ES2266535T3 - Procedimientos relativos a la purificacion de proteinas altamente anionicas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para disociar moléculas que contienen Fc a partir de complejos de moléculas que contienen proteína A/Fc en una mezcla, que comprende poner en contacto la mezcla con una columna de cromatografía de interacciones hidrofóbicas bajo condiciones del pH entre 4, 1 y 4, 5, en donde las condiciones del pH se establecen mediante la adición de arginina a dicha mezcla y dicha columna es lavada con una solución tampón que contiene arginina para disociar las moléculas que contienen Fc de los complejos de moléculas que contienen proteína A/Fc.
Description
Procedimientos relativos a la purificación de
proteínas altamente aniónicas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para disociar moléculas conteniendo Fc (fragmento
cristalizable) a partir de complejos de moléculas que contienen
proteínas A/Fc en mezclas.
La purificación de proteínas objetivo se suele
dificultar por la deficiente extracción del ADN debido a las
interacciones ADN/proteína. Dichas interacciones son más
problemáticas en la purificación de proteínas objetivo altamente
aniónicas, por ejemplo, proteínas sulfatadas. La purificación de
proteínas, por ejemplo, proteínas que contienen dominios de
inmunoglobulina suele ser también difícil sobre la base del bajo pH
de disociación necesario para separar moléculas que contienen Fc
desde proteína A. La identificación de procedimientos útiles para
la extracción de ADN a partir de las proteínas objetivo y la
identificación de procedimientos para extraer la proteína A desde
proteínas objetivo sería de muy ventajosa en la purificación de
varias proteínas.
La Publicación Internacional Nº WP 01/72769
describe procedimientos para aislar y purificar proteínas objetivo
altamente aniónicas y proteínas objetivo que comprenden dominios de
inmunoglobulina, por ejemplo proteínas sulfatadas. Las proteínas
aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa neta. Las
proteínas sulfatadas son proteínas en las que la carga negativa
neta es debida a por lo menos un (1) residuo sulfatado. La
sulfatación de una proteína objetivo se refiere a la sustitución de
al menos un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de una proteína
objetivo se refiere a la sustitución de al menos un grupo hidroxilo
(-OH) con -SO_{4}H en o entre los aminoácidos contenidos dentro
de la proteína objetivo. En una forma de realización preferida, la
proteína sulfatada tiene al menos un (1) grupo de sulfatos. Las
proteínas sulfatadas que contienen al menos dos (2), tres (3),
cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más grupos de sulfatos son
abarcadas también por los procedimientos actuales, por ejemplo,
seis grupos de sulfatos sobre las tirosinas
N-terminal según se materializa en
PSGL-1 (ligando de P-selectina
glicoproteína-1).
En particular, la Publicación Internacional Nº
WP 01/72769 se refiere, en un aspecto, a un procedimiento para
purificar proteínas objetivo altamente aniónicas, que comprende las
etapas de cromatografía de intercambio iónico bajo condiciones
apropiadas para la purificación de las proteínas objetivo. Como
ejemplo, el procedimiento dado a conocer consiste en: (1) poner en
contacto la muestra con un sustrato capaz de unir, de forma
reversible, las moléculas cargadas, de tal modo que las proteínas
objetivo queden ligadas con el sustrato (2); lavar el sustrato con
una primera solución de lavado bajo condiciones apropiadas, de modo
que una pluralidad de impurezas proteináceas y no proteináceas en
la muestra no quede ligadas o se eliminen por lavado de sustrato,
mientras que las proteínas objetivo altamente aniónicas permanezcan
ligadas; (3) eluir la muestra con una primera solución de elución
en la que dicha primera solución de elución comprende una solución
salina con una alta concentración molar y (4) recoger la muestra
eludía, que contenga las proteínas objetivo aniónicas
purificadas.
En una forma de realización, se da a conocer que
el pH de la primera solución de lavado es aproximadamente 4,0 a
8,0. En otra forma de realización, se da a conocer que el pH
aproximado de la primera solución de lavado es 6,5.
En una forma de realización preferida, se da a
conocer que la proteína objetivo altamente aniónica es una proteína
sulfatada y las impurezas incluyen una forma sulfatada de la
proteína objetivo.
La Publicación Internacional Nº WO 172769 da a
conocer también que la muestra eluída a partir de la purificación
de la cromatografía de intercambio iónico, que contienen las
proteínas objetivo purificadas, se puede purificar todavía más.
Esta purificación adicional, por ejemplo, comprende las etapas de
interacción hidrofóbica y/o cromatografía de quelatos metálicos,
bajo condiciones apropiadas para la purificación de las proteínas
objetivo altamente aniónicas. Por ejemplo, esta purificación
adicional proporciona las etapas de: (1) pasar la muestra eluída
que contenga las proteínas objetivo a través de una columna de
cromatografía de quelatos metálicos o una columna de cromatografía
de interacción hidrofóbica, de modo que la muestra eluída sea
capturada en la columna; (2) lavar la columna con una segunda
solución de lavado bajo condiciones apropiadas, de modo que se
disocien los complejos de ADN/histona contenidos en la muestra; (3)
eluir la muestra con una segunda solución de elución y (4) recoger
la muestra eluída, que contiene las proteínas objetivo altamente
aniónicas purificadas.
En una forma de realización dada a conocer, la
segunda solución de lavado comprende una alta concentración salina
y la segunda solución de elución comprende una más baja
concentración salina que la segunda solución de lavado. Por
ejemplo, bajo condiciones de cromatografía de interacción
hidrofóbica, la concentración de sal en la segunda solución de
lavado es de aproximadamente 4 m y la concentración de la sal en la
segunda solución de elución es de aproximadamente 0,48 m. Como
alternativa, bajo la cromatografía de interacción hidrofóbica, la
segunda solución de lavado se selecciona a partir del grupo
constituido por (a) una solución que contiene NaCl a
aproximadamente 4 m y Tris a aproximadamente 20 mM y un pH
aproximado de 7,4, (b) una solución que contiene isopropanol a
aproximadamente 5% y sulfato amónico a aproximadamente 1,2 M, (c)
una solución de etanol a aproximadamente 5% y sulfato amónico a
aproximadamente 1,2 M, (d) una solución de etanol de aproximadamente
5% y NaCl a aproximadamente 4 M.
Además, se da a conocer que bajo las condiciones
de cromatográficas de quelación del hierro, por ejemplo, la segunda
solución de lavado comprende una concentración salina de
aproximadamente 2 M, y la segunda solución de elución comprende una
concentración salina de aproximadamente 200 mM a 1M. Como
alternativa, bajo las condiciones cromatográficas de la quelación
del hierro, la segunda solución de lavado comprende MES a
aproximadamente 40 mM, NaCl a aproximadamente 2 M e imidazol a
aproximadamente 5 mM y la segunda solución de elución comprende una
solución de MES a aproximadamente 40 mM, NaCl a aproximadamente 1 M
e imidazol a aproximadamente 35 mM.
La Publicación Internacional WP 01/72769 da a
conocer que las proteínas objetivo tienen al menos una (1)
sulfatación. Las proteínas objetivo aniónicas que tienen al menos
dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más
sulfataciones son también dadas a conocer; por ejemplo, proteínas
PSGL-1. Las proteínas aniónicas capaces de
purificarse por los procedimientos dados a conocer pueden ser
proteínas que se presentan de forma natural o proteínas
recombinantes.
En la Publicación Internacional WP 01/72769 se
da a conocer también un procedimiento para la purificación de
proteínas altamente aniónicas que comprenden un dominio de
inmunoglobulinas (p.e. un dominio de inmunoglobulina Fc) por
ejemplo, una proteína de fusión PSGL-Ig). Este
procedimiento dado a conocer comprende las etapas de: (1) poner en
contacto la muestra con un sustrato capaz de ligar la parte de Fc de
la proteína objetivo, que tiene un dominio de inmunoglobulina, de
modo que las moléculas objetivos queden ligadas al sustrato; (2)
lavar el sustrato con una primera solución de lavado bajo
condiciones adecuadas para eliminar por lavado los contaminantes
contenidos en la muestra; (3) eluir la muestra con una primera
solución de elución en el que el pH de la primera solución de
elución es bajo, por ejemplo, aproximadamente 4,0, preferentemente
3,7 y (4) recoger la muestra eludía, que contiene las proteínas
objetivo aniónicas purificadas.
Se da a conocer, además, que la muestra eluída
del sustrato ligante de Fc, que contiene las proteínas objetivo
altamente aniónicas purificadas, con un dominio de inmunoglobulina,
se puede purificar todavía más. Por ejemplo, la purificación
adicional comprende las etapas de: (1) poner en contacto la muestra
eluída que contiene las proteínas objetivo aniónicas purificadas,
que comprenden un dominio de inmunoglobulinas, con un sustrato capaz
de ligar reversiblemente las moléculas cargadas, de modo que una
pluralidad de impurezas proteináceas y no proteináceas en la
muestra, no queden ligadas ni sean eliminadas por lavado del
sustrato, mientras que las proteínas objetivo permanezcan ligadas
al sustrato; (2) lavar un sustrato con una segunda solución de
lavado, en el que el pH de la segunda solución de lavado es bajo,
por ejemplo, aproximadamente 4,0, preferentemente 3,8, (3) eluir la
muestra con una segunda solución de elución y (4) recoger la muestra
eluída que contiene las proteínas objetivo aniónicas purificadas
con un dominio de inmunoglobulinas.
En un aspecto, se da a conocer que las proteínas
objetivo que comprenden un dominio de inmunoglobulinas tienen al
menos una (1) sulfatación. Proteínas que comprenden inmunoglobulinas
con al menos dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o
más sulfataciones son también dadas conocer por la Publicación
Internacional Nº WO 01/72769, por ejemplo la
PSGL-Ig.
En una forma de realización preferida, los
procedimientos de purificación dados a conocer proporcionan
proteínas objetivo altamente aniónicas purificadas y proteínas
altamente aniónicas purificadas que comprenden un dominio de
inmunoglobulinas (por ejemplo, PSGL-Ig) al menos un
99,9% puras de proteínas contaminantes.
En otra forma de realización dada a conocer, los
procedimientos de purificación de la invención eliminan al menos un
95% o 2,5 log_{10} valor de reducción logarítmica (LRV) del ADN
contaminante desde las proteínas objetivo altamente aniónicas y las
proteínas altamente aniónicas que comprenden un dominio de
inmunoglobulinas.
Sin embargo, un procedimiento para disociar
moléculas que contienen Fc desde complejos de moléculas que
contienen proteína A/Fc sería muy deseable.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para eliminar proteína A (p.e., rProteina A o rPA)
desde mezclas que contengan asociadas, mediante interacciones
hidrofóbicas, moléculas que contengan proteína A y Fc, tales como,
por ejemplo, moléculas de rPSGL-Ig. La elevación del
pH de disociación, entre pH 4,1 y 4,5, permite la separación de las
moléculas que contienen Fc, tales como moléculas de
rPSGL-Ig, desde la proteína A haciendo pasar la
mezcla a través de una columna de cromatografía de interacción
hidrofóbica (HIC), eliminando de este modo la proteína A desde la
mezcla. El pH de disociación se eleva mediante la adición de
arginina o cualquier composición o agente que reduzca (rompa) o
inhiba (impida) las interacciones hidrofóbicas incluyendo, sin
limitación, a etileno glicol, propileno glicol, etanol, propanol,
metanol y compuestos similares, en combinación con arginina. Un más
alto pH de disociación permite la extracción de rPA a un pH más
normal que ocurriría en la disociación, en caso de no ser así. El
uso de un pH entre 4,1 y 4,5 da lugar también a menos daños, por
ejemplo, pérdida de sulfatación o sialación o introducción de
segmentaciones de Asp-Pro, para algunas proteínas
que contienen Fc debido al pH más bajo, por ejemplo, pH 3,7.
Una columna de HIC se utiliza para la
eliminación de rPA desde moléculas que contienen Fc a un pH más
normal que la disociación que se produciría normalmente a través de
la elevación del pH de la disociación, mediante uso de arginina o
en combinación con etileno glicol.
La invención se refiere a un procedimiento para
disociar moléculas que contienen Fc a partir de complejos de
moléculas, conteniendo proteína A/Fc en una mezcla, que comprende
poner en contacto la mezcla con una columna de cromatografía de
interacción hidrofóbica bajo condiciones de pH entre 4,1 y 4,5, en
el que las condiciones del pH se establecen mediante la adición de
arginina a dicha mezcla y dicha columna se lava con una solución
tampón que contiene arginina para disociar las moléculas que
contienen Fc desde los complejos de moléculas que contienen
proteína A/Fc.
En una forma de realización preferida, las
condiciones del pH son 4,1.
En otra forma de realización, las moléculas que
contienen Fc es rPSG-Ig.
En otra forma de realización, el procedimiento
de la invención comprende, además, eluir las moléculas que
contienen Fc desde la columna de cromatografía de interacciones
hidrofóbicas, de modo que dichas moléculas que contienen Fc estén
sustancialmente libres de la proteína A.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente memoria descriptiva
detallada y de las reivindicaciones.
La presente invención consiste, al menos en
parte, en dar a conocer un nuevo procedimiento para purificar
proteínas objetivo altamente aniónicas y proteínas altamente
aniónicas, que comprenden un dominio de inmunoglobulinas, por
ejemplo, proteínas sulfatadas (p.e., PSGL-1). Las
proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa
neta. Las proteínas sulfatadas son proteínas aniónicas en las que la
carga negativa es debida al menos una, o más preferentemente, cinco
(5) o más sulfataciones, por ejemplo, al menos seis (6)
sulfataciones. Las sulfataciones en una proteína objetivo se
refieren a la sustitución de al menos un grupo hidroxilo (-OH) con
-SO_{4}H en o entre aminoácidos contenidos dentro de la proteína
objetivo. Las sulfataciones pueden ocurrir, por ejemplo, en las
tirosinas de N-terminal, según se materializa en
PSGL-1.
La presente invención está basada, también en
parte, en un nuevo procedimiento para eliminar proteína A (p.e.
rProteina A o rPA) desde mezclas que contienen asociadas, por
ejemplo mediante interacciones hidrofóbicas, moléculas que
contienen proteína A y Fc, tales como, por ejemplo, moléculas de
rPSGL-Ig. Utilizando condiciones de pH entre 4,1 y
4,5 se permite la separación de las moléculas que contienen Fc,
tales como rPSGL-Ig, respecto a la proteína A,
haciendo pasar la mezcla a través de una columna de cromatografía de
interacciones hidrofóbicas (HIC), eliminando de este modo la
proteína A de la mezcla. El pH de disociación es elevado mediante la
adición de arginina o cualquier composición o agente que reduce
(rompe) o inhibe (impide) las interacciones hidrofóbicas que
incluyen, sin limitación, a etileno glicol, propileno glicol,
etanol, propanol, metanol y compuestos similares en combinación con
arginina. Un pH de disociación más alto permite la eliminación de
rPA a un pH más neutro que el pH en el que tendría lugar la
disociación, no siendo de este modo. La utilización de un pH más
alto, por ejemplo, mas alto que 3,7, resulta también en menos
daños, por ejemplo, pérdida de sulfatación o sialación o
introducción de segmentaciones de Asp-Pro para
algunas proteínas que contienen Fc debido al más bajo pH, por
ejemplo, pH 3,7.
Los agentes o composiciones preferidas que
reducen (rompen) o inhiben (impiden) las interacciones hidrofóbicas
incluyen, sin limitación, a etileno glicol, propileno glicol,
etanol, propanol, metanol y compuestos similares. Particularmente
preferido es el etileno glicol para uso en disociar moléculas que
contengan proteína A y Fc. Las composiciones o agentes que reducen
(rompen) o inhiben (impiden) las interacciones hidrofóbicas se
pueden utilizar en cualquier concentración que aumente
satisfactoriamente el pH lo suficiente para permitir la separación
del complejo de moléculas que contienen proteína A/Fc utilizando una
columna cromatográfica incluyendo, por ejemplo, márgenes de
concentraciones de, por ejemplo, etileno glicol entre 10%-50%,
10%-40%, 20%-40% y 20%-30%. Las concentraciones preferidas de
composiciones o agentes que reducen (rompen) o inhiben (impiden)
interacciones hidrofóbicas, por ejemplo, etileno glicol, incluyen
10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 13%, 14%, 15%,
16%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%,
32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%,
45%, 46%, 47%, 48%, 49% y 50%. Especialmente preferido para la
disociación de compuestos que contienen Fc, por ejemplo,
rPSGL-Ig y proteína A, es el etileno glicol a una
concentración de
50%.
50%.
La columna de cromatografía HIC se utiliza para
separación de moléculas que contienen Fc, por ejemplo
rPSGL-Ig, respecto de la proteína A, cuando se
emplean con un pH suficiente para eliminar una cantidad sustancial
de proteína A. Las moléculas que contienen proteína A y Fc se
disocian utilizando una columna de HIC en condiciones del pH entre
4,1 y 4,5, aniónicas un pH de 4,1, en donde las condiciones del pH
se establecen mediante la adición de arginina a dicha mezcla y se
lava dicha columna con una solución tampón que contiene arginina.
La columna de HIC se puede hacer funcionar a un pH de 4,1 con un
lavado de acv a pH 4,1 realizado inmediatamente antes, en arginina
de 500 mM para eliminar la proteína A desde el complejo de moléculas
que contienen proteína A/Fc.
Tal como aquí se utiliza, la expresión
"eliminación de una cantidad sustancial" de proteína A se
refiere a la eliminación de 10%-20%, 20%-30%, 30%-40% y 40%-50%,
50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 50%-90% o preferentemente, 90%-100% de
proteína A desde complejos de moléculas que contienen proteína A
para Fc. Preferentemente, se elimina un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, 80%, 90% y 100% de proteína A.
Tal como aquí se utiliza, la eliminación de
proteína A de modo que las moléculas que contienen Fc queden
sustancialmente libres de proteína A se refiere a la eliminación de
10%-20%, 20%-30%, 30%-40% y 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%,
50%-90% o preferentemente, 90%-100% de proteína A desde los
complejos de moléculas que contienen proteína A/Fc, por ejemplo, en
una mezcla. Preferentemente se elimina un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, 80%, 90% o 100% de proteína A.
En una forma de realización preferida, la
proteína sulfatada es PSGL-1, por ejemplo,
PSGL-1 que comprende el conjunto de aminoácidos
dado a conocer en la patente de los Estados Unidos Nº 5.827.817,
cuyo contenido está incorporado en esta memoria por referencia o
bien, una parte activa de dicho conjunto. La secuencia completa de
aminoácidos de la proteína PSGL-1 (p.e., el péptido
maduro más la secuencia líder) está caracterizada por la secuencia
de aminoácidos dada a conocer en la patente de los Estados Unidos
5.827.817, desde el aminoácido 1 al aminoácido 402 y aquí dada a
conocer como ID SEQ Nº 1. El análisis de la hidrofobicidad y su
comparación con los modelos de segmentación conocidos predicen una
secuencia de señales de 20 a 22 aminoácidos, p.e., aminoácidos 1 a
20 o aminoácidos 1 a 22 de PSGL-1.
PSGL-1 contiene un sitio de segmentación
(-Arg-Asp-Arg-Arg-)
de PACE (enzima de conversión de aminoácidos básicos pareados) en
residuos de aminoácidos 38-41. La proteína
PSGL-1 madura está caracterizada por la secuencia de
aminoácidos establecida en SED ID Nº 1 desde el aminoácido 42 al
aminoácido 402. Una forma soluble de la proteína de ligandos de
P-selectina está caracterizada por los aminoácidos
21 a 310 de la secuencia de aminoácidos dada a conocer en la patente
de los Estados Nº 5.827.817. Otra forma soluble de la proteína
PSGL-1 madura está caracterizada por la secuencia de
aminoácidos dada a conocer en la patente de los Estados Unidos
5.827.817 desde el aminoácido 42 al aminoácido 310. La forma soluble
de la proteína de ligandos de P-selectina está
caracterizada, además, por ser soluble en solución acuosa a la
temperatura ambiente.
Las proteínas de fusión de
PSGL-1 (p.e. PSGL-Ig) se pueden
obtener utilizando las enseñanzas reconocidas de la técnica y
empleando las enseñanzas de la patente de los Estados Unidos Nº
5.827.817 aquí incorporada por referencia. Los fragmentos de la
proteína PSGL-1 se pueden fundir para moléculas
portadoras tales como inmunoglobulinas para aumentar la valencia de
sitios de enlace de ligandos de P-selectina. Por
ejemplo, formas solubles de proteína de ligandos de
P-selectina, tales como los fragmentos desde el
aminoácido 42 al aminoácido 295 o desde el aminoácido 42 al
aminoácido 88 de SEQ ID Nº:1 se pueden fundir mediante secuencias
"ligantes" a la parte de Fc de una inmunoglobulina (secuencia
nativa o secuencias mutadas para conferir propiedades deseables
(tal como más larga semivida o inmunogenecidad reducida) a la
quimera resultante). Para una forma bivalente de la proteína de
ligandos de P-selectina, tal como una fusión, podría
ser la parte de Fc de una molécula de IgG (p.e.,
rPSGL-Ig). Otros isotipos de inmunoglobulina se
pueden utilizar también para generar dichas fusiones. Por ejemplo,
una fusión de IgM - proteína de ligandos de
P-selectina generaría una forma decavalente de la
proteína de ligandos de P-selectina según la
invención.
Tal como aquí se utilizan, los términos
"proteína que contiene Fc" o "molécula que contiene Fc"
incluyen cualquier proteína que se funde con, o incluye, una parte
de Fc de una inmunoglobulina. Un ejemplo de una proteína que
contiene Fc es rPSGL-Ig.
PSGL-1 es una glicoproteína que
puede contener uno o más de los carbohidratos terminales
siguientes:
donde R = resto de la cadena de
carbohidratos, está de forma covalente unida directamente a la
proteína de ligandos de P-selectina o a una mitad
molecular de lípidos que está, de forma covalente, unida a la
proteína de ligandos de P-selectina.
PSGL-1 puede sulfatarse adicionalmente o de otro
modo, modificarse posteriormente a su traducción, tal como se
expresa en las células de COS y CHO, la proteína de ligandos de
P-selectina de longitud completa es una proteína
homodimérica, que tiene un peso molecular aparente de 220 kD tal
como se demuestra por la electroforesis de gel de
SDS-poliacrilamida no
reductora.
La estructura de la secuencia
PSGL-1 de longitud completa incluye un dominio
extracelular (desde aproximadamente el aminoácido 21 al 310), un
dominio de transmembrana (desde aproximadamente 311 al 332) y un
dominio citoplásmico intracelular (desde aproximadamente el
aminoácido 333 al 402). El dominio extracelular contiene tres sitios
de tripéptidos de consenso
(Asn-X-Ser/Thr) de glicosilación de
enlaces N potencial comenzando en los residuos de Asn 65, 111 y
292. Además, el dominio extracelular contiene tres sitios
potenciales de sulfatación de tirosina en los residuos 46, 48, 51.
La región constituida por residuos 55-267 contiene
un alto porcentaje de prolina, serina y treonina incluyendo un
subdominio de quince repeticiones decaméricas de la secuencia de
consenso de 10 aminoácidos
Ala-Trh/Mt-Glu-Ala-Gln-Thr-Thr-X-Pro/Leu-Ala/Thr,
en donde X puede ser Pro, Ala, Gln, Glu o Arg. Regiones tales como
éstas son características de proteínas altamente
O-glicosiladas.
Las supresiones sustanciales de la secuencia de
PSGL-1 se pueden realizar mientras se mantiene la
actividad de proteínas de ligandos de P-selectina.
Por ejemplo, la PSGL-1 comprendiendo la secuencia
desde el aminoácido 42 al aminoácido 189, la secuencia desde el
aminoácido 42 al aminoácido 118 o la secuencia desde el aminoácido
42 al aminoácido 89 de SEQ ID Nº: 1, mantienen cada una la actividad
ligante de proteínas de PSGL-1
P-selectina y la capacidad para el enlace con
P-selectina. Las proteínas de
PSGL-1, en la que uno o más sitios de glicosilación
con enlaces de N (tal como en los aminoácidos 65, 111 y 292) han
sido cambiados a otros aminoácidos o suprimidos, conservando
también la actividad ligante de proteínas de
P-selectina y la capacidad para el enlace con
P-selectina. Las proteínas de ligandos de
P-selectina que comprenden desde el aminoácido 42 al
aminoácido 60 (que incluye una región altamente aniónica de la
proteína desde el aminoácido 45 al aminoácido 58) conservan también
la actividad proteínica de ligandos de P-selectina;
sin embargo, las proteínas de ligandos de
P-selectina, limitadas a dicha secuencia, no
enlazan con P-selectina. Preferentemente, una
aminoácido de ligandos de P-selectina conserva al
menos uno (más preferentemente al menos dos y más preferentemente
más todavía tres) de los residuos de tirosina encontrados 46, 48 y
51, cuya sulfatación puede contribuir a la actividad de proteína de
ligandos de P-selectina.
Además, esta invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos.
Todas las referencias a la secuencia de
aminoácidos de PSGL-1 están basadas en la secuencia
de aminoácidos de PSGL-1 establecida en la patente
de los Estados Unidos Nº 5.827.817 y aquí referida como SEQ ID Nº:
1.
Procedimientos: Procedimientos generales para
purificar proteínas se dan a conocer en Janson, J.C., y L. Ryden
(eds.) (Purificación de proteínas. Principios, métodos y
aplicaciones de alta resolución. VCH Publisher, Inc. New York
(1989), Patente de los Estados Unidos Nº 5.429.746, titulada
Purificación de anticuerpos y la patente de los Estados Unidos Nº
5.115.101, titulada Extracción de proteína desde las preparaciones
de anticuerpos.
Este ejemplo describe la purificación de una
proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante
cromatografía de columna.
Una proteína de ligandos de
P-selectina soluble fue expresada en células CHO y
los medios acondicionados fueron recogidos para purificación de la
proteína. Una columna de Q-Sepharosa^{TM} Fast
Flow (Amersham Pharmacia), con una profundidad de lecho de 8 cm,
fue preparada según las instrucciones del fabricante. La capacidad
de la columna para PSGL, en medios acondicionados, es de
aproximadamente 1 mg PSGL-ml resina.
La cromatografía de intercambio aniónico fue
realizada como sigue. Los medios acondicionados de CHO
microfiltrados fueron cargados en la columna a aproximadamente pH
7, con una conductividad menor que 20 mS/cm. La columna fue lavada
con 20 mM de histidina, 400 mM de NaCl, pH 6,5 para eliminar la
rPSGL-1g hiposulfatada, por ejemplo, 4 o menos
sulfataciones. Las etapas de carga y de lavado fueron realizadas en
3,5 cm/minuto. La columna fue eluída a pH 6,5 con una solución 1M
de NaCl, 20 mM de histidina, pH 6,5 a <1,1 cm/minuto. El pH de
esta etapa podría estar comprendido entre pH 4 y 8, pero es
preferentemente pH 6,5. El pico eluído contiene
PSGL-Ig, ADN e histonas así como otros
contaminantes. La columna Q tiene el ADN ligado mientras que las
histonas se añaden al ADN. La elución de PSGL (causada al elevar la
concentración de sal) coincide con la elución de ADN. La pureza de
PSGL-Ig es >80%. Solamente el 50% del ADN es
eliminada mediante esta etapa.
Bajo estas condiciones se purifican
preferentemente moléculas de rPSGL-Ig
hipersulfatadas, por ejemplo, cinco o seis sulfataciones. El
rPSGL-Ig activo tiene, en condiciones ideales, cinco
o seis sulfataciones en las tirosinas de terminales N.
El eluente procedente de la columna de
intercambio aniónico fue purificado todavía más utilizando una
columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) como
sigue.
Una columna de Phenyl Toyopearl 650ºC (Rohm y
Haas) con una profundidad de lecho de 9 cm fue preparada según las
instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna de HIC es
de aproximadamente 3,5 mg PSGL-ml resina. La
columna fue equilibrada en 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH
7,4 a \leq 1,3 cm/minuto. El efluente procedente de la columna de
Q Sepharose fue ajustado a 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH
7,5 añadiendo solución de 3 M de sulfato amónico, 50 mM Tris, pH
7,4 y fue cargado en el HIC. Como alternativa, la carga pudo
realizarse en 4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato amónico. La
columna fue lavada con 1,2 de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4.
Las etapas de carga y de lavado se realizaron a una velocidad
aproximada de 1,3 cm/minuto. La columna de HIC fue eluída con 0,48
M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 a una velocidad de 0,65
cm/minuto. Bajo estas condiciones, la columna de HIC elimina
primariamente las histonas de H2A y H2B, que no enlazan con el ADN
tan estrechamente como las histonas H3 y H4. Las histonas H2
aparecen en la fracción de lavado y el pico contiene histonas H3 y
H4 y algunas histonas H2. Además, una gran pluralidad del ADN
permanece en las histonas y es objeto de elusión en el pico. El
producto tiene una pureza superior al 95% de proteínas
contaminantes y un 85% del ADN se elimina mediante esta etapa.
El eluente procedente de la columna HIC fue
purificado todavía aún más purificando una columna de cromatografía
de quelatos metálicos (IMAC) como sigue.
Una columna de IMAC Copper (II) de Fractogel
Chelate (M) (E. Merck) fue preparada según las instrucciones del
fabricante. La columna de IMAC tenía una profundidad de lecho de
6,47 2 cm y una capacidad de aproximadamente 6,6 mg PSGL/mL
resina.
La columna fue equilibrada con 50 mm de fosfato
potásico (KPO_{4}), 2,0 M de NaCl, 2 mM de imidazol, pH 7 para 5
cv a \leq 5 cm/minuto. El eluente procedente de la columna HIC fue
ajustado a 2 mM imidazol, 50 mM de KPO_{4}, pH 7 y 200 mM de NaCl
y cargado en la columna de IMAC. La columna fue lavada primero con
solución tampón equlibradora y luego fue lavada con 40 mM MES, 1 M
NaCl, 5 mM imidazol, pH 6,6 a \leq 5 cm/minuto. Esta baja
concentración de sal no rompe el complejo de histona/ADN en la
columna de IMAC. La columna fue eluída con 40 mM, 1 M NaCl, y 35 mM
de imidazol con un pH de 6,6. La columna de IMAC elimina
primariamente las histonas H3 y H4. Las histonas H3 y H4 y algunas
histonas H2 están en la banda, aunque algunas histonas H3 y H2 se
encuentran en el pico de IMAC. El producto resultante tiene una
pureza superior al 99,9% de proteínas contaminantes y esta etapa
elimina un 95% del ADN. Globalmente, hay unos 2,5 LRV de
aclaramiento del ADN a partir de este proceso completo.
Este proceso permitió el transporte de ADN a
través del tren completo del proceso, puesto que el ADN está
directamente ligado con la columna Q. En la etapa Q, el ADN está
también unido a las histonas (p.e., H2A, H2B, H3 y H4) que son
proteínas ligantes de ADN que se encuentran naturalmente y que están
presentes en nuestra carga a la columna Q. En la columna Q, por lo
tanto, había una especie de "emparedado", en el que el ADN está
ligado a la columna Q y las histonas están ligadas al ADN. En las
etapas posteriores, el "emparedado" fue invertido, puesto que
el ADN no está ligado directamente a la columna de HIC o la columna
de IMAC. En cambio, las histonas están ligadas a la columna de HIC
o IMAC y el ADN está ligado a las histonas. Cuando las histonas se
eluyen desde la columna de HIC o IMAC, transportan consigo la
contaminación del ADN. Una eliminación deficiente del ADN, debido a
las interacciones de ADN/proteína, pueden encontrarse, con
frecuencia, en la purificación de las proteínas, sobre todo en el
caso de proteínas objetivo altamente aniónicas y sobre todo, donde
estas proteínas aniónicas son eluídas desde una columna de
intercambio aniónico.
En este ejemplo se describe la purificación de
una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante
(rPSGL-Ig) mediante cromatografía de columna
incluyendo la etapa de disociar los complejos de histonas/ADN
contaminantes con sal o un alcohol, aumentando así la pureza de las
proteínas de PSGL-Ig.
Una etapa de cromatografía de intercambio
aniónico en Q Sepharose fue realizada según se describe en el
ejemplo 1.
El eluente procedente de la columna de
intercambio aniónico fue purificado todavía más utilizando una
columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) como
sigue. Una columna de Phenyl Toyopearl 650ºC (Rohm y Haas), con una
profundidad de lecho de 9 cm, fue preparada según las instrucciones
del fabricante y equilibrada en 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM
Tris y pH 7,4. El pH de esta etapa podía estar entre 6 y 8, pero es
preferentemente pH 7,4.
El pico de Q fue ajustado a 1,2 M de sulfato
amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 añadiendo 3 M de sulfato amónico, 50 mM
Tris pH 7,4 y cargado en la columna. Como alternativa, la carga
podría realizarse en 4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato
amónico.
La columna fue lavada con 1,2 M de sulfato
amónico, 20 mM Tris pH 7,4 seguido por un lavado con 4 M de NaCl,
20 mM Tris, pH 7,4. El lavado con 4 M de NaCl elimina un 90% (o 1
log_{10} reducción logarítmica o 1 LRV) del ADN desde la columna.
Como alternativa se pudo lavar con una solución al 5% de isopropanol
y 1,2 M de sulfato amónico. Esto elimina un 99,9% del ADN desde la
columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV).
Como alternativa, se pudo lavar con una solución
al 5% de etanol y 1,2 M de sulfato amónico. Esto elimina un 99,9%
de ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica",
o 3 LRV).
Como alternativa, se pudo lavar con una solución
al 5% de etanol y 4 M de NaCl. Esto elimina un 99,9% de ADN desde
la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Como
alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de isopropanol y
4 M de NaCl. Esto elimina un 99,9% de ADN desde la columna ("3
log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Las etapas de carga
y lavado se realizaron a una velocidad aproximada de 1,3 cm/minuto.
A continuación, la columna fue eluída con 0,48 m de sulfato amónico,
20 mM Tris, pH 7,4 a una velocidad de 0,65 cm/minuto.
Como se describió antes, esta HIC, con estas
condiciones, elimina primariamente las histonas H2A y H2B, que no
se enlazan con el ADN tan estrechamente como las histonas H3 y H4.
Las histonas H2 aparecen en el lavado. El pico contiene H3 y H4,
con algunas histonas H2. Sin embargo, hemos encontrado que lavando
con más alta concentraciones de sal, se puede romper la interacción
de ADN/histona. De este modo, lavando, por ejemplo, con 4 M de NaCl
en lugar de 1,2 M de sulfato amónico, el ADN se rompe separándose de
la histona y se elimina en el lavado. Bajo estas condiciones, una
gran pluralidad de ADN se elimina en el lavado y las histonas siguen
su elución en el pico. Esta etapa de HIC podría, como alternativa,
realizarse después de la etapa de IMAC (véase más adelante). Esto
podría resultar en un 99,9% de más eliminación del ADN (3 LRV).
El eluente procedente de la columna de HIC se
purificó todavía más utilizando una columna de cromatografía de
quelato metálico (IMAC) como sigue.
Una columna de IMAC Copper (II) en Fractogel
Chelate (M) (E. Merck) fue preparada siguiendo las instrucciones
del fabricante. La columna de IMAC tenía una profundidad de lecho de
6,4 a 7,2 cm y una capacidad aproximada de 6,6 mg PSGL/ml resina.
El pH de esta etapa puede estar comprendido entre 4,8 y 8, pero es
preferentemente de pH 6,6.
La columna fue equilibrada con 50 mM de fosfato
potásico (KPO_{4}), 2,0 M de NaCl, 2 mM de imidazol, pH 7 para 5
cv a \leq 5 cm/minuto. Como alternativa, la columna se puede
equilibrar a 200 mM de NaCl en lugar de 2 M de NaCl. El eluente
desde la columna de HIC fue ajustado a 2 mM de imidazol, 50 mM de
KPO4, pH 7, 200 mM de NaCl y cargado en la columna de IMAC. Como
alternativa, la carga se puede realizar a 200 mM de NaCl en lugar
de 2 M de NaCl.
La columna fue lavada primero con solución
tampón de equilibrado y luego fue lavada con 40 mM MES, 2M NaCl, 5
mM Imidazol, pH 6,6 a \leq 5 cm/minuto. La columna fue eluída con
40 mM MES, 1M NaCl, 35 mM imidazol con pH 6,6. La columna de IMAC
elimina primariamente las histonas H3 y H4. Estas histonas, y
algunas histonas H2, están en la banda. Algunas histonas H3 y H2 se
encuentran también en el pico de IMAC.
Esta etapa elimina un 90% más ADN que la etapa
de proceso I del ejemplo 1(1 LRV) utilizando la carga muy
salina o el lavado muy salino. La novedad de esta etapa es cargar
con 2 M NaCl o lavar con 2 M NaCl para eliminar el ADN de complejo
de histonas/ADN. Las histonas se adhieren a la columna de IMAC y el
ADN se adhiere a las histonas. Puesto que el ADN se une mejor al
complejo de H3/H4 que al de H3/H2 o a simplemente complejo de H2,
sería beneficiosa la eliminación del complejo de H3/H4 lo más pronto
posible en el proceso. De este modo, realizando el HIC después de
IMAC se ha demostrado que se puede conseguir más aclaración de ADN
(99,9% más aclaramiento o 3 LRV). Por lo tanto, introduciendo el
IMAC lo antes posible en el proceso se podría obtener una reducción
adicional de ADN. Sin embargo, IMAC como la primera etapa exigiría
una ultrafiltación / diafiltración para eliminar los aminoácidos de
pequeño peso molecular y otros grupos que contienen aminas desde la
carga.
En este ejemplo se describe un método
alternativo para la purificación de una proteína de fusión
PSGL-Ig recombinante, por ejemplo,
rPSGL-Ig, mediante cromatografía de columna. A
diferencia del plan de purificación descrito en el ejemplo 1, este
proceso utiliza una etapa de afinidad como la primera etapa de
purificación. La etapa de purificación de afinidad utiliza
rProteína A (también referida aquí como rPA) que enlaza con la parte
Fc de la quimera de rPSGL-Ig. El
rPSGL-Ig es eluido desde la columna de rProteína A
bajo pH, en este caso pH 3,7. La etapa de rProteína A proporciona
mejor aclaramiento si la columna se lava con 1 M NaCl después de la
carga. Esta concentración de sal es más alta que la que se suele
utilizarse (normalmente de 150 mM NaCl) y por lo tanto, es una
característica nueva. El aclaramiento del ADN desde esta etapa varía
desde el valor de 4 log_{10} reducción logarítmica (LRV) a 6 LRV
con la adición de esta etapa salina. Esto representa un incremento
de 100 veces en la eliminación de
ADN.
ADN.
La etapa de rProteína A no parece favorecer la
unión con las histonas y proporciona un buen aclaramiento del ADN.
De este modo, las histonas no están notablemente presentes en las
etapas que siguen a la etapa de rProteína A. Sin embargo, puesto
que la rProteína A es objeto de lixiviación desde la columna de
rProteína A, las etapas posteriores se realizan para eliminar la
rProteína A. Un procedimiento nuevo para eliminar la proteína A
lixiviada es cargar el eluato de proteína A directamente en la
columna Q, con un pH neutro o bajo o lavar la columna Q con bajo
pH. Las columnas Q no suelen funcionar a pH bajo y especialmente no
con pH 4. Por lo tanto, la captura del rPSGL-Ig
directamente desde el eluato de proteína A o el lavado de la columna
Q a bajo pH, o una combinación de ambos, es una característica
nueva. Puesto que el rPSGL-Ig y la rProteína A están
a bajo pH, una gran pluralidad de rPSGL-Ig no está
ligada a la rProteína A lixiviada. Como resultado, la rProteína A
no está ligada a la columna Q, sino que se encuentra en el flujo
pasante de columna Q. Ésta es también una característica nueva. Por
lo tanto, se está utilizando la columna Q para la eliminación de
rProteína A. Este nuevo método se puede utilizar para purificar
proteínas altamente aniónicas. Una columna de Protein A Fast Flow
(Arnersham Pharmacia), con una profundidad de lecho de 6 a 10 cm, se
prepara según las instrucciones del fabricante. La capacidad de la
columna es de aproximadamente 1 mg/mL a 5 mg/mL. La columna es
equilibrada con 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,2 a 8,
preferentemente pH 7,4. El medio acondicionado microfiltrado se
carga en la columna entre pH 7 y pH 8, preferentemente pH 7,4, a
una velocidad aproximada de 30-300 cm/hora,
preferentemente 150 cm/hora. La columna se lava con 20 mM Tris, 200
mM NaCl, pH 7 a 8, preferentemente pH 7,4 y es objeto de elución
con 20 mM citrato, pH 3 a 4, preferentemente pH 3,7, a una velocidad
de 50-300 cm/hora. La pureza es >95% para
proteínas y >99% del ADN se elimina mediante esta etapa.
El eluente procedente de la columna de rProteína
A se purifica todavía más en una columna Q Sepharose^{TM} Fast
Flow (Amersham Pharmacia) con una profundidad de lecho de 8 cm. La
capacidad de la columna Q Sepharose para PSGL a pH 3,6 a 4,0,
preferentemente pH 3,8, después de la etapa de rProteína A, es
aproximadamente > 6 mg PSGL/mL resina.
El pico de rProteína A se carga directamente en
la columna de Q Sepharose sin ajustar el pH o el pico se neutraliza
antes de la carga de la columna Q Sepharose. En uno u otro caso, la
columna se lava con 200 mM NaCl y 200 mM citrato a pH 3,5 a 4,
preferentemente pH 3,8, para eliminar la proteína A residual. Ambos
métodos eliminan la proteína A lixiviada, rPSGL-Ig
hiposulfatada, rPSGL-Ig recortada con
N-terminal y
pro-rPSGL-Ig (una especie
precursora para rPSGL-Ig que no tiene segmentación
enzimática del N-terminal). Después del lavado con
pH 3,5 a 4, la columna pudo lavarse con 20 mM histidina, 400 mM
NaCl, pH 6,5 para eliminar la rPSGL-Ig
hiposulfatada. Las moléculas de la rPSGL-Ig
hiposulfatada tiene cuatro o memos sulfataciones, mientras que el
PSGL-Ig activo tiene, en condiciones ideales, 5 ó 6
sulfataciones en las tirosinas de terminales N. Las etapas de carga
y lavado de la columna se realizan a una velocidad de 3,5
cm/minuto. La columna es eluída a pH 6,5 con 1 M NaCl, 20 mM de
histidina, con pH 6,5. Como alternativa, se pudo eluir a pH 3,5 a
4,0, preferentemente pH 3,8, en 500 mM NaCl, 20 mM citrato a
<1,1 cm/minuto. Las proteínas representan menos del 2% del valor
de pico.
Como alternativa, la rProteína A lixiviada se
puede eliminar a través de la elevación del pH de disociación del
complejo de proteína A/rPSGL-Ig. Elevando el pH de
disociación, el compuesto que contiene Fc, por ejemplo
rPSGL-Ig, se puede separar con más facilidad y
eliminarse de la proteína A mediante el uso de una columna
cromatográfica, tal como Fast Flow, una columna de Q, p.e. una
columna Q Sepaharose^{TM} Fast Flow (Amersham Pharmacia), una
columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), una
columna de cromatografía de quelato metálico (IMAC) o columnas de
intercambio catiónico o intercambio aniónico, de hidroxiapatita. El
pH de disociación se puede elevar mediante el empleo de arginina y/o
cualquier otra composición que rompa o impida las interacciones
hidrofóbicas elevando así el pH de disociación, por ejemplo, etileno
glicol, propileno glicol, etanol, propanol, metanol y compuestos
similares. Un más alto pH de disociación permite la eliminación de
rPA a un pH más normal que se produciría en la disociación de otro
modo. El uso de un pH más alto, por ejemplo, más alto que pH 3,7,
también produce menos daños, por ejemplo, pérdida de sulfatación o
sialación o segmentaciones de Asp-Pro, para algunas
proteínas que contienen Fc, por ejemplo rPSGL-Ig,
debido al más bajo pH, por ejemplo, pH 3,7.
Anteriormente, las columnas Q no se podían
utilizar para disociación de rPA desde proteínas que contienen Fc
(que no sean proteínas que contienen Fc que sean altamente
aniónicas), porque el pH era generalmente demasiado bajo para
permitir el enlace de la molécula de Fc o la rProteína A a la
columna Q. Elevando el pH de disociación, mediante, por ejemplo, el
uso de arginina y/o etileno glicol, el pH de disociación es
suficientemente alto para permitir el uso de la columna para
moléculas que contienen Fc bajo condiciones de disociación,
incluyendo las moléculas que no sean altamente aniónicas.
Además, como se indicó anteriormente, las
columnas de IMAC no se podían utilizar bajo condiciones de
disociación, por ejemplo, bajo pH, de nuevo porque la molécula que
contiene Fc y la rPA no permanecerían ligadas a la columna de IMAC
bajo el pH normalmente bajo necesario para que se produzca la
disociación. Mediante la elevación del pH de disociación por, por
ejemplo, el empleo de etileno glicol, la proteína que contiene Fc
permanece ligada a la columna de IMAC, de modo que se puede
utilizar la columna de IMAC para eliminar la rProteína.
Una columna de HIC se puede utilizar también
para la eliminación de rPA desde las moléculas que contiene Fc a un
pH más normal que el de disociación que se produciría mediante la
elevación del pH de disociación, por ejemplo, mediante el empleo de
arginina y/o etileno glicol.
En el siguiente ejemplo se describe la
caracterización de condiciones adecuadas para la eliminación de
rProteína A desde rPSGL-Ig usando la columna de
IMAC, la columna de HIC y la columna Q. Para desarrollar una etapa
de eliminación de rPA para la columna IMAC, que eliminará la
rProteína A mientras la rPSGL-Ig es absorbida en la
columna de IMAC, deben desarrollarse condiciones que no contengan
ningún agente quelatante, por ejemplo, citrato o aminoácidos o
arginina y deben tener una concentración de sal relativamente alta
para reducir al mínimo las interacciones iónicas con la superficie
de IMAC y la superficie de rPSGL-Ig. En este
experimento fue utilizada arginina para explorar la posible
utilidad de la arginina con la columna Q o la columna HIC para la
eliminación de la proteína A.
Para poder caracterizar la disociación de
rPSGL-Ig y rProteína A, fue preparada una columna de
rProteína A, según se describió anteriormente. La columna de
rProteína A fue equilibrada con 20 mM Tris, pH 7,8, 200 mM NaCl. La
rPSGL-Ig fue cargada en la columna de rPA. Se añadió
5M NaCl para elevar la conductividad a 25-30 mS/cm
y la columna fue objeto de titulación con tris HCL o tris base a pH
7,8. La columna fue lavada para 4 ev con solución tampón de
equilibrado. Las condiciones de elución probadas incluyen las
siguientes:
- Elución 1: 50% etileno glicol (EG), 200 mM NaCl, 20 mM Na Acetato pH aproximado 5,7;
- Elución 2: 50% EG, 20 mM NaCl, 20 mM Na Acetato pH aproximado 5,7 y 500 mM de arginina;
- Elución 3: 50% EG, 20 mM NaCl, 20 mM Na Acetato pH aproximado 5,0 y
- Elución 4: 50% EG, 1 mM NaCl, 20 mM Na Acetato pH aproximado 5,0 y 500 mM arginina.
Todas las eluciones son de 5 cv a 2 mL/minuto.
Una elución final fue realizada con 20 mM citrato, pH aproximado
2,7.
Los resultados demostraron que el complejo de
rPSGL-Ig/Proteína A se puede romper con la elución
2, por ejemplo, con un pH aproximado de 5,7 y también se rompe con
la elución 3, por ejemplo, con un pH en torno a 5,0.
La columna de IMAC no se pudo utilizar con la
elución 2 debido a la adición de arginina. Los resultados indicaron
que 3 cv de elución 3 (50% EG, 1M NaCl, 20 mM Na acetato, pH
aproximado 5,0), cuando se aplicaron a una columna de IMAC, podían
disociar la rPA desde el rPSGL-l ligado y eliminar
una parte significativa del rPA desde el tren de procesos de
rPSGL-1.
Los resultados indican también que
aproximadamente un 20% de rPA se eliminaría del
rPSGL-Ig en un lavado de 2 cv con la elución 2 (50%
EG, 200 mM NaCl, 20 mM Na Acetato, pH aproximado 5,7 y 500 mM de
arginina) si PSGL-Ig estaba ligado a otra resina,
por ejemplo una columna Q o una columna HIC. Una columna Q se puede
usar para la eliminación de proteína A aumentando el pH de
disociación con arginina y, por ejemplo, una composición o agente
que rompa las interacciones hidrofóbicas, tales como, por ejemplo,
etileno glicol (EG). Por ejemplo, la columna Q es lavada a un pH
aproximado entre 5,0 y pH 5,7 con, por ejemplo, 200 mM NaCl, 50%
etileno glicol y 20 mM Na Acetato y 500 mM arginina. Una columna
HIC se puede utilizar también para la eliminación de la proteína A
con un pH de disociación incrementado.
Un gradiente del pH con 50% EG, 1M NaCl en una
columna de rProteína A con PSGL fue utilizado para determinar el pH
máximo que se puede utilizar por IMAC para la eliminación de
proteína desde rPSGL-Ig. Una columna de rProteína A
fue preparada, en la forma antes descrita, y se hizo el ensayo de un
gradiente desde pH 5,7 a pH 5,0.
Los resultados indicaron que el agregado de
rPSGL-Ig/rProteína A se puede separar casi
completamente a un pH 5,3 con 50% de etileno glicol y 1 M NaCl, 20
mM Na Acetato. El agregado de rPSGL-Ig/rProteína A
se puede romper parcialmente a un pH de 5,0 con 50% EG y 1 M NaCl,
20 mM Na Acetato. La rPSGL-Ig se puede eluir de la
columna de rPA a valores de pH tan altos como 5,5, se puede eluir
relativamente bien a un pH 5,3 en 50% EG y de forma opcional, 1 M
NaCl, aunque la alta concentración de NaCl no es necesaria para la
elución. NaCl a una concentración de 50-200 mM
sería óptima.
La elución al pH más alto se compara
favorablemente con la elución a pH 3,7, donde la
rPSGL-Ig puede perder sulfatación, sialación y se
pueden producir segmentaciones de Asp-Pro, que son
aceleradas a pH bajo.
Para determinar las propiedades de disociación
de rPSGL-Ig y de rPA en condiciones de elución de
HIC y condiciones de lavado de columna Q, un gradiente del pH desde
pH 6 a pH 4, a través de 20 cv en 20 mM citrato, 500 mM arginina y
500 mM sulfato amónico fue realizado para simular estrechamente las
condiciones de elución de HIC. Dichas condiciones son de
aproximadamente 0,5 M sulfato amónico.
Una columna de rProteína A fue preparada en la
forma antes escrita. La columna fue equilibrada primero con 20 mM
Tris pH 7,8, 200 mM NaCl. La columna fue cargada con
rPSGL-Ig y objeto de titulación con tris HCL o tris
base a pH 7,8 y lavada para 4 cv con solución tampón de equilibrado.
El gradiente fue realizado a partir de 20 mM de citrato, 500 mM de
arginina y 500 mM de sulfato amónico con un pH 5 a 20 cv en 20 mM de
citrato, 500 mM de arginina y 500 mM de sulfato amónico con un pH
4.
Los resultados indicaron que la asociación de
rPrA/rPSGL-Ig se puede romper a un pH aproximado de
4,2 con 500 mM de arginina, 0,5 de sulfato amónico y 20 mM de
citrato, en contraste con un pH de 3,7 sin la arginina. Estos
resultados indican que la arginina puede afectar fuertemente a las
propiedades de disociación de rPSGL-Ig y de rPrA.
La utilización de una columna de HIC a aproximadamente pH 4,1
elimina el rPA desde la corriente del proceso, permitiendo que
rPSGL-Ig tenga una elución libre de rPA. La columna
de HIC se puede utilizar a pH 4,1 con un lavado de acv a pH 4,1
inmediatamente antes, ambos en 500 nM de arginina.
Como alternativa, la elución de la columna de
HIC a pH 4,1 con 500 mM de arginina, pero sin lavado antes de la
arginina, puede reducir también rPA.
Un gradiente de etileno glicol fue realizado
desde 0% a 50% a través de 20 cv en 20 mM acetato, 500 mM arginina
y 500 mM sulfato amónico. Los resultados indican que la mayor parte
de rPSGL-Ig está completamente disociado de rPA a
30% de etileno glicol, pH 4,7 y 500 mM arginina.
Además, 2 LRV de rPA pueden ser afectados por la
elución de la rPSGL-Ig en 500 mM arginina, 400 mM
sulfato amónico, pH 4,1, después del lavado de la columna de HIC
con 500 mM arginina, 1,2 M sulfato amónico, pH 4,1.
Se realizó un nuevo experimento para investigar
si la adición de arginina y el aumento del valor del pH cambia las
condiciones de elución de rPSGL-Ig en la columna de
HIC y resuelve mejor la rPSGL-Ig desde la rPA en la
columna de HIC con una carga que contenga rPA.
Los resultados indicaron que 1,1 LRV de rPA fue
afectada con condiciones de elución a pH 4,1, que 0,9 LRV fue
afectada con condiciones de elución a pH 4,3 y que 0,7 LRV fue
afectada con condiciones de elución a pH 4,5.
Una columna Q se puede utilizar también para
separar el complejo de rProteína A/rPSGL-Ig mediante
la adición una composición o agente que actúa para separar las
interacciones hidrofóbicas, por ejemplo, etileno glicol, a una
concentración suficiente para elevar el pH a un nivel que permita
que la molécula que contiene Fc quede ligada a la columna, puede
utilizarse para separar la rProteína A con una columna Q. Por
ejemplo, un pH entre 5,5 y 5,7, preferentemente 5,5 puede
utilizarse en estas condiciones.
<110> Coffman, J.L., et
al.
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<120> Métodos para purificar
proteínas altamente aniónicas
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<400> 1
Claims (7)
1. Procedimiento para disociar moléculas que
contienen Fc a partir de complejos de moléculas que contienen
proteína A/Fc en una mezcla, que comprende poner en contacto la
mezcla con una columna de cromatografía de interacciones
hidrofóbicas bajo condiciones del pH entre 4,1 y 4,5, en donde las
condiciones del pH se establecen mediante la adición de arginina a
dicha mezcla y dicha columna es lavada con una solución tampón que
contiene arginina para disociar las moléculas que contienen Fc de
los complejos de moléculas que contienen proteína A/Fc.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se añade un agente que reduce o inhibe las interacciones
hidrofóbicas.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el agente se selecciona entre etileno glicol, propileno
glicol, etanol, propanol y metanol.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dicho agente es etileno glicol.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende, además, eluir las moléculas que contienen Fc desde la
columna de cromatografía de interacciones hidrofóbicas, de modo que
dichas moléculas que contienen Fc queden sustancialmente libres de
proteína A.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las condiciones del pH son 4,1.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichas moléculas que contienen Fc es
rPSGL-Ig.
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