CN103269761B - 亲和色谱基质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从液体中分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法。所述方法包括首先使液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触；通过与配体相互作用使含有免疫球蛋白的蛋白质吸附到基质上；接着清洗其上吸附有含有免疫球蛋白的蛋白质的基质的任选步骤；以及通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触来回收所述含有免疫球蛋白的蛋白质。所述方法对先前分离方法的改进在于，每个配体包含一个或多个蛋白A结构域(E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体，至少一个单体具有在对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z？N28的位置上的天冬酰胺的取代，以及其中所述配体与未取代的配体相比提供洗脱pH的增加。

Description

亲和色谱基质
发明领域
本发明涉及亲和色谱法领域，且更具体涉及含有配体的分离基质，所述配体含有一个或多个蛋白A结构域(E、D、A、B、C)或蛋白Z，其中在至少一个结构域(单体)中，对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z的N28的位置上的天冬酰胺已被取代为另一种氨基酸。本发明亦涉及用具有增加洗脱pH的优势的前述基质分离目标蛋白质的方法。
发明背景
免疫球蛋白为全球范围内生产或研发中最普遍的生物制药产品。此特定治疗市场的高度商业化需求和由此带来的价值已导致制药公司将重点放在将其各自的mAb生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。
在大多数情况下将亲和色谱法用作这些免疫球蛋白分子(例如单克隆或多克隆抗体)纯化中的关键步骤之一。特别令人关注的一类亲和试剂为能够与免疫球蛋白分子的恒定部分特异性结合的蛋白质，这类相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。这类试剂可广泛用于从不同样品中用亲和色谱法回收免疫球蛋白，所述样品例如但不限于血清或血浆制品或来源于细胞培养物的原料。所述蛋白质的一个实例为葡萄球菌蛋白A，其含有能够与来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分结合的结构域。
因其高亲和力和选择性所致，基于葡萄球菌蛋白A (SpA)的试剂已在生物技术领域发现了广泛的用途，例如在用于捕获和纯化抗体以及检测的亲和色谱法中发现了广泛的用途。目前，基于SpA的亲和介质可能是用于从不同样品中分离单克隆抗体及其片段的最广泛使用的亲和介质，所述样品包括来自细胞培养物的工业原料。因此，各种包含蛋白A配体的基质可市购获得，例如以天然蛋白A的形式(例如Protein A SEPHAROSETM, GEHealthcare, Uppsala, Sweden)，还包括重组蛋白A (例如rProtein A SEPHAROSETM, GEHealthcare)。更具体地说，在商业重组蛋白A产品中进行的基因操作目的在于利于其附着至支持物。
这些应用，与其他亲和色谱法应用相似，需要广泛关注污染物的明确去除。这类污染物可例如为色谱程序中吸附至固定相或基质的非洗脱分子，例如非所需的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。通常在所需产品的第一次洗脱之后从基质中去除这类污染物，以便于在后续使用之前使基质再生。这类去除通常包括称为原位清洗(cleaning-in-place，CIP)的程序，其中使用能够从固定相上洗脱污染物的试剂。常常使用的一类所述试剂为流过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洗和清洁剂为NaOH，其浓度范围可为0.1 M直至例如1 M，这取决于污染的程度和性质。此策略涉及将基质暴露于超过13的pH值。对于含有蛋白质性质的亲和配体的许多亲和色谱基质而言，这类碱性环境为非常苛刻的条件并因此由于配体对有关高pH的不稳定性而导致能力下降。
因此，广泛的研究已集中在工程改造蛋白质配体的开发上，所述蛋白质配体显示出耐受碱性pH值的能力提高。例如，Gülich等(Journal of Biotechnology 80 (2000),169-178)提出改进链球菌白蛋白结合域(ABD)在碱性环境中的稳定性的蛋白质工程。Gülich等创建了ABD的突变体，其中所有的4个天冬酰胺残基被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)取代。另外，Gülich等报道，其突变体显示出与天然蛋白的靶蛋白结合性能相似的靶蛋白结合性能，并且与使用亲本未工程改造的配体制备的柱相比，含有工程改造的配体的亲和柱在重复暴露给碱性条件之后显示更高的结合能力。因此，从中推断可在对结构和功能无任何显著影响的情况下取代所有的4个天冬酰胺残基。
近期研究表明亦可对蛋白A (SpA)作出改变来产生类似特性。美国专利申请2005/0143566公开了将至少一个天冬酰胺残基突变成除谷氨酰胺或天冬氨酸之外的氨基酸时，与亲本SpA (例如SpA的B结构域)或蛋白Z (来源于SpA的B结构域的合成构建体(US 5,143,844))相比，所述突变赋予了在高达约13-14的pH值下增加的化学稳定性。作者显示当这些突变的蛋白质用作亲和配体时，正如预期的分离介质可更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序。美国专利申请2006/0194955显示突变的配体可更好地耐受蛋白酶从而减少分离过程中的配体漏失。另一个申请美国专利申请2006/0194950显示可进一步修饰碱稳定的SpA结构域以使配体缺失对Fab的亲和力但保留Fc亲和力，例如通过G29A突变。
过去将含有5个IgG结合域的天然蛋白A用于生产所有的蛋白A亲和介质。利用重组技术已产生均含有4或5个IgG结合域的许多蛋白A构建体。近期研究表明，与四聚体配体相比，二聚体配体具有类似或增加的结合能力(WO 2010/080065)。
众所周知，某些抗体在低pH下易于聚集或为敏感的(例如它们可失去活性)。在本领域仍有需要获得包含对抗体或相关靶标具有增加的洗脱pH的蛋白质配体的分离基质。
发明简述
本发明的一个目标为提供包含蛋白质配体的亲和分离基质，所述配体能够结合诸如IgG、IgA和/或IgM等免疫球蛋白，优选经由其Fc片段结合。在蛋白A (E、D、A、B、C)或蛋白Z的至少一个单体结构域中，这些配体带有对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z的N28的位置上的天冬酰胺的取代，因此与没有所述取代的配体相比具有更高的洗脱pH。优选配体为多聚体，即含有多于一个选自蛋白A (E、D、A、B、C)和蛋白Z的单体结构域。
本发明的另一个目标为提供利用本发明的亲和基质分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法。通过使用具有所述取代的亲和配体，所述方法出乎意料地获得针对靶分子增加的洗脱pH。
因此，本发明提供用于产生纯化的产物(例如纯的免疫球蛋白流分或已从中去除免疫球蛋白的液体)或者用于检测样品中免疫球蛋白的存在情况的方法。依照本发明的配体显示出增加的洗脱pH，这使配体成为成本有效的大规模操作的有吸引力的候选。
可如随附权利要求所述达到一个或多个上文确定的目标。
附图简述
图1显示蛋白Z的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)，第28位的天冬酰胺用粗体显示。亦显示了丙氨酸取代。
图2显示来自蛋白A的5个结构域各自的氨基酸序列的比对，对应于蛋白A的B结构域的N28的位置上的天冬酰胺用粗体显示。亦显示了三个α螺旋的位置(Graille等，PNAS2000, 97 (10): 5399-5404；Deisenhofer, Biochemistry 1981, 20 (9): 2361-2370)。
图3显示用于实验研究的二聚体配体的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)，所述二聚体配体具有蛋白Z的两个拷贝，每个拷贝均具有N28A取代。
发明详述
定义
术语“蛋白质”在本文用于描述蛋白质及其片段。因此，术语“蛋白质”包括显示三维结构的任何氨基酸链，并且相应地包括蛋白质片段。
术语蛋白质的“功能性变体”在本文意指变体蛋白质，其中与本发明定义为亲和力和稳定性相关的功能基本保留。因此与所述功能不相关的一个或多个氨基酸可能已替换。
术语“亲本分子”在本文用于依照本发明的突变引入前的形式的相应蛋白质。
术语“结构稳定性”是指分子的三维形式的完整性，而“化学稳定性”是指耐受化学降解的能力。
术语“Fc片段结合”蛋白意指所述蛋白质能够与免疫球蛋白的Fc片段结合。然而，并不排除Fc片段结合蛋白亦可结合其他区域，例如免疫球蛋白的Fab区。
在本说明书中，如果没有通过其全称提及，那么用常规的单字母或三字母符号表示氨基酸。
突变在本文中通过替换的位置的编号来定义，野生型或非突变的氨基酸在前，突变的氨基酸在后。因此，例如在第23位上天冬酰胺突变成苏氨酸表示为N23T。
本发明一方面涉及从液体中分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法，所述方法包括(a)使液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触；(b)通过与配体相互作用使含有免疫球蛋白的蛋白质吸附到基质上；(c)清洗被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白质的任选步骤；和(d)通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触来回收含有免疫球蛋白的蛋白质。所述方法通过使用配体提供针对免疫球蛋白分子增加的洗脱pH，每个配体包含葡萄球菌蛋白A (SpA) (E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体的一个或多个结构域(即单体)，其中对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z的N28的位置上的天冬酰胺被取代为任何其他氨基酸。
免疫球蛋白结合蛋白(即配体)可以是具有天然的免疫球蛋白结合能力的任何蛋白质，例如葡萄球菌蛋白A (SpA)或链球菌蛋白G (SpG)，或含有这些蛋白质的IgG结合域的重组蛋白质。其他这类蛋白质的综述参见例如Kronvall, G., Jonsson, K. Receptins: anovel term for an expanding spectrum of natural and engineered microbialproteins with binding properties for mammalian proteins(用于对哺乳动物蛋白质具有结合特性的天然和工程改造的微生物蛋白的扩展谱的新术语), J. Mol. Recognit.1999 Jan-Feb; 12(1):38-44。配体可包含一个或多个SpA的E、D、A、B和C结构域。更优选配体包含蛋白A的结构域B、蛋白A的结构域C或工程改造的蛋白Z。
每一个蛋白Z或蛋白A结构域包含对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上的天冬酰胺(参见例如图1、图2和SEQ ID NO: 1-8)。
如图2所示，蛋白A的5个结构域之间的序列高度相关。没有缺失或插入，且许多取代是对蛋白质的结构或功能具有最小可能变化的保守改变。例如，在全部58个氨基酸的多肽内，B结构域和C结构域之间只有4个改变。因此，在每个这些结构域中对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上的天冬酰胺具有与蛋白A或含有所述结构域的配体相似的结构/功能贡献。类似地，天冬酰胺的取代对含有所述改变的配体的结构/功能产生类似影响。
在某些实施方案中，天冬酰胺被取代为增加洗脱pH同时保持对IgG的结合能力的氨基酸。优选天冬酰胺被取代为诸如Glu、Leu、Gln、Trp、Lys、Asp或Arg等氨基酸。更优选取代成丙氨酸。
在某些优选的实施方案中，亲本分子序列包含通过SEQ ID NO: 1-2、4-8定义的序列或其任何功能性变体。
在某些实施方案中，在多聚体配体的至少一个单体结构域中，对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上的天冬酰胺被取代。在其他实施方案中，多聚体配体的所有单体结构域中的天冬酰胺残基被取代。
对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上天冬酰胺残基的取代，意外地增加诸如IgG、IgA和/或IgM等免疫球蛋白或者含Fc片段的融合蛋白的洗脱pH。优选洗脱pH增加达0.2-超过1.0 pH。更优选洗脱pH增加至少0.3 pH，最优选洗脱pH增加至少0.4 pH。或者，洗脱pH增至>4.0，优选pH >4.2，同时回收率为亲本配体回收率的至少80%或甚至>90%。
在一个实施方案中，配体亦呈现为碱稳定的，例如通过将SpA结构域B或蛋白Z的至少一个单体结构域的至少另一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸来实现。如早期所讨论，US专利申请US 2005/0143566公开了当至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，所述突变赋予配体在高pH下增加的化学稳定性(例如，N23T)。此外，包含这些配体的亲和介质可更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序。美国专利申请2006/0194955显示突变的配体亦可更好地耐受蛋白酶，从而减少分离过程中的配体漏失。因此，这些申请的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
在另一个实施方案中，这样制备的配体对抗体的Fab部分缺少任何显著的亲和力，而具有对Fc部分的亲和力。因此，在某些实施方案中，配体的至少一个甘氨酸被取代为丙氨酸。美国专利申请2006/0194950显示碱稳定的结构域可进一步修饰以使配体缺少对Fab的亲和力而保留Fc亲和力，例如通过G29A突变来实现。所述申请的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。本文所用的氨基酸编号为本领域常规使用的，以蛋白A的结构域B上的位置为例，且本领域技术人员可容易地识别对于各E、D、A、B、C结构域的待突变的位置。
在一个有利的实施方案中，配体由结构域B的多聚体拷贝构成，以及通过将至少另一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸(例如N23T)来获得结构域B的碱稳定性；并且含有在碱稳定的结构域B的第29位上的氨基酸残基的突变，例如G29A突变。
在一个有利的实施方案中，配体由具有在N28的精氨酸残基突变的结构域C或其功能性变体的多聚体拷贝构成。任选所述配体亦含有在第29位上的氨基酸残基的突变，例如G29A突变。
在另一个实施方案中，配体由蛋白Z的多聚体拷贝构成，其中通过将至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸来获得碱稳定性。在一个有利的实施方案中，通过将至少第23位上的天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸来获得碱稳定性。
如本领域技术人员会容易理解的，可利用常规分子生物学技术以任何次序进行第28位上天冬酰胺的取代、提供碱稳定性的突变以及G到A的突变。此外，可通过含有编码突变蛋白质配体的核酸序列的载体来表达配体。或者，它们亦可通过蛋白质合成技术来制备。用于合成预定序列的肽和蛋白质的方法为本领域所熟知且通常可用。
因此，在本发明中，术语“葡萄球菌蛋白A的碱稳定结构域B”意指基于SpA的结构域B的碱稳定蛋白质，例如在美国专利申请US 2005/0143566和美国专利申请2006/0194950中描述的突变蛋白质；以及其他来源但具有功能上等同的氨基酸序列的其他碱稳定蛋白质。
如技术人员会理解的，在固定到支持物上之前应将表达的蛋白质纯化到适当程度。这类纯化方法为本领域所熟知，且使用标准方法可容易地将基于蛋白质的配体固定到支持物上。合适的方法和支持物将在下文更详细地论述。
因此，在一个实施方案中，依照本发明的突变蛋白质包含至少约75% (例如至少约80%或优选至少约95%)的如SEQ ID NO: 1或2所定义的序列，前提是在第21位没有天冬酰胺突变。
在本说明书中，SEQ ID NO: 1定义SpA的B结构域的氨基酸序列：
SEQ ID NO: 2定义称为蛋白Z的蛋白质：
蛋白Z为来源于SpA的B结构域的合成构建体，其中第29位的甘氨酸被替换为丙氨酸，参见例如The Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation,Biocatalysis and Bioseparation(生物过程技术百科全书：发酵、生物催化和生物分离)，M.C. Fleckinger和S.W. Drew编辑，John Wiley和Sons Inc., New York, 8-22中的Ståhl等, 1999: Affinity fusions in biotechnology: focus on protein A and protein G(生物技术中的亲和融合：聚焦蛋白A和蛋白G)。
在一个实施方案中，上述突变蛋白质包含SEQ ID NO: 1-2或4-8定义的氨基酸序列，或为其具有在对应于蛋白A的B结构域的N28位置上天冬酰胺的取代的功能性变体。本文段所用术语“功能性变体”包括任何类似的序列，其包含氨基酸位置上的一个或多个进一步变异，所述变异不影响突变蛋白质对免疫球蛋白的亲和力，或不影响其在增加的pH值环境中所改进的化学稳定性。
在一个有利的实施方案中，本发明的天冬酰胺的取代选自以下氨基酸：例如Glu、Leu、Gln、Trp、Lys、Asp和Arg；且其中亲本分子包含由SEQ ID NO: 1-2和4-8定义的序列，或其任何功能性变体。更优选取代成丙氨酸。如上所述，为了获得用作在碱性条件下具有长时间的高结合能力的配体的突变蛋白质，避免第21位上的天冬酰胺残基的突变。在一个实施方案中，第3位上的天冬酰胺残基未突变。
在对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上天冬酰胺残基的取代，意外地增加诸如IgG、IgA和/或IgM等免疫球蛋白或含Fc片段的融合蛋白的洗脱pH。优选洗脱pH增加达0.2-超过1.0 pH。更优选洗脱pH增加至少0.3 pH，最优选洗脱pH增加至少0.4 pH。或者，洗脱pH增至>4.0，优选pH >4.2，同时回收率为亲本配体回收率的至少80%或甚至>90%。
在某些实施方案中，在多聚体配体的至少一个单体中的天冬酰胺残基被取代。在其他实施方案中，在多聚体配体的所有单体中的天冬酰胺残基被取代。
在一个有利的实施方案中，位于亮氨酸残基和谷氨酰胺残基之间的天冬酰胺残基亦突变为例如苏氨酸残基。因此，在一个实施方案中，SEQ ID NO: 2定义的序列的第23位上的天冬酰胺残基突变为例如苏氨酸残基。在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO: 2定义的序列的第43位上的天冬酰胺残基亦突变为例如谷氨酸。在其中第43位氨基酸已突变的实施方案中，似乎最有利的是与至少另一个突变例如N23T组合。
因此，本发明包括以上论述的单体突变蛋白质。然而，这类蛋白质单体可组合成多聚体配体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等。因此，本发明的另一个方面为包含依照本发明的至少一个突变蛋白质连同一个或多个其他单元(优选亦为依照本发明的突变蛋白质)的多聚体。因此，本发明为例如包含两个重复单元的二聚体，或包含四个重复单元的四聚体。
在某些实施方案中，多聚体配体包含来自蛋白A的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z或任何功能性变体的相同单体结构域的两个或更多个拷贝。
在其他实施方案中，多聚体配体包含选自蛋白A的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z或任何功能性变体的两个或更多个不同的单体结构域。
在一个实施方案中，依照本发明的多聚体包含通过氨基酸段(优选范围为0-15个氨基酸，例如0-10或5-10个氨基酸)连接的单体单元。这类连接物的性质应优选不会使蛋白质单元的空间构像不稳定。此外，所述连接物还应优选为在碱性环境中足够稳定而不会削弱突变的蛋白质单元的性质。
在另一个实施方案中，本发明的二聚体配体包含SEQ ID NO: 3的序列：
本发明出乎意料地发现当比较配体的洗脱pH时，与未取代的配体相比，在配体的至少一个单体结构域中对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上天冬酰胺的取代提供更高的洗脱pH。
在一个实施方案中，本发明涉及用于亲和分离的基质，该基质包含含有与固体支持物偶联的免疫球蛋白结合蛋白的配体。优选在蛋白A (结构域E、D、A、B、C)或蛋白Z的至少一个单体结构域中，将对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上的天冬酰胺取代为另一种氨基酸。优选配体为多聚体，即含有多于一个选自蛋白A (结构域E、D、A、B、C)和蛋白Z的单体结构域。与没有取代的基质相比时，本发明的基质显示出增加的洗脱pH。突变的蛋白配体优选为Fc片段结合蛋白，并且可用于选择性结合IgG、IgA和/或IgM，优选IgG。
依照本发明的基质可包含在其任何实施方案中如上所述的突变蛋白作为配体。在最优选的实施方案中，存在于固体支持物上的配体包含如上所述的取代。
依照本发明的基质的固体支持物可以是任何合适的熟知种类。常规的亲和分离基质常常为有机性质的，且基于以下聚合物，其使亲水表面暴露给所用水性介质，即，使羟基(-OH)、羧基(-COOH)、酰胺基(-CONH2，可能以N-取代形式)、氨基(-NH2，可能以取代形式)、寡或聚乙烯氧基暴露于其外表面，以及如果存在，亦暴露于内表面。在一个实施方案中，聚合物可例如基于多糖，例如葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰、琼脂、琼脂糖等，其有利地与例如双环氧化物(bisepoxides)、环氧卤丙烷(epihalohydrins)、1,2,3-三卤代低级烃交联，以产生合适的孔隙率和刚性。在最优选的实施方案中，固体支持物为可交联的多孔琼脂糖珠粒。本发明所用支持物可依照标准方法容易地制备，所述方法例如反相悬浮凝胶法(S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964))。或者，基础基质为可市购获得的产品，例如SEPHAROSETM FF (GE Healthcare)。在一个特别有利于大规模分离的实施方案中，调整支持物以增加其刚性，从而致使基质更适应于高流速。
或者，固体支持物基于合成聚合物，例如聚乙烯醇、聚丙烯酸羟烷基酯、聚异丁烯酸羟烷基酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水聚合物，例如基于二乙烯基和单乙烯基取代苯的基质的情况中，常常将基质的表面亲水化以将如上所限定的亲水基团暴露给周围的水性液体。依照标准方法容易地制备这类聚合物，所述方法参见例如“Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization(通过悬浮聚合开发的基于苯乙烯的聚合支持物)”(R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988))。或者，使用可市购获得的产品，例如 SOURCETM (GE Healthcare)。
在另一个备选方案中，依照本发明的固体支持物包括无机性质的支持物，例如二氧化硅、氧化锆等。
在又一个实施方案中，固体支持物为另一种形式，例如表面、芯片、毛细管或滤器。
关于依照本发明的基质的形状，在一个实施方案中所述基质呈多孔整料的形式。在一个备选的实施方案中，所述基质呈可以是多孔或无孔的珠粒或颗粒形式。呈珠粒或颗粒形式的基质可用作填充床或呈悬浮形式。悬浮形式包括称为膨胀床和纯悬浮液的那些形式，其中颗粒或珠粒可自由移动。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离程序通常按照具有浓度梯度的常规色谱法进行。在纯悬浮液的情况下，使用分批模式。
可经由常规偶联技术利用例如存在于配体中的氨基和/或羧基使配体与支持物连接。双环氧化物、环氧氯丙烷、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等为熟知的偶联试剂。在支持物和配体之间，可引入称为间隔物的分子，其改进配体的可用性并利于将配体与支持物化学偶联。或者，配体可通过非共价键合与支持物连接，例如通过物理吸附或生物特异性吸附。基质的配体含量可为例如5-15 mg/ml基质，以及可有利地为5-10 mg/ml。
在一个有利的实施方案中，本发明的配体通过硫醚键与支持物偶联。用于进行这类偶联的方法为本领域所熟知，且本领域技术人员利用标准技术和设备可容易地实施所述方法。在一个有利的实施方案中，首先向配体提供末端半胱氨酸残基以随后在偶联中使用。本领域技术人员亦可容易地进行适当的纯化步骤。
在本发明的某些实施方案中，吸附步骤的条件可以是任何常规使用的条件，其根据靶抗体的特性(例如其pI)适当调整。可使用诸如PBS缓冲液等常用缓冲液进行任选的洗涤步骤。
可通过使用用于从蛋白A介质中洗脱的任何合适的溶液进行洗脱。
本发明的方法可用于捕获靶抗体，例如用于例如治疗或诊断用途的抗体的纯化方案的第一步。在一个实施方案中，回收至少75%的抗体。在一个有利的实施方案中，使用具有针对具体配体系统的合适pH的洗脱液回收至少80%，例如至少90%，且优选至少95%的抗体。本发明的方法之后可进行一个或多个附加步骤，例如其他色谱步骤。因此，在一个具体的实施方案中，回收多于约98%的抗体。
如早期所论述，对于SpA (结构域E、D、A、B、C)或蛋白Z配体，当至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，包含这些突变配体的亲和介质可更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序(美国专利申请2005/0143566)。增加的稳定性意指突变蛋白质对免疫球蛋白的起始亲和力基本上在长时间内保留。因此其结合能力在碱性环境中比亲本分子降低得更慢。环境可定义为碱性的，意指增加的pH值，例如超过约10，例如直达约13或14，即10-13或10-14，一般表示为碱性条件。或者，条件可通过NaOH的浓度来定义，其可直达约1.0 M，例如0.7 M或特别是约0.5 M，相应地在0.7-1.0 M的范围内。
因此，在所讨论的天冬酰胺突变存在下对免疫球蛋白的亲和力(即配体的结合特性)，和由此基质的能力在用碱性试剂处理时基本上未改变。常规而言，对于亲和分离基质的原位清洗处理，所用的碱性试剂为NaOH且其浓度直达0.75 M，例如0.5 M。因此，在用0.5M NaOH处理7.5小时后其结合能力将降至低于约70%，优选低于约50%，且更优选低于约30%，例如约28%。
在另一个方面，本发明涉及分离诸如IgG、IgA和/或IgM等免疫球蛋白的方法，其中使用依照本发明的配体或基质。因此，本发明包括色谱法过程，其中通过吸附到上述的配体或基质来从液体中分离至少一种靶化合物。所需产物可以是分离的化合物或液体。因此，本发明的这方面涉及亲和色谱法，其为广泛使用且熟知的分离技术。简而言之，在第一步中，在允许靶化合物吸附到存在于分离基质上的配体的条件下，使含有靶化合物(优选为如上所述的抗体)的溶液流过所述基质。这类条件通过例如pH和/或盐浓度(即溶液中的离子强度)控制。应注意不要超出基质的能力，即流速应慢至足以允许符合要求的吸附。在此步骤中，溶液的其他组分将基本上无阻通过。任选随后例如用水溶液洗涤基质，以便于去除保留的和/或松散结合的物质。最有利的是将本发明的基质与利用诸如溶剂、盐或清洁剂或其混合物等添加剂的中间洗涤步骤一起使用。
在下一步中，在提供解吸作用(即释放靶化合物)的条件下，使称为洗脱液的第二溶液流过基质。通常通过改变pH、盐浓度即离子强度、疏水性等来提供这类条件。已知多种洗脱方案，例如梯度洗脱和分步洗脱。亦可通过包含竞争物质的第二溶液来提供洗脱，所述竞争物质将替换基质上所需的抗体。基于天然或重组蛋白A的常规蛋白A介质(例如MABSELECTTM和nProtein A SEPHAROSETM 4 Fast Flow)通常在pH 3.1-4.0 (在峰顶点处测定)下洗脱，这主要取决于其VH3结合(参见例如Ghose, S.等Biotechnology andBioengineering 92 665-673 [2005])。来源于蛋白A的B结构域的碱稳定的产品MABSELECTSURETM，基本上缺失VH3结合而得到更高的洗脱pH：3.7-4.0。关于亲和色谱法原理的一般性综述，参见例如Wilchek, M.和Chaiken, I. 2000. An overview of affinitychromatography(亲和色谱法综述). Methods Mol. Biol.147: 1-6。
在对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上天冬酰胺残基的取代，意外地增加免疫球蛋白或含Fc片段的融合蛋白的洗脱pH。因此所述取代提供这样的配体，其允许在超过pH 4.0优选超过4.2下洗脱，同时回收率为亲本配体回收率的至少80%或甚至>90%。这导致更温和的洗脱条件，其使靶蛋白聚集或失活的风险降至最低。
自单体中分离聚集物已成为特别是在较高分辨率下的抗体纯化中的挑战。本发明的配体提供在单体和聚集物之间的改进的分离，从而提供用于即使在大规模下的捕获步骤中去除聚集物的可行方法。
实施例
下面通过实施例的方式描述本发明，提供所述实施例仅用于说明性目的，因此不应解释为限制如通过附随权利要求所定义的本发明的范围。下文和本申请别处给出的所有参考文献在此通过引用包括于本文中。
蛋白质的诱变
使用编码天冬酰胺取代物的寡核苷酸通过两步PCR进行定点诱变。使用含有Z或C单结构域的质粒作为模板。将PCR片段连接到大肠杆菌(E. coli)表达载体(pGO)中。使用DNA测序来验证插入片段的正确序列。
为了形成Z(N28A)的多聚体，使用位于C或Z结构域的起始密码子(GTA GAC)中的Acc I位点，对应于氨基酸VD。将pGO Z(N28A)1用Acc I消化并用CIP处理。设计特异针对各变体的Acc I粘性末端引物，且从各模板上产生两个重叠的PCR产物。将PCR产物纯化并通过在2%琼脂糖凝胶上比较PCR产物来估计浓度。使等量的成对PCR产物在连接缓冲液中杂交(45分钟内90℃->25℃)。所得产物含有大约1/4的可能连接到Acc I位点的片段(正确的PCR片段和/或经消化的载体)。连接和转化后，克隆经PCR筛选以鉴定含有Z(N28A)2的构建体。通过DNA测序验证阳性克隆。
构建体表达与纯化
通过大肠杆菌K12在标准培养基中的发酵使构建体在细菌周质中表达。发酵后，将细胞热处理以使周质内含物释放到培养基中。通过使用具有0.2 µm孔径的膜进行微滤来回收释放到培养基中的构建体。
将各构建体(此刻在来自过滤步骤的渗透物中)通过亲和力进行纯化。将渗透物上样到含有固定的IgG的色谱介质上。用磷酸缓冲盐水洗涤上样的产物并通过降低pH进行洗脱。
将洗脱合并液(elution pool)调至中性pH并通过加入二硫苏糖醇进行还原。然后将样品上样到阴离子交换柱上。在洗涤步骤之后，用NaCl梯度洗脱构建体以使其从任何污染物中分离。通过超滤将洗脱合并液浓缩至40-50 mg/ml。
用LC-MS分析纯化的配体以确定纯度和确定分子量与预期(基于氨基酸序列)相符合。
活化
所用基础基质为刚性交联的85微米平均直径的琼脂糖珠粒，其依照US6602990的方法制备且孔大小相当于用于Mw 110 kDa葡聚糖的0.7的反相凝胶过滤色谱Kav值(依照在Gel Filtration Principles and Methods(凝胶过滤原理和方法), Pharmacia LKBBiotechnology 1991,第6-13页中描述的方法)。
将25 mL (g)排干的基础基质、10.0 mL蒸馏水和2.02 g NaOH在100 mL烧瓶中混合，于25℃机械搅拌10分钟。加入4.0 mL环氧氯丙烷并使反应进行2小时。用10倍凝胶沉降体积(GV)的水洗涤活化的凝胶。
偶联
在50 ml 的Falcon管中，向20 mL配体溶液(50 mg/mL)中加入169 mg NaHCO3、21mg Na2CO3、175 mg NaCl和7 mg EDTA。将Falcon管置于滚子台(roller table)中5-10分钟，然后加入77 mg的DTE。还原进行>45分钟。然后将配体溶液在填充有Sephadex G-25的PD10柱上脱盐。通过测定276 nm处UV吸收来确定已脱盐溶液中的配体含量。
用3-5 GV的0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA pH 8.6洗涤活化的凝胶，然后依照US6399750中所述方法偶联配体。实验中使用的所有缓冲液已用氮气除气至少5-10分钟。
固定化之后，用3xGV的蒸馏水洗涤凝胶。将凝胶+1 GV的0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA/10%硫代甘油pH 8.6混合并将管置于摇床中于室温下过夜。然后用3xGV的0.1 M TRIS/0.15M NaCl pH 8.6和0.5 M的HAc交替洗涤凝胶并随后用8-10xGV的蒸馏水洗涤。将凝胶样品送至外部实验室进行氨基酸分析，且从总氨基酸含量中计算配体含量(mg/ml凝胶)。
实施例1
原型
突变体Z(N28A)2 (SEQ ID NO: 3)：含有蛋白Z的两个拷贝的配体二聚体，所述拷贝各自包含N28A取代(Z(N28A)2)，配体密度为6.6 mg/ml。
Z2 (类似于SEQ ID NO: 3，预期N28未取代为A)：含有蛋白Z的两个拷贝的配体二聚体(Z2)，配体密度为5.9 mg/ml。
2 ml填充到TRICORNTM 5 100柱中的树脂。
蛋白质
Gammanorm (Octapharma) 165 mg/ml，用平衡缓冲液稀释至1 mg/ml。
平衡缓冲液
APB磷酸盐缓冲液20 mM+0.15 M NaCl，pH 7.4 (Elsichrom AB)。
吸附缓冲液
APB磷酸盐缓冲液20 mM+0.15 M NaCl，pH 7.4 (Elsichrom AB)。
洗脱缓冲液
柠檬酸盐缓冲液0.1 M, pH 6。
柠檬酸盐缓冲液0.1 M, pH 3。
CIP
0.1 M NaOH。
实验详述和结果：
用ÄKTAExplorer 10系统在2.4分钟的保留时间确定临界点能力(breakthroughcapacity)。使平衡缓冲液流过旁通柱直到获得稳定的基线。在自动零位调整之前进行此操作。将样品施加到柱上直到获得100%UV信号。然后再次施加平衡缓冲液直到获得稳定的基线。
将样品上样到柱上直到达到85%最大吸光度的UV信号。然后用平衡缓冲液以0.5ml/min的流速洗涤柱直到达到20%最大吸光度的UV信号。用始于pH 6.0且止于pH 3.0的在10倍柱体积内的线性梯度以0.5 ml/min的流速洗脱蛋白质。然后用0.1 M NaOH以0.5 ml/min的流速清洗柱，且在用20%乙醇清洗之前用平衡缓冲液重新平衡。最后一步是通过上样穿过旁通柱直到获得100%UV信号来核查样品浓度。
为了计算在10%的临界点能力，使用以下方程式。其即为上样到柱上直到柱流出液中IgG的浓度为进料的IgG浓度的10%时IgG的量。
A100% = 100% UV信号；
Asub = 来自非结合IgG亚类的吸光度贡献；
A(V) = 给定施用体积下的吸光度；
Vc = 柱体积；
Vapp = 直到10%临界点的施用体积；
Vsys = 系统死体积；
C0 = 进料浓度。
计算了在10%临界点的动态结合能力(DBC)并研究了曲线的表观。亦关于结合、洗脱和CIP峰研究了曲线。对于5、10和80%临界点计算了动态结合能力(DBC)。某些结果在表1中显示。与亲本N28配体(Z2)相比，对于具有N28A取代的配体观察到类似的能力。
对于多克隆人IgG的IgG能力和洗脱研究在Z(N28A)2和Z2上进行。Z(N28A)2和Z2之间的能力值没有差别。某些实施例在表1中显示。
表1. Z(N28A)2和Z2的能力数据，其使用溶于20mM PBS+0,15M NaCl缓冲液，pH7.4的1mg/ml IgG。
在磷酸盐缓冲液中进行对多克隆人IgG的洗脱研究。与Z2相比，Z(N28A)2的洗脱pH显著增加。使用0.1 M柠檬酸盐缓冲液进行pH 6-pH 3的梯度洗脱。记录了峰顶点处的pH(参见表2)。
表2. 多克隆人IgG的洗脱pH。
注意：pH hIgG (第一个峰)和pH hIgG (第二个峰)为多克隆IgG (Gammanorm)。
除突变体配体更高的洗脱pH之外，它们似乎亦比Z2具有更好的分离特性。尽管在两个原型配体上均存在拖尾，但使用突变体配体时两个峰存在实际分离。
以上实施例阐明本发明的具体方面，以及不意图限制其在任何方面的范围并且不应这样解释。得益于上述本发明教导的本领域技术人员，可对其进行众多修改。将这些修改解释为包括在如随附权利要求所述的本发明的范围内。

Claims (27)

1.一种从液体中分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法，所述方法包括
(a)使液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触；
(b)通过与所述配体相互作用使所述含有免疫球蛋白的蛋白质吸附到基质上；
(c)清洗吸附了含有免疫球蛋白的蛋白质的基质的任选步骤；
(d)通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触来回收所述含有免疫球蛋白的蛋白质；
改进在于每个所述配体包含葡萄球菌蛋白A (SpA)或蛋白Z的一个或多个结构域，即单体，其中在至少一个单体中，对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z的N28的位置上的天冬酰胺被取代为丙氨酸，以及其中所述配体与未取代的配体相比提供洗脱pH的增加。
2.权利要求1的方法，其中所述蛋白A或蛋白Z的一个或多个结构域为来自相同的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的两个或更多个拷贝。
3.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白A或蛋白Z的一个或多个结构域为选自结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的两个或更多个结构域。
4.权利要求1的方法，其中所述蛋白A或蛋白Z的一个或多个结构域选自结构域B、结构域C或蛋白Z。
5.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中所述配体是多聚体配体，在所述多聚体配体的所有单体中，对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上的天冬酰胺被取代为丙氨酸。
6.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上的天冬酰胺被取代为增加洗脱pH的另一种氨基酸。
7.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中所述配体与未取代的配体相比提供洗脱pH的增加达至少0.2。
8.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中所述配体与未取代的配体相比提供洗脱pH的增加达至少0.4。
9.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中所述配体提供洗脱pH增加到至少4.0，同时靶标回收率为亲本配体回收率的至少80%。
10.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中所述配体提供洗脱pH增加到至少4.0，同时靶标回收率为亲本配体回收率的>90%。
11.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中所述配体具有对免疫球蛋白的Fc部分的亲和力，但缺失对免疫球蛋白的Fab部分的亲和力。
12.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中将对应于蛋白A的B结构域的第29位上的甘氨酸残基替换为丙氨酸。
13.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中通过将至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸来使所述配体碱稳定。
14.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中所述配体为蛋白Z，其中通过将至少另一个的天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸来获得碱稳定性。
15.权利要求14的方法，其中通过将至少第23位上的天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸来获得蛋白Z的碱稳定性。
16.权利要求1、2、4和15中任一项的方法，其中所述配体是多聚体配体，所述多聚体配体为二聚体。
17.权利要求1、2、4和15中任一项的方法，其中所述配体是多聚体配体，所述多聚体配体为四聚体。
18.权利要求1、2、4和15中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为单克隆抗体。
19.权利要求1、2、4和15中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为多克隆抗体。
20.权利要求1、2、4和15中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为含有与另一种蛋白质融合的免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白。
21.权利要求1、2、4和15中任一项的方法，其中进行pH梯度洗脱，所述pH梯度洗脱导致靶标的聚集物和单体物质的有效分离。
22.权利要求1、2、4和15中任一项的方法，其中所述配体提供洗脱pH增加到至少4.2，同时靶分子的收率为亲本配体收率的至少80%。
23.权利要求1、2、4和15中任一项的方法，其中所述配体提供洗脱pH增加到至少4.2，同时靶分子的收率为亲本配体收率的>95%。
24.一种包含葡萄球菌蛋白A (SpA)或蛋白Z的一个或多个结构域即单体的用于分离免疫球蛋白的配体，其中在至少一个单体中，对应于蛋白A的B结构域或蛋白Z N28的位置上的天冬酰胺被取代为增加洗脱pH的丙氨酸。
25.一种用于免疫球蛋白的亲和分离的基质，所述基质包含与固体支持物偶联的依照权利要求24的配体。
26.权利要求25的基质，其中所述固体支持物为基于多糖的固体支持物。
27.权利要求25或26的基质，其中所述配体经由硫醚键偶联。
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