ES2343023T3 - Procedimientos para purificar proteinas altamente anionicas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra de una serie de complejos de ADN/histona, que comprende los pasos de: (a) purificación de la cromatografía de intercambio iónico de la proteína diana; (b) cargar la muestra purificada de cromatografía de intercambio iónico que contiene la proteína a través en una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, de modo que la muestra sea capturada en la columna; y (c) lavar la columna, caracterizado porque el paso de lavado utiliza una solución que comprende: - aproximadamente un 5% de isopropanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico, - aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico, - aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 4 M de NaCl.
Description
Procedimientos para purificar proteínas
altamente aniónicas.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La purificación de proteínas diana se suele
dificultar por la deficiente extracción del ADN debido a las
interacciones ADN/proteína. Dichas interacciones son más
problemáticas en la purificación de proteínas diana altamente
aniónicas, por ejemplo, proteínas sulfatadas.
La patente WO 95/22389 A1 describe un
procedimiento para purificar anticuerpos mediante cromatografía de
intercambio de iones y cromatografía de interacción hidrofóbica,
donde el ADN se elimina mediante la cromatografía de interacción
hidrofóbica.
La presente invención proporciona un
procedimiento para aislar y purificar proteínas diana altamente
aniónicas, por ejemplo, proteínas sulfatadas. Las proteínas
aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa neta. Las
proteínas sulfatadas son proteínas en las que la carga negativa neta
se debe a por lo menos un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de
una proteína diana se refiere a la sustitución de al menos un (1)
residuo sulfatado. La sulfatación de una proteína diana se refiere
a la sustitución de al menos un grupo hidroxilo (-OH) con
-SO_{4}H en o entre los aminoácidos contenidos dentro de la
proteína diana. En una forma de realización preferida, la proteína
sulfatada tiene al menos un (1) grupo de sulfatos. Las proteínas
sulfatadas que contienen al menos dos (2), tres (3), cuatro (4),
cinco (5), seis (6) o más grupos de sulfatos son abarcadas también
por los procedimientos actuales, por ejemplo, seis grupos de
sulfatos sobre las tirosinas N-terminal según se
materializa en PSGL-1 (ligando de
P-selectina glicoproteína-1).
La invención proporciona un procedimiento para
purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra de
una serie de complejos de ADN/histona, que comprende los pasos
de:
- (a)
- purificación de la cromatografía de intercambio iónico de la proteína diana;
- (b)
- cargar la muestra purificada de cromatografía de intercambio iónico que contiene la proteína a través en una columna de cromatografía de quelatos metálicos, de modo que la muestra sea capturada en la columna; y
- (c)
- lavar la columna,
caracterizado porque el paso de lavado utiliza
una solución que comprende:
- -
- aproximadamente un 5% de isopropanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico,
- -
- aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico,
- -
- aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 4 M de NaCl.
En un aspecto, el procedimiento para purificar
proteínas diana altamente aniónicas comprende las etapas de
cromatografía de intercambio iónico bajo condiciones apropiadas para
la purificación de las proteínas diana. Por ejemplo, el
procedimiento dado a conocer consiste en: (1) poner en contacto la
muestra con un sustrato capaz de unir, de forma reversible, las
moléculas cargadas, de tal modo que las proteínas diana queden
ligadas con el sustrato (2); lavar el sustrato con una primera
solución de lavado bajo condiciones apropiadas, de modo que una
pluralidad de impurezas proteináceas y no proteináceas en la muestra
no queden ligadas o se eliminen por lavado de sustrato, mientras
que las proteínas diana altamente aniónicas permanecen ligadas; (3)
eluir la muestra con una primera solución de elución en la que
dicha primera solución de elución comprende una solución salina con
una alta concentración molar y (4) recoger la muestra eluída, que
contenga las proteínas diana aniónicas purificadas.
En una realización, el pH de la primera solución
de lavado es aproximadamente 4,0 a 8,0. En otra forma de
realización, el pH aproximado de la primera solución de lavado es
6,5.
En una forma de realización preferida, la
proteína diana altamente aniónica es una proteína sulfatada y las
impurezas incluyen una forma sulfatada de la proteína diana.
En otro aspecto, la muestra eluída a partir de
la purificación de la cromatografía de intercambio iónico, que
contiene las proteínas diana purificadas, se purifica todavía más.
Esta purificación adicional las etapas de cromatografía de
interacción hidrofóbica, bajo condiciones apropiadas para la
purificación de las proteínas diana altamente aniónicas. Por
ejemplo, esta purificación adicional proporciona las etapas de: (1)
pasar la muestra eluída que contenga las proteínas diana a través
de una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, de modo
que la muestra eluída sea capturada en la columna; (2) lavar la
columna con una segunda solución de lavado bajo condiciones
apropiadas, de modo que se disocien los complejos de ADN/histona
contenidos en la muestra; caracterizado porque la segunda solución
de lavado se seleccionar del grupo compuestos de (a) una solución
que comprende aproximadamente un 5% de isopropanol y aproximadamente
1,2 M de sulfato amónico, (b) una solución de aproximadamente un 5%
de etanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico, y (c) una
solución de aproximadamente un 5% de etanol y 4 M de NaCl, (3)
eluir la muestra con una segunda solución de elución, y (4) recoger
la muestra eluída, que contiene las proteínas diana altamente
aniónicas purificadas.
En otro aspecto, las proteínas diana tienen al
menos una (1) sulfatación. Las proteínas diana aniónicas que tienen
al menos dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más
sulfataciones son también dadas a conocer; por ejemplo, proteínas
PSGL-1. Las proteínas aniónicas capaces de
purificarse por los procedimientos dados a conocer pueden ser
proteínas que se presentan de forma natural o proteínas
recombinantes.
En una forma de realización preferida, el
procedimiento de purificación dado a conocer proporciona proteínas
diana altamente aniónicas purificadas al menos un 99,9% puras de
proteínas contaminantes.
En otra forma de realización dada a conocer, el
procedimiento de purificación de la invención elimina al menos un
95% o 2,5 log_{10} valor de reducción logarítmica (LRV) del ADN
contaminante desde las proteínas diana altamente aniónicas.
Las figuras 1-3 ilustran los
procedimientos de purificación que se describen en la presente, es
decir, procesos I-III tal como se describe en los
Ejemplos.
Todas las figuras y ejemplos son esencialmente
sólo a efectos de ilustración.
La presente invención se basa, al menos en
parte, en el descubrimiento de nuevos procedimientos para purificar
proteínas diana altamente aniónicas, por ejemplo, proteínas
sulfatadas (p.e., PSGL-1). Las proteínas aniónicas
son proteínas que tienen una carga negativa neta. Las proteínas
sulfatadas son proteínas aniónicas en las que la carga negativa es
debida al menos a una, o más preferentemente, cinco (5) o más
sulfataciones, por ejemplo, al menos seis (6) sulfataciones. Las
sulfataciones en una proteína diana se refieren a la sustitución de
al menos un grupo hidroxilo (-OH) con - -SO_{4}H en o entre
aminoácidos contenidos dentro de la proteína diana. Las
sulfataciones pueden ocurrir, por ejemplo, en las tirosinas de
N-terminal, según se materializa en
PSGL-1.
En una forma de realización preferida, la
proteína sulfatada es PSGL-1, por ejemplo,
PSGL-1 que comprende el conjunto de aminoácidos
dado a conocer en la patente de los Estados Unidos Nº 5.827.817. La
secuencia completa de aminoácidos de la proteína
PSGL-1 (por ejemplo, el péptido maduro más la
secuencia líder) está caracterizada por la secuencia de aminoácidos
dada a conocer en la patente de los Estados Unidos 5.827.817, desde
el aminoácido 1 al aminoácido 402 y aquí dada a conocer como ID SEQ
Nº 1. El análisis de la hidrofobicidad y su comparación con los
modelos de segmentación conocidos predicen una secuencia de señales
de 20 a 22 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos 1 a 20 o
aminoácidos 1 a 22 de PSGL-1. PSGL-1
contiene un sitio de segmentación
(-Arg-Asp-Arg-Arg-)
de PACE (enzima de conversión de aminoácidos básicos pareados) en
los residuos de aminoácidos 38-41. La proteína
PSGL-1 madura está caracterizada por la secuencia de
aminoácidos establecida en SED ID Nº 1 desde el aminoácido 42 al
aminoácido 402. Una forma soluble de la proteína de ligandos de
P-selectina está caracterizada por los aminoácidos
21 a 310 de la secuencia de aminoácidos dada a conocer en la patente
de los Estados Unidos Nº 5.827.817. Otra forma soluble de la
proteína PSGL-1 madura está caracterizada por la
secuencia de aminoácidos dada a conocer en la patente de los
Estados Unidos 5.827.817 desde el aminoácido 42 al aminoácido 310.
La forma soluble de la proteína de ligandos de
P-selectina está caracterizada, además, por ser
soluble en solución acuosa a la temperatura ambiente.
PSGL-1 es una glicoproteína que
puede contener uno o más de los carbohidratos terminales
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
donde R = resto de la cadena de
carbohidratos, está de forma covalente unida directamente a la
proteína de ligandos de P-selectina o a una mitad
molecular de lípidos que está, de forma covalente, unida a la
proteína de ligandos de P-selectina.
PSGL-1 puede sulfatarse adicionalmente o de otro
modo, modificarse posteriormente a su traducción. Tal como se
expresa en las células de COS y CHO, la proteína de ligandos de
P-selectina de longitud completa es una proteína
homodimérica, que tiene un peso molecular aparente de 220 kD tal
como se demuestra por la electroforesis de gel de
SDS-poliacrilamida no
reductora.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La estructura de la secuencia
PSGL-1 de longitud completa incluye un dominio
extracelular (desde aproximadamente el aminoácido 21 al 310), un
dominio de transmembrana (desde aproximadamente el aminoácido 311 al
332) y un dominio citoplásmico intracelular (desde aproximadamente
el aminoácido 333 al 402). El dominio extracelular contiene tres
sitios de tripéptidos de consenso
(Asn-X-Ser/Thr) de glicosilación de
enlaces N potencial comenzando en los residuos de Asn 65, 111 y
292. Además, el dominio extracelular contiene tres sitios
potenciales de sulfatación de tirosina en los residuos 46, 48, 51.
La región constituida por residuos 55-267 contiene
un alto porcentaje de prolina, serina y treonina incluyendo un
subdominio de quince repeticiones decaméricas de la secuencia de
consenso de 10 aminoácidos
Ala-Trh/Met-Glu-Ala-Gln-Thr-Thr-X-Pro/Leu-Ala/Thr,
en donde X puede ser Pro, Ala, Gln, Glu o Arg. Regiones tales como
éstas son características de proteínas altamente
O-glicosiladas.
Las supresiones sustanciales de la secuencia de
PSGL-1 se pueden realizar mientras se mantiene la
actividad de proteínas de ligandos de P-selectina.
Por ejemplo, la PSGL-1 comprendiendo la secuencia
desde el aminoácido 42 al aminoácido 189, la secuencia desde el
aminoácido 42 al aminoácido 118 o la secuencia desde el aminoácido
42 al aminoácido 89 de SEQ ID Nº: 1, mantienen cada una la actividad
ligante de proteínas P-selectina y la capacidad
para el enlace con E-selectina. Las proteínas de
PSGL-1, en la que uno o más sitios de glicosilación
con enlaces de N (tal como en los aminoácidos 65, 111 y 292) han
sido cambiados a otros aminoácidos o suprimidos, conservando
también la actividad ligante de proteínas de
P-selectina y la capacidad para el enlace con
P-selectina. Las proteínas de ligandos de
P-selectina que comprenden desde el aminoácido 42 al
aminoácido 60 (que incluye una región altamente aniónica de la
proteína desde el aminoácido 45 al aminoácido 58) conservan también
la actividad proteínica de ligandos de P-selectina;
sin embargo, las proteínas de ligandos de
P-selectina, limitadas a dicha secuencia, no
enlazan con E-selectina. Preferentemente, un
aminoácido de ligandos de P-selectina conserva al
menos uno (más preferentemente al menos dos y todavía más
preferentemente tres) de los residuos de tirosina encontrados en
los aminoácidos 46, 48 y 51, cuya sulfatación puede contribuir a la
actividad de proteína de ligandos de
P-selectina.
Todas las referencias a la secuencia de
aminoácidos de PSGL-1 están basadas en la secuencia
de aminoácidos de PSGL-1 establecida en la patente
de los Estados Unidos Nº 5.827.817 y aquí referida como SEQ ID Nº:
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos: Procedimientos generales para
purificar proteínas se dan a conocer en Janson, J.C., y L. Ryden
(eds.) (Purificación de proteínas. Principios, métodos y
aplicaciones de alta resolución. VCH Publishers, Inc. New York
(1989), Patente de los Estados Unidos Nº 5.429.746, titulada
Purificación de anticuerpos y la patente de los Estados Unidos Nº
5.115.101, titulada Extracción de proteína desde las preparaciones
de anticuerpos.
Este ejemplo describe la purificación de una
proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante
cromatografía de columna (Figura 1).
Una proteína de ligandos de
P-selectina soluble fue expresada en células CHO y
los medios acondicionados fueron recogidos para purificación de la
proteína. Una columna de Q-Sepharosa^{TM} Fast
Flow (Amersham Pharmacia), con una profundidad de lecho de 8 cm,
fue preparada según las instrucciones del fabricante. La capacidad
de la columna para PSGL, en medios acondicionados, es de
aproximadamente 1 mg PSGL-ml resina.
La cromatografía de intercambio aniónico fue
realizada como sigue. Los medios acondicionados de CHO
microfiltrados fueron cargados en la columna a aproximadamente pH
7, con una conductividad menor que 20 mS/cm. La columna fue lavada
con 20 mM de histidina, 400 mM de NaCl, pH 6,5 para eliminar la
rPSGL-1g hiposulfatada, por ejemplo, 4 o menos
sulfataciones. Las etapas de carga y de lavado fueron realizadas en
3,5 cm/minuto. La columna fue eluída a pH 6,5 con una solución 1M
de NaCl, 20 mM de histidina, pH 6,5 a <1,1 cm/minuto. El pH de
esta etapa podría estar comprendido entre pH 4 y 8, pero es
preferentemente pH 6,5. El pico eluído contiene
PSGL-Ig, ADN e histonas así como otros
contaminantes. La columna Q tiene el ADN ligado mientras que las
histonas se añaden al ADN. La elución de PSGL (causada al elevar la
concentración de sal) coincide con la elución de ADN. La pureza de
PSGL-Ig es >80%. Solamente el 50% del ADN es
eliminado mediante esta etapa.
Bajo estas condiciones se purifican
preferentemente moléculas de rPSGL-Ig
hipersulfatadas, por ejemplo, cinco o seis sulfataciones. El
rPSGL-Ig activo tiene, en condiciones ideales, cinco
o seis sulfataciones en las tirosinas de terminales N.
El eluente procedente de la columna de
intercambio aniónico fue purificado todavía más utilizando una
columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) como
sigue.
Una columna de Phenyl Toyopearl 650ºC (Rohm y
Haas) con una profundidad de lecho de 9 cm fue preparada según las
instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna de HIC es
de aproximadamente 3,5 mg PSGL-ml resina. La
columna fue equilibrada en 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH
7,4 a \leq 1,3 cm/minuto. El efluente procedente de la columna de
Q Sepharose fue ajustado a 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH
7,4 añadiendo solución de 3 M de sulfato amónico, 50 mM Tris, pH
7,5 y fue cargado en el HIC. Como alternativa, la carga pudo
realizarse en 4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato amónico. La
columna fue lavada con 1,2 de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4.
Las etapas de carga y de lavado se realizaron a una velocidad
aproximada de 1,3 cm/minuto. La columna de HIC fue eluída con 0,48
M de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 a una velocidad de 0,65
cm/minuto. Bajo estas condiciones, la columna de HIC elimina
primariamente las histonas de H2A y H2B, que no enlazan con el ADN
tan estrechamente como las histonas H3 y H4. Las histonas H2
aparecen en la fracción de lavado y el pico contiene histonas H3 y
H4 y algunas histonas H2. Además, una gran pluralidad del ADN
permanece en las histonas y es objeto de elusión en el pico. El
producto tiene una pureza superior al 95% de proteínas contaminantes
y un 85% del ADN se elimina mediante esta etapa.
El eluente procedente de la columna HIC fue
purificado todavía aún más purificando una columna de cromatografía
de quelatos metálicos (IMAC) como sigue.
Una columna de IMAC Copper (II) de Fractogel
Chelate (M) (E. Merck) fue preparada según las instrucciones del
fabricante. La columna de IMAC tenía una profundidad de lecho de
6,4-7, vs2 cm y una capacidad de aproximadamente 6,6
mg PSGL/mL resina.
La columna fue equilibrada con 50 mm de fosfato
potásico (KPO_{4}), 2,0 M de NaCl, 2 mM de imidazol, pH 7 para 5
cv a \leq 5 cm/minuto. El eluente procedente de la columna HIC fue
ajustado a 2 mM imidazol, 50 mM de KPO_{4}, pH 7 y 200 mM de NaCl
y cargado en la columna de IMAC. La columna fue lavada primero con
solución tampón equlibradora y luego fue lavada con 40 mM MES, 1 M
NaCl, 5 mM imidazol, pH 6,6 a \leq 5 cm/minuto. Esta baja
concentración de sal no rompe el complejo de histona/ADN en la
columna de IMAC. La columna fue eluída con 40 mM, 1 M NaCl, y 35 mM
de imidazol con un pH de 6,6. La columna de IMAC elimina
primariamente las histonas H3 y H4. Las histonas H3 y H4 y algunas
histonas H2 están en la banda, aunque algunas histonas H3 y H2 se
encuentran en el pico de IMAC. El producto resultante tiene una
pureza superior al 99,9% de proteínas contaminantes y esta etapa
elimina un 95% del ADN. Globalmente, hay unos 2,5 LRV de
aclaramiento del ADN a partir de este proceso completo.
Este proceso permitió el transporte de ADN a
través del tren completo del proceso, puesto que el ADN está
directamente ligado con la columna Q. En la etapa Q, el ADN está
también unido a las histonas (p.e., H2A, H2B, H3 y H4) que son
proteínas ligantes de ADN que se encuentran naturalmente y que están
presentes en nuestra carga a la columna Q. En la columna Q, por lo
tanto, había una especie de "emparedado", en el que el ADN está
ligado a la columna Q y las histonas están ligadas al ADN. En las
etapas posteriores, el "emparedado" fue invertido, puesto que
el ADN no está ligado directamente a la columna de HIC o la columna
de IMAC. En cambio, las histonas están ligadas a la columna de HIC
o IMAC y el ADN está ligado a las histonas. Cuando las histonas se
eluyen desde la columna de HIC o IMAC, transportan consigo la
contaminación del ADN. Una eliminación deficiente del ADN, debido a
las interacciones de ADN/proteína, pueden encontrarse, con
frecuencia, en la purificación de las proteínas, sobre todo en el
caso de proteínas diana altamente aniónicas y sobre todo, cuando
estas proteínas aniónicas son eluídas desde una columna de
intercambio aniónico.
En este ejemplo se describe la purificación de
una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante
(rPSGL-Ig) mediante cromatografía de columna
incluyendo la etapa de disociar los complejos de histonas/ADN
contaminantes con sal o un alcohol, aumentando así la pureza de las
proteínas de PSGL-Ig (Figura 2).
Una etapa de cromatografía de intercambio
aniónico en Q Sepharose fue realizada según se describe en el
ejem-
plo 1.
plo 1.
El eluente procedente de la columna de
intercambio aniónico fue purificado todavía más utilizando una
columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) como
sigue. Una columna de Phenyl Toyopearl 650ºC (Rohm y Haas), con una
profundidad de lecho de 9 cm, fue preparada según las instrucciones
del fabricante y equilibrada en 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM
Tris y pH 7,4. El pH de esta etapa podía estar entre 6 y 8, pero es
preferentemente pH 7,4.
El pico de Q fue ajustado a 1,2 M de sulfato
amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 añadiendo 3 M de sulfato amónico,
50 mM Tris pH 7,4 y cargado en la columna. Como alternativa, la carga podría realizarse en 4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato amónico. La columna fue lavada con 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris pH 7,4 seguido por un lavado con 4 M de NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4. El lavado con 4 M de NaCl elimina un 90% (o 1 log_{10} reducción logarítmica o 1 LRV) del ADN desde la columna. Como alternativa se pudo lavar con una solución al 5% de isopropanol y 1,2 M de sulfato amónico. Esto elimina un 99,9% del ADN de la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de etanol y 1,2 M de sulfato amónico. Esto elimina un 99,9% de ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica", o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de etanol y 4 M de NaCl. Esto elimina un 99,9% de ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de isopropanol y 4 M de NaCl. Esto elimina un 99,9% de ADN de la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Las etapas de carga y lavado se realizaron a una velocidad aproximada de 1,3 cm/minuto. A continuación, la columna fue eluída con 0,48 m de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 a una velocidad de 0,65 cm/minuto.
50 mM Tris pH 7,4 y cargado en la columna. Como alternativa, la carga podría realizarse en 4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato amónico. La columna fue lavada con 1,2 M de sulfato amónico, 20 mM Tris pH 7,4 seguido por un lavado con 4 M de NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4. El lavado con 4 M de NaCl elimina un 90% (o 1 log_{10} reducción logarítmica o 1 LRV) del ADN desde la columna. Como alternativa se pudo lavar con una solución al 5% de isopropanol y 1,2 M de sulfato amónico. Esto elimina un 99,9% del ADN de la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de etanol y 1,2 M de sulfato amónico. Esto elimina un 99,9% de ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica", o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de etanol y 4 M de NaCl. Esto elimina un 99,9% de ADN desde la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Como alternativa, se pudo lavar con una solución al 5% de isopropanol y 4 M de NaCl. Esto elimina un 99,9% de ADN de la columna ("3 log_{10} reducción logarítmica" o 3 LRV). Las etapas de carga y lavado se realizaron a una velocidad aproximada de 1,3 cm/minuto. A continuación, la columna fue eluída con 0,48 m de sulfato amónico, 20 mM Tris, pH 7,4 a una velocidad de 0,65 cm/minuto.
Como se describió anteriormente, esta HIC, con
estas condiciones, elimina primariamente las histonas H2A y H2B,
que no se enlazan con el ADN tan estrechamente como las histonas H3
y H4. Las histonas H2 aparecen en el lavado. El pico contiene H3 y
H4, con algunas histonas H2. Sin embargo, hemos encontrado que
lavando con más alta concentraciones de sal, se puede romper la
interacción de ADN/histona. De este modo, lavando, por ejemplo, con
4 M de NaCl en lugar de 1,2 M de sulfato amónico, el ADN se rompe
separándose de la histona y se elimina en el lavado. Bajo estas
condiciones, una gran pluralidad de ADN se elimina en el lavado y
las histonas siguen su elución en el pico. Esta etapa de HIC
podría, como alternativa, realizarse después de la etapa de IMAC
(véase más adelante). Esto podría resultar en un 99,9% de más
eliminación del ADN (3 LRV).
El eluente procedente de la columna de HIC se
purificó todavía más utilizando una columna de cromatografía de
quelato metálico (IMAC) como sigue.
Se preparó una columna de IMAC Copper (II) en
Fractogel Chelate (M) (E. Merck) siguiendo las instrucciones del
fabricante. La columna de IMAC tenía una profundidad de lecho de 6,4
a 7,2 cm y una capacidad aproximada de 6,6 mg PSGL/ml resina. El pH
de esta etapa puede estar comprendido entre 4,8 y 8, pero es
preferentemente de pH 6,6.
La columna fue equilibrada con 50 mM de fosfato
potásico (KPO_{4}), 2,0 M de NaCl, 2 mM de imidazol, pH 7 para 5
cv a \leq 5 cm/minuto. Como alternativa, la columna se puede
equilibrar a 200 mM de NaCl en lugar de 2 M de NaCl. El eluente
desde la columna de HIC fue ajustado a 2 mM de imidazol, 50 mM de
KPO4, pH 7, 200 mM de NaCl y cargado en la columna de IMAC. Como
alternativa, la carga se puede realizar a 200 mM de NaCl en lugar de
2 M de NaCl.
La columna fue lavada primero con solución
tampón de equilibrado y luego fue lavada con 40 mM MES, 2M NaCl, 5
mM Imidazol, pH 6,6 a \leq 5 cm/minuto. La columna fue eluída con
40 mM MES, 1M NaCl, 35 mM imidazol con pH 6,6. La columna de IMAC
elimina primariamente las histonas H3 y H4. Estas histonas, y
algunas histonas H2, están en la banda. Algunas histonas H3 y H2 se
encuentran también en el pico de IMAC.
Esta etapa elimina un 90% más ADN que la etapa
de proceso I del ejemplo 1(1 LRV) utilizando la carga muy
salina o el lavado muy salino. La novedad de esta etapa es cargar
con 2 M NaCl o lavar con 2 M NaCl para eliminar el ADN de complejo
de histonas/ADN. Las histonas se adhieren a la columna de IMAC y el
ADN se adhiere a las histonas. Puesto que el ADN se une mejor al
complejo de H3/H4 que al de H3/H2 o a simplemente complejo de H2,
sería beneficiosa la eliminación del complejo de H3/H4 lo más pronto
posible en el proceso. De este modo, realizando el HIC después de
IMAC se ha demostrado que se puede conseguir más aclaración de ADN
(99,9% más aclaramiento o 3 LRV). Por lo tanto, introduciendo el
IMAC lo antes posible en el proceso se podría obtener una reducción
adicional de ADN. Sin embargo, IMAC como la primera etapa exigiría
una ultrafiltación/diafiltración para eliminar los aminoácidos de
pequeño peso molecular y otros grupos que contienen aminas de la
carga.
En este ejemplo se describe un método
alternativo para la purificación de una proteína de fusión
PSGL-Ig recombinante mediante cromatografía de
columna. A diferencia del plan de purificación descrito en el
ejemplo 1, este proceso utiliza una etapa de afinidad como la
primera etapa de purificación (figura 3). La etapa de purificación
de afinidad utiliza Proteína A que enlaza con la parte Fc de la
quimera de rPSGL-Ig. La rPSGL-Ig es
eluída de la columna de Proteína A con bajo pH, en este caso pH
3,7. La etapa de Proteína A proporciona mejor aclaramiento si la
columna se lava con 1 M NaCl después de la carga. Esta concentración
de sal es más alta que la que se suele utilizar (normalmente
de
150 mM NaCl) y por lo tanto, es una característica nueva. El aclaramiento del ADN de esta etapa varía desde el valor de 4 log_{10} reducción logarítmica (LRV) a 6 LRV con la adición de esta etapa salina. Esto representa un incremento de 100 veces en la eliminación de ADN.
150 mM NaCl) y por lo tanto, es una característica nueva. El aclaramiento del ADN de esta etapa varía desde el valor de 4 log_{10} reducción logarítmica (LRV) a 6 LRV con la adición de esta etapa salina. Esto representa un incremento de 100 veces en la eliminación de ADN.
La etapa de Proteína A no parece favorecer la
unión con las histonas y proporciona un buen aclaramiento del ADN.
De este modo, las histonas no están visiblemente presentes en las
etapas que siguen a la etapa de Proteína A. Sin embargo, puesto que
la Proteína A es objeto de lixiviación desde la columna de Proteína
A, las etapas posteriores se realizan para eliminar la Proteína A.
Un procedimiento nuevo para eliminar la proteína A lixiviada es
cargar el eluato de proteína A directamente en la columna Q, con un
pH neutro o bajo o lavar la columna Q con bajo pH. Las columnas Q
no suelen funcionar a pH bajo y especialmente no con pH 4. Por lo
tanto, la captura del rPSGL-Ig directamente desde
el eluato de proteína A o el lavado de la columna Q a bajo pH, o una
combinación de ambos, es una característica nueva. Puesto que la
rPSGL-Ig y la Proteína A están a bajo pH, una gran
pluralidad de rPSGL-Ig no está ligada a la Proteína
A lixiviada. Como resultado, la Proteína A no está ligada a la
columna Q, sino que se encuentra en el flujo pasante de columna Q.
Ésta es también una característica nueva. Por lo tanto, se está
utilizando la columna Q para la eliminación de Proteína A.
Una columna de Protein A Fast Flow (Amersham
Pharmacia), con una profundidad de lecho de 6 a 10 cm, se prepara
según las instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna
es de aproximadamente 1 mg/mL a 6 mg/mL. La columna es equilibrada
con 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,2 a 8, preferentemente pH 7,4. El
medio acondicionado microfiltrado se carga en la columna entre pH 7
y pH 8, preferentemente pH 7,4, a una velocidad aproximada de
30-300 cm/hora, preferentemente 150 cm/hora. La
columna se lava con 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7 a 8,
preferentemente pH 7,4 y es objeto de elución con 20 mM citrato, pH
3 a 4, preferentemente pH 3,7, a una velocidad de
50-300 cm/hora. La pureza es >95% para proteínas
y >99% del ADN se elimina mediante esta etapa.
El eluente procedente de la columna de Proteína
A se purifica todavía más en una columna Q Sepharose^{TM} Fast
Flow (Amersham Pharmacia) con una profundidad de lecho de 8 cm. La
capacidad de la columna Q Sepharose para PSGL a pH 3,6 a 4,0,
preferentemente pH 3,7, después de la etapa de Proteína A, es
aproximadamente \geq 6 mg PSGL/mL resina.
El pico de Proteína A se carga directamente en
la columna de Q Sepharose sin ajustar el pH o el pico se neutraliza
antes de la carga de la columna Q Sepharose. En uno u otro caso, la
columna se lava con 200 mM NaCl y 20 mM citrato a pH 3,5 a 4,
preferentemente pH 3,7, para eliminar la proteína A residual. Ambos
métodos eliminan la proteína A lixiviada, rPSGL-Ig
hiposulfatada, rPSGL-Ig recortada con
N-terminal y
pro-rPSGL-Ig (una especie
precursora para rPSGL-Ig que no tiene segmentación
enzimática del N-terminal). Después del lavado con
pH 3,5 a 4, la columna pudo lavarse con 20 mM histidina, 400 mM
NaCl, pH 6,5 para eliminar la rPSGL-Ig
hiposulfatada. Las moléculas de la rPSGL-Ig
hiposulfatada tienen cuatro o menos sulfataciones, mientras que la
PSGL-Ig activa tiene, en condiciones ideales, 5 ó 6
sulfataciones en las tirosinas de terminales N. Las etapas de carga
y lavado de la columna se realizan a una velocidad de 3,5 cm/minuto.
La columna es eluída a pH 6,5 con 1 M NaCl, 20 mM de histidina, con
pH 6,5. Como alternativa, se pudo eluir a pH 3,5 a 4,0,
preferentemente pH 3,8, en 500 mM NaCl, 20 mM citrato a <1,1
cm/minuto. Las proteínas representan menos del 2% del valor de
pico.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citada por el
solicitante es sólo para la comodidad del lector. No forma parte del
documento de patente europea. Incluso aunque se ha prestado mucha
atención en la compilación de las referencias, no pueden excluirse
errores u omisiones y la EPO rechaza cualquier responsabilidad a
este respecto.
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1989 [0019]
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Genetics Institute, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos para purificar
proteínas altamente aniónicas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GFN-002PC
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<140>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<171> Patente versión 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (3)
1. Procedimiento para purificar una proteína
diana altamente aniónica en una muestra de una serie de complejos de
ADN/histona, que comprende los pasos de:
- (a)
- purificación de la cromatografía de intercambio iónico de la proteína diana;
- (b)
- cargar la muestra purificada de cromatografía de intercambio iónico que contiene la proteína a través en una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, de modo que la muestra sea capturada en la columna; y
- (c)
- lavar la columna,
caracterizado porque el paso de lavado
utiliza una solución que comprende:
- -
- aproximadamente un 5% de isopropanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico,
- -
- aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico,
- -
- aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 4 M de NaCl.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la proteína es hipersulfatada.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la proteína es
PSGL-1.
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