JP2012515160A - アフィニティークロマトグラフィーマトリックス - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3
Description
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys。
次の配列番号2はプロテインZとして知られるタンパク質を規定する。
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys。
AlaGlnGlyThrValAspAlaLysPheAspLysGluGln
GlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeu
ThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLys
AspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAla
LysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysCys。
AlaGlnGlyThrValAspAlaLysPheAspLysGluGln
GlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeu
ThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLys
AspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAla
LysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysValAspAla
LysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIle
LeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAla
PheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAla
AsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGln
AlaProLysCys。
この研究の目的は、アルカリ安定化プロテインAの単量体、二量体及び四量体、即ちSuReリガンドドメイン(以下、それぞれz1、z2及びz4と名付ける)を固定化したアガロース系媒体プロトタイプの性能を以下の方法で比較することであった。
−CHO細胞培養で発現された2種のモノクローナル抗体に対する動的結合容量の測定。
−各種のリガンドを用いて得られた溶出pHの比較。
−10%漏出点における動的結合容量の70%の試料ロード量での宿主細胞タンパク質のクリアランスの測定。
1.1 媒体プロトタイプ
MabSelect SuRe:Lot 312257(リガンド密度5.6mg/ml)。
HFA35 Z1:U1975095(リガンド密度1.64mg/ml)。
HFA35 Z2:U1975098(リガンド密度3.46mg/ml)。
PBS緩衝液、SIGMA社、P4417−100Tab。
NaOH、Merck社、1.06649.1000。
クエン酸三ナトリウム無水物、Merck社、1.06448.1000。
MAb1、宿主細胞清澄化供給液(HCCF)、1.1mg MAb/ml。
MAb2、宿主細胞清澄化供給液、1.8mg MAb/ml。
AKTA Explorer 100、AL E100。
AKTA Explorer 10、HH E10S。
分光光度計、UltroSpec 3000 pro。
2.1 前端分析
MAb(MAb1及びMAb2)を含む2種の宿主細胞清澄化供給液に関して前端分析を実施した。
1.5CVにわたりPBS緩衝液で平衡化を行う。
2.MAbの約80%漏出点まで供給液をロードする。
3.10CVにわたりPBS緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
4.60mMクエン酸塩(pH6.0)から60mMクエン酸塩(pH3.0)までの20CV勾配中で溶出する。
5.0.3ml/分の0.1M NaOHを用いて15分間CIPを行う。
6.PBSで再平衡化を行う。
式中、Vx%=x%漏出点での適用試料体積、Co=試料濃度(mg/ml)、Vc=幾何学的総容積(ml)、Vo=ボイド容積。
QB10%値の70%の最終ロード量まで試料を適用した。非結合物質を洗浄除去した後、60mMクエン酸塩(pH3.5)で溶出を行った。溶出画分をプールし、1/10容の0.2Mリン酸ナトリウム、1%BSA、0.5%Tween(pH8.0)で希釈した。次いで、Gyros法を用いて試料のHCP含有量を分析した。上澄み液の吸光度を280nmで測定した。ランベルト−ベールの法則(式2)を用いてMAb濃度を算出した。次いで、ng/ml単位のHCP濃度をmg/ml単位のMAb濃度で割ることでppm単位のHCP濃度を求めた。
式中、C=タンパク質濃度(mg/mL)、A=280nmでの吸光度、l=光路長(cm)=1、ε=吸光係数(mg・mL-1・cm-1)=1.7。
式中、Vpool=プールした画分の体積、Cpool=プール中のMAb濃度、Vin=カラム上にロードした試料の体積、C0=試料濃度(mg/ml)。
マニュアルに従った標準的方法により、SUPERDEX 200 5/150 GL上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出緩衝液はPBS(pH7.4)(SIGMA社)であり、試料体積は25μlであった。MAbの純度はクロマトグラムの積分によって求めた。
3.1 前端分析
3.1.1 MAb1
5%、10%及び80%漏出点に関して動的結合容量(DBC)を算出した。結果を表1aに示す。5%及び10%漏出点でのDBCはMabSelect SuRe(z4)及びz2に関しては同等であったが、z1に関する値は低かった。しかし、表1bに示される通り、z単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量(即ち、mg MAb/mgリガンドとして表した容量)が得られた(即ち、z1>z2>z4)。
2.4分の滞留時間で前端分析を実施し、5%、10%及び80%漏出点に関して動的結合容量(DBC)を算出した。結果を表2aに示す。MAb1と同じく、5%及び10%漏出点でのDBCはMabSelect SuRe(z4)及びz2に関しては同等であったが、z1に関しては低い値が得られた。上記の通り、z単位が少ないリガンドほど高い相対容量が得られた(即ち、z1>z2>z4)。QB10%/QB80%を比較すれば、z単位が少ないリガンドほど速い動力学が得られることがわかる(即ち、z4<z2<z1)。
QB10%値の70%の最終ロード量まで試料を適用し、溶出プールをHCP含有量について分析し、またSuperdex 5/150 GL上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。MAb1及びMAb2の精製に関して得られた結果を表3に示す。HCPのクリアランスはz1、z2及びz4に関してほぼ同等であった。しかし、HCPの相対低減率(即ち、Cstart material/Cpool)及び%収率はMAb2よりもMAb1について高かった。
z4及びz2に関しては最も高い動的結合容量が得られた。最も低いリガンド密度(1.64mg/ml)を有するz1に関しては、最も低い容量が得られた。しかし、z単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量(mg MAb/mgリガンド)が得られた。
この研究の目的は、アルカリ安定化プロテインAの様々なバージョン、即ちZドメインの単量体、二量体及び四量体(以下、それぞれZ1、Z2及びZ4と名付ける)を結合したアガロース系媒体プロトタイプの性能を以下の方法で比較することであった。
−「MAb3」に対する動的結合容量の測定。
−10%漏出点における動的結合容量の70%の試料ロード量での宿主細胞タンパク質のクリアランスの測定。
1.1 クロマトグラフィー媒体及びフィルター
HFA35 Z4:MabSelect SuRe batch 10007589(リガンド密度5.9mg/ml)。
HFA35 Z1:U1975095(リガンド密度1.64mg/ml)。
HFA35 Z2:U1975098(リガンド密度3.46mg/ml)。
Superdex 200 5/150 GL、GE Healthcare社、28−9065−63。
PBS緩衝液、SIGMA社、P4417−100Tab。
NaCl、MERCK社、1.06404.1000。
NaOH、MERCK社、1.06649.1000。
クエン酸、MERCK社、1.00244.0500。
アセトン、MERCK社、1.00014.2511。
原料デキストラン、GE Healthcare社(ロット番号なし)。
ELISA用試料の希釈のための保存溶液:0.2Mリン酸ナトリウム,1%BSA,0.5%Tween(pH8)。
宿主細胞清澄化供給液(HCCF)中のMAb3[VH3]、3mg/ml(吸光係数1.4)。
実施例1参照。
2.1 前端分析
MAb3に関して前端分析を実施した。次の6つのブロックからなる予めプログラムしたUnicorn法を使用した。
1.5CVにわたりPBS緩衝液で平衡化を行う。
2.MAbの>10%漏出点まで供給液をロードする。
3.10CVにわたり平衡化緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
4.6CVにわたり60mMクエン酸塩(pH3.5)で溶出する。
5.0.3ml/分の0.1M NaOHを用いて15分間CIPを行う。
6.平衡化緩衝液で再平衡化を行う。
本質的に実施例1に記載したようにして、295nmでのUV吸光度を用いて漏出量を測定した。式1に従って10%漏出点での動的結合容量を算出した。
QB10%値の70%の最終ロード量まで試料を適用した。非結合物質を洗浄除去した後、0.1Mクエン酸塩(pH3.3)で溶出を行った。溶出画分をプールし、1/10容の保存溶液で希釈した。次いで、2.3記載の分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって試料のHCP含有量及び凝集体含有量を分析した。上澄み液の吸光度を280nmで測定した。ランベルト−ベールの法則(式2)を用いてMAb濃度を算出した(ε=吸光係数(mg・mL-1・cm-1)=1.4)。次いで、ng/ml単位のHCP濃度をmg/ml単位のMAb濃度で割ることでppm単位のHCPを求めた。
実施例1参照。
3.1 前端分析
10%漏出点において、様々な滞留時間(1分、2.4分及び6分)での動的結合容量(DBC)を算出した。結果を表4及び図1に示す。最も高いDBCはZ4(即ち、MabSelect SuRe)に関して得られ、次いでZ2であった。最も低いDBCはZ1に関して得られた。しかし、表5に示される通り、z単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量(即ち、mg MAb/mgリガンド)が得られた(Z1>Z2>Z4)。この結果は、実施例1で得られた以前の結果に一致している。
2.4分の滞留時間において、10%漏出点でのDBCの70%の最終ロード量まで試料を適用し、溶出プールをHCP含有量について分析し、またSuperdex 200 5/150 GL上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。結果を表6に示す。HCPのクリアランス、収率並びに高分子量及び低分子量物質のレベルは、Z1、Z2及びZ4に関してほぼ同等であった。
Fc結合タンパク質は、2種のタンパク質を化合させることで製造される組換えDNA薬物(融合タンパク質)である。それはヒトの可溶性TNFαレセプターをヒト免疫グロブリンG1(IgG1)のFc成分に結合する。それは150kDaの分子量を有する大きい分子であり、TNFαに結合して、ヒト及び他の動物における過度の炎症を伴う疾患(強直性脊椎炎、若年性間接リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ及び潜在的には過剰のTNFαによって媒介されるその他各種の疾患のような自己免疫疾患を含む)でのそれの役割を減少させる。この治療学的ポテンシャルは、TNFαが多くの有機系において炎症応答の「マスターレギュレーター」であることに基づいている。
1.1 クロマトグラフィー媒体及びフィルター
HiTrap MabSelect SuRe、GE Healthcare社、ロット10021346。
プレフィルター:5μmポリプロピレンフィルター、Millipore社、AN5004700。
他の媒体に関しては、実施例2を参照されたい。
TRIS、MERCK社、1.08382.1000。
PBS緩衝液、SIGMA社、P4417−100Tab。
NaCl、MERCK社、1.06404.1000。
NaOH、MERCK社、1.06649.1000。
NaN3、MERCK社、K2806788。
HCl、MERCK社、1.09973.001。
酢酸、MERCK社、1.00063.2511。
アセトン、MERCK社、1.00014.2511。
原料デキストラン、GE Healthcare社(ロット番号なし)。
CHO細胞培養物上澄み液由来のFc融合タンパク質を含む供給液。この供給液は、0.48mg/mlのFc融合タンパク質1を含んでいた。
精製Fc融合タンパク質。
MAb3。
AKTA Explorer 100、AL E100。
AKTA Explorer 100、AL L100。
AKTA Explorer 10、LK−E 10XT。
2.1 試料の前処理
CHO細胞培養物上澄み液を5μmプレフィルターで濾過した。NaN3を0.05%(w/v)の最終濃度に添加した。試料を冷蔵庫内に約6℃で貯蔵した。
Fc融合タンパク質供給液に関して前端分析を実施した。次の6つのブロックからなる予めプログラムしたUnicorn法を使用した。
1.5CVにわたり25mM TRIS−HCl,0.15M NaCl(pH7.4)で平衡化を行う。
2.融合タンパク質の>10%漏出点まで供給液をロードする。(低供給液濃度(0.48mg T2/ml)のため、漏出量をUV信号でモニターできたことに注意されたい。1.3ml画分を集め、下記のようにして分析した。)
3.10CVにわたり平衡化緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
4.6CVにわたり0.1M酢酸(pH3.6)で溶出する。
5.0.4ml/分の0.5M NaOHを用いて15分間CIPを行う。
試料ロード時に、上記と同じ緩衝液を使用しながらHiTrap MabSelect SuReカラム上で選択された画分を分析した。溶出ピークを積分し、mAU×ml単位のピーク面積を出発原料に関するピーク面積と比較した。10%漏出点で適用された体積(V10%)を、出発原料のピーク面積の10%を有する画分から画定した。次いで、式1に従って動的結合容量(QB10%)を算出した。
実施例1と同様にして分析用サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
式中、Vp=細孔容積(=Vt−V0)。
10%漏出点において、2種の滞留時間(即ち、2.4分及び6分)でのFc融合タンパク質に対する動的結合容量(DBC)を算出した。結果を表7に示す。MAbについての以前の結果とは対照的に、Fc融合タンパク質に対するDBCはZ4に比べてZ1及びZ2に関して高い。
この研究の目的は、アガロース系マトリックス上の様々なzリガンドで精製された数種のモノクローナル抗体の溶出pHを検討することであった。溶出は直線的なpH勾配中で実施した。溶出pHはピーク最大値で測定した。単量体リガンドプロトタイプで精製した試料は、他のプロトタイプに比べて僅かに高いpHで溶出した。結果はまた、溶出pHがリガンド密度に依存することも示した。ポリクローナルIgGに関して、高い試料ロード量も検討した。高い試料ロード量が溶出pHに影響を及ぼす徴候は見られなかった。
1.1 材料/調査ユニット
1.1.1 カラム
様々なZリガンドを有するアガロース系媒体:
アガロース系媒体 Z1:U1975077(1.98mg/ml)。
アガロース系媒体 Z2:U1975098(3.46mg/ml)。
MabSelect SuRe(Z4)、ロット:312257(5.6mg/ml)。
MabSelect SuRe(Z4)、ロット:306928(5.6mg/ml)。
10mM リン酸塩緩衝液(PBS、SIGMA社、P4417−100Tab)。
60mM クエン酸Na pH6(クエン酸Na M.294.1g/mol)、HClでpH調整。
60mM クエン酸Na pH3(クエン酸Na M.294.1g/mol)、HClでpH調整。
0.3M NaOH。
すべての試料は純粋画分であった。緩衝液交換のためにはPD−10カラムを使用した。
ポリクローナルヒトIgG(Octapharma社、gammanorm)。
Mab1。
Mab2。
Fc融合タンパク質、ロット:1510。
IgGを含むCHO細胞上澄み液。
MAb4(HiTrap MabSelect SuRe上で精製)。
MAb3。
0.5〜1.5mg/ml媒体の試料をロードした。
UNICORN法
平衡化: 5CV。
試料体積: 1ml(低ロード量)。
非結合試料の洗浄除去: 5CV。
溶出(勾配pH6〜pH3): 20CV。
再平衡化: 5CV。
滞留時間: 2.4分。
溶出は直線的なpH勾配中で実施した。溶出pHはピーク最大値で測定した。
AKTA Explorer 10、TF_E10。
分光光度計、Molecular Devices Spextramax PLUS。
Mettler Toledo、Seven Easy。
様々なzリガンドプロトタイプ(即ち、様々なリガンド密度を有する単量体(Z1)、二量体(Z2)及びSuRe(z4))上で7種のMAb及びFc結合タンパク質を精製した。プロトタイプSuRe(1.37mg/ml)上で溶出させたFc融合タンパク質及びMab1のpH値は、このカラム上での他の試料と異なっている。その説明は、これら2種の試料が適用前に凍結/解凍されたことにあるのかもしれない。
Claims (15)
- 1種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、
(a)該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、
(b)前記免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、
(c)吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び
(d)タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階
を含んでなる方法において、前記リガンドの各々がブドウ球菌プロテインA(SpA)のドメインB又はプロテインZの単量体或いはその機能的変異体から本質的になることを改良点とする方法。 - 1種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、
(a)該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、
(b)前記免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、
(c)吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び
(d)タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階
を含んでなる方法において、前記リガンドの各々がブドウ球菌プロテインA(SpA)のドメインB又はプロテインZの二量体或いはその機能的変異体から本質的になることを改良点とする方法。 - リガンドが、1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性を有する、請求項1又は請求項2記載の方法。
- リガンドが免疫グロブリンのFc部分に対して親和性を有するが、免疫グロブリンのFab部分に対する親和性を欠いている、請求項3記載の方法。
- 前記リガンドの1以上のグリシンがアラニンで置換されている、請求項4記載の方法。
- 29位のグリシン残基がアラニンで変えられている、請求項4記載の方法。
- リガンドがプロテインZであり、そのアルカリ安定性が1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項1又は請求項2記載の方法。
- プロテインZのアルカリ安定性が、少なくとも23位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項7記載の方法。
- 免疫グロブリン含有タンパク質の回収が、3.8〜4.2のpHを有する溶離剤を添加することで達成される、請求項2記載の方法。
- 80%以上、例えば90%以上、好ましくは95%以上の免疫グロブリン含有タンパク質が、3.8〜4.2のpHを有する溶離剤を用いて回収される、請求項2記載の方法。
- 免疫グロブリン含有タンパク質の回収が、4.0〜4.4のpHを有する溶離剤を添加することで達成される、請求項1記載の方法。
- 80%以上、例えば90%以上、好ましくは95%以上の免疫グロブリン含有タンパク質が、4.0〜4.4のpHを有する溶離剤を用いて回収される、請求項1記載の方法。
- 免疫グロブリン含有タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項1又は請求項2記載の方法。
- 免疫グロブリン含有タンパク質がポリクローナル抗体である、請求項1又は請求項2記載の方法。
- 免疫グロブリン含有タンパク質が別のタンパク質と融合した免疫グロブリンを含む融合タンパク質である、請求項1又は請求項2記載の方法。
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