DE60213248T2

DE60213248T2 - Verfahren zur reinigung hochanionischer proteine

Info

Publication number: DE60213248T2
Application number: DE60213248T
Authority: DE
Inventors: L. Jonathan Haverhill COFFMAN; B. William Chelmsford FOSTER; Shujun Brentwood SUN
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 2001-06-05
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2022-06-06
Also published as: ATE421536T1; US7223848B2; EP1404428A4; DK1714982T3; EP1714982A3; US20030050450A1; CA2448788C; EP1714982A2; WO2002098531A1; JP4288153B2; EP1404428B1; AU2008203302A1; NZ530025A; DK1404428T3; ATE333469T1; AU2008203302B2; EP1714982B1; ES2321539T3; ES2266535T3; DE60231016D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Dissoziieren von Fc-enthaltenden Molekülen aus Komplexen von Protein A/Fc-enthaltenden Molekülen in Mischungen gerichtet.
Verwandter Stand der Technik
Die Reinigung von Zielproteinen wird oft durch eine schlechte DNA-Entfernung aufgrund von DNA/Proteininteraktionen beeinträchtigt. DNA/Proteininteraktionen sind bei der Reinigung von hochanionischen Zielproteinen, z.B. sulfatierten Proteinen, problematischer. Die Reinigung von Proteinen, z.B. Proteinen, die Immunglobulin-Domänen enthalten, basierend auf dem niedrigen Dissoziations-pH, der notwendig ist, um Fc-enthaltende Moleküle von Protein A zu trennen, ist auch oft schwierig. Die Identifikation von Verfahren, die zum Entfernen von DNA aus Zielproteinen nützlich sind und die Identifikation von Verfahren zum Entfernen von Protein A aus Zielproteinen würden zum großen Nutzen für die Reinigung verschiedener Proteine sein.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 01/72769 beschreibt Verfahren zum Isolieren und Reinigen hochanionischer Zielproteine und von Zielproteinen, die Immunglobulin-Domänen enthalten, beispielsweise sulfatierte Proteine. Anionische Proteine sind Proteine, die eine negative Nettoladung aufweisen. Sulfatierte Proteine sind Proteine, bei denen die negative Nettoladung an zumindest etwa einem (1) sulfatierten Rest liegt. Die Sulfatisierung eines Zielproteins bezieht sich auf die Substitution zumindest einer Hydroxylgruppe (-OH) durch -SO₄H an oder zwischen im Zielprotein enthaltenen Aminosäure(n). In einer bevorzugten Ausführungsform weist das sulfatierte Protein zumindest etwa eine (1) Sulfatgruppe auf. Sulfatierte Proteine, die zumindest etwa zwei (2), drei (3), vier (4), fünf (5), sechs (6) oder mehr Sulfatgruppen enthalten, sind von dem vorliegenden Verfahren ebenfalls umfasst, z.B. sechs Sulfatgruppen an den N-terminalen Tyrosinen, wie bei PSGL-1 (P-Selectin-Glycoproteinligand-1) ausgeführt.
Insbesondere offenbart die internationale Veröffentlichung Nr. WO 01/72769 in einem Aspekt ein Verfahren zum Reinigen hochanionischer Zielproteine, welches die Schritte der Ionenaustauschchromatographie unter geeigneten Bedingungen für die Reinigung der Zielproteine umfasst. Als Beispiel sieht das offenbarte Verfahren vor: (1) Kontaktieren der Probe mit einem Substrat, das zum reversiblen Binden geladener Proteine in der Lage ist, wodurch die Zielproteine am Substrat binden, (2) Waschen des Substrates mit einer ersten Waschlösung unter geeigneten Bedingungen, wodurch eine Mehrzahl von proteinartigen und nicht proteinartigen Verunreinigungen in der Probe entweder nicht binden oder vom Substrat abgewaschen werden, während die hochanionischen Zielproteine gebunden bleiben, (3) Eluieren der Probe mit einer ersten Elutionslösung, wobei die erste Elutionslösung eine Salzlösung bei hoher molekularer Konzentration umfasst, und (4) Auffangen der eluierten Probe, welche die gereinigten anionischen Zielproteine enthält.
In einer Ausführungsform wird offenbart, dass der pH der ersten Waschlösung etwa 4,0 bis 8,0 ist. Bei einer anderen Ausführungsform wird offenbart, dass der pH der ersten Waschlösung etwa 6,5 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird offenbart, dass das hochanionische Zielprotein ein sulfatiertes Protein ist und die Verunreinigungen eine sulfatierte Form des Zielproteins beinhalten.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 01/72769 offenbart auch, dass die eluierte Probe aus der Ionenaustauschchromatographiereinigung, welche die gereinigten Zielproteine enthält, weiter gereinigt werden kann. Diese weitere Reinigung umfasst beispielsweise die Schritte einer hydrophoben Interaktions- und/oder Metallchelatchromatographie unter geeigneten Bedingungen für die Reinigung der hoch anionischen Zielproteine. Beispielsweise sieht diese weitere Reinigung die Schritte des (1) Hindurchleiten der die Zielproteine enthaltenden eluierten Probe durch eine Metallchelatchromatographiesäule oder eine hydrophobe Interaktionschromatographiesäule, wodurch die eluierte Probe auf der Säule gefangen wird, (2) Waschen der Säule mit einer zweiten Waschlösung unter geeigneten Bedingungen, wodurch DNA/Histonkomplexe, die in der Probe enthalten sind, dissoziiert werden, (3) Eluieren der Probe mit einer zweiten Elutionslösung und (4) Aufnehmen der die gereinigten hoch anionischen Zielproteine enthaltenden eluierten Probe vor.
Bei einer offenbarten Ausführungsform umfasst die zweite Waschlösung eine hohe Salzkonzentration und die zweite Elutionslösung umfasst eine niedrigere Salzkonzentration als die zweite Waschlösung. Beispielsweise ist unter hydrophoben Interaktionschromatographiebedingungen die Konzentration des Salzes in der zweiten Waschlösung etwa 4 M und die Konzentration des Salzes in der zweiten Elutionslösung ist etwa 0,48 M. Alternativ ist unter hydrophober Interaktionschromatographie die zweite Waschlösung ausgewählt aus der Gruppe, die aus (a) einer NaCl bei etwa 4 M und Tris bei etwa 20 mM umfassenden und einen pH von etwa 7,4 aufweisenden Lösung, (b) einer Isopropanol bei etwa 5 % und Ammoniumsulfat bei etwa 1,2 M umfassenden Lösung, (c) einer Lösung aus Ethanol bei etwa 5 % und Ammoniumsulfat bei etwa 1,2 M und (d) einer Lösung von Ethanol bei etwa 5 % und NaCl bei etwa 4 M, besteht.
Es wird weiterhin offenbart, dass unter Eisenchelationschromatographiebedingungen die zweite Waschlösung beispielsweise eine Salzkonzentration von etwa 2 M umfasst, und die zweite Elutionslösung eine Salzkonzentration von etwa 200 mM bis 1 M umfasst. Alternativ umfasst unter Eisenchelationschromatographiebedingungen die zweite Waschlösung MES bei etwa 40 mM, NaCl bei etwa 2 M und Imidazol bei etwa 5 mM und die zweite Elutionslösung umfasst eine Lösung von MES bei etwa 40 mM, NaCl bei etwa 1 M und Imidazol bei etwa 35 mM.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 01/72769 offenbart, dass die Zielproteine zumindest etwa eine (1) Sulfatisierung aufweisen. Anionische Zielproteine, die zumindest etwa zwei (2), drei (3), vier (4), fünf (5), sechs (6) oder mehr Sulfatisierungen aufweisen, sind ebenfalls offenbart, z.B. PSGL-1 Proteine.
Anionische Proteine, die dazu in der Lage sind, durch die offenbarten Verfahren gereinigt zu werden, können natürlich vorkommen oder rekombinante Proteine sein.
Auch wird in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 01/72769 ein Verfahren zur Reinigung eines hochanionischen Proteins offenbart, das eine Immunglobulin-Domäne (z.B. eine Immunglobulin-Fc-Domäne) umfasst, beispielsweise ein PSGL-Ig-Fusionsprotein. Dieses offenbarte Verfahren umfasst den Schritt des (1) Kontaktierens der Probe mit einem Substrat, das zur Bindung des Fc-Bereichs des Zielproteins in der Lage ist, welcher eine Immunglobulin-Domäne umfasst, wodurch die Zielproteine am Substrat binden, (2) Waschen des Substrats mit einer ersten Waschlösung unter geeigneten Bedingung, um in der Probe enthaltende Verunreinigungen wegzuwaschen, (3) Eluieren der Probe mit einer ersten Elutionslösung, wobei der pH der ersten Elutionslösung niedrig ist, z.B. etwa 4,0, vorzugsweise etwa 3,7 und (4) Aufnehmen der die gereinigten anionischen Zielproteine enthaltenden eluierten Probe.
Es wird weiter offenbart, dass die eluierte Probe aus dem Fc-bindenden Substrat, welches die gereinigten hochanionischen Zielproteine enthält, die eine Immunglobulin-Domäne umfassen, weiter gereinigt werden können. Beispielsweise umfasst die weitere Reinigung die Schritte von (1) dem Kontaktieren der eluierten Probe, welche die gereinigten anionischen Zielproteine enthält, die eine Immunglobulin-Domäne umfassen, mit einem Substrat, das zum Binden geladener Moleküle in der Lage sind, wodurch eine Mehrzahl von proteinartigen und nicht-proteinartigen Verunreinigungen in der Probe entweder nicht bindet oder vom Substrat abgewaschen wird, während die Zielproteine am Substrat gebunden bleiben, (2) Waschen des Substrats mit einer zweiten Waschlösung, wobei der pH der zweiten Waschlösung niedrig ist, z.B. etwa 4,0, vorzugsweise etwa 3,8, (3) Eluieren der Probe mit einer zweiten Elutionslösung, und (4) Aufnehmen der die eine Immunglobulin-Domäne umfassenden gereinigten anionischen Zielproteine enthaltenden eluierten Probe.
In einem Aspekt wird offenbart, dass die eine Immunglobulin-Domäne umfassenden Zielproteine, zumindest etwa eine (1) Sulfatisierung(en) aufweisen. Immunglobuline, die Proteine mit zumindest zwei (2), drei (3), vier (4), fünf (5), sechs (6) oder mehr Sulfatisierungen werden ebenfalls durch die internationale Veröffentlichung Nr. WO 01/72769 offenbart, z.B. PSGL-Ig.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellen die offenbarten Reinigungsverfahren gereinigte hochanionische Zielproteine und gereinigte hochanionische Proteine bereit, die eine Immunglobulin-Domaine (z.B. PSGL-Ig) umfassen, zumindest etwa 99,9 % rein von verunreinigenden Proteinen.
In einer anderen offenbarten Ausführungsform entfernen die Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung zumindest etwa 95 % oder 2,5 Logo Entfernungswert (LRV, log removal value) der kontaminierenden DNA aus den hochanionischen Zielproteinen und den eine Immunglobulin-Domäne enthaltenden hochanionischen Proteinen.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/22389 bezieht sich auf die Anwendung einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) auf die Trennung von Immunglobulin-G-Monoeren und die Integration von HIC in einem Kombinationschromatographieprotokoll für die Reinigung von IgG Antikörpermolekülen. Es können gereinigte monomere IgG Antikörper, die frei von Immunglobulinaggregaten, Wirtszellprotein und Protein A sind, durch das Verfahren gewonnen werden.
Jedoch würde ein Verfahren zum Dissoziieren von Fc-enthaltenden Proteinen aus Komplexen von Protein A/Fc-enthaltenden Molekülen in Mischungen sehr erwünscht sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zum Entfernen von Protein A (z.B. rProtein A oder rPA) aus Mischungen bereit, die z.B. durch hydrophobe Wechselwirkungenassoziierte Protein A- und Fc-enthaltende Moleküle, wie etwa beispielsweise rPSGL-Ig-Moleküle enthalten. Das Anheben des Dissoziations-pH zwischen pH 4,1 und 4,5 gestattet die Trennung der Fc-enthaltenden Moleküle, wie etwa rPSGL-Ig von Protein A durch Hindurchleiten der Mischung durch eine hydrophobe Interaktionschromatographie- (HIC)-Säule, wodurch das Protein A aus der Mischung entfernt wird. Der Dissoziations-pH wird durch Zugabe von Arginin oder einer Zusammensetzung oder einem Mittel, welches hydrophobe Wechselwirkungen reduziert (aufbricht) oder inhibiert (verhütet) angehoben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Ethylenglykol, Propylenglykol, Ethanol, Propanol, Methanol und dergleichen, in Kombination mit Arginin. Ein höherer Dissoziations-pH gestattet die Entfernung von rPA bei einem normaleren pH als dem, bei dem die Dissoziation ansonsten auftreten würde. Die Verwendung eines pH zwischen 4,1 und 4,5 führt auch zu weniger Schäden, z.B. Verlust von Sulfatierung oder Sialisierung oder der Einführung von Asp-Pro-Spaltungen, bei einigen Fc-enthaltenden Proteinen aufgrund niedrigerem pH, z.B. pH 3,7.
Eine HIC-Säule wird zum Entfernen von rPA aus den Fc-enthaltenden Molekülen bei einem normaleren pH als dem bei dem Dissoziation normalerweise auftreten würde, durch Anheben des Dissoziations-pH verwendet, unter Verwendung von Arginin oder in Kombination mit Ethylenglykol. Die pH-Bedingungen werden durch Zugabe von Arginin zur Mischung eingestellt. Die pH-Bedingungen werden vorzugsweise durch Zugabe von Arginin in Kombination mit Ethylenglykol eingestellt.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Dissoziieren von Fc-enthaltenden Molekülen aus Komplexen von Protein A/Fc-enthaltenden Molekülen in einer Mischung bereit, welches umfasst Kontaktierung der Mischung mit einer hydrophoben Interaktionschromatographiesäule unter pH-Bedingungen zwischen 4,1 und 4,5, wobei die pH-Bedingungen durch Zugabe von Arginin zu der Mischung eingestellt werden und die Säule mit einem Puffer gewaschen wird, der Arginin enthält, um Fc-enthaltende Moleküle aus Komplexen von Protein A/Fc-enthaltenden Molekülen zu dissoziieren. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die pH-Bedingungen 4,1.
In einer anderen Ausführungsform ist das Fc-enthaltende Molekül rPSGL-Ig.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung weiterhin Eluieren der Fc-enthaltenden Moleküle aus der hydrophoben Interaktionschromatographiesäule, so dass die Fc-enthaltenden Moleküle im Wesentlichen frei von Protein A sind.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen ersichtlich.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert zumindest teilweise auf der Entdeckung eines neuen Verfahrens zum Reinigen hoch anionischer Zielproteine und hochanionischer Proteine, die eine Immunglobulin-Domäne umfassen, beispielsweise sulfatierte Proteine (z.B. PSGL-1). Anionische Proteine sind Proteine mit einer negativen Nettoladung. Sulfatierte Proteine sind anionische Proteine, bei denen die negative Ladung an zumindest etwa einer, und bevorzugtererweise fünf (5) oder mehr Sulfatierungen, z.B. zumindest etwa sechs (6) Sulfatierungen liegen. Sulfatierungen in einem Zielprotein beziehen sich auf die Substitution zumindest einer Hydroxylgruppe (-OH) durch – SO₄H an oder zwischen Aminosäure(n), die im Zielprotein enthalten sind. Sulfatierungen können beispielsweise an den N-terminalen Tyrosinen auftreten, wie in PSGL-1 ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung basiert in Teilen auch auf der Entdeckung eines neuen Verfahrens zum Entfernen von Protein A (z.B. rProtein A oder rPA) aus Mischungen, die z.B. durch hydrophobe Interaktionen assoziierte Protein A- und Fc-enthaltende Moleküle enthalten, wie etwa beispielsweise rPSGL-Ig-Moleküle. Die Verwendung von pH-Bedingungen zwischen 4,1 und 4,5 gestattet die Trennung der Fc-enthaltenden Moleküle, wie etwa rPSGL-Ig aus Protein A durch Hindurchleiten der Mischung durch eine hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)-Säule, wodurch das Protein A aus der Mischung entfernt wird. Der Dissoziations-pH wird durch Zugabe von Arginin oder einer Zusammensetzung oder einem Mittel angehoben, welche(s) hydrophobe Interaktionen vermindert (aufbricht) oder inhibiert (verhütet), einschließlich, aber nicht beschränkt auf Ethylenglykol, Propylenglykol, Ethanol, Propanol, Methanol und dergleichen in Kombination mit Arginin. Ein höherer Dissoziations-pH gestattet das Entfernen von rPA bei einem neutraleren pH als dem, an dem eine Dissoziation ansonsten auftreten würde. Die Verwendung eines höheren pH, z.B. höher als etwa pH 3,7, führt auch zu weniger Beschädigung, z.B. Verlust von Sulfatierung oder Sialatierung oder der Einführung von Asp-Pro-Spaltungen, an einigen Fc-enthaltenden Proteinen aufgrund des niedrigeren pH, z.B. pH 3,7.
Bevorzugte Zusammensetzungen oder Mittel, welche hydrophobe Interaktionen vermindern (aufbrechen) oder inhibieren (verhüten) beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Ethylenglykol, Propylenglykol, Ethanol, Propanol, Methanol und dergleichen. Besonders bevorzugt wird Ethylenglykol zur Verwendung beim Dissoziieren von Protein A und Fc-enthaltenden Molekülen. Zusammensetzungen oder Mittel, welche hydrophobe Interaktionen vermindern, (aufbrechen) oder inhibieren (verhüten) können bei jeglicher Konzentration verwendet werden, die den pH erfolgreich hinreichend steigert, um die Trennung des Protein A/Fc-enthaltenden Molekülkomplexes unter Verwendung einer Chromatographiesäule zu gestatten, einschließlich, beispielsweise Bereichen von Konzentrationen an z.B. Ethylenglykol zwischen 10–50 %, 10–40 %, 20 %–40 % und 20 %–30 %. Bevorzugte Konzentrationen von Zusammensetzungen oder Mitteln, welche hydrophobe Interaktionen vermindern (aufbrechen) oder inhibieren (verhüten), z.B. Ethylenglykol, beinhalten 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 % und 50 %. Besonders bevorzugt für die Dissoziation von Fc-enthaltenden Verbindungen, z.B. rPSGL-Ig und Protein A, ist Ethylenglykol bei einer Konzentration von 50 %.
Die HIC-Säule wird zur Trennung von Fc-enthaltenden Molekülen, z.B. rPSGL-Ig aus Protein A verwendet, wenn bei einem pH eingesetzt, der hinreicht, um eine maßgebliche Menge an Protein A zu entfernen. Protein A und Fc-enthaltende Moleküle werden unter Verwendung einer HIC-Säule bei pH-Bedingungen von zwischen 4,1 und 4,5, vorzugsweise einem pH von 4,1, dissoziiert, wobei die pH-Bedingungen durch Zugabe von Arginin zur Mischung eingestellt werden und die Säule mit einem Arginin-enthaltenden Puffer gewaschen wird. Die HIC-Säule kann bei pH 4,1 mit einer acv-Waschung bei pH 4,1 unmittelbar vorher laufen, beide in 500 mM Arginin, um Protein A aus dem Protein A/Fc-enthaltenden Molekülkomplex zu entfernen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Entfernen einer maßgeblichen Menge" von Protein A auf das Entfernen von 10 %–20 %, 20 %–30 %, 30 %–40 %, 40 %–50 %, 50 %–60 %, 60 %–70 %, 70 %–80 %, 50 %–90 % oder vorzugsweise 90 %– 100 % Protein A aus den Protein A/Fc-enthaltenden Molekülkomplexen. Vorzugsweise werden 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 100 % Protein A entfernt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Entfernung von Protein A, so dass die Fc-enthaltenden Moleküle im Wesentlichen frei von Protein A sind, auf die Entfernung von 10 %–20 %, 20 %–30 %, 30 %–40 %, 40 %–50 %, 50 %–60 %, 60 %–70 %, 70 %–80 %, 50 %–90 % oder vorzugsweise 90–100 % Protein A aus Protein A/Fcenthaltenden Molekülkomplexen, z.B. in einer Mischung. Vorzugsweise werden 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 100 % Protein A entfernt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das sulfatierte Protein PSGL-1, beispielsweise ein PSGL-1, das die im US-Patent Nr. 5 827 817 dargestellte Aminosäure umfasst, dessen Inhalt hierin unter Bezugnahme inkorporiert ist, oder einem aktiven Teil davon. Die komplette Aminosäuresequenz des PSGL-1 Proteins (d.h. das reife Peptid plus die Leadersequenz) ist durch die im US-Patent 5 827 817 dargestellte Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis Aminosäure 402 gekennzeichnet und wird hier als SEQ ID NO: 1 dargestellt. Eine Hydrophobizitätsanalyse und ein Vergleich mit bekannten Spaltenmustern sagt eine Signalsequenz von 20 bis 22 Aminosäuren voraus, d.h. Aminosäuren 1 bis 20 oder Aminosäuren 1 bis 22 von PSGL-1. PSGL-1 enthält eine PACE (paired basic amino acid converting enzyme, gepaartes basisches Aminosäureumwandlungsenzym)-Spaltstelle (-Arg-Asp-Arg-Arg-) an den Aminosäureresten 38–41. Das reife PSGL-1 Protein ist durch die Aminosäuresequenz gekennzeichnet, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, von Aminosäure 42 bis Aminosäure 402. Eine lösliche Form des P-selektiven Ligandenproteins ist durch Aminosäuren 21 bis 310 der im US-Patent Nr. 5 827 817 dargestellten Aminosäuresequenz gekennzeichnet. Eine andere lösliche Form des reifen PSGL-1 Proteins ist durch die in US-Patent Nr. 5 827 817 dargestellte Aminosäuresequenz von Aminosäure 42 bis Aminosäure 310 gekennzeichnet. Die lösliche Form des P-Selectinligandenproteins ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass es in wässriger Lösung bei Raumtemperatur löslich ist.
Fusionsproteine von PSGL-1 (z.B. PSGL-Ig) können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Lehren und unter Verwendung der Lehren von US-Patent Nr. 5 827 817, hierin unter Bezugnahme inkorporiert, hergestellt werden. Fragmente des PSGL-1 Proteins können mit Trägermolekülen, wie etwa Immunglobulinen, fusioniert werden, um die Valenz an P-Selectinligandenbindungsstellen zu erhöhen. Beispielsweise können lösliche Formen des P-Selectinligandenproteins, wie etwa die Fragmente von Aminosäure 42 bis Aminosäure 295 oder von Aminosäure 42 bis Aminosäure 88, von SEQ ID NO: 1 über "Linker"-Sequenzen mit dem Fc-Bereich eines Immunglobulins (native Sequenz oder mutierte Sequenzen zum Verleihen wünschenswerter Qualitäten (wie etwa längerer Halbwertzeit oder verminderter Immunogenizität) für die sich ergebende Chimäre) fusioniert werden. Für eine bivalente Form des P-selektiven Ligandenproteins könnte solch eine Fusion mit dem Fc-Bereich eines IgG-Moleküls (z.B. rPSGL-Ig) erfolgen. Andere Immunglobulinisotypen können ebenfalls verwendet werden, um solche Fusionen zu erzeugen. Beispielsweise würde eine P-Selectinligandenprotein-IgM-Fusion eine dekavalente Form des P-Selectinligandenproteins der Erfindung erzeugen.
Wie hierin verwendet, beinhalten die Begriffe "Fc-enthaltendes Protein" oder "Fc-enthaltendes Molekül" jegliches Protein, das mit einem Fc-Bereich eines Immunglobulins fusioniert ist oder es enthält. Ein Beispiel eines Fc-enthaltenden Proteins ist rPSGL-Ig.
PSGL-1 ist ein Glykoprotein, das ein oder mehrere der folgenden terminalen Kohlenhydrate enthalten kann:
wobei R = Rest der Kohlenhydratkette, die kovalent entweder direkt an dem P-Selectinligandenprotein oder an einer Lipideinheit angebracht ist, die kovalent am O-Selectinligandenprotein angebracht ist. PSGL-1 kann zusätzlich sulfatiert oder anders post-translational modifiziert sein. Wie in COS und CHO-Zellen exprimiert, ist das Voll-Längen-P-Selectinligandenprotein ein homodimeres Protein mit einem Scheinmolekulargewicht von 220 kD, wie durch nicht-reduzierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gezeigt.
Die Struktur des Voll-Längen-PSGL-1 beinhaltet eine extrazelluläre Domäne (etwa von Aminosäure 21 bis 310), eine Transmembran-Domäne (etwa von Aminosäure 311 bis 332) und eine intrazelluläre cytoplasmische Domäne (etwa von Aminosäure 333 bis 402). Die extrazelluläre Domäne enthält drei Consens-Tripeptidstellen (Asn-X-Ser/Thr) potentieller N-verkoppelter Glykosylierung, die bei Asn-Resten 65, 111 und 292 beginnen. Die extrazelluläre Domäne enthält weiterhin drei potentielle Stellen der Thyrosinsulfatierung bei den Resten 46, 48 und 51. Der die Reste 55–267 umfassende Bereich enthält einen hohen Prozentsatz an Prolin, Serin und Threonin, einschließlich einer Subdomäne von fünfzehn dekameren Wiederholungen der Zehn-Aminosäuren-Konsenssequenz Ala-Thr/Met-Glu-Ala-Gln-Thr-X-Pro/Leu-Ala/Thr, wobei X entweder Pro, Ala, Gln, Glu oder Arg sein kann. Bereiche wie diese sind für hoch O-glykosylierte Proteine charakteristisch.
Substantielle Delektionen der PSGL-1 Sequenz können vorgenommen werden, während die P-Selectinligandenproteinaktivität erhalten bleibt. Beispielsweise behalten PSGL-1, die die Sequenz von Aminosäure 42 bis Aminosäure 189, die Sequenz von Aminosäure 42 bis Aminosäure 118 oder die Sequenz von Aminosäure 42 bis Aminosäure 89 von SEQ ID NO: 1 umfassen, alle die P-Selectinproteinbindeaktivität und die Fähigkeit, an P-Selectin zu binden. PSGL-1 Proteine, in denen eine oder mehrere N-verknüpfte Glykosylierungsstellen (wie etwa jene an Aminosäuren 65, 111 und 292) zu anderen Aminosäuren verändert oder deletiert worden sind, behalten ebenfalls die P-Selectinproteinbindeaktivität und die Fähigkeit, E-Selectin zu binden. P-Selectinligandenproteine, die Aminosäure 42 bis Aminosäure 60 umfassen (welche einen hoch anionischen Bereich des Proteins von Aminosäure 45 bis Aminosäure 58 enthält) behalten ebenfalls P-Selectinligandenproteinaktivität; jedoch binden P-Selectinligandenproteine, die auf eine solchen Sequenz beschränkt sind, nicht an E- Selectin. Vorzugsweise behält ein P-Selectinligandenprotein zumindest einen (bevorzugtererweise zumindest zwei und am bevorzugtesten alle drei) der Thyrosinreste, die bei den Aminosäuren 46, 48 und 51 gefunden werden, deren Sulfatierung zur P-Selectinligandenproteinaktivität beitragen kann.
Die Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden Beispiele illustriert, die nicht als beschränkt aufgefasst werden sollten. Alle Bezugnahmen auf die Aminosäuresequenz von PSGL-1 basieren auf der Aminosäuresequenz von PSGL-1, die im US-Patent Nr. 5 827 817 dargestellt und hier als SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
BEISPIELE
Verfahren: Allgemeine Verfahren zum Reinigen von Proteinen werden bei Janson, J.C. und L. Ryden (Herausgeber) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, VCH Publishers, Inc., New York (1989), US-Patent Nr. 5 429 746 mit dem Titel „Antikörperreinigung" und US-Patent Nr. 5 115 101 mit dem Titel „" gefunden.
BEISPIEL 1: REINIGUNG VON REKOMBINANTEN PSGL-Ig-FUSIONSPROTEIN – PROZESS 1 (nur für illustrative Zwecke)
Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung eines rekombinanten PSGL-Ig-Fusionsproteins durch Säulenchromatographie.
Ein lösliches P-Selectinligandenprotein wurde in CHO-Zellen exprimiert und das konditionierte Medium wurde zur Proteinreinigung geerntet. Eine Q-Sepharose^TM-Schnellfluss (Amersham Pharmacia)-Säule mit einer 8 cm Betttiefe wurde gemäß Herstelleranweisungen vorbereitet. Die Säulenkapazität für PSGL im konditionierten Medium ist ungefähr 1 mg PSGL/ml Harz.
Es wurde eine Anionenaustauschchromatographie wie folgt durchgeführt. Mikrogefiltertes, CHO-konditioniertes Medium wurde auf die Säule bei ungefähr pH 7, Leitfähigkeit unter 20 mS/cm geladen. Die Säule wurde mit 20 mM Histidin, 400 mM NaCl, pH 6,5 gewaschen, um hyposulfatiertes rPSGL-1g zu entfernen, z.B. 4 oder weniger Sulfatierungen. Die Beladungs- und Waschschritte wurden bei 3,5 cm/min durchgeführt. Die Säule wurde bei pH 6,5 mit 1 M NaCl, 20 mM Histidin, pH 6,5 bei < 1,1 cm/min eluiert. Der pH dieses Schritts könnte zwischen pH 4 und 8 liegen, ist aber vorzugsweise pH 6,5. Die eluierte Spitze enthält PSGL-Ig, DNA und Histone wie auch andere Kontaminanten. Die Q-Säule bindet DNA und die Histone sind an der DNA angelagert. Die PSGL-Elution (die durch Anheben der Salzkonzentration verursacht wird) koinzidiert mit der DNA-Elution. Die Reinheit von PSGL-Ig ist > 80 %. Nur 50 % der DNA werden in diesem Schritt entfernt.
Unter diesen Bedingungen werden preferentiell hypersulfatierte rPSGL-Ig Moleküle, z.B. fünf oder sechs Sulfatiierungen, gereinigt. Aktives rPSGL-Ig hat Idealerweise fünf oder sechs Sulfatiierungen an den N-terminalen Tyrosinen.
Der Eluent aus der Anionenaustauschsäule wurde weiter unter Verwendung einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC)-Säule wie folgt gereinigt.
Eine Phenyl Toyopearl 650C-Säule (Rohm und Haas) mit einer 9 cm Betttiefe wurde gemäß Herstelleranweisungen vorbereitet. Die Kapazität der HIC-Säule ist ungefähr 3,5 mg PSGL/ml Harz. Die Säule wurde equilibriert in 1,2 M Ammoniumsulfat, 20 mM Tris, pH 7,4 bei ≤ 1,3 cm/min. Der Eluent aus der Q-Sepharosesäule wurde auf 1,2 M Ammoniumsulfat, 20 mM Tris, pH 7,4 durch Zugabe von 3 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris, pH 7,4 eingestellt und auf die HIC geladen. Alternativ könnte das Laden in 4 M NaCl statt 1,2 M Ammoniumsulfat vorgenommen werden. Die Säule wurde mit 1,2 M Ammoniumsulfat, 20 mM Tris pH 7,4 gewaschen. Sowohl der Beladungs- als auch der Waschschritt wurden bei einer Rate von ungefähr 1,3 cm/min durchgeführt. Die HIC-Säule wurde mit 0,48 M Ammoniumsulfat, 20 mM Tris, pH 7,4 bei 0,65 cm/min eluiert. Unter diesen Bedingungen entfernt die HIC-Säule primär H2A und H2B Histone, die DNA nicht so fest binden wie H3 und H4 es tun. H2-Histone erscheinen in der Waschfraktion und die Spitze enthält H3- und H4-Histone und etwas an H2-Histonen. Zusätzlich bleibt eine große Menge von DNA an den Histonen und eluiert im Peak. Das Produkt ist 95% rein von kontaminierenden Proteinen und 85 % der DNA werden durch diesen Schritt entfernt.
Der Eluent aus der HIC-Säule wurde weiterhin unter Verwendung einer Metallchelatchromatographie (IMAC)-Säule wie folgt gereinigt.
Eine IMAC-Kupfer (II)-Säule auf Fractogel-Chelat (M)(E. Merck) wurde gemäß Herstelleranweisung vorbereitet. Die IMAC-Säule hatte eine Betttiefe von 6,47.2 cm und eine Kapazität von ungefähr 6,6 mg PSGL/ml Harz.
Die Säule wurde mit 50 mM Kaliumphosphat (KP0₄), 2,0 M NaCl, 2 mM Imidazol, pH 7 für 5 cv bei ≤ 5 cm/min equilibriert. Der Eluent aus der HIC-Säule wurde auf 2 mM Imidazol, 50 mM KP0₄, pH 7, 200 mM NaCl eingestellt und auf die IMAC-Säule geladen. Die Säule wurde zuerst mit Equilibrierungspuffer gewaschen und dann mit 40 mM MES, 1 M NaCl, 5 mM Imidazol, pH 6,6 bei ≤ 5 cm/min. Diese niedrige Salzkonzentration bricht den Histon/DNA-Komplex auf der IMAC-Säule nicht auf. Die Säule wurde mit 50 mM MES, 1 M NaCl, 35 mM Imidazol pH 6,6 eluiert. Die IMAC-Säule entfernt primär H3- und H4-Histone. H3- und H4-Histone und etwas H2 sind im Streifen, obwohl einige H3- und H2-Histone in der IMAC-Spitze gefunden werden. Das sich ergebende Produkt ist > 99,9 % rein von kontaminierenden Proteinen und dieser Schritt entfernt 95 % der DNA. Insgesamt gibt es eine 2,5 LRV an DNA-Klärung aus diesem Gesamtprozess.
Dieser Prozess gestattet es DNA, durch den gesamten Prozessverlauf geführt zu werden, da die DNA direkt an der Q-Säule gebunden ist. Im Q-Schritt ist die DNA auch an Histone (z.B. H2A, H2B, H3 und 114) gebunden, die natürlich auftretende DNA-Bindeproteine sind, die in unserer Ladung an der Q-Säule vorhanden sind. Auf der Q-Säule gab es daher ein Sandwich, in dem die DNA an die Q-Säule band und die Histone an der DNA banden. In den nachfolgenden Schritten wurde das Sandwich umgekehrt, da die DNA nicht direkt an der HIC oder der IMAC-Säule bindet. Stattdessen banden die Histone an die HIC- oder IMAC-Säule und die DNA band an den Histonen. Wenn die Histone aus der HIC oder IMAC eluieren, tragen sie die DNA-Kontamination mit sich. Eine schwache DNA-Entfernung aufgrund von DNA/Proteininteraktionen kann oft bei Proteinreinigung gefunden werden, speziell im Fall hoch anionischer Zielproteine und insbesondere, wenn diese anionischen Proteine aus einer Anionenaustauschsäule eluiert werden.
BEISPIEL 2: REINIGUNG VON REKOMBINANTEM PSGL-Ig-FUSIONSPROTEIN – PROZESS II (nur für illustrative Zwecke)
Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung eines rekombinanten PSGL-Ig-Fusionsproteins (rPSGL-Ig) durch Säulenchromatographie einschließlich des Schritts des Dissoziierens der kontaminierenden Histon/DNA-Komplexe entweder mit Salz oder einem Alkohol, wodurch die Reinheit der PSGL-Ig-Proteine gesteigert wird.
Ein Anionenaustauschchromatographieschritt auf Q-Sepharose wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Der Eluent aus der Anionenaustauschsäule wurde weiterhin unter Verwendung einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC)-Säule wie folgt gereinigt. Eine Phenyl Toyopearl 650C-Säule (Rohm und Haas) mit einer 9 cm Betttiefe wurde gemäß Herstelleranweisungen vorbereitet und in 1,2 M Ammoniumsulfat, 20 mM Tris, pH 7,4 equilibriert. Der pH dieses Schrittes könnte zwischen 6 und 8 sein, ist aber vorzugsweise 7,4.
Die Q-Spitze wurde durch Zugabe von 3 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris pH 7,4 auf 1,2 M Ammoniumsulfat, 20 mM Tris, pH 7,4 eingestellt und auf die Säule geladen. Alternativ könnte die Ladung in 4 M NaCl statt 1,2 M Ammoniumsulfat vorgenommen werden. Die Säule wurde mit 1,2 M Ammoniumsulfat, 20 mM Tris pH 7,4 gewaschen, gefolgt von einer Waschung mit 4 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4. Das Waschen mit 4 M NaCl entfernt 90 % (oder 1 log₁₀ Entfernung, oder 1 LRV) der DNA auf der Säule. Alternativ könnte man mit 5 % Isopropanol und 1,2 M Ammoniumsulfat waschen. Dies entfernt 99,9 % der DNA aus der Säule ("3 log₁₀ Entfernung", oder 3 LRV). Alternativ könnte man mit 5 % Ethanol und 1,2 M Ammoniumsulfat waschen. Dies entfernt 99,9 % der DNA auf der Säule ("3 log₁₀ Entfernung" oder 3 LRV). Alternativ könnte man mit 5 % Ethanol und 4 M NaCl waschen. Dies entfernt 99,9 % der DNA aus der Säule ("3 log₁₀ Entfernung", oder 3 LRV). Alternativ könnte man mit 5 % Isopropanol und 4 M NaCl waschen. Dies entfernt 99,9 % der DNA aus der Säule ("3 log₁₀ Entfernung" oder 3 LRV). Die Beladungs- und Waschschritte wurden bei einer Rate von ungefähr 1,3 cm/min durchgeführt. Die Säule wurde dann mit 0,48 M Ammoniumsulfat, 20 mM Tris, pH 7,4 bei einer Rate von 0,65 cm/min eluiert.
Wie zuvor entfernt diese HIC bei diesen Bedingungen primär H2A- und H2B-Histone, die an DNA nicht so fest binden wie die H3 und H4-Histone. Es erscheinen H2-Histone in der Waschlösung. Die Spitze enthält H3- und H4- mit einigen H2-Histonen. Jedoch haben wir herausgefunden, dass durch Waschen mit höherer Salzkonzentration die DNA/Histoninteraktion aufgebrochen werden kann. Somit bricht durch Waschen mit beispielsweise 4 M NaCl statt 1,2 M Ammoniumsulfat die DNA vom Histon ab und kommt in die Waschlösung. Unter diesen Bedingungen kommt eine große Mehrzahl von DNA in die Waschlösung und die Histone eluieren immer noch in der Spitze. Dieser HIC-Schritt könnte alternativ nach dem IMAC-Schritt gefahren werden (siehe unten). Dies könnte dazu führen, dass 99,9 % mehr DNA entfernt werden (3 LRV).
Der Eluent aus der HIC-Säule wurde weiterhin unter Verwendung einer Metallchelatchromatographie (IMAC)-Säule wie folgt gereinigt.
Eine IMAC-Kupfer (II)-Säule auf Fractogel-Chelat (M) (E. Merck) wurde gemäß Herstelleranweisungen vorbereitet. Die IMAC-Säule hatte eine Betttiefe von 6,4–7,2 cm und eine Kapazität von ungefähr 6,6 mg PSGL/ml Harz. Der pH dieses Schrittes kann zwischen 4,8 und 8 liegen, ist aber vorzugsweise pH 6,6.
Die Säule wurde mit 50 mM Kaliumphosphat (KP0₄), 2,0 M NaCl, 2 mM Imidazol, pH 7 für 5 cv bei ≤ 5 cm/min equilibriert. Alternativ kann die Säule bei 200 mM NaCl statt 2 M NaCl equilibriert werden. Der Eluent aus der HIC-Säule wurde auf 2 mM Imidazol, 50 mM KP0₄, pH 7, 200 mM NaCl eingestellt und auf die IMAC-Säule geladen. Diese Beladung kann alternativ bei 200 mM NaCl statt 2 M NaCl laufen.
Die Säule wurde zuerst mit Equilibrierungspuffer gewaschen und dann mit 40 mM MES, 2 M NaCl, 5 mM Imidazol, pH 6,6 bei ≤ 5 cm/min gewaschen. Die Säule wurde mit 40 mM MES, 1 M NaCl, 35 mM Imidazol pH 6,6 eluiert. Die IMAC-Säule entfernt primär H3- und H4- Histone. Die Histone und etwas H2-Histone sind im Streifen. Einige H3- und H2-Histone werden auch in der IMAC-Spitze gefunden.
Dieser Schritt entfernt 90 % mehr DNA als der Prozess I Schritt von Beispiel 1 (1 LRV) unter Verwendung entweder der hohen Salzladung oder der hochsalzigen Waschlösung. Die Neuheit dieses Schrittes liegt darin, mit 2 M NaCl zu laden oder mit 2 m NaCl zu waschen, um die DNA aus dem Histon/DNA-Komplex zu entfernen. Diese Histone kleben an der IMAC-Säule und die DNA klebt an den Histonen. Da die DNA besser am H3/H4-Komplex als am H3/H2 oder einfach am H2-Komplex bindet, würde das Entfernen des H3/H4-Komplexes so früh als möglich im Prozess nützlich sein. Daher hat das Fahren der HIC nach der IMAC gezeigt, dass eine größere DNA-Reinigung erzielt werden kann (99,9 % mehr Reinigung oder 3 LRV). Daher könnte das Platzieren der IMAC so früh im Prozess wie möglich voraussichtlich zu einer weiteren Reduktion an DNA führen. IMAC als erster Schritt jedoch würde eine Ultrafiltration/Diafiltration erfordern, um niedermolekulargewichtige Aminosäuren und andere Amine enthaltende Gruppen aus der Ladung zu entfernen.
BEISPIEL 3: REINIGUNG VON REKOMBINANTEM PSGL-Ig-FUSIONSPROTEIN – PROZESS III (für illustrative Zwecke, außer [0080] bis [0087])
Dieses Beispiel beschreibt ein alternatives Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten PSGL-Ig-Fusionsproteins, z.B. rPSGL-Ig, durch Säulenchromatographie. Im Kontrast zum in Beispiel 1 beschriebenen Reinigungsschema verwendet dieser Prozess einen Affinitätsschritt als ersten Reinigungsschritt. Der Affinitätsreinigungsschritt verwendet rProtein A (das hierin auch als rPA bezeichnet wird), das am Fc-Bereich der rPSGL-Ig-Chimere bindet. Das rPSGL-Ig wird aus der rProtein A-Säule bei niedrigem pH, in diesem Falle einem pH von 3,7, eluiert. Der rProtein A-Schritt ergibt eine bessere Reinigung, falls die Säule nach Beladung mit 1 M NaCl gewaschen wird. Diese Salzkonzentration ist höher als die typischerweise verwendete (üblicherweise etwa 150 mM NaCl) und ist daher neu. Die Beseitigung an DNA aus diesem Schritt geht von einem 4 log₁₀ Entfernungswert (LRV) auf 6 LRV bei Hinzufügung dieses Salzschrittes. Dies stellt ein 100faches Anwachsen an DNA-Entfernung dar.
Der rProtein A-Schritt scheint Histone nicht zu binden und ergibt eine gute DNA-Reinigung. Daher sind Histone nicht merklich in, dem rProtein A-Schritt nachfolgenden Schritten vorhanden. Da rProtein A jedoch aus der rProtein A-Säule ausschwemmt, werden die nachfolgenden Schritte durchgeführt, um das rProtein A zu entfernen. Ein neues Verfahren zum Entfernen des ausgeschwemmten Proteins A besteht darin, das Protein A-Eluat direkt auf die Q-Säule zu laden, entweder bei neutralem oder bei niedrigem pH, oder die Q-Säule bei niedrigem pH zu waschen. Q-Säulen werden normalerweise nicht bei niedrigem pH, insbesondere nicht pH 4, gefahren. Somit ist das Einfangen des rPSGL-Ig direkt aus dem Protein A-Eluat oder des Waschens der Q-Säule bei niedrigem pH oder eine Kombination derselben neu. Da das rPSGL-Ig und das rProtein A bei niedrigem pH sind, ist eine große Vielzahl des RPSGL-Ig nicht an dem ausgeschwemmten rProtein A gebunden. Als Ergebnis bindet das rProtein A nicht an der Q-Säule, sondern wird im Q-Durchfluss gefunden. Dies ist auch neu. Somit wird die Q-Säule verwendet, um rProtein A zu entfernen. Dieses neue Verfahren kann verwendet werden, um hoch anionische Proteine zu reinigen. Eine Protein A-Schnellflusssäule (Amersham Pharmacia) mit einer Betttiefe von 6–10 cm wird gemäß Herstelleranweisungen vorbereitet. Die Säulenkapazität ist ungefähr 1 mg/ml bis 6 mg/ml. Die Säule wird mit 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,2 bis 8, vorzugsweise pH 7,4, equilibriert. Es wird mikrogefiltertes konditioniertes Medium auf die Säule zwischen pH 7 und pH 8, vorzugsweise pH 7,4, mit ungefähr 30–300 cm/h, vorzugsweise 150 cm/h, geladen. Die Säule wird mit 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7 bis 8, vorzugsweise pH 7,4, gewaschen und mit 20 mM Citrat, pH 3 bis 4, vorzugsweise pH 3,7, bei 50 bis 300 cm/h eluiert. Die Reinheit ist > 95 % für Proteine und > 99 % der DNA wird durch diesen Schritt entfernt.
Der Eluent aus der rProtein A-Säule wird weiter auf einer Q-Sepharose^TM-Schnellflusssäule (Amerson Pharmacia) mit einer 8 cm Betttiefe gereinigt. Die Kapazität der Q-Sepharose-Säule für PSGL bei pH 3,6 bis 4,0, vorzugsweise etwa pH 3,8, nach dem rProtein A-Schritt ist ungefähr ≥ 6 PSGL/ml Harz.
Die rProteine A-Spitze wird direkt auf die Q-Sepharose-Säule geladen, ohne Einstellen des pH, oder die Spitze wird vor der Beladung auf die Q-Sepharose-Säule neutralisiert.
In jedem Fall wird die Säule mit 200 mM NaCl und 20 mM Citrat bei pH 3,5 bis 4, vorzugsweise etwa pH 3,8 gewaschen, um restliches Protein A zu entfernen. Beide Verfahren entfernen ausgeschwemmtes Protein A, hyposulfatiertes rPSGL-Ig, N-terminal abgeschnittenes rPSGL-Ig und pro-rPSGL-Ig (eine Vorläufer-Spezies für rPSGL-Ig, die keine enzymatische Abspaltung des N-Terminus aufweist). Nach dem pH 3,5 bis 4 Waschschritt könnte die Säule mit 20 mM Histidin, 400 mM NaCl, pH 6,5 gewaschen werden, um hyposulfatiertes rPSGL-Ig zu entfernen. Hyposulfatierte rPSGL-Ig-Moleküle haben 4 oder weniger Sulfatierungen, während aktives rPSGL-Ig idealerweise 5 oder 6 Sulfatierungen an den N-terminalen Tyrosinen aufweist. Die Säulenbeladung und Waschschritte werden bei einer Rate von 3,5 cm/min durchgeführt. Die Säule wird bei pH 6,5 mit 1 M NaCl, 20 mM Histidin, pH 6,5 eluiert. Alternativ könnte man bei pH 3,5 bis 4,0 eluieren, vorzugsweise etwa 3,8, in 500 mM NaCl, 20 mM Citrat bei < 1,1 cm/min. Proteine repräsentieren < 2 % der Spitze.
Alternativ könnte das ausgeschwemmte rProtein A durch Anheben des Dissoziations-pH des Protein A/rPSGL-Ig-Komplexes entfernt werden. Durch Anheben des Dissoziations-pH kann die Fc-enthaltende Komponente, z.B. rPSGL-Ig, leichter abgetrennt und aus dem Protein A durch die Verwendung einer Chromatograhiesäule, wie etwa beispielsweise einer Q-Säule, z.B. einer Q-Sepharose^TM-Schnellfluss (Amersham Parmacia)-Säule, einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC)-Säule, einer Metall-Chelat-Chromatographie (IMAC)-Säule, einer Hydroxyapatit-, Anionenaustausch- oder Kationenaustauschsäule entfernt werden. Der Dissoziations-pH kann durch die Verwendung von Arginin und/oder einer anderen Zusammensetzung erhöht werden, die hydrophobe Interaktionen aufbricht oder verhindert, wodurch der Dissoziations-pH angehoben wird, z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol, Ethanol, Propanol, Methanol und dergleichen. Ein höherer Dissoziations-pH gestattet das Entfernen von rPA bei normalerem pH als bei dem, bei dem Dissoziation andernfalls auftreten würde. Die Verwendung eines höheren pH, z.B. höher als etwa pH 3,7, führt auch zu weniger Beschädigung, z.B. Verlust von Sulfatierung oder Sialatierung oder Asp-Pro-Spaltungen an einigen Fc-enthaltenden Proteinen, z.B. rPSGL-Ig, aufgrund des niedrigeren pH, z.B. pH 3,7.
Zuvor konnten Q-Säulen nicht für die Dissoziation von rPA aus Fc-enthaltenden Proteinen verwendet werden (außer Fc-enthaltenden Proteinen, die hoch anionisch sind), weil der pH allgemein zu niedrig war, um die Bindung der Fc-Moleküle oder des rProteins A an der Q-Säule zu gestatten. Durch Anheben des Dissoziation-pH durch beispielsweise Verwendung von Arginin und/oder Ethylenglykol ist der Dissoziations-pH hoch genug, um die Verwendung der Q-Säule für Fc-enthaltende Moleküle unter Dissoziationsbedingungen, einschließlich solcher Moleküle, die nicht hoch anionisch sind, zu gestatten.
Auch konnten zuvor IMAC-Säulen nicht unter Dissoziationsbedingungen, z.B. niedrigem pH, verwendet werden, wiederum weil die Fc-enthaltenden Moleküle und das rPA nicht an der IMAC unter den normalerweise niedrigem pH gebunden bleiben konnten, der für das Auftreten der Dissoziation notwendig war. Durch das Anheben der Dissoziations-pH durch beispielsweise die Verwendung von Ethylenglykol bleibt das Fc-enthaltende Protein an der IMAC-Säule gebunden, so dass die IMAC-Säule verwendet werden kann, um rProtein A zu entfernen.
Eine HIC-Säule kann auch für die Entfernung von rPA aus Fc-enthaltenden Molekülen bei einem normaleren pH verwendet werden, als dem, bei dem die Dissoziation normalerweise auftreten würde, indem der Dissoziations-pH angehoben wird, z.B. durch Verwendung von Arginin und/oder Ethylenglykol.
Dissoziation von rPA und rPSGL-Ig unter IMAC-Bedingungen
Das nachfolgende Beispiel beschreibt die Charakterisierung geeigneter Bedingungen zur Entfernung von rProtein A aus rPSGL-Ig unter Verwendung der IMAC-Säule, der HIC-Säule und der Q-Säule. Um einen rPA-Entfernungsschritt für die IMAC-Säule zu entwickeln, der rProtein A entfernt, während das rPSGL-Ig an der IMAC-Säule absorbiert ist, müssen Bedingungen entwickelt werden, die keine gelierenden Agenzien enthalten, z.B. Citrat oder Aminosäuren, z.B. Arginin, und die relativ hohe Salzkonzentrat aufweisen müssen, um ionische Interaktionen mit sowohl der IMAC-Oberfläche als auch der rPSGL-Ig-Oberfläche zu minimieren. Es wurde in diesem Experiment Arginin verwendet, um die mögliche Nützlichkeit von Arginin mit der Q-Säule oder der HIC-Säule zur Entfernung von Protein A zu untersuchen.
Um die Dissoziation von rPSGL-Ig und rProtein A zu charakterisieren, wurde eine rProtein A-Säule, wie oben beschrieben, vorbereitet. Die rProtein A-Säule wurde mit 20 mM Tris pH 7,8, 200 mM NaCl equilibriert. rPSGL-Ig wurde auf die rPA-Säule geladen. Es wurde 5 M NaCl zugefügt, um die Leitfähigkeit auf 25–30 mS/cm anzuheben, und die Säule wurde mit Tris-HCl oder Tris-Base auf pH 7,8 titriert. Die Säule wurde für 4 ev mit Equilibrierungspuffer gewaschen. Die getesteten Elutionsbedingungen beinhalten das folgende:
Elution 1: 50 % Ethylenglykol (EG), 200 mM NaCl, 20 mM Na Acetat pH etwa 5,7;
Elution 2: 50 % EG, 200 mM NaCl, 20 mM Na Acetat pH etwa 5,7, und 500 mM Arginin;
Elution 3: 50 % EG, 1 M NaCl, 20 mM Na Acetat, pH etwa 5,0; und
Elution 4: 50 % EG; 1 M NaCl, 20 mM Na Acetat, pH etwa 5,0, und 500 mM Arginin.
Alle Elutionen sind 5 cv bei 2 ml/min. Eine endgültige Elution wurde mit 20 mM Citrat, pH etwa 2,7 durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass der rPSGL-Ig/rProtein A-Komplex mit Elution 2 aufgebrochen werden kann, z.B. mit einem pH um 5,7 herum, und auch mit Elution 3, z.B. mit einem pH um 5,0 herum, aufgebrochen wird. Die IMAC-Säule konnte aufgrund der Zugabe von Arginin nicht mit Elution 2 verwendet werden. Die Resultate zeigten an, dass 3 cv von Elution 3 (50 % EG, 1 M NaCl, 20 mM Na Acetat, pH von etwa 5,0), wenn auf eine IMAC-Säule aufgebracht, das rPA aus dem gebundenen rPSGL-1 dissoziieren konnte und eine signifikanten Anteil des rPA aus dem rPSGL-Prozessverlauf entfernen konnte.
Die Resultate zeigten auch, dass grob 20 % des rPA vom rPSGL-Ig in einer 2 cv-Waschung mit Emulsion 2 herunterkommen würden (50 % EG, 200 mM NaCl, 20 mM Na Acetat, pH von etwa 5,7, und 500 mM Arginin), falls PSGL-IG an einem anderen Harz gebunden war, z.B. einer Q-Säule oder einer HIC-Säule. Eine Q-Säule kann zur Entfernung von Protein A durch Anheben des Dissoziations-pH mit Arginin und beispielsweise einer Zusammensetzung oder einem Agens, das hydrophobe Wechselwirkungen aufbricht, wie etwa beispielsweise Ethylenglykol (EG) verwendet werden. Beispielsweise wird die Q-Säule bei einem pH von etwa zwischen 5 und pH 5,7 mit beispielsweise 200 mM NaCl, 15 % Ethylenglykol und 20 mM Na-Acetat und 500 mM Arginin gewaschen. Eine HIC-Säule kann auch zur Entfernung von Protein A bei einem erhöhten Dissoziations-pH verwendet werden.
Ein pH-Gradient mit 50 % EG, 1 M NaCl auf einer rProtein A-Säule mit PSGL wurde verwendet, um den Maximal-pH zu bestimmen, der von der IMAC verwendet werden kann, um Protein A aus rPSGL-Ig zu entfernen. Eine rProtein A-Säule wurde wie oben beschrieben vorbereitet und es wurde ein Gradient von pH 5,7 bis pH 5,0 getestet.
Die Ergebnisse zeigten an, dass das rPSGL-Ig/rProtein A-Aggregat nahezu vollständig bei pH 5,3 mit 50 % Ethylenglykol und 1 M NaCl, 20 mM Na Acetat getrennt werden kann. Das rPSGL-Ig/rProtein A-Aggregat kann bis zu einem pH 5,0 mit 50 % EG und 1 M NaCl, 20 mM Na Acetat teilweise aufgebrochen werden. Es kann rPSGL-Ig aus der rPA-Säule bei pH-Werten bis zu 5,5 eluiert werden und kann relativ gut bei pH 5,3 und 50 % EG, und optional 1 M NaCl, eluiert werden, obwohl die hohe NaCl-Konzentration für die Elution nicht notwendig ist. NaCl bei einer Konzentration von betragsweise 50–200 mM würde optimal sein.
Elution bei einem höheren pH schneidet im Vergleich mit Elution bei pH 3,7 günstig ab, wo das rPSGL-Ig-Sulfatierung, und Sialatierung verlieren kann und Asp-Pro-Spaltungen auftreten können, die bei niedrigem pH beschleunigt werden.
Die Dissoziation von rPA und rPSGL-Ig unter HIC-Bedingungen und Säulenbedingungen.
Um die Dissoziationseigenschaften von rPSGL-Ig und rPA in HIC-Elutionsbedingungen und Q-Säulenwaschbedingungen zu bestimmen, wurde ein pH-Gradient von pH 6 bis pH 4 über 20 cv in 20 mM Citrat, 500 mM Arginin und 500 mM Ammoniumsulfat gefahren, um die HIC-Elutionsbedingungen genau nachzuahmen. Die HIC-Elutionsbedingungen sind etwa 0,5 mM Ammoniumsulfat.
Eine rProtein A-Säule wurde, wie oben beschrieben, vorbereitet. Die Säule wurde zuerst mit 20 mM Tris pH 7,8, 200 mM NaCl equilibriert. Die Säule wurde mit rPSGL-Ig beladen und mit Tris-HCL oder Tris-Base zu pH 7,8 titriert und für 4 cv mit Equilibrierungspuffer gewaschen. Der Gradient wurde von 20 mM Citrat, 500 mM Arginin und 500 mM Ammoniumsulfat pH 6 zu 20 cv in 20 mM Citrat, 500 mM Arginin und 500 mM Ammoniumsulfat pH 4 gefahren.
Die Ergebnisse zeigten an, dass die rPrA/rPSGL-Ig-Assoziation bei etwa pH 4,2 mit 500 mM Arginin, 0,5 M Ammoniumsulfat und 20 mM Citrat aufgebrochen werden kann, in Kontrast zu einem pH von etwa 3,7 ohne Arginin. Diese Ergebnisse zeigen an, dass Arginin die Dissoziationseigenschaften von rPSGL-Ig und rPrA stark beeinflussen kann. Das Fahren einer HIC-Säule bei etwa pH 4,1 entfernt das rPA aus dem Prozessstrom, was es dem rPSGL-Ig gestattet, rPA-frei zu eluieren. Die HIC-Säule kann bei pH 4,1 mit einem acv-Waschschritt bei pH 4,1 unmittelbar zuvor, beide in 500 nM Arginin, gefahren werden. Alternativ kann das Eluieren der HIC-Säule bei pH 4,1 mit 500 mM Arginin, aber nicht waschen vor dem Arginin, ebenfalls rPA reduzieren.
Ein Ethylenglykolgradient wurde von 9 % bis 50 % über 20 cv in 20 mM Acetat, 500 mM Arginin und 500 mM Ammoniumsulfat gefahren. Die Resultate zeigen an, dass das meiste rPSGL-Ig komplett vom PrA bei 30 % Ethylenglykol, pH 4,7 und 500 mM Arginin dissoziiert ist.
Darüber hinaus kann 2 LRV von rPA durch Eluieren des rPSGL-Ig in 500 mM Arginin, 400 mM Ammoniumsulfat, pH 4,1, nach Waschen der HIC-Säule mit 500 mM Arginin, 1,2 M Ammoniumsulfat, pH 4,1 beeinflusst werden.
Es wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Zugabe von Arginin und das Steigern des pH die Elutionsbedingungen von rPSGL-Ig auf der HIC-Säule verändert und das rPSGL-Ig vom rPA auf der HIC-Säule mit einer rPA-enthaltenden Ladung besser auflöst.
Die Resultate zeigen an, dass 1,1 LRV von rPA bei Elutionsbedingungen bei pH 4,1 beeinflusst waren, 0,9 LRV bei Elutionsbedingungen bei pH 4,3 beeinflusst waren und 0,7 LRV bei Elutionsbedingungen bei pH 4,5 beeinflusst waren.
Eine Q-Säule kann auch verwendet werden, um den rProtein A/rPSGL-Ig-Komplex durch die Zugabe einer Zusammensetzung oder eines Mittels, das dazu dient, hydrophobe Interaktionen zu trennen, z.B. Ethylenglykol, bei einer Konzentration, die hinreicht, um den pH auf einen Pegel anzuheben, der es dem Fc-enthaltenden Molekül gestattet, an der Säule zu binden, verwendet werden kann, um das rProtein A mit einer Q-Säule zu trennen. Beispielsweise kann ein pH von zwischen 5,5 und 5,7, vorzugsweise etwa 5,5 verwendet werden.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Dissoziieren Fc-enthaltender Moleküle aus Komplexen von Protein A/Fc-enthaltenden Molekülen in einer Mischung, umfassend Kontaktieren der Mischung mit einer hydrophoben Interaktionschromatographiesäule unter pH-Bedingungen zwischen 4,1 und 4,5, wobei die pH-Bedingungen durch Zugabe von Arginin zu der Mischung hergestellt werden und die Säule mit einem Arginin enthaltenden Puffer gewaschen wird, um Fc-enthaltende Moleküle von Komplexen aus Protein A/Fc-enthaltenden Molekülen abzutrennen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei weiterhin ein Agens, das hydrophobe Wechselwirkungen vermindert oder inhibiert, zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Agens ausgewählt wird aus Ethylenglykol, Propylenglykol, Ethanol, Propanol und Methanol.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Agens Ethylenglykol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend Eluieren der Fc-enthaltenden Moleküle aus der hydrophoben Interaktionschromatographiesäule, so dass die Fc-enthaltenden Moleküle im wesentlichen frei von Protein A sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die pH-Bedingungen 4,1 sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fc-enthaltende Molekül rPSGL-Ig ist.