ES2266188T3 - Procedimientos de purificacion de proteinas altamente anionicas. - Google Patents

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ES2266188T3 ES01922750T ES01922750T ES2266188T3 ES 2266188 T3 ES2266188 T3 ES 2266188T3 ES 01922750 T ES01922750 T ES 01922750T ES 01922750 T ES01922750 T ES 01922750T ES 2266188 T3 ES2266188 T3 ES 2266188T3
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William Barry Foster
Bonnie J. Germain
Shujun Sun
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Abstract

Procedimiento para purificar una proteína objetivo altamente aniónica en una muestra de una serie de complejos de ADN/histona, que comprende los pasos de: (a) purificación de la cromatografía de intercambio iónico de la proteína objetivo; (b) carga la muestra purificada de cromatografía de intercambio iónico que contiene la proteína a través en una columna de cromatografía de quelatos metálicos, de modo que la muestra sea capturada en la columna; y (c) lavar la columna, de modo que tanto la etapa de carga (b) o la etapa de lavado (c) utilicen una solución con un pH entre 4, 8 y 8 y comprendiendo 2 M NaCl para retirar el ADN de la muestra.

Description

Procedimientos de purificación de proteínas altamente aniónicas.
Antecedentes de la invención
La purificación de proteínas objetivo se suele dificultar por la deficiente extracción del ADN debido a las interacciones ADN/proteína. Dichas interacciones son más problemáticas en la purificación de proteínas objetivo altamente aniónicas, por ejemplo, proteínas sulfatadas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona procedimientos para aislar y purificar proteínas objetivo altamente aniónicas y proteínas objetivo que comprenden dominios de inmunoglobulina, por ejemplo proteínas sulfatadas. Las proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa neta. Las proteínas sulfatadas son proteínas en las que la carga negativa neta se debe a por lo menos un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de una proteína objetivo se refiere a la sustitución de al menos un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de una proteína objetivo se refiere a la sustitución de al menos un grupo hidroxilo (-OH) con -SO_{4}H en o entre los aminoácidos contenidos dentro de la proteína objetivo. En una forma de realización preferida, la proteína sulfatada tiene al menos un (1) grupo de sulfatos. Las proteínas sulfatadas que contienen al menos dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más grupos de sulfatos son abarcadas también por los procedimientos actuales, por ejemplo, seis grupos de sulfatos sobre las tirosinas N-terminal según se materializa en PSGL-1 (ligando de P-selectina glicoproteína-1).
La invención proporciona un procedimiento para purificar una proteína objetivo altamente aniónica en una muestra de una serie de complejos de ADN/histona, que comprende los pasos de:
(a)
purificación de la cromatografía de intercambio iónico de la proteína objetivo;
(b)
carga de la muestra purificada de cromatografía de intercambio iónico que contiene la proteína a través en una columna de cromatografía de quelatos metálicos, de modo que la muestra sea capturada en la columna; y
(c)
lavar la columna,
de modo que tanto la etapa de carga (b) o la etapa de lavado (c) utilicen una solución con un pH entre 4,8 y 8 y comprendiendo 2 M NaCl para retirar el ADN de la muestra con una segunda solución de lavado bajo condiciones apropiadas, de modo que se disocien los complejos de ADN/histona contenidos en la muestra; (3) eluir la muestra con una segunda solución de elución y (4) recoger la muestra eluída, que contiene las proteínas objetivo altamente aniónicas purificadas.
En un aspecto, el procedimiento para purificar proteínas objetivo altamente aniónicas comprende las etapas de cromatografía de intercambio iónico bajo condiciones apropiadas para la purificación de las proteínas objetivo. Como ejemplo, el procedimiento dado a conocer consiste en: (1) poner en contacto la muestra con un sustrato capaz de unir, de forma reversible, las moléculas cargadas, de tal modo que las proteínas objetivo queden ligadas con el sustrato (2); lavar el sustrato con una primera solución de lavado bajo condiciones apropiadas, de modo que una pluralidad de impurezas proteináceas y no proteináceas en la muestra no queden ligadas o se eliminen por lavado de sustrato, mientras que las proteínas objetivo altamente aniónicas permanezcan ligadas; (3) eluir la muestra con una primera solución de elución en la que dicha primera solución de elución comprende una solución salina con una alta concentración molar y (4) recoger la muestra eludía, que contenga las proteínas objetivo aniónicas purificadas.
En una forma de realización, se da a conocer que el pH de la primera solución de lavado es aproximadamente 4,0 a 8,0. En otra forma de realización, se da a conocer que el pH aproximado de la primera solución de lavado es 6,5.
En una forma de realización preferida, se da a conocer que la proteína objetivo altamente aniónica es una proteína sulfatada y las impurezas incluyen una forma sulfatada de la proteína objetivo.
En otro aspecto, la muestra eluída a partir de la purificación de la cromatografía de intercambio iónico, que contiene las proteínas objetivo purificadas, se purifica todavía más. Esta purificación adicional, por ejemplo, comprende las etapas de cromatografía de quelatos metálicos, bajo condiciones apropiadas para la purificación de las proteínas objetivo altamente aniónicas. Por ejemplo, esta purificación adicional proporciona las etapas de: (1) pasar la muestra eluída que contenga las proteínas objetivo a través de una columna de cromatografía de quelatos metálicos, de modo que la muestra eluída sea capturada en la columna; (2) lavar la columna con una segunda solución de lavado bajo condiciones apropiadas, de modo que se disocien los complejos de ADN/histona contenidos en la muestra; (3) eluir la muestra con una segunda solución de elución y (4) recoger la muestra eluída, que contiene las proteínas objetivo altamente aniónicas purificadas.
En otro aspecto, las proteínas objetivo tienen al menos una (1) sulfatación. Las proteínas objetivo aniónicas que tienen al menos dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más sulfataciones son también dadas a conocer; por ejemplo, proteínas PSGL-1. Las proteínas aniónicas capaces de purificarse por los procedimientos dados a conocer pueden ser proteínas que se presentan de forma natural o proteínas recombinantes.
En una forma de realización preferida, el procedimiento de purificación dado a conocer proporciona proteínas objetivo altamente aniónicas purificadas al menos un 99,9% puras de proteínas contaminantes.
En otra forma de realización dada a conocer, los procedimientos de purificación de la invención eliminan al menos un 95% o 2,5 log_{10} valor de reducción logarítmica (LRV) del ADN contaminante desde las proteínas objetivo altamente aniónicas.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1-3 ilustran los procedimientos de purificación que se describen en la presente, es decir, procesos I-III tal como se describe en los Ejemplos. Todas las figuras y ejemplos son esencialmente sólo a efectos de ilustración.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevos procedimientos para purificar proteínas objetivo altamente aniónicas y proteínas altamente aniónicas, que comprenden un dominio de inmunoglobulinas, por ejemplo, proteínas sulfatadas (p.e., PSGL-1). Las proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa neta. Las proteínas sulfatadas son proteínas aniónicas en las que la carga negativa es debida al menos una, o más preferentemente, cinco (5) o más sulfataciones, por ejemplo, al menos seis (6) sulfataciones. Las sulfataciones en una proteína objetivo se refieren a la sustitución de al menos un grupo hidroxilo (-OH) con -SO_{4}H en o entre aminoácidos contenidos dentro de la proteína objetivo. Las sulfataciones pueden ocurrir, por ejemplo, en las tirosinas de N-terminal, según se materializa en PSGL-1.
En una forma de realización preferida, la proteína sulfatada es PSGL-1, por ejemplo, PSGL-1 que comprende el conjunto de aminoácidos dado a conocer en la patente de los Estados Unidos Nº 5.827.817, cuyo contenido está incorporado en esta memoria por referencia o bien, una parte activa de dicho conjunto. La secuencia completa de aminoácidos de la proteína PSGL-1 (p.e., el péptido maduro más la secuencia líder) está caracterizada por la secuencia de aminoácidos dada a conocer en la patente de los Estados Unidos 5.827.817, desde el aminoácido 1 al aminoácido 402 y aquí dada a conocer como ID SEQ Nº 1. El análisis de la hidrofobicidad y su comparación con los modelos de segmentación conocidos predicen una secuencia de señales de 20 a 22 aminoácidos, p.e., aminoácidos 1 a 20 o aminoácidos 1 a 22 de PSGL-1. PSGL-1 contiene un sitio de segmentación (-Arg-Asp-Arg-Arg-) de PACE (enzima de conversión de aminoácidos básicos pareados) en residuos de aminoácidos 38-41. La proteína PSGL-1 madura está caracterizada por la secuencia de aminoácidos establecida en SED ID Nº 1 desde el aminoácido 42 al aminoácido 402. Una forma soluble de la proteína de ligandos de P-selectina está caracterizada por los aminoácidos 21 a 310 de la secuencia de aminoácidos dada a conocer en la patente de los Estados Nº 5.827.817. Otra forma soluble de la proteína PSGL-1 madura está caracterizada por la secuencia de aminoácidos dada a conocer en la patente de los Estados Unidos 5.827.817 desde el aminoácido 42 al aminoácido 310. La forma soluble de la proteína de ligandos de P-selectina está caracterizada, además, por ser soluble en solución acuosa a la temperatura ambiente.
PSGL-1 es una glicoproteína que puede contener uno o más de los carbohidratos terminales siguientes:
\quad
NeuAc\propto (2,3) Gal \beta (1,4) GlcNac - R
\quad
/\propto (1,3)
\quad
Fuc
\quad
NeuAc\propto (2,3) Gal \beta (1,3) GlcNac - R
\quad
/\propto (1,4)
\quad
Fuc
\quad
Gal \beta (1,4) GlcNac - R
\quad
/\proptoc (1,3)
\quad
Fuc
\quad
Gal \beta (1,3) GlcNac - R
\quad
/\propto (1,4)
\quad
Fuc
\newpage
donde R = resto de la cadena de carbohidratos, está de forma covalente unida directamente a la proteína de ligandos de P-selectina o a una mitad molecular de lípidos que está, de forma covalente, unida a la proteína de ligandos de P-selectina. PSGL-1 puede sulfatarse adicionalmente o de otro modo, modificarse posteriormente a su traducción. Tal como se expresa en las células de COS y CHO, la proteína de ligandos de P-selectina de longitud completa es una proteína homodimérica, que tiene un peso molecular aparente de 220 kD tal como se demuestra por la electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida no reductora.
La estructura de la secuencia PSGL-1 de longitud completa incluye un dominio extracelular (desde aproximadamente el aminoácido 21 al 310), un dominio de transmembrana (desde aproximadamente 311 al 332) y un dominio citoplásmico intracelular (desde aproximadamente el aminoácido 333 al 402). El dominio extracelular contiene tres sitios de tripéptidos de consenso (Asn-X-Ser/Thr) de glicosilación de enlaces N potencial comenzando en los residuos de Asn 65, 111 y 292. Además, el dominio extracelular contiene tres sitios potenciales de sulfatación de tirosina en los residuos 46, 48, 51. La región constituida por residuos 55-267 contiene un alto porcentaje de prolina, serina y treonina incluyendo un subdominio de quince repeticiones decaméricas de la secuencia de consenso de 10 aminoácidos Ala-Trh/Met-Glu-Ala-Gln-Thr-Thr-X-Pro/Leu-Ala/Thr, en donde X puede ser Pro, Ala, Gln, Glu o Arg. Regiones tales como éstas son características de proteínas altamente O-glicosiladas.
Las supresiones sustanciales de la secuencia de PSGL-1 se pueden realizar mientras se mantiene la actividad de proteínas de ligandos de P-selectina. Por ejemplo, la PSGL-1 comprendiendo la secuencia desde el aminoácido 42 al aminoácido 189, la secuencia desde el aminoácido 42 al aminoácido 118 o la secuencia desde el aminoácido 42 al aminoácido 89 de SEQ ID Nº: 1, mantienen cada una la actividad ligante de proteínas de PSGL-1 P-selectina y la capacidad para el enlace con E-selectina. Las proteínas de PSGL-1, en la que uno o más sitios de glicosilación con enlaces de N (tal como en los aminoácidos 65, 111 y 292) han sido cambiados a otros aminoácidos o suprimidos, conservando también la actividad ligante de proteínas de P-selectina y la capacidad para el enlace con P-selectina. Las proteínas de ligandos de P-selectina que comprenden desde el aminoácido 42 al aminoácido 60 (que incluye una región altamente aniónica de la proteína desde el aminoácido 45 al aminoácido 58) conservan también la actividad proteínica de ligandos de P-selectina; sin embargo, las proteínas de ligandos de P-selectina, limitadas a dicha secuencia, no enlazan con P-selectina. Preferentemente, una aminoácido de ligandos de P-selectina conserva al menos uno (más preferentemente al menos dos y más preferentemente más todavía tres) de los residuos de tirosina encontrados 46, 48 y 51, cuya sulfatación puede contribuir a la actividad de proteína de ligandos de P-selectina.
Todas las referencias a la secuencia de aminoácidos de PSGL-1 están basadas en la secuencia de aminoácidos de PSGL-1 establecida en la patente de los Estados Unidos Nº 5.827.817 y aquí referida como SEQ ID Nº: 1.
Ejemplos
Procedimientos: Procedimientos generales para purificar proteínas se dan a conocer en Janson, J.C., y L. Ryden (eds.) (Purificación de proteínas. Principios, métodos y aplicaciones de alta resolución. VCH Publisher, Inc. New York (1989), Patente de los Estados Unidos Nº 5.429.746, titulada Purificación de anticuerpos y la patente de los Estados Unidos Nº 5.115.101, titulada Extracción de proteína desde las preparaciones de anticuerpos.
Ejemplo 1 Purificación de proteína de fusión PSGL-Ig recombinante - proceso I (para fines de ilustración solamente)
Este ejemplo describe la purificación de una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante cromatografía de columna (Figura 1).
Una proteína de ligandos de P-selectina soluble fue expresada en células CHO y los medios acondicionados fueron recogidos para purificación de la proteína. Una columna de Q-Sepharosa^{TM} Fast Flow (Amersham Pharmacia), con una profundidad de lecho de 8 cm, fue preparada según las instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna para PSGL, en medios acondicionados, es de aproximadamente 1 mg PSGL-ml resina.
La cromatografía de intercambio aniónico fue realizada como sigue. Los medios acondicionados de CHO microfiltrados fueron cargados en la columna a aproximadamente pH 7, con una conductividad menor que 20 mS/cm. La columna fue lavada con 20 mM de histidina, 400 mM de NaCl, pH 6,5 para eliminar la rPSGL-1g hiposulfatada, por ejemplo, 4 o menos sulfataciones. Las etapas de carga y de lavado fueron realizadas en 3,5 cm/minuto. La columna fue eluída a pH 6,5 con una solución 1 M de NaCl, 20 mM de histidina, pH 6,5 a <1,1 cm/minuto. El pH de esta etapa podría estar comprendido entre pH 4 y 8, pero es preferentemente pH 6,5. El pico eluído contiene PSGL-Ig, ADN e histonas así como otros contaminantes. La columna Q tiene el ADN ligado mientras que las histonas se añaden al ADN. La elución de PSGL (causada al elevar la concentración de sal) coincide con la elución de ADN. La pureza de PSGL-Ig es >80%. Solamente el 50% del ADN es eliminada mediante esta etapa.
Bajo estas condiciones se purifican preferentemente moléculas de rPSGL-Ig hipersulfatadas, por ejemplo, cinco o seis sulfataciones. El rPSGL-Ig activo tiene, en condiciones ideales, cinco o seis sulfataciones en las tirosinas de terminales N.
\newpage
El eluente procedente de la columna de intercambio aniónico fue purificado todavía más utilizando una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) como sigue.
Una columna de Phenyl Toyopearl 650ºC (Rohm y Haas) con una profundidad de lecho de 9 cm fue preparada según las instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna de HIC es de aproximadamente 3,5 mg PSGL-ml resina. La columna fue equilibrada en 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 a \leq 1,3 cm/minuto. El efluente procedente de la columna de Q Sepharose fue ajustado a 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,5 añadiendo solución de 3 M de sulfato amónico, 50 mM Tris, pH 7,4 y fue cargado en el HIC. Como alternativa, la carga pudo realizarse en 4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato amónico. La columna fue lavada con 1,2 de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4. Las etapas de carga y de lavado se realizaron a una velocidad aproximada de 1,3 cm/minuto. La columna de HIC fue eluída con 0,48 M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 a una velocidad de 0,65 cm/minuto. Bajo estas condiciones, la columna de HIC elimina primariamente las histonas de H2A y H2B, que no enlazan con el ADN tan estrechamente como las histonas H3 y H4. Las histonas H2 aparecen en la fracción de lavado y el pico contiene histonas H3 y H4 y algunas histonas H2. Además, una gran pluralidad del ADN permanece en las histonas y es objeto de elusión en el pico. El producto tiene una pureza superior al 95% de proteínas contaminantes y un 85% del ADN se elimina mediante esta etapa.
El eluente procedente de la columna HIC fue purificado todavía aún más purificando una columna de cromatografía de quelatos metálicos (IMAC) como sigue.
Una columna de IMAC Copper (II) de Fractogel Chelate (M) (E. Merck) fue preparada según las instrucciones del fabricante. La columna de IMAC tenía una profundidad de lecho de 6,47 2 cm y una capacidad de aproximadamente 6,6 mg PSGL/mL resina.
La columna fue equilibrada con 50 mm de fosfato potásico (KPO_{4}), 2,0 M de NaCl, 2 mM de imidazol, pH 7 para 5 cv a \leq 5 cm/minuto. El eluente procedente de la columna HIC fue ajustado a 2 mM imidazol, 50 mM de KPO_{4}, pH 7 y 200 mM de NaCl y cargado en la columna de IMAC. La columna fue lavada primero con solución tampón equlibradora y luego fue lavada con 40 mM MES, 1 M NaCl, 5 mM imidazol, pH 6,6 a \leq 5 cm/minuto. Esta baja concentración de sal no rompe el complejo de histona/ADN en la columna de IMAC. La columna fue eluída con 40 mM, 1 M NaCl, y 35 mM de imidazol con un pH de 6,6. La columna de IMAC elimina primariamente las histonas H3 y H4. Las histonas H3 y H4 y algunas histonas H2 están en la banda, aunque algunas histonas H3 y H2 se encuentran en el pico de IMAC. El producto resultante tiene una pureza superior al 99,9% de proteínas contaminantes y esta etapa elimina un 95% del ADN. Globalmente, hay unos 2,5 LRV de aclaramiento del ADN a partir de este proceso completo.
Este proceso permitió el transporte de ADN a través del tren completo del proceso, puesto que el ADN está directamente ligado con la columna Q. En la etapa Q, el ADN está también unido a las histonas (p.e., H2A, H2B, H3 y H4) que son proteínas ligantes de ADN que se encuentran naturalmente y que están presentes en nuestra carga a la columna Q. En la columna Q, por lo tanto, había una especie de "emparedado", en el que el ADN está ligado a la columna Q y las histonas están ligadas al ADN. En las etapas posteriores, el "emparedado" fue invertido, puesto que el ADN no está ligado directamente a la columna de HIC o la columna de IMAC. En cambio, las histonas están ligadas a la columna de HIC o IMAC y el ADN está ligado a las histonas. Cuando las histonas se eluyen desde la columna de HIC o IMAC, transportan consigo la contaminación del ADN. Una eliminación deficiente del ADN, debido a las interacciones de ADN/proteína, pueden encontrarse, con frecuencia, en la purificación de las proteínas, sobre todo en el caso de proteínas objetivo altamente aniónicas y sobre todo, donde estas proteínas aniónicas son eluídas desde una columna de intercambio aniónico.
Ejemplo 2 Purificación de proteína de fusión PSGL-Ig recombinante - proceso II (para fines de ilustración solamente)
En este ejemplo se describe la purificación de una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante (rPSGL-Ig) mediante cromatografía de columna incluyendo la etapa de disociar los complejos de histonas/ADN contaminantes con sal o un alcohol, aumentando así la pureza de las proteínas de PSGL-Ig (Figura 2).
Una etapa de cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose fue realizada según se describe en el
ejemplo 1.
El eluente procedente de la columna de intercambio aniónico fue purificado todavía más utilizando una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) como sigue. Una columna de Phenyl Toyopearl 650ºC (Rohm y Haas), con una profundidad de lecho de 9 cm, fue preparada según las instrucciones del fabricante y equilibrada en 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris y pH 7,4. El pH de esta etapa podía estar entre 6 y 8, pero es preferentemente pH 7,4.
El pico de Q fue ajustado a 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 añadiendo 3 M de sulfato amónico, 50 mM Tris pH 7,4 y cargado en la columna. Como alternativa, la carga podría realizarse en 4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato amónico. La columna fue lavada con 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris pH 7,4 seguido por un lavado con 4 M de NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4. El lavado con 4 M de NaCl elimina un 90% (o 1 log_{10} reducción logarítmica o 1 LRV) del ADN desde la columna. Como alternativa se pudo lavar con una solución al 5% de isopropanol y 1,2 M de sulfato amónico. Esto elimina un 99,9% del ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de etanol y 1,2 M de sulfato amónico. Esto elimina un 99,9% de ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica", o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de etanol y 4 M de NaCl. Esto elimina un 99,9% de ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de isopropanol y 4 M de NaCl. Esto elimina un 99,9% de ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Las etapas de carga y lavado se realizaron a una velocidad aproximada de 1,3 cm/minuto. A continuación, la columna fue eluída con 0,48 m de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 a una velocidad de 0,65 cm/minuto.
Como se describió anteriormente, esta HIC, con estas condiciones, elimina primariamente las histonas H2A y H2B, que no se enlazan con el ADN tan estrechamente como las histonas H3 y H4. Las histonas H2 aparecen en el lavado. El pico contiene H3 y H4, con algunas histonas H2. Sin embargo, hemos encontrado que lavando con más alta concentraciones de sal, se puede romper la interacción de ADN/histona. De este modo, lavando, por ejemplo, con 4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato amónico, el ADN se rompe separándose de la histona y se elimina en el lavado. Bajo estas condiciones, una gran pluralidad de ADN se elimina en el lavado y las histonas siguen su elución en el pico. Esta etapa de HIC podría, como alternativa, realizarse después de la etapa de IMAC (véase más adelante). Esto podría resultar en un 99,9% de más eliminación del ADN (3 LRV).
El eluente procedente de la columna de HIC se purificó todavía más utilizando una columna de cromatografía de quelato metálico (IMAC) como sigue.
Una columna de IMAC Copper (II) en Fractogel Chelate (M) (E. Merck) fue preparada siguiendo las instrucciones del fabricante. La columna de IMAC tenía una profundidad de lecho de 6,4 a 7,2 cm y una capacidad aproximada de 6,6 mg PSGL/ml resina. El pH de esta etapa puede estar comprendido entre 4,8 y 8, pero es preferentemente de pH 6,6.
La columna fue equilibrada con 50 mM de fosfato potásico (KPO_{4}), 2,0 M de NaCl, 2 mM de imidazol, pH 7 para 5 cv a \leq 5 cm/minuto. Como alternativa, la columna se puede equilibrar a 200 mM de NaCl en lugar de 2 M de NaCl. El eluente desde la columna de HIC fue ajustado a 2 mM de imidazol, 50 mM de KPO4, pH 7, 200 mM de NaCl y cargado en la columna de IMAC. Como alternativa, la carga se puede realizar a 200 mM de NaCl en lugar de 2 M de NaCl.
La columna fue lavada primero con solución tampón de equilibrado y luego fue lavada con 40 mM MES, 2 M NaCl, 5 mM Imidazol, pH 6,6 a \leq 5 cm/minuto. La columna fue eluída con 40 mM MES, 1 M NaCl, 35 mM imidazol con pH 6,6. La columna de IMAC elimina primariamente las histonas H3 y H4. Estas histonas, y algunas histonas H2, están en la banda. Algunas histonas H3 y H2 se encuentran también en el pico de IMAC.
Esta etapa elimina un 90% más ADN que la etapa de proceso I del ejemplo 1(1 LRV) utilizando la carga muy salina o el lavado muy salino. La novedad de esta etapa es cargar con 2 M NaCl o lavar con 2 M NaCl para eliminar el ADN de complejo de histonas/ADN. Las histonas se adhieren a la columna de IMAC y el ADN se adhiere a las histonas. Puesto que el ADN se une mejor al complejo de H3/H4 que al de H3/H2 o a simplemente complejo de H2, sería beneficiosa la eliminación del complejo de H3/H4 lo más pronto posible en el proceso. De este modo, realizando el HIC después de IMAC se ha demostrado que se puede conseguir más aclaración de ADN (99,9% más aclaramiento o 3 LRV). Por lo tanto, introduciendo el IMAC lo antes posible en el proceso se podría obtener una reducción adicional de ADN. Sin embargo, IMAC como la primera etapa exigiría una ultrafiltación/diafiltración para eliminar los aminoácidos de pequeño peso molecular y otros grupos que contienen aminas desde la carga.
Ejemplo 3 Purificación de proteína de fusión PSGL-Ig recombinante - proceso III (para fines de ilustración sólo)
En este ejemplo se describe un método alternativo para la purificación de una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante cromatografía de columna. A diferencia del plan de purificación descrito en el ejemplo 1, este proceso utiliza una etapa de afinidad como la primera etapa de purificación (figura 3). La etapa de purificación de afinidad utiliza Proteína A que enlaza con la parte Fc de la quimera de rPSGL-Ig. El rPSGL-Ig es eluido desde la columna de Proteína A con bajo pH, en este caso pH 3,7. La etapa de Proteína A proporciona mejor aclaramiento si la columna se lava con 1 M NaCl después de la carga. Esta concentración de sal es más alta que la que se suele utilizarse (normalmente de 150 mM NaCl) y por lo tanto, es una característica nueva. El aclaramiento del ADN desde esta etapa varía desde el valor de 4 log_{10} reducción logarítmica (LRV) a 6 LRV con la adición de esta etapa salina. Esto representa un incremento de 100 veces en la eliminación de ADN.
La etapa de Proteína A no parece favorecer la unión con las histonas y proporciona un buen aclaramiento del ADN. De este modo, las histonas no están notablemente presentes en las etapas que siguen a la etapa de Proteína A. Sin embargo, puesto que la Proteína A es objeto de lixiviación desde la columna de Proteína A, las etapas posteriores se realizan para eliminar la Proteína A. Un procedimiento nuevo para eliminar la proteína A lixiviada es cargar el eluato de proteína A directamente en la columna Q, con un pH neutro o bajo o lavar la columna Q con bajo pH. Las columnas Q no suelen funcionar a pH bajo y especialmente no con pH 4. Por lo tanto, la captura del rPSGL-Ig directamente desde el eluato de proteína A o el lavado de la columna Q a bajo pH, o una combinación de ambos, es una característica nueva. Puesto que el rPSGL-Ig y la Proteína A están a bajo pH, una gran pluralidad de rPSGL-Ig no está ligada a la Proteína A lixiviada. Como resultado, la Proteína A no está ligada a la columna Q, sino que se encuentra en el flujo pasante de columna Q. Ésta es también una característica nueva. Por lo tanto, se está utilizando la columna Q para la eliminación de Proteína A.
Una columna de Protein A Fast Flow (Amersham Pharmacia), con una profundidad de lecho de 6 a 10 cm, se prepara según las instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna es de aproximadamente 1 mg/mL a 6 mg/mL. La columna es equilibrada con 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,2 a 8, preferentemente pH 7,4. El medio acondicionado microfiltrado se carga en la columna entre pH 7 y pH 8, preferentemente pH 7,4, a una velocidad aproximada de 30-300 cm/hora, preferentemente 150 cm/hora. La columna se lava con 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7 a 8, preferentemente pH 7,4 y es objeto de elución con 20 mM citrato, pH 3 a 4, preferentemente pH 3,7, a una velocidad de 50-300 cm/hora. La pureza es >95% para proteínas y >99% del ADN se elimina mediante esta etapa.
El eluente procedente de la columna de Proteína A se purifica todavía más en una columna Q Sepharose^{TM} Fast Flow (Amersham Pharmacia) con una profundidad de lecho de 8 cm. La capacidad de la columna Q Sepharose para PSGL a pH 3,6 a 4,0, preferentemente pH 3,8, después de la etapa de Proteína A, es aproximadamente \geq 6 mg PSGL/mL resina.
El pico de Proteína A se carga directamente en la columna de Q Sepharose sin ajustar el pH o el pico se neutraliza antes de la carga de la columna Q Sepharose. En uno u otro caso, la columna se lava con 200 mM NaCl y 200 mM citrato a pH 3,5 a 4, preferentemente pH 3,7, para eliminar la proteína A residual. Ambos métodos eliminan la proteína A lixiviada, rPSGL-Ig hiposulfatada, rPSGL-Ig recortada con N-terminal y pro-rPSGL-Ig (una especie precursora para rPSGL-Ig que no tiene segmentación enzimática del N-terminal). Después del lavado con pH 3,5 a 4, la columna pudo lavarse con 20 mM histidina, 400 mM NaCl, pH 6,5 para eliminar la rPSGL-Ig hiposulfatada. Las moléculas de la rPSGL-Ig hiposulfatada tienen cuatro o menos sulfataciones, mientras que el PSGL-Ig activo tiene, en condiciones ideales, 5 ó 6 sulfataciones en las tirosinas de terminales N. Las etapas de carga y lavado de la columna se realizan a una velocidad de 3,5 cm/minuto. La columna es eluída a pH 6,5 con 1 M NaCl, 20 mM de histidina, con pH 6,5. Como alternativa, se pudo eluir a pH 3,5 a 4,0, preferentemente pH 3,8, en 500 mM NaCl, 20 mM citrato a <1,1 cm/minuto. Las proteínas representan menos del 2% del valor de pico.
<110> Genetics Institute, Inc.
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<120> Procedimientos para purificar proteínas altamente aniónicas
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<130> GFN-002PC
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<140>
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<141>
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<150> US 60/193.351
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<151> 27.3.2000
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<160> 1
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<170> Patente versión 2.0
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<210> 1
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<211> 402
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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1
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2
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3
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Claims (5)

1. Procedimiento para purificar una proteína objetivo altamente aniónica en una muestra de una serie de complejos de ADN/histona, que comprende los pasos de:
(a)
purificación de la cromatografía de intercambio iónico de la proteína objetivo;
(b)
carga la muestra purificada de cromatografía de intercambio iónico que contiene la proteína a través en una columna de cromatografía de quelatos metálicos, de modo que la muestra sea capturada en la columna; y
(c)
lavar la columna,
de modo que tanto la etapa de carga (b) o la etapa de lavado (c) utilicen una solución con un pH entre 4,8 y 8 y comprendiendo 2 M NaCl para retirar el ADN de la muestra.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína es hipersulfatada.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la proteína es PSGL-1.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de carga utiliza la solución para retirar ADN de la muestra.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de lavado utiliza la solución para retirar ADN de la muestra.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7223848B2 (en) 2001-06-05 2007-05-29 Genetics Institute, Llc Methods for purifying Fc-containing proteins
CA2483476A1 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Absorber, Ab Fusion polypeptides and methods for inhibiting microbial adhesion
US7427659B2 (en) 2003-10-24 2008-09-23 Amgen Inc. Process for purifying proteins in a hydrophobic interaction chromatography flow-through fraction
BRPI0612672B8 (pt) * 2005-06-24 2021-05-25 Cerule Llc composição de extrato aquoso de alga verde-azulada
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
PT1969007E (pt) * 2005-12-20 2013-12-10 Bristol Myers Squibb Co Composições e métodos para a produção de uma composição
US8853371B2 (en) 2006-10-19 2014-10-07 Janssen Biotech, Inc. Process for preparing unaggregated antibody Fc domains
WO2011090720A2 (en) * 2009-12-29 2011-07-28 Dr. Reddy's Laboratories Ltd Purification of proteins
WO2011098526A1 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Dsm Ip Assets B.V. Single unit antibody purification
EP2619217B1 (en) * 2010-09-20 2016-11-09 Bio-Rad Laboratories, Inc. Dissociation of product-complexed contaminants in chromatography
BR112019007856A8 (pt) * 2016-10-28 2023-04-11 Merck Sharp & Dohme Composição, e, método para remover anticorpos de tirosina sulfatada ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos
JP7065105B2 (ja) * 2017-02-09 2022-05-11 ブラッコ・スイス・ソシエテ・アノニム 可溶性psgl-1タンパク質変異体の精製のための方法
US11447547B1 (en) 2017-12-13 2022-09-20 Amgen Inc. Method of antigen-binding protein production

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4723000A (en) * 1983-07-05 1988-02-02 Biospectrum, Inc. Human interferon gamma and interleukin-2
US5115101A (en) 1988-06-08 1992-05-19 Miles Inc. Removal of protein A from antibody preparations
US5378464A (en) * 1989-03-08 1995-01-03 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Modulation of inflammatory responses by administration of GMP-140 or antibody to GMP-140
US5464778A (en) 1989-03-08 1995-11-07 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Glycoprotein ligand for P-selectin and methods of use thereof
US5034133A (en) * 1990-07-26 1991-07-23 Schering-Corporation Purification of human interleukin-4 from a CHO-cell line culture medium
US5530109A (en) * 1991-04-10 1996-06-25 Ludwig Institute For Cancer Research DNA encoding glial mitogenic factors
DE69333346T2 (de) * 1992-10-23 2004-10-07 Inst Genetics Llc Neuartiges p- selectin ligandenprotein
US6277975B1 (en) * 1992-10-23 2001-08-21 Genetics Institute, Inc. Fusions of P-selectin ligand protein and polynucleotides encoding same
US5843707A (en) * 1992-10-23 1998-12-01 Genetics Institute, Inc. Nucleic acid encoding a novel P-selectin ligand protein
US5429746A (en) 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
DE69522492T2 (de) 1994-04-09 2002-05-23 Hoffmann La Roche Verfahren zur Herstellung von Alpha-Interferon
US6008328A (en) 1994-10-13 1999-12-28 Amgen Inc. Method for purifying keratinocyte growth factors
SE503424C2 (sv) 1994-11-14 1996-06-10 Pharmacia Ab Process för rening av rekombinant koagulationsfaktor VIII
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
FR2738009B1 (fr) 1995-08-24 1997-10-31 Centre Nat Rech Scient Procede d'obtention de polysaccharides sulfates
HU222666B1 (hu) 1996-11-15 2003-09-29 Genentech, Inc. Eljárás neuorotrofinok tisztítására
AU9695698A (en) * 1997-10-14 1999-05-03 Avant Immunotherapeutics, Inc. Method for purifying retroviral particles and soluble viral antigens

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