JP5596078B2 - 高アニオン性タンパク質の精製方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許出願60/193,351(2000年3月27日出願)、表題”高アニオン性タンパク質の精製方法”の優先権を主張する。この引用によりこの出願の内容全体を本明細書に援用する。
ターゲットタンパク質の精製は、DNA/タンパク質相互作用のためDNAが除去されにくいことにより、しばしば妨げられる。DNA/タンパク質相互作用は、高アニオン性タンパク質、たとえばスルフェート化(sulfated)タンパク質の精製に際してはより問題となる。
本発明は、高アニオン性タンパク質および免疫グロブリンドメインを含むターゲットタンパク質、たとえばスルフェート化タンパク質の単離および精製のための方法を提供する。アニオン性タンパク質は正味マイナス電荷をもつタンパク質である。スルフェート化タンパク質は、正味マイナス電荷が少なくともほぼ1つのスルフェート化残基によるタンパク質である。ターゲットタンパク質のスルフェート化とは、ターゲットタンパク質に含有されるアミノ酸上またはアミノ酸間の少なくとも1つのヒドロキシル基(−OH)が−SO4Hで置換されることを表わす。好ましい態様において、スルフェート化タンパク質は少なくともほぼ1つのスルフェート基をもつ。少なくともほぼ2、3、4、5、6またはそれより多いスルフェート基を含むスルフェート化タンパク質、たとえばPSGL−1(P−セレクチン糖タンパク質リガンド−1)のようにN末端チロシン上に6つのスルフェート基を含むものも本発明方法に包含される。
好ましい態様において、高アニオン性ターゲットタンパク質はスルフェート化タンパク質であり、不純物はスルフェート化形のターゲットタンパク質を含む。
log10除去値(LRV)の汚染DNAを除去する。
発明の詳細な記述
本発明は少なくとも一部は、高アニオン性ターゲットタンパク質および免疫グロブリンドメインを含む高アニオン性ターゲットタンパク質、たとえばスルフェート化タンパク質(たとえばPSGL−1)を精製するための新規方法を見いだしたことに基づく。アニオン性タンパク質は、正味マイナス電荷をもつタンパク質である。スルフェート化タンパク質は、正味マイナス電荷が少なくともほぼ1つ、より好ましくは5以上のスルフェート化、たとえば少なくともほぼ6つのスルフェート化によるものであるアニオン性タンパク質である。ターゲットタンパク質のスルフェート化とは、ターゲットタンパク質に含有されるアミノ酸上またはアミノ酸間の少なくとも1つのヒドロキシル基(−OH)が−SO4Hで置換されることを表わす。スルフェート化は、たとえばPSGL−1のようにN末端チロシン上において起きる可能性がある。
ID NO:1として示される。疎水性分析および既知の開裂パターンとの比較から、アミノ酸20〜22個のシグナル配列、すなわちPSGL−1のアミノ酸1〜20またはアミノ酸1〜22が推定される。PSGL−1は、アミノ酸残基38〜41にPACE(塩基性アミノ酸対変換酵素)開裂部位(−Arg−Asp−Arg−Arg)を含む。成熟PSGL−1タンパク質は、SEQ
ID NO:1中のアミノ酸42からアミノ酸402までに示されるアミノ酸配列で表わされる。可溶性形P−セレクチンリガンドタンパク質は、USP5,827,817に示されたアミノ酸配列のアミノ酸21からアミノ酸310までで表わされる。他の可溶性形成熟PSGL−1タンパク質は、USP5,827,817に示されたアミノ酸配列のアミノ酸42からアミノ酸310までで表わされる。可溶性形P−セレクチンリガンドタンパク質はさらに、室温で水溶液中に可溶性であることを特色とする。
PSGL−1は糖タンパク質であり、下記の末端炭水化物を1以上含む可能性がある:
ID NO:1のアミノ酸42からアミノ酸189までの配列、アミノ酸42からアミノ酸118までの配列、またはアミノ酸42からアミノ酸89までの配列を含むPSGL−1は、それぞれP−セレクチンタンパク質結合活性およびE−セレクチン結合能を保持する。1以上のN−結合グリコシル化部位(たとえばアミノ酸65、111および292)が他のアミノ酸に変化した、または欠失したPSGL−1タンパク質も、P−セレクチンタンパク質結合活性およびE−セレクチン結合能を保持する。アミノ酸42からアミノ酸60までを含む(アミノ酸45からアミノ酸58までの高アニオン領域を含む)P−セレクチンリガンドタンパク質も、P−セレクチンタンパク質結合活性を保持する;しかしそのような配列に限定されたP−セレクチンリガンドタンパク質は、E−セレクチンには結合しない。好ましくは、P−セレクチンリガンドタンパク質はアミノ酸46、48および51にみられるチロシン残基を少なくとも1つ(より好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは3つすべて)保有する;そのスルフェート化がP−セレクチンリガンドタンパク質活性に関与すると思われる。
ID NO:1として示された、PSGL−1のアミノ酸配列に基づく。
L.Ryden(編)Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and
Applications,VHC Publishers社,ニューヨーク(1989)、USP5,429,746(表題:抗体精製)、およびUSP5,115,101(表題:抗体調製物からのタンパク質の除去);これらの内容を本明細書に援用する。
この実施例は、組換えPSGL−Ig融合タンパク質のカラムクロマトグラフィーによる精製を記載する(図1)。
Sepharose(商標)Fast Flow(Amersham Pharmacia)カラムを製造業者の指示に従って調製した。コンディショニングした培地中のPSGLに対するカラム容量は約1mg
PSGL/ml樹脂である。
NaCl、pH6.5で洗浄して低スルフェート化rPSGL−Ig(たとえば4以下のスルフェート化)を除去した。装填および洗浄工程を3.5cm/分で実施した。カラムをpH6.5で1M
NaCl、20mMヒスチジン、pH6.5により<1.1cm/分において溶離した。この工程のpHは4〜8であってよいが、好ましくは6.5である。溶出ピークはPSGL−Ig、DNAおよびヒストンならびに他の汚染物質を含有する。QカラムはDNAを結合し、ヒストンはこのDNAに結合している。PSGL溶出(塩類濃度上昇により起きる)はDNA溶出と一致する。PSGL−Igの純度は>80%である。DNAの50%がこの工程で実施されたにすぎない。
床深さ9cmのPhenyl
Toyopearl 650Cカラム(Rohm and Haas)を製造業者の指示に従って調製した。HICカラム容量は約3.5mg
PSGL/mL樹脂である。カラムを1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH7.4中、≦1.3cm/分で平衡化した。Q
Sepharoseカラムからの溶出液を、3M硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH7.4の添加により、1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH7.4に調整し、HICに装填した。あるいは、1.2M硫酸アンモニウムではなく4M
NaClで装填することができる。カラムを1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH7.4で洗浄した。装填および洗浄の両工程とも約1.3cm/分の速度で実施した。HICカラムを0.48M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH7.4により0.65cm/分で溶離した。これらの条件下で、HICカラムからまずH2AおよびH2Bヒストンが除去される。これらはH3およびH4ヒストンほど強固にDNAを結合しない。H2ヒストンは洗浄画分中に出現し、ピークはH3およびH4ヒストン、ならびに少量のH2ヒストンを含有する。さらに、DNAの大部分がヒストン上に留まり、このピーク中に溶出する。生成物は汚染タンパク質について>95%の純度であり、85%のDNAがこの工程で除去される。
Fractogel Chelate(M)(E.Merck)上のIMAC銅(II)カラムを製造業者の指示に従って調製した。IMACカラムは6.4〜7.2cmの床深さ、および約6.6mg
PSGL/mL樹脂の容量をもっていた。
NaCl、2mMイミダゾール、pH7中、5cv、≦5cm/分で平衡化した。HICカラムからの溶出液を2mMイミダゾール、50mM
KPO4、pH7,200mM NaClに調整し、IMACカラムに装填した。カラムをまず平衡化緩衝液で洗浄し、次いで40mM MES、1M NaCl、5mMイミダゾール、pH6.6中、≦5cm/分で平衡化した。この低い塩類濃度では、IMACカラム上のヒストン/DNA複合体は分解されない。カラムを40mM
MES、1M NaCl、35mMイミダゾール、pH6.6で溶離した。IMACカラムからまずH3およびH4ヒストンが除去される。IMACピーク中に少量のH3およびH2ヒストンがみられるが、H3およびH4ヒストン、ならびに少量のH2はストリップ液中にある。得られた生成物は汚染タンパク質について>99.9%の純度であり、95%のDNAがこの工程で除去される。全体として、この全工程で約2.5LRVのDNAクリアランスである。
この実施例は、組換えPSGL−Ig融合タンパク質のカラムクロマトグラフィーによる精製を記載する;これは汚染性のヒストン/DNA複合体を塩類またはアルコール類で解離し、これによりPSGL−Igタンパク質の純度を高める工程を含む(図2)。
アニオン交換カラムからの溶出液を、下記のように疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラムによりさらに精製した。床深さ9cmのPhenyl
Toyopearl 650Cカラム(Rohm and Haas)を製造業者の指示に従って調製し、1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH7.4で平衡化した。この工程のpHは6〜8であってよいが、好ましくはpH7.4である。
NaClで装填することができる。カラムを1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH7.4、続いて4M
NaCl、20mMトリス、pH7.4で洗浄した。4M NaClによる洗浄で90%のDNAがカラムから除去される(または1 log10除去値、すなわち1 LRV)。あるいは5%イソプロパノールおよび1.2M硫酸アンモニウムで洗浄してもよい。これにより99.9%のDNAがカラムから除去される(”3 log10除去値”、すなわち3 LRV)。あるいは5%エタノールおよび1.2M硫酸アンモニウムで洗浄してもよい。これにより99.9%のDNAがカラムから除去される(”3 log10除去値”、すなわち3 LRV)。あるいは5%エタノールおよび4M NaClで洗浄してもよい。これにより99.9%のDNAがカラムから除去される(”3 log10除去値”、すなわち3 LRV)。あるいは5%イソプロパノールおよび4M NaClで洗浄してもよい。これにより99.9%のDNAがカラムから除去される(”3 log10除去値”、すなわち3 LRV)。装填および洗浄の両工程とも約1.3cm/分の速度で実施した。次いでカラムを0.48M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH7.4により0.65cm/分で溶離した。
NaClで洗浄すると、DNAはヒストンから分離し、洗液中へ流出する。これらの条件下では、DNAの大部分が洗液中へ流出し、ヒストンはなおピーク中に溶出する。あるいはこのHIC工程をIMAC工程(下記を参照)の後に実施してもよい。これにより99.9%以上のDNAが除去される(3
LRV)。
Fractogel Chelate(M)(E.Merck)上のIMAC銅(II)カラムを製造業者の指示に従って調製した。IMACカラムは6.4〜7.2cmの床深さ、および約6.6mg
PSGL/mL樹脂の容量をもっていた。この工程のpHは4.8〜8であってよいが、好ましくはpH6.6である。
NaCl、2mMイミダゾール、pH7中、5cv、≦5cm/分で平衡化した。あるいは、2M
NaClではなく200mM NaClで5カラムを平衡化してもよい。HICカラムからの溶出液を2mMイミダゾール、50mM
KPO4、pH7、200mM NaClに調整し、IMACカラムに装填した。あるいは、2M NaClではなく200mM NaClで装填を行ってもよい。
MES、2M NaCl、5mMイミダゾール、pH6.6中、≦5cm/分で平衡化した。カラムを40mM MES、1M NaCl、35mMイミダゾール、pH6.6で溶離した。IMACカラムからまずH3およびH4ヒストンが除去される。これらのヒストンおよび少量のH2ヒストンはストリップ液中にある。少量のH3およびH4ヒストンがIMACピーク中にもみられる。
LRV)より90%多いDNAが除去される。この工程の新規性は、ヒストン/DNA複合体からDNAを分離するために2M
NaClで装填するか、または2M NaClで洗浄することである。ヒストンはIMACカラムに付着し、DNAはこれらのヒストンに付着する。DNAはH3/H2または単にH2複合体よりH3/H4複合体の方により良く結合するので、H3/H4複合体を可能な限り速やかに除去するのが有益である。したがって、IMAC実施後にHICを実施すると、より大きなDNAクリアランス(99.9%高いクリアランス、すなわち3
LRV)を達成できることが示された。したがってIMACを可能な限り早期にプロセスに挿入すると、さらにDNAを減少させうると考えられる。しかしIMACを第1工程にすると、低分子量アミノ酸および他のアミン含有基を装填物から除去するために限外濾過/透析濾過(diafiltration)が必要となる。
この実施例は、組換えPSGL−Ig融合タンパク質のカラムクロマトグラフィーによる精製のための別法を記載する。実施例1に記載した精製方式と異なり、この方法は第1精製工程としてアフィニティー工程を用いる(図3)。このアフィニティー精製工程には、rPSGL−IgキメラのFc部分を結合するプロテインAを用いる。rPSGL−IgはプロテインAカラムから低いpH、この場合pH3.7で溶出する。装填後にカラムを1M
NaClで洗浄すると、プロテインA工程はより良いクリアランスを与える。この塩類濃度は一般に用いられるものより高い(通常は約150mM
NaCl)ので、新規である。この塩工程の付加により、この工程からのDNAクリアランスは4
log10除去値(LRV)ないし6LRVになる。これは100倍のDNA除去増加である。
A Fast Flowカラム(Amersham
Pharmacia)を製造業者の指示に従って調製する。カラム容量は約1mg/mLである。カラムを20mMトリス、200mM
NaCl、pH7.2〜8、好ましくはpH7.4で平衡化する。マイクロフィルトレーションしたコンディショニング培地を、pH7〜8、好ましくはpH7.4、約30〜300cm/時、好ましくは150cm/時でカラムに装填する。カラムを20mMトリス、200mM
NaCl、pH7〜8、好ましくはpH7.4で洗浄し、20mMクエン酸、pH3〜4、好ましくはpH3.7、約50〜300cm/時で溶離する。純度はタンパク質については>95%であり、DNAの>99%がこの工程で除去される。
Sepharose(商標)Fast Flowカラム(Amersham Pharmacia)で精製する。プロテインA工程後のQ SepharoseカラムのPSGLに対する容量は、pH3.6〜4.0、好ましくはpH3.7において約≧6mg
PSGL/mL樹脂である。
Sepharoseカラムに装填するか、またはピークをQ Sepharoseカラムに装填する前に中性にする。いずれの場合も、カラムを200mM
NaClおよび20mMクエン酸、pH3.5〜4、好ましくはpH3.7で洗浄して、残留プロテインAを除去する。両方法とも、浸出プロテインA、低スルフェート化rPSGL−Ig、N末端クリップrPSGL−Ig、およびpro−rPSGL−Ig(rPSGL−Igの前駆物質種;N末端の酵素開裂部位をもたない)を除去する。pH3.5〜4での洗浄後、カラムを20mMヒスチジン、400mM
NaCl、pH6.5で洗浄して低スルフェート化rPSGL−Igを除去することができる。低スルフェート化rPSGL−Ig分子は4以下のスルフェート化をもち、これに対し活性rPSGL−Igは理想的には5または6のスルフェート化をN末端チロシン上にもつ。カラムの装填および洗浄工程を3.5cm/分の速度で実施する。カラムをpH6.5で1M
NaCl、20mMヒスチジン、pH6.5により溶離する。あるいは、pH3.5〜4.0、好ましくはpH3.7、500mM
NaCl、20mMクエン酸、<1.1cm/分で溶離してもよい。タンパク質はピークの<2%である。
Claims (10)
- 試料中のアニオン性ターゲットタンパク質を試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物ならびにDNA/ヒストン複合体から精製する方法であって、
(a)イオン交換クロマトグラフィーを用いてアニオン性ターゲットタンパク質を精製し;
(b)ターゲットタンパク質を含有する試料を疎水性相互作用支持体上に装填し、ここで該タンパク質が支持体上に捕獲され;そして
(c)支持体を洗浄溶液によって洗浄し、これにより試料中のアニオン性ターゲットタンパク質が精製されることを含む方法であって、
ここで疎水性相互作用支持体のための洗浄溶液が、4MのNaClあるいは1.2Mの硫酸アンモニウム、ならびに20mMおよびpH7.4のトリスを含む溶液である
方法。 - ターゲットタンパク質がスルフェート化タンパク質を含み、不純物が低スルフェート化形のターゲットタンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
- スルフェート化タンパク質がP−セレクチン糖タンパク質リガンド−1またはP−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質である、請求項2に記載の方法。
- 疎水性相互作用支持体からターゲットタンパク質を溶離溶液中に溶離することをさらに含む、請求項1に記載の方法であって、ここで溶離溶液が洗浄溶液より低い塩類濃度を含む、方法。
- ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに通し、溶離溶液が濃度0.48Mの硫酸アンモニウムである、請求項4に記載の方法。
- ターゲットタンパク質が少なくとも5つのスルフェート化を有する、請求項1に記載の方法。
- ターゲットタンパク質が組換えタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここでアニオン性ターゲット分子が免疫グロブリンFcドメインを含み、そしてここで該方法がさらに(a’)アニオン性ターゲット分子のFc部分を結合しうる支持体と試料を接触させ、(b’)洗浄溶液により支持体を洗浄し、(c’)試料を溶離溶液で溶離し、その際、溶離溶液のpHは4.0であり、そして(d’)精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離試料を採集することを含む方法。
- 分子がP−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。
- P−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質がrPSGL−Igである、請求項9に記載の方法。
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