴리펩티드들을 식별해내는 각종 방법에 이용된다. 구체예는 관심대상 표적 분자에 선택적으로 결합하는 폴리펩티드들을 식별하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 관심대상의 표적 분자를 본 명세서의 핵산 라이브러리의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드에 노출시키고; 그리고 (b) 상기 표적 분자에 선택적으로 결합하지 않는 것들로부터 이들에 선택적으로 결합하는 폴리펩티드들을 분리시킨다. 한 구체예에서, 상기 관심대상의 표적 분자는 파아지, 박테리아 또는 세포의 표면에서 발현되는, 또는 이에 부착된, 또는 이에 테터링된 또는 그렇지 않으면 고형 지지대에 연합된다.
또다른 구체예는 관심대상의 표적 분자에 높은 친화성으로 선택적으로 결합하는 폴리펩티드들에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 이때 상기 라이브러리는 본 명세서의 핵산 라이브러리의 발현에 의해 생성된 다수의 폴리펩티드를 포함하며, 상기 방법은 (a) 표적 분자에 이 폴리펩티드들의 특이적 결합에 적합한 조건 하에서 이 표적 분자 농도와 함께 항온처리하고; (b) 동일한 조건 하에서, 단 표적 분자 없이, 상기 라이브러리의 제2 샘플을 항온처리하고; (c) 고정된 표적 분자에 이 폴리펩티드가 결합함에 적합한 조건 하에서 이 고정된 표적 분자와 상기 제1 샘플과 제2 샘플 각각을 접촉시키고; (d) 각 샘플에 대해 고정된 표적 분자에 결합된 이 폴리펩티드를 검출하고; (e) 상기 제2 샘플의 결합된 폴리펩티드 양에 비교하여, 상기 제1 샘플의 결합된 폴리펩티드의 양의 비율을 산출함으로써, 상기 표적 분자에 대한 이 폴리펩티드의 친화성을 결정하는 단계에 의해 스크리닝하는 것을 포함한다.
여전히 또다른 구체예는 관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 친화성 리간드들을 식별해내는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 전술한 표적 분자를 파아지 디스플레이 라이브러리에 접촉시키고; (b) 상기 표적 분자와 특이적으로 결합하지 않는 것들로부터 상기 표적 분자에 선택적으로 결합하는 파아지를 분리시킴으로써, 농축된 파아지 라이브러리를 만들고; (c) 상기 농축된 파아지 라이브러리를 이용하여 (a) 단계 및 (b) 단계를 반복하여, 더 농축된 파아지 라이브러리를 만들고; (d) 추가 농축된 파아지 라이브러리가 원래 파아지 라이브러리와 비교하여 적어도 약 10- 내지 약 106-배 또는 그 이상으로 농축될 때 까지 단계 (c)를 반복하고; 그리고 (e) 상기 추가 농축된 파아지 라이브러리를 플레이팅시키고, 이로부터 개별 클론을 단리시키고, 특징화시키고, 이로 인하여 상기 관심대상의 표적 분자에 선택적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 친화성 리간드들이 식별된다. 원하는 개별 클론을 쉽게 분리하는데 충분한, 추가로 농축된 파아지 라이브러리를 얻는데 필요한 주기의 횟수는 일반적으로 3-8회의 선별 라운드이며, 보다 일반적으로 3-4회의 선별 라운드로 수행할 수 있다. 이러한 방법에서, 상기 표적 분자 또는 상기 파아지 디스플레이 라이브러리는 선택적인 결합을 용이하게 하기 위해 (그리고 연속적인 라운드에서 세척 조건을 단순화시키기 위해, 이때 조건의 엄격도는 가변적일 수 있음), 고체 지지체에 결합되거나 또는 부착될 수 있다 (실시예들 참고). 결합된 파아지를 용출시키고 회수하기 위해, 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다.
이들 방법들 중 임의의 방법에 대한 바람직한 구체예들에서, 상기 표적 분자는 AAV 바이러스 또는 캡시드이며, 바람직하게는 AAV8 바이러스 또는 이의 혈청형 변이체다.
여전히 추가 측면은 다수의 합성 또는 재조합 폴리펩티드들을 포함하는 폴리펩티드 라이브러리 조성물에 관계하며, 각 폴리펩티드는 본 명세서의 핵산 라이브러리들 중 임의의 라이브러리에 대해 상기에서 특정된 바와 같은 친화성 리간드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 다수는 본원에서 특정된 바와 같이 50개 또는 그 이상이다 (상기 참고). 파아지 디스플레이 라이브러리에 의해 생성된 폴리펩티드 조성물의 이러한 구체예들에서, 상기 조성물은 상기 파아지 역가로 측정하였을 때, 100개 내지 1010개의 폴리펩티드를 보유할 수 있다.
여전히 추가 측면은 관심대상의 표적 분자에 선택적으로 결합하는 폴리펩티드 (친화성 리간드)를 식별해내는 방법에 관계하며, 이 방법은 (a) 관심대상의 표적 분자를 본 명세서의 폴리펩티드 라이브러리 조성물에 노출시키고; 그리고 (b) 전술한 표적 분자에 선택적으로 결합하지 않는 것들로부터 이들에 선택적으로 결합하는 폴리펩티드들을 분리시키는 것을 포함한다.
따라서, 본 명세서는 임의의 갯수의 원하는 분자 표적 분자들 중 하나 또는 그 이상에 대해 결합 특이성을 갖는 친화성 리간드를 스크리닝하고, 선별하는 영향력있는 방법들을 제공한다. 본 명세서의 라이브러리를 스크리닝할 수 있으며, 가상 결합 모이어티 서열 (폴리펩티드 및/또는 핵산)을 갖는 클론들은 목적하는 관심대상의 표적 분자의 특정 분자에 대해 당업계에 알려지고, 이용가능한 임의의 시험관내 또는 생체내 생물학적 분석에서 농축되고, 정제되고, 그리고 시험될 수 있다. 일단 분자 표적-결합 클론이 단리되면, 상기 친화성 리간드를 인코딩하는 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자들이 식별될 수 있고, 임의선택적으로 단리될 수 있다. 당업자는 표준 유전 및 분자 공학, 예를 들어, 친화성 성숙 및 의도된 목적, 예를 들자면, 높은 친화성으로 관심대상 표적과 상호작용하고, 가역적으로 결합하는 친화성 리간드를 생성하여, 해당 표적의 정제 및 바이오프로세스 제조를 용이하게 하기 위해 결합 모이어티의 특징을 최적화하기 위한 다른 잘 알려진-기술을 사용할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서의 상기 친화성 리간드들은 알칼리 안정적이다.
친화성 제제에 사용을 위한 관심대상 표적에 리간드 결합
표적에 결합하는 리간드의 특징은 그러한 활성을 평가하기 위해 공지된 또는 변형된 분석, 생물분석 및/또는 당업계에 공지된 동물 모델을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "표적에 대한 결합 친화성", "표적에 대한 결합" 및 이와 유사한 용어들은 예를 들어, 친화성 상수 (예를 들자면, 주어진 항원 농도에서 결합하고 및 해리되는 리간드의 양)의 결정을 통해 직접적으로 측정될 수 있는 리간드의 특성을 의미한다. 경쟁 분석, 평형 분석 및 미량열량 분석, 표면 플라즈몬 공명 상호 작용에 기반한 실시간 상호 작용 분석(예를 들면, BIACORE 기기 사용)과 같은 분자 상호 작용을 특성화하는 몇 가지 방법을 사용할 수 있다. 이들 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, Neri D et al. (1996) Tibtech 14:465-470 및 Jansson M et al. (1997) J Biol Chem 272:8189-8197와 같은 간행물에서 논의된다.
주어진 리간드 결합 이벤트에 대한 친화성 요구 사항은 결합 매트릭스의 구성 및 복잡성, 리간드 및 표적 분자 모두의 원자가 및 밀도, 리간드의 기능적 적용을 포함하되, 이에 국한되지 않는 다양한 요인에 따라 달라진다. 일부 구체예들에서, 리간드는 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 또는 10-5 M에 대등한 또는 이 보다 적은 해리 상수 (KD)로 관심대상 표적에 결합한다. 일부 구체예들에서, 리간드는 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7M, 5×10-8 M, 또는 10-8 M에 대등한 또는 이 보다 적은 KD로 관심대상 표적에 결합한다. 일부 구체예들에서, 리간드는 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M에 대등한 또는 이 보다 적은 KD로 관심대상 표적에 결합한다.. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법에 의해 생성된 리간드는 약 10-4 M 내지 약 10-5 M, 약 10-5 M 내지 약 10-6 M, 약 10-6 M 내지 약 10-7 M, 약 10-7 M 내지 약 10-8 M, 약 10-8 M 내지 약 10-9 M, 약 10-9 M 내지 약 10-10 M, 약 10-10 M 내지 약 10-11 M, 또는 약 10-11 M 내지 약 10-12 M의 해리 상수를 갖는다.
KD 및 해리-속도를 결정하기 위한 결합 실험은 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 이러한 용액을 만들기 위한 완충액은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 최종 용액의 원하는 pH에 크게 좌우된다. pH가 낮은 용액(<pH 5.5)은 예를 들어, 시트레이트 완충액, 글리신-HCl 완충액 또는 숙신산 완충액에서 만들 수 있다. 예를 들어, Tris-HCl, 인산염 완충액 또는 중탄산나트륨 완충액에서 pH가 높은 용액이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 최적의 pH 및/또는 염 농도를 결정하기 위한 목적으로, KD 및 해리-속도를 결정하기 위해 다수의 조건이 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 리간드는 0.1 내지 10-7 sec-1, 10-2 내지 10-7 sec-1, 또는 0.5 x 10-2 내지 10-7 sec-1 범위의 koff로 관심대상 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 리간드는 5 x10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 x10-3 sec-1, 또는 10-3 sec-1 미만의 해리속도(koff)로 관심대상 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서 리간드는 5 x10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 x10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1, 5 x10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 x10-7 sec-1, 또는 10-7 sec-1 미만의 해리-속도(koff)로 관심대상 표적에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예들에서, 리간드는 약 103 내지 107 M-1sec-1, 103 내지 106 M-1sec-1, 또는 103 내지 105 M-1sec-1의 범위의 kon로 관심대상 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 리간드 (예를 들자면, 리간드 융합 단백질)은 103 M-1sec-1, 5 x103 M-1sec-1, 104 M-1sec-1, 또는 5 x104 M-1sec-1 이상의 결합속도 (kon)로 관심대상 표적에 결합한다. 추가 구체예에서, 리간드는 105 M-1sec-1, 5 x105 M-1sec-1, 106 M-1 sec-1, 5 x106 M-1 sec-1, 또는 107 M-1 sec-1이상의 kon로 관심대상 표적에 결합한다.
관심대상 표적
각종 구체예들에 따르면, 리간드가 특이적으로 결합된 관심대상 표적 분자는 친화성 제제의 리간드가 결합하는 것이 바람직한 임의의 분자일 수 있다. 예를 들면, 리간드가 특이적으로 결합된 표적은 정제, 제조, 제형, 치료, 진단 또는 예후 관련성 또는 가치의 임의의 표적이 될 수 있다. 비-제한적 용도에는 치료 및 진단 용도가 내포된다. 다수의 예시적인 표적이 예로서 본 명세서에 제공되며, 이들은 설명을 위한으로, 이에 국한되지 않는다. 관심대상 표적은 자연적 발생된 것이거나 또는 합성된 것일 수 있다. 일부 구체예들에서, 표적은 생물학적으로 활성 단백질이다. 일부 구체예들에서, 관심대상 표적은 세포외 성분 또는 세포내 성분, 가용성 인자(예를 들어, 효소, 호르몬, 사이토킨, 성장 인자, 항체, 등) 또는 막경유 단백질(예를 들어, 세포 표면 수용체)이다. 일부 구체예들에서, 리간드가 특이적으로 결합된 관심대상 표적 자체가 상이한 서열을 갖는 리간드다.
링커
용어 "링커" 및 "스페이서(spacer)"는 본원에서 호환사용되며, 독립적인 기능적 도메인을 다른 방식으로 연결하는 기능을 하는 펩티드 또는 다른 화학적 연결을 의미한다. 일부 구체예들에서, 링커는 리간드와 독립적인 기능적 도메인을 함유하는 또 다른 폴리펩티드 성분 사이에 위치한다. 2개 또는 그 이상의 연계된 리간드를 커플링하기 위한 적합한 링커는 일반적으로 펩티드, 단백질 또는 다른 유기 분자를 연결하기 위해 당업계에서 사용되는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구체예들에서, 이러한 링커는 약제학적 용도로 의도되는 단백질들 또는 폴리펩티드들을 구축하는데 적합하다.
단일-쇄 아미노산 서열에서 리간드 융합 단백질의 추가 성분과 리간드를 작동가능하도록 연계시키기 위한 적합한 링커에는 폴리펩티드 링커, 이를 테면, 글리신 링커, 세린 링커, 글리신/세린 혼합형 링커, 글리신-풍부 및 세린-풍부 링커 또는 대개 극성 폴리펩티드 단편들로 구성된 링커가 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
일부 구체예들에서, 링커는 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 및 리신으로부터 선택된 주요 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 링커는 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 아스파르트산, 트레오닌, 글루타민, 및 리신으로부터 선택된 주요 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 리간드 링커는 입체적으로 방해받지 않는 대부분의 아미노산으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 링커는 글리신, 세린, 및/또는 알라닌으로부터 선택된 주요 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 펩티드 링커는 폴리글리신 (이를 테면, (Gly)5, 및 (Gly)8, 폴리(Gly-Ala), 그리고 폴리알라닌으로부터 선택된다.
리간드가 관심대상 표적에 결합하도록 허용하는 방식으로, 리간드에 링커가 작동가능하게 연계될 수 있다면, 이 링크는 임의의 크기 또는 조성일 수 있다. 일부 구체예들에서, 링커는 약 1 내지 50개의 아미노산들, 약 1 내지 20개의 아미노산들, 약 1 내지 15개의 아미노산들, 약 1 내지 10개의 아미노산들, 약 1 내지 5개의 아미노산들, 약 2 내지 20개의 아미노산들, 약 2 내지 15개의 아미노산들, 약 2 내지 10개의 아미노산들, 또는 약 2 내지 5개의 아미노산들이다. 링커(들)의 길이, 유연성 정도 및/또는 기타 속성이 친화성 제제에 사용하기 위한 리간드의 특정 속성, 예를 들어, 관심대상 표적에 대한, 또는 하나 또는 그 이상의 다른 관심대상 단백질에 대한, 또는 관심대상이 아닌 단백질(즉, 비-표적 단백질)에 대한 친화성, 특이성 또는 결합력(avidity)에 영향을 미칠 수 있음이 분명해야 한다. 일부 구체예들에서, 두 개 또는 그 이상의 링커가 이용된다. 일부 구체예들에서, 두 개 또는 그 이상의 링커는 동일하다. 일부 구체예들에서, 두 개 또는 그 이상의 링커는 상이하다.
일부 구체예들에서, 링커는 비-펩티드 링커, 이를 테면, 알킬 링커, 또는 PEG 링커다. 예를 들면, 알킬 링커, 이를 테면, -NH-(CH2)s-C(0)- (이때, s=2-20)가 이용될 수 있다. 이들 알킬 링커는 공간적으로 방해하지 않는 그룹, 이를 테면, 저가 알킬, 예를 들자면, C1 C6) 저가 아실, 할로겐 (예를 들자면, CI, Br), CN, NH2, 페닐, 등으로 추가 치환될 수 있다. 예시적인 비-펩티드 링커는 PEG 링커다. 일부 구체예들에서, PEG 링커의 분자량은 약 100 내지 5000 kDa, 또는 약 100 내지 500 kDa이다.
링커는 본원에 기술된 기술, 및/또는 당업계에 달리 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 링커는 표적 분자에 결합하는 리간드의 능력을 변경시키지 않는다(예를 들면, 이 능력을 파괴시키지 않는다).
콘쥬게이트된 리간드들: 친화성 분리 매트릭스를 포함하는 친화성 제제
리간드들 또는 관심대상 표적에 특이적 결합을 촉진시키는 리간드는 친화성 제제를 만들기 위해, 크로마토그래피에 이용되는 다양한 표면들, 예를 들자면, 비드, 수지, 젤, 막, 모놀리스, 등에 화학적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 관심대상 표적에 대항하는 리간드들을 포함하는 친화성 제제는 정제 및 제작 용도에 유용하다.
일부 구체예들에서, 리간드 (예를 들자면, 리간드 융합 단백질)는 적어도 한 개의 반응성 잔기를 함유한다. 반응성 잔기는 예를 들어, 화학요법 약물 또는 진단제와 같은 콘쥬게이트의 부착을 위한 부위로 유용하다. 예시적인 반응성 아미노산 잔기에는 예를 들면, 리신 및 시스테인이 내포된다. 반응성 잔기는 리간드의 어느 쪽이건 단부에, 또는 이 리간드 서열 내에 추가될 수 있거나, 및/또는 이 리간드 서열 내 또다른 아미노산과 대체될 수 있다. 적합한 반응성 잔기 (예를 들자면, 리신, 시스테인, 등)는 또한 추가 또는 치환 없이, 확인된 리간드 서열 내 또한 위치할 수 있다.
고형 표면에 부착
"고형 표면", "지지체", 또는 "매트릭스"는 본원에서 호환 사용되며, 이는 임의의 컬럼(또는 컬럼 재료), 비드, 시험관, 미량적정 플레이트, 고체 입자(예를 들면, 아가로스 또는 세파로스), 마이크로칩(예를 들면, 실리콘, 실리콘 유리 또는 금 칩) 또는 멤브레인(예를 들면, 합성된 (예를 들면, 필터) 또는 생물학적(예를 들면, 리포좀 또는 소포)) 리간드 또는 기타 단백질이 직접 또는 간접적으로 (예를 들면, 링커와 같은 다른 결합 파트너 중간체를 통해) 부착(즉, 결합, 연결 또는 접착)될 수 있는 것들, 또는 리간드가 매립될 수 있는 (예를 들면, 수용체 또는 채널을 통하여) 것들을 지칭하나, 이에 국한되지 않는다. 폴리펩티드를 고형 지지체에 부착시키기 위한 시약 및 기술, 예를 들어, 카바메이트 또는 티오에테르 커플링은 당업계에 잘 알려져 있다. 적합한 고형 지지체에는 다음의 것들이 내포되나, 그러나 이에 국한되지 않는다: 크로마토그래피 수지 또는 매트릭스(예를 들자면, Sepharose-4 FF 아가로스 비드와 같은 아가로스 비드), 플라스틱 미량적정 플레이트 웰의 벽 또는 바닥, 실리카-기반 바이오칩, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 실리카, 니트로셀룰로오스, 종이, 플라스틱, 나일론, 금속 및 이들의 조합. 리간드 및 기타 조성물은 당업계에 공지된 시약 및 기술을 사용하여 비-공유적 회합 또는 공유적 결합에 의해 지지체 물질 상에 부착될 수 있다. 일부 구체예들에서, 리간드는 링커를 사용하여 크로마토그래피 재료에 커플링된다.
한 측면에서, 본 명세서는 본 명세서의 라이브러리, 불용성 지지체에 커플링된 리간드 또는 다량체로 구성된 친화성 제제 (친화성 분리 매트릭스)를 제공한다. 이러한 지지체는 하나 또는 그 이상의 입자들, 이를 테면, 비드; 막; 필터; 모세관; 모노리스(monoliths); 그리고 크로마토그래피에서 일반적으로 사용되는 기타 형태가 될 수 있다. 상기 친화성 분리 매트릭스의 유리한 구체예에서, 지지체는 비드로도 알려진 실질적으로 구형인 입자로 구성된다. 적합한 입자 크기는 직경이 5-500μm, 이를 테면, 10-100μm, 예를 들자면, 20-80μm 범위 내에 있을 수 있다. 대안적 구체예에서, 상기 지지체는 막이다. 높은 흡착력을 얻기 위해, 상기 지지체는 바람직하게는 다공성이어야 하고, 리간드들은 외부 표면, 뿐만 아니라 이러한 다공성 표면에 커플링될 수 있다. 이러한 측면의 유익한 구체예에서, 상기 지지체는 다공성이다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 크로마토그래피 친화제를 제조하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 상기 기재된 바와 같은 리간드를 제공하고, 리간드를 지지체에 커플링시키는 것을 포함한다. 커플링은 예를 들어, 리간드의 질소 또는 황 원자를 통해 수행될 수 있다. 이들 리간드는 지지체 표면과 리간드 사이에 적절한 거리를 제공하기 위해, 스페이서 요소를 통해 간접적으로 지지체에 커플링될 수 있다. 단백질 리간드들을 다공성 또는 비-다공성 표면에 고정화시키는 방법은 이 분야에 잘 공지되어 있다.
리간드 생산
제공된 방법을 실시하는데 유용한 리간드의 생산은 당업계에 공지된 화학 합성, 반-합성 방법 및 재조합 DNA 방법을 위한 다양한 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 가용성 제제 및 세포 결합 단백질로서 리간드를 개별적으로 또는 다중-도메인 융합 단백질의 일부로서 생산하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구체예들에서, 리간드에 대한 전반적인 생산 계획은 참조 단백질 스캐폴드를 얻는 것과 변형을 위한 스캐폴드 내의 복수의 잔기를 확인하는 것을 포함한다. 이 구체예에 따라, 참조 스캐폴드는 하나 또는 그 이상의 알파-나선 영역 또는 다른 3차 구조를 갖는 단백질 구조를 포함할 수 있다. 일단 확인되면, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환에 의해 다수의 잔기 중 임의의 잔기를 변형시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 보존적 치환을 만든다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 비-보존적 치환을 만든다. 일부 구체예들에서 천연 아미노산 (예를 들자면, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 중 하나)은 기준 스캐폴드에서 변형을 목표로 하는 위치에서 치환된다. 일부 구체예들에서, 변형에는 시스테인 또는 프롤린의 치환은 내포되지 않는다. 특정 구체예에서 확인된 원하는 위치에서 변형된 후, 결과적으로 변형된 폴리펩티드들 (예를 들자면, 후보 리간드들)는 예를 들면, 플라스미드, 박테리아, 파아지, 또는 다른 벡터에서 재조합적으로 발현될 수 있다 (예를 들면, 변형된 폴리펩티드들 각각의 수를 증가시키기 위해). 상기 변형된 폴리펩타이드는 이어서 정제되고, 스크리닝되어, 특정한 관심대상 표적에 대한 특이적 결합을 갖는 변형된 폴리펩타이드를 식별할 수 있다. 변형된 폴리펩티드들는 참조 스캐폴드와 비교하여, 관심대상 표적에 대한 향상된 결합 특이성을 나타낼 수 있거나 또는 주어진 관심대상 표적 (또는 비-표적 단백질)에 대해 전혀 결합하지 않거나, 또는 거의 결합을 나타내지 않을 수 있다. 일부 구체예들에서, 관심대상 표적에 따라, 참조 스캐폴드는 관심대상 표적과 약간의 상호작용 (예를 들자면, 비-특이적 상호작용)을 보일 수 있는 한편, 특정 변형된 폴리펩티드들은 관심대상 표적에 대한 결합 특이성이 적어도 약 2-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 50 배, 또는 적어도 약 100-배 (또는 그 이상) 증가를 나타낼 수 있다. 리간드의 생산, 선택 및 단리에 관한 추가 세부 사항은 아래에서 자세히 제공된다.
리간드들의 재조합 발현
일부 구체예들에서, 리간드 이를 테면, 리간드 융합 단백질은 "재조합적으로 생산된다"(즉, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산된다). 리간드 융합 단백질들을 합성하는데 이용가능한 예시적인 재조합 방법에는 합효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 합성, 콘카타머화(concatemerization), 심리스(seamless) 클로닝 및 반복적 방향성 결찰 (RDL)이 내포되나, 이에 국한되지 않는다 (예를 들자면, Meyer et al., Biomacromolecules 3:357-367 (2002), Kurihara et al., Biotechnol. Lett. 27:665-670 (2005), Haider et al., Mol. Pharm. 2:139-150 (2005); 및 McMillan et al., Macromolecules 32(11):3643-3646 (1999) 참고.
또다른 측면에서, 상기 본원에 기술된 구체예들에 따른 리간드 또는 다량체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 또한 제공된다. 따라서, 본 명세서는 모든 형태의 제시되는 핵산 서열, 이를 테면, 상기 폴리펩티드 (리간드)를 인코딩하는 RNA 및 DNA를 포괄한다. 본 명세서는 벡터, 이를 테면, 플라스미드를 제공하는데, 여기에는 이러한 코딩 서열에 추가하여, 본 명세서에 따른 폴리펩티드 또는 다량체의 발현을 위한 요구되는 신호 서열을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 요소들을 임의선택적으로 더 포함한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 발현 제어 요소로서 하나 이상의 프로모터 또는 전사 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 및 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 벡터 내에 삽입될 수 있고, 이 백터는 발현을 위해 임의의 적합한 숙주 세포 내 함유될 수 있다.
리간드를 인코딩하는 핵산의 발현은 전형적으로 리간드를 인코딩하는 핵산을 발현 벡터의 프로모터에 작동가능하게 연결함으로써 이루어진다. 전형적인 발현 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 해동 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다. 대장균(E. coli)에서 발현에 유용한 예시적인 프로모터에는 예를 들면, T7 프로모터가 내포된다.
당업계에 공지된 방법을 사용하여 적절한 전사/해독 제어 신호와 함께 리간드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전적 재조합이 내포되지만 이에 국한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포이 내포되나, 이에 국한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 발현 숙주에서 수행될 수 있다. 일부 구체예들에서, 리간드를 인코딩하는 핵산 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연계되고, 이 핵산 서열은 숙주 내에서 리간드로 전사되거나 및/또는 해독될 수 있다.
리간드를 인코딩하는 핵산을 발현시키기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 리간드를 인코딩하는 핵산 (예를 들자면, 개별 리간드 하위단위 또는 리간드 융합체) 또는 이의 일부분 또는 이의 단편들을 함유하는 벡터에는 플라스미드 벡터, 단일-가닥으로된 파아지 벡터 및 이중-가닥으로 된 파아지 벡터, 뿐만 아니라 단일-가닥으로 된, 그리고 이중-가닥으로 된 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터가 내포된다. 파아지 벡터 및 바이러스 벡터는 또한 감염 및 형질도입을 위한 공지된 기술을 사용하여 포장되거나 또는 캡슐화된 바이러스 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 더욱이, 바이러스 벡터는 복제 능력이 있거나 또는 그렇지 않으면 복제 결함이 있을 수 있다. 그렇지 않으면, 무-세포 해독 시스템을 사용하여 DNA 발현 구조체에서 파생된 RNA를 사용하여 단백질을 생산할 수도 있다 (예를 들자면, WO86/05807 및 WO89/01036; 그리고 U.S. 특허 번호 5,122,464).
일반적으로, 임의의 유형의 세포 또는 배양 세포주가 본원에 제공된 리간드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 조작된 숙주 세포를 생성하기 위해 사용되는 배경 세포주는 파아지, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포이다. 상기 코딩 서열 리간드 융합 단백질을 발현시키는데 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 포유류 세포는 관심대상 표적의 코딩 서열과 융합 폴리펩타이드의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포 시스템으로 사용될 수 있다. 세포는 유기체, 배양물, 또는 형질전환된 또는 이식유전자적 속성의 세포주로부터의 1차 분리물일 수 있다.
적합한 숙주 세포에는 미생물, 이를 테면, 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예를 들자면, 대장균, B. 서브틸리스); 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들자면, 사카로미세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들자면, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들자면, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 타바코 모자이크 바이러스, TMV)에 감염된, 또는 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들자면, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계가 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
리간드 생산에 있어서 숙주 세포로서 유용한 원핵생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 이를 테면, 대장균(E. coli) 및 B. 서브틸리스가 내포된다. 원핵 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 선택가능한 표현형 마커 유전자 유전자를 함유한다 (예를 들자면, 항생제 내성을 부여하거나, 또는 독립영양요구성을 제공하는 단백질을 인코딩하는 유전자). 유용한 원핵 숙주 발현 벡터에는 pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pGEMl (Promega, Wis., USA), pET (Novagen, Wis., USA) 및 pRSET (Invitrogen, Calif., USA) 일련의 벡터들 (예를 들자면, Studier, J. Mol. Biol. 219:37 (1991) 및 Schoepfer, Gene 124:83 (1993) 참고)이 내포된다. 원핵 숙주 세포 발현 벡터에 빈번하게 이용되는 예시적인 프로모터 서열에는 T7 (Rosenberg et al., Gene 56:125-135 (1987)), 베타-람탐아제 (penicillinase), 락토스 프로모터 시스템 (Chang et al., Nature 275:615 (1978)); 그리고 Goeddel et al., Nature 281 :544 (1979)), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, (1980)), 및 tac 프로모터 (Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)가 내포된다.
일부 구체예들에서, 리간드의 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질변환된 효모 세포들을 비롯한, 진핵 숙주 세포 시스템이 이용된다. 본 명세서의 조성물을 만드는데 이용될 수 있는 예시적인 효모에는 속(genus) 사카로미세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 악티노미세테스(Actinomycetes) 및 클루베로미세스(Kluyveromyces)의 효모들이 내포된다. 효모 벡터는 전형적으로 2mu 효모 플라스미드의 원래 복제 서열, 독자적으로 복제가능한 서열 (ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 서열 for 전사 종료를 위한 서열, 및 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 효모 발현 구조체들에서 프로모터 서열의 예시에는 메탈로티오닌, 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzeman, J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)) 및 기타 해당 효소(glycolytic enzymes), 이를 테면, 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포 글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제의 프로모터가 내포된다. 효모 발현 및 효모 형질전환 프로토콜에 사용하기 위한 적합한 추가 벡터 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들자면, Fleer, Gene 107:285-195 (1991) 및 Hinnen, PNAS 75:1929 (1978) 참고.
곤충 및 식물 숙주 세포 배양 시스템은 본 발명의 조성물을 생산하는데 또한 유용하다. 이러한 숙주 세포 시스템에는 U.S. 특허 번호 6,815,184; U.S. 공개 번호 60/365,769, 및 공개 번호 60/368,047; 그리고 WO2004/057002, WO2004/024927, 및 WO2003/078614에서 기술된 것들을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는, 예를 들면, 리간드의 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들자면, 베큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 타바코 모자이크 바이러스, TMV)에 감염된, 또는 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들자면, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계가 내포된다.
일부 구체예들에서, 이중-미소(double-minute) 염색체에서 안정적으로 증폭된 (CHO/dhfr) 또는 안정적으로 증폭되지 않은 (예를 들자면, 뮤린 세포주), 리간드를 인코딩하는 다수의 DNA 복사체를 함유하도록 공작된 세포주를 비롯하여, 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들자면, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연합된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스)로 감염된 동물 세포 시스템을 비롯한, 숙주 세포 시스템이 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 리간드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 벡터는 폴리시스트론성(polycistronic)이다. 이들 조성물 생산에 유용한 예시적인 포유류 세포에는 293 세포들 (예를 들자면, 293T 및 293F), CHO 세포들, BHK 세포들, NS0 세포들, SP2/0 세포들, YO 골수종 세포들, P3X63 마우스 골수종 세포들, PER 세포들, PER.C6 (Crucell, Netherlands) VERY 세포들, Hela 세포들, COS 세포들, MDCK 세포들, 3T3 세포들, W138 세포들, BT483 세포들, Hs578T 세포들, HTB2 세포들, BT20 세포들, T47D 세포들, CRL7O30 세포들, HsS78Bst 세포들, 하이브리도마 세포들, 그리고 기타 포유류 세포들이 내포된다. 본 명세서를 실행함에 있어서 유용한 예시적인 추가적인 포유류 숙주 세포에는 T 세포들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 발현 시스템 및 선별 방법은 당업계에 공지되어 있고, 하기 참고문헌 및 거기에 인용된 참고문헌에 기재된 것들을 포함한다: Borth et al., Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000), Werner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), Andersen et al., Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), Chadd et al., Curr. Op, Biotechnol. 12:188-194 (2001), 및 Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12:450-454 (2001). 발현 시스템 및 선택 방법의 추가 예시들은 Logan et al., PNAS 81:355-359 (1984), Birtner et al. Methods Enzymol. 153:51-544 (1987))에서 기술된다. 포유류 숙주 세포 발현 벡터에 대한 전사 서열 및 해독 서열은 종종 바이러스 게놈에서 유래된다. 포유류 발현 벡터에서 통상적으로 사용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 유인원 바이러스 40(SV40) 및 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래된 서열들이 내포된다. 포유동물 숙주 세포에서 사용하기 위한 예시적인 시판되는 발현 벡터에는 pCEP4(Invitrogen) 및 pcDNA3(Invitrogen)가 내포된다.
핵산을 숙주 세포(예를 들어, 포유류 숙주 세포)에 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 및 이와 유사한 것들이 내포된다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 참고.
관심대상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법에는 DNA 및 RNA 벡터의 사용이 내포된다. 바이러스 벡터, 특히 레트로 바이러스 벡터는 인간 세포와 같은 포유류 (가령, 인간) 세포에 유전자를 삽입하는 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노 바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참고.
관심대상의 DNA 및 RNA 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 방법에는 세포의 전기천공법이 내포되며, 이때 세포 막의 투과성을 증가시키기 위해 전기장을 세포에 적용하고, 이로써 화학물질, 약물 또는 폴리뉴클레오티드들이 세포로 유입되는 것이 가능하게 된다. 리간드 함유 DNA 또는 RNA 작제물은 전기천공법을 사용하여 포유류 또는 원핵 세포에 도입될 수 있다.
일부 구체예들에서, 세포의 전기청공으로 T 세포들, NK 세포들, NKT 세포들의 표면 상에 리간드-CAR이 발현된다. 이러한 발현은 세포의 수명 동안 일시적이거나 또는 안정적일 수 있다. 전기천공은 MaxCyte GT® 및 STX® 형질감염 시스템 (MaxCyte, Gaithersburg, MD, USA)을 비롯한, 당업계에 공지된 방법으로 달성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙조 세포 안으로 도입시키는 화학적 수단에는 콜로이드성 분산 시스템, 이를 테면, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 그리고 수중유(oil-in-water) 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템이 내포된다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드계는 리포좀 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 비-바이러스성 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 사용은 핵산을 숙주 세포 내로 (시험관내, 생체외 또는 생체내) 도입하기 위해 고려된다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산은 지질과 연합된다. 지질과 연합된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화될 수 있으며, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되어 리포좀 및 올리고 뉴클레오티이드 둘 다와 결합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되어 리포좀에 포획될 수 있고, 리포좀과 복합체를 이루고, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 결합되거나, 지질 중 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함유되거나 또는 복합체화되거나, 또는 그렇지 않으면 지질과 연합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터와 관련된 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들면, 그들은 이중층 구조, 미셀 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 그것들은 단순히 용액에 흩어져 있어 크기 또는 모양이 균일하지 않은 응집체를 또한 형성할 수도 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방성 물질이다. 예를 들면, 지질은 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 부류, 뿐만 아니라 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 방울을 포함한다.
상업적 공급원으로부터 사용에 적합한 지질을 구할 수 있다. 예를 들면, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, Mo.에서 얻을 수 있으며; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, NY)에서 얻을 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring에서 얻을 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)에서 얻을 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올의 지질 원액은 약 -20℃에서 보관할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 쉽게 증발하기 때문에 유일한 용매로 사용된다. "리포좀"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중-박층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것이 특징이 될 수 있다. 다중-박층 리포좀은 수성 매질로 분리된 여러 지질 층을 가지고 있다. 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때, 이들은 자발적으로 형성된다. 지질 성분들은 폐쇄 구조가 형성되기 전에 자가-재배열을 거쳐, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(Ghosh et al., Glycobiology 5:505-510 (1991)). 그러나, 용액에서 정상적인 소포 구조와 다른 구조를 갖는 조성물도 또한 포함된다. 예를 들면, 지질은 미셀 구조로 추정될 수 있거나, 또는 단순히 지질 분자의 비-균일 응집체로 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체 또한 고려된다.
숙주 세포 안으로 외인성 핵산을 도입하거나 또는 본 명세서의 억제제에 세포를 노출시키는 데 사용되는 방법과 무관하게, 숙주 세포에 재조합 핵산 서열의 존재는 당분야에 공지된 다양한 분석을 통하여 통상적으로 확인될 수 있다. 이러한 분석에는 예를 들면, 당분야에 잘 공지된 "분자 생물학적" 검정, 이를 테면, Southern 및 Northern 블랏팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 이를 테면 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 가령, 면역학적 방법(이를 테면, ELISAs 및 Western 블랏)에 의해 탐지하는 검정, 또는 본 명세서 범위 안에 속하는 물질을 식별하기 위한 본원에 기술된 것들이 내포된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나, 또는 발현되지 않는 유전자이며, 폴리펩티드의 발현으로 쉽게 검출 가능한 속성, 예를 들어, 효소 활성으로 현시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포로 도입된 후 적절한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 암호화하는 유전자들이 내포될 수 있지만, 이에 국한되지 않는다 (예를 들자면, Ui-Tei et al., FEBS Lett. 479:79-82 (2000)). 적합한 발현 시스템은 당분야에 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최대 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측면 영역을 갖는 구조체는 프로모터로써 식별된다. 이러한 프로모터 영역들은 리포터 유전자에 통상적으로 연계될 수 있고, 프로모터-구동된 전사를 조절하는 능력에 대하여 물질들을 평가하는데 이용될 수 있다.
포유류 숙주-벡터 발현 시스템에는 다수의 선별 시스템이 이용될 수 있는데, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 유전자, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자를 비롯한 것들이 있으나, 이에 국한되지 않는다(Lowy et al., Cell 22:817 (1980)). 추가적으로, 항대사물질 내성은 예를 들어, dhfr, gpt, neo, hygro, trpB, hisD, ODC(오르니틴 데카르복실라제) 및 글루타민 신타제 시스템에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 개시제 N-말단 메티오닌은 본 발명의 라이브러리의 리간드 또는 리간드들은 NH-말단에 내포된다. 많은 경우에, 이 리간드는 N-말단 메티오닌 잔기가 없는 상태로 단리되며, 이는 발현 중에 절단되는 것으로 추정된다. 많은 경우에, N-말단 메티오닌을 함유하는 정제된 리간드의 일부만을 갖는 혼합물이 얻어진다. N-말단 메티오닌의 존재 또는 부재가 본원에 기술된 라이브러리, 리간드 및 친화성 제제의 기능성에 영향을 미치지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
리간드 정제
일단 리간드 또는 리간드 융합 단백질이 재조합 발현에 의해 생산되었다면, 재조합 단백질의 정제를 위해 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 일부 구체예들에서, 리간드는 정제를 용이하게 하기 위해 본원에 구체적으로 개시되거나, 또는 당업계에 달리 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 임의선택적으로 융합된다. 일부 구체예들에서, 친화성 정제를 위한 리간드 친화성 컬럼을 위한 리간드들 (예를 들자면, 항체들과 기타 친화성 매트릭스), 그리고 임의선택적으로, 이 리간드 또는 이들 리간드에 의해 결합된 융합 조성물의 다른 성분들은 당분야에 공지된 기술을 사용하여 이 리간드의 최종 제조 전, 상기 조성물로부터 제거된다.
리간드의 화학적 합성
재조합 방법에 추가하여, 당업계에 공지된 다양한 액상 화학적 공정과 고형상 화학 공정을 사용하여, 원하는 폴리펩티드의 유기 화학적 합성을 사용함으로써 리간드 생산을 수행할 수도 있다. 다양한 자동 합성기가 상업적으로 이용가능하고 공지된 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105:6442 (1983); Merrifield, Science, 232:341-347 (1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1- 284; Barany et al., Int. J. Pep. Protein Res., 30:705 739 (1987); Kelley et al. in Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K., ed. Plenum Press, NY. 1990, vol. 12, pp. 1-19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1989 참고. 이러한 방법론의 한 가지 장점은 비-천연 아미노산 잔기들이 리간드 서열로 통합될 수 있다는 것이다.
본 명세서의 방법들에서 이용되는 리간드는 합성 또는 해독 과정 동안 또는 그 이후, 예를 들자면, 당화, 아세틸화, 벤질화, 인산화, 아미드화, 페길화, 포르밀화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 항체 분자에 대한 연결, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질 분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 유비퀴틴화, 등에 의해 변형될 수 있다 (예를 들자면, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, 2d Ed. (W.H. Freeman and Co., N.Y., 1992); Postranslational Covalent Modification of Proteins, Johnson, ed. (Academic Press, New York, 1983), pp. 1-12; Seifter, Meth. Enzymol., 182:626-646 (1990); Rattan, Ann. NY Acad. Sci., 663:48-62 (1992) 참고). 일부 구체예들에서, 이들 펩티드는 N-말단에서 아세틸화되거나 및/또는 C-말단에서 아미드화된다.
다양한 화학적 변형 중 임의의 변형은 아세틸화, 포르밀화, 등을 포함하는 공지 된 기술에 의해 수행할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 추가적으로, 유도체들은 하나 또는 그 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
일부 구체예들에서, 이들 펩티드 백본의 고리화 또는 거대-고리화는 측쇄에서 측쇄로 링키지(linkage) 형성에 의해 달성된다. 이를 달성하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 천연 아미노산 뿐만 아니라 비-천연 아미노산이 관련될 수 있다. 이러한 접근법에는 이황화 형성, 란티오닌 형성 또는 티올 알킬화(예를 들면, Michael 추가), 아미노 측쇄와 카르복실레이트 측쇄 간 아미드화, 클릭 화학(예를 들면, 아지드 - 알킨 축합), 펩티드 스테이플링, 폐환 복분해(ring closing metathesis) 및 효소 사용이 내포된다.
정제용 친화성 제제
친화성 크로마토그래피를 기반으로 하는 정제에서, 관심대상 표적 (예를 들자면, 단백질 또는 분자)은 일반적으로 크로마토그래피 매트릭스에 공유 결합된 리간드에 특이적이고, 가역적으로 결합하는 능력에 따라 선택적으로 단리된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 라이브러리로부터 확인된 리간드는 재조합 공급원 또는 생물학적 샘플(예를 들어, 혈청)과 같은 천연 공급원으로부터 관심 표적의 친화성 정제를 위한 시약으로 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 관심대상 표적에 특이적으로 결합하는 리간드는 비드 상에 고정되며, 그 다음 이를 이용하여 해당 표적을 진화성 정제한다.
단백질을 표면에 공유적으로 커플링시키는 방법들은 당업자에게 공지되어 있고, 고형 표면에 리간드를 부착시키는 데 사용될 수 있는 펩티드 태그는 당업자에게 공지되어 있다. 더욱이, 리간드는 당업계에 공지된 임의의 시약들 또는 기술을 사용하여 고형 표면에 부착(즉, 커플링, 연계 또는 접착)될 수 있다. 일부 구체예들에서, 고형 지지체는 비드, 유리, 슬라이드, 칩 및/또는 젤라틴을 포함한다. 따라서, 당업계에 공지된 기술에 의해, 일련의 리간드를 사용하여 고형 표면 상에 어레이를 만들 수 있다. 예를 들면, U.S. 공개 번호 2004/0009530에서는 어레이를 만드는 방법들이 기술된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 라이브러리로부터 유래된 리간드를 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 이의 동계(cognate) 관심대상 표적을 단리시킨다. 일부 구체예들에서, 이러한 리간드는 고형 지지체 상에 고정된다. 상기 리간드는 본원에 기술되거나 또는 그렇지 않으면, 당업계에 공지된 기술 및 시약을 사용하여 고형 지지체 상에 고정화될 수 있다. 적합한 고형 지지체는 본원에 기술되거나 또는 그렇지 않으면 당업계에 공지되어 있고, 특이적 구체예들에서 크로마토그래피 컬럼의 패킹에 적합하다. 상기 친화성 제제는 다양한 크기의 컬럼에 패킹될 수 있고, 다양한 선형 속도에서 작동될 수 있거나, 또는 고정된 친화성 리간드는 리간드와 관심대상 표적 간에 복합체 형성에 유리한 조건 하에서 용액과 함께 로딩되거나, 또는 접촉될 수 있다. 비-결합 물질들은 씻어낼 수 있다. 적합한 세척 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 적합한 세척 조건들의 예시는 Shukla and Hinckley, Biotechnol Prog. 2008 Sep-Oct;24(5):1115-21. doi: 10.1002/btpr.50에 기술되어 있다.
일부 구체예들에서, 크로마토그래피는 관심대상 표적과 리간드를 함유하는 용액을 혼합하고, 그 다음 관심 대상과 리간드의 복합체를 분리하여 수행된다. 예를 들면, 리간드는 고형 지지체, 이를 테면, 비드에 고정되고, 그 다음 여과에 의해 관심대상 표적을 갖는 용액으로부터 단리된다. 일부 구체예들에서, 리간드는 펩티드 태그, 이를 테면, 폴리-His 꼬리 또는 스트렙타아비딘 결합 영역을 함유하는 융합 단백질이며, 이를 이용하여 복합체가 형성된 후, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 수지 또는 스트렙타비딘-피복된 기판을 사용하여 리간드를 단리할 수 있다. 일단 분리되면 용출 조건 하에서 관심대상 표적은 리간드로부터 풀려나와, 정제된 형태로 회수될 수 있다.
관심 표적의 용리는 pH를 낮추고 염 농도를 증가시키거나, 또는 그렇지 않으면, 달리 염 조건을 변경하는 것을 비롯한 당업계에 일반적으로 알려진 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 입자의 용리는 일반적으로 pH를 낮춤으로써, 예를 들어, 더 높은 pH가 사용될 수 있지만, 2.0-3.0으로 낮추어 달성될 수 있다. AAV8 그리고 이의 변이체들 및 이의 돌연변이체의 용리를 위한 최적 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 명세서의 친화성 제제는 알칼리에 잘 견디는 것이어서, 세척을 위해 최대 0.5M 농도의 NaOH를 사용할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 예를 들어, 사이클당 최대 30분 내지 60분 동안 0.5M NaOH 노출의 CIP) 요법은 여러 차례 사이클, 예를 들어, 15-30회 사이클 동안 초기 AAV8 결합 용량의 최대 70% - 90%, 그리고 DNA 및 HCP의 낮은 잔여 수준, 뿐만 아니라 실질적으로 유동 용량의 변화가 없는 것들을 비롯하여 일관된 크로마토그래피 성능을 보장한다.
본 명세서의 일부 구체예들이 예시로서 설명되었지만, 본 명세서의 발명(들)이 실행될 수 있음이 명백할 것이며, 본 발명의 사상을 벗어나거나 또는 청구 범위를 초과하지 않고, 당업자의 범위 내에서 많은 수정, 변형 및 적용, 그리고 수많은 등가물 또는 대체 솔루션의 사용될 수 있다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 최종적으로 그리고 개별적으로 전체가 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 전체가 참조로 여기에 편입된다.
실시예
실시예 1: 라이브러리 구축 및 스크리닝
파아지 디스플레이 라이브러리는 다음 스캐폴드를 이용하여 Z 도메인의 나선 2와 나선 3(도 2 및 도 3) 에서 페이스 변이체 위치에 기반하여 기획되었다:
[A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPSX6SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12-[B].
상기 파아지 라이브러리는 삼량체 코돈 포스포르아미다이트 돌연변이유발을 사용하여 구축되었다.
하나의 라이브러리 경우, [A]는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE이며; 다음 기준 [X2는 알라닌 (A)이 아니며, X4는 세린 (S)이 아니며, X5는 아스파르트산 (D)이 아니며, X6 은 글루타민 또는 세린 (Q 또는 S)이 아니며, X8은 글루탐산 (E)이 아니며, X10은 리신 (L)이 아니며, 그리고 X11은 류신 (L)이 아니다] 중 적어도 두 가지를 충족하는 경우: X9를 제외한 각 X 위치는 임의의 아미노산이며; 그리고 X9는 A, R 또는 K이고,
그리고 그것이 충족되면, 다음 중 적어도 두 가지는 참이다.
또다른 라이브러리의 경우, [A]는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE이며; 다음 기준 [X2는 알라닌 (A)이 아니며, X4는 세린 (S)이 아니며, X5는 아스파르트산 (D)이 아니며, X6 은 글루타민 또는 세린 (Q 또는 S)이 아니며, X8은 글루탐산 (E)이 아니며, X10은 리신 (L)이 아니며, 그리고 X11은 류신 (L)이 아니다] 중 적어도 두 가지를 충족하는 경우: X9 및 X12를 제외한 각 X 위치는 임의의 아미노산이며; 그리고 X9 및 X12는 A, R 또는 K이다.
파아지 라이브러리 패닝(panning)은 (Griffiths et al. 1994, EMBO J., 13:3245-3260)에서 일반적으로 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, AAV8 캡시드를 비롯한, 관심대상 표적에 대해 필요에 따라, 여러 라운드의 패닝이 수행된다.
개별 파아지 클론은 파아지 ELISA에서 관심대상 표적에 대한 결합에 대해 테스트할 수 있다. 간략하게 설명하자면, 1 x 1012 파아지는 관심대상 표적 및 음성 대조군과 함께 1 μg/mL로 피복된 96-웰 플레이트에서 항온처리된다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, PBS-0.1% Tween-20에서 웰을 3회 세척하여 결합되지 않은 입자를 제거한다. 결합된 박테리오파지는 특정 항-M13 항체를 사용하여 검출하고, 관심대상 표적에 결합하는 친화성 리간드를 식별해내기 위해 단리하고, 서열화시킨다. 식별 후, 상기 친화성 리간드들은 펩티드로 만들어지거나, 또는 재조합적으로 생산될 수 있다.
펩티드는 표준 Fmoc 고체상 펩티드 합성 기술에 의해 합성되고, 예비 역상 HPLC에 의해 정제된다. 펩티드들의 순도는 UV 및 사중극자 비행-시간형-질량 분석 검출(quadrupole time-of-flight mass spectrometric detection)을 모두 사용하는 RP-UPLC에 의해 평가된다.
재조합 친화성 리간드들은 표준 기술을 이용하여 대장균(E. coli) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된다. 리간드들을 다중 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. His-태그된 리간드들의 경우, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)가 기본 포획 단계로 사용된다. 바이오티닐화된 리간드들는 AviTag™ 시스템(Avidity, Aurora, CO)으로 생성된다. AviTag™ 서열을 포함하는 비-바이오티닐화된 리간드들은 외인성 비오틴을 생략함으로써 준비된다. 재조합 단백질 리간드들의 순도 및 식별은 SDS-PAGE, RP UPLC, 사중극자 비행-시간형-질량 분석 및 크기 압출 크로마토그래피 (SEC); Sephadex S75, Cytiva, Marlborough, MA)의 조합에 의해 평가된다. 많은 경우에, 이 리간드는 N-말단 메티오닌 잔기가 없는 상태로 단리되며, 이는 발현 중에 절단되는 것으로 추정된다.
실시예 2. 예시적인 AAV8 친화성 리간드
이 실시예는 생물층 간섭계(ForteBio, Menlo Park, CA)를 사용하여, 실시예 1에 기술된 라이브러리로부터 얻은 친화성 리간드에 기초한 AAV8 캡시드에 대한 비오티닐화된 리간드의 결합을 입증한다. 바이오티닐화된 리간드들을 센서 상에 고정시켰으며, 100mM 인산나트륨, 100mM 염화나트륨, 0.01%(w/v) 소 혈청 알부민 및 0.1%(v/v) Triton X-100, pH 7.0를 함유하는 용액에 5 x 1011 개 입자/mL를 항온처리하였다. 블랭크(blank) 센서와 비-결합 리간드가 대조군으로 내포되었다. 연합 단계는 반응이 초기 선형 증가를 보여주었는데, 이는 AAV의 경우 전형적인 것이다. 센서가 포화됨에 따라, 센서그램은 더 큰 곡률을 보였다 (도 4, 리간드 1). 반응은 4000초의 항온처리 후에 측정되었고, 예시적인 AAV8 리간드의 경우는 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
실시예 3. 라이브러리 친화성 리간드들의 알칼리 안정성
본 실시예는 친화성 리간드의 수산화나트륨 안정성을 보여준다. 리간드를 0.5M NaOH에서 16시간 동안 항온처리한 후 중화시켰다. NaOH 처리된 리간드의 결합을 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하고, 처리되지 않은 리간드와 비교하였다. 유지된 결합딩은 다음 공식에 따라 산출되었다:
유지된 결합 % = (NaOH 처리 후 측정된 반응) ÷ (처리되지 않은 경우 측정된 반응) × 100
이 데이터는 라이브러리의 친화성 리간드가 높은 알칼리 안정성을 가질 수 있음을 보여준다 (도 5).
실시예 4. 예시적인 친화성 수지의 구축
본 실시예는 본 명세서에서 식별 및 기술된 리간드를 포함하는 친화성 제제의 생성 및 특성화를 입증한다. 친화성 수지는 리간드를 아가로스 비드에 콘쥬게이팅시켜 준비했다. RAPID RUN 6% Agarose 비드(ABT, Madrid, Spain) 및 Praesto® Jetted A50 비드(Purolite, King of Prussia, PA)는 디숙신이미딜 카보네이트로 활성화되었고, 수지 mL 당 리간드 밀도 1 - 8mg으로 펩티드 리간드와 커플링되었다. 모든 수지에 대한 실질적인 리간드 밀도는 다음 공식에 따라 차감성 RP-HPLC 방법을 사용하여 측정되었다:
실질적인 리간드 밀도 =
(피드 내 리간드 양 - 유출액 내 리간드 양) /
수지 용적.
본 명세서에 기재된 개시 내용의 많은 수정 및 다른 실시예는 전술한 설명 및 관련 도면에 제시된 교시 내용의 이점을 갖는 이러한 개시 내용이 속하는 기술 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 명세서는 개시된 특정 구체예들에 국한되지 않으며, 수정 및 다른 구체예들은 첨부된 청구범위 및 본원에서 개시된 구체예 목록의 범위 내에 포함되도록 의도된다는 것을 이해해야 한다. 비록 특정한 용어가 사용되었지만, 이들은 단지 일반적이고 설명적인 의미로 사용되며 제한을 위한 것은 아니다.
본 명세서에 개시된 임의의 방법은 언급된 순서대로 수행될 필요는 없다. 본 명세서에 개시된 방법들에는 의사에 의해 취해진 특정 조치들이 내포되어 있지만; 그러나 이러한 작업에 대한 명시적 또는 암시적 제3자 지침 또한 내포될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> AVITIDE, INC. <120> AFFINITY LIGAND LIBRARIES OF THREE-HELIX BUNDLE PROTEINS AND USES THEREOF <130> 1580.00155WO <140> PCT/US2021/054874 <141> 2021-10-13 <150> 63/188,229 <151> 2021-05-13 <150> 63/091,201 <151> 2020-10-13 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (16)..(25) <223> /note="This region may encompass 1-10 residues" <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (34)..(34) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(36) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (43)..(43) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> SITE <222> (1)..(75) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> SITE <222> (44)..(75) <223> /note="This region may encompass one of the following sequences: 'VD' or 'VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH' or 'GQAGQGGGSGLNDIFEA QKIEWHEHHHHHH' or 'VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH' or 'GLNDIFEAQKIEWHEH HHHHH' or it may be absent" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 1 Xaa Gln Arg Arg Xaa Phe Ile Xaa Xaa Leu Arg Xaa Asp Pro Ser Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ala Xaa Leu Leu Ala Xaa 20 25 30 Ala Ala Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln Ala Pro Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg Ala Lys Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Val Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu 20 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Val Asp Ala Lys Phe Glu Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu 20 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Ile Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu 20 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Glu 20 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Met Ala Gln Gly Thr 1 5 <210> 9 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Val Asp Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile 1 5 10 15 Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His 20 25 30 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 10 Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu 1 5 10 15 Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His 20 25 30 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 11 Val Asp Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His 1 5 10 15 Glu His His His His His His 20 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 12 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His 1 5 10 15 His His His His His 20 <210> 13 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(49) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (40)..(49) <223> /note="This region may encompass 1-10 residues" <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(60) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> SITE <222> (1)..(67) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 13 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Gln Arg Arg Xaa Phe Ile Xaa 20 25 30 Xaa Leu Arg Xaa Asp Pro Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Ser Ala Xaa Leu Leu Ala Xaa Ala Ala Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln 50 55 60 Ala Pro Ala 65 <210> 14 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(49) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (40)..(49) <223> /note="This region may encompass 1-10 residues" <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(60) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> SITE <222> (1)..(67) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 14 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg Ala Lys Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Gln Arg Arg Xaa Phe Ile Xaa 20 25 30 Xaa Leu Arg Xaa Asp Pro Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Ser Ala Xaa Leu Leu Ala Xaa Ala Ala Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln 50 55 60 Ala Pro Ala 65 <210> 15 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(49) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (40)..(49) <223> /note="This region may encompass 1-10 residues" <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(60) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> SITE <222> (1)..(67) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 15 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Val Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Gln Arg Arg Xaa Phe Ile Xaa 20 25 30 Xaa Leu Arg Xaa Asp Pro Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Ser Ala Xaa Leu Leu Ala Xaa Ala Ala Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln 50 55 60 Ala Pro Ala 65 <210> 16 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(49) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (40)..(49) <223> /note="This region may encompass 1-10 residues" <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(60) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> SITE <222> (1)..(67) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 16 Val Asp Ala Lys Phe Glu Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Gln Arg Arg Xaa Phe Ile Xaa 20 25 30 Xaa Leu Arg Xaa Asp Pro Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Ser Ala Xaa Leu Leu Ala Xaa Ala Ala Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln 50 55 60 Ala Pro Ala 65 <210> 17 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(49) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (40)..(49) <223> /note="This region may encompass 1-10 residues" <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(60) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> SITE <222> (1)..(67) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 17 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Ile Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Gln Arg Arg Xaa Phe Ile Xaa 20 25 30 Xaa Leu Arg Xaa Asp Pro Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Ser Ala Xaa Leu Leu Ala Xaa Ala Ala Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln 50 55 60 Ala Pro Ala 65 <210> 18 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(49) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (40)..(49) <223> /note="This region may encompass 1-10 residues" <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(60) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> /replace="K" or "R" <220> <221> SITE <222> (1)..(67) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 18 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Leu Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Ala Leu Thr Glu Xaa Gln Arg Arg Xaa Phe Ile Xaa 20 25 30 Xaa Leu Arg Xaa Asp Pro Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Ser Ala Xaa Leu Leu Ala Xaa Ala Ala Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln 50 55 60 Ala Pro Ala 65 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 19 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 20 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(27) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Any amino acid <400> 21 Xaa Gln Arg Arg Xaa Phe Ile Xaa Xaa Leu Arg Xaa Asp Pro Ser Xaa 1 5 10 15 Ser Ala Xaa Leu Leu Ala Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Asn Asp Xaa 20 25 30

Claims (18)

  1. N-말단으로부터 C-말단으로, 다음의 식으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 친화성 리간드를 인코드하는 핵산 라이브러리:
    [A]-X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS-[X6]n-SAX7LLAX8AX9X10X11NDX12QAPX13-[B](서열 식별 번호: 1),
    이때
    (a) [A]는 α-나선-형성하는 펩티드 도메인을 포함하며;
    (b) X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, 및 X12 는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이며;
    (c) n은 존재하는 X6 잔기의 수를 나타내고, 1 내지 10의 정수이고,
    (d) X9 및 X13은 각각 독립적으로 A, K 또는 R이며; 그리고
    (e) [B]는 존재하지 않고, VD이거나, 또는 다음 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 도메인이며,
    VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 9),
    GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 10),
    VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 11) 또는
    GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH (서열 식별 번호: 12).
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 전술한 α-나선-형성하는 펩티드 도메인은 SPA Z-도메인, A-도메인, B-도메인, C-도메인, D-도메인 및 E-도메인 중 임의의 하나, 그리고 바람직하게는 Z-도메인의 잔기 5-19에서 발견되는 스타필로코커스 단백질 A (SPA) 도메인의 알칼리-안정적인 나선 1을 포함하는, 핵산 라이브러리.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 [A]는 다음의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는, 핵산 라이브러리:
    VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 2),
    VDAKFDKELEEARAKIERLPNLTE (서열 식별 번호: 3),
    VDAKFDKELEEVRAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 4),
    VDAKFEKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 5),
    VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 6) 또는
    VDAKFDKELEEARAEIERLPALTE (서열 식별 번호: 7).
  4. 청구항 3에 있어서, 이때 [A]의 N-말단은 M 또는 MAQGT (서열 식별 번호: 8)가 앞에 선행될 수 있는, 핵산 라이브러리.
  5. 청구항 1-4 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 임의선택적으로 펩티드 태그를 포함하며, 이때 전술한 태그는 헤마토글루티닌, c-myc, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D, T7, GST, GFP, MBP, strep-태그, His-태그, Myc-태그들, TAP-태그 또는 FLAG 태그인, 핵산 라이브러리.
  6. 청구항 1-5 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 리간드는 C-말단 리신 또는 시스테인을 포함하는, 핵산 라이브러리.
  7. 청구항 1-6 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 [A]는 VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE (서열 식별 번호: 2)이며, n은 1이며, 그리고 X13은 K인, 핵산 라이브러리.
  8. 청구항 1에 있어서, 이때 전술한 라이브러리는 서열 식별 번호: 13-18 중 임의의 하나를 포함하는, 핵산 라이브러리.
  9. 청구항 1-8 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 라이브러리는 파아지 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, RNA 디스플레이 라이브러리 또는 DNA 디스플레이 라이브러리인, 핵산 라이브러리.
  10. 관심대상의 표적 분자과 선택적으로 상호작용하는 폴리펩티드를 식별하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    a) 관심대상의 표적 분자를 청구항 1-9 중 임의의 한 항에 따른 핵산 라이브러리의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드에 노출시키고; 그리고
    b) 상기 표적 분자와 선택적으로 상호작용하지 않는 것들로부터 선택적으로 상호작용하는 폴리펩티드를 분리시킨다.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 관심대상의 표적 분자는 파아지, 박테리아 또는 세포의 표면에서 발현되는, 또는 이에 부착된, 또는 이에 테터링된 또는 그렇지 않으면 고형 지지대에 연합되는, 방법.
  12. 관심대상의 표적 분자에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 있어서, 이때 상기 라이브러리는 청구항 1-9 중 임의의 한 항에 따른 핵산 라이브러리의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드를 포함하며, 이때 방법은 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 이 분자에 이들 폴리펩티드가 특이적 결합하는데 적합한 조건 하에 표적 분자 농도를 상기 라이브러리 샘플과 항온처리하고;
    (b) 상기 표적 분자 없이 동일한 조건 하에서 상기 라이브러리의 제2 샘플을 항온처리하고;
    (c) 상기 고정된 표적 분자에 이 폴리펩티드가 결합하는데 적합한 조건 하에 고정된 표적 분자와 상기 제1 샘플과 상기 제2 샘플 각각을 접촉시키고;
    (d) 각 샘플에 대해 고정된 표적 분자에 결합된 폴리펩티드를 검출하고; 그리고
    (e) 상기 제2 샘플로부터 결합된 폴리펩티드의 양에 대해 상기 제1 샘플의 결합된 폴리펩티드 양의 비율을 산출함으로써, 상기 표적 분자에 대한 이들 폴리펩티드의 친화성을 결정한다.
  13. 관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는하나 또는 그 이상의 친화성 리간드들을 식별해내는 방법에 있어서, 이 방법은 다음을 포함하는 방법:
    (a) 전술한 표적 분자를 청구항 9의 파아지 디스플레이 라이브러리에 접촉시키고;
    (b) 농축된 파아지 라이브러리를 만들기 위해 전술한 표적 분자와 선택적으로 상호작용하지 않는 것들로부터 전술한 표적 분자에 특이적으로 결합하는 파아지를 분리시키고;
    (c) 더 농축된 파아지 라이브러리를 만들기 위해 전술한 농축된 파아지 라이브러리를 가지고 단계 a) 및 단계 b)를 반복하고;
    (d) 원래 파아지 라이브러리와 비교하여 적어도 약 10- 내지 약 106-배 또는 그 이상으로 농축될 때 까지 단계 c)를 반복하고; 그리고
    (e) 전술한 더 농축된 파아지 라이브러리를 도말하고, 이로부터 개별 클론을 단리하고, 특징화시키고, 이로 인하여 상기 관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 친화성 리간드들을 식별해낸다.
  14. 청구항 13에 있어서, 이때 전술한 표적 분자 또는 전술한 파아지 디스플레이 라이브러리는 고형 지지체에 결합되거나, 또는 이에 부착되는, 방법.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 이때 전술한 표적 분자는 아데노-연합된 바이러스 (AAV) 또는 AAV 캡시드인, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 이때 전술한 AAV는 AAV8 또는 AAV8 혈청형 변이체인, 방법.
  17. 합성 또는 재조합 폴리펩티드들을 다수 포함하고, 이때 각 폴리펩티드는 청구항 1-8 중 임의의 한 항에 따른 친화성 리간드를 포함하는, 조성물.
  18. 관심대상의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 식별하는 방법에 있어서, 이 방법은 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 관심대상의 표적 분자를 청구항 17의 조성물에 노출시키고;
    (b) 상기 표적 분자에 선택적으로 결합하지 않는 것들로부터 전술한 표적 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 분리시키고; 그리고
    (c) 전술한 표적 분자가 결합된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들을 확인한다.
KR1020237015988A 2020-10-13 2021-10-13 3중-나선 번들 단백질들의 친화성 리간드 라이브러리 및 이의 용도 KR20230112616A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063091201P 2020-10-13 2020-10-13
US63/091,201 2020-10-13
US202163188229P 2021-05-13 2021-05-13
US63/188,229 2021-05-13
PCT/US2021/054874 WO2022081779A1 (en) 2020-10-13 2021-10-13 Affinity ligand libraries of three-helix bundle proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230112616A true KR20230112616A (ko) 2023-07-27

Family

ID=78819609

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237015988A KR20230112616A (ko) 2020-10-13 2021-10-13 3중-나선 번들 단백질들의 친화성 리간드 라이브러리 및 이의 용도

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240026344A1 (ko)
EP (1) EP4229068A1 (ko)
JP (1) JP2023551353A (ko)
KR (1) KR20230112616A (ko)
WO (1) WO2022081779A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024025911A1 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Avitide LLC An affinity agent comprising a ligand that binds vce and comprises seq id no: 1

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
GB9823071D0 (en) 1998-10-21 1998-12-16 Affibody Technology Ab A method
US6815184B2 (en) 2000-07-31 2004-11-09 Biolex, Inc. Expression of biologically active polypeptide in duckweed
JP5350573B2 (ja) 2002-03-19 2013-11-27 スティヒティング ディーンスト ランドバウクンディフ オンデルズーク 植物におけるｇｎｔｉｉｉ発現
SE0200943D0 (sv) 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
SI1539966T1 (sl) 2002-09-12 2010-10-29 Greenovation Biotech Gmbh Postopek za produkcijo proteinov
WO2004057002A2 (en) 2002-12-20 2004-07-08 Greenovation Biotech Gmbh Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells
CN103269761B (zh) 2010-12-20 2016-05-18 通用电气健康护理生物科学股份公司 亲和色谱基质
CN103269762B (zh) 2010-12-20 2016-01-27 通用电气健康护理生物科学股份公司 亲和色谱基质
CN105377880B (zh) 2013-07-10 2020-08-07 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 突变的免疫球蛋白结合多肽
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method

Also Published As

Publication number Publication date
US20240026344A1 (en) 2024-01-25
WO2022081779A1 (en) 2022-04-21
JP2023551353A (ja) 2023-12-08
EP4229068A1 (en) 2023-08-23
WO2022081779A9 (en) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220213447A1 (en) AAV9 Affinity Agents
JP2013528567A (ja) 免疫グロブリンＧＦｃ領域結合ポリペプチド
Chu et al. Peptides and pseudopeptide ligands: a powerful toolbox for the affinity purification of current and next-generation biotherapeutics
JP7117741B2 (ja) ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法
US20240026344A1 (en) Affinity ligand libraries of three-helix bundle proteins and uses thereof
US20230391829A1 (en) Aav8 affinity agents
US11008365B2 (en) Polypeptide exhibiting affinity to antibodies forming non-native three-dimensional structure
CN116490516A (zh) 三螺旋束蛋白的亲和配体文库及其用途
US20240174717A1 (en) Affinity agents
WO2024025911A1 (en) An affinity agent comprising a ligand that binds vce and comprises seq id no: 1
WO2024054656A2 (en) Affinity agents
KR20240000462A (ko) Aav2 친화성 제제
WO2023122327A2 (en) Chi domain affinity ligands and agents
WO2024102190A2 (en) Affinity agents
WO2024118813A2 (en) Affinity agents
Camperi et al. Protein purification by affinity chromatography with peptide ligands selected from the screening of combinatorial libraries
Swistowski Development of a new platform technology for the recognition and validation of peptide-protein interactions